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GIOVANI CARLO VERÍSSIMO DA COSTA
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GIOVANI CARLO VERÍSSIMO DA COSTA
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GIOVANI CARLO VERÍSSIMO DA COSTA
Rio de Janeiro
Outubro de 2007
Dissertação de Mestrado apres
entada ao
Programa de Pós-
Graduação do Instituto de
Microbiologia Prof. Paulo de Góes,
da
Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como
parte dos requisitos necessários à
obtenção do
título
de Mestre em Ciências Biológicas
(Microbiologia)
Orientador: Dr. José Mauro Peralta
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GIOVANI CARLO VERÍSSIMO DA COSTA
Orientador: José Mauro Peralta
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação do Instituto de
Microbiologia Prof. Paulo de Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas(Microbiologia)
Aprovada por:
______________________________
. Presidente Prof. Walter Martin Roland Oelemann
________________________________
Prof. Regina Helena Saramago Peralta
________________________________
Prof. Salvatori Giovani de Simone
_________________________________
Prof. Maria Helena da Silva
Rio de Janeiro
Outubro/2007
v
Ficha Catalográfica
Veríssimo da Costa, Giovani Carlo.
Estabelecimento de protocolos de solubilização para géis de eletroforese
bidimensional, identificação e produção de anticorpos monoclonais para proteínas de 30 a
34 kDa de Trypanosoma cruzi. Giovani Carlo Veríssimo da Costa. –
Rio de
Janeiro:UFRJ/IMPPG, 2007.
p.92
Orientadores: José Mauro Peralta e Vanda Maria Von Krüger
Dissertação (Mestrado) – UFRJ/Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes-
IMPPG/Programa de Pós-graduação em Microbiologia, 2007.
Referências bibliográficas:f.81-92
1- Estabelecimento de protocolos de solubilização para Eletroforese Bidimensional.
2- Identificação proteínas de 30 a 34 kDa de Trypanosoma cruzi
por Espectrometria
de Massas.
3- Mapea
mento Imunoproteômico de frações protéicas de 30 a 34 kDa de
Trypanosoma cruzi.
4- Produção de anticorpos monoclonais para proteínas de Trypanosoma cruzi
I- Peralta, José Mauro. II-
Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de
Microbiologia (IMPPG), Programa de Pós-Graduação em Microbiologia. III- Título.
vi
A minha avó e A minha mãe.
vii
Agradecimentos
Nesta oportunidade ímpar, desejamos expressar todos os nossos
agradecimentos àqueles que contribuíram para a realização deste trabalho.
Ao Dr. José Mauro Peralta, orientador e amigo, por nos ter guiado até a
presente data, incentivando e estimulando o espírito científico.
À Dr. Vanda Maria Von Krüger, pela orientação, pelas discussões, análise e
interpretação dos experimentos, bem como por nos ter iniciado e guiado nos caminhos
da proteômica.
Ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da UFRJ, nas pessoas de
sua Direção, Coordenação e Secretaria do Curso de Pós-graduação desta instituição,
pelo zelo ao aluno e auxílio constante.
À toda equipe do Laboratório de Sorologia do Departamento de Imunologia do
IMPPG, Carlos Ausberto de Souza, Regina Saramago Peralta, Adriana Neves, Tiana
Gonçalves, Helena Lúcia Carneiro, Mauro Jorge de Castro, Margareth Lessa, Laura
Maria Oliveira, Natália, Ronald, pela colaboração nos experimentos e na confecção
desta dissertação.
À unidade Multidisciplinar de Genômica do Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho da UFRJ, em especial a Letícia Lery, Simone, Carol, Ligia e Priscila, pelo auxílio
nos experimentos em Proteômica.
Ao Laboratório Chron Epigen, BIORIO - UFRJ e seus integrantes, Jorge Luiz
dos Santos Gonçalves e Diva da Cruz Monteiro, pela colaboração na produção dos
hibridomas e pelas extensas discussões sobre a produção de anticorpos monoclonais.
Finalmente, a todos que direta ou indiretamente incentivaram e inspiraram a
nossa formação e aperfeiçoamento profissional, mesmo que, por falha de memória, os
nomes não estejam aqui mencionados.
viii
Resumo
Verísssimo da Costa, Giovani Carlo. Estabelecimento de Protocolos de
solubilização para géis de eletroforese bidimensional, identificação e
produção de anticorpos monoclonais para proteínas de 30 a 34 kDa.
Dissertação de Mestrado em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia
Professor Paulo de Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ,
Rio de Janeiro, 2007.
Orientadores: José Mauro Peralta e Vanda Maria Von krüger
A doença de Chagas é um grave problema de saúde pública na América
Latina. A detecção de anticorpos específicos anti-Trypanosoma cruzi através da
aplicação de técnicas sorológicas é o método de escolha para o diagnóstico da
infecção chagásica na fase crônica, incentivando a busca pela descoberta de
moléculas antigênicas comuns às várias cepas do parasito e reativas a amostras
de soro de indivíduos de diferentes áreas endêmicas.
Neste estudo, estabelecemos a padronização de um protocolo de
solubilização de proteínas de extrato total e de frações protéicas de 30 a 34 kDa
de formas epimastigotas do parasito, comparando a utilização de diferentes
tampões de solubilização. Também identificamos proteínas do parasito através da
aplicação das técnicas de eletroforese bidimensional e espectrometria de massas,
além de iniciar o mapeamento imunoproteômico de extrato total do parasito com
amostras de soro de indivíduos chagásicos e a produção de anticorpos
monoclonais para proteínas de 30 a 34 kDa. Os resultados mostraram que a
combinação dos detergentes ASB-14 ao CHAPS proporcionou uma melhor
solubilização de proteínas do extrato total e das frações protéicas de 30 a 34kDa,
aumentando o número de spots detectados. A partir da utilização deste tampão
puderam ser identificadas quatro novas proteínas: metiltioadenosina fosforilase,
peptidase M20, arginase e catepsina B, não identificadas anteriormente em outros
estudos. O mapeamento imunoproteômico revelou significativa heterogeneidade
de reatividade para proteínas da fração de 30 a 34kDa e foram obtidos dois
hibridomas reativos para estas frações protéicas.
ix
Abstract
Veríssimo da Costa, Giovani Carlo. Stablishment of solubilization protocols of two-
dimensional electrophoresis gels, identification and monoclonal antibodies
production for 30/34kDa proteins of Trypanosoma cruzi. Dissertação de Mestrado
em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Rio de Janeiro, 2007.
Orientadores: José Mauro Peralta e Vanda Maria Von krüger
Chagas disease is a serious problem of public health in Latin America.
Detection of antibodies anti-Trypanosoma cruzi employing serological
technicals is the method of choice for diagnosis of infection in chronic fase,
incentivando the discovered of novel antigenic molecules in various parasite
strains and reactive for serum samples of individuals of different endemic areas.
In this study, we propouse the stablishment of a protocol of solubilization
of proteins total extracts of epimastigotes forms of parasite by comparision of
different solubilization buffers. We also identified proteins of T. cruzi by two-
dimensional electrophoresis and mass spectrometry and were iniciated
immunoproteomic mapping of extract total, using serum samples of cahgasic
individuals and the production of monoclonal antibodies specific for 30-34 kDa
proteins. The results showed that use of ASB-14 detergent in combination with
CHAPS is the best for solubilization of total extract proteins, as well as for 30-
34kDa protein fraction, revealing significantly more spots. Four novel proteins
were identified which not were demostrated by early studies:
methylthioadenosine phosphorylase, Peptidase M20/M25/M40, arginase and
cathepsin B. The immunoproteomic mapping revealed significantly
heterogeneity of rectivity profiles for 30-34 kDa proteins and two hibridomes
were obtained for this fraction.
x
Lista de Abreviaturas, Siglas e Unidades
ACF – Adjuvante completo de Freund
ACN – Acetonitrila
ADN – Ácido desoxirribonucléico
AIF – Adjuvante incompleto de Freund
ASB-14 – Amidosulfobetaína 14
CHAPS- 3[3-colatoamidopropildietilamonio]2-hidroxi-1-propanosulfonato
BCIP – Fosfato de Bromo-cloro-indol
CHCA – Ácido α-ciano-4-hidroxinâmico
CRA – Antígeno Repetitivo Citoplasmático
DCH – Doença de Chagas
DTT – Ditiotreitrol
ELISA – Enzyme-Linked Immunossorbent Assay (Ensaio immunoenzimatico
em superfície sólida)
ETP – Extrato total padrão
ETS – Extrato total solúvel
FRA – Antígeno Repetitivo Flagelar
GE – General Eletric
gp – Glicoproteína
HAI – Hemaglutinação indirea
HSP – Heat shock protein (Proteína de choque térmico)
ICAT - Isotope-Coded Affinity Tag (Marcação Isotópica e separação por
afinidade)
IFI – Imunofluorescência indireta
kDa – Kilo dalton
LC/MS/MS – Cromatografia Líquida/Espectrometria de massa com duplo
quadrupolo
LIA – Line Immunoassay (Imunoensaio em linha)
LIT – Liver infusion triptose (triptose de infusão de fígado)
MAbs – Anticorpos monoclonais
xi
MALDI-TOF – Matrix Assisted Laser Dessortion Ionization – Time of Flight
(Ionização e Dessorção a Laser Auxilada por Matrix- Tempo de Vôo)
MDH – Malato-dehidrogenase
MG – Minas Gerais
MS – Espectrometria de massas
NBT – Azul de nitrotetrazol
NH
4
HCO
3
– Bicarbonato de amônio
NMR – Ressonância magnética nuclear
PB – Paraíba
PBS – Tampão fosfato de sódio contendo salina a 0,85%
PCR – Reação em cadeia pela polimerase
PI - Piauí
PMSF – Fluoreto de fenilmetilsulfonila
RJ – Rio de Janeiro
SAPA – Shed-Antigen-Phase-Acute (Antígeno de fase aguda liberado)
SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de
sódio
SFB – Soro fetal bovino
TCA – Ácido tricloroacético
TFA – Ácido trifluoracético
TMB – Tetrametilbenzidina
WB – Western blot (Imunoblot)
xii
Lista de figuras e tabelas
Figura 1.................................................................................................................
3
Figura 2.................................................................................................................
32
Figura 3.................................................................................................................
52
Figura 4.................................................................................................................
55
Figura 5.................................................................................................................
56
Figura 6.................................................................................................................
57
Figura 7.................................................................................................................
59
Figura 8.................................................................................................................
63
Figura 9.................................................................................................................
65
Figura10................................................................................................................
67
Tabela 1................................................................................................................
38
Tabela 2................................................................................................................
40
Tabela 3................................................................................................................
42
Tabela 4................................................................................................................
44
Tabela 5............................................................................................................... 54
Tabela 6................................................................................................................
60
Tabela 7................................................................................................................
61
Tabela 8................................................................................................................
61
Tabela 9................................................................................................................
64
Tabela10...............................................................................................................
66
xiii
Índice
INTRODUCÃO...............................................................................................
1
1. Um breve histórico sobre a doença de Chagas.........................................
1
2. Ciclo Biológico e vetores do Trypanosoma cruzi.......................................
2
3. A epidemiologia da doença de Chagas..................................................... 4
4. Formas de transmissão da doença de Chagas......................................... 6
5. A patogenia................................................................................................
7
6. O diagnóstico laboratorial da doença de Chagas...................................... 8
6.1. Métodos de detecção do T. cruzi ou de seus ácidos nucleicos..............
9
6.2. Métodos sorológicos............................................................................... 10
7. Utilização de antígenos no diagnóstico sorológico da doença de
Chagas...........................................................................................................
13
8. Caracterização de antígenos de T. cruzi entre 30 e 34
kDa.......................
16
9. Da Genômica à Proteômica.......................................................................
19
10. O avanço da tecnologia Proteômica........................................................ 20
11. A Eletroforese Bidimensional e a Espectrometria de Massas................. 22
12. Proteoma e Imunoproteoma de T. cruzi..................................................
24
13. Produção e utilização de anticorpos monoclonais.................................. 26
14. Aplicação de anticorpos monoclonais na doença de Chagas................ 29
OBJETIVOS..................................................................................................
32
MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................
33
1. Obtenção de formas epimastigotas de T. cruzi
33
1. Obtenção de extrato citosólico de T. cruzi.................................................
33
3. Obtenção das frações proteicas de 30-34 kDa através de eletroforese
preparativa.....................................................................................................
34
3.1 Tratamento da amostra............................................................................
34
3.2. Eletroforese preparativa..........................................................................
34
xiv
3.3.Determinação da concentração de proteínas ......................................... 36
4. Análise do perfil de proteínas do ETP e das frações obtidas por
eletroforese preparativa.................................................................................
36
5. Coloração do gel de poliacrilamida com azul de Coomassie.................... 37
6. Padronização do protocolo de solubilização de proteínas do parasito
para análise em eletroforese bidimensional..................................................
37
6.1. Preparo do extrato total solúvel (ETS)................................................... 37
6.2. Preparo das frações de 30 a 34 kDa...................................................... 39
6.3. Análise em eletroforese bidimensional................................................... 39
6.3.1. Etapas de reidratação e focalização isoelétrica...................................
39
6.3.2. Segunda dimensão.............................................................................. 40
7. Preparação dos spots para análise por espectrometria de massas..........
42
8. Digestão tríptica das proteínas do ETS e fração 30 a 34
kDa....................
43
9. Análise dos peptídios em espectrometria de massas.............................. 44
10. Estratégia utilizada no estudo de mapeamento protéico com amostras
de soro anti-T. cruzi.......................................................................................
45
11. Identificação de proteínas imunorreativas entre 30 e 34 kDa através de
eletroforese bidimensional e Western blot....................................................
46
12. Produção de anticorpos Monoclonais..................................................... 47
13. ELISA (Enzime-Linked Immunossorbent Assay).....................................
48
14. Western blot.............................................................................................
49
RESULTADOS..............................................................................................
51
Parte I – Obtenção de frações protéicas de T. cruzi, estabelecimento de
protocolos de solubilização de proteínas de extrato total e fração 30 a 34
kDa.............................................................................................................
51
1. Avaliação do perfil protéico das frações obtidas por eletroforese
preparativa.....................................................................................................
51
2. Estabelecimento de protocolo de solubilização de proteínas de formas
epimastigotas de T. cruzi...............................................................................
52
3. Separação de proteínas da fração 30-34 kDa em gel de gradiente de
xv
poliacrilamida................................................................................................. 47
Parte II – Identificação de proteínas na região de 30 a 34 kDa através de
espectrometria de massas (MALDI-TOF/TOF)..............................................
53
Parte III – Mapeamento imunonoproteômico de proteínas de 30 a 34 kDa
de formas epimastigotas de T. cruzi e produção de anticorpos
monoclonais...................................................................................................
58
DISCUSSÃO..................................................................................................
66
CONCLUSÕES 80
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................
81
1
Introdução
1. Um breve histórico sobre a doença de Chagas
Há um século (1907), uma severa epidemia de malária atingiu construtores da
ferrovia localizada no antigo Vale do Rio das Velhas em Minas Gerais, no Brasil.
Este fato preocupou as autoridades governamentais, que solicitaram ao pesquisador
do Instituto Manguinhos (Rio de Janeiro), Carlos Justiniano Ribeiro Chagas (Carlos
Chagas), que viajasse rapidamente até a cidade de Lassance (Minas Gerais –
Brasil) e fizesse uma avaliação da situação epidemiológica na região (Leonard,
1990).
Numa noite, o chefe dos engenheiros do local mostrou a Carlos Chagas um
inseto hematófago conhecido como barbeiro, que infestava as estalagens dos
trabalhadores e as residências locais. Com seus profundos conhecimentos sobre
vetores, ciclos biológicos parasitários e mecanismos de transmissão, Chagas
investigou o conteúdo dos tubos digestivos e das glândulas salivares de vários
daqueles insetos. Surpreendentemente, tais investigações revelaram numerosos
parasitos flagelados no intestino dos insetos, conduzindo a suspeita de que
pudessem ser transmitidos para o homem e para outros animais. Amostras de
insetos infectados foram enviadas para o Instituto Manguinhos e inoculados em
macacos. Os animais desenvolveram um quadro febril acompanhado de
mortalidade. Posteriormente, sintomatologia semelhante e letalidade foram
observadas em cães, cobaias e coelhos inoculados com os mesmos parasitos.
De volta a Lassance, em 1909, Chagas identificou o mesmo parasito no
sangue de uma criança, cujo nome era Berenice. A menina apresentava sintomas
característicos da doença, revelando a existência de uma nova tripanossomíase
2
humana. Desta forma, este pesquisador brasileiro revelou tanto o agente etiológico
da doença (atualmente conhecido como Trypanosoma cruzi), quanto seu ciclo
biológico, seus hospedeiros domésticos e silvestres, a patologia da doença, além de
estabelecer também o diagnóstico do primeiro caso humano da infecção (Chagas,
1909).
2. Ciclo biológico do Trypanosoma cruzi
O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, é um parasito
flagelado pertencente à ordem Kinetoplastida e família Trypanosomatidae.
