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DIVERSIDADE ENTRE ISOLADOS DE
ALTERNARIA SOLANI: AVALIAÇÃO
MORFOLÓGICA, FISIOLÓGICA E
MOLECULAR
MARCIANE DA SILVA OLIVEIRA
2007
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MARCIANE DA SILVA OLIVEIRA
DIVERSIDADE ENTRE ISOLADOS DE Alternaria solani: AVALIAÇÃO
MORFOLÓGICA, FISIOLÓGICA E MOLECULAR
Tese apresentada à Universidade Federal de
Lavras, como partes das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Genética e
Melhoramento de Plantas, para a obtenção do
título de “Doutora”
Orientadora
Profa. Dra. Elaine Aparecida de Souza
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
2007
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Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Oliveira, Marciane da Silva.
Diversidade entre isolados de Alternaria solani: avaliação morfológica,
fisiológica e molecular / Marciane da Silva Oliveira. -- Lavras: UFLA, 2007.
99 p. : il.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Lavras, 2007.
Orientador: Elaine Aparecida de Souza.
Bibliografia.
1. Batata. 2. Resistência a doenças. 3. Pinta-preta. 4. Alternaria. 5. Diversidade
genética. 6. Compatibilidade vegetativa. 7. Esporulação. I. Universidade Federal
de Lavras. II. Título.
CDD – 635.21944
MARCIANE DA SILVA OLIVEIRA
DIVERSIDADE ENTRE ISOLADOS DE Alternaria solani: AVALIAÇÃO
MORFOLÓGICA, FISIOLÓGICA E MOLECULAR
Tese apresentada à Universidade Federal de
Lavras, como partes das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Genética e
Melhoramento de Plantas, para a obtenção
do título de “Doutora”
APROVADA em 16 de outubro de 2007
Professor Dr. César Pereira Brasil Pinto UFLA
Pesquisadora Dra. Magnólia de Araújo Campos UFLA
Pesquisador Dr. Ailton Reis EMBRAPA
Pesquisador Dr. Paulo Eduardo Melo EMBRAPA
Profa. Dra. Elaine Aparecida de Souza
UFLA
(Orientadora)
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
A vovó Geralda (in memória),
Por sempre iluminar o meu caminho, por suas formosas, alegres e
memoráveis lembranças;
OFEREÇO
A minha amada Família, por serem os meus Olhos, para o que
não pude ver; minha Mão, para o que não alcancei; meus Pés
quando não consegui caminhar sozinha; minha Voz para
quando perdi a fala, a minha Força quando fraquejei. E,
principalmente, acreditarem em mim até mesmo quando eu não
acreditava!
DEDICO
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Lavras, principalmente ao Departamento de Biologia, pela
oportunidade de realização do curso de doutorado e ao CNPq, pela concessão da bolsa
de estudos.
À Professora Dra. Elaine Aparecida de Souza, orientadora, pelos ensinamentos
transmitidos e pela confiança em mim depositada e ao Professor Dr. César Brasil, pelas
importantes contribuições dadas à execução deste trabalho, além da disponibilidade para
atender-me quando as dúvidas surgiam e pelos ensinamentos transmitidos ao longo do
curso. Agradeço também pela participação na banca examinadora deste trabalho.
À Embrapa Hortaliças, especialmente ao Pesquisador Dr. Ailton Reis, pela oportunidade
de estágio e, também, ao Pesquisador Dr. Paulo Eduardo Melo, por ter concedido folhas
infectadas para a realização deste trabalho. Agradeço pelas participações na banca
examinadora deste trabalho e pelas valiosas sugestões
À Pesquisadora Dra. Magnólia Campos, pela disponibilidade de participação na banca
examinadora deste trabalho e pelas valiosas.
Aos professores do Departamento de Biologia da Universidade Federal de Lavras, em
especial aos professores do curso de Genética e Melhoramento de Plantas: João Bosco,
Magno Ramalho e Lisete Davide, pela amizade e conhecimentos transmitidos; à
Professora Dra. Flávia Avelar, por indicar as portas para essa longa jornada, além da
grande amizade e a toda a sua família.
Aos professores da Universidade Federal de Viçosa, por despertarem em mim o interesse
pela ciência e ter guiado os meus primeiros passos no mundo acadêmico.
Aos colegas do grupo da batata, principalmente ao Raimundo, por ter colaborado para a
realização deste trabalho e aos colegas do laboratório de Genética Molecular, em
especial ao Lamartine que, além da amizade, transmitiu-me seus conhecimentos práticos,
a partir dos quais foi possível a realização deste trabalho, também, a todos os
funcionários do Departamento de Biologia.
Aos companheiros do Laboratório de Resistência de Plantas à Doenças/UFLA,
sobretudo a Thaíssa pela valiosa ajuda e a todos os amigos do GEN pelos ótimos
momentos passados juntos.
Aos inesquecíveis: Mansuêmia, Wel e Juliana e as sempre amigas: Rose, Quélen,
Francine e Lívia, pela ótima convivência, pelos conselhos e companheirismo.
As eternas amigas: Malu, Ju, Flávia, Adriana, Maria e Mariana, que mesmo que nos
encontremos menos que gostaríamos, nunca deixamos nossa amizade enfraquecer.
Aos colegas do Centro Universitário de Caratinga, pelo excelente convívio,
principalmente as professoras Lamara e Patrícia, por muitas vezes ter compreendido a
minha ausência para que pudesse terminar a minha tese.
A minha mãe por ter que muitas vezes deixar a sua casa e me ajudar a vencer meus
fantasmas, ao meu pai, que ficava sozinho torcendo por mim, sem vocês eu não teria
conseguido.
Aos meus irmãos Maurinho e Cilo, pelo apoio logístico e principalmente sentimental,
pela amizade, companheirismo, torcida e por serem muito mais que exemplos. A minha
irmãzinha Mari, que me agüentou nos momentos de tristeza e comemorou comigo as
vitórias, por muitas vezes ter cuidado de mim.
Ao meu amado cãozinho Rick, por ter me ensinado o que é o amor incondicional.
Aos meus tios, tias, primos e amigos por todo o carinho e sempre me apoiarem,
incentivando-me para que nunca desistisse de alcançar meus objetivos.
“É difícil dizer o que é impossível, pois o
sonho de ontem é a esperança de hoje e a
realidade de amanhã. Acima de tudo, a
melhor forma de prever o amanhã é criá-lo.
Chega o momento de parar de sonhar e agir,
pois uma visão sem ação é somente um
sonho, uma ação sem visão é um passatempo.
E uma visão com ação pode transformar o
mundo”.
SUMÁRIO
Página
RESUMO...............................................................................................................i
ABSTRACT .........................................................................................................ii
CAPÍTULO 1........................................................................................................1
1 Introdução..........................................................................................................2
2 Referencial Teórico............................................................................................4
2.1 A pinta-preta na batata e no tomateiro............................................................4
2.2 O patógeno Alternaria solani ..........................................................................6
2.3 Caracterização morfológica e fisiológica de Alternaria solani ......................8
2.4 O ciclo parassexual e os passos envolvidos na formação do heterocário em
A. solani..............................................................................................................
11
2.5 Uso de marcadores moleculares no estudo de fitopatógenos........................15
2.6 Variabilidade genética de Alternaria solani.................................................16
3 Referências Bibliográficas...............................................................................20
CAPÍTULO 2:
Variabilidade morfológica e fisiológica de isolados de
Alternaria solani.................................................................................................
27
1 Resumo ............................................................................................................28
2 Abstract............................................................................................................29
3 Introdução........................................................................................................30
4 Material e Métodos ..........................................................................................32
4.1 Obtenção e manutenção dos isolados ...........................................................32
4.2 Avaliação dos caracteres morfológicos ........................................................32
4.2.1 Índice de velocidade de crescimento micelial (IVCM) .............................32
4.2.2 Diâmetro colonial ......................................................................................34
4.2.3 Taxa de esporulação...................................................................................34
4.2.4 Análises estatísticas ...................................................................................35
5 Resultados e Discussão....................................................................................36
6 Conclusões.......................................................................................................42
7 Referências Bibliográficas...............................................................................43
CAPÍTULO 3: D
iversidade genética entre isolados de Alternaria solani..........46
1 Resumo ............................................................................................................47
2 Abstract............................................................................................................48
3 Introdução........................................................................................................49
4 Material e Métodos ..........................................................................................52
4.1 Isolados de Alternaria solani.........................................................................52
4.2 Análises molecular........................................................................................52
4.2.1 Obtenção de massa micelial.......................................................................52
4.2.2 Extração de DNA total...............................................................................55
4.2.3 Reação ISSR ..............................................................................................56
4.3 Grupos de compatibilidade micelial (GCM).................................................58
4.4 Análises estatísticas ......................................................................................58
4.4.1 Análises dos grupos de compatibilidade micelial......................................58
4.4.2 Identificação do número ótimo de marcadores..........................................59
4.4.3 Estimativa das similaridades genéticas por marcadores ISSR...................60
5 Resultados e Discussão....................................................................................62
5.1 Análise molecular .........................................................................................62
5.1.1 Nível de polimorfismo...............................................................................62
5.1.2 Avaliação da variabilidade genética ..........................................................64
5.2 Grupos de compatibilidade micelial (GCM).................................................68
5.3 Considerações finais .....................................................................................73
6 Conclusões.......................................................................................................76
7 Referências Bibliográficas...............................................................................77
ANEXOS ............................................................................................................81
i
RESUMO
OLIVEIRA, Marciane da Silva. Diversidade entre isolados de Alternaria
solani: avaliação morfológica, fisiológica e molecular. 2007. 99p. Tese
(Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas) – Universidade Federal de
Lavras, Lavras, MG.
1
A pinta-preta da batata e do tomate, causada pelo fungo Alternaria
solani, é responsável por perdas expressivas na produtividade dessas solanáceas
no Brasil. As perdas podem atingir 50% da produção, sob condições ambientais
favoráveis ao desenvolvimento da doença. A estratégia de controle mais
eficiente é o emprego da resistência genética. No entanto, o sucesso no
desenvolvimento de estratégias para controle da doença requer o entendimento
dos níveis de variabilidade genética do patógeno. O objetivo deste trabalho foi
avaliar a diversidade de isolados de A. solani, coletados em diferentes campos de
produtividade de batata e tomate do Brasil, por meio de marcadores
morfológicos e fisiológicos, grupos de compatibilidade micelial (GCM) e
marcadores ISSR. Na análise morfológica e fisiológica as seguintes
características foram avaliadas: diâmetro da colônia, índice de velocidade do
crescimento micelial (ICVM), e taxa de esporulação. Os isolados apresentaram
ampla variabilidade para todas as características avaliadas. As estimativas de
similaridade genética entre os pares de isolados para a compatibilidade micelial
variaram de 0,02 a 0,73, com média de 0,23. Foi observada a formação de 36
grupos, sendo que, apenas três grupos foram formados por isolados que
apresentam o mesmo comportamento quanto à compatibilidade micelial (GCM).
Na análise de marcadores ISSR foram obtidas 85 bandas polimórficas. As
estimativas de similaridade genética entre os isolados variaram de 0,14 a 0,97,
com média 0,58. Na análise de agrupamento foram formados cinco grupos
contendo apenas dois isolados, um grupo com três isolados e dois grupos com
mais de 15 isolados. Dez isolados formaram grupos individuais. Em geral houve
tendência de formação de grupos por local de coleta. Apesar da ampla
variabilidade detectada por ambas as análises de GCM e marcadores ISSR, esta
não foi atípica para espécies de fungos de reprodução assexual.
1
Orientadora: Elaine Aparecida de Souza – UFLA/DBI
ii
ABSTRACT
Oliveira, Marciane da Silva.
Diversity among isolates of Alternaria solani:
morphological, physiological and molecular evaluations. 2007. 99p.
Thesis (Doctorate in Genetics and Plants Breeding) - Federal University of
Lavras, Lavras, MG.
Potato and tomato early blight caused by the fungus Alternaria solani, is
responsible for expressive yeld losses of those solanaceous in Brazil. Yeld losses
can reach up to 50%, under favorable environmental conditions for disease
development. The most efficient strategy for its control is the use of genetic
resistance. However, the success in developing strategies to control this disease
requires the understanding of levels of genetic variability of the pathogen. The
objective of this work was to evaluate the diversity of isolates of A. solani,
collected in different Brazilian potato and tomato crops, through morphological
and physiological markers, mycelial compatibility group (MCG) and ISSR
markers. The following characteristics were appraised: colony diameter,
mycelial growth velocity index (MGVI), and spore production rates. The isolates
presented wide variability for all characteristics. The estimates of genetic
similarity between pairs of isolates for the MCG varied from 0.02 to 0.73, with
0.23 average. The formation of 36 groups was observed, and, only three groups
were formed by isolates that show the same behavior concerning mycelial
compatibility. The ISSR markers produced 85 polymorphic bands. The estimates
of genetic similarity among the isolates varied from 0.14 to 0.97, with 0.58
average. In the cluster analysis five groups were formed containing two isolates,
a group with three isolates and two groups with more than 15 isolates. Ten
isolates formed individual groups. In general, there was a tendency of isolates to
group accordingly to the colleting place. In spite of the wide variability detected
by both analyses of MGC and ISSR markers, this was not atypical for asexual
reproduction fungi species.
∗
Advisor: Elaine Aparecida de Souza - UFLA/DBI.
1
CAPÍTULO 1
2
1 INTRODUÇÃO
O gênero Alternaria tem grande importância econômica por abranger
vários patógenos de plantas, alguns dos quais causam grandes prejuízos
econômicos (Rotem, 1994). Dentre os membros deste gênero, a espécie
Alternaria solani é uma das mais conhecidas e expressivas economicamente
(Bonde, 1929) e causa danos a membros da família Solanaceae nas regiões de
cultivo de todo mundo, principalmente naquelas de clima tropical. A ocorrência
de epidemias severas da doença está associada a temperaturas de 25° a 30°C e
elevada umidade (Tofoli, 2004; Tokeshi & Bergamin, 1980). No Brasil, a pinta-
preta representa uma doença fúngica muito importante e freqüente nas culturas
da batata e do tomate e caracteriza-se por causar intensa redução da área foliar,
queda dos frutos e tubérculos e, conseqüentemente, redução do potencial
produtivo.
Entre as estratégias de controle da doença, a resistência genética é a
mais eficaz, pela redução dos custos de produção e menor impacto ambiental.
Existem cultivares e clones oriundos da seleção nos programas de melhoramento
que exibem bons níveis de resistência de campo que poderiam ser cultivados
sem o emprego de defensivos contra A. solani (Stevenson, 1994; Pinto et al.,
2002). No entanto, pouco se conhece sobre a variabilidade do patógeno,
principalmente no Brasil onde está doença fúngica é a de maior destaque.
Portanto, para a identificação de novas fontes de resistência à pinta-preta, torna-
se imprescindível o conhecimento da estrutura populacional do patógeno, bem
como o seu constante monitoramento.
Dessa forma, torna-se clara a importância de estudar a diversidade
genética em isolados de A. solani de diferentes campos de produtividade de
batata e de tomate, quanto às suas características morfológicas, fisiológicas e sua
3
variabilidade genética. Essas informações são importantes no desenvolvimento
de estratégias de manejo para controle da pinta-preta no Brasil.
4
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 A pinta-preta na batata e no tomateiro
A pinta-preta, em muitas regiões, inclusive no Brasil, representa uma das
mais importantes e freqüentes doenças fúngicas nas culturas da batata e do
tomate. Ela ocorre, principalmente, em regiões com alta umidade e temperaturas
elevadas (Kuczynska, 1992). Caracteriza-se por causar intensa redução da área
foliar, queda do vigor das plantas, depreciação de frutos e tubérculos e
conseqüente redução do potencial produtivo, podendo atingir perdas de cerca de
50%. (Tofoli, 2004; Kwasna, 1992).
