( PDF ) Efeito farmacológico da suplementação dietética de ácidos graxos poliinsaturados n-3 na microcirculação. Observação na bolsa da bochecha do hamster

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Cristiane Maria Simonato Conde

EFEITO FARMACOLÓGICO DA SUPLEMENTAÇÃO

DIETÉTICA DE ÁCIDOS GRAXOS POLIINSATURADOS

n-3 NA MICROCIRCULAÇÃO.

OBSERVAÇÃO NA BOLSA DA BOCHECHA DO

HAMSTER.

Rio de Janeiro

2007

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

CENTRO BIOMÉDICO – INSTITUTO DE BIOLOGIA ROBERTO ALCÂNTARA GOMES

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA (DOUTORADO)

EFEITO FARMACOLÓGICO DA SUPLEMENTAÇÃO

DIETÉTICA DE ÁCIDOS GRAXOS POLIINSATURADOS

n-3 NA MICROCIRCULAÇÃO.

OBSERVAÇÃO NA BOLSA DA BOCHECHA DO

HAMSTER.

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

CENTRO BIOMÉDICO – INSTITUTO DE BIOLOGIA ROBERTO ALCÂNTARA GOMES

Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação em

Biologia do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes

da Universidade do Estado do Rio de Janeiro, como parte

dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em

Ciências

Rio de Janeiro

2007

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

CENTRO BIOMÉDICO – INSTITUTO DE BIOLOGIA ROBERTO ALCÂNTARA GOMES

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA (DOUTORADO)

EFEITO FARMACOLÓGICO DA SUPLEMENTAÇÃO

DIETÉTICA DE ÁCIDOS GRAXOS POLIINSATURADOS

n-3 NA MICROCIRCULAÇÃO.

OBSERVAÇÃO NA BOLSA DA BOCHECHA DO

HAMSTER.

Orientadora: Eliete Bouskela

Professora Titular do Departamento de Ciências Fisiológicas do

Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes da

Universidade do Estado do Rio de Janeiro

Banca examinadora

Efetivos

Prof Ayres Guimarães Dias UERJ

Prof Eder Carlos Rocha Quintão USP

Prof

Eliete Bouskela UERJ

Prof

Magna Cottini Fonseca Passos UERJ

Prof Paulo Roberto Ribeiro Costa UFRJ

Suplentes

Prof

Nazareth de Novaes da Rocha UFF

Prof Pedro Lopes de Melo UERJ

Rio de Janeiro

2007

Conde, Cristiane Maria Simonato

Efeito farmacológico da suplementação dietética de ácidos graxos poliinsaturados n-3 na

microcirculação. Observação na bolsa da bochecha do hamster. Cristiane Maria Simonato

Conde, Rio de janeiro, 2007.

X, 72 p., il.

Orientadora: Prof. Dra Eliete Bouskela

Tese (Doutor em Ciências) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Centro Biomédico,

Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes

1 Ácidos graxos pollinsaturados 2 Microcirculação 3 Reatividade vascular

4 Rolamento e adesão de leucócitos 5 Permeabilidade microvascular 6 Teses

I. Cristiane Maria Simonato Conde II. Universidade do Estado do Rio de Janeiro,

Centro Biomédico, Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes

III. Título

Dedico esta tese a todas as pessoas que torcem pelo meu sucesso.

Em especial Bruno, Juliana e meus pais, Elisa e Alejandro.

Começo e fim da minha vida.

Agradecimentos

A Deus, por me guiar nesta caminhada e me permitir alcançar mais esta etapa da vida.

A determinada professora Eliete Bouskela, exemplo de mulher na ciência, pela

oportunidade que me deu de ingressar na vida científica e por me orientar com suas

discussões e reflexões criativas sobre este projeto de estudo, as quais muito me ajudaram a

compreendê-lo e me permitiram realizar uma análise crítica sobre o mesmo.

Aos membros da banca examinadora pela disposição de analisar este trabalho e pelas

sugestões e críticas.

Ao professor Erik Svensjö, Fátima Zelly Garcia Cyrino e Helena de Carvalho pela

paciência e dedicação com meu aprendizado no modelo da bolsa da bochecha.

Aos estimados amigos de trabalho do LPM e LIB pela cooperação e amizade. Em especial

a Maria Sofia Perez da Gama pela paciência e ajuda prestada em todos os momentos

necessários, ao Waldício da Silva Soares por me ajudar na elaboração dos gráficos e Denise

Salles Coelho da Mota, Eliane de Souza Furtado, Paulo José Ferreira Lopes, Cláudio

Natalino Ribeiro, Fabiana G. da Conceição e Carlos Eduardo Mascarenhas pelos finais de

semana e feriados dedicados ao tratamento dos animais.

A Maria das Graças Coelho de Souza, grande amiga que fiz nesses 12 anos de convivência

no laboratório e que muito me ajudou.

Aos meus familiares (sogros, cunhados, tios, primos, avós – falecidos) e amigos que

sempre torceram por mim.

Ao Benito, meu querido irmão pelo carinho e por estar sempre presente na minha vida

torcendo pelo meu sucesso.

Aos meus queridos pais, Elisa e Alejandro, pelo exemplo de vida que são para mim e

sempre ao meu lado me incentivaram, permitiram e deram condições de lutar pelos meus

sonhos.

Ao Bruno, meu doce companheiro, pela sua fiel presença e apoio constante nos momentos

bons e ruins. E a Juliana, nosso eterno amor que ainda sem entender muita coisa

transformou e irradiou de alegria a nossa vida.

Muito obrigada pela paciência de todos!

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

(do texto em português)

Ach - Acetilcolina

ATP - Adenosina trifosfato

DHA - Ácido docosahexaenóico

EDHF - Fator hiperpolarizante derivado do endotélio

EDRFs - Fatores de relaxamento derivado do endotélio

e-NOS - Óxido nítrico sintase endotelial

EPA - Ácido eicosapentaenóico

EROS - Espécies reativas de oxigênio

GMP

cíclico

- Guanosina monofosfato cíclico

HDL colesterol - Lipoproteína de alta densidade (colesterol)

LTB

- Leucotrienos da série 4

LTB

- Leucotrienos da série 5

LDL colesterol - Lipoproteína de baixa densidade (colesterol)

MitoK

ATP - Canais mitocondriais de K

sensíveis ao ATP

NO - Óxido nítrico

PUFAs - Ácidos graxos poliinsaturados

SNP - Nitroprussiato de sódio

TG - Triacilglicerol

VII

Sumário

__________________________________________________________________

Lista de siglas e abreviaturas.................................................................................VII

Resumo..................................................................................................................IX

Abstract..................................................................................................................X

Introdução..............................................................................................................1

Objetivo geral...... ..................................................................................................11

Artigo1....................................................................................................................11

Artigo2....................................................................................................................25

Discussão...............................................................................................................49

Conclusão...............................................................................................................56

Referências bibliográficas.......................................................................................57

Anexos....................................................................................................................67

VIII

Resumo

Os efeitos cardioprotetores dos ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) n-3 são

atribuídos às ações antiarrítmica, antibrombótica, antiinflamatória e vasoprotetora

cujos mecanismos de ação podem estar inter-relacionados. No presente estudo

avaliamos o efeito farmacológico da suplementação dietética dos PUFAS n-3 na

microcirculação da bolsa da bochecha de hamster. O projeto foi dividido em duas

etapas. Na primeira etapa avaliamos a reatividade vascular em animais tratados

durante 14 dias com óleo de peixe ou azeite de oliva usando aplicação tópica de

dois vasodilatadores: um dependente do endotélio - acetilcolina (Ach) e outro

independente do endotélio - nitroprussiato de Sódio (SNP) e dois vasoconstritores:

fenilefrina (agonista do receptor ∝

- adrenérgico) e serotonina (5-hydroxi-

triptamina). Na segunda etapa estudamos os efeitos farmacológicos da

suplementação oral de diferentes dosagens de ácido eicosapentaenóico (EPA)

triacilglicerol (TG) na permeabilidade a macromoléculas e no rolamento e adesão de

leucócitos induzidos por isquemia/reperfusão comparado à suplementação dietética

com azeite de oliva ou óleo de peixe. O grupo do óleo de peixe comparado ao

grupo do azeite de oliva mostrou maior vasodilatação com todas as substâncias

estudadas, aumento do fluxo sanguíneo e da densidade funcional capilar com

todas as substâncias testadas. Além desses efeitos a suplementação crônica de

óleo de peixe, em condição controle (antes da aplicação tópica de qualquer

substância vasoativa) mostrou uma freqüência de vasomotricidade arteriolar

espontânea 2, 37 vezes maior que os animais tratados com azeite de oliva sem

alterar a amplitude de vasomotricidade. A suplementação dietética com EPA ou

óleo de peixe foi capaz de inibir o aumento da permeabilidade a macromoléculas e

reduzir significativamente o número de leucócitos rolantes e aderidos induzidos

pela isquemia/reperfusão quando comparado ao azeite de oliva. Os efeitos do

EPA foram dose-dependente. Nossos resultados sugerem que a suplementação

dietética do óleo de peixe melhora a reatividade vascular provavelmente por ativar os

canais de K

, que atuam como fator hiperpolarizante do endotélio (EDHF) e

possivelmente aumentam a produção de vasodilatadores, um deles o óxido nítrico

(NO). Além disso, os PUFAs n-3, especialmente o EPA pela capacidade

antioxidante, são capazes de reduzir a interação leucócito-endotélio e a produção de

espécies reativas de oxigênio (EROS) e conseqüentemente diminuir o número de

leucócitos rolantes e aderidos e a permeabilidade microvascular induzida pela

isquemia/reperfusão.

