( PDF ) Efeito de dois probióticos, saccharomyces boulardii e saccharomyces cerevisiae linhagem ufmg 905, na resposta inflamatória induzida por salmonella enterica subsp. Entérica sorovar. typhimurium

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

Flaviano dos Santos Martins

Efeito de dois probióticos, Saccharomyces

boulardii e Saccharomyces cerevisiae linhagem

UFMG 905, na resposta inflamatória induzida

por Salmonella enterica subsp. enterica

sorovar. Typhimurium

Belo Horizonte

2008

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Flaviano dos Santos Martins

Tese

Efeito de dois probióticos, Saccharomyces boulardii e

Saccharomyces cerevisiae linhagem UFMG 905, na

resposta inflamatória induzida por Salmonella enterica

subsp. enterica sorovar. Typhimurium

Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-

Graduação em Ciências da Saúde, área de

concentração Saúde da Criança e do Adolescente, da

Faculdade de Medicina da Universidade Federal de

Minas Gerais, como requisito parcial para a

obtenção do grau de Doutor em Ciências da Saúde.

Orientador:

Prof. Dr. Jacques Robert Nicoli (Departamento de Microbiologia/ICB/UFMG)

Co-orientadores:

Dra. Dorota Czerucka (Faculté de Médecine, Université de Nice-Sophia Antipolis, Nice/France)

Prof. Dr. Francisco José Penna (Departamento de Pediatria, Faculdade de Medicina/UFMG)

Belo Horizonte

2008

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iii

Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde

Área de Concentração em Saúde da Criança e do Adolescente

Reitor: Prof. Ronaldo Tadêu Pena

Vice-Reitora: Profa. Heloisa Maria Murgel Starling

Pró-Reitor de Pós-Graduação: Prof. Jaime Arturo Ramirez

Pró-Reitor de Pesquisa: Prof. Carlos Alberto Pereira Tavares

Diretor da Faculdade de Medicina: Prof. Francisco José Penna

Vice-Diretor da Faculdade de Medicina: Prof. Tarcizo Afonso Nunes

Coordenador do Centro de Pós-Graduação: Prof. Carlos Faria Santos Amaral

Subcoordenador do Centro de Pós-Graduação: João Lúcio dos Santos Jr.

Chefe do Departamento de Pediatria: Profa. Cleonice de Carvalho Coelho Mota

Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde – Área de

Concentração em Saúde da Criança e do Adolescente:

Coordenador: Prof. Joel Alves Lamounier

Sub-coordenador: Prof. Eduardo Araújo de Oliveira

Profª Ana Cristina Simões e Silva

Prof. Francisco José Penna

Profª Ivani Novato Silva

Prof. Lincoln Marcelo Silveira Freire

Prof. Marco Antônio Duarte

Profª Regina Lunardi Rocha

Ludmila Teixeira Fazito (Rep. Disc. Titular)

Dorotéa Starling Malheiros (Rep. Disc. Suplente)

Dedico este trabalho a meus pais, Geraldo e Neuza,

pelo apoio sempre constante e pela contribuição

para o meu crescimento pessoal e profissional. Aos

meus orientadores Jacques Robert Nicoli, Dorota

Czerucka e Francisco José Penna.

vii

“A confiança é a forma mais elevada de motivação

humana. Ela traz à tona o que há de melhor nos

seres humanos. Mas exige tempo e paciência, e não

elimina a necessidade de treinar e aprimorar as

pessoas, de forma que sua competência possa fazer

jus à confiança depositada”. Stephen R. Covey.

viii

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, Prof. Dr. Jacques Robert Nicoli, que me recebeu em seu

laboratório e, desde 2002, vem me orientando, sempre mostrando o melhor caminho a

seguir, pela confiança depositada no meu trabalho, pela incontestável orientação ao

longo de todo este trabalho e pela presença sempre constante. Pela grande pessoa e

pesquisador que é, e por depositar em mim a confiança de uma parceria com um dos

principais nomes na área de mecanismos de ação de probióticos, a Dra. Dorota

Czerucka, e, também por sua presença e ajuda constantes, mesmo durante a realização

do estágio de doutorado no exterior.

À minha co-orientadora, Dra. Dorota Czerucka, que me recebeu em seu

laboratório, mesmo sem me conhecer, atendendo a um pedido do meu orientador.

Também pela presença constante durante toda a realização dos experimentos e pelo

acompanhamento pessoal e profissional durante minha estada na França. Enfim, por ter

sido minha orientadora, amiga e parte da minha família no exterior. Por toda ajuda e

conselhos, mesmo nos momentos mais complicados. Também pela confiança sempre

depositada em mim e no meu trabalho.

Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Francisco José Penna, pelo convite em realizar

essa tese pela Faculdade de Medicina. Também pelos conselhos, sugestões e toda ajuda

ao longo deste trabalho e pela confiança depositada. E que este trabalho seja apenas o

início de futuras colaborações.

À Profa. Dra. Regina Maria Nardi Drummond, do Laboratório de Microbiologia

Oral e Anaeróbios, pela colaboração e ajuda prestada ao longo deste trabalho e pela sua

disponibilidade em partilhar sua experiência profissional.

Ao Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa, do Laboratório de Ecologia e Biotecnologia

de Leveduras, por gentilmente ceder a levedura Saccharomyces cerevisiae linhagem

UFMG 905, utilizada neste trabalho.

À Profa. Dra. Rosa Maria Esteves Arantes, do Laboratório de Neuro-Imuno-

Patologia Experimental, que executou todos os exames histológicos deste trabalho,

pelas sugestões e sua disponibilidade, experiência e paciência na execução do mesmo.

À Profa. Dra. Ana Cristina Persichini Rodrigues, da Faculdade de Medicina da

UNIFENAS, pelo auxílio durante a realização dos experimentos de translocação e de

dosagem de imunoglobulinas, além de todas as sugestões e pela paciência e

disponibilidade em sempre ajudar.

À Dra. Maria José Neves, do Laboratório de Radiobiologia (CNEN/CDTN) que

vem me acompanhando desde a graduação e por ter me iniciado nesta área de pesquisa.

Também pela confiança sempre depositada em mim e no meu trabalho, e por sempre

disponibilizar seu laboratório.

Ao Dr. Emmanuel Lemichez, chefe do INSERM U627 Toxines Bactériennes

dans la relation hôte pathogènes, Faculté de Médecine, Université de Nice-Sophia

Antipolis, Nice, France, e seus colaboradores, em especial Anne Doye e Marc

Lemonnier, pelo auxílio e incontestável experiência na área de proteínas Rho e

microscopia confocal. E, também, por facilitarem a utilização de técnicas de

microscopia eletrônica do Centro de Microscopia da Université de Nice-Sophia

Antipolis.

Aos Drs. Jean-François Peyron (chefe da equipe), Veronique Imbert e Patricia

Lagadec, do INSERM U526 Activation des Cellules Hématopoïétiques, IFR50, Faculté

de Médecine, Université de Nice-Sophia Antipolis, Nice, France, e seus colaboradores,

pela facilidade e disponibilidade do laboratório em realizar todos os experimentos de

fatores de transcrição. Também, pelas discussões e sugestões realizadas nos seminários

semanais do laboratório.

Ao Guillaume Dalmasso, aluno de doutorado da Dra. Dorota Czerucka, à época

do meu estágio no exterior, por todo o auxílio nos experimentos, todas as sugestões,

pela amizade, companhia e presença constantes.

Aos amigos do Laboratoire de Gastroentérologie et Nutrition, IFR50, Faculté de

Médecine, Université de Nice-Sophia Antipolis, Nice, France, Prof. Dr. Jean-Claude

Poirée (diretor do laboratório), Mme. Françoise Balas, Virginie, Nathalie, Celine e

Rodolphe.

A Virginie por toda a sua amizade e companhia dentro e fora do local de

trabalho, durante minha estadia na França.

A Maria Gorete Barbosa Ribas, que além de toda a ajuda técnica, nos

acompanhou com sua agradável presença, amizade e alegria constante.

A Maria Helena Alves de Oliveira, Antônio Mesquita Vaz e Bernardo Barbosa,

pelo inestimável auxílio técnico.

À banca do exame de qualificação, professores Ieso de Miranda Castro, Maria

Auxiliadora Roque de Carvalho e Márcia Regina Fantoni Torres, pelas correções e

sugestões.

Aos amigos e colegas do Laboratório de Ecologia e Fisiologia de

Microrganismos: Ariane, Bernardo, Cristiane, Danielle, Fabiana, Fábio, Felipe, Flávia,

Flávio, Luiz, Gil, Glauciane, Ilana, Kátia, Leandro, Lorena, Luciano, Nely, Tainá,

Tássia, Samir, Silvana, Sílvia, Vânia, e, também, àqueles que não estão mais no

laboratório, mas que acompanharam parte dessa tese: Aline, Ana Carolina, Ana Helena,

Luciana, Rinaldo e Simone.

À professora Sílvia Beleza de Moura, pelas sugestões, pelas conversas e pela

companhia.

Ao professor Luiz Simeão do Carmo.

A Fabiana, que me acompanhou e ajudou na execução de uma parte dos

experimentos.

Ao Luciano, pelo auxílio na parte experimental do trabalho realizado para a

MERCK.

Aos amigos do CDTN/CNEN: Maria José, Raquel, Antero, Luciana, Frederico,

Marcela, Estefânia, Marina e Tanius Mansur.

xii

A todos os professores do Departamento de Microbiologia e da Faculdade de

Medicina, pelos valiosos ensinamentos.

Aos órgãos financiadores deste trabalho: CAPES, CNPq, FAPEMIG, MERCK

S.A., Laboratoires Biocodex (Paris, França), Région Provence-Alpes Côte d’Azur,

Conseil Général des Alpes Maritimes, Faculté de Médecine de l’Université de Nice-

Sophia Antipolis, e Centre Hospitalier Regional de Nice.

Aos meus pais.

A todos os amigos que sempre me apoiaram.

A todos os meus colegas de curso.

A todos aqueles que não citei mas que, direta e indiretamente, sempre me

apoiaram.

Finalmente, agradeço a Deus.

xiii

SUMÁRIO

xiv

SUMÁRIO p

Lista de figuras........................................................................................................... xix

Lista de tabelas........................................................................................................... xxv

Lista de abreviaturas...................................................................................................

xxvi

Resumo.......................................................................................................................

xxx

Abstract.......................................................................................................................

xxxiii

I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.............................................................................. 001

I.1 Epitélio intestinal............................................................................................

002

I.2 Microbiota gastrintestinal...............................................................................

005

I.3 Probióticos......................................................................................................

008

I.3.1 Efeitos benéficos dos probióticos...................................................................

011

I.3.2 Probióticos na dieta animal.............................................................................

012

I.3.3 Probióticos na dieta humana...........................................................................

013

I.3.4 Mecanismos de ação dos probióticos..............................................................

014

I.3.5 A levedura Saccharomyces boulardii.............................................................

015

I.3.5.1 Usos da levedura S. boulardii na medicina humana.......................................

017

I.3.5.2 Mecanismos de ação da levedura S. boulardii................................................

018

I.3.5.2.1 Ações no nível celular.................................................................................

018

I.3.5.2.2 Ações no nível bacteriano........................................................................... 019

I.3.5.2.3 Efeito anti-inflamatório...............................................................................

022

I.3.5.2.4 Outros efeitos.............................................................................................. 023

I.3.5.3 Vantagens e desvantagens da utilização da levedura......................................

023

I.3.6 A levedura Saccharomyces cerevisiae linhagem UFMG 905........................ 024

I.3.7 Utilização de outras leveduras como probióticos........................................... 029

I.4 Diarréias..........................................................................................................

029

I.5 O gênero Salmonella.......................................................................................

031

I.6 Probióticos e Salmonella.................................................................................

041

I.7 As vias de sinalização celular.........................................................................

043

I.7.1 O fator de transcrição NF-κB.........................................................................

043

I.7.2 As MAP quinases............................................................................................

046

I.7.2.1 ERK.................................................................................................................

048

I.7.2.2 p38...................................................................................................................

048

I.7.2.3 JNK.................................................................................................................

049

I.8 Interleucina-8..................................................................................................

050

I.9 O modelo animal gnotobiótico........................................................................

053

I.10 O modelo de células T84................................................................................ 055

II - RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA...................................................................

057

III - OBJETIVOS........................................................................................................

061

III.1 Objetivo geral..................................................................................................

062

III.2 Objetivos específicos......................................................................................

062

IV - MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................

064

Parte I: Efeitos de S. cerevisiae UFMG 905 no sistema imune de camundongos

NIH, isentos de germes e convencionais....................................................................

065

IV.1 Animais...........................................................................................................

065

IV.1.1 Animais isentos de germes (IG)......................................................................

065

IV.1.2 Animais convencionais (CV)..........................................................................

065

IV.1.3 Manejo dos animais........................................................................................ 065

IV.2. Microrganismos..............................................................................................

066

IV.2.1 Linhagens bacterianas.....................................................................................

066

IV.2.2 Leveduras........................................................................................................

066

IV.3 Tratamento e desafio dos animais...................................................................

067

IV.3.1 Tratamento......................................................................................................

067

IV.3.2 Desafio............................................................................................................

068

IV.4 Determinação da translocação de S. cerevisiae UFMG 905 para as placas

de Peyer (PP), linfonodos mesentéricos (LM), baço e fígado de camundongos

gnotobióticos e convencionais....................................................................................

068

IV.5 Determinação do efeito de S. cerevisiae UFMG 905 na translocação de

Salm. Typhimurium em camundongos gnotobióticos e convencionais......................

069

IV.6 Efeito de S. cerevisiae UFMG 905 na quantidade de células de Küpffer em

camundongos gnotobióticos.......................................................................................

069

xvi

IV.7 Determinação do efeito de S. cerevisiae UFMG 905 no clareamento de E.

coli B

em camundongos gnotobióticos....................................................................

070

IV.8 Determinação do efeito de S. cerevisiae UFMG 905 no nível de

imunoglobulina secretada do tipo A (sIgA) total no conteúdo intestinal de

camundongos gnotobióticos e convencionais.............................................................

070

IV.9 Determinação do efeito de S. cerevisiae UFMG 905 nos níveis de IgA, IgG

e IgM totais no conteúdo intestinal e no soro de camundongos gnotobióticos e

convencionais.............................................................................................................

071

IV.10 Exame anatomopatológico..............................................................................

072

Parte II: Efeitos de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na sinalização celular

induzida, em células T84, após infecção pelo enteropatógeno Salm. Typhimurium

14028..........................................................................................................................

072

IV.11 Culturas celulares............................................................................................

072

IV.12 Tratamento das monocamadas de células T84 com as leveduras S.

boulardii ou S. cerevisiae UFMG 905 e infecção com Salm. Typhimurium 14028..

073

IV.13 Medidas da resistência elétrica transepitelial (RTE), em células T84,

infectadas com Salm. Typhimurium 14028, pré- e co-incubadas (ou não), com S.

boulardii ou S. cerevisiae UFMG 905........................................................................

073

IV.14 Efeito de S. boulardii ou S. cerevisiae UFMG 905 na resposta inflamatória,

em células T84, após infecção por Salm. Typhimurium 14028.................................

074

IV.14.1 Dosagem de IL-8.................................................................................

074

IV.14.2 Expressão de IL-8 por PCR em tempo real (“real time PCR”)...........

074

IV.15 Efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 nas vias de sinalização

celular induzidas, em células T84, infectadas por Salm. Typhimurium 14028..........

075

IV.16 Efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na ativação de NF-κB,

induzido por Salm. Typhimurium 14028....................................................................

076

IV.17 Efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 no crescimento, adesão e

invasão celular induzidos, em células T84, infectadas por Salm. Typhimurium

14028..........................................................................................................................

077

IV.18 Efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 nas vias Rac e Cdc42

induzidas, em células T84, infectadas por Salm. Typhimurium 14028......................

078

IV.19 Análise da capacidade de Salm. Typhimurium 14028 de se ligar às células

de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905.................................................................

079

xvii

IV.20 Análise estatística............................................................................................

080

V - RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................... 081

Parte I: Efeitos de S. cerevisiae UFMG 905 no sistema imune de camundongos

NIH isentos de germes e convencionais.....................................................................

082

V.1 Determinação da translocação da levedura S. cerevisiae UFMG 905 para as

placas de Peyer, linfonodos mesentéricos, fígado e baço de camundongos NIH,

gnotobióticos e convencionais....................................................................................

082

V.2 Determinação da translocação de Salm. Typhimurium para os linfonodos

mesentéricos, fígado e baço de camundongos NIH, gnotobióticos e convencionais,

na presença e na ausência da levedura S. cerevisiae UFMG 905...............................

085

V.3 Efeito da levedura S. cerevisiae UFMG 905, nas células de Küpffer, em

animais gnotobióticos.................................................................................................

089

V.4 Efeito da levedura S. cerevisiae UFMG 905 no sistema fagocítico de

camundongos NIH gnotobióticos, controles e experimentais, quando do desafio

endovenoso com E. coli B

........................................................................................

092

V.5 Níveis de imunoglobulinas secretadas do tipo A (sIgA), IgG e IgM no

conteúdo intestinal e no soro de camundongos NIH, gnotobióticos e

convencionais, controles e experimentais, monoassociados ou tratados com a

levedura S. cerevisiae UFMG 905, respectivamente..................................................

094

Parte II: Efeitos de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na sinalização celular

induzida, em células T84, após infecção pelo enteropatógeno Salm. Typhimurium

14028..........................................................................................................................

100

V.6 Efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na integridade epitelial de

células T84, após infecção por Salm. Typhimurium 14028.......................................

100

V.7 Efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na resposta inflamatória,

em células T84, após infecção por Salm. Typhimurium 14028.................................

104

V.8 Efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 nas vias de sinalização

celular, induzidas em células T84, por Salm. Typhimurium 14028...........................

110

V.9 Efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na invasão celular, em

células T84, infectadas por Salm. Typhimurium 14028.............................................

127

VI - SÍNTESE DOS RESULTADOS.........................................................................

141

xviii

VII - CONCLUSÕES.................................................................................................

144

VIII - PERSPECTIVAS............................................................................................. 146

IX - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................

148

X - ANEXOS..............................................................................................................

211

X.1 Artigos publicados..........................................................................................

212

X.2 Artigos aceitos para publicação......................................................................

213

X.3 Artigos a publicar............................................................................................

214

X.4 Participação em eventos..................................................................................

215

X.5 Trabalhos apresentados em eventos................................................................

216

X.6 Prêmios recebidos...........................................................................................

220

X.7 Autorização do Comitê de Ética para Experimentação Animal da

Universidade Federal de Minas Gerais (CETEA/UFMG)..........................................

221

X.8 Certificado de realização de estágio na Université de Nice, França...............

222

xix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Sobrevivência de camundongos NIH convencionais tratados () ou não

() com S. cerevisiae UFMG 905 e desafiados com 10

células de Salm.

Typhimurium no tempo 1. N = 20 (em cada grupo). * Estatisticamente diferente,

segundo o teste Mann-Whitney Rank, (P = 0,00326). (MARTINS, 2004)................

025

Figura 2. Aspecto histológico do cólon (A e C) e do ceco (B e D) de

camundongos NIH gnotobióticos monoassociados (C e D) ou não (A e B) com a

levedura S. cerevisiae UFMG 905 durante dez dias e desafiados com 10

células

de C. difficile durante 6 dias. Coloração H-E (40X). As setas mostram as áreas de

edema. (MARTINS, 2004).........................................................................................

026

Figura 3. Aspecto histológico do fígado de camundongos NIH convencionais

controle (A) ou tratados com a levedura S. cerevisiae UFMG 905 durante dez dias

(B) e desafiados com 10

células de Salm. Typhimurium por 28 dias. Coloração H-

E (100X). As setas indicam as áreas de focos inflamatórios. (MARTINS, 2004).....

027

Figura 4. Sinalização celular induzida pela Salmonella logo após o seu

reconhecimento pelos receptores TLR-4 e TLR-5. (SALEZ & MALO, 2004).........

037

Figura 5. Interação da Salmonella com as células epiteliais. (a) Em contato com a

célula hospedeira, a Salmonella libera várias proteínas efetoras que manipulam o

citoesqueleto celular e induz a entrada da bactéria. SopE, SopE2 e SopB ativam

Cdc42 e Rac, levando ao remodelamento do citoesqueleto. SipA e SipC

estabilizam a actina e induzem nucleação e polimerização da actina. (b) Após a

internalização da bactéria, SptP reverte a função de SopE, SopE2 e SopB. (c)

Após a internalização, o SCV interage, seletivamente, com a maquinaria

endocítica do hospedeiro. (d) Assim que a infecção progride, SPI2-TTSS libera

outras proteínas efetoras e a replicação bacteriana é iniciada. (PATEL et al.,

2005)...........................................................................................................................

040

Figura 6. Ativação do fator de transcrição NF-κB. O NF-κB é mantido no

citoplasma pelas proteínas inibidoras IκBs. Sob determinados estímulos, IκB é

fosforilado, ubiquitinado e degradado, e o NF-κB fica livre para migrar para o

núcleo, onde induz a transcrição de diversos genes dependentes de κB. NF-κB é,

depois, inativado por novas proteínas IκBs sintetizadas. (JOBIN & SARTOR,

2000)...........................................................................................................................

045

Figura 7. Esquema mostrando a sinalização celular via cascata das MAP quinases

ERK, JNK e p38. (KATSOULIDIS et al., 2005).......................................................

047

Figura 8. Esquema mostrando as vias de transdução do sinal essenciais para a

regulação do gene para IL-8. Após ativadas por diversos estímulos, as proteínas

adaptadoras, TRAF 6 e TRAF 2, ativam as vias das MAPKs, assim como fosforila

IκB. O NF-κB transloca-se para o núcleo onde, junto com a proteína AP-1, ativada

pela MAPK JNK, ativam a transcrição do gene para IL-8. O mRNA sintetizado é

rapidamente estabilizado pela MAPK p38. (HOFFMANN et al., 2002)...................

052

Figura 9. Translocação de S. cerevisiae UFMG 905 para o fígado, baço,

linfonodos mesentéricos (LM) e placas de Peyer (PP) em animais monoassociados

(A) e convencionais (B). N = 5...................................................................................

084

Figura 10. Translocação de Salm. Typhimurium, para o fígado, baço e linfonodos

mesentéricos (LM), em camundongos gnotobióticos, previamente monoassociados

com S. cerevisiae UFMG 905 (experimental), ou não (controle). N = 5...................

087

Figura 11. Translocação de Salm. Typhimurium, para o fígado, baço e linfonodos

mesentéricos (LM), em camundongos convencionais, previamente tratados com S.

cerevisiae UFMG 905 (experimental), ou não (controle), após 5 (A) e 10 (B) dias

de desafio. N = 5.........................................................................................................

088

Figure 12. Aspecto histológico do fígado de camundongos corados por HE,

mostrando o número de células de Küpffer em animais isentos de germes (A) e

animais monoassociados com a levedura (B). Observe o aumento do número de

células de Küpffer (setas) no fígado de animais monoassociados com S. cerevisiae

UFMG 905. Aumento: objetiva de 20X.....................................................................

090

Figura 13. Clareamento de E. coli B

do sangue de camundongos isentos de

germes (



) ou monoassociados com S. cerevisiae UFMG 905 (



). Os resultados

são expressos como porcentagem de bactérias viáveis em relação ao tempo 0

(100%) por ml de sangue. Cada ponto representa a média de 11 animais, de dois

experimentos independentes. As barras verticais representam os desvios-padrão

das médias. *Indica diferença estatisticamente significativa entre os grupos

controle e experimental, avaliados pelo teste t de Student (P < 0,05)........................

093

Figura 14. Níveis de IgA (A), sIgA (B), IgG (C-D) e IgM (E-F) produzidas no

conteúdo intestinal (B, D e F) e soro (A, C e E) de camundongos isentos de

germes (controle) e camundongos monoassociados com S. cerevisiae UFMG 905

xxi

(experimental). Os resultados estão expressos como média das concentrações de

imunoglobulinas (ηg) g

-1

de conteúdo intestinal ou ml

-1

de soro. As barras

verticais representam os desvios-padrão das médias. *Indica diferença

estatisticamente significativa entre os grupos controle e experimental, avaliados

pelo teste t de Student (P < 0,05). N = 5....................................................................

098

Figura 15. Níveis de IgG (A) e IgM (B) produzidos no conteúdo intestinal de

camundongos convencionais tratados (experimental) ou não (controle) com a

levedura S. cerevisiae UFMG 905. Os resultados são expressos como média da

concentração de imunoglobulinas (ηg) g

-1

no conteúdo intestinal. As barras

verticais representam os desvios-padrão das médias. Não houve diferença entre os

outros grupos. N = 5...................................................................................................

099

Figura 16. Efeito de S. boulardii (Sb) na diminuição da Resistência Trans-

Epitelial (RTE) induzida por Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células T84. A

RTE diminui progressivamente em células infectadas com Salm. Typhimurium

14028 (), quando comparadas com o controle () ou em células infectadas na

presença simultânea de S. boulardii (), ou em células pré-incubadas com S.

boulardii e infectadas com Salm. Typhimurium 14028 (). A presença de S.

boulardii, apenas, não interfere na RTE (). ON, “overnight”.................................

102

Figura 17. Efeito de S. cerevisiae UFMG 905 (905) na diminuição da Resistência

Trans-Epitelial (RTE) induzida por Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células

T84. A RTE diminui progressivamente em células infectadas com Salm.

Typhimurium 14028 (), quando comparadas com o controle () ou em células

infectadas na presença simultânea de S. cerevisiae UFMG 905 (), ou em células

pré-incubadas com S. cerevisiae UFMG 905 e infectadas com Salm. Typhimurium

14028 (). A presença de S. cerevisiae UFMG 905, apenas, não interfere na RTE

(). ON, “overnight”.................................................................................................

103

Figura 18. Efeito de S. boulardii (Sb) nos níveis de IL-8, induzidos por Salm.

Typhimurium 14028 (ST), em células T84. A IL-8 foi analisada no sobrenadante

de células T84, por ELISA, após 3 horas de infecção com Salm. Typhimurium

14028, na presença de S. boulardii pré- ou co-incubada. *Diferença

estatisticamente significativa entre as células infectadas por Salm. Typhimurium

14028 e células infectadas por Salm. Typhimurium 14028, na presença de S.

boulardii. **Diferença estatisticamente significativa entre as células infectadas

xxii

por Salm. Typhimurium 14028 e o controle (P < 0,05, n = 8). C, controle; ON,

“overnight”.................................................................................................................

107

Figura 19. Efeito de S. boulardii (Sb) nos níveis de IL-8 mRNA, induzidos por

Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células T84. IL-8 mRNA foi analisado nas

células T84, por PCR quantitativo após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm.

Typhimurium 14028, na presença de S. boulardii pré- ou co-incubada. *Diferença

estatisticamente significativa entre as células infectadas por Salm. Typhimurium

14028 e células infectadas por Salm. Typhimurium 14028, na presença de S.

boulardii. (P < 0,05, n = 6). C, controle; ON, “overnight”........................................

108

Figura 20. Efeito de S. cerevisiae UFMG 905 (Sc-905), nos níveis de IL-8,

induzidos por Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células T84. IL-8 foi analisado

no sobrenadante de células T84, por ELISA, após 3 horas de infecção com Salm.

Typhimurium 14028, na presença de S. cerevisiae UFMG 905 pré- ou co-

incubada. *Diferença estatisticamente significativa entre as células infectadas por

Salm. Typhimurium 14028 e células infectadas por Salm. Typhimurium 14028, na

presença de S. cerevisiae UFMG 905. **Diferença estatisticamente significativa

entre as células infectadas por Salm. Typhimurium 14028 e o controle (P < 0,05, n

= 8). C, controle; ON, “overnight”.............................................................................

109

Figura 21. Efeito de S. boulardii (Sb) na indução da fosforilação de MAP

quinases (p38, ERK1/2 e JNK) pela Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células

T84. As células foram lisadas após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm.

Typhimurium 14028 e as amostras foram corridas em SDS-PAGE e analisadas,

por “imunoblotting”, com anticorpos anti-fosfo-p38 (A), anti-fosfo-ERK1/2 (B)

ou anti-fosfo-JNK (C). C, controle; ON, “overnight”................................................

118

Figura 22. Efeito de S. cerevisiae UFMG 905 (905) na indução da fosforilação de

MAP quinases (p38, ERK1/2 e JNK) pela Salm. Typhimurium 14028 (ST), em

células T84. As células foram lisadas após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm.

Typhimurium 14028 e as amostras foram corridas em SDS-PAGE e analisadas,

por “imunoblotting”, com anticorpos anti-fosfo-p38 (A), anti-fosfo-ERK1/2 (B)

ou anti-fosfo-JNK (C). C, controle; ON, “overnight”................................................

119

Figura 23. Saccharomyces cerevisiae W303 (W303) não diminui a fosforilação de

MAP quinases (p38 e ERK1/2), induzidas por Salm. Typhimurium 14028 (ST),

em células T84. As células foram lisadas após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm.

xxiii

Typhimurium 14028 e as amostras foram corridas em SDS-PAGE e analisadas,

por “imunoblotting”, com anticorpos anti-fosfo-p38 (A) ou anti-fosfo-ERK1/2

(B). C, controle; ON, “overnight”..............................................................................

120

Figura 24. Salmonella Typhimurium 14028 (ST), na presença ou ausência de S.

boulardii (Sb), não ativa a apoptose em células T84. As células foram lisadas após

1h, 2h e 3h de infecção com Salm. Typhimurium 14028 e as amostras foram

corridas em SDS-PAGE e analisadas, por “imunoblotting” com anticorpo anti-

caspase-3. C, controle; ON, “overnight”....................................................................

121

Figura 25. Salmonella Typhimurium ATCC 14028 (ST), na presença ou ausência

de S. cerevisiae UFMG 905 (905), não ativa a apoptose em células T84. As células

foram lisadas após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm. Typhimurium 14028 e as

amostras foram corridas em SDS-PAGE e analisadas, por “imunoblotting” com

anticorpo anti-caspase-3. C, controle; ON, “overnight”.............................................

122

Figura 26. Efeito de S. boulardii (Sb) na fosforilação de IκB-α (A) e na ativação

do fator NF-κB (B), induzidas por Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células

T84. As células foram lisadas após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm.

Typhimurium 14028 e as amostras foram corridas em SDS-PAGE e analisadas,

por “imunoblotting”, com anticorpo anti-fosfo-IκB-α. A ligação do fator NF-κB

ao DNA foi examinada pela técnica de EMSA. C, controle; TNF-α (controle

positivo); ON, “overnight”.........................................................................................

123

Figura 27. Efeito de S. cerevisiae UFMG 905 (905) na fosforilação de IκB-α (A)

e na ativação do fator NF-κB (B), induzidas por Salm. Typhimurium 14028 (ST),

em células T84. As células foram lisadas após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm.

Typhimurium 14028 e as amostras foram corridas em SDS-PAGE e analisadas,

por “imunoblotting”, com anticorpo anti-fosfo-IκB-α. A ligação do fator NF-κB

ao DNA foi examinada pela técnica de EMSA. C, controle; TNF-α (controle

positivo); ON, “overnight”.........................................................................................

124

Figura 28. Efeito de S. boulardii (Sb) e do sobrenadante de S. boulardii (SbS) na

indução da fosforilação de MAP quinases (p38 e ERK1/2) pela Salm.

Typhimurium 14028 (ST), em células T84. As células foram lisadas após 3h de

infecção com Salm. Typhimurium 14028 e as amostras foram corridas em SDS-

PAGE e analisadas, por “imunoblotting”, com anticorpos anti-fosfo-p38 (A) e

anti-fosfo-ERK1/2 (B)................................................................................................

125

xxiv

Figura 29. Efeito de S. cerevisiae UFMG 905 (905) e do sobrenadante de S.

cerevisiae UFMG 905 (905S) na indução da fosforilação de MAP quinases (p38 e

ERK1/2) pela Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células T84. As células foram

lisadas após 3h de infecção com Salm. Typhimurium 14028 e as amostras foram

corridas em SDS-PAGE e analisadas, por “imunoblotting”, com anticorpos anti-

fosfo-p38 (A) e anti-fosfo-ERK1/2 (B)......................................................................

126

Figura 30. Efeito de S. boulardii (Sb) na ativação das vias Rac e Cdc42 induzidas

pela Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células T84. As células foram lisadas,

após 3h de infecção com Salm. Typhimurium 14028, e as amostras foram corridas

em SDS-PAGE e analisadas, por “imunoblotting” com anticorpos anti-Rac (A) ou

anti-Cdc42 (B). ON, “overnight”................................................................................

135

Figura 31. Microscopia eletrônica de varredura mostrando a ligação de Salm.

Typhimurium 14028 em células de S. boulardii. (A) Controle (apenas células

T84); (B) Células contendo apenas S. boulardii; (C) Células contendo Salm.

Typhimurium 14028; (D, E, F) Células mostrando ligação de Salm. Typhimurium

14028 em S. boulardii.................................................................................................

136

Figura 32. Microscopia eletrônica de varredura mostrando a ligação de Salm.

Typhimurium 14028 em células de S. cerevisiae UFMG 905. (A) Controle (apenas

células T84); (B) Células contendo apenas S. cerevisiae UFMG 905; (C) Células

contendo Salm. Typhimurium 14028; (D, E, F) Células mostrando ligação de

Salm. Typhimurium 14028 em S. cerevisiae UFMG 905..........................................

137

Figura 33. Microscopia confocal mostrando a ligação de Salm. Typhimurium

14028 (vermelho) em células de S. boulardii (azul)...................................................

138

Figura 34. Efeito de S. boulardii (Sb), na indução da via PI3K-Akt (phosphatidyl-

inositol-3-kinase) pela Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células T84. As

células foram lisadas após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm. Typhimurium 14028

e as amostras foram corridas em SDS-PAGE e analisadas, por “imunoblotting”

com anticorpo anti-fosfo-Akt. C, controle; ON, “overnight”.....................................

139

Figura 35. Efeito de S. cerevisiae UFMG 905 (905) , na indução da via PI3K-Akt

(phosphatidyl-inositol-3-kinase) pela Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células

T84. As células foram lisadas após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm.

Typhimurium 14028 e as amostras foram corridas em SDS-PAGE e analisadas,

por “imunoblotting” com anticorpo anti-fosfo-Akt. C, controle; ON, “overnight”...

140

xxv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Número de focos inflamatórios por unidades de área presentes nos

fígados de camundongos NIH convencionais tratados ou não com a levedura S.

cerevisiae UFMG 905 durante dez dias, e desafiados com 10

células de Salm.

Typhimurium, por 28 dias. (MARTINS, 2004)..........................................................

028

Tabela 2. Número de células de Küpffer (por 100 hepatócitos) em camundongos

sem germes (controle) e camundongos monoassociados, durante 10 dias, com a

levedura S. cerevisiae UFMG 905 (experimental). (P = 0,013; N = 12)....................

091

Tabela 3. Efeito de S. boulardii na adesão e invasão de Salm. Typhimurium

14028, em células T84................................................................................................

133

Tabela 4. Efeito de S. cerevisiae UFMG 905 na adesão e invasão de Salm.

Typhimurium 14028, em células T84.........................................................................

134

xxvi

LISTA DE ABREVIATURAS

AEBSF = 4-(2-aminoetil) benzenosulfonil fluoreto hidroclorido

AMPc = adenosina monofosfato cíclica

AP-1 = proteína adaptadora 1

ARE = elementos cis ricos em AU

ATCC = coleção americana de culturas típicas

BAL = bactérias do ácido láctico

BHI = infuso de cérebro e coração

BSA = soro albumina bovina

C/EBPβ = proteína β ligadora da região “CCAAT/enhancer”

Cadeia J = cadeia “joining”

CV = convencional

DMEM-F12 = “Dulbecco-Vogt modified Eagle” e “Ham’s F-12”

DSS = dextran sulfato de sódio

EGF = fator de crescimento epidérmico

EHEC = E. coli enterohemorrágica

EMSA = ensaio de mudança de mobilidade eletroforética

EPEC = E. coli enteropatogênica

ERK1/2 = quinase regulada por sinal extracelular 1/2

FAO/WHO = “Food and Agricultural Organization / World Health Organization”

FDA = “Food and Drug Administration”

FOS = frutooligossacarídeos

GAP = proteína ativadora de GTPase

GCK = quinase centro germinal

GF = “germ-free”

GM-CSF = fator estimulante de colônias de macrófagos e monócitos

GN = gnotobiótico

GPI = fosfosil-fosfatidil-inositol

GTPases = guanidina tri-fosfatases

HDL = lipoproteínas de alta densidade

HE = hematoxilina-eosina

HSP = proteína de choque térmico

xxvii

IκB = proteína inibidora κB

IFN-β = interferon β

Ig = imunoglobulina

IG = isento de germes

IgA = imunoglobulina do tipo A

IgG = imunoglobulina do tipo G

IgM = imunoglobulina do tipo M

IKK =quinase inibidora de κB

IL = interleucina

INCQS = Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde

IP-10 = proteína 10 induzida por interferon

IRAK4 = quinase associada ao receptor para interleucina 1

IRF-3 =fator 3 regulador de interferon

JNK = quinase c-Jun NH

terminal

kDa = quilo Dalton

LB = Luria Bertani

LBP = proteína de ligação ao LPS

LDL = lipoproteínas de baixa densidade

Lgps = glicoproteínas lisossômicas

LM = linfonodos mesentéricos

LPS = lipopolissacáride

MAP = proteína ativada por mitógeno

MAPK = proteína quinase ativada por mitógeno

MAPKAP-K2 = proteína quinase 2 ativada por MAPK

MAPKK = MAP quinase quinase

MAPKKK = MAP quinase quinase quinase

MCP-1 = proteína 1 quimioatrativa de monócitos

MIP1α = proteína 1α inflamatória de macrófagos

MLC = cadeia leve da miosina

MLCK = MLC quinase

MyD88 = fator 88 de diferenciação mielóide

NADL = “National Animal Disease Laboratory”

NEMO = modificador essencial do fator nuclear κB

xxviii

NF-κB = fator nuclear kappa B

NIH = “National Institute of Health”

NLRs = receptores “parecidos” com o domínio de oligomerização ligado ao nucleotídeo

NOD = domínio de oligomerização ligado ao nucleotídeo

NOS2 = óxido nítrico sintase 2

NRF = fator de repressão do NF-κB

OMS = Organização Mundial de Saúde

ON = “overnight”

PAF = fator ativador de plaquetas

PAMP = motivos moleculares associados a patógenos

PBS = tampão fosfato

PCR = reação em cadeia da polimerase

PEEC = quimioatrativo epitelial extraído de patógeno

PFGE eletroforese em gel de campo pulsado

PI3K-AKT = fosfatidil-inositol-3-quinase

PKC = proteína quinase C

PMN = leucócitos polimorfonucleares

PP = placas de Peyer

PPAR-gamma = receptor gama ativado pelo proliferador de peroxisomo

PtdIns(4,5)P

= fosfatidilinositol 4,5-bifosfato

RAPD-PCR = Amplificação aleatória de genomas polimórficos pela reação em cadeia

da polimerase

RES = sistema reticulo-endotelial

RFLP análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição

Rpm = rotações por minuto

RTE = resistência trans-epitelial

SAPK = proteína quinase ativada por estresse

Sb = Saccharomyces boulardii

SbS = sobrenadante de S. boulardii

SC = componente secretado

Sc 905 = Saccharomyces cerevisiae linhagem UFMG 905

SCID = imunodeficiência combinada com imunoincompetência singênica grave

SCV = vacúolo contendo a Salmonella

SDS-PAGE = eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio

xxix

Sifs = filamentos induzidos pela Salmonella

sIgA = imunoglobulina do tipo A secretada

SPI = ilha de patogenicidade de Salmonella

ST = Salmonella enterica subsp. enterica sorovar. Typhimurium

TAB1 = proteína ligadora à proteína quinase ativada por fator de crescimento e

diferenciação β

TAK1 = quinase associada a fator de crescimento e diferenciação β

TGF-β = fator de crescimento e diferenciação β

TIRAP = proteína adaptadora contendo o domínio do receptor toll para interleucina 1

TLR = receptores semelhantes ao toll

TNF-α = fator de necrose tumoral-α

TRAF6 = fator associado ao receptor de fator de necrose tumoral

TRAM = molécula adaptadora relacionada à TRIF

TRIF = proteína adaptadora indutora de interferon β contendo o domínio do receptor

toll para interleucina 1

TTSS = sistema de secreção do tipo três

UFC = unidade formadora de colônia

YPG = extrato de levedura, peptona e glicose

ZO = “zonula occludens”

xxx

RESUMO

xxxi

Probióticos são definidos como microrganismos viáveis que exibem um efeito

benéfico na saúde do hospedeiro, quando ingeridos em quantidades suficientes. Muitas

espécies de bactérias são usadas para esse fim e a única levedura utilizada como

probióticos em seres humanos é Saccharomyces boulardii. Resultados anteriores

obtidos em nosso laboratório mostraram que a levedura Saccharomyces cerevisiae

linhagem UFMG 905, isolada da produção de cachaça, foi capaz de colonizar e

sobreviver no trato gastrintestinal de camundongos, isentos de germes e convencionais,

respectivamente, além de proteger esses animais contra um desafio oral com Salmonella

enterica subsp. enterica sorovar Typhimurium e Clostridium difficile. Na primeira parte

desse trabalho, os efeitos de S. cerevisiae UFMG 905 na translocação de Salm.

