( PDF ) A fosfoglucomutase de Trypanossoma cruzi: estudos moleculares e localização subcelular

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LUCIANA LOUREIRO PENHA

A fosfoglucomutase de Trypanosoma cruzi: estudos

moleculares e localização subcelular

Tese submetida ao Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do

Rio de Janeiro, visando à obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica)

2008

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS

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Penha, Luciana Loureiro

A fosfoglucomutase de Trypanosoma cruzi: Estudos moleculares e

localização subcelular. / Luciana Loureiro, Penha.

--Rio de Janeiro: UFRJ / IBCCF, 2008.

xii, 139 f.: il.; 31 cm.

Orientadores: Lúcia Mendonça Previato e Ana Paula Cabral de Araújo Lima

Tese (Doutorado) – UFRJ, IBCCF, Pós-graduação em Ciências Biológicas

(Biofísica), 2008.

Referências bibliográficas: f.

1. Trypanosoma cruzi 2. Fosfoglucomutase. 3.Localização. 4.Glicossomos. 5.

Parasitologia-Tese.

I. Mendonça-Previato, L.; Lima, A.P.C.A.

II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica

Carlos Chagas Filho.

III. Título.

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iii

O presente trabalho foi realizado nos Laboratórios de Glicobiologia e Bioquímica e

Biologia Molecular de Proteases sob a orientação das Profs. Lucia Mendonça Previato e Ana

Paula Cabral de Araújo Lima, com o apoio das seguintes entidades:

- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

- Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de

Janeiro (FAPERJ)

- Fundação Universitária José Bonifácio (FUJB / UFRJ).

- Programa Núcleos de Excelência (PRONEX /MCT).

Dedico essa Tese de Doutorado à minha

família, principalmente, à minha filha Bruna, amor da

minha vida. A minha querida mãe, que sem o apoio

dela não teria conseguido realizar essa tese. A meu

pai, pelo grande incentivo para que eu realizasse o

Doutorado. Aos meus irmãos Carla e Leonardo, pelo

carinho e amizade. E as minhas queridas

orientadoras, pois o que sou hoje profissionalmente e

tudo que eu fiz só foram possíveis por ter o apoio

delas. Muito obrigado, sempre, por vocês existirem

na minha vida!

Luciana Loureiro Penha Agradecimentos

♥Gostaria de agradecer às minhas orientadoras Prof. Lucia Mendonça Previato e Prof.

Ana Paula Cabral de Araújo Lima, pessoas tão especiais e importantes na minha vida. A

única coisa que posso dizer é que se eu pedisse a Deus que me desse a melhor pessoa para me

orientar, para me ensinar a ciência, a ser pesquisadora, a ser profissional, a ter amor à

carreira, a ser dedicada ao trabalho... Ele me daria vocês duas! Mais uma vez, meus sinceros

agradecimentos!

♥Ao Prof. José Osvaldo Previato, pelo carinho, atenção, por todos os ensinamentos

fundamentais para meu aprendizado, e pelo início do projeto, há seis anos quando tudo

começou!

♥Ao Prof. Norton Heise e Prof. Adriane Regina Todeschini, pessoas tão queridas e

especiais para mim! Obrigado pelos ensinamentos e por estarem sempre dispostos a me

ajudar.

♥Às colegas do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular de Proteases, por

não serem somente companheiras de trabalho, mas por terem se tornado verdadeiras amigas:

Flavinha, Giancarla, Mayra, Marília, Tati, Camilinha, Tati2, Angelita, Edna, e Iracema.

Obrigado pelo apoio e amizade sempre, por todos os momentos de diversão, que graças a

Deus, foi assim a cada dia durante esses últimos quatro anos. Jamais vou esquecer nenhuma

de vocês!

♥Aos colegas do Labotatório de Glicobiologia: Juju, Victor, Leo, Orlando, Fred,

Lectícia, Sebastião, Ana Acácia, Carol, Romero, Suelen, Daniel, Daniel Gibalde, Gilberto

(meu querido estagiário) e Lana; pelo companheirismo, carinho e amizade sempre. Obrigado

por serem sempre tão prestativos e estarem serem prontos para me fazer sorrir! Vocês são

especiais!

♥ Prof. Narcisa Cunha-e-Silva, do Laboratório de Ultraestrutura Celular Hertha

Meyer, pela colaboração que foi fundamental para o desenvolvimento de minha tese. A suas

alunas, sempre tão prestativas, Daniela, Mirian e Sarah. Muito obrigado!

Luciana Loureiro Penha Agradecimentos

♥Em particular, ao meu amigo Celso Sant´anna, do Laboratório de Ultraestrutura

Celular Hertha Meyer, por toda a paciência e ensinamentos de microscopia que me ajudaram

em cada etapa da realização dessa tese. Por ser sempre tão educado e prestativo, me

acalmando e ajudando nas horas mais difíceis.

♥ Ao Prof. Julio Scharfstein e às companheiras do Laboratóro de Imunologia

Molecular, Vê (querida amiga), Alê, Dani, Ana Carolina, Leila, Daniela, Ilka, Juliana, que

sempre me recebem com muito carinho e sempre dispostos a me ajudar.

♥Ao Prof. Amílcar do laboratório de Virologia Molecular e seus alunos, em especial,

a Celina, Mônica e Flávia. Obrigado por serem sempre tão atenciosas comigo.

♥À minha querida amiga Mariane. Obrigada por estar sempre pronta a me ajudar,

mesmo à distância, com tanto carinho e dedicação.

♥ À minha querida família e amigas (Rê e minha afilhadinha Luiza, ainda na barriga,

Rezinha, Leila, Patrícia e Kelly) por estarem sempre ao meu lado, apoiando-me e

incentivando-me em todas as etapas da minha vida. E em especial, a minha querida filha

Bruna, a razão de tudo isso aqui, que mais tarde vai entender o porquê da ausência da mamãe

em alguns momentos. Dedico esta tese a todos vocês!

Luciana Loureiro Penha Índice

vii

Resumo ________________________________________________________ x

Abstract ________________________________________________________ xi

Lista de Abreviaturas ____________________________________________ xii

Introdução _____________________________________________________ 1

1- O Trypanosoma cruzi ________________________________________ 1

2- O ciclo de vida do Trypanosoma cruzi ___________________________ 2

3- A doença de Chagas _________________________________________ 5

4- Cepas do T. cruzi ___________________________________________ 10

5- Glicoconjugados da superfície do T. cruzi ______________________ 12

6- Importância dos glicoconjugados para o parasito ________________ 15

7- A enzima fosfoglucomutase (PGM) ____________________________ 18

7.1- PGM em bactérias _________________________________________ 22

7.2- PGM em leveduras ________________________________________ 23

7.3- PGM em humanos _________________________________________ 26

7.4- PGM em T. cruzi _________________________________________ 28

8- Peroxissomos ______________________________________________ 30

9- Endereçamento de proteínas para peroxissomos ________________ 32

10- Glicossomos _____________________________________________ 35

11- Endereçamento de proteínas para glicossomos

Objetivos ______________________________________________________ 44

Metodologia ___________________________________________________ 45

1-Cultivo dos parasitos ________________________________________ 45

2-Extração de DNA genômico de epimastigotas ___________________ 45

3-Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) ________________________ 46

4-Eletroforese em gel de agarose ________________________________ 47

Luciana Loureiro Penha Índice

viii

5-Seqüenciamento e análise de seqüências nucleotídicas ____________ 47

6- Clonagem ________________________________________________ 48

7- Indução de competência de bactérias __________________________ 48

8-Transformação de E.coli _____________________________________ 49

9-Clonagem em vetores de expressão ____________________________ 49

10-Eletroforese em gel de poliacrilamida _________________________ 51

11- Expressão e purificação da PGM recombinante ________________ 52

12- Produção de anticorpos policlonais __________________________ 53

13- Purificação dos soros contendo anticorpos anti-PGM ___________ 54

14- Análise por Western Blot __________________________________ 55

15- Reutilização de membranas de nitrocelulose em Western Blot ____ 56

16- Fracionamento sub-celular dos epimastigotas _________________ 56

17- Separação de fase com Triton X-114 _________________________ 57

18- Transfecção em epimastigota de T. cruzi ______________________ 58

19- Imunofluorescência ______________ ________________________ __ 58

20- Microscopia eletrônica de transmissão _______________________ 59

21- Crio-ultramicrotomia _____________________________________ 60

Resultados _______________________________________ ______________ 61

1- Gene pgm nas diferentes cepas de T. cruzi

______________________ 61

2- Múltiplo-alinhamento da seqüência de aminoácidos predita ______ 62

3- Expressão da PGM recombinante em bactéria BL21(λD3). ________ 64

4- Purificação da PGM recombinante e produção de anticorpo ______ 65

5- Expressão da PGM nas diferentes cepas do T. cruzi _____________ 67

6- Expressão da PGM nas diferentes formas do T. cruzi ____________ 68

7- Localização sub-celular da Tc-PGM __________________________ 70

8- Expressão e localização da PGM em promastigota de L. major _____ 78

Luciana Loureiro Penha Índice

9- Endereçamento da PGM para o glicossomo em T. cruzi __________ 79

Discussão _____________________________________________________ 93

Conclusões ___________________________________________________ 105

Anexo I ______________________________________________________ 106

Anexo II _____________________________________________________ 108

Anexo III ____________________________________________________ 110

Anexo IV _____________________________________________________ 112

Referências Bibliográficas _______________________________________ 114

Luciana Loureiro Penha Resumo

A superfície do Trypanosoma cruzi é coberta por sialoglicoproteínas (Tc-mucinas)

altamente O-glicosiladas que parecem ter um papel importante na adesão e na invasão de

células do hospedeiro mamífero por tripomastigotas. Há evidências de que a diminuição da

sialilação da superfície do parasito e, conseqüentemente, a exposição de unidades de

galactose nas cadeias O-glicanas das Tc-mucinas seja crítica para a virulência do parasito.

Como a fosfoglucomutase (PGM) é uma enzima essencial para a obtenção de glucose-1-

fosfato, monossacarídeo fosforilado necessário para a formação de UDP-galactopiranose,

substrato doador de galactose e, sendo o T. cruzi incapaz de metabolizar a galactose pela via

de Leloir, a PGM deste parasito é indispensável para a formação de UDP-galactose. Em

estudos prévios, clonamos o gene que codifica a PGM do T. cruzi e demonstramos que este

codifica uma enzima funcional através de ensaios de complementação de mutantes de

Saccharomyces cerevisiase deficientes em pgm1 e pgm2. Nessa tese, demonstramos que a

TcPGM se encontra no interior de organelas especializadas denominadas glicossomos em

todos os estágios de desenvolvimento do parasito. Estes resultados sugerem que em T. cruzi,

o metabolismo de glucose-6-P e glucose-1-P difere de outros eucariotos cuja PGM está

localizada no citoplasma. Enzimas glicossomais são sintetizadas no citoplasma e transferidas

para o interior da organela, provavelmente, por mecanismos semelhantes aos descritos para o

encaminhamento de proteínas aos peroxissomos em outros eucariotos. Enzimas glicossomais

geralmente ligam-se a proteínas transportadoras denominadas peroxinas (PEX) através de

dois motivos clássicos de endereçamento, denominados PTS-1 e PTS-2, ou mais raramente

ao motivo I-PTS. Apesar da TcPGM estar localizada em glicossomos em T. cruzi, esta

proteína não apresenta motivos PTS1 ou PT2, sugerindo que domínios alternativos possam

mediar o transporte da TcPGM para glicossomas. Produzimos linhagens de T. cruzi

geneticamente modificadas que expressam diferentes domínios da TcPGM fusionados à

proteína fluorescente verde (GFP). A análise da localização sub-celular da proteína de fusão

dos epimastigotas transfectados por microscopia de fluorescência permitiu o mapeamento de

uma região da TcPGM capaz de encaminhar a GFP para glicossomas. Propomos que a região

localizada entre os resíduos de aminoácidos 260-380 da TcPGM seja responsável pelo

endereçamento da TcPGM aos glicossomos, sugerindo que esse domínio contém um provável

I-PTS .

Luciana Loureiro Penha Abstract

The surface of Trypanosoma cruzi is covered with a large number of highly O-

glycosilated sialoglycoproteins (Tc-mucins) that are important for the adhesion and invasion

of mammalian host cells by trypomastigotes. There is evidence that the reduction of the

sialylation at the parasite surface and, consequently, the exposure of galactose units of the O-

glycan chains of Tc-mucins is critical for parasite virulence. In T. cruzi, the enzyme

phosphoglucomutase (PGM) is essential for the formation of glucose 1-phosphate, which is

the phosphorylated monossacaryde necessary for the synthesis of UDP-galactopyranose, the

donnor substrate of galactose. Since the parasite is unable to metabolize galactose through the

Leloir pathway, the PGM of T. cruzi is required for the formation of UDP-glacatose. In

previous studies, we have cloned the gene that encodes T. cruzi PGM and demonstrated that

it encodes a functional enzyme through functional complementation assays of Saccharomyces

cerevisiae  pgm1/ pgm2. In this thesis, we showed that TcPGM is located inside

specialized organelles called glycosomes in all life stages of the parasite. These findings

suggest that the metabolism of glucose-6-P and glucose-1-P in T. cruzi differs from other

eukaryotes, where PGM is located in the cytoplasm. Glycosomal enzymes are synthetized

free in the cytoplasm and then transferred to the interior of the organelle by mechanisms

similar to those described for the delivery of proteins to peroxisomes in other eukaryotes.

Glycosomal enzymes generally bind to carrier proteins called peroxins (PEX) through two

classic targeting motifs, called PTS-1 and PTS-2, or more rarely, to the I-PTS motif.

Although TcPGM is located in glycosomes in T. cruzi, there are no PTS1 or PTS2 motifs in

TcPGM, suggesting that an alternative domain might mediate its transport to glycosomes. We

created genetically modified T. cruzi cell lines expressing different domains of TcPGM fused

to the green fluorescent protein (GFP). The analysis of the sub-cellular localization of the

fusion proteins in transfected epimastigotes by fluorescence microscopy allowed mapping of

a region of TcPGM capable of targeting GFP to glycosomes. We propose that the region

comprised between amino acid residues 260-380 of TcPGM is responsible for the targeting of

the enzyme to glycosomes, suggesting that this domain contains a probable I-PTS.

Luciana Loureiro Penha Lista de Abreviaturas

xii

BSA- albumina bovina sérica

BCIP- 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato

CHO- células de ovário de hamster chinês

DMSO- dimetilsulfóxido

DNA – ácido desoxirribonucléico

DNTP – deoxirribonucleotídeos trifosfatos

DTT-ditiotreitol

E-64- L-trans-epoxisuccinil-leucinamido (4-guanidino) butano

EDTA- ácido etilenodiaminotetraacético

Gal- galactose

Glc- glucose

GPI- glicosilfosfatidilinositol

HeLa- células de adenocarcinoma cervical humano, linhagem HeLa

HEPES- ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanosulfônico

IPTG- isopropil--D-tiogalactopiranosídeo

LAMP- proteína de membrana associada a lisossomos

LB- caldo de Luria (Luria broth)

LIT- infusão de fígado e triptose

NADP- nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

MOPS- ácido 3-(N-morfolino) propanosulfônico

NBT- nitroblue tetrazolium

NP-40- nonidet P-40

OD- densidade óptica

P- fosfato

pb- pares de base

PBS- solução de NaCl (0,15 M) tamponada com fosfato (0,01 M)

PCR- reação em cadeia da polimerase

PGM – fosfoglucomutase

PMSF- fluoreto fenilmetilsulfonil

PTS- sinal de encaminhamento para peroxissomo

p/v- peso/volume

rpm- rotações por minuto

SDS- dodecilsulfato de sódio

Luciana Loureiro Penha Lista de Abreviaturas

xiii

SDS-PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio

SFB- soro fetal bovino

TBST- solução de NaCl (0,19 M) tamponada com Tris (10 mM) contendo 0,1%

Tween 20

TE- tampão Tris-EDTA

TAE – tris-acetato EDTA

Tris- tris (hidroximetil) aminometano

UDP- uridina-difosfato

UMP- uridina-monofosfato

UV- luz ultravioleta

VSG- glicoproteína de superfície variante

v/v- volume/volume

Luciana Loureiro Penha Introdução

1- O Trypanosoma cruzi

O Trypanosoma cruzi, parasito protozoário flagelado, é o agente causador da doença

de Chagas, assim denominada em homenagem ao cientista brasileiro Carlos Chagas que a

descobriu em 1909 (Chagas, 1909). A doença, transmitida por insetos triatomíneos, existe no

continente americano desde o México ao sul da Argentina, afetando 16 – 18 milhões de

pessoas, com aproximadamente 100 milhões vivendo em regiões que as submetem ao risco

de adquirir a doença (Coura et al., 2002). Em virtude das correntes migratórias cada vez mais

freqüentes da América Ibérica para os Estados Unidos e o Canadá, existe a preocupação de

que possa haver a introdução de números significativos de doadores soropositivos para

doença contribuindo para o estoque de sangue contaminado durante a transfusão sanguínea

(Tarleton et al.,2007).

Há dois estágios da doença humana: (1) a fase aguda, que aparece logo após a

infecção e é responsável pela morte de aproximadamente 10% dos casos por insuficiência

cardíaca ou meningoencefalite, principalmente em crianças; (2) a fase crônica na qual estão

afetados órgãos internos principalmente o coração, o esôfago, o cólon e o sistema nervoso

periférico. A fase crônica desenvolve-se após um período assintomático de vários anos, 27%

das pessoas infectadas desenvolvem sintomas cardíacos que podem levar à morte súbita, 6%

desenvolvem alguma patologia intestinal, principalmente megaesôfago e megacólon e 3%

têm lesões no sistema nervoso periférico (Brener e Gazzinelli, 1997; Cunha-Neto et al.,

1999).

Luciana Loureiro Penha Introdução

2- O ciclo de vida do Trypanosoma cruzi

O parasito tem um ciclo de vida complexo que se caracteriza por diferentes formas

presentes em hospedeiros vertebrados e invertebrados (Hoare, 1971; Coura et al., 2002)

(Figura 1). Diferentemente do que ocorre com o tripanossoma africano, o Trypanosoma cruzi

invade células nucleadas de mamíferos, evitando assim o ataque do sistema imune. Com

critérios morfológicos como a forma de fuso do parasito, a posição do cinetoplasto (DNA

mitocondrial) em relação ao núcleo e o ponto de emergência flagelar, o parasito apresenta-se

em três formas: (1) amastigotas (grego, a = desprovido; mastis = chicote, significando

flagelo), células redondas que se dividem com 2,4-6,5 µm de diâmetro encontradas no

citoplasma da célula do hospedeiro vertebrado; alguns autores preferem denominá-las

esferomastigotas uma vez que elas, de fato, têm um flagelo incipiente; (2) tripomastigotas

(trypo = perfurar, referindo-se à propriedade que essa célula tem de aderir ao vidro por um

ponto enquanto faz rápidos movimentos rotatórios como se fosse uma broca), infecciosas,

flageladas e incapazes de se dividir; essas formas estão presentes nos hospedeiros vertebrados

e invertebrados; são fusiformes com um comprimento de aproximadamente 18 µm (incluindo

um flagelo livre de 6 µm) e largura de 2-3 µm; (3) epimastigotas (epi = anterior, de cima),

formas extracelulares flageladas, de comprimento de 20-40 µm e largura 2-5 µm, não

infecciosas para o vertebrado; são formas de divisão tipicamente presentes no intestino do

hospedeiro invertebrado (Figura 2). As formas tripomastigotas metacíclicas aparecem no reto

do inseto como produtos de diferenciação das formas epimastigotas. Quando o inseto

infectado pica o hospedeiro mamífero e inicia o repasto sangüíneo ele elimina

concomitantemente fezes e urina contendo formas tripomastigotas que são mecanicamente

carregadas para a ferida por ação do hospedeiro. As formas tripomastigotas invadem células

podendo residir por aproximadamente 1 h dentro de fagolisossomos dos quais escapam para o

Luciana Loureiro Penha Introdução

citoplasma e se diferenciam para as formas amastigotas. Após aproximadamente 30 h, todas

as formas tripomastigotas tornam-se amastigotas que se replicam por divisão binária. As

formas amastigotas sofrem metamorfose para formas tripomastigotas após aproximadamente

96 h. Esta fase é mediada por uma forma epimastigota – que possui algumas propriedades da

forma espimastigota e é comparativamente mais curta (4 µm de comprimento). A existência

dessa forma no vertebrado foi assunto de debate desde 1914, mas finalmente ela foi

caracterizada por métodos morfométricos, bioquímicos e imunológicos como sendo bem

próxima da forma epimastigota obtida em meio axênico (Almeida-de-Faria et al., 1999) e são

dependentes de prolina para completar a diferenciação (Tonelli et al., 2004). Essas

observações deverão ser levadas em conta em pesquisas futuras: (1) quanto à interpretação de

dados nas infecções em vertebrados, uma vez que formas epimastigota possam, de alguma

forma, contribuir para a imunopatologia da doença; e (2) considerando que as formas

epimastigotas são encontradas consistentemente na glândula anal de gambás e que formas

amastigota – foram encontradas no trato intestinal do hospedeiro invertebrado (De Souza,

2002) parece provável que o parasito tem um ciclo contínuo de diferenciação seguindo o

padrão tripomastigota – amastigota – epimastigota – tripomastigota com uma ou mais formas

intermediárias. A predominância de uma forma particular seria dependente principalmente

das condições ambientais.

Luciana Loureiro Penha Introdução

Figura 1- Representação esquemática do ciclo de vida de T. cruzi. Ao picar um

indivíduo o inseto vetor infectado libera formas tripomastigotas nas fezes próximo ao local da

picada. Os tripomastigotas penetram a pele no local da picada ou através de membranas

mucosas intactas (1). Os tripomastigotas então invadem células hospedeiras, onde se

diferenciam em formas amastigotas (2). Os amastigotas se multiplicam por fissão binária no

citoplasma da célula hospedeira (3), diferenciam novamente em tripomastigotas e rompem a

célula infectada, sendo liberados na corrente sangüínea (4). Ao picar indivíduos infectados o

barbeiro ingere tripomastigotas sangüíneos (5), os quais se diferenciam em epimastigotas no

intestino médio (6) e multiplicam-se (7). No intestino porterior os parasitos diferenciam-se

em tripomastigotas metacíclicos (8). Esquema adaptado http://www.cdc.gov.

Luciana Loureiro Penha Introdução

Figura 2-Esquema geral da forma epimastigota do T.cruzi, monstrando as principais

estruturas sub-celulares (Docampo et al., 2005).

3- A doença de Chagas

A infecção pelo T. cruzi, inicialmente era restrita a pequenos mamíferos das matas e

campos da América, desde a Patagônia até o sul dos Estados Unidos. Esses animais (tatus,

gambás, roedores) convivem com "barbeiros" silvestres, e entre eles ainda hoje circula o

Trypanosoma cruzi (Tarleton et al., 2007). Com a chegada do homem e os processos de

colonização, aconteceram desequilíbrios ecológicos (desmatamentos, queimadas) e os

barbeiros invadiram as habitações rústicas e pobres dos lavradores e colonos. A infecção

chegou ao homem (doença de Chagas) e aos mamíferos domésticos. Hoje existem pelo

menos 15 milhões de pessoas infectadas pelo T.cruzi, sendo a maioria na América Latina

(Moncayo, 2006).

Luciana Loureiro Penha Introdução

Tabela 1- Mudanças nos parâmetros epidemiológicos e diminuição da incidência da

doença de Chagas dada à interrupção da transmissão em 1990, 2000 e 2006 (fonte

TDR/PAHO/WHO).

Parâmetros epidemiológicos 1990 2000 2006

Mortes anuais >45,000 21,000 12,500

Casos de infecção humana 30 milhões 18 milhões 15 milhões

Novos casos por ano 700,000 200,000 41,200

Populações em áreas de risco 100 milhões 40 milhões 28 milhões

Número de países 21 21 21

Graças ao programa de contenção da doença em países da América do Sul, a

transmissão do T.cruzi por vetores ou por transfusão de sangue vem sendo eliminada

com sucesso no Uruguai (desde 1997), Chile (desde 1999) e Brasil (desde 2005)

(Tabela 1). Assim, a incidência global de novos humanos infectados por T.cruzi

diminuiu 67% (Moncayo et al., 2006). Em 9 de junho de 2006, o Ministério da Saúde do

Brasil recebeu a Certificação Internacional de Eliminação da Transmissão da doença de

Chagas conferida pela Organização Pan-Americana da Saúde e concedida pela OPS/OMS.

Para tal, o Brasil teve milhões de casas expurgadas e inspecionadas, reduzindo as capturas de

Triatoma infestans infectados de mais de 80 mil no ano de 1979 para pouco mais de 40 em

2005. Apesar dos avanços alcançados nos controles vetoriais e transfusionais em países do

Cone Sul, a doença de Chagas ainda representa um sério desafio (1) pela sua peculiar

epidemiologia, caracterizada pela diversidade de situações de risco (grande número de

vetores e reservatórios potenciais, variadas formas de infecção e diferentes estoques do

parasito que circulam no ambiente domiciliar, peridomiciliar e silvestre); (2) por não dispor

Luciana Loureiro Penha Introdução

de medidas profiláticas e esquemas terapêuticos mais eficientes, menos tóxicos e de baixo

custo; e (3) pela falta de um entendimento mais completo da fisiopatolologia da evolução da

doença crônica. Assim esta doença continua sendo um sério problema de saúde pública entre

as endemias rurais, e por inutilizar muitas vidas em plena idade produtiva. E, embora tenha

sido classificada como potencial “candidata” à eliminação e/ou erradicação mundial, a

doença de Chagas ainda não pode ser prontamente eliminada com as formas atuais de

controle, havendo necessidade de se expandir e sustentar os esforços de controle

epidemiológico além de se desenvolver soluções mais definitivas, incluindo aquelas

relacionadas à quimioterapia (De Souza et al., 2006).

Outro ponto importante é a ocorrência da transmissão do T. cruzi por via oral através

do consumo de alimentos contaminados, provocando surtos de intoxicação alimentar, como

na Amazônia (Ianni e Mady, 2005; Yoshida, 2008). O grupo que analisou este assunto

recomendou a necessidade de se considerar à transmissão oral dentro do Programa Nacional

de Prevenção e Controle da Doença de Chagas, bem como do Programa Nacional de

Prevenção e Controle de Doenças Transmitidas por Alimentos e dos Setores Nacionais de

Inocuidade de Alimentos.

A doença é caracterizada por uma fase aguda inicial, apresentando sintomas como

febre, edema na face e nas extremidades inferiores e linfoadenopatia generalizada (Kirchhoff,

1993). Os pacientes infectados apresentam uma intensa parasitemia, observando-se diversos

tecidos parasitados, incluindo o coração e o sistema nervoso central. Porém, na maioria dos

casos a doença não é diagnosticada nessa fase devido à ausência de sintomas específicos, e à

falta de assistência médica adequada entre os doentes mais pobres (WHO, 2002).

A fase aguda dura entre 4 a 8 semanas e, em seguida, os pacientes entram na fase

indeterminada da doença onde observam-se anticorpos circulantes contra vários antígenos do

Luciana Loureiro Penha Introdução

T. cruzi e a diminuição da parasitemia em função da atividade do sistema imune do

hospedeiro. O período da fase indeterminada pode variar entre meses, anos ou décadas. Cerca

de 30% das pessoas infectadas saem dessa fase latente, podendo desenvolver a fase crônica

da doença. Os sinais clínicos da fase crônica são perturbações cardíacas (miocardite crônica),

digestivas (mega-síndrome de esôfago, cólon e intestino) e neurológicas decorrentes da

degeneração desses tecidos (Kirchhoff, 1993; WHO, 2002). O comprometimento cardíaco

está entre as mais sérias e freqüentes manifestações da doença de Chagas sendo uma

importante causa de morte súbita (Rossi et al., 2003).