__________________________________________________________________

Abstract

_________________________________________________________________________

The cardioprotector effects of n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) are

attributed to antiarrhytmic, antithrombotic, antiinflammatory and vasoprotector

actions and the mechanisms of action could be inter-related. The aim of this work

was to study pharmacological effects of n-3 PUFAs dietary supplementation in the

microcirculation of the hamster cheek pouch, divided in two steps. In the first step,

we observed vascular reactivity in animals treated during 14 days with fish oil or

olive oil subjected to topical application of 2 vasodilators: endothelial dependent -

acetylcholine (Ach) and endothelial independent – sodium nitroprussiate (SNP)

and 2 vasoconstrictors: phenylephrine (∝

- adrenergic receptor agonist) and

serotonin (5-hydroxi-tryptamin). In the second step, we investigated the

pharmacological effects of differentes doses of eicosapentaenoic acid (EPA)

(triglyceride form) dietary supplementation on macromolecular permeability

increase and on the number of rolling and sticking leukocytes induced by

ischaemia/reperfusion in the cheek pouch microcirculation compared to olive oil

and fish oil dietary supplementation. Fish oil group compared to olive oil one

showed greater dilation, increased blood flow and functional capillary density with

all substances tested. Furthermore, the effects of fish oil dietary supplementation

compared to olive oil group, in control conditions (without topical application of

vasoactive substances) enhanced 2.37 times the spontaneous arteriolar

vasomotion frequency without any effect on the amplitude. EPA or fish oil dietary

supplementation compared to olive oil inhibited macromolecular permeability

increase and significantly reduced the number of rolling and sticking leukocytes

induced by ischaemia/reperfusion. The effect of EPA was dose-dependent. Our

results suggest that fish oil dietary supplementation improved the vascular reactivity

by activating K

channels, which act as endothelial derived hiperpolarizing factor

(EDHF) and possibly increase the production of vasodilators, being one of them nitric

oxide (NO). Furthemore, n-3 PUFAs, specially EPA, through its antioxidant capacity

reduce endothelium-leukocyte interactions and reactive oxygen species (ROS)

production, and consequently decrease the number of rolling and sticking leukocytes

and microvascular permeability induced by ischaemia/reperfusion.

Introdução

_____________________________________________________________

As síndromes cardiovasculares, como o infarto agudo do miocárdio,

insuficiência cardíaca e acidentes cerebrovasculares, são as principais causas

de morte no mundo ocidental e, responsáveis pelo maior gasto de internação

pelo Sistema Único de Saúde no Brasil (Lotufo, 1996; Da Luz & cols

, 2005).

Como a maioria dessas síndromes são oriundas da disfunção endotelial e da

inflamação vascular (Bahia & cols

, 2004; Da Luz & cols

, 2005) muitos

pesquisadores se voltaram para o estudo da microcirculação por sua

capacidade em integrar o sistema cardiovascular e atender às exigências

metabólicas de todo o organismo (Guyton & Hall, 2002; Berne & cols., 2004).

A microcirculação pode ser entendida como a unidade funcional do

sistema circulatório que reúne uma série de estruturas com funções

particulares e harmônicas. Sob o ponto de vista anatômico, este sistema é

composto por uma rede de vasos sanguíneos de diâmetros médios inferiores a

100

m, denominados arteríolas, metarteríolas, capilares, vênulas pós-

capilares, vênulas, comunicações arterio-venosas, sistema linfático e estruturas

perivasais, imersos no fluido intersticial (Guyton & Hall, 2002).

O leito microvascular também pode ser dividido em três segmentos, de

acordo com suas funções específicas em: vasos de resistência - arteríolas,

metarteríolas e esfíncteres pré-capilares que controlam o fluxo sanguíneo aos

órgãos; vasos de troca - capilares; vasos de capacitância - vênulas que são

reservatórios de volume (Guyton & Hall, 2002; Berne & cols., 2004).

As arteríolas são vasos oriundos das artérias de pequeno calibre que

avançam em direção ao sistema capilar através de ramificações progressivas,

onde condutos predominantemente elásticos gradualmente se tornam vasos

cujo diâmetro variável é diretamente controlado pelo tônus da musculatura lisa.

Na parede vascular das arteríolas encontra-se a maior proporção de células

musculares lisas cuja dilatação ou contração pode levar à dilatação máxima ou

até a obstrução dos vasos (Apud Bouskela & cols

, 1999). Nas arteríolas

terminais há uma única camada contínua de células musculares lisas e nas

metarteríolas essa camada é descontínua. Nas metarteríolas, região que dá

origem ao leito capilar, existe um envoltório de células musculares lisas,

denominado esfíncter pré-capilar que está presente em muitos tecidos (Guyton

& Hall, 2002).

As células musculares lisas aparecem também na parede das vênulas

musculares e nas veias mais calibrosas, mas são menos espessas, apesar do

diâmetro ser consideravelmente maior que das arteríolas correspondentes

(Guyton & Hall, 2002).

Normalmente, a inervação simpática vasoconstritora estende-se até as

arteríolas, mas ocasionalmente encontra-se próxima às metarteríolas

(Chambers & Zweifach, 1946).

Devido à ausência de inervação nas metarteríolas e nos esfíncteres pré-

capilares, o controle nesses vasos é realizado por produtos do metabolismo

liberados por tecidos circunjacentes (Guyton & Hall, 2002).

Os capilares, extremamente delgados, formam redes microvasculares

bastante anastomosadas. Podem ser divididos em capilares arteriais e

venosos, dependendo da sua proximidade da metarteríola ou da vênula

coletora. São constituídos por uma camada de células endoteliais e membrana

basal externa envolvida por fina rede de fibras colágenas com diâmetro médio

de 4 a 10

m, sem presença de musculatura lisa. São vasos muito permeáveis

e classificados quanto à continuidade da parede capilar em: contínuos (parede

contínua), fenestrados (com orifícios transcelulares obstruídos por um

diafragma) e sinusóides (com revestimento descontínuo, poroso e trajeto

tortuoso) (Guyton & Hall, 2002).

As vênulas pós-capilares são formadas pela confluência da rede capilar

venosa eventualmente envolta por tecido conjuntivo. Nesses vasos ocorre a

interação leucócito-endotélio, um dos eventos mais importantes na regulação

da inflamação. Além disso, como a sua parede vascular é composta por células

endoteliais ausente de musculatura lisa (Levick, 1991; Guyton & Hall, 2002)

existe a possibilidade de maior troca entre o plasma e o meio extravascular. É

também neste segmento que, em condições fisiopatológicas, ocorre a

permeabilidade a macromoléculas ou permeabilidade microvascular que é

caracterizada pela contração e separação das junções intercelulares das

células endoteliais que permitem o extravasamento das proteínas e

macromoléculas para o meio intersticial (Guyton & Hall, 2002).

O aumento da permeabilidade macromolecular é reversível, mas

depende da concentração de Ca

e da contração dos filamentos de actina e

miosina intracelulares (Rippe & Haraldsson, 1994).

As vênulas musculares são vasos altamente complacentes e possuem a

função de armazenamento ou de reservatório de sangue, ou seja, quando há

excesso de sangue na circulação ou aumento da pressão arterial, as vênulas e

veias se distendem acomodando um volume maior de sangue. Em casos de

diminuição da pressão arterial, ou da necessidade de aumento da volemia, as

vênulas e veias se contraem fazendo com que o sangue armazenado retorne à

circulação. Entretanto, é através do diâmetro médio dos vasos pré-capilares

que ocorre a regulação da pressão arterial.

O aumento da pressão sobre a parede interna arteriolar provoca um

grau de estiramento que é dependente do nível dessa pressão e tende a

despolarizar o músculo liso vascular estimulando a sua contração. A

vasoconstrição significativa diminui o calibre dos vasos, aumenta a resistência

periférica, dificulta o fluxo e diminui o débito cardíaco. Verifica-se o inverso na

vasodilatação. Deste modo, o tônus vascular, que é o estado de contração

parcial dos vasos, determina a resistência periférica causando importante

impacto sobre o fluxo sanguíneo regional (Muller-Delp, 2006). O endotélio

vascular e seus produtos metabólicos também podem interferir no fluxo

sanguíneo regional através da regulação do tônus vasomotor.

Evidências em favor da reação miogênica, como mecanismo

responsável pelo aumento da resistência, foram obtidas em estudos diretos da

microcirculação, principalmente em leitos onde os vasos de resistência exibem

variações rítmicas e espontâneas de seu diâmetro denominadas de

vasomotricidade arteriolar espontânea (Bouskela, 1999).