O patógeno, A. solani, danifica ou afeta folhas, caules e frutos dos
vegetais. Em alguns casos, raízes ou tubérculos podem ser danificados. Logo
que infectado, os tecidos doentes são rapidamente colonizados e as lesões são
produzidas quando ocorre a esporulação. Os sintomas da doença são
caracterizados por manchas foliares numerosas, necróticas, pardo-escuras, com a
presença de anéis concêntricos e bordos bem definidos. Lesões nas hastes e
pecíolos podem surgir em plantas adultas e caracterizam-se como pardas,
alongadas, deprimidas, podendo ou não apresentar halos concêntricos. O
primeiro dano sofrido pela planta é uma severa desfolhação, afetando a
produtividade e a qualidade dos frutos (Strandberg, 1992). Os danos na planta
são enormes, uma vez que toxinas podem causar a morte da planta em regiões
distantes do sítio de infecção (Hooker, 1986).
Em frutos de tomate, os sintomas são caracterizados por manchas
escuras, deprimidas e com a presença típica de anéis concêntricos, que,
geralmente, se localizam na região do pedúnculo. Lesões em tubérculos de
batata são escuras, deprimidas, circulares a irregulares, com bordos de cor
5
púrpura ou bronzeada. A polpa sob a lesão é seca, coriácea e de cor amarela a
castanha. Sintomas de tombamento podem ser verificados em plântulas de
tomate afetadas pela doença (Tofoli, 2004; Tokeshi & Bergamin, 1980).
O aumento da suscetibilidade à pinta-preta está, geralmente, associado a
tecidos que tenham alcançado a maturidade, ou seja, plantas em período de
floração, frutificação ou formação de tubérculos. Durante esta fase, ocorre
demanda maior de açúcares e nutrientes para a formação de frutos e tubérculos,
em detrimento da folhagem, o que favorece o processo infeccioso em órgãos
exportadores. Por este motivo, os sintomas aparecem, primeiramente, nas folhas
mais velhas e evoluem, posteriormente, para as partes mais altas da planta
(Tofoli, 2004).
Esta doença é de difícil controle porque pode ser amplamente
disseminada pelo vento, por distâncias curtas ou para longas distâncias,
associadas às sementes. Como as espécies de Alternaria têm um ciclo de vida
curto, o inóculo secundário (esporos) é produzido nas plantas infectadas muito
rapidamente e com grande abundância, e disseminados pelo vento para outras
culturas (Strandberg, 1992).
Além da sobrevivência por conídios, existe a possibilidade de o
patógeno permanecer viável no solo, na forma de micélio. Os conídios
caracterizam-se por serem altamente resistentes a baixos níveis de umidade,
podendo permanecer viáveis por até dois anos nestas condições. Uma vez
presentes na cultura, são dispersos pela ação da água, vento, trabalhadores,
equipamentos, insetos e pelo contato e atrito entre folhas sadias e infectadas.
Havendo umidade e calor suficientes, os conídios germinam e infectam as
plantas rapidamente, podendo o fungo penetrar diretamente pela cutícula ou
através de estômatos. A colonização é intracelular, invadindo tecidos do
hospedeiro e provoca sintomas. Em condições de campo, as lesões surgem 3 a 5
dias após a inoculação, todavia, em condições controladas, pontuações negras
6
podem ser verificadas 24 horas após a inoculação (Strandberg, 1992; Tofoli,
2004).
A ocorrência de epidemias severas da doença está associada a
temperaturas na faixa de 25° a 32ºC e elevada umidade (Tofoli, 2004), agravada
pelo fato de que, até recentemente, poucos fungicidas apresentaram resultados
efetivos contra essas doenças.
2.2 O patógeno Alternaria solani
De acordo com Fancelli (1991), o agente causal da pinta-preta em batata
e em tomate foi descrito pela primeira vez por Ellis & Matin (1971), que
propuseram a denominação de Macrosporium solani. No entanto, Wiltshire
verificou que este nome era ambíguo e deveria ser substituído por Alternaria
solani Sorauer.
Hooker (1986) descreve Alternaria solani como um fungo imperfeito
que se caracteriza por apresentar conídios isolados, com comprimento entre 150
a 300µm e espessura entre 15 a 19µm, podendo ser retos ou sinuosos, com corpo
oblongo ou elipsoidal, sempre afinando em direção ao bico. Normalmente,
apresentam coloração parda ou ouro-claro médio e septos transversais que
variam entre 9 e 11 µm, com pouco ou nenhum septo longitudinal; possuem bico
de comprimento idêntico ou superior ao corpo do conídio, medindo, geralmente,
de 2,5 a 5,0µm de espessura, o qual diminui gradualmente, podendo ser,
algumas vezes, ramificado.
Os conidióforos, que são estruturas onde ficam inseridos os conídios,
são septados, retos ou sinuosos, com 110µm de comprimento e espessura
variável entre 6 a 10 µm, de coloração idêntica aos conídios. Os conídios podem
germinar entre temperaturas de 1ºC a 45ºC, com ótimo entre 25°C e 35°C. Esta
germinação pode iniciar em 1 a 2 horas após a infecção; a temperatura de 6°C a
7
34°C. Os sintomas se tornam característicos normalmente em 2 a 3 dias e lesões
com 3 mm de diâmetro já apresentam esporulação. Na natureza, os conídios são
produzidos continuamente na parte inferior das folhas ou nos restos de cultura
(Tokeshi & Bergamin, 1980).
Dentre os Hyphomycetes, o gênero Alternaria é o mais comumente
encontrado na natureza, com ampla ocorrência entre as plantas, estações e
regiões geográficas. Podem ser patógenos, parasitas facultativos ou saprófitas
(Kwasna, 1992). Segundo Strandberg (1992), para entender melhor o sucesso
deste fungo como um patógeno para a batata e o tomate, é importante considerar
seu ciclo de vida, a maneira de reprimi-lo e suas características que favorecem a
patogenicidade e a sua ampla ocorrência.
O gênero Alternaria é composto por fungos imperfeitos que não
apresentam o ciclo sexual ou a organização de estruturas de frutificação. Os
conídios são produzidos por conidióforos simples ou ramificados ou podem,
também, ser produzidos diretamente da hifa. Os conídios maduros são
facilmente destacados e disseminados pelo vento ou pela água. Esses fungos
podem persistir como micélio ou conídios que sobrevivem em restos de plantas
entulhadas, ou no solo, ou como micélios ou conídios transportados nas
sementes infectadas. Na presença de água, os conídios germinam rapidamente
(Strandberg, 1992).
Um importante atributo do gênero Alternaria é seu curto ciclo de vida.
Em A. solani, o período entre a infecção e a esporulação, em tomate, é de sete
dias. Certamente, um ciclo de vida com curto tempo é vantajoso porque pode
promover um rápido desenvolvimento e progresso da doença. Produção
freqüente ou contínua de conídios na lesão estabelecida durante condições
favoráveis é de igual importância. Um único conidióforo pode formar até quatro
gerações de conídios de um em A. solani (Strandberg, 1992).
8
2.3 Caracterização morfológica e fisiológica de Alternaria solani
Observa-se variação das características culturais de A. solani.
Entretanto, Bonde (1929) e Hooker (1986) descreveram as colônias como
espalhadas, algodonosas, com a cor variando de marrom-escura para preta,
sendo que alguns isolados produzem um pigmento vermelho-amarelado em
meio nutriente. Essas características morfológicas das colônias são usadas,
freqüentemente, para separar grupos de isolados em diferentes patógenos,
indicando a ocorrência de variabilidade fenotípica dentro das espécies.
A variabilidade de 38 isolados de A. brassicicola, coletados de cultivos
comerciais de crucíferas do estado de Pernambuco, foi estimada com base em
variáveis relacionadas ao desenvolvimento da alternariose e à fisiologia do
patógeno. As características fisiológicas do patógeno avaliadas foram a taxa de
crescimento micelial (TCM), esporulação (ESP), germinação de conídios (GER)
e sensibilidade ao fungicida iprodione (ICM). Para as características TCM, ESP
e GER não foi observada diferença significativa quanto aos hospedeiros e à
origem dos isolados. A maior variabilidade foi observada quanto à resistência ao
fungicida (ICM), devido à variação de isolado para isolado, dentro de uma
mesma espécie hospedeira. Utilizando o conjunto de variáveis avaliadas, não foi
possível a formação de grupos de similaridade, o que reforça a grande
variabilidade entre isolados do patógeno com base nas características avaliadas
(Michereff et al., 2003). Estes resultados corroboram com análises realizadas
pelo emprego de marcadores moleculares RAPD (Verma & Saharam, 1994;
Sharma & Tewari, 1998).
Entretanto, com a espécie em questão, poucos estudos foram
anteriormente realizados. Bonde (1929) observou que, após serem isoladas de
tubérculos de batata, as colônias apresentavam diferentes cromoginicidades, com
a pigmentação variando de amarelo-claro, em colônias jovens a um vermelho-
9
tijolo, com o envelhecimento. Entretanto, pouco se conhece sobre a natureza
química dos pigmentos de A. solani que, quando dissolvidos em água,
observam-se pigmentos laranja e amarelos. Os dados sugerem que o fungo
aumenta o pH do meio de cultura BDA (batata dextrose ágar), sendo a
pigmentação influenciada pelo meio de cultivo, temperatura, luz e quantidade de
hidrogênio. Contudo, a temperatura altera a quantidade de pigmento, pois, em
temperaturas em torno de 15°C, a produção da cor pode ser inteiramente inibida
e, com a temperatura entre 25° e 30°C, uma quantidade máxima de cor é
produzida. Quanto à incidência de luz, as colônias crescidas em casa de
vegetação foram mais pigmentadas do que aquelas crescidas em câmara escura.
Também foi observado que a formação de pigmentos está, geralmente,
correlacionada com a taxa de crescimento. Este autor concluiu que isolados de
A. solani podem ser diferenciados com base na produção de esporos,
pigmentação em BDA, tempo de crescimento, aparência do micélio na cultura e
formação de lesões nos folíolos destacados e em tubérculos.
Esse patógeno produz relativamente poucos conídios no meio de ágar,
sendo importante o estabelecimento de metodologias para a produção de
conídios in vitro. Diversas metodologias já foram utilizadas, como indução por
luz ultravioleta (Charton, 1953; McCallan & Chan, 1944), por luz fluorescente
(Charton, 1953; Lukens, 1960) e por iluminação solar (McCallan & Chan, 1944;
Padhi & Rath, 1974; Rands, 1917). A esporulação tem sido aumentada por
ferimentos no micélio (Charton, 1953; Douglas & Pavek, 1971), no meio
desidratado (Charton, 1953; McCallan & Chan, 1944), ou usando aditivos
químicos (McCallan & Chan, 1944; Ellers & Baxters, 1974). Porém, além de
não produzir número suficiente de esporos para infectar grande número de
plantas, muito desses procedimentos requerem um longo período de esporulação
(de 7 a 20 dias).
Para contornar esses problemas, Shahin & Shepard (1979)
10
desenvolveram uma metodologia na qual, primeiramente, os isolados são
mantidos em meio BDA, no escuro e, depois, transferidos para um meio de
CaCO
3
e também incubados no escuro. No entanto, nem todos os isolados
produzem quantidade suficiente de esporos por essa metodologia.
Há relatos, na literatura, de diversos meios de cultura que favorecem o
crescimento micelial e estimulam a esporulação. Entre eles, destacam-se o de
batata-dextrose-ágar (Shahin &Shepard, 1979; Cotty & Misaghi, 1985;
Strandberg, 1987), o de batata-ágar (Fahim, 1986), o V8A (Strider, 1978;
Strandberg, 1987; Simmons, 1992), o de cenoura-ágar (Hotchkiss & Baxter,
1983) e o de folha de cenoura-ágar (Strandberg, 1987). Porém, nenhuma dessas
metodologias permitiu a esporulação suficiente para inoculação em um grande
número de plantas.
Com a dificuldade na produção de esporos em quantidade suficiente
para inoculação em campo, os inóculos para esse fim são produzidos a partir de
uma mistura de esporos e micélios de folhas infectadas secas (Pinto et al., 2002;
Thirthamallappa & Lohithaswa 2000). Essa metodologia, apesar de prática, não
possibilita separar os inóculos quanto à sua virulência, visto que a capacidade de
esporulação é uma característica importante não só na análise da diversidade dos
isolados, mas também na avaliação da severidade da doença. Pelletier & Fry
(1989) e Johnson & Teng (1990) observaram correlação linear entre a produção
de esporos e a área da lesão.
Eficiente esporulação pode ser induzida expondo-se as culturas à luz
diurna, com as placas parcialmente abertas, depois da remoção de micélios
aéreos (Barksdale 1969). Recentemente, foi proposta uma metodologia de
esporulação por Rodrigues (2005), na qual os isolados são crescidos em meio
V8 líquido com agitação. Posteriormente, os isolados são transferidos para o
meio BDA e mantidos sob o regime de luz negra, com fotoperíodo de 12 horas,
por 72 horas. Esta metodologia permitiu a produção de uma boa quantidade de
11
esporos e mostrou-se de fácil execução. Os diferentes isolados testados nesta
metodologia mostraram diferentes capacidades de esporulação.
2.4 O ciclo parassexual e os passos envolvidos na formação do heterocário
em A. solani
Os fungos imperfeitos ou mitospóricos, Deuteromycetes, como os do
gênero Alternaria, são caracterizados por não apresentarem uma fase sexuada
(Loguercio-Leite et al., 2004). Entretanto, é relatada grande variabilidade
fenotípica e genética dentro das espécies deste gênero (Gherbawy, 2005, Peever
et al., 1999, Pryor & Michailides, 2002, Robert et al., 2000), em A. solani
(Waals et al., 2004, Martinez, et al., 2004, Petrunak & Christ, 1992, Weir et al.,
1998), em A. brassicicola (Bock et al., 2005, Bock et al., 2002), em A. linicola
(McKay et al., 1999), em A. brassicola (Michereff et al., 2003) e em A. alternata
(Morris et al., 2000, Petrunak & Christ, 1992, Weir et al., 1998).
Entre os mecanismos que podem ampliar a variabilidade genética em
fungos assexuais, destaca-se a ocorrência do ciclo parassexual. Esse processo foi
descrito, pela primeira vez, em 1952, por Pontecorvo & Roper, que descobriram
uma alternativa do sexo em Aspergillus nidulans, segundo a qual recombinantes
eram produzidos sem a ocorrência do processo meiótico ou ciclo sexual. Nesta
investigação, o passo decisivo para a descoberta foi o experimento no qual duas
linhagens haplóides, mutantes para diferentes deficiências nutricionais, foram
postas para germinar, de modo que ocorresse a anastomose de hifas e,
conseqüentemente, a formação do heterocário (dois núcleos geneticamente
distintos em um mesmo citoplasma). O heterocário formado não apresentava as
deficiências nutricionais dos mutantes (Azevedo, 2004).
Portanto, um pré-requisito para a ocorrência da parassexualidade é que
diferentes isolados sejam compatíveis vegetativamente, ou seja, é necessário que
12
ocorra a extensão da ponta da hifa, ramificação e fusão, que poderá levar à
formação de um heterocário (Glass et al., 2000).
Uma vez que A. solani, assim como a maioria dos fungos, é composto
por filamentos tubulares denominados hifas, estas desempenham importantes
funções, como a de colonização do substrato, absorvendo água e outros
nutrientes. A fusão de hifas e a formação do heterocário são pré-requisitos
importantes para a comunicação intra-hifas e a homeostase da colônia durante o
crescimento e a reprodução (Glass et al., 2004). O reconhecimento ou não
reconhecimento vegetativo parecem ser cruciais nestes organismos, pois eles
sofrem espontaneamente fusão das células vegetativas com eles mesmos ou com
outros indivíduos. Estas fusões celulares (anastomoses) coordenam a mistura do
citoplasma e a formação de heterocários vegetativos, ou seja, células contendo
diferentes tipos de núcleos (Saupe, 2000).
Acredita-se que a incompatibilidade vegetativa funcione como um
sistema de reconhecimento de genótipos diferentes para limitar a passagem de
elementos infecciosos, para prevenir a exploração por núcleos mal adaptados e
ou para prevenir que recursos sejam retirados durante a reprodução sexual,
sendo, portanto, um mecanismo de autodefesa em fungos filamentosos (Glass et
al., 2000). Os mesmos autores sugerem que a seleção atuaria sobre os locos het
para a manutenção do polimorfismo em populações de fungos. Saupe (2000)
comenta que a função dos genes het é preservar a individualidade genética.
