( PDF ) Espectroscopia Raman em câncer de mama

Download PDF

ads:

Universidade do Vale do Paraíba

Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

MARCELO MORENO

ESPECTROSCOPIA RAMAN EM CÂNCER DE MAMA

São José dos Campos, SP

2006

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

MARCELO MORENO

ESPECTROSCOPIA RAMAN EM CÂNCER DE MAMA

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Engenharia Biomédica

da Universidade do Vale do Paraíba, como

complementação dos créditos necessários

para a obtenção do título de Mestre em

Engenharia Biomédica.

Orientador: Prof. Dr. Airton Abrahão

Martin.

Co-orientador: Profa. Dra. Emília Ângela

Loschiavo Arisawa.

São José dos Campos, SP

2006

ads:

DEDICATÓRIA

Dedico esse trabalho a todas as pacientes que contribuíram para que houvesse o

desenvolvimento de uma técnica diagnóstica que futuramente poderá auxiliar

tantas outras.

AGRADECIMENTOS

Agradeço, primeiramente, à Deus por possibilitar condições de luta e perseverança

nos meus ideais, pois desde jovem tive o espírito investigativo, e apesar das

dificuldades, permitiu-me concluir o ensino médio, fundamental, graduação e pós-

graduação. Agradeço à minha família que sempre me entendeu e apoiou e à pessoa

especial que me acompanha há 8 anos, entendendo os momentos em que devia me

dedicar à leitura de artigos e construção de textos. À Universidade do Vale do

Paraíba, por oferecer a oportunidade de desenvolvimento de pesquisa básica, sob a

forma de pós-graduação stricto sensu. Ao Professor Airton A. Martin, por ter

aceitado ser meu orientador, colocando o laboratório de Espectroscopia

Vibracional à disposição para o desenvolvimento deste estudo, e aos momentos

em que pôde compartilhar seus conhecimentos. À Profa. Emília Ângela L.

Arisawa pela co-orientação e pelo cuidado especial na correção do texto.

Agradeço a dedicação dos profissionais técnicos dessa instituição, principalmente

à Sra. Valéria e a Sra. Ivone, secretárias do IP&D e à Sra. Rúbia bibliotecária da

Biblioteca Setorial do IPD. Agradeço aos colegas e amigos patologistas: Cíntia

Lopes, Jerso Menegasi e Rosane Aguiar pela disponibilidade para a realização dos

exames anátomo-patológicos. Ao colega e amigo cirurgião oncológico Benito

Bodanese que sempre esteve disposto a ajudar nas coletas e armazenamento das

amostras. Faço também um agradecimento especial à colega e agora amiga Renata

Bitar, pois sem os seus conhecimentos, paciência e dedicação, não seria possível

alcançar objetivos propostos.

ESPECTROSCOPIA RAMAN EM CÂNCER DE MAMA

RESUMO

Com o objetivo de avaliar o diagnóstico vibracional molecular de doenças mamárias,

foram coletados espectros Raman de 82 amostras de lesões mamárias de 82 pacientes

com diferentes tipos de diagnósticos, durante o período de abril de 2005 a março de

2006. Com um total de 859 espectros foi formada uma “livraria espectral”, incluindo

diagnósticos como tecido mamário normal, alterações funcionais benignas da mama

(AFBM), fibroadenoma (FBD), neoplasia intra-epitelial ductal e diferentes tipos de

carcinomas mamários. Carcinoma ductal invasor (CDI) representou o maior número dos

espectros (46%), seguido de outras doenças malignas (21%), tecido mamário normal

(14%), doenças benignas (13%) e doenças mamárias pré-malignas (6%). A utilização da

Análise de Componentes Principais e Dispersão Binominal permitiu a análise estatística

multivariada. As variáveis escolhidas para representar os diagnósticos, foram aquelas

que tiveram uma diferença estatística menor que 5% e os espectros escolhidos

representaram o padrão “ouro”. Espectroscopia Raman diferenciou com uma

sensibilidade e especificidade de 100%, as seguintes doenças: CDI de carcinoma ductal

in situ; carcinoma ductal inflamatório de carcinoma medular e mucinoso; CDIS de

Doença de Paget mamária; CDIS de AFBM; CDIS de FBD e mama normal de AFBM e

FBD. Espectroscopia Raman também diferenciou os diagnósticos: Doença de Paget e

AFBM de CDI; FBD de CDI; CDIS de CDI com sensibilidade e especificidade de

95,24 % e 100%; 94,92 % e 81,82 %; 100 % e 93,02 %; 99,58 % e 85,19 %,

respectivamente. O Diagrama de Dispersão, que incluiu todos os agrupamentos deste

estudo, foi dividido em quatro “regiões diagnósticas”: 1- tecido mamário normal; 2 –

doença benigna; 3 – doenças pré-malignas e 4 – doenças malignas. Esses resultados

confirmam que a Espectroscopia Raman é um método com alta acurácia para o

diagnóstico de doenças mamárias podendo ser considerado para o uso in vivo.

PALAVRAS-CHAVE: Espectroscopia Raman; Câncer de mama; Diagnóstico;

Biópsia óptica.

RAMAN SPECTROSCOPY IN BREAST CANCER

ABSTRACT

The aim of this study was evaluate the vibrational molecular diagnosis of malignant and

benign breast diseases, Raman spectra of 82 mammary gland samples were collected

from 82 patients with different kinds of breast diseases during the period of April 2005

to March 2006. A total of 859 spectra have constituted a “spectral library” including

diagnosis like normal breast, aberrations of normal development and involution

(ANDI), fibroadenoma (FBD), ductal intraepithelial neoplasia and different kinds of

breast carcinoma. Ductal carcinoma invasive (DCI) represented the major number of

spectra (46%), followed by others malignant neoplasms (21%), breast normal tissue

(14%) and benign diseases (13%) and pre-malignant breast diseases (6%). The

multivariate statistical evaluation was done using Principal Component Analysis and

Binominal Dispersion. The variables chosen to represent the diagnostic were those

having statistical difference less than 5%. These spectra represented the gold standard.

Raman spectroscopy differentiated with sensibility and specificity of 100% the

following diseases: DCI from ductal carcinoma in situ (DCIS); ductal carcinoma

inflammatory from medullary and mucinous carcinomas; DCIS from mammary Paget’s

Disease; DCIS from ANDI; DCIS from FBD and normal breast tissue from ANDI and

FBD. The Raman spectroscopy was able to discriminate Paget’s Disease from DCI;

ANDI from DCI; FBD from DCI; and DCIS from DCI with sensibility and specificity

of 95,24 % and 100%; 94,92 % and 81,82 %; 100 % and 93,02 %; 99,58 % and

85,19 %, respectively. The Dispersion Diagram, which included all sample clusters of

this study, was divided in four “diagnostics regions”: 1- normal breast tissue; 2 – benign

disease; 3 – pre-malignant diseases and 4 – malignant diseases. These results support

that Raman spectroscopy is a method with high accuracy for breast diseases diagnosis

could be considered to use in vivo.

KEY WORDS: Raman spectroscopy; Breast cancer; Diagnosis; Optical biopsy.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Morfologia macroscópica da glândula mamária humana feminina. 7

Figura 2 – Morfologia microscópica mama feminina humana 8

Figura 3 – Aspecto microscópico dos ductos mamários 8

Figura 4 – Drenagem linfática da glândula mamária humana 9

Figura 5 – Achados microscópicos de alterações fibrocísticas benignas 11

Figura 6 – Morfologia microscópica do fibroadenoma 12

Figura 7 – Morfologia macroscópica do fibroadenoma 13

Figura 8– Aspecto microscópico do carcinoma ductal in situ 16

Figura 9 – Aspecto microscópico do CDIS cribiforme. 16

Figura 10 – Aspecto microscópico do CDIS tipo comedo. 17

Figura 11 – Aspecto microscópico do CLIS.17

Figura 12 – Aspecto macroscópico do CDI sem outra especificação 19

Figura 13 – Aspecto microscópico do CDI sem outra especificação 20

Figura 14 – Êmbolo neoplásico no interior de um canal linfático 20

Figura 15 – RX de tórax mostrando múltiplas lesões metastáticas. 21

Figura 16 – Aspecto clínico do CDI inflamatório. 21

Figura 17 – Aspecto histológico do CLIS 23

Figura 18 – Aspecto histológico do carcinoma tubular de mama 24

Figura 19 – Morfologia microscópica do carcinoma medular mamário 24

Figura 20 – Morfologia microscópica do carcinoma mucinoso 25

Figura 21 – Morfologia microscópica da Doença de Paget mamária. 25

Figura 22 – Mamografia mostrando uma lesão nodular 26

Figura 23 – Aspecto citológico do carcinoma ductal mamário. 28

Figura 24 – Técnica de Core Biopsy 29

Figura 25 – Demarcação pré-operatória pela técnica de agulhamento 31

Figura 26 – ROLL 33

Figura 27 – Fotografia do gama probe Navigator GPS

Figura 28 – Efeito Raman 39

Figura 29 – Espectro Raman infravermelho-próximo do colesterol 39

Figura 30 – Dispositivo para Raman com Transformada de Fourier . 41

Figura 31 – Média dos espectros TF-Raman do tecido mamário normal 44

Figura 32 – Média dos Espectros TF-Raman dos diferentes tecidos mamários 46

Figura 33 – Material utilizado para armazenar e preparar a amostra para a leitura.

Figura 34 – Espectrômetro TF-Raman RFS 100, Bruker.. 49

Figura 35 – Porta-amostras. 50

Figura 36 – Posicionamento da amostra 51

Figura 37 – Posicionamento da amostra utilizando o estágio motorizado. 52

Figura 38 – Dendograma representando o agrupamento sucessivo 54

Figura 39 – Média dos espectros TF-Raman de amostras de tecido mamário normal

Figura 40 – Dendograma representativo dos espectros de mama normal. 61

Figura 41 – Média dos espectros TF-Raman de amostras de AFBM 63

Figura 42 – Dendograma representativo dos espectros de AFBM. 64

Figura 43 – Média dos espectros TF-Raman de amostras de fibroadenoma 66

Figura 44 – Dendograma representativo dos espectros de Fibroadenoma. 67

Figura 45 – Média dos espectros TF-Raman de amostras de CDIS. 68

Figura 46 – Dendograma representativo dos espectros de CDIS 69

Figura 47 – Média dos espectros TF-Raman de amostras de CDIS comedo 70

Figura 48 – Dendograma representativo dos espectros de CDIS tipo comedo. 71

Figura 49 – Média dos espectros TF-Raman de amostras de CDI SOE 73

Figura 50 – Dendograma representativo dos espectros de CDI SOE 74

Figura 51 – Média dos espectros TF-Raman de amostras de CDI inflamatório 76

Figura 52 – Dendograma representativo dos espectros de CDI inflamatório. 77

Figura 53 – Média dos espectros TF-Raman de amostras de CDI medular 78

Figura 54 – Dendograma representativo dos espectros de CDI medular 79

Figura 55 – Média dos espectros TF-Raman de amostras de CDI mucinoso 80

Figura 56 – Dendograma representativo dos espectros de CDI mucinoso 81

Figura 57 – Média dos espectros TF-Raman de amostras de CLI 83

Figura 59 – Média dos espectros TF-Raman de amostras de Doença de Paget 84

Figura 60 – Dendograma representativo dos espectros de Doença de Paget. 85

Figura 61 – Média dos espectros TF-Raman de amostras CEC mamário 87

Figura 62 – Dendograma representativo dos espectros de CEC de mama 88

Figura 63 – Média dos espectros TF-Raman de todas as amostras 90

Figura 64 – Dendograma representativo do cálculo dos espectros das 82 pacientes

incluídas do estudo. 91

Figura 65 – Dispersão Binominal dos espectros de mama normal, AFBM e

fibroadenoma. 93

Figura 66 – Dispersão Binominal dos espectros de CDIS e fibroadenoma. 94

Figura 67 – Dispersão Binominal dos espectros de CDIS e AFBM. 95

Figura 68 – Dispersão Binominal dos espectros de CDI e fibroadenoma. 96

Figura 69 – Dispersão Binominal dos espectros de CDI e AFBM. 97

Figura 70 – Dispersão Binominal dos espectros de mama normal, CDIS e CDI. 99

Figura 71 – Dispersão Binominal dos espectros de CDI, CDIS e CDIS comedo. 101

Figura 72 – Dispersão Binominal espectros de CDI, CDI inflamatório, CDI medular e

CDI mucinoso. 102

Figura 73 – Dispersão Binominal dos espectros de CDI inflamatório, CDI medular e

CDI mucinoso. 103

Figura 74 – Dispersão Binominal dos espectros de CDI e CLI. 104

Figura 75 – Dispersão Binominal dos espectros de CDI e Doença de Paget. 106

Figura 76 – Dispersão Binominal dos espectros de CDIS e Doença de Paget. 107

Figura 77 – Dispersão Binominal dos espectros de todas as amostras 109

Figura 78 – Separação dos agrupamentos em quatro regiões diagnósticas 110

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Marcadores prognósticos para metástases de CM 35

Tabela 2 – Tipos histopatológicos de CM. 36

Tabela 3 – Modos vibracionais e biomoléculas referentes aos picos Raman de tecido

mamário humano.. 45

Tabela 4 - Parâmetros ajustados com auxílio do Software OPUS 4.2 para a aquisição

dos espectros no TF-Raman Spectrometer RFS 100. 51

Tabela 5 – Distribuição do número de pacientes de acordo com o diagnóstico

histopatológico e o número de espectros TF-Raman gerados. 57

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACP – análise dos components principais.

ANDI – aberrations of normal development and involution – aberrações de

desenvolvimento normal e involução.

BRCA1 – gene de suscetibilidade para o desenvolvimento de câncer de mama,

quando mutado. Quando normal tem o papel de reparar danos do DNA.

CDI – carcinoma ductal invasor.

CDIS – carcinoma ductal in situ.

CDISOE – carcinoma ductal invasor sem outra especificação.

CEC – carcinoma espinocelular ou carcinoma epidermóide.

CLI – carcinoma lobular invasor.

CM – câncer de mama.

DP – desvio padrão.

ER – espectroscopia Raman

ERUV – espectroscopia Raman ressonante ultravioleta.

MT – metástases.

Nd:YAG – laser de Neodímio: Ítrio - Alumínio -Granada.

NID – neoplasia intraepitelial ductal.

NIL – neoplasia intraepitelial lobular.

PAAF – punção aspirativa com agulha fina.

PET –positron emission tomography- tomografia por emissão de pósitrons.

PC – componentes principais.

ROLL – radioguided occult lesion localization – localização radioguiada de lesão

oculta.

TF – Transformada de Fourier.

US – ultra-sonografia.

UV – ultravioleta.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 1

2 OBJETIVOS 3

2.1 Geral 3

2.2 Específicos 3

3 REVISÃO DA LITERATURA 4

3.1 Morfologia mamária 5

3.1.1 Anatomia e Histologia 5

3.2 Patologia mamária 9

3.2.1 Doenças Benignas 9

3.2.1.1Alterações funcionais benignas da mama11

3.2.1.2 Lesões benignas esclerosantes 11

3.2.1.3 Fibroadenoma 11

3.2.2 Câncer de mama 13

3.2.2.1 Carcinoma não invasivo 13

3.2.2.2 Carcinoma invasor 18

3.3 Diagnóstico 25

3.4 Tipos de Biópsia 26

3.4.1 PAAF 26

3.4.2 Core Biopsy

3.4.3 Mamotomia 29

3.4.4 Biópsia cirúrgica sem demarcação 30

3.4.5 Agulhamento pré-operatório 30

3.4.6 ROLL 32

3.5 Fatores prognósticos do câncer de mama 34

3.6 Espectroscopia Raman 36

3.6.1 Histórico e princípios 36

3.6.2 ER com transformada de Fourier 40

3.6.3 ER e câncer 42

3.7 ER e câncer de mama 43

3.7.1 Caracterização do epitélio mamário normal na ER 43

3.7.2 Caracterização do epitélio mamário neoplásico na ER 45

4 METODOLOGIA 47

4.1 Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa 47

4.2 Obtenção das amostras de tecido mamário 47

4.3 Obtenção dos espectros TF-Raman 48

4.3.1 Espectrômetro TF-Raman 48

4.3.1.1 Laser Nd: YAG (Neodímio: Ítrio Alumínio Granada) 50

4.3.1.2 Parâmetros do equipamento 50

4.3.2 Preparação das amostras de tecido mamário 52

4.3.3 Número de espectros por amostra 52

4.3.4 Análise dos dados espectrais 53

4.3.5 Análise dos componentes principais 55

4.3.6 Diagnóstico histopatológico 56

5 RESULTADOS 57

5.1 Análise de todas as amostras mamárias 58

5.2 Tecido mamário normal 58

5.3 AFBM 62

5.4 Fibroadenoma 65

5.5 CDIS 68

5.6 CDIS tipo comedocarcinoma 70

5.7 CDI 72

5.8 CDI tipo inflamatório 75

5.9 CDI tipo medular 78

5.10 CDI tipo mucinoso 80

5.11 CLI 82

5.12 Doença de Paget 84

5.13 CEC 86

5.14 Dispersão Binominal entre espectros 92

5.14.1 Dispersão Binominal considerando doença mamária benigna 93

5.14.2 Dispersão Binominal considerando doença mamária benigna, pré-maligna e

maligna....... 94

5.14.3 Dispersão Binominal entre os espectros de todas as amostras analisadas 109

6 DISCUSSÃO 111

7 CONCLUSÕES 118

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 121

Apêndice A – Termo de consentimento livre esclarecido. 125

ANEXO A – Certificado do comitê de ética em pesquisa da UNIVAP. 127

1 INTRODUÇÃO

Câncer de mama (CM) é a neoplasia maligna mais comum entre as mulheres dos

países ocidentais. Estatísticas indicam o aumento de sua freqüência tantos nos

países desenvolvidos quanto nos países em desenvolvimento. Segundo a

Organização Mundial da Saúde, nas décadas de 60 e 70 foi verificado um aumento

de 10 vezes nas taxas de incidência ajustadas por idade nos Registros de Câncer de

Base Populacional de diversos continentes (KOPANS, 1997; VERONESI, 2002;

BURSTEIN, 2004). No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA, 2005)

prevê 472.050 casos novos de câncer diagnosticados, sendo que o CM será o

segundo mais incidente entre a população feminina (49.930 casos novos).