Para o tratamento da doença, algumas drogas com eficácia variável vêm sendo

testadas, como é o caso do benzonidazol, do nifurtimox e do alopurinol (Filardi e Brener, 1987,

Neal e van Bueren, 1988, Molina et al., 2000). Os dois primeiros agentes mostraram-se efetivos

durante a fase aguda, levando à redução na duração e na severidade da doença (Kirchhoff,

1993). Nifurtimox e benzonidazol foram introduzidos na clínica nas décadas de 80, mas

atualmente não se encontram disponíveis comercialmente no Brasil. Nenhum destes

compostos é ideal por que: (1) não são ativos durante a fase crônica da doença e apresentam

sérios efeitos colaterais; (2) requerem administração por longos períodos de tempo sob

supervisão médica; (3) há grande variação na susceptibilidade de isolados do parasito a ação

destas drogas; (4) populações de parasitos resistentes a ambos compostos têm sido relatadas;

(5) apresentam alto custo; e (6) não há formulações pediátricas, apesar do fato de que

crianças até 12 anos possuírem maiores chances de se beneficiarem com o tratamento por não

apresentarem ainda a sintomatologia crônica da doença.

Drogas para o tratamento da doença de Chagas não são do interesse de indústrias

farmacêuticas, devido ao alto custo dos investimentos e a falta de um mercado potencial e

seguro nos países em desenvolvimento. Das 1393 novas drogas desenvolvidas entre 1975 e

1999, menos de 1,1% foram dirigidas para doenças tropicais e para a tuberculose. Dessa

Luciana Loureiro Penha Introdução

forma, a despeito da notável redução na incidência da transmissão, ainda somos desafiados

com dois problemas críticos: (1) o tratamento de pacientes na fase crônica; e (2) a ocorrência

de novos casos agudos em algumas regiões da América Latina. De um modo geral, o

desenvolvimento de uma quimioterapia antiparasitária ocorre (1) pelo estabelecimento de

princípios ativos de plantas utilizadas na medicina popular; (2) pela investigação de drogas já

aprovadas para o tratamento de outras doenças, uma vez que elas já foram submetidas a

ensaios clínicos muito dispendiosos, ou; (3) através da determinação de alvo(s) específico(s)

identificado(s) em vias metabólicas chave para o parasito (Castro e Soeiro, 2007).

A busca de métodos para o reparo de lesões causadas por doenças crônicas tem sido

impulsionada pela descoberta de células-tronco com capacidade de auto-replicação e de

diferenciação em diversos tipos celulares. Ao invés de substituir um órgão lesado, vislumbra-

se a possibilidade de repará-lo através da aplicação de terapias celulares. O coração lesado

pela doença de Chagas crônica é, portanto, um alvo em potencial para a medicina

regenerativa (Tura et al., 2007). Estudos em cardiopatia isquêmica demonstraram que

células-tronco obtidas de várias fontes, incluindo da medula óssea, são eficazes no tratamento

deste tipo de insuficiência cardíaca (Leri et al., 2006).

A terapia com células de medula óssea não pretende tratar a doença de Chagas, pois

não interfere na infecção pelo T. cruzi, não havendo alteração na carga parasitária ou na

parasitemia dos animais experimentais tratados. Esta é uma terapia reparativa dos danos

causados durante anos ou até décadas de agressão ao miocárdio resultante da doença de

Chagas. O que se espera é que estes indivíduos possam conviver com o parasito sem

sintomatologia, como ocorre com a maioria dos indivíduos infectados pelo T. cruzi, na forma

indeterminada da doença (Soares e Santos, 2007).

Luciana Loureiro Penha Introdução

Estudos sobre a biologia molecular e a biologia celular do T. cruzi têm sido realizados

por vários grupos de pesquisadores, visando à descoberta de novas vias metabólicas,

específicas do parasito, que possam ser utilizadas como novos alvos que motivem o

desenvolvimento de novos quimioterápicos.

4- Cepas do T.cruzi

Em condições naturais, o ciclo de vida do T. cruzi alterna entre hospedeiros

vertebrados e invertebrados, havendo mais que 130 hemípteros da família Reduviidae como

hospedeiro invertebrado, e mais que 100 espécies diferentes de mamíferos como hospedeiro

vertebrado (Zeledon e Rabinovich, 1981). A distribuição geográfica dos triatomínios e

hospedeiros vertebrados associados à preferência dos insetos por fonte sanguínea específica

definem dois ciclos de transmissão do T. cruzi, um ciclo silvestre envolvendo diferentes

espécies de insetos triatomínios e animais silvestres e um ciclo doméstico onde fazem parte

animais portadores e humanos que atuam como reservatório (Macedo et al., 2004).

O primeiro método experimental bioquímico que demonstrou a diversidade genética

do T. cruzi foi a variação eletroforética de enzimas celulares (isoenzimas). Baseados na

variabilidade de seis isoenzimas: alanina aminotransferase (ALAT), aspartato

aminotransferase (ASAT), glucofosfato-isomerase (GPI), glucose-6-fosfato-desidrogenase

(G6PDH), malato desidrogenase (ME) e fosfoglucomutase (PGM), Miles et al. (1977, 1978,

1980) propuseram a separação das amostras de T. cruzi em três zimodemos (zimodemas Z1,

Z2 e Z3). Estudos epidemiológicos demonstraram que Z1 e Z3 estavam associados com o

ciclo silvestre e Z2 com o ciclo de transmissão doméstico (Miles et al., 1978, 1980; Barret et

al., 1980).

Luciana Loureiro Penha Introdução

Análises taxonômicas numéricas desses dados sugeriram a existência de duas

linhagens filogenéticas de T. cruzi altamente heterogêneas que diferem em vários aspectos

biológicos (Tibayrenc, 1995). Brisse et al. (2000) identificaram cinco sub-divisões

filogenéticas dentro de uma linhagem e propuseram a existência de seis principais grupos de

T. cruzi, denominados linhagem I, IIa, IIb, IIc, IId, IIe. As linhagens I, observadas

principalmente em hospedeiros mamíferos não humanos e triatomínios; e II, encontradas

principalmente em humanos, são separadas evolutivamente numa distância considerada

quatro vezes maiores que a distância que separa o homem do chimpanzé (Tibayrenc, 1995).

Os primeiros estudos do polimorfismo de DNA do T. cruzi foram publicados em 1980

por Morel e colaboradores utilizando a técnica de RFLP (Análise do polimorfismo dos

fragmentos de restrição) nos mini-círculos do kDNA. A existência de cepas de T. cruzi

multiclonais foi confirmada mais tarde por vários grupos usando-se diferentes técnicas, como

RAPD (Amplificação randômica do polimorfismo do DNA) (Tibayrenc, 1995), polimorfismo

na região do mini-exon (Fernandes et al., 1998), polimorfismo na região do DNA ribossomal

(Souto et al., 1996), cariótipo (Santos et al., 1997), e análises de microsatélite (Macedo et al.,

1998).

A cepa CLBrener, clone escolhido para a realização do projeto genoma do T. cruzi,

foi caracterizada primeiramente como grupo T. cruzi II (TcII), com base na região do mini-

exon (Souto et al., 1996). Entretanto, vários artigos demonstram que a cepa CLBrener é de

fato uma cepa híbrida, apresentando características de ambos os grupos, assim como a cepa

Tulauhen (Brisse et al., 1998; Brisse et al., 2001; Pedroso et al., 2003; Augusto et al., 2003).

Brisse e colaboradores (1998) demonstraram claramente que a cepa CLBrener é

extremamente semelhante a cepa Tulahen, não sendo observado diferenças entre a migração

das isoenzimas em análises por eletroforese de enzimas multilocus (MLEE) (Figura 3).

Luciana Loureiro Penha Introdução

Figura 3- Dois dendogramas obtidos por análises de RAPD (esquerda) e MLEE

(direita) (Brisse et al., 1998).

5- Glicoconjugados da superfície do T. cruzi

O T. cruzi expressa em sua superfície um grande número de glicoproteínas e

glicolipídeos que estão envolvidos nos mecanismos de interação do parasito com seus

diferentes hospedeiros (Burleigh e Andrews, 1995). Algumas dessas moléculas de superfície

são organizadas em grandes famílias cujas estruturas têm sido elucidadas. É possível que

diferenças estruturais encontradas em moléculas dominantes, presentes em diferentes estágios

do parasito, sejam uma conseqüência da pressão seletiva exercida pelo ambiente onde cada

estágio se desenvolve (Frasch, 2003). Vários estudos demonstraram diferentes padrões de

reconhecimento dessas moléculas por células do sistema imune (Camargo et al., 1997) e por

anticorpos (Almeida et al., 1994), sugerindo a importância da diversidade estrutural na

interação entre parasito e o sistema imune do hospedeiro.

Luciana Loureiro Penha Introdução

Os glicoinositolfosfolipídeos (GIPLs) (Previato et al., 1990, Carreira et al., 1996; Previato

et al., 2004), as glicoproteínas O-glicosiladas aceptoras de ácido siálico (mucinas) (Previato et al.,

1985; Schenkman et al., 1993; Previato et al., 1994) e a enzima trans-sialidase (Ts) (Previato et al.,

1985; Schenkman et al. 1991) são as moléculas predominantes na superfície de diferentes estágios

do T. cruzi. Esses glicoconjugados podem funcionar como ligantes ou receptores e

interagir com diferentes moléculas da célula do hospedeiro (Todeschini et al., 2002a,

2002b, 2004; Yoshida, 2005).

Embora os GIPLs e as mucinas estejam presentes em todos os estágios do ciclo

de vida do T. cruzi, existem diferenças estruturais quando comparam moléculas de uma

mesma família obtidas de diferentes cepas do parasito (Previato et al., 1994, Previato et

al., 1995; Todeschini et al., 2001; Agrellos et al., 2003; Jones et al., 2004; Carreira et

al., 1996). Os GIPLs e as mucinas são componentes constitutivos do T. cruzi que têm

sido apontados como moléculas antigênicas capazes de induzir a produção de anticorpos

específicos. Esses anticorpos reconhecem epítopos presentes em algumas dessas

moléculas nos diferentes estágios de desenvolvimento. Esses epítopos são variáveis

dependendo das diferentes cepas do parasito (Gazzinelli et al., 1999). Sugere-se que

esses componentes de superfície sejam essenciais para a invasão do parasito e para sua

sobrevivência nas células do hospedeiro mamífero (Burleigh e Andrews, 1995).

Oligossacarídeos O-ligados derivados de mucinas purificadas de formas epimastigotas

de T. cruzi foram caracterizados, mostrando uma diversidade estrutural entre as diferentes

cepas do parasito analisadas. A principal característica é a presença no final redutor da cadeia

oligossacarídica do monossacarídeo N-acetilglucosamina (GlcNAc) α-1 O-ligado à unidade

de treonina (Thr) na cadeia polipeptídica (Previato et al., 1994; Previato et al., 1995). Outra

característica é que a seqüência Thr-α-GlcNAc pode ser alongada pela adição de unidades de

galactopiranose (Galp), galactofuranose (Galf) e ácido siálico (Neu5Ac) (Previato et al, 1994,

Luciana Loureiro Penha Introdução

1995; Todeschini et al., 2001; Agrellos et al., 2003). Essas sub-estruturas O-ligadas são os

únicos aceptores de ácido siálico da superfície do T. cruzi (Previato et al., 1985;

Previato et al., 1994).

As diferenças estruturais entre mucinas de T. cruzi e de mamíferos mostram que

esses parasitos apresentam rotas metabólicas de O-glicosilação específicas, motivando

estudos mais detalhados sobre as glicosiltransferases envolvidas na biossíntese dessas

moléculas. Na primeira etapa da O-glicosilação nas mucinas de mamíferos, o primeiro açúcar

a ser transferido para resíduos de serina (Ser) e/ou treonina (Thr), através de uma N-

acetilgalactosaminil transferase, é a α-N-acetilgalactosamina (α-GalNAc). Já em mucinas de

T. cruzi, unidades de α-N-acetilglucosamina (α-GlcNAc) foram encontradas exclusivamente

ligadas ao aminoácido treonina. Esta reação única, é catalisada pela enzima polipeptídeo O-α

- N-acetilglucosaminiltransferase (Previato et al., 1998). Já na segunda etapa biossintética das

O-glicanas, na seqüência α-GalNAc 1-O-Thr/Ser das mucinas de mamíferos há a adição de

Galp catalisada por uma β1-3 galactopiranosiltransferase. Em T. cruzi a seqüência α-

GlcNAc-O-Thr é alongada pela adição de β1-4 Galp a unidades de GlcNAc. Esta

transferência é catalisada por uma β1-4 galactopiranosiltransferase, enzima altamente

específica para o substrato aceptor de T. cruzi (Dias et al., 2001). Em algumas cepas

estudadas, como as cepas G, Dm28c e Tulahen, a α-GlcNAc é substituída por unidades de

galactofuranose (Galf), em uma reação, provavelmente, catalisada por uma Galf transferase,

ainda não identificada.

Nas formas tripomastigotas, as mucinas estão ancoradas à membrana plasmática do

hospedeiro via âncoras do tipo glicosilfosfatidilinositol (GPI). As sialoglicoproteínas

purificadas de formas epimastigota e tripomastigota metacíclico apresentam massa molecular

de 35 a 50 kDa (gp35/50) (Previato et al., 1994; Acosta-Serrano et al., 2001). Por outro lado,

Luciana Loureiro Penha Introdução

quando derivadas de formas tripomastigotas de culturas de células, as mucinas apresentam

massa molecular de 60 a 200 kDa (Schenkman et al., 1991; Almeida et al., 1994; Buscaglia

et al., 2006). As cadeias O-glicanas representam mais de 60% da massa molecular das

mucinas do parasito (Schenkman et al., 1993; Previato et al., 1994).

A complexidade na estrutura dos glicoconjugados do T. cruzi está melhor

exemplificado por um pequeno glicopeptídeo denominado NETNES. Nesse glicoconjugado

ocorrem cinco modificações pós-traducão em treze amoniácidos: uma ou duas N-

glicosilações, duas cadeias de manose ligadas a fosfato e uma âncora GPI (MacRae et al.,

2005). Esse é provavelmente o mais completo glicoconjugado já descrito em eucarioto até o

momento (revisado em Previato-Mendonça et al., 2005).

6- Importância dos glicoconjugados para o parasito

As mucinas de T. cruzi (Tc-mucinas) parecem ter uma função importante no papel de

proteção do parasito no hospedeiro vertebrado e a sialilação dessas glicoproteínas parece

essencial para essa proteção. Quando as mucinas são sialiladas, cada parasito adquire

aproximadamente 10

unidades de ácido siálico, resultando numa forte carga negativa na

superfície do parasito. Essa carga negativa parece ser responsável pela proteção da lise

induzida pelos anticorpos humanos anti-α-Gal. Foi demonstrado que é necessária uma

quantidade maior de anticorpos anti-α-Gal de pacientes chagásicos para causar a lise de

parasitos contendo mucinas sialiladas em sua superfície, sugerindo que a sialilação funcione

como um eficiente mecanismo de escape do parasito contra o sistema imune do hospedeiro

(Pereira-Chioccola et al., 2000).

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O envolvimento das unidades terminais não redutoras de ácido siálico na interação do

T. cruzi com as células hospedeiras tem sido investigado. A incubação de formas

tripomastigotas em meio contendo sialoglicoproteínas levou a um aumento da penetração do

parasito em culturas de fibroblastos (Piras et al., 1987). Schenkman e colaboradores (1991)

demonstraram que um anticorpo monoclonal específico contra um epítopo sialilado (Ssp3),

específico das mucinas de formas tripomastigotas, inibe a adesão e a penetração do parasito

em uma linhagem de células derivada de rins de macacos (LLC-MK2). Foi observado ainda

que células de ovário de hamster (CHO) deficientes em ácido siálico apresentam um índice

de invasão menor pelo T. cruzi quando comparadas com as células CHO selvagens

(Chuenkova et al., 1993). Franchin e colaboradores (1997) demonstraram que camundongos,

altamente suscetíveis à infecção pelo T. cruzi, apresentaram redução drástica da infecção após

imunização com anticorpo específico para um epítopo sialilado das mucinas de

tripomastigotas, sugerindo o envolvimento das sialoglicoproteínas (Tc-mucinas) na virulência

do T. cruzi. Por outro lado, Yoshida e colaboradores (1997) demonstraram que a remoção das

unidades de ácido siálico das mucinas de formas tripomastigotas metacíclicas da cepa G,

aumentava a invasão do parasito em células HeLa, porém esses resultados não foram os

mesmos quando a cepa CLBrener foi utilizada.

Durante a internalização de tripomastigotas metacíclicos (TM) ou tripomastigotas de

cultura de tecido (TCT), vias de transdução de sinal são ativadas tanto no parasito como na

célula alvo, acarretando a mobilização de Ca

. Para adesão, TM utilizam as glicoproteínas de

superfície como moléculas indutoras de sinal de Ca

2+,

como a gp82 (Ruiz et al., 1998) e a

gp35/50 (Dorta et al., 1995). Em isolados de T. cruzi que invadem a célula hospedeira de

maneira dependente de gp82, a proteína tirosina cinase assim como a fosfolipase C do

parasito são ativadas, e Ca

é liberado de reservatórios sensíveis a 1,4,5-trifosfato inositol

(IP

) (Yoshida et al., 2000), enquanto em isolados de T. cruzi que se ligam às células alvo

Luciana Loureiro Penha Introdução

através de gp35/50, a via de sinalização envolvendo adenilato ciclase parece ser estimulada,

com liberação de Ca

de acidocalciossomos (Neira et al., 2002).

Dependendo do isolado de T. cruzi, sinais inibitórios mediados por gp90 específica de

TM podem ser desencadeados tanto na célula hospedeira como no parasito. Gp90 é uma

glicoproteína específica do estágio da forma TM que é rica em oligossacarídeos N-ligados.

Essa glicoproteína não é capaz de ativar a cascata de sinalização de Ca

como as

glicoproteínas gp82 e gp35/50 (Veillette et al., 2002; Vivier et al., 2004).

O repertório de moléculas de TCT implicado na invasão celular inclui glicoproteínas

da superfície da família gp85, contendo sítios de ligação à laminina e citoqueratina 18

(Giordano et al. 1994; Magdesian et al., 2001), enzimas como a cruzipaína (Meirelles et al.,

1992; Aparicio et al., 2004), trans-sialidase (Previato et al., 1985; Todeschini et al, 2004;

Dias et al., 2008), e uma oligopeptidase B que gera um agonista de Ca

a partir de uma

molécula precursora (Burleigh et al., 1997; Yoshida, 2006).

Rubin-de-Celis e colaboradores (2006) demonstraram que tripomastigotas que super-

expressam a enzima trans-sialidase eram capazes de sair mais rapidamente do vacúolo

parasitóforo para o citoplasma, e subsequentemente diferenciavam mais rapidamente em

amastigotas. A trans-sialidase parece interagir com a membrana do vacúolo, removendo o

ácido siálico das proteínas LAMP (proteínas associadas à membrana do lisossomo) (Andrade

e Andrews, 2005), facilitando a ação da proteína tipo porina, TcTox, ativada após a

acidificação do vacúolo parasitóforo, facilitando o escape do parasito para o citoplasma

(Hall et al., 1992; Andrews, 1993).

O desenvolvimento de novas metodologias capazes de discriminar a função das

diferentes moléculas presentes na superfície celular do T. cruzi auxiliará no entendimento da

Luciana Loureiro Penha Introdução

patogenia da doença de Chagas. Uma possibilidade é o estudo das enzimas envolvidas no

metabolismo de galactose em T. cruzi, monossacarídeo essencial à sialilação das mucinas e à

biossíntese dos GIPLs.

7- A enzima fosfoglucomutase

No metabolismo de galactose, quando as células são cultivadas em presença de

glucose, uma enzima chave para formação de UDP-galactose em T. cruzi é a

fosfoglucomutase (PGM). Esta enzima pertence a uma família conservada de enzimas,

apresenta diferentes isoformas e é encontrada desde bactérias até mamíferos (Figura 4).

A PGM é responsável pela catálise reversível de glucose 6-fosfato (Glc-6-P) em

glucose 1-fosfato (Glc-1-P), tendo um papel crucial na via da glicólise e na gliconeogênese

(quando a célula é cultivada na presença de Gal como única fonte de carbono). Essa enzima

requer como co-fator a glucose 1,6-difosfato, passando alternativamente por duas formas,

fosforilada e não fosforilada, pertencendo, assim, ao grande grupo de enzimas que possuem

uma serina no sítio ativo que é fosforilada (Nelson e Cox, 2001) (Figura 5). No entanto,

Naught e colaboradores (2003) demonstraram que a substituição de Ser108 por Ala, na

enzima fosfoglucomutase-fosfomanomutase de Pseudomonas aeruginosa, não resulta na

perda de atividade enzimática, sugerindo que, neste caso, outro aminoácido poderia atuar

como aceptor do fosfato.

A PGM de coelho teve sua estrutura tridimensional analisada por difração de raios-X

(Jin-Bi Dai et al., 1992), apresentando-se como um dímero composto por monômeros de

aproximadamente 60 kDa. A proteína apresenta quatro domínios globulares, com domínios

Luciana Loureiro Penha Introdução

independentes, possuindo aminoácidos do sítio catalítico da enzima espalhados entre todos os

domínios.

Figura 4- Modelo por homologia da PGM/PMM de P.aeruginosa (linhas coloridas) e

PGM de coelho (linhas cinza). Domínios I-IV de cada proteína são mostrados em verde,

amarelo, vermelho e azul, respectivamente e correspondem aos resíduos 1-153, 154-256,

257-368 e 369-463 da PGM/PMM. O modelo foi elaborado por MolScript (Shackelford et

al., 2004).

Luciana Loureiro Penha Introdução

Figura 5-

Mecanismo de ação da PGM. A conversão de glicose-1-fosfato em glicose-

6-fosfato pela PGM, em célula cultivada na presença de galactose, ocorre a partir da

transferência de um grupamento fosfato associado a Ser116 da enzima para o açúcar,

formando como intermediário a glucose-1,6-bifosfato. Em seguida ocorre novamente a

fosforilação da enzima, gerando como produto final glucose-6-fosfato (Jin-Bi Dai et al.,

1992).

O metabolismo de galactose no homem, assim como em vários organismos é

realizado pela via de Leloir (Leloir, 1971) (Figura 6). Essa via consiste em uma série de

reações catalisadas pelas enzimas galactoquinase, galactose-1-fosfato uridiltransferase e

UDP-galactose 4-epimerase que convertem a galactose em Glc-1-P. Posteriormente, a Glc 1-

P é convertida, pela PGM, em Glc-6-P que será metabolizada na via glicolítica, gerando

energia para célula.

Diversos estudos têm demonstrado que a atividade da PGM está relacionada a

diversos processos celulares, incluindo não apenas o metabolismo de açúcares, mas também a

síntese de glicoconjugados, exposição de antígenos de superfície, resistência a antibióticos,

síntese de proteínas e homeostase do cálcio, como poderá ser visto adiante.

P O

Glicose-1-fosfato

Fosfoenzima

P O

Glicose-6-fosfato

Fosfoenzima

P O

Glicose-1,6-bifosfato

defosfoenzima

P O

Glicose-1-fosfato

Fosfoenzima

P O

Glicose-1-fosfato

P O

Glucose1-fosfato

Fosfoenzima

P O

Glicose-6-fosfato

Fosfoenzima

P O

Glicose-6-fosfato

P O

Glucose6-fosfato

Fosfoenzima

P O

Glicose-1,6-bifosfato

defosfoenzima

P O

Glicose-1,6-bifosfato

P O

Glucose

1,6

-bifosfato

defosfoenzima

P O

Glicose-1-fosfato

Fosfoenzima

P O

Glicose-1-fosfato

P O

Glicose-1-fosfato

Fosfoenzima

P O

Glicose-6-fosfato

Fosfoenzima

P O

Glicose-6-fosfato

P O

Glicose-6-fosfato

Fosfoenzima

P O

Glicose-1,6-bifosfato

defosfoenzima

P O

Glicose-1,6-bifosfato

P O

Glicose-1,6-bifosfato

defosfoenzima

P O

Glicose-1-fosfato

P O

Glicose-1-fosfato

Fosfoenzima

P O

Glicose-1-fosfato

P O

Glucose1-fosfato

Fosfoenzima

P O

Glicose-6-fosfato

P O

Glicose-6-fosfato

Fosfoenzima

P O

Glicose-6-fosfato

P O

Glucose6-fosfato

Fosfoenzima

P O

Glicose-1,6-bifosfato

P O

Glicose-1,6-bifosfato

defosfoenzima

P O

Glicose-1,6-bifosfato

P O

Glucose

1,6

-bifosfato

defosfoenzima

Luciana Loureiro Penha Introdução

UDP-glucose:galactose-1-fosfato

uridil transferase

P O

galactoquinase

ATP ADP

Galactose Galactose-1-fosfato

P O

UDP-Glucose

P O

UDP-Galactose

UDP-glucose

4-epimerase

NAD

UDP-Glucose

Glucose-1-fosfato

UDP-glucose:galactose-1-fosfato

uridil transferase

UDP-glucose:galactose-1-fosfato

uridil transferase

P O

galactoquinase

ATP ADP

Galactose Galactose-1-fosfato

P O

galactoquinase

ATP ADP

P O

galactoquinase

ATP ADP

Galactose Galactose-1-fosfato

P O

UDP-Glucose

P O

UDP-Glucose

P O

UDP-Galactose

P O

UDP-Galactose

UDP-glucose

4-epimerase

NAD

UDP-glucose

4-epimerase

NAD

UDP-Glucose

Glucose-1-fosfato

UDP-Glucose

Glucose-1-fosfato

Figura 6- A conversão de β-D-galactose a Glc-1-P é realizado por 4 enzimas que

constituem a via de Leloir. A primeira enzima da via é a galactose mutarotase que epimeriza

-D-Gal em -D-Gal (não está representada no esquema). A próxima etapa envolve a

fosforilação dependente de ATP da -D-Gal através da galoctoquinase formando Gal-1-P. A

terceira enzima da via é a UDP-glucose:galactose-1-fosfato-uridiltransferase, que catalisa a

transferência de um grupo UMP da UDP-Glucose para Gal-1-P, formando Glc-1-P e UDP-

Gal. Para completar a via, a UDP-Gal é convertida em UDP-Glc pela ação da UDP-galactose

4-epimerase (Holden et al., 2003).

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7.1- PGM em bactérias

Stenotrophomonas maltophilia é uma bactéria Gram-negativa causadora de infecção

hospitalar, sendo considerada um importante microrganismo oportunista em pacientes

imunodeficientes. McKay e colaboradores (2003) clonaram e caracterizaram o gene spgM

que codifica a PGM. A deleção do gene spgM causou um fenótipo avirulento, sendo o

mutante incapaz de colonizar pulmão de rato, e apresentou, também, maior susceptibilidade a

agentes antimicrobianos. Estes autores confirmaram que a SpgM apresenta atividades de

PGM e PMM, podendo realizar a conversão de Glc-1-P em Glc-6-P, e vice-versa, assim

como, manose-1-fosfato em manose-6-fosfato, e vice-versa. Resultados similares foram

encontrados para a PGM de Pseudomonas aeruginosa (Zielinski et al., 1991; Regni et al.,

2006), Neisseria gonorrhoeae (Sandlin et al., 1994), Xilella campestris (Koplin et al., 1992),

Bordetella bronchiseptica (West et al., 2000) e Staphylococcus aureus (Grundling e

Schnewind, 2007). Essas enzimas formam uma super família de hexose fosfato mutases,

incluindo ainda a fosfoglucosaminomutase, que é responsável pela conversão reversível de N-

acetil-glucosamina-6-fosfato em N-acetil-glucosamina-1-fosfato (Figura 7).

Em P. aeruginosa foi verificado que o gene AlgC codifica a enzima com dupla

especificidade PGM/PMM, utilizando glucose ou manose como substrato, assim, a enzima é

capaz de catalisar a interconversão de manose-6P e manose-1P, bem como glucose-6P em

glucose-1P (Zielimki et al., 1991; Naught, 2001). Estudos genéticos demonstraram que a

atividade da PMM é necessária à biossíntese de alginato e lipopolissacarídeo (LPS), no

entanto a PGM é necessária apenas para a biossíntese de LPS (Ye et al., 1994). Como o LPS

é um componente importante da superfície de bactérias Gram-negativas, modificações

estruturais têm sido correlacionadas a mudanças na resistência a agentes antimicrobianos,

pois após a deleção do gene AlgC a bactéria tornou-se mais susceptibilidade a antibióticos

Luciana Loureiro Penha Introdução

(Kadurugamuwa et al., 1993), modificando, ainda, o padrão de virulência (Goldberg et al.,

1995). Em Streptococcus gordonii após a deleção do gene pgm, houve redução da viabilidade

da bactéria in vitro e in vivo (Bizzini et al., 2007).

