( PDF ) Diagnóstico molecular da síndrome de li-fraumeni em famílias brasileiras

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DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA

SÍNDROME DE LI-FRAUMENI

EM FAMÍLIAS BRASILEIRAS

MARIA ISABEL WADDINGTON ACHATZ

Dissertação de Mestrado apresentada à Fundação

Antônio Prudente para a obtenção do Grau de

Mestre em Ciências

Área de concentração: Oncologia

Orientador: André Luiz Vettore

São Paulo

2006

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FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca do Centro de Tratamento e Pesquisa

Hospital do Câncer A.C. Camargo

Achatz, Maria Isabel Waddington.

Diagnóstico molecular da síndrome de Li-Fraumeni em famílias

brasileiras/ Maria Isabel Waddington Achatz -- São Paulo 2006.

102p.

Dissertação(mestrado)-Fundação Antônio Prudente.

Curso de Pós-Graduação em Ciências-Área de concentração: Oncologia.

Orientador: André Luiz Vettore

Descritores: 1. SÍNDROME DE LI-FRAUMENI. 2. GENES SUPRESORES

DE TUMOR. 3. GENES TP53/genética. 4. BIOLOGIA MOLECULAR. 5.

SÍNDROMES NEOPLÁSICAS HEREDITÁRIAS.

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DEDICATÓRIA

Aos meus filhos Thiago, Rafaela, Mariana e

Felipe, e ao Michael, meus amores e

grande motivo da minha Vida.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Agradeço aos meus filhos tão amados, Thiago, Rafaela, Mariana e Felipe, por

todas as vezes que abriram mão da minha presença, pela compreensão, carinho e

incentivo. Por terem me permitido levar adiante o meu sonho. Agradeço a Deus a

cada dia por vocês terem me escolhido.

Agradeço ao meu marido, Michael, pelo seu incentivo e confiança, por todos

os momentos em que me levantou, que torceu por mim e junto comigo, desde a

faculdade; pelo amor e atenção dado aos nossos filhos na minha ausência e,

principalmente, pela nossa família.

Agradeço a Yvonne, pela sua presença constante, por me guiar a cada passo,

pelo seu amor.

Agradeço aos meus pais, Ary e Maria Martha, por tudo o que vocês me

ensinaram, por tudo que investiram em mim, pela confiança e pelo carinho.

Agradeço aos meus irmãos Eduardo e Roberto, por sempre estarem do meu

lado, pela grande amizade que nos liga.

À Tereza, Joana e Alfredo, por me darem todo apoio e suporte para eu poder

trabalhar. Pelo amor que vocês têm pelos meus filhos.

À Lídia Aratangy, por ter me ajudado a manter a estrutura e pelo carinho.

Ao Fábio Carramaschi, pela grande amizade e apoio, por sempre me ajudar a

abrir meu caminho.

Às minhas amigas Lygia, Drika, Marisa, Alexia, Ana Luisa(s), Tisse e

Juliana, que tanto me acompanharam e torceram por mim quando eu mais precisava.

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao meu orientador neste trabalho, Dr. André Vettore, pela

disponibilidade, presteza e por me introduzir na Biologia Molecular.

Ao Dr. Pierre Hainaut por tudo que me ensinou. Obrigada por acreditar tanto

em meu trabalho e por sempre me mostrar que sou capaz.

Aos amigos do laboratório de Genética do Câncer: ao Fabrício pela amizade e

apoio molecular e psicológico, à Andréa Seixas, companheira de todos os momentos,

à Letícia por seu grande carinho e atenção, à Valeria Paixão pelos primeiros passos

no laboratório, ao Daniel pelas explicações e longas conversas, à Roberta Félix pelo

carinho, ao Fábio pelos momentos de força, à Mariana, pelas dicas, à Luciane pela

ajuda sempre pronta, à Fernanda, pelo apoio, Luciana e Benjamin pelas dúvidas

patológicas, à Dinamar, Roberta Lessa, Cláudia, Simone, Valéria e Manuella pela

simpatia diária, ao Alex e ao Emerson pelas ajudas informáticas, ao Luis e a Viviane

pelas dicas pediatricas, à Andréa Trevisan pelo alto astral e por todos aqueles do

laboratório que tem sempre uma palavra amiga.

Às Dras. Florence le Calvez, Magali Olivier, Ghyslaine Martel-Planche,

Emanuella de Morais, Emmanuelle Gormally e todos do MOC, por todo apoio e

amizade. Por terem me acolhido de braços abertos no IARC.

À Dra. Lygia da Veiga Pereira, pelo infindável incentivo, pela primeira porta

aberta, pelos conselhos e dicas sempre certeiras.

Ao Dr. Benedito Mauro Rossi, pela disponibilidade, pela sua orientação

sempre pertinente e pela sua amizade.

À Dra. Patrícia Aschton-Prolla por trazer resposta a cada uma de minhas

perguntas, pela confiança e ajuda e a Edenir Palmeiro pela presteza e carinho.

Ao Dr. Roberto Giulianni pelos controles de Porto Alegre.

Ao Dr. Fernando Regla Vargas pela confiança em me encaminhar as famílias

cariocas.

Ao Prof. Dr. Ricardo Renzo Brentani, pelo seu exemplo de força e coragem.

Ao Dr. HumbertoTorloni, pelo grande apoio e incentivo.

Ao Dr. Carlos Lotfi, pela confiança e apoio.

Ao Dr. Décio Brunoni por ter me dado a oportunidade de dar continuidade a

Oncogenética na UNIFESP, pelo seu apoio e discernimento.

Ao Dr. Alois Bianchi, pela sua atenção e exemplo de amor ao paciente.

À Dra. Ana Maria Camargo Aranha pela sua gentileza, apoio e compreensão.

Ao Dr. Luis Fernando Lima Reis, pela sua grande atenção e suporte.

Aos Drs. Vilma R. Martins, Dra. Luisa Lina Villa, Dra. Dirce Carraro, Dr.

Alex Fiorini e Dra. Adriana Abalen, pelos comentários e pela proximidade que vocês

nos propiciam.

Aos funcionários do Ludwig, Paulo Roberto, Birgit, Renata, Viviane, Carla,

Andréa, Erica, Roseli, Rubens, Isabel e Sirléia, um grande agradecimento pelo apoio

e dedicação.

À Dra Fernanda Lima, amiga e consultora, por toda base, apoio e amizade.

À Dra Simône Noronha por todas as dúvidas esclarecidas e pelo estímulo.

Ao Dr. José Cláudio Casali Rocha pelo ensino e introdução a Oncogenética.

Ao Prof. Dr. Fernando Soares, pela confiança e ajuda nos inúmeros pedidos

de lâminas.

À Dra. Isabela Werneck, pela sua animação e por estar sempre pronta a

ajudar.

A todos os funcionários do Departamento de Anatomia Patologia.

Ao Dr. Gustavo Guimarães, Dr. Luis Fernando Lopes, Dr. Stenio Zechi, Dr.

Bachega, Dra. Cecília, Dra. Suzana Malheiros e a todos os médicos que confiaram

em meu trabalho, encaminhando seus pacientes.

Ao Dr. André Lopes Carvalho pelas inestimáveis dicas estatísticas e

profissionais.

À Dra. Gilda, por todas as longas conversas sobre ADRs.

À Dr. André Montagnini, Dr. Luiz Paulo Kowalsky, Prof. Dr. Ademar Lopes,

Dra. Maria Tereza Cruz Lourenço, Dr. Mario Mourão, Dra. Beatriz de Camargo e

por todos os departamentos que aceitaram o desafio de acompanhar as famílias SLF.

À enfermeira Erica pelo seu auxílio na compreensão do Cyrillic.

À Dra. Rima Jbili, Dr. Danilo Pena e Dr. Israel Gomy pelo apoio na

investigação inicial dos pacientes.

À Dra. Ana Beatriz Perez pelo grande apoio, carinho e confiança, por tudo

que me ensinou na Genética Médica.

À Dra. Vera Meloni, pelas palavras sempre amigas, por todos ensinamentos

“dismorfológicos” e pelo teu exemplo.

Aos amigos do Centro de Genética Médica – UNIFESP: Dra. Mirlene

cernach, Dra. Ana Maria Martins, Dra. Cecília Micheletti, Dra. Sylvia Longhitano,

Dra. Leila Russowsky Brunoni, Dr. Luís Alonso, Dra. Ana Luisa Pilla, Dra. Nara

Sobrera, Dr. Pablo Domingues, Dra. Flavia Piazon, Dr. Fernando Ferreira Dr. Jordão

Correa Neto, Dr. Marco Ramos, Dra. Marli Rio, Dra. Tânia Seches, Dra. Sasndra

Kyosen e as amigas Naja Vergani, Mariana Picarelli e Jane Francis.A Karla, Cida e

Leandro pelo carinho e apoio.

Ao grupo do GBETH, meu agradecimento aos Dr. Gilles Landman, Dr. Fábio

Ferreira, Dr. Samuel Aguiar Jr, Dr. Wilson Nakagaua, Dr. Francisco Coelho e por

todos que contribuíram com criticas tão construtivas.

À Inês Nishimoto, por toda sua paciência na estatística e pela grande ajuda.

À psicóloga Christina Tarabay, por todo apoio que me deu ao aceitar

acompanhar meus pacientes no aconselhamento pós-teste, por sua presença sempre

alegre.

À Ana Maria Kuninari, a Márcia e Luciana, pelo apoio na pós-graduação.

Às bibliotecárias Suely Francisco, Rosinéia Carneiro e Francyne de Lima,

pelo apoio sempre carinhoso e bem-humorado.

Às secretárias da Oncogenética Luciele, Leda, Michelle e Thiara, pelo apoio.

Aos funcionários do Lavoisier que me auxiliaram na coleta de sangue dos

pacientes.

À FAPESP e ao National Cancer Institute (NCI /NIH - USA) pelo apoio

financeiro e pela bolsa de transferência tecnológica (ICRETT) do Union

Internationale Contre le Cancer (UICC).

RESUMO

Achatz MIW. Diagnóstico molecular da síndrome de Li-Fraumeni em famílias

brasileiras. São Paulo; 2006. [Dissertação de Mestrado-Fundação Antônio Prudente]

A Síndrome de Li-Fraumeni (SLF) é uma síndrome rara de predisposição ao

câncer associada a mutações no gene TP53. É transmitida de forma autossômica

dominante, predispondo indivíduos afetados ao risco aumentado de desenvolvimento

de tumores em idade jovem. Os objetivos deste trabalho são caracterizar mutações

germinativas no gene TP53 em famílias brasileiras com diagnóstico clínico de SLF e

de sua variante Li-Fraumeni like (LFL), avaliar o papel das mutações na síndrome e

estabelecer correlações genótipo-fenótipo. Foram incluídas 45 famílias brasileiras

que preencheram os critérios clínicos da síndrome. A metodologia incluiu a

amplificação dos dez éxons codificantes do gene TP53 por PCR no DNA genômico e

rastreamento de alterações por DHPLC, seguido de seqüenciamento das regiões

suspeitas. Foram encontradas 13 mutações germinativas (29.5%), sendo 12 mutações

missense e uma em sítio de splicing. A troca Arg337His (R337H), descrita

anteriormente como relacionada exclusivamente a carcinomas adrenocorticais

infantis, foi verificada em seis famílias com LFL. Foram detectadas três mutações

novas, Val173Met, Val197Met e Gly244Asp, duas mutações já descritas, Arg213Gly

e Gly245Ser, em famílias não relacionadas, e uma mutação em sítio doador de

splicing do íntron 6. Verificou-se baixa prevalência de mutações em famílias SLF

(11%). A mutação R337H ocorreu em freqüência elevada (46,1%) nas famílias SLF

brasileiras, predispondo ao amplo espectro tumoral. Tumores adrenocorticais foram

2,3 vezes mais freqüentes em famílias com a mutação R337H se comparado a

famílias com outras mutações, sugerindo efeito tecido-específico. Esta é a primeira

descrição da prevalência de mutações no gene TP53 nas SLF e LFL na América

Latina, representando 4,6% das mutações descritas na literatura.

SUMMARY

Achatz MIW. [Molecular diagnosis of Li-Fraumeni syndrome in Brazillian

families]. São Paulo; 2006. [Dissertação de Mestrado-Fundação Antônio Prudente]

Li-Fraumeni syndrome (OMIM #151623) (LFS) is a rare cancer

predisposition syndrome associated with germline mutations in the TP53 gene

(OMIM #191170). It is transmitted in an autossomal dominant pattern, which

predisposes affected individuals to an increased risk of developing a variety of

cancers at an earlier age. The objectives of this study were to analyze TP53

mutations in Brazilian families who received clinical diagnosis of LFS and its

variant, Li-Fraumeni-like syndrome (LFL). The molecular profile of the TP53 gene

was analyzed in 45 Brazilian unrelated individuals with family histories fulfilling the

clinical definitions of LFS or LFL. Analysis of TP53 exons 2 to 11 by PCR in

genomic DNA, screening by DHPLC and sequencing of abnormal profiles revealed

mutations in 13 patients (29.5%). Twelve missense mutations were detected and one

splice site mutation. Arg337His (R337H) mutations, previously described as related

only to adrenocortical tumors in children, were detected in 6 families. Three novel

germline mutations (Val173Met, Val197Met and Gly244Asp) and two already

described mutations (Arg213Gly e Gly 245Ser) were also detected in three families.

Families fulfilling the classical definiton of LFS presented a low detection rate

(11%). R337H mutations were frequent in Brazilian LFS families (46,1%),

predisposing to a wide tumour spectrum. Adrenocortical tumors are 2,3 times more

frequent among R337H carriers if compared to other mutations, suggesting a tumor-

specific effect. This is the first description of TP53 gene prevalence and mutation

pattern among SLF/LFL in Latin America, representing 4.6% of all mutations

described in scientific literature.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 O gene TP53 e a proteína p53. 13

Figura 2 Perfil de tumores das famílias brasileiras com mutações no gene

TP53 comparado ao perfil de tumores em outras famílias com a

mutação no gene TP53 depositadas no banco de dados do IARC. 46

Figura 3 Perfil de tumores das famílias brasileiras com mutações R337H no

gene TP53 comparado ao perfil de tumores em outras famílias com

a mutação no gene TP53 depositadas no banco de dados do IARC. 49

Figura 4 Digestão enzimática do códon 337 do éxon 10 do gene TP53 pela

técnica de RFLP. 55

Figura 5 Heredograma da família Y12. 61

Figura 6 Heredograma da família Y 27. 62

Figura 7 Heredograma da família Y49. 63

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Perfil clínico das famílias brasileiras com diagnóstico clínico de

SLF e LFL. 35

Tabela 2 Perfil tumoral de pacientes com diagnóstico clínico da SLF e LFL. 37

Tabela 3 Perfil de mutações das famílias brasileiras com mutações no gene

TP53. 40

Tabela 4 Espectro tumoral de 13 famílias brasileiras com mutações no gene

TP53. 44

Tabela 5 Idade de acometimento de tumores em de pacientes com diagnóstico

clínico da SLF e LFL. 48

Tabela 6 Espectro tumoral de 32 famílias brasileiras com diagnóstico clínico

da SLF e LFL sem detecção da mutação no gene TP53. 51

Tabela 7 Freqüência de polimorfismos no gene TP53 na população brasileira. 56

Tabela 8 Protocolo de rastreamento para pacientes portadores da SLF e

LFL adaptado à população brasileira. 65

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 Tumores mais freqüentemente associados à SLF e LFL. 6

Quadro 2 Critérios diagnósticos da Síndrome de Li-Fraumeni. 8

Quadro 3 Protocolo de rastreamento na Síndrome de Li-Fraumeni-

National Comprehensive Cancer Network (NCCN). 22

Quadro 4 Seqüência de primers utilizados nas reações de PCR para

DHPLC e seqüenciamento. 30

Quadro 5 Descrição de linhagens celulares usadas como controles positivos

no DHPLC. 31

LISTA DE ABREVIATURAS

ADR Carcinoma adrenocortical

BSA Bovine serum albumin

CCR Câncer colorretal

DNA Ácido desoxiribonucléico

DHPLC Denaturing High Performance Liquid Chromatography

KD Quilodalton

IARC International Agency for the Research on Cancer

LFL-B Síndrome de Li-Fraumeni like, critérios de Birch

LFL-E1 Síndrome de Li-Fraumeni like, critérios de Eeles 1

LFL-E2 Síndrome de Li-Fraumeni like, critérios de Eeles 2

μL Microlitro

mL Mililitro

mM Milimolar

OMIM On-line Mendelian Inheritance in Men

pb Pares de base

PCR Polimerase chain reaction

PCR-RFLP Restriction fragment length polimerase chain reaction

Pellet Precipitado linfocitário

rpm Rotações por minuto

SLF Síndrome de Li-Fraumeni

SNC Tumores do sistema nervoso central

SNPs Single nucleotide polymorphisms

SO Sarcoma ósseo

SPM Sarcoma de partes moles

WHO World Health Organization

ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 Histórico 1

1.2 Herança genética e penetrância 3

1.3 Quadro clínico e critérios diagnósticos 5

1.4 Diagnóstico diferencial 9

1.5 O gene TP53 e proteína p53–estrutura e função 11

1.6 Mutações e polimorfismos no gene TP53 15

1.7 Envolvimento de CHEK2 com a SLF e LFL 17

1.8 Correlação genótipo-fenótipo 18

1.9 Aconselhamento genético e rastreamento 20

2 OBJETIVOS 25

2.1 Objetivo geral 25

2.2 Objetivos específicos 25

3 PACIENTES E MÉTODOS 26

3.1 Seleção dos pacientes 26

3.2 Extração de DNA 28

3.3 Identificação das mutações no gene TP53 29

3.4 Análise de alterações detectadas por PCR-RFLP 33

4 RESULTADOS 34

4.1 Caracterização clínica das famílias SLF e LFL avaliadas 34

4.2 Detecção de mutações germinativas em famílias brasileiras com o

diagnóstico clínico da SLF e LFL 39

4.3 Perfil tumoral em famílias brasileiras com mutações germinativas

e diagnóstico clínico da SLF e LFL 42

4.4 Perfil tumoral em famílias brasileiras sem a detecção de

mutações germinativas e com diagnóstico clínico da SLF e LFL 50

4.5 Avaliação dos polimorfismos encontrados no gene TP53 54

4.6 Aconselhamento genético e acompanhamento 57

4.7 Detecção de mutação em familiares sintomáticos e assintomáticos 59

4.8 Adaptação do protocolo de rastreamento clínico multidisciplinar 64

5 DISCUSSÃO 67

6 CONCLUSÕES 89

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 91

ANEXOS

Anexo 1 Artigo original em peródico: “Achatz MIW, Olivier, Vettore A,

Hainaut P. Cancer letters, in press; MS. Ref. No: CAN-D-05-

00532R1. (Recebido em 15 de novembro de 2005; revisado em 22

de dezembro de 2005; aceito em 22 de dezembro de 2005.

Disponível online 21 de fevereiro de 2006.).

Anexo 2 Artigo de revisão em periódico: “TP53 gene and Li-Fraumeni

syndrome”. Achatz MIW and Hainaut P. Applied Cancer Research

2005; 25(2):51-57.

Anexo 3 Capítulo de livro: “Síndrome de Li-Fraumeni”. Organizadores:

Carlos Gil Ferreira e José Cláudio Rocha. In: Oncologia Molecular

(ISBN: 85-7379-692-8). Editora Atheneu, 2004.

Anexo 4 Ficha de avaliação clínica

Anexo 5 Consentimento informado

Anexo 6 Carta de Aprovação do comitê de ética

Anexo 7 Heredogramas

Anexo 8 Laudos fornecidos aos probandos

Anexo 9 Laudos fornecidos aos familiares

1 INTRODUÇÃO

1.1 HISTÓRICO

Em 1969, os pesquisadores LI e FRAUMENI revisaram 280 prontuários e

418 atestados de óbito de crianças que tiveram o diagnóstico de rabdomiossarcoma.

Buscando informações sobre a história familial destes pacientes, verificaram que

dentre as famílias estudadas, cinco apresentavam um perfil de alta ocorrência de

tumores nas gerações avaliadas, incluindo familiares com diagnóstico de sarcoma na

infância e casos de câncer de mama em idade jovem. As famílias avaliadas relataram

ainda a presença de outras neoplasias em gerações precedentes. A partir da

observação do agrupamento pouco comum de tumores malignos em idade precoce,

que sugeria um padrão de transmissibilidade hereditária, os autores propuseram uma

nova síndrome de câncer familial relacionada a diversos tumores - a Síndrome de Li-

Fraumeni (SLF; OMIM #151623) (LI e FRAUMENI 1969).

A caracterização inicial do espectro tumoral da síndrome incluía como

critérios principais para o diagnóstico a presença de osteossarcomas, sarcomas de

partes moles, câncer de mama em mulheres na pré-menopausa, tumores cerebrais,

tumores adrenocorticais e leucemias agudas sendo inicialmente denominada SBLA

(sarcoma, breast, leukemia and adrenocortical tumor syndrome). No entanto, desde

a descrição inicial da síndrome, verificou-se um amplo espectro tumoral, incluindo

tumores primários malignos de estômago, cólon, pâncreas, esôfago, além de tumores

de células germinativas e melanoma (LI et al. 1988; HARTLEY et al. 1989;

VARLEY et al. 1997a).

Em 1990, a SLF foi associada a mutações germinativas no gene TP53

(OMIM #191170) (MALKIN et al. 1990). O gene TP53 foi escolhido como

candidato por ser o gene mais freqüentemente mutado na maior parte dos tumores

malignos esporádicos. Estudos subseqüentes demonstraram que a mutação no gene

TP53 estava presente em grande parte de famílias com o perfil clínico da síndrome

(SRIVASTAVA et al. 1990).

Em 1994, BIRCH et al. analisaram 21 famílias, sendo que 12 preenchiam os

critérios clássicos propostos por Li e Fraumeni, além de nove famílias que

apresentavam características semelhantes à síndrome, mas que, no entanto, não

preenchiam todos os pré-requisitos para receberem o diagnóstico clínico de SLF. Das

nove famílias que apresentavam perfil semelhante à SLF, sete tiveram a

caracterização da mutação germinativa no gene TP53. Visando definir o diagnóstico

clínico e molecular das famílias que não tinham a expressão completa do fenótipo

clássico da síndrome, mas que apresentavam tumores típicos em idade precoce, um

critério diagnóstico adicional ao da SLF clássica foi proposto, sendo denominado Li-

Fraumeni variante ou Li-Fraumeni Like (LFL) (BIRCH et al. 1994). Posteriormente,

EELES (1995) propôs a inclusão de critérios mais abrangentes para a variante da

SLF, incluindo famílias nas quais eram detectados pelo menos dois tumores típicos

do espectro da síndrome.

O espectro tumoral inicialmente relacionado à SLF e LFL foi revisto após a

descrição de diversos outros tipos de tumores ocorridos em famílias que receberam o

diagnóstico da síndrome. CHOMPRET et al. (2001) demonstraram a presença de

melanoma, tumores de células germinativas, tumores gástricos e tumores de Wilms

nas famílias portadoras da síndrome. NICHOLS et al. (2001) avaliaram 738 tumores

malignos provenientes de 45 indivíduos portadores da mutação em TP53 e em seus

familiares de primeiro grau, além de 140 casos relatados na literatura, e concluíram

que os seis tumores inicialmente descritos como critérios da SLF (mama, sarcoma.

SNC, leucemia, osteossarcoma e adrenocortical) correspondiam a 77% dos tumores

apresentados nas famílias portadoras das mutações germinativas no gene TP53.

BIRCH et al. (2001) descreveram o espectro tumoral de 28 famílias com a SLF e

LFL e referiram como tumores mais freqüentes o câncer de mama, sarcomas de

partes moles, tumores adrenocorticais, osteosarcomas, tumores cerebrais e tumores

de Wilms’.

1.2 HERANÇA GENÉTICA E PENETRÂNCIA

A SLF é uma síndrome rara de predisposição ao câncer de alta penetrância,

que apresenta caráter autossômico dominante. Estima-se que pacientes com SLF e

sua variante LFL apresentem 50% de chance de desenvolver tumores antes dos 40

anos de idade, comparados a 1% na população geral, e que 90% dos portadores

desenvolvam câncer até 60 anos de idade (BIRCH et al. 2001). LE BIHAN et al.

(1995) avaliaram a estimativa do risco de desenvolvimento de algum tumor maligno

associada à idade dos pacientes SLF e LFL. Os pesquisadores consideraram que do

nascimento até os 16 anos de idade o risco para o desenvolvimento de câncer era de

42%, de 17 a 45 anos o risco era de 38% e que após os 45 anos esse risco chegaria a

63%, sendo o risco total ao longo da vida de 85%. VARLEY et al. (1997b)

compararam as idades ao diagnóstico dos tumores em pacientes provenientes de

famílias com SLF e LFL. Na série estudada, dentre os pacientes com o diagnóstico

de SLF, 56% apresentaram tumores malignos antes dos 30

anos e 100% até os 50

anos. Na mesma série, avaliando-se os pacientes com o diagnóstico de LFL,

verificou-se que 44% dos apresentaram tumores malignos antes dos 30 anos e 78%

destes pacientes desenvolveram câncer antes dos 50 anos. Este fato demonstrou que

pacientes com o diagnóstico clínico de LFS apresentam um maior risco para o

desenvolvimento de tumores malignos.

Os pacientes portadores da SLF e LFL têm risco aumentado de

desenvolvimento de múltiplos tumores primários, sendo que os indivíduos portadores

que desenvolveram algum tumor na infância são mais susceptíveis a apresentar mais

de um tumor primário (HISADA et al. 1998). Neste estudo, realizado em famílias

residentes nos Estados Unidos da América com diagnóstico de SLF e LFL, HISADA

et al. (1998) avaliaram 200 membros de famílias SLF nos quais já havia sido

diagnosticado algum tumor e, dentre os indivíduos avaliados, 15% desenvolveram

um novo tumor primário, 4% apresentaram um terceiro tumor primário e 2 %

tiveram quatro tumores primários diagnosticados.

Alguns outros fatores demonstraram estar envolvidos no aumento de risco no

desenvolvimento de tumores na SLF e LFL. LIMACHER et al. (2001) sugeriram

haver uma maior incidência de tumores secundários em regiões tratadas por

radioterapia. Isto foi verificado em uma paciente portadora da mutação germinativa

no gene TP53 que havia apresentado um câncer de mama e que apresentou dois

novos tumores primários, sendo estes adenocarcinoma de células pequenas de

pulmão e adenocarcinoma de cólon, ambos os tumores ocorridos no campo

radioterápico da mamária interna e no campo envolvido na irradiação do ovário.

NUTTING et al. (2000) relataram a incidência de 17 tumores primários em uma

única paciente portadora da mutação germinativa característica da SLF que havia

sido submetida à radioterapia e a quimioprevenção com o uso do Tamoxifeno após

ter apresentado um câncer de mama. Além disso, a exposição à radiação ionizante,

radiação gama, raios UV, agentes oxidantes, drogas citotóxicas e agentes químicos

causadores de câncer podem aumentar o risco de desenvolvimento de tumores

relacionados à síndrome (HISADA et al. 1998; NUTTING et al. 2000; LIMACHER

et al. 2001).

Acredita-se que o risco de desenvolvimento de tumores nos portadores da

SLF e LFL seja maior em mulheres. CHOMPRET (2002) definiu o risco em

mulheres portadoras da síndrome de desenvolvimento de câncer de 100% enquanto

que em homens esse risco seria de 73%, sendo esta diferença atribuída, em parte, ao

alto risco de desenvolvimento de câncer de mama, no entanto outros estudos que

corroborem esta afirmação precisam ser realizados.

1.3 QUADRO CLÍNICO E CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS

As manifestações clínicas da SLF e LFL são caracterizadas pela alta

incidência de tumores malignos de ocorrência em idade jovem. É uma doença

multissistêmica e de penetrância variável. Os tumores mais verificados na SLF e LFL

são sarcomas de partes moles (SPM), cânceres de mama, sarcomas ósseos (SO),

tumores do sistema nervoso central (SNC), tumores adrenocorticais (ADR) e

leucemias de início precoce. Devem-se relacionar ainda outros tipos de câncer que

podem ocorrer nesta síndrome, dentre eles tumores colorretais (CCR), estômago,

pulmão, melanoma e tumores de células germinativas (Quadro 1).

Quadro 1 - Tumores mais freqüentemente associados à SLF e LFL.

Tumores infantis

• Sarcomas de partes moles e ósseos

• Sistema nervoso central

• Câncer adrenocortical

• Linfoma / Leucemia

• Tumor de células germinativas

• Tumor de Wilms

Tumores em adultos

• Câncer de Mama

• Sarcomas de partes moles e ósseos

• Sistema nervoso central

• Câncer de pulmão

• Linfoma / Leucemia

• Câncer gástrico

• Câncer de cabeça e pescoço

• Câncer de próstata

• Câncer de pâncreas

• Câncer de ovário

• Câncer de endométrio

A anamnese e história familial dos pacientes que desenvolveram tumores

típicos da síndrome devem ser minuciosas e seguidas da investigação sobre outros

casos de câncer na família. A SLF e LFL acometem várias gerações, sendo freqüente

o acometimento de tumores em múltiplos familiares em cada geração. O diagnóstico

da síndrome inicialmente é clínico, realizado a partir da observação e anotação dos

diversos casos relatados pelas famílias avaliadas. O diagnóstico clássico da SLF é

realizado a partir de um paciente índice, ou probando, que apresentou sarcoma em

idade jovem (antes dos 45 anos); com um parente de primeiro grau com qualquer

câncer em idade jovem (antes dos 45 anos) além de outro parente de primeiro ou

segundo grau com diagnóstico de câncer em idade jovem (antes dos 45 anos) ou

sarcoma em qualquer idade (LI et al. 1988) (Quadro 2).

BIRCH et al. (1994) sugeriram critérios diagnósticos mais abrangentes do que

a definição clássica da síndrome, que foram denominados critérios de Li-Fraumeni

like. Estes critérios sugerem que a variante da síndrome pode ser definida a partir da

existência de um probando com câncer infantil ou que apresentou sarcoma, tumor

cerebral ou carcinoma adrenocortical em idade jovem (antes dos 45 anos), associado

à presença de um parente de primeiro ou segundo grau com câncer típico da SLF

(sarcoma, câncer de mama, câncer do sistema nervoso central, carcinoma

adrenocortical ou leucemia) em qualquer idade e, além disso, mais um parente de

primeiro ou segundo grau com qualquer câncer antes dos 60 anos (Quadro 2).

Em 1995, EELES propôs critérios diagnósticos definindo a LFL a partir de

dois parentes de primeiro ou segundo grau com tumores relacionados à SLF em

qualquer idade (Quadro 2). Nestes critérios, foi proposta a inclusão de pacientes que

apresentam múltiplos tumores primários e que por si próprios preenchem os critérios

para SLF ou LFL, associados ou não a outros tumores na família. EELES (2000)

propôs ainda a inclusão de famílias nas quais tivesse ocorrido um sarcoma em

qualquer idade associado a outro caso de tumores típicos da síndrome em qualquer

idade.

Posteriormente, CHOMPRET et al. (2001) sugeriram critérios diagnósticos

que elegeriam pacientes para detecção de mutações no gene TP53. Estes critérios são

muito amplos e por este motivo não são freqüentemente empregados no diagnóstico

clínico da síndrome. Além disso, é verificada a baixa taxa de detecção de mutação

em pacientes que receberam o diagnóstico de SLF e LFL a partir destas definições

(VARLEY et al. 1997a) (Quadro 2).

Quadro 2 - Critérios diagnósticos da Síndrome de Li-Fraumeni.

Clássico

Li e

Fraumeni

• Sarcoma na infância ou em idade jovem (antes dos 45 anos) e

• Parente de primeiro grau com qualquer câncer em idade jovem (antes dos 45

anos) e

• Parente de primeiro ou segundo grau que tenha o diagnóstico de câncer em

idade jovem (antes dos 45 anos) ou sarcoma em qualquer idade.

Birch

• Câncer na infância ou sarcoma, tumor do sistema nervoso central ou câncer

adrenocortical antes dos 45 anos e

• Parente de primeiro grau ou segundo grau com câncer típico da Síndrome de

Li-Fraumeni (sarcoma, câncer de mama, tumor do sistema nervoso central,

câncer adrenocortical ou leucemia) em qualquer idade e

• Parente de primeiro ou segundo grau com qualquer câncer antes dos 60 anos.

Eeles

• LFL-E1 presença de dois parentes de primeiro ou segundo grau com tumor

típico em qualquer idade (sarcoma, câncer de mama, tumor SNC, leucemia,

tumor adrenocortical, melanoma, câncer de próstata, câncer pancreático).

• LFL-E2: sarcoma em qualquer idade no probando com dois dos seguintes

tumores (podendo estar presentes no mesmo indivíduo) câncer de mama <50

anos e/ou tumor SNC, leucemia, tumor adrenocortical, melanoma, câncer de

próstata, câncer pancreático aos <60 anos ou sarcoma em qualquer idade.

Chomperet

• Sarcoma, tumor do sistema nervoso central, câncer de mama ou câncer

adrenocortical antes dos 36 anos e

a) Parente de primeiro grau ou segundo grau com câncer antes dos 46 anos

b) Parente com múltiplos tumores primários em qualquer idade

• Múltiplos tumores primários, incluindo dois tumores que sejam do tipo

sarcoma, tumor do sistema nervoso central, câncer de mama ou câncer

adrenocortical, com o primeiro tumor diagnosticado antes dos 36 anos,

independente da história familial.

• Câncer adrenocortical em qualquer idade e independente da história familial.

1.4 DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

Algumas famílias SLF e LFL apresentam quadros clínicos que se sobrepõe

aos de outras síndromes genéticas ligadas ao câncer. A alta incidência de tumores de

mama em idade jovem é uma característica marcante da SLF e LFL e também é

verificada em outras síndromes levando a dificuldade no diagnóstico preciso.

Aproximadamente 80 a 90% dos tumores da mama hereditários estão relacionados à

Síndrome do Câncer de Mama e Ovário Hereditário que está associada a mutações

nos genes BRCA1 e BRCA. Pacientes portadores desta síndrome apresentam um risco

de 87% de desenvolvimento de câncer de mama até os 70 anos de idade (THULL e

VOGEL 2004). Além dos tumores de mama, pacientes portadores de mutações nos

genes BRCA1 ou BRCA2 apresentam maior risco para o desenvolvimento de câncer

de ovário, que acomete 44% das mulheres portadoras da síndrome, além de

melanoma, tumores malignos de próstata, pâncreas e estômago (Breast Cancer

Linkage Consortium 1999).

Outra síndrome na qual é verificado o alto risco para o desenvolvimento de

câncer de mama é a Síndrome de Cowden, relacionada a mutações germinativas no

gene PTEN. Indivíduos portadores desta síndrome apresentam o risco de 22 a 50%

de desenvolvimento de câncer de mama em idade jovem, com o diagnóstico

ocorrendo entre 38 e 46 anos, além da ocorrência de outros tumores relacionados à

SLF e LFL, como o câncer de endométrio (BROWNSTEIN et al. 1978; STARINK et

al. 1986; BLACK et al. 2005).

A presença de casos de câncer gástrico difuso associado ao câncer lobular da

mama pode levantar a suspeita da Síndrome do Câncer Gástrico Difuso Hereditário,

causado pela mutação germinativa no gene CDH1. Em uma família portuguesa com

os critérios diagnósticos incompletos para o diagnóstico da Síndrome do Câncer

Gástrico Difuso Hereditário e sem mutação no gene CDH1 foi verificada a mutação

germinativa do gene TP53 característica da SLF (OLIVEIRA et al. 2004). KIM et al.

(2004) relataram a presença de uma mutação germinativa no gene TP53 em uma

família previamente descrita como portadora da Síndrome do Câncer Gástrico Difuso

Hereditário.

A Síndrome do Câncer Colorretal não Polipose (HNPCC) ou s[indrome de

Lynch, relacionada às mutações nos genes hMLH1, hMSH2, hPMS1,

hPMS2,

GTBP/hMSH6, é caracterizada pela presença de casos de tumores colorretais em

idade jovem podendo ser associada à presença de tumores de endométrio, bexiga e

mama, que também fazem parte do espectro da SLF e LFL (LYNCH 1994; ROSSI et

al. 2002; COURA et al. 2005). A presença de tumores malignos de outras etiologias

em idade jovem em famílias com este diagnóstico devem ser estudada

detalhadamente, aventando-se o diagnóstico diferencial com a SLF e LFL.

A presença de mutações germinativas no gene TP53 em pacientes que

apresentam tumores esporádicos, sem história familial de outros tumores, foi

verificada em diversos tipos histológicos. Este fato é verificado em portadores de

tumores adrenocorticais, nos quais se estima que 50 a 97% apresentem mutações

germinativas no gene TP53 (WAGNER et al. 1994; VARLEY et al. 1997a;

FIGUEIREDO et al. 2005). Estima-se que até 10% das crianças que apresentam

tumores de sistema nervoso central sem outros casos de câncer na família são

portadores da mutação germinativa no gene TP53 (FELIX at al. 1995; LI et al. 1995).

Acredita-se que pacientes com diagnóstico de rabdomiossarcoma serão portadores

em 9% dos casos de mutações germinativas no gene TP53, independente de terem ou

não história familial de outros tumores (DILLER et al. 1995). O mesmo pode ser

verificado em pacientes com osteosarcoma, nos quais se estima que 2 a 3% dos casos

apresentem mutações germinativas no mesmo gene (McINTYRE et al. 1994). A

ocorrência de mutações germinativas no gene TP53 nestes tumores isoladamente, na

ausência de história familial, pode ser explicada pela ocorrência de mutações de

novo. Em famílias nas quais múltiplos tumores precoces ocorrem, mas que não

apresentam, no entanto, os critérios diagnósticos da SLF e LFL, a taxa de detecção

de mutação é de 7 a 20% (MALKIN et al. 1992).

Frente ao fato de existirem diversas síndromes genéticas ligadas ao câncer

com quadros clínicos que podem se sobrepor e frente à presença da mutação

germinativa no gene TP53 em tumores esporádicos, torna-se fundamental a

realização de uma investigação mais aprofundada das famílias acometidas. A

obtenção da história familial de forma adequada, aprofundando-se quanto aos

detalhes sobre os tumores ocorridos e incluindo informações sobre familiares

provenientes de no mínimo três gerações deve ser sempre realizada, possibilitando a

realização do diagnóstico diferencial das diferentes síndromes.

1.5 O GENE TP53 E A PROTEÍNA P53 – ESTRUTURA E FUNÇÃO

O gene envolvido na SLF e LFL é o gene supressor de tumor TP53 (OMIM

#191170), localizado no braço curto do cromossomo 17 (17p13). Este gene tem o

tamanho aproximado de 20 kb, é composto por onze éxons, sendo o primeiro deles

não codificante, e produz um mRNA de 2.508 pb. O TP53 codifica a fosfoproteína

nuclear p53, formada por 393 aminoácidos e de peso molecular de 53 KDa, que se

liga a seqüências específicas de DNA e age como fator de transcrição dos genes

reguladores do crescimento celular (CRAWFORD et al. 1981; HAINAUT 1995)

A proteína p53 humana possui cinco domínios, cada um deles responsável

por funções específicas (MAY e MAY 1999). O domínio inicial (aminoácidos 1 a

62), ou amino terminal, é o domínio de transativação, no qual se encontra o sítio de

ligação à proteína Mdm2. É seguido por um domínio rico em resíduos de prolina

(aminoácidos 63 a 97) e pela região central da p53 (aminoácidos 102 a 292), que

abriga o domínio de ligação ao DNA. Este domínio de ligação ao DNA é alvo de

mais de 90% das mutações encontradas nos tumores humanos e na SLF e LFL. O

domínio de oligomerização (aminoácidos 323 a 356) é fundamental na configuração

espacial da proteína p53, responsável pela multimerização da proteína, que se unirá

em tetrâmeros. O domínio final é o de regulação (aminoácidos 363 a 393) (Figura 1).

A proteína p53 foi descrita por dois grupos distintos de pesquisadores em

1979, liderados por David Lane, da Universidade de Dundee, no Reino Unido (RU) e

Arnold Levine, da Universidade de Princeton, nos Estados Unidos da América

(EUA) (LANE e CRAWFORD 1979; REICH e LEVINE 1979). Inicialmente, foi

considerada como produto de um oncogene, porém no final dos anos 80 verificou-se

que esta propriedade devia-se a apenas algumas formas mutantes do gene, enquanto

que o gene selvagem tinha a capacidade de suprimir a transformação de um tumor,

seja in vitro ou in vivo (FINLAY et al. 1989).

Lege

dom

Figura 1

nda: (A): Representação dos éxons (cilindros) 1 a 11 do gene TP53; (B): Representação da proteína p53. As cores representadas nos éxons correspondem aos

ínios correlacionados na proteína.

4 6 5

7 8 11 9 10

Domínio de

transativação

(1-62)

Domínio

rico em

prolinas

(63-97)

Domínio de ligação

ao DNA

(102-292)

Domínio de

oligomerização

(323-356)

Domínio de

-C

regulação

(363-393)

III

- O gene TP53 e a proteína p53.

N-

Em 1990, o gene TP53 foi apontado como gene candidato da SLF, uma vez

que mutações foram detectadas em pacientes com o diagnóstico clínico da síndrome

(MALKIN et al. 1990; SRIVASTAVA et al. 1990). Dois anos mais tarde foram

produzidos camundongos nocauteados (Trp53) ou knock-out, portadores de mutações

no gene TP53. Os camundongos apresentaram desenvolvimento físico normal, porém

apresentaram tumores múltiplos em idade precoce demonstrando, a partir de um

modelo animal, a importância da proteína p53 na etiologia dos tumores malignos

(DONEHOWER et al. 1992).

A proteína p53 é um fator de transcrição expresso constitutivamente nos mais

variados tipos celulares e tecidos. Danos ao DNA, tais como quebras ou oxidação do

DNA e hipóxia, emitem sinais que ativam a p53. Devido a seu reduzido tempo de

atividade, variando de cinco a 20 minutos, a proteína não se acumula no núcleo. Em

resposta a certos estímulos a sua produção aumenta e passa então a se acumular no

núcleo da célula. Desta forma, a p53 irá exercer o seu efeito através do controle

transcricional, ativando ou reprimindo genes específicos envolvidos em sua via,

promovendo a parada do ciclo celular, principalmente na fase G1, ou induzindo a

célula à apoptose (HAINAUT 1995). O papel fundamental da p53 na regulação do

ciclo celular, na apoptose e no reparo do DNA consagrou-a com a denominação de

“guardião do genoma” (LANE 1992).

O principal regulador da p53 é a proteína Mdm2, uma proteína que se liga à

região N-terminal da p53, formando o complexo p53/Mdm2. Este complexo

possibilita o redirecionamento da p53 do núcleo para o citoplasma, onde a p53 será

degradada pelos proteassomas. A extensão e conseqüências da ativação da p53 vão

depender da intensidade dos sinais de indução e da sua origem. No caso da resposta a

exposição à radiação ionizante, a ativação da p53 ocorrerá a partir da fosforilação de

sua região N-terminal por quinases tais como Atm e Chk2, quinases regulatórias do

ciclo celular. A fosforilação levará a dissociação do complexo p53/Mdm-2 e logo a

estabilização da p53 (MOLL e PETRENKO 2003).

1.6 MUTAÇÕES E POLIMORFISMOS NO GENE TP53

Mais de 18.000 mutações pontuais no gene TP53 foram detectadas, sendo

97% somáticas e 3% germinativas. Mutações somáticas no TP53 estão presentes em

mais de 50% de todos os tumores somáticos, podendo variar de 10 to 60%,

dependendo do tipo de tumor ou da população estudada, o que faz com que este gene

seja considerado um dos genes mais freqüentemente mutados em cânceres humanos

(LEVINE 1997; HAINAUT e HOLLSTEIN 2000).

As mutações germinativas encontradas no gene TP53 levam ao

desenvolvimento de câncer hereditário, representando um exemplo do primeiro passo

do modelo de KNUDSON (1971). Mutações germinativas no gene TP53 foram

encontradas em aproximadamente 71% das famílias com SLF clássica e em 8% a

22% a das famílias com LFL, de acordo com os critérios de Eeles e Birch

respectivamente (VARLEY et al. 1997b). Até o momento, foram identificadas 283

mutações germinativas no gene TP53 descritas em 280 indivíduos ou famílias,

depositadas no

banco de dados de mutações em TP53 da Agência Internacional para

Pesquisa do Câncer – International Agency for the Research on Cancer (IARC TP53

Database R10) (OLIVIER et al. 2002).

As mutações germinativas no gene TP53 tendem a ocorrer

predominantemente no domínio central de ligação ao DNA, codificado pelos éxons 5

a 8 e ainda nos éxons 4 e 9 (OLIVIER et al. 2003). Cerca de 75% destas mutações,

tanto somáticas como germinativas, são do tipo missense, ou seja, promovem

alterações que levam a troca de aminoácidos, ocorrendo principalmente transições

de guanina para adenina. As mutações frameshift (que alteram a janela de leitura)

ocorrem em 6% dos casos enquanto que alterações nos sítios de splicing representam

2% dos casos (IARC TP53 Database R10). Mutações non-sense, nas quais ocorre

uma inserção de um códon de terminação da tradução prematuro, podem ocorrer,

além de duplicações nas diferentes regiões (VARLEY 2003a). Deleções no gene

TP53 aparentemente não são freqüentes, porém já foram relatadas (BOUGEARD et

al. 2003).

A pesquisa por alterações na região promotora do gene é fonte de grande

interesse atual, sendo vislumbrada como possível sítio de alteração nos pacientes

com SLF e LFL sem a detecção da mutação no gene TP53. ATTWOOLL et al.

(2002) descreveram uma deleção na região promotora deste gene em dois probandos

dentre 18 indivíduos com diagnóstico SLF e LFL, mas concluíram que se tratava de

um polimorfismo raro.

O padrão ouro, ou gold standard, para rastreamento das mutações no gene

TP53 é o seqüenciamento direto de DNA genômico de todos os éxons codificantes

(exons 2 a 11), do primeiro éxon que não é codificante, da região promotora, da

região 3’ não traduzida e todos os sítios de junção de splicing (VARLEY 2003a).

Aproximadamente 95% das mutações podem ser detectadas pelo seqüenciamento

direto dos éxons 4 a 9, mas devem-se procurar alterações em todos os éxons

codificantes. Deve-se levar em conta que caso a alteração seja devida a inversões,

duplicações ou grandes deleções, a alteração poderá não ser detectada pela técnica de

seqüenciamento (BOUGEARD et al. 2003).

Mais de 30 polimorfismos no gene TP53 foram descritos até o momento

(IARC TP53 Database R10). Estes polimorfismos ocorrem tanto em regiões

intrônicas como nos éxons. A presença do polimorfismo no códon 72, localizado no

éxon 4 do gene TP53, já foi extensamente estudada e relacionada à maior incidência

de neoplasias de pulmão, esôfago, cérvix e estômago (SUL et al. 2005). Existem

diversas evidências de que este polimorfismo possa ter impacto funcional na

susceptibilidade ao câncer e na resposta à quimioterapia (BERGAMASCHI et al.

2003; XU et al. 2005). Outros polimorfismos vem sendo alvo de estudos recentes. O

polimorfismo 13964, no íntron 6, foi relacionado à maior incidência de câncer de

tireóide em crianças da Bielorússia e a câncer de mama familial, porém não foi

confirmado como fator determinante na SLF (HILLEBRANDT et al. 1997;

LEHMAN et al. 2000).