Atualmente, para detecção precoce do CM, é realizada a combinação do exame

físico e mamográfico anuais a partir dos 40 anos para todas a mulheres, e acima

dos 35 anos para mulheres com alto risco para desenvolvimento da doença tais

como câncer hereditário, doenças pré-malignas, entre outros, (KOPANS, 1997;

VERONESI, 2002). Para a confirmação diagnóstica são necessários métodos

como a punção por agulha fina (PAAF), biópsia incisional (Core Biopsy

cirúrgica) - guiadas ou não por métodos de imagem -, Radioguied Occult Lesion

Localization (ROLL), biópsias excisionais com agulhamento prévio e mamotomia.

Todas as técnicas são realizadas com acesso direto à lesão mamária suspeita,

necessitando auxílio de procedimentos que variam de anestesia local até

internação hospitalar com emprego de anestesia geral (HARRIS, 2000;

VERONESI, 2002), que muitas vezes, pode ser traumático para o paciente. Além

disso, o exame histológico leva, em média, uma semana para ser liberado pelos

laboratórios de patologia e o sistema público e convênios de saúde têm que arcar

com custos médico-hospitalares altos (BEITLER; HURD; EDGE, 1997;

MORROW, 2001).

Espectroscopia Raman (ER) é um método clínico potencialmente importante no

diagnóstico de doenças em tempo real (SHAH, 2001; KRAFFT, 2003; BOERE et

al., 2003). Desde a descrição do efeito Raman, em 1928, inúmeros estudos têm

sido realizados empregando a propriedade da interação entre a luz e a matéria

(HANDLON, 1999; SHAH, 2001; KRAFFT, 2003). Espectros Raman de

moléculas biológicas contêm numerosas bandas que representam modos normais

de vibração molecular servindo como impressões digitais de sua estrutura,

composição, interação e dinâmica. Qualquer condição patológica é acompanhada

por mudanças na composição molecular e/ou estrutura molecular comprometendo

um tecido ou uma célula. Essas mudanças são refletidas no espectro Raman

(HANDLON, 2000; BIGIO, 2000; SHAH, 2001; KRAFFT, 2003). A morfologia

da glândula mamária humana é relativamente simples, (KOPANS, 1997;

HARRIS, 2000; VERONESI, 2002), tornando-se viável a avaliação de

transformações malignas do tecido epitelial desse órgão, utilizando ER

(HANDLON, 2000; SHAH, 2001). O futuro do emprego da ER como método

diagnóstico, depende do conhecimento das características espectrais específicas de

cada doença, e então, desenvolver um dispositivo para a caracterização

diagnóstica in vivo do CM.

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Construir banco de dados espectrais de doenças mamárias benignas e malignas

para estudos comparativos com fatores prognósticos, análises histopatológicas e

diagnósticos clínicos.

2.2 Específicos

Obter e diferenciar espectros Raman em amostras de tecido mamário humano

normal e com alterações patológicas.

Qualificar os espectros Raman obtidos através da análise de suas variações

correlacionando-os com os achados histopatológicos das amostras de tecido

mamário.

3 REVISÃO DA LITERATURA

CM é o segundo tipo de câncer mais comum entre toda a população mundial, com

um milhão de casos novos por ano. Atualmente, no Brasil, há um risco estimado

de 53 casos a cada 100 mil mulheres, enquanto para cada 100 casos de câncer em

mulheres é estimado um caso no sexo masculino. Seu prognóstico é relativamente

bom quando diagnosticado nos estágios iniciais. Estima-se que a sobrevida média

geral cumulativa após cinco anos seja de 65%, variando de 53 a 74% nos países

desenvolvidos, e de 56%, com variação entre 49 e 51% para os países em

desenvolvimento. Na população mundial, a sobrevida média após cinco anos é de

61% (KOPANS, 1997; HARRIS, 2000; VERONESI, 2002; INCA, 2005). Não

existem medidas práticas específicas de prevenção primária do CM aplicável à

população, embora estudos observacionais sugiram que a prevenção do tabagismo,

alcoolismo, obesidade e sedentarismo reduzam o risco de desenvolvimento da

doença. Avanços tecnológicos têm sido direcionados para diagnóstico precoce e

tratamento visando melhorar a qualidade da sobrevida dos pacientes (INCA,

2005). As taxas de mortalidade por CM continuam elevadas no Brasil, muito

provavelmente porque a doença ainda seja diagnosticada em estádios avançados.

Com base nas informações disponíveis dos Registros Hospitalares do INCA, no

período 2000/2001, 50% dos tumores de mama foram diagnosticados nos estádios

III e IV. Em países desenvolvidos, a taxa de mortalidade tem diminuído devido à

implementação do rastreamento com exame mamográfico, resultando em

diagnóstico cada vez mais precoce. CM é uma doença clinicamente heterogênea, e

esta característica pode dificultar não só a definição de cura, como a avaliação do

risco para o desenvolvimento de metástases. Aproximadamente 10-15% dos

pacientes com CM apresentam o curso da doença de forma mais agressiva,

evoluindo rapidamente com metástases à distância e conseqüentemente à morte, o

que ocorre principalmente nos três primeiros anos após o diagnóstico (WEIGETL

et al., 2005; INCA, 2005).

Para entender os tipos de lesões mamárias estudadas neste trabalho, será feita, a

seguir, uma descrição da morfologia e das principais doenças que acometem a

mama humana.

3.1 Morfologia mamária

A região mamária pode ser definida como a parte da parede torácica ocupada pela

mama. A glândula mamária é considerada um anexo cutâneo especializado dessa

região, que adquiriu alta diferenciação. É quase insignificante no sexo masculino,

mantendo-se em estado rudimentar. Na mulher possui importância fisiológica e

patológica pelo desenvolvimento glandular importante secundário aos níveis

aumentados de estrógenos circulantes sendo capaz de secretar leite (TESTUT,

1951; KOPANS, 1997).

3.1.1 Anatomia e Histologia

A mama adulta feminina localiza-se entre a segunda e a sexta costela no eixo

vertical e entre a linha axilar média no eixo horizontal, possuindo diâmetro médio

de 10 a 12cm. O parênquima mamário estende-se até a axila, (prolongamento

axilar de Spence). É composta por três estruturas anatômicas principais: pele,

tecido subcutâneo e parênquima mamário (TESTUT, 1951; HARRIS et al., 2000)

(Fig. 1). A pele da mama é fina e contém folículos pilosos, glândulas sebáceas e

glândulas sudoríparas. No mamilo é encontrada grande quantidade de terminações

nervosas sensoriais, corpos de Ruffini e os corpúsculos de Krause, além de

glândulas sudoríparas apócrinas e glândulas sebáceas. A aréola é circular e

pigmentada, com 15 a 60 mm de diâmetro e possui os tubérculos de Morgagni

localizados na periferia, elevações formadas por aberturas dos ductos das

glândulas de Montgomery, apresentando 10 a 15 glândulas sebáceas em estágio

intermediário entre glândula sudorípara e mamária. O parênquima mamário é

dividido em 15 a 20 segmentos, chamados lobos, que convergem radialmente para

o mamilo (TESTUT, 1951; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Não há cápsula e

cada lobo é separado por septos de tecido conjuntivo que contêm tecido adiposo

Os ductos coletores que drenam cada segmento têm 2 mm de diâmetro, sendo que

na porção subareolar apresentam dilatação de 5 a 8 mm região da ampola ou seio

lactífero, onde se comunicam com o mamilo através de 5 a 10 ductos coletores.

Cada ducto coletor drena um lobo que é formado por 20 a 40 lóbulos. Cada lóbulo

é formado por 10 a 100 alvéolos (Fig. 2) (TESTUT, 1951; COTRAN; COLLINS;

KUMAR, 2000; HARRIS et al., 2000; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). O

ducto lactífero principal é formado pela junção de ductos intralobulares (Fig. 3).

Os ductos menores são revestidos por células epiteliais colunares e, mais

externamente, apresentam uma camada de células mioepiteliais sobre a lâmina

basal. Ductos maiores são revestidos por duas camadas de células epiteliais. Não

há alvéolos secretores na glândula mamária em repouso, mas as células que

fecham o fundo cego de cada ducto intralobular aumentam durante a segunda

metade do ciclo menstrual. Quando ativadas por hormônios, estas células podem

se transformar em alvéolos. A maioria do estroma mamário é formada por um

tecido conjuntivo fibroso ou denso em permeio ao tecido adiposo, estroma

interlobular, contendo fibras elásticas que sustentam os ductos mamários. Os

lóbulos são sustentados por um estroma mixomatoso delicado, com linfócitos em

permeio, denominado estroma intralobular (Fig. 2). O suprimento sangüíneo da

mama é dado principalmente pelas artérias mamárias interna e torácica lateral. Já a

drenagem linfática é feita principalmente para linfonodos axilares (97%) e o

restante para a cadeia linfonodal mamária interna (Fig. 4), (HARRIS et al., 2000;

JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).

Figura 1 – Morfologia macroscópica da glândula mamária humana feminina.

Adaptação do Netter (2003).

Figura 2 – Morfologia microscópica mama feminina humana (H&E – 200X).

Figura 3 – Aspecto microscópico dos ductos mamários (H&E – 100X).

Figura 4 – Drenagem linfática da glândula mamária humana. Adaptado do Netter (2003).

3.2 Patologia mamária

A mama é um sítio sujeito ao desenvolvimento de uma série de doenças. Muitas

vezes o que é traduzido clinicamente como doença mamária é, na verdade, uma

expressão de processos dinâmicos que ocorrem na mama normal durante a vida de

uma mulher. Para melhor entendimento da grande variedade na patologia

mamária, optou-se por dividir a descrição conforme o que segue, considerando as

doenças mamárias mais comuns.

3.2.1 Doenças Benignas

3.2.1.1 Alterações funcionais benignas da mama

Há uma ampla variedade de terminologia para a definição desse grupo de doenças.

Segundo Hughes et al (1987), a melhor definição para todo esse grupo de doenças

seria: aberrações do desenvolvimento normal e involução ou ANDI. No Brasil, a

maioria dos patologistas e mastologistas as denominam como alterações

funcionais ou benignas da mama - AFBM, (SOCIEDADE BRASILEIRA DE

MASTOLOGIA, 2006). Cerca de 50% das pacientes atendidas em ambulatórios

de mastologia, com queixas referentes à glândula mamária, não apresenta achado

expressivo após o emprego racional de métodos diagnóstico, tendo um pico de

incidência entre os 25 e os 45 anos. Algumas das lesões elementares (que

representam o substrato morfológico) como cistos, fibrose e adenose, devem ser

interpretadas como um exagero ou um desvio das modificações fisiológicas que o

parênquima mamário sofre durante o ciclo menstrual. A variável morfológica que

delineia a passagem da fisiologia para patologia é dada pelo grau e aspecto da

hiperplasia epitelial. Considerando esse conceito, são achados comuns: cistos,

metaplasia apócrina (cistos revestidos com epitélio apócrino), fibrose, infiltrado

inflamatório, hiperplasia, adenose (hiperplasia com um aumento da unidade

lobular sem alterações citológicas), entre outros (Fig. 5). Um dos problemas

enfrentados é a distinção entre benignidade absoluta e um tumor maligno, sendo,

muitas vezes necessário recorrer a um procedimento cirúrgico. Além disso, há a

necessidade de avaliar as entidades benignas que podem se apresentar e

sucessivamente desenvolver um câncer (HARRIS et al., 2000; VERONESI, 2002).

Figura 5 – Achados microscópicos de alterações fibrocísticas benignas da mama (H&E –

400X).

3.2.1.2 Lesões benignas esclerosantes

São lesões benignas que simulam malignidade, podendo criar dificuldade no

diagnóstico tanto no âmbito clínico, radiológico como na histologia. Há formação

de adenose, proliferação do estroma e fibrose, resultando em uma lesão sem

limites precisos, de consistência aumentada e multinodular. Adenose esclerosante,

lesão escleroelastósica, adenoma ductal e a adenose microglandular são incluídas

neste grupo de doença mamária (HARRIS et al., 2000).

3.2.1.3 Fibroadenoma

Considerado uma forma localizada de hiperplasia nodular do tecido estromal e do

componente glandular da mama. O componente glandular é constituído por

túbulos revestidos por um epitélio cúbico ou cilíndrico com núcleos redondos e

camada mioepitelial evidente. O estroma é formado por tecido conjuntivo frouxo

de aspecto mixóide semelhante ao do estroma do lóbulo mamário (Fig. 6). Devido

a esta constituição, alguns autores sugerem que seja uma variante da doença

fibrocística. Geralmente ocorre em mulheres entre 25 e 30 anos, podendo ocorrer

com o crescimento da mama durante a gestação e apresentar fenômenos

regressivos depois da menopausa. Clinicamente, apresenta-se como um nódulo

isolado, podendo ser múltiplo em 20% - na mesma mama ou bilateralmente, com

margens arredondadas e lisas, de consistência fibroelástica, móvel, com tamanho

variando entre 2 e 4 cm (Fig. 7). A possibilidade de malignização de um

fibroadenoma é praticamente nula (0,1 a 0,3%) (COTRAN; COLLINS; KUMAR,

2000; VERONESI, 2002).

Figura 6 – Morfologia microscópica do fibroadenoma (H&E – 100X).

Figura 7 – Morfologia macroscópica do fibroadenoma.

3.2.2 Câncer de mama

3.2.2.1 Carcinoma não invasivo

Compreende duas entidades: carcinoma ductal in situ (CDIS) e carcinoma lobular

in situ (CLIS); por não serem invasivas, não apresentam o risco de enviar

metástases. CDIS é definido como uma proliferação de células epiteliais

Recentemente foi proposto por Veronesi et al. (2006), a adoção de uma nova

nomenclatura para neoplasias não invasivas da mama. O CDIS seria denominado NID (neoplasia

intraepitelial ductal) e o CLI de NIL (neoplasia intraepitelial lobular). Essa nomenclatura é baseada

nas observações publicadas por Tavassoli em 1998. Foi decidido, manter a nomenclatura antiga,

pois até o término do texto desta dissertação, não houve pronunciamento oficial da Sociedade

Brasileira de Mastologia nem da Sociedade Brasileira de Patologia sobre a nova classificação.

confinadas ao ducto mamário, não ultrapassa a membrana basal, originando-se do

epitélio ductal na região da unidade ducto-lobular terminal. Provavelmente

representa um estágio intermediário entre uma hiperplasia ductal atípica e um

carcinoma invasor (Fig. 8). Há um grupo heterogêneo de lesões com arquitetura

histológica variável e comportamento clínico diferente. Células malignas que

proliferam dentro do ducto podem obstruí-lo, ser associar-se a uma reação

inflamatória, à reposta estromal e à infiltração linfóide periductal. CDIS é

classificado em 5 subtipos

(MERIC et al., 2003):

Comedo: presença proeminente de necrose, que pode ser observada no exame

macroscópico da lesão pela presença decordões de material pastoso branco-

amarelado. Na histologia são verificadas células grandes e pleomórficas. Mitoses

anômalas são numerosas. Muitos dos espaços envolvidos contêm debris celulares

e necrose central (Fig. 10). O material necrótico freqüentemente calcifica,

podendo ser observadas, no exame mamográfico, microcalcificações lineares e

ramificadas.

