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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY
RIBEIRO
CRISTIANE DA SILVA STABENOW
Didelphis aurita
(MARSUPIALIA: DIDELPHOIDEA): UM NOVO
HOSPEDEIRO PARA
Sarcocystis lindsayi
(APICOMPLEXA:
SARCOCYSTIDAE)
Campos dos Goytacazes
2008
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1
CRISTIANE DA SILVA STABENOW
Didelphis aurita
(MARSUPIALIA: DIDELPHOIDEA): UM NOVO
HOSPEDEIRO PARA
Sarcocystis lindsayi
(APICOMPLEXA:
SARCOCYSTIDAE)
Tese apresentada ao Centro de
Ciências e Tecnologias Agropecuárias
da Universidade Estadual do Nor
te
Fluminense Darcy Ribeiro, como
requisito parcial para obtenção do grau
de Doutor em Produção Animal, na
Área de Concentração de Sanidade
Animal.
ORIENTADOR: Prof. Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira
Campos dos Goytacazes
2008
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2
CRISTIANE DA SILVA STABENOW
Didelphis aurita
(MARSUPIALIA: DIDELPHOIDEA) UM NOVO
HOSPEDEIRO PARA
Sarcocystis lindsayi
(APICOMPLEXA:
SARCOCYSTIDAE)
Tese apresentada ao Centro de
Ciências e Tecnologias Agropecuárias
da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como
requisito parcial para obtenção do grau
de Doutor em Produção Animal, na
Área de Concentração de Sanidade
Animal.
Aprovada em 25 de março de 2008.
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________________________
Prof.
Carlos Wilson Gomes Lopes (
PhD
, Patologia)
-
UFRRJ
___________________________________________________________________
Profa. Ana Maria Reis Ferreira (
DSc
, Patologia Experimental)
-
UFF
__________________________________________________________________
_
Prof. Antonio Henrique Almeida de Moraes Neto (
PhD
, Ciências)
-
FIOCRUZ
___________________________________________________________________
Prof. Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira (
PhD
, Parasitologia Veterinária)
-
UENF
(Orientador)
3
Aos meus pais e irmão,
com todo
o
amor
.
DEDICO
4
AGRADECIMENTOS
A Deus, Criador de tudo, pela vida e oportunidade de chegar até aqui;
À minha família e amigos, pelo apoio, incentivo, compreensão e amor;
Ao meu orientador, Prof. Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira, pela orientação,
incentivo, paciência, compreensão e amizade;
Aos professores Carlos Wilson Gomes Lopes, Victor Martin Quintana Flores e
Antônio Henrique Almeida de Moraes Neto pelos ensinamentos e apoio vital para o
desenvolvimento deste trabalho de pesquisa;
Aos técnicos dos Laboratórios de Biologia Celular e Tecidual (LBCT/CBB/UENF), de
Biotecnologia (LBT/CBB/UENF) e de Coccídeos e Coccidioses
(PSA/EMBRAPA/UFRRJ), pela colaboração fundamental nesta pesquisa;
Aos professores do Curso de Pós-graduação, cujos ensinamentos contribuíram para
minha formação;
A Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, pela oportunidade de
aprimoramento de meus conhecimentos;
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), pelo
suporte financeiro;
Ao IBAMA, pela concessão da licença que permitiu realizar esta pesquisa;
Aos
gambás e periquitos que, com perda de suas vidas, contribuíram para a
pesquisa científica e aquisição de novos conhecimentos;
Àqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
5
“Só sabemos com exatidão quando
sabemos pouco; à medida que
vamos adquirindo conhecimentos,
instala
-
se a dúvida.”
(
Goethe, filósofo alemão)
6
RESUMO
Stabe
now, Cristiane da Silva. UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE
FLUMINENSE DARCY RIBEIRO. Março de 2008. Didelphis aurita
(Marsupialia:
Didelphoidea): um novo hospedeiro para Sarcocystis lindsayi
(Apicomplexa:
Sarcocystidae). Professor Orientador: Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira.
Com o objetivo de identificar espécies do gênero
Sarcocystis
parasitas de gambás
(
Didelphis
aurita
)
nas Regiões da Costa Verde, Norte Fluminense e Metropolitana do
Estado do Rio de Janeiro foram capturados 27 gambás. Foram observado
s
esporocistos em raspado de mucosa intestinal de três gambás oriundos da Região
Metropolitana. De um total de 20 periquitos australianos (Melopsittacus undulatus
)
mantidos em isolamento, foram inoculados cinco periquitos por amostra positiva ao
exame micr
oscópico, com 26 esporocistos do gênero
Sarcocystis
em 500
l de PBS.
Os animais do grupo controle, também em número de cinco, receberam PBS em
mesmo volume
.
Dos periquitos inoculados, somente os que receberam raspado de
mucosa de um dos gambás de Seropédica desenvolveram parasitismo tecidual, na
forma de merontes no endotélio de capilares venosos no pulmão e cistos em células
do tecido muscular estriado esquelético e cardíaco, observados em cortes
histológicos corados por hematoxilina e eosina (HE).
Os
cis
tos, predominantes nos
músculos da língua e das pernas, tinham tamanhos
microscópico
s, variando de
65,25 a 118,06
m de comprimento por 13,98 a 29,38
m
de largura, com espessura
de parede cística entre 0,9 e 1,9 m. Cortes observados em microscopia eletrô
nica
de transmissão (MET) revelaram que parede cística continha numerosas vilosidades
(protrusões) delgadas e recortadas, cada uma com uma formação de estilete no
ápice.
O número de pares de bases do produto obtido através da reação em cadeia
da polimerase (PCR), utilizando-se os iniciadores JNB33 e JNB54, indicou que o
parasita não era Sarcocystis neurona
ou
S. falcatula. Através da PCR não foi
possível determinar a espécie de
Sarcocystis
isolado no gambá.
Levando
-se em
consideração a PCR e a ultra-
estrutu
ra da parede cística, pode-se inferir que
o
parasita em pauta é similar ao Sarcocystis lindsayi e que, dessa forma, D. aurita
passa a ser considerado um novo hospedeiro definitivo para essa espécie no
Brasil.
7
PALAVRAS-
CHAVE:
Sarcocystis lindsayi
,
Didelphis
aurita
, gambá,
Melopsittacus
undulatus
, periquito australiano.
8
ABSTRACT
Stabenow, Cristiane da Silva. UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE
FLUMINENSE DARCY RIBEIRO. March 2008. Didelphis aurita
(Marsupialia:
Didelphoidea): a new host to Sarcocystis lindsayi
(Apicomplexa:
Sarcocystidae).
Major Professor: Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira.
Aiming to
identify
species
of
the genus
Sarcocystis
parasites of
opossums
(
Didelp
his
aurita
)
in
the regions of Costa Verde, Norte
Fluminense
and Metropolitana of the
sta
te of Rio de Janeiro
were
trapped 27
opossums
.
Sporocysts were observed in
scraping of intestinal mucosa of three opossums from the Metropolitan region. Of a
total of 20 budgerigars (Melopsittacus undulatus) kept in isolation were inoculated
five budgerigars per positive sample at microscopic examination, with 26 sporocysts
of the genus Sarcocystis in 500 mL PBS. The animals of control group, in number of
five too, received PBS at the same volume. Among the inoculated budgerigars, only
those who received sc
raping
of mucosa from one of the opossums from Seropédica
developed parasitism in tissue, in the form of meronts in the endothelium of venous
capillaries in the lungs and cysts in cells in the skeletal and cardiac muscle tissue,
observed in histological sections stained by hematoxilin and eosin (HE).
The
cysts
,
with
predominance in the muscles of the tongue and thighs, were microscopic,
ranging from 65,25 to 118,06 m long by 13,98 to 29,38 m wide, with thickness of
the cystic wall between 0,9 and 1,9 m
.
Sections observed in electron
microscopy
(EM) revealed cystic wall containing numerous slender villi (protrusions) with
indentations, each with a stylet at the tip. The number of pairs of bases of the product
obtained by polymerase chain reaction (PCR), using the primers JNB33 and JNB54,
indicated that the parasite was not
Sarcocystis neurona
or
S. falcatula
. Through
PCR
was not possible to determine the specie of
Sarcocystis
isolated in the opossum.
Taking into account the PCR and ultra-structure of the cystic wall, we can infer that
the parasite in prominence is similar to Sarcocystis lindsayi and, thus, D. aurita
passes to be considered a new definitive host for this species in Brazil.
KEY WORDS: Sarcocystis lindsayi-
simile
,
Didelphis aurita, opossum,
Mel
opsittacus
undulatus
, budgerigar.
9
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1.
Estimativa da distribuição geográfica de gambás na América do
Sul (STABENOW, 2004)
..........................................................................
17
Figura 2. Representação diagramática da formação da parede cística
primária dentro de uma fibra muscular através das etapas A-D. A
parede cística primária pode formar protrusões (D1, D3) ou não
(D2) (adaptado de Mehlhorn et al., 1976)
..
......................................
20
Figura 3. Cistos de Sarcocystis lindsayi ( ) em tecido muscular de língua em
periquito australiano (
Melopsittacus
u
ndulatus
)
inoculado
experimentalmente, 30 dias após a infecção. H.E. Barra = 20
m..
...
35
Figura 4. Cisto de Sarcocystis lindsayi
em
tecido muscular de língua em
periquito australiano (
Melopsittacus
u
ndulatus
)
inoculado
experimentalmente, contendo metrócitos ( ) em seu interior, 30
dias após a infecção. H.E. Barra = 10
m..
...................
............
.........
36
Figura 5.
Cist
o de Sarcocystis lindsayi em musculatura da perna em periquito
australiano (
Melopsittacus
u
ndulatus
) experimentalmente infectado.
MET, 4400x. M = Metrócito; S = Septo; P = Protrusão..
.
.......
...
..........
39
Figura 6. Cisto de Sarcocystis lindsayi em musculatura da perna em periquito
australiano (
Melopsittacus
u
ndulatus
) experimentalmente infectado.