1.7 ENVOLVIMENTO DO GENE CHK2 COM A SLF e LFL

Alguns estudos foram realizados correlacionando as SLF e LFL e mutações

germinativas no gene CHK2. BELL et al. (1999) detectaram a presença de mutações

germinativas no gene CHK2 (Cell-cycle checkpoint kinase-2) (OMIM #604373) em

famílias com o fenótipo SLF e LFL e na ausência de mutações germinativas no gene

TP53. VAHTERISTO et al. (2001) verificaram a ocorrência de mutações

germinativas no gene CHK2 em duas dentre 44 famílias finlandesas com as SLF e

LFL que não apresentavam mutações germinativas no gene TP53. SIDDIQUI et al.

(2005) avaliaram a incidência de mutações germinativas no gene TP53 e da alteração

CHK2*1100delC no gene CHK2 (a mais freqüentemente relacionada ao aumento de

risco na síndrome) em 23 famílias com fenótipo SLF e LFL. Foram detectadas

mutações no gene TP53 em sete famílias e apenas uma delas apresentou a alteração

CHK2*1100delC.

Até o presente, cinco famílias com mutação germinativa no gene CHEK2

foram incluídas no banco de dados de mutações germinativas do IARC, todas com a

detecção da mutação no gene TP53 e sendo duas destas com o diagnóstico clínico de

SLF e três com LFL (IARC TP53 Database R10). Outra correlação foi estabelecida,

descrevendo uma maior predisposição ao desenvolvimento do fenótipo da síndrome

de câncer de mama e câncer colorretal hereditário em portadores da alteração

CHEK2*1100delC (MEIJERS-HEIJBOER et al. 2003).

Atualmente se acredita que mutações no gene CHK2 estejam envolvidas no

aumento da susceptibilidade para o câncer de mama sugerindo que este gene possa

exercer ação supressora de tumor (VAHTERISTO et al. 2002; INGVARSSON et al.

2002; SODHA et al. 2002; VARLEY et al. 2003b).

1.8 CORRELAÇÃO GENÓTIPO-FENÓTIPO

Várias tentativas foram feitas no intuito de correlacionar mutações

germinativas no gene TP53 à maior incidência de tumores em algum órgão alvo ou

célula alvo. Em estudo realizado por HORIO et al. (1994) foi verificada maior

incidência de tumores gástricos em uma família japonesa portadora de uma mutação

germinativa no códon 213 do gene TP53. LEHMAN et al. (2000) verificaram a

presença do polimorfismo 13964 no gene TP53 em três mulheres com câncer de

mama e história familial de câncer de mama, dentre 42 avaliadas, levantando a

possibilidade desta alteração ser uma mutação de baixa penetrância.

Em 2001, RIBEIRO et al. avaliaram a presença da mutação no gene TP53 em

36 crianças com tumores adrenocorticais, provenientes da região da periferia de

Curitiba, no Brasil. Dentre as 36 crianças avaliadas, 35 apresentavam a mesma

mutação germinativa específica no domínio de oligomerização da p53, no éxon 10,

com a troca de uma arginina por uma histidina (R337H – CGC para CAC no codon

337). Esta mutação só havia sido descrita anteriormente em uma família com SLF na

Inglaterra (IARC TP53 Database R10). Os autores relataram não haver história

familial documentada de outros tumores e referiram não haver a existência de efeito

fundador, a partir do qual um ancestral comum a todas essas crianças haveria levado

a preservação da alteração nas gerações seguintes. A partir destes resultados, os

autores propuseram que esta mutação era tumor-específica, ou seja, indivíduos

portadores apresentariam um risco aumentado para o desenvolvimento apenas um

tipo de tumor – o carcinoma adrenocortical.

Para confirmar esta hipótese, RIBEIRO et al. (2001) conduziram estudos

funcionais e estruturais, identificando que a mutação R337H

no gene TP53

apresentava um defeito pH-dependente na região de oligomerização, tornando o gene

inativo apenas em condições de aumento de pH intracelular. Segundo estes autores, a

troca da arginina 337 por uma histidina alteraria a capacidade de formação das

pontes de hidrogênio entre dois monômeros de p53, logo impedindo que a

dimerização ocorresse e que a forma ativa da p53 pudesse se formar. Quando a célula

tem um pH 7,0, a histidina está protonada, o que permite a formação das pontes de

hidrogênio, enquanto que em pH 8,0 a histidina se torna desprotonada, prevenindo a

formação deste tipo de ligação química. Com isso, a oligomerização da p53 não pode

ocorrer, levando à inativação da sua capacidade de se ligar nas regiões regulatórias

dos genes. Assim, especulou-se que a R337H seria uma mutação que predispõe

apenas ao desenvolvimento de câncer em tecidos que apresentariam um aumento do

pH intracelular. Esse aumento ocorre em células apoptóticas e pode estar envolvido

no extenso processo de remodelamento que ocorre na glândula adrenocortical nos

períodos de desenvolvimento pré e pós-natal.

1.9 ACONSELHAMENTO GENÉTICO E RASTREAMENTO

Aconselhamento genético é o processo de comunicação da presença de uma

síndrome genética aos portadores e a seus familiares. Neste momento devem ser

detalhadas informações sobre a origem, a herança e as implicações da doença,

possibilitando ao paciente tomar decisões médicas e pessoais (NUSSMAN et al.

2002).

Pelo menos 10% dos casos de câncer em tratamento hoje têm origem

hereditária. Famílias que apresentam múltiplos casos de câncer, ou a presença de

tumores em idades atípicas devem ser avaliadas. A possibilidade de identificar

familiares de elevado risco para o desenvolvimento de câncer torna possível o

emprego de uma abordagem preventiva e de detecção precoce do câncer. Os

indivíduos considerados de alto risco devem ser encaminhados para o

aconselhamento genético onde receberão todas as informações sobre a doença

diagnosticada, informações sobre a herança e suporte para o rastreamento precoce

(ROCHA et al. 2001).

A SLF é uma síndrome de difícil acompanhamento por apresentar um

espectro tumoral amplo e diversificado (VARLEY et al. 1997a). Até o momento,

existem poucas estratégias de rastreamento reconhecidamente eficazes. O

rastreamento de lesões em mama a partir de idade jovem apresentou-se como única

estratégia efetiva no acompanhamento destes pacientes (National Comprehensive

Cancer Network-NCCN 2005). (Quadro 3). Foi sugerido por THULL e VOGEL

(2004) que mulheres portadoras da mutação no gene TP53 deveriam considerar a

possibilidade da realização da mastectomia profilática bilateral para redução do risco

de desenvolvimento de câncer de mama.

Uma vez iniciado o acompanhamento aos pacientes com diagnóstico da SLF

e LFL, estes devem ser bem informados quanto à dificuldade do rastreamento. Deve

ser ressaltada a importância do acompanhamento clínico freqüente e especializado.

Os pacientes devem ter conhecimento do amplo espectro tumoral da síndrome, assim

como a sua expressão variável, e saber como detectar possíveis sintomas

relacionados a tumores, tais como emagrecimento repentino, hiperemias e pruridos

na região da mama ou sangramentos em mucosa gengival. O rastreamento baseado

nos tumores mais freqüentemente apresentados pelas famílias deve ser

implementado, ou seja, em famílias com alto índice de câncer colorretal, o exame de

colonoscopia deve ser realizado em todos os indivíduos em risco, e lesões suspeitas

devem ser acompanhadas por um proctologista. Pacientes portadores da síndrome

que sobreviveram à primeira neoplasia devem intensificar o rastreamento devido ao

alto risco de desenvolvimento de novas lesões primárias. (HISADA 1998)

Quadro 3 - Protocolo de rastreamento na SLF e LFL - NCCN.

Rastreamento Anual Semestral Mensal

Adultos em

risco

• Exame clínico - foco na detecção de

tumores raros e novos tumores primários

•Mamografia anual a partir de 20-25 anos

(M)

• Acompanhamento direcionado aos

tumores ocorridos nas famílias

• Exame clínico das

mamas a partir dos 20-

25 anos ou 5 a 10 anos

antes do tumor de mama

em parente mais jovem

(M)

•Auto-

exame da

mama a

partir dos

18 anos (M)

Crianças em

risco

•Exame clínico com foco na detecção de

tumores raros

•Hemograma completo

Outras

possibilidades

de manejo

• Esclarecer familias sobre limitações no

rastreamento de tumores relacionados à

síndrome

• Informar sobre mastectomia profilática

bilateral (individualizar a cada família)

• Informar pediatras sobre risco de

tumores infantis

•Educação ao paciente e aos médicos

sobre possíveis sinais e sintomas de

câncer

Legenda: (M)- exame realizado em mulheres

O acompanhamento de crianças que são possíveis portadoras é controverso

devido ao fato de não existir nenhum exame específico que venha reduzir a

incidência ou mesmo levar ao diagnóstico precoce dos tumores relacionados à SLF e

LFL na infância. Os pediatras que acompanham crianças que são possíveis

portadores da síndrome devem ser informados sobre o diagnóstico e risco, e o

acompanhamento clínico deve ser freqüente (National Comprehensive Cancer

Network-NCCN 2005).

Os pacientes devem ser esclarecidos sobre a possibilidade de realização do

diagnóstico molecular da SLF e LFL. O teste genético deve ser oferecido como

confirmação do diagnóstico clínico, porém o paciente deve estar bem informado que

o resultado obtido no teste não irá mudar a conduta nem o diagnóstico clínico da

síndrome. Caso haja a detecção da mutação, esta poderá ser rastreada em seus

familiares possibilitando a identificação de indivíduos assintomáticos. No entanto,

caso a mutação não seja detectada pelos métodos utilizados, o paciente deve estar

ciente de que outros fatores não identificados podem ocasionar a síndrome e que,

mesmo sem o diagnóstico molecular, a família deverá continuar o rastreamento

clínico (HEMMINKI e ENG 2004).

Caso o paciente opte pela realização do teste genético, este deve ser realizado

mediante aconselhamento genético continuado. O aconselhamento genético pré-teste

fornecerá informações sobre a doença, esclarecendo os riscos e o benefício do teste.

Este deverá ser individualizado e não direcionado, de modo que o geneticista não

interferirá nas decisões do paciente. O paciente deve estar ciente que o teste genético

e a identidade do indivíduo são confidenciais, impedindo assim quaisquer

dificuldades relacionadas à discriminação e proporcionando uma relação de

confiança entre o paciente e o médico geneticista. O consentimento informado

contendo informações detalhadas sobre a síndrome e o teste a ser realizado deve ser

assinado pelo indivíduo candidato ao teste ou pelo seu responsável legal. Após a

realização do teste, o aconselhamento pós-teste fornecerá ao paciente as informações

sobre o risco, as opções terapêuticas e preventivas e o acompanhamento clínico

multidisciplinar adequado. O resultado é divulgado ao paciente que é orientado

quanto à importância de convocar seus familiares em risco para o aconselhamento

genético (ROCHA et al. 2001).

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

O objetivo geral deste trabalho é avaliar o papel de mutações no gene TP53

na etiologia da Síndrome de Li-Fraumeni e, de sua variante Li-Fraumeni Like em

pacientes da população brasileira.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1- Caracterizar as mutações germinativas no gene TP53 em famílias brasileiras

com diagnóstico clínico das Síndromes de Li-Fraumeni e Li-Fraumeni Like;

2- Correlacionar a presença e a localização da mutação germinativa no gene

TP53 com o fenótipo apresentado pelo paciente e os familiares portadores das

Síndromes de Li-Fraumeni e Li-Fraumeni Like;

3- Correlacionar os genótipos e fenótipos encontrados com os dados de outras

famílias depositados no banco de dados de mutações em TP53 do IARC.

3 PACIENTES E MÉTODOS

3.1 SELEÇÃO DOS PACIENTES

Inicialmente, foram revisados 1.485 prontuários de pacientes atendidos no

Departamento de Oncogenética do Hospital do Câncer – A.C. Camargo, São Paulo,

no período de dezembro de 1999 a agosto de 2004. Os pacientes foram

encaminhados a este serviço por apresentarem agrupamento familial de tumores e

síndromes genéticas ligadas ao câncer. Dentre as famílias avaliadas, 32 foram

selecionadas de acordo com os critérios clássicos (LI et al. 1988), recebendo o

diagnóstico clínico de SLF e com os critérios variantes, de BIRCH et al. (1994) e de

EELES (1995), recebendo o diagnóstico clínico de LFL. Pacientes que fossem

portadores de tumores que por si próprios preenchessem um dos critérios da

síndrome também foram incluídos. Dez pacientes provenientes do Serviço de

Genética Médica - Hospital de Clínicas, Porto Alegre, e que preenchiam os critérios

da SLF e LFL foram adicionados a este grupo. Três famílias provenientes da Divisão

de Genética Médica –

INCA, Rio de Janeiro diagnosticadas como portadoras de SLF

ou LFL também foram incluidas, totalizando 45 famílias.

Os prontuários das famílias com diagnóstico clínico de SLF e LFL foram

revisados visando à obtenção das informações sobre os tumores familiares. A partir

de entrevista com cada paciente foi possível detalhar asr informações obtidas. Foram

solicitados aos pacientes comprovantes dos tumores ocorridos em seus familiares de

primeiro, segundo e terceiro graus. Foram aceitos como comprovantes relatórios de

anatomia-patológica ou relatório médico. Dados relacionados à idade de

acometimento do tumor, ao tipo de tumor e ao gênero do familiar foram incluídos

na ficha clínica do paciente sempre que estivessem disponíveis (Anexo 4). As outras

instituições que também incluíram pacientes neste estudo (Serviço de Genética

Médica - Hospital de Clínicas, Porto Alegre e Divisão de Genética Médica –

INCA,

Rio de Janeiro) forneceram as informações clínicas sobre os pacientes assim como

sobre suas famílias. Os heredogramas foram confeccionados na ficha clínica de cada

paciente na fase inicial do estudo visando compor um painel clínico dos tumores

apresentados pelas famílias. Após a atualização dos dados referentes aos tumores

apresentados nas famílias, novos heredogramas foram elaborados a partir do

programa Cyrillic 2 for pedigree drawing (Cherwell Scientific).

As famílias receberam aconselhamento pré-teste, no qual foram elucidados os

aspectos clínicos da doença e os potenciais benefícios do teste genético, assim como

suas limitações. O teste preditivo não foi oferecido para menores de 18 anos. Todos

os pacientes assinaram o termo de consentimento pós-informado antes de ser

realizada a coleta de sangue para a realização do teste genético (Anexo 5). O

acompanhamento clínico para rastreamento de tumores foi oferecido a todos os

familiares e o teste genético foi oferecido apenas aos familiares que tinham a

mutação no paciente índice da família detectada.

Amostras de DNA genômico de 53 voluntários saudáveis provenientes do

Serviço de Genética Médica, Hospital de Clínicas - Porto Alegre foram analisadas

buscando avaliar a presença das alterações encontradas na população deste estudo e

pouco descritas na literatura existente.

Este estudo, assim como o consentimento informado a ele relacionado, foi

aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação Antonio Prudente na

reunião realizada no dia 30.09.2003, sob o número 531/03 (Anexo 6).

3.2 EXTRAÇÃO DE DNA

Amostras de 20mL de sangue periférico dos pacientes foram coletadas de

maneira convencional em tubos contendo EDTA e estocadas a 4°C. A separação dos

linfócitos ocorreu em um período inferior a cinco dias após a data da coleta e foi

realizada conforme o método descrito por ENGLISH e ANDERSEN (1974). O

precipitado linfocitário (pellet) foi obtido a partir das amostras de sangue através de

centrifugação a 1.500rpm por 15 minutos, sendo o plasma sobrenadante transferido

para tubos de 1,5mL e estocado a –70

C. O sangue restante foi homogeneizado e

transferido para tubos Falcon de 50mL, aos quais foram adicionados 15mL

(aproximadamente o mesmo volume do sangue homogeneizado) de solução PBS 1X

pH 7,4 (123mM de NaCl; 2,7mM de KCl; 4,3mM de Na

HPO4; 1,4mM de

HPO4). Em seguida, foram adicionados 15mL de solução de Ficoll-Hypaque

(Amersham Biosciences). Após centrifugação a 1.200rpm por 30 minutos a 24

C, o

halo linfocitário foi aspirado com o auxílio de uma pipeta Pasteur e transferido para

um tubo Falcon de 15mL. Foi realizada lavagem com 10mL de PBS 1X seguida de

centrifugação por 15 minutos a 2.000rpm e descarte do sobrenadante. O pellet de

linfócitos foi ressuspendido em 1,5mL ml de PBS 1X e transferido para tubo 1,5mL.

Repetiu-se então o processo de lavagem das células com PBS 1X. Após

centrifugação por 4 minutos a 13.000rpm e aspiração do sobrenadante, os pellets de

linfócitos foram estocados a–70

A extração de DNA foi feita com a utilização do Wizard Genomic DNA

Purification Kit (Promega) de acordo com as instruções do fabricante e o DNA assim

obtido foi quantificado em espectrofotômetro GeneQuant Pro (Amershan-Pharmacia

Biotech) e estocado a-20

C. No caso das amostras provenientes de outros estados do

Brasil, o DNA foi extraído no centro de origem e enviado através de empresas

privadas de transporte. As amostras levaram um período máximo de sete dias entre o

envio e o seu recebimento e quando recebidas foram estocadas a–20

3.3 IDENTIFICAÇÃO DAS MUTAÇÕES NO GENE TP53

As etapas de identificação das mutações e comparação com o banco de dados

de mutações em TP53 foram realizadas pela pesquisadora na Unidade de

Carcinogênese Molecular, Agência Internacional para a Pesquisa do Câncer -

International Agency for Research on Cancer (IARC - WHO), Lyon, França, sob a

orientação do Dr. Pierre Hainaut, diretor do laboratório.

As amostras de DNA foram amplificadas por PCR e os éxons codificantes 2 a

11 do gene TP53 foram analisados. Os éxons foram amplificados a partir da

utilização de primers intrônicos específicos (Quadro 4), a partir de 100ng de DNA

genômico, na presença da enzima Taq Platinum DNA polymerase (Invitrogen). As

condições da reação de PCR foram: 1,5mM de MgCl

, 0,2mM de dNTPs; 1,2μM de

cada primer; 1,25U de Taq Platinum DNA polymerase (Invitrogen); 2,5μL de tampão

de reação para Taq Platinum 10X (concentração final 1X) e água em quantidade

suficiente para 25μL.

Para todos os éxons a reação de amplificação foi realizada utilizando-se a

estratégia touchdown, iniciada a partir de uma etapa de desnaturação inicial de 94

por 2 minutos, seguida por 21 ciclos de desnaturação a 94

C durante 45 segundos,

anelamento a 63

C por 45 segundos e extensão a 72

C por 1 minuto. Nesta etapa, a

temperatura de anelamento foi reduzida de 0,5

C a cada 3 ciclos. Após esses 21

ciclos, seguiram-se 30 ciclos adicionais de desnaturação a 94

C durante 45 segundos,

anelamento a 60

C por 45 segundos e uma etapa final de extensão a 72

C por 10

minutos.

Quadro 4 - Seqüência de primers utilizados nas reações de PCR para DHPLC e

seqüenciamento.

Primer direto Primer reverso Fragmento (pb)

Éxons 2-3

p558: 5’-ccaggtgacccagggttgga-3’ p228:5’-agcatcaaatcatccattgc-3’

428

Éxon 4

p326:5’-tgaggacctggtcctctgac-3’ p327:5’-agaggaatcccaaagttcca-3’

412

Éxon 5-6

P236:5’-tgttcacttgtgccctgact-3’ p256:5’-cggagggccactgacaacca-3’

488

Éxon 7

p333:5’-cttgccacaggtctccccaa-3’ p313:5’-aggggtcagcggcaagcaga-3’

237

Éxon 8-9

p314:5’-ttgggagtagatggagcct-3’ p315:5’-acttgataagaggtcccaag-3’

372

Éxon 10

p10li:5’-caattgtaacttgaaccatc-3’ p563:5’-ctttccaacctaggaaggca-3’

191

Éxon 11

p564:5’-atctctcctccctgcttctg-3’ pE11Ri:5’-aggctgtcagtggggaacaa-3’

145

Para o rastreamento de alterações na seqüência de DNA, os produtos de PCR

contendo as regiões codificantes compreendidas entre os éxons 4 e 9 foram

analisadas por cromatografia líquida de desnaturação de alta performance

(Denaturing High Performance Liquid Chromatography - DHPLC) como descrito

por ATEENYI-AGABA et al. (2004). Em cada análise de DHPLC foi usado como

controle o DNA de linhagens celulares tumorais (controles positivos da presença de

alterações) (Quadro 5) e o DNA de linfócitos de indivíduos sem câncer (controles

negativos).

Os fragmentos que apresentaram suspeita de alteração na análise por DHPLC

foram reamplificados e submetidos à nova reação de PCR e analisados por

seqüenciamento automático em ambas as direções, direta e reversa. A reação de

amplificação para o seqüenciamento foi realizada utilizando-se 5pmol de primer

direto ou reverso para cada éxon e o kit BigDye 1.1 (Applied Biosystems) conforme

especificações do fabricante. O kit utilizado baseia-se no uso da metodologia do

seqüenciamento com dideoxinucleotídeos marcados com fluorescência, acoplado a

PCR com apenas um primer. O produto desta reação foi analisado no aparelho de

seqüenciamento automático ABI Prism 3100 (Applied Biosystems).

Quadro 5 - Descrição de linhagens celulares com diferentes mutações no gene TP53

usadas como controles positivos no DHPLC.

Linhagem

celular

Origem Éxon mutado Códon Nucleotídeo

Troca de

aminoácido

Hs578T Câncer de mama 5 157 GTC-TTC Val→Phe

T47D Câncer de mama 6 194 CTT-TTT Leu→Phe

TE11 Câncer de esôfago 7 237 ATG-ATT Met→Ile

TE6 Câncer de esôfago 7 248 CGG-CAG Arg→Gln

TE1 Câncer de esôfago 8 272 GTG-ATG Val→Met

MDA-MB-231 Câncer de mama 8 280 AGA-AAA Arg→Lys

A reação de sequenciamento iniciou-se com etapa de desnaturação inicial a

C por 1 minuto, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 95

C por 18 segundos,

anelamento a uma temperatura de 58

C por 12 segundos e extensão a 60

C por 4

minutos. É realizada então a precipitação na qual se adiciona 40 μL de isopropanol

65% às amostras, sendo a mistura mantida por 15 minutos a temperatura ambiente,

sem o contato com a luz. Em seguida as amostras foram centrifugadas por 20

minutos a 13.000rpm e o sobrenadante foi descartado. Adicionou-se 190μL de etanol

70% as amostras, que foram novamente misturadas e centrifugadas por 20 minutos a

13.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e as amostras foram secas em estufa a

Os éxons 2, 3, 10 e 11 foram analisados por seqüenciamento direto, por não

estarem disponíveis controles positivos (com alterações nestas regiões) para a

comparação na análise por DHPLC. Todas as mutações encontradas foram

confirmadas por uma nova reação de seqüenciamento.

Todos os pacientes foram convocados para divulgação do resultado do teste

genético, mediante o aconselhamento genético pós-teste. Os pacientes nos quais foi

encontrada a mutação no gene TP53 foram estimulados a contactar seus familiares

considerados em risco para que estes pudessem ser também submetidos ao

rastreamento para a detecção da mutação. Todos os familiares que se mostraram

interessados foram submetidos ao teste genético, após a realização do

aconselhamento genético e a assinatura do consentimento informado. O teste

genético para detecção de mutações nos familiares foi realizado no Laboratório de

Genética do Câncer do Instituto Ludwig, São Paulo, sob orientação do Dr. André

Luiz Vettore.

3.4 ANÁLISE DE ALTERAÇÕES DETECTADAS POR PCR-RFLP

A técnica de PCR-RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment

length polymorphism reação), ou reação com cadeia da polimerase associado à

análise do polimorfismo de tamanho dos fragmentos de DNA obtidos por enzimas de

restrição, foi empregada na avaliação da freqüência da alteração R337H no éxon 10

do gene TP53 em 53 voluntários saudáveis. Um fragmento de 238 pb contendo o

códon 337 foi amplificado a partir de DNA genômico com primers específicos para a

região (Quadro 4 – éxon 10) e digerido com a enzima de restrição HhaI. (

Amersham

Biosciences

). A 5μL do DNA amplificado, foi adicionado 1μL da enzima HhaI

(20.000U/mL) (New England Biolabs), 2μL de tampão de reação 10X, 2µl BSA 10X

e água para o volume final de reação de 20μL. A reação foi incubada a 37

C por 4

horas. O produto da digestão foi aplicado em gel de agarose 3% contendo 20μL de

brometo de etídio (1mg/mL), submetido a eletroforese (120 volts, por 30minutos

aproximadamente) e visualizado sob luz UV.

4 RESULTADOS

4.1 CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA DAS FAMÍLIAS SLF E LFL

AVALIADAS

Foram incluídas neste estudo 45 famílias brasileiras sem parentesco e

residentes há pelo menos três gerações no país. Todas as famílias preenchiam

critérios clínicos para a definição da SLF ou pelo menos um dos outros critérios

correspondentes à LFL descritas por BIRCH et al. (1994) e por EELES (1995).

Dentre as 45 famílias avaliadas, 11 (24,4%) apresentavam os critérios diagnósticos

clássicos da SLF e 34 (75,6%) apresentaram critérios diagnósticos da LFL. Das 34

famílias LFL, 14 preenchiam os critérios de LFL-Birch e 20 preenchiam somente os

critérios de LFL-Eeles, dentre as quais apenas um indivíduo isolado com múltiplos

tumores preenchendo critérios (Tabela 1).

A maioria dos indivíduos portadores de tumores incluídos neste estudo era do

sexo feminino, sendo que 66,7% dos probandos (n=30) e 56,7% dos familiares

(n=140) eram mulheres. Todos os probandos referiram ser filhos de pais brancos ou

pardos e quando questionados sobre a qual raça pertenciam, optaram pela branca. A

maior parte das famílias avaliadas era proveniente das regiões sudeste (n=31, 68,9%)

e sul (n=11, 24,4%) do país. Dentre as famílias avaliadas, duas (Y14 e Y15)

relataram consangüinidade (4,5%), sendo que nas duas famílias os pais eram primos

irmãos.

Tabela 1 - Perfil clínico das famílias brasileiras com diagnóstico clínico de SLF e

LFL.

Probandos Familiares

Pacientes (n=292) 45 (100%) 247 (100%)

Diagnóstico

SLF 11 (24,4%) 52 (21,1%)

LFL 34 (75,6%) 195 (78,9%)

Gênero

Mulheres 30 (66,7%) 140 (56,7%)

Homens 15 (33,3%) 107 (43,3%)

Raça

Branca 45 (100%) N/D

Outras 0 N/D

Consangüinidade 2 (4,5%) N/D

Gerações acometidas

4 9 (20%) N/A

3 19 (42,2%) N/A

2 15 (33,3%) N/A

1 2 (4,5%) N/A

Origem geográfica

Sudeste 31 (68,9%) N/A

Sul 11 (24,4%) N/A

Nordeste 1 (2,2%) N/A

Tumores (n=338) 89 (100%) 249 (100%)

Mulheres 49 (55,1%) 142 (57,0%)

Homens 40 (44,9%) 107 (43,0%)

Legenda: N/D: não disponível; N/A: não aplicável.

O total de 338 tumores foi referido em 292 indivíduos pertencentes às

famílias estudadas. Dentre estes tumores, 46,1% foram confirmados a partir de

laudos histopatológicos, relatórios médicos ou atestados de óbito. Os tumores

ocorreram predominantemente em mulheres, sendo um total de 191 tumores

malignos no sexo feminino (56,5%) (Tabela 1). Dentre as famílias avaliadas, nove

relataram tumores acometendo quatro gerações, 19 relatavam o acometimento de três

gerações, 15 relatavam o acometimento de duas gerações e duas famílias tiveram

apenas uma geração acometida. O número de familiares acometidos por neoplasias

malignas variou de um a 18 membros por família. Uma das famílias avaliadas tinha

apenas um membro afetado, sendo que este paciente havia desenvolvido múltiplos

tumores do espectro da síndrome e por si próprio preenchia os critérios LFL-E1.

Dentre os 338 tumores relatados, 99,7% eram tumores malignos (n=337).

Apenas um tumor benigno foi incluído, sendo este um caso de mola hidatiforme que

apresentava um laudo histopatológico com áreas suspeitas de malignização, ocorrido

em um dos probandos (Y1). O total de 338 tumores presentes nas 45 familias foi

subdividido em 24 grupos, de acordo com o tipo e/ou sistema acometido para melhor

compreensão do espectro tumoral apresentado, seguindo o agrupamento utilizado

pelo banco de dados do IARC (IARC TP53 Database R10). Os tumores referidos

pelos familiares como originários de sítio inespecífico, por não terem indicações

precisas da origem ou por terem sido denominados como tumores generalizados,

foram classificados em um grupo suplementar de origem indeterminada (Tabela 2).

O tumor mais freqüente nas famílias incluídas neste estudo foi o tumor de

mama (21,3%), acometendo principalmente mulheres em idade jovem, antes dos 45

anos (idade pré-menopausal) (n=44, 61,1 %). Apenas um caso de câncer de mama foi

relatado em um paciente do sexo masculino aos 75 anos (Y20). Verificou-se alta

incidência de sarcomas de partes moles (n=37, 10,9%), segundo tumor mais

freqüente nas famílias estudadas, ocorridos predominantemente antes dos 45 anos

(n=28, 75,6%). O terceiro grupo de tumores mais freqüentes foi o de tumores de

estômago (n=30, 8,9%), acometendo principalmente adultos acima dos 46 anos. A

maior parte dos tumores de sistema nervoso central, quarto tumor mais freqüente,

ocorreram na infância, antes dos 15 anos de idade (n=9, 36,4%), sendo verificado um

segundo pico de incidência no adulto, entre os 31 e 45 anos (n=6, 23,1%). Foram

verificados oito casos de tumores de adrenocortical nas famílias brasileiras, sendo

que cinco destes tumores foram diagnosticados predominantemente em idade jovem,

antes dos 15 anos de idade (n=5, 62,5%).

Tabela 2 - Perfil tumoral de pacientes com diagnóstico clínico da SLF e LFL.

Tumores n 0-15 anos 16-30 anos 31-45 anos Acima de 46

anos

Idade

indeterminada

Total 338 (100%) 31 (9,1%) 49 (14,5%) 81 (23,9%) 125(37,0%) 52 (15,4%)

Mama 72 (21,3%) 0 13 (18,0%) 31 (43,1%) 24 (33,3%) 4 (5,5%)

Sarcoma de partes moles 37 (10,9%) 8 (21,6%) 8 (21,6%) 12 (32,4%) 8 (21,6%) 1 (2,7%)

Estômago 30 (8,9%) 0 2 (6,7%) 4 (13,4%) 18 (60%) 6 (11,5%)

Sistema nervoso central 26 (7,7%) 9 (34,6%) 4 (13,3%) 6 (23,1%) 3 (11,6%) 4 (7,7%)

Colorretal 21 (6,2%) 0 5 (23,8%) 5 (23,8%) 8 (25,8%) 3 (5,8%)

Leucemia/ Linfoma 21 (6,2%) 4 (19,0%) 5 (23,8%) 3 (14,3) 5 (23,8%) 4 (7,7%)

Pulmão 15 (4,4%) 0 2 (13,3%) 2 (13,3%) 9 (60,0%) 2 (3,8%)

Próstata 12 (3,5%) 0 0 1 (8,3%) 8 (6,7%) 3 (5,8%)

Trato genital feminino 11 (3,2%) 0 0 3 (27,3%) 6 (54,5%) 2 (3,8%)

Pele não melanoma 10 (2,9%) 0 0 4 (40,0%) 4 (40,0%) 2 (3,8%)

Esôfago 9 (2,7%) 0 0 0 6 (66,7%) 3 (5,8%)

Sarcoma ósseo 9 (2,7%) 0 4 (44,4%) 2 (22,2%) 1 (11,1%) 2 (3,8%)

Cabeça e pescoço 9 (2,7%) 0 1(11,1%) 1(11,1%) 5 (55,5%) 2 (3,8%)

Adrenocortical 8 (2,4%) 5 (62,5%) 2 (25,0%) 1 (12,5%) 0 0

Melanoma 7 (2,1%) 1 (14,3%) 0 2 (28,6%) 4 (57,1%) 0

Fígado 7 (2,1%) 0 1(14,3%) 1(14,3%) 3 (42,9%) 2 (3,8%)

Pâncreas 6 (1,8%) 0 0 2 (33,3%) 3 (50,0%) 1 (1,9%)

Tireóide 6 (1,8%) 0 1 (16,7%) 0 5 (83,3%) 0

Renal 4 (1,2%) 2 (50,0%) 0 0 2 (50,0%) 0

Bexiga 3 (0,9%) 0 0 0 2 (66,6%) 11 (1,9%)

Papila duodenal 2 (0,6%) 0 0 1 (50,0%) 1 (50,0%) 0

Wilms´ 1(0,3%) 1 (100%) 0 0 0 0

Ósseo 1 (0,3%) 1 (100%) 0 0 0 0

Mola Hidatiforme 1 (0,3%) 0 1 (100%) 0 0 0

Indeterminado 10 (2,9%) N/A N/A N/A N/A 10 (19,2%)

Legenda: N/A: não aplicável.

A ocorrência de múltiplos tumores primários também foi verificada em

algumas famílias. A incidência de dois tumores primários em um único paciente foi

verificada em 15 indivíduos (6,1%). Três tumores primários ocorreram em cinco

indivíduos (2,0%) com a SLF ou LFL, quatro indivíduos apresentaram quatro

tumores primários (1,6%), um indivíduo apresentou cinco tumores primários (0,4%)

e foi verificada ainda a ocorrência de um indivíduo que apresentou oito tumores

primários (0,4%). A associação entre tumores mais freqüentes foi a de tumores de

mama e sarcomas de partes moles, ocorrida em quatro indivíduos do sexo feminino,

pertencentes a famílias distintas.

Todos os probandos foram submetidos a um exame físico buscando avaliar a

existência de possíveis alterações dismorfológicas. Dismorfias foram detectadas

apenas na probanda Y15, filha de um casal consangüíneo (primos irmãos). A

paciente apresentou sinais de maturação sexual precoce, sendo verificada pilificação

pubiana e axilar aos 20 meses. Aos seis anos, um tumor adrenocortical esquerdo foi

diagnosticado e tratado. Aos sete anos foi diagnosticado um carcinoma de córtex

renal esquerdo e tratado. Aos oito anos a paciente apresentou a menarca. Ao exame

físico realizado após a avaliação clínica deste estudo, quando a probanda apresentava

21 anos, foram detectadas algumas importantes dismorfias. Além das alterações

esperadas relacionadas ao quadro endocrinológico que envolve o tumor

adrenocortical, tais como baixa estatura, fascies Cushingóide e hirsutismo, outras

dismorfias que puderam ser verificadas foram: macrocefalia, ponte nasal deprimida e

braquidactilia com a presença de hipoplasia de quarto e quinto metacarpos (mão

esquerda) e de quinto metacarpo (mão direita). Nenhum outro membro da família foi

avaliado para a presença de dismorfias.

Todos os pacientes e suas famílias foram questionados quanto à exposição

ambiental a pesticidas, venenos ou radiação. Cinco famílias (Y1, Y6, Y12, Y15 e

Y31) referiram exposição prévia a pesticidas, sem proteção física, em um período

que variou de oito a 30 anos. Os probandos não souberam referir a dose empregada a

cada aplicação e nem quantas vezes se submeteram à exposição direta, porém todos

referiram ao menos uma vez a cada ano. Apenas dois probandos (Y12 e Y31)

souberam definir qual pesticidas utilizados, referindo o uso em quantidade grande,

porém indeterminada, de Aldrin®, um composto organo-clorado e de fosfanil-

metabisulfito, um composto organo-fosforado.

Uma das famílias (Y38) referiu exposição intensa a Diazinon (Neocid®),

sendo o produto aplicado semanalmente no colchão e roupa de cama de cada

indivíduo, durante aproximadamente os 12 anos iniciais de vida de três irmãos que

apresentaram tumores típicos da síndrome em idade jovem. A família Y27 refere ter

vivido a menos de 300 metros de uma usina de energia nuclear por 20 anos.

Os probandos foram questionados quanto a tabagismo, atual ou pregresso.

Dentre os 45 pacientes, 22 (48,9%) referiram exposição prévia a tabaco, em um

período que variou de seis meses a 35 anos, com um consumo diário de cinco a 40

cigarros ao dia, porém apenas quatro (8,9%) mantinham o hábito tabagista na última

avaliação realizada.

4.2 DETECÇÃO DE MUTAÇÕES GERMINATIVAS EM FAMÍLIAS

BRASILEIRAS COM O DIAGNÓSTICO CLÍNICO DA SLF E LFL

Mutações germinativas no gene TP53 foram encontradas em

13 (28,9%) das

45 famílias avaliadas (Tabela 3). Todas estas mutações eram transições de G para A,

sendo que 12 (91,7%) eram do tipo missense e em uma família foi verificada a

presença de uma alteração no sítio doador de splicing do íntron 6. Dentre as 12

mutações missense encontradas em famílias SLF e LFL, seis ocorreram no segundo

par de bases do códon 337, especificando uma substituição de uma arginina por uma

histidina (R337H), na região de oligomerização da proteína p53. A ocorrência de

uma mutação específica, R337H, foi detectada em taxas elevadas nas famílias

brasileiras com LFL, representando 46% (6/13) de todas as mutações detectadas e

5,1% de todas as mutações já descritas em famílias LFL.

Tabela 3 - Perfil de mutações das famílias brasileiras com mutações no gene TP53.

SLF/LFL Brasil SLF/LFL - IARC

N SLF LFL SLF LFL

Famílias

45 148 118

Diagnóstico clínico 45 (100%) 11 (24,4%) 34 (75,6%) N/D N/D

Gene TP53 mutado 13 (28,9%) 1/11 (9,1%) 12/34 (35,3%) 148 118

Mutações

13 268*

Missense 12 (92,3%) 1 (8,3%) 11(91,7%) 111 (41,4%) 94 (35,1%)

Sitio de splicing 1(7,8%) 0 1 (100%) 5 (1,9%) 0

Outras 0 0 0 FS:16; S:8;

O:7; S:1

FS:9; NS:13;

O:2; S:2

Mutações (Bases trocadas)

V173M (

GTG > ATG) 1 (7,7%) 0 1 0 0

V197M (

GTG >ATG) 1(7,7%) 1 0 0 1

R213Q (C

GA > CAA) 1(7,7%) 0 1 4 4

G244D (G

GC > GAC) 1(7,7%) 0 1 0 0

G245S (

GGC >AGC) 2 (15,4%) 0 2 7 4

R337H(C

GC > CAC) 6 (46,1%) 0 6 0 1

Íntron 6 (sítio de splicing) 1(7,7%) 0 1 0 0

Legenda: N/D: dado não disponível, NS: Nonsense (sem sentido), FS: Frameshift (alteração na janela

de leitura), S:Silenciosa, O: Outras. * Dados disponíveis para famílias com diagnóstico de SLF e LFL

incluídas no banco de dados, excluindo mutações germinativas detectadas em tumores esporádicos

(n= 15).

A mutação no códon 245 (G245S), que leva a substituição de uma glicina por

uma serina, foi detectada em duas famílias distintas e não relacionadas. Esta é uma

mutação somática e germinativa comum, sendo que sete famílias já foram descritas

como portadoras desta mutação germinativa (IARC TP53 Database R10). Quatro

outras famílias avaliadas apresentaram mutações distintas: no códon 173 (V173M),

causando a substituição de uma valina por uma metionina, nunca descrita; no códon

197 (V197M), causando a substituição de uma valina por uma metionina, também

nunca descrita; no códon 213 (R213Q), causando a substituição de uma arginina por

uma glutamina, descrita em uma família com a SLF proveniente do Reino Unido e

rara em tumores esporádicos e no códon 244 (G244D), causando a substituição de

uma glicina por uma molécula de ácido aspártico, não descrita anteriormente. Estas

quatro mutações ocorreram no domínio de ligação ao DNA.

As mutações missense são as mais freqüentes tanto no banco de dados do

IARC (76,5%) como neste estudo (92,3%), porém sete das 13 mutações (53,8%)

estão localizadas no domínio de ligação ao DNA, região onde 95% das mutações

descritas pelo banco de dados estão localizadas. As mutações em sítio de splicing

representaram 7,8% das mutações detectadas neste estudo, enquanto que foram

detectadas em 1,9% das famílias com SLF e LFL do banco de dados do IARC.

Nota-se a ocorrência neste estudo das mutações V173M, V197M e G244D

que até o presente não foram descritas no banco de dados do IARC. Amostras de

DNA genômico de 53 voluntários saudáveis provenientes do Serviço de Genética

Médica, Hospital de Clínicas - Porto Alegre foram submetidas ao rastreamento por

DHPLC para se avaliar a freqüência das alterações V173M, V197M e G244D na

população brasileira. Este grupo controle foi escolhido por esta amostra ser

considerada semelhante à composta pelas famílias incluídas neste estudo, que eram

provenientes principalmente das regiões sul e sudeste, e por estar diponível para ser

implicado em pesquisas científicas. Nenhum caso dentre os controles apresentou o

perfil sugestivo das alterações V173M, V197M e G244D. Frente ao fato de ensaios

de transativação em levedura demonstrarem que estas alteraçõs proporcionam a

perda de função da p53 (KATO et al. 2003), as alterações G244D, V173M e V197M

foram consideradas mutações novas.

A detecção das mutações no gene TP53 ocorreu predominantemente em

famílias com o diagnóstico clínico de LFL. Foi detectada a presença de mutações no

gene TP53 em 12 das 34 famílias (35,3%) com critérios clínicos para LFL. As

famílias LFL que preenchiam os critérios de Birch (LFL-B) apresentaram a maior

taxa de detecção de mutações (41,8%) dentre a amostra avaliada. Aquelas que

preenchiam apenas os critérios de Eeles apresentaram uma taxa de detecção de

mutação de 31,8%. Das onze famílias que apresentavam os critérios clínicos para a

SLF clássica, apenas uma (9%) teve a presença de mutação no gene TP53 detectada.

No banco de dados do IARC verifica-se uma maioria de famílias com diagnóstico

clínico de SLF com a detecção de mutação (n=148) se comparado às famílias

incluídas com LFL e detecção da mutação (n=118).

4.3 PERFIL TUMORAL EM FAMÍLIAS BRASILEIRAS COM

MUTAÇÕES GERMINATIVAS E DIAGNÓSTICO CLÍNICO DA SLF

E LFL

O espectro tumoral apresentado pelas famílias deste estudo com detecção da

mutação foi bastante amplo, incluindo a maior parte dos tumores relacionados às

SLF e LFL (Tabela 4). Foram relatados 119 tumores ocorridos nas 13 famílias que

tiveram a mutação no gene TP53 detectada, sendo possível a obtenção de

confirmações histopatológicas ou relatórios médicos de 64 tumores (53,8%).

O tumor que ocorreu em um maior número de famílias com a detecção da

mutação foi o tumor de mama, acometendo mulheres em 12 das 13 famílias afetadas,

não sendo detectado na família Y15 (Tabela 4). Em uma das famílias com mutação

detectada (Y12), verificaram-se dois casos de tumores de tireóide. Dois outros

probandos (Y1 e Y58) apresentaram carcinoma de papila duodenal, tumor nunca

antes descrito como parte do espectro da síndrome.

Os casos de carcinoma de papila duodenal ocorreram em duas famílias não

relacionadas entre si com o diagnóstico clínico de LFL. Na família (Y1) a probanda

também apresentou mola hidatiforme invasiva e dentre os familiares ocorreu um caso

de tumor de adrenocortical aos 11 anos, um caso de tumor de sistema nervoso central

aos 31 anos, um caso de câncer de mama aos 62 anos, dois casos de tumores

colorretais aos 38 e 39 anos, cinco casos de tumores de pulmão, todos acima dos 45

anos de idade e um caso de tumor de estômago aos 22 anos (Tabela 4). Na família

Y58 foram também descritos três casos de tumor de sistema nervoso central, sendo

dois antes dos 18 anos de idade; cinco casos de tumor de mama, três deles em idade

pré-menopausal (antes dos 45 anos de idade); além de um caso de tumor colorretal

aos 22 anos, um caso de tumor de próstata, um caso de tumor de esôfago e um caso

de sarcoma ósseo (Tabela 4).

Tabela 4 - Espectro tumoral de 13 famílias brasileiras com mutações no gene TP53.

Família Éxon Codon Tumores em probando

(Gênero-Idade de

acometimento, anos)

Tumores em familiares

(Genero-Idade de acometimento, anos)

a b

Classificação

Clinica

Y33 5 173 SPM (F-23*), Mama

(F-43*)

ADR (M-29), SNC (M-9), Mama (F-60), Fígado

(M-53), Estômago (F-N/D), Leucemia (M-N/D)

SLF

Y58 Íntron

Sítio

doador

Papila duodenal (F-

60*)

SNC (M-18, M-15, M-N/D

), Mama (F-55, F-35,

F-45, F-33, F-49), Próstata (M-57), Esôfago (M-

50), SO (M-N/D), CCR (F-22)

LFL-B

Y65 6 197 CCR (F-45*) ADR (F-18), Mama (F-54), CCR (F-24), C/P (M-

60)

LFL-B

Y1 6 213 Mola Hidatiforme (F-

23*), Papila duodenal

(F-41*)

ADR (F-11), SNC (M-31), Mama (F-62), CCR

(M-38, M-39), Fígado (M-28), Pulmão (F-60, M-

50, M-45, M-50, F-52), Estômago (M-22)

LFL-B

Y57 7 244 Mama (F-40*), CCR

(F-N/D*)

Ósseo (F-21), Mama (F-30), TGF (F-34), SPM

(F-21), C/P (M-59)

LFL-E1

Y53 7 245 Mama (F-36*) SNC (M-9), Mama (F-33), CCR (M-18), Esôfago

(M-50), Leucemia (M-45), Estômago (M-56), C/P

(M-50)

LFL-E1

Y59 7 245 Mama (F-26*) SPM (F-3, F- 4), Mama (F-27, F-27), SNC (M-

40), Fígado (F-36)

LFL-B

Y12 10 337 SPM (F-57*), Tireóide

(F-58*), Mama (F-

61*), Pulmão (F-62*)

ADR (F-1, F-13, F-36

), Mama (

F-35, F-35, F-

40, F-45, F-52, F-60, F-60

), Melanoma (F-80),

Estômago (M-61, F-62), Tireóide (F-25*)

LFL-B

Y15 10 337 ADR (F-7*), Renal

(F-8*)

ADR (F-3), SNC (M-3, M-5, M-50), Renal (M-

2), SPM (M-2)

LFL-B

Y27 10 337 Mama (F-36*) Mama (F-37, F-64), Estômago (M-59, M-69),

SPM (F-59), N/D (F-N/D)

LFL-B

Y35 10 337 SPM (F-50*), Pele (F-

58*)

SNC (M-39), Mama (F-41), SPM (F-38), TGF (F-

83)

LFL-E2

Y49 10 337 Renal (M-64*) Renal (F-9), Mama (F-44*, F-36), Pulmão (M-

72), Próstata (M-72, M-N/D, M-N/D), Pâncreas

(F-58), TGF (F-62), Estômago (M-60)

LFL-E1

Y60

10 337 SPM (F-44*) Mama (F-24, F-31, F-53), Esôfago (M-59), SNC

(M-2, M-N/D)

LFL-B

Legenda: (a): ADR: carcinoma adrenocortical; C/P:cabeça e pescoço; CCR: câncer

colorretal; SNC: sistema nervoso central; SO: sarcoma ósseo; SPM: sarcoma de partes moles; TGF:

Trato genital feminino; M: masculino; F: feminino. (b): Mais de um tumor pode ocorrer em um

paciente; (c): Critérios diagnósticos Clássico, de Birch e de Eeles da Síndrome de Li-Fraumeni; (d):

N/D: dado não disponível; (negrito): tumores confirmados por laudos histopatológicos ou relatório

médico; (*): tumores em indivíduos testados positivos para a mutação em TP53

O perfil de tumores das famílias brasileiras com mutações no gene TP53

comparado ao perfil de tumores em outras famílias com a mutação no gene TP53

depositadas no IARC é apresentado na figura 2. O tumor mais freqüente entre as

famílias acometidas pela mutação no gene TP53 foi o de mama em idade jovem

(27,7%) (Figura 2). Tanto neste estudo como no banco de dados do IARC, o segundo

tipo de tumor maligno mais freqüente foi o dos tumores de sistema nervoso central

(10,9% e 15,1% respectivamente). O mesmo se verificou quanto ao terceiro tipo de

tumor mais freqüente, constituído por sarcomas de partes moles, representado por

8,4% neste estudo e em 14,6% de acordo com os dados do IARC. Foi verificado um

aumento na presença de tumores adrenocorticais, representados por 6,7% neste

estudo e por 3,9% dos tumores do banco de dados do IARC. O aumento também foi

verificado nos tumores gástricos, presentes em 6,7% dos casos neste estudo e em

3,1% dos tumores do banco de dados. Tumores colorretais, ocorridos em 5,9% dos

casos neste estudo, foram verificados em 2,9% dos casos do IARC. Tumores de

pulmão e tumores do trato genital feminino estavam presentes em menor freqüencia

em ambos os grupos. A baixa freqüência de sarcomas ósseos (0,8%) e de tumores do

grupo das leucemias e linfomas (1,7%) diferiu dos dados do IARC (11,4% e 5,1%

respectivamente).