Sólido: células tumorais preenchem e distendem o lúmen ductal, não apresentado

necrose significativa, fenestrações ou papilas (Fig. 8).

Muitas vezes, os diversos padrões arquiteturais podem coexistir em uma mesma

neoplasia.

Cribiforme: proliferação fenestrada das células neoplásicas dentro do ducto com

células pequenas com núcleos monomórficos (Fig. 9).

Micropapilar: possui pequenos tufos de células que são orientadas

perpendicularmente à membrana basal dos espaços envolvidos, projetando-se para

dentro do lúmen ductal. A região apical dessas pequenas papilas geralmente é

mais larga do que sua base e as micropapilas não possuem hastes fibrovasculares.

Possui características celulares semelhantes ao cribiforme.

Papilar: apresenta-se com projeções de células intraluminais, apoiadas em uma

base fibrovascular, constituindo papilas verdadeiras.

Considerando algumas características como citologia, histologia e clínica, alguns

autores preferem dividir o CDIS com base exclusivamente na presença de necrose

do tipo comedo em três grupos: tipo comedo puro, CDIS com necrose –comedo

não puro e o CDIS sem necrose. Também pode ser feita a classificação utilizando

as características nucleares - dimensão, pleomorfismo, disposição, contornos,

característica da cromatina e posição do nucléolo – onde o CDIS pode ser incluído

no grupo de alto grau nuclear ou G3 (núcleos grandes, pleomórficos, irregulares,

cromatina grosseira e nucléolos proeminentes); grau intermediário ou G2

(pleomorfismo leve a moderado, sem a uniformidade vista no de baixo grau); e o

de baixo grau ou G1 (monomorfismo, núcleos grosseiros e redondos, de posição

central e nucléolos pouco evidentes) (COTRAN; COLLINS; KUMAR, 2000;

HARRIS, 2000; MERIC et al., 2003).

CLIS é determinado pela proliferação de células confinadas nos lóbulos, com

arquitetura intacta na unidade ducto-lobular terminal. As células possuem uma

morfologia homogênea e não apresentam cromatina proeminente. A relação do

tamanho do núcleo/tamanho do citoplasma é normal, com mitoses raras e ausência

de necrose na maioria dos casos (Fig. 11) (MERIC et al., 2003).

Figura 8– Aspecto microscópico do carcinoma ductal in situ. Notar os ductos mamários

totalmente preenchidos por células neoplásicas, no entanto, não há invasão da membrana

basal ductal (H&E – 400X).

Figura 9 – Aspecto microscópico do CDIS cribiforme. Notar os ductos, em corte transversal,

totalmente preenchidos por células neoplásicas e com distribuição fenestrada (H&E 200X).

Figura 10 – Aspecto microscópico do CDIS tipo comedo. Notar material necrótico no interior

do lúmen preenchido por células neoplásicas (H&E 200X).

Figura 11 – Aspecto microscópico do CLIS. Notar o confinamento das células neoplásicas no

interior dos lóbulos mamários (H&E – 400X).

3.2.2.2 Carcinoma invasor

O CM possui várias apresentações histológicas. São considerados

adenocarcinomas, pois são originados em tecido epitelial glandular

(SOLORZANO et al., 2003). Os cinco tipos principais de adenocarcinomas

mamários são:

Carcinoma ductal infiltrante (CDI): corresponde a 75% dos CM, apresentando

ausência de uma característica histológica especial, ou sem outra especificação

(SOE). Macroscopicamente apresenta-se como qualquer outra neoplasia maligna

sólida: invasão dos tecidos adjacentes, imprecisão dos limites, podendo estar

associado a áreas de necrose e a vários graus de resposta fibrótica. Muitas vezes

pode ter CDIS no interior da lesão. Diferentemente do CDIS, possui células

neoplásicas em diferentes graus de diferenciação, fora do ducto mamário ou

infiltrando o parênquima glandular. A avaliação histológica das características

como formação de túbulos, atipias nucleares e índice mitótico, permite classificar

os CDIs em três grupos: neoplasias bem diferenciadas ou grau 1 (G1),

moderadamente diferenciadas ou grau 2 (G2) e pouco diferenciadas (G3). Esta

classificação representa um dos fatores prognósticos mais importantes

relacionados ao tipo morfológico (VERONESI et al., 2002). Pode metastatizar

para os linfonodos axilares, considerando fatores prognósticos associados. O

prognóstico tende ser pior, quando comparado ao de pacientes que possuem outro

subtipo histológico de CM. Quando compromete órgãos à distância, possui

preferência por ossos, pulmão, fígado e cérebro (COTRAN; COLLINS; KUMAR,

2000; SOLORZANO et al., 2003), (Figs. 12 a 15).

CDI inflamatório: considerado separadamente dentro do grupo de CDI, uma vez

que apresenta características clínicas e histológicas bem definidas. Representa

uma forma avançada de CM e, consequentemente, com prognóstico reservado.

Clinicamente, a paciente com essa doença possui edema e hiperemia difusos na

porção cutânea da mama, dando um aspecto erisipelóide, usualmente sem massa

palpável associada (Fig. 16). Essa apresentação clínica peculiar é devida à

embolização tumoral dos vasos linfáticos da derme, o que é bem característico

histologicamente (HARRIS et al., 2000).

Figura 12 – Aspecto macroscópico do CDI sem outra especificação (SOE).

Figura 13 – Aspecto microscópico do CDI sem outra especificação (SOE). Nota-se o

potencial de invasão das células neoplásicas (setas azuis) em permeio ao parênquima

mamário (setas verdes) (H&E - 400X).

Figura 14 – Microscopia mostrando êmbolo neoplásico no interior de um canal linfático

(H&E 400X).

Figura 15 – RX de tórax mostrando múltiplas lesões metastáticas (M), no parênquima de

ambos os pulmões.

Figura 16 – Aspecto clínico do CDI inflamatório.

Carcinoma lobular infiltrante (CLI): é visto em 5 a 10% dos casos de CM. À

microscopia, esse tipo de neoplasia possui pequenas células arranjadas em fila

única, com tendência de crescimento ao redor dos ductos e lóbulos (Fig. 17).

Multicentricidade é observada mais freqüentemente do que no CDI. Além do

padrão de metástase dos outros subtipos histológicos de CM, possui tendência

maior de enviar metástase para locais não usuais como meninges e superfícies

serosas (COTRAN; COLLINS; KUMAR, 2000; SOLORZANO et al., 2003).

Carcinoma tubular: ocorre em 2% dos CM, e seu diagnóstico é considerado

quando mais de 75% do tumor possui formação tubular (Fig. 18). Metástases

axilares são incomuns e o prognóstico é consideravelmente melhor em relação aos

outros subtipos de CM (VERONESI, 2002).

Carcinoma medular: corresponde de 5 a 7% dos subtipos histológicos de CM.

Histologicamente, são caracterizados como neoplasia com células contendo

núcleos pobremente diferenciados, e padrão de crescimento sincicial (Fig. 19).

Apresenta margem bem circunscrita e intensa infiltração de pequenos linfócitos e

plasmócitos. O prognóstico tende a ser favorável se todas estas características

estiverem presentes (SOLORZANO et al., 2003).

Carcinoma mucinoso ou colóide: É caracterizado por acúmulo abundante de

mucina extracelular envolvendo agrupamentos de células neoplásicas (Fig. 20) e

representa 3% dos casos de CM. Possui crescimento lento e tende a ser volumoso.

Se o CM é predominantemente mucinoso, o prognóstico é favorável (COTRAN;

COLLINS; KUMAR, 2000).

Doença de Paget mamária: Compreende até 5% de todas as neoplasias malignas

da glândula mamária. Quase sempre é associada com um carcinoma mamário

subjacente (95%), que pode ser invasor ou in situ (90% dos casos quando a lesão

não é palpável). As células de Paget geralmente se apresentam grandes,

arredondadas ou ovóides dentro da epiderme, com um citoplasma claro e

abundante contendo um núcleo hipercromático e pleomórfico (Fig. 21). Ainda não

está definido se a manifestação cutânea, com aparência eczematóide, se deve à

multiplicação celular, que por continuidade intraductal de uma lesão neoplásica do

parênquima mamário atinge a epiderme, ou se as células de Paget teriam origem

na porção terminal dos ductos lactíferos - na junção com o epitélio cutâneo –

sendo células epidérmicas que sofreram metaplasia para células epiteliais ductais

(FARLEY et al., 2001).

Outros tipos de neoplasias malignas mamárias: Existem inúmeras neoplasias

malignas que podem acometer a glândula mamária. Podem ser provenientes tanto

do estroma quanto do tecido epitelial, sendo classificados em sarcomas

(leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma), carcinomas cribiformes, carcinomas com

diferenciação neuro-endócrina, carcinomas epidermóides primários de mama (CDI

com metaplasia para células escamosas) ou lesões metastáticas de outras

neoplasias sistêmicas (KOPANS, el al, 1997; HARRIS et al, 2000).

Figura 17 – Aspecto histológico do CLIS. Notar a infiltração no parênquima mamário pelas

células neoplásicas (H&E – 300X).

Figura 18 – Aspecto histológico do carcinoma tubular de mama. Observar as estruturas

tubulares em meio ao tecido conjuntivo amorfo (H&E – 300X).

Figura 19 – Morfologia microscópica do carcinoma medular mamário. Notar a formação de

estruturas sinciciais (setas) (H&E – 100 X).

Figura 20 – Morfologia microscópica do carcinoma mucinoso ou colóide mamário. Notar a

quantidade de mucina (setas) associada a grupos de células epiteliais neoplásicas (H&E – 200

X).

Figura 21 – Morfologia microscópica da Doença de Paget mamária. Células de Paget em

permeio a epiderme areolar (setas) (H&E – 400 X).

3.3 Diagnóstico

O diagnóstico de CM passou por uma mudança importante nos últimos anos.

Previamente, cerca de 50 a 70% dos CM eram diagnosticados pelo exame físico.

Com o advento da mamografia como exame de rastreamento houve um aumento

considerável no diagnóstico de lesões sub-clínicas (Fig. 22). A partir disso, houve

a necessidade do desenvolvimento de técnicas de biópsia (KOPANS et al., 1997).

Figura 22 – Mamografia mostrando o aspecto radiológico de uma lesão nodular (seta) sub-

clínica.

3.4 Tipos de Biópsia

A obtenção de material biológico para o diagnóstico da lesão mamária, pode ser

feita de várias formas. A lesão pode ser retirada totalmente (biópsia excisional) ou

parcialmente (incisional). Também pode ser obtida somente uma amostra celular,

do conteúdo tumoral, através da biópsia aspirativa com agulha fina (PAAF). Para

isso, há diferentes técnicas descritas abaixo relatadas.

3.4.1 PAAF

PAAF tornou-se um método útil para obter amostra tecidual na grande maioria dos

sítios do corpo humano, sendo uma prática comum na rotina da mastologia. Foi

usada primeiramente na década de 30 por Hayes e difundida a partir da década de

60 por Franzén (Suécia) e Zajicek (França) (BOFIN et al., 2004). Apresenta

resultados falso-negativos em até 15% dos casos, enquanto que resultados falso-

positivos são irrelevantes representando, abaixo de 1% na maioria das séries. No

entanto, um exame citológico negativo em lesões clínica e mamograficamente

benignas não deve excluir a realização de biópsia histológica, antes da realização

do procedimento definitivo (Fig. 23). Uma lesão sólida que surge após os 30 anos,

mesmo com todas as características de benignidade, deve ser sempre submetida à

PAAF e depois avaliar a necessidade de excisão cirúrgica. Para sua realização, são

necessários materiais simples: material para a assepsia, lâminas de vidro para o

esfregaço, fixador, seringa de plástico de 20ml, dispositivo em forma de pistola

para fixar a seringa e agulhas “finas” (calibre de 22G e 23G). O procedimento

pode ser realizado “às cegas”, quando a lesão é palpável, ou dirigida por exame de

imagem, quando a lesão for subclínica. O risco biológico de disseminação

neoplásica durante a realização do procedimento, praticamente inexiste

(SCHILLER et al., 2001) Complicações hemorrágicas, como hematoma e

equimose podem ocorrer principalmente se a PAAF for realizada em locais onde a

mama é mais vascularizada na superfície. O risco de infecção é o mesmo da

injeção intramuscular. Pneumotórax pode ser provocado pela penetração excessiva

da agulha com perfuração da parede torácica (1 caso em 10.000 punções),

(KOPANS et al., 1997).

Figura 23 – Aspecto citológico do carcinoma ductal mamário. Não é possível determinar se a

neoplasia é invasora ou in situ.

3.4.2 Core Biopsy

(CB)

CB é realizada para obter um fragmento pequeno do tecido tumoral. Quando

realizada corretamente, o diagnóstico histológico pode ser feito da mesma maneira

que na lesão retirada totalmente. A amostra tecidual é obtida com agulhas de

calibre grosso (14G ou 16G) e por isso, é necessário utilizar anestesia local. Por

fornecer uma amostra tecidual considerável (Fig. 24), permite o diagnóstico

diferencial entre carcinomas invasores de CDIS e diagnóstico específico de lesões

benignas, muitas vezes difícil de realizar em esfregaços citológicos provenientes

de PAAF (BOFIN et al., 2004). Assim como qualquer técnica de biópsia, CB

possui a chance de não conter amostra tumoral, ou não conter porção suficiente do

tumor e do parênquima mamário adjacente dificultando o diagnóstico de lesões

que necessitam da avaliação do tecido peritumoral para fazer o diagnóstico,

podendo resultar em casos falso-negativos. A movimentação do dispositivo

interno da agulha pode romper a membrana basal ductal e prejudicar a avaliação

da presença de invasão na amostra histológica. O risco de hematoma é maior que

na PAAF, devido ao calibre da agulha. Também há risco de pneumotórax. Assim

como na punção aspirativa, a CB pode ser realizada utilizando, ou não, orientação

radiológica (KOPANS et al., 1997).

Figura 24 – Técnica de CB. A amostra neoplásica é retirada em forma de pequenos cilindros

com espessura de acordo com o calibre da agulha. A técnica de mamotomia utiliza um

dispositivo que além de cortar o fragmento aspira o conteúdo selecionado. Modificado de

Netter (2003).

3.4.3 Mamotomia

É um sistema que associa o princípio da CB com sucção assistida da lesão

orientada por imagem. Através do mamótomo é possível remover toda a lesão, que

é fragmentada pela agulha e aspirada continuamente, sem a remoção do

dispositivo, servindo tanto como procedimento de diagnóstico como de tratamento

para lesões benignas. Todos os fragmentos são enviados para exame histológico

(Fig. 24). Este método diminui a probabilidade de erro amostral. No entanto, é

uma técnica cara, pois necessita de vários equipamentos e equipe

multiprofissional. Também não exclui complicações como hematoma e infecção e

requer que o paciente permaneça em posição desconfortável, na maioria das vezes,

para a sua execução (VERONESI et al., 2002; DREW; IWUAGWU, 2004).

3.4.4 Biópsia cirúrgica sem demarcação

Pode ser excisional ou incisional, sendo muito utilizada em centros de saúde onde

não há disponibilidade de outras técnicas de biópsia, devido à falta de recursos

materiais ou humanos, ou quando os outros métodos não obtiveram amostra

histológica adequada. Só pode ser realizada se a lesão mamária for palpável.

Possui o inconveniente de grande manipulação da área lesional, o que pode ser

prejudicial para o paciente se a lesão for uma neoplasia maligna, pois o parâmetro

de localização tridimensional da mesma é perdido, dificultando uma re-

intervenção para ampliação de margens (HARRIS et al., 2000; VERONESI et al.,

2002).

3.4.5 Agulhamento pré-operatório

Também conhecido como demarcação pré-operatória com agulha. Para sua

realização, é necessário o uso de uma agulha maleável, que possui um “arpão” na

extremidade distal que é “armado” dentro da área do parênquima mamário a ser

retirada (Figs. 25A e B). A colocação da agulha é realizada sob a orientação de

imagem e o paciente permanece com o dispositivo no interior da mama até a

realização da excisão cirúrgica. Possui o risco de deslocamento da agulha durante

o período entre sua colocação e a retirada, principalmente em glândulas mamárias

com componente adiposo predominante. Também já foram descritos casos de

pneumotórax e transecção da agulha durante o procedimento cirúrgico. Além

disso, o procedimento de retirada da lesão, na maioria das vezes, é realizado sob

anestesia geral, pois a movimentação da agulha durante a cirurgia, pode ser

desagradável (KOPANS et al., 1997).

(A)

(B)

Figura 25 – Demarcação pré-operatória de lesão mamária não palpável pela técnica de

agulhamento (A), peça cirúrgica contendo microcalcificações supeitas na proximidade da

extremidade da agulha (B).