7.2- PGM em leveduras

Boles e colaboradores (1994) isolaram e caracterizaram os dois genes que codificam

as duas isoformas de PGM em Saccharomyces cerevisiae. A deleção dos genes pgm1 e pgm2

levaram à redução do crescimento da levedura cultivada em meio contendo glucose como

única fonte de carbono, porém foi observada uma atividade residual na conversão de Glc-6P

em Glc-1P dada pelas atividades da PMM e da fosfoglucosaminamutase, no entanto com

baixa eficiência (1%). Os autores sugerem que um pequeno percentual de atividade

enzimática de conversão de Glc-6P em Glc-1P é suficiente para o crescimento e a viabilidade

da levedura. O duplo mutante apresenta alterações na fisiologia, morfologia e integridade da

parede celular, defeitos na síntese de glicogênio e trealose e aumento na sensibilidade à ação

de quimioterápicos. A redução nos níveis de UDP-Glc foi acompanhada pela redução dos

níveis de glicogênio, sugerindo que as biossínteses de glicogênio e de trealose são

primariamente reguladas pela disponibilidade de UDP-Glc (Daran et al., 1997). A

concentração de UDP-Glc foi pouco alterada pela deleção do gene pgm1, mas o duplo

mutante diminuiu em três vezes esta concentração, sugerindo que a isoforma PGM1 contribui

em menor escala para a manutenção dos níveis de UDP-Glc.

Quando o duplo mutante de S. cerevisiae foi cultivado em meio contendo galactose

como única fonte de carbono, a levedura não foi capaz de se multiplicar, confirmando que

semelhante às células de mamíferos, em S. cerevisiae a galactose necessita da PGM para ser

Luciana Loureiro Penha Introdução

metabolizada pela via de Leloir (Boles et al., 1994). O mutante acumula Gal-1P e Glc-1P.

Tem sido demonstrado que o acúmulo de Gal-1P é tóxico para a célula, como é o caso da

doença denominada galactosemia em humanos. A característica da doença é o alto nível de

galactose-1P, devido à mutação no gene que codifica a galactose-1P-uridiltransferase (Figura

6).

Masuda e colaboradores (2001), analisando os metabólitos intermediários da via de

Leloir em S. cerevisiae cultivada em galactose na presença de lítio, demonstraram o acúmulo

de Gal-1P e Glc-1P. O lítio inibe com alta afinidade a enzima PGM, sendo esta inibição

revertida pelo magnésio, que é um co-fator da enzima. Em S. cerevisiae o lítio é capaz de

inibir o metabolismo de galactose, mas não o de glucose. A inibição da atividade da PGM

provoca redução nos níveis de UDP-Glc, demonstrando que a PGM é um dos principais alvos

da ação do lítio em S. cerevisiae. Nesse trabalho, também foi demonstrado que a atividade da

PGM em linhagens de células humanas HEK293 é inibida pelo lítio de maneira competitiva

com o magnésio. In vivo, a inibição da PGM pelo lítio é revertida pela super expressão da

enzima PGM2 ou pela adição de altas concentrações de Mg

no meio de cultura (Masuda et

al., 2001).

Outros fatores parecem estar envolvidos com a inibição do crescimento de S.

cerevisiae na presença do lítio. Montero-Lomelí e colaboradores (2002) demonstraram que a

síntese protéica também é inibida quando a glicólise é interrompida na etapa da atividade da

PGM. Isso ocorre porque o complexo eIF4A na presença do lítio (em doses letais) é

dissociado do poli-ribossomo e a síntese de proteínas é bloqueada em 90%. A super

expressão do gene TIF2, que codifica o fator iniciador de transcrição eIF4A, confere

tolerância ao lítio quando a levedura é cultivada em meio com galactose, não ocorrendo a

separação do eIF4A do poli-ribossomo. Quando o lítio é utilizado em doses sub-letais, a

Luciana Loureiro Penha Introdução

célula super-expressa naturalmente TIF2. A levedura cultivada em meio contendo glucose

não apresenta dissociação do fator de tradução. Como o Mg

é um co-fator da PGM, este

cátion foi utilizado como controle e conseguiu reverter o efeito inibitório do lítio na síntese

de proteína. Estes dados sugerem que a PGM possa ter um efeito indireto na inibição da

síntese protéica na presença do lítio, por privar a célula de nutrientes.

Foi verificado também que a levedura mutante para a isoforma majoritária da PGM

(PGM2) apresenta maior influxo de Ca

quando comparada com a cepa selvagem, no

entanto, o acúmulo excessivo de Ca

(6-9 vezes) foi observado apenas quando o mutante

pgm2

foi cultivado em meio com galactose como fonte de carbono, o que poderia estar

correlacionado ao acumulo de Glc-1P. Estes resultados sugerem que a Glc-1P poderia regular

o influxo de Ca

nessa condição (Aiello et al., 2000). Porém esse mesmo grupo verificou em

2002 que o aumento simultâneo de ambos os níveis de Glc-1-P e Glc-6-P, utilizando o duplo

mutante para a enzima PGM e a enzima fosfofrutoquinase (pgm2/pfk), restaurava a

homeostasia de Ca

aos níveis normais, sugerindo que o balanço no metabolismo de glucose

tenha um papel importante nesse processo.

Csutora e colaboradores (2005) demonstraram que um minuto de exposição ao LiCl

foi suficiente para aumentar os níveis de Ca

, indicando que a exposição ao LiCl aumenta a

entrada de cálcio por um mecanismo rápido que não requer a síntese de novo de proteínas.

Verificou-se que o aumento de transporte de Ca

para o vacúolo, e a Ca

ATPase codificada

pelo gene pmc1 parecem ter um papel principal nesse processo. Os autores sugerem que a

conseqüência primária de exposição ao lítio seja um aumento nos níveis de Ca

para o

vacúolo, logo a passagem de Ca

pela membrana seria um efeito secundário dado ao seu

aumento excessivo para os vacúolos. O magnésio foi capaz de reduzir o acúmulo de Ca

induzido pelo lítio nesse mutante.

Luciana Loureiro Penha Introdução

Figura 7- Representação esquemática simplificada de vias de interconversão de

monossacarídeos. As enzimas pertencentes à super família de hexose fosfato mutases estão

indicadas em verde. A reação de catálise da PGM em tripanossomatídeos está deslocada para

produção de Glc-1-P, visto que esses parasitos só possuem transportadores para glucose.

7.3- PGM em células humanas

Em humanos a enzima PGM é codificada por três loci estruturais autossômicos

independentes, denominados pgm1, pgm2 e pgm3 (Harris e Hopkinson, 1976). Com base nos

estudos dessas proteínas, supõe-se que o lócus expandiu-se por duplicação gênica, dando

origem às isoenzimas conhecidas, as quais apresentam propriedades distintas, como tamanho

molecular, termoestabilidade, especificidade de substratos e distribuição tecidual (Fisher e

Harris, 1972; Quick et al, 1972). Entretanto, é importante mencionar que as enzimas PGM1,

PGM2 e PGM3 contêm, entre si, menos de 65% de identidade seqüencial. Essa observação é

UDP-galactose-4-epimerase

UDP-glucose-pirofosforilase

Manose-1-fosfato

UDP-N-acetil-Glucosamina

Glucose

fosfato

Frutose-6-fosfato

Manose-6-fosfato

Glucose

fosfato

UDP-Glucose

UDP-Galactose

PGM

Catalisa a transferência de fosfato

entre as posições 1 e 6 da glucose

glucoquinase

fosfohexoisomerase

fosfomanoisomerase

Glucosamina-6-fosfato

N-acetil-glucosamina-6-fosfato

N-acetil-glucosamina-1-fosfato

frutose-6-fosfato amido-

transferase

UDP-N-acetilglucosamina-

pirofosforilase

fosfoglucosaminamutase

fosfomanomutase

UDP-galactose-4-epimerase

UDP-glucose-pirofosforilase

Manose-1-fosfato

UDP-N-acetil-Glucosamina

Glucose

fosfato

Frutose-6-fosfato

Manose-6-fosfato

Glucose

fosfato

UDP-Glucose

UDP-Galactose

PGM

Catalisa a transferência de fosfato

entre as posições 1 e 6 da glucose

glucoquinase

fosfohexoisomerase

fosfomanoisomerase

Glucosamina-6-fosfato

N-acetil-glucosamina-6-fosfato

N-acetil-glucosamina-1-fosfato

frutose-6-fosfato amido-

transferase

UDP-N-acetilglucosamina-

pirofosforilase

fosfoglucosaminamutase

fosfomanomutase

Luciana Loureiro Penha Introdução

corroborada por ensaios imunológicos, onde anticorpos de coelho anti-PGM1 foram capazes

de reconhecer todas as isoformas da PGM1 de mamíferos, peixes e anfíbios, porém não

apresentaram reação cruzada contra PGM2 ou PGM3 de humanos (Drago et al., 1991).

O polimorfismo da enzima PGM3 foi identificado há mais de 30 anos. Até o

momento, quatro alelos distintos são conhecidos, que dão origem a 10 fenótipos diferentes.

Este polimorfismo é útil na ciência forense, permitindo o uso de técnicas de tipagem de

isoenzimas PGM3 como um marcador de individualidade, possibilitando a discriminação

entre indivíduos com 75% de eficácia (Takahashi el al., 1982).

Desde que foi descoberta, o maior interesse na PGM3 foi usá-la como marcador

genético em medicina forense, com pouca atenção dada para os papéis bioquímico e celular

dessa proteína. Porém, um trabalho realizado por Pang e colaboradores (2002) demonstrou

que pgm3 e agm1 são o mesmo gene em humanos. O gene agm1 codifica uma proteína

essencial em S. cerevisiae, que é responsável pela conversão de UDP-N-acetilglucosamina-6-

fosfato (GlcNAc-6-P) em GlcNAc-1-P, uma enzima chave no metabolismo de GlcNAc

(Boles et al., 1994).

Greig e colaboradores (2007) realizaram mutações no gene que codifica a PGM3 em

camundongos, verificando redução nos níveis de UDP-GlcNAc, com redução na glicosilação

de proteínas. Camundongos com uma grande redução nos níveis de UDP-GlcNAc morreram

durante o desenvolvimento embrionário, enquanto que camundongos com diminuição parcial

da atividade foram viáveis e apresentaram alguns defeitos restritos a alguns tipos celulares.

Os defeitos apresentados foram esterilidade, mudanças patológicas nas glândulas salivares,

no pâncreas e no pulmão. Houve também deficiências em algumas linhagens de células

hematopoiéticas, principalmente hemácias, linfócitos e plaquetas.

Luciana Loureiro Penha Introdução

A enzima PGM2 em humanos (PGM1 em camundongos) possui atividade dez vezes

maior de fosfopentomutase do que de fosfoglucomutase, entretanto a PGM1 de mamíferos

(equivalente PGM2 em camundongos) possui uma atividade de apenas 0,2% de

fosfopentomutase quando comparada com a atividade de fosfoglucomutase. A procura no

banco de dados no genoma humano demonstrou a presença de um homólogo a PGM2

denominado PGM2L1, com 60% de identidade com essa proteína. PGM2L1 apresentou

menos de 5% de atividade de fosfopentomutase ou fosfoglucomutase, comparado com a

PGM2, porém apresentou uma atividade alta de glucose-1-6-bifosfato. Essa enzima serve

como co-fator de várias fosfomutases e possivelmente também atua como reguladora de

enzimas da via glicolítica (Maliekal et al., 2007). Nesse trabalho os autores sugerem que

fosfopentomutase e glucose-1-6-bifosfato correspondem respectivamente às proteínas PGM2

e PGM2L1, codificadas por dois genes que se separaram durante a evolução dos vertebrados.

7.4-PGM em Trypanosoma cruzi

Além da PGM ter sido utilizada para genotipagem de T. cruzi, ela pode ser

considerada uma enzima importante no metabolismo do parasito, pois ele é incapaz de

metabolizar galactose (Tetaud et al., 1994). Genes que codificam para transportadores de

hexose foram clonados em espécies do gênero Trypanosoma, e sua expressão verificada em

oócitos de Xenopus e células CHO (Barrett et al., 1998). T. brucei contêm duas isoformas de

transportadores, mas T. cruzi e T. vivax possuem apenas uma isoforma. O gene TcrHT1, que

codifica para o transportador de hexose é expresso constitutivamente em T. cruzi, mas não

transporta D-galactose, sendo assim, o parasito não realiza a via de Leloir. Em trabalho

realizado por Tetaud e colaboradores (1994), o gene TcrHT1 foi expresso em Xenopus e foi

demonstrado que a proteína codificada pelo gene não reconhece D-galactose. Logo, o T. cruzi

Luciana Loureiro Penha Introdução

por não realizar a via de Leloir, a única maneira de obter UDP-galactose, composto essencial

à biossíntese de glicoconjugados que contém galactose em sua estrutura como as mucinas e

os GIPLs, seria pela atividade da PGM.

Estudos prévios (Penha et al., 2005), em nosso laboratório isolamos o Tcpgm e

realizamos a sua caracterização molecular. Os resultados obtidos demonstraram similaridade

de seqüência de aminoácidos putativos de 61% com a PGM da Leishmania major e de 43%

com a PGM de S. cerevisae. O Tcpgm é um gene de cópia única expresso ao longo do ciclo

de vida do parasito, cujo RNA é maturado por adição da seqüência de mini-exon na porção

5’, num sítio mapeado por RT-PCR. Com o intuito de verificar se o gene pgm isolado do T.

cruzi codificava uma enzima funcional, o fragmento gênico foi clonado no vetor de expressão

e introduzido na cepa de S. cerevisiae deficiente em pgm1 e em pgm2. Esses estudos

revelaram que o gene pgm do T. cruzi codifica uma enzima ativa, que foi capaz de

complementar o fenótipo letal dos mutantes de levedura ∆pgm1/pgm2, induzido a partir do

cultivo dessas células em meio contendo galactose.

Em eucariotos superiores e em leveduras, a PGM é encontrada exclusivamente no

citoplasma, local onde ocorre a via glicolítica (Marchase et al., 1993). No entanto, em

tripanosomatídeos diversas enzimas que participam do metabolismo de açúcares estão

localizadas em organelas do tipo peroxissomo, denominadas glicossomos. Acredita-se que o

transporte de moléculas para os glicossomos em tripanosomatídeos segue rotas semelhantes

às descritas para o transporte de moléculas para peroxissomos de leveduras ou de mamíferos,

envolvendo a presença de sinais de endereçamento específicos.

Luciana Loureiro Penha Introdução

8- Peroxissomos

Os peroxissomos são organelas pequenas delimitadas por uma membrana e contêm

enzimas envolvidas em uma variedade de reações metabólicas, incluindo o metabolismo

energético (Masters et al., 1995). Essas organelas foram definidas, originalmente, por

realizarem reações de oxidação, levando à produção de peróxido de hidrogênio, composto

tóxico para a célula. Quando o peróxido de hidrogênio reage com íons metálicos (Fe

) estes podem ser convertidos através da reação de Fenton (Keyer et al., 1995) a um

radical hidroxila extremamente tóxico. Esses compostos, juntamente com ânions superóxidos

), são coletivamente referidos como espécie reativa de oxigênio (ROS) e podem oxidar

todas as classes de macromoléculas celulares, entre elas o DNA, os lipídios e as proteínas. Os

peroxissomos possuem a enzima catalase que decompõe o peróxido de hidrogênio,

convertendo-o em água e O

ou utilizando-o para oxidar outros compostos orgânicos. A

catalase não degrada apenas o H

produzido nos peroxissomos, mas também aquele que é

produzido em outros pontos da célula, como mitocôndria, retículo endoplasmático e citosol,

onde as oxidações produzem pequenas quantidades de O

, denominados radicais livres, que

são muito reativos. A enzima superóxido dismutase encarrega-se de eliminar os radicais

livres, formando O

, sendo o H

degradado no peroxissomo (Terlecky e Koepke,

2007).

Várias substâncias são degradadas pelas reações de oxidação nos peroxissomos, como

o ácido úrico, aminoácidos e ácidos graxos. A oxidação de ácidos graxos é particularmente

importante, uma vez que representa a principal fonte de energia metabólica. Em mamíferos,

peroxissomos participam na  e -oxidação de ácidos graxos, síntese de éter-lipídeos e sais

biliares, assim como na degradação de purinas, poliaminas, ácido L-pipecólico e D-

aminoácido. A função metabólica dos peroxissomos em outros organismos inclui a

Luciana Loureiro Penha Introdução

degradação de metanol (levedura), ciclo glioxilato (plantas e leveduras), biossíntese de

penicilina (fungo), biossíntese de hormônio (plantas) e glicólise (tripanossomatídeos)

(Wanders e Waterham, 2006).

Um importante avanço nos conceitos dos princípios básicos de organização celular do

peroxissomo foi a descoberta de que essa organela constitui um sistema dinâmico de

endomembranas derivado do retículo endoplasmático (Titorenko et al., 1998; Hoepfner et al.,

2005; Titorenko e Mullen, 2006).

Nos distúrbios da biogênese dos peroxissomos (DPBs), muitas funções anabólicas

estão alteradas incluindo a biossíntese de plasmalógenos, colesterol e ácidos biliares. A

deficiência generalizada da -oxidação nos peroxissomos resulta em uma variedade de

distúrbios como alterações marcantes da migração neuronal com malformações e severa

disfunção neurológica. Um marcador útil de diagnóstico das DPBs, é a existência de acúmulo

de ácidos graxos de cadeia muito longa no plasma.

DPBs podem ser sub-divididas dentro do espectro de Zellweger, nas quais são

denominadas síndrome de Zellweger (SZ), adrenoleucodistrofia neonatal (NALD) e doença

de Refsum infantil (DRI) (Steinberg et al., 2006) . Essas doenças têm sido associadas com

mutações em vários genes PEX, codificam diferentes componentes do sistema de transporte

de proteínas para o interior do peroxissomo, e são diferenciadas pelas suas formas clínicas.

Os pacientes com síndrome de Zellweger possuem defeitos nos genes PEX 1, 2, 3, 5, 6, 7, 10,

12, 13, 14, 16, 19 e 26, apresentando anomalias severas, como deformidade crânio-facial,

anomalias nos olhos, extrema hipotonia, ossos frágeis e hepatomegalia. Essas crianças

raramente sobrevivem mais que um ano de vida. Os pacientes com NALD apresentam

defeitos nos genes PEX 1, 5, 6, 10, 12, 13 e 26; e os pacientes com DRI os defeitos ocorrem

nos genes PEX 1, 2, 6, 12 e 26 (Terlecky e Koepke, 2007).

Luciana Loureiro Penha Introdução

9- Endereçamento de proteínas para peroxissomos

Em diversos organismos, 32 proteínas denominadas peroxinas (PEX), foram

identificadas como envolvidas em diferentes aspectos da biogênese dos peroxissomos: (1) no

recrutamento de lipídeos para a formação da membrana, (2) na inserção de proteínas na

membrana peroxissomal, (3) no encaminhamento de proteínas para a matriz peroxissomal

(Moyersoen et al., 2004). O processo de encaminhamento de proteínas para a matriz do

peroxissomo consiste em diferentes fases: (1) reconhecimento da proteína por um receptor;

(2) interação do complexo receptor-proteína com proteínas na membrana; (3) translocação do

complexo para o interior da organela e (4) reciclagem do receptor. As proteínas presentes no

citoplasma que serão encaminhadas à matriz necessitam possuir um sinal de encaminhamento

para peroxissomo, denominado PTS. Duas seqüências consenso PTS foram identificadas em

diferentes organismos. O consenso PTS1 está localizado na extremidade C-terminal, e ocorre

na maioria das proteínas peroxissomais. Inicialmente, acreditava-se que o consenso

compreendia um único tripeptídeo com a seqüência (S/A/C)- (K/R/H)-L. Entretanto, foi

demonstrado que essas seqüências podem variar consideravelmente, com modificações no

tamanho, seqüência e especificidade do sinal, podendo também, haver diferenças entre as

espécies (Neuberger et al., 2003). Postula-se que resíduos de amino ácidos localizados acima

da posição 12 do C-terminal da proteína podem exercer um papel na força da interação

proteína-PTS1 ao receptor (Michels et al., 2005). O consenso PTS2 representa um sinal

topogênico mais raro que consiste de um nonapeptídeo (R/K)-(L/V/I)-X

-(Q/H)-(L/A)

localizado próximo à porção N-terminal da proteína. Essa seqüência pode variar entre as

espécies, podendo também apresentar algumas modificações (Petriv et al., 2004).

O sinal PTS é reconhecido por receptores no citoplasma, sendo PTS1 reconhecido

por PEX5 e PTS2 por PEX7 (Figura 8). PEX5 tem sido encontrado em todos os organismos

Luciana Loureiro Penha Introdução

analisados, mas PEX7 é aparentemente ausente em Caenorhabditis elegans. Todas as

proteínas encontradas nesse organismo possuem o sinal PTS1, e são encaminhadas via PEX5

(Motley et al., 2000). PEX5 é usualmente um tetrâmero, e o sinal PTS1 interage com a

porção C-terminal do PEX5, que é compreendido por 6 a 7 repetições de tetratricopeptídeos

(TPRs), uma seqüência degenerada de 34 aminoácidos. A característica mais proeminente da

metade N-terminal de todos os PEX5 analisados é a presença de muitas seqüências

pentapeptídeos, WXXXF/Y, que estão envolvidas com a interação de PEX5 com receptores

na membrana da organela. O número dessas repetições varia de 2 em S. cerevisiae, 3 em T.

brucei, 7 em humanos para 11 na planta do tabaco (Gatto et al., 2003). Pouco é conhecido

sobre a interação de PEX7 e proteínas contendo PTS2.

Figura 8- Modelo geral de encaminhamento de proteínas para peroxissomos.

Moyersoen et al., 2004 (com modificações).

Interação proteína receptor

Transporte

Reconhecimento

Translocação

Reciclagem do receptor

Matrix

Citoplasma

Interação proteína receptor

Transporte

Reconhecimento

Translocação

Reciclagem do receptor

Matrix

Citoplasma

Interação proteína receptor

Transporte

Reconhecimento

Translocação

Reciclagem do receptor

Matrix

Citoplasma

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O encaminhamento de proteínas para peroxissomos é diferente do encaminhamento de

proteína que ocorre no retículo endoplasmático, mitocôndria e cloroplastos. A maior

diferença é que as proteínas encaminhadas para o peroxissomos podem estar em sua

conformação tridimensional, proteínas oligomerizadas, ou proteínas sem motivo de

encaminhamento (PTS) associadas a proteínas que possuem o motivo (Glover et al., 1994).

Há alguns exemplos raros de proteínas que não contêm domínios PTS1 ou PTS2, mas

continuam sendo encaminhadas para peroxissomos (Small et al., 1988). Vários estudos têm

mostrado que proteínas contendo sinais de encaminhamento do tipo PTS1 ou PTS2 podem

interagir com outras proteínas desprovidas de sinais do tipo PTS e esses complexos

multiméricos são então transportados para o peroxissomo em leveduras, plantas e células de

mamíferos (Mcnew et al., 1994). Isso sugere a existência de um mecanismo alternativo de

encaminhamento aos peroxissomos caracterizado por transporte indireto. Em S. cerevisiae,

fortes evidências sugerem o encaminhamento da enzima cis-trans-enoyl-CoAisomerase

(Eci1p) por transporte indireto. Nesses estudos, demonstrou-se que após a remoção do sítio

PTS1 da Eci1p, a enzima foi capaz de formar oligômeros com a enzima cis-trans-dienoyl-

CoAisomerase (Dci1p), sendo encaminhada para o interior do peroxissomo (Yang et al.,

2001). Da mesma maneira, foi demonstrado que após a remoção do sinal do tipo PTS da

carnitina acetiltransferase (cat2p) a enzima continuava a ser transportada para o peroxissomo

de maneira dependente de PEX5 (Elgersma et al., 1995). Esses resultados sugerem que, em

alguns casos, seqüências alternativas ou acessórias podem mediar o transporte de proteínas

para o peroxissomo por associação com outras proteínas.

Muitas proteínas podem, ainda, ser encaminhadas para peroxissomos através de uma

seqüência polipeptídica interna do tipo PTS (I-PTS). Klein e colaboradores (2002)

demonstraram a existência de uma via de endereçamento dependente de PEX5 mediada pela

Luciana Loureiro Penha Introdução

interação com o motivo I-PTS localizado internamente na proteína acyl-CoA oxidase (POX1)

em S. cerevisiae. Apesar de POX1 e PEX5 poderem interagir diretamente uma com a outra

sem a participação de outras proteínas, a região de ligação de PEX5 a I-PTS está localizada

numa área interna na porção N-terminal de PEX5, enquanto o sítio de reconhecimento PTS1

é representado por TPRs presentes na extremidade C-terminal. Sendo assim, é possível que I-

PTSs sejam reconhecidos por PEX5 ou PEX7 no citoplasma através de domínios alternativos.

Foi proposto que os motivos I-PTS, ou certas seqüências acessórias, poderiam também

funcionar como um novo sinal de encaminhamento denominado PTS3. Esses sinais

auxiliariam o encaminhamento de proteínas enoveladas, onde provavelmente o sinal de

encaminhamento não deve ser um sinal linear como o PTS1, e sim um sinal conformacional

interno (Klein et al., 2002). Além disso, a interação direta entre PEX5 ou PEX7, os autênticos

receptores de encaminhamento, e proteínas contendo I-PTS, não parece ser o único

mecanismo de encaminhamento ao peroxissomo (Michels et al., 2005). Futuros estudos

deverão revelar os detalhes da estrutura desses sinais.

10- Glicossomos

Os glicossomos são organelas do tipo peroxissomo, encontradas apenas em

tripanosomatídeos, e que contém a maior parte dos componentes da via glicolítica. Essas

organelas são peroxissomos autênticos, como pode ser inferido por diferentes critérios: (1)

glicossomos, como outros membros da família peroxissomos (microcorpos em leveduras e

glioxissomos em plantas) são constituídos por uma matriz protéica, que pode conter

cristalóides, limitados por uma única membrana; (2) não contêm DNA nem ribossomos; (3)

além das enzimas da via glicolítica, possuem as enzimas para a oxidação de ácidos graxos e

biossíntese de éter-lipídeos e (4) como outros membros da família peroxissomos, possuem

Luciana Loureiro Penha Introdução

homólogos para o processo de biogênese (Opperdoes, 1987). Cada parasito possui numerosos

glicossomos, que não são responsáveis apenas pela glicólise (Opperdoes e Borst, 1977), mas

também pela biossíntese de éter-lipídeos (Heise e Opperdoes, 1997), pela -oxidação de

ácidos graxos (Terlecky et al., 1996) e na salvatação de purinas (van Roermund et al., 1998).

A diferença entre essas duas organelas (peroxissomos e glicossomos) seria a presença dos

componentes da via glicolítica, da última etapa na biossíntese de pirimidinas e da salvação de

purinas no glicossomo (Parson et al., 2004). Análises por espectrometria de massas

confirmaram a presença dessas proteínas e vias no glicossomo. Em T. brucei brucei

nenhuma enzima envolvida em -oxidação foi encontrada nos glicossomos das formas

procíclicas ou sanguíneas (Colasante et al., 2006).

É proposto que um organismo ancestral da ordem Kinetoplastida adquiriu a

capacidade de compartimentalização da maior parte da via glicolítica no interior de

peroxissomos (Hannaert e Michels, 1994). A simulação computacional do metabolismo de

acúçares na forma sanguínea de T. brucei tem tentado explicar porque a

compartimentalização das enzimas da via glicolítica em glicosomas é essencial, elucidando a

possível função desta organela. A análise computacional baseia-se em duas premissas: (1) a

de que a membrana glicossomal é pouco permeável à maioria dos intermediários glicolíticos,

como nucleotídeos adenosina difosfato (ADP) e adenosina trifosfato (ATP), e (2) a de que

essas enzimas são mantidas compartimentalizadas pela falta de atividade regulatória,

principalmente das enzimas hexoquinase e fosfofrutoquinase, que são reguladas por seus

produtos de reação, na maioria dos organismos. A ausência de sua regulação poderia causar o

acúmulo indesejável de intermediários metabólicos que seriam tóxicos à célula. A

concentração de ATP/ADP no interior do glicossomo, de acordo com a simulação

computacional, é normalmente pequena, mantendo a atividade da hexoquinase e

fosfofrutoquinase reduzida e, principalmente, a concentração de hexoses fosfato reduzida. Se

Luciana Loureiro Penha Introdução

as enzimas estivessem em contato com as altas taxas de ATP/ADP do citoplasma, suas

atividades poderiam ser irrestritas, gerando o acúmulo de seus produtos. Logo, a análise

computacional suporta a hipótese de que a compartimentalização da glicólise compensaria a

ausência de regulação dessas enzimas, e a compartimentalização dessa via em uma organela

com membrana pouco permeável a solutos seria vital ao parasito (Moyersoen et al., 2004).