Todas as famílias avaliadas que apresentaram casos de tumores

adrenocorticais tiveram a mutação detectada. O mesmo ocorreu nas famílias que

apresentaram tumores renais (quatro casos), tumores de papila duodenal (dois casos)

e mola hidatiforme (um caso). Nenhuma das famílias nas quais houve a detecção de

mutação apresentou tumor de bexiga ou tumor de Wilms´, tumores estes presentes no

grupo sem detecção de mutações.

Mutações TP53

(IARC TP53 Database; N=1171)

Mutações TP53

(este estudo; N=119)

27,7%

26.6%

Mama

10,9%

15.1%

SNC

8,4%

14.6%

SPM

0,8%

5.1%

11.4%

Leucemia/

Linfoma

1,7%

5,9%

4.3%

Pulmão

6,7%

3.9%

3.6%

TGF

2,5%

6,7%

3.1%

Estômago

5,9%

2.9%

21,9%

Outros

9.3%

25 20 15 10 5 5 1015202530

Legenda: (a): ADR: carcinoma adrenocortical; CCR: câncer colorretal; SNC: sistema nervoso central;

SO: sarcoma ósseo; SPM: sarcoma de partes moles; TGF: Trato genital feminino.

Figura 2 - Perfil de tumores das famílias brasileiras com mutações no gene TP53

comparado ao perfil de tumores em outras famílias com a mutação no gene TP53

depositadas no banco de dados do IARC.

A idade de acometimento dos diferentes tumores referidos pelas famílias

deste estudo foi predominantemente em idade jovem, com exceção dos tumores de

estômago, tumores colorretais e pulmão (Tabela 5). A idade de acometimento dos

tumores de mama e sarcomas de partes moles em famílias nas quais foi possível a

detecção da mutação foi semelhante àquelas sem a detecção da mutação. O mesmo

foi verificado nos tumores de estômago, tumores de cabeça e pescoço e tumores do

trato genital feminino.

Tabela 5 - Idade de acometimento de tumores em de pacientes com diagnóstico

clínico da SLF e LFL.

Total Idade média (anos)

Tumores 338 (100%) Mutação presente Mutação não detectada

Mama 72 (21,3%)d 43,5 44,9

Sarcoma de partes moles 37 (10,9%)a 30,1 31,8

Estômago 30 (8,9%)e 55,6 51,6

Sistema nervoso central 26 (7,7%)d 19 32

Colorretal 21 (6,2%)c 32,4 51,6

Leucemia/ Linfoma 21 (6,2%)c 45 33,2

Pulmão 15 (4,4%)b 55,9 46,6

Próstata 12 (3,5%)c 64,5 72

Trato genital feminino 11 (3,2%)b 59,7 54,2

Pele não melanoma 10 (2,9%)b 58 48,7

Esôfago 9 (2,7%)c 53 68,3

Sarcoma ósseo 9 (2,7%)b N/A 17,3

Cabeça e pescoço 9 (2,7%)b 54,5 48,8

Adrenocortical 8 (2,4%) 14,7 N/A

Melanoma 7 (2,1%) 80 47

Fígado 7 (2,1%)b 39 60,5

Pâncreas 6 (1,8%)a 58 47,5

Tireóide 6 (1,8%) 41,5 58

Renal 4 (1,2%) 20,7 N/A

Bexiga 3 (0,9%)a N/A 54

Papila duodenal 2 (0,6%) 49,5 N/A

Wilms´ 1(0,3%) N/A 1

Ósseo 1 (0,3%) 21 N/A

Mola Hidatiforme 1 (0,3%) 23 N/A

Legenda: (a) 1 tumor idade indefinida, (b) 2 tumores idade indefinida,(c) 3 tumores idade indefinida;

(d) 4 tumores idade indefinida; (e) 5 tumores idade indefinida; N/A: não aplicável.

Alguns tumores foram mais precoces em indivíduos pertencentes a famílias

com a detecção da mutação. Os tumores de sistema nervoso central ocorreram em

idade mais precoce nas famílias que tiveram a mutação detectada (19 anos) se

comparado às famílias sem mutação detectada (32 anos) (Tabela 5). O mesmo pode

ser verificado nos pacientes com tumores colorretais, que apresentaram idade média

de acometimento de 32,4 anos nas famílias com a mutação e 51,6 anos naquelas que

não tiveram a mutação detectada. Tumores de próstata, tumores de esôfago, tumores

de fígado, tumores de pulmão e tumores de tireóide também ocorreram mais

precocemente nas famílias com a detecção da mutação. O mesmo não foi verificado

em outros tipos tumorais. Pacientes com leucemias, tumores de pele, melanoma,

tumores de cabeça e pescoço e tumores de pâncreas foram acometidos mais

tardiamente quando pertencentes a famílias com a detecção da mutação.

A Figura 3 apresenta a comparação entre o espectro tumoral apresentado

pelas seis famílias com a mutação R337H detectada e os tumores apresentados pelas

famílias incluídas no banco de dados do IARC (IARC TP53 Database R10).

Foram descritos 57 tumores nas seis famílias brasileiras R337H, sendo que o

tumor mais prevalente foi o câncer de mama (29,8%), semelhante ao encontrado no

banco de dados do IARC (26,6%). A segunda maior prevalência de tumores foi

representada por tumores do sistema nervoso central (10,6%) e sarcoma de partes

moles (10,6%), dados também compatíveis com os dados do IARC (15,1% e 14,6%

respectivamente). Verificou-se alta prevalência de tumores adrenocorticais (8,8%)

nestas famílias, quarto tipo de tumor mais prevalente, sendo a sua freqüência 2,3

vezes maior nas famílias brasileiras portadoras da mutação R337H do que nas outras

famílias descritas no IARC (3,9%). Dentre os oito tumores adrenocorticais ocorridos

nas famílias R337H, sete ocorreram em mulheres, sendo que cinco deles antes dos 15

anos.

Mutações TP53

(IARC TP53 Database; N=1171)

Mutações R337H

(neste estudo; N=57)

25 20

10 5

O,4% 7,0%

17,4%

29,8%

10,6%

8,8%

3,5%

10,6%

3.6%

3.1%

8,8%

3,5%

3.9%

4.3%

5.1%

11.4%

14.6%

15.1%

26.6%

9.3%

510

20 25 30

Mama

SNC

SPM

Leucemia/

Linfoma

Pulmão

TGF

Estômago

Outros

Legenda: ADR: carcinoma adrenocortical; C/P:cabeça e pescoço; CCR: câncer colorretal; SNC:

sistema nervoso central; SO: sarcoma ósseo; SPM: sarcoma de partes moles; TGF: Trato genital

feminino; M: masculino; F: feminino.

Figura 3 - Perfil de tumores das famílias brasileiras com mutações R337H no gene

TP53 comparado ao perfil de tumores em outras famílias com a mutação no gene

TP53 depositadas no banco de dados do IARC.

Os sarcomas ósseos, tumores típicos da síndrome e presentes em 11,4% dos

portadores de mutações do banco de dados do IARC, não foram verificados na

população brasileira com a mutação R337H. O mesmo foi verificado em casos de

leucemia, presentes em 5,5% no banco de dados do IARC e ausente na população

brasileira R337H. As famílias R337H apresentaram ainda tumores pouco freqüentes

na SLF, incluindo três casos de adenocarcinoma de células claras renais e dois casos

de tumores papilíferos de tireóide (Figura 3). Os tumores ocorreram

predominantemente em idade jovem, com distribuição entre homens e mulheres de

modo semelhante ao relatado na literatura.

4.4 PERFIL TUMORAL EM FAMÍLIAS BRASILEIRAS SEM A

DETECÇÃO DE MUTAÇÕES GERMINATIVAS E COM

DIAGNÓSTICO CLÍNICO DA SLF E LFL

Em 32 famílias que preencheram pelo menos um dos critérios clínicos para

SLF e LFL não foi detectada a mutação no gene TP53 (Tabela 6). O perfil tumoral

destas famílias era constituído predominantemente de tumores relacionados à

síndrome e as idades de acometimento dos tumores eram precoces.

Frente ao amplo espectro tumoral verificado nas SLF e LFL, algumas

famílias acometidas por múltiplos tumores puderam ser classificadas a partir de

critérios caracter[isticos de mais de uma síndrome genética ligada ao câncer. Na

família Y36, na qual a mutação no gene TP53 não foi detectada, foram relatados

quatro casos de câncer colorretal sendo dois deles em idade jovem. A presença de

outros tumores em idade jovem foi verificada, sendo dois casos de tumor de mama,

um caso de linfoma e um tumor do trato genital feminino acometendo quatro

gerações consecutivas. Deste modo, esta família preencheu os critérios de Eeles 1 e

ao mesmo tempo poderia ser classificada como Síndrome do Câncer Colorretal não

Polipose (HNPCC) a partir dos critérios de Amsterdam II.

Tabela 6 - Espectro tumoral de 32 famílias brasileiras com diagnóstico clinico da

SLF e LFL sem detecção da mutação no gene TP53.

Família Tumores no probando

(Gênero-Idade de acometimento,

anos)

Tumores nos familiares

(Genero-Idade de acometimento,

anos)

Classificação

Clinica

Y2 SPM (F-42*) Leucemia (F-26, M-62), Estômago

(M-49)

LFL-B

Y3 Mama (F-44*) SNC (M-34), Mama (F-36, 43),

Bexiga (M-48)

LFL-E1

Y6 SO (F-15*), Mama (F-32*) LFL-E1

Y7 SPM (F-37*), Mama (F-40*) Mama (F-35), N/D (F-70) SLF

Y8 SNC (M-25*) SNC (M-28), Estômago (F-54, F-

N/D), N/D (M-N/D)

LFL-B

Y9 SPM (F-18*), Mama (F-46*) SPM (F-46), TGF (F-66), Pulmão

(M-55, F-66), Estômago (M-47, M-

50, F-65)

SLF

Y10 SPM (F-55*) CCR (F-50), Estômago (F- 38)

Pulmão (M-25, M-35) Mama (F-36)

LFL-E1

Y11 Tireóide (F-73*), Melanoma (F-75) Pele (M-72), Mama (F-42, F-53),

Melanoma (M-9), Pâncreas (F-63)

CCR(M-60)

LFL-E1

Y14 SPM (M-35*), Linfoma (M-55*),

Próstata (M-63*)

CCR (M-38), Mama (F-29) SLF

Y17 Mama (F-43, 46*) Mama (F-63), Linfoma (M-26),

Pele (F-N/D), Pulmão (F-N/D), SO

(F-63), C/P (F- N/D), TGF (F-

N/D), Próstata (M-43)

LFL-E1

Y20 Renal (M-1*), SPM (M-5, 11,16,

17*), SNC (M-15*), SO (M-18*)

Mama (F-60, M-75), Leucemia (F-

62, F-N/D)

SLF

Y21 SPM (M-39, 40, 41, 44, 45 *) Bexiga (M-60), Linfoma (M-20, F-

69), Melanoma (F- 40), Próstata

(M-78), Estômago (F- 63, F-64),

N/D (M-40, M-70)

SLF

Y22 SPM (F-14*) Estômago (M-21, M-45, M- N/D),

N/D (F- N/D)

SLF

Cont/Tabela 6

Y23 SNC (M-1*) Leucemia (M-34), Mama (F-66),

Esôfago (M-68, F-80), Tireóide (F-

47)*

LFL-B

Y24 Linfoma (F-73*), Mama (F-79*),

Pele (F-81*)

SNC (F-30), C/P (F- 45), Fígado (F-

57), TGF (F-32, F-78)

LFL-E1

Y29 SO (F-19*), SPM (F-23*), C/P (F-

24*), Mama (F-26, 26*)

Linfoma (M-N/D),C/P (F- 63),

Pâncreas (M-52), Mama (F-N/D)

SLF

Y30 Linfoma (F-25*) SPM (F-41), Mama (F-50), Próstata

(M-80), Pele (F- N/D), Pâncreas (F-

N/D)

LFL-E1

Y31 SNC (M-34, 34*) SPM (M-15), Linfoma (F-8) LFL-B

Y32 SPM (F-56*) CCR (F-28), Tireóide (F-58), Pele

(F-51, M-N/D), SNC (M-70, M-78),

SPM (F-56)

LFL-E2

Y36 Mama (F-44*) CCR (M-29, M-48, M-72, F-84),

Linfoma (F-23), Mama (F-44), TGF

(F-63)

LFL-E1

Y38 SPM (M-39*) Pâncreas (F-42)*, Melanoma (F-

35)*, Estômago (M-N/D), Fígado

(M-N/D M-N/D), Bexiga (F-N/D)

SLF

Y41 SO (F-8*), Mama (F-28*) Mama (F-40), Esôfago (F-N/D) SLF

Y42 Melanoma (M-51*), Pulmão (M-

52*), SPM (M-52*)

CCR (F-77, F-N/D), SPM (M-81),

Melanoma (M-72), Fígado (M-64),

Mama (F-N/D)

LFL-E2

Y43 SPM (M-22*) Leucemia (F-1), CCR (F-48),

Estômago (F-60, M-N/D)

LFL-E1

Y44 Pâncreas (M-33*) SO (M-16), Leucemia (F-32),

Estômago (M-56, M-67), Mama (F-

38, F-53,F-98), Tireóide (F-54),

Esôfago (M-57)

LFL-E1

Y46 SPM (M-25*), Pele (M-35*) Estômago (F-70), CCR (F-54),

Mama (F-40, F-40), Próstata (M-

72)

LFL-B

Cont/ Tabela 6

Y47 Linfoma (M-11*), SPM (M-18*),

Estômago (M-36*), Pele (M-33,

34*)

Mama (F-62) LFS

Y51 Mama (F-53*) SNC (M-3), TGF (F-52, F-N/D),

Mama (F-68), CCR (F-N/D),

Próstata (M-N/D), Estômago (M-

N/D), Esôfago (M- N/D, M-N/D)

N/D (F-N/D)

LFL-E1

Y52 Mama (F-48*) Mama (F-36), Leucemia (F-6),

Próstata (F-62)

LFL-E1

Y54 Mama (F-41*), TGF (F-44*) SNC (M-8), Estômago (F-38, M-

50), C/P (M-53, M-59)

LFL-E1

Y55 Mama (F-47*) Mama (F-27), Mama (F-29), SO (F-

N/D), SNC (M-N/D)

LFL-E1

Y56 Linfoma (M-24*), SO (M-24*) CCR (M-31) LFL-B

Legenda: (a): ADR: carcinoma adrenocortical; C/P:cabeça e pescoço; CCR: câncer colorretal; SNC:

sistema nervoso central; SO: sarcoma ósseo; SPM: sarcoma de partes moles; TGF: Trato genital

feminino. M: masculino; F: feminino. Mais de um tumor pode ocorrer em um paciente; (b): Critério

diagnóstico clássico, de Birch e de Eeles da Síndrome de Li-Fraumeni; (*): tumores em indivíduos

testados positivos para a mutação em TP53; (negrito): tumores confirmados por laudos

histopatológicos ou relatório médico; N/D: dado não disponível

A família Y3 foi encaminhada ao departamento de Oncogenética com o

diagnóstico de Síndrome do Câncer de Mama e Ovário Hereditário. Nesta família

haviam ocorrido três casos de adenocarcinomas ductais invasivos de mama em idade

jovem. A probanda apresentou câncer de mama aos 44 anos, sua irmã aos 35 anos e

uma tia paterna aos 43 anos. Além disso, foram relatados outros tumores, sendo um

irmão com câncer de bexiga aos 48 anos e um tio paterno com tumor de sistema

nervoso central aos 34 anos. Mediante o perfil tumoral apresentado, mesmo sem a

confirmação molecular, a família recebeu a hipótese diagnóstica de LFL de acordo

com os critérios de Eeles 1.

A família Y58, na qual a mutação no gene TP53 foi detectada, apresentou um

espectro muito amplo de tumores típicos da SLF e LFL, sendo 13 indivíduos

acometidos na mesma família em três gerações consecutivas. A presença de duas

irmãs com câncer de mama aos 35 e 45 anos, além da mãe com câncer de mama aos

55 anos, da tia materna aos 49 anos e da prima materna aos 33 anos, sugere o

diagnóstico da Síndrome de Mama e Ovário Hereditário. Desta forma, o diagnóstico

diferencial deve ser realizado em todos pacientes com as SLF e LFL nas quais não

foram encontradas mutações no gene TP53, visando a busca de alterações em outros

genes que possam estar envolvidos na etiologia dos tumores apresentados. No

entanto, apesar da mutação não ter sido detectada, o diagnóstico clínico da síndrome

permanece.

4.5 AVALIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS ENCONTRADOS NO

GENE TP53

A freqüência da alteração no códon 10 (R337H) no DNA genômico de 53

voluntários saudáveis provenientes do Serviço de Genética Médica, Hospital de

Clínicas - Porto Alegre foi avaliada através de experimentos de PCR-RFLP.

A presença da troca de G para A no segundo par de bases do códon 337

impede o reconhecimento da seqüência GCGC pela enzima de restrição HhaI e,

conseqüentemente, não ocorre a digestão do DNA. Após a amplificação do DNA

com primers específicos para o éxon 10 e digestão com esta enzima de restrição, a

presença de dois fragmentos de DNA (92 e 146 pb), resultantes da ação da enzima de

restrição, indica que nenhum dos alelos possui a alteração. Por outro lado, a presença

de um terceiro fragmento (238 pb) demonstra que um dos alelos possui a alteração, o

que impediu que a digestão enzimática ocorresse.

Dentre as 53 amostras controle, referentes aos voluntários saudáveis testados,

nenhuma apresentou a alteração R337H (Figura 4). Esta alteração foi encontrada em

seis das 45 famílias que apresentavam o fenótipo da SLF e LFL neste estudo e já

havia sido descrita como mutação germinativa no banco de dados do IARC, podendo

ser classificada como uma mutação patogênica.

Y15 Y2 Y27 Y12 Y24 Y60 NO C1 Y27 C2 C3 C4 C5

238 pb

146 pb

92 pb

238 pb

146 pb

92 pb

Legenda: A: Y15, Y12, Y27, Y60: DNA genômico de probandos portadores da mutação R337H no

gene TP53; Y2, Y24: probandos sem a mutação germinativa no gene TP5; B: NO: controle sem DNA;

C1, C2, C3, C4, C5: DNA genômico de voluntários saudáveis da provenientes do Serviço de Genética

Médica, Hospital de Clínicas - Porto Alegre; Pb: pares de base.

Figura 4 - Digestão enzimática do códon 337 do éxon 10 do gene TP53 pela técnica

de RFLP.

Foram identificados polimorfismos no gene TP53 nas famílias brasileiras com

diagnóstico clínico de SLF e LFL incluídas neste estudo (Tabela 7). O polimorfismo

11827, no íntron 2, foi verificado em 20 famílias dentre as 45 estudadas. Esta

alteração já havia sido descrita previamente como um polimorfismo e faz parte do

banco de dados de polimorfismos encontrados no gene TP53. No íntron 3, na posição

11951, foi verificada a presença de uma inserção de 16 pares de base, presente em 13

das 45 famílias estudadas. Esta alteração também já havia sido descrita previamente.

Tabela 7 - Freqüência de polimorfismos no gene TP53 na população brasileira.

Éxon/

Íntron

Nucleotídeo Tipo Descrição Neste

estudo

Controles

saudáveis

Referências

Códon

(%)

Íntron 2 /

Silenciosa

ANSEN 1994

- 11827 Ponto C>G 20/45

(44,4)

- PLEASANTS

Íntron 3 - 11951 Inserção 16

base

+16 pb - LAZAR et al. 1993;

al. 1996

Éxon 4 72 12139 C>G - 86;

94;

Íntron 6 - 13964 Ponto/

G >C 4/45 6

MALISZEWSKA et al.

pares de

Ponto/

13/45

(28,9)

23/45

SJALANDER et

HARRIS et al. 19

Silenciosa (51,1) BECKMAN et al. 19

THOMAS et al. 1999

Íntron 5 - 13311 Ponto/

Silenciosa

T>G 1/45

(2,2)

3 Nunca descrito

HILLEBRANDT et al.

Silencio (8,9) 1997; FISZER-

2003

Legenda: +16pb: inserção de 16 es.

esta amostra foi o localizado no éxon 4, no

códon 72, encontrado em 51,1% das famílias brasileiras avaliadas, sendo este o

polimo

pares de bas

O polimorfismo mais prevalente n

rfismo no gene TP53 mais freqüentemente descrito na literatura. A alteração

13964, localizada no íntron 6, foi verificada em 4 das 45 famílias avaliadas, e já

havia sido descrita previamente na literatura. A presença da alteração no nucleotídeo

13311 do íntron 5 nunca havia sido descrita em famílias SLF e LFL. Por isso a sua

freqüência foi avaliada nos 53 controles da população de Porto Alegre através de

seqüenciamento direto desta região. Esta avaliação demonstrou a presença da

alteração em três amostras (5,6%), podendo esta alteração ser considerada como um

polimorfismo.

4.6 ACONSELHAMENTO GENÉTICO E ACOMPANHAMENTO

Todos os pacientes selecionados foram submetidos ao aconselhamento

genético e assinaram o consentimento informado após receberem informações sobre

a SLF

da análise das

mutaçõ

do cada paciente atendido de forma individualizada e sem a presença de

acomp

(Anexo 5). O quadro clínico, história familial e o heredograma de todos os

pacientes foram registrados na ficha de avaliação clínica (Anexo 4).

Os resultados dos testes genéticos foram comunicados aos pacientes a partir

de laudos redigidos de forma a incluir os resultados provenientes

es, além de informações referentes ao teste genético (Anexo 8). Informações

publicadas na literatura científica sobre relatos anteriores das alterações encontradas

em cada probando também foram incluídas nos laudos. Todas as informações foram

apresentadas ao paciente de forma concisa e clara para que um médico clínico geral

pudesse compreender seu significado e buscar as informações se necessário. Foi

verificado o desconhecimento das características clínicas da síndrome por parte de

alguns médicos que já acompanhavam os probandos deste estudo demonstrando a

falta de informação sobre o assunto e por isso, possivelmente o subdiagnóstico da

síndrome.

Os resultados foram divulgados de forma confidencial durante uma consulta

clínica, sen

anhante. As famílias provenientes de colaborações com os serviços de

Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre e da Divisão de Genética

Médica do

INCA receberam resultados do teste molecular nos institutos de origem.

No momento da entrega, as características clínicas da doença, assim como os

conceitos de risco, penetrância e rastreamento foram relembrados visando uma

melhor compreensão do significado do resultado do teste molecular e das suas

implicações no seguimento clínico do indivíduo. O impacto psicológico da

comunicação da síndrome genética foi intenso, sendo experimentadas diversas

formas de reação por parte do paciente. Muitos referiram alívio, por terem

encontrado a razão pela qual a família vinha sendo acometida pela alta freqüencia de

tumores malignos.

Após receberem o resultado, os pacientes foram avaliados por uma psicóloga

com treinamento em acompanhamento de pacientes oncológicos, que oferecia apoio

especializado ao paciente. Os pacientes foram questionados quanto à compreensão

do diagnóstico, o impacto causado pelo resultado do diagnóstico molecular e

perspectivas futuras. A intenção desta consulta foi a de fornecer o apoio psicológico

necessário visando proporcionar amparo e redução da sobrecarga (burden), para que

os familiares pudessem tomar decisões mediante a situação de stress que representa a

comunicação do diagnóstico de uma doença genética a na família. A maior parte das

pacientes optou pela comunicação do resultado do teste genético aos familiares em

risco. Ao longo da realização deste estudo, foi oferecido acompanhamento clínico

semestral a todos os pacientes e seus familiares. Este acompanhamento era composto

por uma consulta com o geneticista responsável além da avaliação pelos especialistas

que pudessem estar envolvidos no seguimento das lesões encontradas no

rastreamento. Através das consultas foi possível atualizar o quadro clínico das

famílias, sendo incluídos nesta análise tumores que surgiram ao longo do período

deste estudo.

4.7 DETECÇÃO DE MUTAÇÃO EM FAMILIARES

O teste molecular para a detecção de mutações no gene TP53 foi oferecido a

todos

miliares provenientes de 3 famílias foram testados. Na

família

SINTOMÁTICOS E ASSINTOMÁTICOS

os familiares pertencentes às 13 famílias nas quais mutações foram

encontradas. Em uma primeira consulta com os membros da família, foram

fornecidas informações sobre a síndrome, risco de desenvolvimento de tumores e

conceitos como herança e penetrância. Todos foram informados sobre a importância

do acompanhamento clínico de possíveis portadores, mesmo se assintomáticos. As

consultas familiares foram seguidas de uma avaliação realizada pela psicóloga com

treinamento em acompanhamento de pacientes oncológicos. Todos os interessados

em fazer o teste molecular foram orientados a agendar uma consulta individual para

realização da avaliação clínica e aconselhamento pré-teste. O teste foi realizado após

a assinatura do consentimento informado. As informações fornecidas no

aconselhamento e o apoio psicológico permitiram a compreensão do risco aumentado

e da necessidade de acompanhamento, mesmo em indivíduos assintomáticos,

possibilitando a avaliação do perfil molecular de outros membros pertencentes às

famílias mutadas. Os resultados foram comunicados aos familiares através de laudos

contendo os resultados provenientes da análise das mutações, além de informações

referentes ao teste genético.

Até o momento, 15 fa

Y 12, na qual a mutação R337H foi detectada, os três filhos (Figura 5 - IV:1,

IV:2 e IV:3) da paciente índice foram testados. A mutação foi detectada apenas na

filha mais velha (Figura 5 - IV:1) que havia apresentado aos 25 anos um tumor

ília Y27 (Figura 6 - II:10, III:3, III:5, III:6,

e Porto Alegre, apenas a filha do

probando(Figura 7 - III:24), que apresentou câ

papilífero de tireóide. Dois sobrinhos (IV:5 e IV:6) também foram testados, ambos

negativos para a mutação R337H. É interessante notar que em uma das sobrinhas

testadas (IV:5), que havia apresentado um tumor papilífero de tireóide aos 28 anos,

não foi detectada a mutação R337H.

Oito indivíduos pertencentes à fam

III:8, III:11, III:14 e III:15) foram avaliados para a presença da mutação R337H,

sendo que a mutação estava presente em quatro deles. O tio materno avaliado (II:10)

e um de seus dois filhos (III:14) apresentaram a mutação R337H, ambos

assintomáticos; o outro filho também avaliado (III:15) não apresentou a mutação.

Dois outros primos também assintomáticos apresentaram a mutação (III:8 e III:11).

O irmão da paciente (III:3) e dois outros primos maternos (III:5 e III:6) não

apresentaram a mutação R337H.

Na família Y49, proveniente d

ncer de mama aos 44 anos, foi testada

e teve a mutação R337H detectada. Esta paciente é também portadora da Síndrome

de Down (trissomia do cromossomo 21) (Figura 7), sendo este o único caso

confirmado de outra síndrome genética associada ao SLF e LFL dentre os indivíduos

incluídos nesta amostra. Esta paciente teve o consentimento informado asssinado

pelo pai, seu responsável legal.

IV:5

IV:4

IV:3

IV:

III:2

III:1

V:1 V:2

II:1 II:2

III:4 III:5 III:8III:7

IV:10

III:3

IV:6

III:6

IV:7 IV:8 IV:9

I:1 I:2

II:3 II:5 II:7 II:9 II:10 II:12 II:14 II:15 II:17 II:18 II:19II:4

III:9 III:10 III:11 III:13III:14III:12

IV:11

II:6

III:15 III:16 III:17 III:18 III:19 III:20 III:21

II:8

III:23 III:22

IV:12 IV:13

II:11

III:24 III:25 III:26 III:27

II:13

III:28 III:29 III:30 III:31 III:32 III:33 III:34 III:35 III:36

II:16

III:38 III:39III:37

IV:14

(

)

Tireóide

(

)

R337H/WT

Tireóide

(

)

WT/WT

SPM

(

)

Tireóide

(

)

Mama

(

)

Pulmão

(

)

R337H/WT

Mama

(52)

Mama

(60)

Mama

(

)

Mama

(60)

ADR

(36)

Estômago

(61)

Mama

(40)

Mama

(45)

Melanoma

(80)

Estômago

(62)

Mama

(35)

ADR

(1)

WT/WT WT/WT

Família Y12

Mutação Éxon 10,

R337H

CGC>CAC

Legenda: *Testado para mutação no gene TP53 - R337H no exon 10. =acometido por neoplasia maligna; Ø = óbito; ⁮:

indivíduos testados para a mutação no gene TP53. ⁮:portador assintomático da mutação R337H. R337H/WT: portador da mutação

em heterozigose R337H/ WT: Wildtype ou alelo selvagem. III:2: geração:número do indivíduo; Tumor (idade ao diagnóstico);

Abreviações: TGF: trato genital feminino. ADR: tumor adrenocortical; SPM: sarcoma de partes moles; N/D: não disponível.

ura 5 – Heredo

rama da família Y 12.

III:1

III:2

IV:1

II:1 II:2

III:3

III:4

IV:2 IV:

I:1 I:2

II:

II:4 II:7 II:

II:10

II:

III:5

III:6

II:

III:8

III:10

III:7

IV:4 IV:5

III:9

IV:

IV:7

II:

III:11

I:13

III:12

IV:

IV:9

II:11

III:14

III:15

Estôma

(

)

SPM

(

)

N/D

(

N/D

)

Estôma

(

)

WT R

Mama

(

)

a(3

)

Família Y27

Mutação Éxon 10, R337H,

CGC>CAC

Legenda: *Testado para mutação no gene TP53 - R337H no exon 10. =acometido por neoplasia maligna; Ø = óbito; ⁮:

indivíduos testados para a mutação no gene TP53. ⁮: portador assintomático da mutação R337H. R337H/WT: portador da

mutação em heterozigose R337H/ WT: Wildtype ou alelo selvagem. III: 2: geração: número do indivíduo; Tumor (idade ao

diagnóstico); Abreviações: TGF: trato genital feminino. ADR: tumor adrenocortical; SPM: sarcoma de partes moles; N/D: não

disponível.

Figura 6 – Heredograma da família Y 27.

II:1

Renal

II:1

III:2

III:24

III:2III:2

IV:4 IV:

II:1 II: II:4 II: II: II:1II:

III: III: III: III: III: III:8

III:

IV:

III:

IV: IV:

III:

II:

III:10 III:1 III:12

II:7

III:13 III:14 III:1

II:

III:1 III:1 III:1

II:14

III:19 III:2 III:2 III:22

Renal

TGF

(

)

Próstata

Mama

Pulmão

Próstata

(

N/D

)

Mama

(

)

Próstata

(

N/D

)

Pâncreas

Estôma

R337H/W

II:1

Família Y49

Mutação Éxon 10,

R337H, CG

C>CAC

Legenda: *Testado para mutação no gene TP53 - R337H no exon 10. =acometido por neoplasia maligna; = óbito;

⁮: indivíduos testados para a mutação no gene TP53.⁮:portador assintomático da mutação R337H. R337H/WT: portador da

mutação em heterozigose R337H/ WT: Wildtype ou alelo selvagem. III:2: geração:número do indivíduo;Tumor (idade ao

diagnóstico); Abreviações: TGF: trato genital feminino. ADR: tumor adrenocortical; SPM: sarcoma de partes moles; N/D:

não disponível.

Figura 7 – Heredograma da família Y 49.

Todos os familiares que apresentaram a mutação foram considerados

como portadores da síndrome e orientados a prosseguir o acompanhamento

multidisciplinar para rastreamento de possíveis lesões relacionadas. Os familiares

que não apresentaram a alteração relacionada ao probando receberam o resultado

negativo para a mutação avaliada e foram orientados quanto ao risco de

desenvolvimento de tumores semelhante ao da população em geral, logo sem

necessidade de rastreamento específico. Os resultados dos testes moleculares

realizados nos familiares foram informados após aconselhamento pós-teste.

4.8 ADAPTAÇÃO DO PROTOCOLO DE RASTREAMENTO

CLÍNICO MULTIDISCIPLINAR

Mediante a presença aumentada de tumores pouco descritos na síndrome nas

famílias brasileiras incluídas neste estudo, alguns exames diagnósticos e laboratoriais

foram incluídos no protocolo de rastreamento proposto pelo NCCN. Este protocolo

adaptado propõe, além dos exames de rastreamento já previstos, a inclusão de

exames focalizando a detecção precoce de lesões colorretais e no estômago, além da

avaliação renal por métodos de imagem e citologia oncótica (Tabela 8). Todos os

portadores da síndrome devem ser submetidos a uma endoscopia e a uma

colonoscopia a partir dos 35 anos. Outro exame que deve ser proposto é a

ultrassonografia de tireóide anual visando o rastreamento de tumores de tireóide. Os

tumores de papila duodenal são de difícil diagnóstico precoce, porém devem ser

considerados como diagnóstico diferencial.

Tabela 8 - Protocolo de rastreamento para pacientes portadores da SLF e LFL

adaptado a população brasileira.

Rastreamento Anual Semestral Mensal

Adultos em

risco

• Exame clínico com foco na detecção de tumores

raros e novos tumores primários

• Mamografia anual a partir dos 20-25 anos (M)

•Ultrassonografia de vias urinárias

• Ultrassonografia de tireóide

•Colonoscopia aos 35 anos

a,c

•Exame para detecção de sangue oculto nas fezes

•Endoscopia digestiva alta aos 35 anos

b,c

•Acompanhamento direcionado aos tumores

ocorridos nas famílias

• Exame clínico das

mamas a partir dos

20-25 anos ou 5 a

10 anos antes do

tumor de mama em

parente jovem (M)

•Citologia oncótica

•Auto-

exame da

mama a

partir dos 18

anos

Crianças em

risco

•Exame clínico com foco na detecção de tumores

raros

•Exame para detecção de sangue oculto nas fezes

•Hemograma completo

Outras

possibilidades

de manejo

• Esclarecer famílias sobre limitações no

rastreamento de tumores relacionados à síndrome

• Informar sobre mastectomia profilática bilateral

(individualizar a cada família

• Informar pediatras sobre risco de tumores

infantis

• Rastreamento baseado na história famílias

•Educação sobre possíveis sinais e sintomas de

câncer

Legenda: (M) – exame realizado em mulheres; Negrito: novas propostas para rastreamento precoce

de lesões relacionadas à Síndrome de Li-Fraumeni.

ou 5 a 10 anos antes do tumor de mama em

parente mais jovem.

se presença de pólipos adenomatosos, repetir em 1 ano; ausência de pólipos

adenomatosos, repetir em 3 anos.

na presença de lesões suspeitas, como esôfago de Barret ou atipia,

repetir anualmente.

A alta incidência de tumores adrenocorticais na infância deve ser comunicada

ao pediatra responsável pelas crianças pertencentes a famílias portadoras da

síndrome, devendo estes ficar atentos quanto a sinais característicos deste tumor

como puberdade precoce, hirsutismo e acne infantil. A realização anual de um

hemograma completo deve ser sugerida como acompanhamento destas crianças,

porém elas não devem ser informadas sobre o diagnóstico da síndrome devido à falta

de discernimento e para ser evitada uma sobrecarga emocional desnecessária.

A aplicação destes métodos permitiu o diagnóstico precoce de um tumor

papilífero de tireóide na mãe do probando Y23 aos 47 anos. O probando Y10 foi

submetido à colonoscopia na qual foi verificado a presença de um pólipo

adenomatoso com atipia de alto grau, lesão que pode ser considerada como pré-

maligna. O retorno para a realização de avaliação clínica com o oncogeneticista

deverá ocorrer semestralmente e possibilitará a integração entre as diversas

especialidades envolvidas no acompanhamento do paciente portador da síndrome.

Deste modo, as informações e testes realizados nas diversas especialidades poderão

ser reagrupados para melhor acompanhamento não só do paciente, mas também de

sua família.

5 DISCUSSÃO

O câncer é uma doença de origem genética. É causada por alterações

ocorridas em genes relacionados aos processos de proliferação, diferenciação e morte

celular. Estas alterações podem ocorrer em células somáticas e/ou em células

germinativas. Indivíduos portadores de mutações germinativas em genes

relacionados à tumorigênese apresentam alta predisposição para o desenvolvimento

de neoplasias, podendo ser classificados com portadores de síndromes genéticas de

predisposição ao câncer. A maior parte das síndromes hereditárias de predisposição

ao câncer tem herança autossômica dominante, a partir da qual a presença de apenas

um alelo mutado leva a caracterização da síndrome e confere à prole destes

indivíduos um risco de 50% de serem portadores da síndrome (LYNCH et al. 2004).

A Síndrome de Li-Fraumeni (SLF) é uma síndrome rara de predisposição ao

câncer relacionada a mutações no gene supressor de tumor TP53. O diagnóstico

clínico da SLF e LFL, sua variante, pode ser feito a partir da ocorrência de tumores

típicos da síndrome, geralmente em idade jovem, preenchendo pelo menos um dos

critérios diagnósticos existentes na literatura (LI e FRAUMENI 1969, BIRCH et al.

1994, EELES 1995, CHOMPRET 2002). Diversos tumores estão relacionados a esta

síndrome e, por isso, é difícil definir um padrão no acometimento dos tumores e na

idade ao diagnóstico, o que dificulta a realização de estudos que visem correlacionar

os diferentes aspectos da síndrome (VARLEY 2003a).

Mediante o diagnóstico clínico da SLF e LFL, a adoção de medidas visando o

rastreamento precoce de tumores deve ser aplicada ao paciente e a seus familiares,

que passam a ser considerados como indivíduos de alto risco para o desenvolvimento

de neoplasias malignas. Através do processo de aconselhamento genético é possível

proporcionar ao paciente uma melhor compreensão das características da doença,

padrão de transmissão e prognóstico. Após iniciado o processo de informação e

aconselhamento, o paciente é esclarecido sobre a possibilidade de confirmação do

diagnóstico clínico da SLF e LFL através da análise molecular do gene TP53. A

presença da mutação no gene TP53 ocasionará a inativação ou produção anômala da

proteína p53, levando à falha no mecanismo de supressão tumoral e facilitando a

ocorrência dos tumores relacionados ao fenótipo da SLF e LFL. Com a detecção da

mutação, será possível a busca da mesma alteração em familiares assintomáticos que

apresentam risco aumentado para o desenvolvimento de neoplasias malignas e logo o

rastreamento precoce de tumores (SUTHERS et al. 2005).

Apesar da SLF e sua variante LFL serem consideradas raras, verificou-se a

alta incidência de famílias brasileiras que preenchiam os critérios da síndrome e que

foram encaminhadas ao departamento de Oncogenética do Hospital do Câncer - A.C.

Camargo, São Paulo. A partir da revisão ativa de prontuários de pacientes com

história famílias de múltiplos tumores atendidos neste departamento, foi possível

diagnosticar outras famílias que poderiam ser classificadas como SLF ou LFL. A

colaboração estabelecida com o Serviço de Genética Médica - Hospital de Clínicas,

Porto Alegre e com a Divisão de Genética Médica –

INCA, Rio de Janeiro permitiu a

inclusão de mais 13 famílias. Desta forma, 45 famílias brasileiras com o diagnóstico

clínico de SLF e LFL foram avaliadas neste estudo a partir da análise molecular de

toda região codificante do gene TP53.

Os critérios empregados para o diagnóstico da SLF e LFL foram três: o

critério clássico, inicialmente proposto por LI e FRAUMENI em 1969, o critério de

BIRCH et al. (1994), mais freqüentemente utilizado na identificação da LFL, e o

critério de EELES (E1 e E2) (1995), que caracteriza famílias LFL, mas que é pouco

utilizado devido à baixa taxa de detecção de mutações (VARLEY et al. 1997b). Os

critérios de CHOMPRET (2002) não foram utilizados por serem redundantes se

empregados juntamente aos demais critérios da síndrome. Logo, os critérios

empregados foram amplos, porém bem delimitados, visando à inclusão do maior

número de famílias com o perfil SLF/LFL. Entre as famílias selecionadas para este

estudo, a maior parte preencheu os critérios de LFL (75,6%), o que era esperado por

serem estes os critérios mais abrangentes.

O estudo foi conduzido no estado de São Paulo, incluindo pacientes oriundos

de três centros de referência no tratamento do câncer no país. Os três centros

localizavam-se nas regiões sudeste e sul do Brasil e por este motivo a maior parte das

famílias brasileiras com diagnóstico de SLF e LFL incluídas neste estudo era

proveniente destas regiões. Desta forma, é possível que esta amostra reflita apenas o

perfil parcial da população brasileira, com foco nas populações de origem européia

que foram predominantes na colonização destas regiões. Este dado é corroborado

pelo fato de não haver nenhuma família da raça negra, responsável por uma parcela

importante da população brasileira. Todas as famílias optaram pela raça branca

quando questionados quanto à etnia, sendo este dado subjetivo devido à composição

racial variada que constitui o povo brasileiro. ROSSI et al. (2002) relataram a

dificuldade de determinação da origem racial exata das famílias brasileiras devido a

heterogeneidade e miscigenação étnica no estudo das síndromes genéticas ligadas ao

câncer. Por este motivo, a classificação étnica das famílias não foi considerada para

análise. É interessante notar que não existem dados na literatura referindo a

ocorrência da SLF e LFL nos diferentes grupos étnicos, sendo a maior parte dos

registros de mutações germinativas do gene TP53 referentes a famílias de origem

caucasiana (IARC TP53 Database R10). Estudos futuros incluindo famílias

provenientes de outras regiões do país serão de grande importância para determinar a

freqüência destas mutações e avaliar o perfil tumoral da síndrome nas outras regiões

do país.

Os heredogramas foram constituídos a partir de todas as informações

referentes aos familiares do probando. Foram incluidos todos os familiares que

apresentaram tumores malignos, assim como os familiares saudáveis, provenientes

do maior número de gerações possível. Por se tratarem de famílias muito extensas,

com muitos indivíduos pertencentes às diversas gerações, não foi possível especificar

o número total de indivíduos que compunham cada geração. Por este motivo, não se

avaliou a porcentagem de indivíduos afetados em cada família ou em cada geração.

A presença de 338 tumores em 292 indivíduos de 45 famílias avaliadas neste

estudo reflete a alta incidência de neoplasias nos indivíduos com o diagnóstico

clínico da SLF e LFL. Além disso, a presença de uma grande variedade de tumores

que podem acometer os portadores pode ser verificada neste estudo a partir dos 25

grupos caracterizados para a classificação dos tumores. Como as SLF e LFL são

caracterizadas exclusivamente a partir da ocorrência de tumores malignos, os

tumores benignos não foram incluídos na análise, exceto pelo caso de mola

hidatiforme na probanda Y1, que apresentou caráter invasor descrito em relatório

médico fornecido pela paciente.

Dentre os tumores relatados, 46,1% puderam ser confirmados por meio de

relatório médico ou por laudo histopatológico. Esta taxa pode ser considerada alta se

for levada em conta à dificuldade de acesso aos registros médicos hospitalares no

país. Quando solicitados a buscar algum tipo de comprovante, os pacientes eram

orientados quanto ao seu direito por lei às informações sobre os tumores ocorridos

em seus familiares.

As famílias com o diagnóstico clínico da síndrome incluídas neste estudo

apresentaram de 1 a 18 membros, acometidos por 24 tipos diferentes de tumores,

além de 10 tumores de origem indeterminada. O espectro tumoral apresentado foi

bastante amplo, sendo mais prevalentes os tumores de mama, sarcomas, tumores de

estômago e sistema nervoso central e leucemias (Tabela 2). Dados semelhantes

foram verificados em estudo conduzido por NICHOLS et al. (2001), no qual 77%

dos 738 tumores avaliados em famílias com o diagnóstico molecular da mutação do

gene TP53 eram típicos da SLF (mama, tumores adrenocorticais, sarcomas, tumores

de sistema nervoso central e leucemias) enquanto que o restante era composto por

diversos tipos histológicos. Nas famílias brasileiras foram verificados tumores

descritos como freqüentes na SLF e LFL em porcentagens próximas às descritas no

banco de dados de mutações germinativas do TP53 do IARC (IARC TP53 Database

R10). No entanto, alguns tumores descritos ocasionalmente na síndrome foram

verificados em maior incidência nas famílias deste estudo, como os tumores

malignos de estômago e tumores colorretais. Os tumores gástricos constituíram o

terceiro grupo de tumores mais freqüentes (n=30, 8,9%) e os tumores colorretais, o

quinto grupo de tumores mais freqüentes. A alta incidência de tumores gástricos

pode ser devido a prevalência deste câncer na população brasileira, sendo o terceiro

tumor mais freqüente nos homens e quinto mais freqüente nas mulheres nas regiões

sul e sudeste do país (Ministério da Saúde 2006). A maior incidência de tumores

colorretais pode ser devido a sua alta incidência em países em deselvolvimento,

representando o segundo tumor mais freqüente nestas populações (STEWART e

KLEIHUES 2003). Desta forma a interação entre fatores ambientais e a presença da

alteração genética podem contribuir para o aumento destes tumores.

A idade de aparecimento dos tumores foi precoce conforme esperado para as

famílias SLF/LFL (Tabela 2). Em 61,1% dos pacientes observaram-se tumores de

mama em idade pré-menopausal. Esta idade é atípica para o desenvolvimento de

tumores desta natureza e deve levantar a suspeita de uma síndrome de predisposição

hereditária ao câncer. Dez casos de tumores colorretais ocorreram em idade jovem,

antes dos 45 anos, enquanto que apenas oito casos foram diagnosticados após esta

idade. Estes dados divergem das informações sobre a idade de acometimento de

tumores colorretais esporádicos na população brasileira, que possui maior incidência

na faixa entre 50 e 70 anos de idade (MALHEIROS et al. 2005).