A vasomotricidade arteriolar espontânea parece ser gerada pela

atividade miogênica do vaso (tensão produzida em resposta a um aumento no

estiramento da parede vascular) através de uma corrente de membrana onde

canais de K

parecem ter importante papel, alternando ciclicamente

vasoconstrição e vasodilatação (Bouskela & cols

, 1996) e possui importante

papel na regulação do fluxo sanguíneo, na perfusão e oxigenação tecidual e na

reatividade vascular (Bouskela & cols

, 1996).

A reatividade vascular é um parâmetro microcirculatório obtido através

da análise da variação do diâmetro arteriolar e venular, e é caracterizado pela

resposta vascular a diferentes drogas vasoativas e a variação de volume de

sangue circulante nos vasos (Bouskela & Grampp, 1992).

Dentre as inúmeras drogas vasoativas, a Ach (substância vasodilatadora

dependente do endotélio) e o SNP (substância vasodilatadora independente do

endotélio) são extremamente utilizadas em estudos científicos. A Ach atua nos

receptores muscarínicos das células endoteliais estimulando a liberação de

prostaciclina, EDHF e NO, substâncias que no músculo liso causam

relaxamento (Sobey, 2001; Vanhoutte, 2003). O SNP produz relaxamento do

músculo liso por ativação da guanilato ciclase e pelo aumento da produção de

GMP cíclico independente da integridade do endotélio.

Segundo Bouskela & cols

(1996), os fatores de relaxamento derivados

do endotélio (EDRFs), liberados pelo mesmo, podem regular tanto o diâmetro

arteriolar via óxido nítrico (NO) e guanosina monofosfato cíclico (GMPcíclico)

quanto a vasomotricidade, provavelmente via fator hiperpolarizante derivado do

endotélio (EDHF).

O endotélio produz também substâncias vasoconstritoras como a

endotelina e as espécies reativas de oxigênio (EROS) (Sader & Celermajer,

2002). Sob condições fisiológicas as EROS produzidas são neutralizadas pelos

antioxidantes naturais (Aukrust & cols., 2001). Entretanto, se a produção de

radicais livres for excessiva, ocorre estresse oxidativo (Aukrust & cols

, 2001;

Sirotkovic-Skerlev & cols

, 2006) prejudicando as funções celulares e

mitocondriais (Facundo & cols

, 2005).

Segundo Werns & Lucschesi (1989), a peroxidação lipídica

principalmente da fração LDL colesterol e a oxidação do grupamento sulfidrila

das proteínas causam distúrbios na permeabilidade da membrana celular e nas

funções enzimáticas. Estudo recente mostra que estes danos podem ser

prevenidos se forem ativados canais mitocondriais de K

sensíveis ao ATP

(mitoK

ATP

) que reduzem a liberação das

EROS (Facundo & cols., 2005).

Além disso, as EROS produzidas sob condições de estresse oxidativo,

como na isquemia/reperfusão, diminuem a biodisponibilidade de NO e

promovem a superposição dos efeitos vasoconstritores sobre os efeitos

vasodilatadores (Sanchez & cols., 2006; Bahia & cols

, 2006) prejudicando o

relaxamento vascular dependente do endotélio.

O estresse oxidativo decorrente da isquemia/reperfusão inclui também o

envolvimento de citocinas e de mediadores inflamatórios (Sirotkovic-Skerlev &

cols., 2006) que desencadeiam o acúmulo de leucócitos e o extravasamento de

proteínas e macromoléculas nas vênulas pós-capilares durante a reperfusão

(Simões & cols., 2001).

Em 2001, Conde & cols

propuseram que o aumento do extravasamento

macromolecular induzido pela isquemia/reperfusão pode ser decorrente da

produção das EROS e do controle homeostático do Ca

celular na

microcirculação da bolsa da bochecha. Corroborando essa hipótese, Bertuglia

& Giusti (2003) mostraram que o uso de antioxidantes é capaz de bloquear as

EROS e inibir a adesão leucocitária induzida por isquemia/reperfusão

aumentando o fluxo sanguíneo no mesmo modelo experimental, provavelmente

por diminuir a ativação ou os danos endoteliais causados por esses radicais

livres.

Estudos em modelos experimentais e clínicos têm mostrado que os

ácidos graxos provenientes da dieta podem interferir na morbidade e

mortalidade das doenças cardiovasculares (Bucher & cols., 2002; Griel & Kris-

Etherton, 2006; Leaf & cols, 2003; Zhang & cols, 1999; Wijendran & Hayes,

2004), visto que esses ácidos podem alterar a resposta endotelial (Shimokawa

& Vanhoutte, 1988), os níveis das frações lipídicas e o metabolismo de

quilomicrons (Lottenberg & cols

, 1992), a estereologia do miocárdio (Aguila &

cols., 1998) e outros fatores associados a essas doenças.

Embora, a redução no consumo de lipídeos seja associado a níveis mais

baixos de colesterol e a menor incidência de cardiopatias coronarianas, parece

que a substituição da gordura saturada por insaturada numa dieta é mais

importante que a quantidade de gordura ingerida cuja recomendação varia de

25% a 30% da energia total ingerida diariamente (Apud Castro & cols., 2004).

Além do alto consumo de gordura saturada, o exagerado consumo de

gordura trans, a baixa ingestão de antioxidantes e fibras, associados ao

sedentarismo, tabagismo e outros fatores podem predispor às doenças

circulatórias.

Os ácidos graxos são cadeias de hidrocarbonetos que possuem em uma

das extremidades um grupo carboxila e na outra um grupo metila. São

classificados, respectivamente, quanto à ausência ou presença de dupla

ligação em: saturados (origem animal - carnes, leite integral e seus derivados -

exceto peixe) e insaturados (origem principal vegetal - exceto palma). Os

insaturados se dividem ainda em: monoinsaturados (origem - azeite de oliva,

abacate e amendoim) ou poliinsaturadas de acordo com a quantidade de

duplas ligações. Os ácidos graxos ômega-6 e ômega-3 são exemplos de

poliinsaturados que possuem duas e três insaturações, respectivamente

(Mahan & Arlin, 2005). Além dos ácidos graxos supracitados existem os trans

que geralmente são provenientes do processo de hidrogenação cujos óleos

vegetais são convertidos em margarinas e gorduras vegetais (origem –

biscoitos, margarinas, sorvetes etc).

Os PUFAs ômega-6 (origem - óleos de soja, milho e girassol) possuem

esta denominação por apresentarem a sua primeira dupla ligação no carbono 6

a partir do radical metil do ácido graxo e são representados também pelas

formas n-6 ou ω-6. Os principais ácidos graxos que compõem o grupo Ômega

6 são: ácido linoleico e ácido araquidônico.

Do mesmo modo, o ômega-3

(origem - óleos de canola e linhaça, peixes gordurosos e frutos do mar) possui

sua primeira dupla ligação no carbono 3 a partir do radical metil do ácido graxo

e pode ser representado pelas formas n-3 ou ω-3. Os ácido

-linolênico (18:3n-

3) e os seus derivados, o ácido eicosapentanóico (EPA – 20:5 n-3) e o ácido

docosahexanoico (DHA – 22:6 n-3) são os principais ácidos graxos que

compõem o grupo ômega-3 (Din & cols., 2001).

Vários cientistas, inclusive a FAO/WHO, recomendam que a proporção

ideal de consumo de PUFAs n-6/n-3 diário varia de 5:1 a 10:1, porém alguns

especialistas sugerem uma proporção entre 1:1 e 4:1 como sendo a ideal

(Simoupoulus, 1991; Rodriguez-Cruz & cols., 2005; Consenso de Nutrição –

Região Sul, 2006). Nos Estados Unidos, por exemplo, esta razão chega a 10:1,

devido à alta difusão do uso de óleos vegetais ricos em ômega-6 e no Canadá

a proporção é de 4:1 (Apud Lima & cols., 2000). Os PUFAs da série n-3 não

são sintetizados pelo organismo, por isso devem ser adquiridos através da

alimentação, a fim de evitar deficiências nutricionais (Hu, 2001).

Os benefícios cardiovasculares da inclusão de PUFAs n-3 na dieta são

estudados há mais de 30 anos, quando os cientistas observaram que os

esquimós apresentavam reduzida incidência de doenças cardiovasculares,

apesar do alto consumo de gordura na dieta. Evidenciaram também que os

níveis plasmáticos de triglicerídeos e colesterol total eram baixos e os de

lipoproteína de alta densidade (HDL) aumentados (Apud Beilin, 1993).

Atualmente, a função cardioprotetora dos PUFAs n-3 continua sendo

atribuída a suas ações antitrombótica, antiaterogênica, antiarrítmica e

vasoprotetora (Abeywardena & Head, 2001).

O consumo de PUFAs n-3, diminui a produção de eicosanóides

inflamatórios, citocinas, EROS e a expressão de moléculas de adesão. Estes

ácidos atuam diretamente (substituindo o ácido araquidônico e inibindo o seu

metabolismo) e indiretamente (alterando a expressão de genes inflamatórios

pela capacidade de ativação do fator de transcrição (Calder, 2006).