Embora sejam óbvios os benefícios da formação de heterocário, existem
mecanismos genéticos que restringem a sua formação entre indivíduos
geneticamente diferentes (Glass et al., 2000). Em fungos filamentosos, existem o
reconhecimento sexual, que é controlado por locos mat (“mating types”) e o
reconhecimento vegetativo, que é controlado por um loco específico
denominado het (incompatibilidade de heterocário ou também pode ser chamado
vig, de incompatibilidade vegetativa). Quando dois indivíduos se encontram,
13
eles podem sofrer a fusão celular. Se os dois indivíduos tiverem o mesmo
genótipo het, ocorre a heterocariose. Se eles diferem geneticamente para o loco
het, apesar da fusão de hifas, as células heterocarióticas são rapidamente
destruídas ou têm o seu crescimento severamente inibido (Saupe, 2000).
Dois tipos de sistemas genéticos, um alélico e outro não alélico, foram
descritos como reguladores da incompatibilidade vegetativa. Em sistemas
alélicos, anastomoses entre indivíduos que contêm um único loco het diferente
provocam a incompatibilidade vegetativa. Em interações não alélicas, uma
interação entre alelos específicos em dois locos diferentes provoca a
incompatibilidade. O número de genes het em uma população determina o
número de grupos de compatibilidade vegetativa (GCVs), dentro dos quais
heterocários podem ser prontamente formados (Leslie & Zeller, 1996).
Uma vez que o fenótipo da compatibilidade vegetativa tem bases
multigênicas, ele pode ser usado como uma alternativa de identificar um
conjunto de isolados que compartilham os mesmos alelos desses locos. Como o
número de locos que governam esta característica é grande, o número de grupos
de compatibilidade vegetativa também é grande (milhares) e a possibilidade de
identificação, embora possível, é proporcionalmente pequena em populações de
acasalamentos ao acaso (Leslie & Summerell, 2006). Portanto, na prática,
confrontos entre isolados selvagens de uma mesma população ou de populações
diferentes resultam, freqüentemente, em interações de incompatibilidade (Saupe,
2000).
A classificação de isolados em GCVs pode ser uma importante
ferramenta para a análise de populações de fungos. Isso porque, em uma
população assexual, como não ocorre a recombinação sexual, os isolados com
patogenicidade similar que surgem como parte de uma linhagem clonal podem
ser do mesmo GCV. Nesse sentido, se há uma maneira suficientemente rápida
para a identificação destes GCVs, isso poderá reduzir o tempo consumido nos
14
testes de patogenicidade (Leslie & Summerell, 2006). Muitas pesquisas têm
usado o fenômeno natural da rejeição por não reconhecimento, ou
compatibilidade vegetativa, como é conhecida em Basidiomicetos e
Ascomicetos, como um método para verificar a diversidade genética em várias
espécies de fungos (Kerényi et al., 1997, Elena & Paplomatas, 1998, Caten &
Newton, 2000, Tsor et al., 2001, Nitzan et al., 2002, Gionannetti et al., 2003,
Roca et al., 2004).
Dessa forma, o número de grupos de compatibilidade micelial (GCM) é
um marcador fenotípico com o seu sistema de reconhecimento controlado por
múltiplos locos, mas o conhecimento do mecanismo genético básico é limitado
em muitos fungos filamentosos (Glass & Kaneko, 2003). Quando a hifa de um
isolado difere em um ou mais locos que controlam a fusão, a
compartimentalização e a lise da célula ocorrem, formando uma zona (linha/
barreira) de reação com redução de crescimento entre os dois isolados. Portanto,
ocorre uma perfeita zona de interação, característica entre os isolados que são
incompatíveis vegetativamente (Kohn et al., 1990).
Entretanto, a classificação dos diferentes isolados em grupos de
compatibilidade vegetativa indica a probabilidade de ocorrência de
recombinação somática entre os isolados do mesmo grupo (Leslie, 1993). Saupe
(2000) comenta que a classificação dos isolados em grupos de compatibilidade
vegetativa pode ser uma boa ferramenta para análises de populações de fungos,
pois, em muitos casos, nas populações naturais, o número de GCVs é
considerável. Na prática, um confronto entre isolados selvagens da mesma ou de
diferentes populações freqüentemente resulta em interações de
incompatibilidade. Em geral, o número de GCV amplia com o aumento do
número de isolados e da diversidade de origem geográfica desses (Leslie &
Summerell, 2006).
15
2.5 Uso de marcadores moleculares no estudo de fitopatógenos
Com o advento dos marcadores isoenzimáticos, seguido das técnicas
modernas de biologia molecular que possibilitaram o surgimento de métodos
variados para a detecção de polimorfismo genético, diretamente no DNA
(marcadores de DNA), o número de marcadores genéticos aumentou
substancialmente, possibilitando a sua aplicabilidade em diversas espécies
(Ferreira & Grattapaglia, 1998). Os marcadores moleculares são utilizados
freqüentemente para os estudos genéticos em fungos filamentosos. A estrutura
populacional de um patógeno, visando ao estabelecimento de inferências
evolutivas, pode ser melhor visualizada se forem utilizados marcadores
genéticos seletivamente neutros (RFLP, RAPD, AFLP, etc.), pois eles fornecem
informações sobre todo o genoma, permitindo estimar o parentesco, sem
sofrerem variações ambientais, tornando, assim, o estudo mais conciso.
No gênero Alternaria, diversos tipos de marcadores moleculares são
empregados no estudo da diversidade genética. Petrunak & Christ (1992)
avaliaram a variabilidade isoenzimática nas espécies A. alternata e A. solani.
Com o emprego de marcadores RFLP, foi analisada a variabilidade de A.
altenata, por Adachi et al. (1996) e Aradhya et al. (2001). Já os marcadores
AFLP foram empregados para o estudo da variabilidade genética em A. solani
(Martínez et al., 2004) e em A. brassicicola (Bock et al., 2002; Bock et al.,
2005). Os marcadores RAPD-PCR foram os mais utilizados nos estudos de
diversidade em espécies do gênero Alternaria (Weir et al. 1998; Sharma &
Tewai, 1998; Peever et al. 1999; Morris et al. 2000; Roberts et al. 2000;
Martínez et al. 2002; Pryor & Michailides 2002; Gherbawy 2005).
O maior emprego dos marcadores RAPD deve-se ao seu baixo custo e à
facilidade, uma vez que elevados níveis de polimorfismo são facilmente obtidos.
Entretanto, há a baixa repetibilidade dos resultados, diminuindo a eficácia do
16
método. Uma alternativa é o uso dos random amplifified microsatellites
(RAMS) ou Inter-SSR (Simple Sequence Repeats) amplification (ISSR), que
combina a análise RAPD, não sendo necessário um conhecimento prévio de uma
seqüência de DNA. Em uma única reação, vários locos polimórficos podem ser
encontrados, sendo os RAMS uma técnica promissora para estudo da variação
genética. Vegas & Duran (2004) compararam o uso de marcadores RAPD e
ISSR na avaliação da variação genética intra e interespecífica de lentilhas.
Constataram que os marcadores ISSR produziram mais bandas polimórficas do
que os marcadores RAPD. Waals et al. (2004) utilizaram marcadores RAMS
para determinar a diversidade genética entre isolados de A. solani coletados na
África do Sul e observaram grande número de produtos de amplificação.
2.6 Variabilidade genética de Alternaria solani
Devido à variabilidade na virulência de isolados de A. solani, a
existência de raças fisiológicas para este patógeno tem sido proposta por alguns
autores. Bonde (1929) encontrou diferenças relativas quanto à patogenicidade
entre isolados de A. solani de tomate, enquanto Henning & Alexandre (1959)
descreveram sete raças fisiológicas distintas de A. solani, num campo de
produção de batata.
Com base em diferenças culturais, serológicas e eletroforéticas, Fancelli
(1991) propôs que a espécie A. solani fosse subdividida em dois grupos (tomate
e batata). Simmons (2000) propôs uma nova espécie, A. tomatophila, como o
agente causal da pinta-preta em tomate. No entanto, não há evidências
conclusivas sobre a ocorrência de raças fisiológicas. As raças fisiológicas são
definidas, de acordo com a especificidade, em cultivares hospedeiras
diferenciadoras (Schlegel, 2003) e, segundo Chaerani & Voorrips (2006), o
relato da presença de raças fisiológicas de A. solani não está de acordo com a
17
definição. Isso porque ela tem sido descrita em termos de variabilidade em
caracteres morfológicos, fisiológicos e ecológicos in vitro.
Castro et al. (2000) avaliaram a variabilidade de A. solani a partir da
inoculação de sete isolados em 14 genótipos de tomateiro e verificaram que
todos os isolados diferiram entre si quanto à virulência, mostrando alta
variabilidade entre os isolados coletados apenas em tomate.
Petrunak & Christ (1992) investigaram a variabilidade isoenzimática de
52 isolados de A. solani e 96 isolados de A. alternata, oriundos de diferentes
locais nos EUA e hospedeiros. Estes autores encontraram 12 diferentes classes
eletroforéticas entre os isolados, o que possibilitou verificar que a diferenciação
enzimática ocorreu apenas por espécie, não havendo diferenciação clara dos
isolados de acordo com o hospedeiro ou a origem geográfica.
Em estudo realizado por Weir et al. (1998), marcadores RAPD-PCR
foram utilizados para medir o grau da variação genética entre isolados de A.
alternata e A. solani, e para determinar se há correlação entre os perfis RAPD e
a espécie de fungo, a planta hospedeira ou a origem geográfica. Foram coletados
35 isolados de A. solani de tomate ou de batata e 30 isolados de A. alternata de
tomate, batata, tangerina e limão, em 18 locais diferentes. Cinco primers RAPD
foram selecionados, sendo encontrados, no total, 26 padrões de bandas
polimórficas e uma alta especificidade do padrão de bandas gerado e a espécie
do fungo. A análise de agrupamento mostrou uma distinta separação entre as
espécies. Dois subagrupamentos distintos, entre o grupo de A. solani, foram
observados, correspondendo, aproximadamente, a planta hospedeira, tomate ou
batata. Os três isolados de citrus de A. alternata analisados também formaram
um subgrupo, entretanto, não houve um agrupamento aparente com base na
origem geográfica. Da variação total encontrada, 66% corresponde à variação
dentro da espécie.
Neste mesmo trabalho foi feita uma comparação entre as quatro
18
populações consideradas estrangeiras e as domésticas. A maior distância
genética foi encontrada entre populações de diferentes espécies. As maiores
distâncias genéticas foram encontradas entre isolados de diferentes espécies,
tendo ocorrido uma tendência ao agrupamento por hospedeiros entre os isolados
de A. solani, sugerindo a possibilidade de especialização patogênica com
hospedeiros solanáceos.
Em outro trabalho, realizado por Martínez et al. (2002), a diversidade
patogênica e genética foi analisada em isolados de Cuba e de outros países, entre
estes, isolados do Brasil, coletados em Lavras, MG. Foram analisados 112
isolados A. solani de batata e de tomate e mais nove de Alternaria spp. e um de
Curvalina sp. Um elevado nível de polimorfismo foi encontrado com o emprego
dos marcadores AFLP. A análise de agrupamento das estimativas de
similaridades genéticas apresentou dois grupos maiores; no grupo 1 ficaram
todos os isolados de A. solani e, no outro, os demais isolados. O braço do grupo
1 foi consistentemente formado com 100% das 1.000 simulações boodstrap.
Este grupo revelou um agrupamento por hospedeiro, ficando a maioria dos
isolados de tomate coletados no subgrupo 1 e os de batata no subgrupo 2.
Considerando os isolados de batata e de tomate como duas populações
diferentes, a distância genética foi de 0,330. Uma especialização patogênica de
A. solani, por hospedeiro, batata e tomate, ficou evidenciada, como já descrito
por outros trabalhos.
Neste trabalho, quando os isolados foram analisados, considerando as
populações de acordo com o hospedeiro e a origem geográfica, os resultados
revelaram influência da origem geográfica na variabilidade genética entre as
populações, sugerindo alta dispersão dos esporos do fungo e fraca seleção por
hospedeiro dentro e entre populações.
Análise da estrutura populacional de A. solani, por meio marcadores
moleculares associados a investigação do número de grupos de compatibilidade
19
micelial (GCM), tem sido utilizada, por fornecer informações mais completas
(Meijer et al., 1994; Walls et al., 2004). A análise de 53 isolados de A. solani
coletados em regiões produtoras de batata da África do Sul foram agrupados de
acordo com a virulência, a compatibilidade vegetativa e os marcadores RAMS
(Walls et al., 2004). A análise da virulência mostrou um moderado grau de
variação, pois a maioria dos isolados não foi virulenta ou pouco virulenta. Como
essa técnica é laboriosa e consome muito tempo, além de ser muito influenciada
pelo ambiente e representar uma pequena fração dos genes do genoma do
patógeno, os autores comentam que não foi a mais recomendada na avaliação da
diversidade genética. Entretanto, grande variabilidade genética foi encontrada
com o emprego de grupos de compatibilidade vegetativa e marcadores RAMS.
Dos 53 isolados avaliados, 40 foram agrupados, em 6 grupos de compatibilidade
vegetativa, com outros isolados. Os demais formaram grupos individuais. Os
grupos formados não foram agrupados de acordo com a análise de virulência,
marcadores RAMS ou origem geográfica. Com o emprego de marcadores
RAMS, foi obtido um alto número de produtos de amplificação. A diversidade
genética entre os 46 isolados foi de 0,27 e, no dendrograma formado, não houve
tendência a agrupamentos, de acordo com a origem geográfica.
Segundo os autores, isso sugere que as várias subpopulações geográficas
não estão geneticamente isoladas, o que pode ser devido à disseminação de
esporos por fatores bióticos e abióticos. Os autores comentam que a
variabilidade genética encontrada nas análises de compatibilidade vegetativa e
RAMS, apesar de ser alta, não foi atípica para espécies que se reproduzem
apenas assexuadamente. A provável causa podem ser as mutações naturais,
associadas ao grande número de esporos produzidos em um curto período de
tempo e, principalmente, a ocorrência do ciclo parassexual.
20
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27
CAPÍTULO 2
VARIABILIDADE MORFOLÓGICA E FISIOLÓGICA DE ISOLADOS
DE ALTERNARIA SOLANI
28
1 RESUMO
OLIVEIRA, Marciane da Silva. Variabilidade morfológica e fisiológica de
isolados de Alternaria solani. In: ______. Diversidade entre isolados de
Alternaria solani: avaliação morfológica, fisiológica e molecular. 2007. Cap.2,
p.27-45 Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas) –
Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.
Alternaria solani é um dos principais patógenos de solanáceas do Brasil,
e apresenta ampla variabilidade genética. O objetivo deste trabalho foi avaliar a
diversidade de isolados de A. solani provenientes de lavouras de batata e tomate
do Brasil quanto à morfologia e fisiologia. Foram avaliados 39 isolados e as
seguintes características foram mensuradas: diâmetro da colônia (DC), índice de
velocidade de crescimento micelial (IVCM), e a taxa de esporulação (TE).
Todas as características avaliadas apresentaram ampla variabilidade. Quanto à
avaliação do crescimento micelial foi observada a ocorrência da interação
isolados x tempo indicando que o crescimento dos isolados não foi coincidente
ao longo dos dias, no entanto, os isolados apresentaram uma relação linear entre
o crescimento da colônia e o tempo de avaliação. O IVCM foi um bom indicador
da variabilidade quanto ao crescimento micelial. Quanto à taxa de esporulação,
todos os isolados apresentaram taxas de esporulação estatisticamente diferentes,
formando quatro grupos pelo teste Scott & Knott. Não foi constatada correlação
entre as características IVCM e a taxa de esporulação. Os resultados obtidos
indicam que os isolados de A. solani possuem ampla variabilidade para as
características avaliadas. Não foi observada correlação das características
avaliadas com a procedência dos isolados. Contudo, apesar das características
utilizadas permitirem diferenciar os isolados, há necessidade de avaliar a
correlação dessas características com as características epidemiológicas dos
isolados, para que sejam diferenciados quanto a sua patogenicidade.