Setas indicam a presença de estiletes nas protrusões da parede
cística. MET, 7000x. M = Metrócito; S = Septo; P = Protrusão..
....
....
40
Figura 7.
Cisto
de Sarcocystis lindsayi em musculatura da perna em periquito
australiano (
Melopsittacus
u
ndulatus
) experimentalmente infectado.
Seta ( ) indica os recortes presentes nas protrusões da parede
cística; seta cheia ( )
evidencia o estilete presente na ext
remidade
da protrusão da parede cística
.
MET, 12000x. M = Metrócito.
....
.....
..
41
Figura 8.
Resultado da amplificação do DNA de uma amostra de
esporocistos de Sarcocystis spp. isolados de gambá (
Didelphis
aurita), extraído pelos métodos TELT e BAC, v
isualizado em
gel de agarose a 2%. Seta: banda de amplificação com cerca
de 1300 pb. MPM: marcador de peso molecular 100 bp DNA
10
Ladder. Tubos de PCR numerados de 1 a 9, para cada método
de extração de DNA. Em todos os tubos foram utilizadas as
mesmas quantidades em l de MgCl
2
, dNTPs, Tampão e Taq
Polimerase. Em relação à quantidade de DNA extraído: tubos
1, 4 e 7 com 1 l; tubos 2, 5 e 8: 2 l; tubos 3, 6 e 9: 5
l. Em
relação aos iniciadores: tubos 1, 2 e 3 com 1
l; tubos 4, 5 e 6
com 2 l; tubos 7, 8 e 9 com 4
l. A água Milliq foi utilizada em
quantidade suficiente para atingir, em cada tubo, um volume
final de 20 l
................................................................................
42
Quadro 1. Padronização da extração do DNA de esporocistos de
Sarcocystis
spp. isolados em gambá (
D. aurita
)..................................................
32
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Presença de esporocistos de Sarcocystis lindsayi em raspado de
mucosa de intestino delgado de gambás (
Didelphi
s aurita) e em
prova biológica utilizando-se periquitos australianos
(
Melopsittacus undulatus
)
.................................................................
34
12
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
................................................................
....................................
13
2. REVISÃO DE LITERATURA
..............................................................................
14
2.1.
O GÊNERO
Sarcocystis
Lankester, 1882.................................................
14
2.1.1. Histór
ico
...............................................................................................
14
2.1.2. Ciclo biológico
........................................
.............................................
14
2.1.3. Espécies de gambás e aves
.........
......................................................
16
2.2.
C
ARACTERÍSTICAS MORFO
LÓGICAS DOS SARCOCIS
TOS................................
18
2.3.1. Microscopia Óptica
.............................................................................
19
2.3.
2. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
...............................
21
2.4.
R
EAÇÃO EM
C
ADEIA DA
P
OLIMERASE
(PCR)
...............................................
24
3. MATERIAL E MÉTODOS
............................................................
.......................
26
3.1.
L
OCAIS DE DESENVOLVIM
ENTO DO PROJETO
................................................
26
3.2.
O
BTENÇÃO DOS ESPOROCI
STOS
..................................................................
26
3.3.
O
BTENÇÃO DOS SARCOCIS
TOS E M
ICROSCOPIA ÓPTICA
..........................…...
27
3.4.
M
ICROSCOPIA
E
LETRÔNICA DE
T
RANSMISSÃO
(MET)
...................................
28
3.5.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR PARA IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE
Sarcocystis
............................................
..............................................
29
3.5.1. Extração do DNA
.................................................................................
29
3.5.1.1.
Método BAC
..............................................................................
........
29
3.5.1.2.
Método TELT
.....................................................................................
30
3.5.2. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
....
......................................
30
3.5.2.1.
Amplificação
......................
...............................................................
31
3.5.2.2.
Programa utilizado no Termociclador (Marca MJ, modelo PTC
100)
....................................................................................................
31
4. RESULT
ADOS E DISCUSSÃO.........................................................................
33
4.1.
E
SPOROCISTOS E CISTOS
DO GÊNERO
Sarcocystis
EM
Didelphis aurita
....
33
4.2.
C
ARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS E MORFOMÉTRI
CAS DOS CISTOS
..............
34
4.2.1.
Microscopia óptica
..............................................................................
34
4.2.2. Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
.................................
38
4.3.
R
EAÇÃO EM CADEIA DA P
OLIMERASE
(PCR)
.........................
.......................
38
5. CONCLUSÃO
.....................................................................................................
44
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
...................................................................
45
13
1. INTRO
DUÇÃO
Parasitas do gênero
Sarcocystis
são heteroxenos obrigatórios, com
necessidade de que em seu ciclo biológico exista uma relação presa-predador. O
predador atua como hospedeiro definitivo, com desenvolvimento dos gametas e
oocistos na lâmina própria do intestino delgado. A presa é o hospedeiro
intermediário, no qual ocorre a formação de merontes que culmina na formação de
cistos teciduais.
No território brasileiro existem três espécies de gambás, Didelphis
marsupialis
,
D. aurita
e
D. albiventris, encontrados na Amazônia, na Mata Atlântica,
e no cerrado, caatinga e pantanal, respectivamente.
As aves vêm sendo utilizadas há algum tempo como animais de
experimentação para o isolamento e identificação de espécies do gênero
Sarcocystis
, cujo hospedeiro definitivo seja uma das espécies do gênero
Didelphis
.
Após a descrição de
S. falcatula
, o periquito australiano
(
Melopsittacus undulatus
)
foi
incluído como um hospedeiro intermediário experimental para a identificação de
espécies de
Sarcocystis
parasitas de av
es, infectadas com esporocistos procedentes
de gambás, sendo particularmente susceptível à infecção por S. falcatula
e
S.
lindsayi
.
Sarcocystis lindsayi foi proposto recentemente como uma nova espécie para
um parasita semelhante a S. falcatula, encontrado
em
D. albiventris no Brasil. Desta
forma, o gambá da espécie D. albiventris passou a ser o hospedeiro definitivo de
duas espécies conhecidas do gênero
Sarcocystis
no Brasil: S. neurona
e
S. lindsayi
,
este último, tendo como hospedeiro intermediário experimental o periquito
australiano. Apesar de presentes em habitats diferentes, os gambás das espécies
D.
albiventris
e
D. aurita
são simpátricos.
Essa pesquisa teve como objetivo identificar espécies do gênero
Sarcocystis
, parasitas de gambás da espécie
D. au
rita
, nas Regiões da Costa Verde,
Norte Fluminense e Metropolitana do Estado do Rio de Janeiro, através da Reação
em Cadeia da Polimerase (PCR) e das microscopias óptica e eletrônica de
transmissão de cistos presentes em tecido muscular do hospedeiro inter
mediário
experimental (
M. undulatus
).
14
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1.
O GÊNERO
Sarcocystis
Lankester, 1882
2.1.1. Histórico
O gênero
Sarcocystis
Lankester, 1882, foi primeiro relatado por Miescher
(1843) na Suíça, que descreveu “linhas branco-
leitosas”
na musculatura esquelética
de um camundongo doméstico (Mus musculus). Kühn (1865) encontrou um parasita
similar no suíno e o nomeou Synchytrium miescherianum. Contudo, esse gênero foi
ocupado
e Lankester (1882) introduziu o gênero de nome
Sarcocystis
. Labbé (1899)
mudou o nome
Synchytrium miescherianum
para
Sarcocystis miescheriana
. Assim, o
parasita S. miescheriana (Kühn, 1865) Labbé 1899 tornou-se a espécie-tipo do
gênero. O parasita originalmente encontrado por Miescher no camundongo foi
descrito por Blanchard (1885) e nomeado S. muris por Railliet (1886) (DUBEY,
1992).
Assim, surgiram controvérsias se
S. muris
ou
S. miescheriana
era a espécie
-
tipo correta do gênero. Sarcocystis miescheriana foi então considerada a espécie
tipo correta do gênero por ter
sido descrita antes de
S. muris
(DUBEY et al., 1989).
2.1.2. Ciclo biológico
Os coccídios do gênero
Sarcocystis
têm um ciclo biológico obrigatório de
dois hospedeiros, presa-predador. Estágios assexuados desenvolvem-se apenas no
hospedeiro intermediário, o qual, na natureza, é geralmente um animal-
presa.
Estágios sexuados desenvolvem-se apenas no hospedeiro definitivo, o qual é
predador (BOX e SMITH, 1982; DUBEY et al., 1989; DUBEY, 1992).
O hospedeiro definitivo se torna infectado pela ingestão de tecido muscular
ou neural contendo cistos maduros. Bradizoítas liberados dos cistos, por digestão no
15
estômago e intestino, penetram na mucosa do intestino delgado e se transformam
em gamontes masculino (microgamonte) e feminino (macrogamonte). Os
microgametas
liberados do microgamonte se movem ativamente para a periferia do
macrogamonte. Após a fertilização, desenvolve-se uma parede em volta do zigoto e
o oocisto é formado (SHEFFIELD e FAYER, 1980; BOTELHO e LOPES, 1984). A
localização da gametogonia e o tipo de célula parasitada variam com a espécie de
Sarcocystis
e o estágio de gametogênese (DUBEY, 1992).
Os oocistos do gênero
Sarcocystis
esporulam na lâmina própria, com divisão
da massa principal do oocisto (esporonte) em dois esporocistos (FAYER, 1974).
Qua
tro esporozoítas são formados em cada esporocisto (DUBEY, 1992).
A parede do oocisto é fina e, geralmente, rompe-se ainda na luz intestinal.
Os esporocistos livres no lúmen intestinal são liberados junto com as fezes.
Ocasionalmente, oocistos não-
esporulad
os e parcialmente esporulados são
liberados também junto com as fezes. Os períodos pré-patente e patente variam,
mas, para a maioria das espécies de
Sarcocystis
, os oocistos são primeiramente
liberados nas fezes entre 7 e 14 dias após a ingestão do cisto (
DUBEY, 1992).