Acredita-se que os efeitos benéficos dos maiores constituintes do óleo

de peixe, o EPA e o DHA, nas doenças inflamatórias crônicas sejam

promovidos por mudanças oxidativas que atenuam a expressão dos receptores

de adesão leucocitária e a interação entre leucócito-endotélio (Sethi & cols.,

2002).

A capacidade de modificação da biossíntese dos eicosanóides também

está associada aos efeitos antiagregantes plaquetários e antiinflamatórios dos

PUFAS n-3, principalmente do EPA, capaz de antagonizar os tromboxanos e

leucotrienos das séries 2 e 4, respectivamente pró-agregantes plaquetários e

pró-inflamatórios (Din & cols., 2001).

Os efeitos da suplementação dos PUFAs n-3 na reatividade vascular

estão relacionados à capacidade de modificação da biossíntese dos

eicosanóides (Schmidt, 1997), aumento da produção de NO (Harris & cols.,

1997) e mudança na condutividade seletiva dos íons Ca

e/ou K

que podem

modular o tônus vascular (Asano & cols., 1998).

Adicionalmente, as alterações estruturais e funcionais provocadas pelos

PUFAS n-3 alteram a estabilidade, a viscosidade e a fluidez de membrana

(Abeywardena & Head, 2001). Os PUFAs n-3 incorporados à membrana celular

podem modificar esta estrutura, atuar sobre as ações enzimáticas e

diretamente sobre os canais de Ca

e/ou K

promovendo ações antiarrítmicas

(Abeywardena & Head, 2001). Segundo Matthan & cols. (2005), as arritmias ou

os distúrbios rítmicos do coração podem comprometer o fluxo sanguíneo

coronariano resultando na diminuição da oxigenação do músculo cardíaco

(isquemia) ou na morte deste tecido (infarto).

Os PUFAs n-3 podem também, como antioxidantes (Barbosa & cols

2003), diminuir os danos provocados ao endotélio vascular pelas EROS.

O estudo da microcirculação

in vivo

é de extrema relevância para

complementar e melhor caracterizar os efeitos dos PUFAs n-3 neste sistema.

Acredita-se que a maioria desses efeitos seja mediada pelo endotélio da

parede vascular, responsável pela regulação e manutenção da homeostasia e

da função cardiovascular (Bucher & cols., 2002).

Objetivo Geral

______________________________________________________

Avaliar o efeito farmacológico da suplementação dietética de óleo de

peixe e de EPA triacilglerol na microcirculação usando como modelo

experimental a bolsa da bochecha de hamster.

Artigo 1 – Longchain n-3 polyunsaturated fatty acids and microvascular

reactivity: Observation in the hamster cheek pouch. Microvasc Res. 2006

Dec 27; [Epub ahead of print]

Objetivo

Avaliar o efeito farmacológico da suplementação oral de óleo de peixe na

microcirculação da bolsa da bochecha de hamsters através da análise do

diâmetro e do fluxo de sangue arteriolar e venular, da freqüência e da amplitude

de vasomotricidade arteriolar espontânea e da densidade capilar funcional.

Desenho experimental

Todos os procedimentos realizados com os animais tiveram aprovação do

comitê de ética em pesquisa experimental da UERJ (H36/94) que foram divididos

em 9 grupos (massa corporal entre 85 -135 g). Após período de quarentena, 4

grupos (n=6) foram tratados durante 14 dias, 2 vezes ao dia, por via oral, com

azeite de oliva (placebo) e 4 grupos (n=6) com óleo de peixe (30% de PUFAs n-

3), 0,4 mL/100 g de massa corporal. As dosagens equivalentes a 0,1 e 0,2 mL/

100g de massa corpórea não foram usadas porque experimentos pilotos não

mostraram diferença significativa entre a maior dosagem. No 15

dia, foi

realizada a preparação da bolsa da bochecha (ver p.15-16). O efeito

farmacológico da suplementação dietética do óleo de peixe na reatividade

vascular foi analisado usando aplicação tópica de dois vasodilatadores: um

dependente do endotélio - acetilcolina (Ach) e outro independente do endotélio -

nitroprussiato de Sódio (SNP) e dois vasoconstritores: fenilefrina (agonista do

receptor

∝

-adrenérgico) e serotonina (5-hydroxi-triptamina). O uso desses

vasomediadores foi necessário para mostrar a resposta endotelial e do músculo

liso da microcirculação da bolsa da bochecha de hamster. Um grupo extra (n=12)

foi separado para avaliação de dados eletrofisiológicos.

Resultados principais

A – O diâmetro arterial em animais tratados com óleo de peixe foi maior com os

fatores de relaxamento e de constrição dependentes do endotélio.

B – Os animais tratados com óleo de peixe mostraram fluxo sanguíneo e

densidade funcional capilar aumentados com todas as substâncias testadas.

C – O grupo do óleo de peixe, na condição controle (antes da aplicação tópica

de qualquer substância vasoativa) mostrou uma freqüência de vasomotricidade

arteriolar espontânea 2, 37 vezes maior que os animais tratados com azeite de

oliva sem alteração de sua amplitude.

Para melhor elucidação ver p. 16-20

Conclusão

A suplementação dietética crônica com óleo de peixe aumenta a vasomotricidade

provavelmente associada à ativação dos canais de K

que atuam como o EDHF e

possivelmente aumentam a produção de vasodilatadores, sendo um deles o NO.

Artigo 2 – Effects of eicosapentaenoic acid (EPA) on macromolecular

permeability and leukocyte rolling and sticking induced by

ischaemia/reperfusion (Submetido para publicação na Revista Life

Sciences)

________________________________________________________________________

Objetivo

Avaliar o efeito farmacológico da suplementação oral do EPA

triacilglicerol através da permeabilidade a macromoléculas e do

rolamento/adesão de leucócitos induzidos pela isquemia/reperfusão na

microcirculação da bolsa da bochecha de hamsters.

Desenho experimental

Após período de quarentena, 55 hamsters machos (massa corporal

entre 85 - 135 g) foram divididos e tratados, durante 14 dias, 2 vezes ao dia,

por via oral: Grupo I (n=11) - azeite de oliva (placebo) 0.5 mL/dia; Grupo II

(n=11) – óleo de peixe 0.5 mL/dia (30% de PUFAs n-3); Grupo III (n=11) – EPA

0.004 mL/dia e Grupo IV (n=11) – EPA 0.02 mL/dia e Grupo V (n=11) – EPA

0.1 mL/dia. No 15

dia, os grupos descritos acima foram submetidos à

experimentação. Foi realizada isquemia em todos os animais, entretanto para

não comprometer os resultados dos parâmetros avaliados, dos 11 animais do

grupo I, II, III, IV e V, 5 foram utilizados para análise de rolamento/adesão de

leucócitos e 6 para observação da permeabilidade microvascular durante a

reperfusão (para maior elucidação dos materiais e métodos ver p. 31- 34).

Resultados principais

Durante a reperfusão observamos que o tratamento com óleo de peixe

ou com as diferentes dosagens de EPA triacilglicerol comparado ao tratamento

com azeite de oliva: A – reduziu significativamente o número de leucócitos

rolantes e aderidos; B – inibiu significativamente o aumento da permeabilidade

microvascular. Nossos resultados mostraram também que os efeitos do EPA

são dependentes da dosagem utilizada. Para melhor elucidação dos resultados

ver p. 35 - 37.

Conclusão

O efeito vasoprotetor dos antioxidantes está associado à sua capacidade

de reduzir a interação leucócito-endotélio e a produção de EROS. Nossos

resultados sugerem que a inibição da permeabilidade microvascular e a

redução no número de leucócitos rolantes e aderidos durante a reperfusão seja

decorrente da ação antioxidante dos PUFAs n-3. Apontamos principalmente

para a magnitude desse efeito em um dos seus principais constituintes, o EPA.

Effects of eicosapentaenoic acid (EPA) on macromolecular permeability

and leukocyte rolling and sticking induced by ischaemia/reperfusion

Cristiane M.S. Conde, Maria das Graças Coelho de Souza, Fernando L. Sicuro, Jean

Gardette* and Eliete Bouskela

Laboratório de Pesquisas em Microcirculação, Universidade do Estado do Rio de Janeiro,

Rua São Francisco Xavier, 524, 20550-013 Rio de Janeiro, RJ, Brazil and *Institut de

Recherche Pierre Fabre, 3 rue Ariane, 31527 Ramonville, France.

Running title:

Effects of EPA on ischaemia/reperfusion

Address for correspondence:

Eliete Bouskela, M.D., Ph.D.