Orientadora: Elaine Aparecida de Souza - UFLA/DBI.
29
2 ABSTRACT
Oliveira, Marciane da Silva. Morphological and Physiological Variability of
Isolates of Alternaria solani. In: ______. Diversity among isolates of
Alternaria solani: morphological, physiological and molecular evaluations
2007. Cap2. p. 27-45. Thesis (Doctorate in Genetics and Plants Breeding) -
Federal University of Lavras, Lavras, MG.
∗
Alternaria solani it is one of the principal pathogens of solanaceous
crops of Brazil, and it presents wide genetic variability. The objective of this
work was to evaluate the diversity of A. solani isolated approaching of potato
and tomato farming of Brazil as the morphology and physiologic characters. 39
isolated were appraised and the following characteristics were mansards:
diameter of the colony (dc), index of velocity of growth mycelial (ivgm), and the
sporulation capacity (ec). All the appraised characteristics presented wide
variability. With relationship to the evaluation of the growth mycelial the
occurrence of the interaction was observed isolated x time indicating that the
growth of the isolated was not coincident along the days, however, the isolated
ones presented a lineal relationship between the growth of the colony and the
time of evaluation. Ivgm was a good indicator of the variability with relationship
to the growth mycelial. With relationship to the sporulation capacity, all the
isolated presented rates of sporulation different statistically, forming four groups
for the Scott & knott test. Correlation was not verified among the characteristics
ivgm and sporulation capacity. The obtained results indicate that the isolated of
A. solani possess wide variability for the appraised characteristics. Considering
the origin of the isolated ones, correlation was not observed with the appraised
characteristics. However, the used characteristics allow differentiating the
isolated ones. Though, there is the need to evaluate the correlation of those
characteristics with the epidemic characteristics of the isolated ones, so that the
isolated ones are differentiated with relationship your pathogenicity.
∗
Advisor: Elaine Aparecida de Souza - UFLA/DBI.
30
3 INTRODUÇÃO
No gênero Alternaria, a espécie A. solani é uma das mais conhecidas e
expressivas, economicamente, por causar danos em espécies da família
Solanaceae nas diversas regiões de cultivo, principalmente em regiões de clima
tropical. A ocorrência de epidemias dessa doença está associada a temperaturas
de 25° a 30°C e elevada umidade (Tofoli, 2004). No Brasil, a pinta-preta
representa uma das mais importantes e freqüentes doenças fúngicas nas culturas
da batata e do tomate.
Embora A. solani apresente somente a fase assexual, tem sido observada
ampla variabilidade nos isolados quanto à sua morfologia, fisiologia e
patogenicidade, tanto in vivo quanto in vitro (Bonde 1929; Henning &
Alexander 1959; Hooker, 1986; Weir et al., 1998; Martinez et al., 2004; Waals
et al. 2004). As características morfológicas das colônias, tais como velocidade
de crescimento e coloração, podem ser utilizadas para separar grupos de
isolados, indicando a ocorrência de variabilidade fenotípica dentro da espécie.
Entretanto, para Alternaria solani, poucos trabalhos foram realizados. Nos
trabalhos encontrados, as colônias de A. solani são descritas como espalhadas,
algodonosas, com a cor variando de marrom-escura à preta e alguns isolados
produzem um pigmento vermelho-amarelado em meio de cultura. Observam-se,
ainda, diferenças na produção de esporos, pigmentação em BDA
(cromoginicidade), tempo de crescimento e a aparência do micélio na cultura
(Bonde, 1929; Hooker, 1986).
Devido à baixa esporulação de A. solani no cultivo in vitro, vários
trabalhos têm sido realizados com o objetivo de avaliar meios de cultura e
condições de cultivo. Diversas metodologias para esporulação já foram
utilizadas, tais como indução por luz ultravioleta (McCallan & Chan, 1944,
31
Charton, 1953), luz fluorescente (Charton, 1953; Lukens, 1960), iluminação
solar (Rands, 1917, McCallan & Chan, 1944; Padhi & Rath, 1974), ferimentos
no micélio (Charton, 1953; Douglas & Pavek, 1971), meio desidratado
(McCallan & Chan, 1944, Charton, 1953) ou utilizando aditivos químicos
(McCallan & Chan, 1944; Ellers & Baxters, 1974) ou até mesmo, com a
transferência dos isolados para um meio de cultura contendo CaCO
3
(Shahin &
Shepard, 1979). Porém, nenhuma dessas metodologias permitiu esporulação
suficiente para inoculação em um grande número de plantas. Eficiente
esporulação foi induzida expondo-se os isolados à luz diurna, com as placas
parcialmente abertas, depois da remoção de micélios aéreos (Barksdale 1969).
Recentemente, foi proposta uma metodologia de esporulação por Rodrigues
(2005), em que os isolados crescem em meio V8 líquido com agitação.
Posteriormente, os isolados são transferidos para o meio BDA e mantidos sob o
regime de luz negra, com fotoperíodo de 12 horas, por 72 horas. Esta
metodologia permitiu a produção de boa quantidade de esporos e mostrou ser de
fácil execução.
A taxa de esporulação é uma característica importante não só na análise
da diversidade dos isolados, mas também na avaliação da severidade da doença.
Pelletier & Fry (1989) e Johnson & Teng (1990) observaram correlação linear
entre a taxa de esporulação e o tamanho da lesão.
Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi o de avaliar a
diversidade de isolados de A. solani por meio de marcadores morfológicos e
fisiológica
.
32
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Obtenção e manutenção dos isolados
Folhas com lesões características da pinta-preta foram coletadas, durante
a safra de 2005, em regiões produtoras de batata e de tomate de Minas Gerais
(MG), Goiás (GO), Espírito Santo (ES) e Distrito Federal (DF) (Tabela 1). Os
isolados foram obtidos a partir do isolamento de um único conídio de cada lesão
e crescidos em BDA, na BOD (incubadora de crescimento), com controle de
temperatura de 25°C, no escuro. Os isolados foram armazenados na coleção do
Laboratório de Resistência de Plantas, no Departamento de Biologia da
Universidade Federal de Lavras (UFLA).
4.2 Avaliação dos caracteres morfológicos
4.2.1 Índice de velocidade de crescimento micelial (IVCM)
Isolados de A. solani foram colocados para crescer em meio BDA, com
fotoperíodo de doze horas, a 25°C, em BOD (câmara de crescimento). O
crescimento micelial foi mensurado a cada 72 horas (Nechet 1999), durante 15
dias, a partir do momento da inoculação, utilizando-se duas repetições (placas)
por isolado. O índice de velocidade de crescimento micelial foi calculado
utilizando-se a fórmula adaptada de Oliveira (1991):
IVCM=∑[(D-Da)/N]
sendo:
IVCM=índice de velocidade de crescimento micelial
D=diâmetro médio da colônia
33
TABELA 1 Indicação da espécie e ou cultivar (ou clone) hospedeira e origem
dos isolados avaliados nos estudos de Alternaria solani.
Nº Isolado Hospedeiro Procedência
1 UFLA 1 batata/clones Ijaci, MG
2 UFLA 2 batata/clones Ijaci, MG
3 UFLA 3 batata/clones Ijaci, MG
4 UFLA 4 batata/clones Ijaci, MG
5 UFLA 5 batata/clones Ijaci, MG
6 UFLA 6 batata/clones Ijaci, MG
7 UFLA 7 batata/clones Ijaci, MG
8 UFLA 12 batata/clones Carrancas, MG
9 UFLA 13 batata/clones Carrancas, MG
10 UFLA 14 batata/clones Carrancas, MG
11 UFLA 18 batata/Atlantic Paraguaçu, MG
12 UFLA 19 batata/Atlantic Paraguaçu, MG
13 UFLA 20 batata/Atlantic Paraguaçu, MG
14 UFLA 21 batata/Atlantic Paraguaçu, MG
15 UFLA 22 batata/Atlantic Paraguaçu, MG
16 UFLA 23 batata/Atlantic Paraguaçu, MG
17 UFLA 24 batata/Atlantic Paraguaçu, MG
18 UFLA 25 batata/Achat Embrapa Hortaliças DF
19 UFLA 26 batata/Achat Embrapa Hortaliças DF
20 UFLA 27 batata/clone 118-08 Embrapa Hortaliças DF
21 UFLA 28 batata/clone 118-08 Embrapa Hortaliças DF
22 UFLA 29 batata/Monalisa Embrapa Hortaliças DF
23 UFLA 30 batata/Monalisa Embrapa Hortaliças DF
24 UFLA 31 batata/clone 118-08 Embrapa Hortaliças DF
25 UFLA 32 batata/clone 118-08 Embrapa Hortaliças DF
26 UFLA 33 batata/Delta Embrapa Hortaliças DF
27 UFLA 34 batata/Delta Embrapa Hortaliças DF
28 UFLA 51 tomate Lavras, MG
29 UFLA 52 tomate Lavras, MG
30 UFLA 53 tomate Lavras, MG
31 UFLA 54 tomate Lavras, MG
32 UFLA 55 batata/Ágata Cristalina, GO
33 UFLA 56 batata/Ágata Cristalina, GO
34 UFLA 57 batata/Monalisa São João da Mata, MG
35 UFLA 58 batata/Monalisa São João da Mata, MG
36 UFLA 59 batata/Monalisa São João da Mata, MG
37 UFLA 60 batata/Monalisa São João da Mata, MG
38 UFLA 61 batata Espírito Santo
39 UFLA 62 batata Espírito Santo
34
Da=diâmetro médio da colônia do dia anterior
N=número de dias após a inoculação
4.2.2 Diâmetro colonial
Os diâmetros das colônias foram medidos, a cada 72 horas, por um
período de 15 dias. Foram avaliadas duas placas por isolados.
4.2.3 Taxa de esporulação
Foi utilizada a metodologia proposta por Rodrigues (2005) com
modificações, em que dois discos de cada isolado foram colocados para crescer
em meio líquido V8, em agitação de 110 rpm, a 25+
2ºC no escuro, por sete dias.
Em seguida, foi feita a homogeneização da solução com os micélios, com o
auxílio de um misturador, sendo transferidos 10 mL desta solução para uma
placa de Petri com 15 mL de meio BDA. Para cada isolado foram mantidas três
placas abertas em BOD com luz negra, com fotoperíodo de 12 horas, a 25+
2ºC
por, aproximadamente, 70 horas. Após a incubação, foram adicionados 10 mL
de água destilada esterilizada, com 0,01% de Tween 20. A superfície da colônia
foi escovada com pincel para remover os conídios e obter a suspensão.
Para a quantificação da concentração de conídios, uma gota de 10µl foi
colocada sobre a câmara de Newbayer e a contagem dos conídios foi feita em
microscópio ótico. O número de conídios.ml
-1
foi determinado considerando-se
o fator de diluição. O experimento foi realizado com três repetições.
35
4.2.4 Análises estatísticas
Os dados obtidos relativos a índice de velocidade de crescimento
micelial (IVCM), diâmetro da colônia (DIM) e intensidade de esporulação (ESP)
foram analisados em DIC (delineamento inteiramente casualizado). O
crescimento micelial foi avaliado em DIC, com parcelas subdivididas no tempo.
Foi realizada análise de regressão do crescimento das colônias em função do
tempo em dias. As médias de todas as variáveis analisadas foram comparadas
pelo teste de Scott & Knott
36
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os isolados diferiram estatisticamente quanto ao diâmetro das colônias
nos diferentes dias e as estimativas dos coeficientes de variação (CV%) variaram
de 7,5%, aos três dias a 1,9%, aos 15 dias e 1,7% para o índice de velocidade de
crescimento micelial (IVCM), o que demonstra uma boa precisão ambiental.
Pela avaliação do crescimento micelial, as interações isolados x tempo foram
significativas (P≥0,01), indicando que o crescimento dos isolados não foi
coincidente ao longo dos dias. As correlações entre o diâmetro das colônias em
cada um dos diferentes dias com os resultados do índice de velocidade de
crescimento micelial (IVCM) foram estatisticamente significativas (P≥0,01),
sendo obtida classificação similar dos isolados, tanto pelo diâmetro das colônias
nos diferentes dias quanto o IVCM. Portanto, o IVCM é um bom indicador da
variabilidade quanto ao crescimento. Essa correlação pode ser exemplificada
pelo comportamento do isolado UFLA21, coletado em Paraguaçu, MG, pois foi
o que apresentou maior IVCM e sempre esteve no grupo daqueles com maior
diâmetro, em todas as medições (Tabela 2).
Como o crescimento micelial é um caráter que pode ser utilizado para
diferenciar isolados de A. solani (Bonde 1929) e pela boa correlação entre o
diâmetro das colônias nos diferentes dias e o IVCM, como demonstrado, foi
realizada a comparação entre as médias IVCM, pelo teste de Scott & Knott, que
proporcionou a formação de onze grupos diferentes estatisticamente (Tabela 2).
Desses grupos, o grupo a, que apresentou maior IVCM, foi formado apenas pelo
isolado UFLA21, coletado em Paraguaçu, MG e o grupo k, com menor IVCM,
foi formado pelos isolados UFLA14 coletado em Carrancas, MG (isolados de
batata), e UFLA52, coletado em Lavras, MG (isolado de tomate). Apesar de
alguns isolados, como os coletados em Carrancas, MG, encontrarem-se nos
37
grupos com menor IVCM, de maneira geral não foi observada a formação dos
grupos quanto ao IVCM de acordo com o local de coleta. Quanto ao diâmetro
das colônias medido nos diferentes dias, os isolados apresentaram relação linear
entre o crescimento da colônia e o tempo, nos 15 dias de avaliação (Figura 1).
Esse mesmo comportamento foi observado em Colletotrichum lindemuthianum,
quando avaliado o diâmetro das colônias por doze dias (Souza et al., 2007).
Pelas equações de regressão podemos observar que tanto o valor da
constante a, como, o valor de b sofreram alterações, sendo que, as equações de
regressão dos isolados com menores índices de crescimento micelial
apresentaram estes valores de a e b menores. De acordo com as equações de
regressão o isolado UFLA21 é o que apresentou maior índices de crescimento e
o isolado UFLA52 o que apresentou menor índices de crescimento, entretanto,
apesar das variações nas equações de regressão, para todos os isolados o
crescimento do isolado foi linear (Figura 1).
Pelas comparações entre as médias de diâmetro da colônia, com três,
seis, nove, doze e quinze dias após a inoculação, realizadas pelo teste de Scott &
Knott (Tabela 1A), nota-se que, com nove dias de crescimento in vitro, há a
formação de um maior número de grupos de médias similares. Isso indica que,
nesta época, a maior divergência no crescimento dos isolados ocorre aos nove
dias de crescimento. Comparando-se a contribuição para as interações isolados x
tempos de cada um dos isolados (Tabela 1A), pode-se observar que os isolados
que mais contribuíram para a interação foram UFLA3, UFLA2 e UFLA4, todos
coletados em Ijaci, MG, indicando que, em cada época de avaliação, eles se
comportaram de maneira diferente. Portanto, a diversidade no crescimento
micelial pode ocorrer entre isolados de uma mesma procedência, indicando que
a variabilidade para o caráter avaliado poderá ser elevada tanto entre quanto
dentre as populações de isolados coletados em diferentes locais.