Typhimurium para os linfonodos mesentéricos, placas de Peyer, baço e fígado, assim

como o efeito no sistema imune, pela contagem de células de Küpffer, produção de

imunoglobulinas e clareamento de Escherichia coli B

da corrente sanguínea, foram

avaliados em camundongos gnotobióticos e/ou convencionais. O tratamento com a

levedura reduziu significantemente a translocação de Salm. Typhimurium para o fígado

de animais gnotobióticos e, para todos os órgãos testados, em animais convencionais. O

número de células de Küpffer (por 100 hepatócitos) foi significantemente maior (P <

0,05) em camundongos monoassociados com a levedura (52,9 ± 15,7) que em

camundongos isentos de germes (38,1 ± 9,0). Provavelmente, como uma consequência

do aumento do número de células de Küpffer, o clareamento de E. coli B

da corrente

sanguínea foi mais eficiente nos animais monoassociados com a levedura, quando

comparado com os animais controle isentos de germes. Foram observados maiores

níveis de sIgA no conteúdo intestinal e de IgA e IgM no soro (P < 0,05) nos

camundongos monoassociados com a levedura que no grupo isento de germes.

Concluindo, a proteção observada contra a bactéria enteropatogênica em nosso estudo

anterior foi, provavelmente, devida à modulação local e sistêmica do sistema imune de

camundongos tratados com S. cerevisiae UFMG 905.

Na segunda parte desse trabalho, estudou-se os efeitos de S. boulardii e S.

cerevisiae UFMG 905 na inflamação e na sinalização celular induzidos pela Salm.

Typhimurium 14028, em células T84. Observou-se que os dois probióticos mantiveram

a resistência elétrica transepitelial e diminuiram, significativamente, a secreção de IL-8

em células T84 infectadas por Salm. Typhimurium 14028 (P < 0,05). Saccharomyces

cerevisiae UFMG 905 e S. boulardii diminuiram, significativamente, os níveis de

invasão pela Salm. Typhimurium 14028 (P < 0,05), mas nenhum efeito das leveduras no

xxxii

crescimento ou adesão bacteriana em células T84 foi observado. Diferentemente de S.

boulardii, S. cerevisiae UFMG 905 não foi capaz de diminuir a ativação de Rac1 e

Cdc42 em células infectadas por Salm. Typhimurium 14028. Essas duas proteínas são

Rho-GTPases ativadas pela bactéria e estão envolvidas na internalização de bactérias

invasivas. A ligação de Salm. Typhimurium 14028 à superfície de S. cerevisiae UFMG

905 e S. boulardii, e não às células epiteliais do intestino, pode ser responsável pela

diminuição da invasão e ativação de MAPKs (mitogen-activated protein kinases) e,

conseqüentemente, pela diminuição dos níveis de IL-8, uma vez que esse processo

diminui o número de bactérias ligadas às células T84. Entretanto, a diminuição dos

níveis de IL-8 também pode ser explicada por uma imunomodulação, via secreção de

citocinas anti-inflamatórias, como a IL-10, mas essa hipótese não foi testada nesse

trabalho. A presença das leveduras em células infectadas com Salm. Typhimurium

14028 também reduziu e/ou inibiu a fosforilação das MAPKs ERK1/2, p38 e JNK, mas

não diminuiu a ligação do fator de transcrição para IL-8 (NF-κB) ao DNA, sugerindo

que a diminuição dos níveis de IL-8 não foi devido à inibição do fator de transcrição

para IL-8, mas, provavelmente, ao efeito das leveduras na inibição da MAPK p38, que é

a proteína responsável pela estabilização do mRNA para IL-8. Uma outra explicação é o

fato de as duas leveduras inibirem a MAPK JNK, uma vez que AP-1 (outro fator de

transcrição para IL-8) é dependente da fosforilação dessa proteína. Finalmente, S.

cerevisiae UFMG 905 e S. boulardii inibem, também, a ativação de mecanismos anti-

inflamatórios (a via PI3K/Akt) induzidos por Salm. Typhimurium 14028 em células

T84. Concluindo, S. cerevisiae UFMG 905 e S. boulardii apresentaram um efeito

protetor e modulador na função de barreira e na sinalização celular induzida em células

T84 pela Salm. Typhimurium 14028.

xxxiii

ABSTRACT

xxxiv

Probiotics are defined as viable microorganisms that exhibit a beneficial effect

on the host health when ingested in adequate amounts. Many species of bacteria are

used for this purpose and the only one yeast used as probiotic in humans is

Saccharomyces boulardii. Previous results in our laboratory showed that

Saccharomyces cerevisiae strain UFMG 905, isolated from “cachaça” production, was

able to colonize and survive in the gastrointestinal tract of germ-free and conventional

mice, respectively, and to protect these animals against oral challenge with Salmonella

enterica subsp. enterica serovar Typhimurium and Clostridium difficile. In the first part

of this work, the effects of S. cerevisiae UFMG 905 on the translocation of Salm.

Typhimurium to mesenteric lymph nodes, Peyer’s patches, spleen and liver, as well as

on the immune system by number of Küpffer cells, immunoglobulin production and

clearance of Escherichia coli B

, were evaluated in gnotobiotic and/or conventional

mice. The treatment with the yeast reduced significantly the translocation of Salm.

Typhimurium to liver in gnotobiotic animals and to all the organs tested in conventional

mice. The number of Küpffer cells per 100 hepatocytes in liver was significantly higher

(P < 0.05) in yeast mono-associated mice (52.9 ± 15.7) than in germ-free controls (38.1

± 9.0). Probably, as a consequence, clearance of E. coli B

from the bloodstream was

more efficient in yeast mono-associated animals when compared to germ-free mice.

Higher levels (P < 0.05) of sIgA in intestinal content and of IgA and IgM in serum were

observed in yeast mono-associated mice when compared to germ-free group.

Concluding, the protection against pathogenic bacteria observed in a previous study was

probably due to a modulation of both local and systemic immunity of mice treated with

S. cerevisiae UFMG 905.

In a second part of this work, we have studied the effects of S. boulardii and S.

cerevisiae UFMG 905 on the inflammation and signal transduction induced by Salm.

Typhimurium ATCC 14028 in T84 cells. We have observed that both probiotics

maintained the transmonolayer electrical resistance and significantly diminished IL-8

secretion in Salm. Typhimurium 14028-infected T84 cells (P < 0.05). Saccharomyces

cerevisiae UFMG 905 and S. boulardii also decreased significantly the levels of Salm.

Typhimurium 14028 invasion (P < 0.05), but had no effect on Salm. Typhimurium

14028 growth or adhesion to T84 cells. Differently from S. boulardii, S. cerevisiae

UFMG 905 was not implicated in the diminution of the activation of Rac1 and Cdc42 in

Salm. Typhimurium 14028-infected cells, which are Rho-GTPases activated by the

bacteria involved in the internalization of invasive bacteria. The binding of Salm.

xxxv

Typhimurium 14028 to S. cerevisiae UFMG 905 and S. boulardii surface instead of T84

cells may be responsible for the diminution of invasion and activation of MAPKs

(mitogen-activated protein kinases) and consequently by the diminution of IL-8 levels,

since this process diminishes the number of bacteria bound to T84 cells. However, the

diminution of IL-8 may also be explained by an immunomodulation through secretion

of anti-inflammatory cytokines, such as IL-10, but this hypothesis was not tested in this

work. The presence of the yeasts in Salm. Typhimurium 14028-infected cells also

reduced and/or inhibited the phosphorylation of ERK1/2, p38 and JNK MAPKs, but did

not inhibit NF-κB DNA binding activity, suggesting that the diminution of IL-8 levels

was not due to inhibition of the IL-8 transcription factor but more probably to the

effects of the yeasts on the p38 MAPK inhibition, which is responsible for the

stabilization of IL-8 mRNA. The inhibition of JNK by the yeasts may be another

explanation, once AP-1, another IL-8 transcription factor, is dependent on the

phosphorylation of this protein. Finally, S. cerevisiae UFMG 905 and S. boulardii

inhibited the activation of anti-inflammatory mechanism (PI3K/Akt pathway) induced

by Salm. Typhimurium 14028 in T84 cells. Concluding, S. cerevisiae UFMG 905 and S.

boulardii showed a protective and modulating effect on barrier function and signal

transduction pathway in T84 cells when infected by Salm. Typhimurium 14028.

I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

I.1 Epitélio intestinal

A superfície mucosa do trato gastrintestinal é a maior superfície corporal em

contato com o meio externo (200 a 300 m

). Ela representa um ecossitema complexo

que combina epitélio gastrintestinal, células imunes e microbiota residente

(MCCRACKEN & LORENZ, 2001). A mucosa do trato intestinal está constantemente

exposta a vários microrganismos patogênicos, e uma barreira física e química contra

esses patógenos é criada pelo epitélio intestinal (LIEVIN-LE MOAL & SERVIN,

2006). A superfície do intestino é delineada por um epitélio simples colunar que forma

diversas invaginações, ou criptas, que são embebidas no tecido conectivo. As células

epiteliais intestinais formam uma barreira física que protege o hospedeiro contra uma

infecção patogênica (LOUVARD et al., 1992; KEDINGER et al., 1998;

MONTGOMERY et al., 1999). O epitélio intestinal representa um modelo de

renovação tissular, uma vez que as células intestinais são constantemente geradas de

células tronco multipotentes localizadas nas criptas de Lieberkühn, o que gera novas

células precursoras permitindo uma alta taxa de renovação (“turnover”) celular. Nas

vilosidades intestinais, as células epiteliais polarizadas que formam o epitélio separam

dois diferentes compartimentos. Essa barreira epitelial é formada por quatro linhagens

de células epiteliais diferentes, incluindo (i) os enterócitos, que expressam na parte

apical uma densa e ordenada borda em escova, que consiste de microvilosidades

organizadas na membrana; (ii) as células enteroendócrinas, contendo pequenos grânulos

com diversos peptídeos hormonais; (iii) as células caliciformes, responsáveis pela

produção de muco; e (iv) as células de Paneth, com grânulos apicais contendo peptídeos

e proteínas antimicrobianos. Somado a isso, ainda existem as células M (“microfold”) -

que são células epiteliais especializadas, localizadas no epitélio folicular associado, que

estão sobre o tecido linfóide - presentes no epitélio associado ao folículo (LIEVIN-LE

MOAL & SERVIN, 2006).

Em camundongos, o desenvolvimento do epitélio gastrintestinal começa a partir

da primeira semana de gestação e se estende até o dia 21 pós-natal. Entretanto, em seres

humanos, o desenvolvimento ocorre, principalmente, durante o primeiro trimestre de

gestação, mas segue um programa de desenvolvimento similar àquele observado em

roedores (MONTGOMERY et al., 1999). A morfogênese e a diferenciação do intestino

requerem um “cross-talk” entre o epitélio e as células mesenquimais. Inicialmente, uma

onda de diferenciação proximal-distal muda o epitélio pseudoestratificado para uma

camada colunar simples de células epiteliais indiferenciadas. Logo após, a diferenciação

celular ocorre como células epiteliais originadas de células tronco multipotentes na base

das criptas de Lieberkühn, que são os locais de proliferação de células epiteliais. Após

essa etapa, as células primas começam a se diferenciar em quatro tipos celulares

(CHENG & LEBLOND, 1974; FALK et al., 1998). As células de Paneth migram para a

base da cripta do intestino delgado, enquanto os outros tipos celulares migram da cripta

para as vilosidades do intestino delgado. As células colunares, também conhecidas

como enterócitos, no intestino delgado, ou colonócitos, no intestino grosso,

compreendem mais de 80% de todos os tipos celulares. As células caliciformes estão

presentes em todo o intestino, mas aumentam em densidade da porção proximal para a

distal. As células enteroendócrinas, com o sistema nervoso sistêmico, estão dispersas

em todo o intestino (FURNESS et al., 1999). As células epiteliais intestinais possuem

um ciclo de vida de, aproximadamente, 2-5 dias e, durante a morte, são exfoliadas, junto

com as bactérias aderentes, o que auxilia na eliminação de patógenos. As células de

Paneth possuem uma vida maior, sobrevivendo por mais de 20 dias, ao final dos quais

são fagocitadas.

A integridade da camada de células epiteliais é mantida por complexas junções

intercelulares compostas por junções serreadas, junções aderentes e desmossomas. As

junções serreadas, componentes mais apicais do complexo juncional, criam uma

barreira semipermeável entre células individuais, que podem ser reguladas e servem

como barreira de permeabilidade (ANDERSON et al., 1993; SCHNEEBERGER &

LYNCH, 2004). Quarenta diferentes proteínas estão envolvidas nas junções serreadas,

tais como: ZO (zonula occludens)-1, ZO-2, ZO-3, membros da família de proteínas

guanilato quinases associadas à membrana, ocludina, claudinas, cingulina, 7H6 e várias

fosfoproteínas ainda não identificadas (CITI & CORDENONSI, 1998; MITIC &

ANDERSON 1998). Vários patógenos exploram as junções serreadas para modular a

permeabilidade intestinal e facilitar a própria entrada no tecido (HOFMAN, 2003;

FASANO & NATARO, 2004). Outros patógenos utilizam as células M, que circulam o

sistema linfóide associado à mucosa (KRAEHENBUHL & NEUTRA, 2000; NEUTRA

et al., 2001), como rota de entrada e, após atravessar essas células, encontram as células

fagocíticas, em especial os macrófagos, que estão presentes no folículo (JEPSON &

CLARK, 1998; SANSONETTI & PHALIPON, 1999; CLARK & JEPSON, 2003).

As células epiteliais do intestino protegem o hospedeiro fornecendo uma forte

barreira física e, também, pela produção de uma variedade de substâncias

antimicrobianas. Essa barreira física é, inicialmente, estabelecida, em seres humanos,

dentro de 48 horas após o nascimento, pelo fechamento de membranas, o que limita a

exposição sistêmica a antígenos (BINES & WALKER, 1991). As células epiteliais

secretam diversas substâncias como muco, defensinas e substâncias antimicrobianas,

que inibem o crescimento bacteriano e protegem o epitélio, prevenindo a adesão

microbiana e mantendo as substâncias antimicrobianas e os anticorpos secretados na

superfície epitelial (MAGNUSSON & STJERNSTROM, 1982; OUELLETTE, 1999).

Somado a isso, as células epiteliais secretam diversas citocinas e quimiocinas, incluindo

IL (interleucina)-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, MCP-1 (“monocyte chemoattractant

protein 1”), GM-CSF (“granulocyte-macrophage colony-stimulating factor”), TNF-α

(“tumor necrosis factor α”) e TGF-β (“transforming growth factor β”) (MCCRACKEN

& GASKINS, 1999).

O sistema de defesa do hospedeiro contra patógenos entéricos inclui imunidade

adaptativa e imunidade inata. A resposta imune adaptativa é observada 4 a 7 dias após a

infecção, e esse mecanismo envolve a geração de memória imunológica e a expansão de

receptores com especificidade relevante. Em contraste, o sistema imune inato é

mobilizado nos primeiros dias para controlar a infecção (MEDZHITOV, 2001). O

epitélio intestinal fornece uma superfície onde o hospedeiro pode “sentir” o ambiente

microbiano e ativar uma resposta potente pela liberação de moléculas sinalizadoras,

como as citocinas e as quimiocinas, e essas recrutam leucócitos e iniciam a atração de

células imunes. Entretanto, o epitélio intestinal, ao contrário do epitélio pulmonar, tolera

a colonização bacteriana e, embora exposto a bactérias comensais, a mucosa intestinal

exibe apenas uma inflamação mínima em resposta aos componentes da microbiota

normal, incluindo bactérias Gram-positivo e Gram-negativo. Esses produtos incluem

componentes celulares, como o lipopolissacáride (LPS) de bactérias Gram-negativo e

lipoproteínas e peptideoglicanos de bactérias Gram-positivo. O intestino do hospedeiro

distingue a microbiota normal dos microrganismos enterovirulentos, utilizando sistemas

altamente sofisticados de detecção de antígenos (DIDIERLAURENT et al., 2002;

ATHMAN & PHILPOTT, 2004; ALDRIDGE et al., 2005). As bactérias indígenas da

microbiota compartilham moléculas “self” (ou próprias), conhecidas como motivos

moleculares associados a micróbios. Em contraste, após uma infecção, a resposta imune

inata da mucosa do hospedeiro é ativada como um resultado do reconhecimento

específico por receptores de reconhecimento padrão de estruturas moleculares “non-

self” encontradas em vários grupos de patógenos, conhecidas como motivos

moleculares associados a patógenos, PAMP (“pathogen-associated molecular pattern”)

(JANEWAY & MEDZHITOV, 2002). Por exemplo, as células epiteliais “sentem” o

ambiente dentro do intestino, via receptores de reconhecimento, que incluem os

receptores Toll-like (TLRs) e as proteínas NOD (“nucleotide-binding oligomerization

domain”) (JANSSENS & BEYAERT, 2003; NETEA et al., 2004; PHILPOTT &

GIRARDIN, 2004; ECKMANN, 2005; KAWAI & AKIRA, 2005).

Em síntese, o epitélio intestinal não é apenas uma barreira física que previne os

patógenos de ganharem acesso aos órgãos, ele também fornece uma superfície coberta

de células especializadas na produção de muco, de peptídeos antimicrobianos e

moléculas, como a lisozima que, juntos com a microbiota residente e o sistema imune,

fornecem uma linha de defesa contra microrganismos patogênicos (LIEVIN-LE MOAL

& SERVIN, 2006).

I.2 Microbiota gastrintestinal

O termo microbiota tem sido usado para descrever a coleção de bactérias

abrigadas nas mucosas de um indivíduo (SAVAGE, 1977). O trato gastrintestinal dos

mamíferos abriga uma comunidade microbiana que é extremamente densa e diversa,

composta por 10

unidades formadoras de colônias (UFCs), número dez vezes maior

que o de células do hospedeiro (SAVAGE, 1977; BERG, 1996). Estima-se que o

número de espécies bacterianas do trato gastrintestinal gire em torno de 400, embora

estudos mais recentes indiquem que esse número varie entre 500-1000 espécies

(SONNENBURG et al., 2004; SUZUKI et al., 2007). Entretanto, estudos sugerem que

somente 30 a 40 destas espécies chegam a atingir níveis dominantes, necessários para

exercer funções no ecossistema do hospedeiro que as alojam (MOORE &

HOLDEMAN, 1974; VAUGHAN et al., 2000). Toda esta comunidade microbiana pode

se localizar no lúmen, nas criptas de Lieberkühn, na superfície do epitélio intestinal e

em qualquer parte do trato digestivo (SAVAGE, 1987). O estabelecimento e a

manutenção dessa microbiota constituem um processo complexo, que pode ser

influenciado por vários fatores, como dieta, idade, utilização de antibióticos, utilização

de probióticos e prebióticos, ambiente, microbiota materna, via do parto, interações

microbianas, interações microrganismo-hospedeiro, presença de certos genes (ou

produtos gênicos ou expressão de certos genes) e receptores (MACKIE et al., 1999;

SAVAGE, 1999; BOURLIOUX et al., 2003), além de sua sucessão ecológica, demanda

nutricional e tolerância oral (VAN DER WAAIJ, 1989).

A maioria dos microrganismos do trato digestivo é anaeróbia, como é o caso das

bifidobactérias, ou microaerófila, e estes podem interagir antagonisticamente ou

sinergisticamente (MOORE & HOLDEMAN, 1974; FULLER, 1992). Como

conseqüência, os gêneros envolvidos na sucessão ecológica darão origem a uma

comunidade clímax, que pode ser observada em adultos, nos quais as condições

ambientais e nutricionais não influenciam, de maneira significativa, a população dos

microrganismos dominantes. São encontradas diferenças na composição dessa

comunidade microbiana entre as diferentes espécies de mamíferos - por exemplo, entre

ruminantes e não ruminantes e entre carnívoros e onívoros (SMITH & CRABB, 1961).

Essa microbiota gastrintestinal varia qualitativamente, quantitativamente e

metabolicamente, dependendo do local colonizado, da espécie e da idade do hospedeiro,

além da localização longitudinal e transversal do trato gastrintestinal (NICOLI, 1995).

Os mamíferos nascem completamente estéreis. A colonização das superfícies

corporais expostas, incluindo a pele, o trato respiratório, o sistema genito-urinário e o

tubo digestivo, começa logo após o nascimento. Inicialmente, quando o espaço e a

disponibilidade de nutrientes são abundantes, as bactérias com altas taxas de

multiplicação começam a dominar. A partir do momento em que o número bacteriano

aumenta, esses dois fatores - disponibilidade de nutrientes e espaço - ficam escassos, os

“habitats” ficam ocupados por microrganismos mais especializados e a complexidade da

biota aumenta (FALK et al., 1998). As primeiras bactérias a colonizarem o trato

gastrintestinal são derivadas da microbiota presente no canal do parto. Em recém-

nascidos predominam Escherichia coli, Clostridium spp., Streptococcus spp.,

Lactobacillus spp., Bacteroides spp. e Bifidobacterium spp. (ROTIMI & DUERDEN,

1981). As bifidobactérias formam o grupo mais numeroso enquanto os recém-nascidos

são alimentados no peito (BULLEN et al., 1976). A composição da microbiota fecal de

crianças de diferentes áreas geográficas apresenta diferenças (ADLERBERTH et al.,

1991), que refletem, em parte, o impacto das condições ambientais, por exemplo, das

condições sanitárias. A via do parto (NEUT et al., 1987), o tipo de alimentação

(ÖRSKOV & BIERING-SÖRENSEN, 1975; STARK & LEE, 1982; BALMER &

WHARTON, 1989), hospitalização (LEFROCK et al., 1979) e uso de antibióticos

(BENNET et al., 1986) são outros fatores conhecidos que afetam a composição da

microbiota gastrintestinal de crianças.

Comparações entre linhagens congênitas de ratos criados sob condições

convencionais (com uma microbiota residente), sob condições isentas de germes e sob

condições inicialmente isentas de germes e depois colonizados com certos componentes

da microbiota (“ex-germ-free”) mostraram que as bactérias são responsáveis por um

grande número de funções bioquímicas (MIDTVEDT, 1986; MIDTVEDT et al., 1987).

Essas incluem a desconjugação e desidroxilação de ácidos biliares por E. coli, Bacillus

cereus, Enterococcus faecalis, Bacteroides spp., Eubacterium spp e Clostridium spp.

(MIDTVEDT, 1974), a conversão de bilirrubina a urobilinogênio por Clostridium

ramosum (MIDTVEDT & GUSTAFSSON, 1981) e o metabolismo de colesterol a

coprostanol por linhagens pertencentes ao gênero Eubacterium (SADZIKOWSKI et al.,

1977). Menadiona (vitamina K) é produzida por uma grande variedade de bactérias

intestinais, incluindo espécies de Bacteroides, Eubacterium, Propionibacterium,

Fusobacterium, Bifidobacterium, Lactobacillus, Clostridium, Enterobacterium,

Veillonella, Enterococcus, Enterobacter e Streptococcus (GUSTAFSSON, 1959; HILL,

1997). Além da produção de vitamina K, a microbiota intestinal está envolvida na

produção de ácido pantotênico, biotina, piridoxina e outras vitaminas que não são

absorvidas no cólon, como as vitaminas B

, niacina, riboflavina e tiamina (ROLFE,

1984; NAIDU et al., 1999; SILVERMAN et al., 1999). A geração de ácidos graxos de

cadeia curta é, também, uma característica comum da população clímax, embora as

espécies responsáveis por isso ainda permaneçam indefinidas (HØVERSTAD, 1989).

Além das funções bioquímicas e digestivas no seu hospedeiro, a microbiota

indígena desempenha outros papéis extremamente importantes. A resistência à

colonização é a primeira linha de defesa contra a invasão por patógenos alóctones e por

autóctones oportunistas, pela produção de bacteriocinas, peróxido de hidrogênio e

ácidos orgânicos, competição por nutrientes e por sítios de adesão. A presença da

microbiota também estimula o peristaltismo, o sistema imune e a maturação e

renovação das células epiteliais do cólon (MCFARLAND, 2000b).

Estudos moleculares utilizando B. thetaiotaomicron - um comensal componente

da microbiota normal de seres humanos e de camundongos - em camundongos isentos

de germes, mostrou que esta bactéria modula a expressão de genes envolvidos em

importantes funções intestinais, incluindo a absorção de nutrientes, efeito barreira,

metabolismo de xenobióticos, angiogênese e maturação intestinal pós-natal (HOOPER

et al., 2001).

A comunidade clímax de micróbios nunca é estática. Estudos de enumeração

microbiológica e DNA “fingerprinting” têm revelado diferenças marcantes no número e

tipo de subpopulações de Lactobacillus e Bifidobacterium entre e dentre indivíduos

adultos (MCCARTNEY et al., 1996). Um “habitat” no trato gastrintestinal será, em um

dado momento, colonizado por espécies nativas (residentes ou autóctones) e um

conjunto variável de espécies transientes (alóctones) que irão ocupar, apenas

temporariamente, um espaço vago (SAVAGE, 1977). Bactérias alóctones podem

representar linhagens cujo “habitat” está localizado em uma região mais proximal do

trato gastrintestinal ou microrganismos que foram ingeridos. É difícil definir a

composição da microbiota normal em uma dada região do trato gastrintestinal, mesmo

dentro de um indivíduo; não só por causa do problema para se distingüir residente de

transiente, mas, também, devido à dificuldade de cultivo de muitos componentes ex

vivo. A microbiota dominante raramente apresentará grandes diferenças entre os

indivíduos adultos; entretanto, a microbiota sub-dominante e, principalmente, a residual,

podem sofrer alterações devido à idade, à distribuição geográfica, à dieta, ao estresse, às

mudanças hormonais, ao comportamento sexual e ao uso de antibióticos (SALMINEN

et al., 1995; MARSHALL, 1999; MCFARLAND, 2000b). De todos esses fatores, os

antibióticos são os responsáveis pelas mudanças mais rápidas e drásticas na microbiota

normal (NICOLI, 1995).

I.3 Probióticos

A microbiota normal possui microrganismos com efeitos benéficos

(Bifidobacterium, Eubacterium e Lactobacillus) e microrganismos com efeitos

deletérios (Clostridium e Veillonella) para o hospedeiro (ROBERFROID, 2001). Nos

últimos anos, vem aumentando o interesse no uso de microrganismos que exercem os

efeitos benéficos com o propósito de beneficiar a saúde do hospedeiro e de prevenir ou

tratar doenças. Esses organismos recebem o nome genérico de probióticos e vêm sendo

propostos como medicamentos para prevenção e tratamento de um grande número de

desordens gastrintestinais.

Relatos dos efeitos benéficos das bactérias na alimentação datam desde a versão

Persa do Velho Testamento (Gênesis 18:8), que relata que “Abraão atribuiu sua

longevidade ao consumo de leite azedo”. Plínio, um historiador romano, em 76 a.C.,

recomendou o uso de leite fermentado para o tratamento de gastroenterites

(TEITELBAUM & WALKER, 2002). O termo probiótico foi criado como um antônimo

ao termo antibiótico e, originalmente, foi proposto por LILLEY & STILLWELL

(1965), significando aquele que favorece o crescimento de microrganismos. Mais de 20

anos depois, FULLER (1989) definiu probiótico como “um suplemento microbiano

vivo que afeta beneficamente o animal hospedeiro graças à melhoria no balanço

microbiano intestinal”, embora, hoje, os probióticos já tenham, também, aplicações em

outros ecossistemas (BENGMARK, 1998; REID, 2000). Esta definição pode ser

estendida ao hospedeiro humano como “microrganismos não-patogênicos que, quando

ingeridos, exercem uma influência positiva na saúde ou fisiologia do hospedeiro”

(MARTEAU et al., 2001) ou, como “uma preparação ou produto contendo

microrganismos viáveis, em número suficiente, para alterar a microbiota em um

compartimento do hospedeiro ou para exercer efeitos benéficos no hospedeiro”

(SCHREZENMEIR & DE VRESE, 2001). Esta definição enfatiza que outros

compartimentos do corpo podem ser alvos dos probióticos, além do intestino, onde uma

alteração da microbiota pode exercer um efeito benéfico. Existem alguns trabalhos

mostrando a eficácia dos probióticos nas infecções do trato urogenital (HALLEN et al.,

1992; HILTON et al., 1992; REID & BRUCE, 1995; PARENT et al., 1996;

ASAHARA et al., 2001; REID, 2001; REID et al., 2001), nas infecções causadas pelo

Helicobacter pylori (KABIR et al., 1997), infecções na boca e dentes (BAYONA

GONZALES et al., 1990; BUSSCHER et al., 1999), infecções do trato respiratório

(CANGEMI DE GUTIERREZ et al., 2000; GRANGETTE et al., 2001) e outras

(BAUTISTA-GARFIAS et al., 1999). Atualmente, a definição mais aceita para

probióticos é aquela estipulada pela FAO/WHO (“Food and Agricultural Organization /

World Health Organization”), que diz que probiótico é “um microrganismo vivo que,

quando ingerido em quantidades suficientes, confere um benefício à saúde do

hospedeiro” (FAO/WHO, 2002).

Apesar de a definição de probióticos focar a importância de sua viabilidade,

alguns trabalhos sugerem que microrganismos probióticos não-viáveis podem exercer

algum efeito benéfico (OUWEHAND & SALMINEN, 1998). KAILA et al. (1995),

utilizando microrganismos não-viáveis, observaram uma diminuição na duração de

diarréia por rotavirus e, VESA et al. (2000) observaram uma melhor tolerância à

lactose.

Metchnikoff (1845-1916) foi o primeiro microbiologista a sugerir que o uso de

bactérias poderia influenciar positivamente a microbiota do trato intestinal e prolongar a

vida (METCHNIKOFF, 1907). Ele observou que a população da Bulgária tinha uma

média de vida superior à do restante da Europa e correlacionou esta observação com a

grande ingestão de coalhada pelos búlgaros. A partir deste dado, ele supôs que os

lactobacilos eram importantes para a saúde humana e passou a defender o uso de

iogurtes e alimentos fermentados.

O conceito de probiótico implica que o microrganismo empregado esteja viável,

ou tenha condições de ser reativado, para que possa exercer seu efeito benéfico. Esta

exigência reduz o número de microrganismos que podem atuar como medicamento, já

que o intestino humano apresenta uma microbiota extremamente competitiva, que

funciona como uma barreira física e química, conhecida como “barreira intestinal”,

possuindo mecanismos poderosos de combate a microrganismos não autóctones

(SAAVEDRA, 1995; CHANDAN, 1999). Embora não sejam mencionados números

específicos na definição de probióticos, considera-se que, pelo menos, 10

unidades

formadoras de colônias (UFCs)/dia de microrganismos devam ser ingeridos para chegar

ao intestino em níveis iguais aos da microbiota dominante (OUWEHAND et al. 2002).

Os probióticos têm sido referidos, também, como agentes bioterapêuticos e

alimentos funcionais (“functional foods”); porém, alguns autores preferem se referir a

eles com termos distintos, definindo probióticos como “um suplemento microbiano

vivo, que afeta beneficamente o animal hospedeiro graças à melhoria no balanço

microbiano intestinal”, e alimentos funcionais como “agentes (vivos ou não) que

possuem outras funções além de seu papel nutricional”, e reservam o termo “agentes

bioterapêuticos” para “microrganismos vivos que possuem eficácia comprovada na

prevenção ou tratamento de alguma doença pela interação com a microecologia natural

do hospedeiro”. Neste último caso, vários autores consideram a levedura

Saccharomyces boulardii e a bactéria Lactobacillus rhamnosus GG como os principais

agentes bioterapêuticos atualmente estudados e comercializados, conforme revisado por

ELMER et al. (1996), MCFARLAND (2000a) e ELMER & MCFARLAND (2001).

Além dos probióticos, também são estudados os prebióticos e os simbióticos. Os

prebióticos são ingredientes alimentares não-digeríveis, que promovem a saúde do

hospedeiro ao estimular a multiplicação ou a ação de uma espécie bacteriana - ou um

grupo delas - benéfica no trato digestivo. A lactulose, os frutooligossacarídeos (FOS) e

a inulina são os prebióticos mais estudados e comercializados (ROBERFROID, 2001).

O primeiro aumenta a atividade lactofermentativa de populações de Lactobacillus, e os

FOS estimulam o crescimento de Bifidobacterium. É interessante salientar que o

desenvolvimento dos prebióticos veio da descoberta dos fatores “bifidus”, grupo de

oligossacarídeos presentes em maior quantidade no leite humano e que favorecem a

multiplicação de Bifidobacterium de recém-nascidos amamentados no seio. Alimentos

como alcachofra, cebola, banana, aspargo e chicória contêm, naturalmente,

componentes com propriedades prebióticas. Já os simbióticos são combinações de

probióticos e prebióticos (NICOLI & VIEIRA, 2000).

Entre os probióticos mais estudados, tanto experimentalmente quanto

clinicamente, estão as bactérias e as leveduras. Alguns já são comercializados sob a

forma de suplemento alimentar ou preparações farmacêuticas, contendo um ou vários

microrganismos. Entre os principais probióticos estão as bactérias do ácido láctico

(BAL), que incluem os lactobacilos (Lactobacillus lactis, L. acidophilus, L. plantarum,

L. brevis, L. fermentum, L. casei, L. bulgaricus, L. rhamnosus, L paracasei, L. jensenii,

L reuteri, L. johnsonii, L. helveticus, L. gasseri), Enterococcus faecium SF68 e E.

faecalis, Streptococcus salivarius e S. thermophilus, Pediococcus acidilactici e espécies

de Leuconostoc e Lactococcus. Além das BAL, temos também as bifidobactérias

(Bifidobacterium bifidum, B. longum, B. breve, B. infantis, B. animalis, B. adolescentis),

Escherichia coli EMO e E. coli Nissle, Bacillus subtilis e B. toyoi, e as leveduras S.

boulardii e S. cerevisiae. Esta última, geralmente, é utilizada apenas na medicina

veterinária.

I.3.1 Efeitos benéficos dos probióticos

Entre os possíveis efeitos benéficos dos probióticos estão a modulação da

resposta imune (SCHIFFRIN et al., 1997; NEUMANN et al., 1998; TEJADA-SIMON

et al., 1999; ISOLAURI et al., 2001; HE et al., 2002), o balanço da microbiota normal

(PERDIGON et al., 1998), a redução de enzimas fecais responsáveis pelo início do

desenvolvimento de alguns tipos de cânceres (HIRAYAMA & RAFTER, 2000),

prevenção de doenças atópicas (ISOLAURI et al., 2000; KALLIOMAKI et al., 2001;

KALLIOMAKI et al., 2003; KIRJAVAINEN et al., 2003; ARVOLA et al., 2004) e

alérgicas (HOPPU et al., 2001; ISOLAURI, 2001; KIRJAVAINEN et al., 2001;

LAIHO et al., 2002; RAUTAVA & ISOLAURI, 2002; KALLIOMAKI & ISOLAURI,

2003), tratamento da diarréia do viajante (SCARPIGNATO & RAMPAL, 1995),

tratamento da diarréia associada ao uso de antibióticos (BARTLETT, 1992) e da

diarréia infecciosa (KAILA et al., 1992; FIGUEIREDO et al., 2001), o controle da

infecção por rotavírus e Clostridium difficile (MCFARLAND et al., 1994), proteção

contra a ação de patógenos (SILVA et al., 1999), o papel de coadjuvante no tratamento

com antibióticos no combate às úlceras causadas pelo H. pylori (AIBA et al., 1998), a

redução do colesterol do soro (EYSSEN, 1973; LIN et al., 1989; FUKUSHIMA &

NAKANO, 1996; BEENA & PRASAD, 1997), o antagonismo in vitro e in vivo contra

enteropatógenos (NICOLI & RAIBAUD, 1990; VANDENBERG, 1993; LIMA FILHO

et al., 2000; SILVA et al., 2001), alívio da constipação intestinal (GOLDIN, 1998) e o

auxílio na absorção da lactose em pessoas com intolerância a este açúcar (SANDERS et

al., 1996; VESA et al., 2000). Devemos observar que estes efeitos, além dos possíveis

mecanismos de ação, são os mesmos propostos para os componentes da microbiota

intestinal.

Para que um microrganismo utilizado como probiótico exerça o seu efeito

benéfico desejado, além de permanecer viável durante sua passagem pelo sistema

gastrintestinal, o seu nível populacional deve ser igual ou maior que 10 milhões de

células por grama de conteúdo fecal (NICOLI & VIEIRA, 2000). Para isso, ele deve ser

ingerido diariamente, para manter seus níveis artificialmente elevados no ecossistema

digestivo. À exceção dos L. rhamnosus GG e Lcr35, não se conhecem probióticos

capazes de persistir por um longo período no trato digestivo do adulto (ALANDER et

al., 1999; DE CHAMPS et al., 2003).

I.3.2 Probióticos na dieta animal

Existem vários trabalhos mostrando os benefícios do uso de probióticos na dieta

animal. FERREIRA & KUSSAKAWA (1999) relataram que a administração do

probiótico B. subtilis em granjas de frangos de corte acarretava um aumento da

musculatura e uma diminuição da quantidade de gordura, além de uma diminuição na

porcentagem de isolamento da Salmonella de 60 para 20%. Ainda com este probiótico,

observou-se um aumento na atividade das enzimas tripsina, amilase e lipase nos

frangos. Foi obtida uma diminuição no número de coliformes fecais, em frangos de

corte, utilizando o probiótico Bacillus natto (FERREIRA & KUSSAKAWA, 1999).

NADER DE MACIAS et al. (1993) observaram que Lactobacillus spp. competia com

microrganismos indesejáveis do intestino, aumentando, desde modo, a saúde do animal.

MAIA et al. (2001) observaram o efeito protetor da bactéria E. faecium, um

componente de um produto comercial (Vitacanis) composto por L. acidophilus, E.

faecium e S. cerevisiae, durante desafio experimental com o enteropatógeno Salmonella

enterica subsp. enterica sorovar. Typhimurium.

Na dieta de ruminantes usa-se muito a levedura S. cerevisiae. Ela estimula a

atividade dos microrganismos benéficos do trato gastrintestinal, aumentando, deste

modo, a digestibilidade de nutrientes e o potencial de produção dos animais

(NEWBOLD et al., 1995; SINGH et al., 1995; WOHLT et al., 1998).

I.3.3 Probióticos na dieta humana

O uso de probióticos na dieta humana vem sendo amplamente difundido, tanto

como suplemento alimentar (leite, leites acidófilos, iogurtes, coalhadas, etc), como na

forma de medicamento, como é o caso da levedura S. boulardii, do Lactobacillus GG e,

mais recentemente, o L. casei Shirota. O uso de probiótico como suplemento alimentar

é devido, principalmente, à capacidade de várias bactérias diminuírem o colesterol

circulante no soro, principalmente as bactérias do ácido láctico. Essas bactérias

probióticas promovem um aumento notável no HDL (lipoproteínas de alta densidade) e

diminuem a quantidade de LDL (lipoproteínas de baixa densidade) (BEENA &

PRASAD, 1997). Um outro modo pelo qual estas bactérias conseguem diminuir o

colesterol é acelerando a conversão desta substância em ácidos biliares, o que diminui a

concentração de colesterol no soro (EYSSEN, 1973; FUKUSHIMA & NAKANO,

1996).

Várias bactérias podem auxiliar na prevenção do câncer de cólon (LIDBECK et

al., 1992; LING et al., 1992; LING et al., 1994; WOLLOWSKI et al., 1999), na

absorção da lactose em pessoas que não conseguem digerir este açúcar (SANDERS et

al., 1996), na produção de certas vitaminas, principalmente a vitamina K e vitaminas do

complexo B, no aumento populacional de certas bactérias desejáveis (BENNO et al.,

1996; MATTILA-SANDHOLM et al., 1999), além de outros benefícios adquiridos com

a ingestão destas bactérias (HANSON & YOLKEN, 1999). Adiciona-se a todos estes

benefícios citados, o sabor agradável dos alimentos preparados a partir da fermentação

realizada por estas bactérias, como os iogurtes e os leites fermentados.

Quanto ao efeito medicamentoso exercido por estes microrganismos, cita-se,

principalmente, o uso na recomposição da microbiota após tratamentos com antibióticos

de amplo espectro, durante o curso de vários tipos de diarréias e outros usos (conforme

citado no item I.3.1), por vários mecanismos de ação (item I.3.4).

I.3.4 Mecanismos de ação dos probióticos

Existem vários mecanismos propostos para explicar os efeitos benéficos dos

probióticos:

Produção de substâncias inibidoras de outros microrganismos. Os

microrganismos produzem substâncias que inibem o crescimento de vários patógenos

(SILVA et al., 1987; VANDENBERG, 1993). Essas substâncias incluem os ácidos

orgânicos, peróxido de hidrogênio, bacteriocinas, dentre outras. Estes compostos, além

de reduzirem o número de células bacterianas viáveis, afetam o metabolismo bacteriano

ou a produção de toxinas (ROLFE, 2000). PONGPECH & HENTGES (1989)

constataram que as bactérias do ácido lático são capazes de produzir ácidos graxos

voláteis, que são responsáveis pelo controle da colonização do intestino pela Shigella

sonnei e E. coli enteropatogênica.