Laboratório de Pesquisas em Microcirculação

Pavilhão Reitor Haroldo Lisboa da Cunha, térreo

Universidade do Estado do Rio de Janeiro

Rua São Francisco Xavier, 524

20550-013 Rio de Janeiro RJ

Brazil

Telephones: +55-21-2587-7764 or +55-21-2587-7771

Telefax: +55-21-2587-7760

e-mail: eliete_bouskela@yahoo.com.br

Abstract

There are

evidences suggesting that oxygen free radicals can mediate tissue injury

during ischaemia (I) and, in particular, during reperfusion (R) where accumulation of

activated neutrophils elicit an inflammatory response. Reports of postischaemia events

in the hamster cheek pouch have shown an increase of rolling/sticking leukocytes and of

microvascular permeability. The aim of our study was to determine if these events could

be affected by n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) and specifically by purified

eicosapentaenoic acid (EPA). Male hamsters were treated for 14 days by oral gavage

with olive oil (positive placebo), fish oil or different doses of EPA. On the 15

day,

animals were anesthetized and had their cheek pouch everted and prepared for intravital

microscopy. Temporary ischaemia (30 min) was obtained using an expandable cuff

placed around the proximal part of the preparation. Treatment with fish oil or EPA

significantly reduced macromolecular permeability in a dose-dependent fashion and the

number of rolling/sticking leukocytes induced by I/R compared to olive oil group.

Purified EPA elicited similar or even more pronounced results than fish oil. Our data

suggest that n-3 PUFAs could act as an antioxidant and exert their protective effect by

reducing endothelium-leukocyte interactions and reactive oxygen species (ROS)

production.

Key words:

n-3 PUFAs, rolling/sticking leukocytes, microvascular permeability,

ischemia/reperfusion, hamster, reactive oxygen species

Introduction

Fish oil improves endothelial cell function that play an important role on vascular tone

regulation, tissue perfusion, vascular permeability, myocardial function, blood fluidity,

anticoagulant activity and inflammatory responses (Abeywardena and Head, 2001;

Calder, 2004). Under physiological conditions, the endothelium balances the production

of vasodilators such as nitric oxide (NO) and vasoconstrictors like endothelin and

reactive oxygen species (ROS) (Abeywardena and Head, 2001; Pratico, D:, 2005).

During ischaemia/reperfusion (I/R) injury, activation and dysfunction of endothelial

cells have been reported (Carden and Granger, 2000) and the

production/biodisponibility of endothelium-derived relaxing factors (EDRFs), mainly

NO, are reduced (Bahia et al., 2006).

The pathogenesis of I/R injury includes excessive production of ROS and vasoactive

substances such as NO and endothelin, activation of neutrophils and complement with

involvement of cytokines and other inflammatory mediators (Sirotkovic-Skerlev et al.,

2006) resulting in impairment of cellular functions. Futhermore, reactive oxygen and

nitrogen metabolites are important physiological modulators of leukocyte-endothelial

cell interactions within the microcirculation (Grisham et al., 1998). These interactions

are essential during acute inflammatory responses and tissue repair (Lerh and Hübner,

1995).

ROS generated by activated neutrophils have been implicated in several

pathophysiological conditions, including reperfusion after local or systemic ischaemia

(Lerh and Hübner, 1995; Usatyuk and Natarajan, 2005).

In the microcirculation, accumulation of leukocytes and excessive fluid and protein

filtration are observed on postcapillary venules of inflammed tissues (Granger and

Kubes, 1994). Leukocyte adhesion has been correlated with increased microvascular

permeability (Bertuglia et al

, 1993). However, according to He and co-workers. (2000)

adhesion of leukocytes to postcapillary venules does not always result on increased

vascular permeability. Bertuglia and Giusti (2003) showed that an antioxidant treatment

blocked ROS production and leukocyte adhesion induced by I/R in the hamster cheek

pouch.

Although the underlying mechanism has not been fully elucidated yet, there is evidence

that fish oil intake exerts a protective effect on I/R injury manifestation in models of

experimental myocardial and cerebral ischaemia (Black et al., 1979; Culp et al., 1980;

McLennan et al., 1988).

N-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) intake, as found in fish oils, decrease the

production of inflammatory eicosanoids, cytokines, ROS and the expression of adhesion

molecules. N-3 PUFAs act both directly (by replacing arachidonic acid as an eicosanoid

substrate and inhibiting arachidonic acid metabolism) and indirectly [by altering the

expression of inflammatory genes through effects on transcription factor activation

(Calder, 2006)]. Chen and co-workers (2003) suggested that major fish oil constituents,

eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA), can reduce

inflammation by attenuation ox-LDL-induced expression of adhesion molecules and

adhesion of monocytes in human coronary artery endothelial cell culture (HCAECs).

N-3 PUFAs, such as eicosapentaenoic acid (EPA), are highly polyunsaturated and

undergo readily to oxidation (Sethi, 2002). Beneficial effects of fish oil in chronic

inflammatory diseases may be due to oxidative modification

of omega-3 fatty acids with

subsequent inhibition of leukocyte

adhesion receptor expression and leukocyte-

endothelial interactions (Sethi et al., 2002.).

The present study was designed to examine the effects of fish oil and different doses of

one of its constituents EPA triacylglyceride (TG) treatments for 14 days on

rolling/sticking leukocytes and microvascular permeability after I/R in the hamster

cheek pouch. The pouch was observed in its cutaneous part to facilitate comparison with

data available in the literature (Bouskela and Grampp, 1992; Duling, 1973). This part of

the preparation is highly vascularized and all classes of microcirculatory vessels can

usually be visualized in the microscopic field with good clarity. Therefore, comparative

studies of various microvascular segments are possible.

Material and methods

All experiments were performed according to protocols approved by the Ethical

Committee of the State University of Rio de Janeiro, Brazil (H 36/94).

Experiments were performed on 55 male hamsters (Mesocricetus auratus, Botucatu, São

Paulo, SP, Brazil) weight range from of 85 to 135 g (7 to 10 weeks old). Animals were

divided into 5 groups treated by oral route for 14 days, twice a day, at 8:00 AM and 5:00

PM. Group I received olive oil, 0.5 mL/100 g body weight/day; group II, fish oil (Maxepa,

Institut de Recherche Pierre Fabre, Ramonville, France, concentrated in 30% on n-3

polyunsaturated fatty acids), 0.5 mL/100 g body weight/day; group III, EPA TG

(OMÉGAVIE EPA 90 TG, Institut de Recherche Pierre Fabre, Ramonville, France,

concentrated in 94.5%), 0.004 mL/100 g body weight/day; group IV, EPA TG,

0.02mL/100 g body weight/day and group V, EPA TG, 0.1 mL/100g body weight/day.

PUFAs n-3 effects on I/R were evaluated through macromolecular permeability and

number of rolling and sticking leukocytes.

On the 15

day, 30 min after the last dose of either olive oil, fish oil or EPA TG, anesthesia

was induced by an intraperitoneal injection of 0.1-0.2 ml of sodium pentobarbital

(Pentobarbital sodique, Sanofi, Paris, France, 60 mg/mL) given intraperitoneally and

maintained with

-chloralose [1,2-O-(2,2,2-trichlorethyliden)

-D-glucofuranose, Merck,

Darmstadt, Germany, 100 mg body weight] administered through the femoral vein catheter

also used for injections of fluorescein isothyocyanate (FITC)-dextran (TdB Consultancy,

Uppsala, Sweden) or rodhamine-6G (Sigma Chemicals, St. Louis, M.O., USA).

Throughout surgery and subsequent experiment, the temperature of the animals was kept at

36.5

C with a heating pad controlled by a rectal thermistor (LTB 750 Thermostat System,

Uppsala process data AB, Sweden). To facilitate spontaneous breathing, a tracheal tube

was inserted.

Cheek pouch preparations were prepared according to Duling (1973) modified by

Svensjö (1990) and Bouskela and Grampp (1992). The pouch was mounted in an

experimental chamber continuously superfused by a HEPES-supported HCO

-buffered

saline solution bubbled with 5% CO

- 95% N

in order to keep the pH of the

superfusion solution at 7.40. Throughout the experiment, the same gas mixture was also

gently blown over the experimental chamber to keep a low oxygen tension (pO

at 12-

15 mmHg) in the superfusion solution. The temperature of the solution was kept at 36.0

0.5º C with a circulating bath (model 8005, Polyscience - USA). After 30 minutes of

stabilization (resting period), the cheek pouch was subjected to local ischaemia induced

by a cuff (a thin latex tubing) placed around the proximal part of the preparation and

kept inflated for 30 min (Erlansson et al., 1991). The placement of the cuff can be made

without any visible interference with local blood flow. The intratubular pressure can be

rapidly increased by air compression using a syringe, and also rapidly decreased at

evacuation. An intratubular pressure of 200 to 220 mmHg in the cuff resulted in a

complete arrest of microvascular blood flow, which eventually returned to a level

similar to that observed before occlusion, during the reperfusion period.

In the absence of an ischaemic period, the observed parameters [microvascular

permeability and rolling and sticking leukocytes] did not change significantly during 5

hours. Once the resting period finished, if the preparation meets the inclusion criteria:

(1) no spontaneous leakage of plasma and (2) no increase in the number of

rolling/sticking leukocytes, the experiment was performed.