Apresenta um complexo ciclo de vida, com estágios de desenvolvimento que são
identificados no inseto vetor hematófago e no hospedeiro mamífero (Tanowitz et al.,
1992). Durante esta transição vetor-hospedeiro, quatro estágios evolutivos distintos
estão relacionados aos microambientes decorrentes de sua adaptação (figura 1).
No lúmem intestinal do inseto vetor, o parasito multiplica-se sob a forma de
epimastigotas, diferenciando-se em tripomastigotas metacíclicos altamente
infectantes. Estas formas se acumulam no intestino posterior do inseto. No momento
do repasto sangüíneo em um hospedeiro mamífero, a compressão de seu abdome
promove a liberação das formas infectantes. Em conseqüência disto, estes parasitos
podem penetrar no local da picada ou mucosas e invadir células do hospedeiro,
onde se diferenciam em formas amastigotas replicativas, dando prosseguimento ao
seu ciclo biológico. Em seguida, as formas amastigotas se diferenciam em formas
tripomastigotas, que são liberadas por lise celular. Assim, os tripomastigotas podem
invadir novas células do hospedeiro ou serem ingeridos por novos insetos vetores,
fechando-se desta forma, o ciclo da parasitose (Tanowitz et al., 1992).
3
3. A epidemiologia da doença de Chagas
A doença de Chagas (DCH) é uma infecção endêmica amplamente distribuída
na América Latina, afetando 17,4 milhões de pessoas e constituindo-se num grave
problema de saúde pública. Nesta região, a infecção é heterogeneamente
distribuída, alcançando índices consideráveis de prevalência, tais como: 5% na
Figura 1.
Ciclo biológico do Trypanosoma cruzi.
(Extraído e adaptado de
www.dpd.cdc.gov/dpdx)
4
Argentina, na Bolívia (50% na cidade de Santa Cruz), 2% na Colômbia, 1% no
Equador e 8% na Guatemala (WHO, 2002).
Em 1975, no Brasil, as áreas endêmicas ocupavam 36% da superfície do
território nacional, distribuídas em 17 estados, alguns com altos índices de
prevalência como no Acre (2,4%), na Bahia (5,7%), em Minas Gerais (8,8%) e no
Rio Grande do Sul (8,8%) (WHO, 2002). Nos últimos anos, tem sido observada uma
diminuição significativa da incidência entre jovens e, ainda, o controle da DCH em
alguns estados, como resultado de um eficaz programa plurianual, que inclui a
melhoria das habitações e a aplicação de pesticidas (Dias, Silveira & Schofield,
2002).
Além disso, resultados de iniciativas visando o controle da transmissão
doméstica do parasito em alguns países do cone sul (INCOSUR), têm entusiasmado
autoridades e a comunidade científica de nosso país e de outras áreas da América,
motivando-os a implementar programas similares (Yamagata & Nakagawa, 2006)
Todavia, se por um lado alguns autores têm preconizado a erradicação da
doença, algumas investigações têm fornecido dados preocupantes tais como a
invasão de novos vetores silvestres no ambiente domiciliar e peridomiciliar, o registro
da incidência de casos agudos associado à presença desses vetores e, ainda, o
surgimento de surtos esporádicos da DCH em áreas até então consideradas de
baixa endemicidade (Coura, 1990; Coura, Garrett & Naranjo, 1994; Coura, Arboleda-
Naranjo & Willco, 1995; Dias-Lima & Sherlock, 2000). Além disso, ainda que a
transmissão autóctone seja irrelevante em países como Estados Unidos e Canadá e
em algumas áreas da Europa (Kirchhoff, Gam & Gilliam, 1987; Ochs, Hinlica &
Moser, 1996; Herwaldt Grijalva & Newsome, 1998), resultados de alguns estudos
têm alarmado as autoridades de saúde. Estima-se, por exemplo, que cerca de
5
100.000 imigrantes nos Estados Unidos (EUA) possam estar cronicamente
infectados com o T. cruzi. Isto pode decorrer da ausência de programas de triagem
eficazes para doadores de sangue e de eventos subclínicos da DCH nestes
indivíduos, ou ainda, do mimetismo sintomatológico da cardiomiopatia chagásica
frente à doença coronariana, muito típica neste país (Hagar & Rahimtoola, 1991).
Igualmente preocupante é o fato de que, em algumas áreas dos EUA, existem
seres humanos não infectados e animais silvestres infectados habitando áreas
comuns. Como exemplo, cita-se uma área urbana do norte da Virgínia (EUA), onde a
análise da prevalência de anticorpos anti-T. cruzi em gambás mostrou
soropositividade de cerca 36% entre os anos de 2000 e 2001, ressaltando a
constante exposição destes animais ao T. cruzi e o perigo iminente de transmissão
ao homem (Hancock et al., 2005).
4. Formas de transmissão da doença de Chagas
A principal via de transmissão da DCH é a vetorial, devido à precariedade das
habitações nas áreas endêmicas, possibilitando a domiciliação dos vetores e a
posterior infecção do homem. Entretanto, com a implementação de programas de
combate ao vetor e com o intenso fluxo migratório de indivíduos contaminados em
direção aos grandes centros urbanos em busca de melhores condições sócio-
econômicas, a transmissão pela transfusão de sangue e hemoderivados tornou-se
também uma importante via de disseminação da DCH, embora ainda seja limitada
pelo nível de parasitemia do doador, pelo volume de transfusão e pelo estado
imunológico do receptor (Schmuñis, 1985). A possibilidade de que a DCH pudesse
ser transmitida pelo sangue infectado foi inicialmente postulada por Bertin, 1940 e
6
Diaz, 1949. Posteriormente, sugeriu-se a transmissão pela transfusão de plasma
contaminado (Nussenzweig et al., 1955; Camargo & Lesser, 1974).
No início da década de 80, a possibilidade da transmissão da DCH por essa
via era extremamente alta na América Latina, devido ao elevado número de
doadores soropositivos em vários países: 20 a 22% na Argentina (Bergoglio, 1972);
0,3 a 25% no Brasil (Marsochi, 1981); 63% na Bolívia; 3,7 a 14,5% no Chile (Lorca
et al., 1983); 28% em Honduras (Ponce & Zeledon, 1973) e 5,1 a 12% na Venezuela
(Maekelt, 1973). Até então, os testes sorológicos para a triagem de doadores de
sangue não eram realizados na maioria dos países da região e cerca de 500.000
transfusões eram feitas anualmente. Deste número, cerca de 10.000 transfusões
representavam risco potencial para a transmissão da DCH. Segundo Cerisola et al.,
(1972), 5% dos pacientes hemofílicos apresentavam sorologia positiva após a quinta
transfusão e 26% após a 15ª transfusão. Até 2002 em países como o Panamá, a
Nicarágua e o México, a triagem dos doadores de sangue nem sequer era
obrigatória (WHO, 2002). Já no Brasil, de 1991 até 2005 foi utilizado um programa
de triagem sorológica que incluía pelo menos a aplicação de duas técnicas
sorológicas. Isto reduziu o risco de contágio por meio de transfusões para 0,5% das
quase 4 milhões de transfusões realizadas anualmente no país (Souza et al., 1994).
Este programa brasileiro, portanto, contribuiu significativamente para a diminuição
por essa via de transmissão.
Outros tipos de transmissão como a congênita e a oral, têm importância
menos expressivas na disseminação da doença. A transmissão congênita ocorre por
via transplacentária e é influenciada por fatores decorrentes do parasito e do
hospedeiro (Dias, 1997; Riera et al. 2006). A transmissão oral ocorre através da
ingestão de alimentos contendo parasitos, como carnes de animais silvestres
7
contaminadas, ou ainda frutas moídas contaminadas com triatomíneos (Dias &
Coura, 1997; Coura, 2006).
5. A patogenia
A patogênese da DCH ainda permanece desconhecida e tem sido atribuída à
persistência do parasito e\ou às reações auto-imunes do hospedeiro (Kierszenbaum,
2005). A necessidade do parasito para o desenvolvimento da patogenia da DCH foi
evidenciada pela existência de uma associação entre a doença e essa persistência,
pela correlação entre inflamação e presença de DNA ou de antígenos parasitários e
pela diminuição dos efeitos inflamatórios em decorrência da eliminação do parasito
(Dumonteil et al., 2004).
No decorrer da infecção chagásica, o indivíduo infectado entra em uma fase
inicial aguda, caracterizada por alguns aspectos imunopatológicos como:
imunossupressão, alta parasitemia, invasão tissular moderada ou severa e aumento
da concentração de anticorpos do isotipo IgM. Ao fim de 3 a 4 meses, a doença
evolui para uma fase crônica, acompanhada de baixa parasitemia e altos títulos de
anticorpos da classe IgG. Nesta última fase, a doença pode evoluir para uma forma
sintomática com invasão das células cardíacas, gerando a cardiopatia chagásica
crônica (CCC) e/ou para uma forma digestiva com alterações esofágicas e intestinais
(Megaesôfago e Megacólon) (Tanowitz et al., 1992). Estes quadros clínicos
provocam profundos impactos sociais, devido ao impedimento ao trabalho, à
elevação de custos previdenciários e à perda de produtividade (WHO, 2002). Além
das duas formas clínicas da DCH descritas acima, o indivíduo também pode evoluir
para uma forma subclínica ou indeterminada, caracterizada pela ausência de
sintomas. Nestes indivíduos, a produção de anticorpos específicos anti-T. cruzi pode
8
persistir durante toda a vida e, consequentemente, sua detecção torna-se de
extrema importância para o diagnóstico.
6. O diagnóstico laboratorial da doença de Chagas
O diagnóstico laboratorial da DCH pode ser realizado através de métodos
parasitológicos, pela detecção direta ou indireta do parasito, através da detecção do
seu material genético (técnicas de biologia molecular), ou ainda, através de métodos
imunológicos baseados na detecção de antígenos do parasito ou de anticorpos
específicos do hospedeiro (Tanowitz et al.,1992).
6.1 Métodos de detecção do Trypanosoma cruzi ou de seus ácidos
nucléicos
Métodos diretos ou indiretos para a detecção do T. cruzi são utilizados
preferencialmente na fase aguda da doença, em que, na grande maioria dos casos,
ocorre um elevado grau de parasitemia. Tais métodos baseiam-se na detecção de
tripomastigotas sanguíneos, tendo como vantagem o não requerimento de
equipamentos de alta tecnologia para sua realização. Todavia, em virtude da
subjetividade e complexidade técnica-operacional, torna-se necessária à formação
de técnicos treinados para sua execução (Krieger et al., 1992).
Métodos indiretos de detecção do parasito tais como o Xenodiagnóstico e a
Hemocultura também são utilizados no diagnóstico laboratorial da DCH. Ambos os
métodos apresentam grande sensibilidade para detectar o parasito na fase aguda da
doença. No caso do xenodiagnóstico a sensibilidade pode chegar a 100% quando
são avaliados indivíduos com infecção aguda em algumas áreas endêmicas, o
mesmo não ocorrendo em outras regiões, onde os níveis de parasitemia são
9
extremamente baixos (Cerisola et al., 1969). Já na fase crônica esses valores caem
drasticamente (Borges-Pereira et al., 1986; Coura et al., 1991).
A utilização de técnicas de biologia molecular para a detecção de material
genético do T. cruzi foi iniciada na década de 80. Estas técnicas baseavam-se na
hibridização, de sondas para a detecção de seqüências repetitivas do DNA nuclear
do parasito (Gonzales et al., 1984; Ashall et al., 1988). Posteriormente, seqüências
gênicas, altamente repetitivas dos minicírculos do cinetoplasto do parasito,
passaram a ser utilizadas como moldes em reações em cadeia da polimerase (PCR)
com iniciadores específicos, com alta sensibilidade, podendo detectar até 100% em
casos de infecção (Ávila et al., 1993; Centurion-Lara et al., 1994; Wincker et al.,
1994). Entretanto, a continuidade desses estudos revelou que a sensibilidade desta
técnica não era tão alta. Isso foi atribuído aos diferentes graus de parasitemia
encontrados nos indivíduos em diferentes fases da doença, bem como à diferenças
de parasitemia em indivíduos provenientes de diferentes regiões geográficas do
Brasil (Brito et al., 1995; Junqueira, Chiari & Wincker, 1996; Teixeira, 2000).
6.2 Métodos sorológicos
As limitações dos métodos parasitológicos e moleculares incentivaram a
melhoria dos testes sorológicos para o diagnóstico da DCH. A demonstração de
anticorpos é reconhecidamente de extrema importância, uma vez que os testes
desenvolvidos para essa finalidade, em sua grande maioria, apresentam facilidades
operacionais, rapidez nos resultados e baixa onerosidade. Existe uma considerável
variedade de testes sorológicos aplicados ao diagnóstico da infecção chagásica, tais
como a Imunofluorescência indireta (IFI), o Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
(ELISA) (Pinho et al., 1999; Pinho, 2001; Oelemann et al., 1998), o Western blot
10
(Teixeira et al.,1994), a Quimioluminescência (Almeida et al.,1999) e a aplicação de
Biosensores (Ferreira et al., 2005). Estes três últimos, até o momento, são utilizados
exclusivamente na pesquisa científica. Cada uma destas técnicas apresenta
diferentes características operacionais e, conseqüentemente, diferentes níveis de
sensibilidade e especificidade.
Desde a sua primeira descrição por Fife & Mushel (1959) e, posterior
modificação por Camargo (1966), a IFI vem sendo um dos testes de escolha para o
diagnóstico sorológico da infecção chagásica. Este método emprega parasitos
íntegros tratados com formol que são detectados pelos anticorpos presentes na
amostra de soro do indivíduo infectado. A visualização dos complexos antígeno-
anticorpo gerados, é promovida pela adição de anti-imunoglobulinas marcadas com
compostos fluorescentes. A praticidade do teste e a possibilidade de se obter
reagentes bem padronizados são responsáveis pela sua extensa utilização.
Contudo, o uso de parasitos, íntegros permite a reatividade cruzada com amostras
de soro de indivíduos infectados com Leishmania, fato que tem restringido a sua
utilização em situações em que os índices de especificidade devam ser altos em
detrimento da sensibilidade (Krieger et al., 1992).
A técnica de ELISA (Voller, 1975) vem sendo um excelente ensaio de triagem
de doadores de sangue. Vários antígenos purificados têm sido empregados nos
ensaios de ELISA, apresentando diferentes desempenhos. Porém, na grande
maioria dos kits de diagnósticos disponíveis comercialmente, lisados de parasitos,
são empregados como fonte de antígenos (Franco-da-Silveira, Umezawa & Luquetti,
2001; Oelemann et al., 1998; Oelemann et al., 1999; Teixeira, 2000; Cheng et al.,
2007).
11
Ferreira, Camargo & Nakahara, 1979, demonstraram a concordância entre
diferentes testes sorológicos e o ELISA quando usaram 272 amostras de soro de
pacientes provenientes de uma área endêmica para a DCH. Neste estudo, os
autores demonstraram 99,54% de sensibilidade e 99,69% de especificidade no
ELISA, usando 1648 amostras de soro e comparando seus resultados com os testes
de IFI e de Hemaglutinação indireta (HAI). Em 1998, Oelemann et al. avaliaram três
dos quatro conjuntos diagnósticos comerciais mais usados no Brasil, que
empregavam extratos citosólicos totais como antígenos. Os resultados obtidos por
esses autores mostraram sensibilidade e especificidade relativas entre 97 e 100% e
93 e 100%, respectivamente. Assim como na IFI, variações na especificidade estão
estritamente relacionadas à presença de reatividade cruzada com amostras de soro
de indivíduos com leishmaniose ou infectados com Trypanosoma rangeli.
Diversos pesquisadores têm padronizado e utilizado, de maneira satisfatória,
a técnica de Western blot para o diagnóstico de diferentes doenças infecciosas
(Center for Disease Control, 1989; Tsang, Brand & Boyer, 1989). No que tange à
DCH, alguns cientistas têm estudado e avaliado proteínas de alto peso molecular
(160-200kDa) excretadas pelo parasito, para detecção da doença, com excelentes
resultados, principalmente, para indivíduos na fase aguda (Umezawa et al., 1996).
Por outro lado, Teixeira et al. (1994), verificaram através da técnica de Western blot
alta freqüência de reatividade para bandas protéicas do parasito, de massa
molecular relativa entre 14-75kDa (14, 19, 27, 30, 34, 37 e 75kDa), com
sensibilidade e especificidade de 99,3% e 100%, respectivamente.
12
7. Utilização de antígenos no diagnóstico sorológico da doença de
Chagas
Diferentes antígenos parasitários vêm sendo aplicados no diagnóstico
sorológico da infecção chagásica. Como dito antes, antígenos obtidos a partir de
extratos totais de parasitos, têm sido empregados atualmente em testes comerciais,
mas problemas relativos aos índices de especificidade têm incentivado a utilização
de antígenos purificados, recombinantes e sintéticos.
Empregando como antígenos, proteínas de superfície de epimastigotas de
T.cruzi, Guimarães et al. (1981), demonstraram sensibilidade semelhante entre os
métodos que utilizam tais antígenos em comparação aos extratos totais do parasito.