O hospedeiro intermediário se torna infectado pela ingestão do esporocisto
em alimento ou água contaminados. Os esporozoítas excistam de esporocistos no
intestino delgado (CAWTHORN et al., 1986). O destino do esporozoíta, do momento
de ingestão do esporocisto até o desenvolvimento inicial nas artérias dos linfonodos
mesentéricos, não é conhecido. A merogonia de primeira geração pode iniciar-
se
nas células endoteliais logo aos sete dias após a infecção (DAI) e pode ser
completada aos 15 DAI. A segunda geração de merontes pode ser verificada no
endotélio de 19 a 46 DAI, predominantemente, em capilares, mas também em
pequenas artérias, praticamente por todo o corpo (DUBEY, 1992).
O número de gerações de merogonia e o tipo de célula hospedeira, na
qual
a merogonia pode ocorrer, variam com cada espécie de
Sarcocystis
(DUBEY,
1982a,b; DUBEY et al., 1982, 1989; HEYDORN, 1977, 1985; HEYDORN e
GESTRICH, 1976; HEYDORN e KARAER, 1986; HEYDORN e UNTERHOLZNER,
1983; OBENDORF e MUNDAY, 1987).
Os merozoítas liberados da geração terminal de merogonia iniciam a
formação do cisto. O merozoíta intracelular forma um metrócito e cada metrócito
produz duas progênies de metrócitos por endogenia. Depois de várias gerações
assim, alguns dos metrócitos, pelo processo de endopoligenia, produzem zoítas em
16
forma de “banana”, chamados bradizoítas (também chamados cistozoítas).
Finalmente, o cisto é preenchido com bradizoítas, que são o estágio infectivo para o
predador (FAYER e JOHNSON, 1974; DUBEY, 1992).
Os cistos são encontrados na musculatura estriada esquelética e cardíaca,
bem como no sistema nervoso central e em fibras de Purkinje no coração, mas
sempre em números relativamente baixos (POWELL et al., 1986; DUBEY et al.,
1989).
2.1.3. Espécies de gambás e aves
Até 19
95,
S. falcatula era a única espécie de
Sarcocystis
conhecida no
gambá norte
-
americano,
D. virginiana
, tendo este como hospedeiro definitivo (BOX e
DUSZYNSKI, 1978; BOX et al., 1984). Atualmente, segundo a literatura,
D.
virginiana
é o hospedeiro definitivo de pelo menos três espécies: S. falcatula (BOX e
DUSZYNSKI, 1978; BOX et al., 1984; DUBEY, 2000); S. neurona (FENGER et al.,
1995, 1997; DUBEY e LINDSAY, 1998; DUBEY et al., 1999; DUBEY, 2000); e
S.
speeri
DUBEY, 2000
.
Há três espécies de gambás no Brasil: Didelphis albiventris, gambá-
de
-
orelha
-branca, encontrado no cerrado, na caatinga e no pantanal; Didelphis aurita
,
gambá
-
de
-
orelha
-preta, presente na Mata Atlântica; e D. marsupialis, gambá comum
que possui também orelhas pretas, mas é proveniente da Amazônia (GALLETI,
2002; SILVA e ROSSI, 2003). A estimativa da distribuição destas espécies pode ser
verificada na Figura 1.
Na América do Sul, o gambá-
de
-
orelha
-
branca
é distribuído nas zonas
temperadas e tropicais de altitude
, incluindo os países dos And
es
(Figura 1)
, exceto o
Chile (DUBEY et al., 1999). Este é hospedeiro definitivo para S. falcatula
na
Argentina
DUBEY et al., 1999
e, no Brasil, para S. falcatula-simile DUBEY et al.,
2000a
,
S. neurona
DUBEY et al., 2001a
e
S. lindsayi
DUBEY et al.,
2001b
.
17
Figura 1. Estimativa da distribuição geográfica de gambás na América do Sul (STABENOW,
2004).
18
Sarcocystis falcatula utiliza espécies de aves como hospedeiros
intermediários e o gambá norte-americano (D. virginiana) como hospedeiro definitivo
(BOX et al., 1984). É uma espécie não usual de
Sarcocystis
por sua ampla gama de
hospedeiros intermediários (Passeriformes, Psittaciformes e Columbiformes), sua
prolongada merogonia (durando mais de cinco meses) e pela alta p
atogenicidade
para seu hospedeiro intermediário (BOX e SMITH, 1982; SMITH et al., 1987a, b,
1990a, b;
NEILL et al., 1989; CLUBB e FRENKEL, 1992).
Sarcocystis lindsayi foi proposto como uma nova espécie por DUBEY et al.
(2001b) para um parasita semelhante à
espécie
S. falcatula, oriundo de
D.
albiventris
, proveniente de Jaboticabal, São Paulo, Brasil. Seu hospedeiro
intermediário natural é desconhecido, porém o seu hospedeiro intermediário
experimental é o periquito australiano (M. undulatus), e foi separado de S. falcatula
por características estruturais e genéticas (DUBEY et al., 2001b).
2.2.
C
ARACTERÍSTICAS MORFO
LÓGICAS DOS SARCOCIS
TOS
Membros dos gêneros
Sarcocystis
,
Toxoplasma
,
Besnoitia
,
Frenkelia
,
Cystoisospora
e
Hammondia
são conhecidos como coccídios formadores de cistos
porque estes produzem cistos teciduais característicos nos seus hospedeiros
intermediários, geralmente um onívoro ou herbívoro, após a ingestão de oocistos
esporulados ou esporocistos do hospedeiro final, geralmente um carnívoro.
Em
todos esses gêneros, os esporozoítas excistam e deixam o intestino, iniciando uma
ou mais merogonias e produzindo merozoítas, os quais invadem novas células
hospedeiras, resultando na formação de cistos (SMITH et al., 1987a).
Nas espécies de
Sarcocystis
, o parasita está situado no interior de um típico
vacúolo parasitóforo limitado por uma única unidade de membrana, a qual
rapidamente se torna reforçada por uma deposição de segmentos de material
osmiofílico irregularmente arranjados abaixo desta (Figura 2). Esse complexo,
denominado parede cística primária, é uma característica de todos os coccídios
formadores de cistos, exceto em
Besnoitia
, e pode alcançar a espessura de 20-
100
nm no início de seu desenvolvimento em espécies de
Sarcocystis
. As áreas não
reforçadas da parede cística têm um diâmetro de cerca de 40 nm e formam
19
invaginações semelhantes a vesículas para o interior do cisto. Em algumas
espécies, as áreas reforçadas desenvolvem protrusões características que variam
em comprimento, forma e micromorfologia, de acordo com a espécie. Assim, as
paredes de cistos maduros podem ter protrusões que podem ser digitiformes e
agrupadas como em
S. ovicanis,
ramificadas e tipo couve
-
flor como em
S. tenella
, ou
hastes curtas como em S. muris. Imediatamente abaixo da parede cística primária
no interior do vacúolo parasitóforo está posicionada uma faixa de substância
fundamental amorfa, a qual pode conter material fibrilar e granular. A partir dessa
substância se estendem numerosos septos ramificados para o interior do cisto,
formando compartimentos, os quais contêm os parasitas. Cistos de espécies de
Sarcocystis
contêm dois estádios: metrócitos e merozítas (bradizoítas) (SMITH et al.,
1987a).
2.3.1. Microscopia Óptica
A estrutura dos parasitas dentro dos cistos varia com a maturação destes.
Os cistos geralmente se tornam infecciosos cerca de 75 DAI, porém há considerável
variação deste tempo entre as espécies de
Sarcocystis
. Os cistos imaturos contêm
apenas metrócitos (células-mãe), e os merontes não são infecciosos para o
hospedeiro definitivo. Mesmo os cistos maduros podem conter alguns metrócitos
arrumados perifericamente (DUBEY, 1992).
Os cistos variam em tamanho e forma, dependendo da espécie do parasita.
Alguns sempre permanecem microscópicos, variando de longos e estreitos a curtos
e largos, enquanto outros se tornam macroscópicos, com aparência filamentosa (tipo
grãos
-
de
-arroz) e globular. A estrutura e a espessura da parede cística também
diferem entre as espécies de
Sarcocystis
e, dentro de cada espécie, entre cistos
maduros. Histologicamente a parede do cisto pode ser lisa, estriada e filamentosa,
ou pode possuir complexas projeções ramificadas. Internamente, os grupos de
bradizoítas são divididos entre compartimentos por septos, que se originam da
pare
de do cisto e estão presentes na maioria das espécies de
Sarcocystis
, ou
podem não ser compartimentados (
DUBEY, 1992)
.
20
Figura 2. Representação diagramática da formação da parede cística primária dentro de uma fibra
muscular através das etapas A-D. A parede cística primária pode formar protrusões (D1,
D3) ou não (D2) (adaptado de Mehlhorn et al., 1976).
Unidade de
membrana
Parte interna do vacúolo parasitóforo
Material
osmiofílico
Parede primária
Invaginação
Substância
fundamental
Protrusão
Microtúbulos
Septo
Compartimento
21
Sarcocistos de S. falcatula observados em periquitos australianos
experimentalmente infectados podem ter até 9 mm de comprimento, presentes nas
musculaturas estriadas esquelética e cardíaca, contudo com menor freqüência na
última, com espessura de parede de 1 a 5
m (NEILL et al., 1989). Já os observados
em periquitos australianos experimentalmente infectados com S. lindsayi
sã
o
microscópicos, com até 600 m de comprimento e 50 m de largura, presentes em
pequena quantidade nas pernas, mas não na musculatura peitoral. A espessura da
parede do cisto varia entre 1 e 2 m, dependendo da duração da infecção, sendo de
2
m no periqui
to eutanasiado no 45º DAI (DUBEY et al., 2001b).
2.3.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
Neill et al. (1989), através de infecções experimentais de periquitos
australianos com S. falcatula, observaram que os cistos de musculatura esquelética
e cardíaca estão localizados exclusivamente dentro de células musculares estriadas
e são compostos por uma parede cística primária, abaixo desta por substância
amorfa, a qual nos cistos maduros se estende formando septos, e por metrócitos e
bradizoítas em desenvolvimento. Além disso, estes autores classificaram os
sarcocistos nos estágios: primário, metrócito, intermediário, maduro e degenerado.