Observation of leukocytes

Leukocytes in circulation were labeled in vivo by an i.v. injection of 0.4 mL (0.1

mg/mL) of rhodamine 6G (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) immediately prior

to the observation and followed by a continuos infusion of the fluorescent dye thereafter

(10

L/min - Harvard apparatus, model 55-2222) and observed in UV-light microscope

(Leica DM LS; Leica) with a set of filters (Excitacion BP 546-12/Emission LP 590)

coupled to a closed circuit TV system, 445 X magnification. In each preparation, two

venules (10-15

m diameter and a length from 100 to 400

m) were selected taking into

account the possibility to return exactly to the same site (presence of fat cells,

bifurcations, etc) for consecutive measurements. Experiments were performed by taking

1 min videotape recordings of selected microvessel fields in initial control conditions

(before ischaemia) and subsequently at onset, 15, 30, 45 min of reperfusion.

Rolling and sticking leukocytes were counted using playback of videotape recordings

and frame by frame analysis. A leukocyte was considered as rolling when it was in

contact with the venular wall and had lower velocity than circulating erythrocytes and

adherent when it did not flow within the blood stream but was immobilized at one

position during the entire observation period (30s) (Simões et al., 2001).

Macromolecular permeability

Thirty minutes after the completion of the preparation, FITC-dextran was injected (Mw

= 150000, 25 mg/100g body weigth) as a marker of leaky sites (= leaks). Leaks are

defined as visible extravascular spots (diameter > 100

m) of FITC-dextran seen under

fluorescent light on postcapillary venules (9-16

m in internal diameter).

Microvascular permeability was quantified by counting the number of leaks in the

prepared area using an UV-light microscope (Leica DM LS; Leica, optical

magnification 40X) with a set of filters (excitacion BP 450-490/Emission LP 520). The

number of leaks was manually scanned and counted before ischaemia and during

reperfusion. Maximal response to I/R occurs at 10 min after the onset of reperfusion and

this is the value reported for each experiment.

Statistical analyses

Comparisons between groups were made by Kruskal-Wallis non-parametric ANOVA

and Mann-Whitney U test. Intra-group comparison was performed by Wilcoxon test.

Values of p

≤

0.05 were considered significant.

Results

Mean arterial pressure and body mass were not significantly different among the

investigated groups.

Rolling/sticking leukocytes increase induced by I/R

After total ischaemia of 30 minutes, there was an increase in the number of rolling and

sticking leukocytes during reperfusion. The number of rolling leukocytes on the olive

oil group significantly increased at 15, 30 and 45 min of reperfusion compared to what

was observed before ischaemia (p

0.04 for all times). The fish oil group had a

significant increase at 15 min of reperfusion (p < 0.04) and for EPA TG groups, only

the one of 0.004 mL/day increased the number of rolling leukocytes at 15 min of

reperfusion (p < 0.04). Comparisons time to time between fish and olive oil treated

animals pointed to a significant decrease in the number of rolling leukocytes at 15 (p =

0.05), 30 (p < 0.02) and 45 min (p < 0.01) of reperfusion. Compared to olive oil, groups

treated with EPA TG 0.004 mL/day (group III), did not show a significant difference on

the number of rolling leukocytes during reperfusion; EPA TG 0.02 mL/day (group IV)

had a reduction at 15 (p = 0.05), 30 (p < 0.01) and 45 min (p = 0.05) of reperfusion and

EPA TG 0.1 mL/day (group V) showed a significant difference at 15 (p < 0.03) and 45

min (p < 0.02) of reperfusion.

Comparing fish oil and EPA TG groups, only EPA TG 0.004 mL/day (group III) had a

significant difference on the number of rolling leukocytes at 45 min of reperfusion (p <

0.03). Comparison time to time has shown a significant difference between EPA TG

0.004 mL/day and EPA 0.1 mL/day at 15 min of reperfusion (p = 0.05 ) (figure 1).

In the olive oil group there was a significant increase on the number of sticking

leukocytes, at onset, 15 and 30 minutes of reperfusion compared to what could be

observed before ischaemia (p

0.04 for all times). The fish oil group had a significant

increase only 15 minutes after reperfusion has started (p < 0.04) and EPA TG groups at

the onset and at 15 minutes of reperfusion (p < 0.04).

Comparison between fish and olive oil treated animals within the same time pointed to a

significant decrease in the number of sticking leukocytes immediately (p < 0.01), 15 (p

< 0.01) and 30 min (p < 0.01) of reperfusion. Furthermore, when the two highest EPA

TG doses were compared to olive oil, the number of sticking leukocytes was

significantly smaller for the same times (p < 0.01). Comparison of EPA TG 0.04 mL

versus olive oil showed a significant decrease on the number of sticking leukocytes

immediately (p < 0.02), 15 and 30 min of reperfusion (p < 0.01). There were no

significant differences between fish oil and EPA TG or among EPA TG groups

themselves on the number of sticking leukocytes. At 45 min of reperfusion, no

difference on the number of sticking leukocytes could be detected in any of the groups

studied (figure 2).

Macromolecular permeability increase induced by I/R

Total ischaemia of 30 minutes caused a reversible increase in the number of leaks at

postcapillary venules during reperfusion on the olive oil treated group. Results obtained

for the group treated with olive oil was not significantly different from the ones

obtained with untreated animals previously studied in our laboratory (Conde et al.,

2001). Mean maximal number of leaks observed, in the hamster cheek pouch, for group

I was 121 leaks/cm

, group II (fish oil) 36 leaks/cm

, group III (EPA TG) 52 leaks/cm

group IV (EPA TG) 38 leaks/cm

and group V (EPA TG) 32 leaks/cm

(figure 3).

Comparison between olive oil and each one of the other groups showed a significant

inhibition on the number of leaks. Macromolecular permeability increase induced by I/R

was significantly inhibited by fish oil (p

0.01), EPA TG 0.004 mL/day (p

0.002),

EPA TG 0.02 mL/day (p

0.002) and EPA 0.1 mL/day (p

0.001), compared to olive

oil treated group. No significant differences could be detected between fish oil and the

highest doses of EPA TG (0.1 mL/day) used. However, when fish oil treatment was

compared to other EPA TG doses used, significant differences could be detected, for

EPA TG 0.004 mL/day (group III), p

0.01 and for EPA TG 0.02 mL/day (group IV),

0.04. No statistically significant difference was noted between the two highest doses

of EPA TG (0.02 and 0.1 mL/day), but there were significant differences between EPA

TG 0.004 and 0.02 mL/day (p

0.01) and between EPA TG 0.004 and 0.1 mL/day (p

0.01).

Discussion

We have shown in this study that treatment with n-3 PUFAs is more effective than with

olive oil in postischaemic events. Fish oil, as well as EPA TG in different doses reduced

the number of rolling/sticking leukocytes and inhibited the increase of microvascular

permeability in the hamster cheek pouch. Our data corroborate the study of Lehr and

co-workers (1991) and add the effects of different doses of EPA, to our knowledge not

explore before. In fact, this constituent of fish oil in the form of triacylglyceride,

purified to 94, 5%, seems to be at least 5 times more potent than the whole oil. Lerh and

co-workers (1991), in the dorsal skinfold hamster model, that fish oil enriched diet

could attenuate microvascular manifestations of I/R, such as increased macromolecular

permeability and number of rolling/sticking leukocytes.

Evidences suggest that intake of high doses of PUFAs can promote lipid peroxidation

and subsequent propagation of oxygen radicals (Roig-Perez et al., 2004). However, it

was also showed that n-3 PUFAs contributes to inhibit or diminish tissues lesions

caused by ROS (Jahangiri et al

, 2006) which may specifically damage ion pumps,

exchangers and channels, including Ca

, Na

and K

channels (Kourie, 1998). Another

study demonstrated that pre-treatment with EPA significantly inhibited ROS production

(Zhang et al., 2002) which may damage endothelium and myocytes by lipid

peroxidation and oxidation of protein sulfhydryl groups, leading to disturbance of

membrane permeability and enzyme function (Werns and Lucschesi, 1989).

Moreover, n-3 PUFAs dietary supplementation changes fatty acid composition and

cholesterol content of cell membranes modifying membrane fluidity and altering

membrane receptor functions, membrane-bound enzymes and ion-transporters such as

and Ca

(McMurchie et al.,1983; Fournier et al., 1995). Danthi et al. (2005)

showed that n-3 PUFAs, DHA, EPA and α-linolenic, inhibit T-type Ca

channels which

regulate Ca

entry.

Although recent studies have also shown an immunomodulatory function of DHA

(Apud Shimizu et al., 2003), only EPA stimulated NO production in spite of a smaller

and more transient elevation of intracellular Ca

concentration in endothelial cells in

situ (Omura et al., 2001).

Zhu and He (2005) suggested that elevation of endothelial Ca

is an early event

preceding NO synthesis which could activate barrier changes and contribute to platelet

activating factor (PAF) induced increases in microvessel permeability. Studies using the

cat mesentery demonstrated that leukocyte adherence to postcapillary venules is

promoted by platelet activating factor (PAF) and leukotriene B

(LTB

) (He et al.,

2000). LTB

induces leukocyte adhesion to microvascular endothelium through

upregulation of CD11b/CD18 (Mac-1, CR3) adherence receptors on leukocyte surface.