A forma procíclica de T. brucei não foi viável com a deleção do gene que codifica

para PEX14, através da técnica de RNAi, apenas quando crescidos em meio com glucose

(Kessler e Parson, 2005). Outros modelos de estudo computacionais propuseram que a

glucose poderia ser tóxica para o T. brucei na ausência de compartimentalização glicossomal

por causa da ausência de regulação das enzimas hexoquinase (HK) e fosfofrutoquinase

(PFK). Para testar essa hipótese os autores Kessler e Parsons (2005) realizaram o RNAi duplo

para hexoquinase e PEX14. Esses parasitos foram viáveis na presença de glucose, reduzindo

o fenótipo letal do mutante para PEX14, indicando que com a diminuição da atividade da

hexoquinase ocorre uma diminuição do efeito tóxico causado pela glucose. Nesse mesmo

trabalho também foi realizado o RNAi de PEX14 e fosfofrutoquinase e ao contrário do

fenótipo observado com a deleção de HK, o parasito foi sensível a glucose, diminuindo a

viabilidade do parasito, levando-o à morte. Esse fenótipo não foi uma surpresa já que o T.

brucei mutante somente para PFK já apresentou um fenótipo letal na presença de glucose.

Esses resultados sugerem que o glicossomo proporciona uma significativa, porém

incompleta, proteção aos efeitos tóxicos da glicólise nos tripanossomas.

Os eucariotos utilizam dois mecanismos distintos de degradação, o sistema de

ubiquitina-proteossomo e a autofagia. Duas formas de autofagia são encontradas em

eucariotos multicelulares e em leveduras, a microautofagia e macroautofagia. A autofagia do

peroxissomo é denominada pexofagia. Tem sido observado que o conteúdo, número e

Luciana Loureiro Penha Introdução

tamanho dos peroxissomos podem variar significamente durante as mudanças no

desenvolvimento. Leveduras como Hansenula polymorpha (Leão et al., 2003) e Pichia

pastoris (Sakai et al., 1998), que sob certas condições crescem com metanol como fonte de

carbono, têm o peroxissomo ocupando a maior parte do volume celular. Os peroxissomos

possuem um conjunto de enzimas que são essenciais apenas em condições específicas de

crescimento, quando ocorre algum tipo de mudança. Na mudança da fonte de carbono, os

peroxissomos velhos são rapidamente e eficientemente degradados por pexofagia, sendo que

novos peroxissomos, com diferentes conteúdos de enzimas, são sintetizados (Farré et al.,

2004). A degradação do peroxissomo pode ocorrer tanto por macro como por micropexofagia

(Figura 9), fenômeno já descrito em S. cerevisiae (Mukaiyama et al., 2004), H. polymorpha

(Stasyket et al., 2007) e P. pastoris (Chang et al., 2005).

Herman e colaboradores (2006) através de análise computacional, utilizando o

genoma de Leishmania e Trypanosoma propuseram que genes putativos poderiam codificar

enzimas necessárias ao processo de pexofagia, utilizando como base os genes que codificam

essas proteínas em levedura. Os autores concluíram que os tripanosomatídeos possuem um

conjunto completo de proteínas necessário para programar a autofagia do glicossomo, por um

processo análogo à pexofagia. Esse processo parece ser essencial para a viabilidade dos

tripanossomatídeos, sendo um processo ainda pouco estudado. A interferência nesse processo

poderia ser usada como possível alvo para o desenho de novas drogas, já que a identidade

entre as proteínas que participam desse processo em tripanossomatídeos e humanos é

relativamente baixa, variando de 26% até 46%, dependendo da proteína.

Luciana Loureiro Penha Introdução

Retículo

endoplasmático

Fusão

Glicossomo

Proliferação

Inserção de proteínas

de membrana

Importação de

proteínas para matrix

Microautofagia

Macroautofagia

Condições alteradas,

desenvolvimento de

novos glicossomos,

indução da pexofagia

Lisossomos

Retículo

endoplasmático

Fusão

Glicossomo

Proliferação

Inserção de proteínas

de membrana

Importação de

proteínas para matrix

Microautofagia

Macroautofagia

Condições alteradas,

desenvolvimento de

novos glicossomos,

indução da pexofagia

Lisossomos

Figura 9- Modelo do “turnover” de glicossomos. Michels et al., 2006 (com

modificações).

Enzimas glicossomais são sintetizadas em ribossomas livres no citoplasma e

transportados para o interior da organela. Os polipeptídeos transportados ao glicossomo são

sintetizados já com tamanho final, sem ser detectada quebra proteolítica ou modificação

secundária, como fosforilação, glicosilação ou adição de lipídeos. O tempo de vida médio de

algumas enzimas glicolíticas em T. brucei no citoplasma, antes de serem encaminhadas ao

glicossomo foi medido, e é em torno de 1,0- 3,4 minutos, sendo, portanto, o encaminhamento

para o glicossomo um processo relativamente rápido. Esses valores são comparáveis ao

tempo descrito para a translocação mais rápida de proteína de leveduras para os peroxissomos

(Subramani, 1992).

Luciana Loureiro Penha Introdução

11- Endereçamento de proteínas para glicossomos

A caracterização de proteínas envolvidas no direcionamento para o glicossomo

demonstrou a existência de diversas proteínas PEX em tripanosomatídeos. Essas proteínas

são essenciais para o T. brucei e para L. donovani (Flaspohler et al., 1999; Furuya et al.,

2002; Guerra-Giraldez et al., 2002; Moyersoen et al., 2003; Krazy e Michels, 2006), em

contraste com outros organismos, onde peroxinas não são essenciais para o crescimento

celular (Eckert e Erdmann, 2003). Acredita-se que a falta de viabilidade celular na ausência

de PEX reflete a necessidade da compartimentalização da glicólise no parasito (Furuya et al.,

2002). Dentre as 30 peroxinas já identificadas em mamíferos e leveduras, apenas uma

pequena fração foi identificada em tripanossomatídeos, e mesmo assim, somente uma delas

(PEX2) pôde ser identificada com base em pesquisa por homologia (Flaspohler et al., 1997)

dada à pequena identidade entre essas proteínas. Como exemplo de algumas PEXs estudadas

em tripanossomatídeos, as PEX5 e PEX14 de T. brucei e L. donovani foram clonadas e

caracterizadas e suas interações com algumas proteínas glicossomais foram demonstradas

bioquimicamente (Madrid e Jardim, 2005). Estudos semelhantes foram feitos com PEX5 e

PEX7 de T. brucei (Galland et al., 2007). Flaspohler e colaboradores (1999) tentaram a

deleção do gene que codificava a proteína PEX2 em L. donovani, porém os parasitos não

foram viáveis, sugerindo que esse gene seja essencial. O mesmo ocorreu com gene que

codifica PEX11 (Lorenz et al., 1998) e PEX14 (Furuya et al., 2002) em T. brucei.

A maioria das enzimas glicossomais analisadas em T. brucei e Leishmania

apresentam o sinal PTS1, algumas apresentam o sinal PTS2 e um pequeno número de

proteínas não apresentam sinal detectável que possa ser responsável pelo encaminhamento da

proteína. A análise computacional utilizando o projeto genoma de tripanossomatídeos revelou

a presença de aproximadamente 250 proteínas putativas contendo o consenso PTS, sendo

Luciana Loureiro Penha Introdução

consideradas proteínas glicossomais putativas. Aproximadamente, 2/3 das proteínas

apresentam o sinal PTS1 e 1/3 apresentam o sinal PTS2 (Opperdoes e Skikora, 2006).

Duas enzimas glicolíticas de T. brucei apresentaram um sinal I-PTS de

encaminhamento para glicossomo. A isoenzima fosfoglicerato quinase (PGK-A) minoritária

glicossomal é encaminhada para o glicossomo por uma seqüência interna localizada entre os

aminoácidos 24 e 91 da proteína (Peterson et al., 1997). A trifosfato isomerase (TIM) do T.

brucei é encaminhada para glicossomas por uma seqüência interna de 22 aminoácidos.

Existem três isoformas de PGK no T. brucei, uma PGK glicossomal (PGKg) que

possui um motivo de encaminhamento PTS-I (SSL) na extremidade C-terminal da proteína,

uma PGK citoplasmática (PGKc) que é mais abundante na forma procíclica, e uma PGK

glicossomal menor (PGK56) que é constitutivamente expressa em baixos níveis. O possível

papel dessa PGK menor, não é conhecido, no entanto, ela possui atividade enzimática e,

aparentemente, está conservada em todos os organismos que possuem glicossomo (Parker et

al., 1995). A identidade entre a PGKc e PGKg é de 95%, com a ausência do SSL no C-

terminal da proteína. Já a PGK56 possui 60% de identidade com as outras isoformas,

apresentando semelhanças nos 8 aminoácidos na extensão C-terminal e 80 aminoácidos de

inserção únicos dessa proteína. Peterson e colaboradores (1997) demonstraram que com a

deleção dos 13 primeiros aminoácidos de PGK56, assim como a deleção dos 24 primeiros

aminoácidos, essa proteína continuou sendo encaminhada para glicossomo. Após a deleção

dos primeiros 91 aminoácidos a proteína manteve-se no citoplasma, sugerindo que o motivo

de encaminhamento da proteína esteja contido entre os aminoácidos 24 e 91. No entanto, a

presença dos 91 aminoácidos não foi capaz de encaminhar a proteína repórter luciferase para

o glicossomo. Os autores sugerem:(1) que esse sinal, em caso de sinal linear, não tenha sido

exposto ou formado, em caso de sinal conformacional; (2) os primeiros 91 aminoácidos

Luciana Loureiro Penha Introdução

sozinhos não contenham a região completa de encaminhamento, necessitando de uma

seqüência comum a PGK56 e PGKc e que seja necessária também para o encaminhamento;

(3) que a PGK56 não contenha nenhum motivo de endereçamento, sendo encaminhada em

associação com outra proteína que contenha o motivo, sendo os 91 primeiros aminoácidos

possíveis de conter a subunidade que é necessária à possível associação.

O peptídeo compreendido pelos resíduos de aminoácidos 140 a 161, dos 250 resíduos

da proteína TIM, foi demonstrado ser suficiente e necessário para direcionar a proteína

repórter cloranfenicol acetil transferase para o glicossomo, quando fusionado na porção N-

terminal. O peptídeo correspondente da proteína TIM de S. cerevisiae não direcionou a

proteína para glicossomo, sugerindo que tripanossomatídeos possam conter moléculas

transportadoras alternativas ainda não carcaterizadas. Nos tripanossomatídeos (T. brucei, T.

cruzi e L. mexicana) a seqüência peptídica dos aminoácidos 140 a 161 da proteína TIM

apresenta alguns aminoácidos específicos, que são conservados apenas em

tripanossomatídeos e a inserção de 2 aminoácidos, podendo ser esses aminoácidos

responsáveis pelo endereçamento da proteína TIM para glicossomos em tripanossomatídeos

(De Walque et al., dado não publicado). Michels e colaboradores (2004) propõem que esse

peptídeo está localizado em uma alça exposta da molécula, que seria responsável pela

interação com uma proteína de encaminhamento ainda não caracterizada. Essa proteína

poderia ser uma peroxina ou outra proteína glicossomal que encaminharia a proteína TIM

para o interior do glicossomo por transporte indireto.

Neste trabalho demonstramos que a TcPGM encontra-se no interior de glicossomos

em todos os estágios de desenvolvimento do parasito, sugerindo que o metabolismo de Glc-

6P e Glc-1P em T. cruzi difere de outros eucariotos que possuem a PGM localizada no

citoplasma. Além disso, na TcPGM não há o consenso clássico de endereçamento para

Luciana Loureiro Penha Introdução

glicossomo, indicando que a PGM de T. cruzi seja encaminhada para essa organela por um

mecanismo alternativo ainda não caracterizado.

Luciana Loureiro Penha Objetivos

Esta tese visa investigar a localização sub-celular da PGM de T. cruzi (TcPGM) e as

bases moleculares e celulares do transporte da TcPGM para glicossomas em epimastigotas,

utilizando parasitos geneticamente modificados. A TcPGM é uma enzima essencial para a

biossíntese de glicoconjugados no T. cruzi, constituindo um potencial alvo para a ação de

quimioterápicos. Apesar de apresentar semelhanças na estrutura primária com a PGM de

mamíferos e leveduras, dados na literatura demonstraram que algumas enzimas do

metabolismo de açúcares em tripanosomatídeos estão localizadas no interior do glicossomo

(Roper et al., 2005). Esta afirmativa nos motivou a pesquisar a localização da TcPGM que

poderia estar localizada no glicossomo, sítio distinto da PGM de mamíferos. Apesar do

transporte de moléculas para glicossomos ser bastante estudado em T. brucei, pouco se

conhece sobre o endereçamento de compostos para os glicossomos em T. cruzi. O estudo do

metabolismo da galactose em T. cruzi, a continuação dos estudos moleculares da TcPGM e a

caracterização dos mecanismos envolvidos em seu endereçamento aos glicossomos,

permitirão a melhor compreensão da bioquímica deste parasito, a descoberta de novos alvos

para a ação de quimioterápicos e um avanço nos estudos genômicos, proteômicos e

glicômicos do T. cruzi. Para isto, os objetivos específicos a serem alcançados nesta tese são:

1) Estudar molecularmente a PGM em diferentes cepas de T. cruzi;

2) Estudar a localização sub-celular da TcPGM e sua associação a glicossomos;

3) Estudar as vias de endereçamento da TcPGM aos glicossomos.

Luciana Loureiro Penha Metodologia

1- Cultivo dos parasitos

Neste trabalho foram utilizados as cepa Dm28c, G, X10/6, Y, CLBrener e Tulahen de

T. cruzi. As formas epimastigotas foram mantidas axenicamente em meio LIT (infusão de

fígado e triptose) suplementado com 1 µg/mL de hemina e 10 µg/mL de ácido fólico,

contendo 10% de soro fetal bovino. Tripomastigotas de cultura foram obtidos do

sobrenadante de monocamadas de células LLCMK2 infectadas, cultivados em meio

Dulbeco’s, suplementado com 2% de soro fetal bovino (GIBCO), em atmosfera úmida,

contendo 5% CO

a 37 °C. Os tripomastigotas foram coletados e lavados por centrifugação

duas vezes em solução salina antes do uso. Formas amastigotas extracelulares foram obtidas a

partir de culturas de LLCMK2 infectadas e mantidas em meio Dulbeco`s, suplementado com

2 % de soro fetal bovino (GIBCO) em estufa seca a 37°C, em garrafas vedadas com

parafilme. Após 48 h de incubação os amastigotas foram recolhidos do sobrenadante.

Promastigotas de L. major cepa selvagem foram cultivados em meio Homem (Invitrogen)

contendo 10 % de soro fetal bovino a 28 º C. As culturas foram repicadas duas vezes por

semana com inóculo de 10

parasitos por mL.

2- Extração de DNA genômico de epimastigotas

O DNA de epimastigotas foi extraído seguindo a metodologia de Morel (1983). Uma

massa de células (aproximadamente 1,2x10

parasitos) foi lavada em tampão fosfato 20 mM,

NaCl 150 mM pH 7,2 (PBS) e o precipitado obtido após centrifugação a 3000 x g foi

ressuspenso em NaCl 0,15 M, contendo EDTA 0,1 M pH 8,0 e proteinase K (100 µg/mL).

Em seguida, adicionou-se 0,5% de sarcosyl e 10 µg/mL RNAse H e incubou-se por 3 h a 50

Luciana Loureiro Penha Metodologia

°C. A preparação foi submetida a extrações com fenol/clorofórmio (1:1, saturado em Tris-

HCl) até o desaparecimento do material precipitado e esbranquiçado da interface, seguindo-

se diálise em tampão TE (Tris 10 mM pH 8,0 e EDTA 1 mM) por 24 h. Após a diálise, a

amostra foi precipitada com NaOAc 0,3 M, 7 0% de etanol por 10min a -70 °C, o precipitado

foi separado por centrifugação a 10000 x g e ressuspenso em água mili-Q. A concentração de

DNA total foi determinada de acordo por absorbância a 260 nm em espectrofotômetria.

3- Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)

Tabela 1: Temperaturas de anelamento (T

) dos oligonucleotídeos utilizados na reação de

PCR.

LIGONUCLEOTÍDEOS SEQÜÊNCIA T

Start (senso) 5´ CGGAATTCATGAATCTGGGCGAAACCC 3´

52°C

Stop (antisenso) 5´ CGCTCGAGTCAAGTGATGACTGTGGGGGCG 3´

52°C

PGMF (senso) 5´ TCCCCCGGGATGAATCTGGGCGAAACCCAG 3´

65°C

CTRI (antisenso) 5´ CGGAATTCCCCAATGGCATTAAAAG 3´

61°C

CTRII (antisenso) 5´ CGGAATTCGCACAAAGCACTTTCTG 3´

64°C

CTRIII (antisenso) 5´ CGGAATTCCCAACCTGTGGGAACTTC 3´

66°C

CTRIV (antisenso) 5´ CGGAATTCATGCCGTGCTACGGCATTGGG 3´

65°C

FullPGM (antisenso) 5´ CGGAATTCAGTGATGACTGTGGGGGCG 3´

59°C

GFPF (senso) 5´ GAATTCATGGTGAGCAAGGGCGA 3´

65°C

GFPR (antisenso) 5´ GTCGACTTACTTGTACAGCTCGTC 3´

59°C

GAATTC Sítio de enzima de restrição EcoRI

CTCGAG Sítio de enzima de restrição XhoI

CCCGGG Sito de enzima de restrição SmaI

GTCGAC Sítio de enzima de restrição SalI

Luciana Loureiro Penha Metodologia

Para a reação de PCR foi utilizado 1 µg de DNA genômico juntamente com 0,3 µM

de cada oligonucleotídeo, 200 µM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl

, 1x tampão de PCR Phusion,

1 pmol de cada oligonucleotídeo e 1 U de Phusion DNA polimerase (Invitrogen) em volume

final de reação de 50 µL. A reação foi realizada em termociclador modelo MWG AG

(Bistech, Inc.) programado para desnaturação inicial de 94 °C por 30 s, seguida por 30 ciclos

de desnaturação (98 °C/5-10 s), anelamento (temperaturas de acordo com tabela 1/10-30 s) e

extensão (72°C/15-30 s) mais uma extensão final de 10 min a 72 °C.

4- Eletroforese em gel de agarose

As preparações de DNA foram submetidas à corrida eletroforética em gel de

agarose (Sigma Chemical Co, USA) 0,8 % em tampão TAE (Tris-acetato 20 mM, EDTA

0,5 M) a 100 V.cm

-2

. Os géis foram corados com brometo de etídeo 0,5 µg/mL. O

fracionamento do DNA foi visualizado através da fluorescência emitida pelo brometo de

etídeo associado ao DNA quando exposto à radiação ultra-violeta de onda curta

(Sambrook et al. 1989, com modificações).

5- Seqüenciamento e análise de seqüências nucleotídicas

O DNA foi seqüenciado em seqüenciador automático API-3100 (Applied Biosystems)

utilizando-se o protocolo de seqüenciamento (Applied Biosystems), de acordo com as

recomendações do fabricante. As seqüências obtidas foram analisadas pelo software

DNASTAR. A busca por seqüências homólogas, nucleotídicas e peptídicas, foram realizadas

Luciana Loureiro Penha Metodologia

no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov

), no Projeto Genoma de parasitos

(http://www.tigr.org

) ou (http://www.genedb.org), utilizando o algoritmo BLAST (Altschul

et al., 1997). Os alinhamentos das seqüências foram realizados utilizando o programa

ClustalW (http://www.expasy.org

6- Clonagem

A região codificante completa do gene pgm de T. cruzi foi obtida a partir de reação de

PCR tendo o DNA genômico do parasito como molde e os oligonucleotídeos Start e Stop

como iniciadores. Em seguida, o produto de PCR foi purificado a partir de gel de agarose

utilizando-se o kit Gene Clean II (Bio101) e submetido a uma reação de adição de terminação

adenosina livre (“3’ A-overhangs”), por 15 min a 72

C na presença de 50 nmol do

desoxirribonucleotídeo adenina e 0,5 U da enzima Taq polimerase. Posteriormente, o

fragmento foi ligado ao vetor de clonagem pCR4-TOPO (Invitrogen).

7- Indução de competência de bactérias

As células competentes foram preparadas a partir de estoque de Escherichia coli

DH5 [F- supE44 lacU169 (ø80 lacZM15)hsdR17 (r

–, m

–) recA1 endA1gyrA96 thi–1

relA1], Escherichia coli BL21(D3) e Escherichia coli K12. Uma colônia de cada bactéria

foi coletada e crescida em 5 mL de meio LB (Bacto-Tiptona 1,0 %, extrato de levedura 0,5

%, NaCl 1,0 %) por 16 h a 37

C, sob agitação constante. Em seguida, 1 mL da cultura

crescida foi inoculado em 200 mL de meio LB e incubado por 2-3 h a 37

C sob agitação

(300 rpm) até atingir a OD

600

= 0,2. As células foram então transferidas para tubos de

Luciana Loureiro Penha Metodologia

centrífuga e incubadas por 10 min no gelo, centrifugadas a 7.000 x g por 5 min e

cuidadosamente ressuspensas em 1/5 do volume inicial (40 mL) de MgCl

100mM.

Posteriormente as bactérias foram incubadas no gelo por 20 min, centrifugadas a 7000 x g por

5 min e ressuspensas cuidadosamente em 8 mL de CaCl

100 mM no gelo. Foram então

adicionados 2 mL de glicerol 80 % (v/v) estéril à suspensão bacteriana, a qual foi distribuída

em tubos Eppendorf e utilizadas imediatamente ou armazenadas a –70

8- Transformação de E.coli

A transformação foi induzida adicionando-se 2 µL da reação de ligação de interesse

em 100 µL de E. coli (DH5α, K12 ou Bl21(D3)) competente, seguindo-se de incubação em

banho de gelo por 30 min. Após choque térmico por 2 min a 42 °C e incubação em banho de

gelo por 2 min, as células foram recuperadas adicionando-se 800 µL de meio LB e mantendo

a cultura por 1 h a 37 °C. Após sedimentação das células por centrifugação (1 min a 12000 x

g), as bactérias ressuspensas em 100 µL de meio LB foram plaqueadas em meio LB sólido

contendo 100 µg/mL de ampicilina ou 15 µg/mL kanamicina (Sigma Chemical Co.) para

seleção dos transformantes (Sambrook et al. 1989, com modificações).

9- Clonagem em vetores de expressão

Plasmídeos pCR4-TOPO, contendo o gene completo para a PGM de T. cruzi e os

vetores de expressão pET-28a(+) (Novagen) foram digeridos com as endonucleases EcoRI e

XhoI (New England Biolabs). A ligação do fragmento liberado pelo pCR4-TOPO nos vetores

de expressão foi feita com a enzima T

DNA ligase (Promega), por 18 h à temperatura

Luciana Loureiro Penha Metodologia

ambiente. A transformação foi realizada em E. coli DH5α e a verificação dos clones

positivos concluída através de extração de plasmídeos por lise alcalina.

Para clonagem dos fragmentos de PCR com as diferentes construções a serem

inseridas no plasmídeo pTEX (Kelly et al., 1992), os fragmentos obtidos após realização do

PCR foram purificados utilizando-se o kit Gene Clean II (Bio101) e digeridos com as

enzimas SmaI e EcoRI. Após digestão, os fragmentos foram novamente purificados e

clonados no plasmídeo pTEX com o gene que codifica para a “Green fluorescent protein”

(GFP) já inserido nos sítios de EcoRI e SalI do plasmídeo.

PGM GFPPGM GFP

Figura 10- Múltiplo sítio de clonagem do plasmídeo pTEX (Kelly et al., 1992). Em

vermelho, sítios onde as diferentes construções gênicas que codificam para PGM foram

clonadas (SmaI/EcoRI), e em verde sítios onde o gene que codifica para GFP foi clonado

(EcoRI/SalI).

Luciana Loureiro Penha Metodologia

Lise alcalina para extração de plasmídeos

As bactérias transformadas com plasmídeos de interesse foram cultivadas em 3 mL de

meio LB contendo 100 µg/mL de ampicilina ou 15 µg/mL kanamicina por 18h a 37 °C sob

agitação. Posteriormente 1 mL das células foram sedimentados por centrifugação a 12000 x g

por 1 min. O precipitado foi ressuspenso em 100 µL da solução I (0,9% de glicerol 20%, 10

mM de EDTA 0,5 M pH 8,0, 25 mM de Tris-HCl 1 M pH 8,0). A solução II (10% SDS 10%,

20% NaOH 1 N) foi preparada para o uso imediato, e foram adicionados 200 µL da soluçãoII

à suspensão de células. Em seguida 150 µL da solução III (60% KAc 5 M, 11,5% ác. acético)

foram adicionados e a mistura incubada por 10 min em banho de gelo. Logo após, a

suspensão obtida foi centrifugada, sendo o DNA plasmidial obtido no sobrenadante

submetido à extração com fenol-clorofórmio e a fase aquosa transferida para um novo tubo,

onde foram adicionados 20 µL de acetato de sódio (NaOAc) 3 M e 250 µL de etanol (Merck)

e incubado a -70 °C por 15 min. O material precipitado foi lavado com etanol 70% e

ressuspendido em 30 µL de H

OmilliQ (Sambrook et al. 1989, com modificações). Para

preparações de DNA plasmidial em larga escala foi utilizado kit de Maxi-prep do fabricante

Quiagen.

10- Eletroforese em gel de poliacrilamida

Os extratos totais (100 µg de proteína) foram homogenizados em solução contendo

tampão 100 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 10% 2-β-mercaptoetanol, 0,012% glicerol e azul

de bromofenol (tampão de amostra). As amostras foram fervidas por 5 min e submetidas a

SDS-PAGE 11% para separação eletroforética. Os géis foram corados e fixados

Luciana Loureiro Penha Metodologia

mergulhando-os em solução de Azul de Comassie e posteriormente mergulhados em solução

descorante I (50% metanol, 10% ác. acético) e solução descorante II (5% metanol, 7% ác.

acético). Para secagem o gel foi mergulhado em solução de secagem (40% metanol e 3%

glicerol) e preso entre folhas de papel celofane por aproximadamente 48 h.

11- Expressão e purificação da PGM recombinante

A expressão foi realizada conforme protocolo do fabricante do plasmídeo pET-28a(+)

(Novagen), deixando a cultura atingir uma OD

600nm

de 0,6 em meio LB com 15 µg/mL de

kanamicina, para serem induzidas com 400 mM de IPTG por 3 h a 28 ºC.

As células foram coletadas por centrifugação, lavadas com tampão PBS (20 mM

fosfato de sódio, 150 mM NaCl pH 7,2) e solubilizadas em tampão 20 mM Tris-HCl 200 mM

NaCl pH 8,0 contendo os inibibores de protease (30 µm E-64, 0,5 mM PMSF, 2 µg/mL

leupeptina, 1mM EDTA, 2 µg/mL pepstatina). As bactérias foram rompidas após adição de 1

mg/mL de lisozima, por sonicação a uma eficiência de 20% com 6 repetições de pulsos por

10 s com pausas entre cada pulso de 10 s no gelo. Após lise, o material foi centrifugado a

16.000 x g por 20 min, e amostras do pellet e sobrenadante foram dissolvidos em tampão de

amostra (100mM Tris-HCl pH6,8, 2% SDS, 10% 2-β-mercaptoetanol, 0,012% glicerol e azul

de bromofenol) para serem resolvidos em SDS-PAGE 11%. A eletroforese foi realizada a 25

mA em tampão Tris-glicina (Tris HCl 25 mM pH 8,3; glicina 191 mM; SDS 0,1%) até que o

corante atingisse o fim do gel. Para a visualização das proteínas, logo após a corrida, o gel foi

corado em azul de comassie (comassie blue R250 0,2% p/v; metanol 45% v/v; ácido acético

10% v/v) sob agitação à temperatura ambiente por cerca de 16 h e descorado em 40%

metanol v/v, 10% v/v ácido acético.