A presença de mais de um tumor primário foi verificada em 15 dos 292

(5,1%) indivíduos com o diagnóstico clínico da síndrome incluídos neste estudo. A

associação mais freqüente foi a de sarcomas de partes moles e câncer de mama,

verificada em quatro indivíduos, seguida da associação de câncer de mama e

sarcomas ósseos, que ocorreu em três indivíduos. Estes dados diferem do estudo de

HISADA et al. (1998), que verificaram a multiplicidade de tumores em 21% de 200

indivíduos com diagnóstico da síndrome. A menor freqüência de indivíduos com

múltiplos tumores observada neste estudo pode ser devido à dificuldade do paciente

oncológico obter assistência médica especializada no país, levando ao diagnóstico

mais tardio da doença e a uma maior mortalidade relacionada a primeira neoplasia. A

associação de tumores de mama e sarcomas não é característica de famílias SLF e

LFL e a ocorrência desta associação enfatiza a necessidade de um rastreamento mais

intensivo em tumores de mama em pacientes portadores de sarcomas. No caso da

ocorrencia de tumores de mama, o inverso é mais difícil de ser realizado, devido a

dificuldade de rastreamento de sarcomas.

Alguns relatos na literatura descrevem a incidência de múltiplos sarcomas em

famílias portadoras da mutação germinativa no gene TP53. KING et al. (1993)

relataram o caso de um paciente do sexo masculino que apresentou três sarcomas

primários, além de ter história familial de diversos tumores e mutação detectada no

gene TP53. Em 2004, KHAYAT e JOHNSTON relataram a ocorrência de dois

sarcomas em uma criança portadora de mutação germinativa no gene TP53, sendo o

primeiro deles um rabdomiosarcoma do músculo escapular e o segundo um

osteosarcoma de mandíbula. Sem história familial de câncer, este mesmo paciente

apresentou posteriormente um tumor adrenocortical. Neste estudo, a presença de

duas famílias com indivíduos portadores de múltiplos sarcomas (Y 20 e Y21) e sem

diagnóstico molecular foi de grande interesse. Nas duas famílias ocorreram tumores

típicos da SLF nas linhagens materna e paterna, não havendo o predomínio da

ocorrência de tumores em apenas uma linhagem. Devido a este fato, os tumores

referentes a ambas linhagens destas famílias foram considerados para as análises

deste estudo, por não ter sido possível definir pelos métodos utilizados qual lado

segrega a alteração. Nos estudos de KING e KHAYAT e JOHNSTON, foi possível a

detecção molecular da mutação enquanto que nas famílias brasileiras que

apresentaram o mesmo perfil clínico, a mutação não foi verificada. A associação

entre a incidência de múltiplos sarcomas em famílias portadoras da SLF ou LFL e a

ausência da detecção de mutação germinativa no gene TP53 reforça a hipótese de

que a população brasileira pode apresentar alterações, sendo estas prováveis

mutações cromossômicas, que levem a inativação do gene TP53 distintas das demais

populações.

O uso de pesticidas vem sido relacionado ao aumento da incidência de câncer

em algumas populações. O programa Agricultural Health Studies, lançado em 1993

pelo Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos (NIH) (www.aghealth.org),

visa avaliar a exposição freqüente de fazendeiros a pesticidas e a sua relação ao

aumento de neoplasias malignas e outras doenças. Dados preliminares demonstram

que na população de fazendeiros expostos da região de Durham, no estado da

Carolina do Norte, foi verificada a alta incidência de tumores tais como sarcomas de

partes moles, tumores de sistema nervoso central, leucemia, linfoma, estômago,

próstata e pele, assim como a maior incidência de doenças não relacionadas ao

cancer, tais como Parkinson e doenças pulmonares. É de grande interesse notar que

estes tumores compõem o espectro SLF/LFL, sendo alguns dos tumores mais

freqüentemente descritos na síndrome. SANDRINI et al. (1997) levantaram a

hipótese de que a alta incidência de tumores adrenocorticais na região da periferia de

Curitiba poderia estar relacionada à forte exposição a poluentes ambientais, tais

como pesticidas, que são utilizados sem a vigência de normas de segurança.

Pesquisadores ingleses relacionaram o aumento de duas vezes na incidência de

tumores adrenocorticais na região noroeste da Inglaterra com a maior exposição a

pesticidas nesta área (BIRCH e BLAIR 1988). A exposição parental a pesticidas já

foi relacionada ao aumento da incidência de tumores em crianças de 0 a 4 anos na

Noruega (KRISTENSEN et al. 1996).

O uso indiscriminado de pesticidas foi descrito em 11,1% das famílias

brasileiras deste estudo (5/45 - 11,1%). Em três destas famílias (Y1, Y12, Y15) a

mutação no gene TP53 foi detectada, enquanto que nas duas restantes (Y6, Y31) a

mutação não foi encontrada. Chama a atenção o número relativamente alto de

famílias com exposição a pesticidas entre as 13 famílias que tiveram sua mutação

detectada (3/13 – 23,1%). Os relatos sobre a intensidade da exposição foram

inespecíficos, sendo observados desde o contato esporádico com venenos utilizados

em plantações próximas a suas moradias até o contato intenso, diário, por mais de

doze anos, com diversos tipos de venenos, sem utilização de proteção. Todos os

pacientes que referiram exposição a pesticidas relataram também a exposição

parental a pesticidas. Apenas informações referentes à coloração (“veneno azul”) ou

nomes vulgares foram fornecidas pelas famílias. Devido às imprecisões das

informações, não foi possível estabelecer qualquer correlação entre tipo, intensidade

ou período de exposição e a incidência de tumores na síndrome. Estes dados sugerem

a possível interação entre a exposição a pesticidas e a ocorrência de um fenótipo

SLF/LFL, ocorrendo tumores típicos da síndrome em membros expostos na família,

ou na sua descendência. Estudos para a avaliação da exposição a pesticidas e a

incidência de tumores característicos da SLF e LFL serão necessários para esclarecer

esta correlação.

Este estudo é a primeira descrição na América Latina da prevalência de

mutações germinativas no gene TP53 e dos perfis clínicos de famílias que preenchem

os critérios diagnósticos da SLF/LFL. Até o momento, estudos de mutações nas SLF

e LFL eram originários principalmente da Europa Ocidental e da América do Norte.

Mutações germinativas foram detectadas em 28,9% (13/45) das famílias brasileiras

avaliadas neste estudo. Estas famílias são provenientes de centros de referência no

tratamento de câncer no país e na avaliação de famílias portadoras de síndromes

genéticas ligadas ao câncer.

A maior parte das mutações encontradas foi verificada nos indivíduos com

diagnóstico de LFL (12/34 - 35,3%) (Tabela 3). As mutações germinativas no gene

TP53 encontradas nas famílias com diagnóstico clínico de LFL deste estudo

aumentam em 10,2% o número de todas as famílias LFL com a mutação detectada

descritas no banco de dados do IARC, somando 12 famílias as 118 já descritas na

LFL. Entre as famílias portadoras da mutação com diagnóstico de LFL, 41,8%

preenchiam os critérios de Birch e 31,8% que apresentavam somente os critérios de

Eeles. É importante lembrar que critérios de Birch são mais restritos e, por isso, todas

as famílias que os preenchiam, também preenchiam os critérios de Eeles. A taxa de

detecção de mutações em famílias LFL foi superior à relatada por VARLEY et al.

(1997b), que haviam verificado mutações em 22% das famílias com o diagnóstico de

LFL pelos critérios de Birch e em 8% das famílias com os critérios de Eeles. Devido

à maior taxa de detecção de mutações no gene TP53 nas famílias brasileiras com

perfil LFL, torna-se de grande importância à caracterização do diagnóstico da LFL

em famílias brasileiras a partir não somente dos critérios de Birch, mas também dos

critérios de Eeles, que devem ser aplicados na prática clínica.

Relatos da literatura demonstraram uma alta taxa de detecção de mutações em

TP53 nas famílias com os critérios clássicos da SLF. Dados publicados por

VARLEY et al. (1997b) e por VARLEY (2003a) demonstraram a presença de

mutações no gene TP53 em mais de 71% e 77% respectivamente das famílias com o

perfil clássico da SLF. As famílias brasileiras que preencheram os critérios clássicos

da síndrome tiveram uma taxa de 9% detecção de mutação no gene TP53, muito

abaixo da relatada pela literatura (Tabela 3). Uma possível explicação para a baixa

taxa de detecção de mutações poderia ser o fato de que outras alterações, não

detectadas pelos métodos utilizados neste estudo, que também podem causar a

inativação do gene TP53, tais como translocações, grandes deleções ou inserções, ou

mesmo alterações na região promotora do gene TP53, podem ser mais freqüentes na

população brasileira. BOUGEARD et al. (2003) avaliaram 98 famílias com critérios

para a SLF e LFL e 92 famílias que não preenchiam completamente os critérios, a

partir da técnica de PCR multiplex quantitativo de pequenos fragmentos (QMPSF) e

foi detectada a presença de uma deleção no gene TP53 em apenas uma família. Com

isso, os autores concluíram que rearranjos no gene TP53 que estejam envolvidos na

etiologia da SLF são raros. Como a população brasileira mostrou algumas diferenças

tanto no espectro tumoral como na predominância na localização das mutações,

deve-se considerar a possibilidade da busca da mutação no gene TP53 a partir de

outros métodos, visando à busca da detecção de grandes deleções, de alterações na

região promotora e no exón 1, que é considerado um exon não codificante. A

avaliação de outros genes diretamente envolvidos na via da p53, como o gene Mdm-

2, um dos principais reguladores desta proteína, poderia determinar alterações que

levariam ao funcionamento anômalo da p53. Uma outra possibilidade para a não

detecção de mutações no gene TP53 naquelas famílias brasileiras estudadas é que

outros genes estão envolvidos na SLF.

Dentre as 13 famílias que tiveram as mutações detectadas, 12 eram do tipo

missense e uma mutação foi encontrada no sítio doador de splicing do íntron 6

(Tabela 3). A presença de uma mutação germinativa no códon 245 (G245S) foi

detectada em 2 famílias distintas, descrita previamente em outros estudos

(BORRESEN et al. 1992; MACGEOCH et al. 1995; CORNELIS et al. 1997;

VARLEY et al. 1997b). A mutação R213Q, que foi descrita em uma família no

banco de dados do IARC, foi detectada em uma família brasileira. Três alterações

nunca descritas na literatura (V173M, V197M e G244D) foram verificadas,

detectadas em três famílias não relacionadas entre si e, por não causarem danos a

função da proteína p53 foram consideradas mutações novas relacionadas à SLF ou

LFL.

A maior parte dos polimorfismos encontrados neste estudo já haviam sido

descritos na literatura. O polimorfismo no intron 5, nunca descrito anteriormente, foi

encontrado em uma família na qual também foi detectada a mutação germinativa no

códon 173. Esta alteração foi considerada um polimorfismo e não uma mutação

patogênica por estar localizada em uma região intrônica que geralmente não é

codificante. Além disso, este polimorfismo foi verificado em 5% dos controles

saudáveis da população.

As outras seis mutações germinativas do tipo missense ocorridas em seis

famílias distintas e não relacionadas, foram idênticas, ocorrendo todas no éxon 10, no

códon 337, ocasionando a troca de uma arginina por uma histidina (R337H) no

domínio de oligomerização do gene (Tabela 6). Mutações germinativas e somáticas

do gene TP53 são raras neste domínio (IARC TP53 Database R10). Devido a isto,

estudos moleculares iniciais no gene TP53 nas famílias SLF e LFL buscavam a

detecção de mutações apenas no domínio de ligação ao DNA, compreendido entre os

éxons 4 e 9 (domínio de ligação ao DNA), sendo que 95% das mutações descritas

neste gene ocorrem neste domínio. No entanto, VARLEY (2003a) levantou a

possibilidade de serem encontradas mutações em outros domínios do gene TP53 e

passou a considerar como padrão ouro o sequenciamento de todos os 10 éxons

codificantes do gene.

A mutação germinativa no códon 337 do éxon 10 (R337H), encontrada em

maior freqüência nas famílias avaliadas neste estudo, já havia sido descrita em um

paciente que apresentou tumor adrenocortical e que apresentava história familial de

tumor de sistema nervoso central (IARC TP53 Database R10). A mesma mutação foi

detectada por RIBEIRO et al. (2001) em 35 dentre 36 crianças que apresentaram

carcinoma adrenocortical, todas provenientes da periferia de Curitiba no Paraná.

Estas crianças pertenciam a 28 famílias que não apresentaram história familial

documentada de outros tumores. Os pesquisadores levantaram a hipótese de que a

mutação R337H teria como efeito aumentar a predisposição exclusivamente a

tumores adrenocorticais, em contraste com as outras mutações no TP53 descritas

previamente. Desta forma, a mutação R337H exerceria uma ação tumor específica,

ocasionando exclusivamente o desenvolvimento de tumores adrenocorticais na

infância, excluindo desta forma o diagnóstico da SFL e LFL destas famílias. No

estudo descrito, marcadores polimórficos intragênicos foram avaliados nos

portadores de mutações, demonstrando diferenças que indicavam que os alelos

mutantes eram independentes, eliminando a possibilidade dos portadores desta

mutação apresentarem efeito fundador. No entanto, em estudo recente realizado pelo

mesmo grupo (FIGUEIREDO et al. 2005), verificou-se que o espectro tumoral

relacionado às famílias das crianças portadoras de mutações germinativas no gene

TP53 (R337H) era amplo tanto nas crianças como nos adultos, sendo semelhante às

famílias com outras mutações germinativas no TP53 compiladas no banco de dados

do IARC. A revisão do espectro tumoral pelo grupo curitibano, assim como o amplo

espectro tumoral apresentado pelas famílias portadoras da mutação R377H deste

estudo permite concluir que a R337H não é uma mutação tumor específica, sendo

responsável por um fenótipo típico da SLF e LFL. Desta forma, pode-se considerar

que a mutação R337H não é uma mutação tumor específica, podendo ser esta

responsável por um fenótipo típico da SLF e LFL.

Em um estudo realizado no estado de São Paulo, LATRONICO et al. (2001)

verificaram a presença da mutação R337H em 77,8% das crianças (14/18) e em

13,5% (5/37) dos adultos que apresentavam tumores adrenocorticais esporádicos, na

ausência de história familial significante de câncer. O mesmo grupo (PINTO et al.

2004) verificou a provável presença de um ancestral comum a estas famílias a partir

da análise de dois marcadores polimórficos intragênicos em 16 crianças e 6 adultos

que apresentaram carcinoma adrenocortical e que eram portadores da mutação

germinativa R337H no gene TP53. Os pesquisadores verificaram fortes evidências de

que havia co-segregação entre os marcadores polimórficos e a mutação germinativa

R337H, indicando que esta mutação de originou de um único ancestral e sugerindo a

existência de efeito fundador no grupo estudado ao contrário do citado no estudo

realizado em Curitiba por RIBEIRO et al. (2001).

As diferenças verificadas no espectro tumoral relacionado à mutação

germinativa R337H entre este estudo e os de RIBEIRO et al. (2001) e LATRONICO

et al. (2001) podem ser explicadas pelos diferentes desenhos experimentais.

Enquanto que neste estudo realizamos a detecção da mutação em famílias com um

perfil tumoral característico da SLF, RIBEIRO et al. (2001) e LATRONICO et al.

(2001) selecionaram casos esporádicos de tumores adrenocorticais sem história

familial, sendo o grupo de RIBEIRO et al. (2001) constituído exclusivamente de

crianças. A partir destes dados e dos diversos tumores do espectro da SLF e LFL

verificados neste estudo, pode-se supor que o aparecimento de outros tumores entre

os familiares dos pacientes incluídos nos estudos de RIBEIRO et al. (2001) e

LATRONICO et al. (2001) talvez seja apenas uma questão de tempo, indicando a

necessidade de um rastreamento mais intensivo nos possíveis portadores. A

identificação de um efeito fundador entre as famílias avaliadas por LATRONICO et

al. (2001) levanta a possibilidade de que o mesmo possa ocorrer nas famílias R337H

incluídas nesse estudo, apesar de não terem relatado parentesco conhecido entre si.

Estudos avaliando marcadores polimorficos para identificação de um possível efeito

fundador poderiam contribuir para a elucidação deste fato.

O perfil tumoral das famílias R337H neste estudo foi amplo, sendo

verificadas proporções semelhantes nos principais tumores relacionados à síndrome

(Figura 3). O tumor mais freqüente foi o câncer de mama (29,8% - 17/57), ocorrido

em 5 das 6 famílias com mutação no R337H. As incidências de tumores do sistema

nervoso central e sarcomas de partes moles foram de 10,6%, dados semelhantes aos

das outras famílias SLF/LFL. A incidência de tumores adrenocorticais em portadores

do R337H foi verificada numa proporção 2,3 vezes maior do previamente relatado na

SLF/LFL, demonstrando o maior risco de desenvolvimento de tumores

adrenocorticais nos portadores desta mutação. A incidência de tumores de estômago

também foi maior nos portadores do R337H do que em outras famílias SLF e LFL,

ocorrendo numa freqüencia 2,8 vezes maior do que nos portadores de outras

mutações (IARC TP53 Database R10).

A presença de tumores pouco relacionados à SLF e LFL foi observada nas

famílias estudadas portadoras da mutação R337H. Foi verificada a ocorrência de

carcinomas de células claras renais em duas famílias nas quais a mutação R337H foi

identificada e a ausência destes tumores nas demais famílias desta amostra. Este

tumor é pouco relacionado à síndrome e apenas outros três casos foram relatados na

literatura em famílias portadoras da SLF/LFL, correspondendo a 0,44% dos tumores

já descritos na síndrome. (IARC TP53 Database R10) Desta forma, portadores da

mutação germinativa R337H podem apresentar um risco aumentado para o

desenvolvimento de carcinomas de células claras renais e este tipo tumoral deve ser

investigado nos portadores desta mutação.

Alguns tumores apresentaram um padrão distinto nas famílias brasileiras com

diagnóstico da SLF e LFL se comparados às famílias pertencentes ao banco de dados

do IARC. Todas as famílias brasileiras com diagnóstico clínico da síndrome nas

quais ocorreu pelo menos um caso de carcinoma adrenocortical tiveram a detecção

da mutação no gene TP53 (Tabela 4). Este fato pode-se sugerir que a presença de

tumores adrenocorticais em famílias brasileiras com diagnóstico clínico de SLF e

LFL em famílias brasileiras representa um forte indicativo da presença da mutação

no gene TP53.

A presença de tumores de papila duodenal, nunca descritos na LFS e LFL, foi

verificada em indivíduos provenientes de duas famílias deste estudo nas quais foram

detectadas mutações no gene TP53 (Tabela 4). Em ambas as famílias foi relatada a

ocorrência de tumores de sistema nervoso central e tumores colorretais em outros

membros da família em idade jovem. Desta forma, o diagnóstico da SLF e LFL deve

ser considerado em famílias nas quais ocorram tumores de papila duodenal em idade

jovem associados a história familial de câncer em idade jovem. No entanto, como

cada família apresentou mutações diferentes, em domínios diferentes do gene, não

foi possível estabelecer uma correlação genótipo-fenótipo.

Tumores de tireóide, somente descritos no artigo original de LI e

FRAUMENI (1969), foram verificados tanto em portadores da mutação quanto nas

famílias brasileiras sem detecção da mutação (Tabela 4 e Tabela 6). Os tumores de

tireóide que acometeram os indivíduos deste estudo eram todos carcinomas do

subtipo papilífero, que são geralmente tumores pouco agressivos e com invasão

predominantemente local. Frente ao número expressivo de tumores de tireóide

encontrado nesta amostra, indica-se o rastreamento precoce que pode ser feito a

partir de uma ultrassonografia local e, caso haja suspeita, o diagnóstico pode ser feito

a partir de uma punção por agulha fina guiada, evitando diagnósticos tardios que

levariam a necessidade de cirurgias mutilantes. O amplo espectro tumoral presente

nas famílias deste estudo pode estar relacionado a uma possível maior exposição a

fatores mutagenicos, tais como pesticidas, relatados em famílias deste estudo, que

ocasionaria além do fenótipo característico da síndrome a ocorrência de outros

tumores nunca descritos.

Entre as famílias nas quais foram detectadas as mutações no gene TP53 foi

verificada a ocorrência de alguns tumores em idade mais precoce (Tabela 5). No

entanto, a média da idade de acometimento dos três tumores mais prevalentes nas

famílias deste estudo (tumores de mama, sarcomas de partes moles e tumores de

estômago) foi semelhante em ambos grupos. Este dado demonstra que possivelmente

estas variações foram encontradas devido ao pequeno número de tumores em alguns

grupos.

Dismorfias foram detectadas ao exame físico em uma das famílias com a

mutação R337H. A paciente Y15, que apresentou um tumor adrenocortical e um

tumor renal na infância, foi submetida a uma avaliação endocrinológica, na qual

algumas alterações, tais como a baixa estatura, o fascies Cushingóide e o hirsutismo,

foram relacionados ao quadro ocasionado pelas alterações endocrinológicas geradas

pelos tumores adrenocorticais. No entanto, as alterações esqueléticas, como ponte

nasal deprimida e braquidactilia com a presença de hipoplasia de quarto e quinto

metacarpos (mão esquerda) e de quinto metacarpo (mão direita), além de

macrocefalia, não eram correlacionadas a estas manifestações. A existência de

dismorfias relacionadas à SLF e LFL nunca havia sido descrita na literatura. Não foi

possível realizar a avaliação clinica dos familiares, para excluir dismorfias

semelhantes devido a distancia geográfica. No entanto, este relato é importante para

motivar outros médicos assistentes de famílias SLF/LFL a buscarem em seus

pacientes dismorfias semelhantes. É interessante ressaltar que a probanda Y15 é

proveniente de uma das famílias na qual foi relatado exposição a pesticidas. Como

dismorfias foram descritas em apenas uma paciente portadora da síndrome, não é

possível estabelecer correlações, no entanto demonstra a importância da realização

de um exame físico em todas famílias SLF/LFL buscando dismorfias.

Também é um fato inédito a detecção de mutação no gene TP53 em uma

paciente com síndrome de Down que apresentou um tumor de mama em idade

precoce, pertencente à família Y49 (Figura 7). Esta é uma associaçâo casual

envolvendo a síndome de Down, que é a mais freqüente causa de retardo mental

sindrômico, e a SLF (NUSSBAUM et al. 2002). Vale ressaltar que a paciente

apresentava somente dismorfias características da síndrome de Down. O aumento da

incidência de neoplasias malignas na síndrome de Down já foi descrito em diversos

estudos, sendo relatado maior acometimento de leucemias e tumores de testículo

(FERNANDEZ-PLAZA et al. 2004, GOLDACRE et al. 2004). No entanto, tumores

malignos de mama são menos freqüentes em mulheres portadoras da Síndrome de

Down do que na população feminina geral (SATGE et al. 2002). Estudos avaliando

interação da mutação germinativa no gene TP53 e a ocorrência da trissomia no

cromossomo 21 seriam de grande interesse na deteminação desta associação.

O fato de familiares de apenas três famílias com a detecção da mutação

buscarem a realização do teste molecular foi inesperado. A família Y49 demonstrou

o desejo de realização do teste em familiares desde o início do estudo. As famílias

Y12 e Y27 mostraram interesse imediatamente após a comunicação do resultado,

enquanto que as outras famílias solicitaram um tempo para reflexão. Isto demonstra a

dificuldade de aceitação por parte dos possíveis portadores frente ao comunicado do

diagnóstico molecular da síndrome genética. O fato de existirem portadores da

mutação assintomáticos demonstra a necessidade do rastreamento precoce. A

ausência de mutação na paciente IV:1 da família Y12 que já apresentou um tumor de

tireóide demonstra que nem todos os pacientes portadores de tumores em famílias

com a SLF/LFL são necessáriamente portadores da mutação germinativa.

A realização de rastreamento precoce de tumores na SLF e LFL constitui um

desafio. Para que as famílias possam ser corretamente diagnosticadas e

acompanhadas, os médicos devem ter conhecimento dos tumores relacionados à

síndrome, sobre os possíveis métodos de rastreamento e sobre a ocorrência na

população brasileira de tumores pouco descritos como relacionados à SLF e LFL. No

entanto, perante o amplo espectro tumoral que compõe a síndrome torna-se difícil

realização de exames específicos no rastreamento precoce de tumores. Em 2001,

FREBOURG et al. propuseram um protocolo de rastreamento pré-sintomático que

incluía o tumor de mama como principal sítio de acompanhamento, sugerindo que

outros tumores são de difícil rastreamento. VARLEY (2003a) propôs que o

rastreamento das famílias portadoras da SLF e LFL era complicado devido à

variação não apenas do tipo de tumor que pode ocorrer, mas da diversidade de idade

em que os tumores ocorrem. Logo, frente ao alto risco para tumores malignos e à alta

penetrância, devem-se utilizar todos os métodos disponíveis.

O acompanhamento de um oncogeneticista vai orientar os pacientes quanto

aos riscos da síndrome, vai possibilitar o rastreamento precoce de lesões malignas

relacionadas à síndrome e proporcionar alguma segurança de que o paciente está

sendo acompanhado com todos os recursos disponíveis para o seu caso. As famílias

incluídas neste estudo foram inicialmente submetidas ao rastreamento proposto pelo

NCCN (Quadro 3) após o diagnóstico. Todos os pacientes foram estimulados a trazer

seus familiares que pudessem ser portadores para que fossem também rastreados.

A única medida reconhecida como eficaz era o rastreamento de tumores de

mama, a partir da mamografia anual associada à ressonância magnética da mama

caso houvesse suspeita (LEACH et al 2005). A possibilidade de realização da

mastectomia profilática bilateral em mulheres portadoras da mutação germinativa no

gene TP53 foi proposta por THULL e VOGEL (2004), porém outros estudos não

foram feitos para avaliar o seu impacto. Neste estudo, as mulheres foram informadas

sobre a existência desta cirurgia como medida preventiva, porém a opção de realizar

a mastectomia profilática bilateral não foi aceita por nenhuma paciente. Devido à

variedade de tumores que podem acometer mulheres portadoras da síndrome, essa

estratégia foi considerada pelas pacientes como “mutilante” e “desnecessária”.

Os tumores pouco relacionados à síndrome, mas que ocorreram nas famílias

brasileiras também foram rastreados neste estudo. Foram realizados exames de

imagem e laboratoriais incluindo ultrassonografia de tireóide, exame considerado de

alta sensibilidade na detecção de nódulos suspeitos de tireóide, além de citologia

oncótica e ultrassonografia de vias urinárias, na busca de possíveis lesões renais. As

técnicas de endoscopia digestiva alta foram empregadas na busca de tumores

gástricos e colonoscopias foram realizadas visando à detecção precoce de pólipos

adenomatosos ou lesões malignas. A utilização destes métodos levou a detecção

precoce de um tumor de tireóide na mãe de um dos probandos deste estudo (Y23) e a

detecção de uma lesão pré-maligna colorretal (um pólipo com atipia de alto grau) no

probando Y10.

O rastreamento das crianças relacionadas às famílias deste estudo foi feito

pelos pediatras que acompanhavam previamente as crianças. O pediatra deve estar

ciente sobre o diagnóstico da família e da alta incidência de tumores na infância,

devendo adotar todas as medidas possíveis para o rastreamento de possíveis lesões

malignas que têm maior incidência na SLF e LFL na infância e adolescência, sem

que a criança seja submetida a estresse desnecessário. Apesar de ocorrerem tumores

malignos na infância, os testes genéticos para detecção da mutação no gene TP53

não são indicados para crianças ou adolescentes assintomáticos por não existirem

métodos para o diagnóstico precoce de tumores característicos desta síndrome nesta

faixa etária, sendo restritos para maiores de 18 anos (maioridade legal)

(ENSENAUER 2005).

Não foram verificadas intercorrências durante a realização dos exames de

rastreamento nos pacientes deste estudo e não foram realizadas cirurgias

desnecessárias devido a dúvidas diagnósticas. Com a utilização destes métodos

diagnósticos de forma adequada e a sua realização em laboratórios de alta

confiabilidade os riscos aos quais os pacientes estão submetidos tornam-se mínimos

perante as possibilidades do rastreamento precoce de tumores malignos.

Os dados expostos mostram a importância da realização da história familiar

detalhada em todos os indivíduos que apresentem neoplasias malignas e

principalmente uma investigação detalhada em famílias que apresentem múltiplos

tumores em idade precoce. A SLF e a sua variante LFL são consideradas raras e sua

incidência não é estimada na população, mas deve-se considerar a possibilidade de

um sub-diagnóstico. O estudo detalhado das famílias ao longo do tempo pode

aumentar seu diagnostico, esclarecer o espectro tumoral e fornecer informações

importantes sobre a evolução e historia natural dos tumores apresentados. O

aconselhamento genético e o rastreamento preventivo irão fornecer as famílias o

suporte necessário para lidar com a doença e poderão diminuir significativamente o

impacto e a morbimortalidade relacionada com tal entidade.

6 CONCLUSÕES

• Este estudo é a primeira descrição na América Latina da prevalência de

mutações germinativa no gene TP53 e dos perfis tumorais de famílias que

preenchem os critérios diagnósticos da SLF/LFL.

• Foram detectadas mutações germinativas no gene TP53 em 13 famílias

brasileiras (28,9%) com o diagnóstico clínico da SLF/LFL dentre as 45

estudadas, representando 4,6% de todas as mutações já descritas na literatura.

• A taxa de detecção de mutações nas famílias que preenchiam os critérios

clássicos da SLF foi de apenas 11% (1/9), valor menor do que o relatado na

literatura (50 a 70%).

• As mutações germinativas no gene TP53 encontradas nas famílias com

diagnóstico clínico de LFL deste estudo aumentam em 10,2% o número de

todas as famílias LFL com a mutação detectada descritas no banco de dados

do IARC. Verificou-se a alta incidência de mutações nas famílias que

preencheram os critérios de Birch (41,8%) e os critérios de de Eeles (31,8%).

• Todas as 13 mutações germinativas encontradas eram transições de G para A,

sendo que 12 (91,7%) eram do tipo missense e uma em sítio doador de

splicing do íntron 6.

• A mutação no códon 245 (G245S) foi detectada em duas famílias distintas e

não relacionadas. Quatro outras famílias avaliadas apresentaram mutações

distintas nos códons 173 (V173M), 197 (V197M), 213 (R213Q) e 244

(G244D).

• Uma mutação específica, R337H, foi detectada em taxas elevadas nas

famílias brasileiras com LFL, representando 46% (6/13) de todas as mutações

detectadas e 5,1% de todas as mutações já descritas em famílias LFL. As

famílias acometidas pela mutação R337H apresentaram amplo espectro

tumoral em diversas idades, demonstrando que esta mutação não está

relacionada somente ao desenvolvimento de tumores adrenocorticais na

infância, mas também com o desenvolvimento dos múltiplos tumores

envolvidos na síndrome.

• As famílias brasileiras portadoras da SLF e LFL apresentaram tumores

incomuns ao espectro tumoral desta síndrome. A ocorrência de carcinomas

papilíferos de tireóide e carcinomas de células renais, tumores pouco

freqüentes na SLF e LFL, e de tumores de papila duodenal e mola

hidatiforme, nunca antes relacionados como parte do espectro, foram

descritos nas famílias brasileiras, indicando a necessidade de inclusão destes

tumores como foco no rastreamento dessas lesões.

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ANEXOS

Anexo 1 Artigo original em peródico: “Achatz MIW, Olivier, Vettore A, Hainaut P.

Cancer letters, in press; MS. Ref. No: CAN-D-05-00532R1. (aceito em 22 dezembro

de 2005).

THE TP53 MUTATION, R337H, IS ASSOCIATED WITH LI-FRAUMENI

AND LI-FRAUMENI-LIKE SYNDROMES IN BRAZILIAN FAMILIES

Maria Isabel Waddington Achatz

1,2

, Magali Olivier

, Florence Le

Calvez

, Ghyslaine Martel-Planche

, Ademar Lopes

, Benedito Mauro

Rossi

, Patricia Ashton-Prolla

5-6

, Roberto Giugliani

5-6

, Edenir Inez Palmero

Fernando Regla Vargas

, José Claudio Casali Da Rocha

, Andre Luiz

Vettore

and Pierre Hainaut

Ludwig Institute for Cancer Research, São Paulo, Brazil;

Department

Oncogenetics, Hospital A.C. Camargo, São Paulo, Brazil;

Molecular Carcinogenesis

Group, International Agency for Research on Cancer, Lyon, France;

Department

Pelvic Surgery, Hospital A.C. Camargo, São Paulo, Brazil;

Hospital das Clínicas,

Porto Alegre, Brazil;

Department of Genetics, Federal University of Rio Grande do

Sul, Porto Alegre, Brazil;

Genetics Division, INCA, Rio de Janeiro, Brazil.

To whom requests for reprints should be addressed: P. Hainaut, Molecular

Carcinogenesis Group, International Agency for Research on Cancer, 150 cours

Albert Thomas, 69372 Lyon Cedex 08, France. Phone (33)-4-72 73 84 62; FAX

(33)-4-72 73 83 22; E-mail : [email protected]

Anexo 2 Artigo de revisão em periódico: “TP53 gene and Li-Fraumeni syndrome”.

Achatz MIW and Hainaut P. Applied Cancer Research 2005; 25(2):51-57.

TP53 Gene and Li-Fraumeni Syndrome

REVIEW ARTICLE

Maria Isabel Waddington Achatz,

MD; Pierre Hainaut,

PhD

1 Department of Oncogenetics, A.C. Camargo Cancer Hospital – São Paulo, Brazil

2 Chief of Molecular Carcinogenesis Cluster, International Agency for Research on Cancer - Lyon, France

Correspondence

Maria Isabel Waddington Achatz

Department of Oncogenetics

A. C. Camargo Cancer Hospital

Rua Professor Antonio Prudente 211

01509-900 São Paulo, Brazil

Tel: 55 11 32725181 Fax: 55 11 32077001

E-mail: [email protected]

Applied Cancer Research 2005; 25(2):51-57

ABSTRACT

Cancer is a disease that strikes most families and its

devastating effects bring suffering and instability to both

patient and family. Clustering of cancers in certain

families is even more devastating, leading medicine to

study its origin and ways to prevent it. Many cancer

syndromes have been identified due to the repeated

occurrence of specific tumors over a certain age-range.

The rare cancer predisposition Li-Fraumeni syndrome

(OMIM #151623; LFS) is transmitted in an autosomal

dominant pattern, which predisposes affected

individuals to an increased risk of developing a variety

of cancers at an early age, including childhood. The most

characteristic forms of cancers in LFS include soft-tissue

sarcoma, breast cancers, brain tumors, and adrenocortical

carcinomas. LFS is a dominantly inherited syndrome,

frequently associated with germline mutations in the

TP53 gene (OMIM #191170), which encodes protein p53.

This protein regulates cell cycle, apoptosis, DNA repair,

differentiation, senescence and development. Activation

of p53 prevents DNA replication and cell proliferation

when cells are subjected to stress that may disturb genetic

or genomic integrity. Thus, TP53 acts as a major tumor

suppressor gene by exerting simultaneous control on

many components of the molecular mechanisms of

carcinogenesis. Loss of p53 function may favor cancer

development and explains predisposition in germline

TP53 mutation carriers. This review will discuss the main

characteristics of TP53, its regulation, the consequences

of its inactivation in cancer, the germline TP53 mutation

related to Li-Fraumeni syndrome and strategies for

surveillance.

Key words: Li-Fraumeni syndrome. Genes, TP53. Genes,

p53.

INTRODUCTION

Almost every form of cancer in humans

has been reported to aggregate in families. The

occurrence of cancer clustering in certain families

is devastating, leading medicine to study its

origin and ways to prevent it. These familial

clusters could be inheritable mutated cancer-

susceptible gene, though other explanations

include odds association and exposure to

environmental carcinogens.

Cancer

predisposition syndromes have been identified

by the repeated occurrence of specific tumors

over a certain age-range.

In recent years, advances on novel

techniques of molecular genetics have located

and mapped some cancer-predisposing genes,

including the hereditary retinoblastoma (Rb)

gene, WT1 gene for Wilms’ tumor, the APC gene

of familial polyposis coli, BRCA 1 and 2 for

Familial Breast and Ovarian Cancer Syndrome

and the TP53 tumor suppressor gene in Li-

Fraumeni syndrome.

Li-Fraumeni syndrome is

an autosomal dominant disorder of multiple

cancers that are difficult to treat and often lethal.

This review discusses the main characteristics

of TP53, its regulation, the consequences of its

inactivation in cancer, the germline TP53

mutation related to Li-Fraumeni syndrome and

to the main perspectives in the cancer

management.

LI-FRAUMENI SYNDROME

In 1969, Li and Fraumeni reviewed

medical files and death certificates from children

with a histopathological diagnosis of

Applied Cancer Research, Volume 25, Number 2, 2005

rhabdomiosarcoma and found a high early onset

cancer incidence among their relatives.

They

presented different tumor types occurring over

a wide age range, including childhood cancer.

The first definition of the syndrome derived

from Li and Fraumeni’s work in 1988.

The Li-

Fraumeni syndrome (LFS; OMIM# 151623) was

then proposed as a cancer predisposition

syndrome and it was subsequently confirmed

by a series of epidemiological studies that

detected a similar tumor pattern among family

members.

5,6

It was characterized by the incidence of a

sarcoma, diagnosed before the age of 45 years,

associated with the presence of other early onset

tumors in first and second degree family

members, which included breast cancers, brain

tumors, and adrenocortical carcinomas (ADR)

(Table 1). Other cancers, such as leukemia, lung

cancer, skin melanoma, gastric, pancreatic, and

prostate cancer were also described to be

overexpressed in some families. In some cases,

germcell tumors, choroid plexus papilloma, and

Wilms’ tumor have been reported as part of the

spectrum. However, population-based data on

tumor incidence in Li-Fraumeni families are still

scarce and the exact spectrum of cancer diseases

is still a matter of debate. A number of families

present a tumor pattern that is reminiscent of

LFS without matching the classical criteria and

are termed Li-Fraumeni like (LFL)

(Table 2).

Several definitions of LFL have been proposed

(LFL-E1 and LFL-E2) (Table 3).

8,9

Table 1 - Clinical criteria for Li-Fraumeni syndrome

Proband with a sarcoma diagnosed before 45 years of age

AND

First degree relative with any cancer under 45 years of age

AND

First- or second-degree relative with any cancer under 45

years or sarcoma at any age

Table 2 - Clinical criteria for Li-Fraumeni Like

syndrome (Birch)

Proband with any childhood cancer or sarcoma, brain

tumor, or adrenocortical tumor diagnosed before 45 years

of age

AND

First- or second-degree relative with a LFS cancer (sarcoma,

breast cancer, brain tumor, adrenocortical tumor, or

leukemia) at any age

AND

First- or second-degree relative with any cancer under the

age of 60

LFS is a highly penetrant cancer

syndrome. A segregation analysis conducted on

families with LFS revealed 50% increased chance

to develop a tumor before 40-year old,

compared to 1% of the general population. It

has also demonstrated that 90% of the carriers

might present a tumor at the age of 60.

Cancer

patients in these families who survive the first

neoplasm are prone to develop second cancers,

particularly within the field of radiation

therapy. The most common childhood cancers

have been soft-tissue sarcomas in the first 5 years

of life and osteosarcomas in adolescence. Acute

leukemia and brain tumors also occur

throughout childhood and young adulthood,

whereas adrenocortical carcinomas occur

primarily in infancy. In young adults,

premenopausal breast cancer is, by far, the most

common neoplasm.

Clinically, the entire range

of cancers in the syndrome remains to be

defined.

Table 3 - Clinical criteria for Li-Fraumeni Like

syndrome (Eeles)

Eeles 1

Two different tumors that are part of extended LFS in first

or second degree relatives at any age (sarcoma, breast

cancer, brain tumor, leukemia, adrenocortical tumor,

melanoma, prostate cancer, pancreatic cancer);

Eeles 2

Sarcoma at any age in the proband AND two of the

following: (may be in the same individual)

Breast cancer at <50 years and/or brain tumor, leukemia,

adrenocortical tumor, melanoma, prostate cancer,

pancreatic cancer at <60 years or sarcoma at any age

The molecular basis of this familial

alteration remained unknown until its

connection to the TP53 tumor suppressor gene.

In 1990, five families who received a clinical

diagnosis of the Li-Fraumeni syndrome were

reported to show germline mutations in the TP53

tumor suppressor gene.

Subsequent studies

have found germline TP53 mutations in many,

but not all, Li-Fraumeni families.

The mutations

typically cluster in sequences that code for the

DNA binding domain of the p53 protein (see

below). These sequences are also the most

frequent sites for somatic TP53 mutations in

sporadic cancers. Failure to detect TP53

mutations in some families with LFS could be

due in part to the fact that mutations may occur

outside the coding, “hotspot” regions, thus

TP53 Gene and Li-Fraumeni Syndrome

Applied Cancer Research, Volume 25, Number 2, 2005

escaping detection by standard methods.

Another explanation is that the syndrome is

genetically heterogeneous, with TP53 mutations

accounting for only a fraction of Li-Fraumeni

families. Recent data show that 70% of LFS

families are attributable to germline mutations

in TP53, whereas 20% of LFL had a mutation

detected.

So far 280 families have been

identified as carriers of germline p53

mutations.

14,15

Despite intensive search, no other

gene has been hitherto associated with LFS/LFL.

Earlier reports that the CHK2 gene may carry

germline mutations have not been substantiated.

These mutations are now considered as common

polymorphisms that may be associated with

predisposition to breast cancer.

THE TP53 GENE

The TP53 tumor suppressor gene

(chromosome 17p13; OMIM#191170) encodes a

ubiquitous phosphoprotein involved in many

overlapping cellular pathways that control cell

proliferation and homeostasis, such as cell cycle,

apoptosis, and DNA repair. The coding

sequence contains five regions showing a high

degree of conservation in vertebrates, and

comprises 10 coding exons.

The gene contains

a very long 5' region containing a non-coding

exon 1 and intron 1 over about 10 kilobase pairs.

TP53 mutations appear to be an important

alteration in the complex process of

carcinogenesis being the most common site of

somatic mutations in human cancers. Somatic

TP53 genetic alterations are frequent in a variety

of human sporadic cancers, with frequencies

varying from 10% to 60%, depending on the

tumor type or population group. They are

particularly frequent in cancers associated with

exposure to environmental or occupational

carcinogens (e.g. lung cancers in smokers,

bladder cancers in exposed industry workers,

among other events). Overall, the types and

distribution of germline and somatic TP53

mutations are very similar, with a majority of

missense mutations in the DNA-binding domain

encoded by exons 4 to 9 of the TP53 gene.

Splice-site mutations, large deletions and

complex insertion-deletion may also be

found.

18,19

When present in the germline, TP53

mutation is considered a first-hit in Knudson’s

two-mutation model of hereditary cancer

development. However, the fate of the

remaining, wild-type allele during tumor

development is poorly understood. In some

instances, this wild-type allele is lost or mutated

in cancers, fulfilling Knudson’s paradigm. In

other cases, this allele persists, but its biological

activity seems to be extinguished, perhaps as

the result of overexpression and stabilization of

the product of the mutant allele. This hypothesis

is supported by biological evidence showing that

accumulation of mutant p53 protein can

inactivate wild-type p53 in a dominant-negative

manner. There is emerging evidence that the

nature and position of the germline mutation in

TP53 may, to some degree, determine cancer

phenotypes in affected carriers. For example,

mutations in a specific region of the DNA

binding domain encoding protein loops in direct

contact with DNA seems to carry a significantly

higher predisposition to brain cancers. In

contrast, mutations that predispose to adrenal

cortical tumors are frequently located outside

of the major “hotspots” area. Moreover, it is

most likely that other, still unknown genes may

act as modifiers, explaining the variations in

tumor patterns.

Recently, a specific germline mutation

falling into exon 10, encoding the

oligomerization domain of p53, R337H (CGC to

CAC at codon 337), has been reported in

Brazilian children with ADR but no documented

familial history of other cancers.

20,21

Structural

and functional studies have identified that

R337H mutant proteins had a pH-dependent

defect in the oligomerization domain, making

them inactive only in conditions of increased

intracellular pH. It was postulated that arginine

337 is located in the dimerization motif of the

p53 protein. Its replacement by histidine alters

hydrogen bonding between two p53 monomers

and hampers dimerization in a pH-dependent

manner. At pH 7, the histidine is protonated

and participates in hydrogen bonding. At pH 8,

however, the histidine is deprotonated,

preventing formation of the hydrogen bond.

This would result in disruption of p53 oligomers

and inactivation of its binding ability capacity

to bind with high affinity to p53-response

elements in the regulatory regions of p53-target

genes. The unusual prevalence of this mutation

in Brazilian families appears to be due to a

founder effect.

Achatz and Hainaut

Applied Cancer Research, Volume 25, Number 2, 2005

This observation has led to the speculation

that R337H may predispose to cancer

development only in tissues in which a rise in

intracellular pH is a major growth or survival

regulatory signal. Such a rise in pH occurs in

apoptotic cells and may play a role in the

extensive tissue remodeling that occurs through

selective apoptosis in adrenal cortical glands

during pre- and post-natal development. It was

postulated that this conditional mutant might

only predispose to a narrow spectrum of cancers

within the LFS spectrum. However, so far no

studies have reported whether this mutant is

also present in families that match LFS or LFL

definitions. Interestingly, the same mutant has

been described in a British family matching

LFS/LF criteria.

Over 15 polymorphisms are identified in

human population, with allele frequencies that

vary with ethnic origin.

One of them affects

the coding sequence at codon 72, specifying

either an arginine or a proline. The Arg allele is

the most common in the western population

(allele frequencies ranging from 0.6 to 0.8) but

the prevalence of the Pro allele seems to increase

according to a North-South gradient, so that

the Pro allele is the most frequent one near the

equator and in indigenous populations of the

Southern hemisphere.

Increasing evidence

states that this polymorphism may have a

functional impact on cancer susceptibility and

response to therapy.

Two genes related to TP53

have been identified on chromosome 1p36

(TP73, OMIM 601990) and on chromosome 3p28

(TP63, OMIM 603273). Both genes encode

proteins with high homology to p53 in terms

of overall structure.

To date, no association

has been found between these genes and familial

cancer.

P53 PROTEIN

After 25 years since first described, the

p53 protein has been shown to play a key role

in both tumor suppression and aging and it has

been one of the main targets on molecular cancer

research. The p53 protein is a transcription

factor constitutively expressed in most cell types

and tissues and activated in response to various

stress signals, in particular genotoxic stress. Due

to its rapid turnover (5-20 minutes) the protein

does not accumulate unless it is stabilized in

response to a variety of intracellular and

extracellular stimuli.

Signals that activate p53 include diverse

types of DNA damage (strand breaks, bulky

adducts, oxidation of bases), blockade of RNA

elongation, hypoxia, depletion of microtubules,

ribonucleotides or growth factors, modulation

of cell adhesion and alteration of polyamine

metabolism.

Oncogenic, genotoxic, and non-

genotoxic stress interact with main p53 co-

factors. The main regulator of p53 protein

activity is Mdm-2, a transcriptional target of

p53. The p53/Mdm-2 complex is regulated by

p14

Arf

(Alternative Reading Frame), a 14 kD

protein encoded by an alternative reading

frame of CDKN2A, the gene that encodes the

Figure 1 - Pathways of p53 activation

TP53 Gene and Li-Fraumeni Syndrome

Applied Cancer Research, Volume 25, Number 2, 2005

tumor suppressor p16 (Figure 1).