A ultra-estrutura da parede cística primária em S. falcatula
muda
progressivamente com a maturação do sarcocisto. Para todos os estágios, uma
membrana trilaminada periférica corresponde ao limite membranoso do vacúolo
parasitóforo (Figura 2). Nos sarcocistos primários, foi encontrada uma camada
elétron
-densa fina (23,3 ± 2,1 nm), fenestrada e finamente granular abaixo da
membrana. Nas fenestrações na camada elétron-densa, a membrana vacuolar
parasitófora evaginou no sarcoplasma adjacente. Esse perfil periférico dá à parede
cística primária uma aparência de cabeça
-
de
-
prego. Cortes tangenciais da superfície
geralmente
mostram “cabeças
-
de
-
prego” arranjadas aleatoriamente. As evaginações
se tornam mais alongadas durante os estágios finais do desenvolvimento primário e
tornam
-se precursoras das protrusões da parede cística primária (NEILL et al.,
1989).
22
No estágio metrócito, desenvolvem-se protrusões curtas digitiformes na
parede cística primária. Essas protrusões têm uma camada elétron-densa mais
espessa (60,7 ±4,5 nm de profundidade) e suportam evaginações hemisféricas. No
estágio inicial de metrócito, as protrusões são 2 a 3 vezes mais longas que seus
diâmetros. A substância amorfa, que se estende no cerne das protrusões, contém
agregados de filamentos intermediários (NEILL et al., 1989).
Nos cistos intermediários e maduros as protrusões aumentam em
comprimento (1135 ± 65,1 nm) e em largura (251,7 ± 18,6 nm), estão mais próximas
e assumem perfis mais angulares, contudo retêm seu padrão não-ramificado e
assumem a forma de cones ovais afilados, com a ponta estreita
.
No início do estágio
intermediário, cortes cruzados mostram perfis de 2 a 7 agregados de filamentos
intermediários (NEILL et al., 1989).
A substância amorfa consiste de um material fibrilogranular com uma
variedade de inclusões. Está abaixo da parede cística primária e se estende no
cerne das protrusões e septos entre grupos de metrócitos e bradizoítas. Nos cistos
iniciais, a profundidade da substância amorfa entre os septos é de 136 ± 14 nm, mas
aumenta com a maturação dos cistos para 923 ± 95 nm (NEILL et al., 1989).
Os cistos dos estágios primário e metrócito são completamente preenchidos
com metrócitos arredondados a ovóides, enquanto que nos cistos intermediários
estes são encontrados em volta da periferia. Agregados ocasionais de metrócitos
persistem na periferia de cistos maduros (NEILL et al., 1989).
Os sarcocistos degeneram nas musculaturas cardíaca e peitoral. Esses
cistos degenerados têm uma parede cística primária que exibe protrusões
minúsculas (similares às dos cistos de metrócitos iniciais), abundante material
amorfo, metrócitos grandes aparentemente viáveis e numerosos zoítas centrais
degenerados. Esses zoítas degenerados são menores que os metrócitos, têm
citoplasma elétron-denso com numerosos filamentos intermediários e núcleo
pequeno e lobulado com heterocromatina irregularmente agrupada similar aos
bradizoítas; contudo, sua forma não é fusiforme e são vistas numerosas
invaginações (NEILL et al., 1989).
O citoplasma dos miócitos manifesta alterações degenerativas menores
adjacentes à parede cística primária, mas o restante dos miócitos parasitados
pe
rmanece intacto. Essas alterações mínimas consistem em divisão e fragmentação
das miofibrilas, dissolução da banda Z, desarranjo do retículo sarcoplasmático e
23
componentes do sistema T, e concentração das mitocôndrias entre ou adjacente às
protrusões da parede cística. Não foram encontradas diferenças nas alterações
observadas em miócitos abrigando cistos maduros e degenerados (NEILL et al.,
1989).
Segundo Neill et al. (1989), cistos na musculatura peitoral e cardíaca
degeneram enquanto cistos amadurecem na musculatura da perna. A degeneração
parece começar no estágio inicial de metrócito com a parada do desenvolvimento da
parede cística primária. Subseqüentemente, há acentuada distensão do retículo
endoplasmático rugoso dos zoítas, que mais tarde degeneram e sofrem dissolução.
Não há diferença ultra-estrutural na morfologia do miócito hospedeiro entre cistos
maduros e degenerados. Contudo, miócitos humanos exibem acentuadas diferenças
bioquímicas enquanto mantêm a ultraestrutura quase homogênea. Presume-
se,
então, que a musculatura esquelética das aves exibe heterogeneidade bioquímica
similar. O músculo peitoral das aves tem funções especializadas e provavelmente
um perfil bioquímico distinto; essa distinção leva a presumir que as musculaturas
cardíaca e peitoral sejam deficientes em um ou mais fatores necessários à
maturação dos cistos.
A parede do sarcocisto de S. lindsayi consiste de numerosas protrusões
delgadas, com até 2 m de comprimento e 0,3 m de largura, cada uma com um
estilete em sua ponta. Nas protrusões há recortes e são pautadas por uma densa
camada de aproximadamente 0,1 m de espessura. A membrana vacuolar
parasitófora e a camada densa são interrompidas a intervalos regulares (DUBEY et
al., 2001b).
Segundo Dubey et al. (1989), em meio a todos os critérios de avaliação
morfológica, a estrutura da parede do sarcocisto é o critério mais confiável para
distinguir espécies de
Sarcocystis
em um dado hospedeiro, mas não entre diferentes
hospedeiros porque espécies biologicamente distintas podem ter sar
cocistos
estruturalmente idênticos em diferentes hospedeiros. Por exemplo, a semelhança
estrutural dos sarcocistos em ovelhas e cabras é muito próxima, no entanto não há
transmissão cruzada e são biologicamente distintos.
Box et al. (1984) compararam sarcocistos de S. falcatula de periquitos
australianos e canários e verificaram que são estruturalmente idênticos, com
protrusões na parede cística de sarcocistos maduros medindo 1-
5
m de
24
comprimento; contudo, a mais longa protrusão em sarcocisto de periquito
australiano
foi de 2,2
m, enquanto que em sarcocisto de canário foi de 4,8
m.
Recentemente, foram encontrados sarcocistos de S. neurona
morfologicamente similares aos de organismos S. falcatula-simile, embora esses
parasitas difiram na gama de hospedeiro
s experimentais e na patologia que induzem
(DUBEY et al, 2000a).
2.4.
R
EAÇÃO EM
C
ADEIA DA
P
OLIMERASE
(PCR)
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é cada vez mais utilizada na
detecção de coccídios. Através dela é possível detectar o DNA do parasita no
hospedeiro intermediário logo no início da infecção, tanto em amostras de animais
infectados natural e experimentalmente, bem como em infecções mistas. Outra
vantagem da PCR é seu potencial de adaptação para examinar os diferentes
estágios do parasita isol
ados dos hospedeiros definitivos (TENTER, 1995).
Dame et al. (1995) comparando o gene ssuRNA de S. falcatula com o
mesmo gene de S. neurona, observaram uma similaridade de 99,6%, sugerindo
que
S. falcatula
e
S. neurona pudessem ser a mesma espécie. Porém,
em
estudos posteriores, utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR), foi
demonstrado que S. falcatula
e
S. neurona tinham variações genéticas sendo,
portanto, consideradas como espécies diferentes (CUTLER et al., 1999;
TANHAUSER et al., 1999).
Tanha
user et al. (1999) desenvolveram os primers (iniciadores) de PCR
JNB33 e JNB54, que amplificam para ambas as espécies um produto de 1100
pares de bases (pb); sendo assim, para distinguir esporocistos de S. neurona
daqueles de S. falcatula foram utilizadas as endonucleases de restrição
Hinf
e
Dra
. O produto de PCR de
S. neurona
não é cortado por Hinf
, enquanto o produto
de S. falcatula é cortado em fragmentos. Por outro lado, o produto de S. neurona
é
cortado em fragmentos pela digestão por Dra , enquanto o produto de S. falcatula
não é cortado por essa enzima.
25
Contudo, dois isolados de esporocistos oriundos de gambás possuíram tanto
locais Dra
e Hinf , indicativo de infecção mista ou de uma linhagem com um novo
genótipo. Foram relatados então organismos provenientes do gambá sul-
americano
(D. albiventris), distintos de S. neurona
e
S. speeri, mas semelhantes a S. falcatula
,
cujo produto recebe a ação de ambas endonucleases de restrição
(DUBEY et al., 2000a,b; ROSENTHAL et al., 2001
).
Com os iniciadores JNB25 e JD396 houve a amplificação de um produto
de 334 pb para ambas as espécies, onde o produto de S. neurona não foi
digerido por Hind , enquanto o de S. falcatula foi digerido em fragmentos de
180 e 154 pb. Sete de nove isolados de esporocistos obtidos de intestinos de
gambás foram rapidamente caracterizados como semelhantes a S. neurona
ou
S.
falcatula, contudo no seqüenciamento verificou-se que dois isolados foram
igualmente diferentes para S. neurona e S. falcatula, mas 98,8% similares entre
si. Assim, esses isolados são provavelmente de uma espécie distinta, ainda não
identificada (TANHAUSER et al., 1999).
26
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1.
L
OCAIS DE DESENVOLVIM
ENTO DO PROJETO
O projeto foi desenvolvido no Laboratório de Sanidade Animal (LSA) do
Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA), em conjunto com o
Laboratório de Biologia Celular e Tecidual (LBCT) e Laboratório de Biotecnologia
(LBT) do Centro de Biociências e Biotecnologia (CBB), todos pertencentes à
Universi
dade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), em colaboração
com o Laboratório de Coccídios e Coccidioses (Projeto Sanidade
Animal/EMBRAPA/UFRRJ), Departamento de Parasitologia Animal do Instituto de
Medicina Veterinária da Universidade Federal R
ural do Rio de Janeiro (UFRRJ).
3.2.