3.4.6 ROLL

A localização radioguiada de lesão oculta (ROLL), é um método que vem sendo

muito usado na prática da mastologia desde 1996, quando foi desenvolvido no

Instituto Europeu de Oncologia (ZURRIDA et al., 1998). Um material radioativo

é injetado na lesão não palpável, seja agrupamento de microcalcificação, nódulo

ou outra apresentação radiológica, utilizando um método de imagem auxiliar como

estereotaxia, ecografia, entre outros (Fig. 26). Durante o procedimento cirúrgico, a

lesão é localizada com a utilização de um gama probe manual, que orienta a

incisão cutânea e a localização da lesão (Fig. 27). Após a excisão, pode ser

verificada a radiação residual no leito cirúrgico e se há ou não necessidade de

ampliação de margem. O método é melhor que a demarcação com agulha, pois

evita o uso do arpão de metal (GRAY et al., 2001). Outra característica que deve

ser considerada na utilização do ROLL é a diminuição dos custos em relação ao

agulhamento, pois não requer o uso de anestesia geral nem de internação

hospitalar. Mesmo assim requer a participação de uma equipe multiprofissional,

incluindo o mastologista, o radiologista e o médico nuclear além dos profissionais

de apoio (ZURRIDA et al., 1998; VERONESI, 2002).

0.1mCi de Tc

em partículas de albumina sérica humana (com 10-150 µm de diâmetro),

perfazendo um total de 0,5mg de micro-agregado que é diluído em 0,2ml de soro fisiológico, para

então ser injetado (GRAY et al., 2001).

(A)

(B)

Figura 26 – ROLL - MMG mostrando o momento de injeção do Tc

juntamente com

contraste iodado (A), cintilografia mamária evidenciando o local exato da lesão que será

retirada (B).

Figura 27 – Fotografia do gama probe Navigator GPS

, utilizado para ROLL no trans-

operatório.

3.5 Fatores prognósticos do câncer de mama

O risco de desenvolvimento de metástases aumenta com o número de linfonodos

comprometidos pela lesão primária, tamanho maior do tumor mamário e com o

grau de perda da diferenciação celular, que são fatores prognósticos estabelecidos

e independentes. Fatores de risco apresentados na Tabela 1, como invasão

angiolinfáfica (Fig. 14), são importantes quando considerados em associação com

outros fatores como o comprometimento metastático dos linfonodos. Os subtipos

histológicos de CM também influenciam no prognóstico e estão listados na Tabela

2, (VERONESI et al., 2002; WEIGELT et al., 2005).

Tabela 1 – Marcadores prognósticos para metástases de CM

Marcador Uso clínico Determinante metástico Observação

Tamanho do tumor

(diâmetro)

Estabelecido

< 2cm: risco menor

2-5 cm: risco alto

> 5 cm: risco muito alto

Marcador

prognóstico

independente

Comprometimento

metastático em

linfonodo axilar

Estabelecido

Sem comprometimento: baixo risco

com comprometimento: risco alto

> 4 linfonodos: risco muito alto

Relacionado ao

tamanho do tumor

primário

Grau histológico Estabelecido

Grau 1: baixo risco

Grau 2: risco intermediário

Grau 3: risco muito alto

Relacionado ao

tamanho do tumor

primário

Invasão vascular

Estabelecido em

pacientes com

linfonodos sem

metástases

Presença de êmbolo tumoral em

mais de 3 vasos é associada com

Em pacientes com

linfonodos sem

metástases

Nível de proteínas

uPA/PAI1

Estabelecido

Índices elevados de proteínas uPA

and PAI1 são associados com risco

aumentado de MT

Marcador

prognóstico

independente

Receptor de

estrogênio

Estabelecido para

decisão de terapia

adjuvante

Baixos níveis de receptores são

associados com metástases

Relacionado com o

grau histológico

Expressão proteica e

amplificação do gene

ERBB2

Estabelecido para

decisão de terapia

adjuvante

Amplificação/superexpressão são

associadas com MT

Em pacientes com

linfonodos positivos

Perfil de expressão

gênica

Atualmente sendo

avaliado

Uma “assinatura boa” de 70 genes é

associada com risco baixo de MT.

Uma “assinatura ruim” de 70 genes

é associada a um alto risco de MT.

Testado em

pacientes com

linfonodos não

comprometidos

Tabela modificada de Weigelt et al (2005).

Metástases.

PAI 1 – inibidor – ativador do plasminogênio; uPA – ativador do plasminogênio tipo

uroquinase.

Marcadores que podem predizer o local de metástases são escassos. Foi

verificado que CM que possui receptor de estrogênio positivo tem predisposição a

desenvolver metástases em ossos, enquanto carcinomas lobulares recidivam com

uma freqüência maior em trato gastrointestinal e ovários. Atualmente, marcadores

prognósticos tradicionais são capazes de identificar um grupo de

aproximadamente 30% dos pacientes que provavelmente terão um curso favorável

ou desfavorável da doença. Para os 70% restantes, novos marcadores prognósticos

são necessários para identificar grupos de baixo e alto risco, e direcionar o melhor

tratamento sistêmico adjuvante (HARRIS et al., 2000; WEIGELT et al., 2005).

Tabela 2 – Tipos histopatológicos de CM.

Histologia Freqüência

Índice de sobrevida

em 10 anos

Carcinoma ductal invasivo SOE

50-80% 35-50%

Carcinoma lobular invasivo

5-15% 35-50%

Tipo misto (ductal + lobular)

4-5% 35-50%

Carcinoma cribiforme

invasivo/tubular

1-6% 90-100%

Carcinoma mucinoso

<5% 80-100%

Carcinoma medular

1-7% 50-90%

Carcinoma papilar invasivo

<1-2% desconhecido

Carcinoma micropapilar invasivo

<3% desconhecido

Carcinoma metaplásico

<5% desconhecido

Carcinoma adenóide cístico

0,1% desconhecido

Carcinoma apócrino invasivo

0,3-4% desconhecido

Carcinoma neuroendócrino 2-5% desconhecido

Carcinoma secretório

0,01-0,15% desconhecido

Carcinoma rico em lipídio

<1-6% desconhecido

Outros

1-3% desconhecido

Tabela modificada de Weigelt et al, 2005.

3.6 Espectroscopia Raman

3.6.1 Histórico e princípios

O efeito Raman foi descrito em 1928 por Chandrasekhara Venkata Raman, que lhe

rendeu o prêmio Nobel da física em 1930 (RAMAN, 1930; SINGH, 2002). Assim

como várias descobertas importantes da humanidade, foi através da observação de

um fenômeno natural que Raman formulou a hipótese do efeito. Após verificar o

espalhamento da luz solar na água do oceano

(the colour of the sea), ele notou

que se tratava de um fenômeno comum que pode ser visto não somente em gases

ou vapores como também em líquidos e estruturas sólidas amorfas e cristalinas. É

um efeito originário do desarranjo molecular e flutuações da densidade óptica do

material observado. Com exceção do material sólido amorfo, o desarranjo pode ser

caracterizado como uma agitação térmica. Como as moléculas são opticamente

anisotrópicas, podem ser orientadas livremente em material líquido, produzindo

assim um tipo adicional de espalhamento. Quando a luz incide sobre um material

pode ocorrer absorção ou espalhamento da mesma. A maior parte da luz espalhada

apresenta a freqüência da luz incidente e uma pequena parte da luz incidente

interage com as moléculas do material exposto produzindo vibração molecular.

Uma vez que a energia da luz é proporcional à freqüência, a alteração da

freqüência da luz espalhada será igual à freqüência vibracional das moléculas em

espalhamento. O processo de troca de energia entre as moléculas espalhadas e a

luz incidente é denominado de efeito Raman (Fig. 28). A luz espalhada pode ser

coletada por um espectrômetro e demonstrada como um “espectro”, em que a

A cor azul do mar, apesar da absorção de comprimentos de onda grandes, é causada pelo

espalhamento molecular da luz na água, e não reflexão da cor do céu, como a maioria das pessoas

imaginava (MANOHARAN; WANG; FELD, 1995).

intensidade evidenciada está em função da sua mudança de freqüência (Fig. 29).

Partindo do princípio de que cada espécie molecular possui uma única

configuração de vibração molecular, o espectro Raman de uma espécie particular

será constituída de um conjunto de picos ou bandas para cada uma das ligações

moleculares (MANOHARAN; WANG; FELD, 1995).

Durante muito tempo, a ER foi usada para análise molecular e química, sendo que

recentemente vem sendo utilizada para avaliação de compostos biológicos com

aplicação biomédica como método diagnóstico (FRANK et al., 1994; FRANK;

MCCREERY, 1995; HUONG, 1996; PILOTTO et al., 2001; EIKJE, 2005).

O espalhamento Raman é originariamente fraco, com 10

-9

a 10

-6

de intensidade, o

que torna necessário o uso de detectores sensíveis e uma luz monocromática

intensa de excitação encontrada nos lasers modernos. Além disso, a utilização de

ER em tecidos biológicos possui certas particularidades não aplicáveis a outros

materiais, pois o tecido biológico tem uma composição não homogênea. Essa

heterogeneidade resulta em diferentes formas de interação com a luz (KORTUM;

MURACA, 1996).

Figura 28 – Efeito Raman: excitação utilizando UV, luz visível e infravermelho próximo. S

estado fundamental; S

e S

- estados eletrônicos excitados. As linhas horizontais indicam os

níveis vibracionais de energia. ν

indica a freqüência de excitação do laser enquanto que, ν

indica a freqüência da luz espalhada (Raman). Adaptado de Manoharan; Wang ; Feld, 1996 ;

Hanlon et al., 2000.

Figura 29 – Espectro Raman infravermelho-próximo do colesterol indicando as curvas

(bandas) das ligações entre os elementos moleculares. Adaptado de Hanlon et al., 2000.

O fato de que a emissão da fluorescência, através de um tecido, ser na ordem de

um milhão de vezes maior do que o espalhamento Raman, provoca uma severa

interferência no sinal Raman quando usados comprimentos de onda UV próximo e

da região visível. No entanto, se o comprimento de onda excitante for maior que

700 nm, utilizando infravermelho próximo (IR), ou menor que 300 nm, esta

interferência não ocorre. Radiação IR geralmente não induz excitação dos estados

eletrônicos (Fig. 28), portanto a maioria dos materiais, principalmente material

biológico não exibe fluorescência. Outra forma de evitar o efeito da fluorescência

no espectro Raman, é a utilização de comprimento de onda menor que 300 nm,

processo conhecido como espectroscopia Raman ressonante UV (ERUV). A luz

IR penetra profundamente (>1 mm) no tecido e portanto, pode ser utilizada em

amostras teciduais grandes, sendo possível analisar componentes que se

encontram abaixo da superfície da amostra. Já a penetração da luz UV é pequena

(< 50 µm), podendo ser utilizada no estudo superficial das amostras biológicas,

além disso, o fato da ERUV ser ressonante facilita o estudo de constituintes

presentes em baixa concentração na amostra (MANOHARAN; WANG; FELD,

1995; KORTUM; MURACA, 1996).

3.6.2 ER com transformada de Fourier (TF)

ER com TF utiliza como fonte de excitação o laser de Nd: YAG (1064 nm), que

mantém a maioria das bandas de absorção dos fluoróforos fora do espectro

Raman; um interferômetro de Maxwell e um detector Ge para a coleta de sinais

Raman livres de fluorescência (Fig. 30). Possui a capacidade de coletar vários

comprimentos de onda em um curto período de tempo. A excitação no

infravermelho próximo a 1064 nm também minimiza a degradação fotolítica da

amostra, permitindo que uma maior potência de incidência do laser seja utilizada

para compensar a redução da seção de espalhamento Raman. No entanto, o

detector Ge produz ruídos eletrônicos, necessitando um tempo maior de exposição

O espectro de freqüências ou TF foi desenvolvido por Jean Fourier em 1822. A TF é uma

ferramenta matemática de aplicabilidade na resolução de problemas de processamento digital de

imagens podendo ser utilizada para a análise ou reconstrução bi-dimensional de imagens em geral,

devido sua facilidade e rapidez de cálculo (REZA, 1999).

para a coleta dos dados, normalmente 10 minutos, para poder adquirir espectro

Raman de boa qualidade de sinal/ruído (MANOHARAN; WANG; FELD, 1996;

HANLON et al, 2000).

Figura 30 – Representação esquemática do dispositivo para Raman com Transformada de

Fourier (TF). Adaptado de Manoharan; Wang; Feld, 1996.

3.6.3 ER e câncer

Considerando que o surgimento do câncer é dado por alterações na composição

bioquímica da célula

e que a ER é sensível a essas alterações moleculares, pode-

se dizer que é uma técnica em potencial para ser utilizada no diagnóstico de lesões

malignas e pré-malignas. A utilização do ER neste tipo de material é possível

graças ao grande número de moléculas teciduais específicas. Proteínas, lipídeos e

ácidos nucléicos apresentam “assinaturas” Raman distintas (Fig. 29) (DACOSTA

et al., 2002; BIGIO; BOWN, 2004). A quantidade destes elementos se encontra de

forma diferenciada em tecido neoplásico e no tecido biológico normal. Em estudos

prévios, alguns metabólitos presentes em determinadas neoplasias apresentaram

significância diagnóstica na ER (MANOHARAN; WANG; FELD, 1996;

NIJSSEN et al., 2002; MARTINS et al., 2004; HAMMOND et al., 2004;

PEREIRA et al., 2004).

Além disso, outras modificações bioquímicas de conteúdo, aneuploidia e

hipometilação do DNA, podem ser caracterizadas em espectros de neoplasias

Composição celular é dada principalmente por água (90%). O restante das moléculas presentes

(peso seco) é composto aproximadamente por: 50% proteína,15% carbohidrato, 15% ácido

nucléico, 10% lipídio, 10% outros. Considerando o elemento químico, a composição aproximada é:

60% hidrogênio, 25% oxigênio, 12% carbono, 5% nitrogênio. Outros elementos significantes que

constituem estruturas moleculares da célula são o fósforo (P) e o enxofre (S). Em adição há traços

de sódio (Na), magnésio (Mg), cloro (Cl), potássio (K), cálcio (Ca) e ferro (Fe) e em menor

freqüência outros metais (KRAFFT, 2003).

(ALLAIN; VO-DINH, 2001; CASPERS; LUCASSEM; PUPPELS, 2003; GÃO;

BUTLER; KREMER, 2003).

3.7 ER e câncer de mama

3.7.1 Caracterização do epitélio mamário normal na ER

Conforme visto no item 3.2.2, o CM se caracteriza pela proliferação de células

ductais epiteliais. Conhecer as características do espectro do epitélio normal

mamário é de fundamental importância antes da caracterização deste componente

neoplásico. Em estudos prévios (SCHAEBERLE et al., 1996; KNEIPP et al.,

2003; BITAR et al., 2005; HAKA, 2005), essa caracterização foi, de um modo

geral, facilmente feita quando realizada a comparação visual. O tecido mamário

normal possui grande quantidade de lipídios identificada por intensas bandas

Raman: 1270 cm

-1

do modo vibracional de estiramento ν(CN) e de dobramento

δ(NH); 1304 cm

-1

e 1446 cm

-1

do modo vibracional de dobramento δ(CH

); 1645

-1

do modo vibracional de estiramento da ligação C=C e 1745 cm

-1

do modo

vibracional de estiramento da ligação C=O (FRANK et al., 1994; FRANK;

MCCREERY, 1995; HUONG, 1996; BITAR et al., 2004) (Fig. 31; Tab. 3).

Figura 31 – Média dos espectros TF-Raman não normalizados do tecido mamário normal

representados entre 1200 a 1800 cm

–1

. (Modificado de Bitar et al., 2005).

Tabela 3 – Modos vibracionais e biomoléculas referentes aos picos Raman de tecido

mamário humano. Adaptado de Bitar et al., 2005.

Picos

Modos Vibracionais Biomoléculas

1 (S-S), (-CO) e (-NO), (O-P-O)

Cisteína, Hemoprotéinas, Ácidos Nucléicos

?(C-C), d(CCH), Anel Aromático, (O-P-

Prolina, Tirosina, Polissacarídeos, Ácidos Nucléicos

?(C-C), a-helix, (O-P-O)

Prolina, Valina, Colágeno, Desoxirribose

(C-C), Anel Aromático, (C-CH

)

Fenilalanina, Carotenóides

? (C-C) ou ?(C-O), (-CH OH)

Fosfolipídios, Carboidratos

?(CN), d(NH), Amina III, a-helix, (=C-H)

Colágeno, Triptofano, Lipídios

d(CH

),(dCH

)

Colágeno, Fosfolipídios, Triglicérides

d(CH

), d(CH

), (O-P-O)

Colágeno, Fosfolipídios, Desoxirribose,

Carboidratos

?(C=O), Amina I, a-helix, (C=C)

Colágeno, Elastina, Lipídios

?(C=O)

Fosfolipídios

(C-O)

Proteínas, Ácidos Nucléicos

12 C=O/ C-N/ C-O Proteínas, Ácidos Nucléicos

3.7.2 Caracterização do epitélio mamário neoplásico na ER

Manoharan, Wang e Feld (1996) conseguiram obter o diagnóstico diferencial entre

mama normal daquelas com alterações benignas e malignas, obtidas de amostras

citológicas, utilizando a técnica de Espectroscopia Micro-Raman, com o objetivo

de melhorar a exatidão do diagnóstico. Desde então, vários trabalhos utilizando

ER caracterizaram diferentes condições neoplásicas mamárias, sendo possível

identificar diferenças espectrais entre CDI, CDIS e subtipos, além de AFBM e

neoplasias benignas como fibroadenoma (Fig. 32), (BITAR et al., 2005; HAKA et

al., 2005).