38
TABELA 2 Médias para a esporulação e índice de velocidade de crescimento
micelial dos isolados avaliados.
isolados
IVCM*
(cm/dia)
Procedência
isolados Esporu-
lação
(10
3
)*
Procedência
UFLA21 1,80 a Paraguaçu, MG UFLA 55 8,25 a Paraguaçu, MG
UFLA27 1,74 b Embrapa Hort.DF UFLA 60 8,00 a Embrapa Hort. DF
UFLA05 1,72 b Ijaci, MG UFLA 02 7,75 a Lavras, MG
UFLA04 1,71 b Ijaci, MG UFLA 31 7,75 a S. J. da Mata, MG
UFLA22 1,63 c Paraguaçu, MG UFLA 26 7,00 a Paraguaçu, MG
UFLA06 1,62 c Ijaci, MG UFLA 23 6,75 a Ijaci, MG
UFLA23 1,62 c Paraguaçu, MG UFLA 07 6,75 a Carrancas, MG
UFLA25 1,62 c Embrapa Hort DF UFLA 22 6,50 a Ijaci, MG
UFLA01 1,57 d Ijaci, MG UFLA 32 6,25 b Paraguaçu, MG
UFLA07 1,57 d Ijaci, MG UFLA 51 6,25 b Embrapa Hort. DF
UFLA28 1,55 d Embrapa Hort. DF UFLA 61 6,25 b Embrapa Hort. DF
UFLA62 1,55 d Espírito Santo UFLA 62 6,00 b Paraguaçu, MG
UFLA29 1,53 d Embrapa Hort.DF UFLA 21 5,75 b Ijaci, MG
UFLA26 1,50 e Embrapa Hort. DF UFLA 20 5,75 b Cristalina, GO
UFLA32 1,50 e Embrapa Hort. DF UFLA 27 5,50 b Ijaci, MG
UFLA24 1,48 e Paraguaçu, MG UFLA 01 5,50 b Carrancas, MG
UFLA55 1,48 e Cristalina, GO UFLA 56 5,50 b Embrapa Hort. DF
UFLA18 1,47 e Paraguaçu, MG UFLA 30 5,50 b Lavras, MG
UFLA51 1,45 e Lavras, MG UFLA 52 5,50 b Espírito Santo
UFLA58 1,41 f S. J. da Mata, MG UFLA 28 5,25 b Paraguaçu, MG
UFLA61 1,41 f Espírito Santo UFLA 29 5,25 b Paraguaçu, MG
UFLA60 1,40 f S. J. da Mata, MG UFLA 25 5,00 b Ijaci, MG
UFLA54 1.39 f Lavras, MG UFLA 06 5,00 b Carrancas, MG
UFLA19 1,36 g Paraguaçu, MG UFLA 59 5,00 b Embrapa Hort. DF
UFLA56 1,35 g Cristalina, GO UFLA 34 5,00 b S. J. da Mata, MG
UFLA59 1,35 g S. J. da Mata, MG UFLA 54 4,75 c Embrapa Hort. DF
UFLA03 1,33 g Ijaci, MG UFLA 03 4,75 c Embrapa Hort. DF
UFLA02 1,31 h Ijaci,MG UFLA 57 4,75 c Lavras, MG
UFLA30 1,29 h Embrapa Hort.DF UFLA 04 4,50 c Ijaci, MG
UFLA33 1,28 h Embrapa Hort. DF UFLA 05 4,25 c Ijaci, MG
UFLA13 1,27 h Carrancas, MG UFLA 19 4,25 c Embrapa Hort. DF
UFLA57 1,27 h S. J. da Mata, MG UFLA 53 4,25 c S. J. da Mata, MG
UFLA20 1,25 i Paraguaçu, MG UFLA 24 3,75 c Paraguaçu, MG
UFLA34 1,23 i Embrapa Hort./DF UFLA 18 3,75 c Embrapa Hort. DF
UFLA12 1,22 i Carrancas, MG UFLA 58 3,75 c Embrapa Hort. DF
UFLA31 1,18 j Embrapa Hort. DF UFLA 14 3,75 c Espírito Santo
UFLA53 1,16 j Lavras, MG UFLA 33 3,25 c Lavras, MG
UFLA14 1,01 k Carrancas, MG UFLA 12 0,50 d S. J. da Mata, MG
UFLA52 1,00 k Lavras, MG UFLA 13 0,25 d Cristalina, GO
*médias na mesma coluna com a mesma letra não diferem estatisticamente, pelo
teste de Scott-Knott, a 5%.
39
FIGURA1 Equação e gráficos de regressão para o crescimento micelial de
alguns isolados de Alternaria solani representativos de cada grupo.
40
Diferenças nas intensidades de crescimento micelial também foram
observados entre isolados de A. brassicicola (Michereff et al., 2003) e entre
isolados de diferentes espécies de Alternaria, patogênicas de Senna obstusifolia
(Mello et al., 2001). Diversos trabalhos demonstraram que as características
morfológicas das colônias podem ser usadas para separar grupos de isolados,
indicando a ocorrência de variabilidade fenotípica dentro da espécie. Entretanto,
poucos estudos com Alternaria solani foram realizados. Um deles foi realizado
por Bonde (1929) que observou que isolados de tubérculos de batata podem ser
diferenciados com base na produção de esporos, pigmentação em BDA, tempo
de crescimento e aparência do micélio na cultura. Entretanto, a importância do
presente estudo está em comprovar que isolados de A. solani coletados de
diferentes regiões podem ser diferenciados quanto ao crescimento micelial,
apesar da formação dos grupos não corresponder à origem geográfica.
Com uma espécie relacionada, A. brassicicola, as características
fisiológicas do patógeno, como intensidade de crescimento micelial,
esporulação, germinação de conídios e sensibilidade ao fungicida iprodione,
foram usadas como ferramentas para estimar a variabilidade dos isolados
coletados de cultivos comerciais de crucíferas do estado de Pernambuco. Foi
observada grande variabilidade entre os isolados, com base nas características
avaliadas (Michereff et al., 2003). Estes resultados corroboram análises
realizadas pelo emprego de marcadores moleculares RAPD (Verma & Saharam,
1994; Sharma & Tewari, 1998). Neste sentido, para uma melhor diferenciação
dos isolados e obter resultados mais fidedignos, foi medida a intensidade de
esporulação desses isolados.
Todos os isolados apresentaram taxas de esporulação que diferiram
estatisticamente (P≥0,05). O coeficiente de variação (13,95%) para este caráter
foi um pouco elevado, provavelmente devido a diferenças na intensidade de luz
negra sobre as placas. Ao ser empregado o teste de Scott & Knot, foi possível
41
observar a formação de quatro grupos diferentes estatisticamente (P≥0,01)
(Tabela 2). Os isolados UFLA55 e UFLA26, coletados em Paraguaçu, MG;
UFLA60, coletado na Embrapa Hortaliças/DF; UFLA02, coletado em Lavras,
MG; UFLA31, coletado em São João da Mata, MG; UFLA26 e UFLA23,
coletados em Ijaci, MG e UFLA07, coletado em Carrancas, MG, foram os que
apresentaram maiores intensidades de esporulação. Os isolados UFLA13,
coletado em São João da Mata, MG e UFLA12, de Cristalina, GO, os que
tiveram as menores intensidades de esporulação. Essas diferentes intensidades
de esporulação também foram observadas por Rodrigues (2005), ao testar e
propor o protocolo utilizado para esporulação. Entretanto, não ocorreu a
formação de grupos de acordo com a origem geográfica.
A partir das características morfológicas das colônias e da intensidade
de esporulação de isolados de Alternaria de pistache, foram formados grupos
idênticos ou muito similares, de acordo com as espécies, A. alternata, A.
tenuissima, A. arborescens, ou A. infectoria (Pryor & Michailides, 2002),
indicando que essas características formam grupos divergentes. Entretanto,
como observado por Michereff et al. (2003), no presente trabalho também não
foi constatada correlação entre as características IVCM e taxa de esporulação, o
que pode ser devido à hipótese de que essas características podem ser
controladas por diferentes genes.
42
6 CONCLUSÕES
Os isolados de A. solani apresentaram ampla variabilidade tanto para
índice de crescimento micelial quanto para a taxa de esporulação.
Não houve correlação entre o índice de crescimento micelial e a taxa de
esporulação dos isolados.
Não houve correlação das características avaliadas com a procedência
dos isolado.
As características utilizadas permitiram diferenciar os isolados.
Entretanto, há necessidade de avaliar a correlação dessas características com as
características epidemiológicas dos isolados, para que sejam diferenciados
quanto a sua patogenicidade.
43
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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46
CAPÍTULO 3
DIVERSIDADE GENÉTICA ENTRE ISOLADOS DE ALTERNARIA
SOLANI
47
1 RESUMO
OLIVEIRA, Marciane da Silva. Diversidade genética entre isolados de
Alternaria solani. In: ______. Diversidade entre isolados de Alternaria solani:
avaliação morfológica, fisiológica e molecular. 2007. Cap.3, p.46-80. Tese
(Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas) – Universidade Federal de
Lavras, Lavras, MG.
∗
A pinta preta, causada pelo fungo Alternaria solani, é uma das doenças
mais importantes em solanáceas no Brasil. O desenvolvimento de estratégias
para controle da doença requer um conhecimento prévio da variabilidade
genética do patógeno. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar a
diversidade genética entre isolados de A. solani coletados em regiões de
produção de batata e tomate. Foram avaliados 60 isolados de A. solani, os quais
foram caracterizados por meios de marcadores ISSR e a diferenciação em
grupos de compatibilidade micelial (GCM). Todos os isolados evidenciaram a
sua capacidade de serem compatíveis micelialmente com os demais. As
estimativas de similaridade genética, obtidas pelo coeficiente de Russel e Rao,
entre os pares de isolados para a compatibilidade micelial variaram de 0,02 a
0,73, com média de 0,23. Foi observada a formação de 36 grupos, sendo que,
apenas três grupos foram formados por isolados que apresentaram o mesmo
comportamento quanto à compatibilidade micelial (GCM). A partir de 18
primers ISSR foram obtidas 85 bandas polimórficas. As estimativas de
similaridade genética, obtidas pelo coeficiente de Nei e Li, entre os isolados
variaram de 0,14 a 0,97, com média 0,58. A partir análise de agrupamento, pelo
método UPGMA, foram formados cinco grupos contendo apenas dois isolados,
um grupo com três isolados e dois grupos com mais de 15 isolados. Dez isolados
formaram grupos individuais. Em geral, não houve tendência de formação de
grupos por hospedeiro, como observado pela análise dos dados de GCM. Apesar
da ampla variabilidade detectada por ambas as análises de GCM e marcadores
ISSR, esta não foi atípica para espécies de fungos de reprodução assexual.
∗
Orientadora: Elaine Aparecida de Souza.
48
2 ABSTRACT
Oliveira, Marciane da Silva. Genetic diversity among isolates of Alternaria
solani. In: ______. Diversity among isolates of Alternaria solani:
morphological, physiological and molecular evaluations 2007. Cap3. p. 46-80.
Thesis (Doctorate in Genetics and Plants Breeding) - Federal University of
Lavras, Lavras, MG.
∗
Early blight caused by the fungus Alternaria solani, is one of the most
important diseases in solanaceous in Brazil. Development of strategies to control
this disease requires a previous knowledge of the genetic variability of the
pathogen. The objective of this study was to investigate the genetic diversity
among isolates of A. solani collected in areas of potato and tomato production.
Sixty isolates of A. solani were appraised, which were characterized by means of
ISSR markers and differentiation in mycelial compatibility groups (MCG). All
isolates presented mycelial compatibility with the others. The estimates of
genetic similarity by the coefficient of Russeo and Rao, among pairs of isolates
for the compatibility mycelial varied from 0.02 to 0.73, with 0.23 average. The
formation of 36 groups was observed, and, only three groups were formed by
isolates that presented the same behavior concerning mycelial compatibility.
From eighteen ISSR primers 85 polymorphic bands were obtained. The
estimates of genetic similarity among the isolates varied from 0.14 to 0.97, with
0.58 average. In the cluster analysis five groups were formed containing two
isolates, a group with three isolates and two groups with more than 15 isolates.
Ten isolates formed individual groups. In general, there was a tendency of
isolates to group accordingly to the colleting place. In spite of the wide
variability detected by both analyses of MGC and ISSR markers, this was not
atypical for asexual reproduction fungi species.
∗
Advisor: Elaine Aparecida de Souza - UFLA/DBI.
49
3 INTRODUÇÃO
O fungo Alternaria solani é um dos patógenos mais importantes e
freqüentes nas culturas da batata e do tomate no Brasil e em várias regiões de
cultivo de clima tropical. A ocorrência de epidemias da doença está associada a
temperaturas de 25° a 30°C e elevada umidade (Bonde, 1929). Entre as
estratégias de controle da doença, a resistência genética é a mais eficaz, pois
reduz os custos da produção e o impacto ambiental.
Existem cultivares e clones oriundos da seleção nos programas de
melhoramento que exibem bons níveis de resistência de campo e que poderiam
ser cultivados sem o emprego de defensivos contra A. solani (Stevenson, 1994,
Pinto et al., 2002). No entanto, pouco se conhece sobre a variabilidade do
patógeno, principalmente no Brasil, onde esta doença fúngica é a de grande
destaque. Portanto, para a identificação de novas fontes de resistência, bem
como a seleção de clones promissores nos programas de melhoramento visando
resistência à pinta-preta, torna-se importante o conhecimento da estrutura
populacional do patógeno e o seu constante monitoramento.
A variabilidade de isolados de A. solani tem sido avaliada por meio de
patogenicidade, marcadores morfológicos, fisiológicas (Bonde, 1929; Henning
& Alexandre, 1959; Fancelli, 1991; Simmons, 2000), moleculares
(isoenzimáticos, RAPD, RAMs e AFLP) e grupos de compatibilidade micelial
(Petrunak & Christ, 1992, Weir et al., 1998; Martínez et al., 2004; Waals et al.,
2004). Nesses trabalhos têm sido evidenciada ampla variabilidade genética entre
os isolados e, em alguns relatos, a existência de especificidade por hospedeiro ou
origem geográfica. No entanto, não há evidências conclusivas sobre a ocorrência
de raças fisiológicas.
O termo raça fisiológica é definido de acordo com a especificidade em
50
cultivares hospedeiras diferenciadoras (Schlegel, 2003). Segundo Chaerani &
Voorrips (2006), o relato da presença de raças fisiológicas de A. solani não está
de acordo com a definição, pois, elas têm sido descritas em termos de
variabilidade em caracteres morfológicos, fisiológicos e ecológicos in vitro
(Bonde, 1929). Henning & Alexander (1959) reconheceram sete raças
fisiológicas distintas de A. solani em campo de produção de batata a partir de
diferenças culturais e uma aparente especificidade por hospedeiro, mas o padrão
de infecção não foi consistente entre os experimentos.
A grande variabilidade fenotípica e genética relatada dentro das espécies
do gênero Alternaria sugere a ocorrência de recombinação. Entretanto, os
fungos imperfeitos ou mitospóricos, como os deste gênero, são caracterizados
por não apresentarem a fase sexuada (Loguercio-Leite, 2004). Portanto, é
provável que algum mecanismo de recombinação assexual esteja ocorrendo,
como, por exemplo, o ciclo parassexual que envolve a ocorrência de permuta
mitótica (Azevedo, 2004). Um pré-requisito para a ocorrência da
parassexualidade é que diferentes isolados sejam compatíveis micelialmente, ou
seja, é necessário que ocorra a extensão da ponta das hifas, ramificação e fusão,
o que poderá levar à formação de um heterocário (Leslie & Zeller, 1996; Glass
et al., 2000; 2004).
A classificação dos diferentes isolados em grupos de compatibilidade
micelial (GCM) indica a probabilidade de ocorrência de recombinação somática
entre estes grupos (Leslie, 1993). Saupe (2000) comenta que a classificação de
diferentes isolados em grupos de compatibilidade micelial pode ser uma boa
ferramenta para análises de populações de fungos de reprodução assexual. Em
muitos casos, nas populações naturais, o número de GCMs é considerável.
Nesse sentido, a análise de A. solani, por meio de marcadores
moleculares, associado à investigação do número de grupos de compatibilidade
micelial, tem sido utilizada por fornecer informações mais completas sobre as
51
populações deste fungo (Meijer et al., 1994; Walls et al., 2004). A variabilidade
genética encontrada por Walls et al. (2004), com o emprego de grupos de
compatibilidade micelial (GCM) e marcadores RAMS, foi alta e não foi atípica
para espécies que se reproduzem apenas assexuadamente. A provável causa
podem ser mutações naturais, associadas ao grande número de esporos
produzidos em um curto período de tempo e, principalmente, a ocorrência do
ciclo parassexual.