Competição por sítios de adesão e por nutrientes. Vários microrganismos

usados como probióticos competem por sítios de adesão na superfície do epitélio

intestinal e, por nutrientes, inibindo, deste modo, a fixação e a sobrevivência de

patógenos (BERNET et al., 1994; COCONNIER et al., 1998). Um exemplo disso é o

patógeno intestinal Vibrio cholerae, que precisa aderir à parede intestinal para colonizá-

la e produzir a doença. Conseqüentemente, alguns probióticos são escolhidos devido à

capacidade de adesão ao epitélio e competição pelos receptores, conforme demonstrado

por TANNOCK (1986). Em 1988, WILSON & PERINI observaram, in vitro, que os

microrganismos do intestino competem mais efetivamente pela glicose, pela N-acetil-

glicosamina e pelo ácido silíaco, que o patógeno C. difficile.

Inibição da produção ou ação de toxinas. A levedura S. boulardii pode

proteger os animais contra a ação do C. difficile pela liberação de uma protease que

cliva as toxinas A e B, inibindo, deste modo, os efeitos na mucosa do cólon

(CASTAGLIUOLO et al., 1999). Um outro mecanismo proposto é a ligação da toxina

do cólera em sítios específicos desta levedura (BRANDÃO et al., 1998).

Modulação do sistema imune. Evidências sugerem que a modulação da

resposta imune específica e não-específica pode ser um outro mecanismo pelo qual os

probióticos protegem o hospedeiro contra as desordens gastrintestinais (KAILA et al.,

1992; PERDIGON et al., 1995; MATSUZAKI & CHIN, 2000). Um exemplo é a

administração de Lactobacillus GG durante a diarréia aguda, causada por rotavírus, que

está associada ao aumento da resposta imune ao rotavírus (KAILA et al., 1995).

I.3.5 A levedura Saccharomyces boulardii

Em meados de 1920, na Indochina, um microbiologista francês, Henri Boulard,

estava à procura de uma linhagem de levedura que fosse capaz de suportar altas

temperaturas, a fim de produzir um bom vinho. Durante esta época houve uma epidemia

de cólera em uma das vilas e o pesquisador foi informado que a população local

preparava um chá da casca de uma fruta local (lichia) para aliviar e até mesmo curar a

diarréia. Posteriormente, verificou-se que a fruta, na verdade, estava recoberta por uma

levedura, e a eficácia contra a diarréia se devia a esta levedura, que foi chamada de

Saccharomyces boulardii (FLORASTOR, 2003). Saccharomyces boulardii é uma

levedura não patogênica, termotolerante (cresce na temperatura de 37ºC) e de uso muito

difundido na medicina humana (MCFARLAND & BERNASCONI, 1993).

A partir de 1960 iniciou-se a comercialização da levedura liofilizada, pelo

“Laboratoires Biocodex” (Paris, França). Assim, seu uso como medicamento para

combate às diarréias foi difundido em toda Europa e está disponível no mercado sob

diversos nomes comerciais, tais como: Ultra-Levure (França), Florastor (Estados

Unidos), Precosa (Dinamarca), Levucell (Lallemand, Canadá), Perenterol

(Alemanha), Perenteryl (Chile), Codex (Itália), Floratil (Brasil). Atualmente, a

levedura é amplamente comercializada na Europa, Américas do Sul e do Norte, Ásia e

África (MCFARLAND & BERNASCONI, 1993) e recentemente seu uso foi liberado

pela FDA (Food and Drug Administration) nos Estados Unidos (FLORASTOR, 2007).

Os direitos de comercialização para a América do Sul foram adquiridos pelas Indústrias

Químicas da MERCK S.A. Além disso, outras preparações contendo S. boulardii estão

disponíveis no Brasil (MARTINS et al., 2005b).

Saccharomyces boulardii foi, inicialmente, identificada como uma espécie

distinta do gênero hemiascomiceto Saccharomyces (MCFARLAND, 1996).

Atualmente, a taxonomia do gênero Saccharomyces é baseada em métodos genotípicos.

Vários pesquisadores afirmam que a S. boulardii é uma linhagem de S. cerevisiae, uma

vez que os métodos convencionais não podem ser utilizados para separar linhagens de S.

cerevisiae. Devido ao seu valor terapêutico, à sua deficiência em utilizar galactose e

produzir ascósporos, MCFARLAND (1996) sugeriu que esta levedura deveria ser

considerada como uma espécie à parte. Uma série de estudos de reassociação de DNA

[(nDNA)–nDNA] sugerem a divisão do gênero Saccharomyces sensu stricto em quatro

espécies relacionadas: S. bayanus, S. cerevisiae, S. paradoxus e S. pastorianus

(CARDINALI & MARTINI, 1994). Cariotipagem eletroforética comparativa e análise

multivariada do polimorfismo observado em gel de eletroforese de campo pulsado

confirmam a existência de quatro “clusters”, cada um correspondente a um “taxon”, que

foram distinguidas com base na comparação do DNA, utilizando a técnica de

reassociação (nDNA)–nDNA, e corroboram a classificação de S. boulardii fora da

espécie S. cerevisiae e também fora das outras três espécies (CARDINALI &

MARTINI, 1994). Por outro lado, MALLIÉ et al. (2001) relataram que a tipagem por

isoenzimas e estudo de polimorfismo de restrição do DNA mitocondrial permite a

inclusão de S. boulardii no complexo sensu stricto. Saccharomyces boulardii está muito

relacionado com S. cerevisiae e, por este motivo, propôs-se a denominação de S.

cerevisiae var. boulardii. Um método utilizando polimorfismo de microsatélite,

identificou uma seqüência específica 9 (CAG) no lócus 4, presente apenas em S.

boulardii e, deste modo, conferindo uma possível identifidade à espécie S. boulardii,

que não a de uma linhagem da espécie S. cerevisiae (HENNEQUIN et al., 2001). VAN

DER AA KUHLE & JESPERSEN (2003), analisando seqüências do domínio D1/D2 da

região 26S do rDNA, a região ITS1-5.8S rDNA-ITS2 e o gene da subunidade 2 da

citocromo oxidase c mitocondrial, mostraram uma relação muito íntima entre S.

boulardii e S. cerevisiae e defenderam a identificação de S. boulardii como um membro

da espécie S. cerevisiae, e não como uma espécie separada. Além do mais, a utilização

de galactose não pode ser considerada como critério para classificar S. boulardii como

uma espécie diferente de S. cerevisiae uma vez que esta capacidade é muito variável

dentro da espécie (BARNETT et al., 2000), assim como a capacidade de produção de

ascósporos (NAUMOVA et al., 2003). MITTERDORFER et al. (2002), utilizando

quatro técnicas moleculares diferentes [PCR (“polymerase chain reaction”) espécie-

específico, RAPD-PCR (“randomly amplified polymorphic DNA-PCR”), análise do

rDNA por RFLP (“rectriction fragment lenght polymorphic”) e PFGE (“pulse-field gel

eletrophoresis”)] classificaram S. boulardii como uma espécie de S. cerevisiae.

Recentemente, EDWARDS-INGRAM et al. (2007), utilizando hibridização genômica

comparativa para análise do genoma inteiro, também concluíram que S. boulardii e S.

cerevisiae são membros da mesma espécie.

Entretanto, apesar da semelhança genética entre S. boulardii e S. cerevisiae, elas

apresentam algumas diferenças genéticas e fisiológicas. FIETTO et al. (2004)

observaram que S. boulardii é geneticamente muito semelhante a S. cerevisiae,

entretanto, metabolicamente e fisiologicamente diferente, particularmente no que se

refere ao crescimento e à resistência à temperatura de 37°C e estresse ácido, que são

importantes características de um microrganismo usado como probiótico. Alguns

autores sugerem que a superexpressão de genes relacionados à síntese de proteínas e

respostas a estresses poderiam contribuir para o aumento da taxa de crescimento e

melhor sobrevivência de S. boulardii ao pH ácido (EDWARDS-INGRAM et al. 2007).

I.3.5.1 Usos da levedura S. boulardii na medicina humana

Este probiótico é usado no combate a vários tipos de distúrbios gastrintestinais,

como diarréia associada ao uso de antibióticos (SURAWICZ et al., 1989a;

BARTLETT, 1992; MCFARLAND et al., 1995; SURAWICZ, 2003), no tratamento da

diarréia causada pelo C. difficile (ELMER & MCFARLAND, 2001; SURAWICZ,

2003), tanto nos casos de prevenção (SURAWICZ et al., 1989a; MCFARLAND et al.,

1994; CASTAGLIUOLO et al., 1999), quanto nos casos de recorrência da doença

(SURAWICZ et al., 1989b; KIMMEY et al., 1990; ELMER et al., 1999; SURAWICZ

et al., 2000), na prevenção e tratamento da diarréia do viajante (SCARPIGNATO &

RAMPAL, 1995) e da diarréia em pacientes infectados pelo HIV (SAINT-MARC et al.,

1991; BORN et al., 1993). O uso de S. boulardii tem sido sugerido na manutenção do

tratamento da doença de Crohn (GUSLANDI et al., 2000) e na prevenção de diarréia

em pacientes recebendo alimentação por sonda (BLEICHNER et al., 1997). Além

destes, existem ensaios clínicos mostrando o seu efeito na microbiota de prematuros

(COSTALOS et al., 2003) e na diminuição da diarréia em pacientes com amebíase

aguda (MANSOUR-GHANAEI et al., 2003). Apesar de todos estes trabalhos

mostrando os efeitos benéficos de S. boulardii, poucos trabalhos se referem a uma

relação entre a dose e o efeito de sua ingestão (PERET FILHO et al., 1998; GIRARD et

al., 2003).

Existem relatos clínicos demonstrando que a levedura apresenta eficácia sob

vários parâmetros clínicos analisados, tais como: incidência, tempo de duração,

freqüência, consistência e quantidade dos episódios diarréicos. A possibilidade de

translocação de S. boulardii no interior do intestino é, praticamente, inexistente, uma

vez que a levedura não coloniza o cólon (MCFARLAND & BERNASCONI, 1993).

A ingestão ocorre por via oral e, nestas condições, a levedura é insensível à ação

dos sucos digestivos e de antibacterianos (BLÉHAUT et al., 1989; BODDY et al.,

1991). A administração da levedura deve ser realizada de maneira repetida e regular,

pois ela não se implanta no tubo digestivo, embora seja capaz de atingir, rapidamente,

altas concentrações no cólon (FULLER, 1992). Dois a cinco dias após a descontinuação

do seu uso, ela não é mais encontrada nas fezes (BLÉHAUT et al., 1989). Em um

estudo realizado com voluntários humanos, após o tratamento com a levedura, não

foram observadas alterações nos níveis populacionais de anaeróbios estritos e

facultativos da microbiota normal (KLEIN et al., 1993).

I.3.5.2 Mecanismos de ação da levedura S. boulardii

Vários mecanismos de ação da levedura em infecções experimentais foram

extensivamente estudados. Ensaios em animais e seres humanos, assim como estudos in

vitro, mostraram que S. boulardii pode ter um papel protetor e atividades específicas

contra vários patógenos entéricos, conforme revisado por CZERUCKA & RAMPAL

(2002) e CZERUCKA et al. (2007).

I.3.5.2.1 Ações no nível celular

(i) Efeito na mucosa intestinal. A análise microscópica de mucosas duodenais e

jejunais de camundongos, ratos e seres humanos mostrou que, mesmo em doses

elevadas, S. boulardii não provocou alterações morfológicas e/ou morfométricas, tanto

no nível das vilosidades quanto nas criptas, assim como não foram observadas

alterações na lâmina própria (BUTS et al., 1986; CORTHIER et al., 1992; JAHN et al.,

1996). Entretanto, a levedura promove um aumento da atividade de diversas

dissacaridases na mucosa intestinal, tais como lactase, sacarase e maltase (BUTS et al.,

1986; JAHN et al., 1996) graças a um aumento de poliaminas, como a espermidina e a

espermina, que regulam a expressão gênica e a síntese protéica (BUTS et al., 1994).

Também já foi descrito o efeito da levedura na liberação de aminopeptidases na mucosa

e fluido endoluminal de camundongos (BUTS et al., 2002). Foi observada a liberação

de proteínas e fatores tróficos durante o trânsito intestinal, que aumentam as defesas

imunes, a digestão e a absorção de nutrientes. Existem, ainda, mais de 1500 proteínas

não estudadas, que poderiam ser liberadas pela levedura durante seu trânsito intestinal

(BUTS & DE KEYSER, 2006).

(ii) Resposta imunológica. Existem diversos trabalhos mostrando o efeito da

levedura no sistema imune (CAETANO et al., 1986; BUTS et al., 1990; RODRIGUES

et al., 2000). Estudos em ratos e camundongos permitiram demonstrar que a levedura

induz um aumento significativo nos níveis de IgA (Imunoglobulina do tipo A)

secretados (BUTS et al., 1990; QAMAR et al., 2001); entretanto, em um estudo com 12

voluntários humanos, recebendo a levedura durante 3 semanas, esse aumento de IgA

não foi observado (JAHN et al., 1996). Em camundongos desafiados com a toxina A de

C. difficile, a levedura provocou um aumento de 4 vezes nos níveis de IgA dirigidos

contra a toxina A (QAMAR et al., 2001), o que mostra que a levedura possui um efeito

modulador da resposta imune. Trabalhando com animais isentos de germes,

RODRIGUES et al. (2000) também observaram um aumento nos níveis de IgA.

I.3.5.2.2 Ações no nível bacteriano

(i) Um primeiro mecanismo de ação da levedura seria a inibição total ou parcial

de vários microrganismos patogênicos (BRUGIER & PATTE, 1975). Este efeito de

inibição total é observado apenas in vitro, pois existem trabalhos mostrando que esta

inibição não ocorre in vivo, sendo observada apenas uma proteção (RODRIGUES et al.,

1996) e um trabalho que mostra uma diminuição nos níveis populacionais de algumas

espécies de Candida (DUCLUZEAU & BENSAADA, 1982).

(ii) Efeito sobre a microbiota. Um estudo com voluntários sadios mostrou que a

levedura não induz qualquer mudança significativa na microbiota, ainda que se observe

um aumento no número de bactérias aeróbias e de coliformes (KLEIN et al., 1993). Em

um estudo com prematuros, COSTALOS et al. (2003) observaram uma diminuição nos

níveis intestinais de E. coli e Enterococcus e um aumento de Bifidobacterium e

Staphylococcus no grupo tratado com a levedura.

(iii) Saccharomyces boulardii e C. difficile. De todos os efeitos benéficos da

levedura, os mais extensivamente estudados e relatados na literatura são o seu efeito nas

diarréias associadas ao uso de antibióticos e nas diarréias associadas ao C. difficile. Em

um primeiro estudo realizado por TOOTHAKER & ELMER (1984), com hamsters,

mostrou-se que a mortalidade associada ao C. difficile foi de 51% em animais tratados

com a levedura, contra 80% dos animais controle. Como a diarréia associada ao C.

difficile está diretamente ligada à produção das toxinas A e B, CORTHIER et al. (1992)

observaram que nos animais tratados com a levedura, o título de toxinas diminuiu 1000

vezes, quando comparado com os animais controle. Trabalhando com as toxinas A e B

de C. difficile, CZERUCKA et al. (1991) observaram um efeito protetor da levedura

utilizando um modelo de células intestinais. Em um modelo utilizando alças intestinais

de ratos, observou-se que a levedura bloqueia a atividade secretória da toxina A

(POTHOULAKIS et al., 1993). Esses autores observaram que essa atividade anti-

secretória também foi encontrada no meio condicionado da levedura, sugerindo que esse

efeito era devido a substância(s) secretada(s) pela levedura e, posteriormente,

verificaram que essa inibição da ação das toxinas do C. difficile era devida à produção

de uma serino-protease de 54 kDa, que clivava as toxinas A e B e seus respectivos

receptores na mucosa intestinal (CASTAGLIUOLO et al., 1996; CASTAGLIUOLO et

al., 1999). Além disso, em um trabalho com camundongos BALB/c, QAMAR et al.

(2001) observaram um aumento na resposta imune contra a toxina A. Também foi

demonstrado, in vitro, que a levedura inibe a adesão do C. difficile em células VERO

devido a uma serino-protease (TASTEYRE et al., 2002).

(iv) Saccharomyces boulardii e V. cholerae. Em ratos tratados com a levedura

durante 5 dias, foi observado um efeito protetor contra V. cholerae (DIAS et al., 1995).

Utilizando linhagens celulares, CZERUCKA et al. (1989a, 1989b) observaram que a

levedura diminui em 50% o aumento de AMPc (adenosine monophosphate cyclic)

intracelular induzido pela toxina do cólera, limitando, assim, a secreção de cloro. Como

o sobrenadante da levedura foi suficiente para proteger as células da ação da toxina,

observou-se uma diminuição dos níveis de AMPc induzidos pela toxina do cólera

devido à ação de uma proteína extracelular de 120 kDa (CZERUCKA et al., 1994;

CZERUCKA & RAMPAL, 1999). Também observou-se a inibição de perdas de água,

sódio e potássio induzida pelas toxinas de V. cholerae (CZERUCKA et al., 1994).

Outros estudos mostraram que a inibição da ação da toxina do cólera era devida à

ligação da toxina em sítios específicos da levedura, diminuindo, assim, a quantidade de

toxina livre capaz de se ligar aos receptores intestinais (BRANDÃO et al., 1998;

NEVES et al., 2002).

(v) Saccharomyces boulardii e EPEC (E. coli enteropatogênica) e EHEC (E. coli

entero-hemorrágica). MASSOT et al. (1983) observaram a inibição de perdas de água,

sódio e potássio induzidas por E. coli, em células epiteliais intestinais, pela S. boulardii.

Estudos in vitro com células do cólon, infectadas por EPEC, permitiram demonstrar que

a levedura é capaz de preservar a integridade da barreira epitelial, mantendo as junções

serreadas, assim como sua intervenção na modulação da sinalização celular induzida

durante a infecção por esta mesma bactéria (CZERUCKA et al., 2000). DAHAN et al.

(2003) observaram que a levedura exerce um efeito protetor nas infecções por EHEC,

mantendo a integridade epitelial e interferindo em vias de transdução do sinal, assim

como diminuindo os níveis de citocinas pró-inflamatórias via inibição de NF-κB

(“nuclear factor kappa B”) e MAPK (“mitogen activated protein kinase”) ativadas pela

bactéria. DALMASSO et al. (2006b) demonstraram que S. boulardii induz uma

diminuição nos níveis de TNF-α e na apoptose relacionados à infecção em células com

EHEC.

(vi) Saccharomyces boulardii e outros microrganismos. A levedura também é

capaz de exercer um efeito protetor em animais infectados com Salm. Typhimurium e S.

flexneri (RODRIGUES et al., 1996) e, no caso de Salm. Typhimurium, esse efeito pode

estar relacionado a uma imunomodulação pela levedura (RODRIGUES et al., 2000).

MUMY et al. (2007) demonstraram que S. boulardii interfere na sinalização induzida

por S. flexneri em células T84, além de diminuir a secreção de IL-8 e a migração

transepitelial de leucócitos polimorfonucleares, sugerindo que o uso da levedura poderia

aliviar os sintomas associados à resposta inflamatória do hospedeiro. Em um modelo de

colite in vivo, WU et al. (2007) observaram que S. boulardii mantém a integridade

epitelial e diminui os efeitos inflamatórios associados à infecção por Citrobacter

redentium. Em outro modelo de colite, in vivo, induzida quimicamente por DSS

(“d

extran-sulfate-sodium”), JAWHARA & POULAIN (2007) mostraram que S.

boulardii diminui a inflamação causada no intestino, assim como a colonização por C.

albicans nesse modelo de colite.

I.3.5.2.3 Efeito anti-inflamatório

SOUGIOULTZIS et al. (2006) mostraram que S. boulardii secreta substâncias

anti-inflamatórias. Trabalhando com células HT-29 e THP-1, esses autores observaram

que a levedura secreta um fator anti-inflamatório (<1 kDa) termo-estável, que inibe a

produção de IL-8, a degradação de IκB-α (“inhibitory protein κB α”) e reduz a ativação

de NF-κB em células tratadas com IL-1β ou LPS. Observou-se, também, um efeito anti-

inflamatório, pela produção de fatores solúveis de baixo peso molecular, que bloqueiam

a ativação de NF-κB e a expressão de IL-8. Segundo os autores, essas substâncias

podem mediar, pelo menos em parte, os efeitos benéficos da levedura S. boulardii

observados nas infecções intestinais. CHEN et al. (2006), também trabalhando com o

sobrenadante da levedura (SbS), observaram que o SbS inibe a produção de IL-8

induzida pela toxina A do C. difficile ou IL-1β, assim como a ativação de algumas MAP

quinases. In vivo, demonstraram que SbS normaliza a secreção de fluidos mediada pela

toxina A.

LEE et al. (2005) observaram que S. boulardii possui um efeito anti-inflamatório

via PPAR-gamma (“peroxisome proliferator-activated receptor-gamma”), uma molécula

que regula a inflamação no epitélio intestinal. Eles observaram que a levedura aumenta

a expressão de PPAR-gamma nos níveis de mRNA e proteína, e que ela inibe o efeito

de TNF-α, IL-1β ou LPS na diminuição da expressão de PPAR-gamma. Trabalhos

recentes sugerem um novo mecanismo de ação da levedura, envolvendo uma possível

inibição da produção de óxido nítrico pela levedura (GIRARD et al., 2003; GIRARD et

al., 2005a).

Utilizando animais SCID (“immunoincompetent syngenic severe combined

immunodeficiency”), DALMASSO et al. (2006a) demonstraram que S. boulardii

interfere no processo inflamatório, devido a uma alteração específica no comportamento

de migração de células T que se acumulam nos linfonodos mesentéricos, e que o

tratamento com essa levedura limita a infiltração de células Th1 no cólon inflamado e a

amplificação da inflamação induzida pela produção de citocinas pró-inflamatórias.

I.3.5.2.4 Outros efeitos

Além de todos o efeitos já listados, exitem trabalhos mostrando a ligação de

alguns microrganismos na superfície da levedura (GEDEK, 1999), assim como a

presença de receptores para toxinas bacterianas (BRANDÃO et al., 1998; NEVES et al.,

2002). GIRARD et al. (2005b) mostraram que a levedura minimiza o desequilíbrio

eletrolítico induzido por óleo de castor no cólon de ratos.

I.3.5.3 Vantagens e desvantagens da utilização da levedura

A maior parte dos probióticos comercializados é representada por bactérias.

Apenas duas leveduras são usadas, a S. boulardii na medicina humana e a S. cerevisiae

na medicina veterinária. A vantagem de se trabalhar com levedura é que ela pode ser

liofilizada, é rapidamente eliminada após interrupção da terapia e não é afetada pelo uso

de antibacterianos (BLEHAUT et al., 1989; BODDY et al., 1991). Esta última

propriedade é importante, pois algumas terapias associam a administração de

probióticos com antibacterianos durante infecções gastrintestinais como, por exemplo,

no caso de pacientes infectados por H. pylori, cuja terapia é uma combinação de drogas

(ARMUZZI et al., 2001).

O uso da levedura não acarreta mudanças nas populações normais da microbiota

do cólon após exposição por 4-5 dias. Porém, após este tempo, nota-se um aumento nas

populações de aeróbios (1,4 x 10

/g para 2,1 x 10

/g de conteúdo intestinal) e de

coliformes totais (1,8 x 10

/g para 1,9 x 10

/g de conteúdo intestinal) (MCFARLAND

& BERNASCONI, 1993).

Em todo o mundo, já foram descritos 27 casos de fungemia devido ao uso da S.

boulardii (ZUNIC et al., 1991; PLETINCX et al., 1995; VIGGIANO et al., 1995;

BASSETTI et al., 1998; FREDENUCCI et al., 1998; NIAULT et al., 1999; CESARO et

al., 2000; HENNEQUIN et al., 2000; PERAPOCH et al., 2000; RIJNDERS et al., 2000;

LHERM et al., 2002; CASSONE et al., 2003; LESTIN et al., 2003; RIQUELME et al.,

2003). Ultimamente, infecções fúngicas invasivas devido a agentes novos ou raros têm

sido, freqüentemente, descritos em todo o mundo. Esses casos são considerados como

uma conseqüência do aumento da população de risco para doenças crônicas ou

debilitantes, aumento no uso de drogas imunossupressivas e de antibióticos de amplo

espectro, nutrição parental e uso de catéter venoso central. Devido a tudo isso, o uso da

levedura não é recomendado em pacientes imunossuprimidos ou muito debilitados,

como no caso de tratamentos radioterápicos ou quimioterápicos (CESARO et al., 2000),

já que alguns casos de fungemia têm sido descritos na literatura nesses pacientes após

tratamento enteral com S. boulardii, embora nenhum deles tenha levado o paciente a

óbito devido à levedura e, foram, na maioria dos casos, resolvidos após interrupção do

probiótico e utilização de fluconazol ou anfotericina B (CASSONE et al., 2003).

Assim como ocorre com a levedura, existem casos descritos de bacteremia

devido à utilização de bactérias usadas como probióticos (OGGIONI et al., 1998;

RICHARD et al., 1988; MACKAY et al., 1999; RAUTIO et al., 1999). Entretanto,

essas correlações entre infecções sistêmicas e consumo de probióticos são raras e

sempre ocorrem em pacientes sob condições médicas extremamente debilitantes.

I.3.6 A levedura Saccharomyces cerevisiae linhagem UFMG 905

A levedura S. cerevisiae linhagem UFMG 905 foi isolada da destilaria de

cachaça de Germana, na cidade de Nova União, em Minas Gerais, na região da zona

metalúrgica (VIANNA, 2003). A linhagem foi identificada e classificada como S.

cerevisiae, segundo métodos descritos em KURTZMAN & FELL (1998) e YARROW

et al. (1998). A identidade da levedura foi confirmada utilizando o programa

YEASTCOMPARE (CIRIELLO & LACHANCE, 2001).

MARTINS (2004) mostrou que a S. cerevisiae UFMG 905 foi capaz de reduzir a

ação de alguns enteropatógenos. Os resultados mostraram que a levedura foi capaz de

diminuir a mortalidade (15% de sobrevivência no grupo controle contra 55% no grupo

tratado com a levedura) de animais desafiados com Salm. Typhimurium durante 28 dias

(Figura 1) e os dados histopatológicos mostraram que a levedura apresentou proteção

contra o desafio oral com C. difficile, em camundongos gnotobióticos (Figura 2) e

preservação do fígado de animais convencionais tratados com a levedura e desafiados

com Salm. Typhimurium (Figura 3). O menor número de focos inflamatórios no fígado

de animais previamente tratados com a S. cerevisiae UFMG 905 sugeriu que a levedura

diminuiu, in vivo, a translocação da Salm. Typhimurium (Tabela 1) (MARTINS et al.,

2005a).

100

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tempo (dias)

Sobrevivência (%)

Figura 1. Sobrevivência de camundongos NIH convencionais tratados () ou não ()

com S. cerevisiae UFMG 905 e desafiados com 10

células de Salm. Typhimurium no

tempo 1. N = 20 (em cada grupo). * Estatisticamente diferente, segundo o teste Mann-

Whitney Rank, (P = 0,00326). (MARTINS, 2004).

Figura 2. Aspecto histológico do cólon (A e C) e do ceco (B e D) de camundongos NIH

gnotobióticos monoassociados (C e D) ou não (A e B) com a levedura S. cerevisiae

UFMG 905 durante dez dias e desafiados com 10

células de C. difficile durante 6 dias.

Coloração H-E (40X). As setas mostram as áreas de edema. (MARTINS, 2004).

Figura 3. Aspecto histológico do fígado de camundongos NIH convencionais controle

(A) ou tratados com a levedura S. cerevisiae UFMG 905 durante dez dias (B) e

desafiados com 10

células de Salm. Typhimurium por 28 dias. Coloração H-E (100X).

As setas indicam as áreas de focos inflamatórios. (MARTINS, 2004).

Tabela 1. Número de focos inflamatórios por unidades de área presentes nos fígados de

camundongos NIH convencionais tratados ou não com a levedura S. cerevisiae UFMG

905 durante dez dias e desafiados com 10

células de Salm. Typhimurium por 28 dias.

Grupo

Número de focos

inflamatórios

Área medida (em

unidades de área)

Focos/unidades de área

8,7 x 10

µm

8,7 x 10

µm

Controle

8,7 x 10

µm

Média

25,3 ± 5,5*

8,7 x 10

µm

8,7 x 10

µm

Experimental

8,7 x 10

µm

Média

8,0 ± 4,6*

Foco inflamatório define-se por acúmulo de células inflamatórias em número maior

que 10 células, acompanhadas de alterações necróticas do parênquima associado.

A unidade de área medida em todos os animais foi a somatória da área de 10 campos

em aumento de 10X. Cada medida anotada corresponde a um corte (3 cortes medidos,

um de cada animal).

* Estatisticamente significativo. Teste “t” de Student (P = 0,014). (MARTINS, 2004).

I.3.7 Utilização de outras leveduras como probióticos

Devido ao grande interesse na utilização de probióticos hoje em dia e, também,

pelo estímulo da Organização Mundial da Saúde (OMS) na utilização dessa alternativa

ao uso dos antibióticos, grandes laboratórios e centros de pesquisas vêm investindo

nesta área. Dados bem preliminares do nosso laboratório, e ainda não publicados, vêm

mostrando que outras leveduras não pertencentes ao gênero Saccharomyces, isoladas de

diversos ambientes e da indústria agro-alimentar, são capazes de colonizar o trato

digestivo de animais experimentais e, também, de produzirem substâncias, ainda não

identificadas, responsáveis pela inibição in vitro de enteropatógenos (TIAGO, 2008).

Trabalhando com leveduras isoladas de laticínios, KUMURA et al. (2004)

testaram 8 espécies diferentes de leveduras (Candida humilis, Debaryomyces hansenii,

Debaryomyces occidentalis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces lodderae,

Kluyveromyces marxianus, S. cerevisiae e Yarrowia lipolytica) quanto à capacidade de

aderir em culturas celulares, resistência a ácidos, temperatura corporal humana e sais

biliares, além da capacidade de não causar inflamação, e selecionaram uma levedura (K.

lactis) para testes posteriores para uso como probiótico.

Outros trabalhos (SCHELLENBERG et al., 1994; CHIA et al., 1995; IZADNIA

et al., 1998; KOVACS & BERK, 2000) mostram a eficácia de leveduras de cervejaria e

panificação, tanto em ensaios laboratoriais quanto em pacientes humanos, no combate

às diarréias.

I.4 Diarréias

De acordo com dados da OMS, mais de 75% dos antibióticos são prescritos de

forma inapropriada, fato corrente mesmo em hospitais de ensino de países considerados

desenvolvidos (WHO, 2002). Além da prescrição e do uso irracional dos antibióticos,

apenas uma média de 50% dos pacientes tomam seus medicamentos corretamente.

Conseqüentemente, a resistência de microrganismos responsáveis por muitas doenças

infecciosas, incluindo diarréia bacteriana, gonorréia, pneumonia e tuberculose, está

crescendo.

A diarréia é definida como a passagem de fezes, em três ou mais episódios, num

período de 24 horas, suficientemente líquida para ocupar a forma do “container” no qual

ela é colocada (KEUSCH et al., 2006). Ela pode ser causada por microrganismos

infecciosos, incluindo vírus, bactérias, protozoários e helmintos, que são transmitidos

das fezes de um indivíduo para a boca de outro, a chamada transmissão fecal-oral, ou

por outros fatores etiológicos, não-infecciosos, como a diarréia alimentar, diarréia

alérgica, causada por estresse e diarréias sem causa aparente (KEUSCH et al., 2006).

As diarréias agudas são responsáveis por altas taxas de mortalidade e morbidade

em todo o mundo. Essas taxas estão relacionadas a um aumento na secreção intestinal,

resultado de infecções por bactérias produtoras de enterotoxinas (E. coli

enterotoxigênica, V. cholerae, C. difficile) ou de uma diminuição da absorção intestinal

pela infecção com microrganismos que causam danos ao epitélio intestinal (E. coli

enteropatogênica, Shigella sp., Salmonella sp.) (KAUR & GANGULY, 2003).

Dentre as diarréias bacterianas, a habilidade em sobreviver no estômago é um

fator determinante do tamanho do inóculo necessário para causar doença. Por exemplo,

Shigella, que é resistente ao pH ácido, em torno de alguns milhares de UFCs são

necessários para causar a doença. Ao contrário, bactérias que são rapidamente

inativadas pelo baixo pH, como o V. cholerae, requerem um inóculo bem maior

(milhões de UFCs) para causar a doença e, assim, precisam, primeiramente, se

multiplicar no alimento ou na água para atingir números suficientes para causar a

doença (KEUSCH et al., 2006). Dentre as espécies de Salmonella, alguns sorotipos são

adaptados para infectar animais e, desse modo, não causam doenças em seres humanos.

Outros sorotipos são bem adaptados aos seres humanos e não causam doenças em

animais. A maioria, entretanto, não é adaptada a um hospedeiro específico e podem,

dessa maneira, infectar seres humanos e animais domésticos, facilitando a transmissão.

Pouco mais de 10 sorortipos, dos mais de 2500 de Salmonella, causam a maioria das

infecções humanas, refletindo a necessidade de genes que codificam fatores de

virulência essenciais (KEUSCH et al., 2006).

Nas diarréias bacterianas o tratamento corrente é não permitir a desidratação do

paciente e, somente em casos mais graves, fazer uso de antibióticos. Esta terapia com

antibióticos é eficaz, mas apresenta três grandes inconvenientes: a seleção de bactérias

cada vez mais resistentes, a destruição de parte da microbiota intestinal, acarretando

diarréias secundárias, o alto custo dos novos antibióticos, uma vez que os antibióticos

de primeira geração não são mais eficazes para as possíveis bactérias resistentes,

previamente selecionadas (WHO, 2002).

As características socio-econômicas do Brasil, e da maioria dos países no

mundo, propiciam o aparecimento de várias infecções bacterianas, principalmente as

que atingem o intestino. Diarréias são um sério problema de saúde pública no Brasil,

sendo que os índices de mortalidade e morbidade, devido às diarréias, em crianças do

Nordeste são significantemente mais elevados (RIBEIRO, 2000).

I.5 O gênero Salmonella

Salmonella, o quarto microrganismo patogênico em importância, após Yersinia,

Escherichia e Shigella, dentro do grupo das enterobactérias, é um agente infeccioso

intracelular facultativo, constituído por espécies de bacilos anaeróbios facultativos,

Gram-negativo, que incluem agentes etiológicos de doenças coletivamente chamadas de

salmoneloses (BERGEY, 1994). Estas bactérias pertencem à família

Enterobacteriaceae e fermentam a glicose, reduzem nitrato a nitrito e possuem flagelos

peritríquios (exceção da Salm. pullorum). A Salmonella foi isolada em 1885, por Daniel

Salmon, um veterinário americano e, desde então, mais de 2463 sorotipos diferentes

foram descritos (BRENNER et al., 2000). Dados da OMS, de 2004, listam 2501

diferentes sorotipos (WHO, 2007). Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Typhi e

S. enterica subsp. enterica sorovar Paratyphi são os agentes da febre tifóide nos seres

humanos, infecções que se tornam um problema de saúde pública, principalmente em

regiões onde há pouco ou nenhum acesso a água potável e onde o tratamento de águas é

insastifatório. Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Typhimurium e S. enterica

subsp. enterica sorovar Enteritidis, outros sorotipos da espécie S. enterica, podem

infectar diversos hospedeiros (aves, homem, camundongos, répteis, anfíbios) e causam

uma gastroenterite que, na maioria das vezes, se resolve sem uso de antibióticos

(SALEZ & MALO, 2004).

Enquanto todos os sorotipos podem causar doenças em seres humanos, eles são

classificados de acordo com sua adaptação aos hospedeiros. Alguns sorotipos possuem

um limitado espectro de hospedeiro, por exemplo, Salm. Typhi em primatas, Salm.

enterica subsp. enterica sorovar Dublin em gado e Salm. enterica subsp. enterica

sorovar Choleraesuis em suínos. Quando esses sorotipos causam doença em seres

humanos, costuma ser de forma invasiva. A maioria dos sorotipos, entretanto, possui

um amplo espectro de hospedeiros. Classicamente eles causam gastroenterite, que

precisam de tratamento específico apenas em crianças, idosos e indivíduos

imunodebilitados. Esse grupo compreende Salm. Enteriditis e Salm. Typhimurium, os

dois principais sorotipos transmitidos do animal para o homem (WHO, 2007).

Os sorotipos de Salm. enterica estão entre as causas mais comuns de infecções

alimentares e causam uma infecção alimentar que resulta em gastroenterite. Os sintomas

aparecem dentro de 6 a 24 horas após a ingestão da água ou do alimento contaminado,

podendo durar até uma semana. Os sintomas iniciais incluem náusea e vômito, que

diminuem após algumas horas. Estes sintomas são seguidos de dores abdominais e

diarréia, podendo, também, haver febre. A gravidade da dor e da diarréia varia bastante

de pessoa para pessoa, desde dor branda e diarréia quase imperceptível até uma dor que

lembra uma apendicite grave e diarréia sanguinolenta. Após o final dos sintomas, a

pessoa continua a excretar a bactéria por mais de 3 meses. Em 1 a 3% dos casos, a

pessoa se torna um carreador crônico da bactéria por mais de um ano. Muitos casos de

gastroenterite ocorrem em crianças com menos de 10 anos de idade, e os sintomas

costumam ser mais graves neste grupo de pessoas (MEADOW et al., 1985). A infecção

pode se tornar sistêmica, o que é mais comum em crianças e pacientes imunodeprimidos

(pacientes com câncer e AIDS) (SALYERS & WHITT, 1994).

Os surtos de salmoneloses envolvem diferentes tipos de alimentos, mas os

derivados de leite e de aves domésticas são os mais comuns. Os produtos derivados de

aves domésticas são uma fonte comum de infecção porque estes animais carregam,

normalmente, estas bactérias em seus tratos intestinais e, também, devido à alimentação

rica em proteínas destes animais, o que assegura que eles serão colonizados pela Salm.

Typhimurium e outros sorotipos de Salm. enterica. A bactéria contamina a carcaça após

o abate e a superfície de ovos. Foi demonstrado que as aves também transmitem a Salm.

enterica pela via transovariana. A gastroenterite resulta do cozimento inadequado dos

ovos e carne de aves domésticas, mas ela pode resultar de contaminação cruzada de

outros alimentos e pela carne crua das aves, por exemplo, quando se utiliza a mesma

faca para cortar a carne e fatiar os ingredientes de uma salada (SALYERS & WHITT,

1994).

As infecções por Salmonella acometem, geralmente, o trato digestivo. Em

camundongos, a Salm. Typhimurium causa uma doença sistêmica acompanhada de

sintomas semelhantes à febre tifóide causada pela Salm. Typhi em seres humanos,

independente da via de infecção. Classicamente, a cinética de infecção em

camundongos se caracteriza por quatro fases. A primeira se traduz pela rápida

eliminação de bactérias séricas. Durante a semana seguinte à infecção, a Salmonella se

replica ativamente dentro de células fagocitárias. Essa fase precede uma fase de platô,

caracterizada pelo reconhecimento de certos patógenos, por motivos moleculares

específicos, pelas células mononucleadas da linhagem fagocitária. Isso resulta na

produção de várias citocinas (TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12, IFN-γ) e uma infiltração

massiva de monócitos e de neutrófilos polinucleares nos locais de inflamação. Na quarta

fase da infecção se instala a defesa inflamatória adquirida, fazendo intervir as células B

e T, assim como os fatores humorais que dela decorrem (SALEZ & MALO, 2004).

Os mecanismos de enteropatogenicidade nas salmoneloses são bastante

complexos, não sendo, ainda, completamente compreendidos. Sabe-se que a bactéria

possui diversos fatores de virulência, como adesinas, exoenzimas, enterotoxinas e

endototoxina (MAKELA et al., 1973; FRETER, 1981; KOO et al., 1984), além da

capacidade de invadir a mucosa gastrintestinal, multiplicar-se, disseminar-se e

sobreviver nas células do sistema retículo-endotelial (CARTER & COLLINS, 1974). A

Salm. Typhimurium adere e invade diferentes linhagens celulares de mamíferos,

incluindo células HeLa (GIANELLA et al., 1973), células Hep-2 (SNALL et al., 1987)

e células Henle (ALTMEYER et al., 1993).