Luciana Loureiro Penha Metodologia

Para purificação do corpo de inclusão de acordo com protocolo do plasmídeo

pET28a(+) após lise das bactérias por sonicação o material foi centrifugado a 5000 x g por 15

min a 4ºC, o sobrenadante foi retirado e o corpo de inclusão foi lavado 2 vezes com tampão

PBS antes de serem ressuspensos em tampão 10 mM Tris-HCl, 100 mM N

, 8 M uréia,

pH 8,0.

A proteína de fusão foi purificada em resina de afinidade níquel-agarose (Quiagen),

tendo o plasmídeo pET28a(+) uma extensão de poli-histidinas no N-terminal da proteína

recombinante. O extrato da bactéria obtido foi incubado por 30 min a temperatura ambiente

com resina de níquel/NTA-agarose previamente equilibrada em tampão 10 mM Tris-HCl,

100 mM N

, 8 M uréia, pH 8,0. A resina ligada foi então carregada em uma coluna de

cromatografia, lavada com mesmo tampão anterior acrescido de 25 mM de imidazol (10

volumes) e eluída com o mesmo tampão contendo 1 M de imidazol (Merk). Alíquotas de

todas as etapas de purificação foram coletadas, diluídas em igual volume de tampão de

amostra e analisadas por SDS-PAGE. A proteína purificada foi dosada através do método de

Bradford, utilizando o kit Dc-bioassay (Biorad) (Bergmeyer, 1986).

12- Produção de anticorpos policlonais

A imunização foi feita na região lombar do coelho por via sub-cutânea com 400 µg de

PGM recombinante, diluída 1:1 em adjuvante completo de Freund. Após 30 e 45 dias os

animais receberam reforços de imunização com a mesma quantidade de PGM diluída em

adjuvante incompleto de Freund. Dez dias após o último reforço os animais foram sangrados

e o soro policlonal coletado. Para a obtenção do soro foi utilizado o sistema BD Vacutainer.

Luciana Loureiro Penha Metodologia

As amostras de proteína purificadas foram também utilizadas na imunização de 10

camundongos Balb/C com 2 meses e meio de idade. Cada camundongo sofreu uma primeira

imunização com, aproximadamente, 50 µg de proteína diluída 1:1 em adjuvante completo de

Freund. Após 2 semanas os animais receberam reforço de imunização com a mesma

quantidade de PGM diluída em adjuvante incompleto de Freund, e se repetiu após mais 2

semanas. Dez dias após a última imunização os camundongos tiveram seu sangue coletado

para purificação do soro.

Os soros foram utilizados em ensaios preliminares de Western Blot para determinação

da titulação ideal a ser usada. Foram feitas inicialmente diluições de 1:500, 1:1000, 1:2000,

1:3000, 1:4000 e 1:5000 do soro em tampão PBS, que foram utilizados em membranas de

nitrocelulose (Amershan) cortadas em tiras de 1 cm de largura (Olmsted, 1981; revisado por

Pringle et al., 1991) com 100 µg de extrato total da forma epimastigotas de T.cruzi em cada

tira.

13- Purificação dos soros contendo anticorpos anti-PGM

Os soros produzidos em coelho e camundongo foram purificados contra extrato

protéicos de bactéria. Extratos protéicos de E. coli Bl21(D3) foram submetidos à SDS-

PAGE 11%. Ao final da corrida o gel, foi transferido para membrana de nitrocelulose. A

membrana foi cortada em tiras (1 cm) e foram incubados em PBS, leite desnatado 5% p/v à

temperatura ambiente por 1 h para que ocorresse o bloqueio de sítios inespecíficos. Os soros

de camundongo e coelho foram adicionados aos filtros e incubados por 16 h a 4ºC sob

agitação. Os anticorpos que permaneceram em solução, não tendo se ligado ao filtro

Luciana Loureiro Penha Metodologia

formaram a fração de nosso interesse. As frações foram utilizadas em ensaios de Western

Blot.

Para purificação do anticorpo por afinidade, o material contendo o corpo de inclusão

foi aplicado SDS-PAGE 11%, transferido para membrana de nitrocelulose, e corados por

solução de Ponceau. A região da nitrocelulose que continha a proteína recombinante foi

cortada com auxílio de um bisturi, em uma pequena tira de membrana. Essa foi bloqueada

em solução PBS BSA 3% (albumina de soro bovino-Sigma) à temperatura ambiente por 1 h.

Os soros de coelho e camundongos foram adicionados às tiras de nitrocelulose por 48 h a 4ºC

com agitação. Após esse período, as tiras de nitrocelulose foram lavadas por 3 vezes com

PBS, e os anticorpos específicos para a proteína recombinante foram eluídos da membrana à

temperatura ambiente por 8 min com glicina 0,2M; EDTA 1mM pH 4,0 e coletados em um

tubo previamente resfriado contendo solução de Tris-base 10 mM em volume suficiente para

neutralização da solução resultante. Tal fração de anticorpos purificados foi utilizada em

ensaios de Western Blot e imunofluorescência.

14- Análise por Western Blot

Para análise por Western blot as proteínas foram transferidas para membranas de

nitrocelulose de 0,45µm (BioRad) segundo o método de Towbin e colaboradores (1979).

Após a transferência eletroforética, as membranas foram incubadas a 4

C por 1 a 16 h em

tampão de bloqueio [Tris 10mM, NaCl 190mM, Tween 20 0,1% (v/v), leite em pó desnatado

9% (v/v)]. Foram realizadas repetidas lavagens em tampão TBST [Tris 10mM, NaCl 190mM,

Tween 20 0,1% (v/v)]. As membranas foram então incubadas por 1 h sob agitação suave com

o soro policlonal PGM diluído 1:2000 em tampão de bloqueio, subseqüentemente incubadas

Luciana Loureiro Penha Metodologia

por mais 1 h sob agitação com o anticorpo secundário α-IgG de coelho ou camundongo

conjugado a fosfatase alcalina (Sigma Chemical Co.) diluído 1:10000 em tampão de

bloqueio, e lavadas repetidas vezes em TBST. O produto resultante foi revelado por

incubação das membranas com o substrato da fosfatase alcalina NBT/BCIP (Sigma Chemical

Co.). A reação foi parada com H

O destilada.

15- Reutilização de membranas de nitrocelulose em Western Blot

As membranas de nitrocelulose previamente utilizadas em ensaios de Western Blot

foram submetidas a tratamento para retirada dos anticorpos primários e secundários para que

pudessem ser reutilizadas. As membranas foram mantidas a 50 °C por 30 min em solução de

-mercaptoetanol 100 mM, SDS 2%, Tris HCl 62,5 mM pH 6,7. Em seguidas, foram lavadas

2 vezes, sob agitação, TBS-Tween 0,05% v/v à temperatura ambiente por 10 minutos.

Finalmente, as membranas foram colocadas em TBS-Tween 0,05% v/v, leite desnatado 9%

p/v por 1 h sob agitação, à temperatura ambiente, para que pudessem reutilizadas.

16- Fracionamento sub-celular dos epimastigotas

O fracionamento sub-celular dos epimastigotas foi elaborado pelo grupo de Cunha-e-

Silva e colaboradores (2002) para o isolamento de reservossomos. 10

parasitos em fase

logarítmica de crescimento foram centrifugados e lavados 2 vezes em tampão TMS (20 mM

Tris-HCl pH 7.2, contendo 2 mM MgCl

e 250 mM sacarose) e reusspensos em 13 mL do

mesmo tampão. Os parasitos foram cautelosamente rompidos por sonicação, com 15 ciclos de

2 seg e 1 seg de intervalo entre os ciclos, no gelo, utilizando o aparelho ultra-sônico (Sigma,

Luciana Loureiro Penha Metodologia

GEX 600 Model), operando a 10% da amplitude total, gerando um homogenato total. Após

centrifugação a 2450 x g por 10 min, o pellet foi descartado e o sobrenadante foi misturado

em volumes iguais a tampão contendo 2,3 M sacarose. Doze mL da mistura foram

depositados em um tubo de centrifuga Beckman SW28, e foi adicionado 10 mL dos tampões

1,2 M, 1,0 M e 5 mL do tampão 0.8 M de sacarose, para formação do gradiente de sacarose.

A amostra foi centrifugada a 97000 x g por 250 min. A interface 0,8M/1,0M, denominada R e

a camada 1,2 M/1,27 M denominada M, foram coletadas, diluídas em tampão TMS e

centrifugadas a 120000 x g por 30 min, e o pellet foi ressuspenso em TMS, sendo então

processadas para microscopia eletrônica ou para análise bioquímica. O conteúdo de PGM ou

GPDH presente nas frações foi analisado por Western Blot de acordo com o método descrito

acima.

17- Separação de fase de proteínas integrais de membrana com Triton X-114

Epimastigotas (5x10

células) foram lisados em 200 µl da solução Tris-HCl 10 mM,

NaCl 150 mM, pH 7,4, 2% Triton X-114, coquetel de inibidores e incubados por 30 min a 4

ºC. Depois a amostra foi incubada por 5 min a 37 ºC e centrifugada por 5 min a 11000 x g a

temperatura ambiente. A fase detergente I foi separada da fase aquosa I e de acordo com o

volume obtido na fase aquosa, foi adicionado Triton X-114 10% à fase aquosa I de forma a

mantê-la 2% final, novamente foi incubado por 5 min a 37 ºC. Juntou-se então essa amostra

que foi incubada pela segunda vez por 5 min a 37 ºC a fase detergente I e o material foi

centrifugado por 5 min a 11000 rpm. Assim foi separado a fase detergente II da fase aquosa

II, e adicionou-se novamente Triton X-114 10% à fase aquosa II, de forma que ficasse 2%

final. Na fase detergente II foi adicionado tampão de forma que essa fase também ficasse 2%

final. As amostras foram visualizadas por Western Blot.

Luciana Loureiro Penha Metodologia

18- Transfecção em epimastigota de T. cruzi

A transfecção foi realizada de acordo com protocolo utilizado por Buck e

colaboradores (1994) onde epimastigotas (5x10

parasitos) foram lavados 2 vezes em tampão

PBS, antes de serem ressuspensos em 0,4 mL de tampão HEPES (140mM NaCl, 0,4mM

HPO

, 25mM HEPES

pH 7,0) no qual foram adicionados 50µg do DNA purificado. Os

parasitos foram incubados 10 min no gelo antes de serem eletroporados. A eletroporação foi

realizada em cubetas de 0,4 cm com 2 pulsos de 1,5 K

, 25 µF em eletroporador Bio-Rad.

Imediatamente após a transfecção , os parasitos foram incubados por 5 min a temperatura

ambiente e foram diluídos em 5 mL de meio LIT contendo 10% de soro fetal bovino e

cultivados em frascos de 25 cm

por 24 h a 28 ºC, antes da adição da droga, 500 µg/mL de

geneticina (Sigma). Após aproximadamente 30 dias, os parasitos foram selecionados na

presença da droga.

19- Imunofluorescência

Epimastigotas de cultivo axênico, tripomastigotas e amastigotas do sobrenadante de

culturas infectadas foram coletados através de centrifugação, lavados em PBS (tampão

fosfato de sódio 10 mM, pH 7,2-7,4, acrescido de NaCl 150 mM) e fixados em

paraformaldeído 4% em PBS por 10 min à temperatura ambiente. Posteriormente, os

parasitos foram aderidos por 15 min a lamínulas previamente revestidas por poli-L-lisina

0,1% em PBS. As células não aderidas foram retiradas por lavagem com PBS e as aderidas

foram permeabilizadas com Triton X-100 0,5% por 5 min a 28

C. As amostras foram

incubadas em cloreto de amônio 50 mM em PBS por 30 min, a fim de bloquear os aldeídos

livres. Depois disso, foram incubadas em PBS suplementado com albumina bovina fração V

Luciana Loureiro Penha Metodologia

1,5% e gelatina de peixe 0,5%, pH 7,4 (tampão de bloqueio) por 1 h à temperatura ambiente.

Depois de bloquear os sítios inespecíficos, as lamínulas foram incubadas com os anticorpos

primários utilizados na concentração específica por 1 h na temperatura ambiente. Os

controles foram feitos substituindo-se os anticorpos primários por tampão de bloqueio.

Depois de lavadas em tampão de bloqueio as amostras foram incubadas com anticorpos

secundários conjugados a Alexa 488 (Molecular Probes) (diluídos 1:500) ou Alexa 546 na

mesma diluição, para experimentos de co-localização. Por fim, as amostras foram lavadas,

montadas sobre lâmina usando n-propil galato (Sigma) 0,2 M em PBS-glicerol 9:1 como

meio de montagem e observadas no microscópio de fluorescência Zeiss Axioplan-1 equipado

com uma câmera Hamamatsu C5810. As imagens capturadas foram processadas usando o

programa Adobe Photoshop CS2.

20- Microscopia eletrônica de transmissão

Para a microscopia eletrônica de transmissão de rotina, parasitos foram coletados

através de centrifugação, lavados em PBS, pH 7,2, fixados em glutaraldeído tipo I (Electron

Microscopy) 2,5% em tampão fosfato de sódio 0,1 M pH 7,2, pós-fixados em tetróxido de

ósmio (Electron Microscopy) 1%, ferrocianeto de potássio 0,8%, cloreto de sódio 5mM em

tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,2. Após desidratação em série crescente de acetona

(50, 70, 90 e 100%) as amostras foram infiltradas e incluídas em Epon (Electron

Microscopy), que polimerizou após 48 h em estufa a 60

C. Secções ultrafinas foram obtidas

em ultramicrótomo Reichert Ultracut S, coletadas em grades de cobre e coradas

sucessivamente com acetato de uranila 5% em água por 40 min e citrato chumbo por 5 min.

As amostras foram examinadas e fotografadas ao microscópio eletrônico Zeiss EM 900 ou

JEOL 1200 operando a 80 kV. Depois de revelados, os negativos fotográficos foram

Luciana Loureiro Penha Metodologia

digitalizados em scanner Epson com resolução de pelo menos 600 dpi e as imagens foram

processadas usando o programa Adobe Photoshop CS2.

21- Crio-ultramicrotomia

Epimastigotas foram fixados em tampão cacodilato 0,1M contendo 4% de

paraformaldeído e glutaraldeído 0,2% tipo I por 40 min a 28

C . Depois de fixadas, as

amostras foram lavadas em tampão cacodilato 0,1M e infiltradas em sacarose 2,3M em PBS,

cortadas em pequenos blocos e transferidas para suportes que foram rapidamente congelados

por imersão em nitrogênio liquido. Criocortes foram obtidos com o uso do

crioultramicrotomo Leica Ultracut e foram coletados em sacarose 2,3 M, depositados sobre

grades de níquel cobertas por Formvar/carbono e foram transferidos para uma solução de

PBS contendo BSA 3%. Os criocortes foram bloqueadas com PBS contendo 50 mM de

cloreto de amônio por 15 min e posteriormente com BSA 3% por 1 h antes de incubar com

anticorpo anti-PGM de camundongo (1:100) e anti-GAPDH de coelho (1:200), seguida de

IgG anti-camundongo (cabra) acoplados a partículas de ouro de 5 nm e IgG anti-coelho

(cabra) acoplados a partículas de ouro de 15 nm, diluídos 1:100. Depois da incubação, os

criocortes foram incluidos em 1,4 % de metilcelulose e 0,3% de acetato de uranila.

Posteriormente, as amostras foram observadas no microscópio eletrônico de transmissão Jeol

1200 EX a 80kV.

Luciana Loureiro Penha Resultados

1- Gene pgm nas diferentes cepas de T. cruzi

Em trabalho anteriormente realizado pelo nosso grupo (Penha et al., 2005), o gene que

codifica PGM de T. cruzi foi clonado e sua atividade caracterizada por complementação

heteróloga em levedura mutante deficiente da PGM. Como a PGM já foi utilizada como

isoenzima para diferenciar cepas de T. cruzi em três zimodemos principais (Miles et al.,

1980), utilizamos os oligonucleotídeos que amplificavam a região codante do gene pgm da

cepa Dm28c como ferramenta para analisar molecularmente a PGM nas diferentes cepas de

T. cruzi. Reações de polimerase em cadeia (PCR) utilizando enzimas de alta fidelidade e

DNA genômico de epimastigota das cepas Dm28c, Silvio X10/6, Brazil, Y, G, Tulahen e

CLBrener como molde foram realizadas para isolar o gene pgm. Oligonucleotídeos dirigidos

para região codante da pgm da cepa Dm28c (Start/Stop) resultaram na amplificação de um

único fragmento apresentando 1800pb nas diferentes cepas utilizadas (Figura 11). Esses

fragmentos foram purificados e seqüenciados pelo menos três vezes.

1,5

2,0

1,0

M 1 2 3 4 5 6 7

1,5

2,0

1,0

M 1 2 3 4 5 6 7

Figura 11- Fragmentos de PCR amplificados utilizando oligonucleotídeos específicos

para a região codante da pgm da cepa Dm28c. (M) marcador de peso molecular (BioToots do

Brasil), e DNA utilizado com molde da cepa (1) Dm28c, (2) CLBrener, (3) Tulahen, (4)

Brazil, (5) Y, (6) G e (7) Silvio X10/6.

Luciana Loureiro Penha Resultados

2- Múltiplo-alinhamento da seqüência de aminoácidos predita

As seqüências de aminoácido preditas obtidas juntamente com a seqüência de

aminoácidos da cepa CLBrener anotadas (TIGR 7811 e 8825) foram alinhadas utilizando o

programa CLUSTAL W. Esses fragmentos apresentaram-se altamente conservados,

apresentando uma homologia entre as seqüências de 99,8% a 98%. Entretanto uma pequena

variação foi observada nos resíduos de aminoácidos das posições 3 e 16, que foi

particularmente interessante, já que essas substituições ocasionaram mudança de carga dos

aminoácidos. Enquanto o resíduo da posição 3 nas seqüências provenientes das cepas

CLBrener e Tulahen é alanina as seqüências das demais cepas apresentaram nessa mesma

posição um ácido aspártico, que é um aminoácido de carga negativa. Já na posição 16, as

seqüências provenientes das cepas CLBrener e Tulahen apresentaram uma lisina (K), que foi

substituído nas demais cepas por uma glutamina (Q). Já a cepa CLBrener por ser uma cepa

híbrida apresentou na posição 16 em um alelo uma lisina (K) e em outro alelo uma glutamina

(Q).

Nossos resultados condizem com o que já foi demonstrado no trabalho realizado por

Brisse e colaboradores (1998) onde foi demonstrado claramente que a cepa CLBrener é

molecularmente semelhante à cepa Tulahen, não sendo observado diferenças entre a

migração das isoenzimas PGM em análises por MLEE. Estudos posteriores poderão

demonstrar se a PGM poderá ser usada futuramente como uma ferramenta molecular para

separar as diferentes cepas do T. cruzi.

Fgura 12 – Múltiplo alinhamento da seqüência de aminoácidos predita para PGM.

Resíduos conservados são assinalados com asterístico (

*). Em rosa e verde substituições que

introduzem mudança de carga. (CL) cepa CLBrener. Foi utilizado o programa CLUSTALW.

Luciana Loureiro Penha Resultados

Dm28c MLDVKKVPTRPFIDQKPGTSGLRKKVRVFQQENYLANFIQSTFNAIGKQGMIPDTLVLGGDGRYFLSEAIQ

CL8825 MLAVKKVPTRPFIDQKPGTSGLRKKVRVFQQENYLANFVQSTFNAIGKQGMIPDTLVLGGDGRYFLSEAIQ

CL7811 MLAVKKVPTRPFIDQQPGTSGLRKKVRVFQQENYLANFIQSTFNAIGKQGMIPDTLVLGGDGRYFLSEAIQ

Bra MLDVKKVPTRPFIDQKPGTSGLRKKVRVFQQENYLANFIQSTFNAIGKQGMIPDTLVLGGDGRYFLSEAIQ

G MLDVKKVPTRPFIDQKPGTSGLRKKVRVFQQENYLANFIQSTFNAIGKQGMIPDTLVLGGDGRYFLSEAIQ

X10/6 MLDVKKVPTRPFIDQKPGTSGLRKKVRVFQQENYLANFIQSTFNAIGKQGMIPDTLVLGGDGRYFLSEAIQ

Tul MLAVKKVPTRPFIDQQPGTSGLRKKVRVFQQENYLANFIQSTFNAIGKQGMIPDTLVLGGDGRYFLSEAIQ

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***********************************************************************

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CL8825 EMHHLKIFEVPTGWKFFGNLMDSRELFGGEDYNPLICGEESFGTGSNHIREKDGVWAALFWLSVIASKNVD

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G EMHHLKIFEVPTGWKFFGNLMDSRELFGGEDYNPLICGEESFGTGSNHIREKDGVWAALFWLSVIASKNVD

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***********************************************************************

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CL8825 PLKPLVGVKDIVEDHWTRYGRNYYCRYDYENVAEDSAKAVMETVQRQRPQDIPSLQGKRCVKVDNFEYHDP

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G PSKPLVGVKDIVEDHWTRYGRNYYCRYDYENVAEDSAKAVMETVQRQRPQDIPSLQGKRCVKVDNFEYHDP

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* *********************************************************************

Dm28c VDGLVSKNQGIRVIFEDGSRFVIRLSGTGSSGATIRLYLEHYMEPNAVARHIRDGTLPTPQSALANLIAVA

CL8825 VDGLVSKNQGIRVIFEDGSRFVIRLSGTGSSGATIRLYLEHYMEPNAVARHIRDGTLPTPQSALANLIAVA

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Bra VDGLVSKNQGIRVIFEDGSRFVIRLSGTGSSGATIRLYLEHYMEPNAVARHIRDGTLPTPQSALANLIAVA

G VDGLVSKNQGIRVIFEDGSRFVIRLSGTGSSGATIRLYLEHYMEPNAVARHIRDGTLPTPQSALANLIAVA

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Tul VDGLVSKNQGIRVIFEDGSRFVIRLSGTGSSGATIRLYLEHYMEPNAVARHIRDGTLPTPQSALANLIAVA

***********************************************************************

Dm28c LNVSQISELTGRDAPTVIT

CL8825 LNVSRISGLTGRDAPTVIT

CL7811 LNVSQISELTGRDAPTVIT

Bra LNVSQISELTGRDAPTVIT

G LNVSQISELTGRDAPTVIT

X10/6 LNVSQISELTGRDAPTVIT

Tul LNVSQISELTGRDAPTVIT

****:** ***********

Luciana Loureiro Penha Resultados

3- Expressão da PGM recombinate em bactéria Bl21(λD3)

A fim de investigar a expressão e localização da PGM no T. cruzi, a PGM

caracterizada pelo nosso grupo (Penha et al., 2005) foi clonada no plasmídeo pET28a(+) e

expressa em E. coli Bl21(D3). A expressão da PGM foi realizada primeiramente por 3 h a

37 °C com sucesso, porém na forma de corpo de inclusão. Em seguida modificações no

sistema de expressão foram realizadas na tentativa de obter a PGM de forma solúvel, como,

por exemplo, 3 h a 28 °C (Figura 13), ou por 16 h a 16 °C, sem sucesso. Também foram

testadas as concentrações de IPTG, como, por exemplo, 400 µM e 200 µM de IPTG (Figura

13), até utilizando 10 µM, 25 µM, 50 µM, e 100 µM de IPTG (Figura 14), e em todos os

ensaios utilizados a proteína continuou sendo expressa na forma de corpo de inclusão.

66,0 kDa

M 1 2 3 4 5 6kDa

82,0

48,3

33,4

28,3

104,0

66,0 kDa

M 1 2 3 4 5 6kDa

82,0

48,3

33,4

28,3

104,0

Figura 13– Expressão da PGM recombinante no plasmídeo pET28a(+) em bactéria

Bl21(D3). A PGM foi expressa por 3 h a 28 °C, com 400 µM (3) ou 200 µM (6) de IPTG.

(M) marcador de peso molecular BioRad, (1) e (4) extrato total bactéria antes da indução, (2)

e (5) sobrenadante da bactéria após indução, (3) e (6) pellet da bactéria após indução.

Luciana Loureiro Penha Resultados

kDa

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

104,0

82,0

48,3

33,4

28,3

kDa

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

104,0

82,0

48,3

33,4

28,3

kDa

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

104,0

82,0

48,3

33,4

28,3

Figura 14 – SDS-PAGE do lisado de bactéria submetido à indução de expressão da

PGM sob várias condições. Marcador de peso molecular BioRad (M), extrato total da

bactéria antes da indução (1), sobrenadante da bactéria após a indução (2, 4, 6 e 8) e após

indução com 100 µM (3), 50 µM (5), 25 µM (7) e 10 µM (9) de IPTG.

4- Purificação da PGM recombinante e produção de anticorpo

O plasmídeo pET28a(+) proporciona a expressão do gene de interesse sob a forma de

uma proteína de fusão contendo uma cauda de poli-histidina na extremidade N-terminal para

rápida purificação da proteína recombinante. Os corpos de inclusão contendo a PGM foram

solubilizados em condições desnaturantes (8 M de uréia), e a proteína recombinante foi

purificada através de cromatografia de afinidade. A análise das amostras por SDS-PAGE

revelou o alto grau de pureza da PGM recombinante (Figura 15). A proteína foi

posteriormente inoculada em coelho para produção do anti-soro. A proteína recombinante

também foi inoculada em camundongos para a obtenção de anti-soro adicional que pudesse

ser utilizada em conjunto com anticorpo para outra molécula do

T. cruzi.

Luciana Loureiro Penha Resultados

1 2 3 4

kDa

104,0

82,0

48,3

33,4

28,3

1 2 3 4

kDa

104,0

82,0

48,3

33,4

28,3

Figura 15 – Purificação da PGM recombinante. Extrato total da bactéria antes da

indução (1), corpo de inclusão purificado (2), material que não ficou absorvido na coluna de

agarose (3) e proteína recombinante purificada (4).

A especificidade e o título do anti-soro foram testados por Western Blot (Figura 16).

Em todas as diluições utilizadas o anticorpo anti-PGM reconheceu uma única proteína de

tamanho esperado no extrato total da forma epimastigota do parasito, de tamanho similar ao

da proteína recombinante, demonstrando que o anticorpo é altamente específico para a PGM.

A reação foi observada até a diluição de 1:5000, indicando o alto título do anticorpo obtido.

Luciana Loureiro Penha Resultados

1 21 2

Figura 16 - Western Blot utilizando anticorpo feito em coelho anti- PGM de

T. cruzi.

100 µg de extrato total de epimastigota (1) e proteína recombinante (2) foram aplicadas em

gel SDS-PAGE 11%, transferido para membrana de nitrocelulose, bloqueada com 9% de leite

em PBS 0,05% Tween-20 e incubada com anti-PGM (1:5000). As bandas foram visualizadas

usando solução BCIP-NBT, de acordo com manual do fabricante.

5- Expressão da PGM nas diferentes cepas do T. cruzi

A proteína recombinante purificada foi utilizada para a produção de anticorpos

policlonais em coelho e camundongos. Western Blot utilizando o anticorpo obtido de coelho

contra a PGM da cepa Dm28c, foi realizado contra o lisado das diferentes cepas do

T. cruzi.

A análise revelou uma marcação de peso esperado demonstrando que a PGM é expressa em

todas as amostras testadas (Figura 17).

Luciana Loureiro Penha Resultados

Anti-PGM 1:6000

66 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8

Anti-PGM 1:6000

66 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8

Figura 17 – Análise por Western Blot da expressão da PGM nas diferentes cepas de

cruzi. (1) proteína recombinante, (2) extrato total cepa Dm28c, (3) CLBrener, (4) Y, (5)

Tulahen, (6) G, (7) X10/6, (8) Brazil.

6- Expressão da PGM nas diferentes formas do T. cruzi

A expressão da PGM nas diferentes formas do parasito foi avaliada por Western Blot.

Primeiramente foi utilizado o anticorpo anti-PGM na membrana contendo o lisado das

diferentes formas do parasito, a membrana foi reciclada e incubada com anticorpo anti-

chaperona residente no retículo endoplasmático (Bip) de

T. brucei (Bangs et al., 1993), que

reconhece a Bip de

T. cruzi, como controle de concentração protéica nos lisados.

A análise por Western Blot revelou que a PGM é mais expressa na forma epimastigota

do parasito, depois na forma amastigota, e a menor expressão foi visualizada na forma

tripomastigota. O anti-BIP reagiu com a mesma intensidade nas diferentes formas do parasito

confirmando que foram colocadas quantidades equivalentes de proteínas em cada canaleta

(Figura 18). Esse resultado indica que a PGM parece ser mais expressa nas formas

multiplicativas, o que pode estar relacionado com o maior gasto de energia nessas formas do

parasito, como também com maior síntese de glicoconjugados.