1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

1270cm

-1

1747cm

-1

1657cm

-1

1446cm

-1

1304cm

-1

Tecido Mamário Normal

Doença Fibrocística

Carcinoma Ductal in Situ

Carcinoma Ductal in Situ Comedo

Carcinoma Ductal Infiltrante

Carcinoma Ductal Infiltrante Inflamatório

Carcinoma Ductal Infiltrante Medular

Carcinoma Ductal Infiltrante Mucinoso

Carcinoma Lobular Infiltrante

Intensidade (u.a.)

Deslocamento Raman (cm

-1

)

Figura 32 – Média dos Espectros TF-Raman não-normalizados dos diferentes tecidos

mamários representados entre 1200 a 1800cm

-1

. (BITAR et al., 2005).

4 METODOLOGIA

4.1 Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa

O levantamento e análise dos dados foram realizados seguindo as diretrizes e

normas que regulamentam pesquisas envolvendo seres humanos, conforme

Resolução n

196/96 do Conselho Nacional de Saúde, após aprovação do Comitê

de Ética em Pesquisa da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP)

(017/2000/CEP – anexo A). Todas as pacientes foram informadas sobre a pesquisa

e assinaram um termo de consentimento para utilização do material coletado

(apêndice A).

4.2 Obtenção das amostras de tecido mamário

As amostras de tecido mamário foram obtidas de 82 pacientes do gênero feminino,

sendo 60 delas submetidas à cirurgia no Hospital Regional do Oeste, Chapecó-SC,

e 22 pacientes do Ambulatório de Mastologia do Hospital do Câncer A. C.

Camargo, São Paulo-SP. O período de coleta estendeu-se de abril de 2005 a março

de 2006. As amostras compreenderam tecido mamário normal

, tecido mamário

Todas as amostras de tecido mamário normal foram provenientes de mamas de pacientes

submetidas à mamoplastia redutora.

com doença benigna, doença pré-maligna e diferentes tipos de neoplasias malignas

mamárias.

Todas pacientes com lesão possuíam diagnóstico cito ou histopatológico da

doença mamária no momento da primeira consulta obtido através de uma das

técnicas descritas no item 3.4. A coleta das amostras foi realizada após a ressecção

da lesão, dentro do bloco cirúrgico. As amostras apresentaram diferentes tamanhos

e formatos, com dimensões variando de 0,3 x 0,5 x 0,3 cm a 0,5 x 1,5 x 0,5 cm.

Todas as amostras foram identificadas e colocadas em tubos criogênicos Nalgene

(Fig. 33), sendo armazenadas em nitrogênio líquido a –196

C até o momento da

realização da análise por ER no Laboratório de Espectroscopia Vibracional

Biomédica (LEVB) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) em São José

dos Campos, São Paulo.

4.3 Obtenção dos espectros TF-Raman

4.3.1 Espectrômetro TF-Raman

O equipamento utilizado neste estudo para aquisição dos espectros Raman das

amostras de mama humana foi o espectrômetro TF-Raman RFS 100 da Bruker

Alemanha, instalado no LEVB (Fig. 34). A seguir é descrito a composição do

espectrômetro:

Figura 33 – Material utilizado para armazenar e preparar a amostra para a leitura: tubos

criogênicos Nalgene (1), cabo de bisturi com lâmina n

15 (B), tesoura de íris (3), pinça

anatômica simples oftálmica (5), lamínula com o porta amostra(6).

Figura 34 – Espectrômetro TF-Raman RFS 100, Bruker. (1) detector de Germânio resfriado

por nitrogênio líquido, (2) caixa óptica – corpo do equipamento, (3) estágio motorizado-

controlador dos eixos “x”, “y” e “z” do porta-amostra do equipamento, (4) micro-Raman, (5)

porta-amostra (6) câmara do porta-amostra.

4.3.1.1 Laser Nd: YAG (Neodímio: Ítrio Alumínio Granada)

O laser de Nd: YAG usado no espectrômetro TF-Raman emite alta intensidade de

radiação, em 1064 nm. A potência do laser deste equipamento é de, no máximo,

500 mW; podendo ser eletronicamente ajustada para cada tipo de amostra. Neste

experimento, a potência ajustada na amostra foi de 235 mW, para que ocorresse a

coleta dos sinais com melhor razão sinal/ruído, sem que houvesse aquecimento ou

degradação do material biológico exposto à luz.

4.3.1.2 Parâmetros do equipamento

A geometria de espalhamento utilizada foi de 180

e a amostra foi fixada em um

suporte de alumínio pressionado contra uma lamínula (Figs. 35 e 36).

Figura 35 – Porta-amostras: 0,5cm de diâmetro com porção central de 1 mm.

Figura 36 – Posicionamento da amostra entre o porta-amostra e a lamínula de vidro. O

conjunto é fixo manualmente.

Com o software instalado no TF-Raman Spectrometer RFS 100 (OPUS 4.2

Bruker Optik GmHb 1997-2002) todos os parâmetros do

equipamento foram ajustados (Tabela 4), além do armazenamento e manipulação

dos dados espectrais, análises quantitativas e armazenamento dos resultados em

forma de biblioteca.

Tabela 4 - Parâmetros ajustados com auxílio do Software OPUS 4.2 para a aquisição dos

espectros no TF-Raman Spectrometer RFS 100.

Espectrômetro TF-Raman RFS 100

Tecido Mamário

Espera antes das medidas 05 segundos

Espera para Estabilização 10 segundos

Número de Varreduras 300

Resolução

4 cm

-1

Tempo total de Varreduras (médio)

5 minutos por ponto

Abertura da fenda 7 mm

Potência do laser Raman 300 mW

Potência do laser na Amostra 235 mW

Velocidade da Varredura 5.0 KHz

Lente Objetiva 180

Porta amostra alumínio + lamínula de vidro

Número de pontos por amostra 3 pontos

Centro de interferograma 58057

4.3.2 Preparação das amostras de tecido mamário

Imediatamente antes da análise espectral, a amostra era descongelada em soro

fisiológico (0,9%) em temperatura ambiente. Depois de cortada em fragmentos de

2 mm utilizando um bisturi lâmina número 15, a amostra era posicionada na

porção central do porta-amostra de alumínio para proceder a leitura no

espectrômetro (Figs. 33 e 35).

4.3.3 Número de espectros por amostra

O número de amostras por paciente variou entre 3 a 9. Cada amostra foi submetida

a leitura de 3 pontos, sendo que cada ponto resultou em um espectro. Para o

posicionamento dos pontos foi utilizado o estágio motorizado, onde os eixos “y” e

“z” foram mantidos fixos em 100 e 102 respectivamente, enquanto o eixo “x” foi

alterado em 100, 90 e 110 resultando em pontos A, B e C de leitura (Fig. 37).

Figura 37 – Posicionamento da amostra utilizando o estágio motorizado.

4.3.4 Análise dos dados espectrais

A avaliação da qualidade do espectro pode ser feita de duas formas: com um

dendograma (análise clustering) ou com um teste de identidade. Optou-se pela

primeira forma de análise por ser um método de simples compreensão. A análise

clustering é realizada quando se possui n itens (objetos/variáveis), estruturando

uma matriz de distâncias entre os elementos e é usada para estabelecer

similiraridades. Os dois elementos mais próximos, de menor distância, são

unificados formando uma nova matriz (dimensões (n-1)x(n-1)), gerando com isso

um novo objeto ou grupo (MILLIGAN; COOPER, 1988). Isso se repete até

formar um grupo somente, e todas as etapas são registradas pela construção de um

dendograma

O dendograma é apresentado graficamente com uma raiz principal formada pela

união de dois grupos principais que por sua vez foram formados por outros dois e

assim por diante. Apresenta uma escala de distâncias que indica o nível em que

dois grupos tornam-se um (Fig. 38).

Diagrama em forma de árvore, bastante usado pelos taxonomistas (MILLIGAN;

COOPER, 1988).

Figura 38 – Dendograma representando o agrupamento sucessivo dos objetos A, B, C, D, E e

F. Notar que as distâncias d

e d

representam os pontos em que os agrupamentos

foram formados.

Dependendo do nível e da quantidade de agrupamentos desejada, pode-se tomar

um determinado valor para se estabelecer a resposta de quais objetos estão

contidos em quais agrupamentos. Por exemplo, um valor entre d

e d

na Fig. 38,

haverá dois agrupamentos: {C,D} e {E}. Com isso, devem ser medidas a distância

entre dois objetos individuais e a distância entre dois grupos de objetos. O grau de

diferença entre dois grupos, medido através de sua distância, sugere algum tipo de

média das distâncias individuais ou soma das distâncias entre os centros dos

conglomerados.

Os espectros foram agrupados através do software MINITAB

versão 14.20,

utilizando o cálculo do coeficiente de correlação entre os dados apresentados

posteriormente na forma de dendogramas. Os espectros escolhidos para o cálculo

da média de cada grupo tiveram similaridade maior ou igual a 95 %.

4.3.5 Análise dos componentes principais

Análise de componentes principais (ACP) é usada para reduzir dimensionalmente

uma quantia de dados através de uma análise de covariância

entre fatores

diferentes. Assim, grande quantidade de dados como resultante de um estudo de

expressão gênica, por exemplo, pode ser organizada em pequenos grupos de

componentes semelhantes dentro da amostra (SMITH, 2002).

Nesta etapa do estudo, a classificação dos espectros Raman de tecido mamário

humano normal e com doença é o ponto mais importante, pois evidencia o

potencial discriminativo e a especificidade dos sinais Raman coletados. Desta

maneira, os espectros a serem classificados foram submetidos à ACP através do

software MINITAB

Release 14.20. As informações sobre esta análise foram

obtidas através dos quatro primeiros componentes principais (PC1, PC2, PC3 e

PC4). Posteriormente, foram relacionados os componentes principais “PC2” e

“PC3” de cada agrupamento através da construção de gráficos de Dispersão

Binomial, onde foram obtidas as classificações dos espectros. Nesta classificação

Covariância é sempre medida entre dois fatores. Quando mais de dois fatores são

envolvidos, os valores de covariância podem ser colocados em uma matriz. É quando a ACP torna-

se útil.

foi traçada uma linha reta aleatória (guia visual) entre os agrupamentos de

interesse para calcular a sensibilidade e especificidade dos achados

, utilizando o

software ORIGIN 7.0. Os grupos escolhidos para realização da análise foram

propositalmente selecionados devido à importância da discriminação clínica e

histopatológica entre os mesmos. Para análise classificatória foram realizadas as

seguintes combinações: CDI versus CDIS, CDI SOE versus CDI subtipos

especiais (CDI inflamatório, medular e mucinoso), lesões benignas (AFBM e

fibroadenoma) versus CDI e CDIS.

4.3.6 Diagnóstico histopatológico

O diagnóstico histopatológico das lesões mamárias foi realizado em dois

laboratórios de patologia conveniados aos serviços de oncologia citados

anteriormente. Os laudos foram assinados por três médicos patologistas (C.L., J.M

e R.A.), que seguiram os critérios de diagnóstico para CM da Sociedade Brasileira

de Patologia.

Sensibilidade= casos verdadeiro-positivos/(número de verdadeiro-positivos + falso-

negativos) e especificidade= casos verdadeiro-negativos/(número de verdadeiro-negativos + falso-

positivos).

5 RESULTADOS

Foram incluídas amostras de tecido mamário de 82 pacientes. A idade das

pacientes variou entre 15 a 80 anos, com média de 49,5 anos (DP=14,65 anos).

Os diferentes diagnósticos histológicos de tecido mamário que variaram desde

parênquima mamário normal, até subtipos especiais de câncer de mama estão

relacionados na Tabela 5.

A análise das amostras resultou em 859 espectros Raman, sendo que cada amostra

resultou em média 79 espectros, considerando 3 pontos de leitura (Fig. 37) em

cada fragmento da amostra. Cada fragmento do tecido mamário, com ou sem

lesão, foi dividido em amostras menores, produzindo uma média de 3,4 amostras

por paciente.

Tabela 5 – Distribuição do número de pacientes de acordo com o diagnóstico histopatológico

e o número de espectros TF-Raman gerados.

Diagnóstico

Amostras

(pacientes)

f Espectros f

Espectros

(dendograma)

CDI 44 54% 395 46% 236 46%

Mama Normal 10 12% 121 14% 25 5%

AFBM 6 7% 50 6% 22 4,3%

CD in situ* 5 6% 53 6% 48 (27+21*) 9,4%

CDI Medular 5 6% 52 6% 35 6,8%

CLI 4 5% 47 5% 31 6%

CDI Mucinoso 3 4% 17 2% 6 1,2%

Fibroadenoma 2 2% 57 7% 43 8,4%

Doença de Paget 1 1% 20 2% 20 4%

CDI Inflamatório 1 1% 13 2% 13 2,5%

CEC de Mama 1 1% 34 4% 33 6,1%

TOTAL 82 100% 859 100% 512 100%

inclui dois casos de CDIS tipo comedocarcinoma.

5.1 Análise de todas as amostras mamárias

Para obtenção das médias espectrais, todos os dados foram, de acordo com o

grupo diagnóstico, separadamente agrupados de acordo com seu coeficiente de

correlação e projetados os dendogramas. Os dados escolhidos para representarem

o grupo diagnóstico foram aqueles que se agruparam com uma diferença

estatística menor que 5%. Estes espectros representam o grupo diagnóstico para a

obtenção do padrão espectral “ouro”.

As médias dos espectros TF-Raman também foram obtidas separadamente (Figs.

ímpares de 39 a 61) sendo depois agrupadas em um diagrama para verificação do

padrão de deslocamento Raman (Fig. 63).

5.2 Tecido mamário normal

Na Figura 39, pode ser observado o espectro característico do tecido mamário

humano normal. Conforme descrito anteriormente, há um aspecto peculiar devido

a formas arredondadas das bandas e intensidades aumentadas resultantes do

conteúdo lipídico (comparar com Figura 31). No entanto, no procedimento de

preparação das amostras para aquisição dos espectros Raman, foi retirado o

excesso de tecido adiposo de algumas amostras, na tentativa de se obter o espectro

do tecido epitelial e conjuntivo fibroso. Sendo assim, foram obtidos dois grupos de

espectros de tecido de mama normal: um grupo com todos os componentes do

tecido normal, e o segundo sem o componente adiposo (macroscópico). Essa

correspondência histológica também ocorre no agrupamento realizado através do

cálculo do coeficiente de correlação.

Foram obtidos 121 espectros TF-Raman de tecido mamário normal. Os dois

maiores grupos encontrados através do índice de correlação separaram grupos sob

as condições citadas anteriormente. Sob o aspecto histopatológico, o grupo que

apresentou todos os componentes tissulares foi o agrupamento 1, representado na

Figura 40 pela cor laranja, enquanto o agrupamento 2, representado pela cor verde,

apresentou todos os componentes tissulares presentes na mama normal, exceto

tecido adiposo (Fig. 40). O sinal do tecido adiposo obscurece o sinal dos

componentes restantes, sendo este o aspecto fundamental de diferenciação

espectral entre o tecido normal e patológico da mama (BITAR et al., 2006). Desta

maneira o agrupamento 1 foi selecionado para representar o grupo diagnóstico

para a obtenção do padrão espectral “ouro” do tecido mamário normal.

800 1000 1200 1400 1600 1800

Intensidade (u.a.)

Deslocamento Raman (cm

-1

)

Mama Normal

Figura 39 – Média dos 25 espectros TF-Raman de amostras de tecido mamário humano

normal entre 800 e 1800 cm

-1

com linha de base corrigidas e normalizados pelo pico de

máxima intensidade.

Figura 40 – Dendograma representativo do cálculo do Coeficiente de Correlação entre os espectros de mama normal; (1): todos os componentes histológicos; (2):

sem tecido adiposo.

5.3 AFBM

Dentre os 50 espectros obtidos pela análise das amostras de AFBM, 22 foram

selecionados devido à correlação de 95 % e foram utilizados para os cálculos

estatísticos e de média (Fig. 41). O dendograma da Figura 42 representa o cálculo

do coeficiente de correlação dos espectros destas amostras. A variabilidade de

diagnósticos, como cistos simples, metaplasia apócrina, fibrose, calcificação,

processo inflamatório, entre outros pode ter sido a responsável pela grande

quantidade de variáveis representadas no coeficiente de correlação. A

individualização de cada diagnóstico seria importante para uma melhor

caracterização espectral dessa entidade.