O
BTENÇÃO DOS ESPOROCI
STOS
Os esporocistos foram obtidos de gambás da espécie D. aurita,
capturados de acordo com a licença n
96/02
-RJ, processo IBAMA n
02022.008098/02
-91, no Estado do Rio de Janeiro, nos Municípios de
Seropédica, Mangaratiba, Rio de Janeiro e Campos dos Goytacazes, e
eutanasiados de acordo com a Resolução n
714, de 20 de junho de 2002, do
Conselho Federal de Medicina Veterinária (CFMV), em conformidade com a Lei
Estadual n
o
3900/02, com aprovação
d
a Comissão de Bioética
.
Após a necrópsia e evisceração dos gambás, a mucosa do intestino delgado
foi raspada para obtenção dos esporocistos retidos na lâmina própria de acordo com
o protocolo preconizado por Dubey et al. (1999) e Porter et al. (2001). O raspado da
mucosa do intestino delgado foi macerado em gral com pistilo e digerido em
hipoclorito de sódio aquoso a 10% por 10 minutos em agitador magnético
(MEDINGEN SITZ FREITAL, modelo 2374). Após esse processo, o material foi
passado em tamis com gaze dupla, depositado em tubo cônico de 15 ml e
centrifugado (Centrífuga CELM, Modelo LS-3 Plus) três vezes com solução salina
27
tamponada (PBS) para remoção do cloro. Os esporocistos obtidos foram suspensos
em solução salina balanceada de Hanks (HBSS), acrescida de 10mg de
estreptomicina, 10.000U de penicilina, 500U de micostatin e 0,05mg de anfotericina
B por ml de solução e em seguida estocados à temperatura de refrigeração (DUBEY
et al., 1999).
3.3.
O
BTENÇÃO DOS SARCOCIS
TOS E MICROSCOPIA ÓP
TICA
Um total de 20 periquitos australianos (M. undulatus) foi mantido em
isolamento por duas semanas, recebendo água e alimento ad libitum, sendo então
inoculados cinco periquitos por amostra positiva ao exame microscópico com 26
esporocistos do gênero
Sarcocystis
em 50
0
l de PBS, após lavagem com três
centrifugações sucessivas para retirada da solução de estoque. Os animais do grupo
controle, também em número de cinco, receberam PBS em mesmo volume
(placebo). O inóculo foi depositado diretamente no papo dos animais com auxílio de
uma sonda de gavagem, e cada grupo foi mantido separado em gaiolas próprias
para a criação da espécie.
Os periquitos que vieram a óbito ou foram eutanasiados no 30º DAI, de
acordo com a Resolução n
714, de 20 de junho de 2002, do Conselho Federal de
Medicina Veterinária (CFMV) e com a Lei Estadual n
o
3900/02, após aprovação pela
Comissão de Bioética, foram necropsiados e eviscerados, sendo coletadas amostras
de pulmões, língua, coração, musculatura peitoral e musculatura das pernas, que
foram fixadas em formalina neutra tamponada a 10%, clivadas, processadas,
incluídas em parafina e cortadas em 5 m. Os cortes foram então corados pelo
método de HE.
Os cistos musculares observados nos cortes histológicos foram fotografados
em microscópio binocular NIKON, modelo ECLIPSE E400 e medidos com auxílio de
ocular micrométrica GF-P16X em microscópio binocular JENAVAL (ZEISS-
JENA
-
RDA) com ocular micrométrica 15X (PZO-Polônia) e objetiva de 40x e 25x,
respectivamente.
A parede dos sarcocistos foi mensurada ut
ilizando
-
se
microscópio binocular
28
digital, marca “OPTION”, modelo “TNB-04D”, objetiva de 100x e software
“Microscopy Image Processing System
-
DN2 for Windows” de análise de imagens.
3.4.
M
ICROSCOPIA
E
LETRÔNICA DE
T
RANSMISSÃO
(MET)
Fragmentos de coração, língua e musculatura da perna e do peito contendo
sarcocistos foram retirados do formol, clivados e acondicionados em tubos tipo
“Eppendorf” a 4ºC. As amostras foram lavadas em tampão cacodilato de sódio
(0.1M, pH 7.0) por três vezes e mantidas a 4ºC durante a noite. Estas foram pós-
fixadas, por 1 hora, em ferrocianeto de potássio a 0,8% em tampão cacodilato e
tetróxido de ósmio a 1%, e então lavadas no mesmo tampão.
As amostras foram então desidratadas em série ascendente de acetona
(15% a 100%), permanec
endo por 30 minutos em cada concentração, a temperatura
ambiente. Em relação à acetona a 100%, foram feitas três séries, também com
intervalos de 24 horas a temperatura ambiente, sendo que as duas primeiras foram
em acetona a 100% P.A. (para Análise) e a t
erceira em acetona a 100% super seca.
A infiltração do material foi realizada em mistura de Spurr e acetona a 100%
super seca, respectivamente, nas seguintes concentrações: 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2,
1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 e 6:1, por 24 horas em cada etapa, a 4ºC.
Os fragmentos foram incluídos em Spurr puro durante três dias, 24 horas
cada etapa, a temperatura ambiente, e polimerizados em estufa a 70ºC por 24
horas.
Foram obtidos cortes semifinos (0.5 m de espessura) das amostras em
ultramicrótomo Reichert® e corados com solução de azul de toluidina a 1% e bórax
a 1%. Estes cortes foram observados em microscópio Zeiss Axioplan, com objetiva
de 10x em campo claro. Além disso, foram obtidos também cortes ultra-finos (60 a
70 nm de espessura), coletados em grades de cobre (300 mesh) e contrastados em
solução de acetato de uranila por 30 minutos e citrato de chumbo por 5 minutos e
observados ao Microscópio Eletrônico de Transmissão Zeiss 900, a 80 KV. As
micrografias foram digitalizadas em programa Adobe Photoshop, em plataforma
Windows XP, através de computador Pentium IV, acoplado ao Microscópio
Eletrônico de Transmissão.
29
3.5.
D
IAGNÓSTICO MOLECULAR
PARA IDENTIFICAÇÃO D
E ESPÉCIES DE
Sarcocystis
3.5.1. Extração do DNA
Foram testados dois métodos para a extração do DNA da amostra de
esporocistos que infectou periquitos australianos.
3.5.1.1.
Método BAC
Uma alíquota de 1ml da amostra foi colocada em tubo de 1,5ml para
microcentrífuga e centrifugada a 10.000 RPM por 5 minutos, sendo desprezado o
sobrenadante.
Em seguida procedeu-se a lavagem com 500 l de água Milliq,
homogeneizando bem em agitador de tubos do tipo “Vortex”, centrifugando e
desprezando o sobrenadante.
Ao
“pellet”
acrescentaram
-se 200 l de GTE (0,027 l de Glicose + 62,4 l de
Tris HCl 1M, pH 8.04 + 48 l de EDTA 0,5M, pH 8.03 Sigma) e 150 l de RNAse na
concentração de 10mg/ml, homogeneizando e depois adicionando 400 l de
NaOH/SDS (240
l NaOH 2N + 240
l SDS 10% Sigma), com nova homogeneização.
Acrescentaram
-se 300 l de acetato de potássio (KAc) 3M, pH 5.33 (Merck),
com nova centrifugação por 15 minutos a 12.000 RPM. Foi adicionado 0,7V a 1V de
Isopropanol P.A. (Merck), levando ao freezer por 30 minutos.
Finalmente o material foi centrifugado por 15 minutos a 12.000 RPM,
procedeu
-se a lavagem com 500 l de Etanol 70%, sendo homogeneizado e
centrifugado por 15 minutos a 12.000 RPM. Após ficar por 3 horas no freezer, o
“
pellet
” foi ressuspenso com água Milliq para atingir o volume de 20 l.
30
3.5.1.2.
Método TELT
A metodologia aplicada foi a descrita por Medina-Acosta e Cross (1993),
como a seguir:
Uma alíquota de 1ml da amostra foi colocada em tubo de 1,5ml para
microcentrífuga e centrifugada a 10.000 RPM por 5 minutos, sendo desprezado o
sobrenadante. Em seguida procedeu-se a lavagem, acrescentando 500 l de água
Milliq, homogeneizando bem em agitador de tubos, centrifugando novamente e
desprezando o sobrenadante.
O “
pellet
” foi homogeneizado e acrescentaram-se 150 l de TELT e 7,5 l de
RNAse, misturando por inversão três vezes e incubando por 5 a 10 minu
tos.
Foi acrescentado então 150 l de Fenol/Clorofórmio, misturando e
centrifugando por 5 minutos a 13.000 RPM. A fase aquosa foi pipetada e colocada
em outro tubo para microcentrífuga, acrescentando-se a essa fase 0,7V a 1V de
Isopropanol, misturando e incubando por 5 minutos. Após 30 minutos no freezer, foi
centrifugado por 15 minutos a 12.000 RPM.
Em seguida, procedeu-se a lavagem com 500 l de Etanol 70%,
homogeneizando e centrifugando por 15 minutos a 12.000 RPM.
Após permanecer durante 3 horas no freezer, o “
pellet
” foi re-suspenso com
água Milliq para atingir o volume de 20 l.
3.5.2. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Foi realizada a PCR das amostras extraídas por ambos os métodos,
utilizando
-
se as seguintes seqüências de iniciadores para amplific
ação:
Iniciador JNB33:
5’
-
CGAACAGGAGATGAGGAAAAT
-
3’
Iniciador JNB54:
5’
-
GTTGTGGTGTTGCGTGAGTC
-
3’
31
3.5.2.1.
Amplificação
Para um volume final de reação de 20 l/tubo, colocou-se em cada tubo de
1,5 ml para microcentrífuga (Quadro1):
a) DNA extraído pelos
métodos BAC e TELT, em volumes de 1, 2 e 5 l
b) Iniciadores na concentração de 5,4 pmoles/
l, em volumes de 1, 2 e 4 l:
c) MgCl
2
, em volume de 4
l
d) dNTPs, em volume de 8
l
e) Tampão, em volume de 2 l
f) Taq Polimerase, em volume de 0,16
l
g) Água Milliq
, em volumes variáveis para completar 20
l
O conteúdo dos tubos foi aplicado em gel de agarose a 2% em cuba de
eletroforese, utilizando-se 5 l de cada amostra com 5 l do tampão, além do
marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder (Quadro 1).