Na tentativa de melhorar o desempenho do ELISA, vários autores procuraram utilizar
diferentes antígenos purificados. Em 1983, Schechter et al., empregando a
glicoproteína de 90 kDa (gp 90) purificada obtiveram 96,6% de sensibilidade.
Entretanto, em estudos posteriores, Schechter et al. (1985), observaram a
reatividade deste antígeno com amostras de indivíduos com leishmaniose visceral.
Ainda em 1985, Scharfstein et al. isolaram e caracterizaram uma glicoproteína de 25
kDa (gp25) e avaliaram-na num ensaio radiométrico, demonstrando 96,5% de
sensibilidade. Posteriormente, esta glicoproteína foi descrita como um produto da
proteólise da glicoproteína de 57/51kDa (Scharfstein et al., 1986), que mais tarde
mostrou ser eficiente em ensaios de ELISA para detectar a cura após quimioterapia
específica para o T. cruzi (Gazzinelli et al., 1993). Carbonetto et al. (1990), avaliaram
o uso da gp52 em ELISA e observaram 100% de especificidade, sugerindo o uso
desta proteína no diagnóstico diferencial entre a leishmaniose e a DCH. Lemersre et
al. (1986), empregaram um epitopo da gp72 e obtiveram 96,6% de sensibilidade e
100% de especificidade frente a amostras de indivíduos na fase crônica.
13
A tecnologia do DNA recombinante trouxe, a partir de meados da década de
80, novas perspectivas para o uso de antígenos em ensaios imunoenzimáticos.
Moncayo & Luquetti (1990), realizando um estudo multicêntrico em que foram
avaliados diferentes antígenos recombinantes, propuseram o uso conjunto de alguns
desses antígenos num único ensaio. Os antígenos recombinantes flagelar (FRA) e
de citoplasma de epimastigotas de T. cruzi (CRA), foram utilizados em conjunto
(Krieger et al, 1992) e apresentaram sensibilidade e especificidade de 100%. O uso
da proteína recombinante rTc-24 também foi proposto para o monitoramento de
cura e/ou para diferenciação entre infecções por Leishmania sp e T. cruzi (Guevara
et al., 1995; Passos et al., 1997). Umezawa et al. (1999), propuseram um ELISA com
seis proteínas recombinantes (H49, JL7, A13, B13, JL8 e 1F8). Todavia, o teste
apresentou sensibilidade inferior à encontrada em testes comerciais que utilizam
extratos totais do parasito.
Para melhorar o desempenho dos testes de ELISA, iniciaram-se tentativas
para a obtenção de antígenos de 3
a
geração, os peptídios sintéticos. Vergara et al.
(1992), avaliaram a utilização de cinco moléculas (pep 1, pep 2, pep 3, pep 36 e
SAPA) com amostras de soro de 60 pacientes chagásicos crônicos e observaram
sensibilidade de 98% quando as amostras eram reativas para pelo menos um
peptídeo. Peralta et al. (1994), usando dois peptídios (TcD e o pep2) em um teste de
ELISA, demonstraram uma sensibilidade de 99,4% quando foram utilizadas 260
amostras de soro de indivíduos de área endêmica. foram utilizadas. Em 1999,
Ferreira et al. propuseram o uso de um antígeno de 4
a
geração, que são moléculas
recombinantes obtidas por clonagem da fusão de dois peptídeos sintéticos
diferentes. Estes autores utilizaram 290 amostras de soro de pacientes chagásicos e
não-chagásicos e observaram 100% de sensibilidade e 98,4% de especificidade,
14
esta última, superior a encontrada pelo teste com antígeno total (94,2%). Oelemann
et al. (1999), utilizando sete antígenos recombinantes e/ou sintéticos adsorvidos
numa única tira de nylon (Line Immunoassay), frente a um painel de 1.064 amostras
de indivíduos de diferentes áreas endêmicas, obtiveram sensibilidade de 100% e
especificidade de 99,3%. Em outra avaliação do mesmo teste, com 1.604 amostras
oriundas de um banco de sangue, Saez-Alquézar et al. (2000), demonstraram 99,4%
e 98,1% de sensibilidade e especificidade, respectivamente. A utilização de
antígenos recombinantes e sintéticos tem ampliado as perspectivas para o
desenvolvimento e aprimoramento de metodologias para o diagnóstico da doença de
Chagas. O uso de alguns destes antígenos num único teste pode aumentar
significativamente os índices de especificidade sem detrimento da sensibilidade.
Como descrito anteriormente, através de um ensaio de Western blot com
amostras de soro de indivíduos de uma área endêmica (Virgem da Lapa - MG),
Teixeira et al. (1994), demonstraram freqüências significativas de reatividade para as
bandas de 30kDa (100%) e 34kDa (90%). Devido a isto, estas bandas passaram a
fazer parte de um conjunto de sete bandas utilizadas como critério de positividade
para DCH. Alta freqüência de reatividade para as bandas de 30-34 kDa também foi
encontrada pelos mesmos investigadores quando analisaram amostras de soro de
diferentes regiões endêmicas (dados não publicados). Reiche et al. (1998),
utilizaram amostras provenientes do Centro de Hemoterapia do Paraná para avaliar
a reatividade das bandas de 30 a 34 kDa através da técnica de Western blot e
obtiveram sensibilidade em torno 86%.
15
8. Caracterização de antígenos de Trypanosoma cruzi entre 30 e 34 kDa
A separação e a definição de bandas por eletroforese em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE), aliadas à detecção de bandas reativas por Western blot,
têm permitido melhorar os resultados de sensibilidade e, principalmente, da
especificidade da técnica. Estes procedimentos também têm permitido a análise dos
perfis antigênicos de diferentes cepas de T. cruzi, bem como dos perfis antigênicos
de suas formas evolutivas. Os estudos têm mostrado que, apesar da existência de
diferenças antigênicas entre algumas cepas e formas do parasito, bandas protéicas
de 30 a 70kDa são encontradas predominantemente em epimastigotas (Araújo &
Tighe, 1984; Morgado et al., 1989; Rangel-Adao et al., 1986). Ainda nestes estudos,
os autores demonstraram também a reatividade específica da banda protéica de
30kDa, que não foi reconhecida por amostras de soro de pacientes com outras
infecções como, por exemplo, a leishmaniose.
Chiller, Samudio & Zoulek, em 1990, padronizaram a técnica de Western blot
para o diagnóstico da leishmaniose tegumentar e revelaram que bandas protéicas
de 30 a 38 KDa eram reconhecidas por 100% das amostras de soro de pacientes
chagásicos. Estes resultados corroboraram outros posteriores (Gonçalves et al.,
2002), em que os autores avaliaram a freqüência de reatividade das amostras de
soro de 4 grupos de indivíduos frente a extratos citosólicos totais de três espécies de
Leishmania. Consistentemente, seus resultados também demonstraram que bandas
entre 28 e 38 kDa das três espécies de Leishmania foram reconhecidas por 78,3% a
90,0% dos soros dos pacientes chagásicos, porém com baixa ou nenhuma
reatividade com amostras de soro de indivíduos com leishmaniose.
Tozetti em 1997 analisou seis cepas do T. cruzi, provenientes da América
Latina e observou que as bandas entre 30 e 34 kDa eram reativas a amostras de
16
soro de pacientes no ensaio de Western blot. Resultados semelhantes foram
descritos por Sanchéz et al. (2001), com extratos de quatro cepas mexicanas de
T.cruzi, que observaram 86% de freqüência de reatividade para a banda protéica de
30kDa e 100% para a de 32kDa. Em outro estudo, em que foi avaliada a reatividade
de extratos de tripanosomatídeo não-patogênico (Chrithidia luciliae), a banda de
30kDa também foi reconhecida por 100% das amostras de soro de pacientes
chagásicos e as bandas de 33 e 35 kDa reagiram de forma significativa (Monteón et
al., 1997).
Garcia et al. (1998), identificaram uma nova glicoproteína com atividade
proteolítica, presente nas três formas evolutivas do T. cruzi. Esta molécula migrava
na região de 30 kDa quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE). Imunização em coelhos, com esta glicoproteína, gerou anticorpos de
alta afinidade. Ainda neste estudo, os autores descreveram esta molécula como uma
cisteína-proteinase pertencente ao grupo das catepsinas B.
Duas isoformas da enzima malato-desidrogenase (MDH1 e MDH2) foram
purificadas a partir de epimastigotas e identificadas como proteínas de 33 kDa
(Hunter et al., 2000). Neste estudo, os autores também demonstraram que as
isoformas não apresentaram reatividade cruzada. Em nosso laboratório, nossos
esforços estão voltados para a caracterização e identificação de proteínas de 30 a
34 kDa desde o ano de 2000 (Veríssimo da Costa, 2000; Caseca, 2000, 2002). Ao
longo destes anos pudemos observar índices de sensibilidade e especificidade que
alcançavam até 100%, quando estas proteínas foram utilizadas parcialmente
purificadas, em testes de ELISA e de Western blot frente a soros de pacientes
chagásicos. Paralelamente, também demonstramos que tais moléculas pertenciam
ao grupo das glicoproteínas, uma vez que eram capazes de ligar lectinas marcadas,
17
além de apresentarem atividade proteolítica. Caseca em 2002 demonstrou que estas
moléculas estavam presentes nas três formas evolutivas do parasito. Neste mesmo
trabalho, através de estudos imunohistoquímicos, foi demonstrado ainda que a
molécula de 30 kDa correspondia a proteínas de diferentes grupos de microtúbulos
do T. cruzi.
Os altos índices de reatividade bem como o caráter imunodominante destas
moléculas abriu perspectivas para a sua utilização não somente como antígenos
purificados, mas também como proteínas recombinantes, ou ainda, como moldes
para elaboração de peptídeos sintéticos (Moncayo & Luquetti, 1990; Peralta et al.,
1994; Hernandez-Marin et al., 2005). Entretanto, nenhum estudo abrangente de
identificação e caracterização destas moléculas foi realizado até o momento. Isto
provavelmente se deve à dificuldade metodológica das etapas de purificação e pela
impossibilidade da manutenção de suas características desde o processo de
purificação até o momento de sua análise estrutural. Por outro lado, sabe-se também
que bandas eficientemente resolvidas por SDS-PAGE, são formadas, na maioria dos
casos por fragmentos ou grupos de proteínas que apresentam o mesmo peso
molecular gerados após o processo de preparação da amostra. Neste contexto, o
uso de ferramentas da proteômica torna-se uma importante alternativa, tanto para a
identificação destas moléculas como para a detecção do maior número possível de
antígenos do parasito envolvidos na reatividade imunológica de amostras de soro de
pacientes chagásicos.
9. Da Genômica a Proteômica
O grande avanço da Genômica tem contribuído de maneira fundamental para
a melhoria da vida do homem. Através das técnicas de clonagem, de PCR, de
18
hibridização, de seqüenciamento e de análise de transcritos por macro/microarranjos
e/ou biochips (transcriptoma), tem sido possível o melhor entendimento sobre a
origem do homem e de outros seres vivos. Além disto, estas metodologias
permitiram ampliar os conhecimentos sobre os processos infecciosos e tumorais,
aprimorar as técnicas terapêuticas e o desenvolvimento de metodologias para o
desenvolvimento da agropecuária. Entretanto, os estudos exclusivos do genoma de
um organismo e dos produtos de sua transcrição não revelam todas as informações
acerca das proteínas sintetizadas sob determinada condição e de suas propriedades
particulares. As cadeias polipeptídicas podem sofrer mais de 200 modificações do
tipo pós-traducional, incluindo fosforilação, glicosilação, acetilação, desaminação e
proteólise, dentre outras (Liebler, 2003). Tais modificações não podem ser preditas
apenas pelas seqüências de DNA ou de mRNAs, ficando a elucidação destes
processos a cargo do estudo das proteínas, denominado de Proteômica.
10. O avanço da tecnologia Proteômica
Inicialmente designado por Wilkins et al. (1996), proteoma foi definido como o
conjunto de proteínas sintetizadas a partir de um determinado genoma em uma
determinada condição. Entretanto, a análise de proteoma, além de revelar a
identidade das proteínas, também pode revelar sua estrutura primária, todas as suas
isoformas, suas modificações pós-traducionais, suas interações proteína-proteína ou
com outras moléculas, sua descrição estrutural no espaço tridimensional e,
conseqüentemente, o conjunto das interações e a interdependência de processos
biológicos (Tyers & Mann, 2003). Desta forma, informações proteômicas podem
complementar dados de análise de expressão de transcritos e da taxonomia
molecular.
19
Nos últimos anos, as ferramentas proteômicas têm tido grande importância e
aplicabilidade nas diferentes áreas da Biologia. A proteômica diferencial possibilita a
análise quantitativa e comparativa de proteínas em amostras diferentes. A
proteômica estrutural, por outro lado, se refere à determinação de estruturas
tridimensionais de proteínas por cristalografia de raios-X e espectroscopia de
ressonância magnética nuclear (NMR). A proteômica funcional tem como objetivos
principais, a identificação e classificação de funções, atividades e interações de
todas as proteínas em um dado proteoma. Recentemente, técnicas da proteômica
têm sido utilizadas para investigar proteínas expressas diferencialmente por
amostras biológicas obtidas de pacientes, com a finalidade de identificar novos
biomarcadores que possam ser úteis no diagnóstico de doenças e monitoramento de
pacientes sob terapia. Este ramo, a proteômica clínica, poderá revolucionar a
metodologia de detecção das causas das doenças, permitindo a descoberta de
novas modalidades de tratamento e orientando o desenvolvimento de novos
medicamentos e terapias (Lau, Qing-Yu & Chiu, 2003).
Três fatos foram de fundamental importância para o desenvolvimento
tecnológico da proteômica atual: (1) o avanço das técnicas de separação e
isolamento de proteínas pela padronização dos géis para eletroforese bidimensional;
(2) a possibilidade de compatibilizar a análise de polímeros, como peptídios, com
equipamentos de espectrometria de massas, assim como seu acoplamento aos
métodos cromatográficos; (3) a melhoria de métodos de detecção, análise e
documentação de imagem e o desenvolvimento da Bioinformática, com programas
de “softwares” capazes de armazenar e analisar uma imensa quantidade de dados
(Liebler 2003; Haoudi & Bensmail, 2006).
20
11. A Eletroforese Bidimensional (2D) e a Espectrometria de Massas
A separação de proteínas por eletroforese bidimensional (2D) possibilitou a
análise de misturas complexas de proteínas, sejam de células, frações subcelulares
ou de fluídos biológicos. Descrita inicialmente por O’Farrel em 1975, as proteínas
são separadas inicialmente de acordo com seus pontos isoelétricos em um gradiente
de pH e, posteriormente, em um gel de acrilamida contendo dodecil sulfato de sódio
(SDS-PAGE), também chamado de gel de segunda dimensão. Portanto esta técnica
utiliza duas propriedades intrínsecas e independentes da proteína: sua carga e sua
massa molecular. Isso permite a obtenção de um mapa bidimensional 2D contendo
centenas e até milhares de proteínas sintetizadas expressas num determinado
momento e numa condição específica. O aperfeiçoamento desta técnica como a
utilização de tiras de poliacrilamida contendo gradientes de pH imobilizados, tem
possibilitado o aumento da resolução e a reprodução do perfil protéico em diversas
faixas de pH, inclusive em pHs básicos, embora ainda existam algumas limitações.
Dentre elas estão as dificuldades de separar proteínas extremamente básicas (pI
maior que 11), proteínas com pI abaixo de 3 e proteínas com alto poder de
agregação (Lau et al., 2003).
A Espectrometria de Massas se fundamenta na determinação da relação
massa/carga das moléculas convertidas em íons, separadas e deslocadas como
partículas em fase gasosa num campo elétrico ou num campo eletromagnético.
Previamente, entretanto, as proteínas são convertidas em peptídeos pelo tratamento
com enzimas proteolíticas (geralmente a tripsina). Um dos métodos de ionização
mais aplicados atualmente é o MALDI (ionização e dessorção a laser assistida por
matriz) e foi descrito para a análise de proteínas (Hillenkamp & Karas, 1990),
associado ao analisador de tempo de vôo de partículas ionizadas (TOF). No MALDI-
21
TOF/TOF dos peptídios (analitos) derivados da digestão tríptica de uma molécula
protéica purificada, são misturados a uma matriz (ácido α-ciano-4-hidroxinâmico
para peptídeos menores que 10kDa), criando um complexo matriz/analito sobre uma
placa especial. Esta placa é então introduzida na câmara de vácuo do espectrômetro
de massas e a análise dos peptídios é iniciada por um de feixe de laser que
transfere grande quantidade de energia para as moléculas da matriz. A energia
transferida é suficiente para promover a transição da matriz e peptídeos, do estado
sólido para o estado gasoso. A matriz é ionizada e transfere prótons para o analito.