Luciana Loureiro Penha Resultados

E T A

Ponceau

78,0 kDa

66,0 kDa

E T A

Anti-PGM

E T A

Anti-BIP

78,0 kDa

66,0 kDa

E T A

Ponceau

78,0 kDa

66,0 kDa

E T A

Anti-PGM

E T A

Anti-BIP

78,0 kDa

66,0 kDa

Figura 18– Expressão da PGM nos diferentes estágios de vida do

T. cruzi. Lisado total

de epimastigota (E), tripomastigota (T) e amastigota (A) foram obtidos por repetidos ciclos

de congelamento e descongelamento seguidos da adição de 1% de NP-40. Após de 10 min no

gelo, as amostras foram centrifugadas a 13000 x

g, e a fração solúvel coletada. 50 µg de

proteína foram aplicadas em gel SDS-PAGE 11%, transferido para membrana de

nitrocelulose, bloqueada com 9% e leite em PBS 0,05% Tween-20, e corado com ponceau

vermelho. A membrana foi incubada com anti-PGM (1:5000), após a visualização da reação

foi reciclada e incubada com anti-BIP (1:2000). As proteínas foram visualizadas usando

solução BCIP-NBT.

Luciana Loureiro Penha Resultados

7- Localização sub-celular da TcPGM

A PGM é encontrada no citoplasma de todos os organismos (Harris e Hopkinson,

1976; Canter

et al., 1982; Jin-Bi Daí et al., 1992; Boles et al., 1994) até então estudados. A

localização sub-celular da PGM em epimastigotas de

T. cruzi foi primeiramente investigada

por imunofluorescência utilizando anticorpo específico produzido em coelho. Assim como

nas demais células eucarióticas, a TcPGM apresentou uma distribuição citoplasmática, porém

a enzima foi encontrada em várias estruturas arredondadas espalhas por todo corpo do

parasito (Figura 19). Este perfil de marcação é consistente com a localização de proteínas

glicossoais, como a gliceraldeído fosfato desigrogenase (GAPDH) ou a aldolase, observado

por imunofluorescência. Para comprovar a localização glicossomal da TcPGM realizamos

experimentos de dupla marcação utilizando anticorpos anti-PGM em conjunto com

anticorpos dirigidos contra enzimas previamente descritas como glicossomais: GAPDH

(Misset

et al., 1987) ou aldolase (Misset et al., 1986).

Análises por imunofluorecência demonstraram que os anticorpos anti-PGM

purificados por afinidade concentraram-se em vesículas dispersas ao longo do corpo de

epimastigotas, assim como, no citoplasma. Essas vesículas também apresentaram

positividade para GAPDH (Figura 20). Da mesma forma, a localização citoplasmática e em

estruturas arredondadas espalhadas pelo corpo celular que colocalizam com a enzima

glicossomal foi observada nas formas tripomastigotas e amastigotas (Figura 20). A co-

localização das duas enzimas, PGM e GAPDH, numa mesma vesícula, indicam que a

TcPGM apresenta uma localização glicossomal no

T. cruzi.

Luciana Loureiro Penha Resultados

Figura 19– Epimastigotas de

T. cruzi foram preparados para imunofluorescência com

anticorpo policlonal de coelho contra PGM (1:100), purificado por afinidade. Parasitos foram

coletados por centrifugação, lavados 3 vezes em PBS e fixados com 4% de paraformaldeído

por 10 min, a temperatura ambiente. Depois da fixação as células foram aderidas com poli-L-

lisina 1% em PBS e permeabilizadas com 1% NP40 em PBS. Escala da barra: 0,5 µm.

Luciana Loureiro Penha Resultados

A B C D

Figura 20– Localização sub-celular da PGM nas diferentes formas do parasito.

Epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas de

T. cruzi foram processados para

imunofluorescência com anticorpo policlonal produzido em coelho contra a enzima GAPDH

T. brucei (1:200), marcador de glicossomo e anticorpo policlonal de camundongo contra

PGM (1:100), purificado por afinidade. Parasitos foram coletados por centrifugação, lavados

3 vezes em PBS e fixados com 4% de paraformaldeído por 10 min, a temperatura ambiente.

Depois da fixação as células foram aderidas com poli-L-lisina 1% em PBS e permeabilizadas

com 1% NP40 em PBS. (A) Imagens de contraste interferencial diferencial (DIC) (B)

anticorpo anti-PGM, (C) anticorpo anti-GAPDH, (D) Sobreposição das imagens. Escala da

barra: epimastigota 0,6 µm, tripomastigota 0,4 µm e amastigota 0,5 µm.

Luciana Loureiro Penha Resultados

Os resultados de imunofluorescência indicaram que a PGM está localizada em

vesículas glicossomais em

T. cruzi. Realizamos também análises bioquímicas para confirmar

a localização glicossomal da PGM. Formas epimastigotas da cepa Dm28c foram submetidas

a fracionamento sub-celular de acordo com Cunha-e-Silva et al., (2002) e as frações

resultantes foram analisadas quanto à presença da PGM e da GAPDH, essa última utilizada

como marcador de glicossomo (Figura 21).

As frações coletadas em um gradiente de sacarose foram analisadas subseqüentemente

por Western Blot, utilizando anticorpo anti-PGM (1:2000) e anti-GAPDH (1:2000). Os

resultados demonstraram que a PGM está presente em sua maior parte nas frações Pellet, B4

e B3, assim como estão a GAPDH (Figura 21). Em trabalho realizado por Vieira e

colaboradores (2005) foi verificada que a atividade específica da hexoquinase, uma enzima

glicossomal, foi maior na fração de Pellet, seguida da fração B3. Esses resultados indicam

que a PGM, em uma análise bioquímica está co-localizada em frações que contêm

glicossomos de

T. cruzi.

Luciana Loureiro Penha Resultados

Vieira et al., 2005

T.cruzi

Pellet

0.8 M

1.0 M

1.2 M

1.27 M

Vieira et al., 2005

T.cruzi

Pellet

0.8 M

1.0 M

1.2 M

1.27 M

Vieira et al., 2005

T.cruzi

Vieira et al., 2005

T.cruzi

Pellet

0.8 M

1.0 M

1.2 M

1.27 M

Pellet

0.8 M

1.0 M

1.2 M

1.27 M

Pellet B4 B3 B2 B1

Anti-PGM

Anti-GAPDH

Pellet B4 B3 B2 B1

Anti-PGM

Anti-GAPDH

Pellet B4 B3 B2 B1

Figura 21–Western Blot após o fracionamento sub-celular da forma epimastigota de

T. cruzi. Epimastigotas (10

) foram sonicados e o lisado foi submetido a fracionamento sub-

celular usando gradiente de sacarose, como determinado por Cunha-e-Silva e colaboradores

(2002). Foram analisadas as frações: (1) Pellet - após centrifugação de 97000 x

enriquecidas de acidocalcissoma, (2) B1 - interface entre 0,8 M/1,0 M de sacarose, rica em

reservossomos e organelas menos densas, (3) B2 - interface entre 1,0 M/ 1,2 M, rica em

reservossomo, (4) B3 – interface entre 1,2 M/ 1,27 M e B4 – interface de 1,27 M, ambas

contendo diferentes organelas como mitocôndria, glicossomo e acidocalcissomos (A). No

adendo (B) atividade específica da hexoquinase, marcador glicossomal, no fracionamento

sub-celular da forma epimastigota da cepa Y de

T. cruzi retirado de Vieira e colaboradores

(2005). As frações coletadas foram aplicadas em gel de SDS-PAGE 11%, transferidas para

membrana de nitrocelulose, bloqueadas com 9% de leite em TBS 0,05% Tween-20 e

incubadas com anticorpo anti-PGM (1:2000) ou anti-GAPDH (1:2000). A reatividade das

bandas foi visualizada usando solução de BCIP-NBT (

C).

Luciana Loureiro Penha Resultados

As análises por microscopia óptica e bioquímica indicaram que a PGM está associada

a glicossomos no

T. cruzi. Para verificarmos se a PGM está associada à membrana do

glicossomo, realizamos a lise de epimastigotas seguidas de partição em solução contendo

Triton X-114. As frações aquosa e de membrana foram em seguida avaliadas por Western

Blot utilizando anticorpos anti-PGM.

Nossos resultados indicaram que a PGM está presente majoritariamente na fração

aquosa e não na fração de membrana, sugerindo que a PGM é principalmente encontrada na

forma solúvel no parasito (Figura 22).

Figura 22– Western Blot utilizando frações aquosa e de membrana da lise de

epimastigotas e extração em Triton X-114. As frações coletadas foram aplicadas em SDS-

PAGE 11%, transferidas para membrana de nitrocelulose, bloqueadas com 9% de leite em

TBS 0,05% Tween-20 e marcadas com anticorpo anti-PGM (1:2000). A reatividade das

bandas foi visualizada usando solução de BCIP-NBT.

A- fração aquosa M- fração de

membrana.

Anti-PGM

Luciana Loureiro Penha Resultados

Para realizar a localização fina da TcPGM utilizamos a imunocitoquímica

ultraestrutural a partir de crio-cortes obtidos por crio-ultramicrotomia. Esta metodologia é

empregada para a melhor preservação de antigenos, assim como, para estudos morfológicos

de membrana. Portanto, formas epimastigotas foram fixadas e congeladas em nitrogênio

líquido, os crio-cortes foram obtidos e incubados com anticorpos anti-PGM e anti-GAPDH

(Figura 23). Desta forma, foi possível demonstrar que a TcPGM (setas) está localizada em

compartimentos citoplasmáticos envoltos por membrana, que também são positivos para

GAPDH (cabeças de setas). Além disso, a TcPGM foi observada no citoplasma. A estrutura

destes compartimentos é compatível com a dos glicossomos e distinto das demais organelas

das formas epimastigotas de

T. cruzi, como o núcleo, cinetoplasto (Shalomai, 2004),

reservossomos (Cunha-e-Silva et al., 2006), acidocalcissomos (Docampo et al., 2005) entre

outros. Este conjunto de resultados ratifica a localização glicossomal da PGM no

T. cruzi.

Figura 23- Localização da TcPGM em epimastigota de

T. cruzi por microscopia

eletrônica de transmissão. Epimastigotas foram preparados para crio-ultramicrotomia como

descritos na Metodologia. Criocortes foram obtidos com o uso do crioultramicrótomo e

incubados com o anticorpo anti-GAPDH (1:200) (A) e os com anticorpos anti-PGM (1:100) e

anti-GAPDH (1:200) juntos (B e C), seguidos dos imunoconjugados acoplados a partícula de

ouro coloidal. As amostras foram observadas no microscópio eletrônico de transmissão Jeol

1200 EX a 80 kV. As setas indicam a PGM marcada com anti-camundongo acoplados a

partículas de ouro de 5 nm, e as cabeças de setas indicam a GAPDH marcada com anti-

coelho acoplados a partículas de ouro de 15nm. M – mitocôndria. Escala da barra: 0,15 µm.

Luciana Loureiro Penha Resultados

8- Expressão e localização sub-celular da PGM na forma promastigota de L.

major

O gene que codifica a PGM de L. major apresenta identidade de aminoácidos prevista

de 63% com a TcPGM.Como a PGM de

Leishmania major ainda não foi caracterizada a

nível protéico, realizamos ensaios de Western Blot com anticorpos desenvolvidos contra a

TcPGM para observar a sua expressão em

Leishmania. Foi possível verificar que os

anticorpos anti-TcPGM reconheceram uma única proteína de tamanho similar a PGM do

cruzi

em lisados de promastigota de L. major (Figura 24).

A localização da enzima nesse parasito foi subseqüentemente avaliado por

microscopia óptica. A imunofluorescência de promastigota de

L. major com o anticorpo anti-

PGM de

T. cruzi apresentou distribuição citoplasmática e vesicular por todo corpo do

parasito, assemelhando-se à marcação de glicossomo. A utilização concomitante de

anticorpos anti-GAPDH revelou a co-localização da PGM e da GAPDH no mesmo

compartimento sub-celular (Figura 25), indicando que a PGM também está localizada no

glicossomo na forma promastigota de

L. major.

Figura 24– Western Blot anti-TcPGM de formas epimastigotas de

T. cruzi e formas

promastigotas de

L. major. 100 µg do extrato protéico de L. major e T. cruzi foram aplicados

em gel SDS-PAGE 11%, transferido para membrana de nitrocelulose, bloqueada com 9% de

leite em PBS 0,05% Tween-20 e incubada com anticorpo anti-TcPGM (1:5000). As bandas

foram visualizadas usando solução BCIP-NBT, conforme protocolo do fabricante.

75 KDa

L. major T. cruzi

Anti-PGM rabbit

75 KDa

L. major T. cruzi

Anti-PGM rabbit

Luciana Loureiro Penha Resultados

Figura 25- Localização sub-celular da PGM na forma promastigota de

L. major.

Células foram preparados para imunofluorescência e incubados com anticorpos policlonais de

coelho contra a enzima GAPDH de

T. brucei (1:200), marcador de glicossomo e anticorpo

policlonal de camundongo contra TcPGM (1:100), purificado por afinidade. Parasitos foram

coletados por centrifugação, lavados 3 vezes em PBS e fixados com 4% de paraformaldeído

por 10 min, a temperatura ambiente. Depois da fixação as células foram aderidas com poli-L-

lisina 1% em PBS e permeabilizadas com 1% NP40 em PBS. Escala da barra: 0,7 µm.

9- Endereçamento da PGM para o glicossomo em T. cruzi

O endereçamento de proteínas a glicossomos é normalmente mediado por sinais de

endereçamentos conservados. Como nossos resultados indicaram que a TcPGM encontra-se

associada a glicossomos em

T. cruzi, iniciamos a procura por motivos de endereçamento na

TcPGM. Primeiramente utilizamos o programa disponível para busca que se conceitua na

identificação de motivos do tipo PTS1 (“www.expasy.org - PTS1- Prediction of peroxisomal

targeting signal 1 containing proteins”), porém nenhum motivo foi encontrado quando a

seqüência da PGM de

T. cruzi (TcPGM) foi usada como molde.

Opperdoes e Szikora (2006) realizaram a análise computacional do genoma de

tripanossomatídeos na busca por genes que codificassem para proteínas glicossomais. Esta

busca revelou a presença de aproximadamente 250 proteínas putativas contendo o consenso

PTS, sendo postuladas como possivelmente glicossomais. Nesse trabalho, os autores relatam

que a PGM de

L. major assim como a PGM de T. cruzi apresentam um motivo PTS1 de

Luciana Loureiro Penha Resultados

encaminhamento para glicossomo (SKL). Porém a seqüência da TcPGM caracterizada pelo

nosso grupo (Penha

et al., 2005) não apresenta motivo PTS1 clássico. Realizamos o

alinhamento das seqüências da PGM/PMM referida por Opperdoes e Szikora (2006) como a

PGM de

L. major (LmjF34.3738) com a seqüência da TcPGM anotada pelo nosso grupo

(AY695273). O alinhamento da TcPGM, com a PGM de

L. major (LmPGM), e a PGM/PMM

publicada por Opperdoes (que contém o motivo de encaminhamento PTS1) revelou baixa

similaridade (Figura 26).

A PGM de bactéria apresenta atividade de PGM e PMM, podendo realizar a

conversão reversível de Glc-1-P em Glc-6-P, e vice-versa, assim como, manose-1-fosfato em

manose-6-fosfato (Zielinski

et al., 1991; Regni et al., 2006). Opperdoes & Szikora (2006)

citam no trabalho que a PGM de

T. cruzi e L. major como uma proteína (PGM/PMM), porém

uma única proteína com dupla atividade só ocorre em bactérias, nos demais organismos, cada

enzima (PGM ou PMM) é codificada por dois genes diferentes.

A PMM de

L. mexicana já foi caracterizada (Garami et al., 2001), mostrando

atividade enzimática. O alinhamento da seqüência publicada por Opperdoes e Szikora (2006)

com a PMM de

L. major, a PMM publicada de L. mexicana ou a PMM de T. cruzi, também

apresentou baixa similaridade (Figura 27).

Nossos resultados indicam que a seqüência putativa PGM/PMM que apresenta o

motivo SKL de encaminhamento para glicossomo citada por Opperdoes & Szikora (2006)

difere substancialmente das seqüências da PGM ou PMM já caracterizadas no

T. cruzi ou L.

mexicana

. Portanto concluímos que a PGM/PMM, citada no trabalho, não codifica a PGM ou

PMM convencionais.

Luciana Loureiro Penha Resultados

PGM L.major -------------------------------------------ME

TTTAY

DQKPGTSG

PGM T.cruzi ---------------------------------------MLDVKKVPTRPFIDQKPGTWG

PMM L.majorOpperdoes MSSLDAKVEQWLAWDRDPATRQIIESLAAKKDTAELRRRLETRMKFNTAGLRSTMGAGSA

:. * . . .

PGM L.major LRKKVTVFQQPNYTANFVQSTFNALHRQGAVPDVLVVGGDGRYYTSEAVQVILKVSAANG

PGM T.cruzi LRKKVRVFQQENYLANFIQSTFNAIGKQGMIPDTLVLGGDGRYFLSEAIQIIIKLAAANG

PMM L.majorOpperdoes HMNRLTVLQTAQGLAAYVKQQFAPAE----LSRGVVIGYDGRHHSREFGEITATVMHQQG

::: *:* : * :::. * . :. :*:* ***:. * :: .: :*

PGM L.major VRCVWVGQHGLLSTPAVSTMVRRRRDADGRKATGAFILTASHNPGGPDADFGIKYNSENG

PGM T.cruzi VSNVWVGKDGLLSTPAVSNIIRQRRDGD-VTAKGAFILTASHNPGGPEEDFGIKYNTENG

PMM L.majorOpperdoes VKTYLYR-H-CVPTPFVPYGVKFF------KALVGVMVTASHNP---KEYNGLKVYWSNG

* . :.** *. :: .* ..::****** . *:* .**

PGM L.major GPAPEKLTSQIYEETVKITHIKMAPTLPEVDIHTLGTYTFDDYNFQVEVVDSLADYAAYM

PGM T.cruzi GPAAEKITSVIYEETLKIDHFLTCPNIGTVNVSEMGDHVFE--RFRVSVIHSTEDYVQSM

PMM L.majorOpperdoes ---AQIVAPLDVSIAASIDANLT-PLESSWAPFTAADHVDP--YDVV-----FEDYFATL

.: ::. . : .* * . :. * ** :

PGM L.major QEVFDFEAIRALVQRLDFKVHVDSLHGVSGPYVDRIFHEGLGVPKTSLFRTNVLPDFGGC

PGM T.cruzi KKIFDFQSIRNLLNRTDFTIRLDGLSGIGGPYMKDIFVSSLGVPESALCGATPLPDFGKQ

PMM L.majorOpperdoes RSSYAPASDASAV-RFTF----TAMHGVGTRFTTHGLRHVLGLPASHLSVVAE-----QA

:. : : : * * .: *:. : : **:* : * .

PGM L.major HPDPNLTYAADLVHVMGLLPDGNANPAMKHISTVPSFGVAFDGDADRNMILGCRFFVNPS

PGM T.cruzi HPDPNLTYAKELVRTMGL--DSTGRPVADFVGEVPNFAAAFDGDADRNMILGERFFVTPS

PMM L.majorOpperdoes EPNPDFPTVRFPNPEEGQ--SAFALSFATAGAHGASVVLANDPDADR-LAVAER-LPNEE

.*:*::. . * .. . . . ... * * **** : :. * : . .

PGM L.major DSLAVLAAN--ADCVPFFTQSS-----SSGLKAVARSMPTSGAVDRVAAAHDFALF-EVP

PGM T.cruzi DSLAILSAN--ANVVPFFAQ-------QGGIKAVARSMPTSGAVDRVAEMHHLKIF-EVP

PMM L.majorOpperdoes EGWHILTGNEIGALLGWWAMERARRQGIALERCLLISTVVSSCILKTMAAREGAQYSETL

:. :*:.* . : ::: . :.: * .*..: :. :. : *.

PGM L.major TGWKFFGNLMDSKDLYGGKDFNPLLCGEESFG-TGSNHIREKDGIWASLFWLSVIAKRNA

PGM T.cruzi TGWKFFGNLMDSRELFGGEDYNPLICGEESFG-TGSNHIREKDGVWAALFWLSVIASKNV

PMM L.majorOpperdoes TGFKFMGN--KALERKASEGLQTLFAYEEAIGFMWGERVMDKDGVTAAVVVADLACYLRK

**:**:** .: : ..:. :.*:. **::* .::: :***: *::. .: . .

PGM L.major -PGTPLV-GVQQIVEEHWATYGRNYYSRYDYEDVSAEAAKAVMDTVENTVVDDVPNLNGV

PGM T.cruzi DPSKPLV-GVKDIVEDHWTRYGRNYYCRYDYENVAEDSAKAVMETVQRQRPQDIPSLQGK

PMM L.majorOpperdoes EKQCSLVEHLQSLYRQYGYHFTHNSYMTIDDPSR----TEALLQSIRTAASGDYPSQVAG

.** ::.: .:: : :* * * . ::*:::::. * *. .

PGM L.major ACK--TIDNFSYTDPIDGSVS----TKQGVRVLFEDGSRFVLRLSGTGSSGATIRLYLEQ

PGM T.cruzi RCV--KVDNFEYHDPVDGLVS----KNQGIRVIFEDGSRFVIRLSGTGSSGATIRLYLEH

PMM L.majorOpperdoes RPVTRVVDLAAQVDTATPSRRPSLGKTPMITLHVDGGMSITIRGSGTEPK---IKWYAEL

:* *. .. : : .:.* :.:* *** .. *: * *

PGM L.major YMDSATVKSHLAEKTLPTASTALKALIGVALQVSKMESLTG-----RKTPTVI-T

PGM T.cruzi YMEPNAVARHIRDGTLPTPQSALANLIAVALNVSQISELTG-----RDAPTVI-T

PMM L.majorOpperdoes VTKDAA------------GQQVLNAFVAKAVRQLMQPHKFGLIMRPEDAETFSKL

. : . .* ::. *:. * ..: *.

Figura 26 – Alinhamento da seqüência deduzida de aminoácidos da PMM/PGM de

major

(LmjF34.3738) citada no trabalho de Opperdoes & Szikora (2006) com a PGM de T.

cruzi

(AY695273) e PGM de L. major (CAC14526). O alinhamento foi realizado utilizando

programa CLUSTALW. Em amarelo, os resíduos conservados e em vermelho, o motivo

PTS1 de encaminhamento para glicossomo.

Luciana Loureiro Penha Resultados

PMM L.major MTSKVILLFDVDGTLTPPRNPETQDMKETLA----------------ARAAGFKLGVVG

PMM L.mexicana MGSKAILLFDVDGTLTPPRNPETHDMKEALL----------------ARAAGFKLGVVG

PMM T.cruzi -MKKVLLLFDIDGTLTPPRLSQPDEVREVIR----------------AKSAGFTVGTVG

PMM L.major Opperdoes MSS---DAKVEQWLAWDRDPATRQIIESLAAKKDTAELRRRLETRMKFNTAGLRSTMGA

PMM L.major GS------DFAKQKEQLGDSILEDFDYVFSENGLLAYKDGTE------------HRNSL

PMM L.mexicana GS------DFAKQKEQLGESILEDFDYVFSENGLLAYKDGKE------------HRNSL

PMM T.cruzi GS------DLAKQIEQLGEDVFQQFDYVFAENGLLAYKHGKE------------HRQNL

PMM L.major Opperdoes SAHMNRLTVLQTAQGLAAYVKQQFAPAELSRGVVIGYDGRHHSREFGEITATVMHQQGV

PMM L.major LKALGNEKV--------VAFVKKCLHLI--DLDIPVQRGTFVEFRNGMFNVSPIGRNCS

PMM L.mexicana LRALGNEKV--------VAFVKKCLHLI--DLDIPVQRGTFVEFRNGMFNVSPIGRNCS

PMM T.cruzi LKELGNERI--------VKFVRRALRLL--ELDIPVQRGTFIEYRNGMINVCPIGRNCT

PMM L.major Opperdoes TYLYRHCVPTPFVPYGVKFFKALVGVMVTASHNPKEYNGLKVYWSNGAQIVAPLDVSIA

PMM L.major QQERDEFEQLDKE----------------------------------------------

PMM L.mexicana QQERDEFENLDKE----------------------------------------------

PMM T.cruzi QSERDEFEVYDKE----------------------------------------------

PMM L.major Opperdoes SIDANLTPLESSWAPFTAADHVDPYDVVFEDYFATLRSSYAPASDASAVRFTFTAMHGV

PMM L.major ---------RHI------REKLIRNLKEAFPDYP---------------AYSVGGQISF

PMM L.mexicana ---------RHI------REKLIRELKEAFPDYQ---------------AYSVGGQISF

PMM T.cruzi ---------HHV------REKLIKELQNSFPDYG---------------KYSIGGQISF

PMM L.major Opperdoes TRFTTHGLRHVLGLPASHLSVVAEQAEPNPDFPTVRFPNPEEGQSAFALSFATAGAHGA

PMM L.major DVF---PKGWDKTYCLQFVENDFEKIH--------------------------------

PMM L.mexicana DVF---PKGWDKTYCLQFVENDFETIH--------------------------------

PMM T.cruzi DVF---PVGWDKSYCLRFVENDFDEIH--------------------------------

PMM L.major Opperdoes VVLANDPDADRLAVAERLPNEEEGWHILTGNEIGALLGWWAMERARRQGIALERCLLIS

PMM L.major ---------------------------FFGDKTSEGGNDYEIYT---------------

PMM L.mexicana ---------------------------FFGDKTSEGGNDYEIFT---------------

PMM T.cruzi ---------------------------FFGDKTHAGGNDYEIYT---------------

PMM L.major Opperdoes VVSSCILKTMAAREGAQYSETLTGFKFMGNKALERKASEGLQTLFAYEEAIGFMWGERV

PMM L.major -----------------------DCRTIGHSVKTYK--------------TIAILEALL

PMM L.mexicana -----------------------DSRTIGHSVKTYK--------------TIAILEALL

PMM T.cruzi -----------------------DKRIIGHAVKSYK--------------TVDEVNKLI

PMM L.major Opperdoes DKDGVTAAVVVADLACYLRKEKQCSLVEHLQSLYRQYGYHFTHNSYMTIDDPSRTEALL

PMM L.major EESR-------------------------------------------------------

PMM L.mexicana EDSR-------------------------------------------------------

PMM T.cruzi SS-K-------------------------------------------------------

PMM L.major Opperdoes SIRTAASGDYPSQVAGRPVTRVVDLAAQVDTATPSRRPSLGKTPMITLHVDGGMSITIR

PMM L.major ---------------------------------------------------------

PMM L.mexicana ---------------------------------------------------------

PMM T.cruzi ---------------------------------------------------------

PMM L.major Opperdoes GSGTEPKIKWYAELVTKDAAGQQVLNAFVAKAVRQLMQPHKFGLIMRPEDAETFSKL

Figura 27– Alinhamento da seqüência da PMM/PGM de

L. major (LmjF34.3738)

citada no trabalho de Opperdoes & Szikora (2006) com a PMM de

T. cruzi

(Tc00.1047053510187), PMM de

L. mexicana (LmAB5062) e PMM de L. major

(LmjF36.1960). O alinhamento foi realizado utilizando programa CLUSTALW. Em amarelo,

os resíduos conservados e em vermelho, o motivo PTS1 de encaminhamento para

glicossomo.

Luciana Loureiro Penha Resultados

Como nenhum motivo clássico de encaminhamento para glicossomo foi encontrado

na TcPGM, utilizamos como base as seqüências de proteínas glicossomais identificadas em

L. major, T. cruzi e T. brucei (Opperdoes e Szikora, 2006), realizamos uma busca manual de

motivos putativos de encaminhamento para o glicossomo. Identificamos 5 motivos putativos

do tipo PTS, distribuídos em diferentes domínios da proteína. Destes, 4 representam motivos

com seqüência semelhante às do tipo PTS-1, porém encontradas distribuídas pela proteína e

não no C-terminal, e um representava um motivo do tipo PTS-2, como pode ser visto na

(Figura 28). Portanto, é possível que motivos de endereçamento do tipo I-PTS encontrados na

TcPGM sejam funcionais, mediando a ligação da enzima a transportadores que seriam

responsáveis pelo direcionamento aos glicossomos.