3.5.2.2.
Pr
ograma utilizado no Termociclador (Marca MJ, modelo PTC 100)
As condições estabelecidas para a PCR foram:
a) 1 ciclo de 95º C por 5 minutos;
b) 40 ciclos de: 95º por 1 minuto, 50º C por 1 minuto e 15 segundos, e 72º C por 1
minuto;
c) 1 ciclo de 10º C po
r 1 hora.
32
Quadro 1.
Padronização da extração do DNA de esporocistos de
Sarcocystis
spp. isolados
em
gambá (
D
idelphis
aurita
).
Reagentes
MÉTODO DE EXTRAÇÃO
1
TELT
BAC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9
DNA
1 2 5 1 2 5 1 2 5 1 2 5 1 2 5 1 2 5
Primer 1
1 1 1 2 2 2 4 4 4 1 1 1 2 2 2 4 4 4
Primer 2
1 1 1 2 2 2 4 4 4 1 1 1 2 2 2 4 4 4
MgCl
2
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
dNTPs
8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8
Tampão
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Taq
Polimerase
0,16 0,16 0,16
0,16 0,16 0,16 0,16 0,16 0,16
0,16 0,16 0,16 0,16 0,16 0,16 0,16 0,16 0,16
Água Milliq
12,84
11,84
8,84
10,84
9,84 6,84 6,84 5,84 2,84
12,84
11,84
8,84 10,84
9,84 6,84 6,84 5,84 2,84
Volume
total
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
1
Volume em
l adicionado em tubos para microcentrífuga de 1,5 ml numerados.
33
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1.
E
SPOROCISTOS E CISTOS
DO GÊNERO
Sarcocystis
EM
Didelphis aurita
De 27 gambás capturados, foram observados esporocistos em apenas três
animais capturados no Município de Seropédica (Tabela 1).
Dos periquitos utilizados na infecção experimental, somente os que
receberam sedimento de raspado de mucosa de intestino delgado de um dos
gambás do Município de Seropédica desenvolveram infecção (Tabela 1). Quanto à
utilização de aves como animal experimental para o isolamento e identificação de
espécies do gênero
Sarcocystis
, cujo hospedeiro definitivo seja uma espécie do
gênero
Didelphis
, a primeira foi relatada por Box e Duszynski (1978) quando
inocularam pardais e canários com esporocistos obtidos de gambás da espécie
D.
virginiana
. Mais tarde, com a descrição de S. falcatula, Box et al. (1984) incluíram o
periquito australiano como um hospedeiro intermediário experimental para a
identificação de espécies de
Sarcocystis
parasitas de pássaros infectados com
esporocistos procedentes desta espécie de gambá comum no continente norte-
americano. A escolha do periquito australiano como modelo experimental foi
baseada em resultados de outros pesquisadores, que consideram este animal um
bom modelo para isolamento de espécies de
Sarcocystis
de aves (BOX e
DUSZYNSKI, 1978; BOX et al., 1984; SMITH et al., 1987a,b; NEILL et al., 1989;
DUBEY et al., 2001b).
Em todos os periquitos positivos foram encontrados merontes no endotélio
vascular de capilares
venoso
s no pulmão e cistos em células do tecido muscular
estriado esquelético e cardíaco, com maior predominância nos músculos da língua e
das coxas, caracterizando com isso a capacidade do par
asita de não só desenvolver
formas proliferativas (merontes), como também a formação final de cistos na
musculatura. Estes resultados são semelhantes ao relatados para as espécies
S.
falcatula
de
D. virginiana nos EUA (BOX et al., 1984; CHEADLE et al., 2001) e
S.
lindsayi
de D. albiventris no Brasil (DUBEY et al., 2001b). Confirma-se, assim, que o
parasita isolado é uma espécie de
Sarcocystis
com ciclo no gambá e ave,
34
descartando dessa forma as espécies S. neurona e S. speeri (MARSH et al, 1997;
DUBEY e LIN
DSAY, 1998; DUBEY et al., 1998; DUBEY e LINDSAY, 1999).
Tabela 1. Presença de esporocistos
de
Sarcocystis
lindsayi
em raspado de mucosa de intestino
delgado de gambás (Didelphis aurita) e em prova biológica utilizando-se periquitos
australianos (
Melopsit
tacus undulatus
).
Local de coleta
Gambás
Periquitos
Capturados
Positivos
1
Inoculados
2
Positivos
3
Seropédica
9 3
15
5
Mangaratiba
7 0
0 0
Rio de Janeiro
6 0
0 0
Campos dos Goytacazes
5 0
0 0
Total
27
3
15
5
1
Para presença de esporocistos no
material.
2
Cinco animais para cada amostra positiva.
3
Todos de uma mesma amostra.
4.2.
C
ARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS E MORFOMÉTRI
CAS DOS CISTOS
4.2.1. Microscopia óptica
Os cistos observados nos tecidos do periquito tinham tamanho microscópico,
vari
ando de 65,25 a 118,06 m de comprimento por 13,98 a 29,38 m de largura.
Foram encontrados em grande quantidade em musculatura estriada esquelética
(Figuras 3 e 4) e, embora bastante observados em musculatura cardíaca, nesta
estavam em menor número, tal como citado nos relatos de Neill et al. (1989) para
S.
falcatula
, apesar dos cistos desta espécie atingirem até 9 mm de comprimento, e ao
contrário de Dubey et al. (2001b) para S. lindsayi que, embora tenham
formado
cistos microscópicos, estes tinham formato fusiforme com até 600 m de
comprimento e 50 m de largura, e estavam presentes em pequeno número na
musculatura da perna mas ausentes na musculatura do peito.
35
Figura 3. Cistos de
Sarcocystis
lindsayi
( ) em tecido muscular de l
íngua
em periquito australiano
(
Melopsittacus
u
ndulatus
) inoculado experimentalmente, 30 dias após a infecção. H.E.
Barra = 20
m.
20
m
36
Figura 4. Cisto de
Sarcocystis
lindsayi
em tecido muscular de língua em periquito austra
liano
(
Melopsittacus
u
ndulatus
) inoculado experimentalmente,
contendo metrócitos (
) em seu
interior,
30 dias após a infecção. H.E.
Barra = 10
m.
10
m
37
No presente trabalho verificou-se predominância de cistos em musculatura
da perna e língua (Figuras 3 e 4), resultado não discutido por outros autores, mas
que pode estar relacionado ao hábito alimentar do gambá (
D. aurita
).
Além disso, foi comum encontrar cistos em franco desenvolvimento,
contendo metrócitos no seu interior ao lado de bradizoítas já bem formados,
determinando que houvesse ainda um bom período de desenvolvimento, como
observad
o
por Neill et al. (1989), Smith et al.
(1989) e Dubey et al. (2001b).
A espessura da parede cística variou de acordo com o corte histológico e
constituiu
-
se de du
as camadas distintas: a externa, caracterizada por finas projeções
digitiformes, e a interna totalmente lisa. Estas observações são semelhantes às
descritas por Neill et al. (1989) para
S. falcatula
do hospedeiro definitivo
D. virginiana
e por Dubey et al
. (2001b) para
S. lindsayi
do hospedeiro definitivo
D. albiventris
.
Nesta pesquisa, a espessura da parede dos cistos variou de 0,9-
1,9
m, o
que é semelhante ao mensurado por Dubey et al (2001b) para S. lindsayi, cuja
variação foi de 1 a 2 m, e diferente do observado por Neill et al. (1989) para
S.
falcatula
, que variou de 1 a 5 m. Segundo Dubey et al. (2001b), a variação
dependeu da duração da infecção e a maior espessura de parede (2
m)
foi
observada em um periquito eutanasiado no 45º DAI. No presente trabalho, os
periquitos foram eutanasiados no 30º DAI, o que pode justificar a pequena variação
observada.
Neill et al. (1989) verificaram que cistos de S. falcatula no coração e
musculatura peitoral degeneram, enquanto cistos na musculatura da perna e lín
gua
amadurecem, sem verificar diferença ultra-estrutural na morfologia do miócito
hospedeiro entre cistos em degeneração e maduros, o que não foi observado nos
cortes histológicos dessa pesquisa. Como o músculo peitoral das aves tem funções
especializadas
e, provavelmente, um papel bioquímico distinto, Neill et al. (1989)
presumiram que a musculatura peitoral e cardíaca deva ser deficiente em um ou
mais fatores necessários para a maturação do cisto ou mesmo que a localização dos
cistos férteis esteja relacionada aos hábitos alimentares dos hospedeiros definitivos,
no caso o gambá, como verificado nesta pesquisa para os tecidos onde houve maior
intensidade de formação de cistos.
38
4.2.2. Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
Segundo Dubey et al.
(1989
), em meio a todos os critérios de avaliação
morfológica, a estrutura da parede do sarcocisto é o critério mais confiável para
distinguir espécies de
Sarcocystis
em um dado hospedeiro, mas não entre diferentes
hospedeiros
, porque espécies biologicamente distintas podem ter sarcocistos
estruturalmente idênticos em diferentes hospedeiros. Por exemplo, a semelhança
estrutural dos sarcocistos em ovelhas e cabras é muito próxima, no entanto não há
transmissão cruzada e são biologicamente distintos. Neste trabalho utilizou-se a
mesma espécie de hospedeiro experimental que Neill et al. (1989) e Dubey et al.
(2001b), conferindo confiabilidade na avaliação morfológica dos sarcocistos.
Dubey et al. (2001b) verificaram numerosas protrusões delgadas e
recortadas (denteadas) em cistos de S. lindsayi, cada uma com um
estilete
na sua
extremidade
, enquanto Neill et al. (1989) descreveram protrusões em forma de cone
oval afilado, com pontas estreitas, para S. falcatula. O padrão morfológico das
protrusões da parede cística de todos os sarcocistos observados nesta pesquisa foi
semelhante ao descrito por Dubey et al (2001b) para
S. lindsayi
(Figuras 5, 6 e 7).