800 1000 1200 1400 1600 1800

Intensidade (u.a.)

Deslocamento Raman (cm

-1

)

AFBM

Figura 41 – Média dos 22 espectros TF-Raman de amostras de AFBM entre 800 e 1800 cm

-1

com linha de base corrigidas e normalizados pelo pico de máxima intensidade.

Figura 42 – Dendograma representativo do cálculo do Coeficiente de Correlação entre os espectros de AFBM.

5.4 Fibroadenoma

Dentre os 57 espectros obtidos, 43 foram selecionados devido à correlação de

95 % e foram utilizados para os cálculos estatísticos e de média (Fig. 43).

Histologicamente, as amostras associadas a esses espectros apresentaram dois

componentes em abundância da mama normal: estroma e tecido epitelial.

Considerado uma forma localizada de hiperplasia nodular do tecido estromal e do

componente glandular da mama, poderia haver sugestão do cruzamento das

médias espectrais dessa doença com as médias do tecido mamário normal. Na

Figura 44, pode ser observado o dendograma representando o cálculo do

coeficiente de correlação dos espectros das amostras diagnosticadas como

fibroadenoma.

800 1000 1200 1400 1600 1800

Intensidade (u.a.)

Deslocamento Raman (cm

-1

)

Fibroadenoma

Figura 43 – Média dos 43 espectros TF-Raman de amostras de fibroadenoma entre 800 e

1800 cm

-1

com linha de base corrigidas e normalizados pelo pico de máxima intensidade.

Figura 44 – Dendograma representativo do cálculo do Coeficiente de Correlação entre os espectros de Fibroadenoma - agrupamento selecionado compreendendo as

variáveis da esquerda do gráfico.

5.5 CDIS

Dentre os 30 espectros obtidos, 27 foram selecionados devido à correlação de

95 % e foram utilizados para os cálculos estatísticos e de média (Fig. 45). A

Figura 46 mostra o dendograma representando o cálculo do coeficiente de

correlação dos espectros das amostras diagnosticadas como CDIS. Os espectros

selecionados estatisticamente, corresponderam histologicamente às amostras desta

lesão que apresentaram tecido epitelial, com células apresentando alteração

correspondente à lesão epitelial neoplásica, lâmina basal e tecido conjuntivo

adjacente. Os demais espectros representam seções normais da amostra e de tecido

conjuntivo.

800 1000 1200 1400 1600 1800

Intensidade (u.a.)

Deslocamento Raman (cm

-1

)

CD in situ

Figura 45 – Média dos 27 espectros TF-Raman de amostras de CDIS entre 800 e 1800 cm

-1

com linha de base corrigidas e normalizados pelo pico de máxima intensidade.

Figura 46 – Dendograma representativo do cálculo do Coeficiente de Correlação entre os espectros de CDIS (agrupamento selecionado demarcado pela seta).

5.6 CDIS tipo comedocarcinoma

Dos 23 espectros obtidos, 21 foram selecionados devido à correlação de 95 % e

foram utilizados para os cálculos estatísticos e de média (Fig. 47). O dendograma

representando o cálculo do coeficiente de correlação dos espectros das amostras

diagnosticadas como CDIS tipo comedocarcinoma (Fig. 48), mostra que além dos

achados do CDIS sem comedo, a representação gráfica pode corresponder à

grande quantidade de necrose celular associada.

800 1000 1200 1400 1600 1800

Intensidade (u.a.)

Deslocamento Raman (cm

-1

)

CD in situ comedo

Figura 47 – Média dos 21 espectros TF-Raman de amostras de CDIS tipo comedocarcinoma,

entre 800 e 1800 cm

-1

com linha de base corrigidas e normalizados pelo pico de máxima

intensidade.

Figura 48 – Dendograma representativo do cálculo do Coeficiente de Correlação entre os espectros de CDIS tipo comedocarcinoma.

5.7 CDI

Foram obtidos 395 espectros TF-Raman desta doença. Devido ao grande número

de amostras medidas, provenientes de diferentes pacientes e com diferentes

características biológicas

, foi verificado diversidade entre os espectros.

Histologicamente, essa diversidade pode ser explicada em termos da porcentagem

de tecido ductal propriamente normal e alterado, em relação ao tecido conjuntivo,

como reação desmoplásica, reação inflamatória e necrose. Os dois maiores

agrupamentos encontrados através do índice de correlação acabaram separando

grupos sob as condições citadas. Sob o aspecto histopatológico, o grupo que

apresentou maior porcentagem de tecido epitelial com CDI, foi o agrupamento 2,

representado pela cor azul que continha 236 espectros, selecionados para serem os

representantes o grupo diagnóstico para a obtenção do padrão espectral “ouro”

(Fig. 49). Na Figura 50 observa-se o dendograma representando o cálculo do

coeficiente de correlação dos espectros das amostras diagnosticadas como CDI.

Por exemplo, neoplasias G1, G2 e G3 foram analisadas no mesmo conjunto de amostras.

800 1000 1200 1400 1600 1800

Intensidade (u.a.)

Deslocamento Raman (cm

-1

)

CDI

Figura 49 – Média dos 236 espectros TF-Raman de amostras de CDI SOE, entre 800 e

1800 cm

-1

com linha de base corrigidas e normalizados pelo pico de máxima intensidade.

Figura 50 – Dendograma representativo do cálculo do Coeficiente de Correlação entre os espectros de CDI SOE; (2): agrupamento selecionado para representar a

amostra.

5.8 CDI tipo inflamatório

Todos os espectros coletados são provenientes de uma única paciente

apresentaram um coeficiente de correlação maior 95 %, e por isso, todos foram

selecionados para classificação (Fig. 51). Para o CDI inflamatório, foi observado

13 espectros representando o cálculo do coeficiente de correlação dos espectros

das amostras diagnosticadas (Fig. 52).

O número de amostras disponíveis é menor porque essa neoplasia é geralmente tratada

previamente com quimioterapia e a cirurgia é reservada para os casos com necessidade de terapia

local paliativa.

800 1000 1200 1400 1600 1800

Intensidade (u.a.)

Deslocamento Raman (cm

-1

)

CDI Inflamatório

Figura 51 – Média dos 13 espectros TF-Raman de amostras de CDI inflamatório, entre 800 e

1800 cm

-1

com linha de base corrigidas e normalizados pelo pico de máxima intensidade.

Figura 52 – Dendograma representativo do cálculo do Coeficiente de Correlação entre os espectros de CDI inflamatório, agrupamento selecionado inclui todas

variáveis, exceto as de número “1” e “6”.

5.9 CDI tipo medular

Dentre os 52 espectros obtidos, 35 foram selecionados devido à correlação de

95 % e foram utilizados para os cálculos estatísticos e de média (Fig. 53). Os

espectros de CDI medular, selecionados estatisticamente, corresponderam

histologicamente às características estruturais específicas desta lesão. Na Figura

54, pode ser observado o dendograma representando o cálculo do coeficiente de

correlação dos espectros das amostras diagnosticadas como CDI medular.

800 1000 1200 1400 1600 1800

Intensidade (u.a.)

Deslocamento Raman (cm

-1

)

CDI Medular

Figura 53 – Média dos 35 espectros TF-Raman de amostras de CDI medular, entre 800 e

1800 cm

-1

com linha de base corrigidas e normalizados pelo pico de máxima intensidade.

Figura 54 – Dendograma representativo do cálculo do Coeficiente de Correlação entre os espectros de CDI medular e destacando o agrupamento selecionado para a análise

espectral.

5.10 CDI tipo mucinoso

Na histologia das amostras obtidas para este estudo, foram evidenciadas diferentes

parcelas de tecido epitelial, conjuntivo e mucina. O grupo de seis espectros, dentre

os 17 adquiridos, representa o componente mucinoso dessa neoplasia (Fig. 55). Na

Figura 56, pode ser observado o dendograma representando o cálculo do

coeficiente de correlação dos espectros das amostras diagnosticadas como CDI

mucinoso.

800 1000 1200 1400 1600 1800

Intensidade (u.a.)

Deslocamento Raman (cm

-1

)

CDI Mucinoso

Figura 55 – Média dos 6 espectros TF-Raman de amostras de CDI mucinoso, entre 800 e

1800 cm

-1

com linha de base corrigidas e normalizados pelo pico de máxima intensidade.

Figura 56 – Dendograma representativo do cálculo do Coeficiente de Correlação entre os espectros de CDI mucinoso – agrupamento indicado pela seta foi utilizado

para cálculo das médias espectrais.

5.11 CLI

Os espectros de CLI, selecionados estatisticamente, correspondem à descrição

histopatológica e geraram uma média espectral verificada na Figura 57. O

dendograma representando o cálculo do coeficiente de correlação dos espectros

das amostras diagnosticadas como CLI mostra que entre os 47 espectros obtidos

(Fig. 58), 31 foram selecionados devido à correlação de 95 % e foram utilizados

para os cálculos estatísticos e de média.

800 1000 1200 1400 1600 1800

11,5

12,0

12,5

13,0

13,5

14,0

Intensidade (u.a.)

Deslocamento Raman (cm

-1

)

CLI

Figura 57 – Média dos 31 espectros TF-Raman de amostras de CLI, entre 800 e 1800 cm

-1

com linha de base corrigidas e normalizados pelo pico de máxima intensidade.

Figura 58 – Dendograma representativo do cálculo do Coeficiente de Correlação entre os espectros de CLI.

5.12 Doença de Paget

Todos os 20 espectros Raman obtidos da lesão intramamária de uma única

voluntária, foram selecionados por terem apresentado coeficiente de correlação de

95 % (Fig. 59). A Figura 60 representa o dendograma com o cálculo do

coeficiente de correlação dos espectros das amostras diagnosticadas como Doença

de Paget. Para a análise foram consideradas amostras da neoplasia intra-

parenquimatosa somente.

800 1000 1200 1400 1600 1800

11,0

11,5

12,0

12,5

13,0

13,5

14,0

Intensidade (u.a.)

Deslocamento Raman (cm

-1

)

Doença de Paget

Figura 59 – Média dos 20 espectros TF-Raman de amostras de Doença de Paget mamária –

lesão intra-parenquimatosa, entre 800 e 1800 cm

-1

com linha de base corrigidas e

normalizados pelo pico de máxima intensidade.

Figura 60 – Dendograma representativo do cálculo do Coeficiente de Correlação entre os espectros de Doença de Paget.

5.13 CEC

Histologicamente, as características encontradas desta amostras coincidiram com

as transformações neoplásicas que ocorrem nos queratinócitos da camada

espinhosa do epitélio. Desta maneira, os espectros (Fig. 61) apresentaram

características de célula epitelial ductal com transformação neoplásica para tecido

epitelial cutâneo. O cálculo do coeficiente de correlação dos espectros das

amostras diagnosticadas como CEC de mama está representado na Figura 62. Este

tipo raro de neoplasia mamária foi incluído no estudo, pois foi diagnosticada

durante o período de coleta de amostras. Apesar de ser proveniente de uma única

paciente, foram obtidos vários espectros. Dentre os 34 espectros obtidos, apenas

um não apresentou coeficiente de correlação de 95 % entre os demais (variável 29

do dendograma), sendo este excluído da classificação.

800 1000 1200 1400 1600 1800

Intensidade (u.a.)

Deslocamento Raman (cm

-1

)

CEC de mama

Figura 61 – Média dos 33 espectros TF-Raman de amostras CEC mamário, entre 800 e

1800 cm

-1

com linha de base corrigidas e normalizados pelo pico de máxima intensidade.

Figura 62 – Dendograma representativo do cálculo do Coeficiente de Correlação entre os espectros de CEC de mama – somente a variável “29” não foi incluída nos cálculos

estatísticos.

Para cálculos das médias espectrais foram utilizados 512 espectros que

apresentavam coeficiente de correlação de 95 % (Fig. 63). Na Figura 64, é

possível observar o cálculo do coeficiente de correlação dos espectros de todas as

amostras mamárias utilizadas neste estudo, com a separação dos agrupamentos em

2 grandes partes: mama normal/doenças benignas mamárias e doenças pré-

malignas e malignas.

1000

Intensidade (u.a.)

Deslocamento Raman (cm

-1

)

Mama Normal

Condição Fibrocística

Fibroadenoma

CD in situ

CD in situ Comedo

CDI

CDI Inflamatório

CDI Medular

CDI Mucinoso

CLI

Doença de Paget

CEC de Mama

Figura 63 – Média dos 512 espectros TF-Raman de amostras de tecido mamário humano normal e patológico entre 800 e 1800 cm

-1

com linhas de base corrigidas e normalizadas

pelo pico de máxima intensidade.

Figura 64 – Dendograma representativo do cálculo do Coeficiente de Correlação entre todos os espectros das 82 pacientes incluídas do estudo. Notar a separação dos

agrupamentos de dividindo em dois grupos: mama normal e lesões benignas (1,2 e 3) e doenças pré-malignas e malignas (4 a 11).

5.14 Dispersão Binominal entre espectros

Com a finalidade de automatizar o processo de avaliação dos espectros, e seguir

um protocolo sistemático de coleta foram obtidos resultados da ACP e dispersão

binomial entre PC2 versus PC3, para evidenciar o potencial discriminativo. Os

grupos escolhidos para realização da análise foram propositalmente selecionados

devido à importância da diferenciação clínica entre os mesmos e agrupados em

diagramas de dispersão, conforme especificado no item 4.3.5 desta dissertação.

5.14.1 Dispersão Binominal considerando doença mamária benigna

Na Figura 65, pode ser observado facilmente a separação dos agrupamentos que

representam o tecido mamário normal, da AFBM e do fibroadenoma, o que seria

esperado uma vez que a composição celular predominante nessas 3 condições

possuem características específicas conforme revisado no item 3.2, sendo assim,

tanto a sensibilidade quanto a especificidade foram de 100%.

-0.15 -0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15

-0.25

-0.20

-0.15

-0.10

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

PC3

PC2

Normal

Condição Fibrocística

Fibroadenoma

Figura 65 – Dispersão Binominal PC2 versus PC3 dos espectros de mama normal, AFBM e

fibroadenoma.

5.14.2 Dispersão Binominal considerando doença mamária benigna, pré-

maligna e maligna.

A diferenciação entre os espectros das amostras de fibroadenoma e CDIS resultou

em 100% de sensibilidade e especificidade respectivamente conforme observado

na Figura 66. O mesmo foi observado quando comparados os espectros da AFBM

e CDIS (Fig. 67).

-0.25 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

PC3

PC2

CD in situ

Fibroadenoma

Figura 66 – Dispersão Binominal PC2 versus PC3 dos espectros de CDIS e fibroadenoma.

-0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

PC3

PC2

CD in situ

Condição Fibrocística

Figura 67 – Dispersão Binominal PC2 versus PC3 dos espectros de CDIS e AFBM.

A dispersão binominal representada na Figura 68 mostra que a sensibilidade do

método em diferenciar fibroadenoma de CDI foi de 100 %, enquanto que a

especificidade foi de 93,02 %. A sensibilidade e especificidade da espectroscopia

Raman em diferenciar AFBM de CDI foi de 94,92 % e 81,82 %, respectivamente

conforme verificado na Figura 69.

-0.15 -0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15

-0.25

-0.20

-0.15

-0.10

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

PC3

PC2

Fibroadenoma

CDI

Figura 68 – Dispersão Binominal PC2 versus PC3 dos espectros de CDI e fibroadenoma.

-0.15 -0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

-0.20

-0.16

-0.12

-0.08

-0.04

0.00

0.04

0.08

0.12

PC3

PC2

Condição Fibrocística

CDI

Figura 69 – Dispersão Binominal PC2 versus PC3 dos espectros de CDI e AFBM.

Na dispersão binominal entre os espectros do tecido de mama normal, CDIS e

CDI, foi possível observar uma sensibilidade e especificidade de 100%

respectivamente para diferenciar o tecido normal do neoplásico. Já a diferenciação

entre o CDIS e o CDI a apresentou uma sensibilidade de 99,58 % e especificidade

de 85,19 % (Fig. 70).

-0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

-0.20

-0.15

-0.10

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

PC3

PC2

Mama Normal

CD in situ

CDI

Figura 70 – Dispersão Binominal PC2 versus PC3 dos espectros de mama normal, CDIS e CDI.

Na Figura 71, é possível observar a separação nítida entre o CDI e o CDIS,

diferença de dispersão importante uma vez, que uma representa uma doença

neoplásica invasora e a outra restrita à membrana basal ductal. A interface entre o

CDIS e o CDIS tipo comedocarcionoma é difícil de ser visualizada, fato que pode

estar relacionado com as características histológicas de ambas lesões. O mesmo

foi verificado quando comparados os espectros de CDI e CDI sub-tipos especiais

conforme Figura 72, ou quando compararmos CDI com CLI (Fig. 74).