Após sua ingestão e passagem pelo estômago, a Salmonella coloniza o intestino,

interagindo com e translocando através do epitélio intestinal, via três rotas: (i) invasão

ativa dos enterócitos, (ii) invasão das células M e, (iii) pelas células dentríticas que

intercalam as células epiteliais (TAKEUCHI, 1967; GRASSL & FINLAY, 2008). As

bactérias, aderidas à superfície das células epiteliais, induzem degeneração nas

microvilosidades do enterócito. Posteriormente, projeções citoplasmáticas das células

do hospedeiro circundam as bactérias até que elas fiquem contidas em vacúolos

envoltos por membrana. Ocorre, então, a reconstituição da borda em escova dos

enterócitos. A Salm. Typhimurium induz rearranjos na membrana celular como parte do

processo de internalização (FINLAY & FALKOW, 1990; FINLAY et al., 1992;

FRANCIS et al., 1992).

Em camundongos inoculados intragastricamente, observou-se que o sítio

primário de colonização por Salm. enterica é o íleo terminal (CARTER & COLLINS,

1974). Também foi observado que a Salmonella interagia, preferencialmente, com as

células das placas de Peyer (tecido linfóide associado ao intestino), como é o caso da

Salm. Typhimurium que, seguindo a rota oral de colonização, associa-se rapidamente

com o tecido das placas de Peyer (HOHMANN et al., 1978). A bactéria entra,

seletivamente, pelas células M do epitélio associado aos folículos linfóides (JONES et

al., 1994). A entrada bacteriana é seguida pela morte destas células M e, após a

eliminação destas células, os microrganismos movem-se lateralmente ao longo da

lâmina própria ou invadem os folículos, onde se multiplicam. Com o tempo, a infecção

progride para os linfonodos que drenam a região, chegando ao fígado e ao baço

(CARTER & COLLINS, 1974; NARDI et al., 1991). Em camundongos, a Salmonella

cresce em macrófagos residentes do fígado e do baço.

Os receptores de reconhecimento de patógenos, como os TLRs e NLRs

[nucleotide binding and oligomerization domain (NOD)-like receptors], são estimulados

pelos PAMPs (DELBRIDGE & O’RIORDAN, 2007). Os TLRs estão localizados nas

membranas plasmática e do fagossomo, e podem ser ativados por PAMPs como o LPS e

a flagelina. Os NLRs estão localizados no citoplasma, onde podem reconhecer PAMPs,

como o peptideoglicano. A ligação de PAMPs a esses receptores leva à ativação e

transcrição de fatores de transcrição e à subsequente produção de citocinas e

quimiocinas (GRASSL & FINLAY, 2008). A Salmonella possui, pelo menos, 4

ativadores de TLRs: LPS, lipoproteínas bacterianas, flagelina e DNA CpG, que ativam,

respectivamente, TLR4, TLR2, TLR5 e TLR9. Está claramente descrito que, in vitro,

células como macrófagos e células dendríticas podem “sentir” a Salmonella via TLRs e

induzir a produção de citocinas que também são relevantes nas respostas, in vitro,

contra a Salmonella (GEROLD et al., 2007).

Por ser uma bactéria Gram-negativo, a Salmonella exprime em sua parede

externa o LPS, uma molécula extremamente imunogênica. A LBP (LPS-binding

protein), proteína de ligação ao LPS, é uma proteína sérica cuja principal característica é

apresentar o LPS sob a forma monomérica ao receptor CD14, sua forma livre em

solução sendo micelar. Os primeiros trabalhos que colocaram em evidência o papel da

LBP, quando da infecção por Salm. Typhimurium, o descreveram como sendo

necessário para uma reação inflamatória eficaz para eliminar o patógeno invasivo

(JACK et al., 1997). O receptor CD14, presente majoritariamente nos monócitos e

macrófagos, é o receptor, por excelência, do LPS. Presente nos organismos sob a forma

membranar (mCD14) e solúvel (sCD14), ele possui em seu domínio carboxi-terminal,

um sítio de ligação para um grupamento GPI (fosfosil-fosfatidil-inositol), que favorece

a ancoragem à membrana celular, mas sem a atravessar, impedindo qualquer contato

com o meio citoplasmático e, assim, toda interação molecular permite a transdução do

sinal (SALEZ & MALO, 2004) (Figura 4).

A fixação do LPS à célula não provoca a ativação celular de imediato. O

intervalo de tempo necessário à ativação (15 a 30 minutos) se explica pela necessidade

de internalizar o complexo LPS/CD14. Alguns estudos mostram que o bloqueio da

fusão endossômica ou da internalização provocam uma ruptura na sinalização induzida

pelo LPS (TRIANTAFILOU & TRIANTAFILOU, 2002).

O complexo LPS/LBP pode gerar uma mensagem intracelular via o receptor

CD14, por intermédio de uma proteína dotada de um domínio transmembranar, o

receptor TLR-4, que reconhece especificamente o LPS. Esse receptor possui um

domínio extracelular, rico em leucina, e um domínio intracelular, homólogo ao domínio

intracelular do receptor de IL-1 (domínio TIR) (TAKEDA et al., 2003). A fixação do

complexo LPS/LBP ao complexo CD14/TLR-4 (em cooperação com MD2, uma

proteína perimembranar) produz a ativação de duas vias de sinalização distintas e

parcialmente reduntantes. Uma primeira via faz intervir duas proteínas adaptadoras,

MyD88 (“myeloid differentiation factor 88”) e TIRAP (“toll-interleukin 1 receptor

domain-containing adapter protein”) (BEUTLER et al., 2003), capazes de mobilizar a

via de sinalização dependente das proteínas IRAK4 (“interleukin 1 receptor-associated

kinase”), TRAF6 (“tumor necrosis factor receptor associated factor”), TAB1

(“transforming growth factor β-activated protein kinase-binding protein”) e TAK1

(“transforming growth factor β-associated kinase”), mas também as MAP quinases

(“MAPKK, MAP kinase kinase”) e a proteína p38. Essa cascata de ativações

moleculares, principalmente pela ubiquidade do complexo molecular NEMO (“nuclear

factor κB essential modifier”) / IKKα (“inhibitor of κB kinase α”) / IKKβ (“inhibitor of

κB kinase β”), induz a degradação de IκB, a translocação de NF-κB para o núcleo e a

ativação de AP-1 (“adaptor protein 1”) levando à ativação transcripcional de certos

genes que codificam as citocinas inflamatórias, tais como TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, IL-

12 ou ainda MIP1α (“macrophage inflammatory protein 1 α”). Independentemente de

TRAF6, o fator de transcrição C/EBPβ (“CCAAT/enhancer-binding protein β”) (ou NF-

IL-6) parece ser mobilizado desde a ativação dessa via (MyD88), por uma via de

sinalização ainda pouco descrita, e permite a produção de prostaglandina E

(UEMATSU et al., 2002). A outra via ativada após a ativação do receptor TLR-4 faz

intervenir uma via independente de MyD88, onde duas outras proteínas adaptadoras

intervêm, TRAM (“TRIF-related adapter molecule”) e TRIF (“Toll/interleukin-1

receptor domain-containing adaptor protein inducing interferon β”) (YAMAMOTO et

al., 2002). Essas proteíns adaptadoras, assim como MyD88/TIRAP, ativam não apenas

a via de MAP quinases e a proteína p38, mas também uma via que lhes é própria e que

permite a síntese de IFN-β (“interferon β”), NOS2 (“nitric oxide sintase 2”) e de IP-10

(“interferon inducible protein 10”) após a ativação do fator de transcrição IRF-3

(“interferon regulatory factor 3”) (BEUTLER et al., 2003). Todo esse processo de

sinalização pode ser visualizado, esquematicamente, na Figura 4.

O TLR-4 não exerce apenas um papel de reconhecimento do patógeno, ele

intervém, também, na fagocitose de bactérias Gram-negativo e Gram-positivo. Esse

efeito é regulado pela cascata de sinalização MyD88/IRAK-4/p38 (DOYLE et al.,

2004).

A Salmonella é, também, reconhecida pelo TLR-5. Contrariamente ao TLR-4,

que possui vários ligantes diferentes, o TLR-5 apresenta uma afinidade exclusiva pela

flagelina. Essa proteína, expressa nos flagelos bacterianos, possui uma capacidade

extremamente imunogênica, como sua capacidade de ativação do sistema fagocitário

mononuclear (HAYASHI et al., 2001) e de células epiteliais da mucosa intestinal

(GEWIRTZ et al., 2001). TLR-5 induz uma mensagem similar à do TLR-4, uma vez

que a via ativada mobiliza NF-κB e induz a produção de citocinas pro-inflamatórias

como TNF-α e IL-6 (HAYASHI et al., 2001) (Figura 4).

Em contato com a célula hospedeira, a Salmonella estimula sua própria captura

pelas células epiteliais. A habilidade dessa bactéria em entrar na célula hospedeira é

central para o sucesso da infecção. Para isso ela faz uso de um aparato, conhecido como

secreção do tipo 3 (TTSS, “type three secretion system”), onde ela introduz na célula

hospedeira um conjunto de proteínas efetoras que são capazes de mimetizar as funções

de várias proteínas da célula hospedeira (GALÁN, 2001). O mecanismo de entrada na

célula é caracterizado por um profundo rearranjo do citoesqueleto de actina no local

onde a bactéria entra em contato com a célula hospedeira (PATEL & GALÁN, 2005).

Esse remodelamento do citoesqueleto da célula induz a membrana a formar extensões

celulares que envelopam a bactéria, conduzindo à entrada da bactéria em vacúolos

ligados à membrana. Essa entrada em células não fagocíticas é absolutamente

dependente da liberação de proteínas efetoras específicas introduzidas na célula

hospedeira via TTSS codificadas pela ilha de patogenicidade 1 da Salmonella (SPI-1,

“Salmonella pathogenicity island 1”). Esses fatores de virulência funcionam em

conjunto para empregar as proteínas da célula hospedeira e orquestrar uma série de

eventos que culminam na entrada da bactéria (PATEL et al., 2005).

Figura 4. Sinalização celular induzida pela Salmonella logo após o seu reconhecimento

pelos receptores TLR-4 e TLR-5. (SALEZ & MALO, 2004).

Um alvo celular chave é a família de proteínas Rho, que são pequenas GTPases

(“Guanidine Tri-Phosphatases”) reguladoras centrais do citoesqueleto eucarioto

(ETIENNE-MANNEVILLE & HALL, 2002). As RhoGTPases funcionam como

“ativadores/desativadores” moleculares, alternando entre a forma GTP-ligada ativa e a

forma GDP-ligada inativa. Essa troca binária de nucleotídeos induz mudanças

estruturais definidas (VETTER & WITTINGHOFER, 2001). A Salmonella possui uma

estratégia sofisticada para modular reversivelmente essa função ativadora/desativadora

das RhoGTPases. Ela codifica três proteínas efetoras do tipo III, SopE, SopE2 (que são

intimamente relacionadas) e SopB, que diretamente engajam e ativam dois importantes

membros da família Rho: Cdc42 e Rac (HARDT et al., 1998; STENDER et al., 2000),

levando ao remodelamento de actina. SopE e SopE2 catalizam diretamente a ativação

de GTPase, enquanto SopB funciona indiretamente, via manipulação de

fosfoinositídeos. A membrana plasmática está intimamente associada com o

citoesqueleto de actina, e essa interação depende de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato

[PtdIns(4,5)P

]. SopB/SigD é uma inositol fosfatase, que induz um rápido

desaparecimento de PtdIns(4,5)P

pela invaginação de regiões da membrana durante a

invasão pela Salmonella. Isso aumenta a elasticidade para facilitar o remodelamento da

membrana plasmática associada à entrada da bactéria (RAUCHER et al., 2000;

TEREBIZNIK et al., 2002).

Além das 3 proteínas efetoras citadas anteriormente, duas outras proteínas são

translocadas, SipA, que se liga a e estabiliza a actina, e SipC, que induz nucleação e

polimerização da actina (ZHOU & GALÁN, 2001). Após a invasão, uma proteína

efetora do tipo III, SptP, age como uma proteína ativadora de GTPase (GAP, “GTPase-

activating protein”) para Cdc42 e Rac, inativando essas proteínas G e retornando a

morfologia celular a um estado relativamente normal (FU & GALÁN, 1999) e as

bactérias internalizadas ocupam o vacúolo gerado pela fusão das vesículas induzidas por

SopB.

Após a internalização, o vacúolo contendo a Salmonella (SCV, “Salmonella-

containing vacuole”) interage, seletivamente, com a maquinaria endocítica do

hospedeiro. Inicialmente, o SCV adquire os marcadores endossômicos precoces, EEA1

e Rab5, que são sequencialmente substituídos pelo endossomo tardio, e marcadores

lisossômicos Rab 7 e glicoproteínas lisossômicas (Lgps, lysosomal glycoproteins).

Entretanto, o SCV não se funde diretamente com os endosomos e lisossomos, em parte

devido à atividade fosfatase fosfoinositídica de SopB (PATEL et al., 2005). À medida

que a infecção progride, as proteínas do TTSS contidas na ilha de patogenicidade 2 da

Salmonella (SPI-2, “Salmonella pathogenicity island 2”) (SPI2-TTSS) libera proteínas

efetoras adicionais e a replicação bacteriana é iniciada. A proteína SifA é essencial para

a formação de filamentos induzidos pela Salmonella (Sifs, “Salmonella-induced

filaments”), túbulos da membrana alongados que emanam do SCV. SifA, SopD2, SseF,

SseG e SseJ se localizam no SCV e em Sifs, e participam da formação da membrana

(BEUZÓN et al., 2000; BRUMELL et al., 2001; BRUMELL et al., 2002; KUHLE &

HENSEL, 2002; RUIZ-ALBERT et al. 2002; BRUMELL et al., 2003; FREEMAN et

al., 2003). Todo esse processo de internalização da Salmonella pela célula hospedeira

pode ser visualizado, esquematicamente, na Figura 5, adaptada a partir de PATEL et al.

(2005).

Somado às modificações pós-transducionais transitórias ocorridas devido à

entrada da Salmonella, ela induz mudanças drásticas nos níveis transcricionais e

transducionais das células infectadas, em especial nas células epiteliais que, após a

infecção, se comportam como sentinelas pela indução de um programa transcricional,

cuja principal função é regular os mecanismos da defesa imune inata (COSSART &

SANSONETTI, 2004). Isso ocorre, principalmente, em resposta à indução de NF-κB,

que regula uma boa parte dos genes pró-inflamatórios. Esse programa pró-inflamatório

das células epiteliais - em contraste com a sinalização extracelular, que é mediada pelos

TLRs em células fagocíticas, na presença de PAMPs bacterianos - parece ser mediado

por um sistema sensor intracelular envolvendo proteínas citosólicas da família Nod

(GIRARDIN et al., 2001). Nod1 é prevalente nas células epiteliais do intestino e

reconhece muropeptídeos presentes no peptideoglicano de bactérias Gram-negativo.

Uma outra proteína citosólica, Nod2, reconhece peptideoglicanos de qualquer bactéria,

essencialmente porque ela é capaz de reconhecer o muramil-dipeptídeo, uma estrutura

comum a todos os peptideoglicanos (GIRARDIN et al., 2003).

Pela sua capacidade de regular a transcrição gênica e por outras vias, a

Salmonella pode controlar o destino da célula hospedeira. Dentre os mais intrigantes

paradigmas está a capacidade dessa bactéria de controlar os processos apoptóticos da

célula. A proteína SipB, liberada pelo TTSS, ativa a caspase-1 (uma cisteíno-protease

pró apoptótica), que ativa apoptose em macrófagos infectados enquanto inicia, também,

uma resposta inflamatória, via processamento ou maturação de duas potentes citócinas

pró-inflamatórias, IL-1β e IL-18 (HERSH et al., 1999; HILBI et al., 1998).

Figura 5. Interação da Salmonella com as células epiteliais. (a) Em contato com a

célula hospedeira, a Salmonella libera várias proteínas efetoras que manipulam o

citoesqueleto celular e induz a entrada da bactéria. SopE, SopE2 e SopB ativam Cdc42 e

Rac, levando ao remodelamento do citoesqueleto. SipA e SipC estabilizam a actina e

induzem nucleação e polimerização da actina. (b) Após a internalização da bactéria,

SptP reverte a função de SopE, SopE2 e SopB. (c) Após a internalização, o SCV

interage, seletivamente, com a maquinaria endocítica do hospedeiro. (d) Assim que a

infecção progride, SPI2-TTSS libera outras proteínas efetoras e a replicação bacteriana

é iniciada. (PATEL et al., 2005).

A interação da Salmonella com as células epiteliais polarizadas induz a liberação

de potentes quimiocinas que direcionam a migração de células polimorfonucleares

(PMN, “polymorphonuclear leukocytes”) (MCCORMICK et al., 1993; MCCORMICK

et al., 1995; MCCORMICK et al., 1998). Por exemplo, IL-8 é secretada

basolateralmente nas células epiteliais e funciona atraindo PMN do espaço

intravascular, via lâmina própria, para dentro da mucosa infeccionada (MCCORMICK

et al., 1995). PEEC (“pathogen-elicited-epithelial-chemoattractant”) é secretado na

parte apical das células epiteliais e direciona a migração de PMN através da camada

epitelial pelas junções serreadas (MCCORMICK et al., 1998). A secreção contínua e

polarizada de IL-8 e PEEC pelas células epiteliais é responsável por direcionar a

movimentação de PMN, no lúmen intestinal, em resposta a infecções por Salmonella

não-tifóide em seres humanos. A ativação do promotor de IL-8 durante a invasão de

células epiteliais é, primariamente, dependente de NF-κB pela ativação do TLR-5

(GEWIRTZ et al., 2001).

O estudo de salmoneloses em camundongos utilizando a Salm. Typhimurium é

um excelente modelo, pois os sintomas provocados por esta bactéria e pela Salm.

Choleraesuis são muito semelhantes aos sintomas da febre tifóide causada pela Salm.

Typhi em seres humanos (SALYERS & WHITT, 1994). Os resultados obtidos nestes

estudos têm sido extrapolados para a compreensão de vários aspectos da infecção

causada pela Salm. Typhi. Em condições experimentais normais, este último sorotipo

não é virulento para o camundongos, sendo incapaz de induzir uma doença progressiva

neste animal (CARTER & COLLINS, 1974).

I.6 Probióticos e Salmonella

O efeito de probióticos em casos de salmoneloses já vem sendo demonstrado há

alguns anos. Estudando o efeito protetor de diversos microrganismos em ensaios

laboratoriais, relatou-se, utilizando um modelo animal, que probióticos como S.

boulardii, S. cerevisiae, E. coli EMO, B. longum, B. bifidum, E. faecium e L.

acidophilus (RODRIGUES et al., 1996; SILVA et al., 1999; LIMA FILHO et al., 2000;

MAIA et al., 2001; MOURA et al., 2001; SILVA et al., 2002; MARTINS et al., 2005a)

conferem um efeito protetor aos animais desafiados com Salm. Typhimurium e, que na

maioria desses casos, o efeito benéfico é devido, pelo menos em parte, a um aumento da

resposta imune do hospedeiro devido ao tratamento com o probiótico (NEUMANN et

al., 1998; RODRIGUES et al., 2000; GILL et al., 2001; LIMA FILHO et al., 2004;

SILVA et al., 2004).

Trabalhando com uma mistura de probióticos (duas linhagens de L. murinus, L.

salivarius subsp. salivarius, L. pentosus e Pediococcus

pentosaceous) para suínos,

CASEY et al. (2007) observaram que os animais tratados e desafiados com Salm.

Typhimurium apresentaram um número menor de episódios de diarréia, com uma

menor gravidade e duração, além de maior ganho de peso, quando comparados com

animais controle. Ao contrário do que já havia sido observado em outros trabalhos, eles

observaram que essa associação de probióticos possibilitou uma diminuição nos níveis

fecais da Salmonella, em relação ao controle, após 15 dias de infecção, demonstrando

que o tratamento possibilitou uma melhora clínica e microbiológica. Vários autores

hipotetizam que o efeito benéfico dos probióticos contra desafios patogênicos com

Salmonella pode ser explicado pela inibição do crescimento dos patógenos pela

diminuição do pH, produção de bacteriocinas e outras substâncias inibidoras de

crescimento de patógenos (FAYOL-MESSAOUDI et al., 2005; MAKRAS et al., 2006;

THEPPANGNA et al., 2006); entretanto, vários trabalhos in vivo sugerem que o efeito

benéfico é, na grande maioria das vezes, explicado por outros mecanismos como a

imunomodulação (NEUMANN et al., 1998; RODRIGUES et al., 2000; LIMA FILHO

et al., 2004; SILVA et al., 2004).

Também utilizando um sistema in vivo, WATERS et al. (2005) observaram que

em pássaros tratados com uma cultura contendo microrganismos do ceco e com uma

cultura comercial, a contagem de Salm. Typhimurium diminuía significantemente,

sendo que a cultura comercial proporcionou uma melhor proteção contra o patógeno.

Análises do ceco dos animais experimentais não acusaram diferenças entre os grupos,

no que se referia ao pH ou concentrações de acetato ou propionato. Entretanto, um

aumento nos níveis de butirato foi observado no ceco dos animais tratados com as duas

culturas, em relação ao controle. PROMSOPONE et al. (1998) também observaram

uma diminuição nos níveis de Salm. Typhimurium em aves tratadas com L. acidophilus,

E. faecium e anticorpos anti- Salm. Typhimurium. Essa diminuição nos níveis de Salm.

Typhimurium em animais tratados com L. acidophilus e lactose não foi observada por

JOHANNSEN et al. (2004), o que demonstra que o efeito benéfico não é oferecido por

todos os microrganismos e que, na grande maioria das vezes, esse efeito é espécie-

específico.

Trabalhando com uma associação de probióticos para cães, contendo L.

acidophilus, E. faecium e S. cerevisiae, MAIA et al. (2001), utilizando o modelo de

camundongos isentos de germes, observou que apenas o E. faecium promovia uma

proteção intestinal e uma menor mortalidade significativa, e que essa proteção não foi

devido a uma diminuição dos níveis intestinais de Salm. Typhimurium. Também

utilizando o mesmo enteropatógeno, RODRIGUES et al. (1996) observaram uma

proteção em camundongos isentos de germes e convencionais tratados com S. boulardii,

e que essa proteção estava intimamente relacionada com a imunomodulação promovida

pela levedura (RODRIGUES et al., 2000). SILVA et al. (1999) observaram um efeito

protetor de B. bifidum contra Salm. Typhimurium e correlacionaram esse efeito a uma

capacidade imunomoduladora desse probiótico e uma diminuição da resposta

inflamatória (SILVA et al., 2004). Resultados semelhantes, no que diz respeito a

proteção e efeito imunomodulador, foram encontrados por LIMA FILHO et al. (2004),

utilizando E. coli EMO em animais isentos de germes desafiados com Salmonella.

I.7 As vias de sinalização celular

Os diferentes estímulos externos são integrados, internamente, por vias de

sinalização celular. Desse modo, no nível dos enterócitos, duas grandes vias de

sinalização celular se distinguem: o fator de transcrição NF-κB e a via das MAP

quinases.

I.7.1 O fator de transcrição NF-κ

κκ

κB

O fator nuclear κB é um fator de transcrição que desempenha um papel crítico

na coordenação das respostas imune, inata e adaptativa, regulando a expressão gênica de

vários mediadores celulares (ZINGARELLI et al., 2003). Este fator foi descrito, pela

primeira vez, em 1986, por Sen e Baltimore, como um fator nuclear capaz de se ligar à

cadeia leve kappa (κ) de imunoglobulinas de linfócitos B, onde ele regula a transcrição

(SEN & BALTIMORE, 1986). Sabe-se, atualmente, que o NF-κB é um fator ubíquo,

expresso na maioria dos tipos celulares, e que é um dímero composto de membros da

família Relish (Rel). Este fator reconhece a sequência consenso 5’GGGRNNYYCC3’,

onde R é uma purina, Y, uma pirimidina e, N, qualquer base.

Nos vertebrados a família NF-κB/Rel engloba cinco sub-unidades, chamadas

p50, p52, p65 (RelA), c-Rel e RelB. Essas sub-unidades podem formar homodímeros ou

heterodímeros em várias combinações. A mais comum consiste de dois polipeptídeos de

50 kDa (p50) e 65 kDa (p65). Normalmente, o NF-κB se encontra no citoplasma, numa

forma fisicamente inativa, devido à associação a proteínas inibidoras conhecidas como

IκBs (Inhibitor κB proteins). Sete formas diferentes de IκBs são conhecidas: IκB-α,

IκB-β, IκB-γ, IκB-ε, Bcl-3, p100 e p105, sendo a IκB-α a mais conhecida e mais bem

estudada (ZINGARELLI, 2005). O NF-κB pode ser ativado por diversos sinais, como:

bactérias Gram-positivo e Gram-negativo, produtos bacterianos (endotoxinas,

peptideoglicanos, ácido lipoteicoico), vírus e componentes virais, protozoários,

citocinas (como TNF-α e IL-1β), radicais livres e agentes oxidantes (CAAMANO &

HUNTER, 2002).

Estudos in vitro, utilizando culturas celulares e, também, estudos in vivo,

utilizando modelos animais para estudo de sepse, mostraram que a ativação do NF-κB é

rápida e ocorre poucos minutos após o desafio microbiano (CAAMANO & HUNTER,

2002; SHEEHAN et al., 2002; SHEEHAN et al., 2003; ZINGARELLI et al., 2003). A

ativação desse fator de transcrição requer a fosforilação de seus inibidores fisiológicos,

isto é, as IκBs, em especial a IκB-α, em resíduos específicos de serina. Este evento de

fosforilação é mediado por um complexo de três proteínas quinases de IκB (IKKs):

IKK-α, IKK-β e IKK-γ, estas ativam a degradação subsequente de IκBs pelo

proteasoma 26S (ZINGARELLI et al., 2003). A degradação proteolítica das IκBs

permite que o NF-κB se transloque para o núcleo, onde ele regula a expressão de

centenas de genes que são importantes nas respostas imune e inflamatória

(ZINGARELLI et al., 2003) (Figura 6). Esses incluem genes para citocinas, moléculas

de adesão e quimioquinas, receptores requeridos para a adesão de neutrófilos e sua

transmigração nas paredes dos vasos sanguíneos, receptores envolvidos no

reconhecimento imune (como membros do complexo principal de histocompatibilidade)

e proteínas envolvidas na apresentação de antígenos. Ativando a expressão de vários

genes que interagem no processo de apoptose e regulam a sobrevivência e proliferação

celular, o NF-κB também modula a sobrevivência de neutrófilos e a proliferação e

diferenciação de linfócitos B e T no local de infecção, permitindo que essas células

desempenhem suas funções imunológicas e antimicrobianas (SEN & BALTIMORE,

1986; CAAMANO & HUNTER, 2002; ZINGARELLI et al., 2003).

Figura 6. Ativação do fator de transcrição NF-κB. O NF-κB é mantido no citoplasma

pelas proteínas inibidoras IκBs. Sob determinados estímulos, IκB é fosforilado,

ubiquitinado e degradado, e o NF-κB fica livre para migrar para o núcleo, onde induz a

transcrição de diversos genes dependentes de κB. NF-κB é, depois, inativado por novas

proteínas IκBs sintetizadas. (JOBIN & SARTOR, 2000).

Além do controle da resposta imune, o NF-κB estimula, também, a expressão de

enzimas cujos produtos contribuem para a patogênese da resposta inflamatória,

incluindo a ciclo-oxigenase-2, a forma induzível da óxido nítrico sintase, e uma

variedade de citocinas pro-inflamatórias. Vários desses mediadores inflamatórios, que

são regulados pelo NF-κB (como TNF-α e IL-1β) podem, por sua vez, ativar este fator

de transcrição, criando, dessa forma, um ciclo inflamatório que se auto-mantém, o que

aumenta a gravidade e a duração da resposta inflamatória (CAAMANO & HUNTER,

2002; ZINGARELLI et al., 2003). Do mesmo modo, como parte de um controle de

“feedback” negativo do processo inflamatório, o NF-κB induz a transcrição de seu

próprio inibidor (IκB-α), ativando um mecanismo que limita sua própria ativação.

Desse modo, é possível que exista um balanço dinâmico entre o mecanismo de defesa e

o papel inflamatório do NF-κB durante a infecção. Entretanto, esse balanço pode ser

desligado quando a infecção ativa uma resposta inflamatória sistêmica exagerada,

levando a uma ativação prolongada do NF-κB e inapropriada expressão de moléculas

tóxicas (CAAMANO & HUNTER, 2002; ZINGARELLI et al., 2003).

I.7.2 As MAP quinases

As MAP quinases são vias de sinalização fortemente conservadas ao longo da

evolução. As vias envolvendo as MAP quinases constituem as vias mais importantes da

transdução do sinal, da superfície celular ao núcleo. Elas estão implicadas na

proliferação, diferenciação e morte celular. São uma cascata onde cada membro ativa

outro por fosforilação dos resíduos treonina e/ou tirosina. Na extremidade da cadeia

encontramos as MAP quinases controle. A cascata clássica de MAP quinase consiste da

ativação de três proteínas quinases intracelulares, que se inicia quando o primeiro

membro, MAP quinase quinase quinase (MAPKKK), é ativada. MAPKKK é uma

proteína quinase que fosforila e ativa MAP quinase quinase (MAPKK), e essa ativação

é seguida pela ativação de uma MAP quinase específica (Figura 7). Dessa maneira, as

MAPKs ativam numerosas proteínas quinases, proteínas nucleares e fatores de

transcrição, levando a uma transdução do sinal. A ativação da cascata de MAPK é

rápida e possibilita às células responder a mudanças ambientais de uma maneira

regulada. Três grandes grupos de MAP quinases são reconhecidas em células de

mamíferos: ERK1/2 (extracellular signal regulated kinase), p38 e JNK (c-Jun NH

terminal kinase) (WAETZIG & SCHREIBER, 2003; CUSCHIERI & MAIER, 2005)

que, junto com NF-κB, controlam a resposta celular ao estresse e à inflamação.

Figura 7. Esquema mostrando a sinalização celular via cascata das MAP quinases

ERK, JNK e p38. (KATSOULIDIS et al., 2005).

I.7.2.1 ERK

ERK foi a primeira proteína da família das MAPKs identificada, apresentando-

se sob duas isoformas, ERK1 e ERK2, também conhecidas por p44 e p42 MAPK e,

normalmente, referida como ERK1/2 (p44/42). Esta proteína está envolvida,

primariamente, na proliferação, transformação e diferenciação (COWLEY et al., 1994;

HILL & TREISMAN, 1995; HUNTER, 1995; MARSHALL, 1995). Sua ativação é

iniciada pela fosforilação e ativação de Raf (MAPKKK), seguida da fosforilação e

ativação de MKK1/2 (MAPKK), que leva à ativação de ERK1/2 (MAPK) (KOLCH,

2000) (Figura 7). A ativação da MAPK ocorre pela fosforilação de treonina e tirosina

(202 e 204 da MAPK humana - ERK1 - ou 183 e 185 de rato - ERK2) na sequência

T*EY* de MEK (STURGILL et al., 1988; PAYNE et al., 1991). Raf é uma quinase

altamente conservada que é ativada pela proteína G, Ras. Ras é ativada pela interação

com o complexo Grb2-SOS, onde SOS catalisa a formação do complexo Ras-guanosina

trifosfato (GTP). Esse complexo se liga a Raf e o ativa de um modo dependente de

cálcio (CUSCHIERI et al., 2002). Essa cascata é ativada por diversos mitógenos,

incluindo EGF (fator de crescimento epidérmico, epidermal growth factor), fator de

crescimento derivado de plaquetas, tromboxano A, angiotensina II, TGF-β, insulina,

citocinas, hormônios e neurotransmissores (COBB et al., 1994). Adicionalmente, ERK

é ativado em resposta à endotoxina, estresse oxidativo, fator ativador de plaquetas

(PAF, “platelet activating factor”) e aderência por células do sistema imune inato como

monócitos e macrófagos.

I.7.2.2 p38

p38 MAPK, também conhecida como RH (ROUSE et al., 1994) ou CSBP (HAN

et al., 1994), é ativada em resposta a estresses fisiológicos, endotoxina, estresse

osmótico, exposição a raios ultravioleta, citocinas inflamatórias, LPS e fatores de

crescimento (FRESHNEY et al., 1994; HAN et al., 1994; LEE et al., 1994; ROUSE et

al., 1994; RAINGEAUD et al., 1995) e participa na cascata de sinalização, controlando

as respostas celulares a citocinas e estresses (FRESHNEY et al., 1994; HAN et al.,

1994; LEE et al., 1994; ROUSE et al., 1994). Cinco isoformas do grupo p38 já foram

identificadas: p38-α (SAPK2), p38-β, p38-β2, p38-γ (SAPK3) e p38-δ (CHEN et al.,

2001). A expressão dessas isoformas varia entre os tecidos. p38-α é altamente expressa

em leucócitos e médula óssea, p38-β é expresso no coração e no cérebro, e p38-γ é

expresso, predominantemente, nos músculos esqueléticos. A ativação de p38 é iniciada

pela fosforilação e ativação de MEKK4, TAK1, ASK-1, MLK3 (MAPKKK), seguida

da fosforilação e ativação de MKK 3,4,6 (MAPKK), que fosforila p38 (MAPK) nos

resíduos treonina 180 e tirosina 182 (CUSCHIERI & MAIER, 2005) (Figura 7).

Os principais substratos para p38 incluem proteína quinase 2 ativada por MAPK

(MAPKAP-K2) e MAPKAP-K3, que são serino-proteínas quinases conhecidas por

ativarem a proteína de choque térmico p27 (HSP-27, heat shock protein-27) (LARSEN

et al., 1997), que é uma proteína ligadora de actina que ajuda a reparar o citoesqueleto

de actina e inibe a apoptose, além de possuir algumas propriedades anti-inflamatórias.

p38 também fosforila e ativa os fatores de transcrição ATF-2 e SP1. ATF-2 é crítico na

ativação de várias proteínas inflamatórias (RAINGEAUD et al., 1995), enquanto SP1

parece ser crítico na transcrição da citocina anti-inflamatória IL-10 (MA et al., 2001).

I.7.2.3 JNK

A MAPK JNK foi originalmente identificada como uma proteína quinase de 54

kDa ativada por estresse e, por isso, é também conhecida por SAPK (stress-activated

protein kinase). Ela é ativada por vários estímulos que ativam p38, como LPS, TNF-α,

IL-1, estresse osmótico e radiação ultravioleta (DAVIS, 1999; ICHIJO, 1999; CHEN et

al., 2001; KYRIAKIS & AVARUCK, 2001). As proteínas quinases JNK são

codificadas por três genes: JNK1, JNK2 e JNK3. JNK 1 e 2 são expressos de forma

ubíqua, enquanto JNK3 é expresso apenas no cérebro, coração e testículos. Quando

ativada como um dímero, JNK se transloca para o núcleo onde regula a transcrição, via

seus efeitos no c-Jun, ATF-2 e outros fatores de transcrição. A ativação de JNK é

iniciada pela fosforilação e ativação de MEKK1-5, TAK1, ASK1 e MLK1-4

(MAPKKK), seguida da fosforilação e ativação de MKK4 e MKK7 (MAPKK), que

fosforila JNK (MAPK) na treonina 183 e tirosina 185 (CUSCHIERI & MAIER, 2005)

(Figura 7).

O JNK ativado fosforila ATF-2, Elk-1 e c-Jun. Desse modo, JNK desempenha

um importante papel na ativação do fator de transcrição AP-1, que é constituído de um

homodímero c-Jun ou um complexo c-Jun-c-Fos. Embora os efeitos de JNK não sejam

tão bem compreendidos como aqueles de ERK e p38, este desempenha um importante

papel na expressão de TNF e óxido nítrico sintase induzível em macrófagos e monócitos

(LAHTI et al., 2003). Adicionalmente, JNK desempenha um papel na proliferação de

células T, diferenciação e produção de IL-2.

Os sinais de estresse são transmitidos a essa cascata pelas pequenas proteínas

GTPases da família Rho (Rac, Rho, Cdc42). Rac1 e Cdc42 medeiam a estimulação de

MEKKs e MLKs. Alternativamente, MKK4-7 podem ser ativadas por uma via

independente de GTPases, via estimulação de um membro da família quinase centro

germinal (GCK, germinal center kinase) (KYRIAKIS, 1999).

I.8 Interleucina-8

Uma infecção ou um dano no organismo sempre resulta em inflamação, cuja

principal característica é o recrutamento de neutrófilos do sangue para o tecido onde

ocorreu o dano. Esse processo é direcionado por polipeptídeos quimiotáticos de 8 a 14

kDa, conhecidos como quimiocinas. Aproximadamente, 40 quimiocinas são conhecidas

hoje em dia (ZLOTNIK & YOSHIE, 2000). A IL-8 foi identificada em 1987 como um

novo tipo de citocina ativadora de neutrófilos e muitas de suas propriedades, incluindo

sua estrutura tri-dimensional, receptores, mecanismos de sinalização e funções

adicionais na angiogênese, progressão de tumores, mitose e remodelamento tissular, são

bem conhecidas (BAGGIOLINI & CLARK-LEWIS, 1992). Uma de suas principais

propriedades é a variação nos níveis de expressão. Normalmente, a IL-8 é fracamente

secretada em células não-induzidas, mas sua produção é rapidamente induzida por uma

grande variedade de estímulos, que abragem as citocinas pró-inflamatórias, como TNF-

α ou IL-1 (KASAHARA et al., 1992; BRASIER et al., 1998), bactérias (AIHARA et

al., 1997; HOBBIE et al., 1997), produtos virais (MURAYAMA et al., 1997;

MASTRONARDE et al., 1998) e estresse celular (DEFORGE et al., 1993; SHAPIRO

& DINARELLO, 1995; LEE et al., 1997; SONODA et al., 1997). Entretanto, alguns

estímulos, como IL-1 e TNF-α, aumentam a expressão de IL-8 em mais de 100 vezes

(KASAHARA et al., 1992; MURAYAMA et al., 1997; SONODA et al., 1997;

BRASIER et al., 1998), enquanto outros, como certas bactérias ou o EGF, causam um

aumento mais moderado, de 5 a 10 vezes, na secreção de IL-8 (AIHARA et al., 1997;

HOBBIE et al., 1997; HOLTMANN et al., 1999). Os níveis máximos de IL-8 são

gerados pela combinação de três diferentes mecanismos: (i) a desrepressão do fator de

transcrição, (ii) a ativação transcricional do gene pelo NF-κB e pela proteína quinase

JNK e, (iii) pela estabilização do mRNA pela MAPK p38 (HOFFMANN et al., 2002)

(Figura 8).

Em células não estimuladas, o fator de repressão do NF-κB (NRF, NF-κB

repressing factor) previne a transcrição de IL-8 (NOURBAKHSH et al., 2001). A

ligação de IL-1 ou TNF-α à superfície celular resulta na formação de complexos

receptores multiméricos que recrutam as proteínas adaptadoras TRAF6 e TRAF2,

respectivamente (MALININ et al., 1997; BAUD et al., 1999; NINOMIYA-TSUJI et al.,

1999). A oligomerização de TRAF provoca a ativação de MAPKKK, assim como

TAK1, NIK1 ou MEKK1, por mecanismos ainda desconhecidos (MALININ et al.,

1997; BAUD et al., 1999; NINOMIYA-TSUJI et al., 1999). TAK1 ou MEKK1 ativa

MKK7-JNK e a via IKK-β/-γ (CHU et al., 1999; HOLTMANN et al., 1999;

SCHMIDT-SUPPRIAN et al., 2000; HOLTMANN et al., 2001; NOURBAKHSH et al.,

2001). Os alvos diretos de JNK, assim como as proteínas ligadoras para o local de AP-

1, ainda não foram identificadas, enquanto IKK fosforila IκB, permitindo a liberação de

NF-κB (ZANDI & KARIN, 1999). A subunidade p65 do NF-κB transloca para o núcleo

e se liga ao local do promotor de IL-8 (CHEN et al., 1998; NOURBAKHSH et al.,

2001), onde interage com NRF e fatores de transcrição de AP-1 (HOLTMANN et al.,

1999; NOURBAKHSH et al., 2001). Modificações pós-transducionais, como

fosforilação dos domínios de transativação de AP-1 (WHITMARSH & DAVIS, 1996) e

NF-κB (SCHMITZ et al., 2001), recrutamento do coativador (CBP/p300) (VANDEN

BERGHE et al., 1999) e fosforilação ou acetilação de histonas (VANDEN BERGHE et

al., 1999; ASHBURNER et al., 2001; WEN & WU, 2001), resultam na remodelagem

da cromatina e numa forte transcrição de IL-8. Os elementos cis para AP-1, NF-κB e

NRF não podem ser alterados sem diminuírem JNK ou a transcrição de IL-8 mediada

por NF-κB (HOLTMANN et al., 1999; NOURBAKHSH et al., 2001), favorecendo um

modelo onde todas as proteínas envolvidas na transcrição interajam para formar um

complexo multi-protéico. Essa estrutura favorece um contato máximo com a RNA

polimerase II, que se auto-fosforila (NISSEN & YAMAMOTO, 2000). Os novos

transcritos sintetizados são rapidamente estabilizados pela MAPK p38, que tem como

alvo elementos ARE (elementos cis ricos em unidades de absorbância, “absorbance unit

(AU)-rich cis-elements”) no mRNA para IL-8, por um mecanismo ainda desconhecido

que pode envolver proteínas que se ligam ao ARE (WINZEN et al., 1999).