4.3.
R
EAÇÃO EM CADEIA DA P
OLIMERASE
(PCR)
Após a revelação do gel verificou-se que a extração por TELT foi melhor do
que a extração por BAC, evidenciado pela visualização de bandas mais fortes
(Figura 8). Contudo, as bandas correspondem a um maior número de pares de
bases do que o relatado na literatura por Tanhauser et al. (1999)
para
S. neurona
e
S. falcatula, utiliza
ndo
-se os iniciadores JNB33 e JNB54, sugerindo que os
esporocistos não seriam de nenhuma dessas espécies.
39
Figura 5. Cisto de
Sarcocystis
lindsayi
em musculatura da perna em periquito australiano
(
Melopsittacus
u
ndulatus
)
experimen
talmente infectado. MET, 4400x. M = Metrócito; S =
Septo; P = Protrusão.
M
S
P
40
Figura 6. Cisto de
Sarcocystis
lindsayi
em musculatura da perna em periquito australiano
(
Melopsittacus
u
ndulatus
) experimentalmente infectado. Setas indicam a presença de
estiletes
nas protrusões da parede cística. MET, 7000x. M = Metrócito; S = Septo; P =
Protrusão.
M
P
S
41
Figura 7. Cisto de
Sarcocystis
lindsayi
em musculatura da perna em periquito australiano
(
Melopsittacu
s u
ndulatus
) experimentalmente infectado. Seta ( ) indica os recortes
presentes nas protrusões da parede cística; seta cheia ( ) evidencia o
estilete
presente
na extremidade da protrusão da parede cística
.
MET, 12000x.
M = Metrócito
.
M
42
Figura 8. Resultado da amplificação do DNA de uma amostra de esporocistos de Sarcocystis
spp. isolados de gambá (Didelphis aurita), extraído pelos métodos TELT e BAC,
visualizado em gel de agarose a 2%. Seta: banda de amplificação com cerca de
1300
pb. MPM: marcador de peso molecular 100 bp DNA Ladder. Tubos de PCR numerados
de 1 a 9, para cada método de extração de DNA. Em todos os tubos foram utilizadas
as mesmas quantidades em l de MgCl
2
, dNTPs, Tampão e Taq Polimerase. Em
relação à quantidade de DNA extraído: tubos 1, 4 e 7 com 1 l; tubos 2, 5 e 8: 2 l;
tubos 3, 6 e 9: 5 l. Em relação aos iniciadores: tubos 1, 2 e 3 com 1 l; tubos 4, 5 e 6
com 2 l; tubos 7, 8 e 9 com 4 l. A água Milliq foi utilizada em quantidade suficiente
para atingir, em cada tubo, um volume final de 20 l.
1500pb
1100pb
TELT
BAC
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6
7 8 9
MPM
MPM
1500pb
1100pb
43
Com essa dúvida foram realizadas novas extrações por TELT, mas não foi
possível visualizar nenhuma banda. Dessa forma, não foi realizada a digestão do
produto de PCR usando as enzimas de restrição Hinf I e Dra I, preconizadas para a
diferenciação entre essas espécies, como realizado por Tanhauser et al. (1999), ou
de outras enzimas de restrição para observar o resultado destas sobre o produto de
PCR.
Dubey et al. (2000a,b) e Rosenthal et al. (2001) também não pu
deram
caracterizar isolados de esporocistos oriundos de gambás sul-americanos, distintos
de S. neurona
e
S. speeri, mas semelhantes a S. falcatula, cujo produto recebe a
ação de ambas endonucleases de restrição.
Tanhauser et al. (1999) utilizando outros iniciadores (JNB25 e JD396)
amplificaram um produto de 334 pb para ambas as espécies, caracterizando
isolados de S. neurona
e
S. falcatula. Contudo, dois isolados não puderam ser
caracterizados através da PCR. No seqüenciamento verificou-se que foram
igualmente diferentes para S. neurona e S. falcatula, mas 98,8% similares entre
si, sendo provavelmente de uma espécie distinta, ainda não identificada.
44
5. CONCLUSÕES
1. Com base na formação de merontes e cistos nos periquitos australianos, os
esporocistos obtidos do gambá (Didelphis aurita) não são das espécies
S.
neurona
e
S. speeri
;
2.
Levando
-
se em conta o número de pares de bases do produto de PCR obtido com
os iniciadores JNB33 e JNB54, os esporocistos não são de S. neurona ou de
S.
falc
atula
;
3. O parasita observado nesta pesquisa, baseado na morfologia e espessura da
parede cística primária através da MET, é similar a
S. lindsayi
;
4. O gambá-
de
-
orelhas
-pretas da Mata Atlântica, D. aurita, passa a ser considerado
como um novo hospedeiro definitivo para S. lindsayi, em condições naturais na
América do Sul.
45
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BOTELHO, G. G.; LOPES, C.
W. G. Esporocistos de
Sarcocystis cruzi
(Apicomplexa:
Sarcocystidae) em linfonodos mesentéricos de cães.
Arquiv
os da Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro
, v. 7, n. 1, p. 87
-
88, 1984.
BOX, E. D.; SMITH, J. H. The intermediate host spectrum in a Sarcocystis species of
birds.
J. Parasitol.
, v. 68, p. 608
-
673, 1982.
BOX, E. D.; DUSZYNSKI, D. W. Experimental
transmission of
Sarcocystis
from
icterid birds to sparrows and canaries by sporocysts from the opossum.
J. Parasitol.
, v.
64, p. 682
-
688, 1978.
BOX, E. D.; MEIER, J. L.; SMITH, J. H. Description of
Sarcocystis falcatula
Stiles,
1893, a parasite of birds
and opossums.
J. Protozool.
, v. 31, p. 521
-
524, 1984.
BRASIL. Assembléia Legislativa do Estado do Rio de Janeiro
.
Lei n
o
3900, de julho de
2002
.
Rio de Janeiro, RJ, 2002. Disponível em:
<http://www.alerj.rj.gov.br/processo2.htm>. Acesso em: 09 mar. 2004
.
______. Conselho Federal de Medicina Veterinária.
Resolução n
o
714, de 20 de
junho de 2002.
Brasília, DF, 2002. Disponível em:
<
http://www.cfmv.org.br/res714.htm
>. Acesso em: 09 mar. 2004.
CAWTHORN,
R.; REDUKER, D. W.; SPEER, C. A.; DUBEY, J. P. In vitro excystation
of
Sarcocystis capracanis
,
Sarcocystis cruzi
, and
Sarcocystis tenella
(Apicomplexa).
J. Parasitol.
, v. 72, p. 880
-
884, 1986.
CHEADLE, M. A.; DAME, J. B.; GREINER, E. C. Sporocyst size of
isolates of
Sarcocystis
shed by the Virginia opossum (
Didelphis virginiana
).
Vet. Parasitol.
, v.
95, p. 305
-
311, 2001.
CLUBB, S. L.; FRENKEL, J. K.
Sarcocystis falcatula
of opossums: transmission by
cockroaches with fatal pulmonary disease in psittacine
birds.
J. Parasitol.
, v. 78, p.
116
-
124, 1992.
CUTLER, T. J.; MACKAY, R. J.; GINN, P. E.; GREINER, E. C.; PORTER, R.;
YOWELL, C. A.; DAME, J. B. Are
Sarcocystis neurona
and
Sarcocystis falcatula
46
synonymous? A horse infection challenge.
J. Parasitol.
, v.
85, n. 2, p. 301
-
305,
1999.
DAME, J. B.; MACKAY, R. J.; YOWELL, C. A.; CUTLER, T. J.; MARSH, A.;
GREINER, E. C.
Sarcocystis falcatula
form passerine and psittacine birds: synonymy
with
Sarcocystis neurona,
agent of equine protozoal myeloencephalitis.
J.
Parasitol.
,
v. 81, n. 6, p. 930
-
935, 1995.
DUBEY, J. P. Development of ox
-cat cycle of
Sarcocystis hirsuta
.
Proc. Helminthol.
Soc. Wash.
, v. 49, p. 295
-
304, 1982a.
______. Prevalence of
Sarcocystis
species sporocysts in wild
-
caught opossums
(
Didelphis
virginiana
).
J. Parasitol.
, v. 86, p. 705
-
710, 2000.
______. Quantitative parasitemia in calves fed
Sarcocystis cruzi
sporocysts from
coyotes.
Am. J. Vet. Res.
, v. 43, p. 1085
-
1086, 1982b.
______.
Toxoplasma
,
Neospora
,
Sarcocystis
, and other tissue cy
st
-
forming coccidia
of humans and animals. In: KREIER, J. P. (Ed.)
Parasitic protozoa.
2. ed. San
Diego: Academic Press, 1992. cap. 1, p. 1
-
131.
DUBEY, J. P.; LINDSAY, D. S. Isolation in immunodeficient mice of
Sarcocystis
neurona
from opossum (
Didelphis
virginiana
) faeces, and its differentiation from
Sarcocystis falcatula
.
Int. J. Parasitol.
, v. 28, p. 1823
-
1828, 1998.
______.
Sarcocystis speeri
n. sp. (Protozoa:
Sarcocystidae) from the opossum
(
Didelphis virginiana
).
J. Parasitol.
, v. 85, p. 903
-
90
9, 1999.
DUBEY, J. P.; LINDSAY, D. S.; KERBER, C. E.; KASAI, N.; PENA, H. F. J.;
GENNARI, S. M.; KWOK, O. C. H.; SHEN, S. K.; ROSENTHAL, B. M. First isolation
of
Sarcocystis neurona
from the South America opossum,
Didelphis albiventris
, from
Brazil.
Vet.
Parasitol.
, v. 95, p. 295
-
304, 2001a.
DUBEY, J. P.; LINDSAY, D. S.; REZENDE, P. C. B.; COSTA, A. J. Characterization
of an unidentified
Sarcocystis falcatula
-like parasite from the South America
opossum,
Didelphis albiventris
from Brazil.