Figura 28– Seqüência gênica e de aminoácidos da PGM de

T. cruzi com motivos

putativos de encaminhamento para glicossomo assinalados. Grifados em amarelo estão os

motivos que podem ser responsáveis pelo encaminhamento da PGM para glicossomo, que

foram selecionados manualmente usando como base os motivos selecionados através da

predição

in silico de motivos PTS em Tripanossomatídeos (Opperdoes e Szikora, 2006).

Luciana Loureiro Penha Resultados

atgaatctgggcgaaacccagtgtttagtatttcaaataatgctcgacgtgaaaaaagtg

M N L G E T Q C L V F Q I M L D V K K V

ccaacaaggccctttattgatcaaaaaccaggaacgtggggacttcgcaagaaagtgagg

P T R P F I D Q K P G T W G L R K K V R PTS2

gtgttccagcaagaaaactatctagccaactttattcaaagcacttttaatgccattggg

V F Q Q E N Y L A N F I Q S T F N A I G

aaacaggggatgattcccgatacccttgtccttggtggtgacgggcggtactttctctct

K Q G M I P D T L V L G G D G R Y F L S

gaggctattcagatcattatcaaattggctgctgccaatggggtatcaaatgtttgggtg

E A I Q I I I K L A A A N G V S N V W V

ggtaaagatggtcttctctcaacccctgccgtgtcaaacatcatccgtcaacgaagggat

G K D G L L S T P A V S N I I R Q R R D

ggtgatgtcacggcgaagggagcctttattctcacagcaagtcataatcccggtggccct

G D V T A K G A F I L T A S H N P G G P

gaggaagattttggtatcaagtacaatacagaaaatggaggacctgcggctgagaaaatc

E E D F G I K Y N T E N G G P A A E K I

acttctgttatttacgaagagaccttgaaaattgatcattttctgacctgcccaaatatt

T S V I Y E E T L K I D H F L T C P N I

ggcacagtgaacgtgtcagaaatgggtgaccatgtatttgagaggttcagagtttcggta

G T V N V S E M G D H V F E R F R V S V

atccatagcacagaggattacgtccagagcatgaagaaaatctttgactttcaaagtatc

I H S T E D Y V Q S M K K I F D F Q S I

cgaaatctgttaaatagaactgattttacgattcggttggatggcttaagtggtattggg

R N L L N R T D F T I R L D G L S G I G

ggcccttatatgaaggatatttttgtttcttccttgggcgttccagaaagtgctttgtgc

G P Y M K D I F V S S L G V P E S A L C PTS1

ggtgctacgccattgccggactttggtaagcaacatccggatccaaacctcacatatgcg

G A T P L P D F G K Q H P D P N L T Y A

aaggagcttgtgagaaccatgggacttgattccaccggcagacctgttgctgactttgtt

K E L V R T M G L D S T G R P V A D F V

ggcgaggtgccgaactttgctgcggcgtttgatggggatgcagatcgtaatatgattctt

G E V P N F A A A F D G D A D R N M I L

ggcgagcgtttttttgtaacaccgtctgattctttggcaattctttcagcaaatgcaaat

G E R F F V T P S D S L A I L S A N A N

gtcgtgccattttttgctcaacaaggtggaattaaagcggtagcgagatctatgccgacg

V V P F F A Q Q G G I K A V A R S M P T

agtggagctgttgaccgtgttgcggaaatgcatcaccttaaaatatttgaagttcccaca

S G A V D R V A E M H H L K I F E V P T PTS1

ggttggaagttttttgggaatctgatggacagccgggagttatttggaggtgaagattac

G W K F F G N L M D S R E L F G G E D Y

aatcctctcatttgtggagaggaaagctttggtactggtagcaaccatattcgtgagaag

N P L I C G E E S F G T G S N H I R E K

gatggcgtgtgggcagcgttattttggctatcggtaattgcgagtaaaaatgtggatcca

D G V W A A L F W L S V I A S K N V D P

tcaaagcctcttgtgggtgtaaaagacattgttgaagaccactggacgcgctacgggcgg

S K P L V G V K D I V E D H W T R Y G R

aactactactgtcgatacgactatgaaaatgtggcagaggactcagccaaggctgtgatg

N Y Y C R Y D Y E N V A E D S A K A V M

gagactgtacagaggcagcgcccccaggacattccctccttgcagggaaaacgctgtgtc

E T V Q R Q R P Q D I P S L Q G K R C V

aaggttgacaactttgagtaccacgaccctgtagacggtttggtctccaaaaatcagggc

K V D N F E Y H D P V D G L V S K N Q G

attcgtgtgatatttgaagatggttctcgatttgtgattcgtttaagcggaactggatcg

I R V I F E D G S R F V I R L S G T G S

tcaggcgccacaattcgactatacctggagcattacatggagcccaatgccgtagcacgg

S G A T I R L Y L E H Y M E P N A V A R PTS1

catatccgtgacggcacgctgcctactcctcaatctgcgctggccaatctcatcgccgtt

H I R D G T L P T P Q S A L A N L I A V

gcgttgaatgtctcacagatttcggagcttacggggcgtgacgcccccacagtcatcact

A L N V S Q I S E L T G R D A P T V I T PTS1

tga-

Luciana Loureiro Penha Resultados

Para dar continuidade aos nossos estudos, adotamos a estratégia de transfecção gênica

T. cruzi para investigarmos a(s) região(ões) da molécula que poderiam ser responsáveis

pelo encaminhamento da PGM para os glicossomos. Primeiramente, o gene completo da

TcPGM (sem o códon de terminação – tga) foi clonado em fusão com o gene que codifica a

proteína fluorescente verde (Green F

luorescent Protein - GFP) no vetor de expressão pTEX,

para ser introduzido em epimastigotas do

T. cruzi por eletroporação. Como controle, foi

utilizado o vetor contendo apenas a proteína GFP. Para se determinar o domínio da TcPGM

responsável por seu endereçamento a glicossomos, foram realizadas construções gênicas em

fusão com a GFP, contendo deleções sucessivas de fragmentos gênicos que poderiam

codificar os domínios PTS putativos para o encaminhamento. Foram elaboradas 6

construções diferentes (Figura 29): (A) o gene que codifica para GFP, (B) construção que

contém o primeiro motivo putativo de encaminhamento para glicossomo “RVFQQENVL”

(oligonucleotídeos utilizados PGMF/CTRI), (C) construção que contém os motivos putativos

“RVFQQENVL” e “SSL” (PGMF/CTRII), (D) construção que contém os motivos

“RVFQQENVL”, “SSL” e “HHL” (PGMF/CTRIII), (E) construção que contém os motivos

“RVFQQENVL”, “SSL”, “HHL” e “PNA” (PGMF/CTRIV) e (F) construção que contém os

motivos “RVFQQENVL”, “SSL”, “HHL”, “PNA” e “SEL” (PGMF/FullPGM).

Todas as construções foram elaboradas por PCR utilizando-se oligonucleotídeos

complementares a seqüências específicas da

pgm de T. cruzi. Os fragmentos de PCR obtidos

(Figura 30), foram purificados e clonados no vetor de expressão pTEX e foram seqüenciados

para confirmação da seqüência e inserção correta no vetor de expressão.

Luciana Loureiro Penha Resultados

Figura 29: Representação esquemática das construções da TcPGM em fusão com a

GFP. O retângulo superior indica a TcPGM completa com os motivos de endereçamento a

peroxisomas/glicossomos putativos identificados

in silico (Opperdoes e Szikora, 2006) . Os

números indicam as posições dos resíduos de aminoácidos na seqüência da TcPGM e as

letras indicam os resíduos que compõem cada motivo. Os retângulos inferiores representam

as construções gênicas em fusão com a GFP que foram introduzidas no

T. cruzi. Os números

ao final de cada barra indicam o último resíduo de aminoácido da TcPGM presente em cada

construção.

PTS2

RVFQQENYL

41-49

SSL

250-252

HHL

371-373

PNA

555-557

SEL

588-590

PTS1

TcPGM

260 aa

GFP

380 aa

GFP

560 aa

GFP

CTR2

CTR3

CTR4

CTR1

60 aa

GFP

PGMF

600 aa

GFP

FullPGM

PGMF

RVFQQENYL

SSL

HHL

PNA

SEL

PTS2

RVFQQENYL

41-49

SSL

250-252

HHL

371-373

PNA

555-557

SEL

588-590

PTS1

TcPGM

260 aa

GFP

260 aa

GFPGFP

380 aa

GFP

380 aa

GFPGFP

560 aa

GFP

560 aa

GFPGFP

CTR2

CTR3

CTR4

CTR1

60 aa

GFP

PGMF

CTR1

60 aa

GFP

PGMF

60 aa

GFPGFP

PGMFPGMF

600 aa

GFP

FullPGM

PGMF

600 aa

GFP

600 aa

GFPGFP

FullPGM

PGMFPGMF

RVFQQENYL

SSL

HHL

PNA

SEL

Luciana Loureiro Penha Resultados

Figura 30– Amplificação por PCR das diferentes seqüências gênicas para as

construções da PGM-GFP. Um µg de DNA da maxi-prep pET28a

/PGM foi utilizado como

molde para reações de PCR com os diferentes oligonucleotídeos: (1) PGMF/CTR1, (2)

PGMF/CTR2, (3) PGMF/CTR3, (4) PGMF/CTR4 e (5) PGMF/FullPGM . Os produtos foram

visualizados em gel de agarose 0,8% e os fragmentos purificados clonados no plasmídeo

pTEX nos sítios

SmaI/EcoRI.

Após confirmação por seqüenciamento gênico, as diferentes construções foram

introduzidas nos parasitos por eletroporação. As populações selecionadas foram

primeiramente avaliadas quanto à expressão da PGM fusionada a GFP nos parasitos

transfectados, por Western Blot. Lisados dos parasitos transfectados foram avaliados com

anticorpos anti-PGM (camundongo) e anti-GFP (Figura 31). Foi verificado que a proteína de

fusão PGM-GFP foi expressa com sucesso nos parasitos transfectados, tendo o grau de

expressão similar nos diferentes parasitos. Pode-se observar com o anti-PGM na canaleta (1)

que, como esperado, apenas a PGM endógena foi reconhecida, já que a construção contém

apenas a GFP controle; porém na canaleta (2), a construção que contém apenas 60

2,0

0,25

0,5

1,5

0,75

1,0

12 3 4 5

2,0

0,25

0,5

1,5

0,75

1,0

12 3 4 5

Luciana Loureiro Penha Resultados

aminoácidos da proteína PGM, também só foi reconhecida a PGM endógena, possivelmente

porque nenhum epítopo foi reconhecido pelo anticorpo nesse pequeno fragmento da proteína.

Figura 31- Expressão da PGM fusionada a GFP nos parasitos transfectados. Lisados

de epimastigota das diferentes construções foram aplicados em gel SDS-PAGE 11%,

transferido para membrana de nitrocelulose, bloqueada com 9% de leite em PBS 0,05%

Tween-20 e incubados com anti-PGM (1:2000) e anti-GFP (1:100). Os extratos protéicos

correspondem aos parasitos transfectados com (1) somente a GFP, (2) construção

PGMF/CTRI, (3) construção PGMF/CTRII, (4) construção PGMF/CTRIII, (5) construção

PGMF/CTRIV e (6) construção PGMF/FullPGM. As bandas foram visualizadas usando

solução BCIP-NBT, conforme protocolo do fabricante.

Após verificar que a proteína de fusão PGM-GFP estava sendo expressa em todos os

transfectantes, fomos avaliar por microscopia de fluorescência a localização sub-celular

dessas proteínas na forma epimastigota de

T. cruzi. A presença da proteína de fusão em

glicossomos pode ser confirmada por co-localização com anticorpos anti-aldolase. Como

pode ser observado os parasitos transfectantes contendo pTEX apenas com a GFP

apresentaram a GFP de forma citoplasmática (Figura 32 A), pTEX contendo a construção

100

150

1 2 3 4 5 6

kDa

100

150

250

Anti-GFP

Anti-PGM

kDa

1 2 3 4 5 6

100

150

1 2 3 4 5 6

kDa

100

150

250

Anti-GFP

1 2 3 4 5 6

kDa

100

150

250

Anti-GFP

kDa

100

150

250

Anti-GFP

Anti-PGM

kDa

1 2 3 4 5 6

Anti-PGM

kDa

1 2 3 4 5 6

Luciana Loureiro Penha Resultados

PGMF/CRTI apresentaram a GFP de forma citoplasmática (Figura 32 B) e pTEX contendo a

construção PGMF/CTRII também apresentaram a GFP de forma citoplasmática (Figura 32

C). Já os parasitos transfectados com a construção PGMF/CTRIII apresentaram a GFP co-

localizada com a marcação do anticorpo anti-aldolase, no glicossomo (Figura 32 D), assim

como as construções PGMF/CTRIV (Figura 32 E) e PGMF/FullPGM (Figura 32 F).

Essa estratégia permitiu identificar que a seqüência gênica que codifica os

aminoácidos entre 261 a 380 foi capaz de promover o endereçamento da GFP a glicossomos

(Figura 33). Logo, essa enzima pode estar sendo encaminhada para essas organelas por um

mecanismo alternativo ainda não caracterizado, envolvendo a participação de um I-PTS

putativo, um mecanismo ainda não descrito em

T. cruzi.

Figura 32– Sub-celular localização da PGM-GFP em

T. cruzi. Parasitos foram

centrifugados, lavados 3 vezes com PBS e fixados com 4% paraformaldeído por 10 min a

temperatura ambiente. Depois da fixação as células foram aderidas com poly-L-lisina. Para a

marcação com aldolase, as células foram permeabilizadas com 1% de NP40 em PBS e

incubadas com soro policlonal de coelho contra a proteína recombinante aldolase de

brucei

, marcador de glicossomo. As células foram analisadas por imunofluorescência. Em

(A) construção pTEX somente com GFP, (B) construção PGMF/CTRI, (C) construção

PGMF/CTRII, (D) construção PGMF/CTRIII, (E) construção PGMF/CTRIV e (F)

construção PGMF/FullPGM. As setas indicam a co-localização no glicossomo. Escala da

barra 4 µm.

Luciana Loureiro Penha Resultados

GFP Aldolase Merge

GFP Controle

GFP

GFP Aldolase Merge

GFP Controle

GFP Aldolase MergeGFP Aldolase Merge

GFP Controle

GFP

GFPGFP

60 aa

GFP

CTR1

CTRI

GFP Aldolase Merge

60 aa

GFP

CTR1

60 aa

GFP

CTR1

CTRI

GFP Aldolase MergeGFP Aldolase Merge

GFP Aldolase

CTRII

Merge

260 aa

GFP

CTR2

GFP Aldolase

CTRII

Merge

260 aa

GFP

CTR2

GFP Aldolase

CTRII

Merge

260 aa

GFP

CTR2

260 aa

GFP

CTR2

260 aa

GFP

260 aa

GFPGFP

CTR2

Luciana Loureiro Penha Resultados

GFP Aldolase MergeCTRIII

380 aa

GFP

CTR3

GFP Aldolase MergeCTRIII

380 aa

GFP

CTR3

GFP Aldolase MergeCTRIII

380 aa

GFP

CTR3

380 aa

GFP

CTR3

380 aa

GFP

380 aa

GFPGFP

CTR3

GFP Aldolase Merge

CTRIV

560 aa

GFP

CTR4

GFP Aldolase Merge

CTRIV

560 aa

GFP

CTR4

560 aa

GFP

CTR4

560 aa

GFP

560 aa

GFPGFP

CTR4

GFP Aldolase Merge

PGM inteira

600 aa

GFP

Full PGM

GFP Aldolase Merge

PGM inteira

600 aa

GFP

Full PGM

600 aa

GFP

Full PGM

600 aa

GFP

600 aa

GFPGFP

Full PGM

Luciana Loureiro Penha Resultados

260 aa

GFP

CTR2

380 aa

GFP

CTR3

60 aa

GFP

CTR1

560 aa

GFP

CTR4

600 aa

GFP

Full PGM

C G

+ -

+ +

260 aa

GFP

CTR2

380 aa

GFP

CTR3

60 aa

GFP

CTR1

560 aa

GFP

CTR4

600 aa

GFP

Full PGM

260 aa

GFPGFP

CTR2

380 aa

GFP

CTR3

380 aa

GFP

380 aa

GFPGFP

CTR3

60 aa

GFP

CTR1

60 aa

GFP

CTR1

560 aa

GFP

CTR4

560 aa

GFP

CTR4

560 aa

GFP

560 aa

GFPGFP

CTR4

600 aa

GFP

Full PGM

600 aa

GFP

Full PGM

600 aa

GFP

600 aa

GFPGFP

Full PGM

C G

+ -

+ +

Figura 33 – Esquema das diferentes construções de fragmentos da proteína PGM de

cruzi

fusionada a GFP. As proteínas que se localizam no citoplasma (C) foram marcadas com

sinal (+) e as que não se encontram com sinal (-). O mesmo foi feito para proteínas

localizadas no glicossomo (G). A seta vermelha indica a construção que começou a ser

encaminhada para glicossomo.

Luciana Loureiro Penha Discussão

Com os resultados obtidos nessa tese, foi possível a caracterização sub-celular da

PGM de

T. cruzi no interior de organelas especializadas denominadas glicossomos, e foi

comprovado que uma região compreendendo 100 aminoácidos localizada na porção interna

da TcPGM (I-PTS) é capaz de endereçar essa proteína aos glicossomos. O fato de a PGM ser

uma enzima essencial para o metabolismo do parasito, e da TcPGM apresentar uma

localização diferenciada da PGM humana, sendo direcionada para uma organela específica de

tripanosomatídeos, através de um mecanismo alternativo de endereçamento intracelular,

tornam o estudo desta enzima atrativo para a geração de novos agentes quimioterápicos

contra a doença de Chagas.

A partir do uso de diferentes construções gênicas contendo fragmentos da TcPGM

fusionados à GFP, determinamos que o motivo de encaminhamento desta proteína para os

glicossomos está contido entre os aminoácidos 261 e 380. Porém, algumas questões ainda

faltam ser respondidas, como: esse domínio por si só é capaz de direcionar qualquer proteína

para o glicossomo? A seqüência de endereçamento é linear ou deve apresentar uma

conformação tridimensional específica para ser reconhecida? Este motivo I-PTS é

diretamente reconhecido por um receptor, similar a PEX5 ou PEX7? Ou existe alguma outra

proteína contendo domínios PTS1 e/ou PTS2 que interage com a TcPGM e promove o seu

transporte indireto?

Nossos resultados também demonstraram que a PGM da forma procíclica de

Leishmania major apresentava-se no interior de glicossomos, uma observação original.

Futuramente, as mesmas ferramentas utilizadas nesse trabalho poderão ser utilizadas para se

caracterizar o motivo de endereçamento da PGM em

L. major. Um dado surpreendente foi

que nenhuma seqüência similar da PGM de

T. cruzi e L. major foi encontrada após busca no

banco genômico de

T. brucei, dado também relatado por Opperdoes e Szikora (2006).

Luciana Loureiro Penha Discussão

Acreditamos que é pouco provável que este gene esteja ausente do genoma de

T. brucei, pois

essa enzima parece ser vital para o metabolismo. É possível que a PGM do

T. brucei possua

baixos níveis de similaridades com a PGM de outros tripanossomatídeos ou que a atividade

de PGM pode estar sendo executada por outra enzima como a PMM.

Através de análise computacional nenhum consenso clássico de endereçamento de

proteínas glicossomais foi identificado na TcPGM, o que sugere fortemente a existência de

um mecanismo diferente de encaminhamento desta proteína para o glicossomo em

T. cruzi.

Nossos resultados demonstraram que a TcPGM seria encaminhada ao glicossomo através de

uma região interna na proteína, compreendida entre os aminoácidos 261-380, responsável por

seu encaminhamento, direto ou indiretamente.

Algumas proteínas que contêm motivos I-PTS já foram descritas, como por exemplo:

malato sintase em

Hansenula polymorpha (Bruinenberg et al., 1990); oxidases acil-CoA em

Candida tropicalis (Small et al., 1988), Candida maltosa (Hill et al., 1988) e S. cerevisiae

(Dmochowska et al., 1990); isoenzima fosfoglicerato quinase (PGK) em T. brucei (Peterson

et al., 1997) e trifosfato isomerase (TIM) em T. brucei (Moyersoen et al., 2004), porém

nenhuma proteína apresentando I-PTS foi descrita em

T. cruzi.

As proteínas que contêm I-PTS podem ser encaminhadas para a matriz do

peroxissomo/glicossomo através de transporte indireto, por formação de um complexo

heteromérico com proteínas que contêm os motivos PTS1 ou PTS2. Segundo Moyersoen e

colaboradores (2004), esse mecanismo de transporte indireto é objetivo para a pesquisa de

novos alvos de agentes quimioterápicos capazes de interferir especificamente na biogênese de

glicossomos de tripanosomatídeos, já que a possibilidade dos motivos de interação proteína-

proteína ser conservada entre o parasito e seu hospedeiro é muito pequena. Por exemplo,

segundo os autores, a seqüência de 22 aminoácidos presente na proteína TIM de

T. brucei,

Luciana Loureiro Penha Discussão

que foi identificada como responsável pelo encaminhamento da proteína para o glicossomo, é

muito diferente da região correspondente nas proteínas TIM de outros organismos não

tripanossomatídeos. A seqüência não foi encontrada em nenhuma outra proteína glicossomal,

sendo, portanto, única, e podendo ser utilizada como alvo no desenvolvimento de um

quimioterápico específico que perturbe esta interação, ou seja, interrompendo o

encaminhamento da proteína TIM para o glicossomo. Os autores sugerem que essa

abordagem poderia ser utilizada para impedir o encaminhamento de qualquer outra proteína

que apresente o motivo I-PTS.

Opperdoes & Szikora (2006) realizaram a análise computacional do genoma de

tripanossomatídeos na busca por genes que codificavam proteínas glicossomais e relataram

que a PGM de

L. major, assim como a PGM de T. cruzi, apresentava um motivo PTS1 de

encaminhamento para glicossomo (SKL). A seqüência da TcPGM já caracterizada pelo

nosso grupo (Penha

et al, 2005) e a PMM já caracterizada em L. mexicana (Garami et al.,

2001) foram utilizadas para a busca da seqüência da PGM e PMM de

L. major. Porém, após

realização do alinhamento das seqüências da PGM e PMM de

T. cruzi, L. mexicana e L.

major

não foram encontrados motivos clássicos de encaminhamento para o glicossomo. As

seqüências citadas no trabalho podem ser de genes que codificam uma proteína PGM/PMM,

como encontrada em bactérias, porém que não estão mais sendo expressas.

S. cerevisiae a análise por microscopia eletrônica de transmissão de anticorpos

que reconhecem proteínas contendo o motivo PTS1 demonstrou sua presença no interior de

peroxissomos (Walton

et al., 1995). Três possíveis mecanismos de transporte de proteínas

oligoméricas através da membrana peroxissomal foram sugeridos: (1) a existência de um

poro na membrana do peroxissomo similar ao poro nuclear, onde um canal transiente poderia

se abrir em resposta a um estímulo na membrana (Hettema

et al., 1999); (2) a internalização

Luciana Loureiro Penha Discussão

através de invaginação de parte da membrana peroxissomal, num processo similar à

endocitose (McNew & Goodman, 1994); (3) ou o revestimento de proteínas na dupla

membrana, formando uma vesícula na membrana externa que se fusionaria à membrana

interna, essa parte da membrana interna seria degradada e o conteúdo da vesícula liberado no

lúmen do peroxissomo (Eckert & Erdmann, 2003).

A partir de manipulação genética foi demonstrado que a redução na expressão de

diversas peroxinas em tripanosomatídeos leva à redução da viabilidade destes parasitos. Esses

resultados sugerem que há possibilidade das peroxinas serem responsáveis pela biogênese

dos glicossomos, essenciais à viabilidade desses microrganismos. O baixo nível de

conservação entre as seqüências das peroxinas dos tripanossomatídeos e de humanos faz com

que essas proteínas sejam alvos promissores para o desenvolvimento de drogas tripanocidas.

Com este objetivo, pesquisas vêm sendo desenvolvidas visando determinar a interação

transitória entre os diferentes grupos de proteínas envolvidas na biogênese dos glicossomos, a

níveis molecular e protéico. Esses estudos podem trazer bases sólidas para o futuro desenho

de peptido-domínios e outros compostos que possam interferir, seletivamente, nessas

interações sem afetar as envolvidas entre proteína-proteína da célula hospedeira (Moyersoen

et al., 2004).

Das 32 peroxinas identificadas até o momento, apenas 3 estão envolvidas na síntese

de proteínas de membrana peroxissomais e na sua inserção na membrana do peroxissomo:

PEX3, PEX19 e PEX16. Estudos demonstraram a associação das proteínas PEX3 e PEX19

através do domínio C-terminal, sendo esta interação necessária e alvo para que outras

proteínas de membrana peroxissomal sejam reconhecidas na membrana (Hazra

et al., 2002).

A PEX19 está localizada no citoplasma e parcialmente inserida na membrana do peroxissomo

Luciana Loureiro Penha Discussão

e alguns autores sugerem que a PEX19 poderia atuar como chaperona na membrana

peroxissomal (Snyder

et al., 2000; Fransen et al., 2001).

Saveria e colaboradores (2007) demonstraram que a especificidade de ligação da

proteína PEX19 de

T. brucei na membrana glicossomal é muito similar à encontrada na

PEX19 de humanos e leveduras. Estes autores construíram uma proteína fusionada baseada

na seqüência gênica humana da proteína responsável pelo transporte de ácidos graxos de

cadeia longa na membrana peroxissomal, adrenoleucodistrofina (ALDP), fusionada ao gene

que codifica para GFP, e transfectaram esta construção na forma procíclica de

T. brucei.

Após a transfecção, a proteína de fusão GFP-HsALDP foi encaminhada para os glicossomos

T. brucei, confirmando que a TbPEX19 reconhece a mesma região em proteínas de

membrana peroxissomal de humanos. Trabalhos anteriores já haviam demonstrado a

interação da proteína ALDP de humanos (Hs) e leveduras com domínios trans-membrana e

sítios de ligação de PEX19 (Halback

et al., 2005). Esta observação é de interesse especial,

devido à baixa homologia entre as duas proteínas PEX19. Nesse mesmo trabalho, os autores

expressaram a proteína PEX14 de

T. brucei em fusão com a proteína GFP em fibroblastos

humanos para determinar a sua localização. No entanto, a proteína de fusão GFP-TbPEX14

foi localizada no citoplasma, não sendo encaminhada para peroxissomo. Esse resultado

demonstrou que TbPEX14 não é reconhecida pelo mecanismo de encaminhamento de

proteínas peroxissomais de humanos, sugerindo que a maquinaria seja distinta.

As peroxinas 5 e 7 são os receptores no citoplasma responsáveis pelo

encaminhamento das proteínas para o interior dos peroxissomos/glicossomos. Galland e

colaboradores (2007) realizaram o bloqueio da expressão dos dois genes que codificam para

PEX5 e PEX7 em

T. brucei por interferência de RNA (RNAi). A deleção dos genes resultou

em um efeito severo no crescimento, culminando com a morte de ambas as formas do

Luciana Loureiro Penha Discussão

parasito. Na forma procíclica, o bloqueio da expressão isolada de cada um dos genes que

codificam para PEX5 ou PEX7 resultou na localização citoplasmática das proteínas que

continham o motivo PTS1, PTS2 ou I-PTS. Por outro lado, na forma sanguínea, a deleção de

PEX7 afetou apenas o endereçamento de proteínas que continham o motivo PTS2. O fato da

deleção de PEX5 estar envolvida no encaminhamento de proteínas com os motivos PTS1 e

PTS2, confirmou resultados prévios que demonstraram a interação das proteínas PEX5-PEX7

(Hayashi

et al., 2005; Woodward & Bartel, 2005). Embora os receptores responsáveis pelo

encaminhamento de proteínas que contenham o motivo I-PTS ainda não tenham sido

caracterizados, os resultados discutidos acima sugerem que este mecanismo é dependente de

PEX5/PEX7. Os autores não justificam ou sugerem o porquê que a deleção de PEX7 alterou

apenas o encaminhamento de proteínas contendo o motivo PTS2 e não I-PTS na forma

sanguínea.