Once activated, p53 exerts its effects

through two major mechanisms: transcriptional

control (activation or repression of specific

genes) and interference with the function of

other protein through complex formation. Over

4800 genes have been identified as containing a

p53-response element in regulatory regions.

the cellular level, activation of p53 generally

induces either cell-cycle arrest (mostly in G1

and/or G2/M) or apoptosis. However, it must

be realized that apoptosis is the preferential

response in primary cells and that when cell-

cycle arrest is induced, it is generally a

permanent one, followed by cell senescence.

In other words, activation of p53 in a normal

cell generally results in its permanent deletion

from the pool of cells with proliferative capacity,

providing a drastic way for suppressing any cell

that carries a risk of oncogenic transformation.

These functional and biological features

provide a rationale to understand the

consequences of inheritance of a germline TP53

mutation. Subjects with only one functional TP53

allele are at high risk of developing multiple

cancers when the remaining allele becomes

inactivated by various mechanisms. Loss of p53

function would then create a form of “mutator

phenotype”, allowing cells to replicate damaged

DNA and accelerating their progression towards

cancer.

SURVEILLANCE

Both patients with clinical diagnosis of

LFS/LFL and TP53 carriers should be advised

to seek early medical attention for signs and

symptoms of cancer. There are no established

surveillance measures or widely agreed

guidelines for mutation screening and

management of LFS/LFL patients but

surveillance strategies have been suggested for

individuals at risk.

Patients should be aware

of the limitations of screening for many cancers

associated with the syndrome. Breast cancer is

the most common tumor found in women with

LFL/LFS and breast monitoring has been shown

to be effective in reducing morbidity or

mortality among individuals at risk. Training

and education in breast self-exam should be

addressed at age 18. Regular semiannual clinical

breast exams should be performed starting at

age 20 to 25, or 10 years before the earliest

known breast cancer in the family; or yearly

since younger age. Routine annual mammograms

and mammary ultrasounds should begin in

women over age 25 years, but have not been

proven to be beneficial for younger women with

LFS/LFL.

Controversy exists regarding the use

of routine mammograms because of possible

radiation sensitivity associated with TP53

mutations.

A specialist on a case-by-case basis

should address other investigational breast

imaging possibilities such as MRI, as wells as

shorter intervals.

Furthermore, LFS/LFL patients and their

possible carriers must receive targeted

surveillance based on individual family

histories. Due to the multitude of tumors that

are included in the syndrome, patients should

be educated regarding signs and symptoms of

cancer and complaints should be thoroughly

investigated. Annual comprehensive physical

exam starting in younger adults with suspicion

for rare tumors and second malignancies in

cancer survivors should be addressed.

Additional organ-targeted surveillance based on

family history is of great value, such as

colonoscopies at regular intervals if a relative

has had colorectal cancer. Full-body MRI

examination or PET scan has been suggested.

However, no evidence supporting the benefit

of such testing exists and it is possible that it

may lead to unnecessary biopsies or other

follow-up tests. Perhaps most importantly, at-

risk individuals and their physicians are urged

to pay greater attention to lingering symptoms

and illnesses, particularly headaches, bone pain,

or abdominal discomfort, and to schedule

diagnostic tests promptly.

Patients should receive genetic counseling

and advice about risk to relatives and possibility

of genetic testing. In 1992, an International

Consortium of clinicians and researchers

convened and developed recommendations

regarding genetic testing for germline TP53

mutations.

These recommendations state that

testing should be done voluntarily with

appropriate pre- and post-test.

For at-risk children, pediatricians should

be warned about the syndrome and apprised

of the risk of childhood cancer in affected

families. They must be evaluated on annual com-

plete physical examination and an additional

Achatz and Hainaut

Applied Cancer Research, Volume 25, Number 2, 2005

organ-targeted surveillance based on family

history should be considered.

Individuals with TP53 mutations should

avoid or minimize exposure to radiation

whenever possible.

The TP53 gene is

recognized as playing a crucial role in genomic

repair.

TP53-deficient mice are prone to early

formation of multiple, spontaneous cancers and

p53-deficient mouse cells have been shown to

be radiation sensitive and prone to cancer.

Radiation-induced second malignancies have

been reported among individuals with TP53

mutations.

36-38

A high incidence of exposure to

genotoxic agents, such as to pesticides, has been

reported in some families but to date, no

correlation has been established.

CONCLUSION

After 25 years of research and over 30 000

publications, studies on TP53 have had a major

impact on our understanding on cancer

molecular biology . The challenge for the years

to come is to turn this knowledge into advances

in cancer prevention, detection, prognosis and

therapy. New discoveries about the function and

control of p53 continue to emerge every month

and attempts to exploit the system to develop

better therapeutics and diagnostics are

beginning to be successful in clinics. Current

understanding of LiFraumeni syndrome and its

association with germline p53 mutations is

incomplete. Additional studies are needed for

cancer spectrum in the syndrome, the role of

environmental carcinogens in cancer

development among family members, possible

genetic heterogeneity and other methods, age-

specific penetrance of the mutant gene, and rare

p53 polymorphisms that might be mistaken for

functional mutations.

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Achatz and Hainaut

Anexo 3 Capítulo de livro: “Síndrome de Li-Fraumeni”. Organizadores: Carlos Gil

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315

Síndromes de Câncer Hereditário

Simone Noronha da Silva

29.1

Síndrome de Câncer de Mama e Ovário Hereditários

INTRODUÇÃO

Dentre todos os casos de câncer de mama, cerca de 10 a

20% dos tumores são hereditários. O BRCA1 e o BRCA2 são

genes supressores de tumor descritos como causadores da

síndrome do câncer de mama e ovário hereditários (SMOH).

Além deles, acredita-se que existam outros genes envolvidos

na etiologia da SMOH, pois uma percentagem das famílias

com diagnóstico clínico presuntivo da síndrome não apresen-

ta mutações no BRCA1 ou BRCA2.

O reconhecimento de grupos de alto risco é fundamental

para que estratégias de rastreamento, diagnóstico precoce e

prevenção possam ser desenvolvidas e oferecidas a estas

famílias. Mulheres portadoras de mutações no BRCA1 e

BRCA2 têm um altíssimo risco de desenvolverem câncer de

mama e de ovário. Homens portadores de mutações no

BRCA2 possuem um risco aumentado de desenvolverem cân-

cer de mama e de próstata em idade jovem

2,8

. Descreve-se

também um aumento da incidência de outros tumores nas fa-

mílias com mutações no BRCA2 como melanoma e câncer de

pâncreas

. Assim, as famílias de alto risco necessitam de pro-

gramas de rastreamento e prevenção específicos, conforme

descrito na Tabela 29.1.1.

DEFINIÇÃO DA SÍNDROME DE CÂNCER DE

MAMA E OVÁRIO HEREDITÁRIOS (SMOH)

A definição de SMOH varia de instituição para insti-

tuição. De acordo com a NCCN (National Comprehensive

Cancer Network), disponível na Internet no sitehttp://

www.nccn.org/physician_gls/f_guidelines.html, os critérios

para diagnóstico presuntivo da síndrome são os seguintes:

• Membro de uma família com diagnóstico de certeza de

SMOH.

• História pessoal de câncer de mama e mais uma das

características abaixo:

— Diagnóstico com menos de 40 anos, com ou sem his-

tória familiar.

— Diagnóstico com menos de 50 anos, com um parente

próximo com câncer de mama ou câncer de ovário.

— Diagnóstico em qualquer idade, com pelo menos dois

parentes próximos com câncer de ovário em qualquer

idade ou câncer de mama especialmente se um dos

casos for diagnosticado antes dos 50 anos ou se o

tumor for bilateral.

— Diagnóstico de câncer de mama masculino em um pa-

rente próximo.

— História pessoal de câncer de ovário.

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316

— Se for descendente de Judeus Ashkenazi com diag-

nóstico antes dos 50 anos, mesmo sem história fami-

liar; ou em qualquer idade se houver história de cân-

cer de mama e ovário em parentes próximos.

• História pessoal de câncer de ovário e mais uma das

características abaixo:

— Um ou mais parentes próximos com câncer de ovário.

— Um ou mais parentes próximos com câncer de mama

com menos de 50 anos ou com tumor bilateral.

— Dois ou mais parentes próximos com câncer de mama.

— Um ou mais casos de câncer de mama em homens.

— Caso seja descendente de Judeus Ashkenazi, não é

necessária história familiar.

• História pessoal de câncer de mama em homem e mais

uma das características abaixo:

— Um ou mais parente próximo com câncer de mama (ho-

mem ou mulher).

— Um ou mais parente próximo com câncer de ovário.

— Caso seja descendente de Judeus Ashkenazi, não é

necessária história familiar.

• Apenas história familiar:

— Um ou mais parentes próximos que preenchem os cri-

térios acima.

Nesta classificação, considera-se como parentes próximos

os parentes de primeiro, segundo e terceiro grau e deve-se

levar em conta sempre o mesmo lado da família (materna ou

paterna). Como os critérios são muito abrangentes, uma aná-

lise cuidadosa da história familiar deve ser feita para se reduzir

o número de casos com diagnóstico falso-positivo.

CARACTERÍSTICAS E FUNÇÃO DOS GENES BRCA1

E BRCA2

O gene BRCA1 está localizado no cromossomo 17, sen-

do um gene grande que contém uma região codificadora com

5.592 pares de bases. O gene BRCA2 está localizado no cro-

mossomo 13, e é maior ainda que o BRCA1, tendo uma região

codificadora com 10.254 pares de bases.

A função dos genes BRCA1 e BRCA2 ainda não é com-

pletamente conhecida. Sabe-se que o BRCA1 participa do

processo de proliferação das células epiteliais de mamíferos

em resposta à estimulação hormonal, no processo de apop-

tose, controle da recombinação e manutenção da integrida-

de do genoma após ligar-se com proteínas relacionadas a es-

tas atividades. Há evidências da interação da proteína

BRCA1 com o Rad51, que estaria relacionado com a função

de manter a integridade do genoma celular

O gene BRCA2 atua como um supressor de tumores com

atividades relacionadas à ativação da transcrição assim como

envolvimento no sistema de reparo do DNA

. A proteína

BRCA2 também interage com o Rad51

e a proteína Dss1. O

complexo BRCA2 e Dss1 se liga à hélice simples de DNA e

isto pode ser a maneira de transportar o Rad51 até os pon-

tos onde haja defeitos no DNA

MUTAÇÕES FUNDADORAS

Algumas mutações são altamente prevalentes em popu-

lações específicas, e são conhecidas como mutações funda-

doras. Estas mutações ocorreram há muito tempo (talvez sé-

culos) e se mantêm restritas até hoje a um determinado gru-

po étnico por motivos geográficos ou religiosos. Os judeus

Ashkenazi são o melhor exemplo disto, e possuem três mu-

tações fundadoras bem conhecidas que são 185 delAG e

538insC no BRCA1 e 6174delT no BRCA2

, porém cerca de

20% destes indivíduos são portadores de outras mutações

deletérias que não estas

. Na população holandesa, foram

descritas três mutações fundadoras que são grandes dele-

ções no BRCA1

. É interessante notar que grandes deleções

ou translocações não são diagnosticadas pelo método de

seqüenciamento, o que pode ser responsável pelo grande

número de famílias com diagnóstico clínico de SMOH, porém

sem a detecção de mutações no BRCA1 ou BRCA2.

Quando se pesquisa a presença de mutações em um gru-

po étnico onde as mutações fundadoras são muito prevalen-

tes, pode-se iniciar a pesquisa por elas para, em um segun-

do momento, caso não estejam presentes, fazer-se o estudo

do restante do gene.

CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS

Mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 apresentam carac-

terísticas clínicas diversas, e estas características podem

orientar por qual gene deve-se iniciar a pesquisa de muta-

ções.

Mulheres portadoras de mutações no BRCA1 têm o ris-

co de 85% de desenvolvimento de câncer de mama até os 70

anos e 63% de risco de desenvolvimento de câncer de ová-

Tabela 29.1.1

Recomendações para Famílias Portadoras da Síndrome de Câncer de Mama e Ovário Hereditários

Orientação quanto ao teste genético e risco familiar.

Auto-exame das mamas a partir dos 18 anos.

Exame médico semestral a partir dos 20 anos (exame das mamas).

Mamografia a partir dos 25 anos (anual ou semestral).

Rastreamento anual para câncer de ovário a partir dos 30 anos.

Orientação quanto medidas preventivas (mastectomia profilática, ooforectomia profilática, tamoxifeno).

Orientação quanto ao exame das mamas em homens.

Rastreamento precoce para câncer de próstata.

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

317

rio

11,14

. Os tumores causados por mutações no BRCA1 apre-

sentam uma maior incidência de receptores de estrógeno e

progesterona negativos e p53 positivos

. Mulheres portado-

ras de mutações no gene BRCA2 têm um risco de 85% de de-

senvolvimento de câncer de mama até os 70 anos e 27% de

risco de desenvolvimento de câncer de ovário

11,14

. Homens

portadores de mutações no gene BRCA2 têm aumento de in-

cidência de câncer de mama e estudos sugerem que também

exista um aumento na incidência de câncer de próstata

6,8

. As

mutações no BRCA2 estão presentes em cerca de 10% das

famílias com câncer de pâncreas hereditário, ou seja, famíli-

as com pelo menos dois parentes de primeiro grau com cân-

cer de pâncreas e que não preenchem os critérios para diag-

nóstico de outras síndromes hereditárias

Está descrito que há um efeito antecipatório no surgimen-

to dos tumores relacionados à SMOH, ou seja, a cada gera-

ção os tumores tendem a surgir em idade mais jovem. Em al-

guns casos de famílias de alto risco, recomenda-se que os

exames de rastreamento sejam iniciados dez anos antes do

caso mais jovem de câncer que ocorreu na família, devido a

este efeito antecipatório.

ACONSELHAMENTO GENÉTICO

O aconselhamento genético e a avaliação de risco são fei-

tos baseados na história pessoal e familiar do indivíduo, e

devem levar em conta não só dados referentes a tumores ma-

lignos porque algumas síndromes são caracterizadas por al-

terações benignas associadas às neoplasias.

Durante o processo de avaliação, alguns dados são su-

gestivos de que haja um componente hereditário na etiologia

dos tumores em determinada família: casos de câncer de in-

divíduos jovens, vários casos de câncer na família, agrupa-

mento de tumores raros. Além disto, existem outras síndro-

mes com alta incidência de câncer de mama que devem ser

lembradas no momento da análise do caso. A Tabela 29.1.2

resume alguns destes diagnósticos diferenciais.

Durante o processo de aconselhamento genético e ava-

liação de risco, podemos estimar a probabilidade de um indi-

víduo ser portador de uma mutação deletéria ou de vir a de-

senvolver câncer através de modelos matemáticos. Alguns

modelos como o modelo de Gail

e o modelo de Claus

foram

desenhados para a estimativa do risco de desenvolvimento

de câncer de mama. Já o BRCAPRO

, por exemplo, foi desen-

volvido para estimar a probabilidade de que o indivíduo seja

portador de uma mutação. Cada um destes modelos matemá-

ticos tem suas limitações e vantagens, e por isto a avaliação

do risco de cada indivíduo deve ser feita por um profissional

que esteja familiarizado com eles e que possa decidir qual o

melhor método a ser usado em cada caso. Além de modelos

matemáticos, existem também tabelas com a prevalência de

mutações em determinadas populações, que podem ajudar na

estimativa da probabilidade de o indivíduo ser portador de

uma mutação.

Indivíduos com alta possibilidade de serem portadores de

mutações devem ser orientados quanto à possibilidade de

realização do teste genético, seus riscos, benefícios e limita-

ções. Indivíduos considerados de alto risco, mas que por

qualquer motivo não façam o teste genético ou que recebem

resultados inconclusivos ou indeterminados do teste, devem

ser acompanhados como portadores de mutações.

Mulheres com alto risco para desenvolverem câncer de

mama, mesmo que consideradas como tendo baixa probabi-

lidade de portarem uma mutação, devem receber recomenda-

ções quanto às medidas de diagnóstico precoce e prevenção.

Tabela 29.1.2

Diagnóstico Diferencial entre SMOH e outras Síndromes de Predisposição Genética ao Câncer de Mama e Ovário de

Acordo com Tumores Apresentados na Família

Associação de tumores tipicamente relacionados ao

BRCA1

BRCA2

- Câncer epitelial de ovário em qualquer idade.

- Câncer de mama e de ovário em uma mesma pessoa.

- Câncer de mama em homens.

- Carcinomatose peritoneal como sítio primário e câncer de tuba uterina.

Outros tumores e diagnóstico diferencial com outras síndromes

- BRCA1

: colo-retal, melanoma, leucemia, linfoma.

- BRCA2: pân

creas, próstata, estômago, colo-retal, cabeça e pescoço, linfoma, melanoma.

- Li-Fraumeni (gene TP53):

qualquer caso de câncer de mama em idade jovem (≤ 25 anos) em uma família com sarcoma, tumor

cerebral, leucemia, linfoma, carcinoma de laringe, carcinoma de cortical da adrenal.

- Síndrome de Cowden (gene PTEN): qualq

uer caso de câncer de mama em idade jovem (≤ 25 anos) em família com história de

patologia benigna ou maligna de tireóide, meningeoma, leiomioma, câncer de endométrio; lesões características de pele como pápulas

faciais múltiplas, queratose acral e palmoplantar, triquelimomas faciais, lipomas subcutâneos. Hamartomas do cólon e doença mamária

benigna são achados comuns desta síndrome.

- Síndrome de Peutz-Jeghers

(gene

LKB1/STK11

): máculas pigmentadas nos lábios, mucosa oral, conjuntiva, área periorbital e

dedos. Os pacientes também apresentam múltiplos pólipos intestinais hamartomatosos, alguns dos quais com achados

adenomatosos, mas não há evidência suficiente para uma associação com câncer colo-retal. Existe um aumento do risco para

câncer de intestino delgado, principalmente duodeno, e também tumores do cordão sexual, melanoma, câncer de pâncreas, câncer

gástrico e câncer de mama. Alterações germinativas no gene

STK11/LB1

têm sido identificadas em algumas famílias.

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

318

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Benedito Mauro Rossi

29.2

Câncer Colo-retal Hereditário sem Polipose  HNPCC

INTRODUÇÃO

O câncer colo-retal (CCR) é o sexto em incidência no Bra-

sil. Se considerarmos apenas a região Sudeste é o segundo

mais freqüente no homem e o terceiro na mulher

Não existem dados sobre a incidência da síndrome de

câncer colo-retal hereditário sem polipose (do inglês,

hereditary non-polyposis colon cancer ou HNPCC, também

conhecida como síndrome de Lynch) no Brasil. Porém, se

considerarmos a literatura internacional, esse número está

entre 3 e 12% de todos os casos de CCR

7,10

GENES ENVOLVIDOS

O HNPCC é causado pela ocorrência de mutação germi-

nativa transmitida de forma autossômica dominante em um

dos genes de reparo do DNA: hMSH2 (2p16); hMLH1

(3p21); hPMS1 (2q31-33); hPMS2 (7p22); hMSH6/GTBP

(2p16). Mais recentemente, relatos de outros genes de repa-

ro envolvidos têm sido descritos, como o hMSH3

4,6

Os genes de reparo agem como controladores de qualida-

de, mantendo a fidelidade do DNA na divisão celular, por

meio de mecanismos que identificam, retiram e corrigem os

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

319

erros nas seqüências de bases. Esses erros podem ocorrer

por pareamento errado entre as bases ou por falha da enzi-

ma DNA polimerase, causando alças de inserção/deleção de

bases (IDLs). As IDLs ocorrem por deslizamento errôneo da

enzima na fita molde de DNA, geralmente em seqüências de

bases repetitivas, como, por exemplo, os microssatélites. Por

isso, mais de 90% dos pacientes com CCR em famílias de

HNPCC apresentam instabilidade de microssatélites (do in-

glês, microsatellite instability ou MSI) nos tumores.

Dois grupos principais de proteínas estão envolvidos no

processo de reparo em humanos: mutSh e mutLh. O modelo

postulado para a correção dos erros consiste de três passos

básicos: reconhecimento do erro e formação do “reparosso-

mo”, degradação da fita de DNA contendo o erro, e, finalmen-

te, realização do reparo. Um primeiro heterodímero chamado

de hMutSa, formado por proteínas do grupo de homólogos

de mutS (MSH), hMSH2 e hMSH6, tem sua ação principal-

mente nos erros de pareamento entre as bases. Um segundo

heterodímero chamado de hMutSb, formado por hMSH2 e

hMSH3, também pode iniciar o processo; porém, com ação

principalmente nas IDLs. Por isso, os mecanismos de ação

desses dois heterodímeros são complementares

. O passo

seguinte nesse processo é desempenhado pela atividade da

enzima ATPase, codificada na metade carboxi-terminal dos

homólogos mutS. O ganho de um fosfato (ADP > ATP) no

heterodímero hMutSa causa uma mudança conformacional no

mesmo, transformando-o em uma espécie de braçadeira que

corre sobre a dupla fita de DNA a ser reparada (sliding

clamp) desempenhando assim sua função

. A proteína

hMSH6 parece ter papel fundamental nessa fase, que ainda

não é bem conhecida. Outras proteínas parecem também ser

parte do processo nessa fase, como as provenientes dos ho-

mólogos mutL (MLH) e dos PMS (postmeiotic segregation),

além dos antígenos nucleares de proliferação celular (PCNA)

RPA e RFC, e das exo/endonucleases EXO1 e FEN1

. Outro

heterodímero chamado hMutLα, formado pelas proteínas

hMLH1 e hPMS2, também parece estar envolvido com o me-

canismo de reparo, assim como o hMutLβ (proteínas hMLH1

e hPMS1); porém, ainda com mecanismos de ação pouco es-

clarecidos em humanos

. Caso os mecanismos de reparo não

sejam suficientes para corrigir os erros de replicação do DNA,

a maquinaria de apoptose é ativada, levando a célula à mor-

DIAGNÓSTICO CLÍNICO

O diagnóstico do HNPCC é clínico. Por isso, médicos que

lidam com pacientes portadores de CCR e tumores relaciona-

dos ao HNPCC devem conhecer as características clínicas da

doença.

As principais características do HNPCC são

• Diagnóstico de câncer em idade precoce, em torno dos

47 anos de idade;

• CCR com predominância pelo lado direito do cólon,

em torno de 70% dos casos;

• Associação com CCR metacrônico, em torno de 45%

em dez anos, se houver cólon remanescente após a

primeira cirurgia;

• Associação com tumores extracolônicos, incluindo

adenocarcinoma de endométrio, intestino delgado, es-

tômago e ovário, e carcinoma de células transicionais

de vias excretoras renais.

Além das características clínicas descritas, alguns acha-

dos anátomo-patológicos do CCR em HNPCC são comuns,

tais como: células em anel de sinete, componente mucinoso

e predomínio de lesões indiferenciadas.

Em 1991, com a intenção de padronização internacional

do diagnóstico clínico de HNPCC, o Grupo Colaborativo In-

ternacional (ICG/HNPCC) publicou os chamados Critérios de

Amsterdam I

(Tabela 29.2.1).

Os Critérios de Amsterdam I tiveram aceitação internacio-

nal e são de extrema valia para a padronização do diagnósti-

co clínico de HNPCC. Porém, também foram criticados pela

exclusão dos tumores extracolônicos. Por isso, em 1999, o

mesmo ICG/HNPCC acrescentou alguns tumores extracolôni-

cos nos Critérios iniciais

, chamados agora de Critérios de

Amsterdam II (Tabela 29.2.2).

Tumores de estômago e ovário não foram incluídos, se-

gundo os autores, por sua baixa incidência dentro da síndro-

me. É interessante notar que não há menção sobre a neces-

sidade do diagnóstico de CCR dentro de uma família para o

diagnóstico do HNPCC, bastando o preenchimento dos Cri-

térios de Amsterdam com tumores extracolônicos.

Claro que o espectro de diagnóstico do HNPCC foi am-

pliado com os novos Critérios de Amsterdam; porém, ainda

existem algumas críticas, e a principal delas é relativa à difi-

culdade de diagnóstico clínico principalmente em famílias

pequenas, com poucos descendentes, fato comum na Euro-

pa, por exemplo. Nesses casos, para o diagnóstico clínico ser

realizado, teríamos que esperar muito tempo, retardando, por-

tanto, a orientação e o acompanhamento familiar.

Dentro desse enfoque, o Instituto Nacional de Câncer

dos Estados Unidos (NCI) já havia publicado, em 1997, os

Critérios de Bethesda

, não com o intuito de caracterizar o

diagnóstico clínico de HNPCC, mas sim de indicar a pesqui-

Tabela 29.2.1

Critérios de Amsterdam I

Pelo menos três membros de uma mesma família com CCR.

Um dos membros parente em primeiro grau dos outros dois.

Pelo menos duas gerações acometidas.

Pelo menos um dos membros com CCR e idade menor que 50

anos.

Exclusão de polipose adenomatosa familiar.

Tabela 29.2.2

Critérios de Amsterdam II

Mesmos Critérios de Amsterdam I.

Adenocarcinoma de endométrio.

Adenocarcinoma de intestino delgado.

Carcinoma de células transicionais de vias excretoras renais.

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

320

sa molecular da síndrome, por meio de MSI, em pacientes com

suspeita HNPCC, com ou sem antecedentes familiares. A pes-

quisa de MSI serve como um teste de rastreamento, para

posterior seqüenciamento dos principais genes de reparo

(MMR) nas famílias onde estiver presente, pois a instabilida-

de, como já vimos, ocorre na grande maioria dos casos de

HNPCC (Tabela 29.2.3).

INDICAÇÃO DE TESTES DE PREDISPOSIÇÃO

Pacientes com preenchimento dos Critérios de

Amsterdam para diagnóstico clínico de HNPCC, ou Critérios

de Bethesda e MSI, devem ter indicação de seqüenciamento

dos genes hMLH1 e hMSH2. Se estes forem normais, também

devem ter a indicação do seqüenciamento de hMSH6.

O primeiro teste de predisposição dentro de uma família

com diagnóstico clínico de HNPCC deve ser realizado em um

indivíduo com tumor (probando), de preferência o mais jovem

da família. Esse procedimento deve ser realizado porque, se

a família tem o diagnóstico clínico de HNPCC e aquele mem-

bro é portador de câncer, é nele que temos a maior probabili-

dade de detecção da mutação, ou seja, se a mutação for

detectável, será nesse indivíduo

. Seguindo ainda nesse

exemplo, se a mutação for detectada nesse indivíduo, teremos

um resultado positivo do teste genético, com uma família clí-

nica e molecularmente caracterizada como HNPCC. Nessa si-

tuação, poderemos pesquisar a mesma mutação, característica

dessa família, nos demais membros, e diagnosticar quais os

indivíduos assintomáticos, mas portadores da predisposição

ao câncer. Com isso, a indicação da realização dos exames de

seguimento fica restrita aos portadores de mutação nestes ge-

nes de predisposição. A penetrância descrita em HNPCC é em

torno de 80%, e essa é a probabilidade de o genótipo trans-

formar-se em fenótipo tumoral para os indivíduos portadores

da mutação

. Membros com teste negativo, ou seja, sem a pre-

disposição detectada na família, ficam liberados do seguimen-

to; porém, recomendamos uma colonoscopia a cada cinco

anos para esses indivíduos, principalmente após os 50 anos.

Se imaginarmos essa mesma família citada como exemplo,

mas sem a detecção da mutação nos genes de reparo no

probando (primeiro membro com câncer testado na família),

o teste de predisposição, nesse caso, é chamado de incon-

clusivo, pois não terá utilidade para rastrear os membros por-

tadores da predisposição e assintomáticos. Nessa situação,

a família continua sendo caracterizada clinicamente como

HNPCC, mas com teste de predisposição inconclusivo.

ACOMPANHAMENTO DE PACIENTES E SUAS

FAMÍLIAS

O seguimento de famílias com diagnóstico clínico de

HNPCC e com teste de predisposição inconclusivo, ou sem

o teste, deve ser realizado em todos os membros, pois todos

os descendentes são suspeitos de portarem a mutação pre-

disponente. Em famílias com mutação já identificada, somente

os membros portadores da mutação devem ser seguidos com

o programa especial de rastreamento. O seguimento deve ser

realizado com base nas seguintes orientações

• Colonoscopia com um a dois anos de intervalo, com

início entre os 20-25 anos;

• Ultra-sonografia transvaginal anual, com início entre

os 25-35 anos;

• Ultra-sonografia abdominal e pélvica anual, com iní-

cio entre os 25-35 anos;

• Exame de urina tipo I e citologia urinária anual, com

início entre os 25-35 anos, principalmente nas famíli-

as com carcinoma de células transicionais de vias

excretoras renais;

• Endoscopia digestiva alta com um a três anos de in-

tervalo, com início entre os 25-35 anos, principalmen-

te nas famílias com tumores gástricos;

• Dosagem de CA-125 anual, com início entre os 25-35

anos, principalmente nas famílias com câncer de ovário.

CIRURGIA

O ponto mais importante na indicação de cirurgias em

pacientes com CCR e HNPCC é a conduta diferenciada com

relação a pacientes com CCR esporádico. Pacientes com

câncer de cólon e HNPCC devem ser submetidos à colecto-

mia total e anastomose ileorretal, independentemente da lo-

calização do tumor no cólon. Essa conduta é indicada de-

vido à alta probabilidade de o indivíduo desenvolver nova

lesão colônica no decorrer de sua vida. Esses indivíduos

devem fazer retoscopias regularmente, com um a três anos

de intervalo. Pacientes com câncer de reto e HNPCC devem

ser submetidos à proctocolectomia total, se possível com

preservação esfincteriana, utilizando-se bolsa ileal e anas-

tomose anal na reconstrução. No caso de comprometimen-

to esfincteriano pelo tumor, deve-se realizar a amputação

abdômino-perineal do reto e ânus juntamente com a colec-

tomia total, e uma ileostomia definitiva, que pode ser con-

tinente. Em casos de tumores extracolônicos, a cirurgia deve

obedecer aos padrões clássicos da cirurgia oncológica para

o órgão acometido.

Existe controvérsia sobre a cirurgia profilática, ou seja,

remover cirurgicamente um órgão morfologicamente normal

de um indivíduo sabidamente portador da predisposição ge-

nética ao câncer (com teste positivo). Nosso ponto de vista

é que essa não deve ser uma cirurgia com indicação rotinei-

ra, mas deve ser oferecida como uma opção de prevenção aos

indivíduos assintomáticos com teste genético positivo

. As

Tabela 29.2.3

Critérios de Bethesda

Paciente dentro de família de HNPCC pelos Critérios de

Amsterdam.

Paciente com CCR e menos de 45 anos.

Paciente com tumor extracolônico relacionado ao HNPCC e

menos de 45 anos.

Paciente com adenoma colo-retal e menos de 40 anos.

Atenção para CCR em jovens, indiferenciados ou com células

em anel de sinete.

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

321

duas cirurgias profiláticas que podem ser indicadas atualmen-

te são

: colectomia total com anastomose ileorretal; histerec-

tomia total com salpingo-ooforectomia bilateral em mulheres

pós-menopausadas ou após a idade reprodutiva.

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Bernardo Garicochea

29.3

Polipose Adenomatosa Familial

INTRODUÇÃO

A Polipose Adenomatosa Familial (FAP) é uma síndrome

hereditária rara que afeta uma em cada 30 mil pessoas e está

associada a menos de 1% dos casos de câncer colo-retal. A

FAP caracteriza-se pela predisposição hereditária ao desen-

volvimento de centenas a milhares de adenomas que se lo-

calizam especialmente no cólon e no reto, mas que podem

desenvolver-se também no intestino delgado e no estômago.

Praticamente todos os portadores apresentam adenomas aos

35 anos e cerca de 90% dos casos não tratados desenvolvem

câncer aos 45 anos. Os pólipos podem ser detectados tão

precocemente quanto na primeira década de vida, mas fre-

qüentemente aparecem na faixa dos 16 anos.

A idade média para o diagnóstico de câncer colo-retal é de

39 anos e os tumores são distribuídos preferencialmente no

terço distal do cólon. Suspeita-se que de 20 a 30% dos casos

de FAP sejam representados por mutações novas. A detecção

cada vez maior de variantes atenuadas de FAP (i.e. dez a 100

pólipos em contraste com os milhares vistos na FAP clássica)

e de famílias em que os fenótipos da doença são distintos em

portadores reforça a impressão de que FAP é subdiagnosticada

quando se baseia exclusivamente em critérios clínicos

Pacientes com FAP têm risco sete vezes maior de desen-

volverem câncer no sistema nervoso central e mais da meta-

de dos pacientes apresenta adenomas na ampola duodenal,

e 10 a 12% destes desenvolverão carcinoma periampular. Não

associado a câncer — mas relevante na avaliação clínica des-

tes pacientes — são a hipertrofia congênita de epitélio pig-

mentado retiniano (CHRPE), as lesões benignas, como

osteomas e odontomas, e outras não tão benignas como os

tumores desmóides.

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

322

O caráter mendeliano da FAP é conhecido há pelo menos

um século. No entanto, os primeiros avanços significativos

feitos para se compreender as bases moleculares desta sín-

drome foram feitos somente na década de 1980. Em 1986,

Herrera e col. detectaram uma deleção no braço longo do cro-

mossomo 5 em um paciente com Síndrome de Gardner, que

hoje é considerada como uma forma de FAP. Este achado não

foi uma simples coincidência: o final da década de 1980 foi

uma época de grandes avanços nas técnicas de cariotipagem

de tumores sólidos. Nos anos seguintes à descrição do caso

de Herrera, surgiram diversos relatos de anomalias cariotípi-

cas em FAP, localizando o provável gene da síndrome na re-

gião 5q22, marginalmente à junção da banda 5q21.

O próximo passo era definir-se com maior precisão o lócus

do gene da FAP. Dois estudos publicados quase simultane-

amente foram fundamentais para que esta região fosse encon-

trada. Em 1987, Bodmer e Leppert, utilizando-se de diversas

sondas de DNA para regiões com alta taxa de polimorfismo

do cromossomo 5, obtiveram o mesmo resultado. Entre vári-

os marcadores de DNA testados, um em especial, denomina-

do C11p11, apresentava uma alta taxa de ligação com a heran-

ça do fenótipo FAP. Rapidamente, outros marcadores com al-

tas taxas de ligação foram também identificados permitindo o

mapeamento físico da região onde estaria localizado o gene

da FAP.

Durante alguns anos, estes marcadores polimórficos que

flanqueavam o gene APC foram utilizados para teste genéti-

co visando a detectar-se aqueles indivíduos de uma família

com FAP que haviam herdado a cópia alterada do gene.

Como já se dispunha de diversos marcadores com alta taxa

de polimorfismo, esta forma de teste era altamente informati-

va, permitindo o diagnóstico correto de portador de FAP em

virtualmente todos os casos onde não havia recombinação

entre os marcadores testados.

Estas sondas de DNA, todavia, tinham limitações. A mais

importante dizia respeito à baixa sensibilidade do método para

diagnóstico pré-sintomático. As razões para este problema

eram muitas — altas taxas de recombinação entre os marcado-

res, um número substancial de pacientes com mutações novas,

heterogeneidade genética, e em alguns grupos estudados, uma

taxa elevada de mosaicismo e de paternidade adulterada —, o

que confundia a análise de herança dos marcadores.

A prática de se utilizar marcadores de DNA para diagnós-

tico pré-sintomático de FAP só seria abandonada quando o

gene que estes marcadores flanqueavam fosse identificado.

E isto ocorreu em 1991, quando (mais uma vez) dois grupos,

simultânea e independentemente, reportaram a caracterização

do gene responsável pela FAP e de mutações responsáveis

por aberrações na proteína codificada pelo mesmo. Este gene

foi denominado APC (Adenomatous Polyposis Coli) para

evitar confusão com a sigla FAP (Familial Amyloid

Polyneuropathy) que já era utilizada no léxico genético.

O GENE APC

O gene APC é extenso. A sua porção codificante é com-

posta por 15 éxons com uma fase aberta de leitura de 8.535

nucleotídeos. Duas formas de transcritos podem ser geradas

a partir do éxon 9 (splicing alternativo), uma composta por

100 aminoácidos a mais que a outra. O éxon 15 deste gene é

um dos maiores éxons descritos até o momento no genoma

humano. Composto por mais de 6.500 nucleotídeos, é neste

éxon que grande parte dos sítios funcionais da proteína APC

são codificados

A PROTEÍNA APC

O produto predito para a proteína APC tem cerca de três

mil aminoácidos e a sua estrutura sugere tendências à homo

e dimerização, localização citoplasmática e expressão ubíqua.

A função da proteína APC ainda não foi totalmente elucidada,

mas o estudo de proteínas que interagem com ela pode for-

necer pistas importantes sobre o seu papel biológico.

A proteína APC liga-se com grande afinidade à beta-

catenina e gama-catenina. Estas proteínas participam de me-

canismos de adesão celular, atuando nos complexos desmos-

sômicos e de junção aderente. Estes complexos ligam-se ao

domínio citoplasmático da E-caderina, uma proteína da famí-

lia das moléculas de adesão cálcio-dependentes responsável

pela adesão célula-célula. As cateninas formam uma ponte

entre as caderinas e o citoesqueleto. A proteína APC não é

encontrada no complexo caderina, mas a sua associação com

componentes desta estrutura sugere que um possível meca-

nismo oncogenético de mutações no gene APC seria via in-

teração intercelular aberrante.

Além de interagir com o complexo caderina, a proteína

APC parece ser capaz de modular os níveis de beta-catenina.

Em outras palavras, a proteína APC teria um papel regulató-

rio na expressão de elementos responsáveis pela adesão ce-

lular. Regulando a expressão da beta-catenina que também

atua como ativador transcricional, a proteína APC, mesmo

não tendo função direta nas vias de sinalização celular, teria

um papel importante indireto.

Estudos de transfecção celular também sugerem que a

proteína APC desempenha um papel importante na regulação

da proliferação celular. Nestes estudos, APC foi capaz de inibir

a progressão das células da fase G1 para S. O mecanismo

mais provável envolveria a regulação negativa da função de

CDK2, uma ciclina-quinase fundamental na progressão de G1

para S durante a divisão celular

Portanto, a perda da função da proteína APC implicaria a

perda do controle de algumas funções importantes para a cé-

lula e poderia explicar o fenótipo da doença. A produção de

vegetações do tipo polipóide poderia refletir a perda da regu-

lação intercelular por alteração na expressão de beta-cate-

nina; a proliferação descontrolada, etapa fundamental no pro-

cesso de malignização, poderia refletir a menor repressão fun-

cional de CDK2 com o conseqüente incremento na taxa de

progressão das células acometidas de G1 para S. Desta for-

ma, o gene APC funcionaria aos moldes de um gene supres-

sor de tumor, já que a perda da sua função reflete em vanta-

gem proliferativa e predisposição à célula acometida de aqui-

sição de novos eventos genéticos que conduzirão ao fenó-

tipo maligno pleno (adenocarcinoma).

Se mutações no gene APC provocam funcionalmente um

efeito do tipo gene supressor, a forma como o gene APC pro-

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

323

move este efeito não ocorre nos moldes clássicos dos genes

supressores. Uma única cópia mutada é capaz de iniciar os

eventos proliferativos, ao contrário dos genes supressores

em que a perda da função do alelo restante é necessária para

comprometer a função da proteína. O mecanismo pelo qual o

alelo intacto restante não é capaz de contrabalançar o efeito

produzido pelo alelo mutado é conhecido como “dominante

negativo”. A explicação para este fenômeno ainda não é cer-

ta, mas presume-se que, pela forte tendência a funcionar sob

forma de dímeros e tetrâmeros, a proteína APC encurtada pela

truncagem provocada pela mutação, ao se polimerizar com a

proteína APC normal, afetaria a função do polímero como um

todo, desestabilizando-o.

MUTACÕES NO GENE APC

Cerca de 300 mutações diferentes já foram identificadas

até o momento no gene APC em famílias portadoras de FAP.

Entre as mutações já descritas, uma em cada três são dele-

ções; a minoria dos casos consiste em inserções ou mutações

de ponto. No caso das deleções e das inserções, ocorre des-

locamento na fase aberta de leitura (frameshift

), gerando um

códon de parada precoce que promove a truncagem da pro-

teína.

As mutações de ponto respondem por um quarto a um

quinto das mutações já identificadas no gene APC. Em 95%

dos casos, a substituição de uma base por outra gera direta-

mente um códon de parada (mutação non-sense) promoven-

do a truncagem da proteína de maneira similar à observada

com mutações por deleção e inserção. Apenas em 5% dos

casos as mutações de ponto são do tipo missense, ou seja, a

substituição de uma base por outra não produz códons de pa-

rada que interrompem prematuramente a proteína, mas sim pro-

teínas com estruturas distintas da conformação original — ape-

sar do mesmo número final de bases. A proteína traduzida pelo

gene mutante será disfuncional se envolver regiões que codi-

ficam domínios funcionais importantes ou se for capaz de ge-

rar aberrações substanciais na sua estrutura terciária

Menos de 3% das mutações descritas encontram-se em

sítios de splicing. Este tipo de mutação também produz

códons de parada com conseqüente truncagem da proteína

APC.

Cerca de 4% dos casos constituem-se em grandes dele-

ções no gene APC. Estas aberrações podem ser observadas

por estudos citogenéticos e por hibridização in situ fluores-

cente, já que ocorre perda de grande quantidade de material

genético envolvendo a região 5q22.

DISTRIBUIÇÕES DAS MUTAÇÕES NO GENE APC

Um quarto das mutações foi descrita entre os éxons 1 e

14, geralmente envolvendo códons para o aminoácido

arginina (CGA). A vasta maioria das mutações no gene APC

é encontrada no éxon 15, e freqüentemente em dois sítios cor-

respondendo aos códons 1061 (ACAAA del) e 1309

(AAAGA del). Estas duas aberrações respondem por pelo

menos 30% de todas as mutações já descritas no gene APC.

As demais mutações descritas no éxon 15 (40 a 50% do total

de mutações no gene APC) encontram-se concentradas na

metade 5´ do mesmo. Menos de dez mutações foram descri-

tas na metade 3´ do gene. A maioria das mutações encontra-

das no éxon 15 é do tipo frameshift ou com deslocamento de

fase de leitura.

O conhecimento da distribuição das mutações no gene

APC é importante na medida em que se pode definir uma es-

tratégia de detecção em casos novos. Ou seja, a busca da

mutação deve iniciar-se na metade 5´ do éxon 15, focalizan-

do-se preferencialmente os dois códons mais comumente

afetados. Todavia, é importante lembrar que uma grande par-

te das mutações fora destes hot-spots distribui-se em um

fragmento de 4.500 pares de bases, tornando a sua busca

uma tarefa complicada para fins de rotina diagnóstica.

Uma quantidade pequena de casos de FAP ocorre por

mecanismos variados de inativação do gene APC que não

implicam mutações ou deleções do gene APC. Por exemplo,

foram descritas famílias com FAP onde se detectou ruptura

da seqüência normal do gene APC por meio da inserção de

um transposon (seqüência de DNA móvel que geralmente se

posiciona em áreas silenciosas do genoma). Transcrição in-

suficiente do gene APC pode também ocorrer por metilação

aberrante do promotor. Finalmente, é possível que casos de

FAP ocorram por anomalias herdadas em proteínas que regu-

lam a função da proteína APC, sem afetá-la estruturalmente.

DETECÇÃO DE MUTAÇÕES NO GENE APC

A regra de ouro para detecção de mutações em APC é o

seqüenciamento físico do gene. Como as mutações podem

encontrar-se em regiões distintas do gene em cada família

com polipose, o seqüenciamento integral do gene APC tor-

na-se uma tarefa tecnicamente complicada. Portanto, foi ne-

cessário desenvolver tecnologias alternativas para a detec-

ção de mutações em APC, tais como análise de heteroduple-

xes (HA), ensaio de proteção de RNAse, polimorfismo de

conformação de fita simples (SSCP), método de clivagem quí-

mica e eletroforese em gel com gradiente desnaturante

(DGGE). O teste mais utilizado em diversos centros do mun-

do e que basicamente tornou-se o método padrão de rastrea-

mento de mutações em FAP, pela sua simplicidade e alta sen-

sibilidade, é o teste de truncagem de proteína (PTT).

A vasta maioria das mutações no gene APC descritas até

o momento gera uma proteína encurtada (truncada), destitu-

ída de domínios funcionais importantes codificados na por-

ção mais a 3´ da mutação. O teste da PTT baseia-se na tra-

dução in vitro de uma proteína a partir de um fragmento de

DNA, visando à determinação da presença de mutações que

produzam códons de parada, por meio de um artifício bastante

engenhoso. O DNA é obtido de linfócitos do sangue perifé-

rico do paciente com polipose. Diversas regiões de cerca de

mil pares de bases são então amplificadas por meio de PCR.

No primer senso foi adaptada uma seqüência idêntica ao sí-

tio de ligação da T7 RNA-polimerase seguida de um códon

de iniciação. Neste caso, a seqüência amplificada é codifica-

da para RNA e imediatamente traduzida para proteína com

aminoácidos radiomarcados. Este material é submetido a uma

corrida eletroforética e as proteínas truncadas podem ser

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

324

distinguidas, dado o seu padrão aberrante de migração, das

proteínas normais.

A associação de PTT com análise de heteroduplexes foi

capaz de detectar 70% das mutações em famílias portadoras

de FAP em uma população finlandesa. Deve-se levar em con-

ta que o laboratório que executou o estudo é especializado

nestas técnicas e que as famílias estudadas eram altamente

selecionadas, o que sugere que outros laboratórios talvez não

atinjam estas taxas tão expressivas de positividade. Conse-

qüentemente, parece claro que tanto PTT como HA podem

ser métodos interessantes para rastreamento, mas que efeti-

vamente não substituem o seqüenciamento ou, no caso de

grandes deleções ou duplicações, o método de Southern-

blotting

CORRELAÇÃO GENÓTIPO-FENÓTIPO

A transição de pólipos até o aparecimento de adenocar-

cinoma na FAP envolve ganho de aberrações genéticas de

forma seqüencial no epitélio cólico. Da mesma forma que nos

adenocarcinomas esporádicos, a geração de fenótipo malig-

no na FAP obedece à hipótese de Knudson, em que a aqui-

sição de danos em genes regulatórios importantes no epité-

lio cólico produz um fenótipo cada vez mais instável, predis-

pondo esta(s) célula(s) ao acúmulo progressivamente mais

rápido de aberrações genéticas e conseqüentemente perda da

homeostase. Dentre as alterações genéticas consistentemen-

te descritas nos casos de FAP estão mutações no proto-

oncogene K-RAS, e anomalias nos cromossomos 17 (TP53)

e 18 (DCC). Além da inativação do gene APC, que é o even-

to primário da FAP e um achado também precoce nos carci-

nomas esporádicos, o envolvimento dos genes acima suge-

re que as vias de malignização do epitélio cólico observadas

na FAP e nos carcinomas esporádicos são similares. A con-

clusão de que estes tumores de história mórbida tão distinta

apresentam interfaces biológicas comuns tem implicações te-

rapêuticas, já que tratamentos futuros para câncer colo-retal

direcionados para proteínas aberrantes ou não funcionantes

destas células poderiam ser aplicados igualmente para casos

esporádicos ou com FAP.