Outros trabalhos têm usado o fenômeno natural da compatibilidade
micelial como um método para verificar a diversidade genética em várias
espécies de fungos (Kerényi et al., 1997, Elena & Paplomatas, 1998, Caten &
Newton, 2000, Tsor et al., 2001, Nitzan et al., 2002, Gionannetti et al., 2003,
Roca et al., 2004).
Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a variabilidade genética de
isolados de A. solani coletados em diferentes campos de produção de batata e
tomate, em relação à compatibilidade micelial e à diversidade de perfis
moleculares, visando obter informações sobre a estrutura populacional deste
patógeno
52
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Isolados de Alternaria solani
Foram avaliados 60 isolados de A. solani (Tabela 1), sendo 49
provenientes de Minas Gerais, Goiás, Distrito Federal, Bahia e Espírito Santo,
no Brasil e os demais, provenientes de Cuba. Os isolados foram crescidos a
partir de um único conídio da lesão, colocados em BDA, em BOD (incubadora
de crescimento) com controle de temperatura de 25°C, no escuro e armazenados
na coleção do Laboratório de Resistência de Plantas a Doenças, no
Departamento de Biologia da Universidade Federal de Lavras (UFLA). Os
isolados coletados em Ijaci, MG apresentam dados complementares quanto à
planta (1,2 ou 3), à folha (A, B ou C) e à lesão (i ou ii) em que cada conídio foi
coletado (Tabela 2).
4.2 Análises molecular
4.2.1 Obtenção de massa micelial
A massa micelial foi obtida por meio do crescimento de discos de
micélios do fungo retirados das bordas das colônias de cada um dos 60 isolados
(Tabela 1) e transferidos para frascos de Erlenmeyer com 250 mL de meio
líquido V8 e mantidos, a 25°C, em incubadora (Shaker) com agitação, na
rotação de 110 RPM, por sete dias. Após o crescimento da massa micelial, a
umidade foi retirada parcialmente, por meio de bomba a vácuo e,
posteriormente, realizou-se a extração.
53
TABELA 1 Identificação da espécie e ou cultivar hospedeira e procedência dos
isolados de A. solani armazenados na coleção do Laboratório de
Resistência de Plantas a Doenças, Departamento de Biologia,
UFLA.
Nº Isolado Hospedeiro Procedência
1 UFLA 1 batata/clones Ijaci, MG
2 UFLA 2 batata/clones Ijaci, MG
3 UFLA 3 batata/clones Ijaci, MG
4 UFLA 4 batata/clones Ijaci, MG
5 UFLA 5 batata/clones Ijaci, MG
6 UFLA 6 batata/clones Ijaci, MG
7 UFLA 7 batata/clones Ijaci, MG
8 UFLA 8 tomate Manhuaçu, MG
9 UFLA 9 tomate Manhuaçu, MG
10 UFLA 10 tomate Piracicaba, SP
11 UFLA 11 tomate Piracicaba, SP
12 UFLA 12 batata/clones Carrancas, MG
13 UFLA 13 batata/clones Carrancas, MG
14 UFLA 14 batata/clones Carrancas, MG
15 UFLA 18 batata/Atlantic Paraguaçu, MG
16 UFLA 19 batata/Atlantic Paraguaçu, MG
17 UFLA 20 batata/Atlantic Paraguaçu, MG
18 UFLA 21 batata/Atlantic Paraguaçu, MG
19 UFLA 22 batata/Atlantic Paraguaçu, MG
20 UFLA 23 batata/Atlantic Paraguaçu, MG
21 UFLA 24 batata/Atlantic Paraguaçu, MG
22 UFLA 25 batata/Achat CNPH/DF
23 UFLA 26 batata/Achat CNPH/DF
24 UFLA 27 batata/clone 118-08 CNPH/DF
25 UFLA 28 batata/clone 118-08 CNPH/DF
26 UFLA 29 batata/ Monalisa CNPH/DF
27 UFLA 30 batata/Monalisa CNPH/DF
28 UFLA 31 Batata/clone 118-08 CNPH/DF
29 UFLA 32 Batata/clone 118-08 CNPH/DF
“...continua...”
54
“TABELA 1, Cont.”
Nº Isolado Hospedeiro Procedência
30 UFLA 33 batata/Delta CNPH/DF
31 UFLA 34 batata/Delta CNPH/DF
32 UFLA 51 Tomate Lavras, MG
33 UFLA 52 Tomate Lavras, MG
34 UFLA 53 Tomate Lavras, MG
35 UFLA 54 Tomate Lavras, MG
36 UFLA 55 batata/Ágata Cristalina, GO
37 UFLA 56 batata/Ágata Cristalina, GO
38 UFLA 57 batata/Monalisa São João da Mata, MG
39 UFLA 58 batata/Monalisa São João da Mata, MG
40 UFLA 59 batata/Monalisa São João da Mata, MG
41 UFLA 60 batata/Monalisa São João da Mata,MG
42 UFLA 61 Batata Espírito Santo
43 UFLA 62 Batata Espírito Santo
44 BR – 4 batata/ano ind. Lavras, MG
45 BR – 8 batata/2000
1
Lavras, MG
46 BR – 12 batata/2000
1
Lavras, MG
47 BR – 13 batata/2000
1
Lavras, MG
48 C – 114 batata/1997
1
Pinar del Rio, Cuba
49 C – 119 batata/1997
1
Havana, Cuba
50 C – 128 batata/1997
1
Villa Clara, Cuba
51 C – 150 batata/1998
1
Tonas, Cuba
52 C – 154 batata/1998
1
Tonas, Cuba
53 C – 156 batata/1998
1
Tonas, Cuba
54 C – 187 batata/1998
1
Tonas, Cuba
55 C – 251 batata/1999
1
Pinar del Rio, Cuba
56 C – 255 batata/1999
1
Camagüey, Cuba
57 C – 258 batata/1999
1
Camagüey, Cuba
58 EH – 725 batata/clones CNPH/DF
59 EH – 769 Tomate Crisopólis, BA
60 EH – 929 Tomate J. Dourado, BA
1
Ano de coleta: nos isolados em que não está indicado, a coleta foi realizada em
2005.
55
TABELA 2 Identificação dos isolados DE Alternaria solani de Ijaci, MG,
quanto a planta, folha e lesão de coleta.
Isolado Planta Folha Lesão
UFLA 1 1
1
A
2
I
3
UFLA 2 2 B iii
UFLA 3 2 C iv
UFLA 4 1 A i
1
UFLA 5 3 D v
UFLA 6 1 A ii
1
UFLA 7 3 E vi
1
Números iguais indicam a mesma planta;
2
Folhas representadas pela mesma letra foram coletadas na mesma planta;
3
Lesões representadas pela mesma letra foram coletadas na mesma folha da
mesma planta.
4.2.2 Extração de DNA total
A extração de DNA foi efetuada de acordo com a metodologia
desenvolvida por Raeder & Broda (1985) modificada. A massa micelial foi
transferida para almofariz de porcelana e macerada em 10 ml de tampão de
extração com CTAB a 65°C, juntamente com 30 μl de b-mercaptoetanol, com
auxílio de areia esterilizada e nitrogênio líquido. O tampão de extração continha
2% de CTAB, 100 mM de TRIS (pH = 8,0), 20 mM de EDTA (pH = 8,0), 1,4 M
de NaCl e 1% de PVP (polivinilpirrolidona).
O macerado foi mantido em banho-maria, a 65°C, por 30 minutos, sendo
agitado, por suaves inversões, a cada 10 minutos; logo após, as amostras foram
submetidas a resfriamento durante cinco minutos. Em seguida, foram
adicionados 10 mL da solução clorofórmio:álcool isoamil (24:1), seguindo-se
homogeneização e centrifugação, durante 10 minutos, a 4.000 rpm. O
sobrenadante foi misturado a 30 mL da solução álcool etílico a 95% acetato de
56
amônio 7,5M (6:1) e levado ao freezer (-20°C). por seis horas, no mínimo. Ao
DNA coletado foram adicionados 300 μL de TE (Tris 1 mM e EDTA 0,1 mM,
pH 7,7). O DNA dissolvido foi submetido a uma segunda extração com
clorofórmio álcool isoamil, sendo o sobrenadante coletado e misturado com o
triplo de seu volume com álcool a 95%:acetato de sódio 3M (20:1) e mantido no
freezer (-20°C), por seis horas, no mínimo. A solução de álcool acetato de sódio
foi eliminada e o DNA dissolvido em 50-100 μL de TE.
Após este processo, o material foi quantificado usando-se o fluorímetro
Hoeffer Scientific TKO100. Para isso, foram utilizados 2 μL da solução de DNA
em 2 mL de tampão (Tris 10 mM, EDTA 1,0 mM, NaCl 0,1 M, pH 7,4),
juntamente com 0,1 μL.mL-1 do corante H32258. As amostras foram diluídas
em TE para uma concentração de 10 ng.mL-1, para as reações ISSR.
4.2.3 Reação ISSR
Primers degenerados foram sintetizados a partir dos utilizados por Walls
et al. (2004) para possibilitar a amplificação isoladamente de seqüências
especificas. Cada seqüência foi sintetizada separadamente. A partir de teste
preliminar, foram escolhidas as seqüências que apresentaram produtos de
amplificação (Tabela 3). As amostras de DNA foram amplificadas pela técnica
de ISSR. Cada reação de amplificação de 12 μL continha 4,74 μL de água, 2,5 µl
de DNA (aong.ml
-1
), 0,66 µl de dNTP (mistura equitativa de dATP, dGTP,
dCTP, dTTP), 2,5 µl de um dos oligonucleotídeos iniciadores (primer),
indicados na tabela 5, 1,0 µl de tampão de reação e 0,6 unidades de enzima Taq
polimerase.
As reações de amplificação foram realizadas em termociclador
Eppendorf MasterCycler Gradient 5331. Os ciclos de amplificação foram
subdivididos em dois programas: 1) nos oito primeiros ciclos, a desnaturação do
57
DNA foi feita a 94°C, por dois minutos; o anelamento, a 40°C, por 20 segundos
e a elongação, a 72°C, por 20 segundos e 2) adicionalmente, mais 24 ciclos
diferiram apenas no tempo de desnaturação (20 segundos). Após 30 ciclos,
procedeu-se a extensão final, por 4 minutos, a 72°C.
Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese em gel de
agarose 2% imerso em tampão TBE (0,45 M de Tris-Borato e 0,01 M EDTA), a
60 volts, durante 4 horas. Logo após, foram corados com brometo de etídio a
uma concentração de 0,5 μg.mL-1 e visualizados em transiluminador de luz
ultravioleta Fotodyne e fotografados com a câmara fotográfica EDA - 290 da
KODAK.
TABELA 3 Primers de ISSR que detectaram polimorfismo nos isolados de
Alternaria solani, com suas respectivas seqüências de bases.
Primers Seqüências
CA1 5’ACCACACACACACACACA3’
CA2 5’ATCACACACACACACACA3’
CA3 5’TACACACACACACACACA3’
CA4 5’GCCACACACACACACACA3’
CA5 5’AGCACACACACACACACA3’
CA6 5’GGCACACACACACACACA3’
CA7 5’GTCACACACACACACACA3’
CA8 5’TCCACACACACACACACA3’
CA9 5’TTCACACACACACACACA3’
CAC1 5’ACGCACCACCACCACCAC3’
CAC4 5’ACACACCACCACCACCAC3’
CAC5 5’ACTCACCACCACCACCAC3’
CAC6 5’AGTCACCACCACCACCAC3’
CAC7 5’ATGCACCACCACCACCAC3’
CAC10 5’GGACACCACCACCACCAC3’
CAC11 5’GGGCACCACCACCACCAC3’
CAC12 5’GTCCACCACCACCACCAC3’
CAC13 5’GTTCACCACCACCACCAC3’
58
4.3 Grupos de compatibilidade micelial (GCM)
Para a avaliação dos grupos de compatibilidade micelial (GCM) foi
utilizada a metodologia de Waals et al. (2004), com modificações. Discos
miceliais de 3mm de diâmetro foram transferidos para placas com BDA, em um
arranjo de seis discos distanciados a 2cm por placa e mantidas em câmara de
crescimento (BOD), a 25+
2ºC, no escuro, por quinze dias.
Os pares de isolados confrontados foram considerados como
incompatíveis quando alguma das situações a seguir foi observada: uma região
de contato, entre os isolados, com micélios escassos ou ausentes ou uma linha
escura fina, com micélios pigmentados, chamada de linha de contato ou zona de
reação. Por conseguinte, entre os pares de isolados nos quais não foi possível
verificar uma região de contato, indicando que os micélios dos isolados se
misturaram uniformemente, estes foram considerados compatíveis
micelialmente. Foram realizadas duas repetições para cada par de combinações.
4.4 Análises estatísticas
4.4.1 Análises dos grupos de compatibilidade micelial
Após a avaliação foi construída uma matriz binária, em que 0 (zero)
corresponde a isolados não compatíveis e 1 (um) a isolados compatíveis
vegetativamente. Dessa forma, com esses dados, foi gerada uma matriz.
Para estimar a similaridade, foi utilizado o coeficiente de Russel & Rao
(1940) por meio da expressão:
sg
ij
=a/(a+b+c+d)
Sendo,
59
a: compatibilidade para ambos os isolados i e j,
b: compatível apenas para o isolado i,
c: apenas para o isolado j e
d: incompatível para ambos isolados i e j.
As análises de similaridade genética foram realizadas por meio do
programa NTSYS.pc 2.1 (Rohlf, 2000).
O dendrograma foi obtido a partir da matriz de similaridade genética
gerada por meio de análises de agrupamento de similaridade, utilizando o
método de média das similaridades (UPGMA). Os erros associados a cada
similaridade foram estimados utilizando-se a expressão:
s
gs
={sg
ij
[(1- sg
ij
)/(n-1)]}
0,5
Em que,
n é a soma de a, b, c e d para cada par de isolados.
Os isolados pertencentes a diferentes grupos de compatibilidade micelial
foram identificados no dendrograma a partir da estimativa do valor máximo
significativo (sg
m
). O sg
m
foi estimado por meio do teste t, utilizando-se a
expressão:
sg
m
=1-(t.* s
sg
)
Em que,
t é o valor tabelado da distribuição de t de Student, a 1% de probabilidade, com
n-2 graus de liberdade e
s
sg
o erro médio das comparações consideradas no dendrograma.
4.4.2 Identificação do número ótimo de marcadores
Com a finalidade de verificar se o número de bandas polimórficas
geradas pelos 18 primers de ISSR (Tabela 5) foi suficiente para determinar com
precisão as estimativas de similaridades genéticas entre isolados, foi realizada a
60
análise de bootstrap.
Para cada par de isolados, a similaridade genética foi estimada a partir
de simulações com reamostragens de diferentes tamanhos (5, 15, 25, 35,..., 85
bandas), sendo cada uma repetida 10.000 vezes por meio do software GQMOL
(Cruz & Schuster, 2004). Neste aplicativo, obtêm-se as estimativas de correlação
de valores da matriz de similaridade original com os de outras matrizes de
similaridade, as quais são obtidas levando-se em consideração diferentes
números de bandas. O programa disponibiliza também dois outros parâmetros: a
soma de quadrados dos desvios em relação às reamostragens e o valor de
estresse (E), que indica o ajuste entre a matriz original e a matriz amostral, por
meio da expressão:
E= {(s
ij
*
- s
ij
)
2
/ ∑s
ij
*2
}
0,5
em que:
E: estresse;
s
ij
*
: similaridade genética média entre todos os pares de acessos estimada para
cada amostragem;
s
ij
: similaridade genética média entre todos os pares de acessos estimada a partir
do total de bandas polimórficas.
O número ideal de bandas polimórficas foi considerado quando o estresse
assumiu valor menor que 0,05 (Kruskal, 1964).
4.4.3 Estimativa das similaridades genéticas por marcadores ISSR
Ao avaliar os géis, constou-se que cada banda polimórfica foi tratada
como um caráter único. Foi gerada uma matriz de dados 0 e 1 (Tabela 1A), a
partir da codificação da presença (1) e da ausência (0) das bandas polimórficas
presentes nos 60 isolados. A estimativa da similaridade genética, entre cada par
de isolados, foi efetuada pelo coeficiente de Nei e Li, por meio da expressão
61
(Rohlf, 2000).