Figura 8. Esquema mostrando as vias de transdução do sinal essenciais para a regulação

do gene para IL-8. Após ativadas por diversos estímulos, as proteínas adaptadoras,

TRAF 6 e TRAF 2, ativam as vias das MAPKs, assim como fosforila IκB. O NF-κB

transloca-se para o núcleo onde, junto com a proteína AP-1, ativada pela MAPK JNK,

ativam a transcrição do gene para IL-8. O mRNA sintetizado é rapidamente estabilizado

pela MAPK p38. (HOFFMANN et al., 2002).

I.9 O modelo animal gnotobiótico

Uma importante estratégia experimental para estudar as relações que ocorrem

entre os microrganismos e seus hospedeiros é a utilização de um modelo animal isento

de germes (IG). Neste caso, deve-se, primeiro, definir as funções celulares na ausência

de microrganismos e, depois, avaliar os efeitos da adição de um único microrganismo

ou de uma população definida de microrganismos. A criação de animais sob condições

isentas de germes tem desenvolvido um campo científico para este propósito, a

gnotobiologia. O termo gnotobiótico foi proposto para designar o campo de

investigação interessado na criação de animais e plantas que estão livres de todos os

microrganismos, ou associados somente a espécies conhecidas (TREXLER, 1978). A

palavra gnotobiologia é derivada do grego onde “gnotos” e “biota” significam,

respectivamente, conhecida e vida (GUSTAFSSON, 1948). Os animais IG são, de um

certo modo, uma extensão do conceito de cultura pura, permitindo o estudo das

interações do hospedeiro com os microrganismos, sem a interferência dos organismos

associados (GORDON & PESTI, 1971; TREXLER, 1978).

A tecnologia da gnotobiologia depende da habilidade de controlar a composição

do ambiente no qual o organismo se desenvolve e funciona. O uso combinado de

organismos geneticamente manipulados e gnotobióticos têm o potencial de fornecer

novas e importantes informações sobre como uma bactéria afeta o desenvolvimento

normal, o estabelecimento e a manutenção do sistema imune associado à mucosa e as

funções célula-epitélio. Além do mais, a gnotobiologia pode ajudar no estudo sobre as

etiologias de doenças infecciosas, condições inflamatórias agudas e crônicas

(FEDORAK, 1995; SARTOR, 1995) e, possivelmente, em tumorigênese (GORBACH

& GOLDIN, 1990).

Desde a década de 1950, quando a produção de ratos e camundongos isentos de

germes foi estabelecida, o uso desse modelo animal nas ciências biomédicas vem se

expandindo. Entretanto, o estado IG dá origem a uma variedade de aspectos

fisiológicos, morfológicos e imunológicos diferentes daqueles encontrados na presença

da microbiota normal. Esses animais possuem um grande aumento do ceco, devido, em

grande parte, ao acúmulo de muco, que não é degradado na ausência dessas bactérias

(GUSTAFSSON et al., 1970). As vilosidades do intestino delgado são maiores e as

criptas são mais curtas e contêm menos células (ALAM et al., 1994). As diferenças

entre os animais convencionais e os animais isentos de germes são maiores nas regiões

do trato digestivo onde as densidades microbianas são normalmente maiores (FALK et

al., 1998).

Além das diferenças na arquitetura geral do trato digestivo, os animais IG

apresentam diferenças na motilidade intestinal, na diferenciação epitelial e na

imunologia. A distribuição espacial e temporal dos complexos motores que migram no

intestino delgado desses animais é mais restrita e mais lenta que em animais

convencionais (STRANDBERG et al., 1966). Estudos em camundongos IG mostraram

que a morfogênese de unidades de vilosidades da cripta pode ser completada na

ausência de microrganismos. Entretanto, comparações entre esses animais e os

convencionais revelaram que componentes da microbiota podem diferenciar linhagens

intestinais epiteliais durante a morfogênese (FALK et al., 1998).

Os camundongos IG representam um sistema experimental para simplificar o

fenômeno de resistência à colonização e os mecanismos envolvidos nesse fenômeno e,

também, para testar a capacidade de uma terapia à base de probióticos, para prevenir ou

impedir a colonização por patógenos. Muitos estudos mostram que os animais IG,

quando infectados por patógenos, podem, em alguns casos, se mostrar mais resistentes

e, em outros, mais susceptíveis àquele patógeno (VIEIRA et al., 1998).

O experimento gnotobiótico oferece considerável potencial como uma

ferramenta no estudo das relações hospedeiro-microrganismo porque: retrata o

hospedeiro quando livre de germes, ou quando modificado por microrganismos

conhecidos ou outras associações; permite o estudo da relação inter-microbiana dentro

do organismo do hospedeiro; pode ser usado no estudo de algum fator exógeno ou

endógeno, em que as ações isoladas de tais fatores, afetadas ou não pela microbiota

associada ao hospedeiro, seja de interesse (GORDON & PESTI, 1971). Esses modelos

são necessários, pois o estudo das interações entre linhagens bacterianas in vitro nem

sempre pode ser extrapolado para o que realmente ocorre, in vivo, no tubo digestivo de

animais gnotoxênicos (DUCLUZEAU, 1989). Esses animais são, também, uma

excelente ferramenta para avaliar as mudanças anatômicas, fisiológicas e imunológicas

induzidas pela microbiota autóctone e alóctone na mucosa intestinal (NICOLI, 1995).

Inúmeras tentativas vêm sendo feitas para sistematizar a terminologia usada em

gnotobiologia, mas nenhum sistema é universalmente aceito. A nomenclatura usada é

limitada a termos que, por uso geral, é familiar e compreendida pela maioria dos

pesquisadores da área. Animal isento de germes (IG), axênico ou “germ-free” (GF) é

um animal livre de toda forma demonstrável de vida, sendo criado e mantido

continuamente em isoladores. O animal gnotobiótico (GN) ou gnotoxênico é aquele

inicialmente axênico, mantido em isoladores, em associação intencional com um ou

mais tipos microbianos conhecidos. Animal heteroxênico é um animal inicialmente

isento de germes, mantido em isoladores, em associação com uma microbiota complexa

conhecida ou não e que não é da própria espécie. O animal holoxênico ou convencional

(CV) apresenta uma microbiota complexa e desconhecida na sua totalidade e é criado

sem precauções especiais desde o nascimento. O animal convencionalizado é o animal

ex-isento de germes que foi associado com uma microbiota normal de animais CV

(GORDON & PESTI, 1971; GUSTAFSSON, 1984; ANDREMONT et al., 1985).

Os equipamentos e procedimentos correntemente em uso que permitem a

manutenção do “status” gnotobiótico de animais experimentais incluem, em essência,

equipamentos para transferência do feto maduro do útero para o interior de isoladores

de plástico, estéreis, supridos com filtros de ar e luvas de borracha. Procedimentos de

rotina incluem criação e manutenção de animais gnotobióticos em isoladores,

esterilização de dietas, água, cama e outros utensílios, por autoclavação, irradiação ou

filtração, quando aplicável (DUCLUZEAU, 1989).

Como os animais gnotobióticos permitem o estudo e reprodução de mecanismos

de interação entre microrganismos e hospedeiro, que não observados por meio de

experimentos in vitro (GORDON & PESTI, 1971), eles constituem um excelente

modelo na avaliação do potencial probiótico de certos microrganismos (NICOLI &

RAIBAUD, 1990; NARDI et al., 1991; RODRIGUES et al., 1996; NEUMANN et al.,

1998; PERET FILHO et al., 1998; SILVA et al., 1999; LIMA FILHO et al., 2000;

RODRIGUES et al., 2000; MAIA et al., 2001).

I.10 O modelo de células T84

A linhagem celular epitelial T84 é derivada de um adenocarcinoma do cólon

humano e já foi extensivamente estudada, tanto morfologicamente quanto

funcionalmente (DHARMSATHAPHORN et al., 1984). Essas células crescem

confluentemente como uma monocamada, com a membrana basolateral atachada à

superfície da placa de cultura e, a membrana apical, com todas as suas microvilosidades,

em contato com o meio. As junções serreadas e os desmossomos já foram demonstrados

entre as células adjacentes, tornando este um excelente modelo, também, para o estudo

dessas junções. As monocamadas confluentes conduzem a um transporte vetorial de

eletrólitos, similar a um tecido epitelial do intestino. Isso faz dessa célula um excelente

modelo de estudo em processos de transporte de eletrólitos e sua regulação por

hormônios, peptídeos e neurotransmissores (DHARMSATHAPHORN et al., 1984).

Essa linhagem apresenta as características de enterócitos maduros, quando

cultivada sobre filtros: há a formação de uma monocamada de células polarizadas que

exprimem as junções celulares. A infecção desta célula por EPEC induz uma

diminuição das funções de barreira, seguida do desaparecimento da proteína ZO-1

(PHILPOTT et al., 1996), a formação de lesões do tipo A/E e a indução de certas vias

de sinalização, como a ativação de PKC e a fosforilação de MLCK (ROBERT et al.,

1997). Este modelo é, também, extremamente utilizado em infecções por Salm.

Typhimurium (MCCORMICK et al., 1993; MCCORMICK et al., 1995; MCCORMICK

et al., 1998; MA et al., 2004; HUANG et al., 2005; RAFFATELLU et al., 2005), E. coli

(CZERUCKA et al., 2000; CZERUCKA et al., 2001; DAHAN et al., 2002; DAHAN et

al., 2003; DALMASSO et al., 2006), Salm. dublin, Shigella dysenteriae, Yersinia

enterocolitica, Listeria monocytogenes (JUNG et al., 1995).

II - RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA

A salmonelose é um dos principais problemas de saúde pública e representa um

custo significativo para a sociedade em muitos países, em especial naqueles sub-

desenvolvidos e em desenvolvimento. Milhões de casos são relatados a cada ano, em

todo o mundo, e a doença resulta em milhares de mortes. Atualmente, mais de 2500

sorotipos de Salmonella são conhecidos e, os problemas relacionados a essa bactéria,

aumentaram significativamente, tanto em termos de incidência, quanto em termos de

gravidade da doença. Desde o começo da década de 1990, linhagens de Salmonella

resistentes a diversos antimicrobianos vêm aumentando e um dos grandes problemas

atuais da medicina é a alta resistência bacteriana aos antibióticos disponíveis no

mercado (WHO, 2007).

Poucos países relatam os gastos com essa doença. Nos Estados Unidos, uma

estimativa de 1,4 milhões de infecções por Salmonella não tifóide resulta em 168.000

consultas a hospitais, 15.000 internações e 580 mortes anuais. O custo associado com

salmoneloses é estimado em $ 3 bilhões anuais nos Estados Unidos. Na Dinamarca esse

custo é de $ 15,5 milhões por ano (WHO, 2007).

Nas últimas décadas, muita atenção tem sido dada à modulação da microbiota

intestinal normal por adjuvantes microbianos vivos, conhecidos como probióticos. O

interesse no uso destes agentes microbianos vivos com o propósito de beneficiar a saúde

do hospedeiro e prevenir ou tratar doenças tem sido explorado nesses últimos anos.

Esses organismos vêm sendo propostos como medicamentos para prevenção ou

tratamento de um grande número de desordens gastrintestinais. A grande vantagem da

terapia com os probióticos é a ausência de efeitos secundários, como a seleção de

bactérias resistentes. Os efeitos benéficos destes microrganismos são basicamente os

mesmos da microbiota normal do corpo humano. O que se faz, neste caso, é a

utilização, em grande quantidade, daqueles que possuem eficácia comprovada, podendo

ser constituintes normais da microbiota, como é o caso das bifidobactérias e dos

lactobacilos, ou não, como da levedura S. boulardii.

Atualmente, a única levedura disponível no mercado para uso como probiótico

em seres humanos, e com eficácia comprovada, é a S. boulardii (nome comercial

Floratil). Como é um medicamento patenteado pelos Laboratoires Biocodex (Paris,

França), e comercializado no Brasil pela MERCK S.A. (Rio de Janeiro, RJ), por um

valor elevado e, levando-se em consideração que os principais casos de diarréia ocorrem

em pessoas de baixa renda, seria de grande interesse a seleção de uma nova levedura de

origem nacional, a custos mais acessíveis. Além do mais, uma das principais

preocupações da Organização Mundial da Saúde é a implementação de novas terapias

que não atuem como uma forte pressão seletiva, propiciando a geração de patógenos

cada vez mais agressivos e resistentes.

Resultados prévios em nosso laboratório mostraram que a S. cerevisiae linhagem

UFMG 905 foi capaz de reduzir a ação de alguns enteropatógenos. Os resultados

mostraram que a levedura foi capaz de diminuir a mortalidade associada a um desafio

com Salm. Typhimurium (15% de sobrevivência no grupo controle contra 55% no

grupo tratado com a levedura) e os dados histopatológicos mostraram que a levedura

apresentou proteção contra o desafio oral com C. difficile em camundongos

gnotobióticos e preservação do fígado de animais convencionais tratados com a

levedura e desafiados com Salm. Typhimurium, sugerindo que a levedura diminui, in

vivo, a translocação deste patógeno (MARTINS et al., 2005a).

Uma vez evidenciada a proteção conferida pela levedura, testada em alguns

casos, é interesse do grupo prosseguir com os estudos, verificando os mecanismos pelos

quais a levedura exerceu seu efeito benéfico, comparar os resultados com aqueles já

descritos para a S. boulardii, e tentar esclarecer se os mecanismos descritos são os

mesmos para as duas leveduras ou se existem outros mecanismos de ação ainda não

descritos para os efeitos protetores das leveduras contra a ação de alguns patógenos.

Além do mais, para que possa ser liberada a utilização de um microrganismo para uso

como probiótico, são necessários dados científicos mostrando a proteção e os

mecanismos de ação, além de testes, in vivo, em cobaias, e ensaios clínicos.

Espera-se, com essa tese, dar mais um importante passo nesta linha de trabalho,

num projeto que integra a competência e a infra-estrutura da UFMG com aquelas de

uma reconhecida instituição estrangeira. Numa primeira etapa de experimentos,

realizada no Laboratório de Ecologia e Fisiologia de Microrganismos do Departamento

de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas

Gerais, mostrou-se o efeito, in vivo, da levedura no sistema imune do hospedeiro, pela

dosagem de imunoglobulinas, além da capacidade da levedura de proteger um ambiente

conturbado pelo enteropatógeno Salm. Typhimurium.

Na segunda etapa dos experimentos, realizados no laboratório da Dra. Dorota

Czerucka (Laboratoire de Gastroentérologie et Nutrition, Faculté de Médecine,

Université de Nice-Sophia Antipolis, Nice, France), mostrou-se alguns sinais

intracelulares induzidos pelo enteropatógeno, em cultura de células do cólon humano, e

o efeito de duas leveduras (S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905) nos diferentes sinais

induzidos pela ação da bactéria, como a indução de IL-8, NF-κB, ativação de proteínas

quinases ativadas por mitógenos (ERK1/2, p38, JNK), além do efeito na invasão celular

pela bactéria.

III - OBJETIVOS

III.1 Objetivo geral

Estudar os efeitos da levedura S. cerevisiae UFMG 905 no sistema imune de

camundongos NIH, isentos de germes e convencionais, e os efeitos de S. boulardii e S.

cerevisiae UFMG 905 na sinalização celular induzida em células T84, após infecção

pelo enteropatógeno S. Typhimurium.

III.2 Objetivos específicos

III.2.01 Determinar a translocação da levedura S. cerevisiae UFMG 905 para as

placas de Peyer, linfonodos mesentéricos, fígado e baço de camundongos NIH,

gnotobióticos e convencionais.

III.2.02 Determinar a translocação de Salm. Typhimurium para as placas de

Peyer, linfonodos mesentéricos, fígado e baço de camundongos NIH, gnotobióticos e

convencionais, na presença e na ausência da levedura S. cerevisiae UFMG 905.

III.2.03 Determinar e comparar o efeito da levedura S. cerevisiae UFMG 905 nas

células de Küpffer em camundongos NIH, gnotobióticos e convencionais, controles e

experimentais.

III.2.04 Determinar e comparar o efeito da levedura S. cerevisiae UFMG 905 no

sistema fagocítico de camundongos NIH, gnotobióticos e convencionais, controles e

experimentais, quando do desafio endovenoso com E. coli B

III.2.05 Determinar e comparar os níveis de imunoglobulinas secretadas do tipo

A (sIgA) total, IgA, IgG e IgM, no conteúdo intestinal e no soro de camundongos NIH,

gnotobióticos e convencionais, controles e experimentais, monoassociados ou tratados

com a levedura S. cerevisiae UFMG 905, respectivamente.

III.2.06 Verificar o efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na

integridade epitelial de células T84, após infecção pelo enteropatógeno Salm.

Typhimurium ATCC 14028.

III.2.07 Verificar o efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 sobre a

resposta inflamatória (produção de IL-8), em células T84, após infecção pelo

enteropatógeno Salm. Typhimurium 14028.

III.2.08 Mostrar o efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 nas vias de

sinalização celular (fosforilação de MAPKs), fosforilação de IκB e ativação de NF-κB,

envolvidas na indução de IL-8, em células T84, pela Salm. Typhimurium 14028.

III.2.09 Mostrar o efeito do sobrenadante de cultura de S. boulardii e S.

cerevisiae UFMG 905 nas vias de sinalização celular (fosforilação de MAPKs),

induzidas em células T84, pela Salm. Typhimurium 14028.

III.2.10 Verificar o efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 no

crescimento, adesão e invasão celular, em células T84, pelo enteropatógeno Salm.

Typhimurium 14028.

III.2.11 Verificar o efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 nas vias

Rac1 e Cdc42, envolvidas na invasão celular pela Salm. Typhimurium 14028

III.2.12 Verificar, utilizando técnicas de microscopia eletrônica e confocal, a

capacidade de Salm. Typhimurium 14028 de se ligar a S. boulardii e S. cerevisiae

UFMG 905.

III.2.13 Verificar o efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na ativação

da via AKT pela Salm. Typhimurium 14028.

IV - MATERIAIS E MÉTODOS

Parte I: Efeitos de S. cerevisiae UFMG 905 no sistema imune de camundongos

NIH, isentos de germes e convencionais

IV.1 Animais

IV.1.1 Animais isentos de germes (IG)

Foram utilizados camundongos IG de 21-23 dias de idade, de ambos os sexos, da

linhagem NIH (Taconic, Germantown, USA). Os animais foram propagados no biotério

de Gnotobiologia do Departamento de Bioquímica e Imunologia do Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, mantidos em isoladores

flexíveis do tipo Trexler (Standard Safety Equipment Company, McHenry, USA) e

manuseados de acordo com técnicas já estabelecidas (PLEASANTS, 1974) e adaptadas

às nossas condições (SILVA, 1986). Os animais receberam uma ração sólida (Nuvilab

Nuvital, Curitiba, PR) e água, esterilizados por calor úmido, ad libitum. Para os

experimentos, os camundongos foram mantidos em microisoladores (UNO

Roestvaststaal B.V., Zevenaar, The Netherlands), no biotério do Departamento de

Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas

Gerais. Um ciclo diurno/noturno de 12 h foi mantido no biotério.

IV.1.2 Animais convencionais (CV)

Foram utilizados animais CV da linhagem NIH, de 21-23 dias de idade, de

ambos os sexos. Estes animais foram obtidos a partir da segunda geração de animais

derivados por convencionalização dos animais IG e mantidos em biotério aberto, onde

receberam a mesma ração comercial (Nuvilab Nuvital, Curitiba, PR) e água ad libitum.

IV.1.3 Manejo dos animais

A manutenção e o uso dos animais nos experimentos foram conduzidos

respeitando o “Guide for the care and use of experimental animal”, da Canadian Council

on Animal Care, vol. 1, 1993. O projeto foi encaminhado ao Comitê de Ética para

Experimentação Animal da Universidade Federal de Minas Gerais (CETEA/UFMG) e

aprovado com a referência 075/04 em 03/11/2004. Os experimentos foram iniciados

somente após a autorização do CETEA.

IV.2. Microrganismos

IV.2.1 Linhagens bacterianas

A linhagem de Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Typhimurium, de

origem humana, que foi utilizada nos experimentos, pertence ao Laboratório de

Ecologia e Fisiologia de Microrganismos do Departamento de Microbiologia do

Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo

Horizonte, MG, Brasil.

A linhagem de Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Typhimurium ATCC

14028 foi cedida pelo Laboratório de Materiais de Referência, do Instituto Nacional de

Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ),

Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

A linhagem de Escherichia coli B

(K99

, F41), de origem humana, cedida pelo

Dr. Moon, é proveniente do National Animal Disease Laboratory (NADL), Iowa,

Estados Unidos.

As linhagens bacterianas foram conservadas em 0,2 ml de glicerina, esterilizada

por calor seco, com 1ml da cultura de 18h, crescida em caldo BHI (Brain Heart

Infusion, DIFCO, Detroit, USA), a 37ºC e estocadas a -86ºC.

Para todos os experimentos, as bactérias foram crescidas em caldo BHI ou LB

(Luria Bertani), a 37°C, durante 18 horas, sem agitação.

IV.2.2 Leveduras

A levedura S. cerevisiae linhagem UFMG 905, isolada da fermentação artesanal

de cachaça, foi gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa, do Laboratório

de Ecologia e Biotecnologia de Leveduras do Departamento de Microbiologia do

Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo

Horizonte, MG, Brasil. A linhagem foi identificada e classificada como S. cerevisiae,

segundo métodos descritos em KURTZMAN & FELL (1998) e YARROW et al.

(1998). A identidade da levedura foi confirmada utilizando o programa

YEASTCOMPARE (CIRIELLO & LACHANCE, 2001).

O probiótico S. boulardii foi gentilmente cedido por Laboratoires Biocodex,

Paris, França (Ultra-levure) e pelo Laboratório MERCK, Rio de Janeiro, RJ, Brasil

(Floratil).

A levedura S. cerevisiae “wild type” W303 (MATa/α trp1 ade2 his3 leu2 ura3)

foi gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Ieso de Miranda Castro, do Laboratório de

Biologia Celular e Molecular, do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas do

Departamento de Farmácia da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro

Preto.

As linhagens foram mantidas em meio contendo 1% de extrato de levedura, 2%

de peptona e 25% de glicerol e conservadas a -86°C, em tubos criogênicos de 2 ml.

Para todos os experimentos, as leveduras foram crescidas em meio YPG (1% de

extrato de levedura, 2% de peptona e 2% de glicose), a 37°C, por 24 h, sob agitação

constante (150 rpm) e concentradas para obter uma quantidade de 10

UFC/ml.

IV.3 Tratamento e desafio dos animais

IV.3.1 Tratamento

Quando tratados com a levedura (grupos experimentais), os camundongos dos

grupos IG receberam um inóculo único (monoassociação) de 10

células (0,1 ml de uma

cultura contendo 10

UFC/ml), por inoculação intragástrica, dez dias antes do desafio

com a bactéria patogênica. Os animais experimentais, dos grupos CV, receberam um

inóculo diário de 10

células por inoculação intragástrica, dez dias antes do desafio com

a bactéria patogênica. Os animais IG e CV, dos grupos controle, receberam inóculos de

água destilada estéril, de acordo com o esquema descrito para os respectivos grupos

experimentais, conforme descrito por RODRIGUES et al. (1996). Após o desafio com a

bactéria patogênica, apenas os animais CV do grupo experimental continuaram a

receber inóculos diários da levedura.

IV.3.2 Desafio

Os inóculos de Salm. Typhimurium foram preparados a partir da seleção de uma

colônia lisa crescida em ágar MacConkey (DIFCO, Detroit, USA) e, posteriormente

repicada para caldo BHI (ou LB) e mantida a 37ºC, por 18-24h. A cultura pura foi

submetida a diluições sucessivas em PBS (Phosphate Buffer Saline) esterilizado, para

obtenção da concentração de células desejada. A confirmação da viabilidade do inóculo

e as contagens bacterianas foram feitas em ágar MacConkey, após 24h, de incubação, a

37ºC. Os camundongos GN (controle e experimental) receberam inóculos de 0,1 ml,

contendo 10

UFC, por via oral, utilizando uma agulha de inoculação intragástrica. Para

os animais CV, foram realizados inóculos de 0,1 ml contendo 10

UFC.

Para determinação do experimento de clareamento, foram inoculados 0,2 ml de

uma suspensão contendo 10

UFC/ml em PBS de E. coli B

, crescida em caldo BHI, a

37ºC, por 18-24 h, por injeção, na veia da cauda do camundongo.

IV.4 Determinação da translocação de S. cerevisiae UFMG 905 para as placas de

Peyer (PP), linfonodos mesentéricos (LM), baço e fígado de camundongos

gnotobióticos e convencionais

Para determinação da translocação da levedura S. cerevisiae UFMG 905 para as

placas de Peyer, linfonodos mesentéricos, baço e fígado, grupos de cinco camundongos

GN e CV foram monoassociados, ou tratados, durante 10 dias, com a levedura. Ao final

desse período, eles foram sacrificados, por deslocamento cervical, e as PP, os LM, o

baço e o fígado foram coletados sob condições assépticas em uma capela de fluxo

laminar (VECCO, Campinas, SP). Após a coleta, os órgãos foram imediatamente

pesados, triturados com maceradores, homogeneizados e submetidos a diluições

decimais em PBS estéril. Alíquotas de 100 µl das diluições adequadas foram

incorporadas em ágar Sabouraud (DIFCO, Detroit, USA) para os grupos GN, ou ágar

Sabouraud contendo 0,1% de cloranfenicol, para os grupos CV, e incubadas a 37ºC, por

48h, para enumeração das leveduras.

IV.5 Determinação do efeito de S. cerevisiae UFMG 905 na translocação de Salm.

Typhimurium em camundongos gnotobióticos e convencionais

Para determinação do efeito de S. cerevisiae UFMG 905 na translocação de

Salm. Typhimurium para as PP, LM, baço e fígado, grupos de três a cinco camundongos

GN e CV foram monoassociados, ou tratados, durante 10 dias, com a levedura, ao final

dos quais foram desafiados com Salm. Typhimurium (3 dias para os animais GN e 5 e

10 dias para os animais CV). Ao fim do período de desafio, os animais foram

sacrificados por deslocamento cervical e as PP, os LM, o baço e o fígado foram

coletados sob condições assépticas em uma capela de fluxo laminar (VECCO). Após a

coleta, os órgãos foram imediatamente pesados, triturados com maceradores,

homogeneizados e submetidos a diluições decimais em PBS estéril. Alíquotas de 100 µl

das diluições foram semeadas em ágar MacConkey (DIFCO) e incubadas a 37ºC, por

24h, para a enumeração bacteriana.

IV.6 Efeito de S. cerevisiae UFMG 905 na quantidade de células de Küpffer em

camundongos gnotobióticos

Para determinar a quantidade de células de Küpffer em camundongos, grupos de

12 camundognos GN foi monoassociado, durante 10 dias, com a levedura. Um grupo de

12 animais IG foi utilizado como controle. Ao final do período, os animais foram

sacrificados por deslocamento cervical. Os fígados foram retirados e fixados em

formaldeído a 4%, durante 24h, e processados para a inclusão e microtomia em

parafina. Foram executados cortes de 3 a 5 micrômetros de espessura, posteriormente

corados pela Hematoxilina-Eosina (HE). Para o exame morfométrico, foram obtidas

imagens utilizando uma microcâmera JVC TK-1270/RGB e o programa analisador de

imagens KS 300 Software da Kontron Elektronick/Carl Zeiss image analyzer

(Oberkohen, Germany). As células de Küpffer foram contadas e expressas por cem

hepatócitos, em 12 campos diferentes.

IV.7 Determinação do efeito de S. cerevisiae UFMG 905 no clareamento de E.

coli B

em camundongos gnotobióticos

Para determinação do efeito de S. cerevisiae UFMG 905 no clareamento de E.

coli B

da circulação sistêmica de camundongos GN e IG, grupos de 11 animais foram

monoassociados com a levedura ou receberam o mesmo inóculo de água estéril,

respectivamente. Ao final de dez dias, os animais dos grupos controle e experimental

foram inoculados com 200 µl da bactéria (E. coli B

), diluída em PBS (10

UFC/ml),

pela veia caudal, conforme descrito por NEUMANN et al. (1998). Nos tempos 0, 15,

30, 60 e 90 min, após a injeção, amostras de sangue foram coletadas pelo plexo retro-

orbital, submetidas a diluições seriadas em PBS estéril, plaqueadas em ágar MacConkey

(DIFCO) e incubadas a 37ºC, por 24h. Os resultados foram expressos como

porcentagem do número de células bacterianas viáveis por ml de sangue em relação ao

tempo 0 (100%).

IV.8 Determinação do efeito de S. cerevisiae UFMG 905 no nível de

imunoglobulina secretada do tipo A (sIgA) total no conteúdo intestinal de

camundongos gnotobióticos e convencionais

Para determinação do efeito de S. cerevisiae UFMG 905 no nível de

imunoglobulina secretada do tipo A (sIgA) total, no conteúdo intestinal dos

camundongos GN e CV dos grupos controle e experimental, um grupo de cinco

camundongos controles e um grupo de cinco camundongos experimentais GN e CV

foram sacrificados, por deslocamento cervical, 10 dias após a monoassociação ou

tratamento com a levedura, e o intestino delgado foi removido, pelo corte nas junções

gastroduodenal e ileocecal. O conteúdo foi retirado, pesado e lavado com salina

fosfatada, pH 7,2, na proporção de 500 mg do conteúdo / 2,0 ml de PBS. Depois de

centrifugado a 2000 g, por 30 min, a 4°C, o sobrenadante foi recolhido e congelado a -

86°C, para posterior dosagem de imunoglobulinas. A determinação dos nível de sIgA

total foi realizada pelo método de ELISA. O procedimento de coleta do conteúdo

intestinal foi uma modificação do método descrito por NADER DE MACIAS et al.

(1992) e modificado por RODRIGUES (1995). As amostras de fluido intestinal foram

inicialmente diluídas 1:10 em PBS e, em seguida, diluições foram realizadas e

adicionadas, em triplicata, nos poços das placas de ELISA. A sIgA total do fluido

intestinal foi determinada utilizando anticorpos anti-IgA de camundongos

desenvolvidos em cabra (M-8769, SIGMA Chemical Co., St. Louis, USA), para

revestimento das placas e, anticorpos desenvolvidos em cabra, anti-IgA de

camundongo, conjugados com peroxidase (A-4789, SIGMA Chemical Co., St. Louis,

USA) para detecção. A concentração de sIgA total foi determinada utilizando um

padrão de IgA purificado (0106-01, Southern Biotechnology Associates, Birmingham,

USA). A leitura foi feita, a 492 nm, em um leitor de placas (ELISA READER, 2550,

BioRad Laboratories, Hercules, USA).

IV.9 Determinação do efeito de S. cerevisiae UFMG 905 nos níveis de IgA, IgG e

IgM totais no conteúdo intestinal e no soro de camundongos gnotobióticos e

convencionais

Para determinação do efeito de S. cerevisiae UFMG 905 nos níveis de IgA, IgG

e IgM totais no conteúdo intestinal e no soro de camundongos GN e CV dos grupos

controle e experimental, um grupo de cinco camundongos controles e um grupo de

cinco camundongos experimentais, GN e CV, foram monoassociados ou tratados com a

levedura. Ao final de 10 dias, os animais foram anestesiados com éter e o sangue

retirado do plexo axilar e, a seguir, centrifugado. O soro foi recuperado e congelado a -

86°C para posterior dosagem das imunoglobulinas. Ao final da coleta de sangue, os

animais foram sacrificados por deslocamento cervical e o intestino delgado foi

removido pelo corte nas junções gastroduodenal e ileocecal e o conteúdo foi retirado,

processado e armazenado conforme descrito no item IV.8. A determinação dos níveis de

IgA, IgG e IgM totais foi realizada pelo método de ELISA de captura. Para

revestimento das placas, foram utilizados anticorpos anti-IgA (M-8769, SIGMA

Chemical Co., St. Louis, USA), anti-IgG (M-5899, SIGMA Chemical Co., St. Louis,

USA) e anti-IgM (M-6274, SIGMA Chemical Co., St. Louis, USA) de camundongo,

desenvolvidos em cabra. Utilizou-se os anticorpos, desenvolvidos em cabra, conjugados

com a peroxidase, anti-IgA (A-4789, SIGMA Chemical Co., St. Louis, USA), anti-IgG

(A-3673, SIGMA Chemical Co., St. Louis, MO, USA) e anti-IgM (A-8786, SIGMA

Chemical Co., St. Louis, USA) de camundongo para detecção das IgA, IgG e IgM. As

unidades de densidade óptica foram determinadas, a 492 nm, em um leitor de placas

(ELISA READER, 2550, BioRad Laboratories, Hercules, USA).

IV.10 Exame anatomopatológico

Amostras das vísceras (baço e fígado) e de porções do trato digestivo (íleo, ceco

e cólon) dos camundongos GN e CV, controles e experimentais, sacrificados no final

dos experimentos, foram submetidos a exame anatomopatológico. As amostras foram

fixadas em formaldeído 4% e processadas para a inclusão e microtomia em parafina.

Foram executados cortes de 3 a 5 micrômetros de espessura, posteriormente corados

pela Hematoxilina-Eosina HE. Para o exame morfométrico, foram obtidas imagens

utilizando uma microcâmera JVC TK-1270/RGB e o programa analisador de imagens

KS 300 Software da Kontron Elektronick/Carl Zeiss image analyzer (Oberkohen,

Germany). Os fragmentos das amostras codificadas foram observados seqüencialmente,

por uma mesma patologista (Profa. Dra. Rosa Maria Esteve Arantes, do Laboratório de

Neuro-Imuno Patologia Experimental, NIPE, do Departamento de Patologia Geral do

Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais), que não

teve acesso ao significado dos códigos. As amostras foram decodificadas somente após

o laudo ter sido emitido pela patologista.

Parte II: Efeitos de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na sinalização celular

induzida, em células T84, após infecção pelo enteropatógeno Salm. Typhimurium

14028

IV.11 Culturas celulares

A linhagem celular T84, do cólon humano, foi obtida da European Collection of

Animal Cell Culture (Salisbury, England) e cultivada em frascos de 75 cm

, a 37°C, em

atmosfera úmida contendo 5% de CO

, em meio completo, constituído dos meios

Dulbecco-Vogt modified Eagle e Ham’s F-12 (DMEM-F12) (SIGMA, Saint Quentin

Fallavier, France), na proporção de 1:1, suplementado com glutamina, 5% de soro fetal

bovino (HYCLONE, Bezons, France), 50 µg/ml de penicilina e 50 µg/ml de

estreptomicina (SIGMA, Saint Quentin Fallavier, France), conforme descrito por

CZERUCKA et al. (2000). O meio foi trocado a cada 48 horas e, após confluência de

aproxidamente 80-90%, as células foram tripsinizadas com uma solução de 0,2% de

tripsina (SIGMA) contendo 0,5 mM de EDTA e, cultivadas em placas de 6 poços para

os experimentos de infecção.

IV.12 Tratamento das monocamadas de células T84 com as leveduras S. boulardii

ou S. cerevisiae UFMG 905 e infecção com Salm. Typhimurium 14028

As células cultivadas nas placas de 6 poços, após atingirem 80-90% de

confluência, foram lavadas três vezes, com PBS estéril, a 37°C, e o meio foi trocado por

DMEM-F12, contendo glutamina e 0,1% de soro albumina bovina (BSA), desprovido

de antibióticos e soro fetal bovino, antes da infecção (“overnight”). Para as células pré-

tratadas “overnight” com S. boulardii ou S. cerevisiae UFMG 905, uma alíquota

contendo 10

UFC/poço (aproximadamente 10 leveduras por célula) de levedura foi

adicionada à superfície apical da monocamada de células T84 e incubadas a 37ºC, em

uma atmosfera de 5% de CO

. No momento da infecção, 10

UFC de Salm.

Typhimurium 14028/poço (aproximadamente 100 bactérias por célula) foi adicionada à

superfície apical da monocamada de células T84 e incubadas a 37ºC, em uma atmosfera

de 5% de CO

. Quando o tratamento foi feito no mesmo momento da infecção, a mesma

quantidade de leveduras (10

UFC/poço) e de bactérias (10

UFC/poço) foi adicionada,

conforme descrito acima. Esta proporção de leveduras não modifica a viabilidade das

células intestinais (CZERUCKA et al., 1989b).

IV.13 Medidas da resistência elétrica transepitelial (RTE), em células T84,

infectadas com Salm. Typhimurium 14028, pré- e co-incubadas (ou não), com S.

boulardii ou S. cerevisiae UFMG 905

Para o experimento de RTE, as células foram crescidas em membranas de filtro

porosas de 4,6 cm

(poros de 0.4 µm; Nunc, Poly Labo Paul Block & Cia, Strasbourg,

France). Nessas condições, uma elevada RTE é alcançada ao fim de 20-30 dias. As

membranas foram divididas em 8 grupos: grupo 1 (somente as células T84), grupo 2

(células infectadas com Salm. Typhimurium 14028, por 8 h), grupo 3 (células infectadas

com Salm. Typhimurium 14028 e S. boulardii ao mesmo tempo, durante 8 h), grupo 4

(células pré-tratadas com S. boulardii, “overnight”, e infectadas com Salm.

Typhimurium 14028, por 8 h), grupo 5 (células apenas tratadas com S. boulardii), grupo

6 (células infectadas com Salm. Typhimurium 14028 e S. cerevisiae UFMG 905 ao

mesmo tempo, durante 8 h), grupo 7 (células pré-tratadas com S. cerevisiae UFMG 905,

“overnight”, e infectadas com Salm. Typhimurium 14028, por 8 h) e grupo 8 (células

apenas tratadas com S. cerevisiae UFMG 905). A RTE foi medida com o equipamento

Millicell-ERS (Millipore, Molsheim,

France), conforme o método descrito por FINLAY

& FALKOW (1990), durante um período de 8h, com intervalos de 2h, conforme

descrito por CZERUCKA et al. (2000).

IV.14 Efeito de S. boulardii ou S. cerevisiae UFMG 905 na resposta inflamatória,

em células T84, após infecção por Salm. Typhimurium 14028

IV.14.1 Dosagem de IL-8

Para avaliar a expressão da citocina pró-inflamatória IL-8, foram utilizadas

células com 80-90% de confluência, em placas de 6 poços. Após infecção com Salm.

Typhimurium 14028, durante 3 horas, na presença ou na ausência de S. boulardii ou S.

cerevisiae UFMG 905, pré- ou co-incubadas, o sobrenadante foi recuperado,

centrifugado por 10 minutos, a 10.000 g, a 4°C, e a citocina foi dosada, pelo método

ELISA, no sobrenadante da cultura celular utilizando-se o kit Quantikine human IL-8

immunoassay (R&D System, Abington, United Kingdom), conforme descrito em

DAHAN et al., 2003.

IV.14.2 Expressão de IL-8 por PCR em tempo real (“real time PCR”)

Para avaliar a expressão do mRNA para IL-8, foram utilizadas células com 80-

90% de confluência em placas de 6 poços. Após infecção com Salm. Typhimurium

14028, durante 1h, 2h e 3h, na presença, ou não, de S. boulardii, pré- ou co-incubada, o

sobrenadante foi retirado e as células lavadas três vezes com PBS estéril, a 4°C. As

células foram rapidamente congeladas em nitrogênio líquido e mantidas a -86°C até o

momento de extração do RNA total. A extração do RNA total foi realizada nas células

T84 pelo método do tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio (CHOMCZYNSKI &

SACCHI, 1987). O RNA foi convertido em cDNA, utilizando-se oligo (dT)

em 20 µl

de solução de reação para transcrição reversa (Fermentas) e depois usada para a reação

em cadeia da polimerase. O cDNA foi amplificado utilizando-se o kit SYBR Green para

PCR (Eurogentec), em placas ópticas de microtitulação de 96 poços (Applied

Biosystems, Courtaboeuf, France), em um sistema de detecção ABI PRISM 7000

Sequence Detection System (Applied Biosystems), de acordo com as instruções do

fabricante. Os sinais de fluorescência foram gerados a cada ciclo de PCR, pela

incorporação direta do SYBR Green na dupla fita de DNA, para gerar as informações

do PCR quantitativo em tempo real. As condições do PCR foram: 10 min a 94°C e 40

ciclos de 30s a 94°C, 30s a 60°C e 30s a 72°C para cada amplificação, num volume

final de 20 µl. Os primers usados foram: IL-8 senso, 5’-

AAGGAACCATCTCACTGTGTGTAAAC-3’; IL-8 antisenso, 5’-

ATCAGGAAGGCTGCCAAGAC-3’. O gene de referência RPLP0 (que codifica a

fosfoproteína ribossomal ácida humana P0) foi usado para todos os cálculos, uma vez

que ele não apresenta mudança na sua expressão durante o tratamento das células. Os

valores foram expressos como “fold increased” em relação ao controle negativo.

IV.15 Efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 nas vias de sinalização

celular induzidas, em células T84, infectadas por Salm. Typhimurium 14028

Para avaliar os diferentes sinais induzidos nas células T84 infectadas pela Salm.