Compared to LTB

, EPA-derived LTB

is less potent in upregulating CD11b/CD18

(Mac-1, CR3) (Apud Lehr et al., 1991).

Werns and Lucschesi (1989) have reported an accelerated influx of neutrophils during

reperfusion following myocardium ischaemia and our group showed that total ischaemia

of the hamster cheek pouch followed by reperfusion induces leukocyte adherence and

increased microvascular permeability (Simões et al., 2001; Bouskela et al., 1999)

probably due to excessive production of ROS and reduced NO bioavailability. We have

also observed a decrease of microvascular permeability on animals treated with vitamin

E, shark cartilage, ascorbic acid and different flavonoids (Conde et al., 2001; Bouskela et

al., 1997; Bouskela et al., 1993) again possibly due to their antioxidant effects. Another

study in the rat liver parenchyma showed that fish oil and vitamin E improved the

antioxidant defense system more than olive oil treatment (Kirimlioglu et al., 2006).

Fish oil could act through an inhibition of the biosynthesis of leukotrienes, series 4

(Lehr et al., 1991) but other factors might also contribute to leukocyte infiltration

(Takamatsu et al., 2004). We suggest that n-3 PUFAs through its antioxidant capacity

reduce endothelium-leukocyte interactions and ROS production, and consequently

decrease the number of rolling/sticking leukocytes and microvascular permeability. Our

data also points out to the importance of one of its constituents, namely EPA, for the

observed effects and opens up possibilities for purified compounds.

Acknowledgements

The authors wish to Mr. Carlos Eduardo Mascarenhas, Fátima Z.G.A. Cyrino, Eliane de

Souza Furtado, Denise Salles C. da Mota, Paulo José Ferreira Lopes and Claúdio Natalino

Ribeiro for technical help.

This work was supported by the National Research Council of Brazil (CNPq), FAPERJ

and the State University of Rio de Janeiro. Fish oil, EPA and olive oil were generous

gifts of the Institut de Recherche Pierre Fabre, Ramonville, France.

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Figures legends

Figure 1 - Number of rolling leukocytes/

m/min before ischaemia and during

reperfusion at its onset, 15, 30 and 45 min in the hamster cheek pouch. Animals were

treated with olive oil 0.05 mL/day (control group), fish oil 0.05mL/day and different

EPA doses (0.004, 0.02 and 0.1 mL/day) during 14 days by oral route. Five animals per

group. *, statistically different from values before ischaemia; #, statistically different

from values obtained with olive oil, at the same time; §, statistically different from

values obtained with fish oil oil, at the same time; +, statistically different from values

obtained with EPA 0.004 mL/day, at the same time.

Figure 2 - Number of sticking leukocytes/mm

before ischaemia and during reperfusion

at its onset, 15, 30 and 45 min in the cheek pouch. Animals were treated with olive oil

0.05 mL/day (control group), fish oil 0.05mL/day and different EPA doses (0.004, 0.02

and 0.1 mL/day) during 14 days by oral route. Five animals per group. *, statistically

different from values before ischaemia; #, statistically different from values obtained

with olive oil, at the same time.

Figure 3 – Maximal number of leaks at poscapillary venules observed in the hamster

cheek pouch during reperfusion in groups treated with olive oil, fish oil and EPA

groups. *, significantly different from olive oil group; #, significantly different from fish

oil oil group; §, significantly different from EPA 0.004 mL/day group.

Discussão

______________________________________________________

Um dos métodos de avaliação da microcirculação

in vivo

é a microscopia

intravital, utilizada em nosso laboratório. Escolhemos a preparação da bolsa da

bochecha de hamster pela vizualização nítida da microcirculação e por ser um

modelo estável que garante a análise de seus parâmetros e a reprodutibilidade

dos dados. Além disso, os roedores possuem aspectos hemodinâmicos

semelhantes à espécie humana (Fink & Heard, 1990) permitindo a correlação

do estudo experimental com o estudo clínico.

É descrito na literatura que o uso de várias doses de pentobarbital

sódico pode provocar efeitos indesejáveis na função cardiovascular (Hoque &

cols., 1996), por isso utilizamos uma única dose intraperitoneal desta

substância, apenas para induzir a anestesia. Durante experimentação, a

manutenção da anestesia foi feita com injeção endovenosa de α-cloralose.

A temperatura corporal do animal mantida em 36,5

C e a traqueostomia

tiveram o intuito de manter a homeostasia e facilitar a respiração espontânea

do animal, respectivamente.

A solução de perfusão que banhou a bolsa da bochecha com pH (7, 4) e

temperatura (36, 5

C ± 0.3

C) controlados foi utilizada para evitar alterações

oxidativas decorrentes da exposição ao ar e desestabilizações metabólicas que

alteram as atividades enzimáticas locais.

Os cuidados descritos foram seguidos para descartar variáveis que

poderiam prejudicar a análise do estudo.

Experimentos pilotos mostraram que não houve diferença significativa na

permeabilidade vascular induzida pela isquemia/reperfusão em animais

tratados com azeite de oliva (controle positivo) ou água (controle). Embora a

dieta do Mediterrâneo promova um menor índice de doenças cardiovasculares,

a suplementação dietética do azeite de oliva por si só quando comparado ao

óleo de peixe não justifica os benefícios cardiovasculares relatados. Entretanto,

o azeite de oliva pode ser benéfico na substituição de ácidos graxos saturados

e trans associados à mudança de dieta e estilo de vida saudável (Trichopoulou

& cols

, 2003; Visioli & Galli, 1998).

As dosagens suplementadas de óleo de peixe e azeite de oliva foram

escolhidas previamente em estudos realizados no mesmo modelo experimental

(Laflor, 2004). As dosagens de 0,02 e 0,1 mL/dia de EPA TG purificado foram

escolhidas para verificar a existência de uma relação dose-resposta nos efeitos

observados. Dosagens menores não foram possíveis pela dificuldade de

tratamento e dosagens maiores não foram testadas pela possível toxicidade.

Além de indicarem que os efeitos dos PUFAs n-3 não se restringem ao

sistema macrocirculatório, nossos estudos mostraram que os efeitos benéficos

destas substâncias também são observados na microcirculação.

Na microcirculação, a análise da resposta vascular a diferentes drogas

vasoativas e a variação de fluxo de sangue circulante nos vasos mostrou que o

tratamento com PUFAs n-3 foi mais eficaz comparado ao tratamento com

azeite de oliva.

Embora o mecanismo de ação dos PUFAs n-3 no relaxamento arterial

seja discutido, estudos mais recentes mostraram que a dilatação arteriolar

coronariana promovida pelos metabólitos do DHA parecem ter relação com a

ativação dos canais de K

dependente de Ca

nas células musculares lisas

(Ye & cols

, 2002).

Observamos que os animais tratados com óleo de peixe apresentaram

maior vasodilatação com os fatores de relaxamento e de constrição

dependentes do endotélio, com vasodilatação arteriolar acompanhada por

aumento do fluxo sanguíneo e da densidade funcional capilar com todas as

substâncias testadas. Acreditamos que a vasodilatação arteriolar observada

possa ser regulada pelo NO, via GMPcíclico, e pela modulação de canais

iônicos. Acreditamos também que os PUFAs n-3 ativem os canais de K

dependentes de voltagem e inative os principais canais iônicos responsáveis

pela despolarização (canais de sódio e cálcio).

Outro estudo realizado no nosso laboratório mostrou que animais

suplementados com óleo de peixe, por via oral, apresentaram diâmetro

arteriolar médio maior durante a reperfusão que os suplementados com azeite

de oliva, possivelmente pela proteção dada ao endotélio (Laflôr, 2004). A

função endotelial através de iontoforese também foi testada em indivíduos

saudáveis que receberam suplementação alimentar de diferentes tipos de

ácidos graxos. Constatou-se que apenas o grupo suplementado com PUFAs n-

3 apresentou vasodilatação dependente do endotélio. Isso demonstra que a

adição de PUFAs n-3 à dieta pode melhorar a saúde vascular e reduzir os

riscos de doenças cardiovasculares (Khan & cols, 2003). A melhora da função

endotelial dependente de óxido nítrico também foi observada em homens

hiperlipidêmicos, mas foi atribuída somente ao DHA (Mori & cols., 2000).

Para Abeywardena & Head (2001), o efeito protetor do óleo de peixe

está associado à melhora da função das células endoteliais vasculares, à

modulação da interação aos receptores agonistas, à diminuição da pressão

arterial e à redução de lesões em órgãos.

Estudos apontam que a suplementação dietética com PUFAs n-3

estimula a expressão de óxido nítrico sintase endotelial (e-NOS) (Nyby & cols.,

2005) cuja produção excessiva de NO foi confirmada pelo aumento da

excreção urinária de seus metabólitos em humanos (Harris & cols

, 1997).