Sg
ij
= 2a
2a+b+c
Em que:
a: presença de bandas no indivíduo i e j;
b: presença de bandas no indivíduo i e ausência no indivíduo j;
c: ausência de bandas no indivíduo i e presença no indivíduo j;
As análises de similaridade genética foram realizadas por meio do
programa NTSYS-pc 2.1 (Rohlf, 2000). A matriz de similaridade genética
gerada foi, então, usada para produzir um dendrograma pelo método da média
das similaridades (UPGMA).
Os erros associados a cada similaridade e os isolados geneticamente diferentes
foram identificados no dendrograma e estimados como demonstrado no item
1.4.1.
62
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Análise molecular
5.1.1 Nível de polimorfismo
As reações efetuadas com os 18 primers selecionados para a análise da
diversidade genética (Tabela 4) proporcionaram 85 produtos de amplificação, os
quais forneceram uma média de 4,7 bandas por primer. Tanto os primers da
família CA (Figura 1A) quanto os da família CAC amplificaram, em média, o
mesmo número de bandas polimórficas.
Waals et al. (2004) avaliaram isolados de A. solani utilizando os primers
ISSR [Inter-SSR (Simple Sequence Repeats) amplification] chamados por ele de
RAMS (Random Amplified Microssatellites). Entretanto, estes autores utilizaram
os primers de forma degenerada. Além disso, também usaram as combinações
destes primers, GACA
4
-CAC
5
e CA
8
-CAC
5
, sendo obtido um total de 47 bandas
polimórficas. No entanto, há dúvidas se estes primers gerariam um número de
bandas polimórficas capaz de representar a diversidade existente entre os
isolados. Para constatar este fato, foram realizadas análises de reamostragens
(bootstrap), empregando-se as 85 bandas geradas nos 60 acessos (Figura 1).
Verifica-se que houve relação direta entre o número de bandas e a
magnitude da correlação dos valores da matriz de similaridade original com os
das outras matrizes de similaridade geradas a partir das amostras dos diferentes
números de bandas. Contudo, somente a partir de 45 bandas, a estimativa de
correlação apresentou alta magnitude (r=0,94). Mesmo assim, para este número
de bandas, a soma dos quadrados dos desvios em relação às reamostragens e ao
valor do estresse ainda foram altos (SQd=11,7 e estresse=0,09), sugerindo baixa
63
consistência na associação das matrizes, segundo Kruskal (1964).
O número ótimo foi considerado quando se atingiu 75 bandas, pois,
neste valor, houve um bom ajuste entre os valores da matriz de similaridade
original com os das outras matrizes de similaridade geradas. Para este número de
bandas, a magnitude da correlação foi bem próxima do valor máximo (r=0,99),
apresentando alta confiabilidade, uma vez que cada reamostragem foi repetida
10.000 vezes. A soma de quadrados dos desvios (SQd) e o valor do estresse (E)
atingiram valores baixos, isto é, 0,0966 e 0,0383, respectivamente. Para Kruskal
(1964), valores de estresse inferiores a 0,05 representam um excelente indicativo
de precisão, pois este valor indica um ajustamento do gráfico (dendrograma) em
relação à matriz de similaridade original.
FIGURA 1 Resumo da análise bootstrap contendo as correlações obtidas para
diferentes números de bandas polimórficas do marcador ISSR na
determinação do número ideal de bandas para a análise de isolados
de Alternaria solani.
64
5.1.2 Avaliação da variabilidade genética
A partir das 85 bandas polimórficas geradas (Tabela 3A), foi construída
uma matriz de similaridades genéticas. As estimativas de similaridade genética
entre os isolados variaram de 0,14 a 0,97, com média de 0,58, valor este similar
ao encontrado (0,423) por Petrunak & Christ (1992), na avaliação da diversidade
genética entre isolados de A. solani, dos Estados Unidos. Todavia, Waals et al.
(2004) relatam uma similaridade genética média de 0,27. Com relação à
distribuição de freqüência das similaridades obtidas entre os pares formados na
matriz genética, verificou-se que 82% dos pares variaram de 0,38 a 0,78. Estes
resultados reforçam a possibilidade de os isolados avaliados possuírem ampla
diversidade genética e fornecem indícios de que a amostra analisada represente
bem a variabilidade dessa espécie, pelo menos entre os isolados mais distintos
geneticamente. Apesar de terem sido encontradas valores de similaridades
genéticas baixos, a maioria destes valores é maior, sendo a média considerada
alta quando comparada com resultados dos trabalhos anteriormente
mencionados.
Para melhor visualização da divergência genética entre os isolados, foi
construído um dendrograma a partir das similaridades (Figura 2). Pela análise do
dendrograma foi possível verificar a formação de oito grupos, todos com
elevados valores de bootstrap (bootstrap≥90%).
Dos grupos formados, cinco grupos contêm apenas dois isolados, um
grupo foi formado por três isolados e dois grupos foram formados por mais de
quinze isolados. Entretanto, dez isolados não formaram grupos dentro do
intervalo estabelecido. Os grupos formados são apresentados na Tabela 7, com
seus hospedeiros e locais de coleta. Como se pode observar, nesta tabela, os
isolados do grupo 1 e do grupo 2 foram coletados de batata em Ijaci, MG. Dos
sete isolados coletados neste local, cinco encontram-se nestes dois grupos.
65
FIGURA 2 Dendrograma dos isolados de Alternaria solani agrupados de acordo
com a estimativas de similaridades genéticas, com base em 85
bandas polimórficas de ISSR geradas (UPGMA) A linha de corte
representa o valor máximo de similaridade (sgm), à direita da qual
os isolados apresentaram o mesmo comportamento. O sgm a 1% de
probabilidade foi de 0,71.
66
O grupo3 é formado por dois dos três isolados coletados em Carrancas, MG. Do
mesmo modo, o grupo 7 é formado pelos dois isolados coletados em Manhuaçu,
MG. Entretanto, apesar dos dois isolados do grupo 6 terem vindo de Cuba, eles
foram coletados em locais diferentes. De modo semelhante, os isolados do grupo
8 foram coletados em Carrancas, MG e no CNPH/DF.
A tendência de agrupamentos dos isolados de A. solani por origem
geográfica e hospedeiro foi observada por Martínez et al. (2004). Alguns
isolados utilizados por estes autores também foram avaliados no presente
trabalho, os quais mostraram coincidência nos agrupamentos dos dois trabalhos.
No trabalho realizado por Martínez et al. (2004), os isolados de A. solani
formaram dois grupos, grupo 1 e grupo 2. Entre os isolados do grupo 1
encontram-se C-114, C-128, C-255, C-150 e C-154 que, no presente trabalho,
ficaram no grupo 5 e, também, os isolados C-187, C-251, C-258 que, no
presente trabalho, encontram-se no grupo 6. Entre os isolados do grupo 2 de
Martínez et al. (2004) encontram-se C-119, BR-12, BR-13, BR-8 e BR4 que, no
presente trabalho, encontram-se no grupo 4; somente o isolado BR-4 não formou
grupo. Os isolados BR-12, BR-13 e BR-8, em ambos os trabalhos, formaram um
grupo menor.
Apesar da formação de grupos com isolados do mesmo local de origem,
não se pode inferir sobre a tendência de formação de grupos por hospedeiro,
devido ao baixo número de isolados coletados de tomate. Esses agrupamentos
por hospedeiro foram observados por Petrunak & Christ (1998), Weir et al.
(1998), Waals et al. (2004) e Martínez et al. (2004). Contudo, nestes trabalhos,
não ocorreu formação de grupos de acordo com a origem geográfica. Os
resultados desses trabalhos sugerem que as várias subpopulações de diferentes
regiões geográficas não são geneticamente isoladas, o que não foi observado no
presente trabalho.
67
TABELA 4 Grupos de isolados considerando os resultados do UPGMA e do
dendrograma, referentes aos 60 isolados (Figura 3).
G Isolado Local Hospedeiro
1 UFLA 1, UFLA 2 Ijaci/MG batata
2 UFLA 4, UFLA 5, UFLA 6 Ijaci/MG batata
3 UFLA 12, UFLA 13 Carrancas/MG batata
UFLA18, UFLA19, UFLA20
UFLA23, UFLA24, UFLA21,
UFLA22
Paraguaçu/MG batata
BR – 8, BR – 12, BR – 13 Lavras/MG batata
C – 119 Havana, Cuba batata
UFLA 55, UFLA 56 Cristalina/GO batata
4
UFLA57, UFLA 58, UFLA59,
UFLA60
S. J. da Mata/MG batata
UFLA 61, UFLA62 Espírito Santo tomate
UFLA 11 Piracicaba/SP tomate
EH – 929 J. Dourado/BA tomate
UFLA28, UFLA30, UFLA32,
UFLA33, UFLA34
CNPH/DF batata
C – 154, C – 150 Tonas/Cuba batata
C – 251, C – 114 Pinar D. Rio/Cuba batata
C – 255 Camgüey/Cuba batata
5
C – 128 Villa Clara, Cuba batata
C – 187,
Tonas, Cuba batata
6
C – 258
Camagüey, Cuba batata
7 UFLA 8, UFLA 9 Manhuaçu/MG tomate
8
UFLA 14
Carrancas/MG batata
EH – 725 CNPH/DF batata
UFLA 3, UFLA 7 Ijaci/MG batata
UFLA 10
Piracicaba/
SP
tomate
UFLA25,
UFLA26,UFLA27,
UFLA31,
CNPH/DF batata
UFLA 54, UFLA 59, Lavras/MG batata
Isolados que
não formaram
grupos
BR - 4 Lavras/MG tomate
68
5.2 Grupos de compatibilidade micelial (GCM)
Todos os isolados evidenciaram a sua capacidade de serem compatíveis
micelialmente com os demais (Tabela 2A). Os diferentes tipos de reações de
compatibilidade micelial podem ser observados na Figura 3. A reação de
compatibilidade micelial envolve a ocorrência de vários eventos anteriores que
foram descritos por diferentes autores (Leslie & Zeller, 1996; Glass et al., 2000;
2004). Um estágio inicial de pré-contato leva ao crescimento das hifas de um
isolado em direção às hifas do outro isolado (Glass et al., 2004). Quando esta
etapa não ocorre, observamos uma região de contato entre os isolados com
micélios escassos ou ausentes (Figura 2(a)). Entretanto, em muitos casos, as
etapas de pré-contato e fusão das hifas ocorrem, contudo, as células
heterocarióticas resultantes são rapidamente destruídas por uma reação
degenerativa e lítica, ficando escuras, sendo possível observar a linha de contato
(Figura 2(b)) (Leslie, 1996).
Os isolados que apresentaram maior percentual de reações compatíveis
(75%) foram UFLA57 e UFLA59, ambos coletados de batata, em São João da
Mata, MG. Quando se comparam as reações destes isolados com os demais
isolados, estas foram diferentes, ou seja, o isolado UFLA57 foi compatível
micelialmente com o UFLA31 e o isolado UFLA59 não foi, o que,
provavelmente, indica que eles apresentam genótipos diferentes para os locos
envolvidos no controle do caráter. Já o isolado que apresentou maior percentual
(78%) de reações incompatíveis foi o UFLA31, coletado de batata, na Embrapa
Hortaliças/DF.
Confrontando-se os isolados de uma mesma região dois a dois,
observaram-se reações de incompatibilidade entre eles, o que corrobora o relato
de Saupe (2000), de que interações incompatíveis podem ocorrer freqüentemente
entre os isolados de uma mesma população, bem como de populações distintas.
69
De acordo com Glass et al. (2000), as reações de incompatibilidade podem estar
relacionadas a um sistema de autodefesa. Já a compatibilidade micelial
possibilita a formação do heterocário, o que poderá originar variação genética na
população do patógeno.
FIGURA 3 Visualização dos confrontos entre isolados de Alternaria solani. Em
cada placa foram confrontados seis isolados. Os números indicam o
isolado e as letras: (a) região de contato entre os isolados com
micélios escassos ou ausentes, (b) linha de contato ou zona de
reação formada por uma linha escura fina, com micélios
pigmentados, indicam reação de incompatibilidade micelial e (c)
reação de compatibilidade com os micélios dos isolados se
misturando livremente.
70
A compatibilidade micelial é um requisito para a ocorrência do ciclo
parassexual, que é um mecanismo de recombinação genética em fungos
assexuados, como os do gênero Alternaria (Loguercio-Leite, 2004), que poderá
ampliar a variabilidade genética da população. A partir dos dados de
compatibilidade micelial do confronto dos isolados dois a dois (Tabela 2A) não
foi possível a formação de grupos, pois vários isolados seriam compatíveis com
isolados de diferentes grupos de compatibilidade micelial. Evolutivamente, este
comportamento é vantajoso, por permitir a troca de informações entre grupos de
compatibilidade diferentes. A incompatibilidade é um mecanismo de autodefesa
em fungos filamentosos, limitando a passagem de elementos infecciosos e ou
prevenindo a exploração por núcleos mal adaptados (Glass & Kaneco, 2003).
As estimativas de similaridade genética para a compatibilidade micelial
entre os pares de isolados variaram de 0,02 a 0,73, com média de 0,23. Ishikawa
(2006), a partir de dados de grupos de anastomoses em Colletotrichum
lindemuthianum, encontrou estimativas de similaridade entre 0,28 e 0,85 e Silva
(2007), também a partir de dados de grupos de anastomoses em Phaeoisariopsi
griseola, encontrou estimativas de diversidade entre 0,15 e 0,85. Como no
presente estudo, esses trabalhos demonstraram grande variação nas estimativas
de similaridades genética para a compatibilidade micelial. Entretanto, as
estimativas para A. solani encontradas foram baixas; a maioria, 78%, encontra-
se entre 0,12 a 0,33 e somente 5% das similaridades foram superiores a 0,4,
indicando diferentes padrões de comportamento dos isolados quanto às reações
de compatibilidade micelial
Para melhor visualização da análise das estimativas de similaridade
genética entre os isolados, foi construído um dendrograma que está apresentado
na Figura 4. A linha de corte representa o valor máximo de similaridade (sgm), à
direita da qual os isolados apresentaram o mesmo comportamento. O sgm, a 1%
de probabilidade, foi de 0,45.
71
FIGURA 4 Dendrograma dos isolados de A. solani agrupados de acordo com o
comportamento de compatibilidade micelial com os demais
isolados (UPGMA) A linha de corte representa o valor máximo de
similaridade (sgm), à direita da qual os isolados apresentaram o
mesmo comportamento. O sgm, a 1% de probabilidade, foi de 0,45.
72
Pela análise do dendrograma, verifica-se a formação de 36 grupos, dos
quais apenas três foram formados por isolados que apresentam o mesmo
comportamento quanto à compatibilidade micelial (GCM). Desses, dois grupos
foram formados por dois isolados (grupo 1: C154 e C-255, grupo 2: UFLA54 e
C-114) e um grupo foi formado por cinco isolados (grupo 3: UFLA57, UFLA58,
UFLA59, UFLA60, UFLA61 e UFLA 62).
Walls et al. (2004), ao analisarem os grupos de compatibilidade micelial
de 53 isolados de A. solani, observaram a formação de 6 grupos contendo vários
isolados e 13 isolados não formaram grupos. Já Silva (2007), avaliando grupos
de anastomoses em P. griseola, verificou que apenas cinco isolados formaram
um único grupo; os remanescentes ficaram agrupados isoladamente. A formação
de poucos grupos também foi observada por Ishikawa (2006), com grupos de
anastomoses em isolados de C. lindemuthianum, em que, dos 11 grupos
formados, apenas um continha três isolados. Estas observações estão de acordo
com o que foi comentado por Rodrigues-Guerra (2003) de que, em populações
naturais, vários grupos de anastomoses podem ser identificados, uma vez que o
confronto entre isolados de uma mesma população ou de populações distintas
resulta, freqüentemente, em interações de incompatibilidade (Saupe, 2000).