Typhimurium 14028 e os possíveis efeitos das leveduras S. boulardii ou S. cerevisiae

UFMG 905 nesses sinais, utilizou-se a técnica de “Western Blotting”. As células foram

tratadas e/ou infectadas conforme descrito no item IV.12 e foi avaliado o efeito das

leveduras pré- e co-incubadas em células infectadas por Salm. Typhimurium 14028. Em

tempos pré-determinados (1h, 2h e 3h após a infecção), as células infectadas foram

lavadas com PBS estéril e solubilizadas em tampão de lise (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5;

150 mM de NaCl; 1% de Nonidet P-40 [NP-40]; 2 mM de Na

; 1 mM de EDTA; 1

µM de aprotinina; 25 µM de leupeptina; 1 µM de pepstatina; 1 mM de AEBSF; 10 mM

de NaF; 5 mM de sódio PP

; 10 mM de β-glicerofosfato). O lisado foi solubilizado por

30 min, a 4ºC, e depois centrifugado a 14.000 g, por 20 min, a 4ºC. O conteúdo de

proteína presente no sobrenadante foi determinado utilizando-se reagentes da Bio-Rad

DC (“Detergent Compatible”). O “Western Blotting” foi realizado de acordo com o

método descrito por BOCCIARDI et al. (1997). Cinqüenta µg de cada amostra foram

aplicados e corridos em SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil

sulfato de sódio), utilizando 12% de poliacrilamida. As proteínas foram transferidas

para uma membrana de difluorido de polivinilideno (PVPD) (Hybond-P; Amersham) e

incubadas, “overnight”, a 4ºC, com anticorpos anti-cpp32 (Caspase-3/CPP32, BD

Transduction Laboratories), anti-fosfo-ERK1/2 [Phospho-p44/42 Map Kinase

(Thr202/Tyr204) Antibody, Cell Signaling Technology, Inc.], anti-fosfo-p38 [Phospho-

p38 MAP Kinase (Thr180/Tyr182) Antibody, Cell Signaling Technology, Inc.], anti-

fosfo-JNK [Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) Antibody, Cell Signaling

Technology, Inc.],

ou anti-fosfo-IκB-α [Phospho-IκB-α (Ser32/36) (5A5) Mouse mAb,

Cell Signaling Technology, Inc.], anti-fosfo-Akt [Phospho-Akt (Ser473) Antibody, Cell

Signaling Technology, Inc.]; anti-ERK2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,

Califórnia, USA),

anti-p38 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Califórnia, USA),

anti-JNK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Califórnia, USA), anti-IκB-α (Santa

Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Califórnia, USA), seguidos de uma incubação com o

anticorpo secundário conjugado com peroxidase apropriado (Anti-rabbit IgG, HRP-

linked Antibody, Cell Signaling Technology, Inc. / Anti-mouse IgG, HRP-linked

Antibody, Cell Signaling Technology, Inc.). A presença de anticorpos foi revelada

utilizando-se um sistema de detecção por quimioluminescência ECL (Amersham

Hyperfilms, Orsay, France), conforme recomendações do fabricante, como descrito por

DAHAN et al. (2003).

IV.16 Efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na ativação de NF-κ

κκ

κB,

induzido por Salm. Typhimurium 14028

Para avaliar a ativação de NF-κB induzido nas células T84 pela Salm.

Typhimurium 14028, e os possíveis efeitos das leveduras S. boulardii ou S. cerevisiae

UFMG 905 nessa ativação, utilizou-se a técnica de Ensaio de Mudança de Mobilidade

Eletroforética (“Electrophoretic Mobility Shift Assay” - EMSA). As células foram

tratadas e/ou infectadas conforme descrito no item IV.12 e foi avaliado o efeito das

leveduras pré- e co-incubadas com células infectadas com Salm. Typhimurium 14028.

Em tempos pré-determinados (1h, 2h e 3h após a infecção), as células infectadas foram

lavadas com PBS estéril e suspendidas em 25 µl de tampão TOTEX (20 mM de HEPES

pH 7,9, 350 mM de NaCl, 20% de glicerol, 1% de NP40, 1 mM de MgCl

, 0,5 mM de

EDTA, 0,1 mM de EGTA, 1 mM de DTT, 1 mM de PMSF e 2 µg/ml de aprotinina),

para preparação dos extratos celulares totais. Amostras de 10 µg de proteínas foram

incubadas por 10 min, a 4°C, com 2 µl de poli-dIdC 15 µg/ml, 5 µl do tampão de

ligação (NF5X) e 12 µl de H

O. Logo após, adicionou-se a sonda marcada e as amostras

foram incubadas por 25 min, a 25ºC, com oligonucleotídeos de dupla fita (marcados

com

P) contendo os sítios de ligação para κB (5’-GATCCAAGGGGACTTTCCATG-

3’). A especificidade do complexo foi analisada pela incubação com excesso de

oligonucleotídeos de κB não marcados. Os complexos foram separados por eletroforese

em gel de poliacrilamida não desnaturante a 6%, em TBE 0,5X. Os géis foram secos e

radiografados (Amersham Hyperfilms, Orsay, France).

IV.17 Efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 no crescimento, adesão e

invasão celular induzidos, em células T84, infectadas por Salm. Typhimurium

14028

Para avaliar o efeito de S. boulardii ou S. cerevisiae UFMG 905 na adesão e

invasão celular, as células T84 foram tratadas e/ou infectadas conforme descrito no item

IV.12 e foi avaliado o efeito das leveduras pré- e co-incubadas em células infectadas

com Salm. Typhimurium 14028, após 3h. A adesão bacteriana às células T84 foi

quantificada usando-se o método de diluição em placa (ROSENSHINE et al., 1992). Ao

final da infecção, as células foram tripsinizadas e lisadas em água contendo 0,1% de

BSA. Os lisados celulares, contendo bactérias associadas às células, correspondem às

bactérias aderentes e intracelulares. Para a determinação da invasão, após as lavagens

com PBS, as monocamadas foram incubadas, por 1h, em meio novo (DMEM-F12)

contendo 100 µg/ml de gentamicina. Uma vez que a gentamicina não se concentra nas

células epiteliais, as bactérias intracelulares sobreviveram à incubação, enquanto as

bactérias aderidas e dispersas no meio foram mortas (FALKOW et al., 1987). As

monocamadas foram lavadas com PBS estéril e as células epiteliais com as bactérias

intracelulares foram separadas, utilizando-se tripsina, e lisadas, conforme descrito por

ROSENSHINE et al. (1992). As células foram diluídas, plaqueadas e as contagens

bacterianas foram realizadas em ágar MacConkey, após 24h, a 37°C. A porcentagem de

invasão celular foi calculada do seguinte modo: porcentagem de invasão = (numero de

bactérias intracelulares) / [número de bactérias associadas às células (aderentes e

intracelulares)], conforme descrito por CZERUCKA et al. (2000).

IV.18 Efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 nas vias Rac e Cdc42

induzidas, em células T84, infectadas por Salm. Typhimurium 14028

O método de “Pull-Down” para ativação de proteínas Rho, utilizando GST-

PAK

70–106

, foi previamente descrito por MANSER et al. (1998) e REN et al. (1999). As

células cultivadas nas placas de 60 mm, após atingirem 80-90% de confluência, foram

lavadas três vezes com PBS estéril, a 37°C, e o meio trocado por DMEM-F12 contendo

glutamina e 0,1% de BSA, desprovido de antibióticos e soro fetal bovino, antes da

infecção (“overnight”). As infecções com Salm. Typhimurium 14028 foram conduzidas,

nesse meio, com 3 x 10

bactérias, na presença (ou não) de 3 x 10

leveduras (S.

boulardii ou S. cerevisiae UFMG 905), “overnight”. Em tempos indicados, as

monocamadas foram lavadas com PBS estéril, a 4°C, e lisadas com tampão de lise (25

mM de Tris-HCl, pH 7.5; 150 mM de NaCl; 5 mM de MgCl

; 0,5% de Triton X100; 4%

de glicerol; 10 mM de NaF) suplementado, no momento de extração, com 1 mM de

PMSF, 2 mM de Na

, 2 mM de DTT e 20 mM β- glicerofosfato. Os lisados foram

centrifugados, durante 10 min, a 10.000 g, a 4°C. Uma alíquota de 50 µg foi coletada

(proteína Rho total) e misturada com o tampão de Laemmli. O restante de cada lisado

foi incubado com 30 µg de GST-PAK

70–106

ligados a pérolas de vidro de agarose-

glutationa (Sigma-Aldrich), durante 45 min, a 4°C, sob agitação. As pérolas de vidro

foram lavadas duas vezes com 1 ml de tampão de lise. As pérolas foram misturadas com

30 µl do tampão de Laemmli e as proteínas foram aplicadas em SDS-PAGE utilizando-

se 12% de poliacrilamida e transferidas para uma membrana de PVPD (Hybond-P;

Amersham Biosciences). Os “imunoblottings” foram realizados utilizando-se anticorpos

monoclonais, incubados a 4°C, “overnight”, na diluição de 1:250 para o anticorpo anti-

Cdc42 (clone 44; Transduction Laboratories), ou 1h à temperatura ambiente, na diluição

de 1:1000, para anti-Rac1 (clone 102; Transduction Laboratories), seguidos de uma

incubação com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase apropriado

(Amersham Biosciences) (DOYE et al., 2006). Os imunocomplexos foram visualizados

utilizando-se o sistema de ECL, conforme descrito anteriormente (IV.15).

IV.19 Análise da capacidade de Salm. Typhimurium 14028 de se ligar às células

de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905

Para avaliar a capacidade de Salm. Typhimurium 14028 de se ligar às células de

S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905, as células T84 foram cultivadas em placas de

35 mm, tratadas “overnight” e/ou infectadas, conforme descrito no item IV.12 e, após

3h de infecção, as células foram fixadas em glutaraldeído à temperatura ambiente, por

1h, enviadas ao Centro de Microscopia da Université de Nice-Sophia Antipolis, Nice,

França, para fotografia em microscopia de varredura (6340F; Jeol), utilizando-se técnica

padrão (ARNOLD & BOOR, 1986). As amostras foram fotografadas e retornadas para

análise.

Para o experimento de microscopia confocal, às placas de 6 poços, foram

adicionadas lamínulas, previamente esterilizadas e tratadas, por 30min, com 1ml de uma

solução de gelatina (Sigma-Aldrich) a 0,2%. Após o excesso de gelatina ser retirado, as

células foram cultivadas até se obter 50% de confluência. As células foram tratadas e/ou

infectadas, conforme descrito no item IV.12, e foi avaliado o efeito da pré-incubação da

levedura em células infectadas com Salm. Typhimurium 14028 transformada com o

plasmídeo pMW221 - Ds-Red (que deixa a bactéria corada de vermelho).

Para a transformação da Salm. Typhimurium 14028, utilizou-se o mesmo

protocolo para marcação de E. coli, conforme descrito por HANAHAN et al. (1991). A

inserção do plasmídeo na bactéria foi feita por método químico utilizando o CaCl

. A

Salm. Typhimurium 14028 DsRed marcada foi obtida pela transformação da bactéria

com o plasmídeo pMW221 (gentilmente cedido pelo Dr. Artur Altenhoefer, University

of Wuerzburg), um derivado do plasmídeo colE1, que expressa uma proteína DsRed

variante e confere resistência a ampicilina. A presença do plasmídeo foi determinada

pela contagem de UFCs em ágar LB suplementado com 75 µg/ml de ampicilina,

conforme descrito por LEMONNIER et al. (2008).

Para marcação da levedura, utilizou-se um anticorpo anti-S. boulardii (anti-Sb2),

obtido a partir da fração F2, desenvolvido em coelho, conforme descrito por

CZERUCKA et al. (1994), na diluição de 1/100.

Após 3h de infecção, as células foram lavadas com PBS, fixadas com

paraformaldeído a 4%, por 30min, e permeabilizadas com Triton X-100 a 0,1%, por

5min, e depois lavadas novamente com PBS. Logo após, utilizou-se um anticorpo

(cyan-5) anti-coelho, na diluição de 1/500, para corar a levedura em azul. A lamínula foi

retirada da placa e fixada, “overnight”, a 37°C, em uma caixa escura. As lâminas foram

observadas em microcópio confocal (TCS-SP; Leica), em um aumento de 63X, e as

imagens foram analisadas utilizando-se o software para análises de imagens MetaMorph

2.0 (Invitrogen).

IV.20 Análise estatística

Os significados estatísticos dos resultados obtidos foram avaliados com a

utilização do teste “t” de Student. Na realização dos testes descritos, foi utilizado o

programa SIGMASTAT (Jandel Scientific Software, versão 1.0, San Rafael, USA),

utilizando-se 0,05 como limiar de confiança.

V - RESULTADOS E DISCUSSÃO

Parte I: Efeitos de S. cerevisiae UFMG 905 no sistema imune de camundongos NIH

isentos de germes e convencionais

V.1 Determinação da translocação da levedura S. cerevisiae UFMG 905 para as

placas de Peyer, linfonodos mesentéricos, fígado e baço de camundongos NIH,

gnotobióticos e convencionais

Resultados prévios obtidos em nosso laboratório mostraram que uma linhagem

de S. cerevisiae, isolada da fermentação de cana de açúcar, foi capaz de reduzir a ação

de alguns enteropatógenos. Os resultados mostraram que a levedura foi capaz de

diminuir a mortalidade de animais desafiados com Salm. Typhimurium (15% de

sobrevivência no grupo controle, contra 55% no grupo tratado com a levedura) e os

dados histológicos mostraram que a levedura conferiu uma proteção contra o desafio

oral com C. difficile, em camundongos gnotobióticos e, também, preservação do fígado

de animais convencionais tratados com a levedura e desafiados com Salm.

Typhimurium (MARTINS, 2004). O menor número de focos inflamatórios no fígado de

animais previamente tratados com a S. cerevisiae UFMG 905 sugeriu que a levedura

diminui, in vivo, a translocação da Salm. Typhimurium.

A translocação de um microrganismo é definida como a passagem de

microrganismos viáveis através da barreira mucosa para locais extra-intestinais, como

linfonodos mesentéricos, fígado, baço, rim e sangue (BERG & GARLINGTON, 1979).

Como primeiro experimento, avaliou-se a capacidade de S. cerevisiae UFMG 905 se

translocar do intestino. Para isso, após 10 dias de monoassociação ou tratamento com a

levedura, placas de Peyer, linfonodos mesentéricos, baço e fígado foram assepticamente

retirados, macerados, diluídos em PBS e plaqueados em ágar Sabouraud, durante 48

horas, a 37°C. A Figura 9A mostra que, nos camundongos monoassociados, a levedura

foi detectada apenas nas placas de Peyer. Em animais convencionais (Figura 9B), a

levedura foi detectada também nos linfonodos mesentéricos, além das placas de Peyer.

Nas placas de Peyer, foi observado que os níveis da levedura variavam entre 10

e 10

UFC por grama de órgão, nos animais monoassociados (Figura 9A) e, entre 10

e 10

UFC por grama de órgão, nos animais convencionais tratados (Figura 9B). Nos

linfonodos mesentéricos, os níveis populacionais da levedura flutuaram entre 10

e 10

UFC por grama de órgão, nos animais convencionais tratados (Figura 9B) e não houve

translocação para este órgão, nos animais monoassociados (Figura 9A). A presença da

levedura nestes órgãos não resultou em um aumento da relação do peso do órgão / peso

corporal nos animais monoassociados ou tratados (dados não mostrados).

Resultados prévios (MARTINS et al., 2005a) mostraram que nem a

monoassociação nem o tratamento dos animais com a levedura acarreta qualquer tipo de

alteração morfológica considerada patológica, nos órgãos analisados (estômago,

intestino delgado, intestino grosso, baço e fígado).

Trabalhando com S. boulardii, RODRIGUES et al. (2000) observaram que, em

animais monoassociados, os níveis populacionais dessa levedura flutuaram entre 10

UFC por grama de placas de Peyer e entre 10

e 10

UFC por grama de linfonodos

mesentéricos. Uma possível explicação para a levedura S. cerevisiae UFMG 905 não

translocar para os linfonodos mesentéricos em animais GN pode ser a alta capacidade

de floculação apresentada por ela, o que dificulta a passagem das placas de Peyer para

os linfonodos, fenônemo que não ocorre com a levedura S. boulardii.

O processo de translocação está envolvido na patogênese de infecções

bacterianas intestinais tanto endógenas (infecções oportunísticas) quanto exógenas

(BERG & GARLINGTON, 1979). BERG (1995) propôs que, normalmente, ocorre uma

translocação fisiológica e esta seria responsável pela modulação da resposta imune do

hospedeiro pela microbiota indígena. A translocação de um probiótico para órgãos

linfóides, como as placas de Peyer e linfonodos mesentéricos, poderia ativar eventos de

apresentação de antígenos, respostas imunes in situ e sistemáticas. Somado a isso, antes

do desenvolvimento de respostas mediadas por células T, eventos de imunidade inata

poderiam ser ativados na presença do probiótico em tecidos linfóides associados ao

trato digestivo, como os efeitos locais e sistêmicos observados em animais

monoassociados com S. boulardii (RODRIGUES et al., 2000). Consequentemente, os

baixos níveis de translocação observados para S. cerevisiae UFMG 905 poderiam ser

benéficos, no sentido de preparar a resposta imune do hospedeiro na defesa contra um

patógeno.

Fígado Baço LM PP

Órgão

Log

UFC g

-1

Fígado Baço LM PP

Órgão

Log

UFC g

-1

Figura 9. Translocação de S. cerevisiae UFMG 905 para o fígado, baço, linfonodos

mesentéricos (LM) e placas de Peyer (PP) em animais monoassociados (A) e

convencionais (B). N = 5.

V.2 Determinação da translocação de Salm. Typhimurium para os linfonodos

mesentéricos, fígado e baço de camundongos NIH, gnotobióticos e convencionais,

na presença e na ausência da levedura S. cerevisiae UFMG 905

Para avaliar o efeito da levedura S. cerevisiae UFMG 905 na translocação de

Salm. Typhimurium em camundongos gnotobióticos, os animais foram monoassociados

com a levedura, durante 10 dias, e desafiados com Salm. Typhimurium. Ao final de três

dias de desafio, os animais foram sacrificados e os linfonodos mesentéricos, baço e

fígado foram assepticamente retirados, macerados, diluídos em PBS estéril e plaqueados

em ágar MacConkey, durante 24h, a 37°C. A Figura 10 mostra que os níveis

populacionais de Salm. Typhimurium nos linfonodos mesentéricos e no baço foram os

mesmos nos camundongos monoassociados ou não com a levedura. Entretanto, a Salm.

Typhimurium foi detectada apenas no fígado de animais que não foram previamente

monoassociados com a levedura S. cerevisiae UFMG 905. Este fato sugere que essa

levedura retarda a translocação de Salm. Typhimurium, e esse fato pode ser explicado

pela capacidade da levedura em estimular o aumento das células de Küpffer (Figura 12

e Tabela 2).

Para avaliar o efeito da levedura S. cerevisiae UFMG 905 na translocação de

Salm. Typhimurium em camundongos convencionais, os animais foram tratados,

durante 10 dias, com a levedura e desafiados com Salm. Typhimurium (10

UFC). Ao

final de 5 e 10 dias de desafio, os animais foram sacrificados e os linfonodos

mesentéricos, baço e fígado foram assepticamente retirados, macerados, diluídos em

PBS estéril e plaqueados em ágar MacConkey, durante 24 h, a 37°C. A Figura 11

mostra que o tratamento com a levedura impede a translocação da Salm. Typhimurium

para todos os órgãos analisados, após 5 (Figura 11A) e 10 dias (Figura 11B) de desafio.

Estes resultados sugerem que a levedura, em presença da microbiota normal, impede a

translocação da Salm. Typhimurium, o que pode ser explicado pelo efeito barreira ou

pela resposta imune da mucosa. Um resultado muito parecido foi observado por

RODRIGUES (2000) com o probiótico S. boulardii, quando do desafio com uma dose

10 vezes menor da mesma bactéria. Entretanto, trabalhando com a mesma dose de

patógeno, não foi observada uma diminuição na translocação entre os dois grupos,

sugerindo que o probiótico testado pela autora não impediu, com a dose testada, a

translocação da Salm. Typhimurium em animais.

A redução da translocação de Salm. Typhimurium observada nos animais

tratados com S. cerevisiae UFMG 905 poderia explicar o baixo número de focos

inflamatórios hepáticos nesses animais, após 28 dias de desafio enteropatogênico, como

observado em nossos resultados prévios (MARTINS et al., 2005a). A translocação de

Salm. Typhimurium para o fígado e baço de animais controle, sem detecção do

patógeno nos linfonodos (Figura 11A) poderia ser explicada por um maior dano físico

no epitélio intestinal desse grupo. Como descrito por BERG (1995), a translocação para

o fígado poderia ser feita por passagem intracelular (rota linfática, via linfonodos) ou

passagem extracelular (rota vascular, devido a danos físicos no epitélio intestinal). Uma

diminuição na translocação também foi observada em vários modelos animais

submetidos a queimaduras, danos hepáticos, imunossupressão experimental e infecção

abdominal, usando probióticos bacterianos (CHIVA et al., 2002; GUN et al., 2005) e

leveduras (BERG et al., 1993; PERET FILHO et al., 1998; HEREK et al., 2004).

Parece que todos os componentes da resposta imune - incluindo imunidades

mucosa, mediada por células, e humoral - estão envolvidos no controle da translocação

bacteriana. Acredita-se que a sIgA iniba a associação íntima do patógeno com a mucosa

epitelial, reduzindo, desse modo, a penetração bacteriana. A imunidade mediada por

células na lâmina própria e em órgãos linfóides exerce uma segunda linha de defesa

contra a translocação bacteriana. As imunoglobulinas séricas agem, provavelmente,

como opsoninas para aumentar a efetividade de fagocitose por macrófagos e leucócitos

polimorfonucleares e, subsequentemente, matam as bactérias que translocaram. No caso

de uma translocação efetiva, o sistema reticuloendotelial (RES, “reticuloendothelial

system”) desempenha um papel importante na remoção de microrganismos da

circulação. A fagocitose hepática pelas células de Küppfer é responsável por mais de

80% da função do RES (SABA, 1970). Glicanos e outros produtos de Saccharomyces

são importantes estimuladores do RES. A proliferação de células tronco

hematopoiéticas pluripotentes (células formadoras de colônia de macrófagos e

granulócitos e as células formadoras de colônia de eritrócitos), na medula óssea de

murinos, foi demonstrada após administração de glicanos (PATCHEN & MCVITTIE,

1982). Além do mais, após a administração de glicano, há um aumento na produção de

interleucina-1, por um efeito direto nos macrófagos, ou indireto, por um aumento na

produção de fatores estimulantes do cólon de células T estimuladas por glicano

(HAMURO et al., 1982).

Fígado Baço LM Fígado Baço LM

Controle Experimental

Órgão

Log

UFC g

-1

Fígado Baço LM Fígado Baço LM

Controle Experimental

Órgão

Log

UFC g

-1

Figura 10. Translocação de Salm. Typhimurium, para o fígado, baço e linfonodos

mesentéricos (LM), em camundongos gnotobióticos, previamente monoassociados com

S. cerevisiae UFMG 905 (experimental), ou não (controle). N = 5.

Fígado Baço LM Fígado Baço LM

Controle Experimental

Órgão

Log

UFC g

-1

Fígado Baço LM Fígado Baço LM

Controle Experimental

Órgão

Log

UFC g

-1

Fígado Baço LM Fígado Baço LM

Controle Experimental

Órgão

Log

UFC g

-1

Fígado Baço LM Fígado Baço LM

Controle Experimental

Órgão

Log

UFC g

-1

Figura 11. Translocação de Salm. Typhimurium, para o fígado, baço e linfonodos

mesentéricos (LM), em camundongos convencionais, previamente tratados com S.

cerevisiae UFMG 905 (experimental), ou não (controle), após 5 (A) e 10 (B) dias de

desafio. N = 5.

V.3 Efeito da levedura S. cerevisiae UFMG 905, nas células de Küpffer, em

animais gnotobióticos

A contagem do número de células de Küpffer foi feita em 12 campos aleatórios.

A Figura 12 mostra o aspecto histológico do fígado de camundongos, corado por HE,

mostrando o número de células de Küpffer em animais sem germes (Figura 12A) e

animais monoassociados com a levedura (Figura 12B). A Tabela 2 mostra o número de

células de Küpffer (por 100 hepatócitos) em camundongos sem germes (controle) e

camundongos monoassociados, durante 10 dias, com a levedura. O número de células

de Küpffer foi significantemente maior (P = 0,013) no grupo experimental (animais

monoassociados) (52,9 ± 15,7 células de Küpffer por 100 hepatócitos) em relação ao

grupo de animais isentos de germes (controle) (38,1 ± 9,0 células de Küpffer por 100

hepatócitos). No grupo experimental, o material mostrou raros mononucleares intra-

parenquimatosos e aumento da relação núcleo citoplasmática das células de Küpffer,

além de maior hipertrofia e hiperplasia das células de Küpffer, em relação ao controle.

O aumento do número de células de Küpffer não resultou em um aumento da relação do

peso do órgão / peso corporal nos animais monoassociados (dados não mostrados).

Os mononucleares não são freqüentes no parênquima hepático normal; em geral,

aparecem em pequeno numero nos espaços porta, ou no conjuntivo peri veia central.

Destaca-se que, nos resultados encontrados, a presença de mononucleares intra-

parenquimatosos, mesmo em pequenas quantidades, entre as fileiras de hepatócitos,

refletem um aumento da migração destas células, e são um indício de que há resposta

inflamatória e aumento de fenômenos migratórios. A hipertrofia (aumento do tamanho

das células, que indica, em geral, um aumento da atividade metabólica, de

processamento de antígenos) vem acompanhada de um aumento da taxa de divisão

celular e aumento do número de células (hiperplasia) (BOGLIOLO & BRASILEIRO

FILHO, 2004).

O aumento do número de células de Küpffer, em animais gnotobióticos, também

já foi observado em animais monoassociados com Lactobacillus delbrueckii UFV-

H2B20 (NEUMANN et al., 1998) e S. boulardii (RODRIGUES et al., 2000).

Figure 12. Aspecto histológico do fígado de camundongos corados por HE, mostrando

o número de células de Küpffer em animais isentos de germes (A) e animais

monoassociados com a levedura (B). Observe o aumento do número de células de

Küpffer (setas) no fígado de animais monoassociados com S. cerevisiae UFMG 905.

Aumento: objetiva de 20X.

Tabela 2. Número de células de Küpffer (por 100 hepatócitos) em camundongos sem

germes (controle) e camundongos monoassociados, durante 10 dias, com a levedura S.

cerevisiae UFMG 905 (experimental). (P = 0,013; N = 12).

Controle Experimental

Número de células de

Küpffer (por 100

hepatócitos)

38,1 ± 9,0

52,9 ± 15,7*

*Indica diferença significativa.

V.4 Efeito da levedura S. cerevisiae UFMG 905 no sistema fagocítico de

camundongos NIH gnotobióticos, controles e experimentais, quando do desafio

endovenoso com E. coli B

Como os macrófagos desempenham um papel importante na resposta imune do

hospedeiro, e devido ao aumento observado do número dessas células nos fígados dos

animais monoassociados, foi avaliada a influência da associação com a levedura no

clareamento sistêmico de uma bactéria na corrente sanguínea. Para isso, um grupo de

animais IG foi monoassociado com a levedura e um outro grupo, inoculado com uma

dose única de PBS estéril. Após 10 dias, os dois grupos de animais foram inoculados, na

veia da cauda, com uma dose de 200 µl contendo 10

UFC/ml de E. coli B

e, nos

tempos 0, 15, 30, 60 e 90 min após a injeção, amostras de sangue foram coletadas pelo

plexo retro-orbital, plaqueadas, em ágar MacConkey, e incubadas, durante 24 h, a 37°C.

A porcentagem de bactérias encontradas em cada grupo de camundongos, em relação ao

tempo zero, determinada por diluições decimais, está representada na Figura 13. A

capacidade de clareamento (clearance) no grupo experimental foi maior que a observada

em animais do grupo controle (P < 0,05). Este aumento na capacidade de clareamento

não foi devido a um aumento no tamanho do fígado dos animais experimentais, uma vez

que não foi observada hepatomegalia (dados não mostrados).

Após 30 minutos de desafio endovenoso, o grupo de animais monoassociados

apresentou um clareamento mais rápido em relação ao grupo controle e, após 75

minutos, um clareamento total foi observado apenas no grupo experimental (Figura 13).

É bem conhecido que as células de Küppfer representam uma das maiores

populações de macrófagos em tecidos e, junto com os neutrófilos, têm sido implicadas

como responsáveis pelo clareamento de patógenos (Listeria monocytogenes, E. coli,

Klebsiella pneumoniae e Trypanosoma musculi) na corrente sanguínea (KONGSHAVN

et al., 1990; HIRAKATA et al., 1991; GREGORY et al., 1996).

O aumento das células de Küppfer (Tabela 2) foi simultâneo com um aumento

do clareamento de uma bactéria patogênica injetada sistemicamente (Figura 13). Nossos

resultados mostram que a capacidade de clareamento de E. coli B

da corrente

sanguínea em animais gnotobióticos experimentais foi maior que aquela observada no

grupo controle. Juntos, esses resultados sugerem que, neste modelo experimental, um

maior número de células de Küppfer em animais experimentais foi responsável por um

melhor clareamento observado, quando comparado com animais controle.

Tempo (minutos)

0 15 30 45 60 75 90

Porcentagem de E. coli B

viáveis

0,001

0,01

0,1

100

Figura 13. Clareamento de E. coli B

do sangue de camundongos isentos de germes

(



) ou monoassociados com S. cerevisiae UFMG 905 (



). Os resultados são expressos

como porcentagem de bactérias viáveis em relação ao tempo 0 (100%) por ml de

sangue. Cada ponto representa a média de 11 animais, de dois experimentos

independentes. As barras verticais representam os desvios-padrão das médias. *Indica

diferença estatisticamente significativa entre os grupos controle e experimental,

avaliados pelo teste t de Student (P < 0,05).

V.5 Níveis de imunoglobulinas secretadas do tipo A (sIgA), IgG e IgM no

conteúdo intestinal e no soro de camundongos NIH, gnotobióticos e convencionais,

controles e experimentais, monoassociados ou tratados com a levedura S. cerevisiae

UFMG 905, respectivamente

A superfície mucosa do trato gastrintestinal forma um importante órgão de

defesa do hospedeiro. Somado às suas principais funções fisiológicas - digestão e

absorção de nutrientes - a mucosa intestinal serve como uma interface protetora entre o

ambiente interno e os antígenos presentes nos alimentos e microrganismos vindos do

ambiente externo. O hospedeiro é protegido contra esses agentes nocivos por diversos

fatores não imunológicos, incluindo saliva, ácido gástrico, peristaltismo, muco,

proteólise intestinal, microbiota indígena e a membrana celular com suas junções

intercelulares (ISOLAURI, 1999). O sistema imune de mucosas apresenta duas armas

de defesa: (i) exclusão imune, desempenhada pelo sistema de imunoglobulinas

secretadas (sIg) e, (ii) regulação imune, que é o estado de hiporesposta induzida por

uma administração oral de antígenos (BRANDTZAEG, 1995).

A Figura 14 mostra a influência de S. cerevisiae UFMG 905 nos níveis de IgA,

IgG e IgM produzidas no conteúdo intestinal e soro de camundongos IG (controle) e

camundongos monoassociados com S. cerevisiae UFMG 905 (experimental). Uma

diferença estatisticamente significativa (P < 0,05) entre os grupos controle e

experimental foi observada apenas nos níveis de IgA total no soro (24 ± 3 ηg ml

-1

soro de animais IG contra 295 ± 164 ηg ml

-1

de soro de animais monoassociados com S.

cerevisiae UFMG 905. P = 0,002. N = 8 animais em cada grupo) (Figura 14A); sIgA

(52 ± 41 ηg g

-1

de conteúdo intestinal de animais IG contra 168 ± 42 ηg g

-1

de conteúdo

intestinal de animais monoassociados com S. cerevisiae UFMG 905. P = 0,0002. N = 8

animais em cada grupo) (Figura 14B) e IgM no soro (5973 ± 1342 ηg ml

-1

de soro de

animais IG contra 10457 ± 666 ηg ml

-1

de soro de animais monoassociados com S.

cerevisiae UFMG 905. P = 0,014. N = 4 animais em cada grupo) (Figura 14E). Nas

outras dosagens, apenas uma discreta diferença foi observada, mas que não foi

estatisticamente significativa: IgG sérica (16633 ± 6060 ηg ml

-1

de soro de animais IG

contra 20278 ± 8670 ηg ml

-1

de soro de animais monoassociados com S. cerevisiae

UFMG 905. P = 0,32. N = 9 animais em cada grupo) (Figura 14C); IgG intestinal (225

± 86 ηg g

-1

de fluido intestinal de animais IG contra 268 ± 48 ηg g

-1

de fluido intestinal

de animais monoassociados com S. cerevisiae UFMG 905. P = 0,32. N = 6 animais em

cada grupo) (Figura 14D) e IgM intestinal (56 ± 16 ηg g

-1

de fluido intestinal de animais

IG contra 69 ± 3 ηg g

-1

de conteúdo intestinal de animais monoassociados com S.

cerevisiae UFMG 905. P = 0,21. N = 4 animais em cada grupo) (Figura 14F).

Em animais CV (Figura 15), um aumento nos níveis de IgG (Figura 15A) e IgM

(Figura 15B) foi observado apenas no fluido intestinal [IgG (123 ± 6 ηg g

-1

de fluido

intestinal de animais CV contra 181 ± 23 ηg g

-1

de fluido intestinal de animais CV

tratados com S. cerevisiae UFMG 905. P = 0,16. N = 4 animais em cada grupo); IgM

(12 ± 2 ηg g

-1

de fluido intestinal de animais CV contra 21 ± 9 ηg g

-1

de fluido

intestinal de animais CV tratados com S. cerevisiae UFMG 905. P = 0,38. N = 4

animais em cada grupo)], mas essa diferença não foi estatisticamente significativa.

Nenhuma alteração foi observada nos níveis de imunoglobulinas séricas nos animais

convencionais (dados não mostrados).

Assim como S. boulardii (RODRIGUES et al., 2000), S. cerevisiae UFMG 905

aumenta tanto a produção local de IgA (no fluido intestinal) como a sua produção

sistêmica (no soro). sIgA representa uma barreira imunológica contra a adesão de

patógenos à mucosa intestinal, ligando-se à superfície bacteriana e prendendo-a na

camada mucosa do epitélio intestinal, ou às moléculas da superfície bacteriana que

medeiam a adesão às células epiteliais, prevenindo, assim, a translocação para órgãos

internos (HAJISHENGALLIS et al., 1992). Essa habilidade de estimular a produção de

sIgA não é a mesma para os diferentes microrganismos e, em camundongos GN,

bactérias Gram-negativo e leveduras, geralmente, induzem uma maior estimulação que

bactérias Gram-positivo (MOREAU et al., 1982; NEUMANN et al., 1998;

RODRIGUES et al., 2000).

O complicado papel da mucosa intestinal em absorver nutrientes e, ao mesmo

tempo, proteger contra agentes infecciosos está refletido no tamanho de seu sistema

imune. Existem mais células linfóides no trato digestivo que no baço, glândulas

linfáticas periféricas e sangue juntos. Isso pode, também, refletir o fato que a mucosa

intestinal, com sua superfície de 200-300 m

, separa as 10

células eucarióticas

humanas das 10

bactérias residentes no trato digestivo (HANSON et al., 1999).

O sistema linfóide associado ao intestino pode ser dividido em dois

compartimentos funcionais: um indutor e um efetor, interligados pelas vias hemo-

linfáticas. Podemos distinguir, em primeiro lugar, os órgãos linfóides organizados (as

placas de Peyer e os gânglios mesentéricos), cujo papel é organizar uma resposta imune

específica. O compartimento efetor é formado por um tecido linfóide difuso, constituído

de linfócitos T e de plasmócitos (CELLIER et al., 2000). A indução da resposta imune é

efetuada mais particularmente nas placas de Peyer. Elas contêm as células M que

asseguram o transporte, por pinocitose, de microrganismos e de macromoléculas até as

células apresentadoras de antígenos e os linfócitos B e T. Após estimulação por um

antígeno, os linfócitos das placas de Peyer migram, através dos gânglios mesentéricos,

onde se diferenciam e se multiplicam e, em seguida, encontram a mucosa, após um

trânsito pela circulação geral. Essa domiciliação específica é assegurada pelas

moléculas de adesão expressas na superfície de certas células endoteliais e dos

linfócitos. O sistema linfóide difuso participa igualmente da defesa do intestino,

notavelmente via linfócitos T intra-epiteliais, que são células diferenciadas, ricas em

perforina e granzima. Estes linfócitos exercem uma potente atividade citotóxica contra

alvos infectados por vírus ou parasitas. Enfim, os linfócitos T secretam linfocinas, como

IL-5 e IL-6, que favorecem a diferenciação de plasmócitos a IgA e, estes, participam da

indução local de produção de anticorpos protetores contra diversos patógenos

(CELLIER et al., 2000).

O sistema linfóide do trato digestivo é bem diferente daquele de outros tecidos.

Enquanto na imunidade sérica e imunidade tecidual há uma predominância de IgG sobre

IgA e IgM, na lâmina própria do trato digestivo existem mais de 20 imunócitos

produtores de IgA para cada célula produtora de IgG (GOLDBLUM et al., 1996). Além

do mais, as moléculas de IgA e IgG séricas são monômeros, mas os anticorpos IgA

produzidos na mucosa intestinal são dímeros de IgA, com uma cadeia J (“joining”)

extra. Essa cadeia permite a sua ligação a um receptor especial, o componente secretado

(SC, “secretory component”), também chamado receptor poli Ig, na porção basal do

epitélio intestinal. A ligação ao SC é seguida pelo transporte através da célula epitelial

pelo complexo dímero J de IgA-SC, que é chamado de anticorpo IgA secretada (sIgA).

A sIgA, que é mais estável a mudanças de pH e enzimas proteolíticas que anticorpos

séricos, aparece na superfície da mucosa intestinal em concentrações relativamente

altas. A sIgA funciona neutralizando vírus e toxinas, mas também pode se ligar a

bactérias, prevenindo a aderência bacteriana às células intestinais (HANSON et al.,

1999).

sIgA está envolvida, principalmente, na proteção imune específica da superfície

da mucosa intestinal. Ela é resistente à proteólise intraluminal e não ativa o sistema de

complemento ou a resposta inflamatória. Isso a faz ideal para desempenhar sua função

na primeira linha de defesa, em combinação com os mecanismos de defesa não

imunológicos. Um homem adulto saudável, com peso de 70 kg, produz

aproximadamente 3 g de anticorpos diariamente. Quase dois terços desta quantidade são

formados por IgA, produzida pelas células B, nas paredes dos tratos gastrintestinal e

respiratório, e transportada ativamente para a luz. A grande quantidade de IgA

produzida reflete a grande área de superfície desses órgãos. Após a exposição ao

antígeno, a maior parte da resposta dos anticorpos ocorre nos tecidos linfóides,

principalmente no baço, nos linfonodos e no tecido linfóide associado às mucosas, mas

células produtoras de anticorpos de longa duração podem persistir em outros tecidos,

especialmente na medula óssea (ABBAS & LICHTMAN, 2005).

100

200

300

400

500

Controle Experimental

IgA ( g ml

-1

de soro)

100

150

200

250

Controle Experimental

sIgA total ( g g

-1

de conteúdo

intestinal

10000

20000

30000

40000

Controle Experimental

IgG ( g ml

-1

de soro)

100

200

300

400

Controle Experimental

IgG ( g g

-1

de conteúdo intestinal)

3000

6000

9000

12000

Controle Experimental

IgM ( g ml

-1

de soro)

Controle Experimental

IgM ( g g

-1

de conteúdo intestinal)

Figura 14.

Níveis de IgA (A), sIgA (B), IgG (C-D) e IgM (E-F) produzidas no

conteúdo intestinal (B, D e F) e soro (A, C e E) de camundongos isentos de germes

(controle) e camundongos monoassociados com

S. cerevisiae

UFMG 905

(experimental). Os resultados estão expressos como média das concentrações de

imunoglobulinas (

g) g

-1

de conteúdo intestinal ou ml

-1

de soro. As barras verticais

representam os desvios-padrão das médias. *Indica diferença estatisticamente

significativa entre os grupos controle e experimental, avaliados pelo teste

de Student

(

< 0,05). N = 5.

100

150

200

250

Controle Experimental

IgG ( g g

-1

de conteúdo intestinal)

Controle Experimental

IgM ( g g

-1

de conteúdo intestinal)

Figura 15. Níveis de IgG (A) e IgM (B) produzidos no conteúdo intestinal de

camundongos convencionais tratados (experimental) ou não (controle) com a levedura

S. cerevisiae UFMG 905. Os resultados são expressos como média da concentração de

imunoglobulinas (ηg) g

-1

no conteúdo intestinal. As barras verticais representam os

desvios-padrão das médias. Não houve diferença entre os outros grupos. N = 5.