A heterogeneidade clínica e anátomo-patológica da FAP

tem recebido grande atenção nos últimos cinco anos devi-

do às descrições concordantes de casos cujo fenótipo cor-

responde a mutações em regiões específicas no gene APC.

Mutações entre os códons 1215 e 1464, região que corres-

ponde à porção mais 5’ do éxon 15, associa-se aos quadros

de polipose mais severos, com formação profusa de microa-

denomas. Na variante atenuada de FAP (síndrome do ade-

noma plano), as mutações têm sido descritas entre os éxons

1 e 4 ou na porção 3’ do éxon 15 (códon 1597). Em ambas

as situações, o teste de PTT é de difícil interpretação, já que

os produtos destas mutações são proteínas de tamanho tão

pequeno que não são identificáveis no teste, ou de tama-

nho similar ao produto normal, não podendo ser diferenciá-

veis deste no gel de SDS-PAGE. Um relato de caso recente

implicou a presença de doença desmóide em pacientes com

uma mutação que produziu alteração de fase de leitura no

códon 1924.

Não se constitui surpresa o fato de que mutações distin-

tas no gene APC causem fenótipos distintos. A abolição de

domínios importantes da proteína APC por conta de termina-

ção precoce da proteína determina uma maior ou menor ca-

pacidade funcional da proteína com efeitos biológicos corres-

pondentes. O fato mais importante, no entanto, refere-se ao

achado de que truncagens nas porções inicial ou terminal da

fase de leitura do gene produzam fenótipos atenuados simi-

lares. Esta constatação confirma as evidências de que a pro-

teína APC funciona via formação de polímeros. Mutações em

regiões a 5’ do gene produzem fragmentos incapazes de se

dimerizar com a proteína APC produzida pelo alelo normal e,

portanto, as proteínas produzidas pelo alelo intacto conse-

guem dimerizar-se praticamente sem competição. Esta situa-

ção é também vista em mutações nas porções terminais da

fase de leitura, ou seja, a proteína truncada não perdeu seus

domínios de dimerização e consegue produzir polímeros com

algum grau de funcionalidade. Esta hipótese não foi comple-

tamente comprovada, mas existem forte evidências que apon-

tam para este mecanismo como o mais provável na geração

de fenótipos atenuados

TESTE GENÉTICO PARA FAP, QUANDO E EM

QUEM FAZER?

Na prática, nem sempre é necessário estudar a mutação

do gene APC para se confirmar o diagnóstico de FAP em um

determinado paciente, uma vez que o quadro clínico associa-

do à história familiar definem a situação na maioria dos casos.

No entanto, em alguns casos, a análise mutacional pode ser

crucial para a definição diagnóstica. Como, por exemplo, em

casos de mutações novas com fenótipo atenuado. Nestes

casos, a ausência de história familiar e o número limitado de

pólipos dificultam o diagnóstico definitivo, tornando a iden-

tificação da mutação um elemento diagnóstico importante. A

análise mutacional de FAP pode ser útil também em casos de

diagnóstico diferencial de síndromes polipóides, como entre

a síndrome de Gardner e Peutz-Jehgers, em que, naquela, a

mutação encontra-se no gene APC, e, na última, a mutação

pode ser detectada no gene PJS.

Se a aplicação dos testes de DNA é limitada a algumas

situações no caso de diagnóstico de FAP, isto não é verda-

de no que diz respeito a diagnóstico pré-sintomático da doen-

ça. Em outras palavras, o teste permite definir que membros

da família herdaram o gene mutado e que, portanto, vão de-

senvolver a síndrome (e, por isso, apresentam alto risco para

câncer colo-retal). De uma forma geral, o teste inicial é feito

em um portador conhecido de polipose na família. Uma vez

encontrada a mutação, recomenda-se submeter cada familiar

de risco (primeiro grau) deste portador à análise de DNA.

Como a mesma mutação segrega na família, basta abordar-se

diretamente a região mutada, não havendo necessidade de se

analisar integralmente o gene APC, reduzindo-se tanto o tem-

po como o custo da análise.

A análise deve ser feita o mais precocemente possível.

Como a mutação no gene APC tem 100% de penetrância e vir-

tualmente todos os pacientes que a herdarem desenvolverão

câncer colo-retal, a importância da detecção precoce da mu-

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

325

tação é tão importante para os não portadores como para os

portadores. Para os primeiros, porque o fato de estarem livres

da síndrome terá um impacto psicológico enorme, especial-

mente durante a infância. O fato de se saber não portador não

implica somente poder evitar controles periódicos com

colonoscopias ou outros exames endoscópicos, mas acima de

tudo remove um estigma de “ser doente” e de uma série de

temores que envolvem idéias de mutilação e morte.

Para os indivíduos da família que apresentam mutação

genética e são ainda assintomáticos, uma série de medidas

podem ser tomadas no sentido de melhorar a qualidade de

vida antes e após o surgimento dos sintomas. É recomendá-

vel que estes indivíduos sejam abordados por grupos multi-

disciplinares, e que sejam acompanhados pelo menos até o

início da adolescência por grupos de suporte que os auxili-

em a entender e conviver de forma adequada com a síndro-

me e suas conseqüências, especialmente a tediosa e incômo-

da vigilância endoscópica necessária

O acompanhamento endoscópico de indivíduos assinto-

máticos deve seguir-se indefinidamente, iniciando-se no iní-

cio da adolescência nos portadores de mutação ou em indi-

víduos em risco que não se submeteram a testes de DNA. Na

Tabela 29.3.1 é apresentado um programa de seguimento exe-

cutado por vários serviços. As idades de início de investiga-

ção e de periodicidade de exames são arbitrárias e se basei-

am em experiências de outros grupos, mas não se constituem

em paradigmas. Em casos de polipose atenuada, os contro-

les poderiam ser mais espaçados, assim como, em caso de fa-

mílias com alta incidência de câncer duodenal ou gástrico, o

rastreamento destes órgãos em portadores assintomáticos,

ou com polipose cólica já instalada, deve ser mais agressivo

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Tabela 29.3.1

Programa de Seguimento de Membros de Famílias com FAP

Exame Início Periodicidade Objetivo

Retossigmoidoscopia ou colonoscopia 12-14 anos A cada 18 meses Identificar polipose

Gastroscopia Ao diagnóstico A cada três anos em casos Prevenção de câncer de

com pólipos gástricos estômago e duodeno

Avaliação oftalmológica Ao diagnóstico A cada três anos Identificar CHRPE

Maria Isabel Waddington Achatz

29.4

Síndrome de Li-Fraumeni

INTRODUÇÃO

Em 1969, Li e Fraumeni revisaram 280 prontuários e 418

atestados de óbito de crianças que tiveram o diagnóstico de

rabdomiossarcoma, analisando a historia familial destes pa-

cientes. Verificaram que cinco famílias dentre as estudadas

apresentavam irmãos ou primos de 1

grau com diagnóstico

de sarcoma na infância, um aumento significativo de casos de

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

326

câncer de mama em idade jovem, alm N.R.: ??? de outras neo-

plasias, tais como leucemia aguda, tumores de sistema nervo-

so central e carcinoma de pulmão, pâncreas, adreno-cortical

e pele nas famílias estudadas. A partir destas observações,

os autores propuseram uma nova síndrome de câncer fami-

lial relacionada a diversos tumores — a Síndrome de Li-

Fraumeni(LFS)

A LFS é uma síndrome rara de predisposição ao câncer

com caráter autossômico dominante com alta penetrância.

Estima-se que pacientes com esta síndrome apresentem 50%

de chance de desenvolver tumores antes dos 30 anos de ida-

de, comparados a 1% na população geral e que 90% dos por-

tadores desenvolvam câncer até 70 anos de idade

. Portado-

res que desenvolveram tumor na infância são mais susceptí-

veis ao desenvolvimento de tumores secundários. Observa-

se também maior incidência de tumores secundários em re-

giões tratadas por radioterapia. O risco aparenta ser maior em

mulheres, em parte devido ao alto risco de desenvolvimento

de câncer de mama

Diversos tipos de tumores malignos estão diretamente

relacionados a LFS (Tabela 29.4.1), tais como sarcoma, leuce-

mia, tumores do sistema nervoso central, tumores adreno-cor-

ticais, e câncer de mama de início em idade jovem. Deve-se

relacionar ainda outros tipos de câncer que são freqüentes

em famílias com LFS, dentre eles melanoma, tumores de cé-

lulas germinativas, tumores gástricos e tumor de Wilms, e

outros em casos individuais de LFS, como pâncreas, pulmão,

laringe, próstata e linfomas. Famílias que não apresentam a

expressão completa do fenótipo clássico da síndrome são

denominadas Li-Fraumeni-like (LFL) ou Li-Fraumeni varian-

(Tabelas 29.4.2 e 29.4.3).

QUADRO CLÍNICO E CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS

A anamnese e história familial de pacientes que desenvol-

veram câncer infantil devem ser sempre minuciosas, buscan-

do outros casos de câncer na família. O diagnostico clínico

da LFS é definido a partir de um probando que apresentou

sarcoma na infância ou em idade jovem (antes dos 45 anos),

associado a um parente de primeiro grau com qualquer cân-

cer em idade jovem (antes dos 45 anos) e a outro parente de

primeiro ou segundo grau que tenha o diagnóstico de cân-

cer em idade jovem (antes dos 45 anos) ou sarcoma em qual-

quer idade

(Tabela 29.4.2).

A LFL é definida pelo diagnóstico no probando de qual-

quer câncer infantil ou sarcoma, tumor cerebral ou carcinoma

adreno-cortical em idade jovem (antes dos 45 anos), associado

a um parente de primeiro ou segundo grau com câncer típico da

síndrome de Li-Fraumeni (sarcoma, câncer de mama, câncer do

sistema nervoso central, carcinoma adreno-cortical ou leucemia)

em qualquer idade e um parente de primeiro ou segundo grau

com qualquer câncer antes dos 60 anos (Tabela 29.4.3).

Outro critério diagnóstico mais abrangente foi proposto

por Eeles, definindo a LFL a partir de dois parentes de primei-

ro ou de segundo grau com câncer relacionado a LFS em qual-

quer idade

. Cabe ainda ressaltar a existência de pacientes que

por si próprios preenchem os critérios para LFS ou LFL, as-

sociado ou não a outros casos de câncer na família. Estes

pacientes preenchem todos os critérios acima descritos a par-

tir de uma história pessoal de múltiplos cânceres e são con-

siderados pacientes Li-Fraumeni ou Li-Fraumeni-like.

O GENE TP53

O gene envolvido na LFS e LFL é o gene supressor de

tumor TP53, que codifica a proteína p53. Mutações germina-

tivas no gene TP53 foram encontradas em aproximadamente

77% da LFS clássica e entre 40 a 20% das famílias com LFL,

podendo chegar a 8%

. O risco de câncer em portadores da

mutação germinativa mostrou-se mais alto no sexo feminino,

em parte devido à maior incidência de câncer de mama em ida-

de jovem. A exposição à radiação ionizante, radiação gama,

a raios UV, agentes oxidantes, drogas citotóxicas e agentes

químicos causadores de câncer aumentam o risco de tumo-

Tabela 29.4.1

Tumores mais Freqüentemente Associados a LFS e LFL

Tumores infantis Sarcoma

Leucemia

Tumor do sistema nervoso central

Câncer adreno-cortical

Tumor de Wilms

Tumores em adultos Câncer de Mama

Melanoma

Tumor de células germinativas

Câncer gástrico

Câncer de pâncreas

Câncer de pulmão

Câncer de laringe

Câncer de próstata

Linfoma

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

327

res. Outros agentes mutagênicos e carcinogênicos são fon-

tes atuais de estudos

. Suspeita-se de que haja ainda o en-

volvimento do gene CHEK2, que agiria como gene de sus-

ceptibilidade alternativa na LFS, porém recentemente levan-

taram-se dúvidas quanto à real participação deste gene

Mutações germinativas no gene CHEK2 foram encontradas

em apenas algumas famílias com LFS e LFL, no entanto sua

relação direta com a síndrome ainda não está confirmada.

A proteína p53 foi descoberta há 20 anos, e inicialmente

era considerada como um produto de um oncogene. No final

dos anos 80, verificou-se que esta propriedade devia-se a

apenas algumas formas mutantes do gene, enquanto o gene

selvagem, ou wild type, tinha a capacidade de suprimir a

transformação de um tumor, seja ele in vitro ou in vivo. Em

1990, o gene TP53 foi apontado como gene candidato, uma

vez que mutações foram detectadas nos pacientes com LFS.

Dois anos mais tarde, foram produzidos camundongos

nocauteados (trp53) ou knock-out, que são animais modifi-

cados geneticamente portadores dessas mutações. Os camun-

dongos apresentaram desenvolvimento normal, porém de-

senvolveram tumores múltiplos em idade precoce. Em estu-

dos mais recentes, os camundongos homozigotos trp53 tive-

ram morte precoce devido a linfomas enquanto heterozigotos

tiveram alterações fenotípicas, apresentando exencefalia, gas-

trosquise, polidactilia, edema cefálico e fenda palatina, sen-

do mais freqüente em fêmeas. Além disso, os tumores mais

verificados foram linfomas tímicos, sarcomas, carcinomas de

mama e bexiga

O papel do gene TP53 na regulação do ciclo celular e sua

participação direta no controle da apoptose é determinante,

recebendo por isso a denominação de “guardião do geno-

ma”

. O TP53 é um gene supressor de tumor localizado no

braço curto do cromossomo 17 (17p13.1), com 20kb e contém

11 éxons, e o primeiro não codificador. O gene TP53 huma-

no codifica uma proteína de 393 aminoácidos, a p53. A pro-

teína p53 liga-se a seqüências específicas de DNA e age

como fator de transcrição dos genes reguladores do cresci-

mento celular. A proteína p53 é rapidamente convertida a sua

forma ativa sob a ação de fatores que destroem o DNA. A

proteína p53 está inativa na maior parte de cânceres humanos

devido à mutação do gene TP53 ou por ação de proteínas

virais. Assim como em tumores esporádicos, a perda de he-

terozigosidade levando à inativação do alelo selvagem ocorre

nos tumores LFS.

Mais de 18 mil mutações pontuais foram detectadas, sen-

do 97% somáticas e 3% germinativas e são predominante-

mente do tipo missense, principalmente transições guanina

para adenina, porém todos os tipos de mutações podem ocor-

rer: mutações non-sense, deleções frameshift ou inserções de

seqüências repetidas. Há um caso de mosaico de LFS descrito

na literatura

Para seqüenciamento do gene, considera-se

como hot spot a região entre os éxons 5 e 8, no entanto deve-

se procurar a mutação em todos os éxons. O gold standard

para detecção das mutações pontuais é o seqüenciamento

direto de DNA genômico de todos os éxons, incluindo os sí-

tios de splicing.

CORRELAÇÃO GENÓTIPO-FENÓTIPO

Mutações germinativas no gene TP53 não são específi-

cas quanto a algum órgão-alvo ou célula-alvo. No entanto,

verifica-se o agrupamento de certos tumores, tais como tumo-

res gástricos no Japão e tumores adreno-corticais na região

da periferia de Curitiba, no Brasil

. As famílias brasileiras

apresentaram mutações no códon 337, nunca antes descrita

na literatura, em 35 crianças dentre as 36 estudas, não sen-

do identificado efeito fundador. Acredita-se que esta muta-

ção germinativa específica ocorreu devido à alteração do pH

em células adrenais apoptóticas no período pré- e pós-natal,

o que levou à inativação do TP53. Famílias com mutações do

tipo missense apresentaram tumores mais precocemente

Es-

tudos com famílias LFS, correlacionando os tipos de mutação

germinativa e os tipos de tumores encontrados, seriam

elucidativos.

RASTREAMENTO

O acompanhamento de famílias com história sugestiva de

LFS deve ser realizado como medida preventiva para o desen-

Tabela 29.4.2

Critérios Diagnósticos da Síndrome de Li-Fraumeni

Sarcoma na infância ou em idade jovem (antes dos 45 anos).

Parente de primeiro grau com qualquer câncer em idade jovem (antes dos 45 anos).

Parente de primeiro ou segundo grau que tenha o diagnóstico de câncer em idade jovem (antes dos 45 anos) ou sarcoma em

qualquer idade.

Tabela 29.4.3

Critérios Diagnósticos da Síndrome de Li-Fraumeni-

Câncer na infância ou sarcoma, tumor do sistema nervoso central ou câncer adreno-cortical antes dos 45 anos.

Parente de primeiro grau ou segundo grau com câncer típico da síndrome de Li-Fraumeni (sarcoma, câncer de mama, tumor do

sistema nervoso central, câncer adreno-cortical ou leucemia) em qualquer idade e parente de primeiro ou segundo grau com qualquer

câncer antes dos 60 anos.

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

328

volvimento de possíveis tumores. Inicialmente, deve-se rea-

lizar um heredograma detalhado da família, tomando-se o cui-

dado de comprovar o tipo de tumor do paciente e dos fami-

liares por meio de laudo anátomo-patológico ou relatório mé-

dico. Uma vez preenchidos os critérios descritos anteriormen-

te, deve-se desenvolver um programa personalizado de ras-

treamento em parentes de primeiro e de segundo grau, mes-

mo assintomáticos. Pacientes com história pregressa de ou-

tros tumores devem ser avaliados não só para o aparecimento

de recidivas, mas também para novos tumores primários. De-

vido à diversidade de tumores passíveis de aparecimento na

síndrome, cada família deve ser avaliada inicialmente nos sí-

tios tumorais acometidos em outros membros da família.

Deve-se também investigar, por meio de exames periódicos,

o aparecimento dos tumores já descritos para LFS. O acom-

panhamento deve ser periódico, com realização de exames de

imagem.

O teste genético, feito através do seqüenciamento do

gene TP53, é indicado para pacientes que preencham os cri-

térios diagnósticos clínicos da LFS e LFL. Após detecção da

mutação, o exame deve ser oferecido aos familiares previa-

mente submetidos a aconselhamento oncogenético. No en-

tanto, até o presente, o seqüenciamento do gene TP53 não

é feito rotineiramente, e o seu estudo é oferecido apenas em

alguns centros de pesquisa.

PERSPECTIVAS

O diagnóstico da síndrome de Li-Fraumeni é de grande

importância clínica para a prevenção de neoplasias em famí-

lias que apresentam constitutivamente mais propensão ao seu

desenvolvimento. Como constitui uma entidade clínica pou-

co conhecida, é muitas vezes confundida com um agrupa-

mento casual de tumores ou mesmo com outras síndromes

genéticas, como a síndrome de mama e ovário hereditário,

quando mais se um familiar apresenta câncer de mama. O

diagnóstico correto desta síndrome vai permitir a detecção de

pacientes que apresentam alto risco para apresentar tumores

e que necessitam de rastreamento sistemático. Ao mesmo

tempo, através do aconselhamento genético, os familiares

serão informados do risco de transmissão à prole e estimu-

lados a sensibilizar o maior número de familiares possível.

Com isso, será possível avaliarmos os indivíduos assintomá-

ticos, poupando-os muitas vezes, devido à detecção preco-

ce, de complicações futuras. A importância do atendimento

multidisciplinar deve ser ressaltada, incluindo geneticista,

oncologista clínico, cirurgião, assim como avaliação psicoló-

gica e acompanhamento feito por enfermeira geneticista.

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FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

329

Mariana Morais Cajaiba

29.5

Síndromes de Cowden e Bannayan-Riley-Ruvalcaba

INTRODUÇÃO

A síndrome de Cowden é caracterizada pela predisposi-

ção a lesões hamartomatosas e neoplasias benignas e malig-

nas; tem herança autossômica dominante com mutações ger-

minativas encontradas no gene supressor de tumor PTEN

(10q22-23). Portadores da síndrome de Bannayan-Riley-

Ruvalcaba compartilham características fenotípicas da síndro-

me de Cowden e também apresentam mutações germinativas,

algumas idênticas, no gene PTEN. As duas síndromes são

consideradas por alguns autores como variação fenotípica

de uma mesma entidade (PTEN-Defined Syndromes ou

PTEN-Hamartoma Tumor Syndrome). Ambas são segrega-

das por herança autossômica dominante; a síndrome de

Cowden tem incidência estimada de 1:200.000 (provavelmente

subestimada)

4,7,9

QUADRO CLÍNICO E DIAGNÓSTICO

Clinicamente, a síndrome de Cowden apresenta lesões

mucocutâneas características, consideradas marcadores clí-

nicos da síndrome; tratam-se de triquilemomas faciais, pápu-

las de mucosa oral (fibromas) e lesões hiperqueratósicas de

extremidades. Os portadores da síndrome apresentam um ris-

co elevado em relação à população geral para o desenvolvi-

mento de neoplasias malignas, principalmente de mama e de

tireóide, e também é descrito câncer de endométrio, rim e

colo-retal. O carcinoma mamário, principalmente do tipo duc-

tal, é a neoplasia maligna mais relatada na síndrome, acome-

tendo até 50% das mulheres portadoras, com tumores bilate-

rais em um terço dos casos. Também estão presentes lesões

benignas de mama e tireóide, pólipos de trato gastrointesti-

nal, alterações ósseas, genitourinárias e neurológicas

2,3,6

. Os

achados clínicos descritos na síndrome estão sumarizados na

Tabela 29.5.1. A síndrome de Cowden mostra penetrância

completa aos quarenta anos de idade, com manifestações

presentes geralmente no início da terceira década de vida,

aparentemente acometendo mais mulheres do que ho-

mens

3,4,8,9

Já a síndrome de Bannayan-Riley-Ruvalcaba é descri-

ta como a associação de macrocefalia, múltiplos lipomas

(subcutâneos e viscerais), hemangiomas viscerais e de

partes moles, polipose gastrointestinal geralmente florida,

lentiginose de genitália externa (considerada uma das le-

sões mais marcantes da síndrome), retardo mental leve e

atraso no desenvolvimento neuropsicomotor. As manifes-

tações geralmente ocorrem na infância, mas podem estar

presentes já ao nascimento, e são relatados casos de ma-

crossomia fetal. Inicialmente, a síndrome não foi conside-

rada como de risco elevado para desenvolvimento de neo-

plasias, assim como não constitui parte do espectro clíni-

co da síndrome a presença de alterações mucocutâneas

floridas como na síndrome de Cowden, porém são relata-

dos casos onde estas alterações estão presentes, além de

casos de bócio e fibroadenomas de mama, câncer de mama

e tireóide

5,7,8

CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS

O diagnóstico da síndrome de Cowden é clínico, basea-

do em critérios bem definidos (Tabela 29.5.2)

que devem ser

pesquisados em todos os casos suspeitos.

Para se estabelecer o diagnóstico clínico da síndrome de

Bannayan-Riley-Ruvalcaba, é necessária a presença de ao

menos três dos quatro achados clínicos a seguir, considera-

dos os mais característicos da síndrome: macrocefalia, lenti-

ginose de genitália externa, lipomatose e hemangiomas

5,7

O GENE PTEN

O gene supressor de tumor PTEN está localizado em

10q22-23, contém nove éxons e codifica uma fosfatase cito-

plasmática com 403 aminoácidos. A principal ação desta fos-

fatase é a desfosforilação do segundo mensageiro PIP3

(fosfoinositol 3,4,5 trifosfato), inibindo a proteina AKT, uma

proteína-quinase responsável pela tradução de sinais de so-

brevivência e proliferação celulares e inibição de apoptose.

Assim, mutações deletérias na proteína PTEN levam à eleva-

ção nas concentrações intracelulares de AKT, com indução

de proliferação celular e inibição de apoptose

. Nas síndro-

mes de Cowden e Bannayan-Riley-Ruvalcaba, são descritos

em PTEN os seguintes tipos de mutações germinativas: de

ponto missense e non-sense, inserções e deleções frameshift,

e mutações em sítios de splicing; também já foram descritas

deleções grosseiras envolvendo todo o gene. A maioria das

mutações descritas nas duas síndromes leva à proteína

truncada, com perda ou redução da função. O éxon 5 é apon-

tado como região de hot-spot por conter a maior parte (30 a

40%) das mutações deletérias descritas, e é a região que co-

difica o cento ativo da enzima fosfatase; em seguida ao éxon

5, os éxons 7 e 8 apresentaram grande parte das mutações

deletérias

1,9

No gene PTEN, também foram encontradas mutações so-

máticas em tumores esporádicos (carcinomas de endométrio,

ovário, próstata, mama, rim e tireóide, astrocitomas e melano-

mas)

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

330

CORRELAÇÕES GENÓTIPO-FENÓTIPO

A expressão das duas síndromes é bastante variável, e,

conforme dito acima, muitos dos casos descritos na literatu-

ra apresentam características de ambas as síndromes

5,7,8

. Fo-

ram encontradas mutações idênticas em famílias com diagnós-

ticos distintos de síndrome de Cowden e de Bannayan-Riley-

Ruvalcaba, e também foram descritas famílias que comparti-

lham os fenótipos das duas síndromes

1,7-9

A maioria dos pacientes do sexo feminino com síndrome

de Bannayan-Riley-Ruvalcaba que apresentou mutações ger-

minativas em PTEN (principalmente mutações levando à pro-

teína truncada) e desenvolveu fibroadenomas e/ou câncer de

mama, características da síndrome de Cowden mais relatadas

também em pacientes portadores desta com mutações iden-

tificadas. Também foi encontrada associação entre mutações

em PTEN e fenótipo de lipomatose; não foi possível estabe-

lecer uma relação fenótipo-genótipo para outras lesões, ma-

lignas e benignas, nas duas síndromes

7,9

De um modo geral, as mutações germinativas em PTEN

são mais freqüentes em famílias com síndrome de Cowden ou

com sobreposição das duas síndromes, e menos freqüentes

Tabela 29.5.1

Achados Clínicos mais Freqüentemente Descritos na Síndrome De Cowden

Pele

- Triquilemomas (principalmente face).

- Queratoses acrais (incluindo

pits

palmo-plantares).

- Fibromas (principalmente mucosa oral).

- Lipomas.

- Hemangiomas.

Tireóide

- Bócio multinodular.

- Adenomas.

- Carcinoma não medular (principalmente subtipo folicular).

Mama

- Doença fibrocística.

- Fibroadenomas.

- Hiperplasia ductal.

- Ginecomastia (homens).

- Hipertrofia virginal.

- Papilomas.

- Alterações de aréola e mamilos.

- Carcinoma ductal.

Trato digestivo

- Pólipos acometendo todo o tubo digestivo (hiperplásicos, hamartomatosos, inflamatórios, adenomatosos).

- Carcinoma colo-retal.

Sistema nervoso

- Doença de Lhermitte-Duclos (gangliocitoma cerebelar displásico).

- Retardo mental.

- Meningioma (geralmente associado à doença de Lhermitte-Duclos).

Trato genitourinário

- Irregularidades menstruais.

- Leiomiomas.

- Malformações uterinas/ureterais.

- Adenocarcinoma de endométrio.

- Adenocarcinoma de células renais.

Osteoarticular

- Macrocefalia.

- Pectus excavatum.

- Cistos ósseos.

- Palato arqueado.

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

331

em famílias com fenótipo apenas de síndrome de Bannayan-

Riley-Ruvalcaba

4,7-9

. As mutações no éxon 5 foram mais fre-

qüentemente relacionadas à síndrome de Cowden e ao fenó-

tipo de neoplasia, sugerindo papel importante desta região na

função supressora de tumor do gene

8,9

. Devido a maioria de

as mutações germinativas estarem localizadas na porção C-

terminal do gene ou 5’ em relação ao centro ativo da enzima

fosfatase (éxons 5, 7 e 8), foi sugerido que esta região do

gene seria responsável por um fenótipo mais grave

7,9

RASTREAMENTO CLÍNICO E GENÉTICO

Não há consenso quanto aos exames de seguimento para

afetados, sua periodicidade e idade de início, assim como exa-

mes de rastreamento para suspeitos. A literatura sugere exa-

mes de tireóide (clínico e ultra-sonografia) e dermatológico

anualmente após os dezoito anos ou cinco anos antes do pri-

meiro caso de câncer de tireóide na família, e avaliação anu-

al de mamas (mamografia e/ou ultra-sonografia) após os trinta

anos ou cinco anos antes do primeiro caso

2,4

A indicação de teste genético (através do seqüenciamen-

to do gene PTEN) para confirmação de diagnóstico nas sín-

dromes de Cowden e/ou Bannayan-Riley-Ruvalcaba deve ser

feita em indivíduos que preencham os critérios diagnósticos

clínicos e em indivíduos com ao menos um parente de primeiro

grau afetado (seguindo os mesmos critérios). Após detecção

da mutação, o exame deve ser oferecido aos parentes de pri-

meiro grau adultos assintomáticos, previamente submetidos

a aconselhamento oncogenético e a termo de consentimen-

to informado, para excluirmos pacientes não-portadores do

processo de rastreamento e oferecermos acompanhamento

adequado aos portadores.

CONCLUSÃO

A importância clínica da síndrome reside principalmente

no risco elevado de desenvolvimento de neoplasias e possi-

bilidade de transmissão à prole, sendo necessário rastreamen-

to cuidadoso de indivíduos em risco e aconselhamento ge-

nético oncológico. Neste aspecto, o teste molecular preditivo

tem grande importância ao identificar os portadores, apresen-

tando sensibilidade de 13 a 80% segundo a literatura para a

síndrome de Cowden e aproximadamente 60% para a síndro-

me de Bannayan-Riley-Ruvalcaba

7-9

. É também importante o

reconhecimento das síndromes de Cowden e Bannayan-

Riley-Ruvalcaba como variações de um mesmo fenótipo, pes-

quisando alterações características de ambas nos pacientes

suspeitos, e levando em consideração o provável risco para

desenvolvimento de neoplasias na síndrome de Bannayan-

Riley-Ruvalcaba

5,7,9

Tabela 29.5.2

Critérios para Diagnóstico da Síndrome de Cowden

Critérios Patognomônicos Critérios maiores Critérios Menores

Lesões mucocutâneas Carcinoma de mama Outras lesões de tireóide (ex.: adenoma ou bócio

Triquilemomas faciais Carcinoma de tireóide (não medular) multinodular

Queratoses acrais especialmente carcinoma folicular Retardo mental ( QI ≤ 75)

Pápulas papilomatosa Macrocefalia (megalencefalia) Hamartomas gastrointestinais

Lesões mucosas Doença de Lhermitte-Duclos Doença fibrocística da mama

Carcinoma endometrial Lipomas

Fibromas

Tumores genitourinários (ex.: carcinoma de células

renais, fibróides uterinos ou malformações

Diagnóstico operacional em um indivíduo

1. Apenas lesões mucocutâneas se:

a) Seis ou mais pápulas faciais, das quais três devem ser triquilemomas ou

b) Pápulas cutâneas faciais e papilomatose de mucosa oral ou

c) Papilomatose de mucosa oral e queratoses acrais ou

d) Seis ou mais queratoses palmo-plantares

2. Dois critérios maiores, sendo um macrocefalia ou doença de Lhermitte-Duclos

3. Um critério maior e três menores

4. Quatro critérios menores

Diagnóstico operacional em uma família com um indivíduo diagnóstico

1. Critérios patognomônicos

2. Qualquer critério maior com ou sem critérios menores

3. Dois critérios menores

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

332

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Marilza Cristina Legrazie Ezabella

Adriana Bezerra Nunes

Delmar Muniz Lourenço Junior

Sergio Pereira de Almeida Toledo

29.6

Neoplasias Endócrinas Múltiplas

INTRODUÇÃO

As neoplasias endócrinas múltiplas são classificadas em

dois grupos: tipo 1 (NEM1) e tipo 2 (NEM2). São síndromes

complexas hereditárias caracterizadas pela ocorrência de dis-

túrbios proliferativos diversos no tecido endócrino, varian-

do desde hiperplasia até adenoma e carcinoma.

As glândulas envolvidas mais comumente nestas sín-

dromes são a paratireóide, a hipófise, o pâncreas, as célu-

las parafoliculares da tireóide e a supra-renal. Postula-se

que os tipos celulares envolvidos nos referidos tumores

tenham um precursor embriológico comum no neuroecto-

derma.

As síndromes da neoplasia endócrina múltipla são

transmitidas de modo autossômico dominante, mas pode

haver uma variabilidade considerável na penetrância e in-

cidências específicas do tumor entre famílias. As dosa-

gens hormonais são usadas em conjunto com as caracte-

rísticas clínicas no diagnóstico desses distúrbios. Agora

que alguns dos genes associados foram mapeados, exis-

te a possibilidade de usar o teste genético para aprimorar

o diagnóstico dos tumores endócrinos hereditários. Esta

revisão irá descrever os principais aspectos clínicos e os

avanços recentes no seu entendimento e estratégias tera-

pêuticas.

NEOPLASIA ENDÓCRINA MÚLTIPLA TIPO 1

CONCEITO

A Neoplasia Endócrina Múltipla Tipo 1 (NEM1) é doença de

ocorrência familiar ou pode apresentar-se como um caso “de

novo”, ocorrendo igualmente em todas as etnias, raças, áreas

geográficas e em ambos os sexos. A NEM1 é transmitida por um

padrão de herança autossômico dominante com elevada pene-

trância e expressividade clínica variável

. Os aspectos clínicos

e gênicos desta patologia foram recentemente revistos

. O diag-

nóstico clínico da NEM1 nos casos-índice requer o reconheci-

mento de tumores em pelo menos duas das três glândulas en-

dócrinas-alvo principais (paratireóide, pâncreas endócrino/duo-

deno e hipófise). Para o diagnóstico de NEM familiar, é neces-

sário o reconhecimento de um caso de NEM1, com, no mínimo,

um parente em primeiro grau com tumor em pelo menos uma des-

tas três glândulas endócrinas-alvo já citadas. Tumores neuro-en-

dócrinos tímico/brônquicos e das glândulas adrenais (tumores

não-secretores) também podem estar presentes

3,12

ETIOLOGIA

O gene da NEM1 foi clonado e seqüenciado em 1997

está localizado no cromossomo 11, tem 9Kb e dez éxons, e

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

333

tanto o éxon 1 como 832 bases do éxon 10 não são traduzi-

dos. O gene MEN1 codifica transcrito de 2,8Kb correspon-

dente à proteína menin, expressa em vários tecidos, de loca-

lização intranuclear, composta de 610 aminoácidos, não apre-

sentando homologia com qualquer outra proteína já conhe-

cida e que interage diretamente com o fator Jun-D

. Cerca de

300 mutações germinativas e/ou somáticas no gene MEN1

foram descritas, não havendo hot-spots ou qualquer correla-

ção genótipo-fenótipo. A maioria das mutações são non-

sense ou frameshift, gerando uma proteína anômala e com

perda de sua função supressora tumoral

2,7

(Fig. 29.6.1).

QUADRO CLÍNICO

Hiperparatireoidismo

O hiperparatireoidismo (HPT) é a manifestação clínica

mais freqüente da NEM1 (80-100%) e sua primeira manifesta-

ção clínica em 85 a 100% dos casos

. O HPT/NEM1 difere do

HPT esporádico por ser de aparecimento mais precoce, apre-

sentar hiperplasia das quatro glândulas, não ter preferência

sexual, estar associado a outros tumores e ter freqüente re-

cidiva pós-cirúrgica. Seu diagnóstico não difere do HPT iso-

lado

. O tratamento definitivo é cirúrgico; duas abordagens

são utilizadas: paratireoidectomia total seguida por auto-en-

xerto e paratireoidectomia subtotal, mantendo tecido

paratireóideo viável em região cervical

3,11

Tumores Neuroendócrinos Pancreáticos

São a segunda lesão mais freqüente na NEM1 com pre-

valência em rastreamento clínico variando de 30 a 75%

Gastrinoma

São tumores secretores de gastrina, podendo ser esporá-

dicos ou relacionados a NEM1. Cerca de 25% dos casos são

relacionados a NEM1

. É o tumor pancreático mais freqüen-

te na NEM1, com penetrância de 30-50% aos 50 anos de ida-

de. São malignos em pelo menos 60% dos casos. Os associa-

dos a NEM1 são considerados menos malignos que os espo-

rádicos. O gastrinoma/NEM1 apresenta múltiplas tumorações

pancreáticas, têm apresentação duodenal em 70% dos casos

e é mais precoce

. Um terço dos casos apresenta associação

de hipersecreção ácida gástrica (> 15mmol/hora) e hipergas-

trinemia (gastrina > 1.000pg/ml). Os dois terços restantes te-

rão valores intermediários gastrinemia (100-1.000pg/ml). Nes-

tes casos, a realização de testes funcionais provocativos

(secretina, infusão de cálcio e refeição-padrão) são úteis no

estabelecimento do diagnóstico

. No tratamento do

gastrinoma/NEM1, tem-se como fundamental: 1) a utilidade

do uso dos bloqueadores do receptor H-2 (para gastrinomas)

e dos análogos da somatostatina para vários tumores neu-

roendócrinos pancreáticos, na prevenção da morbidade desta

doença; 2) o tratamento cirúrgico é controverso devido à

multiplicidade de nódulos e à malignidade destes tumores;

seu estadiamento com exames de imagens é dependente da

escolha da intervenção cirúrgica

Insulinoma

É o segundo tumor pancreático mais prevalente (35%) na

NEM1

. Uma pequena minoria (< 10%) de pacientes com

insulinoma está relacionada a NEM1

. Eventualmente, pode

ser a primeira manifestação clínica de NEM,

usualmente é

multifocal, enquanto a forma esporádica em 90% é solitária.

Não há diferenças no diagnóstico clínico e laboratorial de

insulinoma/NEM1 e insulinoma esporádico

Adenomas Hipofisários

Os tumores hipofisários relacionados a NEM1 usualmen-

te são detectados entre 17 e 65 anos com predomínio na quar-

ta década, não diferindo assim dos tumores esporádicos (13-

75 anos). Em geral, menos de 5% dos adenomas hipofisários

e 2 a 3% dos prolactinomas são relacionados a NEM1

. Po-

dem ser a primeira manifestação clínica de NEM1 em 10 a 25%

dos casos

3,11

. A prevalência de tumores hipofisários na

Fig. 29.6.1

— Representação esquemática do gene MEN1. As áreas escuras representam porções do gene não traduzidas. Mutações

de 47 famílias com NEM1 e oito casos de NEM1 “

de novo

” são ilustrados, sendo 13 mutações

frameshift

e 11

non-sense

(acima do

diagrama) e três deleções

in-frame

e 13

missense

(abaixo do diagrama). Mutações em NEM1 “

de novo

” estão indicadas com asteris-

co. Oito mutações na NEM1 familiar foram encontradas mais de uma vez (modificado de Agarwal e col, 1997)

313delC*

357del4

416delC

K120X*

512delC

W183X

W198X

713delG

735del4

Q260X*

W265X*

S308X

Y312X

Y323X

1132delG

1202del2*

1280del G*

W436X

R460X

1484del8

1509Ins2

1650delC, 1650InsC

R527X

P12L

L22R

K119del

H139D, H139Y*

F144V

A160P

A176P

A242V

L286P

A309P

T344R

E363del

D418del

W436R

F447S*

100bp

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

334

NEM1 é variável. O diagnóstico de adenomas hipofisários/

NEM1 segue os mesmos padrões dos adenomas esporádi-

cos

. Os prolactinomas são os mais freqüentemente associa-

dos a NEM1 (76%), seguidos por somatropinomas (8%), de

ACTH (6%) e adenomas não-funcionantes (6%)

. Os tumo-

res relacionados a NEM1 diferem dos esporádicos por apre-

sentarem menor incidência de adenomas secretores de gona-

dotrofinas e de adenomas cromófobos; pela maior incidência

de prolactinomas e de adenomas plurihormonais; e por serem

multicêntricos

. O tratamento dos tumores hipofisários na

NEM1 não difere daquele empregado para tumores hipofisá-

rios esporádicos

Tumor Carcinóide Tímico e Brônquico

A maioria dos estudos revela uma incidência de 7% de

tumor carcinóide na NEM1. Quando consideramos os tumo-

res carcinóides tímicos em geral, observa-se que 25% deles

são relacionados a NEM1, o que sugere que todo paciente

com tumor carcinóide tímico deveria ser rastreado para

NEM1. O grau de malignidade dos tumores carcinóides brôn-

quicos é de 26%, não diferindo dos esporádicos (22%). Os

tumores carcinóides tímicos, tanto esporádicos quanto rela-

cionados a NEM1, apresentam elevado grau de malignidade

(90%). O tratamento de escolha é a cirurgia

13,16

RASTREAMENTO CLÍNICO

Recentemente, um protocolo de rastreamento clínico foi

sugerido, já considerando a descoberta do gene e o rastrea-

mento gênico dos familiares sob risco de NEM1. Este proto-

colo é direcionado a indivíduos portadores de mutação ger-

minativa no gene MEN1 e para aqueles sob risco nos quais

não se pôde detectar a mutação. Devido à elevada penetrân-

cia da doença, o rastreamento clínico é preconizado por toda

a vida para os portadores de mutação no gene MEN1. Este

rastreamento inclui dosagens anuais de: PTH, cálcio, gastri-

na, secreção ácida, glicose, insulina, glucagon, prolactina e

IGF-1. Além disto, a cada três anos há recomendação de es-

tudo por imagem: TC, RNM, octreoscan, ultra-som endoscó-

pico, dos órgãos de maior risco

RASTREAMENTO GENÉTICO

As recomendações para a realização de análise de muta-

ções no gene MEN-1 estão sendo desenvolvidas. Dentre os

candidatos devem ser incluídos: casos-índice de NEM1 e pa-

rentes sob risco, e neste último grupo a abordagem deverá ser

direcionada primeiramente para: a) parentes em primeiro grau;

b) casos-índice que tenham achados clínicos sugestivos de

NEM1, mas que não possam ser incluídos nos critérios diag-

nósticos de NEM1 como por exemplo: tumores múltiplos de

paratireóide antes da idade de 30 anos ou tumores neuroen-

dócrinos pancreáticos múltiplos em qualquer idade

Como exemplo de rastreamento gênico, estamos utilizan-

do em nosso meio o método do DGGE no estudo gênico da

NEM1

9-11

. Na Fig. 29.6.2 mostramos padrão eletroforético de

heterozigose por nós encontrado no éxon 2 do gene MEN1

de uma extensa família brasileira. O seqüenciamento gênico

revelou uma mutação gênica: uma deleção de citosina no

códon 67 do éxon 2 do gene MEN1.

Recentemente, Brandi e col.

relataram os resultados de

Consenso sobre NEM1 (e NEM2) que fixa as normas básicas

para o diagnóstico e tratamento. Propõe-se: a) seguimento

anual bioquímico associado a seguimento com exames de

imagem a cada três anos; b) paratireoidectomia total ou

subtotal, criopreservação das paratireóides e timectomia pre-

ventiva; c) uso de inibidores de bomba de próton no controle

da hipersecreção de gastrina e análogos da somatostatina

nos gastrinomas e em outros tumores pancreáticos relaciona-

dos a NEM1; d) cirurgia é o tratamento de escolha nos casos

de hipoglicemia devido à insulinoma; e) há controvérsias

quanto a indicação de tratamento cirúrgico e protocolo cirúr-

gico em relação aos gastrinomas, o mesmo ocorrendo com

pacientes assintomáticos com tumores êntero-pancreáticos

relacionados a NEM1; f) todos casos familiares de NEM1 pa-

recem ter mutação gamética inativadora no gene MEN1; g) a

caracterização gênica é fundamental, mas raramente orienta

para conduta cirúrgica (como ocorre na NEM2).

NEOPLASIA ENDÓCRINA MÚLTIPLA TIPO 2

CONCEITO

O termo Neoplasia Endócrina Múltipla do tipo 2 (NEM2) re-

fere-se a um grupo de síndromes tumorais, de herança autossô-

mica dominante, com alto grau de penetrância e expressividade

variável, que são clinicamente distintas. O aspecto comum a elas

é a presença do carcinoma medular de tireóide (CMT).

Essa variabilidade no fenótipo tornou necessária uma clas-

sificação operacional

com pelo menos três subtipos princi-

pais, baseando-se na ocorrência de outras patologias. Quan-

do a tendência ao CMT é expressa como o único fenótipo

tumoral na família, estando presente em mais de quatro indi-

víduos, denomina-se Carcinoma Medular de Tireóide Familiar

(CMT-F). Quando o CMT é, dentro de uma família, associa-

do a hiperparatireoidismo (HPT) e/ou feocromocitoma (FEO),

Fig. 29.6.2

— Gel de poliacrilamida a 7,5% ilustrando padrão de

bandas obtido ao DGGE: os casos afetados (AF) apresentam três

bandas eletroforéticas (padrão anormal). O indivíduo controle-nor-

mal (N) e o familiar não-portador (NP) da mutação gênica, ambos

apresentam uma única banda (padrão normal)

10,12

AFAFAFAF

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

335

classifica-se como NEM2A. A NEM2B compartilha a predis-

posição herdada ao CMT e FEO que ocorre na NEM2A, po-

rém com diferenças clínicas: o paciente NEM2B tende também

a ter neuromas mucosos, ganglioneuromas intestinais, hábi-

to marfanóide e o HPT é raro. Nesta última manifestação fe-

notípica, o CMT costuma ser mais precoce e agressivo que

na NEM2A e CMTF.

A associação em algumas famílias entre NEM2 e doença

de Hirschsprung, bem como NEM2 e Líquen amilóide cutâ-

neo, propiciou a inclusão destas patologias dentro do espec-

tro NEM2.

A NEM2 é pouco freqüente: 20 a 25 casos novos/ano no

Reino Unido

Em geral, manifesta-se como NEM2A (60-

90%dos casos), sendo a NEM2B uma forma bastante rara (2-

5%). O diagnóstico de CMT-F é feito em 35% dos casos. O

diagnóstico de NEM2 é construído a partir da suspeita clinica

pela expressão dos tumores, história familiar e confirmado

pelo teste genético.

QUADRO CLÍNICO

Em geral, as características clínicas e bioquímicas dos tu-

mores componentes das síndromes NEM2 não diferem ex-

pressivamente daquelas de cada tumor quando este ocorre

isoladamente; por isso, esses aspectos serão citados apenas

brevemente. Por sua vez, a concomitância de múltiplas endo-

crinopatias pode ter implicações específicas para o tratamen-

to. A identificação de tumores familiares em uma faixa etária

inferior a dos casos esporádicos possivelmente decorre do

alto grau de suspeita clínica e triagem dos indivíduos sob ris-

co. Contudo, destaca-se na história familiar a detecção de

mutação “de novo” em 50% dos pacientes NEM2B, o que é

bem diferente dos 95% dos NEM2A que apresentam sempre

um dos pais afetados. Para o diagnóstico de CMT-F é fun-

damental o antecedente de, no mínimo, quatro casos de CMT

na família, e os achados genéticos justificam a preocupação

com esse critério.

Carcinoma Medular de Tireóide

O CMT desenvolve-se nas células C da tireóide, deriva-

das da crista neural e não relacionadas embriologicamente

com as células foliculares da tireóide. A hiperplasia de célu-

las C e a multicentricidade do CMT são características de dis-

tinção entre forma esporádica e hereditária. Vários hormônios

e aminas biogênicas são secretados pelo CMT, e o mais im-

portante é a calcitonina, cuja dosagem sérica serve como ex-

celente marcador tumoral para diagnóstico e acompanhamen-

to. Testes de estímulo para calcitonina são usados para de-

tectar a presença de hiperplasia de células C, a lesão primor-

dial

. A evolução de hiperplasia de células C para CMT mi-

croscópico tem duração de tempo variável, e não se sabe em

que ponto desta evolução as metástases iniciam. Cerca de

50% dos indivíduos com nódulos palpáveis já apresentam

metástases cervicais. Essas metástases podem ocorrer em lin-

fonodos cervicais e mediastinais ou em órgãos à distancia

principalmente cérebro, pulmões, fígado e ossos. É importante

ressaltar que 25% dos pacientes com metástases gangliona-

res cervicais, sem evidência de outras metástases à distância,

podem ser curados por uma ressecção cirúrgica com esvazia-

mento ganglionar cervical, salientando a importância nessa

doença do diagnóstico realizado num estágio precoce.