Os peptídios ionizados, agora na fase gasosa, são submetidos a um campo elétrico
(no vácuo) no espectrômetro, onde são separados em duas seções de Tempo de
Vôo separados por uma célula de colisão, de acordo com as relações massa/carga e
pelo tempo de vôo até um detector, que gera um sinal elétrico para cada peptídio
detectado. A massa de cada peptídio é proporcional ao seu tempo de vôo e pode ser
minuciosamente calculada. Ao fim do processo, obtém-se um espectro de massas
dos peptídeos gerados, que chegou até o detector, o fingerprint do analito (Lau,
Qing-Yu & Chiu, 2003).
12. Proteoma e Imunoproteoma de Trypanosoma cruzi
Diferentes ferramentas proteômicas têm sido empregadas na identificação de
proteínas do T. cruzi. Paba et al. (2004), realizaram análise comparativa entre
formas amastigotas e tripomastigotas através da tecnologia ICAT associada à LC-
MS/MS (Cromatografia Líquida – espectrometria de massa com duplo quadrupolo),
e detectaram a expressão diferencial de 41 proteínas pelas duas formas, entre elas,
proteínas HSP 70 e também tubulinas.
22
Posteriormente, Atwood et al. (2005) avaliaram as proteínas expressas em
lisados celulares de formas amastigota, tripomastigota e epimastigota e identificaram
2.784 proteínas incluindo 30 cisteína-proteases, 212 proteínas ribosomais e 1.008
proteínas hipotéticas. Algumas dessas proteínas comuns às três formas do parasito.
A caracterização de proteínas do T. cruzi, pela eletroforese 2D, se iniciou a
partir dos estudos de Andrews, Katzin & Colli (1984), que identificaram proteínas
ácidas da superfície do parasito, pI 5,0 e 6,7, de alto peso molecular entre 70 e 120
kDa. Neste estudo, proteínas de 80 e 90 kDa com alta afinidade de ligação para
lectinas, foram detectadas em epimastigotas e em tripomastigotas, respectivamente,
e nenhuma banda de baixo peso molecular foi notificada.
Em 1986, Mc Daniel et al. analisaram proteínas de membrana e citosólicas de
diferentes cepas de formas epimastigotas de T. cruzi e evidenciaram alto índice de
conservação entre as proteínas citoplasmáticas dos parasitos, ao contrário das
proteínas de superfície que apresentaram diferenças quantitativas significativas. O
mesmo não foi observado por Ruiz-Ruano, Villalta & Lima (1991), que analisaram os
perfis de expressão de proteínas durante o processo de diferenciação de formas
tripomastigotas para amastigotas, por eletroforese 2D associada a densitometria a
laser. Esses autores detectaram expressão aumentada dos polipeptídios de massa
molecular 23, 29, 32, 33, 42 e 43 kDa. Parodi-Talice et al. (2004) foram os primeiros
a fazer uma análise proteômica mais ampla do T. cruzi no Brasil, utilizando o clone
Dm28c, chegando a identificar dezenas de proteínas, algumas de baixo peso
molecular, incluindo monômeros de tubulina na faixa de 30-34 kDa, proteínas de
choque térmico (HSP70) e prostraglandina sintases.
Faz-se interessante notar que, em nenhum destes estudos citados foi
proposto o estabelecimento de protocolos de solubilização para a utilização de
23
extratos do parasito com o objetivo de otimizar a resolução em géis 2D de
eletroforese bidimensional, como ocorre normalmente em outros sistemas celulares
(Van Deursen, Thornton & Matthews, 2003; Trovo de Marqui et al., 2006; Méchin et
al., 2003; Zuobi-Hasona et al., 2003; Stanley et al., 2003). No que diz respeito a
análise imunoproteômica de T. cruzi, ou seja, análise do perfil de reatividade de
antígenos do parasito com anticorpos específicos, através da combinação das
técnicas de eletroforese 2D bidimensional e de Western blot, pouco é citado na
literatura com exceção do trabalho iniciado por Gomes-Silva et al., (2004). Estes
autores analisaram antígenos secretados e excretados de 150 e 160 kDa de
tripomastigotas e detectaram 4 isoformas destas proteínas em fases distintas da
doença, todas reativas à amostras de soro de indivíduos chagásicos. Além disto,
observaram que, com a progressão da infecção, a isoforma de ponto isoelétrico 6,4
tornava-se imunodominante. Até o momento, não há nenhum relato sobre o estudo
imunoproteômico de T. cruzi envolvendo proteínas de baixo peso molecular,
principalmente, proteínas localizadas na região de 30 a 34 kDa.
13. Produção e utilização de anticorpos monoclonais
Em 1975, Kohler & Milstein (1975), demonstraram que era possível produzir
células híbridas capazes de secretar anticorpos com uma especificidade pré-
definida. O princípio era baseado, essencialmente, em imunizações sucessivas de
animais (camundongos) com antígenos de eritrócitos de carneiro, seguidas da fusão
de células de baço destes animais imunizados com células de mieloma . A posterior
análise dos híbridos formados demonstrou que alguns deles eram capazes de
produzir anticorpos que reagiam apenas com eritrócitos de carneiro. Tais hibridomas
resultantes desta fusão foram selecionados de acordo com sua habilidade de
24
crescimento em um meio de cultura seletivo. Com o passar do tempo de cultivo ,
células resultantes da fusão cresciam rapidamente e sua capacidade de secretar
anticorpos pôde ser detectada através de um teste sorológico. Sendo assim, cada
clone resultante dos hibridomas podia, portanto, produzir grandes quantidades de
anticorpos com afinidade para um único determinante antigênico ou epitopo.
Anticorpos monoclonais apresentam especificidade para um único epitopo
apesar de, eventualmente, ocorrerem reações cruzadas, uma vez que células do
hospedeiro e microrganismos podem apresentar epitopos homólogos em sua
estrutura antigênica macromolecular. Tais anticorpos vêm ao longo dos anos, sendo
empregados com sucesso tanto na pesquisa básica quanto aplicada, seja na
identificação de estruturas de diferentes moléculas de superfície celulares e de
organismos patogênicos, em diagnóstico laboratoriais, em imunoterapia, na
caracterização e purificação de componentes celulares e, mais recentemente, no
mapeamento de epitopos.
Mapeamento de epitopos pode ser definido como a identificação do
determinante antigênico reconhecido pela região variável de uma molécula de
anticorpo conhecida como paratopo. Este procedimento, na maioria das vezes, tem
permitido a determinação de regiões específicas antigênicas de uma proteína, que
possibilita a sua posterior utilização no desenvolvimento de vacinas e,
particularmente, em testes de imunodiagnóstico.
Uma variedade de ferramentas tem sido desenvolvida para mapeamento de
epitopos. Dentre elas podemos destacar a utilização da técnica de ELISA, em que
são utilizados como antígenos de fase sólida, peptídios sintéticos com sequências
sobrepostas (overlapping). Outra ferramenta importante empregada é a SPR
(Ressonância Plasmônica de Superfície) em conjunção com técnicas
25
imunoenzimáticas (Mullett, Lai & Yeng, 2000). Um dos mais elucidativos métodos de
estudo de interações entre anticorpos e antígenos tem sido a NMR (Ressonância
Magnética Nuclear) (Liu & Hsu, 2005). Esta técnica tem permitido a determinação da
estrutura tridimensional de complexos imunes formados em condições similares às
condições fisiológicas no que diz respeito ao pH e à força iônica. Entretanto, a
determinação da estrutura de interação é limitada pela concentração de amostra e
tempo requeridos para a análise. Informações detalhadas sobre a interação entre
resíduos Ag-Ac também podem ser obtidas pela técnica de cristalografia. Todavia,
podem ocorrer problemas na cristalização de algumas proteínas, relacionados à má
solubilização, agregação e mudanças na estrutura tridimensional da proteína
analisada (misfolding).
A Espectrometria de Massas (MS) tem sido utilizada com sucesso, no
mapeamento de epitopos, principalmente, na identificação de epitopos lineares. Isto
tem sido realizado, através do princípio de proteólise limitante de um antígeno não-
covalentemente ligado ao anticorpo. Curiosamente, moléculas de anticorpos são
resistentes à digestão por proteases na região Fab e a eficiência da digestão do
antígeno depende da presença ou da ausência de ligação ao antígeno (Parhan,
1983; Jemmerson & Patterson, 1985), de modo que as áreas de interação não são
afetadas pelas enzimas. As seqüências de anticorpo e antígenos são preservadas e
podem após o rompimento das ligações não-covalentes ocorridas entre ambos, ser
analisadas por espectrometria de massas (Suckau, Kohl & Karwart, 1990). Desta
forma, a produção de anticorpos monoclonais ligantes de proteínas altamente
específicas, tais como as proteínas de 30 a 34 kDa de T. cruzi poderá possibilitar o
mapeamento de epitopos destas moléculas.
26
14. Aplicação de anticorpos monoclonais no diagnóstico da doença de
Chagas
A década de 80 foi marcante para a produção e caracterização de anticorpos
monoclonais reativos aos antígenos parasitários e, especialmente, às moléculas
relacionadas ao T. cruzi. Tais anticorpos eram principalmente produzidos para a
identificação de moléculas de superfície e para a análise de sua importância na
biologia do parasito e na relação parasito-hospedeiro. Posteriormente, foram
utilizados para a determinação de moléculas estágio-específicas, para a verificação
da atividade protetora dos anticorpos produzidos e na medicina laboratorial.
Em 1982, Orozco et al., produziram pela primeira vez anticorpos IgG1 reativos
contra o antígeno 5 do parasito a partir da hibridização de células SP2/0 com
linfócitos esplênicos de camundongos BALB/c imunizados. O objetivo foi ampliar as
perspectivas para a aplicação destas moléculas purificadas no diagnóstico
laboratorial. Mais tarde, o mesmo grupo de pesquisadores verificou que três
anticorpos produzidos para o mesmo componente antigênico eram capazes de
reconhecer bandas específicas de 24, 43, 51 e 72 kDa, quando utilizados em testes
de imunoprecipitação precedido de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-
PAGE).
Anticorpos monoclonais reativos às formas estágio-específicas de T. cruzi
foram descritos primeiramente através das publicações de Manas et al. (1986), que
estabeleceram 5 clones produtores. Os anticorpos gerados por esses clones eram
capazes de reconhecer moléculas relacionadas ao flagelo, à membrana plasmática e
às estruturas nucleares, revelando imunoreatividade frente a antígenos de 58/60
kDa e 68 kDa. De maneira interessante, dois, destes anticorpos eram também
capazes de reconhecer antígenos de Leishmania mexicana e Leishmania infantum.
27
Já em 1989, Takasu et al. (1989), revelaram que alguns anticorpos
monoclonais produzidos reagiam contra antígenos específicos da cepa utilizada na
imunização. Isto também foi observado por Bongertz et al., em 1992. Os antígenos
identificados nestes estudos, compreendiam moléculas de 43 e 58 kDa de natureza
protéica e de 43 e 62 kDa, de natureza glicolipídica.
A aplicação de anticorpos monoclonais na pesquisa de moléculas funcionais
do T. cruzi foi realizada consistentemente por Gonzalez e colaboradores (Gonzales
et al., 1994). Estes autores desenvolveram clones produtores de anticorpos contra a
cruzipaína, considerada a principal proteinase do parasito. Nenhum dos anticorpos
produzidos neste estudo foi capaz de reagir com a enzima papaína, ainda que
apresentassem regiões homólogas importantes. Além disso, o uso desses
anticorpos para a caracterização de sítios de ligação, revelou 4 epítopos localizados
separadamente na proteína.
Também, até o presente momento, nenhum estudo relacionado ao
mapeamento de epítopos de moléculas entre 30-34 kDa de formas epimastigotas do
T. cruzi, localizados na região foi realizado, indicando a necessidade de ampliar as
investigações neste sentido.
No intuito de verificar a futura aplicabilidade de proteínas de formas
epimastigotas do T. cruzi, nesta faixa de massa molecular, para o diagnóstico da
DCH, propusemos neste presente trabalho, realizar a identificação de proteínas de
30 a 34 kDa. Lisados do parasito e frações parcialmente purificadas foram obtidos
utilizando protocolos de solubilização de amostras bem estabelecidos. As proteínas
foram inicialmente resolvidas por eletroforese 2D bidimensional e testadas quanto à
sua reatividade frente a amostras de soro de pacientes chagásicos através da
técnica de Western blot. Por fim, foi iniciada a produção de anticorpos monoclonais
28
para estas proteínas, para sua posterior utilização em processos de mapeamento de
seus epitopos.
29
Objetivos
1) Estabelecer um protocolo otimizado de solubilização de proteínas de extratos
totais e de frações protéicas de 30 a 34 kDa de Trypanosoma cruzi para melhorar a
resolução das amostras em géis de eletroforese 2D.
2) Determinar o número e a identidade de bandas protéicas entre 30 e 34 kDa de
extratos totais e de frações parcialmente purificadas de formas epimastigotas de
T.cruzi (cepa Y) resolvidas por eletroforese 2D.
3) Realizar mapeamento immunoproteômico para proteínas de 30 a 34 kDa de
formas epimastigotas de T. cruzi, frente às amostras de soro de indivíduos
chagásicos e iniciar a produção de anticorpos monoclonais reativos a estas frações
protéicas.
30
Material e Métodos
Parte I – Estabelecimento de protocolos de solubilização de proteínas
para eletroforese bidimensional (2D)
1. Obtenção de formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi
Formas epimastigotas de T. cruzi (cepa Y) foram coletadas com cinco dias
(fase logarítmica de crescimento) de cultivo em meio LIT (Liver Infusion Triptose;
Castellani et al.,1967) e os sedimentos obtidos por centrifugação inicial a 3.000 x g
Após o descarte do sobrenadante, os parasitos foram ressuspensos em solução de
PBS (tampão fosfato de sódio 0,01M, pH 7,2 com salina 0,875%) e novamente
centrifugados a 3.000 x g durante 20 minutos a 4°C. Este processo foi repetido por
três vezes. Após a última etapa de lavagem o sedimento foi pesado para a
determinação do peso úmido de parasito. A contagem dos parasitos em suspensão
em PBS contendo formaldeído a 1% foi realizada em câmara de Neubauer.
2. Obtenção de extrato citoplasmático de formas epimastigotas de
Trypanosoma cruzi
Sedimentos de formas epimastigotas de T. cruzi, contendo cerca 1x10
8
parasitos foram ressuspensos em 1,0mL de água deionizada seguido da adição de
iodoacetamida 100mM e fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) a 10mM (Sigma
Chemicals CO. St Louis, Missouri. USA). Após cinco ciclos alternados de
congelamento e descongelamento por imersão em nitrogênio líquido e em banho-
maria a 25
o
C, o homogeneizado foi centrifugado a 150 x g durante 10 minutos a 4°C
(centrífuga 5415c, Eppendorf, Hamburg, Germany). O sobrenadante foi coletado e
novamente centrifugado a 14.000 x g por 20 minutos a 4°C (centrífuga Eppendorf
31
5415c). Este material final foi denominado extrato citoplasmático total padrão de T.
cruzi (ETP), fazendo alusão à padronização prévia realizada por Teixeira et al.
(1994) e fazendo também distinção a outros extratos preparados posteriormente
neste trabalho. O extrato foi distribuído em alíquotas conservadas sob congelamento
a -20°C, até o momento de uso.
3. Obtenção das frações protéicas de 30 a 34 kDa por eletroforese
preparativa
3.1. Tratamento da amostra (ETP)
Cerca de 1,0 mL do extrato total padrão (ETP), contendo 10 a 15 mg/mL de
proteínas foi misturado (1:1, v/v) com tampão de amostra 2 x (Tris-HCl 50mM, SDS
1%, glicerol 20% e 2-mercaptoetanol a 10%) e a mistura foi aquecida a 100
o
C
durante 5 minutos. Em seguida, foi adicionado azul de bromofenol a 4%,
possibilitando a preparação do material para aplicação ao sistema de eletroforese
preparativa.
3.2. Eletroforese preparativa
Neste sistema foram preparados um gel de empilhamento a 4% de
poliacrilamida e um de separação a 12% , em um cilindro de borosilicato de 9cm de
altura e 28mm de diâmetro (Sistema de Eletroforese Preparativa, Prep Cell, Bio Rad)
(figura 2). A amostra foi aplicada e o conjunto submetido à eletroforese a 40-50 mA
e voltagem de 200-300 V durante 8 horas. Diferentes frações com faixa de massa
molecular relativa foram obtidas e coletadas. As frações eluídas fora analisadas por
SDS-PAGE e após a identificação das frações de 30 a 34 kDa, estas foram reunidas
e dialisadas em tampão de bicarbonato de amônio a 1% durante 24h a 4
o
C e mais
12 horas em água destilada, para a determinação da concentração de proteínas.
32
3. Determinação da concentração de proteínas
A concentração de proteínas do ETP e das frações obtidas por eletroforese
preparativa foi determinada com reagente BCA Protein Assay Reagent (Pierce,
Rockford, Illinois, USA) (Smith et al., 1985), utilizando como padrão, a albumina
bovina sérica (Sigma Chemicals CO. St Louis, Missouri.EUA).
4. Análise do perfil de proteínas do (ETP) e das frações obtidas a partir
de eletroforese preparativa
O perfil de proteínas do ETP, das frações obtidas diretamente do Prep Cell e
de frações concentradas por precipitação com TCA foram analisados por
eletroforese em gel de poliacrilamida, contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-
Figura 2.