Pode-se observar uma tendência a agrupamento de acordo com o local
de coleta. O grupo 1 é formado pelos isolados, C-154 e C-255, coletados de
batata provenientes de Cuba, assim como todos os isolados do grupo 3 foram
coletados de batata, sendo quatro isolados, UFLA57, UFLA58, UFLA59,
UFLA60, provenientes de São João da Mata, MG e dois, UFLA61 e UFLA62,
do Espírito Santo. Já o grupo 2 é formado por isolados de hospedeiros e locais
de coleta diferentes, o isolado UFLA54 foi coletado de tomate em Lavras, MG e
o isolado C-114 foi coletado de batata em Cuba. Esta disposição dos grupos de
compatibilidade de acordo com a origem geográfica não foi observada por
Waals et al. (2004).
73
Todos os isolados coletados em São João da Mata, MG mostraram-se
similares quando avaliados por meio da compatibilidade micelial, indicando
baixa variabilidade genética entre estes isolados e sugerindo o isolamento desta
população em relação às demais.
5.3 Considerações finais
Comparando-se os grupos formados pelos marcadores ISSR com os
formados pelas reações de compatibilidade micelial (GCM), observa-se que,
pelos dados de GCM, o número de grupos formados foi inferior ao que se
formou pelos dados de marcadores ISSR. Estas observações corroboram com as
apresentadas por Waals et al. (2004), que não observaram correlação entre os
grupos de compatibilidade vegetativa (GCV) e os padrões moleculares.
A correlação entre as matrizes de similaridades de GCM e marcadores
ISSR foi muito baixa (0,3),.o que é esperado, uma vez que a diversidade
genética medida por marcadores moleculares baseia-se na análise aleatória de
todo o genoma do fungo e os locos responsáveis pela reação de compatibilidade
são em menor quantidade e podem estar em diferentes regiões do genoma.
A reação de compatibilidade é controlada por diferentes locos que
podem ter diferentes alelos (Glass et al., 2000; Leslie & Zeller, 1996). Contudo,
apesar de ser relativamente elevada, a divergência genética encontrada usando
tanto marcadores moleculares quanto GCM, de acordo com os diversos
trabalhos realizados com o gênero Alternaria, não é atípica para espécies de
reprodução assexual (Petrunak & Christ, 1992; Weir et al., 1998; Morris et al.,
2000, Martínez et al., 2004; Waals et al., 2004). Este fato sugere que as
variações encontradas podem ser devido a mutações e, possivelmente, à
recombinação parassexual.
Entretanto, os isolados UFLA18, UFLA19, UFLA20 UFLA23,
74
UFLA24, UFLA21 e UFLA22, coletados em Paraguaçu, MG, apresentaram o
mesmo padrão de agrupamentos, tanto para dados de GCM quanto para os dados
de marcadores ISSR, sugerindo o isolamento geográfico desta população em
relação às demais.
Os isolados de Ijaci, MG, foram coletados tomando-se os dados de
planta, folha e lesão de cada esporo. Foi realizada a análise de similaridades
genéticas desses isolados. As similaridades variaram de 0,54 a 0,82, com média
de 0,68. Os isolados mais divergentes geneticamente foram UFLA3 e UFLA4,
que foram coletados de plantas diferentes. Quanto aos isolados coletados numa
mesma lesão, como o UFLA1 e UFLA4, estes apresentaram similaridade de
0,76. Os isolados coletados na planta 1, UFLA1, UFLA4 e UFLA6,
apresentaram similaridades entre 0,75 e 0,76. Já os isolados coletados na planta
2, UFLA2 e UFLA3, apresentaram similaridade de 0,80.
A variabilidade genética entre esporos de A. alternata por lesão foi
avaliada por Morris et al. (2000). Todos os isolados de uma mesma lesão
puderam ser claramente distinguidos dos isolados das outras lesões. Entretanto, a
co-infecção de uma mesma lesão por isolados de A. alternata diferentes, em
folhas de pêra japonesa, foi encontrada por Adachi & Tsuge (1994). No presente
trabalho, os isolados de uma mesma lesão, UFLA1 e UFLA4, ficaram em grupos
separados, indicando haver divergência entre os isolados de uma mesma lesão.
Entretanto, pelos resultados observados, para o monitoramento das populações
do patógeno, o mais interessante é retirar amostras o mais distante possível e em
diferentes campos de produção.
As análises de GCM e marcadores ISSR mostraram ampla variabilidade
em Alternaria solani no Brasil e, de acordo com McDonald & Linde (2002),
populações de patógeno com alta diversidade genética tornam-se um grande
risco na quebra de resistência do hospedeiro. Estes autores sugerem que, nestes
casos, os esforços no melhoramento deveriam se concentrar na resistência
75
quantitativa que poderia ser combinada com outras formas de controle. Pelos
resultados obtidos neste trabalho, na seleção de clones resistentes deve ser
utilizado o maior número possível de isolados, procurando representar, o mais
possível, a ampla variabilidade detectada, sendo estes isolados coletados do
maior número possível de campos de produção.
O entendimento da diversidade genética em A. solani em batata no
Brasil auxiliará sobremaneira nas estratégias de manejo da pinta-preta. A
quantidade e a distribuição da variação entre e dentro das populações indicam a
adaptabilidade do patógeno em vencer os estresses naturais ou artificiais a que
população está submetida e, portanto, a neutralizar as medidas de controle da
doença (McDonald & Linde, 2002; McDonald et al. 1989). Esse resultado torna
explícita a necessidade de que novos estudos sejam realizados para a melhor
compreensão da dinâmica populacional deste patógeno no Brasil.
76
6 CONCLUSÕES
No presente trabalho comprovou-se a ampla variabilidade genética entre
os isolados de A. solani, tanto pelo emprego de grupos de compatibilidade
micelial quanto por marcadores ISSR.
Houve a formação de um número maior de grupos a partir dos dados de
compatibilidade micelial do que os gerados pelos marcadores ISSR.
O maior grupo de similaridade quanto a compatibilidade micelial foi
formados pelos isolados coletados em São João da Mata, MG.
Tanto os grupos formados pelas análises de compatibilidade micelial
quando pelos marcadores ISSR apresentaram uma tendência a agruparem-se por
local de coleta.
77
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81
ANEXOS
ANEXO A
Página
TABELA 1A
Médias dos isolados quanto à esporulação, os
diâmetros das colônias em cada dia de medição e
o índice de velocidade de crescimento micelial
calculado.................................................................
82
TABELA 2A
Matriz de 1 e 0 obtida pelas reações de
compatibilidade micelial do confronto dos
isolados de A. solani, dois a dois............................ 84
TABELA 3A
Matriz de 1 e 0 obtida pelos padrões de bandas
dos primer ISSR dos 60 isolados de A. solani........
90
82
TABELA 1A Médias dos isolados quanto à esporulação, aos diâmetros das
colônias em cada dia de medição e ao índice de velocidade de
crescimento micelial calculado.
diâmetro da colônia
isolados
3dias 6dias 9dias 12dias 15dias
UFLA 01 2,60 b 3,85 c 6,35 d 8,40 b 9,15 B
UFLA 02 1,85 d 3,30 e 4,35 i 6,55 g 8,80 C
UFLA 03 1,80 d 2,65 g 5,90 e 6,95 f 9,05 B
UFLA 04 3,00 a 5,05 a 6,90 c 8,60 b 8,85 c
UFLA 05 3,15 a 4,60 b 5,95 e 7,45 e 9,70 a
UFLA 06 3,10 a 4,05 c 6,80 c 7,80 d 8,35 c
UFLA 07 2,85 a 3,45 e 5,90 e 8,15 c 9,05 b
UFLA 12 1,55 d 2,10 h 4,35 i 7,80 d 8,85 c
UFLA 13 1,80 d 2,75 g 4,15 i 7,25 e 8,70 c
UFLA 14 1,55 d 2,80 g 3,30 k 4,35 j 6,45 e
UFLA 18 2,25 c 3,55 d 6,00 e 7,45 e 9,15 b
UFLA 19 1,75 d 3,10 f 5,75 e 7,30 e 9,15 b
UFLA 20 1,40 e 2,85 g 4,95 g 6,45 g 9,20 b
UFLA 21 3,15 a 4,95 a 7,70 a 9,00 a 9,55 a
UFLA 22 2,55 b 4,85 a 6,40 d 7,80 d 9,45 a
UFLA 23 3,05 a 4,10 c 5,85 e 8,05 c 8,80 c
UFLA 24 2,50 b 3,15 f 5,45 f 6,45 g 9,40 a
UFLA 25 3,05 a 3,60 d 5,70 e 6,75 f 9,65 a
UFLA 26 2,20 c 4,35 b 5,70 e 7,95 c 9,05 b
UFLA 27 3,05 a 4,40 b 7,05 b 8,80 a 9,65 a
UFLA 28 2,80 a 3,65 d 6,35 d 7,15 e 8,80 c
UFLA 29 2,55 b 3,65 d 6,55 d 8,00 c 8,85 c
UFLA 30 1,85 d 2,50 g 3,60 j 6,55 g 9,55 a
UFLA 31 1,55 d 2,20 h 3,30 k 6,85 f 8,85 c
UFLA 32 2,50 b 3,35 e 5,35 f 6,40 g 9,65 a
UFLA 33 1,15 e 3,10 f 6,45 d 7,95 c 9,10 b
UFLA 34 1,05 e 2,45 g 5,50 f 8,00 c 9,55 a
UFLA 51 2,35 c 4,25 b 5,30 f 6,40 g 8,55 c
UFLA 52 1,25 e 2,10 h 3,75 j 6,05 h 7,10 d
UFLA 53 1,00 e 2,55 g 4,55 h 7,00 f 9,05 b
“...continua...”
83
“TABELA 1A, Cont.”
diâmetro da colônia
isolados
3dias 6dias 9dias 12dias 15dias
UFLA 54 2,15 c 3,80 c 4,60 h 5,65 i 8,95 b
UFLA 55 2,55 b 3,80 c 4,75 g 6,70 f 9,05 b
UFLA 56 2,00 d 2,65 g 4,95 g 8,05 c 8,90 c
UFLA 57 1,55 d 2,80 g 5,85 e 6,45 g 8,85 c
UFLA 58 1,80 d 3,85 c 6,20 e 7,45 e 9,05 b
UFLA 59 1,65 d 3,15 f 5,70 e 7,60 d 9,15 b
UFLA 60 2,25 c 2,95 f 5,45 f 6,40 g 9,10 b
UFLA 61 2,20 c 3,45 e 5,85 e 6,60 g 8,75 c
UFLA 62 2,35 c 4,80 a 5,90 e 7,25 e 9,05 b
*médias na mesma coluna com a mesma letra não diferem estatisticamente, pelo
teste de Scott & Knott, a 5%.
84
TABELA 2A Matriz de 1 e 0, obtida pelas reações de compatibilidade
micelial do confronto dos isolados de A. solani dois a dois.
Isolados 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1
1
12 13 14 15 16 17 18 19
2
0
1
1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1
2
0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1
3
0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1
4
1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0
5
1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1
6
1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0
7
1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
8
1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1
9
1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1
10
0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1
11
0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1
12
0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1
13
1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1
14
1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1
15
0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1
16
1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0
17
0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1
18
1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0
19
0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
20
1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1
21
0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1
22
1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0
23
1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0
24
0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
25
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
26
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
27
0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
28
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
29
0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
30
0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0
“...continua...”
85
“TABELA 2A, Cont.”
Isolados 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
31
1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0
32
0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0
33
1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0
34
1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0
35
0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0
36
0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0
37
1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 1
38
1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1
39
1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1
40
1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1
41
1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1
42
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1
43
0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0
44
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
45
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
46
0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0
47
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
48
0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0
49
0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0
50
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
51
0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0
52
1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1
53
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1
54
0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0
55
1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
56
1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 0
57
0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0
58
0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0
59
0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
60
0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1
“...continua...”
86
“TABELA 2A, Cont.”
Isolado 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
1
0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1
2
0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1
3
1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1
4
0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
5
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
6
1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1
7
1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1
8
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0
9
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1
10
1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0
11
1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1
12
1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0
13
1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1
14
1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1
15
1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
16
0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0
17
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1
18
1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1
19
0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0
20
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
21
1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1
22
1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0
23
1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1
24
0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1
25
0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1
26
0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
27
0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1
28
0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1
29
0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0
30
1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0
“...continua...”
87
“TABELA 2A, Cont.”
Isolado 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
31
1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1
32
1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1
33
0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1
34
1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1
35
1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1
36
0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1
37
0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0
38
1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1
39
0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1
40
1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
41
0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1
42
0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1
43
1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0
44
1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1
45
1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1
46
1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0
47
0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0
48
1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1
49
0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1
50
1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1
51
0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1
52
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1
53
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0
54
0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1
55
0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1
56
1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0
57
0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1
58
0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1
59
0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0
60
1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0
“...continua...”
88
“TABELA 2A, Cont.”
Isol. 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
1
1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0
2
1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1
3
1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1
4
1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0
5
1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
6
1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0
7
1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1
8
0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1
9
1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1
10
0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1
11
1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1
12
0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0
13
1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1
14
1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1
15
1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0
16
1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0
17
1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1
18
1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1
19
0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0
20
1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1
21
0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1
22
0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0
23
0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0
24
0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0
25
1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0
26
1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1
27
1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1
28
1 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0
29
0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0
30
1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0
“...continua...”
89
“TABELA 2A, Cont.”
Isol. 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
31
0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0
32
0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0
33
1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1
34
1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0
35
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1
36
0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0
37
0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0
38
1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0
39
1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0
40
1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0
41
0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0
42
1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0
43
0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0
44
1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0
45
1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0
46
1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0
47
0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0
48
1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0
49
1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 0
50
1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1
51
1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0
52
1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1
53
0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0
54
1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0
55
1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0
56
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57
1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1
58
1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 1
59
0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0
60
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1
90
TABELA 3A. Matriz de 1 e 0 obtida pelos padrões de bandas dos primer ISSR, dos 60 isolados de A. solani.
prime
r
1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
CA 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1
1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1
1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
CA 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1
0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0
1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1
1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1
1 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0
CA 3 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1
0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0
1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1
CA 4 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1
1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1
1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1
CA 5 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0
0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0
0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0
0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0
“...continua...”
91
“TABELA 3A, Cont.”
p
32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62
CA 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1
CA 2 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1
1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
CA 3 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1
CA 4 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
CA 5 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0
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1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1
1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1
1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0
“...continua...”
92
“TABELA 3A, Cont.”
p
1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
CA6 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0
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1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0
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“...continua...”
93
“TABELA 3A, Cont.”
p
32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62
CA6 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1
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CA 8 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1
1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0
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1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1
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1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0
CA 9 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1
1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
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1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0
“...continua...”
94
“TABELA 3A, Cont.”
P
1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
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1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1
1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1
1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0
0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1
1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1
CAC 5 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0
0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1
0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1
1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1
1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1
1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1
1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1
CAC 6 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0
0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 1
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1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1
“...continua...”
95
“TABELA 3A, Cont.”
P
32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62
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1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1
CAC 4 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0
1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0
1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0
CAC 5 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0
1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
CAC 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1
0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1
1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1
1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1
“...continua...”
96
“TABELA 3A, Cont.”
P
1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
CAC6 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1
CAC 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1
0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0
0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1
1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1
1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1
CAC 10 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1
0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1
CAC 11 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1
1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0
CAC 12 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1
1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1
0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CAC 13 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0
0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0
“...continua...”
97
“TABELA 3A, Cont.”
P
32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62
1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1
1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1
CAC 7 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1
0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
CAC 10 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
CAC 11 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0
0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1
CAC 12 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0
1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
CAC 13 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
98
98
ANEXO B Página
FIGURA 1B
Padrão de bandas ISSR com o primer CAC6. Nas 20
colunas estão os isolados de 1 a 20 e, nas linhas, os
produtos de amplificação desses isolados de Alternaria
solani................................................................................ 99
99
FIGURA 1B Padrão de bandas ISSR com o primer CAC6. Nas 20 colunas estão os isolados de 1 a 20 e, nas linhas, os
produtos de amplificação desses isolados de Alternaria solani.
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