Feocromocitoma

O FEO ocorre em 50% dos pacientes NEM2A e NEM2B.

Algumas peculiaridades podem ter implicações na investiga-

ção diagnóstica e estratégia terapêutica. Quando associado

a NEM2, o FEO é bilateral em mais de 50% dos casos. Inclu-

sive, em virtude da multicentricidade característica da NEM2,

acredita-se que potencialmente todos os casos apresentari-

am envolvimento bilateral, embora não sincrônico entre as

glândulas. Outro ponto importante é a localização invariável

do FEO na medula adrenal. Os raros relatos de FEO extra-

adrenal nessa síndrome surgem de restos de tecido adrenal

ou representam recorrência de um FEO na região anatômica

da glândula adrenal. Este tecido expressa a enzima

feniletanolamina-N-metil-transferase, que catalisa a metilação

da noradrenalina para adrenalina. Por conseguinte, o tipo de

catecolamina mais produzido pelo FEO associado ao NEM2

é a adrenalina, ocasionando a clínica de palpitações, nervo-

sismo, inquietação e ausência de hipertensão. É incomum o

FEO preceder o desenvolvimento do CMT ou ser a manifes-

tação inicial do NEM2, e alguns autores sugerem que os FEO

familiares podem ter comportamento mais indolente e menos

sintomático que as variantes esporádicas. O rastreamento

deve ser feito anualmente até os 35 anos, basicamente com

dosagens urinárias de catecolaminas e metanefrinas, embo-

ra as medidas de metanefrinas e normetanefrina plasmáticas

sejam mais sensíveis

. A maioria dos autores concorda que

a avaliação por imagens (tomografia, ressonância magnética

e 131-meta-iodo-benzilguanidina) deve ser reservada para

quando existir alteração bioquímica.

Hiperparatireoidismo

A baixa freqüência — apenas 25% dos casos — torna di-

fícil estudar a história natural do HPT na NEM2. Clinicamen-

te, é semelhante ao HPT esporádico, embora seja observada

uma maior freqüência de HPT assintomáticos na NEM2. A

hiperplasia de múltiplas paratireóides é mais freqüentemente

encontrada que adenomas múltiplos. O diagnóstico é estabe-

lecido pelo achado PTH sérico alto ou inapropriadamente

normal na presença de hipercalcemia.

Líquen Amilóide Cutâneo

Lesão cutânea descrita como pruriginosa e pigmentada na

região interescapular ou superfícies extensoras da extremida-

de, com deposição amilóide no local. Talvez resulte de uma

neuropatia primaria.

Doença de Hirshsprung

Ausência congênita dos gânglios autonômicos intesti-

nais, que se apresenta geralmente como obstrução intestinal

neonatal grave.

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

336

ASPECTOS GENÉTICOS

A causa genética dessas síndromes envolve mutações no

proto-oncogene RET, no lócus 10q11.2. O gene RET esten-

de-se por 50kb e contém 21 éxons, todos codificantes

. A

proteína RET é um receptor tirosina-quinase envolvido na

regulação do crescimento, sobrevida, diferenciação e migra-

ção de células da linhagem da crista neural. Vários fatores

neurotróficos têm sido identificados como ligantes de RET:

GDNF, Nerturina, Persepina e Artemina, e co-ligantes: GFR-

α1, GFR-α2, GFR-α3 e GFR-α4. Não obstante a necessidade

deste tetrâmero complexo para ativar a sinalização via RET, as

mutações associadas a NEM2 têm sido encontradas apenas

no gene RET (Fig. 29.6.3).

Apesar de todos os éxons serem codificantes, as muta-

ções ativadoras causadoras de NEM2 se agrupam em éxons

de regiões de particular importância para a função da molé-

cula. Assim, na região extracelular, o domínio rico em cisteí-

nas, fundamental para que ocorra a ligação ao ligante e

dimerização, pré-requisito para ativação, é onde estão 80%

das mutações relacionadas a NEM2. As demais mutações

descritas estão em sítios de função catalítica tirosina-quina-

se ou em alça de reconhecimento de substrato intracelular

A localização da mutação no gene RET apresenta uma re-

lação com a expressão do subtipo clínico. Deste modo, a

maioria das mutações relacionadas a NEM2A e CMT-F são

substituições das cisteínas nos éxons 10 e 11. Particularmen-

te, a mutação na cisteína 634, éxon 11, é a mais freqüentemen-

te encontrada e tem sido associada ao surgimento de FEO e

HPT

. A mutação Met918Thr, no éxon 16, localizada no do-

mínio tirosina-quinase alterando a especificidade do substra-

to intracelular, está associada às características fenotípicas

NEM2B. Mutações nos éxons 13, 14 e 15 (códons 768, 804,

891) têm sido descritas em fenótipos CMT-F.

A relação genótipo/fenótipo tem sido direcionada para a

idade ao diagnóstico e a presença de metástases, que são

importantes fatores prognósticos, conforme já descrito. Além

disso, estudos in vitro demonstram diferenças na ativação

oncogênica de acordo com o tipo de mutação. Isso permite

uma classificação na literatura das mutações como de alto ris-

co: 611, 618, 629 e 634, que são mutações nas quais se reco-

menda intervenção terapêutica mais precoce, e outras consi-

deradas de menor risco, nos códons 609, 768, 790, 791, 804 e

891, geralmente com início mais tardio da doença e, especu-

la-se, cuja tireoidectomia poderia ser postergada.

ASPECTOS TERAPÊUTICOS

No que diz respeito ao tratamento, continua válido que a

oportunidade de cura existe quando a cirurgia é realizada num

estágio precoce da doença. Os protocolos de radioterapia e

quimioterapia convencionais não alcançam boa resposta, bem

como alguns variantes. Expectativas promissoras em relação

à terapia gênica têm surgido com a divulgação de estudos

experimentais

A indicação de tireoidectomia em indivíduo portador de

mutação do gene RET tem sido muito discutida. A maioria

dos grupos recomenda a intervenção, apoiada pelos relatos

de metástases em crianças com idade inferior a cinco anos.

Esse argumento sobrepujou os receios pelo risco cirúrgico

nesta faixa etária. A indicação é preferencialmente baseada

em resultados de análise genética. Assim, para mutações de

alto risco, o último consenso define a idade ideal para cirur-

gia como cinco anos para NEM2A e um ano para NEM2B

Fig. 29.6.3

— Representação gráfica dos domínios da proteína RET e da localização das mutações mais freqüentes associadas a NEM2.

RET

N-Terminal

Domínio

extracelular

Domínio

transmembrana

Domínio

citoplasmático

918

768

804

C-Terminal

Núcleo catalítico

tirosina Kinase

634

620

618

611

609

Ligante

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

337

CONCLUSÕES

O modelo da NEM2 é ímpar, oferecendo vários aspectos

patogenéticos fascinantes dentro do contexto dos estudos

de oncogênese molecular. Certamente o que coloca a NEM2

numa posição especial em relação a outras síndromes gené-

ticas é a utilidade da informação molecular na decisão tera-

pêutica. Excluir do seguimento clínico 50% dos membros fa-

miliares sem a mutação é um aspecto muito importante, mas,

sem dúvida, a transformação do prognóstico da doença pela

identificação dos genótipos mutantes tem sido o resultado de

maior impacto

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José Cláudio Casali da Rocha

29.7

Doença de Von Hippel-Lindau

INTRODUÇÃO

Desde 1864, alguns oftalmologistas começaram a relatar

que lesões angiomatosas da retina podiam ocasionar a per-

da da visão e algumas vezes estavam associadas a lesões

semelhantes no cerebelo. Somente em 1904 a natureza fami-

lial dos angiomas de retina foi reconhecida pelo oftalmologis-

ta alemão Eugen von Hippel (1867-1938) que denominou es-

tas lesões de angiomatosis retinae. No entanto, foi o pato-

logista sueco Arvin Lindau que em 1927 relatou que o heman-

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

338

gioblastoma (HB) de cerebelo e o angioma de retina (AR)

apresentavam a mesma morfologia sugerindo um mecanismo

patogênico semelhante, comum a esses tumores e de causa

hereditária. A associação com outros tumores, como carcino-

ma de células claras do rim (CR), feocromocitoma (FE), tumo-

res pancreáticos e cistoadenoma do epidídimo, entre outros,

vem sendo relatada na literatura apenas nas últimas décadas

do século XX. A primeira revisão da literatura veio com o clás-

sico estudo de Melbon e Rosen (1964) que estabeleceu os

critérios diagnósticos clínicos utilizados até hoje e descreveu

uma família extensamente afetada pela síndrome por eles de-

nominada de “Von Hippel-Lindau” (VHL)

A doença de Von Hippel-Lindau (VHL) é uma doença he-

reditária multissistêmica, causada por mutação no gene VHL

que predispõe o portador a manifestações benignas e malig-

nas em diversos órgãos. O início dos sintomas pode ocorrer

a partir dos primeiros anos de vida e inclui, entre outros,

angioma de retina; hemangioblastoma (HB) de sistema nervo-

so central (SNC); feocromocitoma (FE); carcinoma renal do

tipo células claras (CR) e cistos múltiplos renais, pancreáti-

cos, hepáticos e de epidídimo.

O diagnóstico clínico baseia-se em critérios que conside-

ram a história familial e a apresentação clínica das lesões.

Muitas vezes, o diagnóstico é dificultado ou retardado até

que estes critérios sejam preenchidos. A idade do início da

doença é variável e depende da expressividade da doença no

indivíduo e da intensidade do rastreamento de lesões assin-

tomáticas. Assim, um programa de rastreamento intensivo

pode aumentar significativamente o número de indivíduos

afetados na família. O aconselhamento genético e os avanços

dos métodos de diagnóstico e de tratamento vêm mudando

o curso desta enfermidade com a diminuição da morbidade e

da mortalidade, contribuindo para a melhoria da qualidade de

vida das famílias afetadas por esse mal e para o entendimen-

to da doença

QUADRO CLÍNICO

A doença de VHL é uma doença multissistêmica e de apre-

sentação clínica variada. Uma característica peculiar desta

síndrome é a combinação de tumores malignos e benignos em

mais de dez órgãos-alvo diferentes. As manifestações clíni-

cas podem ocorrer ao longo de toda a vida do indivíduo.

Aproximadamente 60,2% dos pacientes desenvolvem HB ce-

rebelar; 41%, AR; 25,3%, carcinoma renal de células claras

(CR); 14,5%, HB espinhal e 14,5%, FE (Fig. 29.7.1). Relativa-

mente, poucos pacientes desenvolvem todas as manifesta-

ções da doença e cerca de 50% dos pacientes têm apenas

uma manifestação. Os cistos são, na grande maioria das ve-

zes, assintomáticos e representam os achados clínicos mais

freqüentes. Afetam principalmente o rim e o pâncreas e são

geralmente múltiplos

A seguir, são discutidas as manifestações mais caracte-

rísticas da doença de VHL.

ANGIOMA DE RETINA

O AR é geralmente a manifestação mais precoce da doen-

ça. O AR é indistinguível morfologicamente do HB do cere-

belo sendo de apresentação comum na doença VHL, com ida-

de média de diagnóstico aos 25 anos (variando de 1 a 67

anos). O oftalmologista tem um papel crítico no diagnóstico

da doença, uma vez que 43% dos pacientes apresentam AR

como primeira manifestação clínica. Apesar de ser freqüente-

mente assintomático, o AR pode causar danos visuais gra-

ves à medida que atinge maiores proporções ou quando está

Fig. 29.7.1

— Incidência cumulativa dos casos de angioma de retina (AR), hemangioblastoma (HB) do SNC e de carcinoma renal do

tipo células claras (CR) pela idade do diagnóstico destas lesões (adaptado de Choyke e col. (1995)

1,0

0.8

0,6

0,4

0,2

0,0

010

60 70

Idade (anos)

Probabilidade

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

339

localizado centralmente. O tratamento consiste na fotocoagu-

lação a laser para lesões diagnosticadas precocemente, crio-

terapia para lesões maiores, e enucleação nos casos graves

HEMANGIOBLASTOMA DO SNC

Os HB do SNC localizam-se preferencialmente no cerebe-

lo, na medula espinhal e mais raramente no cérebro. Apenas

2% dos HB do SNC ocorrem no parênquima cerebral. Clini-

camente, o HB na doença de VHL desenvolve-se quase in-

variavelmente antes dos 50 anos, e a idade média de diagnós-

tico é aos 29 anos (variando de 11 a 78 anos). Os HB tendem

a ocorrer de forma múltipla, e freqüentemente apresentam

componentes císticos e sólidos. Devido ao seu crescimento

lento, muitas vezes são assintomáticos. Os sintomas podem

ser intermitentes como cefaléia, vertigem, vômito, ataxia, fala

arrastada, nistágmo, dismetria e paralisia do nono par crania-

no, até quadros neurológicos agudos graves com perdas

sensoriais e motoras dependendo da localização da lesão. O

tratamento primário das lesões sintomáticas consiste na

exérese cirúrgica da lesão. Em casos especiais, os tratamen-

tos com radioterapia ou radiocirurgia têm sido utilizados para

o controle da progressão das lesões

CARCINOMA RENAL

O tipo histológico dos CR de pacientes com VHL é tipi-

camente de células claras e em 35% das vezes se apresentam

clinicamente com componente cístico. A idade média do diag-

nóstico é aos 37 anos, variando de 16 a 76 anos. O CR, as-

sociado à doença de VHL, ocorre em uma idade menor quan-

do comparado com o seu correspondente esporádico (em tor-

no dos 62 anos), é mais freqüentemente bilateral (mais de

75% dos pacientes portadores de VHL) e multicêntrico em

87% dos casos. Além disso, o CR da doença de VHL parece

apresentar uma taxa de crescimento menor e metástase mais

tardia em relação à forma esporádica (não hereditária)

1,8

LESÕES PANCREÁTICAS

Lesões pancreáticas, incluindo cistos, cistoadenomas,

tumores neuroendócrinos, adenocarcinoma, hemangioblasto-

ma e metástase de carcinoma renal, têm sido descritas asso-

ciadas a VHL

. Recentemente, o envolvimento pancreático na

evolução da doença foi estudado em 158 pacientes consecu-

tivos pertencentes a 94 famílias francesas. O envolvimento

pancreático foi observado em 77,2% dos pacientes e incluíam

cistos pancreáticos (91,1%), tumores neuroendócrinos (12,3%)

e lesões combinadas (11,5%). O pâncreas foi o único órgão afe-

tado em 7,6% dos pacientes. As lesões pancreáticas necessi-

taram de intervenção cirúrgica em apenas 8,2%, quando sinto-

máticas ou para ressecção de tumores neuroendócrinos

FEOCROMOCITOMA

As famílias que apresentam fenótipo associado à FE fre-

qüentemente desenvolvem o FE antes de outras manifesta-

ções da doença. A média de idade ao diagnóstico do FE em

VHL é de 29 ± 14 anos (variando de 5 a 62 anos). Freqüente-

mente, o FE é bilateral (cerca de 42%), podendo apresentar-

se como tumor extra-adrenal (paraganglioma) ou mesmo como

um FE maligno

OUTRAS MANIFESTAÇÕES

O cistoadenoma do epidídimo ocorre em 10 a 26% dos

pacientes com VHL. Tumores de saco endolinfático têm sido

descritos em associação com VHL em 11% dos pacientes

ocasionando perda auditiva, zumbido e paresia (N.R.: não

seria paralesia?) facial e, portanto, devem ser considerados no

rastreamento clínico dos indivíduos com diagnóstico de

VHL

. Manifestações paraneoplásicas podem ocorrer, como

policetemia secundária associada ao HB do cerebelo (5 a

20%) ou ao tumor renal. Recentemente, a presença de muta-

ções germinativas no gene VHL em pacientes com policetemia

congênita sugerem que este quadro seja uma das formas va-

riantes da doença de VHL

ASPECTOS GENÉTICOS

A doença de VHL tem sido encontrada em todos os gru-

pos étnicos. Estudo epidemiológicos revelaram uma incidên-

cia de 1/39.000 a 1/53.000 nascimentos e uma prevalência de

1/31.000 a 1/85.000. Devido à raridade e à diversidade clínica

desta doença, é provável que muitos casos sejam subestima-

dos. A penetrância é de 97% em torno dos 60 anos. A sín-

drome VHL é hereditária e segue um padrão de herança au-

tossômico dominante, afetando igualmente ambos os sexos

e predispondo a prole a uma chance de 50% de herdar um

alelo com mutação de um dos pais com a doença.

Ocasionalmente, uma mutação de novo no gene ocorre na

ovogênese, espermatogênese ou mesmo nas fases iniciais da

embriogênese, dando origem a um indivíduo afetado cujos

pais não são afetados pela doença VHL. A incidência estima-

da de mutação de novo é menor que 5% das mutações detec-

tadas. Porém, estudos recentes com detecção de mutação

germinativa em tumores “aparentemente esporádicos” suge-

rem que este número seja maior.

A suspeita de que o gene implicado na doença de VHL

poderia estar situado no braço curto do cromossomo 3 veio

através do estudo de famílias com CR hereditário, cujos mem-

bros afetados apresentavam na análise do cariótipo uma que-

bra no braço curto do cromossomo 3 e translocação do seg-

mento quebrado para o cromossomo 8. Este achado levou

aos estudos genéticos de ligação (Linkage) com foco no cro-

mossomo 3 nas décadas de 1980 que resultaram na localiza-

ção do gene na região 3p25-26. Em 1993, o gene VHL foi iden-

tificado por pesquisadores no Instituto Nacional do Câncer

(NCI) nos Estados Unidos

. Desde então, enormes avanços

vêm sendo alcançados no entendimento da fisiopatologia e

da tumorigênese desta doença.

CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS

Embora muitas vezes os testes genéticos sejam de enor-

me valor para o diagnóstico de VHL, os critérios diagnósti-

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

340

cos utilizados para a doença de VHL são essencialmente ba-

seados nos achados clínicos. Na presença de uma história fa-

milial positiva para a doença de VHL, o diagnóstico clínico

pode ser feito pela identificação de uma única manifestação

característica da síndrome: AR, HB do SNC, tumores renais, FE,

cistos pancreáticos múltiplos, ou cistoadenoma papilífero de

epidídimo. Na ausência de história familial, é necessário o diag-

nóstico de pelo menos duas lesões características, e uma de-

las deve ser AR ou HB do SNC

. Os cistos renais e de epidí-

dimo são muito freqüentes na população geral para serem con-

siderados sinais confiáveis para o diagnóstico de VHL e, por-

tanto, não devem ser considerados lesões características.

CLASSIFICAÇÃO DE VHL E CORRELAÇÃO

GENÓTIPO-FENÓTIPO

Em decorrência da sua enorme heterogeneidade clínica, a

síndrome VHL tem sido classificada pela ausência ou presen-

ça de FE na família em VHL tipo 1 e VHL tipo 2 (7 a 20%), res-

pectivamente. Posteriormente, a observação de que as famí-

lias com VHL tipo 2 (com FE) cursavam com espectros clíni-

cos diferentes dependendo do tipo de mutação permitiu a

subdivisão em: tipo 2A (com FE, com AR e/ou HB, sem CR);

tipo 2B (com FE, com AR e/ou HB, com CR); e tipo 2C (com

FE, sem AR e/ou HB, sem CR)

. A policetemia congênita as-

sociada com mutações germinativas no gene VHL tem sido

recentemente classificada como VHL tipo 3

As evidências que justificam esta classificação foram ba-

seadas na correlação entre o genótipo e o fenótipo apresen-

tado por estas famílias. As famílias com VHL tipo 1 freqüen-

temente apresentam grandes deleções e mutações pontuais

que causam uma terminação prematura da transcrição gênica

(microdeleções e inserções e mutações non-sense) resultan-

do em uma proteína truncada, enquanto 96% do grupo com

VHL tipo 2 apresentam mutações do tipo missense

O GENE VHL

O gene VHL (3p25-26) foi clonado em 1993, é composto

por três éxons e apresenta dois códons de início da transcri-

ção produzindo duas proteínas funcionais de 160 e 213 ami-

noácidos, respectivamente. O cDNA do gene VHL possui

1810pb em extensão com uma fase aberta de leitura (Open

Reading Frame) de 852pb. A expressão do gene VHL é ne-

cessária para a embriogênese, como foi demonstrado com ex-

perimentos em camundongos knock-out

Um maior entendimento do papel deste gene na tumori-

gênese foi alcançado com a identificação de alvos funcionais

da proteína VHL (pVHL). A pVHL é capaz de ligar-se forte e

especificamente com as subunidades B e C da Elongina SIII,

inibindo a sua atividade transcricional. Nos pacientes com

doença VHL, a mutação no gene VHL interfere com este me-

canismo de controle, acelerando o processo transcricional e

favorecendo o crescimento celular

. Aproximadamente 50%

das mutações no gene VHL afetam o domínio α da pVHL,

nos resíduos de contato com a Elongina C.

O papel da pVHL na angiogênese tumoral colocou o fa-

tor de crescimento vascular endotelial (VEGF) como um dos

possíveis alvos da pVHL. Foi demonstrado que a pVHL pode

inibir a transcrição do gene VEGF, e a presença da pVHL

intacta é necessária para a via de angiogênese induzida por

hipoxia. Desta forma, demonstrou-se que a hipoxia induzia a

transcrição de mRNAs, como o mRNA de VEGF, PDGF-B (ca-

deia B do fator de crescimento derivado de plaqueta) e de

GLUT1, através de uma via mediada pela pVHL. Além deste

efeito transcricional em VEGF, foi demonstrado que a pVHL

também age interferindo na estabilidade do mRNA de VEGF

tendo, deste modo, um efeito pós-transcricional. Assim, a

pVHL íntegra é necessária para a desestabilização do mRNA

de VEGF sob condições normóxicas. Maxwell e col. (1999)

demonstraram que o mediador da pVHL na regulação da res-

posta à hipoxia é o HIF1 (hipoxia-inducible factor-1)

. A

pVHL íntegra tem uma ação de ubiqüitinação das subunida-

des α de HIF1 (HIFα) na presença de oxigênio, marcando-a

para degradação pelo proteassoma 26S. Células deficientes de

pVHL são incapazes de degradar as subunidades HIFα pro-

duzindo a ativação constitutiva dos genes induzidos por HIF

e contribuindo para o fenótipo angiogênico dos tumores re-

lacionados ao VHL

TESTE GENÉTICO

Até hoje, aproximadamente 600 famílias com VHL já foram

identificadas na Europa, nos Estados Unidos e no Japão sen-

do caracterizadas mais de 200 mutações germinativas distin-

tas no gene VHL nestas famílias. O diagnóstico molecular da

doença baseia-se na aplicação de técnicas de biologia mole-

cular que visam à detecção de mutações germinativas no

gene VHL. Historicamente, a detecção de mutações variava

de 36 a 82%, dependendo das técnicas utilizadas. Mais re-

centemente, com os avanços na análise das mutações com a

combinação das técnicas de seqüenciamento, Southern-blot

quantitativo e FISH, tem sido possível detectar mutações ger-

minativas no gene VHL de 73 a 100% dos probandos

15,18

Aproximadamente 20% dos pacientes com mutações germi-

nativas do gene VHL apresentam grandes deleções detecta-

das por Southern-blot ou por FISH, 27% têm mutações tipo

missense e 27% mutações non-sense ou frameshift. Métodos

de pré-rastreamento de mutação têm sido propostos antes do

seqüenciamento de diversos genes, e o SSCP (single strand

conformational polymorfism) é uma das técnicas mais utili-

zadas. Recentemente, a técnica DHPLC (denaturing high

performance liquid chromatography) revelou-se um método

prático e bastante sensível.

O teste genético em pacientes com VHL permite avaliar a

amplitude do fenótipo da doença baseado no estudo de ou-

tras famílias com a mesma mutação. Também pode ser utilizado

como teste preditivo, selecionando os indivíduos considera-

dos como de alto risco e, portanto, candidatos ao programa

de rastreamento clínico de lesões. A pesquisa de mutação no

gene VHL é particularmente importante nos indivíduos com

lesões relacionadas a VHL sem história familial. Como todos

os tumores associados à doença de VHL também ocorrem de

forma esporádica, o diagnóstico clínico de casos de novo

pode ser dificultado ou mesmo pode ser retardado até que

critérios mínimos sejam conseguidos.

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

341

No Brasil, o teste genético para pesquisa de mutação no

gene VHL está disponível desde 1998. Este estudo possibi-

litou a avaliação de 83 indivíduos pertencentes a 20 famílias

com diagnóstico clínico de VHL. A taxa de 100% de detecção

de mutação foi alcançada através da combinação das técni-

cas de seqüenciamento direto e de Southern-blot quantita-

tivo. Das mutações deletérias encontradas, oito nunca havi-

am sido descritas anteriormente em outras populações e cor-

respondem a 50% das mutações pontuais. A correlação en-

tre o genótipo e o fenótipo apresentado pelas famílias refor-

ça algumas observações descritas na literatura. O fenótipo de

VHL tipo 1 foi associado com mutações potencialmente de-

letérias à proteína VHL e o fenótipo VHL tipo 2 foi associa-

do a mutações do tipo missense. Especificamente, a mutação

no códon 167 do gene VHL se correlacionou com um alto ris-

co para o desenvolvimento de feocromocitoma apresentado

em duas famílias com VHL. O perfil clínico da doença de VHL

no Brasil mostra semelhanças de incidência e idade de apre-

sentação com outros países onde a doença foi estudada. No

entanto, 12 famílias (60%) foram caracterizadas como de alto

risco para o desenvolvimento de CR, baseado na ocorrência

familial e nas características intrínsecas das mutações. Três

das quatro famílias com grandes deleções apresentavam alta

incidência de HB do SNC. Também foi observada uma ten-

dência das mutações concentrarem-se principalmente nos

éxons 1 e 2 do gene VHL incluindo as regiões de emenda

(85,5%). Este estudo contribuiu para o entendimento da

doença de Von Hippel-Lindau no Brasil, possibilitou o diag-

nóstico precoce através do teste molecular, bem como inter-

veio na história natural da doença nas famílias com VHL atra-

vés do aconselhamento genético oncológico e do programa

de rastreamento de lesões

ACONSELHAMENTO GENÉTICO

O aconselhamento do risco de câncer familial serve tan-

to para analisar os fatores de risco para o desenvolvimento

dos tumores nos membros das famílias, bem como para infor-

mar as opções disponíveis para a prevenção e para o trata-

mento precoce das lesões. O aconselhamento genético fami-

lial é educativo no sentido que orienta os membros da famí-

lia a compreenderem os aspectos clínicos e hereditários rela-

tivos à doença e a escolherem alternativas de ação preventi-

vas e terapêuticas. São discutidos aspectos epidemiológicos

e genéticos da origem dos tumores e o espectro da apresen-

tação clínica, diagnóstico e tratamento da doença. O aconse-

lhamento também consiste na atuação direta do geneticista

sobre os aspectos psicossociais do paciente visando à redu-

ção da ansiedade, adaptação à carga de estresse relaciona-

da à doença, conforto no luto e ajuda na decisão sobre o teste

genético.

Nos membros assintomáticos da família, o enfoque prin-

cipal é o preventivo. A identificação dos indivíduos de alto

risco na família permite ao geneticista dirigir o programa de

rastreamento clínico para estes indivíduos. O rastreamento

clínico é um programa de prevenção e de detecção precoce

das lesões recomendado à população de risco, com impacto

positivo na redução da morbidade e na mortalidade da doen-

ça

. A estimativa do risco é baseada na análise do heredo-

grama, após cuidadosa coleta da história familial. Sempre que

possível é importante obter documentos que comprovem a

ocorrência das lesões nos familiares afetados. Os indivíduos

assintomáticos de primeiro e de segundo grau relacionados

ao paciente têm um risco de 50 e 25% respectivamente de se-

rem portadores da mutação germinativa no gene VHL e, por-

tanto, são considerados para avaliação molecular com o tes-

te genético.

O teste positivo define a população de alto risco para a

doença VHL que deve seguir um estreito acompanhamento

em programa especial de rastreamento clínico (Tabela 29.7.1).

Familiares de primeiro e de segundo grau que aguardam o re-

sultado do teste genético ou que não foram testados são

considerados clinicamente como alto risco e também devem

ser incluídos no programa de rastreamento clínico regular.

Mesmo os testes positivos não significam que o portador se

tornará sintomático no futuro. Por isso, é recomendado que

indivíduos sob risco sejam encaminhados para aconselha-

mento genético com um geneticista clínico, antes mesmo do

teste.

Como a doença de VHL é multissistêmica, é recomenda-

do que os pacientes e seus familiares de risco sejam acom-

panhados por uma equipe multidisciplinar constituída pelos

profissionais médicos e de apoio das diversas especialidades

relacionadas às manifestações clínicas da doença de VHL,

como geneticista clínico, urologista, neurocirurgião, oftalmo-

logista, endocrinologista, psicólogo, enfermeira, assistente

Tabela 29.7.1

Programa de Rastreamento Clínico de Lesões para Indivíduos Considerados como Alto Risco para a

Doença de VHL, de Acordo com o Consenso de Especialistas Reunidos no 5

Simpósio Internacional

da Doença de Von Hippel-Lindau, em Pádova (2002).

Exame Complementar Consenso de Especialistas em VHL

Catecolaminas urinárias. No mínimo uma vez ou se PA elevada.

Oftalmoscopia. A partir de seis anos anualmente.

Angiografia fluoresceínica. Não é rotina.

TC ou RM cerebral e espinhal. Iniciar aos 20 anos e repetir a cada três anos.

US ou TC ou RM abdominal. Iniciar entre 15-20 anos e repetir anualmente.

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

342

social, nutricionista, entre outros. Logo que o diagnóstico de

VHL seja suspeitado, o geneticista clínico deve ser consul-

tado para coordenar os vários exames necessários para ava-

liar completamente o probando e também para identificar por-

tadores assintomáticos entre seus familiares.

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Fernanda Teresa de Lima

29.8

Neurofibromatose Tipo I

INTRODUÇÃO

As neurofibromatoses são doenças genéticas que afetam

primariamente o crescimento celular de tecidos neurais

. Fo-

ram descritas como doenças neurocutâneas, facomatoses,

neurocristopatias e defeitos mesodérmicos

, como uma sín-

drome de predisposição hereditária ao câncer

e como sín-

drome macrossômica

Constituem um grupo heterogêneo de doenças, sendo

a forma mais comum a neurofibromatose tipo 1 (NF1), tam-

bém conhecida como doença de Von Recklinghausen

. A

segunda forma mais freqüente é a NF2, caracterizada por

schwannomas vestibulares bilaterais. As formas alterna-

tivas da NF1 são definidas como condições que apresen-

tam algumas das características clássicas, mas não de

uma maneira típica, e incluem fenótipo de deleção total

do gene, forma mista e formas localizadas. Outras formas

representam variantes com manifestações adicionais atí-

picas, podendo ou não cumprir os critérios diagnósticos

da doença

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

343

A NF1 afeta cerca de 1:3.500 indivíduos com uma preva-

lência variando de 2 a 4,6 em dez mil nascidos vivos em dife-

rentes estudos, sem diferir nas várias populações estudadas

Cerca de 50% de todos os pacientes com NF1 não têm historia

familial positiva, e, portanto, constituem casos de novo.

A NF1 é uma doença autossômica dominante com pene-

trância completa, com uma alta taxa de mutações

. O mosai-

cismo germinativo em portadores de NF1 pode sugerir não-

penetrância, e está associado à patogênese dos raros casos

de NF1 segmentar. A penetrância completa implica um baixo

risco de recorrência para a irmandade de afetados (portado-

res de uma mutação de novo) cujos pais são normais. Como

a doença apresenta uma grande variabilidade clínica, os pais

devem ser submetidos à avaliação clínica e complementar

antes de serem definidos como não-afetados

QUADRO CLÍNICO

A NF1 tem uma expressão muito variável, entre diferen-

tes famílias, entre diferentes indivíduos de uma mesma famí-

lia e entre diferentes segmentos de um mesmo indivíduo. É

progressiva, com diferentes manifestações clínicas nas dife-

rentes faixas etárias

1,6,18

. A seguir, são discutidas as principais

manifestações clínicas da NF1.

NEUROFIBROMAS

Os neurofibromas são tumores benignos que surgem da

bainha dos nervos periféricos, compostos principalmente por

células de Schwann e podem ser classificados como discre-

tos (cutâneos ou subcutâneos) ou plexiformes (nodulares ou

difusos)

Os neurofibromas cutâneos, sésseis ou pedunculados, se

movem quando a pele é movida e raramente causam dor. Os

neurofibromas subcutâneos geralmente são ovóides ou es-

féricos e pode-se deslizar a pele sobre eles, causando dor ao

comprimir os nervos

. Ambos se apresentam como massas

com margens bem definidas, raramente estão presentes ao

nascimento e podem estar associados a prurido

Os neurofibromas plexiformes são tumores que se esten-

dem ao longo do nervo, podendo crescer exageradamente e

causar desfiguração, apresentando ramificações digitiformes

que se insinuam nos tecidos adjacentes normais, tornando a

remoção cirúrgica completa praticamente impossível

. Ao en-

volver a pele, podem apresentar hiperpigmentação e

hipertricose. Os neurofibromas plexiformes difusos que en-

volvem a pele geralmente se tornam aparentes nos primeiros

dois anos de vida. Os neurofibromas plexiformes podem

malignizar, dando origem aos tumores malignos da bainha dos

nervos periféricos (TMBNP), antes denominados

neurofibrossarcomas ou schwannomas malignos

MANCHAS CAFÉ-COM-LEITE

As manchas café-com-leite típicas da NF1 são ovóides, de

cor uniforme e bordas bem definidas. Podem ocorrer em qual-

quer lugar do corpo. São caracterizadas histologicamente pela

presença de melanossomos gigantes dentro dos melanócitos

EFÉLIDES

As efélides, ou sardas, podem ser similares à cor das

manchas café-com-leite, mas geralmente tem entre 1 a 3mm de

diâmetro e ocorrem agrupadas. Podem aparecer de maneira

difusa sobre o tronco e extremidades proximais, mas geral-

mente estão restritas a regiões intertriginosas e de superpo-

sição de pele, especialmente regiões axilares, inguinais, pal-

pebrais superiores, cervicais e inframamárias. As efélides axi-

lares podem estar presentes ao nascimento, mas geralmente

aparecem na infância tardia, como as efélides nas outras re-

giões

NÓDULOS DE LISCH

Os nódulos de Lisch são hamartomas pigmentados pre-

sentes na íris, geralmente bilaterais. Não estão associados a

comprometimento visual e são observados por lâmpada de

fenda. Desenvolvem-se em função da idade, geralmente após

os 10 anos

GLIOMAS ÓPTICOS

Os gliomas ópticos são astrocitomas pilocíticos grau I

(WHO), ocorrendo normalmente nas vias ópticas anteriores,

geralmente benignos

. O período de maior risco para o de-

senvolvimento de gliomas ópticos sintomáticos é durante os

primeiros seis anos de vida e seu curso, na NF1, parece ser

mais benigno que nos casos esporádicos. Podem se compor-

tar de duas maneiras: nunca causar sintomas e serem desco-

bertos somente por neuroimagem, ou crescerem a ponto de

causar sintomas, até se estabilizarem, raramente progredindo.

Os gliomas ópticos, além dos sintomas visuais, podem cau-

sar puberdade precoce

. Nos negros com NF1, a ocorrência

de gliomas ópticos é menor

LESÕES ÓSSEAS

A escoliose displástica e a pseudoartrose tibial são as le-

sões ósseas mais graves da NF1. O abaulamento dos ossos

longos e afilamento dos córtex são lesões displásticas con-

gênitas e podem complicar com pseudoartrose e fraturas pa-

tológicas

OUTRAS MANIFESTAÇÕES E COMPLICAÇÕES

Outras manifestações e complicações estão apresentadas

na Tabela 29.8.1.

AVALIAÇÃO CLÍNICA E CONDUTA

CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS

Os critérios diagnósticos estão listados na Tabela 29.8.2

Esses critérios têm alta especificidade e sensibilidade em adul-

tos11, mas, nos primeiros anos, as crianças podem não

preenchê-los, uma vez que os sinais da NF1 são idade-depen-

dentes

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

344

Avaliação Clínica Inicial

A abordagem inicial de pacientes com NF1 deve constar

de detalhada anamnese, dando ênfase aos sinais e sintomas

da NF1; exame físico, com antropometria, medida da pressão

arterial (PA), avaliação da pele, inspeção dos ossos longos

e coluna; exame neurológico; exame oftalmológico e avalia-

ção de outros membros da família

É consenso que estudos de neuroimagem não precisam

ser realizados de rotina e que devem ser solicitados na pre-

sença de sintomas, como convulsões, macrocefalia, puberda-

de precoce, alterações da aprendizagem, ou sintomas oftalmo-

lógicos

. Outros exames complementares também devem ser

solicitados caso haja sintomas

História Natural da Doença, Acompanhamento e

Tratamento

O acompanhamento do paciente com NF1 deve ser mul-

tidisciplinar e anual

ou de acordo com os sintomas

. Huson

(1989) recomenda que seja semestral para crianças, uma vez

que a maior parte das complicações se desenvolve nessa faixa

etária

. Os principais sinais e sintomas que devem ser moni-

torados de acordo com cada faixa etária estão listados na Ta-

bela 29.8.3. Avaliações oftalmológicas devem ser realizadas

anualmente

. Existem recomendações especiais para o acom-

panhamento dos pacientes de acordo com a idade

2,11,12,16

. Na

presença de qualquer alteração, em qualquer faixa etária, o

paciente deve ser referido a um especialista, para realizar in-

vestigação e tratamento adequados

2,11

Não existe um tratamento específico para a NF1

. O tra-

tamento é voltado para as complicações, à medida que ocor-

rem, que são tratadas como o seriam se isoladas, e à sua an-

tecipação e prevenção

2,12

MORBIDADE E MORTALIDADE

A NF1 é uma doença progressiva, imprevisível e associa-

da com um aumento da mortalidade por causas relacionadas

à doença e diminuição da expectativa de vida. A maior cau-

Tabela 29.8.1

Complicações da NF1

7,9,12,17

Esqueléticas Neurológicas Endócrinas Neoplásicas Cardiovasculares

Displasia da asa do esfenóide Alterações de coordenação Puberdade precoce TMBNP HAS

motora ou tardia

Displasias craniofaciais Déficit cognitivo Gliomas Vasculopatias

Displasias vertebrais Alterações psiquiátricas Feocromocitomas Cardiopatias congênitas

Deformidades esternais Cefaléia Tumores derivados Estenose da artéria renal

de células da crista

neural

Genu varum/

valgum

Epilepsia Tumores carcinóides

Pseudoartrose Estenose de aqueduto Rabdomiossarcomas

Lesões líticas ósseas Alterações

cerebrovasculares

Baixa estatura

Macrocefalia

Escoliose

Tabela 29.8.2

Critérios Diagnósticos de NF1

NF1 está presente em um paciente com dois ou mais dos seguintes critérios:

• Seis ou mais manchas café-com-leite > 5mm no maior diâmetro em indivíduos pré-puberais ou > 15mm após a puberdade.

• Dois ou mais neurofibromas de qualquer tipo ou um ou mais neurofibromas plexiformes.

• Sardas nas regiões axilares ou inguinais (sinal de Crowe).

• Um tumor na via óptica.

• Dois ou mais nódulos de Lisch (hamartomas da íris).

• Uma lesão óssea distinta, como displasia da asa do esfenóide ou espessamento do córtex de ossos longos com ou sem pseudo-

artrose.

• Um parente de primeiro grau com NF1 que preencha os critérios acima.

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

345

sa de morte está relacionada à malignidade. A morbidade da

doença está relacionada à progressão dos vários sinais e sin-

tomas já descritos

GENÉTICA

ESTRUTURA E EXPRESSÃO GÊNICAS

O gene da NF1 está localizado em 17q11.2

e tem uma es-

trutura complexa. O cDNA contém 8.454 nucleotídeos e a re-

gião codificadora cobre cerca de 335kb de DNA genômico

É transcrito na direção centrômero-telômero. Foram identifi-

cados 60 éxons, numerados de 1 a 49, alguns subdivididos e

designados por letras

Existem vários locus homólogos ao lócus da NF1, que re-

presentam pseudogenes não processados causados por du-

plicações repetidas do lócus da NF1

. Foi sugerido que es-

tes pseudogenes fossem responsáveis pela alta taxa de mu-

tações encontradas no gene NF1, por conversão gênica en-

tre o lócus NF1 e os pseudogenes

Dentro do intron 27b existem três outros genes, cada um

com dois éxons, transcritos na direção oposta à transcrição

do gene NF1. O gene EVI2A codifica um peptídeo de 232

aminoácidos, expresso no cérebro e medula óssea, com um

domínio transmembrana. O gene EVI2B codifica um peptídeo

de 448 aminoácidos, de função desconhecida. O gene OMGP

codifica um peptídeo de 416 aminoácidos expresso na super-

fície celular de oligodendrócidos. Não foram identificados

fenótipos associados à inativação de qualquer um desses

genes

A região 3’ não traduzida se estende por 3,5kb após o si-

nal de parada da tradução e é altamente conservada, o que

sugere que seja importante na estabilidade do mRNA

. O

mRNA tem cerca de 12 a 14kb, identificado em todos os te-

cidos, em baixos níveis. Existem três isoformas geradas por

splicing alternativo, com diferentes padrões de expressão. A

forma mais comum inclui o éxon 23a, que está dentro do úni-

co domínio funcional identificado, apresenta diminuição da

atividade catalítica da enzima codificada

. A isoforma com o

éxon 48a é expressa em derivados musculares e a isoforma

com o éxon 9a é expressa somente no cérebro durante a em-

briogênese

. O mRNA também sofre um processo regulató-

rio pós-transcricional, onde a base 3.916 no éxon 23-1 é

deaminada de C para U, gerando uma parada prematura da

leitura no códon 1.303. Foram encontrados diferentes níveis

de mRNA editado em TMBNPs, neurofiromas benignos e as-

trocitomas, especulando-se que a inativação do alelo normal

por edição do mRNA leve a uma proliferação celular anor-

mal

FUNÇÃO PROTÉICA

O gene NF1 codifica a proteína neurofibromina, de 2.818

aminoácidos e 327kD, com uma região de homologia com a

família de proteínas ativadoras de GTPase (GAP), o domínio

relacionado a GAPs (GRD). O GRD pode estimular a ativida-

de GTPase intrínseca de ras

18,19

. O gene RAS é um proto-

oncogene que codifica a proteína RAS, membro de uma su-

perfamília de proteínas G que estão ativas quando ligadas a

GTP e inativas quando ligadas a GDP. Uma das vias de trans-

dução de sinal mediada por RAS é a via RAF-MAP quinases.

A proteína RAS-GTP ativada envia sinais, através de uma

fosfoinositol 3’quinase (PI3-quinase), que inibem a apopto-

se e, através da via RAF-MAP quinase, sinais que estimulam

a proliferação celular. A neurofibromina inativa RAS-GTP e a

diminuição de seus níveis levam a um aumento da sinalização

através da via RAF-MAP quinase e PI3 quinase, aumentan-

do a proliferação e a sobrevivência celular

MUTAÇÕES E FENÓTIPOS

A análise de mutações nos pacientes com NF1 é de difí-

cil execução devido ao grande tamanho do gene e à falta de

pontos quentes de mutação. Várias metodologias foram uti-

lizadas, tais como heteroduplex e SSCP para triagem de mu-

tações e análise por Southern blot e FISH para triagem de

grandes deleções. A maior parte dos estudos, baseados na

análise do DNA, encontrou mutação em cerca de 20% dos

pacientes e se concentrou no GRD. O método mais efetivo é

o teste da proteína truncada (PTT), que detecta mutações

confirmadas por seqüenciamento em cerca de 70% dos pa-

cientes

18,19

Vários tipos de alterações no gene foram encontrados,

incluindo anomalias cromossômicas; deleção de todo o gene,

de vários éxons ou pequenas deleções intragênicas; inser-

ções e mutações de ponto

. A maior parte das mutações re-

sulta em uma proteína truncada

. Mutações idênticas são

pouco comuns. A mutação mais comum identificada é a subs-

Tabela 29.8.3

Principais sinais/sintomas, de acordo com a faixa etária

2,11

Primeiros Dois Anos Pré-escolar Escolar Adolescência Adultos

neurofibromas plexiformes desenvolvimento puberal escoliose neurofibroma

estatura dificuldade de aprendizado neurofibroma HAS

perímetro cefálico gliomas DNMP neoplasias

displasias ósseas sardas alterações de comportamento

manchas café-com-leite cefaléia distúrbios do crescimento

escoliose

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

346

tituição C5839T no éxon 31

. A maior parte das mutações de

ponto tem origem paterna e a maior parte das deleções

intragênicas ocorre durante a ocogênese materna

18,19

A variedade de mutações encontradas sugere que sejam

geradas por muitos mecanismos diferentes. Não existe uma

correlação entre a mutação e o fenótipo resultante, excetuan-

do-se os fenótipos associados a grandes deleções do gene,

que sugerem que genes contíguos ao gene NF1 possam ser

importantes no desenvolvimento do fenótipo

A variabilidade clínica observada na NF1 é uma questão

intrigante, que pode ser em parte explicada por inativação do

alelo normal em células somáticas, o que está relacionado

com algumas neoplasias e com mosaicismo somático

. Outras

hipóteses levantadas, pela observação de agrupamento fami-

liar de algumas características da NF1, foi a existência de ge-

nes modificadores ou atuação de genes envolvidos em tra-

ços limitados ao sexo masculino

. Também foi sugerido que

fatores ambientais, como traumas mecânicos pudessem estar

envolvidos no desenvolvimento de neurofibromas cutâneos

NEOPLASIAS

Entre as neoplasias mais comuns estão os tumores malig-

nos de bainha do nervo periférico (TMBNP), tumores difíceis

de detectar e de mau prognóstico. Devem ser suspeitados

quando o paciente desenvolve intensa dor sem explicação

plausível, aumento rápido no tamanho ou mudança na con-

sistência de um neurofibroma plexiforme ou déficit neuroló-

gico

. Os TMBNPs devem ser biopsiados e removidos cirur-

gicamente com amplas margens livres sempre que possível.

O tratamento oncológico deve ser idêntico à de tumores de

tecidos moles de pacientes não-NF1. A radioterapia auxilia no

controle local e pode retardar o início de uma recidiva, mas

tem pouco efeito na sobrevida em longo prazo. Existem con-

trovérsias quanto ao uso de quimioterapia, que pode ser be-

néfica para tumores localizados em locais de difícil acesso à

radioterapia

. Foi demonstrado que esses tumores exibem

perda da expressão do gene NF1 e aumento da ativação do

ras, além de outras alterações genéticas (p27-Kip1, p53, p16).