100

Parte II: Efeitos de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na sinalização celular

induzida, em células T84, após infecção pelo enteropatógeno Salm. Typhimurium

14028

V.6 Efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na integridade epitelial de

células T84, após infecção por Salm. Typhimurium 14028

Para determinar o efeito das duas leveduras (S. boulardii e S. cerevisiae UFMG

905) na diminuição da resistência transepitelial (RTE) induzida por Salm. Typhimurium

14028, as células T84 foram cultivadas sobre filtros, o que permite delimitar um

compartimento superior (apical) e um compartimento inferior (basal), e infectadas na

porção apical com a bactéria, na presença e na ausência de uma das duas leveduras. A

RTE foi acompanhada durante 8 horas e os resultados são mostrados nas Figuras 16 e

17.

A Figura 16 mostra que S. boulardii impede a queda da RTE induzida por Salm.

Typhimurium 14028. Ao final de 8 horas, a RTE caiu 50% nas células infectadas

apenas com Salm. Typhimurium 14028, enquanto nas células pré-incubadas com S.

boulardii e infectadas com Salm. Typhimurium 14028, a RTE se assemelha à das

células controle (sem infecção). Em células infectadas com Salm. Typhimurium 14028 e

S. boulardii ao mesmo tempo, a RTE permanece semelhante à das células controle até 7

horas, quando, ao final de 8 horas, a RTE começa a cair. A presença isolada de S.

boulardii não interferiu na RTE, conforme observado na Figura 16. Os resultados

encontrados com S. cerevisiae UFMG 905 (Figura 17) são muito semelhantes àqueles

encontrados para S. boulardii (Figura 16). Entretanto, ao contrário do que aconteceu

com S. boulardii, quando S. cerevisiae UFMG 905 é incubada ao mesmo tempo com

Salm. Typhimurium 14028, a RTE cai a níveis próximos aos das células infectadas

apenas com Salm. Typhimurium 14028, mostrando que o efeito preventivo de S.

cerevisiae UFMG 905 é melhor que o efeito curativo, no que se refere à RTE (Figura

17).

Essa queda na RTE de enterócitos induzida por Salm. Typhimurium, já havia

sido observada (BERTELSEN et al., 2004); entretanto, o efeito de S. boulardii e S.

cerevisiae UFMG 905 nessa queda da RTE, induzida por Salm. Typhimurium, não

havia sido, ainda, demonstrado. CZERUCKA et al. (2000) e DAHAN et al. (2003) já

101

haviam observado o efeito protetor de S. boulardii na queda da RTE em infecções por

EPEC e EHEC.

As células epiteliais servem de barreira seletiva entre dois ambientes distintos.

Para isso, existem as junções serreadas, situadas no pólo apical, que limitam o fluxo

paracelular. Essas junções são compostas de diversas proteínas e o fechamento dos

espaços paracelulares é feito por proteínas associadas às membranas, as ocludinas e as

claudinas, que interagem com seus homólogos entre as células vizinhas. Ao lado,

encontramos as proteínas periféricas, não membranárias, em especial ZO-1, ZO-2 e ZO-

3, que são as mais bem estudadas e caracterizadas. Associado a essas proteínas, o

citoesqueleto de actina tem um papel importante no controle da permeabilidade das

junções serreadas. De fato, a contração do citoesqueleto possibilita a abertura dessas

junções. Essa contração está intimamente ligada à fosforilação da MLC (cadeia leve de

miosina, “myosin light chain”), fosforilação esta que é feita por duas quinases: a MLCK

(MLC quinase) e a PKC (proteína quinase C, “protein kinase C”) (NISHIKAWA et al.,

1983). A ruptura das junções serreadas está implicada em diversas doenças, uma vez

que ela aumenta a permeabilidade intestinal, favorecendo a passagem de substâncias

tóxicas presentes na luz intestinal. Essa desestabilização pode ser verificada, in vitro,

medindo-se a resistência transepitelial de células cultivadas em monocamadas. A

ativação de MLCK está diretamente implicada na queda da RTE, após infecções com E.

coli enteropatogênicas e enterohemorrágicas (YUHAN et al., 1997; PHILPOTT et al.,

1998; CZERUCKA et al., 2001), assim como em infecções por Salm. Typhimurium

(BERTELSEN et al., 2004).

102

100

120

0 2 4 6 8

Tempo (horas após a infecção)

RTE (%)...

Figura 16. Efeito de S. boulardii (Sb) na diminuição da Resistência Trans-Epitelial

(RTE) induzida por Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células T84. A RTE diminui

progressivamente em células infectadas com Salm. Typhimurium 14028 (), quando

comparadas com o controle () ou em células infectadas na presença simultânea de S.

boulardii (), ou em células pré-incubadas com S. boulardii e infectadas com Salm.

Typhimurium 14028 (). A presença de S. boulardii, apenas, não interfere na RTE

(). ON, “overnight”.

Controle

SbON

Sb + ST

SbON + ST

103

100

120

0 2 4 6 8

Tempo (horas após a infecção)

RTE (%)...

Figura 17. Efeito de S. cerevisiae UFMG 905 (905) na diminuição da Resistência

Trans-Epitelial (RTE) induzida por Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células T84. A

RTE diminui progressivamente em células infectadas com Salm. Typhimurium 14028

(), quando comparadas com o controle () ou em células infectadas na presença

simultânea de S. cerevisiae UFMG 905 (), ou em células pré-incubadas com S.

cerevisiae UFMG 905 e infectadas com Salm. Typhimurium 14028 (). A presença de

S. cerevisiae UFMG 905, apenas, não interfere na RTE (). ON, “overnight”.

Controle

905ON

905 + ST

905ON + ST

104

V.7 Efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na resposta inflamatória, em

células T84, após infecção por Salm. Typhimurium 14028

Em resposta à infecção por Salm. Typhimurium, as células secretam IL-8

(HOBBIE et al., 1997). Para verificar o efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905

na secreção de IL-8, induzida por Salm. Typhimurium, as células foram infectadas,

durante 3 horas, com Salm. Typhimurium 14028, na presença ou não de uma das duas

leveduras, e a concentração de IL-8 presente no sobrenadante das culturas celulares foi

analisada pelo método de ELISA (Figuras 18 e 20). A presença de Salm. Typhimurium

14028 induz um aumento de, aproximadamente, 50 vezes nos níveis de IL-8, em relação

às células controle (de 5,6 ± 4,5 pg/ml para 266 ± 41,3 pg/ml). Na Figura 18, podemos

observar que a presença da levedura S. boulardii diminui drasticamente os níveis de IL-

8 induzidos por Salm. Typhimurium 14028. Quando pré-incubada, S. boulardii provoca

uma diminuição de mais de nove vezes nos níveis de IL-8 e, quando co-incubada, uma

diminuição de três vezes. A presença da levedura S. boulardii, apenas, não acarretou um

aumento significativo nos níveis de IL-8. Essa diminuição foi, também, observada na

expressão do mRNA para IL-8 (Figura 19), pela técnica de PCR em tempo real. Nesse

caso, em que foi realizada uma cinética de infecção, avaliou-se o efeito de S. boulardii

nos níveis de IL-8 mRNA, induzidos por Salm. Typhimurium 14028, em células T84,

por PCR quantitativo, após 1h, 2h e 3h de infecção com a bactéria, na presença da

levedura pré- e co-incubada. Foi observado que, tanto pré- quanto co-incubada, a

levedura diminui os níveis do mRNA para IL-8, mas diferenças estatisticamente

significativas foram encontradas apenas durante a pré-incubação com a levedura,

independentemente do tempo de infecção.

A Figura 20 mostra os mesmos resultados utilizando a levedura S. cerevisiae

UFMG 905 como probiótico. Assim como S. boulardii, ela foi capaz de diminuir os

níveis de IL-8 induzidos por Salm. Typhimurium 14028. Tanto pré- quanto co-

incubada, foi, também, capaz de promover uma diminuição significativa nos níveis de

IL-8 (9,3 e 3,2 vezes menos, respectivamente). Esses resultados mostram que as duas

leveduras (S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905) exercem um efeito preventivo na

secreção de IL-8 durante a infecção por Salm. Typhimurium 14028, em células do

cólon.

DAHAN et al. (2003) já haviam observado o efeito anti-inflamatório de S.

boulardii em infecções por EHEC. Trabalhando com culturas de lactobacilos,

105

NEMETH et al. (2006) mostraram um efeito anti-inflamatório do probiótico mediado

diretamente pela cultura probiótica ou via secreção de produtos anti-microbianos.

Trabalhando com bifidobactérias, RIEDEL et al. (2006) observaram um efeito anti-

inflamatório devido à inibição da ativação de NF-κB induzida pelo LPS bacteriano.

O'HARA et al. (2006) demonstraram que B. infantis e L. salivarius diminuíam a

secreção de IL-8 em células infectadas com Salm. Typhimurium e que B. infantis

também limitava a secreção de IL-8 induzida pela flagelina de Salm. Typhimurium.

Trabalhando com uma E. coli enterotoxigênica, ROSELLI et al. (2006) observaram que

B. animalis MB5 e L. rhamnosus GG diminuíam a resposta inflamatória causada pelo

patógeno, devido a uma diminuição da adesão da bactéria e pela regulação da expressão

de quimiocinas e citocinas.

MA et al. (2004) também observaram uma inibição da síntese de IL-8 induzida

por Salm. Typhimurium, em culturas celulares pré-incubadas com L. reuteri, e esse

efeito foi atribuído à inibição da translocação de NF-κB para o núcleo, assim como a

prevenção da degradação de IκB.

Todo enteropatógeno, após atingir seu local de ação no hospedeiro, precisa

competir com a microbiota presente no trato digestivo para poder se estabelecer e causar

infecção. A maioria destes patógenos, como é o caso de Salmonella e algumas linhagens

de E. coli, causa infecção em um processo que envolve três estágios: adesão, indução de

sinais nas células do hospedeiro e entrada da bactéria (ou de suas toxinas) na célula

(SCALETSKY et al., 1984). Todo este processo leva à indução de várias respostas,

dentre elas a resposta imune, via produção de imunoglobulinas e citocinas. Estudos

prévios, utilizando ensaios in vitro e in vivo, mostraram que uma linhagem de EHEC

induzia uma potente resposta pró-inflamatória via liberação de IL-8 em células T84

infectadas (DAHAN et al., 2002), que é um dos principais produtos secretados por

células epiteliais infectadas (ECKMANN et al., 1993).

A expressão do gene que codifica a IL-8 é regulada por várias vias. A região

promotora do gene para IL-8 contem seqüências às quais se ligam vários fatores de

transcrição, incluindo NF-IL-6, NF-κB e AP-1 (MUKAIDA et al., 1994). ELEWAUT

et al. (1999) mostraram que NF-κB é o regulador central da resposta imune inata

epitélio-célula a infecções por bactérias enteroinvasivas, como é o caso do gênero

Salmonella e algumas linhagens de Escherichia. Além do mais, respostas imunes e

inflamatórias no intestino envolvem a transcrição do fator NF-κB (NEURATH et al.,

106

1998). Na maioria das células, o NF-κB se encontra no citoplasma na sua forma inativa

pela ligação de uma proteína inibitória, a IκB, que oculta o sinal para localização

nuclear no NF-κB e impede a sua translocação para o núcleo. A translocação do NF-κB

requer a fosforilação de IκB e, uma vez fosforilado, IκB é ubiquitinilado e, depois,

degradado pela subunidade 26S do proteasoma (BROWN et al., 1995).

A ativação de AP-1 é dependente de MAPKs que desempenham um papel

central em muitas respostas do hospedeiro, incluindo resposta a citocinas, respostas a

estresses e reorganização do citoesqueleto (DAVIS, 1993; DAVIS, 2000). As vias de

MAP quinases formam um grupo de proteínas quinases reguladas por sinal extracelular

(ERK1/2) e duas proteínas quinases ativadas por estresse chamadas p38 e JNK. Muitos

receptores de superfície de eucariotos utilizam, pelo menos, uma dessas cascatas de

MAPK, altamente conservadas para sinalização intracelular (ROBINSON & COBB,

1997).

DAHAN et al. (2002), utilizando EHEC como modelo, demonstraram a

habilidade desta bactéria em induzir uma resposta pró-inflamatória em células T84 e

viram que esta resposta envolvia vias sinalizadoras de NF-κB, AP-1 e MAPK. Este tipo

de infecção é capaz de alterar, também, a permeabilidade intestinal (PHILPOTT et al.,

1998).

107

100

200

300

400

C ST 3h Sb + ST 3h SbON + ST 3h SbON

IL-8 (pg/ml)...

Figura 18. Efeito de S. boulardii (Sb) nos níveis de IL-8, induzidos por Salm.

Typhimurium 14028 (ST), em células T84. A IL-8 foi analisada no sobrenadante de

células T84, por ELISA, após 3 horas de infecção com Salm. Typhimurium 14028, na

presença de S. boulardii pré- ou co-incubada. *Diferença estatisticamente significativa

entre as células infectadas por Salm. Typhimurium 14028 e células infectadas por Salm.

Typhimurium 14028, na presença de S. boulardii. **Diferença estatisticamente

significativa entre as células infectadas por Salm. Typhimurium 14028 e o controle (P <

0,05, n = 8). C, controle; ON, “overnight”.

108

Figura 19. Efeito de S. boulardii (Sb) nos níveis de IL-8 mRNA, induzidos por Salm.

Typhimurium 14028 (ST), em células T84. IL-8 mRNA foi analisado nas células T84,

por PCR quantitativo após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm. Typhimurium 14028, na

presença de S. boulardii pré- ou co-incubada. *Diferença estatisticamente significativa

entre as células infectadas por Salm. Typhimurium 14028 e células infectadas por Salm.

Typhimurium 14028, na presença de S. boulardii. (P < 0,05, n = 6). C, controle; ON,

“overnight”.

400

800

1200

1600

C 1h 2h 3h 1h 2h 3h 1h 2h 3h

ST Sb + ST Sb(ON) + ST

IL-8 mRNA (fold increase)

* * *

400

800

1200

1600

C 1h 2h 3h 1h 2h 3h 1h 2h 3h

ST Sb + ST Sb(ON) + ST

IL-8 mRNA (fold increase)

* * *

109

100

200

300

400

C ST 3h Sc-905 + ST 3h Sc-905ON + ST

Sc-905ON

IL-8 (pg/ml)...

Figura 20. Efeito de S. cerevisiae UFMG 905 (Sc-905), nos níveis de IL-8, induzidos

por Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células T84. IL-8 foi analisado no

sobrenadante de células T84, por ELISA, após 3 horas de infecção com Salm.

Typhimurium 14028, na presença de S. cerevisiae UFMG 905 pré- ou co-incubada.

*Diferença estatisticamente significativa entre as células infectadas por Salm.

Typhimurium 14028 e células infectadas por Salm. Typhimurium 14028, na presença de

S. cerevisiae UFMG 905. **Diferença estatisticamente significativa entre as células

infectadas por Salm. Typhimurium 14028 e o controle (P < 0,05, n = 8). C, controle;

ON, “overnight”.

110

V.8 Efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 nas vias de sinalização

celular, induzidas em células T84, por Salm. Typhimurium 14028

Diversos trabalhos já mostraram que a secreção de IL-8 é dependente de fatores

de transcrição, como NF-κB e AP-1, assim como das MAP quinases (p38, ERK1/2 e

JNK) (HOBBIE et al., 1997; CZERUCKA et al., 2000; GEWIRTZ et al., 2000;

CZERUCKA et al., 2001; DAHAN et al., 2002; HOFFMANN et al., 2002; DAHAN et

al., 2003). Para avaliar o efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na indução da

fosforilação de MAP quinases (p38, ERK 1/2 e JNK) pela Salm. Typhimurium, as

células foram cultivadas em placas de 6 poços, infectadas com Salm. Typhimurium

14028, na presença ou não de S. boulardii ou S. cerevisiae UFMG 905 e, ao final da

infecção, as proteínas foram extraídas, corridas em SDS-PAGE e analisadas por

“imunoblotting” com anticorpos anti-fosfo-p38, anti-fosfo-ERK1/2 ou anti-fosfo-JNK.

A Figura 21 mostra o efeito de S. boulardii na indução de fosforilação de MAP

quinases induzidas pela Salm. Typhimurium 14028, após 1h, 2h e 3h de infecção com a

bactéria. A Salm. Typhimurium 14028 ativa a fosforilação de todas as três MAP

quinases, em todos os tempos, sendo a ativação maior após 3 horas de infecção. A

levedura S. boulardii, quando incubada ao mesmo tempo com Salm. Typhimurium

14028, não inibe as MAPKs ativadas pela Salm. Typhimurium 14028; entretanto,

quando pré-incubada toda a noite, ela diminui a fosforilação de p38, após 1h e 2h de

infecção e bloqueia após 3h de infecção com Salm. Typhimurium 14028 (Figura 21A).

Além disto, bloqueia completamente a fosforilação de ERK1/2 e JNK, em todos os

tempos (Figuras 21B e 21C). Um resultado idêntico foi encontrado com a levedura S.

cerevisiae UFMG 905 (Figura 22). A presença de S. boulardii (Figura 21) ou de S.

cerevisiae UFMG 905 (Figura 22) apenas, não ativa a fosforilação de nenhuma das

MAPKs.

Para avaliar o efeito de uma S. cerevisiae de laboratório (S. cerevisiae W303)

nessa inibição de fosforilação de MAPKs, induzidas por Salm. Typhimurium 14028, o

mesmo experimento foi realizado com a S. cerevisiae W303, no lugar de S. boulardii ou

S. cerevisiae UFMG 905, e, observou-se que, ao contrário das outras duas leveduras, S.

cerevisiae W303 não foi capaz de inibir o efeito da Salm. Typhimurium 14028, mesmo

quando pré-incubada, mostrando que o efeito benéfico não foi devido simplesmente à

presença de uma levedura (Figura 23). Todos esses resultados mostram que as leveduras

111

S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 previnem a ativação de MAPKs, induzidas por

Salm. Typhimurium 14028, em enterócitos.

Muitas vezes a infecção por enteropatógenos leva à morte programada celular ou

apoptose. As caspases são proteases que desempenham um papel-chave na iniciação e

execução da apoptose. Entre elas, a caspase-3 (cpp-32) é a mais bem estudada. Esta é

sintetizada como uma pró-enzima inativa de 32 kDa, que é clivada em células em

processo de apoptose em duas formas ativas, uma de 12 kDa e outra de 20 kDa

(ZYCHLINSKY & SANSONETTI, 1997).

Para mostrar que nenhuma das células estava em apoptose, avaliou-se, também

por “imunoblotting”, a clivagem da caspase-3. Salmonella Typhimurium 14028, na

presença ou na ausência de S. boulardii (Figura 24) ou S. cerevisiae UFMG 905 (Figura

25), não ativa a apoptose em células T84. É sabido, pela literatura, que Salm.

Typhimurium ativa a apoptose; entretanto, quando o fator NF-κB é ativado, ele inibe a

apoptose celular. A Salm. Typhimurium é uma bactéria que, ao mesmo tempo em que

ativa vias que levam à morte celular, também ativa vias que impedem a apoptose

celular, como a via PI3K/Akt (phosphatidyl-inositol-3-kinase) e o fator de transcrição

NF-κB (ZYCHLINSKY & SANSONETTI, 1997).

Trabalhando com EHEC, DAHAN et al. (2003) também observaram o efeito

protetor de S. boulardii na ativação de vias sinalizadoras induzidas por essa bactéria.

Este tipo de mecanismo de proteção já foi, também, descrito para um probiótico

bacteriano. Estudos utilizando a linhagem celular Caco-2/TC7 mostrou que L.

acidophilus LB possui um efeito antimicrobiano em infecções causadas por Salm.

Typhimurium (COCONNIER et al., 2000). Este probiótico induziu uma diminuição do

rearranjo dos filamentos de actina nos sítios de adesão da Salm. Typhimurium e uma

diminuição do número de bactérias aderentes, induzindo uma menor resposta pro-

inflamatória pela secreção de IL-8. Além disso, o L. acidophilus permitiu, igualmente, a

diminuição do número de células de Salm. Typhimurium intracelulares e do número de

bactérias translocadas.

Estudos recentes mostraram que probióticos de origem bacteriana podem,

igualmente, intervir em etapas posteriores à adesão de Salmonella e modificar a resposta

dos enterócitos à infecção (OTTE & PODOLSKI, 2004).

Como descrito para os colibacilos enteropatogênicos, o processo infeccioso da

Salmonella é composto de três etapas: 1) adesão das bactérias às células (M,

enterócitos); 2) formação de um sistema de secreção do tipo III, que permite a

112

translocação de proteínas dentro do citoplasma da célula hospedeira, e 3) indução, por

fosforilação, de vias de sinalizações intracelulares (GRASSL & FINLAY, 2008). Nos

enterócitos, a translocação de proteínas bacterianas pela célula do hospedeiro tem, por

conseqüência, um acúmulo de actina nos sítios de adesão bacteriana, com formação de

vacúolos de macropinocitose e internalização de bactérias. Estas modificações do

citoesqueleto da célula hospedeira estão intimamente relacionadas às modificações do

metabolismo de fosfo-inositol induzidas pelas bactérias (HOBBIE et al., 1997).

As MAPKs já foram associadas à patogenia de bactérias enteroinvasivas, como a

Salm. Typhimurium e a Listeria monocytogenes. No caso da Salm. Typhimurium, a

ativação de MAP quinases do tipo ERK 1/2, p38 e JNK, e do fator NF-kB, estão

implicados na síntese de IL-8, em resposta à infecção (HOBBIE et al., 1998). A MAP

quinase p38 está envolvida na estabilização do mRNA para IL-8, ERK1/2, na invasão e

na indução de respostas inflamatórias e, JNK e os fatores NF-κB e AP-1 estão

envolvidos na síntese de IL-8, em resposta à infecção (HOFFMANN et al., 2002).

Como o fator de transcrição NF-κB é um dos principais responsáveis pela

síntese de IL-8, em resposta a diversos fatores, dentre eles uma resposta à infecção,

avaliou-se a ativação desse fator, assim como a fosforilação de sua proteína inibidora

(IκB). Para se avaliar o efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na indução da

fosforilação da proteína inibidora pela Salm. Typhimurium, as células T84 foram

cultivadas em placas de 6 poços, infectadas com Salm. Typhimurium 14028, na

presença ou não de S. boulardii ou S. cerevisiae UFMG 905 e, ao final da infecção, as

proteínas foram extraídas, corridas em SDS-PAGE e analisadas, por “imunoblotting”,

com anticorpo anti-fosfo-IκB-α. Para se avaliar o efeito de S. boulardii e S. cerevisiae

UFMG 905 na ativação do fator NF-κB pela Salm. Typhimurium, as células foram

cultivadas em placas de 6 poços, infectadas com Salm. Typhimurium 14028, na

presença ou não de S. boulardii ou S. cerevisiae UFMG 905 e, ao final da infecção, as

proteínas totais foram extraídas, incubadas com oligonucleotídeos, marcados

radioativamente, que reconhecem o sítio κB. Os complexos foram separados por

eletroforese em gel de retardamento, analisados e os resultados estão apresentados nas

Figuras 26 e 27.

A Figura 26 mostra o efeito de S. boulardii na fosforilação de IκB-α (Figura

26A) e na ativação do fator NF-κB (Figura 26B) induzidas por Salm. Typhimurium

14028. Salmonella Typhimurium promove a ativação de IκB-α, que é a proteína

113

inibidora que impede que o fator NF-κB transloque para o núcleo e ative os genes

responsáveis pela ativação de diversas citocinas pró-inflamatórias, como a IL-8. A

presença de S. boulardii, incubada ao mesmo tempo com Salm. Typhimurium 14028,

não promove uma diminuição da ativação de IκB-α. Quando pré-incubada, S. boulardii

promove uma pequena diminuição na fosforilação de IκB-α (Figura 26A) e essa

diminuição não é responsável por uma diminuição da ativação do fator NF-κB,

conforme pode ser observado na Figura 26B. Um resultado muito parecido foi

encontrado quando se utilizou S. cerevisiae UFMG 905, no lugar de S. boulardii (Figura

27).

Uma vez que foi observada uma grande diminuição dos níveis de IL-8, induzida

por Salm. Typhimurium 14028, na presença de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905

(Figuras 18, 19 e 20), e não tendo sido observada uma diminuição da ativação do fator

NF-κB (Figuras 26 e 27), uma explicação plausível para essa diminuição de IL-8 se

encontra no fato de as duas leveduras diminuírem a fosforilação de p38 (Figuras 21A e

22A), que é a MAPK responsável pela estabilização do mRNA para IL-8, induzida pela

Salm. Typhimurium, e também pelo fato de as duas leveduras terem bloqueado a

fosforilação de JNK (Figuras 21C e 22C), que junto com o fator NF-κB, é responsável

pela indução de IL-8. Assim, o gene para IL-8 é induzido pelo NF-κB, mas o mRNA

não é estável, uma vez que p38 não é fosforilado na presença das leveduras. Uma outra

explicação é o fato de as leveduras inibirem a fosforilação da MAPK JNK, uma vez que

AP-1, um outro fator de transcrição para IL-8, é dependente da fosforilação dessa

proteína. Como as duas leveduras inibem a fosforilação dessa MAPK, essa poderia ser

uma outra explicação para a diminuição dos níveis de IL-8 observados. A dimunição

dessa citocina pró-inflamatória também poderia estar relacionada a uma

imunomodulação, como a produção de IL-10, uma citocina anti-inflamatória; entretanto,

essa hipótese não foi testada nesse trabalho.

A interação de proteínas com o DNA é um ponto-chave no controle de diversos

processos celulares, incluindo a replicação, recombinação e reparo do DNA e a

transcrição. Uma técnica extremamente útil no estudo da regulação gênica e da

interação proteína-DNA é o EMSA (“electrophoretic mobility shift assay”). Essa

técnica é baseada na observação de que o complexo proteína-DNA migra mais

lentamente que moléculas de DNA livres, quando submetidos a géis de poliacrilamida

não desnaturantes. Como a taxa de migração de DNA é mudada ou retardada quando

114

este aparece ligado a complexos de proteínas, o ensaio é também referido como ensaio

de mudança em gel ou ensaio de retardamento (FRIED & CROTHERS, 1981;

GARNER & REVZIN, 1981). No EMSA, um oligonucleotídeo de DNA, dupla fita, que

contém sítios específicos de ligação de NF-κB é marcado radioativamente e incubado

com células ou extratos nucleares de tecidos. À reação de ligação adiciona-se poli-dIdC

para prevenir ligações inespecíficas de proteínas ao oligonucleotídeo marcado e,

também, para reduzir o “background”. Essa incubação resulta na ligação de NF-κB ao

nucleotídeo e em uma mudança da mobilidade eletroforética do nucleotídeo no gel de

poliacrilamida, sendo que, após separação das amostras, as bandas podem ser

visualizadas por fosfo-imagem ou radiografia (VAN DEN BERG et al., 2001).

O método mais amplamente utilizado para determinar a ativação de NF-κB é o

EMSA. Com essa técnica molecular, é possível detectar diferenças nas concentrações de

NF-κB que se translocaram para o núcleo. Essa técnica possibilitou o uso de NF-κB

como um biomarcador funcional de estresse inflamatório em diversos estudos, in vitro e

in vivo. O EMSA é, também, amplamente aplicado em ensaios clínicos, uma vez que

pode ser usado em células sanguíneas humanas, fluídos biológicos, biópsias de tecidos,

etc (ZINGARELLI, 2005).

Vários estímulos e agentes patogênicos provocam a secreção basolateral de IL-8

pelos enterócitos (JUNG et al., 1995; YANG et al., 1997). A expressão de IL-8 está sob

o controle de NF-κB, assim como das proteínas da família das MAPKs. Foi

demonstrado que essas intervêm na expressão de IL-8 em diversos níveis como, por

exemplo, na estabilização dos mRNAs (HOFFMANN et al., 2002). Além disso, o

emprego de inibidores farmacológicos de MAPKs, em infecções, in vitro, por diversas

bactérias patogênicas, se traduz em uma importante diminuição da secreção de IL-8,

confirmando a importância dessas quinases na produção dessa citocina em condições

patológicas (SAVKOVIC et al., 2001; BERIN et al., 2002; DAHAN et al., 2002).

A ativação da via NF-κB já foi observada por diversos autores, em várias

infecções bacterianas, envolvendo, por exemplo: Salm. Typhimurium (HOBBIE et al.,

1997; GEWIRTZ et al., 2000), E. coli enteropatogênica (SAVKOVIC et al., 1997) e E.

coli enterohemorrágica (DAHAN et al., 2002). Uma relação entre a ativação da via NF-

κB e a produção de IL-8 já foi estabelecida para todas essas bactérias. De fato, as

linhagens celulares epiteliais de origem intestinal, transfectadas com o potente repressor

IKKβ ou IκB-α impedem toda a ativação de NF-κB, não secretando mais IL-8 em

115

resposta às infecções bacterianas (ELEWAUT et al., 1999). A IL-8 secretada pelos

enterócitos desempenha um papel importante na defesa do organismo contra as

bactérias patogênicas, uma vez que permite o recrutamento e a transmigração de

neutrófilos polimorfonucleares (PMN) através do epitélio, que se encarregam da

destruição dos patógenos (SAVKOVIC et al., 1996). Em diversas bactérias patogênicas,

um dos principais fatores responsáveis pela ativação de NF-κB e da potente resposta

inflamatória é uma proteína derivada dos flagelos: a flagelina (BERIN et al., 2002;

TALLANT et al., 2004).

De uma maneira interessante, a ativação de NF-κB por EPEC e EHEC é

transitória. A inibição de NF-κB foi atribuída à proteína bacteriana EspB. De fato,

linhagens deficientes para EspB são incapazes de inibir NF-κB (HAUF &

CHAKRABORTY, 2003). Esses autores avançaram na hipótese de que essa inibição

poderia ser um meio de defesa das bactérias para diminuir a quantidade de IL-8

secretada, limitando, assim, a eliminação bacteriana.

O epitélio está em contato direto com a microbiota intestinal e vários

mecanismos de controle são encontrados para evitar um processo patogênico. O

glicocálice, que cobre todo o epitélio, limita o contato entre as células e as bactérias; as

células de Paneth, no fundo das criptas, secretam as defensinas. Mas o controle da

inflamação é feito, também, pelas células epiteliais. Por exemplo, Bacteroides

thetaiotaomicron, uma bactéria da microbiota normal, exerce um papel anti-

inflamatório sobre as células epiteliais intestinais, impedindo a ativação do fator de

transcrição NF-κB. Esta bactéria induz a relocalização citoplasmática da sub-unidade

p65 do NF-κB, impedindo a sua ativação (KELLY et al., 2004). Uma outra alternativa

para manter a tolerância enterocitária consiste em interferir na via de ubiquitinação que

conduz à degradação das proteínas pelo proteasoma. A exposição dos enterócitos a uma

espécie não virulenta de salmonela (Salm. pullorum) previne a ubiquitinação de IκB,

impedindo, assim, a ativação do fator de transcrição NF-κB (NEISH et al., 2000).

Algumas bactérias comensais, como E. coli MG1655, são capazes de induzir uma

resposta inflamatória nas células intestinais (BAMBOU et al., 2004) e, nesses casos, o

glicocálice limita o contato entre as células intestinais e as bactérias da microbiota, o

que previne a resposta inflamatória provocada pela bactéria ou por alguns de seus

constituintes.

116

Uma vez que o efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 sobre as

MAPKs é verificado somente quando as leveduras são pré-incubadas toda a noite

(Figuras 21 e 22), foi hipotetizado que as leveduras secretam alguma(s) substância(s)

que impede(m) a fosforilação das MAPKs pela Salm. Typhimurium 14028. Para avaliar

isso, as leveduras foram crescidas no mesmo meio de crescimento das células T84

(DMEM/F12), na presença e na ausência das células. Após crescimento por toda a noite,

o meio foi centrifugado e filtrado em membranas de 0,22 µm, para eliminar as leveduras

e, então, incubado com as células intestinais, na presença ou não de Salm. Typhimurium

14028. Após 3h de infecção com o patógeno, as células foram lavadas, congeladas,

lisadas e as proteínas extraídas foram corridas em SDS-PAGE e analisadas, por

“imunoblotting”, com anticorpos anti-fosfo-p38 e anti-fosfo-ERK1/2. Os resultados são

mostrados nas Figuras 28 e 29.

A Figura 28 mostra o efeito do sobrenadante de S. boulardii (SbS) na indução da

fosforilação de MAPKs (p38 e ERK1/2) pela Salm. Typhimurium 14028. Assim como

S. boulardii pré-incubada inibe a fosforilação das MAPKs, SbS também apresenta um

efeito similar. A presença da levedura aderida às células (representada pelas células pré-

incubadas com S. boulardii e lavadas três vezes para retirar o SbS e S. boulardii

presente no sobrenadante) por si só não é suficiente para inibir os efeitos da S.

Typhimurium, indicando que a levedura secreta alguma(s) substância(s) que inibe(m) a

ativação das MAPKs. Esse efeito é verificado independentemente de a levedura estar

em contato com as células intestinais, uma vez que esse efeito foi observado mesmo

quando S. boulardii foi crescida em meio na ausência das células T84, indicando que

a(s) substância(s) é secretada pela levedura, e não pela célula, em resposta ao contato

com a levedura. Um efeito semelhante foi observado quando se trabalhou com a

levedura S. cerevisiae UFMG 905 (Figura 29).

Trabalhando com o SbS, CHEN et al. (2006) observaram que este era capaz de

inibir a produção de IL-8 induzida por IL-1β e pela toxina A de C. difficile, e, que essa ,

era dose dependente. Observaram, também, que o SbS inibia as MAPKs ERK1/2 e JNK

induzidas por IL-1β e pela toxina A de C. difficile, mas não p38. Nesse mesmo trabalho,

observaram que, in vivo, SbS inibiu, significantemente, ERK1/2, assim como diminuiu

a secreção de fluidos e os danos histológicos causados pela toxina A do C. difficile.

SOUGIOULTZIS et al. (2006) também observaram que SbS era capaz de inibir a

produção de IL-8, assim como prevenir a degradação de IκB e reduzir a ativação de

117

NK-κB induzidas por IL-1β e TNF-α. Análises mais detalhadas mostraram que esse

efeito era devido a um fator anti-inflamatório de menos de 1 kDa, termoestável e

solúvel em água.

Outros autores já mostraram a capacidade de S. boulardii em liberar substâncias

anti-inflamatórias. BUTS et al. (2006) observaram que S. boulardii libera uma fosfatase

de 63 kDa, que é capaz de inibir os efeitos de endotoxinas de E. coli, devido a uma

grande capacidade de defosforilação. CASTAGLIUOLO et al. (1996 e 1999)

demonstraram que S. boulardii libera uma protease de 54 kDa, que cliva as toxinas A e

B de C. difficile, assim como o receptor intestinal da toxina A. CZERUCKA et al.

(1994) e CZERUCKA & RAMPAL (1999) demonstraram que S. boulardii libera uma

proteína de 120 kDa, que reduz os níveis intestinais de AMPc induzidos pela toxina do

cólera.

118

ST Sb + ST Sb (ON) + ST

C Sb 1h 2h 3h 1h 2h 3h 1h 2h 3h

Fosfo-p38

Total p38

Fosfo-ERK1/2

Total ERK2

Fosfo-JNK

Total JNK

Figura 21. Efeito de S. boulardii (Sb) na indução da fosforilação de MAP quinases

(p38, ERK1/2 e JNK) pela Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células T84. As células

foram lisadas após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm. Typhimurium 14028 e as

amostras foram corridas em SDS-PAGE e analisadas, por “imunoblotting”, com

anticorpos anti-fosfo-p38 (A), anti-fosfo-ERK1/2 (B) ou anti-fosfo-JNK (C). C,

controle; ON, “overnight”.

119

ST 905 + ST 905 (ON) + ST

C 905 1h 2h 3h 1h 2h 3h 1h 2h 3h

Fosfo-p38

Total p38

Fosfo-ERK1/2

Total ERK2

Fosfo-JNK

Total JNK

Figura 22. Efeito de S. cerevisiae UFMG 905 (905) na indução da fosforilação de MAP

quinases (p38, ERK1/2 e JNK) pela Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células T84.

As células foram lisadas após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm. Typhimurium 14028 e

as amostras foram corridas em SDS-PAGE e analisadas, por “imunoblotting”, com

anticorpos anti-fosfo-p38 (A), anti-fosfo-ERK1/2 (B) ou anti-fosfo-JNK (C). C,

controle; ON, “overnight”.

120

ST W303 + ST W303 (ON) + ST

C W303 1h 2h 3h 1h 2h 3h 1h 2h 3h

Fosfo-p38

Fosfo-ERK1/2

Figura 23. Saccharomyces cerevisiae W303 (W303) não diminui a fosforilação de

MAP quinases (p38 e ERK1/2), induzidas por Salm. Typhimurium 14028 (ST), em

células T84. As células foram lisadas após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm.

Typhimurium 14028 e as amostras foram corridas em SDS-PAGE e analisadas, por

“imunoblotting”, com anticorpos anti-fosfo-p38 (A) ou anti-fosfo-ERK1/2 (B). C,

controle; ON, “overnight”.

121

ST Sb + ST Sb (ON) + ST

C Sb 1h 2h 3h 1h 2h 3h 1h 2h 3h

Caspase-3

Figura 24. Salmonella Typhimurium 14028 (ST), na presença ou ausência de S.

boulardii (Sb), não ativa a apoptose em células T84. As células foram lisadas após 1h,

2h e 3h de infecção com Salm. Typhimurium 14028 e as amostras foram corridas em

SDS-PAGE e analisadas, por “imunoblotting” com anticorpo anti-caspase-3. C,

controle; ON, “overnight”.

122

ST 905 + ST 905 (ON) + ST

C 905 1h 2h 3h 1h 2h 3h 1h 2h 3h

Caspase-3

Figura 25. Salmonella Typhimurium ATCC 14028 (ST), na presença ou ausência de S.

cerevisiae UFMG 905 (905), não ativa a apoptose em células T84. As células foram

lisadas após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm. Typhimurium 14028 e as amostras

foram corridas em SDS-PAGE e analisadas, por “imunoblotting” com anticorpo anti-

caspase-3. C, controle; ON, “overnight”.

123

ST Sb + ST Sb (ON) + ST

C Sb 1h 2h 3h 1h 2h 3h 1h 2h 3h

Fosfo-IκB-α

Total IκB-α

ST Sb + ST Sb (ON) + ST

TNFα

Sb 1h 2h 3h 1h 2h 3h 1h 2h 3h

NF-κB

Figura 26. Efeito de S. boulardii (Sb) na fosforilação de IκB-α (A) e na ativação do

fator NF-κB (B), induzidas por Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células T84. As

células foram lisadas após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm. Typhimurium 14028 e as

amostras foram corridas em SDS-PAGE e analisadas, por “imunoblotting”, com

anticorpo anti-fosfo-IκB-α. A ligação do fator NF-κB ao DNA foi examinado pela

técnica de EMSA. C, controle; TNF-α (controle positivo); ON, “overnight”.

124

ST 905 + ST 905 (ON) + ST

C 905 1h 2h 3h 1h 2h 3h 1h 2h 3h

Fosfo-IκB-α

Total IκB-α

ST 905 + ST 905 (ON) + ST

TNFα

905 1h 2h 3h 1h 2h 3h 1h 2h 3h

NF-κB

Figura 27. Efeito de S. cerevisiae UFMG 905 (905) na fosforilação de IκB-α (A) e na

ativação do fator NF-κB (B), induzidas por Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células

T84. As células foram lisadas após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm. Typhimurium

14028 e as amostras foram corridas em SDS-PAGE e analisadas, por “imunoblotting”,

com anticorpo anti-fosfo-IκB-α. A ligação do fator NF-κB ao DNA foi examinado pela

técnica de EMSA. C, controle; TNF-α (controle positivo); ON, “overnight”.

125

Controle

ST 3h

SbON + ST 3h

SbS + ST 3h

SbS(

T84

) + ST 3h

Sb(3X PBS) + ST 3h

Fosfo-p38

Fosfo-ERK1/2

Figura 28. Efeito de S. boulardii (Sb) e do sobrenadante de S. boulardii (SbS) na

indução da fosforilação de MAP quinases (p38 e ERK1/2) pela Salm. Typhimurium

14028 (ST), em células T84. As células foram lisadas após 3h de infecção com Salm.

Typhimurium 14028 e as amostras foram corridas em SDS-PAGE e analisadas, por

“imunoblotting”, com anticorpos anti-fosfo-p38 (A) e anti-fosfo-ERK1/2 (B). ON:

“overnight”. Controle: células sem infecção; ST 3h: células infectadas com Salm.

Typhimurium 14028 por 3h; SbON + ST 3h: células pré-incubadas com S. boulardii e

infectadas, por 3 h, com Salm. Typhimurium 14028; SbS + ST 3h: meio de S. boulardii

crescida em DMEM/F12, durante 12 horas, centrifugado, filtrado e colocado nas células

na proporção de 1:1 (1 de DMEM/F12 e 1 de SbS) e infectadas com Salm.