Modelo esquemático do sistema utilizado para eletroforese preparativa
(Mini PrepCell Model 490) das frações protéicas de 30 a 34 kDa de formas
epimastigotas de T. cruzi.
33
PAGE) (Laemili,1970). Um volume de ETP com 30-50µg foi misturado (1:1, v/v) com
tampão de amostra 2 X (Tris 0,5M pH 6,8; SDS a 1%; glicerol a 20%;
mercaptoetanol a 0,5%) e fervido a 100°C por 5 minutos. Após centrifugação de
14.000 x g durante 10min (centrífuga Eppendorf) o sobrenadante foi submetido à
eletroforese em tampão descontínuo e gel vertical (Mini Protean II Dual Slab Cell,
Bio Rad, USA). As proteínas no gel de empilhamento (4% de poliacrilamida) foram
submetidas a uma corrente de 10mA e no gel de separação (10 ou 12% de
poliacrilamida) a 20mA. As proteínas no gel foram visualizadas por coloração com
solução de azul de Coomassie (ítem 5). O mesmo procedimento foi realizado para
avaliação do sucesso do processo de purificação parcial.
5. Coloração e análise dos geís de poliacrilamida com azul de
Coomassie
Todos os géis obtidos neste estudo, incluindo aqueles que foram utilizadas
para análise de espectrometria de massas, foram corados com solução, contendo
0,1% de azul de Coomassie G-250, etanol a 30% e ácido acético glacial a 0,5% e
imersos durante 10-14 horas. Para a descoloração dos géis, foi utilizada uma
solução de etanol 30% e ácido acético glacial 0,5%(v/v). Por fim, os géis foram
digitalizados através de softwear LabScan
TM
(Amersham Biosciences, Sweden,
atualmente GE) e os as massas moleculares relativas das bandas determinadas a
partir do softwear ImageMaster Platinum (Amersham Biosciences, Sueden).
34
6. Padronização do protocolo de solubilização de proteínas do parasito
para análise em eletroforese bidimensional
6.1. Preparo do extrato total solúvel (ETS)
Para cada seis tubos de microcentrífuga (Eppendorf), contendo cada um
deles 200µg de extrato total de formas epimastigotas, foram adicionados 100µL de
Tris-HCl 1M pH7,5; 10µL de PMSF 10mM (Sigma); 50µL de DNAse (1mg/mL) (GE
Healthcare) e 5 µL de RNAse (10mg/mL) (GE Healthcare). Os tubos foram
incubados durante 10 horas a 4
o
C e centrifugados a 14.000 x g durante 20 minutos
(centrifruga 5415c, Eppendorf) e novamente ultracentrifugados a 30.000 x g por 40
minutos a 4ºC e os sobrenadantes precipitados com ácido tricloroacético (TCA) a
10%, com incubação em banho de gelo durante 30 minutos. Após cinco etapas de
lavagem em solução de etanol-éter (1:1, v/v) e centrifugação a 14.000 x g, cada
sedimento foi solubilizado com 200µL do respectivo tampão de hidratação, cada
um deles contendo diferentes reagentes caotrópicos e detergentes conforme
descrito na tabela 1.
Tampões de Solubilização
1 2 3 4 5 6
Reagentes
Caotrópicos
Uréia 8M
Uréia 8M
Uréia 8M
Uréia 8M
Uréia 7M
Tiouréia
2M
Uréia 7M
Tiouréia 2M
Detergentes
CHAPS
4%
Triton X-100
4%
Nonidet P40
4%
-
CHAPS 4%
CHAPS 3%
ASB-14 1%
Referências
(Hebert,
1999)
(In-House)
(Carboni et
al., 2000)
(In-
House)
(Rabilloud
et al.,
1997)
(Twine, et al
2005)
Tabela 1
. Concentração dos agentes caotrópicos e de detergentes nos tampões de
solubilização das amostras.
35
Em todos os tampões foram adicionados carreadores anfólitos Pharmalytes
pH 4-7 para a estabilização do gradiente de pH ao longo das tiras de focalização
isoelétrica e DTT (65mM). Uma vez preparado cada extrato foi estocado a –20
o
C até
o momento de sua aplicação em géis de eletroforese bidimensional.
6.2. Preparo da fração 30 a 34kDa
Cerca de 1,0mL de fração protéica de 30 a 34 kDa, contendo 200µg/mL, foi
distribuído em seis diferentes tubos de microcentrífuga (Eppendorff, Hamburg,
Germany). O material foi precipitado por adição de TCA a 10% e incubação em
banho de gelo durante 30 minutos. Após centrifugação inicial de 14.000 x g, por 10
minutos, o precipitado foi ressuspenso em solução de etanol-éter (1:1, v/v) e
novamente centrifugado. O procedimento foi repetido mais quatro vezes e o
sedimento foi solubilizado em até 100µL nos mesmos tampões de hidratação
descritos anteriormente (Tabela 1). O mesmo procedimento foi realizado para o
estoque do material a -20
o
C, até o momento de sua utilização em eletroforese
bidimensional.
6.3. Análise em eletroforese bidimensional
6.3.1. Etapas de reidratação e focalização isoelétrica (FI)
Para a reidratação e focalização isoelétrica (FI), etapas da primeira dimensão,
foram utilizadas tiras de poliacrilamida de 7cm de comprimento com gradientes
imobilizados de pH 3-10 ou 4-7 “IGP Dry Strip” (GE Healthcare). Uma alíquota de
100µg do extrato total ou de uma fração protéica, obtida por determinada condição
36
de solubilização (Tabela 1), foi aplicada a uma tira de FI, recobertas imediatamente
com óleo mineral (GE Healthcare) e incubadas por 10 horas a 20
o
C. Após a
reidratação, as tiras foram submetidas à focalização no Multiphor II (GE Healthcare)
acoplado a um banho-maria a 20ºC e fonte de alimentação de voltagem EPS
3501XL (GE Healthcare). O programa para a focalização dos géis de 7cm foi o
recomendado pelo do fabricante (Tabela 2). Ao final da focalização, os géis foram
incubados a -20
o
C ou usados imediatamente.
Tabela 2. Programa para focalização isoelétrica em sistema Multiphor II – EPS 3501 XL(GE
Healthcare) das tiras de 7cm, pH 4-7.
Programa para a Focalização Isoelétrica*
Etapas Gradiente
Voltagem(V) kVh Tempo (h:min)
- - - 10:00
1 Linear 200 0,001 0:01
2 Linear 3500 2,8 1:30
3 Linear 3500 3,2-5,2 0:55-1:30
Total - 9200 6-8 2:25-3:00
*Todas as etapas foram realizadas a uma temperatura de 20
o
C, potência máxima de 5 Watts, e
amperagem de 2mA.
6.3.2. Segunda dimensão (SDS-PAGE)
As tiras foram submetidas a uma incubação inicial de 15 minutos a 20
o
C com
leve agitação, em tampão de equilíbrio (Tris-HCl 50mM; SDS a 2%; uréia 6M;
glicerol a 30% (v/v); azul de bromofenol a 0,02%), contendo 100mg de DTT/10mL,
seguida de nova incubação de mais 15 minutos, com o mesmo tampão de equilíbrio
e contendo 250mg de iodocetamida/10mL.
Ao final das etapas de equilíbrio, as tiras de FI foram sobrepostas diretamente
sobre géis de SDS-poliacrilamida a 12% (8,5cm x 6,5cm) para géis de 7cm e
37
submetidos a uma voltagem de 50V por 2:30h. A preparação do gel e dos tampões
utilizados neste procedimento seguiu as recomendações de Laemmili (1970). Os
equipamentos utilizados nesta etapa foram os mesmos utilizados no item 3. Ao final
da corrida, os géis foram corados com solução de azul de Coomassie. A imagem de
cada gel obtido foi devidamente digitalizada através de scaner (GE Healthcare) com
o auxílio do softwear LabScan
TM
(GE Healthcare). Os perfis proteômicos do extrato
total solúvel (ETS) e da fração de 30-34 KDa, foram analisados e comparados
através da utilização do softwear ImageMaster Platinum (GE Healthcare), para a
determinação da quantidade e da massa molecular e ponto isoelétrico dos spots
obtidos. Somente após este ultimo procedimento, os spots puderam ser
selecionados para a posterior análise em espectrometria de massas. Para tentar
melhorar a resolução dos spots obtidos a partir da fração protéica, a segunda etapa
da eletroforese bidimensional (segunda dimensão) foi realizada em gel de gradiente
de 17 x 14 cm, com 10 a 15% de concentração de acrilamida (Tabela 3).
38
Gel de acrilamida em gradiente de concentração
Componentes 10% 15%
Tris-HCl (pH8,8) (0,5M) 1,75mL 1,75mL
Acrilamida/Bis-acrilamida (T 1,6%) 2.29mL 3,44mL
Glicerol 0,15mL 0,75mL
SDS (1%) 0,675mL 0,675mL
H
2
O 2,41mL 0,68mL
Persulfato de Amônio(10%) 0,675mL 0,65mL
TEMED 3,8µL 3,8 µL
Parte II – Quantificação e identificação de proteínas de 30 a 34 kDa
através de Espectrometria de Massas (MS)
7. Preparação dos spots protéicos para análise por Espectrometria de
Massas
Cada spot do extrato total ou das frações protéicas, localizado na região entre
30-34 kDa pelo softwear e/ou por visualização direta, foi cortado do gel e transferido
individualmente para um microtubo (Eppendorf), previamente lavado 3 vezes com
metanol e uma vez com água ultrapura (Mili Q) . Em cada tubo contendo o
fragmento de gel foram adicionados 60µL de uma solução de bicarbonato de amônio
(NH
4
HCO
3
) 50mM (pH 7,8), seguido de 40µL de acetonitrila (ACN) a 100%. O
material foi agitado em vortex durante 10 segundos e sonicado durante 5 minutos. A
Tabela 3
. Concentração dos componentes utilizados em gel de SDS-PAGE em gradiente
de concentração de 10 a 15%.
39
solução foi descartada e todo o procedimento foi repetido por mais 3 vezes até o
desaparecimento total do corante de cada fragmento de gel. Ao final, cada gel foi
desidratado com 200µL de acetonitrila a 100% e incubado durante 20minutos em
banho de gelo. Novamente o sobrenadante foi descartado e os fragmentos de gel
desidratados em Speed Vac durante 20 minutos.
8. Digestão tríptica das proteínas do ETS e fração 30 a 34 kDa
Em cada tubo contendo um spot excisado do gel, foram adicionados 4µL de
solução de tripsina (80ng/mL em NH
4
HCO
3
25mM pH 7,8) e a mistura foi incubada
durante 30 minutos em banho de gelo. A cada tubo foi adicionado um volume de
solução de NH
4
HCO
3
25mM, pH 8,0 suficiente para cobrir o fragmento, seguido de
incubação a 37ºC por 12 horas. O sobrenadante foi transferido para outro tubo
previamente lavado e o fragmento de gel foi tratado com 50µL de solução de TFA
(ácido trifluoroacético) a 5% e ACN a 50%, em um banho sonicador durante 5
minutos e, então, agitado em vortex durante 30 minutos a temperatura ambiente. O
sobrenadante foi coletado e adicionado ao anteriormente obtido e a extração foi
repetida mais uma vez. O volume dos sobrenadantes foi reduzido até 5µL em Speed
Vac e posteriormente estocados a –20
o
C para a análise.
9. Análise de peptídeos em Espectrometria de Massas
Para cada 0,5µL do sobrenadante concentrado contendo os peptídeos
resultantes da digestão tríptica foram adicionados 0,5µL de matriz CHCA (ácido-α
ciano-4-hidroxicinâmico, Sigma; 10µg de matriz/µL de TFA a 0,1% em ACN a 50%)
e a mistura foi aplicada sobre a placa metálica do MALDI-TOF/TOF (4700 Explorer
Proteomics Analyzer, Applied Biosystem) e deixada secar à temperatura ambiente.
40
Para calibração foi utilizada uma mistura de peptídios de massas conhecidas
(Calmix 1 e 2, Applied Biosystems) aplicada na mesma placa. A placa foi introduzida
no MALDI-TOF/TOF e às razões massa/carga dos peptídeos, juntamente com as
seqüências obtidas, foram inseridas em programa computadorizado de
busca(htttp://www.Matrixscience.com/cgi/search_form.pl.FORMVER=2&SEARCH=M
IS) – MATRIX SCIENCE, utilizando os parâmetros conforme a tabela 4.
41
Tabela 4. Parâmetros utilizados de busca em banco de dados, visando a identificação da
estrutura primária dos peptídeos analisados em MALDI-TOF
/TOF
Taxonomy: All entries
Type of search: MS/MS Íon search
Enzyme:Trypsin
Fixed Modifications: Carbamidomethyl
Variable modifications:Oxidation (M)
Mass values:Monoisotopic
Peptide charge: +1
Peptide tol.: -/+ 0.3 Da
Instrument: Maldi-TOF/TOF
Overview:Report top 50 hits
Parte III- Mapeamento immunoproteômico das frações protéicas de 30 a
34 kDa de formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi e
produção de anticorpos monoclonais.
10. Estratégia utilizada no estudo de mapeamento protéico com
amostras de soro anti-Trypanosoma cruzi
Para a determinação dos spots imunodominantes de formas epimastigotas de
T. cruzi específicos para anticorpos anti-T.cruzi. foram combinadas as técnicas de
eletroforese bidimensional e Western blot. Para isto, membranas de nitrocelulose
contendo as proteínas de extrato total solúvel separadas por SDS-PAGE (item 11),
foram incubadas com seis amostras de soro de indivíduos chagásicos, pertencentes
a 3 áreas endêmicas do Brasil. Estas áreas apresentam soroprevalências distintas
de 12,6%, 9,5% e 5,9%. Os indivíduos pertencentes à estas áreas também
apresentam diferenças nas manifestações clínicas da doença. Em Virgem da Lapa,
apontam como as principais formas da doença, a cardíaca e digestiva, enquanto que
no sertão dos estados da Paraíba e no Piauí são encontrados comumente,
indivíduos com a forma indeterminada da doença. Todos os indivíduos foram
42
submetidos a estudos imunológicos para a pesquisa de anticorpos específicos anti-
T. cruzi que envolveram a utilização das técnicas de HAI, IFI o teste LIA, 3 ELISAs
comerciais e um teste ELISA in-house produzido em nosso laboratório (Oelemann et
al., 1998). Nenhum dos indivíduos estava sob tratamento no momento da coleta de
sangue. Estas amostras de soro fazem parte da coleção de 1067 amostras mantidas
no Laboratório de Sorologia e caracterizadas em estudos anteriores (Oelemann et al.
Oelemann et al., 1999).
11. Identificação de proteínas imunoreativas entre 30 e 34 kDa através de
eletroforese bidimensional e Western blot
Cerca de 100µg de proteínas de ETS resolvidas em géis bidimensionais,
foram transferidas para membranas de nitrocelulose de 0,2 µm de porosidade (Bio
Rad), na câmara de eletrotransferência (Mini Trans Blot Cell, BioRad) com tampão
apropriado (Tris 25mM, glicina 192mM, metanol a 20% pH8,3) a 400 mA por 1 hora
a 25
o
C. As membranas foram lavadas três vezes, por 5 minutos, com solução de
lavagem (Tris-HCl 0,02M; NaCl 0,5%; Tween 20 0,2%) e, então, incubadas em
tampão de bloqueio Tris-HCl 0,025M; leite desnatado Molico/Nestlé a 5%; Tween 20
a 0,2%) por 60 minutos, sob agitação, a 20
o
C.
Cada membrana foi incubada com uma amostra de soro de indivíduo
chagásico, diluído 1:100 em tampão de bloqueio por 60 minutos e, então, lavada 5
vezes por 5 minutos, como descrito acima. Em seguida, foram incubadas durante 60
minutos com 10mL de uma solução de anti-IgG humana conjugada à fosfatase
alcalina (Sigma Chemicals CO. St Louis, Missouri.EUA) diluída 1:5.000 em tampão
de bloqueio. Após mais 5 etapas de lavagem, os complexos conjugado-IgG da
amostra imobilizados nas membranas, foram detectados com a solução de 100µL de
BCIP (bromo 4-cloro3-indol-fosfato, a 150mg/10mL de dimetilformamida; Sigma
43
Chemicals CO. St Louis, Missouri.EUA) 100µL de NBT (azul de nitrotetrazol, a 300
mg/10mL de dimetilformamida; Sigma Chemicals CO. St Louis, Missouri.EUA) e
10mL de tampão (Tris-HCl 100mM pH 9,5; MgCl
2
5mM). As membranas
permaneceram nesta solução reveladora a 25
o
C até o momento do aparecimento
dos spots com coloração violeta, devido à reação da fosfatase alcalina com
BCIP/NBT. Finalmente, as membranas foram lavadas por 30 minutos em água
destilada e deixadas para secar à 20
o
C.