J. Eukaryot. M
icrobiol.
, v. 47, p. 538
-
544, 2000a.
47
DUBEY, J. P.; LINDSAY, D. S.; VENTURINI, L.; VENTURINI, C. Characterization of
Sarcocystis falcatula
isolates from the Argentinian opossum,
Didelphis albiventris
.
J.
Eukaryot. Microbiol
.
, v. 47, p. 260
-
263, 2000b.
D
UBEY, J. P.; ROSENTHAL, B. M.; SPEER, C. A.
Sarcocystis lindsayi
n. sp.
(Protozoa: Sarcocystidae) from the South American opossum,
Didelphis albiventris
from Brazil.
J. Eukaryot. Microbiol.
, v. 48, p. 595
-
603, 2001b.
DUBEY, J. P.; SPEER, C. A.; EPLING, G.
P. Sarcocystosis in newborn calves fed
Sarcocystis cruzi
sporocysts from coyotes.
Am. J. Vet. Res.
, v. 43, p. 2147
-
2164,
1982.
DUBEY, J. P.; SPEER, C. A.; FAYER, R.
Sarcocystosis of animals and man.
Boca
Raton: CRC Press, 1989.
DUBEY, J. P.; SPEER, C.
A.; LINDSAY, D. S. Isolation of a third species of
Sarcocystis
in immunodeficient mice fed feces from opossums (
Didelphis virginiana
)
and its differentiation from
Sarcocystis falcatula
and
Sarcocystis neurona
.
J.
Parasitol.
, v. 84, p. 1158
-
1164, 1998.
DU
BEY, J. P.; VENTURINI, L.; VENTURINI, C.; BASSO, W.; UNZAGA, J. Isolation of
Sarcocystis falcatula
from the South American opossum (
Didelphis albiventris
) from
Argentina.
Vet. Parasitol.
, v. 86, p. 239
-
244, 1999.
FAYER, R. Development of
Sarcocystis fusi
formis
in the small intestine of the dog.
J.
Parasitol.
, v. 60, p. 660
-
665, 1974.
FAYER, R.; JOHNSON, A. J.
Sarcocystis fusiformis
: development of cysts in
calves
infected with sporocysts from dogs.
Proc. Helminthol.
Soc. Wash.
, v. 41, p. 105
-
108,
1974.
FENGER, C. K.; GRANSTROM, D. E.; LANGEMEIER, J. L.; STAMPER, S.;
DONAHUE, J. M.; PATTERSON, J. S.; GAJADHAR, A. A.; MARTENI
UK, J. V.;
XIAOMIN, Z.; DUBEY, J. P. Identification of opossums (
Didelphis virginiana
) as the
putative definitive host of
Sarcocyst
is neurona
.
J. Parasitol.
, v. 81, p. 916
-
919, 1995.
FENGER, C. K.; GRANSTROM, D. E.; GAJADHAR, A. A.; WILLIAMS, N. M.;
MCCRILLIS, S. A.; STAMPER, S.; LANGEMEIER, J. L.; DUBEY,
J. P. Experimental
induction of equine protozoal myeloencephalitis in horses u
sing
Sarcocystis
sp.
sporocysts from the opossum (
Didelphis virginiana
).
Vet.
Parasitol.
, v. 68, p. 199
-
213,
1997.
48
GALLETI, M.
Guia de Mamíferos da Mata Atlântica.
[S.l.: s.n.], 2002. Disponível
em: <
http://www.rc.unesp.br/ib/ecologia/caeco/4.pdf
>.
Acesso em: 01 jul. 2003.
HEYDORN, A. O. Beiträge zum lebenszyklus der Sarkosporidien. IX.
Entwicklungszyklus von
Sarcocystis suihominis
n. spec.
Berl. Munch. Tierarztl.
Wochenschr.
, v. 90, p. 218
-
224, 1977.
______. Zur entwicklung von
Sarcocystis arieticanis
n. sp.
Berl. Munch. Tierarztl.
Wochenschr.
, v. 98, p. 231
-
241, 1985.
HEYDORN, A. O.; GESTRICH, R. Beiträge zum lebenszyklus der Sarkosporidien.
VII. Entwicklungsstadien von
Sarcocystis ovic
anis
im schaf.
Berl. Munch. Tierarztl.
Wochenschr.
, v. 89, p. 1
-
5, 1976.
HEYDORN, A. O.; KARAER, Z. Zur schizogonie von
Sarcocystis ovicanis
.
Berl.
Munch. Tierarztl. Wochenschr.
, v. 99, p. 185
-
189, 1986.
HEYDORN, A. O.; UNTERHOLZNER, J. Zur Entwicklung
von
Sarcocystis hircicanis
n. sp.
Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr.
, v. 96, p. 275
-
282, 1983.
MARSH, A. E.; BARR, B. C.; TELL, L.; KOSKI, M.; GREINER, E.; DAME, J.;
CONRAD, P. A. In vitro cultivation and experimental inoculation of
Sarcocystis
falcatu
la
and
Sarcocystis neurona
merozoites into budgerigars (
Melopsittacus
undulatus
).
J. Parasitol.
, v. 83, p. 1189
-
1192, 1997.
MEDINA
-
ACOSTA, E.; CROSS, G. A. M. Rapid isolation of DNA from
trypanosomatid protozoa using a simple ‘mini
-
prep’ procedure
.
Mol.
Biochem.
Parasitol.
, v. 59, p. 327
-
330, 1993.
MEHLHORN, H.; HARTLEY, W. J.; HEYDORN, A. O. A comparative ultrastructural
study of the cyst wall of 13
Sarcocystis
species.
Protistologica
, v. 3, p. 451
-
467,
1976.
NEILL, P. J. G.; SMITH, J. H.; BOX, E. D.
Pathogenesis of
Sarcocystis falcatula
(Apicomplexa: Sarcocystidae) in the budgerigar (
Melopsittacus undulatus
). IV.
Ultraestructure of developing, mature and degenerating sarcocysts.
J. Protozool
.
, v.
36, p. 430
-
437, 1989.
OBENDORF, D. L.; MUNDAY, B. L.
Experimental infection with
Sarcocysits
medusiformis
in sheep.
Vet. Parasitol., v. 24, p. 59
-
65, 1987.
49
PORTER, R. A.; GINN, P. E.; DAME, J. B.; GREINER, E. C. Evaluation of the
shedding of
Sarcocystis falcatula
sporocysts in experimentally infected Virg
inia
opossums (
Didelphis virginiana
).
Vet. Parasitol.
, v. 95, p. 313
-
319, 2001.
POWELL, E. C.; PEZESHKPOUR, G.; DUBEY, J. P.; FAYER, R. Types of myofibers
parasitized in experimentally induced infections with
Sarcocystis cruzi
and
Sarcocysits capracanis
.
Am. J. Vet. Res.
, v. 47, p. 514
-
517, 1986.
ROSENTHAL, B. M.; LINDSAY, D. S.; DUBEY, J. P. Relationships among
Sarcocystis species transmitted by New World opossums (Didelphis spp.).
Vet
.
Parasitol.
, v. 95, p. 133
-
142, 2001.
SHEFFIELD, H. G.; FAYER, R
. Fertilization in the coccidia: fusion of
Sarcocystis
bovicanis
gametes.
Proc. Helminthol.
Soc. Wash.
, v. 47, p. 118
-
121, 1980.
SILVA, J.; ROSSI, R. V.
Gambá.
São Paulo: Saraiva, [199
-
]. Disponível em:
<http://
www.editorasaraiva.com.br/biosonialopes
>.
Acesso em: 01 jul. 2003.
SMITH. J. H.; CRAIG, T. M.; DILLARD III, E. A.; NEILL, P. J. G.; JONES, L. P.
Naturally occuring apicomplexan acute intersti
cial pneumonitis in thick-
billed parrots
(
Rhynchopsitta pachyrhyncha
).
J. Parasitol.
, v. 76, p. 285
-
288, 1990a.
SMITH, J. H.; MEIER, J. L.; NEILL, P. J. G.; BOX, E. D. Pathogenesis of
Sarcocystis
falcatula
in the budgerigar. I. Early pulmonary schizogony.
Lab. Invest.
, v.
56, p. 60
-
71, 1987a.
______. Pathogenesis of
Sarcocystis falcatula
in the budgerigar. II. Pulmonary
pathology.
Lab. Invest.
, v. 56, p.
72
-
84, 1987b.
SMITH, J. H.; NEILL, P. J. G.; BOX, E. D. Pathogenesis of
Sarcocystis falcatula
(Apicomplexa: Sarcocystidae) in the budgeriga
r (
Melopsittacus undulatus
). III.
Pathologic and quantitative parasitologic analysis of extrapulmonary disease.
J.
Parasitol
.
, v. 75, p. 270
-
287, 1989.
SMITH, J. H.; NEILL, P. J. G.; DILLARD III, E. A.; BOX, E. D. Pathology of
experimental
Sarcocystis fa
lcatula
infections of canaries (
Serinus canarius
) and
pigeons (
Columba livia
).
J. Parasitol.
, v. 76, p. 59
-
68, 1990b.
50
STABENOW, C.S.
Identificação de Sarcocystis lindsayi
-
simile
(Apicomplexa:
Sarcocystinae) do Gambá (
Didelphis aurita
) e sua patogenicidad
e para o
periquito australiano (
Melopsittacus undulatus
).
2004. 54 f. Dissertação
(Mestrado em Produção Animal)
–
Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes, 2004.
TANHAUSER, S. M.; YOWELL, C. A.; CUTLER, T. J.; GREINE
R, E. C.; MACKAY,
R. J.; DAME, J. B.
Multiple DNA markers differentiat
e
Sarcocystis neurona
and
Sarcocystis falcatula.
J. Parasitol.
, v. 85, n. 2, p. 221
-
228, 1999.
TENTER, A. M. Current research on
Sarcocystis
species of domestic animals.
Int. J.
Parasi
tol
.
, v. 25, n. 11, p. 1311
-
1330, 1995.
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