Typhimurium 14028, por 3h; SbS (T84) + ST 3h: SbS de S. boulardii crescida em

presença de células T84, durante 12 horas, centrifugado, filtrado e colocado nas células

na proporção de 1:1 (1 de DMEM/F12 e 1 de SbS-T84) e infectadas com Salm.

Typhimurium 14028 por 3h; Sb (3X PBS) + ST 3h: células pré-incubadas com S.

boulardii e lavadas 3X com PBS a 37°C, antes da infecção, para eliminar todas as

leveduras no sobrenadante e, também, qualquer possível substância secretada pela

levedura, e infectadas com Salm. Typhimurium 14028, por 3h. Obs: após lavagem com

PBS, restam 9 (± 3,17) x 10

UFC/poço de S. boulardii.

126

Controle

ST 3h

905ON + ST 3h

905S + ST 3h

905S(

T84

) + ST 3h

905(3X PBS) + ST 3h

Fosfo-p38

Fosfo-ERK1/2

Figura 29. Efeito de S. cerevisiae UFMG 905 (905) e do sobrenadante de S. cerevisiae

UFMG 905 (905S) na indução da fosforilação de MAP quinases (p38 e ERK1/2) pela

Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células T84. As células foram lisadas após 3h de

infecção com Salm. Typhimurium 14028 e as amostras foram corridas em SDS-PAGE e

analisadas, por “imunoblotting”, com anticorpos anti-fosfo-p38 (A) e anti-fosfo-

ERK1/2 (B). ON: “overnight”. Controle: células sem infecção; ST 3h: células infectadas

com Salm. Typhimurium 14028 por 3h; 905ON + ST 3h: células pré-incubadas com S.

cerevisiae UFMG 905 e infectadas, por 3 h, com Salm. Typhimurium 14028; 905S + ST

3h: meio de S. cerevisiae UFMG 905 crescida em DMEM/F12, durante 12 horas,

centrifugado, filtrado e colocado nas células na proporção de 1:1 (1 de DMEM/F12 e 1

de SbS) e infectadas com Salm. Typhimurium 14028, por 3h; 905S (T84) + ST 3h: 905S

de S. cerevisiae UFMG 905 crescida em presença de células T84, durante 12 horas,

centrifugado, filtrado e colocado nas células na proporção de 1:1 (1 de DMEM/F12 e 1

de 905S-T84) e infectadas com Salm. Typhimurium 14028 por 3h; Sb (3X PBS) + ST

3h: células pré-incubadas com S. cerevisiae UFMG 905 e lavadas 3X com PBS a 37°C,

antes da infecção, para eliminar todas as leveduras no sobrenadante e, também, qualquer

possível substância secretada pela levedura, e infectadas com Salm. Typhimurium

14028, por 3h. Obs: após lavagem com PBS, restam 8,63 (± 1,37) x 10

UFC/poço de S.

cerevisiae UFMG 905.

127

V.9 Efeito de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na invasão celular, em

células T84, infectadas por Salm. Typhimurium 14028

Para explicar o modo de ação das leveduras S. boulardii e S. cerevisiae UFMG

905, levantou-se a hipótese de que elas poderiam modificar o crescimento bacteriano de

Salm. Typhimurium durante a infecção. Para verificar essa hipótese, as células foram

infectadas na presença ou não de uma das duas leveduras, co- e pré-incubadas e, ao final

de 3 horas de infecção, uma alíquota do sobrenadante foi retirada, diluída e plaqueada

em ágar MacConkey (Tabelas 3 e 4). O resultado da contagem de bactérias totais no

sobrenadante permite descartar-se a hipótese levantada, uma vez que o número de

bactérias não foi modificado de uma maneira estatisticamente significativa, tanto na

presença de S. boulardii (Tabela 3), quanto na presença de S. cerevisiae UFMG 905

(Tabela 4), independentemente de a levedura ter sido pré-incubada ou incubada no

momento da infecção bacteriana.

Ao contrário do que foi observado nos resultados com as MAPKs (Figuras 28 e

29), as substâncias secretadas pelas leveduras não são eficazes a ponto de impedir um

crescimento bacteriano. Trabalhando com S. boulardii e EHEC, e utilizando o mesmo

modelo celular, DAHAN et al. (2003) encontraram resultados semelhantes aos nossos,

mostrando que a levedura S. boulardii não é capaz de influenciar o crescimento

bacteriano. Nossos resultados vão ao encontro daqueles descritos por RODRIGUES et

al. (1996). Trabalhando com animais isentos de germes, esses autores mostraram que a

levedura S. boulardii não é capaz de inibir o crescimento de Salm. Typhimurium, S.

flexneri e nem de E. coli. MARTINS (2004), trabalhando com S. cerevisiae UFMG 905

e 6 diferentes bactérias patogênicas (Salm. Typhimurium, S. flexneri, E. coli, V.

cholerae, C. difficile e C. perfringens) demonstrou que essa levedura não era capaz de

inibir, in vivo, o crescimento de patógenos.

PECQUET et al. (1991), também trabalhando com S. cerevisiae, observaram

que a levedura não era capaz de inibir o crescimento de E. coli, Staphylococcus aureus,

V. parahaemolyticus, V. cholerae e C. difficile, em camundongos GN. Apesar de ser

muito bem descrito na literatura que a levedura S. boulardii não exibe, como

mecanismo de ação, a inibição do crescimento de patógenos, in vivo, SCEVOLA et al.

(2003) demonstraram que uma linhagem de S. cerevisiae conseguia diminuir a

população de Candida spp. em alguns voluntários humanos. DUCLUZEAU &

BENSAADA (1982) observaram que S. boulardii foi capaz de diminuir os níveis

128

populacionais de algumas espécies de Candida, tanto curativa quanto preventivamente

e, que este antagonismo desaparecia quando a levedura era inativada por calor.

Uma vez que a adesão celular é a primeira etapa da patogenia de bactérias

entero-aderentes, como é o caso da Salm. Typhimurium e das EHEC, avaliou-se o efeito

das leveduras S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 na adesão e na invasão bacteriana.

Para isso, utilizou-se o método de proteção pela gentamicina. Após 3 horas de infecção,

metade das células foram lavadas com PBS, para eliminar todas as bactérias não

aderidas, lisadas, vortexadas, diluídas e plaqueadas em ágar MacConkey. A outra

metade foi tratada com meio contendo gentamicina (um antibiótico que não entra nas

células), durante uma hora, para eliminar todas as bactérias exteriores, deixando as

bactérias intracelulares vivas. Após esse tempo, as células foram lavadas

extensivamente com PBS, para eliminar todo o antibiótico residual, lisadas com

tripsina, vortexadas, diluídas e plaqueadas em ágar MacConkey. A porcentagem de

invasão celular foi calculada do seguinte modo: porcentagem de invasão = número de

bactérias intracelulares / número de bactérias associadas às células (aderentes e

intracelulares), conforme descrito por FALKOW et al. (1987). Os resultados estão

mostrados nas Tabelas 3 e 4.

A Tabela 3 mostra que não houve uma diferença estatisticamente significativa

no número de bactérias aderidas às células, na presença ou não de S. boulardii;

entretanto, o número de bactérias intracelulares foi, aproximadamente, 19 vezes menor

e, a porcentagem de invasão, 32 vezes menor, no grupo pré-tratado com S. boulardii e

infectado com Salm. Typhimurium 14028, em relação ao grupo que continha apenas

Salm. Typhimurium 14028. A Tabela 4 mostra que também não houve uma diferença

estatística no número de bactérias aderidas às células, na presença ou não de S.

cerevisiae UFMG 905. O número de bactérias intracelulares foi, aproximadamente, 21

vezes menor e a porcentagem de invasão foi 8,4 vezes menor, no grupo pré-tratado com

S. cerevisiae UFMG 905 e infectado com Salm. Typhimurium 14028, em relação ao

grupo que continha apenas a bactéria.

A porcentagem de invasão de Salm. Typhimurium encontrada em nossos

resultados vão ao encontro daqueles descritos por RAFFATELLU et al. (2005).

RODRIGUES (2000) já havia mostrado o efeito de S. boulardii na invasão de Salm.

Typhimurium em camundongos. Resultados encontrados na primeira parte do nosso

trabalho mostraram que S. cerevisiae UFMG 905 é capaz de diminuir ou inibir a

translocação de Salm. Typhimurium, em camundongos gnotobióticos e convencionais.

129

Para tentar explicar a modulação exercida pelas duas leveduras nas vias de

sinalização celular, RTE, níveis de IL-8 e demais resultados encontrados, várias

hipóteses podem ser levantadas. Uma primeira explicação poderia ser o efeito das

leveduras no crescimento bacteriano, o que, pelos resultados obtidos, foi descartada.

Entretanto, como as leveduras influenciam a quantidade de bactérias intracelulares, duas

hipóteses foram, a princípio, levantadas. Uma primeira hipótese, é que a levedura

influenciaria nos mecanismos de invasão bacteriana e, uma segunda hipótese, é que, ao

se ligarem às células intestinais, as leveduras diminuiriam a quantidade de receptores

livres para as bactérias e, parte dessas bactérias se ligaria às leveduras, e não às células,

o que diminuiria o número de bactérias internalizadas nas células intestinais.

Para testar a primeira hipótese, avaliou-se a influência das leveduras na ativação

de duas proteínas regulatórias (Rac1 e Cdc42), que são responsáveis pelos rearranjos

dos filamentos de actina que possibilitam a internalização bacteriana. Para isso, as

células foram infectadas, na presença ou não de uma das leveduras. Ao final da

infecção, as células foram lisadas, as proteínas separadas por SDS-PAGE, transferidas

para as membranas e incubadas com anticorpos, anti-fosfo-Cdc42 e anti-fosfo-Rac1, e

reveladas. A Figura 30 mostra o efeito de S. boulardii na ativação das vias Rac e Cdc42

induzidas pela Salm. Typhimurium 14028. Pelos resultados, podemos observar que S.

boulardii foi eficaz ao inibir a fosforilação da proteína Rac pela Salm. Typhimurium

14028. Entretanto, o mesmo resultado não foi observado para Cdc42. Quando se

utilizou a levedura S. cerevisiae UFMG 905 no lugar de S. boulardii, não foi observada

a inibição da fosforilação de nenhuma das duas proteínas (dados não mostrados). Os

resultados sugerem que o mecanismo de diminuição de invasão da Salm. Typhimurium

14028 pela levedura S. boulardii pode estar relacionado com a inibição da ativação de

Rac pela S. boulardii. Para a levedura S. cerevisiae UFMG 905, um outro mecanismo

pode estar implicado na diminuição da invasão de Salm. Typhimurium 14028,

sugerindo que os mecanismos de ação das duas leveduras, nesse caso, sejam distintos.

A infecção por Salm. Typhimurium envolve invasão das células epiteliais

intestinais, indução de um infiltrado inflamatório e uma eventual erosão da arquitetura

da mucosa (SANTOS et al., 2001). Análises genéticas mostraram que a expressão de

SPI1-TTSS e a translocação de proteínas efetoras são requeridas para o processo de

invasão bacteriana de celulas epiteliais, assim como a produção de enterite em modelos

animais (GALÁN, 2001; ZHANG et al., 2002). A retirada da Salmonella pelas células

não fagocíticas do epitélio intestinal envolve uma série de mudanças complexas no

130

citoesqueleto de actina, que é induzida pelas proteínas efetoras translocadas. Três

processos bioquímicos podem ser citados: (1) a ativação de pequenas proteínas

regulatórias do citoesqueleto: Cdc42 e Rac1; (2) a interação dos efetores bacterianos

com a actina promovendo a polimerização e empacotamento de filamentos de actina; e

(3) a restauração do citoesqueleto, após a invasão bacteriana.

A invasão pela Salmonella é caracterizada pela formação de “ruffles” na

membrana, levando à macropinocitose e engolfamento da bactéria, numa espécie de

vacúolo conhecido como SVC. Os efetores SopB, SopE e SopE2 estão envolvidos na

ativação das GTPases da família Rho, Cdc42 e Rac1 (HARDT et al., 1998; ZHOU et

al., 2001). As proteínas G específicas requeridas para a invasão da Salmonella parecem

se diferenciar, dependendo do tipo e da orientação. SopB é uma inositol 3-fosfato que

aumenta os níveis de (1,4,5,6)P4, levando à ativação de Cdc42 (ZHOU et al., 2001).

SopE e SopE2 são fatores de troca de nucleotídeos guanina para Cdc42 e Rac1

(HARDT et al., 1998; STENDER et al., 2000). SopE é codificado em um fago

lisogênico e está presente apenas em algumas amostras de serovar Typhimurium,

enquanto SopE2 está presente em todo o gênero Salmonella (STENDER et al., 2000). A

ativação de Cdc42 e Rac1 leva ao recrutamento e ativação das famílias de proteínas

WASP e Scar/WAVE, que, juntas com o complexo Arp2/3, estão envolvidas no início

da polimerização de actina (CRISS & CASANOVA, 2003). A perda das funções

combinadas de SopB e SopE/E2 resulta em danos no processo de invasão. Junto com a

ativação da proteína G, a Salmonella transloca duas proteínas ligadoras de actina, SipA

e SipC (MCGHIE et al., 2001; HAYWARD & KORONAKISS, 2002). SipC é também

requerido para a função de translocação de SPI1-TTSS e é inserido na membrana da

célula alvo. Sua localização na membrana pode direcionar a formação de filamentos de

actina, em locais apropriados, em posição adjacente à bactéria invasora (HAYWARD &

KORONAKIS, 1999; MCGHIE et al., 2001). O papel exato da atividade de ligação de

SipC à actina ainda não foi descoberto geneticamente, uma vez que mutantes para SipC

não conseguem transportar todo o aparato efetor de SPI1-TTSS. Estudos mostraram que

SipA se liga a subunidades de actina, formando filamentos estáveis (LILIC et al., 2003).

Tudo indica que SipA e SipC agem em parceria, promovendo a polimerização de actina

e o empacotamento de F-actina, nos locais de invasão bacteriana. Dessa maneira, o

recrutamento da maquinaria Arp2/3, mediado pela proteína G, junto com a ligação de

actina localizada mediada por SipA e SipC, resulta na polimerização de actina, que

conduz ao engolfamento da bactéria.

131

A Salmonella também transporta a proteína SptP, que é responsável em reverter

os rearranjos do citoesqueleto induzidos durante a invasão (GALÁN, 2001). SptP é uma

proteína bi-funcional com um domínio ativador de GTPase (GAP), na região N-

terminal, e atividade tirosina fosfatase na região C-terminal (FU & GALÁN, 1999;

MURLI et al., 2001). A função GAP reverte a ativação das proteínas G, Cdc42 e Rac, e

é responsável por restaurar a arquitetura normal do citoesqueleto, logo após a invasão da

Salmonella (FU & GALÁN, 1999). A fosforilação de tirosina das proteínas do

hospedeiro também parece estar envolvida na invasão, assim como a transdução de

sinais nucleares na expressão de genes inflamatórios (MURLI et al., 2001). Todos esses

processos são revertidos pela atividade tirosina fosfatase presente na região C-terminal

do SptP (KUBORI & GALÁN, 2003).

Para testar a segunda hipótese, de ligação da Salmonella em sítios das leveduras

S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905, foram utilizadas técnicas de microscopia

confocal e microscopia eletrônica. Os resultados são mostrados nas Figuras 31, 32 e 33.

As Figuras 31 e 32 apresentam fotos de microscopia eletrônica de varredura

mostrando a ligação de Salm. Typhimurium 14028 em células de S. boulardii e S.

cerevisiae UFMG 905, respectivamente. A Figura 33 mostra uma foto de microscopia

confocal, onde podemos observar a ligação de Salm. Typhimurium 14028 em S.

boulardii.

GEDEK & AMSELGRUBER (1990) e GEDEK (1999) já haviam mostrado a

adesão de E. coli O157 e de Salm. Typhimurium DT 104 à superfície de S. boulardii.

PEREZ-SOTELO et al. (2005) mostraram que bactérias patogênicas, como E. coli e

Salmonella spp., foram capazes de se ligar a uma linhagem de S. cerevisiae utilizada em

nutrição animal, sugerindo que esse pode ser um provável mecanismo pelo qual os

animais tratados com essa levedura se tornem mais resistentes às infecções por essas

bactérias.

Resultados de outros autores (BRANDÃO et al., 1998, NEVES et al., 2002)

sugerem que S. boulardii também possui receptores para toxinas bacterianas. OATLEY

et al. (2000) e GRATZ et al. (2005) mostraram que a aflatoxina B1 foi capaz de se ligar

em bifidobacteria e em Lactobacillus e Propionibacterium.

Bactérias do gênero Salmonella desenvolveram diversos mecanismos anti-

inflamatórios, como a via PI3K/Akt (phosphatidyl-inositol-3-kinase), que podem

contribuir para a manutenção da infecção, uma vez que a bactéria foi englobada pela

132

célula, via TTSS (HUANG et al., 2005). As Figuras 34 e 35 mostram que as duas

leveduras são capazes de inibir essa via ativada pela Salmonella.

Akt, também conhecido como PKB ou Rac, desempenha um importante papel

no controle do balanço entre a sobrevivência e a apoptose. Essa proteína quinase é

ativada por insulina e por diversos fatores de crescimento e sobrevivência e, promove a

sobrevivência celular, inibindo a apoptose, devido à sua habilidade em fosforilar e

inativar diversos alvos, incluindo caspase-9, c-Raf e Bad. Uma vez estimulado, Akt é

recrutado do citosol, em uma conformação inativa, para as membranas celulares.

Entretanto, sua atividade não é estimulada apenas por sua translocação, mas sim,

dependente, também, da fosforilação em dois resíduos (Thr308 e Ser473). A

fosforilação e ativação de Akt por Salm. Typhimurium é absolutamente dependente da

secreção de SopB (também conhecido por SipD) pelo SPI1-TTSS (STEELE-

MORTIMER et al., 2000). Essa proteína efetora desfosfoforila uma variedade de

inositol-fosfatos soluvéis, assim como inositol-fosfolipideos, e converte inositol

1,3,4,5,6-pentafosfato [Ins(1,3,4,5,6)P

] em inositol 1,4,5,6-tetrafosfato [Ins(1,4,5,6)P

KNODLER et al. (2005) observaram que, em células epiteliais infectadas por

Salmonella, a apoptose foi bloqueada, e demonstraram que SopB possui uma atividade

anti-apoptótica dependente da atividade fosfatase de SopB e da presença de Akt.

HUANG et al. (2005) observaram que a inibição da via PI3K/Akt, em células T84,

resultava em um aumento dos níveis de IL-8, em células infectadas por Salm.

Typhimurium, indicando que a ativação dessa via, como um sinal anti-inflamatório,

pode contribuir para o estabelecimento da Salmonella no intestino.

133

Tabela 3. Efeito de S. boulardii na adesão e invasão de Salm. Typhimurium 14028, em células T84.

Média ± Desvio-padrão

Tratamento celular

Bactérias associadas

às células

(x 10

UFC/poço)

Bactérias

intracelulares

(x 10

UFC/poço)

Bactérias totais no

sobrenadante

(x 10

UFC/poço)

% Invasão

Salm. Typhimurium 14028

2,25 ± 0,21 3,00 ± 0,30 1,62 ± 0,79 11,78 ± 0,90

S. boulardii + Salm. Typhimurium 14028

3,80 ± 0,52 2,00 ± 0,13 1,88 ± 0,51 5,12 ± 0,64*

S. boulardii (ON) + Salm. Typhimurium 14028

4,56 ± 0,10 0,16 ± 0,07 1,85 ± 0,42 0,37 ± 0,20*

As células foram infectadas durante 3h, com a Salm. Typhimurium 14028 (~100 bactérias/célula), na presença ou ausência de S. boulardii (~10

leveduras/célula), co- e pré incubada. O teste de invasão foi realizado pelo método de proteção pela gentamicina. * P < 0,05. ON, “overnight”.

134

Tabela 4. Efeito de S. cerevisiae UFMG 905 na adesão e invasão de Salm. Typhimurium 14028, em células T84.

Média ± Desvio-padrão

Tratamento celular

Bactérias associadas

às células

(x 10

UFC/poço)

Bactérias

intracelulares

(x 10

UFC/poço)

Bactérias totais no

sobrenadante

(x 10

UFC/poço)

% Invasão

Salm. Typhimurium 14028

2,61 ± 0,32 5,70 ± 0,10 1,62 ± 0,79 2,16 ± 0,46

S. cerevisiae 905 + Salm. Typhimurium 14028

2,30 ± 0,21 3,85 ± 0,75 1,79 ± 0,40 1,68 ± 0,51

S. cerevisiae 905 (ON) + Salm. Typhimurium 14028

1,15 ± 0,25 0,27 ± 0,11 1,81 ± 0,18 0,26 ± 0,18*

As células foram infectadas durante 3h, com a Salm. Typhimurium 14028 (~100 bactérias/célula), na presença ou ausência de S. cerevisiae

UFMG 905 (~10 leveduras/célula), co- e pré incubada. O teste de invasão foi realizado pelo método de proteção pela gentamicina. * P < 0,05.

ON, overnight.

135

Controle

SbON

ST 3h

SbON + ST 3h

Rac-GTP

Rac total

Cdc42-GTP

Cdc42 total

Figura 30. Efeito de S. boulardii (Sb) na ativação das vias Rac e Cdc42 induzidas pela

Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células T84. As células foram lisadas, após 3h de

infecção com Salm. Typhimurium 14028, e as amostras foram corridas em SDS-PAGE

e analisadas, por “imunoblotting” com anticorpos anti-Rac (A) ou anti-Cdc42 (B). ON,

“overnight”.

136

Figura 31. Microscopia eletrônica de varredura mostrando a ligação de Salm.

Typhimurium 14028 em células de S. boulardii. (A) Controle (apenas células T84); (B)

Células contendo apenas S. boulardii; (C) Células contendo Salm. Typhimurium 14028;

(D, E, F) Células mostrando ligação de Salm. Typhimurium 14028 em S. boulardii.

137

Figura 32. Microscopia eletrônica de varredura mostrando a ligação de Salm.

Typhimurium 14028 em células de S. cerevisiae UFMG 905. (A) Controle (apenas

células T84); (B) Células contendo apenas S. cerevisiae UFMG 905; (C) Células

contendo Salm. Typhimurium 14028; (D, E, F) Células mostrando ligação de Salm.

Typhimurium 14028 em S. cerevisiae UFMG 905.

A B

138

Figura 33. Microscopia confocal mostrando a ligação de Salm. Typhimurium 14028

(vermelho) em células de S. boulardii (azul).

139

ST Sb + ST Sb (ON) + ST

C Sb 1h 2h 3h 1h 2h 3h 1h 2h 3h

Fosfo-Akt

Figura 34. Efeito de S. boulardii (Sb), na indução da via PI3K-Akt (phosphatidyl-

inositol-3-kinase) pela Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células T84. As células

foram lisadas após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm. Typhimurium 14028 e as

amostras foram corridas em SDS-PAGE e analisadas, por “imunoblotting” com

anticorpo anti-fosfo-Akt. C, controle; ON, “overnight”.

140

ST 905 + ST 905 (ON) + ST

C 905 1h 2h 3h 1h 2h 3h 1h 2h 3h

Phospho-Akt

Figura 35. Efeito de S. cerevisiae UFMG 905 (905) , na indução da via PI3K-Akt

(phosphatidyl-inositol-3-kinase) pela Salm. Typhimurium 14028 (ST), em células T84.

As células foram lisadas após 1h, 2h e 3h de infecção com Salm. Typhimurium 14028 e

as amostras foram corridas em SDS-PAGE e analisadas, por “imunoblotting” com

anticorpo anti-fosfo-Akt. C, controle; ON, “overnight”.

141

VI - SÍNTESE DOS RESULTADOS

142

Os resultados obtidos podem ser resumidos como a seguir:

VI.01 A levedura S. cerevisiae UFMG 905 é capaz de translocar, em níveis baixos,

para as placas de Peyer, em animais GN, e para as placas de Peyer e linfonodos

mesentéricos, em animais CV, após 10 dias de monoassociação ou tratamento,

respectivamente.

VI.02 Saccharomyces cerevisiae UFMG 905 diminui a translocação de Salm.

Typhimurium para o baço e linfonodos mesentéricos e retarda a translocação dessa

bactéria para o fígado, em animais GN, e inibe a translocação para os linfonodos

mesentéricos, baço e fígado, em animais CV, após 5 e 10 dias de desafio.

VI.03 Saccharomyces cerevisiae UFMG 905 estimula o aumento de células de

Küpffer, em animais GN, após 10 dias de monoassociação.

VI.04 Saccharomyces cerevisiae UFMG 905 estimula o sistema fagocítico de

camundongos GN, o que é comprovado pelo aumento da capacidade de clareamento do

sangue, quando do desafio endovenoso com uma bactéria Gram-negativo.

VI.05 Saccharomyces cerevisiae UFMG 905 estimula o aumento dos níveis de sIgA,

no fluido intestinal, e de IgA e IgM, no soro de animais GN, após 10 dias de

monoassociação.

VI.06 Saccharomyces boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 mantêm a integridade das

células do epitélio intestinal, após infecção com Salm. Typhimurium 14028.

VI.07 Saccharomyces boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 exercem um efeito

preventivo na produção de IL-8, durante uma infecção por Salm. Typhimurium 14028,

em células do cólon.

VI.08 Saccharomyces boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 diminuem e/ou bloqueiam

as MAPKs ativadas em células epiteliais, após infecção por Salm. Typhimurium 14028,

sendo esse efeito das duas leveduras, uma vez que a linhagem de laboratório, S.

cerevisiae W303, não foi capaz de exercer esse mesmo efeito.

143

VI.09 Saccharomyces boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 não diminuem a ativação

do principal fator de transcrição para IL-8, o NF-κB.

VI.10 O efeito benéfico de S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 pode ser devido à

produção de substância(s) anti-inflamatória(s), uma vez que o sobrenadante das

leveduras foi capaz de bloquear a ativação das MAPKs p38 e ERK1/2.

VI.11 Saccharomyces boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 diminuem a porcentagem

de invasão celular pela Salm. Typhimurium 14028 e essa diminuição está relacionada à

diminuição da via Rac-1 (para S. boulardii) ativada pela Salm. Typhimurium 14028 e à

capacidade da bactéria em se ligar às leveduras (para S. boulardii e S. cerevisiae UFMG

905), ao invés de se ligar à célula epitelial.

VI.12 Saccharomyces boulardii e S. cerevisiae UFMG 905 inibem a ativação da via

PI3K/Akt, que é uma via ativada pela Salm. Typhimurium 14028, após a sua

internalização e que contribui para a manutenção da infecção.

144

VII - CONCLUSÕES

145

Sustentado pelos resultados encontrados, podemos concluir que:

VII.1 Tanto S. boulardii quanto S. cerevisiae UFMG UFMG 905 são capazes de

reduzir os efeitos patogênicos de Salm. Typhimurium, durante infecções experimentais,

em camundongos e em culturas celulares.

VII.2 Essa redução dos efeitos patogênicos da Salm. Typhimurium parece resultar de

uma estimulação do sistema imune e supressão de sinais intracelulares gerados pela

infecção.

146

VIII - PERSPECTIVAS

147

Após todos os resultados obtidos, temos como perspectivas:

VIII.1 Uma vez que a levedura S. cerevisiae UFMG 905 possui um efeito

imunomodulador e um efeito benéfico em camundongos desafiados com Salm.

Typhimurium, seria interessante verificar esse efeito em outras infecções bacterianas,

além de estudar os outros mecanismos de ação para, posteriormente, passarmos para

ensaios clínicos.

VIII.2 Como as duas leveduras (S. boulardii e S. cerevisiae UFMG 905) possuem um

efeito na inflamação e nas vias envolvidas nessa inflamação desencadeada pela Salm.

Typhimurium em células do epitélio intestinal, seria interessante verificar se todos esses

mecanismos se repetem num modelo in vivo.

VIII.3 Uma vez que a levedura S. boulardii está envolvida na inibição da via Rac

ativada pela Salm. Typhimurium, é de interesse verificar se a levedura está implicada

em outros mecanismos de invasão utilizados pela bactéria.

VIII.4 Evidenciado o efeito anti-inflamatório das duas leveduras pela produção de

substâncias que inibem a ativação de MAPKs pela Salm. Typhimurium, pode-se estudar

o efeito desse sobrenadante das leveduras, na inflamação e na invasão, além de

identificar quais são as substâncias responsáveis por esse efeito.

VIII.5 Além de todas as perpectivas citadas, também será importante verificar outros

mecanismos de ação das leveduras responsáveis pela diminuição da inflamação, como

uma imunomodulação, via produção de citocinas anti-inflamatórias, como a IL-10.

VIII.6 Após o estudo dos mecanismos de ação da levedura S. cerevisiae UFMG 905,

realizar ensaios clínicos.

148

IX - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

149

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211

X - ANEXOS

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X.1 Artigos publicados

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J.R. Efeito do método de conservação na viabilidade, reativação, colonização intestinal

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MARTINS, F.S.; RODRIGUES, A.C.P.; TIAGO, F.C.P.; PENNA, F.J.; ROSA, C.A.;

ARANTES, R.M.E.; NARDI, R.M.D.; NEVES, M.J.; NICOLI, J.R. Saccharomyces

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213

X.2 Artigos aceitos para publicação

MARTINS, F.S.; MIRANDA, I.C.; ROSA, C.A.; NICOLI, J.R.; NEVES, M.J. Effect

of the trehalose levels on the screening of yeast as probiotic by in vivo and in vitro

assays. (Artigo submetido à revista “Brazilian Journal of Microbiology” e aceito para

publicação).

214

X.3 Artigos a publicar

MARTINS, F.S.; LAGADEC, P. PEYRON, J-F; NICOLI, J.R.; RAMPAL, P.;

CZERUCKA, D. The probiotic yeast Saccharomyces boulardii prevents Salmonella

Typhimurium infection of T84 cells. (Este artigo será submetido à revista “Infection and

Immunity”).

MARTINS, F.S.; DALMASSO, G.; IMBERT, V.; PEYRON, J-F; NEVES, M.J.;

ROSA, C.A.; PENNA, F.J.; NICOLI, J.R. Effects of Saccharomyces cerevisiae strain

905 on barrier function and signal transduction pathway in T84 cells infected by

Salmonella enterica serovar Typhimurium. (Este artigo será submetido à revista

“Journal of Medical Microbiology”).

MARTINS, F.S.; DALMASSO, G.; DOYE, A.; LEMICHEZ, E.; IMBERT, V.;

PEYRON, J-F; RAMPAL, P.; NICOLI, J.R.; CZERUCKA, D. Epithelial integrity,

inflammation and involvement of MAP Kinases of T84 intestinal cells infected with

Salmonella enterica serovar Typhimurium. (Este artigo será submetido à revista

“Journal of Medical Microbiology”).

MARTINS, F.S.; VELOSO, L.C.; ARANTES, R.M.E.; NICOLI, J.R. Comparação de

cinco preparações comerciais contendo Saccharomyces boulardii, na forma liofilizada,

ou Saccharomyces cerevisiae, em suspensão, em termos de proteção contra a infecção

experimental por Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Typhimurium em

camundongos convencionais.

215

X.4 Participação em eventos

III Fórum de Microbiologia do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do

Instituto de Ciências Biológicas da UFMG. Departamento de Microbiologia, Instituto

de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais.. Belo Horizonte/MG,

11 de Abril de 2007.

WORKSHOP: BIOQUÍMICA E FISIOLOGIA DE MICRORGANISMOS:

ASPECTOS BÁSICOS E APLICADOS. Programa de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro

Preto. Ouro Preto, 30 de Abril a 02 de Maio de 2007.

X INTERNATIONAL UNION OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR

BIOLOGY CONFERENCE & XXXVI ANNUAL MEETING OF SBBq

(SOCIEDADE BRASILEIRA DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR).

Salvador/BA, Brasil, 21 a 25 de Maio de 2007.

216

X.5 Trabalhos apresentados em eventos

MARTINS, A.K.S.; MARTINS, F.S.; TIAGO, F.C.P.; CARA, D.C.; ROSA, C.A.;

PENNA, F.J.; NEVES, M.J.; NARDI, R.M.D.; NICOLI, J.R. Efeito do método de

conservação na viabilidade, reativação, colonização intestinal e efeito imunomodulador

de dois produtos probióticos à base de leveduras. II Fórum do Programa de Pós-

Graduação em Microbiologia. Belo Horizonte/MG, 15 de Março de 2006.

MARTINS, F.S.; DALMASSO, G.; VELOSO, L.C.; DOYE, A.; LEMICHEZ, E.;

IMBERT, V.; PEYRON, J-F; RAMPAL, P.; NICOLI, J.R.; CZERUCKA, D. Efeitos de

Saccharomyces boulardii na invasão, integridade epitelial e sinalização celular

induzidas em células intestinais infectadas por Salmonella enterica serovar

Typhimurium. III Fórum de Microbiologia do Programa de Pós-Graduação em

Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG. Belo Horizonte/MG, 11

de Abril de 2007.

VELOSO, L.C.; MARTINS, F.S.; NICOLI, J.R. Comparação de cinco preparações

comerciais contendo Saccharomyces boulardii ou S. cerevisiae em termos de proteção

contra a infecção experimental por Salmonella enterica subsp. enterica sorovar

Typhimurium em camundongos convencionais. III Fórum de Microbiologia do

Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da

UFMG. Belo Horizonte/MG, 11 de Abril de 2007.

MARTINS, A.K.S.; MARTINS, F.S.; VELOSO, L.C.; CARA, D.C.; NICOLI, J.R.

NARDI, R.M.D. Estudo de antagonismo in vitro, ex vivo e in vivo do probiótico

biovicerin® contra microorganismos patogênicos. III Fórum de Microbiologia do

Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da

UFMG. Belo Horizonte/MG, 11 de Abril de 2007.

TIAGO, F.C.P.; MARTINS, F.S.; VELOSO, L.C.; CARA, D.C.; ROSA, C.A.;

NICOLI, J.R. Estudo de leveduras de origem ambiental para uso como probiótico. III

Fórum de Microbiologia do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do Instituto

de Ciências Biológicas da UFMG. Belo Horizonte/MG, 11 de Abril de 2007.

217

MARTINS, F.S.; DALMASSO, G.; DOYE, A.; LEMICHEZ, E.; IMBERT, V.;

PEYRON, J-F; RAMPAL, P.; NICOLI, J.R.; CZERUCKA, D. Efeitos de

Saccharomyces boulardii na invasão, integridade epitelial e sinalização celular

induzidas em células intestinais infectadas por Salmonella enterica serovar

Typhimurium. WORKSHOP: BIOQUÍMICA E FISIOLOGIA DE

MICRORGANISMOS: ASPECTOS BÁSICOS E APLICADOS. Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas,

Universidade Federal de Ouro Preto. Ouro Preto, 30 de Abril a 02 de Maio de 2007.

TIAGO, F.C.P.; MARTINS, F.S.; VELOSO, L.C.; CARA, D.C.; ROSA, C.A.;

NICOLI, J.R. Estudo de leveduras de origem ambiental para uso como probiótico.

WORKSHOP: BIOQUÍMICA E FISIOLOGIA DE MICRORGANISMOS:

ASPECTOS BÁSICOS E APLICADOS. Programa de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro

Preto. Ouro Preto, 30 de Abril a 02 de Maio de 2007.

MARTINS, F.S.; BARBOSA, F.H.F.; CARA, D.C.; ROSA, C.A.; PENNA, F.J.;

NEVES, M.J.; NICOLI, J.R. Efeito do método de conservação na viabilidade,

reativação, colonização intestinal e efeito imunomodulador de dois produtos probióticos

contendo Saccharomyces boulardii ou Saccharomyces cerevisiae. III CONGRESSO

LATINO AMERICANO DE HIGIENISTAS DE ALIMENTOS / IX CONGRESSO

BRASILEIRO DE HIGIENISTAS DE ALIMENTOS / II ENCONTRO NACIONAL

DE CENTROS DE CONTROLE DE ZOONOSES. Porto Seguro/BA. 01 a 04 de Maio

de 2007.

TIAGO, F.C.P.; MARTINS, F.S.; SOUZA, T.C.; CARA, D.C.; ROSA, C.A.; NICOLI,

J.R. Seleção de leveduras do gênero Pichia para uso como probiótico. III CONGRESSO

LATINO AMERICANO DE HIGIENISTAS DE ALIMENTOS / IX CONGRESSO

BRASILEIRO DE HIGIENISTAS DE ALIMENTOS / II ENCONTRO NACIONAL

DE CENTROS DE CONTROLE DE ZOONOSES. Porto Seguro/BA. 01 a 04 de Maio

de 2007.

LIMA, L.P.J.; BARBOSA, F.H.F.; BAMBIRRA, F.H.S.; BAMBIRRA, L.H.S.;

MARTINS, F.S. Produção de proteínas unicelulares (Candida utilis) a partir de vinhoto

218

de cana-de-açúcar suplementado com fontes de carbono alternativas para a alimentação

animal. III CONGRESSO LATINO AMERICANO DE HIGIENISTAS DE

ALIMENTOS / IX CONGRESSO BRASILEIRO DE HIGIENISTAS DE

ALIMENTOS / II ENCONTRO NACIONAL DE CENTROS DE CONTROLE DE

ZOONOSES. Porto Seguro/BA. 01 a 04 de Maio de 2007.

MARTINS, F.S.; DALMASSO, G.; DOYE, A.; LEMICHEZ, E.; IMBERT, V.;

PEYRON, J-F.; RAMPAL, P.; NICOLI, J.R.; CZERUCKA, D. Effects of

Saccharomyces boulardii on the invasion, barrier function and signal transduction

pathway induced in Salmonella enterica serovar Typhimurium-infected T84 cells. X

INTERNATIONAL UNION OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY

CONFERENCE & XXXVI ANNUAL MEETING OF SBBq (SOCIEDADE

BRASILEIRA DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR). Programas e

Resumos da X IUBMB Conference 2007 & XXXVI Annual Meeting of SBBq.

Salvador/BA, Brasil, 21 a 25 de Maio de 2007.

MARTINS, F.S.; MARTINS, A.K.S.; DALMASSO, G.; DOYE, A.; LEMICHEZ, E.;

IMBERT, V.; PEYRON, J-F.; RAMPAL, P.; NICOLI, J.R.; CZERUCKA, D. Effects of

Salmonella enterica serovar Typhimurium infection in the epithelial integrity,

inflammation and implication of MAP kinases in response to the infection in cells. X

INTERNATIONAL UNION OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY

CONFERENCE & XXXVI ANNUAL MEETING OF SBBq (SOCIEDADE

BRASILEIRA DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR). Programas e

Resumos da X IUBMB Conference 2007 & XXXVI Annual Meeting of SBBq.

Salvador/BA, Brasil, 21 a 25 de Maio de 2007.

MARTINS, F.S.; TIAGO, F.C.P.; DALMASSO, G.; IMBERT, V.; PEYRON, J-F.;

ROSA, C.A.; NEVES, M.J.; PENNA, F.J.; NICOLI, J.R. Effects of Saccharomyces

cerevisiae strain 905 in the barrier function and signal transduction pathway induced in

Salmonella enterica serovar Typhimurium-infected T84 cells. X INTERNATIONAL

UNION OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY CONFERENCE &

XXXVI ANNUAL MEETING OF SBBq (SOCIEDADE BRASILEIRA DE

BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR). Programas e Resumos da X IUBMB

219

Conference 2007 & XXXVI Annual Meeting of SBBq. Salvador/BA, Brasil, 21 a 25 de

Maio de 2007.

ELIAN, S.D.A.; MARTINS, F.S.; VELOSO, L.C.; ARANTES, R.M.E.; NARDI,

R.M.D.; NICOLI, J.R. Comparação de cinco preparações comerciais contendo

Saccharomyces boulardii ou S. cerevisiae em termos de viabilidade, velocidade de

reativação e proteção contra a infecção experimental por Salmonella enterica subsp.

enterica sorovar Typhimurium em camundongos convencionais. XVI Semana de

Iniciação Científica da UFMG. Belo Horizonte/MG, 01 a 05 de Outubro de 2007.

MARTINS, F.S.; LAGADEC, P. PEYRON, J-F; NICOLI, J.R.; RAMPAL, P.;

CZERUCKA, D. The probiotic yeast Saccharomyces boulardii prevents Salmonella

Typhimurium infection of T84 cells. 15th United European Gastroenterology Week. Le

Palais des Congrès de Paris, Paris, France. 27-31 de Outubro de 2007.

220

X.6 Prêmios recebidos

Trabalho selecionado para apresentação oral: Saccharomyces cerevisiae strain 905

reduces the translocation of Salmonella enterica serovar Typhimurium in mice,

XXIII CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA, 2005. Santos/SP, 22 a 25

de Novembro de 2005.

221

X.7 Autorização do Comitê de Ética para Experimentação Animal da

Universidade Federal de Minas Gerais (CETEA/UFMG)

222

X.8 Certificado de realização de estágio na Université de Nice, França

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