12. Produção de anticorpos monoclonais
A produção de anticorpos monoclonais foi realizada no laboratório CHRON
EPIGEN (BIORIO - Universidade Federal do Rio de Janeiro), a partir da imunização
de camundongos Balb/c isogênicos com 8 semanas de idade. No 1
o
dia, os animais,
foram inoculados intraperitonealmente, com 100µg de extrato total solúvel (ETS) de
formas epimastigotas de T. cruzi/animal, misturados 1:2 (v/v) com adjuvante
completo de Freund (ACF). Nova imunização foi realizada no 14
o
dia com 100µg de
fração 30 a 34 kDa, agora com adjuvante incompleto de Freund (AIF). No 21
o
dia,
cada animal foi novamente imunizado por via endovenosa com 0,1mL, contendo
50µg do ETS diluído em PBS estéril (v/v). O mesmo procedimento foi repetido no 28
o
dia, de forma a preparar os animais para o processo de esplenectomia. Amostras de
sangue foram obtidas de cada animal antes e após a última imunização, para a
obtenção de soro pré-imune e imune, respectivamente. Também foram obtidas
amostras de soro de camundongos imunizados somente com extrato total e
exclusivamente com a fração protéica. Os hibridomas foram preparados a partir da
fusão de células esplênicas, de camundongos Balb/c imunizados, obtidas como
descrito acima, e células de mieloma SP2/0 não secretoras de imunoglobulina ou
44
cadeia leve κ ou λ. Os camundongos cujos soros apresentaram maiores
absorbâncias no teste de ELISA para a detecção de imunoglobulinas totais foram
selecionados para a esplenectomia.
13. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
O teste de ELISA para a detecção de anticorpos anti-fração 30 a 34 kDa foi
elaborado com base no teste de ELISA in-house (Teixeira et al., 1994). Placas de
poliestireno (Corning, Nunc Maxi-sorb 16, Immunolon) de 96 poços foram
sensibilizadas com EST em tampão bicarbonato (50mM, pH 9,6) (500ng/poço) e
incubadas durante 1 hora a 37
o
C, seguido de incubação por 10-14 horas a 4°C. As
placas sensibilizadas foram lavadas três vezes com solução de lavagem (PBS;
Tween 20 0,3%) e bloqueadas com solução bloqueadora (PBS; Tween 20 0,3%;
leite desnatado Molico/Nestlé 5%) durante 30 minutos a 37°C. Os sobrenadantes
dos hibridomas foram adicionados às placas e incubadas durante 1 hora a 37°C e
mais 10-14 horas a 4
o
C. Após seis etapas de lavagem as placas foram incubadas
durante 1 hora a 37°C com anti-Ig polivalente de camundongo ligada a peroxidase
(Sigma Chemicals CO. St Louis, Missouri, EUA) numa diluição de 1:10.000 em
tampão de bloqueio, seguida por mais seis etapas de lavagem. Os complexos
imunes formados foram revelados pela adição de 100µL/poço de solução reveladora
(TMB-Tetrametilbenzidina/H
2
O
2
) em tampão citrato/fosfato pH 5,0 durante 20
minutos em câmara escura à temperatura ambiente. A reação foi bloqueada com
50µL de H
2
SO
4
2N e a absorbância medida em espectrofotometria a 450 nm. Em
cada placa, dois poços foram utilizados como controle positivo (CP), dois como
controle negativo (CN) e um como branco (B). Os sobrenadantes foram
considerados positivos para a detecção de anticorpos anti-gp 30 a 34 kDa de T. cruzi
45
quando as absorbâncias foram superiores a 0,2. Os sobrenadantes positivos foram
confirmados através da técnica de Western blot.
14. Western blot
Proteínas separadas por SDS-PAGE foram transferidas para membranas de
nitrocelulose de 0,2 µm (Bio Rad) na câmara de eletrotransferência (Mini Trans Blot
Cell, Bio Rad) com tampão apropriado (Tris 25mM, glicina 192mM, metanol a 20%
pH8,3) a 400 mA por 1 hora a 4
o
C (Teixeira et al., 1994). As membranas foram
lavadas três vezes, por 5 minutos, com solução de lavagem de Tris-HCl 0,02M; NaCl
0,5%; Tween 20 0,2%) e, então, incubadas em tampão de bloqueio (Tris-HCl
0,025M; leite desnatado Molico/Nestlé a 5%; Tween 20 a 0,2%) por 60 minutos, sob
agitação, a 25
o
C.
Na etapa seguinte, as membranas foram incubadas, separadamente, com
amostras de soro de camundongos imunizados com extrato total padrão (ETP) e
com a fração protéica diluídas a 1:100 em tampão de bloqueio por 60 minutos e,
então, lavadas 5 vezes por 5 minutos, como descrito acima. Em seguida, cada
membrana foi incubada por 60 minutos com 10mL de uma solução de anti-IgG de
camundongo conjugada a fosfatase alcalina (Sigma Chemicals CO. St Louis,
Missouri.EUA) diluída 1:10.000 em tampão de bloqueio. Após mais 5 etapas de
lavagem, os complexos conjugado-IgG imobilizados na membrana, foram
detectados com a solução de 100µL de BCIP (bromo 4-cloro3-indol-fosfato, a
150mg/10mL de dimetilformamida; Sigma Chemicals CO. St Louis, Missouri.EUA)
100µL de NBT (azul de nitrotetrazol, a 300 mg/10mL em dimetilformamida; Sigma
Chemicals CO. St Louis, Missouri.EUA) e 10mL de tampão (Tris-HCl 100mM pH 9,5;
MgCl
2
5mM). As membranas permaneceram nesta solução reveladora a 20
o
C até o
46
momento do aparecimento de bandas de coloração violeta, devido à reação da
fosfatase alcalina com BCIP/NBT. As membranas foram lavadas por 30 minutos em
água destilada e deixadas para secar à temperatura ambiente.
47
Resultados
Parte I – Obtenção e análise de frações protéicas de Trypanosoma cruzi
e estabelecimento de protocolos para solubilização de
proteínas de extrato total e na fração de 30 a 34 kDa
1. Obtenção e análise das frações protéicas de 30 a 34 kDa obtidas por
eletroforese preparativa
Para a obtenção de frações parcialmente purificadas contendo proteínas de
massa molecular entre 30 e 34 kDa, utilizamos o sistema de eletroforese preparativa
em condições desnaturantes. As frações eluídas foram reunidas, os eluatos
dialisados foram concentrados e a amostra foi analisada por SDS-PAGE, para
comparar as bandas eluídas com o prefil protéico do extrato total padrão (ETP). A
figura 3, mostra as proteínas de 30 a 34 kDa nas frações purificadas (figura 3,
colunas 8 e 9). Cada etapa de fracionamento resultou em aproximadamente 0,2
.mg de fração protéica/mL em um volume final de 1,0 mL, indicando a
obtenção de rendimento em torno de 2%, quando 10mg de extrato total do parasito
foram utilizados. A localização no gel e a intensidade das bandas de 30 a 34kDa
eluídas e concentradas (figura 3, coluna 3) foram comparadas às bandas protéicas
do ETP (figura 3, coluna 2). Desta forma, a eletroforese preparativa possibilitou a
obtenção da fração protéica de 30 a 34kDa de formas epimastigotas de T. cruzi,
para a sua utilização nos experimentos posteriores deste estudo.
48
2. Estabelecimento de protocolo de solubilização de proteínas de
formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi
Com o intuito de otimizar a resolução de proteínas de extratos totais e frações
específicas de T. cruzi em géis de eletroforese bidimensionais, diferentes protocolos
utilizados anteriormente para solubilização de proteínas do parasito (Parodi-Talice et
al., 2004) e de outras amostras biológicas foram comparados (van Deursen,
Thornton & Matthews, 2003; Trovo de Marqui et al., 2006; Méchin et al., 2003; Zuobi-
Hasona et al., 2003; Stanley et al., 2003). Neste estudo foram utilizados seis tipos de
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 3
. Gel de poliacrilamida a 10%, (SDS-
PAGE) mostrando as frações
parcialmente purificadas por eletroforese preparativa. ETP (coluna 2); frações
eluídas diretamente do sistema Prep Cell
(colunas) 4 a 10) e frações concentradas
com o auxílio do “Speed Vac” (coluna 3) As (col
unas) 8 e 9 (contém as frações
protéicas de 30 a 34 kDa.
kDa
198-
131-
82-
40-
30-
49
tampões de solubilização que se diferenciavam na composição de detergentes e de
reagentes caotrópicos (Tabela 1). Extratos totais de formas epimastigotas de T. cruzi
foram analisados por eletroforese bidimensional em géis de 7cm pH 4-7 (figura 4),
seguidos de coloração com azul de Coomassie. A análise dos spots foi realizada
com o auxílio do softwear ImageMaster Platinun (GE Healthcare) e também
visualmente. A utilização do tampão 1 possibilitou a resolução de 215 spots, 11
localizados na região de 30 a 34kDa (figura 4a); com o tampão 2, foi possível
resolver 265 spots, 8 na região de 30 a 34kDa (figura 4b); com o tampão 3 (figura
4c) obteve-se a resolução de 169 spots, 9 localizados na região selecionada; com o
tampão 4 (figura 4d), 189 spots em todo o gel e 8 na região de 30 a 34kDa; com o
tampão 5, 297 spots no total e 10 na região selecionada (figura 4e). Com o
emprego do tampão 6, em que foram utilizados como detergentes CHAPS em
conjunto do ASB-14, foi possível distinguir 312 spots em todo o gel e 34 na região
selecionada (figura 4f). Todos estes valores estão listados na tabela 5. Portanto,
dentre os tampões utilizados, aquele que apresentou o melhor poder de
solubilização de proteínas totais de formas epimastigotas de T. cruzi, permitindo a
otimização de sua resolução, foi aquele em que foram utilizados em conjunto, os
detergentes CHAPS e ASB-14 (tampão 6).
50
Tabela 5. Número de spots protéicos de amostras de ETS de Trypanosoma cruzi e frações
preparadas em diferentes tampões de solubilização obtidos a partir de em géis de
eletroforese bidimensional.
Tampão Extrato Total
Extrato Total
Proteínas de 30-34 kDa
Fração
Proteínas de 30-34 kDa
1 215 11 8
2 265 8 8
3 169 9 9
4 189 8 -
5 297 10 8
6 312 34 40
No que diz respeito às frações de 30 a 34 kDa, uma melhoria na resolução
também ocorreu variando-se o tampão (figura 5). O tampão 1 possibilitou a
resolução de 8 spots (figura 5a); o tampão 2, 8 spots (figura 5b); o tampão 3 (figura
5c), 9 spots; o tampão 4 (figura 5d), spots não-detectados; o tampão 5, 8 spots
(figura 5e), enquanto que o tampão 6, 40 spots (figura 5f). Mais uma vez, um maior
número de spots da fração protéica de 30 a 34 kDa foi observado quando as frações
foram utilizados em conjunto com os detergentes CHAPS e ASB-14.
51
A
F
Figura 4
. Géis de eletroforese bidimensional do ETS de T. cruzi
(cepa y), preparado em
diferentes tampões. O gel F demostrou a melhor resolução quando o extrato foi
solubilizado na presença do detergente ASB-14.
A
D
C
4
4
7
7
kDa
198-
131-
82-
40-
30-
17-
KDa
198-
131-
82-
40-
30-
17-
4
4
7
7
kDa
198-
131-
82-
40-
30-
17-
kDa
198-
131-
82-
40-
30-
17-
B
kDa
198-
131-
82-
40-
30-
17-
kDa
198-
131-
82-
40-
30-
17-
F D
52
A B
kDa
198-
131-
82-
40-
30-
17-
kDa
198-
131-
82-
40-
30-
-
C D
kDa
198-
131-
82-
40-
30-
17-
kDa
198-
131-
82-
40-
30-
17-
E F
4
4
7
7
kDa
198-
131-
82-
40-
30-
17-
kDa
198-
131-
82-
40-
30-
17-
4
4
7
7
Figura 5
. Géis de eletroforese bidimensional da fração 30 a 34kDa de T. cruzi
(cepa y),
solubilizada em diferentes tampões. O gel F demostrou a melhor resolução quando o extrato
foi solubilizado na presença do detergente ASB-14.
53
3. Separação de proteínas da fração 30 a 34 kDa em gel de gradiente de
poliacrilamida
Com o objetivo de melhorar a resolução das frações parcialmente purificadas,
foram preparados géis de gradiente de 10 a 15% de acrilamida de 14 x14cm para
separar as proteínas focalizadas em tiras de 11cm e gradiente de pH 4-7. Os
resultados demonstraram que o emprego do gel em gradiente não foi capaz de
melhorar a resolução dos spots, uma vez que 37 spots também foram visualizados
empregando este sistema (figura 6).
Parte II – Identificação de proteínas na região de 30 a 34 kDa através de
espectrometria de massas (MALDI-TOF/TOF)
As evidências de melhoria da resolução dos géis 2D com a utilização do
tampão 6, permitiu o estabelecimento deste protocolo como o mais indicado entre
todos aqueles testados neste estudo para solubilização das proteínas das diferentes
Figura 6. Gel 2-DE em gradiente de 10 a 15% de poliacrilamida da fração 30 a 34kDa.
4
4
7
7
54
amostras. Os géis obtidos a partir deste procedimento de solubilização foram
separados e os spots detectados com o auxilio do softwear Image Master Platinum
(GE HealthCare) e conferência visual (figura 7). Os spots localizados na região
entre 30 e 34 kDa detectados em cada gel foram cortados e analisados através de
MS, após digestão com tripsina. A análise dos peptídios trípticos derivados de
alguns spots com o MALTOF/TOF possibilitou a sua identificação da proteína
correspondente a partir da comparação em banco de dados (MASCOT/MATRIX
SCIENCE). Para géis contendo extrato total (ETS), 14 spots puderam ser
identificados (Tabela 6), enquanto que para géis contendo exclusivamente a fração
protéica, 3 spots foram identificados. Três das 14 proteínas do ETS foram
identificadas no banco de dados do Trypanosoma cruzi, enquanto que apenas uma
proteína dentre as 4 da fração protéica foi identificada no banco de dados do
parasito. As enzimas catepsina B (spots 48 e 50 ) e arginase (spots 61 e 62) foram
identificadas em spots vizinhos, cada par com o mesmo valor de Mr e valores
ligeiramente distintos de pI, sugerindo que sejam isoformas da mesma proteína
(Figura 7a). Estas proteínas encontradas no banco do T. cruzi tinham como
características funcionais mais comuns à participação no metabolismo de ácidos
aminados, ácidos nucléicos e proteínas (Tabela 8). Nenhuma delas foi utilizada, até
o momento, para fins de diagnóstico imunológico da doença.
55
4
4
7
7
4
4
7
7
A
B
Figura 7
. Géis de eletroforese bidimensional (2D) do extrato total solúvel (a) e fração 30 a
34 kDa (b). Os spots foram detectados, cortados e os peptídios trípticos resultantes foram
analisados por MALDI-TOF/TOF.
56
Spot gel
ETS
Identificação
da Proteína
Identificação
de Acesso
NCBI
Origem Score Seqüência de peptídeos
43
carbonic
anhydrase II
NP848667 Bos taurus 65 K.AVVQDPALKPLALV
YGEATSR.R
87 permease,
putative family
protein
EAS00447 Tetrahymena
thermophila
30 R.VNEILKDYR.A
48 cathepsin
B-like
protease
AAL06327 Trypanosoma
cruzi
70 .FDAGEAWPECPTVTE
IR.D
49 hypothetical
protein
SMU.1542c
NP721885 Streptococcus
mutans
UA159
21 R.MMINLDGEYGGD
APIELR
50 cathepsin
B-like
protease
AAL06327 Trypanosoma
cruzi
21 K.HVAGIFLGGHAVR.I
92 transcriptional
regulator,
XRE
YP551791 Polaromonas
sp. JS666
65
MNLAAAFKSE IARV
53 lipoprotein NP326340 Mycoplasma
pulmonis
UAB CTIP
16 R.IATFKIWITEK.D
57 peptidase
M20/M25/M40
XP811760 Trypanosoma
cruzi
32 K.SNAHGPNEFLHVPF
TK.G
58 Permease EAS00447 Tetrahymena
thermophila
SB210
30 R.VNEILKDYR.A
61 Chain A,
Arginase
Superfamily
2A0MA Trypanosoma
Cruzi
95 K.LYDAGDITASTLEEA
HEK.L
62 Chain A,
Arginase
2A0MA Trypanosoma
Cruzi
58 R.EEDADIVIIGFPYDE
GCVR
46 DNA-directed
RNA
polymerase
subunit H
Q58443 M. jannaschii 24 K.VTDHILVPK.H
45 permease,
putative
family protein
EAS00447 Tetrahymena
thermophila
30 R.VNEILKDYR.A
44 hypothetical
protein
CAE36077 Bordetella
parapertussis
27 R.IILLPELALPR.T
Tabela 6.
Proteínas da fração 30 a 34 kDa separadas por gel 2D e identificadas através de
espectrometria de massas (MALDI-TOF/TOF).