Individualizando os sub-tipos de CDI: medular, mucinoso e inflamatório,

verificou-se uma interface entre os três grupos (Fig. 73). Com isso, a sensibilidade

e a especificidade da espectroscopia Raman em diferenciar o CDI mucinoso do

inflamatório e em diferenciar o CDI medular do inflamatório foram de 100%

respectivamente. A mesma observação foi verificada quando comparados CDI

mucinoso e CDI medular. No entanto, se considerarmos esses tipos de CDI,

juntamente com o CDI SOE, a interface entre os agrupamentos, não fica clara,

havendo uma concentração dos mesmos na parte central da dispersão (Fig. 72),

correspondendo, aos componentes em comum dessas neoplasias.

-0.12 -0.08 -0.04 0.00 0.04 0.08 0.12

-0.15

-0.10

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

PC3

PC2

CDI

CD in situ

CD in situ comedo

Figura 71 – Dispersão Binominal PC2 versus PC3 dos espectros de CDI, CDIS e CDIS comedo.

-0.15 -0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15

-0.20

-0.15

-0.10

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

PC3

PC2

CDI

CDI Inflamatório

CDI Medular

CDI Mucinoso

Figura 72 – Dispersão Binominal PC2 versus PC3 dos espectros de CDI, CDI inflamatório, CDI medular e CDI mucinoso.

-0.30 -0.24 -0.18 -0.12 -0.06 0.00 0.06 0.12 0.18 0.24 0.30

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

PC3

PC2

CDI Inflamatório

CDI Medular

CDI Mucinoso

Figura 73 – Dispersão Binominal PC2 versus PC3 dos espectros de CDI inflamatório, CDI medular e CDI mucinoso.

-0.16 -0.12 -0.08 -0.04 0.00 0.04 0.08 0.12

-0.20

-0.15

-0.10

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

PC3

PC2

CLI

CDI

Figura 74 – Dispersão Binominal PC2 versus PC3 dos espectros de CDI e CLI.

Na Figura 75, pode ser observado o PCA realizado entre os dados de CDI e

Doença de Paget de mama. A sensibilidade e a especificidade da espectroscopia

Raman em diferenciar essas duas doenças foram de 95,24 % e 100 %,

respectivamente. Já quando compararmos o CDIS e a Doença de Paget a acurácia

do método é de 100% (Fig. 76).

-0.12 -0.08 -0.04 0.00 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20

-0.12

-0.08

-0.04

0.00

0.04

0.08

0.12

0.16

0.20

PC3

PC2

Doença de Paget

CDI

Figura 75 – Dispersão Binominal PC2 versus PC3 dos espectros de CDI e Doença de Paget.

-0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

PC3

PC2

CD in situ

Doença de Paget

Figura 76 – Dispersão Binominal PC2 versus PC3 dos espectros de CDIS e Doença de Paget.

A partir da dispersão binominal verificada da Figura 77, onde todos os espectros

incluídos na análise foram relacionados, houve uma separação visual entre 4 regiões,

que incluíram agrupamentos de mama normal, doença benigna (AFBM e

fibroadenoma), lesões pré-malignas (CDIS e CDIS tipo comedo) e lesões malignas

(CDI, sub-tipos de CDI, Doença de Paget e CEC de mama). Foi possível, construir um

diagrama, a partir do binominal, que representasse de forma esquemática as regiões que

correspondem a cada grupo de diagnóstico das amostras incluídas no estudo (Fig. 78).

5.14.3 Dispersão Binominal entre os espectros de todas as amostras analisadas

-0.10 -0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12

-0.12

-0.10

-0.08

-0.06

-0.04

-0.02

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

PC3

PC2

Mama Normal

Condição Fibrocística

Fibroadenoma

CD in situ

CD in situ comedo

CDI

CDI Inflamatório

CDI Medular

CDI Mucinoso

CEC de mama

CLI

Doença de Paget

Figura 77

Figura 78 – Dispersão Binominal PC2 versus PC3 dos espectros de mama normal, AFBM, Fibroadenoma CDI, CDL, CDIS, sub-tipos de CDI, Doença de Paget e CEC de mama.

Figura 79 – Separação dos agrupamentos em quatro “regiões”: região 1 -

mama normal, região 2 – doença benigna, região 3 – lesões pré-malignas e

região 4 – lesões malignas.

6 DISCUSSÃO

MMG é utilizada largamente como rastreamento diagnóstico de lesões mamárias pré-

malignas e malignas. Esse exame possui papel limitado em mamas densas

principalmente em mulheres com menos de 50 anos onde o tecido glandular mamário

encontra-se denso, prejudicando a identificação de lesões em 30 a 60% das vezes.

Devido a incorreções relacionadas à própria densidade da mama, os resultados podem

apresentar até 22 % de índices falso-negativos, assim como uma alta taxa de resultados

falso-positivos; apresentando risco cumulativo de 56 % depois de 10 exames, em

mulheres com idade inferior a 50 anos (SHAH et al., 2001). Técnicas como a ultra-

sonografia (US), cintilografia mamária e ressonância magnética nuclear (RMN), e mais

recentemente a PET-scan, são utilizadas como procedimentos de imagem

complementares, mas apresentam alto custo e baixa especificidade ou ainda baixa

sensibilidade em lesões precoces que se apresentam como microcalcificações. Além

disso, não fornecem o diagnóstico histo ou citológico da lesão mamária. Procedimentos

invasivos como a PAAF, Core Biopsy



ou biópsias cirúrgicas, incisionais ou

excisionais, guiadas por agulhamento prévio ou por material radioativo (ROLL) são

implementadas para se obter o diagnóstico cito ou histológico. PAAF possui resultados

falso-negativos de até 15%, considerando um operador experiente e, dependendo se o

procedimento é realizado guiado por imagem, em lesões não palpáveis, este índice pode

aumentar (BIGIO et al, 2000). No entanto, os resultados falso-positivos são irrelevantes,

chegando a 1% em serviços de referência. A acurácia é operador dependente, e pode ser

modificada se o próprio médico patologista executar o método, pois o diagnóstico

definitivo depende muito das informações clínicas e radiológicas, o que muitas vezes

são perdidas quando não há comunicação entre o profissional que executa a PAAF e o

médico que fará a leitura das lâminas. Essa técnica representa um “divisor de águas”,

dentro da propedêutica mastológica, ou seja, classifica a lesão mamária em maligna ou

não-maligna, a partir disso o médico escolhe a conduta associando os achados clínicos e

radiológicos. No entanto, quando a citologia é inadequada ou inconclusiva, ou mesmo

quando for positiva para células malignas

, é necessária a utilização de outra técnica

para obter uma amostra tecidual maior.

Core Biopsy



guiada ou não por métodos radiológicos, assim como os demais exames

utilizados para a obtenção de amostra tecidual da lesão mamária, requerem uma incisão

cutânea e uma abordagem incisional ou excisional diretamente na lesão glandular. Além

dos custos elevados relacionados a essas técnicas, que muitas vezes requerem ambiente

hospitalar, é necessário o envolvimento de uma equipe multiprofissional para a

execução de técnicas como o agulhamento e o ROLL.

Com a possibilidade de utilização de métodos espectrais vibracionais moleculares para

análise de componentes biológicos, a ER vem sendo estudada como método diagnóstico

em várias áreas da Medicina. É um método com potencial para ser utilizado para o

diagnóstico em tempo real de algumas doenças e com o mínimo de invasão da área em

questão.

Não é possível diferenciar CDIS de CDI pela citologia, pois é necessária a presença da

membrana basal ductal. Pode ser considerado diagnóstico de CDI nos casos em que a citologia foi

positiva e o quadro clínico e radiológico favorecem esse diagnóstico juntamente com a citologia. Além

disso, a técnica de imunohistoquímica é mais aceita do que a imunocitoquímica para a verificação de

receptores celulares (CIPOLLA et al., 2006).

O uso da ER para verificar as características espectrais do parênquima mamário humano

vem sendo descrito principalmente a partir da década de 90. A maioria dos estudos era

de caráter experimental, apresentando número pequeno de espectros, mesmo assim

caracterizaram e diferenciaram os componentes vibracionais dos principais picos dos

espectros de tecido mamário normal e doente (FRANK et al., 1994; SCHRADER et al.,

1995; FRANK; McCREERY, 1995; MANOHARAN; WANG; FELD, 1996). A partir

disso, outros estudos foram publicados relacionando análise bioquímica do tecido

mamário, o desenvolvimento de dispositivo de análise in vivo, a caracterização de

neoplasia maligna, a verificação de acurácia diagnóstica em linfonodos axilares

metastásticos de CM, e, até mesmo, caracterização do gene BRCA1 por ER de

espalhamento (SHAH et al., 2001; ALLAIN; VoDINH, 2002; KNEIPP et al., 2003;

SMITH et al., 2004; HAKA et al., 2005). Entretanto, em todos esses trabalhos não

foram realizados estudos sistemáticos de lesões mamárias analisando de um grande

número de dados espectrais provenientes de uma população maior e diferentes

diagnósticos visando formar uma biblioteca ou banco de espectros; com intenção de

diagnóstico diferencial entre os principais conjuntos de alterações do parênquima

mamário. Também não houve comparação de grande número de espectros de doenças

mamárias com o tecido glandular normal.

Os espectros encontrados, neste estudo, foram compostos pelos diversos tipos de tecido

que compõe a glândula mamária humana. Portanto, não existem espectros Raman dos

tecidos biológicos “certos ou errados”, e sim a representação de um padrão “ouro”

espectral para cada diagnóstico e permitindo desenvolver um algoritmo estatístico

adequado visando a diferenciação entre um tipo espectral e outro. Desta maneira, foi

realizada a adequação e a escolha de um modelo espectral mais adequado para análise

estatística.

Neste estudo foi possível identificar e catalogar um grande número de espectros: 859

espectros provenientes de amostras mamárias de 82 pacientes. O maior número de

amostras coletadas, e em conseqüência o maior número de espectros, foi proveniente de

lesões de pacientes com CDI SOE de mama (Tab. 5).

Em todas as análises, nas quais as variáveis relacionadas ao CDI foram incluídas, foi

possível realizar observações importantes. A acurácia em diferenciar CDI de doença

benigna foi elevada (Figs 68 e 69). A pequena interface entre as variáveis da AFBM e

do fibroadenoma poderia ser explicada pela presença de CDI bem diferenciados na

amostra. Quando relacionadas variáveis do CDI SOE com os demais CDIs foi possível

notar uma interface importante que poderia traduzir os aspectos biológicos comuns

dessas doenças como, por exemplo a presença de invasão e a capacidade de enviar

metástases. Além disso, a grande maioria de lesões, como CDI medular ou mucinoso,

não se apresenta como forma pura, contendo também componentes de CDI clássico em

sua arquitetura (Figs. 72 a 74). O número de amostras desses CDI sub-tipos especiais

incluídos neste estudo compreendeu a percentagem média de pacientes encontrada em

séries da literatura (WEIGELT et al., 2005). A diferenciação entre estes tipos de

neoplasias malignas da mama foi possível (sem relacionar as variáveis de CDI SOE); e

com sensibilidade e especificidade de 100% (Fig. 73). Essa caracterização pode ser

explicada pelos componentes biológicos predominantes em cada uma dessas doenças,

como a mucina em abundância no CDI mucinoso. No entanto, há necessidade de obter

mais amostras de CDI mucinoso, para a construção de diversos padrões

espectrais/estruturais que compõe esta doença, decorrentes da sua composição

histológica específica, valendo o mesmo para o CDI inflamatório.

Na Figura 74, pode ser observado o PCA realizado entre os dados de CDI e CLI. O

padrão histológico destas neoplasias apresenta células provenientes da mesma estrutura

glandular, embora a arquitetura de distribuição das células neoplásicas seja diferente.

Isso pode explicar a sobreposição dos espectros em função da dispersão dos PCs.

Amostras de CDIS foram provenientes de 5 pacientes com neoplasias clinicamente

palpáveis

e resultaram em 48 espectros para análise estatística. Foi feita a opção de

análise separada do CDIS sem necrose e do CDIS com necrose ou tipo comedo (Figs 45

a 48), uma vez que possuem comportamento biológico diferente. Sob ponto de vista

espectral essas duas doenças apresentaram uma interface com algumas variáveis, no

entanto, houve dispersão de variáveis em ambas as neoplasias (Figs 68 e 74), fato este

que poderia estar relacionado com a presença de necrose, no CDIS comedo, ou ausência

de necrose no CDIS. No entanto, houve diferença estatisticamente significante entre as

variáveis de CDIS (comedo e não comedo) e as de CDI SOE, conforme demonstrado

nas Figuras 70 e 71. Isto reflete que, sob ponto de vista molecular, existem várias

diferenças que ocorrem no processo de transformação de uma neoplasia não invasora

para uma neoplasia com capacidade de destruição da membrana basal ductal. Esse

achado é de fundamental importância, pois se a ER poderá ser usada para diagnóstico in

vivo, o método será capaz de diferenciar entre um CDIS de um CDI, o que a citologia,

por exemplo, não é capaz de realizar. Foi possível verificar a separação completa –

estatisticamente significante - entre os agrupamentos do CDIS e doenças benignas da

O diagnóstico de CDIS, é realizado na grande maioria das vezes após mamografia de

rastreamento (1 caso para cada 1300 mamografias), onde são identificadas lesões subclínicas e excisadas

por métodos indiretos de localização e sendo necessária a análise de toda a lesão devido ao tamanho

pequeno da amostra (BURTEIN et al., 2004) , o que justifica poucos casos desta lesão no presente estudo.

mama (Figs. 66 e 67), mostrando que o método pode diferenciar doença pré-maligna de

doença benigna (AFBM e fibroadenoma).

CDI inflamatório, Doença de Paget da mama e carcinoma epidermóide de mama foram

incluídos na análise por caracterizarem doenças neoplásicas malignas mamárias, que

apesar de apresentação clínica, tratamento e evolução peculiares, poderiam apresentar

relações espectrais interessantes com os casos de CDI e de doenças benignas.

No caso da Doença de Paget, foi possível observar características interessantes, uma vez

que sua relação com CDI e CDIS é controversa na literatura, principalmente no que se

diz respeito à sua origem: as células de Paget teriam crescimento nos ductos mamários

prosseguindo nos sinusóides lactíferos até a epiderme do mamilo. Outra hipótese sugere

que as células de Paget teriam origem na porção terminal dos ductos lactíferos - na

junção com a epiderme – ou seja, seriam células epidérmicas que sofreram metaplasia

para células epiteliais ductais (LUCAROTTI; JENKINS; WEBB, 1995; FARLEY et al.,

2001). Os achados mostrados nas Figuras 75 e 76 suportam a segunda teoria.

Por outro lado, as amostras das doenças benignas de mama utilizadas neste estudo,

AFBM e fibroadenoma, foram provenientes de pacientes com lesões palpáveis e

citopatologia pré-operatória não conclusiva para diagnóstico sendo necessário a excisão

das mesmas

. Observou-se a separação das variáveis dessas duas doenças (Fig. 65),

Tanto fibroadenoma quanto AFBM, na grande maioria das vezes, são diagnosticados em

exames de imagem de rastreamento, sendo necessário retirá-los para diagnóstico histológico quando a

citologia é duvidosa, ou quando não é possível PAAF.

além de haver distinção entre essas patologias mamárias e doença pré-maligna e maligna

(Figs. 66 a 69), conforme já discutido anteriormente.

Para caracterização do tecido mamário normal, foram utilizadas amostras de tecidos

provenientes de mamoplastia redutora. Sendo assim, as amostras obtidas eram

compostas pelos tecidos glandulares propriamente ditos e de sustentação, favorecendo

uma abordagem mais real do que possivelmente será encontrado caracterizado ao se

realizar ER in vivo. Em todas as comparações de variáveis em que os espectros de tecido

mamário normal foram incluídos, houve diferença estatística significante entre mama

normal mama com doença, seja ela benigna ou maligna (Figs. 65, 70 e 78).

Observando as Figuras 78 e 79 foi possível verificar a distribuição dos agrupamentos de

acordo com o diagnóstico histológico. Houve separação clara entre o tecido mamário

normal e demais amostras analisadas (região 1). As doenças benignas, que neste estudo

incluiram AFBM e fibroadenoma, ficaram posicionadas periférica e inferiormente no

diagrama (região 2), enquanto que as lesões pré-malignas (CDIS e CDIS tipo comedo)

apresentaram-se periférica e superiormente (região 3). Todas as doenças malignas

mamárias (CDI SOE, CDI sub-tipos especiais, CEC, Doença de Paget) ficaram

posicionadas na parte central do diagrama (região 4). A interface entre a região 2 e 4

poderia ser explicada pelas lesões malignas bem diferenciadas que possuem

componentes histológicamente semelhentes ao tecido mamário com doença benigna. Por

outro lado, a interface entre a região 3 e 4 poderia ser explicada pelos CDIs com maior

quantidade de componente in situ associada. Todas essas observações poderão ser

comprovadas através do cruzamento dos dados histopatológicos das amostras das

pacientes com os respectivos espectros. Além disso, utilizando Distância de

Mahalanobis e Redes Neurais Artificiais poderá ser verificado a significância estatística

desses achados.