Dispondo das seqüências de PEX5 e PEX7 de

T. brucei, realizamos buscas em bancos

de dados genômicos para a identificação da seqüência gênica de

PEX5 e PEX7 de T. cruzi

(Anexo II e III). Conhecendo essas seqüências, futuramente será possível investigar as

proteínas que interagem com o domínio de endereçamento da TcPGM, podendo as TcPEX5 e

TcPEX7 serem clonadas e expressas para produção de proteínas recombinantes.

A presença da PGM no glicossomo sugere que a compartimentalização da biossíntese

de açúcar nucleotídeos em

T. cruzi está dispersa em diferentes compartimentos sub-celulares.

A UDP-Glc, por exemplo, deve necessariamente transitar pelo citoplasma, de onde ela é

transportada para o lúmen do retículo endoplasmático e do Golgi para ser incorporada a

proteínas e lipídeos. Entretanto, não se sabe até o momento se ela é formada já no citoplasma

ou se é produzida no interior dos glicossomos e posteriormente exportada para o citosol.

Luciana Loureiro Penha Discussão

Segundo Roper e colaboradores (2005), caso a Glc-1-P fosse formada no interior dos

glicossomos, este açúcar teria que ser transportado para o citoplasma, onde ocorreria a reação

com UTP, via a ação da UDP-glucose-pirofosforilase para a formação de UDP-Glc. De

acordo com os autores, a seqüência de aminoácidos prevista para a UDP-glucose-

pirofosforilase de

T. brucei (Tb10.389.0330) não possui nenhum motivo conhecido de

encaminhamento para o glicossomo, o que sugere que a enzima seja citoplasmática.

Entretanto, não podemos excluir a possibilidade de que UDP-glucose-pirofosforilase seja

transportada para o glicossomo através de vias alternativas ainda não identificadas. Neste

caso, a UDP-Glc, e não a Glc-1-P, precisaria ser exportada dos glicossomos para o

citoplasma, para ser incorporada a proteínas e lipídeos (Anexo IV).

Em contrapartida, se a UDP-Glc só fosse formada no citoplasma, esse produto teria

que voltar para o interior do glicossomo, onde iria reagir com a enzima UDP-Glc 4’-

epimerase, enzima já caracterizada no interior do glicossomo (Roper

et al., 2005), para

formação do substrato UDP-Gal. Este açúcar ativado seria então transportado de volta para o

citoplasma, por algum transportador específico ainda não caracterizado, e direcionado para o

lúmen do retículo endoplasmático ou do Golgi, onde serve de substrato para

glicosiltransferases.

Com o seqüestramento de enzimas para o glicossomo, não apenas as enzimas da via

glicolítica mas também de enzimas que participam da biossíntese de açúcar nucleotídeos

levantam uma série de novas perguntas. Que molécula é transportada para fora do

glicossomo, Glc-1-P ou UDP-Glc? Que transportador realiza essa tarefa? Essas e outras

perguntas motivam mais pesquisas moleculares, bioquímicas, ultraestruturais e fisiológicas

sobre o glicossomo, organela única em tripanosmatídeos.

Luciana Loureiro Penha Discussão

100

Roper e colaboradores (2005) verificaram que a enzima UDP-4-epimerase se encontra

no glicossomo. Como a PGM participa da formação de Glc-1-P que vai sofrer a ação da

enzima UDP-glucose pirofosforilase, formando UDP-Glc que é substrato da enzima UDP-4-

epimerase, havendo uma grande possibilidade da TcPGM também estar localizada no

glicossomo, o que condiz com nossos resultados.

Michels e colaboradores (1986) caracterizaram duas isoenzimas da gliceraldeído

fosfato desidrogenase (GAPDH), uma residente no glicossomo e outra no citoplasma. Os

autores relataram que a enzima glicossomal era codificada por dois genes idênticos situados

em “tandem” no genoma do parasito. Esse gene codifica uma proteína de 358 aminoácidos,

sendo a proteína de maior tamanho encontrada, quando comparada com a de outros

organismos. Através de experimentos de hibridização e por análise de proteínas, os autores

constataram que as enzimas citoplasmática e glicossomal eram diferentes, apresentando 56%

de homologia. O mesmo não ocorreu para enzima fosfoglicerato quinase (PGK) que

apresentou 95% de homologia entre a PGK citoplasmática e a glicossomal (Osinga

et al.,

1985).

Apesar do anticorpo contra TcPGM ter reconhecido a proteína no citoplasma e no

glicossomo, demonstramos em análise por

Southern Blot (Penha et al., 2005) (Anexo I) que a

TcPGM é codificada por um gene de cópia única. Isso não exclui a possibilidade de haver

uma outra isoforma da TcPGM com baixa similaridade que codifique a enzima

citoplasmática, porém apresentando epítopos conservados com a proteína glicossomal. Por

outro lado, sendo a PGM sintetizada no citoplasma e direcionada ao glicossomo, existe a

possibilidade do anticorpo estar reconhecendo a proteína em trânsito.

A PGM é responsável pela manutenção dos níveis relativos de Glc-1-P e Glc-6-P em

eucarioto. No entanto, no

T. cruzi, alterações na sua atividade também provocam efeitos no

Luciana Loureiro Penha Discussão

101

metabolismo de galactose, uma vez que, o parasito não transporta galactose. Isto sugere a

grande importância dessa atividade na espécie. Efeitos drásticos para o crescimento de

tripanossomatídeos podem ser observados quando o metabolismo de galactose é alterado,

como pode ser visto nos exemplos citados abaixo.

Roper e colaboradores (2005) tentaram realizar a deleção do gene

TbGALE que

codifica para UDP-Glc4’- epimerase, enzima que realiza a interconversão de UDP-Glc e

UDP-Gal, na forma procíclica de

T. brucei, porém só foi possível a deleção por

recombinação homóloga de apenas um alelo. Os parasitos perdem a viabilidade após a

deleção dos dois alelos, sugerindo que o gene

TbGALE deve ser essencial à forma procíclica

T. brucei. A partir desses resultados os autores obtiveram um mutante completo de forma

condicional através da inserção do gene da epimerase no lócus para o RNA ribossomal que

expressa constitutivamente uma T7 RNA polimerase e um repressor de tetraciclina. Na

presença de tetraciclina, as células multiplicaram-se normalmente, semelhantes a cepa

selvagem. No entanto, na ausência de tetraciclina os tripanossomas mutantes multiplicaram-

se por 8 dias e, após esse tempo, cessaram a divisão celular e começaram a morrer. Na forma

procíclica de

T. brucei, as unidades de galactose são encontradas, principalmente, na âncora

GPI da prociclina onde estão presentes cadeias de poli-

N-acetillactosamina. O fenótipo

apresentado pelo mutante condicionado foi a diminuição na massa molecular da prociclina e

o aumento na expressão dessas proteínas (em 10 X), fenótipos, provavelmente relacionados à

morte do parasito.

O gene

TbGALE é essencial na forma sanguínea de T. brucei. O mutante com a

deleção nos dois alelos só foi viável na forma condicional. O fenótipo apresentado por esse

mutante, após 24 h de cultivo na presença de tetraciclina, foi a diminuição substancial (80%)

nos níveis de UDP-Gal, com pouco ou nenhum efeito em outros açúcares nucleotídeos.

Luciana Loureiro Penha Discussão

102

Entretanto, após 48 h, foi possível observar a diminuição nos níveis de UDP-Glc e UDP-

GlcNAc, indicando um estresse metabólico mais complexo. Após 72 h de cultivo os níveis de

UDP-Gal não foram mais detectáveis, confirmando modificações no padrão de glicosilação

de proteínas do parasito. A glicoproteína variante de superfície da forma sanguínea do

brucei (VSG), na cepa selvagem, contém 5 sítios com unidades de galactose em sua

estrutura. Na análise estrutural da VSG mutante não foi detectada a presença de galactose.

Após 96 h a divisão celular foi cessada, a morfologia das células mostrou-se distinta da forma

normal dos parasitos, arredondada, e foi possível observar a formação de uma vesícula perto

da bolsa flagelar. Os autores sugerem que esses efeitos poderiam ser devido à ausência da

glicosilação correta de proteínas na via de reciclagem endocítica/exocítica (Nolan

et al.,

1999; Urbaniak

et al., 2006).

Tentativas de deleção gênica em

T. cruzi revelaram que o gene TcGALE também é

essencial para a forma epimastigota deste parasito. Com a deleção de apenas um alelo foi

possível analisar alguns fenótipos. A análise das mucinas no

T. cruzi, revelou um conteúdo

menor de unidades da galactose e a menor expressão (6 a 9 X) dessas moléculas na superfície

do parasito, em relação à cepa selvagem. Quando os GIPLs foram analisados, o conteúdo de

unidades de galactofuranose na cepa mutante foi menor (1 a 2 X) quando comparado com os

parasitos selvagens. Os autores sugerem que a deleção de um alelo

TcGALE tem um impacto

menor nos níveis e galactosilação dos GIPLs quando comparado com o das mucinas. As

células mutantes também apresentaram alterações marcantes na estrutura celular, evidenciado

pelo aparecimento de células mais aderentes, que se aglutinam através do corpo celular ou do

flagelo; células com o flagelo diminuído; com a superfície ondulada; aumento da incidência

de esferomastigotas nas culturas; e a presença de células com formato de uma noz (McRae

., 2006).

Luciana Loureiro Penha Discussão

103

O fenótipo encontrado com a deleção do gene que codifica a UDP-Glucose

4`epimerase na forma procíclica e sanguínea de

T. brucei e parcialmente da forma

epimastigota de

T. cruzi demonstra que a galactosilação de uma ou mais glicoproteína(s) é

essencial para a sobrevivência desses parasitos. MacRae e colaboradores (2006) sugerem que

se esse fenótipo também for encontrado na forma amastigota e tripomastigota de

T. cruzi, a

enzima epimerase, transportadores de UDP-Gal e galactosiltransferase UDP-Gal

dependentes, poderiam ser exploradas como alvo potenciais para drogas. Inibidores poderiam

ser desenhados a partir de análogos de substratos aceptores parasito-específicos.

A estrutura tridimensional da UDP-glucose 4’-epimerase de

T. brucei (TbGalE) foi

caracterizada e comparada à de humanos (HsGalE). Os autores verificaram semelhanças entre

a estrutura das enzimas do parasito e do mamífero, existindo uma pequena diferença no

domínio relativo ao nucleotídeo (NDR) presente na região C-terminal. A Gly237 em HsGalE

corresponde a Cys266 em

TbGalE e nesta Cys ocorre a presença de um grupamento tiol. Os

autores sugerem que esta diferença, embora envolvendo um único aminoácido, possibilitaria

estudos posteriores visando à inibição da enzima do patógeno (Shaw

et al., 2003).

Garami e colaboradores (2001) deletaram o gene que codifica para fosfomanomutase

(PMM) de

L. mexicana e foi verificada uma atividade de conversão de manose-6-fosfato em

manose-1-fosfato em torno de 10%, possivelmente resultante da atividade das enzimas PGM

e fosfo

-N-acetilglucosaminamutase, entretanto, a atividade residual de 10% não foi suficiente

para repor o defeito de glicosilação nas moléculas do parasito. A diminuição da expressão de

todos os glicoconjugados contendo manose nesse mutante foi suficiente para causar um

fenótipo avirulento. Logo, antes de inferirmos que a PGM é essencial para esses

tripanosomatídeos, é necessário analisar a compensação na formação da Glc-1-P, pela

Luciana Loureiro Penha Discussão

104

atividade das enzimas PMM e fosfo-

N-acetilglucosaminamutase. Em T. cruzi, esta análise só

poderia ser realizada após a deleção do gene que codifica a PGM.

A modulação da atividade da PGM também poderia interferir na viabilidade do

parasito, devido a alterações na homeostasia de Ca

, como ocorreu com a inibição da

atividade da PGM pelo lítio em

S. cerevisiae (Csretora et al., 2005). Os autores sugerem que

os níveis de Glc-1-P e Glc-6-P são diretamente responsáveis pela homeostasia Ca

celulares

da levedura. Como a PGM deve ser a enzima responsável por manter os níveis de Glc-1-

P/Glc-6-P também no

T. cruzi, podemos especular que ela poderia estar envolvida na

homeostasia de Ca

Vários estudos têm demonstrado que os tripomastigotas metacíclicos

para entrarem na célula hospedeira ativam, através de moléculas na sua superfície, cascata de

sinalização e mobilização de Ca

de ambas as células (Yoshida et al., 2000). Assim se o

bloqueio da atividade da PGM poderia também interferir nos níveis de Ca

nesse parasito,

outras vias vitais para o parasito poderiam ser alterados.

Luciana Loureiro Penha Conclusões

105

¾ O gene pgm de diferentes amostras de T.cruzi foi isolado e seqüenciado,

¾ O alinhamento da seqüência predita de aminoácidos demonstrou altos níveis de

conservação entre as amostras (99,8% a 99%),

¾ Os resíduos de aa das posições 3 e 16 das amostras apresentaram modificações com

mudança de carga, agrupando as amostras Dm28c, G, Brazil e X10/6 (

T. cruzi grupo 2),

enquanto ClBrener e Tulahen apresentaram sequência similar, como observado em análises

MLEE, elaboradas por Brisse

et al, 1998,

¾ A PGM em T. cruzi está associada a glicossomos, e de forma solúvel,

¾ As diferentes proteínas de fusão contendo domínios da TcPGM-GFP foram expressos

em linhagens de epimastigotas transfectados em níveis similares,

¾ A região da PGM compreendida entre os resíduos de aminoácidos 260 a 380

promoveu o endereçamento da proteína de fusão para glicossomos, sugerindo que este

domínio contém um I-PTS putativo,

¾ As proteínas de fusão TcPGM-GFP contendo domínios a partir do aminoácido 380

estão localizadas no glicossomo e citoplasma do parasito.

Luciana Loureiro Penha Anexos

106

Anexo I:

Luciana Loureiro Penha Anexos

107

Luciana Loureiro Penha Anexos

108

Anexo II:

Luciana Loureiro Penha Anexos

109

PEX5 T.brucei MDCGAGFALGQQLAKDALHMQGGVRPGTTGNVEQDALMTGMMVPP--TGPMEDWAQHFAA

PEX5 T.cruzi MDCSTGAAIGQQFAKDAFHMHGGVGVGPTGNPEHDVLMNEMMMVQTPTGPAGEWTHQFAA

PEX5 L.major MDCNTGMQLGQQFSKDVTMMHGGVPMSGAM-SEQDALMVSAQVGGASPMMAAQWAQNF--

***.:* :***::**. *:*** . : *:*.** : . :*:::*

PEX5 T.brucei HQHHHQQH--QQMMMQRQHNDALMIQQQHRDMEEAFRASARAGAPQQANAGPLMMPP---

PEX5 T.cruzi YQGKQQQQHPQELAMRHQQNDALMLRQQ-QEMEEAFCTLCAAHPHSHAHSHAHSHQPQGL

PEX5 L.major ----QQQQAMQAMRQQHEMEQAFQNSQQ-QQH--------AAVAQSGQMLGMAGPQQQQF

:**: * : ::: ::*: ** :: * . .

PEX5 T.brucei -GPMMMAGG-MAPMMH---AGGFMMGGMPQMMPCTPMGMNMGMAPVATMNPATTSTVSGA

PEX5 T.cruzi VGPAMMGPQIMPPMMFGPGSGGFMM-GTPPMMPYA----SMKFAGDAAMAAANNTTMTQG

PEX5 L.major MVQQQQQASMMNAAMMSQGMMTANM-GFGMMMPRT----QYQPLPNLSVLQPN-----QQ

* . * * * *** : . :: ..

PEX5 T.brucei REGATAVSSAAPGVVDLGGDSAWAEKLHQAEWGQDYKDVEVHTVEGSTAQTVEEHAKTSK

PEX5 T.cruzi ATATSTTSVQQEQQQQQSSDNGWVEKLRDAEWAQDYSDAQVFTLEGQSEQTMEEHAKNSE

PEX5 L.major QQQQQQLVNLAPAV----QDSAWADQLSQQQWSTDYSQVQTFSAPGMEDKTVEERIKDSE

*..*.::* : :*. **.:.:..: * :*:**: * *:

PEX5 T.brucei FYEFMDKIRKKELLVDEDSGEVVQGPGPDPDVEADTEYLARLAAMEGINVPPSVMDHM--

PEX5 T.cruzi FYQFMDKIRSKELLIDEETGQLVQGPGPDPDAPEDAEYLKEWAAAEGLNMPPGFFEHMMQ

PEX5 L.major FYKFMDQVKNKEVLIDEEKGELVQGPGPEVGVPEDAEYLRHWAEMEGLNMPEGVFQPP--

**:***:::.**:*:**:.*::******: .. *:*** . * **:*:* ..::

PEX5 T.brucei --QGQDGVQRGT--DEDMEGMMGDDVYDPSADVEQWAQEYAQMQAMQERLQNNTDYPFEA

PEX5 T.cruzi RPQGNNEQAEGRLFDGSNDALMDDGALDNAADVEEWAREYAEAQEQLQRVQNETNYPFEP

PEX5 L.major --PPASAMMTPE--NGDPDTYI-KEMDMAENDVEDWAQEYAEMQERLQKVTNNTDYPFEP

. : . : : . ***:**:***: * ::: *:*:****.

PEX5 T.brucei NNPYMYHENPMEEGLSMLKLANLAEAALAFEAVCQKEPEREEAWRSLGLTQAENEKDGLA

PEX5 T.cruzi NNPYMYHDKPMEEGIAMLQLANMAEAALAFEAVCQKEPENVEAWRRLGTTQAENEKDCLA

PEX5 L.major NNPYMFHDFPFDEGMEMLQLGNLAEAALAFEAVCHKDSSNEKAWQILGTTQAENEKDGLA

*****:*: *::**: **:*.*:***********:*:... :**: ** ******** **

PEX5 T.brucei IIALNHARMLDPKDIAVHAALAVSHTNEHNANAALASLRAWLLSQPQYEQLGSVNLQ---

PEX5 T.cruzi IIALNHARMLDPKDIAVHAALAVSHTNEHNVGAALQSLRSWLLSQPQYEHLGLVDLQEVA

PEX5 L.major IIALNNARKLNIRNLEVHAALSVSHTNERNADAAMDSLKAWLVNHPEYEQLASVSI---P

*****:** *: ::: *****:******:*..**: **::**:.:*:**:*. *.:

PEX5 T.brucei ADVDIDDLNVQSEDFFFAAPNEYRECRTLLHAALEMNPNDAQLHASLGVLYNLSNNYDSA

PEX5 T.cruzi ADEGLDE--VPEENYFFAAPSEYRDCCTLLYAAVEMNPNDPQLHASLGVLHNLSHRFDEA

PEX5 L.major PDAELD----VQETFFFADPSRMREARTLYEAAIEMNPSDSQLFTNLGVLHNVAHEFDEA

.* :* .* :*** *.. *:. ** **:****.*.**.:.****:*:::.:*.*

PEX5 T.brucei AANLRRAVELRPDDAQLWNKLGATLANGNRPQEALDAYNRALDINPGYVRVMYNMAVSYS

PEX5 T.cruzi AKNFRRAVELRPDDAHTWNKLGATLANGNRPQEALEAYNRALDINPGYVRVMYNMAVSYS

PEX5 L.major AECFRKAVALHPDDPKMWNKLGATLANGGHPDQALEAYNRALDINPGYVRAMYNMAVAYS

* :*:** *:***.: ***********.:*::**:**************.******:**

PEX5 T.brucei NMSQYDLAAKQLVRAIYMQVGGTTPTGEASREATRSMWDFFRMLLNVMNRPDLVELTYAQ

PEX5 T.cruzi NMAQYPLAAKHITRAIALQAGGTNPQGEGSRIATRGLWDLLRMTLNLMDRSDLVEASWQQ

PEX5 L.major NMSQYNMAARQIVKAIASQQGGTKPSGEGSIMATRNMWDLLRMTLNLMDRDDLVQLTYNE

**:** :**:::.:** * ***.* **.* ***.:**::** **:*:* ***: :: :

PEX5 T.brucei NVEPFAKEFGLQSMLL

PEX5 T.cruzi DLTPFLKEFGLEDMAV

PEX5 L.major QLEPFVKEFGLEGH-V

:: ** *****:. :

Anexo II- Alinhamento das seqüências de aminoácidos preditas para PEX5.

Seqüências foram obtidas com o Projeto Genoma de parasitos (TIGR), utilizando programa

ClustalW, formato T-COFFEE.

Luciana Loureiro Penha Anexos

110

Anexo III:

Luciana Loureiro Penha Anexos

111

PEX7 T.brucei MPSFVLHPGFAGHSLRCNPWQPTQFLVTASEHFGVAGSGKVYVVNTSQGLQPHSPVQLVG

PEX7 T.cruzi MPSFNFHPGFAGHGMRCNPWQPTQYILTAAEHFGVVGSGKVYIVNTAPGMPPGSLVSLLG

PEX7 L.major MPSFQMHPGFAGQSIRTNPWKPTQFIISTSQNFGIVGSGKAYVVEAAPGFQAGSPVSLVG

**** :******:.:* ***:***::::::::**:.****.*:*::: *: . * *.*:*

PEX7 T.brucei CWGTSDAAFDACFSEVDRDLVAVACGDGVKLYSLQQSFNRDGVMPVAHSTEHRAEVVGVA

PEX7 T.cruzi CWGTSDGAFDACFSEVDQNIAAVACGDGVKLYNVQQSLNLDGAPPLVHIMEHQGEVAGVT

PEX7 L.major CWGTSDGVFDACFSEVDQNIVVTACGDGVKVYNLAMSLNRDGVIPLVHNAEHQAEVSCVT

******..*********:::...*******:*.: *:* **. *:.* **:.** *:

PEX7 T.brucei WC---RDAFLSCSWDGAVKLWKAATPQVSFMTFHEHLKEVYEVSCSTFNPASFLSCSGDG

PEX7 T.cruzi WN---RDNFLSCSWDGSVKMYQAANPNASCMTFQEHMKEVYEVACSTRNPASFLSCSGDG

PEX7 L.major WNSAHRDTFYSASWDTTIKMYSAVKPEVSMVTMQEHFKEVYEVASTAHSPSSILSCSGDG

* ** * *.*** ::*::.*..*:.* :*::**:******:.:: .*:*:*******

PEX7 T.brucei TWRLWDSRSP-RSVLTQIGHGHQPILSIDFNKQDNSIFATGGVDRTVHLWDVRRPQRPLT

PEX7 T.cruzi TWKLWDARTP-RSVLTQVGHNHQIVLSIDWNKYDGCLFASGGVDRTVRLWDLRRPTQPLA

PEX7 L.major SWKLWDNRSPQRSVLTQMAHQNQIVLSIDFCKSDPNIFASGGVDRTVRVWDARRPNQPLA

:*:*** *:* ******:.* :* :****: * * :**:*******::** *** :**:

PEX7 T.brucei VLPGHDNACRRVRFSPHSRTLLASSGYDCRVCLWDLNQPQRPLTARYAHHREFVVGLQWS

PEX7 T.cruzi SLPGHENACRRVRFSPHSRVLLASAGYDCRVCIWDLNQPQRPLVGRYAHHREFVVGLDWS

PEX7 L.major SFPGHDQACRRVRFSTHNPSMLASSGYDMRVCVWDLSKPQQPLTARYQHHREFVAGLEWS

:***::********.*. :***:*** ***:***.:**:**..** ******.**:**

PEX7 T.brucei LATPNALASVSWDGSAFFWTNGQPLTPSPSSQPLPPAIPPPRVRPPRPKGVP---DIS-A

PEX7 T.cruzi LAVPNALASASWDGRVFFWVSGQQVTPSPPLPQLPAAVPPPRVRVPRNKVLP---GLP-P

PEX7 L.major QAAPNALASASYDGSAFFWSVGQAATPSLPTQQLPPAVPPPRVPRPRTKVLAGLPQPSMP

*.******.*:** .*** ** *** . **.*:***** ** * :. . .

PEX7 T.brucei LPLTV--PP-VR-

PEX7 T.cruzi APPAI--PV-QQ-

PEX7 L.major MPMAVTSPPRSPR

* :: *

Anexo III- Alinhamento das seqüências de aminoácidos preditas para PEX7.

Seqüências foram obtidas com o Projeto Genoma de parasitos (TIGR), utilizando programa

ClustalW, formato T-COFFEE.

Luciana Loureiro Penha Anexos

112

Anexo IV:

Luciana Loureiro Penha Anexos

113

Anexo IV: Representação esquemática das vias metabólicas para síntese de UDP-

glucose e UDP-galactose no glicossomo de

T. cruzi. Os pontos de interrogação representam

os transportadores de açúcares putativos presentes na membrana glicossomal. As linhas

pontilhadas representam a via alternativa proposta por Roper e colaboradores (2005),

baseados na ausência de motivos de encaminhamento para glicossomo/peroxissomo

conhecidos na enzima UDP:glucose pirofosforilase.

Glucose

Glucose-6-P

Fructose-6-P

Mannose-6-P

Mannose-1-P

Glucose-1-P

phosphohexoisomerase

hexokinase

phosphomannoisomerase

phosphomannomutase

PGM

UDP-Glucose

UDP-Galactose

UDP-glucose-4’-epimerase

UTP:glucose-1-phosphate

uridylyltransferase (?)

Glycosome

Cytosol

UDP-Glucose

UDP-Galactose

protein

lycosilatio

in ER and Golgi

UDP-Glucose

Glucose-1-P

UTP:glucose

pyrophosphorylase(?)

glucose-6-phosphatase

Glucose

Glucose-6-P

Fructose-6-P

Mannose-6-P

Mannose-1-P

Glucose-1-P

phosphohexoisomerase

hexokinase

phosphomannoisomerase

phosphomannomutase

PGM

UDP-Glucose

UDP-Galactose

UDP-glucose-4’-epimerase

UTP:glucose-1-phosphate

uridylyltransferase (?)

Glycosome

Cytosol

UDP-Glucose

UDP-Galactose

protein

lycosilatio

in ER and Golgi

UDP-Glucose

Glucose-1-P

UTP:

(?)

glucose-6-phosphatase

Glucose

Glucose-6-P

Fructose-6-P

Mannose-6-P

Mannose-1-P

Glucose-1-P

phosphohexoisomerase

hexokinase

phosphomannoisomerase

phosphomannomutase

PGM

UDP-Glucose

UDP-Galactose

UDP-glucose-4’-epimerase

UTP:glucose

pyrophosphorylase(?)

Glycosome

Cytosol

UDP-Glucose

UDP-Galactose

protein

lycosilatio

in ER and Golgi

UDP-Glucose

Glucose-1-P

UTP:

(?)

glucose-6-phosphatase

Glucose

Glucose-6-P

Fructose-6-P

Mannose-6-P

Mannose-1-P

Glucose-1-P

phosphohexoisomerase

hexokinase

phosphomannoisomerase

phosphomannomutase

PGM

UDP-Glucose

UDP-Galactose

UDP-glucose-4’-epimerase

UTP:glucose-1-phosphate

uridylyltransferase (?)

Glycosome

Cytosol

UDP-Glucose

UDP-Galactose

protein

lycosilatio

in ER and Golgi

UDP-Glucose

Glucose-1-P

UTP:glucose

pyrophosphorylase(?)

glucose-6-phosphatase

Glucose

Glucose-6-P

Fructose-6-P

Mannose-6-P

Mannose-1-P

Glucose-1-P

phosphohexoisomerase

hexokinase

phosphomannoisomerase

phosphomannomutase

PGM

UDP-Glucose

UDP-Galactose

UDP-glucose-4’-epimerase

UTP:glucose-1-phosphate

uridylyltransferase (?)

Glycosome

Cytosol

UDP-Glucose

UDP-Galactose

protein

lycosilatio

in ER and Golgi

UDP-Glucose

Glucose-1-P

UTP:

(?)

glucose-6-phosphatase

Glucose

Glucose-6-P

Fructose-6-P

Mannose-6-P

Mannose-1-P

Glucose-1-P

phosphohexoisomerase

hexokinase

phosphomannoisomerase

phosphomannomutase

PGM

UDP-Glucose

UDP-Galactose

UDP-glucose-4’-epimerase

UTP:glucose

pyrophosphorylase(?)

Glycosome

Cytosol

UDP-Glucose

UDP-Galactose

protein

lycosilatio

in ER and Golgi

UDP-Glucose

Glucose-1-P

UTP:

(?)

glucose-6-phosphatase

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