57
Spots
Gel
Fração
30/34
kDa
Identificação
da Proteína
Identificação de
Acesso
NCBI
Origem Score Sequência de peptídeos
1 methylthioaden
osine
phosphorylase
XP816536
Trypanosoma
cruzi
71 R.HGVGHVLNPSEVNY
R.A
16 hypothetical
protein
MADE_08896
ZP0110939
Alteromonas
macleodii
20 R.VKPQLDNAHK.V
17 Unnamed
protein product
CAF95556 Tetraodon
nigroviridis
29 R.HIDVAADVPLLYR.Y
Tabela 8. Caracterização funcional das proteínas identificadas através de MALDI TOF/TOF
e sua utilização em testes de imunodiagnóstico para a DCH.
Spots (Gel)
Proteína Caracterização
Funcional
Epitopos Utilizados em
Imunodiagnóstico
1 (Fração
30/34kDa)
methylthioadenosine
phosphorylase
Metabolismo de
ácidos nucléicos
Não
48 (ETS) cathepsin B-like protease
Metabolismo de
proteínas
Não
50 (ETS) cathepsin B-like protease
Metabolismo de
proteínas
Não
57 (ETS) peptidase M20/M25/M40
Metabolismo de
ácidos aminados
Não
61 (ETS) Chain A, Arginase
Metabolismo de
ácidos aminados
Não
62 (ETS) Chain A, Arginase
Metabolismo de
ácidos aminados
Não
Tabela 7
. Identificação de Proteínas da fração de 30 a 34 kDa identificadas por de
espectrometria de massas (MALDI
-
TOF/TOF)
58
Parte III - Mapeamento imunoproteômico da fração de 30 a 34 kDa de
formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi
Para avaliar a freqüência de reatividade de moléculas de 30 a 34 kDa de
T.cruzi, iniciamos um estudo de mapeamento imunoproteômico de extratos totais de
formas epimastigotas (cepa Y) de T. cruzi, frente a seis amostras de soros de
indivíduos chagásicos oriundos de três áreas endêmicas do Brasil. Com esse
objetivo, membranas de nitrocelulose contendo proteínas obtidas através da
transferência de géis bidimensionais foram individualmente incubadas com soro de
paciente chagásico, seguido de adição de conjugado (figura 8). Todas as seis
amostras de soro utilizadas neste estudo reagiram positivamente para proteínas
entre 30 e 34kDa, demonstrando mais uma vez a alta freqüência de reatividade
destas moléculas. Entretanto, o perfil de reatividade dos spots na região de 30 a 34
kDa se mostrou heterogêneo frente às seis amostras de soro, reagindo
preferencialmente com moléculas focalizadas entre os pH 5 e 5,8. O alinhamento
entre as membranas de 2D e o gel de extrato total solúvel (EST) revelou 100% de
freqüência de reatividade para o spot 55, cuja análise por espectrometria de massas
ainda não pôde ser realizada.
O paciente 1 (figura 8a) apresentou reatividade para 12 spots localizados na
região de 30 a 34kDa. O paciente 2 (figura 8b), reatividade para 15 spots. O
paciente 3 (figura 8c), 9 spots. O paciente 4 (figura 8d), 8 spots. O indivíduo 5
(figura 8e), 4 spots e o indivíduos 6, 9 spots (figura 8f). Os resultados estão
descritos na tabela 9.
59
Figura 8
. Western blot de extrato total de formas epimastigotas de T. cruzi.
frente às amostras de soro de indivíduos chagásicos. Proteínas
foram submetidas à 2-DE (géis 7cm-pH 4-
7) e transferidas para membrana de nitrocelulose. A (amostra 1), B (amostra 2), C (amostra 3), D
(amostra 4), E (amostra 5) e F (amostra 6). Os spots circulados são aqueles que foram reativos para todas as amostras analisadas.
60
Figura 8
. Western blot de extrato total de formas epimastigotas de T. cruzi. frente às amostras de soro de indivíduo
s chagásicos. Proteínas
foram submetidas à 2-DE (géis 7cm-pH 4-
7) e transferidas para membrana de nitrocelulose. A (amostra 1), B (amostra 2), C (amostra 3), D
(amostra 4), E (amostra 5) e F (amostra 6). Os spots circulados são aqueles que foram reativos para todas as amostras analisadas.
61
Figura 8
. Western blot de extrato total de formas epimastigotas de T. cruzi.
frente às amostras de soro de indivíduos chagásicos. Proteínas
foram submetidas à 2-DE (géis 7cm-pH 4-
7) e transferidas para membrana de nitrocelulose. A (amostra 1), B (amostra 2), C (amostra 3), D
(amostra 4), E (amostra 5) e F (amostra 6). Os spots circulados são aqueles que foram reativos para todas as amostras analisadas.
62
Tabela 9. Números de spots protéicos do ETS de formas epimastigotas de
Trypanosoma cruzi. que reagiram com amostras de soro de indivíduos chagásicos
oriundos de MG – Minas gerais; PB – Paraíba; PI – Piauí.
Soro de paciente
chagásico
Número de spots reativos
na região de 30 a 34 kDa
1 (MG) 12
2 (MG) 15
3 (PB) 9
4 (PB) 8
5 (PI) 4
6 (PI) 9
Neste estudo, também iniciamos a produção de anticorpos monoclonais para
a fração protéica de 30 a 34 kDa. Na figura 9 vê-se que camundongos BALB/c
imunizados exclusivamente com a fração protéica são capazes de reagir
especificamente com proteínas nesta faixa de massa molecular (figura 9b),
enquanto que camundongos imunizados com extrato total de T. cruzi reagiram com
um número significativamente diversificado de spots (figura 9a) Os resultados deste
último experimento (figura 9b) concordam com os mapas proteômicos na figura 8,
uma vez que as moléculas reativas encontraram-se nas mesmas regiões.
63
Figura 9. Westernblot
de membranas de nitrocelulose contendo proteínas de ETS
separadas por 2-DE frente a amostr
a de soro de Camundorngo BALB/c imunizados
com extrato total de T cruzi epimastigotas (A) e com fração 30 a 34kDa de T. cruzi (B).
kDa
198-
131-
82-
40-
30-
kDa
198-
131-
82-
40-
30-
A
B
64
Com o objetivo de produzir anticorpos monoclonais para futuramente utilizá-
los no estudo de mapeamento dos epítopos relativos a fração de 30 a 34 kDa,
camundongos BALB/c foram inicialmente imunizados com extratos total (ETP),
seguido de uma segunda imunização com fração protéica de 30 a 34 kDa. As fusões
realizadas resultaram até o momento na produção de seis hibridomas (tabela 10),
dos quais dois foram selecionados para a clonagem. A fusão para o hibridoma 7C6
resultou em 4 sobrenadantes reagentes a extrato total do parasito, enquanto que o
hibridoma 8C1 resultou em 23 sobrenadantes positivos. Estas células resultantes
foram estocadas até o momento de sua utilização.
Hibridoma Número de cavidades
cultivadas
Número de sobrenadantes
com anticorpos específicos
7C6 96 4
8C1 384 23
A triagem dos sobrenadantes dos hibridomas reativos foi realizada
inicialmente, através do teste de ELISA, utilizando como antígeno, extrato total de
formas epimastigotas. Posteriormente, estes sobrenadantes foram analisados
através da técnica de Western blot. As absorbâncias encontradas no teste de ELISA
variaram entre 0,16 e 0,57, com maior absorbância para os hibridomas 3A3 e 8C1,
respectivamente (figura 10). Quando analisados através do Western blot, cujas
Tabela 10
. Obtenção de
hibridomas obtidos pela fusão de células de mieloma SP2/0 e
células esplênicas de camundongos BALB/c imunizados com extrato total de formas
epimastigotas de T. cruzi
65
membranas foram sensibilizadas com extrato total de formas epimastigotas, a
reatividade foi positiva para os 6 hibridomas, ressaltando suas variabilidades de
reatividade (figura 10). Somente os sobrenadantes dos hibridomas 7C6 e 8C1 que
reagiram positivamente com a fração de 30 a 34 kDa foram selecionados para a
clonagem (figura 10, linhas 5 e 7).
CP CN 5A1 7D2 7C6 3A3 8C1 1D3
0,20 0,22 0,23 0.30 0,57 0,16
Figura 10. Immunoblotting
dos hibridomas obtidos a partir da fusão de células SP2/0 e células
esplênicas de camundongos imunizados com extrato total de formas epimastigotas de T.cruzi
.
Os hibridomas 7C6
e 8C1 foram selecionados para clonagem e reclonagem , conforme os
resultados de suas absobâncias (D.O.) observadas no teste de ELISA e de sua capacidade de
reconhecimento das bandas de 30 e 34kDa. CP (soro de camundongo imunizado
com Extrato
total), e CN (soro de camundongo pré-imune).
34kDa
30kDa
1 2 3 4 5 6 7 8
66
Discussão
A detecção de anticorpos específicos anti-Trypanosoma cruzi através da
aplicação de técnicas sorológicas é de grande importância no diagnóstico da
infecção chagásica. O diagnóstico parasitológico apresenta grandes limitações e o
diagnóstico clínico torna-se difícil, devido à elevada percentagem de indivíduos
apresentando a forma indeterminada da doença. O diagnóstico sorológico, por sua
vez, tem como características a facilidade de execução e a possibilidade de fornecer
dados e informações de caráter diagnóstico com rapidez, variando de acordo com a
técnica utilizada, de minutos a algumas horas. Além disso, no que diz respeito a
doença de Chagas (DCH), a aplicação do diagnóstico sorológico se beneficia do fato
da possibilidade dos anticorpos aparecerem ainda na fase aguda da infecção e
persistirem continuamente ao longo de toda a fase crônica (Araújo, Heilman & Tighe,
1984), Desta forma, a detecção de anticorpos anti-T. cruzi é o método de escolha
para o diagnóstico laboratorial da DCH, na fase crônica. Contudo, a aplicação de
métodos de imunodiagnóstico deve ser apoiada na produção e padronização de
testes altamente confiáveis, uma vez que resultados falso-negativos e falso-positivos
podem resultar em infecções pós-transfusionais e problemas de caráter pessoal,
respectivamente.
Na busca de testes sorológicos com alta especificidade e sensibilidade, tem-
se tentado evitar variações nas preparações antigênicas e diferentes lotes do
mesmo reagente, que podem levar a diferenças significativas na reatividade os
testes empregados (Luquetti, 1990). Nos últimos anos, no Brasil e no exterior,
diferentes testes comerciais têm sido comercializados por várias empresas, mas
poucos estudos de avaliação destes testes, utilizando painéis sorológicos
67
heterogêneos têm sido publicados (Ferreira et al., 1991, Oelemann et al., 1998,
Umezawa et al., 1999). Paralelamente a estes problemas, ainda não existe um teste
comercial confirmatório para a DCH, excluindo os casos duvidosos, gerando
prejuízos pessoal e social consideráveis.
Os antígenos empregados nos testes geralmente incluem células íntegras,
extratos brutos, extratos purificados ou semi-purificados. Entretanto, nos últimos
anos, tem sido discutido e preconizado a utilização de frações imunodominantes do
parasito. A busca pela otimização dos índices de especificidade dos testes
sorológicos tem se tornado o principal foco de estudo da sorologia aplicada a DCH ,
uma vez que a existência de reações cruzadas com amostras de soro de indivíduos
infectados com outros tripanossomatídeos é um problema crítico para a utilização de
extratos brutos.
Os diferentes estudos de caracterização de cepas de T. cruzi têm
demonstrado consistente diversidade genética e molecular intra-específica. Tais
variações têm estimulado a busca de moléculas antigênicas comuns à grande
diversidade de cepas circulantes nas Américas. Vários destes estudos têm resultado
na identificação, caracterização e obtenção de patentes de diferentes moléculas,
algumas delas sendo utilizadas como moldes para a produção de proteínas
recombinantes e peptídeos sintéticos. Contudo, ainda que tenham sido feitos
incansáveis esforços neste sentido, não há um teste comercial nacional utilizando
proteínas purificadas ou proteínas recombinantes e/ou peptídeos sintético. Têm sido
utilizados testes importados, baseados em extratos brutos de formas epimastigotas.
Desta forma, a busca de novos antígenos específicos do T. cruzi, para futura
obtenção de patentes e utilização em larga escala comercial no Brasil, ainda está em
aberto.
68
Frações protéicas e glicoprotéicas de 30 a 34 kDa têm sido preconizadas
como excelentes antígenos para o diagnóstico sorológico da DCH com base em
estudos que evidenciam que tais moléculas são altamente reativas no teste de
Western blot e em estudos iniciais que utilizam estas frações parcialmente
purificadas em testes de ELISA (Caseca, 2000; Veríssimo da Costa, 2000). Em vista
destas evidências, nos propusemos a purificar parcialmente as proteínas desta
fração através da técnica de eletroforese preparativa, seguida de análise por 2-D e a
identificação de algumas proteínas da fração por Espectrometria de Massas. Além
disto, iniciamos o mapeamento imunoproteômico desta fração e produção de
anticorpos monoclonais para tais moléculas.
Em algumas circunstâncias, a técnica de eletroforese preparativa é o método
de escolha para a purificação parcial de proteínas em condições desnaturantes,
principalmente, quando se tem como objetivo a manutenção das condições
desnaturantes de uma amostra. Em estudos anteriores ficou demonstrado que a
técnica de eletroforese preparativa já revelava ser uma eficiente ferramenta para a
purificação parcial de frações protéicas de 30 a 34 kDa de T. cruzi (Veríssimo da
Costa, 2000; Caseca, 2000, 2002).
No presente estudo, empregando essa técnica de purificação, em cada etapa
eletroforética foram obtidos cerca de 200µg da fração protéica por etapa
eletroforética, que foram posteriormente analisadas através de eletroforese 2DE.
Como já descrito anteriormente, este processo permitiu a obtenção de um
rendimento de aproximadamente 2% a partir de 10mg de extrato total padrão
aplicados no início da eletroforese preparativa. Para cada etapa de solubilização e,
conseqüente preparação para eletroforese bidimensional que se seguia, foram
utilizados 200
µg de fração protéica, indicando que cada gel bidimensional
69
necessitou de uma corrida de eletroforese preparativa, ou seja, 10mg de extrato total
padrão. Estes resultados indicam que a obtenção de altas concentrações da fração
parcialmente purificada foi um aspecto limitante de nosso trabalho. Portanto, caso
seja necessário produzir estas frações em larga escala, técnicas de purificação mais
eficientes deverão ser usadas. A produção de anticorpos monoclonais também
poderá permitir a utilização da cromatografia de afinidade para purificação das
frações com um rendimento certamente maior que a eletroforese preparativa.
O sucesso do pontencial analítico da eletroforese bidimensional é
absolutamente dependente do processo de preparação da amostra. Devido à
características distintas das amostras quanto às suas propriedades físico-químicas
ou quanto à sua origem, cada procedimento de preparação deve ser estabelecido de
maneira empírica, visando a completa solubilização, desagregação, desnaturação e
redução das proteínas presentes (Shaw & Riederer, 2003). Para o desenvolvimento
de uma estratégia eficiente de solubilização da amostra, se faz necessário, a
princípio, ter a idéia clara dos objetivos a serem alcançados pela análise 2-D. Neste
caso em particular, pode-se desejar observar ou “resolver” tantas proteínas quantas
forem possíveis a partir de uma amostra biológica, ou ainda, privilegiar a resolução
de um grupo particular de proteínas. A inserção de uma determinada etapa no
processo de solubilização pode representar um ganho significativo na qualidade do
resultado final, mas também pode significar uma perda parcial de proteínas.
Reconhecer esses fatores torna-se fundamental na interpretação dos resultados
obtidos.
A identificação eficiente de proteínas a partir de géis de 2-D é dependente da
completa solubilização de proteínas, uma vez que a presença de proteínas não-
solubilizadas pode interferir na qualidade dos géis. Uma etapa de solubilização bem
70
sucedida depende, além de outros fatores, dos métodos de lise celular, e de
concentração e dissolução das proteínas, se necessário. Depende ainda dos
detergentes e dos reagentes caotrópicos empregados. Extratos totais celulares
contêm comumente complexos de proteínas associadas com estruturas de
membrana, ácidos nucléicos ou com outras proteínas, muitas vezes resultando em
agregados não-específicos. Quando todas as etapas são otimizadas para uma
amostra em particular, o resultado é a aquisição de géis 2-D bem resolvidos e, mais
importante, reprodutíveis.
Van Deursen et al. (2003) utilizaram como tampão solubilizante de proteínas
do T. brucei, a composição de uréia, tiouréia, CHAPS e DTT, analisaram as
amostras em géis de 18cm e encontram 1000 spots, quando tais géis foram
impregnados com nitrato de prata. Ainda segundo estes autores, quando os géis
foram corados com corantes de menor sensibilidade, como o azul de Coomassie ou
Coomassie coloidal, foi observada uma redução de 90% e 75% do número de spots
no gel, correspondendo a 100 e 250 spots, respectivamente. Já Parodi-Talice et al.