7 CONCLUSÕES

Os grupos escolhidos para realização deste estudo foram propositalmente selecionados

devido à importância da discriminação clínica entre os mesmos. Os cálculos de

coeficiente de correlação entre os espectros de cada grupo, serviram para identificar as

variáveis que possuíam correlação maior que 95 %. Estes espectros, sob aspecto

histopatológico, foram obtidos de amostras que continham as principais estruturas

características de cada lesão. Os dados foram posteriormente utilizados, como sucesso,

na realização da ACP, como finalidade classificatória.

Os resultados, obtidos através da ACP e dispersão binomial dos PC2 e PC3,

demonstraram compatibilidade entre os achados espectrais, clínicos e histológicos,

demonstrando alta sensibilidade e especificidade da técnica Raman.

Foi possível observar sensibilidade e especificidade de 100 % quando comparados os

espectros através da dispersão binominal PC2 versus PC3:

- de CDI, CDIS e CDIS comedo;

- de CDI inflamatório, CDI medular e CDI mucinoso;

- de CDIS e Doença de Paget;

- de CDIS e AFBM;

- de CDIS e fibroadenoma;

- e de mama normal, AFBM e fibroadenoma.

A comparação dos espectros através da dispersão binominal PC2 versus PC3 das

seguintes variáveis apresentou sensibilidade e especificidade, respectivamente:

- Doença de Paget e CDI: 95,24 % e 100%;

- CDI e AFBM: 94,92 % e 81,82 %;

- CDI e Fibroadenoma: 100 % e 93,02 %;

- CDIS e CDI: 99,58 % e 85,19 %.

A comparação entre CDI e CLI resultou em alta sobreposição dos dados,

impossibilitando o cálculo da sensibilidade e especificidade. Neste caso seria necessário

identificar outras variáveis em ambas as neoplasias que pudessem distingui-las pela

técnica Raman, o que poderia ser realizado individualizando um estudo que incluísse

maior número de amostras de CLI.

Também foi possível, utilizando dispersão binominal PC2 versus PC3 dos espectros de

todas as amostras mamárias, separar os agrupamentos em quatro regiões bem definidas

que representam os achados histológicos: tecido mamário normal, tecido mamário com

doença benigna, tecido mamário com doença pré-maligna e tecido mamário com doença

maligna. Essa caracterização foi visual, sendo necessário verificar a acurácia dos

achados através da sensibilidade e especificidade que em continuidade deste estudo

poderão ser realizadas utilizando treinamento de redes neurais ou Distância de

Mahalanobis.

Estes resultados deixaram clara a possibilidade da aplicação da ER para o diagnóstico

diferencial de doenças mamárias, podendo ser considerados estudos utilizando a técnica

Raman in vivo, ao mesmo tempo em que a lesão seria clínica ou radiologicamente

avaliada.

Além disso, é possível uma análise individualizada dos casos de CDI, para verificação

de diferenças espectrais entre os fatores prognósticos histopatológicos e clínicos. Se

considerarmos o método como uma forma de diagnóstico, em nível molecular, em

tempo real, características como presença de receptores hormonais, oncogenes, ou

alterações citogenéticas poderiam ser analisadas sem a necessidade da retirada de

fragmento da lesão. Além disso, durante o tratamento cirúrgico a ER seria um método

potencial para a verificação das margens do leito tumoral, bem como da presença de

lesão metastática em linfonodo sentinela. Outras aplicações que poderiam ser

consideradas, e necessitariam de verificação, seriam o uso da ER para determinar a

ocorrência de reposta ao tratamento neoadjuvante e para determinar as características da

biologia celular das lesões metastáticas e da lesão mamária primária.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALLAIN, L. R.; VO-DINH, T. Surface-enhanced Raman scattering detection of the breast

cancer susceptibility gene BRCA1 using a silver-coated microarray platform. Anal Chim. v.

469, p. 149-154, 2001.

BEITLER, A.L.; HURD, T.C.; EDGE, S.B. The evaluation of palpable breast masses:

common pitfalls and management guidelines. Surg Oncol. v. 6, n.2, p. 227-234, 1997.

BIGIO, I. J. Diagnosis of breast cancer using elastic-scattering Spectroscopy: preliminary

clinical results. J Biomed Opt. v.5, n.2, p.221-228, 2000.

BIGIO, I. J.; BOWN, S. G. Spectroscopy Sensing of cancer and cancer Therapy. Landes

Bioscience.v.33, p.259-267, 2004.

BITAR, R. A. et al. Breast Cancer diagnosis using TF-Raman Spectroscopy. Progress In

Biomedical Optics And Imaging. v.5692, p.147-154, 2005.

BITAR, R. A. et al. Biochemical analysis of human breast tissues using TF-Raman

spectroscopy. J Biomed Opt. (2006 in press).

BITAR, R. A. et al. TF-Raman spectroscopy study of human breast tissue. Biomedical

Vibrational Spectroscopy. v. 5321, n. 7, p. 190-195, 2004.

BOERE, I. A. et al. Use of fibre optic probes for detection of barrett’s epithelium in the rat

esophagus by Raman spectroscopy. Vibrational Spectroscopy. v.32, p.47-55, 2003.

BOFIN, A. M. et al. Interpretation of fine needle aspiration cytology of the breast: a

comparison of cytological, frozen section, and final histological diagnoses. Cytopathology.

v.15, p.297-304, 2004.

BURSTEIN H. J. et al. Ductal carcinoma in situ of the breast. N Engl J Med. v.350, n.14, p.

1430-1441, 2004.

CASPERS, P. J.; LUCASSEM, G. W.; PUPPELS, G. J. Combined in vivo confocal Raman

spectroscopy and confocal microscopy of human skin. Biophysical Journal. v.85, p.572-580,

2003.

CIPOLLA, C. et al. Validity of needle core biopsy in the histological characterization of

mammary lesions. The Breast. v. 15, p. 76-80: 2006.

COTRAN, R.S.; COLLINS, T.; KUMAR V. Robins patologia estrutural e funcional. 6ed.

Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, c2000. 1251p.

DACOSTA, R. S. et al. New optical technologies for earlier endoscopic diagnosis of

premalignant gastrointestinal lesions. J Gastroen Hepatol. v.17, p. 85-104, 2002.

DREW, P.; IWUAGWU, O. Vacuum-assisted biopsy device – diagnostic and therapeutic

applications in breast surgery. The Breast. v.13, p.483-487, 2004.

EIKJE, N. S. et al. Fiber Optic Near-infrared Raman spectroscopy for clinical noninvasive

determination of water content in diseased skin and assessment of cutaneous edema. J

Biomed Opt. v.10, n.1, p.1-13,2005.

FARLEY, D.R. et al. Paget’s disease of the breast. CANCER TREAT REV, v.27, p.9-18,

2001.

FRANK, C. J. et al. Characterization of human breast biopsy specimens with near-IR Raman

spectroscopy. Anal Chem. v.66, n.3, p.329-326, 1994.

FRANK, C. J.; MCCREERY, R. L. Raman spectroscopy of normal and diseased human

breast tissues. Anal Chem. v.67, n.5, p.777-783, 1995.

GÃO, X.; BUTLER, I. S.; KREMER, R. A near-infrared Fourier transform Raman

spectroscopy of epidermal keratinocytes: changes in the protein-DNA structure following

malignat transformation. Spectrochim. v.61, p.27-35, 2003.

GRAY, R. J. et al. Randomized prospective evaluation of a novel technique for biopsy or

lumpectomy of nonpalpable breast lesions: radioactive seed versus wire localization. Ann

Surg Oncol. v.8, n.9, p.711-715, 2001.

HAKA, S. A. et al. Diagnosing breast cancer by using Raman spectroscopy. PNAS. v.102, n.

35, p.12371-12376, 2005.

HAMMOND, B. R.J. et al. Validity issues with the vivo measurement of skin carotenoids

using Raman spectroscopy. J Invest Dermatol. v.122, p.544-546, 2004.

HANLON, E. B. et al. Prospect for in vivo Raman spectroscpoy. Phys Med Biol. v.45, p.1-

59, 2000.

HARRIS, J. R. et al. Diseases of the breast. 2ed. New York: Lippincott w & w, 2000. 1360p.

HUGHES, L. E., et al. Aberrations of normal development and involution (ANDI): a new

perspective on pathogenesis and nomenclature of benign breast disorders. Lancet. v.2, n.

8571, p.1316-1319, 1987.

HUONG, P. V. New possibilities of Raman micro-spectroscopy. Vib Spec. v.11, p.17-28,

1996.

INCA – INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER – Estimativas|2006. Ministério da Saúde,

Rio de Janeiro, 2005.

JUNQUEIRA, C.; CARNEIRO, J. Glândulas mamárias. In: JUNQUEIRA, C.; CARNEIRO,

J. Histologia básica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004. 488p.

KNEIPP, J. et al. Characterization of breast duct epithelia: a Raman spectroscopic study. Vib

Spec. v.32, p.67-74, 2003.

KOPANS, D. B. Breast imaging. 2.ed. New York: Lippincott W & W, 1997. 875p.

KORTUM, R. R.; MURACA, E. S. Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis.

Phys Chem. v.47, p.555-606, 1996.

KRAFFT, C. Bioanalytical applications of Raman spectroscopy. Anal Bioanal Chem. v.378,

p.60-62, 2003.

LUCAROTTI, M.E; JENKINS, M; WEBB, A.J. Paget’s disease of the nipple and breast

cancer: problems with diagnosis. The Breast. v.4, p.92-95, 1995.

MANOHARAN, M.; WANG, Y.; FELD, M. S. Histochemical analysis of biological tissues

using Raman spectroscopy. Spectrochim ACTA. v.52, p.215-249, 1995.

MARTINS, A. A. et al. Principal components analysis of TF-Raman spectra of ex vivo basal

cell carcinoma. Biomedical Vibrational Spectroscopy. v.5321, n.7, p.198-203, 2004.

MERIC, F. et al. Noninvasive breast cancer. In: FEIG, B.W.; BERGER, D. H.; FUHRMAN,

G.M. M.D. Anderson surgical oncology handbook. Houston: Lippincott Williams &

Wilkins, 2003. p.1-13.

MILLIGAN, G.W.; COOPER, M.C. A study of variable standardization. J Classif. v.5,

p.181-204, 1988.

MORROW, M.; et al. Prospective comparison of stereotactic core biopsy and surgical

excision as diagnostic procedures for breast cancer patients. Ann Surg. v.233, n.4, p. 537-

541, 2001.

NETTER, F. H. Atlas de anatomia humana. 3ed. Porto Alegre: Artmed, 2003. 542p.

NIJSSEN, A. et al. Discriminating Basal Cell Carcinoma from its surrounding tissue by

Raman spectroscopy. J Invest Dermatol. v.119, n.1, p.64-69, 2002.

PEREIRA, R. M. et al. Diagnosis of squamous cell carcinoma of human skin by Raman

spectroscopy. Optical Biopsy V. v.5326, n.7, p.106, 2004.

PILOTTO, S. et al. Analysis of Near-infrared Raman spectroscopy as a new technique for a

transcutaneous non-invasive diagnosis of blood components. Lasers Med Sci. v.16, p.02-09,

2001.

RAMAN, C.V. The molecular scattering of light. Nobel lecture. 1930.

REZA, A. M. From Fourier transform to Wavalet transform – basic concepts. Xilinx, Inc. p.2-

17, 1999. Disponível em: http://www.xilinx.com/products/logicore/dsp/fft_to_wavelet.

Acesso em: 05 maio 2006.

SCHAEBERLE, Michael D.; et al. Raman chemical imaging: histopathology of inclusions in

human breast tissue. Anal Chem. v..68 n 11, p. 1829-1833, jun 1, 1996.

SCHILLER, A. B. et al. Cellular dyscohesion in fine-needle aspiration of breast carcinoma.

Am J Clin Pathol. v.115, n.2, p.219-223, 2001.

SCHRADER, B. et al. NIR FT Raman spectroscopy in medical diagnosis. J Mol Struct. v.

348, p.293-296, 1995.

SHAH, N. Non-invasive functional optical spectroscopy of human breast tissue. Britton

Chance. v.98, n.08, p.4420-4425, 2001.

SINGH, R. Raman and the discovery of the Raman effect. Physics Perspective. v.4, p.399–

420, 2002.

SMITH, J. et al. Raman spectroscopy for lymph node assessment in breast cancer. Brist J

Surg. v. 91, p.1227, 2004.

SMITH, L. I. A tutorial on principal component analysis. Disponível em:

http://csnet.otago.ac.nz/cosc453/student_tutorials/principal_components.pdf. Acesso em: 06

abr. 2006.

SOCIEDADE BRASILEIRA DE MASTOLOGIA. Disponível em:

http://www.sbmastologia.com.br. Acesso em: 10 jan. 2006.

SOLORZANO, C.C. et al. Invasive breast cancer. In: FEIG, B.W.; BERGER, D. H.;

FUHRMAN, G.M. M.D. Anderson surgical oncology handbook. Houston: Lippincott

Williams & Wilkins, 2003. p. 14-40.

TAVASSOLI, F. A. Ductal carcinoma in situ: introduction of the concept of ductal

intraepithelial neoplasica. Mod Pathol. v.11, p.140-154, 1998.

TESTUT, L. Region mamaria. In: TESTUT, L. Tratado de anatomia humana. Barcelona:

Salvat, 1951. p.812- 823.

VERONESI, U. et al. Mastologia oncológica. São Paulo: MEDSI Editora Médica e

Científica Ltda, 2002. p.580.

VERONESI, U. et al. Rethinking TNM: Breast cancer TNM classification for treatment

decision-making and research. The Breast. v.15, p.3-8, 2006.

WEIGELT, B. el al. Breast cancer metastasis: markers and models. Nat Rev Cancer. v.5,

p.591-602, 2005.

ZURRIDA, S. et al. Radioguided localization of occult breast lesions. The Breast. v.7, p.11-

13, 1998.

APÊNDICES

Apêndice A – Termo de consentimento livre esclarecido.

Para obter um maior conhecimento clínico e científico do câncer, o Corpo Clínico deste

Hospital (médicos e pesquisadores) desenvolvem pesquisas clínico-científicas, as quais

possibilitam conhecer melhor os mecanismos da doença, oferecendo novas

possibilidades de diagnóstico e tratamento. Estes estudos são realizados em fragmentos

de tumores removidos em cirurgias. Você está sendo admitido (a) neste Hospital para

estabelecimento de diagnóstico e tratamento de alguma forma de tumor. Para fins de

diagnóstico, fator prognóstico e/ou como parte de seu tratamento, há necessidade da

remoção do tumor para exames clínicos laboratoriais, necessários para um diagnóstico

definitivo, principalmente o diagnóstico histopatológico. O restante do tumor que é

retirado, não é utilizado, sendo descartado, conforme Legislação Sanitária regulamenta

sobre o assunto.

Um fragmento do tumor será encaminhado para um projeto de pesquisa, previamente

submetido à apreciação da Comissão de Ética em Pesquisa do Hospital, através da

utilização da Espectroscopia Raman e de Infravermelho com Transformada de Fourier

para estudos de materiais biológicos, com ênfase em tecidos com câncer de mama, a

qual fornece informações bioquímicas detalhadas, diferenciando tecidos benignos de

tecidos malignos, através de alterações microscópicas detectadas por espectroscopia

óptica. O fragmento do tumor será identificado no laboratório por um código formado

por números e letras e, portanto, sua publicação científica será feita de modo a manter o

anonimato do paciente.

Concordamos com o uso do material para fins acima descritos, é necessário esclarece-

lo (a) que não existem quaisquer benefícios ou direitos financeiros a receber sobre

eventuais resultados decorrentes da pesquisa. Se você não concordar em doar materiais

para pesquisa, sua decisão não influenciará, de modo algum, no seu tratamento.

Dúvidas ou questões sobre o Termo de Consentimento poderão ser esclarecidas pelo

seu médico.

Você receberá uma cópia deste documento e o original será arquivado em seu

prontuário.

Somente assine este termo, se consentir.

DECLARAÇÃO

Declaro estar ciente das informações ora prestadas, tendo lido atentamente e

concordando com o teor.

_________,_____de_______de 200__.

Responsável ou Paciente

Nome:

RG:

RGH:

ANEXO A – Certificado do comitê de ética em pesquisa da UNIVAP.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 