Além disso, estudos clínicos e experimentais apontam que o EPA como o DHA

aumentam a produção de prostaciclinas e deprimem a resposta de agentes

vasoconstritores, pois os eicosanóides provenientes da conversão do EPA são

vasoconstritores menos potentes (o tromboxano A

- vasoconstritor é

biologicamente inativo e a prostaglandina 3 – vasodilatadora equipotente à

prostaglandina 2) (DeCatarina & cols., 1990; Abeywardena & cols., 1989;

Abeywardena & Head, 2001). Entretanto, Chin & Dart (1995) citam que a

vasodilatação arterial causada pelo EPA não é afetada pelo ibuprofeno que é

inibidor da ciclooxigenase, mas pela produção de NO, via L-arginina, induzida

por acetilcolina, entre outras substâncias.

A ação antioxidante dos PUFAs n-3 e do EPA também melhora a função

endotelial, influencia no aumento da biodisponibilidade de óxido nítrico, via

GMPcíclico e previne o acúmulo de Ca

nas células musculares lisa (Jahangiri

& cols

, 2006). Com a manutenção do Ca

intracelular ocorre menor contração

e separação das junções interendoteliais e diminuição do extravasamento de

proteínas e macromoléculas para o interstício. Zhu & He (2005) sugerem que a

elevação dos níveis de Ca

endotelial que precede a síntese de NO, causa

mudanças na membrana dessas células e contribui para o aumento da

permeabilidade microvascular.

O NO pode também atuar nos neutrófilos e nas células endoteliais e

amenizar a ativação de mastócitos e plaquetas com os quais os neutrófilos

atuam em sinergismo durante a isquemia/reperfusão (Apud Chakraborti & cols.,

2000).

Segundo Barros (2000), na isquemia/reperfusão, a maioria das EROS

citotóxicas é produzida pelos leucócitos polimorfonucleares que se infiltram na

região isquêmica e liberam esses radicais durante a reperfusão.

Em nosso estudo o óleo de peixe, assim como o EPA TG nas diferentes

dosagens testadas foram capazes de reduzir o número de leucócitos rolantes e

aderidos e inibir o aumento da permeabilidade microvascular induzida pela

isquemia/reperfusão na bolsa da bochecha do hamster. O EPA purificado na

formulação de TG parece ser até mais potente que o óleo de peixe. Os dados

referentes a este estudo corroboram com o estudo de Lerh e cols. (1991) e as

diferentes dosagens de EPA fornecem resultados ainda não explorados.

Embora alguns estudos assegurem que a incorporação dos PUFAs n-3

nos fosfolipídeos de membrana torne-a mais susceptível à peroxidação

(Alexander-North & cols., 1994; Van Ginkel & Sevanian, 1994), é possível que

o estresse oxidativo promovido pelos PUFAs n-3 ative o sistema de defesa e

estimule a regulação das enzimas antioxidantes pelas mitocôndrias que são as

fontes primárias de EROS (Perry & cols., 2000; Cristophe & Nicolas, 2006).

Outros estudos demonstram que a suplementação dietética de PUFAs

n-3 é capaz de diminuir a concentração de peróxidos e normalizar as enzimas

antioxidantes, quando a produção de oxidantes excede a de antioxidantes

gerados pelos sistemas protetores de oxidação (Iraz & cols., 2005; Padma &

cols

., 2006). Outra hipótese a ser considerada refere-se às características

específicas de cada derivado. Postula-se que o DHA por ser mais insaturado, é

mais susceptível à oxidação que o EPA (Abeywardena & Head, 2001). Sasaki

& cols. (1990) e Volker & cols. (2000) já mostravam que o EPA era mais efetivo

na resposta inflamatória que o DHA. Estudos posteriores

in vitro

mostraram

que o EPA era capaz de inibir significativamente as EROS (Zhang & cols.,

2002). No mesmo ano, Sethi & cols (2002) apontaram para o efeito do EPA

oxidado na inflamação, como potente inibidor da interação leucócito-endotélio

comparado ao EPA nativo.

Efeitos dos PUFAs n-3 na expressão gênica têm recebido considerável

atenção, pois há evidências de que estes ácidos regulem a expressão de

genes em leucócitos (Otton & Cols., 1998; Verlengia & cols., 2003). Acredita-se

que os PUFAs n-3 atuam na interação leucócito-endotélio, porque diminuem a

expressão de moléculas de adesão leucocitária ou porque impedem a ativação

das células endoteliais (DeCatarina & cols., 2000). Para Lehr & cols. (1991), a

redução no número de leucócitos aderidos ao endotélio vascular é decorrente

de seu derivado, o leucotrieno da série 5 (LTB

que é menos potente na

regulação de receptores de adesão CD11b/CD18 na superfície leucocitária

comparado ao leucotrieno da série 4 (LTB

Embora os PUFAs n-3 possam atuar através da inibição da biossíntese

de leucotrienos da série 4 (Lehr & cols., 1991) outros fatores podem contribuir

para o infiltrado de leucócitos (Takamatsu & cols., 2004). Sugerimos que a

melhora observada após isquemia/reperfusão no nosso modelo possa ser

promovida também pelos efeitos antioxidantes dos PUFAs n-3, porque quando

utilizamos vitamina E, cartilagem de tubarão, ácido ascórbico e diferentes

flavonóides observamos a diminuição da permeabilidade microvascular

possivelmente por seus efeitos antioxidantes (Conde & cols, 2001; Bouskela &

cols., 1997; Bouskela & cols., 1993). Outro estudo em parênquima de fígado de

rato mostrou que o óleo de peixe e a vitamina E melhoraram o sistema de

defesa antioxidante mais que o azeite de oliva (Kirimlioglu & cols., 2006).

A capacidade antioxidante dos PUFAs n-3 podem reduzir a interação

leucócito-endotélio e a produção de EROS, e consequentemente diminuir o

número de leucócitos rolantes e aderidos e a permeabilidade microvascular.

Nossos resultados também mostram a importância de um dos constituintes

desses PUFAs n-3, denominado EPA e abre novas possibilidades de estudos

para os componentes purificados.

Conclusão

______________________________________________________________________

Os PUFAs n-3 possuem importante papel protetor no endotélio vascular

demonstrado pela melhora da reatividade vascular e pela redução dos eventos

inflamatórios resultantes da interação leucócito-endotélio e da inibição da

permeabilidade vascular induzida pela isquemia/reperfusão.

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ANEXOS

_________________________________________________________________________

Figura 1 - Leito microcirculatório de mesentério adaptada do Guyton, A.C. and

Hall, J.E.: Tratado de fisiologia médica. Editora Guanabara Koogan A.S. 10a

edição, Rio de Janeiro, RJ, Brasil, 153-161, 2002.

Figura 2 – Representação esquemática dos maiores representantes dos ácidos

graxos poliinsaturados.

Figura 3 – Preparação da bolsa da bochecha do hamster apta a visualização

em microscópio.

Figura 4 - Ilustração do sistema para a manutenção da homeostase da

preparação e do sistema de vídeo acoplado ao microscópio.

Figura 5 -

Isquemia induzida com auxílio de manguito feito de tubo de látex fino

colocado na parte proximal da bolsa da bochecha do hamster.

Figura 6 - Representação da imagem no monitor que faz o alinhamento vertical

e corte óptico da imagem, permitindo o registro das variações do diâmetro

interno dos vasos.

Figura 7 – Imagens da microcirculação da bolsa da bochecha (aumento 40X)

com isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrana sem pontos de

extravasamento e com pontos de extravasamento em vênulas pós-capilares.

Figura 8 - Imagem de leucócitos rolantes e aderidos a parede de uma vênula

pós-capilar registrada em videotape, durante 1 minuto, através de circuito

fechado de televisão acoplado ao microscópio (aumento de 445X). A seta

presente na imagem A e B mostra o rolamento do um leucócito.

COMPOSIÇÃO DA RAÇÃO COMERCIAL UTILIZADA NA DIETA

DOS HAMSTERS

COMPOSIÇÃO BÁSICA DO PRODUTO: Milho integral moído, farelo de soja,

farelo de trigo, carbonato de cálcio, fosfato bicálcico, cloreto de sódio, premix

vitamínico mineral aminoácido.

Níveis de garantia por quilograma do produto

Umidade (máx.) 12,50%

Proteína Bruta (min.) 22,00%

Extrato Etéreo (min.) 4,00%

Matéria Fibrosa (máx.) 8,00%

Matéria Mineral (máx.) 10,00%

Cálcio (máx.) 1,40%

Fósforo (min.) 0,80%

Enriquecimento por quilograma do produto:

Vitaminas: Vit A 25.200 UI; Vit D

2.100 UI; Vit E 60 mg; Vit K

12,5 mg;

Vit B

14,4 mg; Vit B

11 mg; Vit B

12 mg; Vit B

60 mcg; Niacina 60 mg;

Ácido Pantotênico 112 mg; Ácido Fólico 6 mg; Biotina 0,26 mg;

Colina 1.100 mg.

Microelementos minerais:

Ferro 50 mg; Zinco 60 mg; Cobre 10 mg;

Iodo 2 mg; Manganês 60 mg; Selênio 0,05 mg; Cobalto 1,5 mg.

Aminoácidos: Lisina 100 mg; Metionina 300 mg.

Aditivos: Antioxidantes 100 mg.

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