(2004) utilizaram CHAPS, uréia e DTT e PMSF no tampão de lise e hidratação de
extrato de T. cruzi e conseguiram resolver cerca de 400 spots também após
impregnação pela prata. Mais recentemente, Kikuchi (2007) conseguiu resolver
amostras de T cruzi, solubilizadas com uma mistura de uréia, CHAPS e DTT, em
até 325 spots em géis de 17cm (pH 4-7) corados com nitrato de prata. No presente
trabalho, avaliamos a capacidade de solubilização de diferentes tampões de
solubilização para extratos totais de formas epimastigotas de T. cruzi pertencentes à
cepa Y. Nenhum estudo deste tipo foi realizado até o momento para a padronização
do método de preparo de amostras de tripanosomatídeos e, em particular, para o
T.cruzi.
71
O tampão de extração 1 é uma solução padrão para a solubilização de
proteínas de origens diversas, incluindo de tripanosomatídeos (Parodi-Talice et al.,
2004). Os tampões 2 e 3 têm a mesma composição básica, mas diferem quanto
aos detergentes (TritonX-100 e NP40, respectivamente). O tampão 4 não contém
detergentes solubilizadores, e os resultados obtidos confirmam mais uma vez, que a
presença destes se faz importante para a etapa de focalização. O número de spots
protéicos visualizados no gel utilizado para analisar a amostra preparada com o
tampão 4 foi consideravelmente reduzido em relação aos demais. Os tampões
5 e 6 apresentaram composições similares, ressaltando a presença de ASB-14 no
tampão 6.
O detergente ASB-14, é uma amidosulfobetaína que tem sido utilizada
predominantemente na solubilização de proteínas de membrana citoplasmática e de
organelas subcelulares. Mais recentemente, esse composto tem sido também
empregado na solubilização de extratos totais bacterianos, proporcionando
melhorias significativas na resolução de géis 2DE. A princípio, nosso estudo
demonstra ser o pioneiro na aplicação deste detergente na solubilização de extratos
celulares de protozoários parasitas e, particularmente, de tripanosomatídeos,
demonstrando a grande importância da aplicabilidade deste composto. Géis SDS-
PAGE utilizados para analisar proteínas de extratos totais solubilizadas com este
detergente e focalizadas em tiras de poliacrilamida de apenas 7cm e pH 4-7,
apresentaram um total de 312 spots corados com o azul de Coomassie, 4,9% a
mais do que os géis com o segundo tampão mais eficiente. Para a fração protéica de
30 a 34 kDa, o tampão 6 também possibilitou a separação de 24 spots a mais que o
segundo tampão mais eficiente. A partir desses resultados concluímos que o
detergente ASB-14 em conjunto com a uréia e a tiouréia solubilizou eficientemente
72
as amostras de extrato total do parasita, uma vez que géis dessas amostras
apresentaram um maior número de spots. Uma outra vantagem da utilização do
ASB-14 em tampões solubilizantes é a sua compatibilidade com altas concentrações
de uréia (até 9M), ao contrário dos outros detergentes utilizados neste estudo.
Alguns autores têm afirmado que altas concentrações deste detergente ocasionam o
aparecimento de pequenos “arrastes” horizontais nos géis 2-D próximos à região
básica do gel. Estudos utilizando três diferentes detergentes (CHAPS, ASB-14 e NP-
40) em soluções de solubilização também demonstraram um maior arraste horizontal
nos géis 2-D (Carboni, et al, 2002). Estes fatores nos levaram a escolher tiras de
poliacrilamida contendo um gradiente imobilizado de pH na faixa 4 a 7 para a
focalização isoelétrica em contraste com os géis de pH de 3 a 10. Uma outra
motivação para a utilização do gradiente de pH 4 a 7 foi a maior concentração de
proteínas de médio e baixo peso molecular com pIs nesta faixa de pH, quando
comparados aos géis de pH 3 a 10 (dados não mostrados). Em todos os tampões
testados utilizou-se a mesma concentração de carreadores anfólitos (0,5%), pois
esta concentração tem sido a ideal para a obtenção de bons géis 2-D.
Faz-se importante também ressaltar, que a quantificação de proteínas foi
realizada na etapa anterior ao processo de solubilização e não posterior ao contrário
de outros autores (Trovo de Marqui et al., 2006), uma vez que este procedimento
pode resultar em variações na determinação final da concentração de proteínas em
cada preparação utilizada, decorrentes das diferenças entre os métodos de
dosagem. Neste sentido, procuramos então considerar apenas a utilização de um
único método de dosagem anterior ao processo de solubilização com cada tampão,
considerando máxima, a sua capacidade solubilizante.
73
Agentes redutores como DTT são comumente utilizados em soluções de
solubilização. Quando proteínas são solubilizadas usando reagentes contendo
grupos tiol livres são necessárias duas etapas de equilíbrio após a focalização
isoelétrica. Na primeira utiliza-se o agente redutor (DTT) e na segunda um agente
alquilante, geralmente iodocetamida. O DTT tem sido utilizado como reagente
redutor padrão para géis 2-D (Molloy, 2000; Görg, et al., 2000), e, portanto, mesmo
considerando a importância de outros agentes redutores, nós também optamos pela
utilização do DTT como único agente redutor utilizado neste estudo.
Várias proteínas de T. cruzi têm sido identificadas através da aplicação das
mais diversas ferramentas proteômicas. Para tal finalidade, têm sido empregadas,
preferencialmente, técnicas de eletroforese bidimensional, HPLC e a tecnologia
ICAT, associadas à espectrometria de massas. No que diz respeito à técnica de
2-D, poucos trabalhos têm produzido resultados significativos quanto à identificação
de proteínas de massa molecular na faixa de 30 a 34kDa. Num universo de cerca de
1000 spots revelados pela impregnação pela prata, Parodi-Talice et al. (2004)
puderam confirmar somente a presença de poucas proteínas, incluindo
prostraglandinas, tubulina e HSPs com massas moleculares entre 30 e 35 kDa.
Tais moléculas, de fato, apresentam massas moleculares maiores do que aquelas
encontradas no gel de eletroforese, e tal fato pode estar associado à fragmentação
protéica, decorrentes de processos de preparação da amostra ou da própria etapa
eletroforética.
Em nosso estudo, pela primeira vez pudemos identificar 14 spots encontrados
no ETS e 4 na fração purificada, número significativamente superior a estudos
anteriores (Parodi-Talice et al., 2004). Dos spots identificados, podemos destacar as
enzimas metiltioadenosina fosforilase (MTAP), arginase e catepsina B, não
74
identificadas em estudos anteriores pela técnica de 2-D. Estes resultados
demonstram mais uma vez, que a busca de componentes mais eficientes para
solubilização de proteínas deve ser considerada quando se pretende fazer uma
análise que permita a identificação de um número grande de proteínas em uma
determinada amostra.
A enzima metiltioadenosina fosforilase (MTAP) é uma enzima importante no
metabolismo de ácidos nucléicos e já foi parcialmente purificada de extratos de
cepas peruanas de formas epimastigotas de T. cruzi, mas sua presença já foi
observada nas três formas evolutivas do parasito (Neves, 2006). Esta enzima tem
peso molecular de aproximadamente 68 kDa na sua forma nativa mas tem peso
molecular de 33 kDa na sua forma desnaturada e é capaz de realizar a clivagem de
uma variedade de grupos de nucleosídios em pH entre 6 e 8 (Miller, Sabourin &
Krenitsky, 1987). A enzima arginase tem sido descrita como um eficiente inibidor da
produção de óxido nítrico em macrófagos infectados e que a adição de inibidores
desta enzima em sistemas de células hospedeiras inibi radicalmente a replicação de
formas amastigotas (Stempin et al., 2003). A Catepsina B foi inicialmente
identificada em T. cruzi por Garcia e colaboradores (Garcia et al., 2003). Esta
enzima foi encontrada nas três formas do parasito e apresenta massa molecular
relativa de 30 kDa. Apresenta atividade duas vezes maior nas formas epimastigotas
e tem papel fundamental no evento de metaciclogênese. Fernandez et al., 2005
demonstraram que tanto humanos quanto coelhos apresentam altas concentrações
de anticorpos específicos para esta enzima, embora a presença destes anticorpos
representem uma inibição da atividade desta enzima. Em todos os estudos
realizados acima, os autores preconizam a utilização destas moléculas como alvos
de quimioterápicos ou potencial utilização no diagnóstico da doença. Algumas delas
75
como no caso da arginase, já foi realizada a obtenção de patentes para o uso em
diagnóstico (Tarleton, 2007).
Ao longo dos anos, diferentes metodologias vêm sendo aplicadas no
diagnóstico sorológico da doença de Chagas. Desde o início da década de 70,
diferentes autores vêm identificando e caracterizando antígenos potencialmente
aplicáveis a tais metodologias, alguns deles servindo como moldes para a produção
de proteínas recombinantes e peptídios sintéticos. Em dois estudos anteriores
(Caseca, 2000; Veríssimo da Costa, 2000), verificou-se que 100% de 240 indivíduos
chagásicos oriundos de diferentes áreas endêmicas reagiam positivamente com a
fração 30 a 34 kDa, quando esta era utilizada em teste de Western Blot, mas
nenhum estudo abrangente de identificação destas moléculas foi concluído até o
presente momento. Tais evidências nos levaram a combinar as técnicas de
eletroforese bidimensional e Western blot, objetivando o mapeamento
imunoproteômico desta fração imunodominante. Nossos resultados demonstraram
que cada uma das amostras de soro de indivíduo chagásico analisadas apresentou
um perfil de reatividade diferente com proteínas do ETS de T. cruzi nesta faixa de
massa molecular, indicando a heterogeneidade antigênica desta fração. A
comparação do perfil de reatividade das diferentes amostras de soro revelou
grandes diferenças entre os antígenos-alvo reconhecidos por cada soro analisado.
Nem mesmo as amostras de soro dos pacientes oriundos da mesma área
endêmica apresentaram perfis de reatividade similares e apenas um spot protéico
dominante foi encontrado (spot 55) (figura 7a). Neste estudo não foram
considerados a idade, o sexo dos indivíduos ou a manifestação clínica da doença.
De certo, nenhum deles estava sob terapia até o momento da coleta da amostra.
Esta heterogeneidade nos perfis de reatividade até mesmo para uma fração protéica
76
em particular, tem reforçado a argumentação da não utilização de uma única
proteína purificada como antígeno em testes de imunodiagnóstico para a DCH. Um
conjunto de moléculas altamente antigênicas e específicas certamente possibilitaria
a produção de kits com maior sensibilidade e especificidade que pudessem ser
aplicados em diferentes áreas endêmicas do Brasil, das Américas ou de outras
áreas distribuídas mundialmente. Em resumo, os dados apresentados neste estudo
sobre a imunoproteômica de frações protéicas do T. cruzi, forneceram informações
relevantes sobre a qualidade e identidade dos antígenos-alvo do T cruzi nesta faixa
de massa molecular particular e sobre sua resposta imune ao soro de indivíduos
infectados. Como já descrito também para outros tripanosomatídeos, a resposta
humoral da maioria dos indivíduos tem sido direcionada principalmente para
proteínas altamente expressas e regiões altamente conservadas como proteínas de
choque térmico (HSPs), proteínas ribosomais, proteínas pertencentes a maquinaria
transcripcional e síntese de DNA, proteínas flagelares ou ainda proteínas da
superfície celular do parasito.
Como mostrado neste estudo, a tecnologia imunoproteômica pode ser, sem
dúvida, uma poderosa ferramenta, que poderá permitir desvendar, em breve, o perfil
de antigenicidade de agentes infecciosos e o perfil de resposta imune humoral
contra patógenos complexos. Da mesma forma, a sorologia proteômica ou
imunoproteômica traz um número de problemas, cujas etapas ainda são de difícil
resolução. Dificuldades, por exemplo, ainda são observadas quando se quer
comparar géis corados com as membranas de nitrocelulose contendo as proteínas
correspondentes e reveladas por Western blot. Ou seja, relacionar o antígeno que
reagiu com determinado soro em uma membrana a uma banda protéica no gel
corado. Estes problemas são decorrentes de diferenças na sensibilidade de
77
detecção entre o teste de Western blot e os métodos de coloração dos géis, uma vez
que os antígenos revelados não são, necessariamente, as proteínas mais expressas
e coradas nos géis. Neste estudo, em particular, não foi realizada uma comparação
entre a membrana de nitrocelulose após a transferência das proteínas e os géis
originais corados, devido às dificuldades acima citadas. Apesar destas dificuldades,
a sorologia proteômica ainda parece ser superior a outras ferramentas para a
descoberta de antígenos. A utilização desta tecnologia juntamente com o projeto
genoma para Trypanosoma cruzi auxiliará inevitavelmente, na identificação de
proteínas por eletroforese bidimensional e espectrometria de massas.
A possibilidade de produzir e utilizar anticorpos monoespecíficos revolucionou
a pesquisa básica e aplicada nas mais diferentes áreas das ciências médicas. Estes
anticorpos têm sido utilizados na caracterização molecular de estruturas superfície,
na imunoterapia, no imunodiagnótico e, mais recentemente, na caracterização e
identificação de epitopos dominantes. Essas novas possibilidades de aplicação da
tecnologia de hibridomas, nos impulsionou à produção inicial de anticorpos
monoclonais para a fração imunodominante de 30 a 34 kDa com o objetivo de
futuramente utilizá-los na caracterização de epítopos das proteínas desta faixa de
peso molecular. Para tal fim, foram realizadas fusões, obtendo-se 6 hibridomas
reativos com moléculas do extrato total de T. cruzi e 2 também com bandas
protéicas de massa molecular na faixa de 30 a 34 kDa. Estes resultados estimulam
a subseqüente utilização destes MAbs na identificação dos epitopos destas
moléculas.
O teste inicial de triagem utilizado para a análise dos hibridomas foi o ELISA,
seguido do Western blot como teste confirmatório. Este último revelou que os
sobrenadante de 2 hibridomas positivos para a fração protéica também reagiam com
78
proteínas de outras proteínas de massa molecular em outras faixas de kDa. Estes
resultados indicam uma heterogeneidade de clones numa mesma cavidade da placa
ou ainda, que os anticorpos reconhecem epítopos em proteínas de outras faixas de
massa molecular. Esse fato pode decorrer da fragmentação molecular durante o
processo de extração, preparação da amostra e eletroforese, comumente observada
em SDS-PAGE análise de outras moléculas. A ocorrência destes eventos será
investigada futuramente após a clonagem, análise dos clones positivos e utilização
dos anticorpos monoclonais produzidos frente a membranas de nitrocelulose com
proteínas separadas por 2-D.
Neste estudo também ficou patente a capacidade imunogênica da fração 30 a
34 kDa e de resposta humoral de camundongos Balb/C imunizados com esta fração.
Para isso, foram realizados testes de Western blot com amostras de soro de animais
imunizados com extrato total e/ou com a fração protéica versus membranas de
nitrocelulose sensibilizadas com extrato total de formas epimastigotas de T. cruzi. O
soro do animal imunizado com extrato total reconheceu uma grande diversidade de
antígenos, como descrito por outros autores que utilizaram outras ferramentas
metodológicas para o mesmo fim. Em especial para o animal imunizado com a
fração protéica foi observado reação positiva na membrana de nitrocelulose para um
conjunto de 14 spots de peso molecular faixa 30 e 34 kDa alinhados vertical e
horizontalmente. Muito provavelmente os spots de mesma massa molecular, mas pIs
distintos, são isoformas de uma mesma proteína. A primeira linha horizontal inferior
mostrou 3 spots alinhados, a segunda 3 spots, a terceira 4 spots e a 4ª linha, 4
spots. Estudos anteriores também demonstraram a diversidade de isoformas
imunogênicas de proteínas do parasito, porém em faixas mais altas de peso
molecular (Gomes-da-Silva et al., 2002). No presente estudo, evidenciamos pela
79
primeira vez a existência de isoformas antigênicas de proteínas de peso molecular
na região de 30-34 kDa.
80
Conclusões
• A inclusão do detergente ASB-14, aos reagentes caotrópicos uréia e tiouréia,
contribui eficazmente para a melhoria da solubilização de proteíns de extratos
totais de formas epimastigotas de T. cruzi (cepa Y), proporcionando o
aparecimento de um maior número de spots protéicos nos géis 2D.
• A utilização deste novo protocolo de solubilização permitiu a identificação de
novas proteínas tais como: peptidase M20/M25/M40, metiltioadenosina
fosforilase, arginase e catepsina B.
• O mapeamento imunoproteômico de proteínas de 30 a 34 kDa de T. cruzi
demonstrou uma significativa heterogeneidade no perfil de reatividade entre
as amostras de soros de indivíduos chagásicos.
•
A partir da fusão de células de mieloma e células de camundongos Balb/c
imunizados foram obtidos dois hibridomas contendo anticorpos monoclonais
para as proteínas 30 a 34 kDa
.
•
Amostras de soro de camundongos Balb/c imunizados exclusivamente com a
fração protéica de 30 a 34 kDa foram capazes de reagir especificamente com
um grupo particular de proteínas, com pI entre 4 e 5,8, semelhantes a perfis
de isoformas em géis 2D.
81
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