Pacientes com microdeleções do gene NF1 tem um risco mai-

or de desenvolvê-los

Além dos gliomas ópticos, já discutidos anteriormente

nesse capítulo, os gliomas na NF1 podem ocorrer em qual-

quer ponto do neuroaxis e apresentam maior freqüência de

progressão maligna que tumores semelhantes na população

em geral, sem NF1

Os pacientes com NF1 apresentam um risco maior para

desenvolver neoplasias hematológicas, especialmente leuce-

mia mielomonocítica crônica, leucemia linfoblástica aguda e

linfoma não-Hodgkin. Foi relatado que pacientes com NF1 e

xantogranuloma juvenil podem apresentar um risco maior para

leucemia mielóide crônica juvenil, embora essa associação

não seja conclusiva

. As células leucêmicas nos pacientes

com NF1 apresentam perda de heterozigosidade do gene NF1

e a perda da neurofibromina foi associada com um aumento

da ativação do ras

Dentre as neoplasias, os feocromocitomas têm uma forte

associação com NF1. A maioria está na medula adrenal, 10%

são bilaterais e 10% são malignos. Geralmente, são detecta-

dos na idade adulta e os pacientes apresentam hipertensão

arterial sistêmica (HAS), agitação e ansiedade imotivadas, ta-

quicardia e sudorese excessiva. Níveis elevados de epinefri-

na estão associados com HAS intermitente e níveis elevados

de norepinefrina, com a HAS mantida. Além disso, pode ha-

ver alteração do metabolismo da glicose

. A glândula adre-

nal normal expressa o mRNA do gene NF1 contendo o éxon

23a, e os feocromocitomas expressam o mRNA sem esse éxon.

O significado deste fato não está ainda esclarecido, mas su-

põe-se que esteja relacionado com a patogênese tumoral

Outros tumores derivados de células da crista neural fo-

ram descritos, incluindo carcinoma medular de tireóide e me-

lanomas. A expressão do gene NF1 é alta nas células deriva-

das da crista neural, o que sugere que a perda da expressão

gênica desregule o crescimento desses tecidos, levando ao

aparecimento de neoplasias

Na NF1, tumores carcinóides ocorrem com maior freqüên-

cia na raça negra. Geralmente, são diagnosticados entre a

quarta e a sexta década de vida e aparecem na região da am-

pola de Vater. Quase todos contêm somatostatina. Os pacien-

tes com feocromocitoma são especialmente propensos a

desenvolvê-los e vice-versa

. Outros tumores endócrinos

descritos em pacientes com NF1 incluem adenomas de para-

tireóide e carcinomas de tireóide

Os rabdomiossarcomas ocorrem em 1 a 2% dos pacientes

com NF1, sendo a maioria embrionária. A distribuição dos

tumores não difere da distribuição na população sem NF1. À

existência de uma isoforma músculo-específica da neurofibro-

mina, sugere-se que o gene NF1 deva ter uma função espe-

cífica durante a diferenciação da célula muscular e que a per-

da da expressão protéica esteja associada a uma maior proli-

feração dessas células

A associação entre tumor de Wilms e NF1 é controversa

e não comprovada. No entanto, crianças com NF1 e tumores

embrionários parecem ser mais susceptíveis ao desenvolvi-

mento de neoplasias secundárias após quimioterapia e radio-

terapia

MODELOS ANIMAIS

Homólogos da neurofibromina foram estudados na leve-

dura e na Drosophila, mas foi o desenvolvimento de camun-

dongos transgênicos que possibilitou o seu estudo em um

sistema biológico semelhante ao humano

. Animais knock-

out convencionais possibilitaram o estudo da função gênica

e desenvolvimento de knock-outs condicionais permitiu o

estudo da função da neurofibromina em tecidos específicos,

o que é particularmente útil para o estudo da tumorigênese.

Outra abordagem para o estudo da formação tumoral envol-

ve a geração de animais heterozigotos para mutações no gene

nf1 e outros genes supressores de tumores relevantes. A

existência de isoformas da neurofibromina levou à constru-

ção de animais deficientes em éxons específicos relacionados

às isoformas. O estudo desses animais pode contribuir para

o entendimento de fatores genéticos e biológicos determinan-

tes da tumorigênese e fornecer informações cruciais que per-

mitam o desenvolvimento de alvos moleculares para o desen-

volvimento de potenciais drogas terapêuticas

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

347

ACONSELHAMENTO GENÉTICO

O aconselhamento genético deve ser oferecido para todas

as famílias portadoras de NF1. O risco de NF1 para cada des-

cendente de um portador é de 50%, independente do sexo. É

importante ressaltar que existe uma grande variabilidade clí-

nica da doença e que não existem ainda maneiras de se pre-

ver a gravidade e a evolução

O diagnóstico pré-natal pode ser realizado por análise di-

reta de mutações, quando um dos pais já tem o diagnóstico

molecular ou por análise de ligação, se na família houver

membros afetados disponíveis e marcadores informativos

suficientes para sua realização

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FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

348

INTRODUÇÃO

O retinoblastoma é o tumor intra-ocular maligno mais co-

mum da infância originando-se da membrana neuroectodér-

mica da retina embrionária. Pode ser unilateral ou bilateral,

unifocal ou multifocal. Ocorre na forma hereditária (40%) e

esporádica (não-hereditária) em 60% dos casos.

É creditado a Petrus Pawius a primeira descrição na lite-

ratura de um retinoblastoma. Ele descreveu um tumor ocular

maligno que invadia a órbita e a região temporal. Dunphy

acredita que a primeira descrição do sinal chamado reflexo de

olho de gato foi descrita por Hayes em 1767, porém outros

historiadores atribuem o termo a George Joseph Beer que en-

fatizou o sinal diagnóstico. Foi apenas em 1809 que o retino-

blastoma foi descrito como uma entidade por James

Wardrop

No Brasil, a incidência de retinoblastoma ainda é desco-

nhecida. Estudos realizados em outros países demonstraram

uma incidência em torno de 1/18.000-30.000 nascidos-vivos

dependendo do país. Não existe uma aparente predileção ra-

cial ou sexual. Cerca de 90% dos diagnósticos são feitos an-

tes dos sete anos de idade. Os tumores bilaterais são diag-

nosticados por volta de 13 meses de vida e os unilaterais por

volta de 24 meses

Cerca de 90% dos pacientes com retinoblastoma sobrevi-

vem ao tumor. Pacientes com tumores bilaterais ou unilate-

rais-multifocais apresentam uma predisposição genética ao

desenvolvimento de tumores secundários, e a mortalidade

nesses indivíduos é maior que naqueles que apresentam

mutações somáticas. O diagnóstico precoce torna maior a

possibilidade de cura e a conservação do globo ocular e da

visão.

QUADRO CLÍNICO E DIAGNÓSTICO

No Brasil, muitas vezes o diagnóstico é tardio fazendo

com que grande parte dos retinoblastomas tenham apresen-

tação extra-ocular, que é de pior prognóstico. As manifesta-

ções clínicas encontradas vão depender da localização do

tumor, do seu tamanho e da época do diagnóstico. A mani-

festação clínica mais freqüente nos retinoblastomas intra-

oculares é a leucocoria ( reflexo do olho de gato) que está pre-

sente em cerca de 70% dos casos e que geralmente é descri-

ta pelos pais. Outras manifestações clínicas podem ser encon-

tradas: estrabismo em 20% dos casos (divergente ou conver-

gente), protusão do globo ocular, hiperemia, glaucoma (10%),

heterocromia, dilatação pupilar. No retinoblastoma extra-ocu-

lar, as manifestações clínicas dependem de quais estruturas

Marli de Castro Pereira Rio

29.9

Retinoblastoma Hereditário

foram afetadas, podendo encontrar manifestações como uma

massa na região orbitária, proptose, sinais neurológicos fo-

cais, cefaléia, vômito. O retinoblastoma é considerado

unifocal se apenas um tumor está presente, e multifocal se

mais de um tumor está presente.

Pacientes com deleções envolvendo o cromossomo 13

podem apresentar algumas dismorfias faciais e malformações

características como: lóbulo da orelha antevertido e espesso,

testa alta, filtro proeminente e nariz curto

O diagnóstico clínico é feito através do exame de fundo

de olho por oftalmoscopia indireta. Outros exames podem ser

realizados com o intuito de encontrar outras alterações pre-

sentes nos quadros de retinoblastoma e servem para nos

mostrar quais estruturas foram acometidas e em que estágio

se encontra o tumor. A ecografia é precisa em detectar calci-

ficações intra-oculares quando comparada com raio X de crâ-

nio. A tomografia computadorizada de crânio é importante

para avaliar o envolvimento do nervo óptico, as estruturas

orbitárias ou metástases cerebrais. Raramente, o retinoblas-

toma bilateral pode estar associado ao envolvimento da hi-

pófise; neste caso, é referido como retinoblastoma trilateral

(retinoblastoma bilateral + pinealoma).

Para o estadiamento do tumor, os seguintes exames são

realizados: tomografia computadorizada de crânio e órbita;

mapeamento ósseo com tecnésio; ultra-sonografia abdominal;

punção lombar com exame citológico do líquor e mielograma

O diagnostico diferencial de retinoblastoma deve ser fei-

to com:

• Doença de Coats (retinite exudativa);

• Esclerose tuberosa;

• Doença de Norrie;

• Incontinentia pigmenti;

• Vítreoretinopatia exudativa familial;

• Manifestações oculares do Toxocara canis (granulo-

ma larval).

O tratamento varia de acordo com a extensão do tumor, as

estruturas acometidas e o estadiamento. Os tipos de trata-

mento utilizados incluem: quimioterapia, radioterapia, criote-

rapia, fotocoagulação e enucleação.

GENÉTICA DO RETINOBLASTOMA

Em 60% dos casos, o retinoblastoma é esporádico, sem

história familiar positiva e acomete apenas um dos olhos (uni-

lateral), fruto de duas mutações somáticas, não predispõem

a um risco aumentado de tumores extra-oculares. Cerca de

40% dos retinoblastomas são da forma hereditária. Destes

apenas ¼ apresentam um padrão familial (com outros familia-

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

349

res afetados), e a maioria, ou ¾ dos casos, é considerada de

novo.

O retinoblastoma hereditário tem herança autossômica

dominante, isto é, existe um risco de 50% de transmitir a pre-

disposição ou o retinoblastoma para seus descendentes. A

penetrância, chance de um genótipo ter qualquer expressão

fenotípica, é maior que 90% (Fig. 29.9.1).

Os retinoblastomas hereditários podem acometer um olho

(unilateral) em 15% dos casos (geralmente multifocal), ou

dois olhos (bilateral) em 25% dos pacientes. Os tumores bi-

laterais são sempre hereditários. A distinção destas formas

do retinoblastoma tem importantes implicações para os pa-

cientes e suas famílias. A Tabela 29.9.1 mostra algumas carac-

terísticas que podem ajudar-nos na diferenciação.

Alguns casos de retinoblastoma hereditário com baixa

penetrância têm sido descritos na literatura. A penetrância

incompleta é acompanhada de baixa expressividade (retino-

blastoma unilateral). Alelos com baixa penetrância resultam

em inativação parcial da função do gene RB1.

O GENE RB1

Em 1971, Alfred Knudson postulou que duas mutações

no mesmo lócus eram necessárias para que o retinoblastoma

se desenvolvesse (hipótese de Knudson). Assim, na forma

hereditária, uma mutação no gene RB1 é herdada e a outra,

adquirida. A primeira mutação ocorre na célula germinativa e

está presente em cada célula do corpo humano. A segunda

mutação ocorre em células somáticas da retina desencadean-

do o aparecimento do tumor. O primeiro evento pode ser her-

dado de um dos progenitores, ou a mutação acontecer duran-

te a embriogênese, neste caso chamado de mutação de novo.

O alelo mutante, embora seja transmitido de forma autossô-

mica dominante, é recessivo ao nível celular, uma vez que é

um gene supressor de tumor. A segunda mutação, necessá-

ria para que o tumor se desenvolva, leva à perda ou inativa-

ção do alelo normal no homólogo RB1 remanescente, geral-

mente por perda da heterozigosidade (LOH). A perda da he-

terozigosidade pode ser resultado de deleções ou rearranjos

cromossômicos como não disjunção ou recombinação

mitótica.

Existe um balanço entre os sinais estimuladores e inibido-

res de crescimento interagindo todas as células que formam

o organismo. Uma perturbação desse balanço pode levar as

células a se proliferarem desordenadamente e fora de contro-

le, resultando em aparecimento de câncer. Múltiplos mecanis-

mos controlam a diferenciação e a proliferação, mas o gene

do retinoblastoma tem um papel importante nesse processo.

O retinoblastoma foi o primeiro câncer a ser relacionado com

um tipo de defeito genético específico

O gene RB1 é um gene supressor de tumor, e está locali-

zado no braço longo do cromossomo 13 (13q14). Da mesma

forma que outros genes supressores de tumor, o gene RB1

inibe a proliferação das células. O gene RB1 foi descoberto

em 1986 por Dryja e col., contém 27 éxons, ocupa uma exten-

são de 180kb do genoma e transcreve um RNA mensageiro

de 4,7kb, com uma fase aberta de leitura (ORF) de 2,7kb. A

proteína RB (pRB) apresenta 110KDa (p110), é uma fosfopro-

teína nuclear composta de 928 aminoácidos. Outros dois pro-

dutos do gene RB1, p107 e p130 foram identificados e tam-

bém estão envolvidos na indução de retinoblastoma em ca-

mundongos transgênicos. A pRB, p107 e a p130 constituem

uma pequena família de proteínas que compartilham seqüên-

cias similares

Os genes TP53 e RB1 participam na regulação da trans-

crição do DNA, impedindo que a célula saia do estágio G1 e

entre na fase S do ciclo celular. A pRB atua por regulação

negativa na progressão do ciclo celular, é hipofosforilada na

fase GO e início de G1, (mediado por uma quinase dependen-

te de ciclina — cdk2), e permanece fosforilada na fase S, G2

e durante a mitose. Durante a fase G1 do ciclo celular, a pRB,

forma hipofosforilada, liga-se a E2F causando a repressão da

transcrição dos genes mediados por estes genes. Quando a

pRB é fosforilada no final da fase G1, os fatores E2F são li-

Fig. 29.9.1

— Heredograma de uma família com retinoblastoma hereditário.

RB bilateral,

1ano

RB bilateral, 1 ano

Osteossarcoma, 16 anos

RB bilateral,

6 meses

RB bilateral,

6 meses

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

350

berados e promovem a expressão de genes que é necessária

para a divisão celular. A pRB fosforilada (resíduos de treoni-

na da pRB) encontra-se inativada por uma alteração da sua

estrutura conformacional que libera a proteína E2F, um impor-

tante fator de transcrição. A atividade da pRB é controlada

pelas cdk e inibidores de cdk

A inativação da regulação da pRB é um evento inicial ne-

cessário para o desenvolvimento do retinoblastoma e também

está envolvido com a tumorigênese de outras neoplasias

como os osteossarcomas e melanomas.

MUTAÇÕES GERMINATIVAS NO GENE RB1 E

CORRELAÇÃO GENÓTIPO-FENÓTIPO

O espectro das mutações do gene RB1 varia desde alte-

rações cromossômicas (deleções citogenéticas), genômicas

(deleções submicroscópicas), bem como intragênicas (muta-

ções de ponto). As mutações pontuais incluem tanto subs-

tituições de bases únicas, quanto pequenas deleções e inser-

ções, até mesmo mutações complexas (Tabela 29.9.2). Cerca

de 400 mutações germinativas distintas no gene RB1 já foram

relatadas em pacientes com retinoblastoma através do estu-

do do DNA. Cerca de 85-90% das mutações resultam de ter-

minação prematura de um códon, através de substituição úni-

ca de bases, mutações frameshift, ou mutações intrônicas em

sítios de splicing.

Na maioria das famílias com retinoblastoma, todos os

membros que herdaram a mutação germinativa desenvolvem

múltiplos tumores em ambos os olhos. Muitas dessas famíli-

as segregam alelos nulos que são alteradas por mutações

non-sense ou frameshift. Algumas famílias têm baixa pene-

trância com expressividade reduzida (prevalência aumentada

em retinoblastoma unilateral) e penetrância incompleta (25%

ou menos). Esta baixa penetrância parece estar associada com

uma mutação dos alelos RB1 mostrando mutação na região

promotora do gene RB1 ou mutação tipo missense na região

codificadora. Uma terceira categoria de famílias mostra pene-

trância reduzida, mas a expressividade não está reduzida em

membros de uma família com retinoblastoma

Deleções visíveis ao exame citogenético envolvendo 13q14

resultam em deleções de outros genes na mesma região cro-

mossômica podendo causar atraso de desenvolvimento e

dismorfismo facial moderado

. Pequenas deleções do 13q14

mostram reduzida expressividade, uma proporção considerável

destes pacientes mostram retinoblastoma unilateral apenas.

ACONSELHAMENTO GENÉTICO

É importante ressaltar que os pacientes que apresentam

a forma hereditária, com mutação germinativa RB1, têm risco

aumentado para desenvolvimento de tumores extra-oculares.

Outros tumores observados nestes pacientes são: osteossar-

Tabela 29.9.1

Características do Retinoblastoma Hereditário e do Não-hereditário

Hereditário (40%) Não-hereditário (60%)

Tipo de Tumor 25% bilateral 15% unilateral 100% unilateral

História Familiar 10% positiva 30% negativa (

de novo

) 100% negativa

Idade ao Diagnóstico < 1 ano ~24 meses

Tipo de Mutação Mutação germinativa Mutação somática

Risco para outros tumores Tumores ósseos Risco de osteossarcoma secundário

Câncer de pele (associado ao tratamento)

Pinealoma

Outros tumores

Tabela 29.9.2

Distribuição das Mutações Intragênicas do Gene

RB1

em 19 Relatos Internacionais pelo País de Origem

Tipo de Mutação Alemanha França Reino Unido Japão Argentina Estados Unidos Total (%)

Non-sense

41 14 25 2 1 0 83 ( 43)

Frameshift

27 20 12 5 3 0 67 ( 35)

Intron 9 5 4 4 0 1 23 (12 )

Missense

2 5 3 1 0 0 11 ( 6)

Deleção

in-frame

4 1 0 0 0 0 5 ( 3)

Promotor 0 0 1 0 0 2 3 ( 2 )

Total 83 45 45 12 4 3 192

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

351

coma, sarcoma de tecidos moles e melanoma. Estes tumores

geralmente se manifestam na adolescência ou na fase adul-

ta. A incidência de tumores secundários é aumentada em

mais de 50% em pacientes tratados com radioterapia.

Os familiares de primeiro grau (pais e irmãos) de pacien-

tes com retinoblastoma hereditário sem história familiar de-

vem ser investigados com fundo de olho. Nesses casos, há

indicação do exame oftalmológico dos pais à procura de

retinomas ou retinocitomas, que é a lesão cicatricial de um

retinoblastoma que sofreu regressão espontânea. Do ponto

de vista genético, tem o mesmo significado que o retinoblas-

toma causado por inativação do gene RB1.

Alguns exames laboratoriais estão disponíveis e nos au-

xiliam no diagnóstico e no aconselhamento genético. O es-

tudo citogenético dos linfócitos do sangue periférico (por

cariótipo ou por FISH) detecta deleções visíveis ou rearran-

jos envolvendo 13q14.-q14.2. É recomendado que esse estu-

do tenha resolução de cerca de 600-650 bandas e que pelo

menos 30 metáfises sejam analisadas. As alterações em mo-

saico estão presentes em cerca de 1% dos pacientes. No en-

tanto, estes exames só mostram anomalias cromossômicas em

apenas 7,5% dos pacientes com retinoblastoma bilateral. Isso

ocorre porque a análise citogenética tem baixa resolução e

detecta apenas as grandes alterações. A técnica de Southern-

blot pode detectar pequenos rearranjos do DNA em 16% dos

pacientes. Técnicas moleculares mais sofisticadas podem

detectar pequenas mutações e vêm sendo usadas, incluindo

o SSCP (single strand conformational polymorphism), aná-

lise por heteroduplex, e o seqüenciamento direto. Essas téc-

nicas são capazes de detectar mudanças de um único par de

bases, e identificam a mutação germinativa em ate 75% dos

pacientes com retinoblastoma hereditário

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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chromosome 13 in q32: Report of 14 cases with 13q deletions

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N.R.: e a editora e cidade?

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tumors, gene and protein contribute to the understanding of

cancer. Edited by J K Cowell. Molecular genetics of cancer,

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5. Harbour JW. Overview of RB gene mutations in patients with

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6. Latorre MRDO. Epidemiologia dos tumores na infância. Acta

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7. Lohmann DR et al. Retinoblastoma. Disponível na Internet:

http://www.geneclinics.org. N.R.: data de acesso?

Patricia Ashton-Prolla

Charles André Carvalho

29.10

Melanoma Familiar

INTRODUÇÃO

O primeiro relato de melanoma data de 1820 e descreve

uma família com suspeita de suscetibilidade hereditária à

doença. No entanto, somente a partir de 1983, análises gené-

ticas formais identificaram um padrão de herança autossômica

dominante em algumas famílias. Síndromes de suscetibilida-

de hereditária ao câncer (SSHC) podem ser definidas, no sen-

tido mais amplo, como agrupamentos de certos tipos de neo-

plasias em determinada família com uma freqüência maior do

que a esperada para a população em geral. Atualmente, a

grande maioria das SSHC está associada a mutações germi-

nativas em genes específicos, incluindo genes supressores

de tumor, oncogenes ou genes envolvidos com o reparo do

DNA. Nem sempre é fácil diagnosticar uma SSHC consideran-

do unicamente dados clínicos, já que tumores esporádicos

podem simular uma predisposição familiar

. Atualmente, o

melanoma é considerado um modelo de doença multifatorial,

onde fatores genéticos e ambientais estão envolvidos.

O melanoma é a primeira causa de morte por doenças de

pele e representa cerca de 1% de todos os tumores malignos.

Associado à elevada morbi-mortalidade, sua incidência tem

aumentado dramaticamente nas últimas quatro décadas em

diversos países industrializados. Nos EUA, 44.200 novos ca-

sos foram registrados em 1999, resultando em 7.300 mortes

;

para 2002, projetam-se 53 000 novos casos

. (N.R.: informa-

ção defasada; fala-se em projeção de 53 mil novos casos para

2002, ano passado!) Entre 1973 e 1998, a incidência e a mor-

talidade por melanoma neste país aumentaram continuamen-

te, em taxas superiores àquelas da maioria das outras neopla-

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

352

sias passíveis de prevenção

. Este aumento no número de

novos casos pode dever-se a um diagnóstico mais precoce

e eficaz e/ou a um aumento real na incidência. O envelheci-

mento marcado da população nos países industrializados ex-

plica grande parte deste fenômeno, associado ao aumento

genérico na incidência de outras neoplasias malignas. No

entanto, as mudanças culturais que levaram ao aumento na

exposição solar, particularmente a valorização crescente do

padrão de pele bronzeada, também podem ter contribuído

para o aumento das taxas de incidência de melanoma ao lon-

go de décadas. É fato que o diagnóstico do melanoma tem

ocorrido em estágios mais precoces, resultando em importan-

te redução na mortalidade, mas isso não parece ser o princi-

pal determinante da tendência secular de aumento na sua in-

cidência. No Brasil, estima-se que cerca de quatro mil novos

casos (INCA, 1999) sejam diagnosticados anualmente, o que

provavelmente é um sub-registro dos números reais

2,8

A idade média ao diagnóstico de melanoma na população

geral é de 57 anos para os homens e 50 anos para as mulhe-

res

. Por outro lado, em indivíduos de alto risco para mela-

noma hereditário, esta média se antecipa para 36 anos em ho-

mens e 29 anos em mulheres. Além da idade mais precoce ao

diagnóstico, os pacientes com melanoma familiar têm maior

incidência de múltiplos melanomas primários

Como a mortalidade por melanoma é diretamente propor-

cional ao estágio de desenvolvimento da doença, a identifi-

cação de indivíduos geneticamente predispostos poderá ser

importante para direcionar intervenções de vigilância, diag-

nóstico precoce e tratamento curativo.

GENES ASSOCIADOS AO MELANOMA FAMILIAR

Quatro a 15% dos indivíduos diagnosticados com mela-

noma apresentam história familiar positiva para esta neopla-

sia. Embora agrupamentos de casos de melanoma e/ou nevos

displásicos possam ocorrer em uma família devido a padrões

comuns de exposição solar e não a fatores genéticos, estima-

se que 5 a 7% de todos casos de melanoma sejam causados

por mutações germinativas em genes de suscetibilidade e se-

jam, portanto, hereditários. Até o presente momento, dois

genes associados a alto risco foram identificados: CDKN2A

e CDK4. Um terceiro gene — p14

ARF

— também poderá ser

enquadrado nesta categoria, bem como outros genes ainda

não identificados (em várias famílias com história compatível

há ausência de mutações nos genes descritos acima)

CDKN2A

Historicamente, análises de ligação, estudos citogenéti-

cos e de perda de heterozigosidade em indivíduos com forte

história familiar associaram o lócus 9p21 a um gene de sus-

cetibilidade ao melanoma. Este gene, p16

INK4A

/CDKN2A, foi

clonado em 1993 e formalmente associado a uma síndrome de

melanoma familiar em 1994. Ele codifica a proteína p16, que

inibe a atividade do complexo formado pela ciclina D1 com as

quinases ciclina-dependentes 4 (CDK4) ou 6 (CDK6). Este

complexo participa da fosforilação da proteína Rb, que per-

mite a progressão além da fase G1 do ciclo de divisão celu-

lar. A proteína p16, portanto, tem uma ação supressora de tu-

mor, através de regulação negativa do ciclo celular. A fre-

qüência de mutações no gene CDKN2A observada em vári-

os estudos de famílias afetadas com melanoma (América do

Norte, Austrália e Europa) varia de 5 a 50% (média 20%), de

acordo com os critérios de inclusão das famílias. A compila-

ção dos dados destes estudos indica que a freqüência de

mutações em CDKN2A aumenta com: a) o número de casos

de melanoma na família, b) a presença de indivíduos com múl-

tiplos melanomas primários e c) número de casos diagnosti-

cados antes dos 50 anos. Além disso, portadores de mutação

podem ter um risco aumentado de câncer de pâncreas e pro-

vavelmente de outros tumores também (carcinomas epider-

móides de cabeça e pescoço e tumores do sistema nervoso

central). Um excesso de casos de câncer de mama também

tem sido descrito em dois grupos de famílias (italianas e su-

ecas), mas esta observação aguarda confirmação em um nú-

mero maior de famílias. Além de famílias com múltiplos casos

de melanoma, mutações em CDKN2A têm sido identificadas

em 10% dos indivíduos com múltiplos melanomas primários

na ausência de história familiar. Deve ser ressaltado que a fre-

qüência de mutações neste gene na população geral não é

conhecida

CDK4

O gene CDK4 é um oncogene que está localizado no cro-

mossomo 12q13 e codificauma proteína quinase ciclina-de-

pendente do ciclo celular. Em todas as famílias de melanoma

que apresentam uma mutação (três descritas até o momento),

esta se localiza no códon 24 dentro do domínio que liga CDK4

à proteína p16

P14

ARF

O lócus p16 é peculiar pela sua capacidade de codificar

dois genes diferentes, a partir de quadros de leitura distintos.

O gene CDKN2A, que codifica p16, divide-se nos éxons E1a,

E2 e E3. O transcrito alternativo desta região inicia a partir do

éxon E1b (10 a 20 kb acima de E1a) e compreende também as

seqüências de E2 e E3, dando origem às proteínas p19

ARF

(em

camundongos) e p14

ARF

(em humanos), que não apresentam

homologia significativa de sua seqüência de aminoácidos

com p16, mas têm um papel importante de inibição do ciclo

celular

. Do ponto de vista funcional, ambos produtos

gênicos agem regulando negativamente a progressão do ci-

clo celular. A proteína p16 inibe competitivamente CDK4, que

é um fator necessário para a progressão das células através

de um ponto importante de transição do ciclo de divisão ce-

lular (após G1).

Alterações funcionais de p16 (por mutações de ponto ou

deleções) aumentam a probabilidade de que células com

DNA danificado escapem de processos de reparo antes da

divisão celular. A proteína p14

ARF

regula o crescimento celu-

lar através de efeitos independentes sobre a via regulatória

de p53. Sendo assim, p14

ARF

poderia ser um excelente candi-

dato à condição de terceiro gene associado com melanoma

hereditário. Recentemente, foram descritas quatro famílias

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

353

com múltiplos casos de melanoma e tumores do sistema ner-

voso central (SNC) que apresentavam mutações envolvendo

a perda funcional de p14

ARF

, associando de uma forma mais

definitiva esse gene à ocorrência de uma síndrome de mela-

noma e tumores do SNC

OUTROS GENES

A presença de mutações no gene BRCA2, associado à

síndrome de suscetibilidade hereditária ao câncer de mama e

ovário, também confere um risco aumentado de melanoma

assim como o diagnóstico de retinoblastoma, síndrome de Li-

Fraumeni, síndrome de Von Hippel-Lindau e xeroderma pig-

mentoso (Tabela 29.10.1)

OUTROS FATORES DE RISCO GENÉTICO PARA

MELANOMA

MC1R

Além das raras mutações deletérias em genes de alta pe-

netrância como CDKN2A e CDK4, variantes alélicas freqüen-

tes de genes de baixo risco estão provavelmente envolvidas

na suscetibilidade ao melanoma. Tais variantes alélicas pode-

riam agir como modificadores de genes de alto risco em famí-

lias afetadas ou como genes de suscetibilidade de baixa pe-

netrância em casos esporádicos ou famílias com poucos ca-

sos. Considerando a exposição à radiação ultravioleta e as

reações da pele a tal exposição como importantes fatores de

risco, é lógico pensar que alguns destes genes de baixa pe-

netrância estejam envolvidos com os processos de pigmen-

tação, reparo de DNA e metabolismo de carcinógenos. Nes-

se contexto, o único gene que confere um risco levemente

aumentado de melanoma até hoje identificado —

melanocortin-1 receptor gene (MC1R) — codifica uma pro-

teína que tem papel chave no processo de pigmentação da

pele. O gene, localizado em 16q24, é marcadamente

polimórfico em indivíduos brancos, com mais de 20 variantes

alélicas descritas. Estudos recentes mostraram que algumas

destas variantes modulam o tipo de pele, a capacidade de

bronzear, a cor do cabelo e o risco de melanoma, estabelecen-

do um elo de ligação entre estas características cutâneas e o

risco de desenvolver melanoma

NEUROFIBROMATOSE TIPO 1

Embora uma associação definitiva entre melanoma e neu-

rofibromas não tenha sido descrita até o momento, alguns

estudos sugerem tal possibilidade. Os melanócitos são res-

ponsáveis pelas características mais proeminentes da neuro-

fibromatose, (manchas café-com-leite e os nevos gigantes

congênitos) e, além disso, têm a mesma origem embrionária

da maioria dos tumores associados à neurofibromatose (neu-

roectoderma)

Uma observação interessante é a perda dos

dois alelos do gene NF1 na maioria das linhagens celulares

de melanoma, sugerindo que esse gene pudesse ter um pa-

pel importante no desenvolvimento ou na progressão do me-

lanoma

. Ainda, um estudo recente identificou uma mutação

germinativa afetando o processamento do RNA dos genes

CDKN2A e p14

ARF

em uma família com múltiplos casos de

melanoma e neurofibromas

INTERAÇÃO GENE-AMBIENTE

O risco que portadores de mutação em CDKN2A têm de

desenvolver melanoma (isto é, a penetrância) foi recentemen-

te estimado usando um total de 80 famílias provenientes da

Europa, América e Austrália. Esta análise, baseada em mode-

los de regressão logística, mostrou uma variação no risco de

melanoma de acordo com a origem geográfica: o risco cumu-

lativo de melanoma aos 80 anos de idade foi de 58% nas fa-

mílias européias, 76% nas famílias americanas e 91% nas fa-

mílias australianas. Estes achados sugerem uma interação de

CDKN2A com o grau de exposição solar, que por sua vez se

Tabela 29.10.1

Genes Associados a Melanoma Familiar

Gene Síndrome Locus

CDKN2A CDK4

Melanoma familiar 9p21 12q14

BRCA2

Síndrome de câncer de mama e ovário hereditários 13q12-q13

RB1

Retinoblastoma hereditário 13q14

TP53

Síndrome de Li-Fraumeni 17p13

VHL

Síndrome de Von Hippel-Lindau 3p25-p26

XPA

Xeroderma pigmentoso 9q34

XPB

2q21

XPC

3p25

XPD

19q13

XPE

11p12

XPF

16p13

XPG

13q32

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354

correlaciona com a latitude. Este risco independe do sexo do

indivíduo e do efeito funcional das diferentes mutações (isto

é, se alteram ou não p16 e p14

ARF

simultaneamente) e sugere

que os mesmos fatores que afetam a incidência de melanoma

em diferentes populações possam também mediar a penetrân-

cia de mutações em CDKN2A

ASPECTOS PRÁTICOS DO DIAGNÓSTICO E

MANEJO DO MELANOMA FAMILIAR

O primeiro passo para identificação de indivíduos em ris-

co para o melanoma familiar é a revisão detalhada da histó-

ria familiar, com a construção de heredograma de pelo menos

três gerações e confirmação dos diagnósticos de neoplasia

com laudos anátomo-patológicos sempre que possível. Em-

bora os casos mais evidentes sejam aqueles com múltiplos

afetados por melanoma na família, esses não são os mais co-

muns. A presença de melanoma e outra neoplasia maligna

primária ou de múltiplos melanomas primários no mesmo indi-

víduo deve sempre levantar a suspeita de um fator genético

predisponente, especialmente se os diagnósticos forem em

idade precoce. A presença de outros tumores na família não

exclui a possibilidade de uma síndrome de predisposição he-

reditária ao câncer e o diagnóstico específico dependerá dos

tipos e idades em que esses tumores não-melanoma ocorreram.

O Consórcio de Genética e Melanoma, um grupo interna-

cional de estudo do melanoma hereditário, concluiu recente-

mente que o nível de evidência atual não permite ainda utili-

zar o diagnóstico de uma mutação em CDKN2A como deter-

minante absoluto de condutas de prevenção e rastreamento.

Este mesmo grupo sugere que estudos genéticos do melano-

ma familiar sejam ainda realizados somente no contexto de

pesquisa

. Mesmo assim, vários investigadores sugeriram

que estratégias de prevenção e rastreamento intensivo sejam

oferecidas a indivíduos de risco. Estas recomendações de

manejo, baseadas em evidências de nível IV apenas centrali-

zam-se em dois aspectos principais: a) modificação de fato-

res de risco para o melanoma e b) o rastreamento com o ob-

jetivo de otimizar detecção e exérese precoce do melanoma

(Tabela 29.10.2). Estudos adicionais de seguimento em longo

prazo com grupos maiores de pacientes de diversas popula-

ções serão necessários para determinar a real eficácia destas

medidas em indivíduos de alto risco para o melanoma here-

ditário.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Andersen LB, Fountain JW, Gutmann DH et al. Mutations in

the neurofibromatosis 1 gene in sporadic malignant melanoma

cell lines. Nat Genet, 3(2):118-121, 1993.

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11. Kefford R, Bishop JN, Tucker M et al. Genetic testing for

melanoma. Lancet Oncol,Nov, 3(11):653-4, 2002.

Tabela 29.10.2

Recomendações de Manejo de Pacientes de Alto Risco para Melanoma

Modificação de Fatores de Risco Rastreamento

- proteção solar intensa com vestuário apropriado e filtros - exame dermatológico de base aos 10 anos

solares (FPS > 15; UVA/UVB) - educação quanto ao auto-exame mensal

- evitar queimaduras solares - exame dermatológico semestral incluindo genitália e escalpo até

- evitar exposição a fontes intensas de radiação UV estabilização dos nevos (exclui puberdade e gestação)

(bronzeadores artificias, exposição ocupacional) - exame dermatológico anual após estabilização dos nevos

- evitar imunossupressão e exposição a psoraleno + UVA - remoção de toda lesão pigmentada suspeita

- US abdominal anual em indivíduos com HF de câncer de pâncreas*

- fundoscopia anual em indivíduos com HF de melanoma ocular*

(*) Não existe qualquer evidência quanto à eficácia destas medidas.

Abreviações: FPS: fator de proteção solar; UV: ultravioleta; US: ultra-sonografia; HF: história familiar.

FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

355

12. Lindor NM, Greene MH and the Mayo Familial Cancer

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15. Miller BA et al. Cancer Statistics Review 1973 — 1989. NIH

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splicing mutation affecting both p16INK4 and p14arf RNA

processing in a melanoma/neurofibroma kindred. Gen Chrom

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19. Piepkorn M. Melanoma genetics: an update with focus on the

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FERREIRA ROCHA - ATHENEU - 1ª PROVA - 05/02/04 - PETRODADOS

356

Anexo 4 - Ficha de Avaliação Clínica

SÍNDROME DE LI-FRAUMENI

Identificação:

Nome: _____________________________________________________________________

Data de Nascimento: __________________Sexo: M/F Raça:_________ Religião_________

Endereço: _________________________________Cidade

: ________________Estado: ____

CEP:_________Telefone:

- _______ E-mail:

Manifestações Clínicas:

Tumores Único Múltiplo

ou bilat.

Idade ao

diagnóstico

Observações

( ) Sarcoma de partes moles

( ) Osteosarcoma

( ) Cancer adreno-cortical

( ) Tumor do sist. nervoso central

( ) Leucemia

( )Tumor de Wilms

( ) Câncer de mama

( ) Melanoma

( ) Câncer de pâncreas

( ) Tumor de próstata

( ) Linfoma

( ) Outros

Exames Realizados:

( )USG abdome. Data: __/__/__ Resultado: _____________________

( )USG tireóide Data:__/__/__ Resultado:_____________________

( )Mamografia/US de mama. Data: __/__/__ Resultado: _____________________

( )Biópsia de:_______________ Data: __/__/__ Resultado: _____________________

( )Outros: __________________Data: __/__/__ Resultado: _____________________

História Patológica Pregressa:

( ) Cirurgias:_____S/N. Qual:__________________________________Data:_______

( ) Doenças Prévias:_____S/N. Qual:____________________________Data:_______

( )Exposição ambiental:____________________________________Período: _______

Hábitos

( ) Tabaco:____S/N.N

de cigarros/dia: _________ Duração:_____________________

( ) Álcool:_____S/N.Doses/dia: _______________ Duração:_____________________

História Familial:

Heredograma:

Grau de

parentesco

Nome

(Iniciais)

Sexo Idade Atual Idade ao

diagnóstico

Tipo de Tumor

Anexo 5 Termo de Consentimento Pós-Informado

(Obrigatório para Pesquisa Clinica em Seres Humanos – Resolução CNS 196/96 e Resolução CNS 251/97 do

Ministério da Saúde)

Hospital do Câncer – A. C. Camargo – Fundação Antonio Prudente

Rua Prof. Antonio Prudente, 211 – Tel.3272-5000 – Fax. 3272-5088

I - DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO PACIENTE OU RESPONSÁVEL LEGAL

Nome do Paciente:_______________________________________________________________

Documento de Identidade: _________________________Data de Nascimento: _____/____/_____

Endereço:_____________________________________________N

______Complemento:______

Cidade:________________Estado:_____CEP:______-___Tel:(___)_________________________

II – DADOS SOBRE O ESTUDO

1- Título: “DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA SÍNDROME DE LI-FRAUMENI EM FAMÍLIAS

BRASILEIRAS”

2- Pesquisador: Dra. Maria Isabel Waddington Achatz CRM – 105322

no Laboratório de Genética do Câncer - Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer - São Paulo.

Telefone para contato: 9631-4796.

Início do Estudo: 15 de setembro de 2003.

III – EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU SEU REPRESENTANTE LEGAL

1- JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS DA PESQUISA: O diagnóstico da Síndrome de Li-Fraumeni é de grande

importância clínica para a prevenção de neoplasias em famílias portadoras, que apresentam maior propensão

ao desenvolvimento de múltiplos tumores. Este estudo visa realizar o diagnóstico molecular da Síndrome de

Li-Fraumeni, identificar e caracterizar as mutações no gene TP53 nos indivíduos portadores da doença.

2- PROCEDIMENTOS QUE SERÃO UTILIZADOS: Serão coletados 20 mL de sangue do paciente para

estudo de DNA. O gene TP53 será analisado por técnicas de biologia molecular visando a detecção da

mutação.

3- COMPLICAÇÕES E RISCOS ESPERADOS: A SLF é uma síndrome hereditária de predisposição ao

câncer. Estima-se que metade dos pacientes com Síndrome de Li-Fraumeni apresente desenvolva tumores

antes dos 30 anos de idade e que 90% dos portadores desenvolvam câncer até 70 anos de idade. O risco

aparenta ser maior em mulheres, em parte devido ao alto risco de desenvolvimento de câncer de mama.

Diversos tipos de tumores malignos estão diretamente relacionados à Síndrome de Li-Fraumeni, tais como

sarcoma, leucemia, tumores do sistema nervoso central, câncer adrenocortical e câncer de mama de início

em idade jovem. Estas lesões podem ser rastreadas e encontradas em estádios iniciais, permitindo

tratamento precoce e muitas vezes menos invasivo. O teste genético visa identificar a mutação no gene

TP53 e confirmar o diagnóstico clínico da doença. No entanto, em cerca de 30% dos casos na Síndrome de

Li-Fraumeni e em 50% dos casos na Síndrome de Li-Fraumeni like não é possível detectar a mutação pelos

métodos atuais.

4- BENEFÍCIOS QUE PODERÃO SER OBTIDOS: Este estudo permite o diagnóstico molecular da Síndrome

de Li-Fraumeni em famílias brasileiras, confirmando o diagnóstico clínico e caracterizando as mutações do

gene TP53. Uma vez identificada a mutação, o diagnóstico em familiares assintomáticos pode ser realizada,

seguida do aconselhamento genético das famílias acometidas. A realização do teste possibilita o

rastreamento de pacientes portadores da Síndrome de Li-Fraumeni que possivelmente desenvolverão algum

tumor típico, diminuindo desta forma os danos causados pelo tumor devido ao diagnóstico e tratamento

precoce. A caracterização da mutação no gene TP53 e a comparação com as mutações encontradas

anteriormente possibilitarão a melhor compreensão dos mecanismos da doença e o desenvolvimento de

estratégias de rastreamento mais eficazes. A detecção da mutação permite caracterizar o risco do paciente

como alto risco, quando o resultado for positivo, ou como baixo risco quando o exame for negativo (quando

não for encontrada a mesma mutação característica da família). Caso a mutação na família com o

diagnóstico clínico não seja encontrada, o teste será considerado inconclusivo.

5- Declaro ter sido esclarecido sobre a garantia de receber resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento

sobre procedimentos, riscos, benefícios ligados à pesquisa e ao tratamento e que serei informado quanto ao

desenvolvimento de novos exames relacionados.

SIM NÃO

6- Declaro estar ciente do meu direito de retirar meu consentimento a qualquer momento, sem que isso traga

prejuízo a continuidade do meu tratamento.

SIM NÃO

7- Declaro ter sido esclarecido que não receberei nenhum tipo de remuneração financeira.

SIM NÃO

8- Declaro ter sido esclarecida sobre a segurança de que minha identidade será preservada e que todas as

informações por mim fornecidas serão confidenciais.

SIM NÃO

9- CONSENTIMENTO PÓS-INFORMADO: Declaro ter sido esclarecido sobre as características da Síndrome

de Li-Fraumeni e sobre os benefícios e as limitações do teste genético ao qual serei submetido, conforme

definido nos itens 1 a 9, e consinto em participar na qualidade de paciente do projeto de pesquisa acima

descrito.

“Se o pesquisador principal não fornecer as informações/ esclarecimentos suficientes, por favor, entre em

contato com o Coordenador do Comitê de Ética do Hospital do Câncer – SP, pelo Telefone 2189-5000,

ramais 1113 ou 1117”.

São Paulo, ____de________________de______.

____________________________________ __________________________________

Assinatura do paciente ou responsável legal Assinatura e carimbo do pesquisador

Anexo 6 - Aprovação do Comitê de Ética

Anexo 7 - Heredogramas

Família Y1

Mutação Éxon 6,

R213Q, CG

Ampola de Vater (41)

III:23 III:1

II:5 II:6

III:2 III:3 III:4 III:5 III:6 III:7 III:8 III:9 III:10 III:11 III:12 III:13

IV:1

I:1 I:2

II:1 II:2 II:3 II:4

I:3 I:4

II:7 II:8 II:9 II:11 II:14 II:16 II:17 II:15

III:21 III:22 III:24 III:25 III:26

II:12

III:16 III:17

II:10

III:15

II:13

III:18 III:19 III:20

Mola Hidatiforme (23)

Estômago (22)

Pulmão (50)

ADR (11)

Pulmão (60)

Pulmão (50)

Pulmão (45)

Fígado (28)

SNC (31)

CCR (39)

Pulmão (52)

CCR (38)

Mama (62)

III:14

T>CAA

IV:

III:7 III:

IV: IV: IV: IV:

III:

II: II:

III:1 III:1 III:1 III:1 III:1 III:1 III:1III:1

IV:

III:18

IV:

III:1

IV:IV:

IV:1

II: II:

III: III: III: III:4 III: III:

ADR (7)

Renal

SNC

ADR (3)

Renal

SNC

SPM(2

I: I:

Família Y15

Mutação Éxon 10,

R337H, CG

C>CAC

III:2 III:1

IV:1 IV:2 IV:

II:5 II:6

III:3 III:4 III:5 III:6 III:7 III:8 III:9 III:10

II:1 II:2 II:3 II:4

SPM

Mama

SNC

Fígado (53)Mama (60) Estomago

Leucemia

Família Y33

Mutação Éxon 5,

V173M, G

TG>ATG

III:2

II:8 II:9

III:3 III:4 III:5 III:6 III:7 III:8

I:1 I:2

II:1 II:3 II:4 II:5 II:6 II:7II:2

III:1

SPM (50)

Pele (58)

Mama (41)

SPM (38)

SPM (83)

Família Y35

Mutação Éxon 10,

R337H, CG

C>CAC

II:9

III:6III:5

IV:1 IV:2

II:8

III:7 III:10III:8

IV:3 IV:4

III:9

IV:5

I:1 I:2

II:1 II:3 II:5 II:6 II:7 II:2

III:1 III:2

II:4

III:3 III:4

Esôfago (50)

C/P (50)

Estômago (56)

Leucemia (45)

Mama (33)

SNC (8)

CCR (18)

Mama (35)

Família Y53

Mutação Éxon 7,

G245S, G

GC>AGC

IV:9

III:2

II:1 II:2

III:3 III:5 III:6 III:8 III:10 III:12 III:13 III:15 III:17 III:1

IV:1 IV:2

I:1 I:2

II:3

I:3 I:4

III:11

IV:14

III:16

IV:16

III:14

IV:15

III:9

IV:12 IV:13

III:7

IV:10 IV:11

III:4

IV:3 IV:4 IV:5 IV:6 IV:7 IV:8

Mama (40)

CCR (N/A)

TGF (34) Mama (30)

Ósseo (21)

SPM (21)

C/P (50)

Família Y57

Mutação Éxon 7,

G244D, GG

C>GAC

III:22

III:2

II:1 II:2

III:3 III:5 III:6 III:8 III:10 III:11III:7

IV:1 IV:2 IV:3

III:9

IV:4

I:1 I:2

II:3 II:4 II:6 II:9 II:10 II:5

III:12 III:13 III:15III:14

IV:5 IV:6 IV:7

II:7

III:16 III:17

II:8

III:23

III:18 III:19 III:20 III:21

III:1

IV:8 IV:9 IV:10

III:4

IV:11 IV:12 IV:13

Mama (45) Prostate (57)

Papila

duodenal (60)

SNC (18)

Mama (35)

SNC (15)

Mama (55)

SNC (N/A)

SO(N/A)

CRC (22)

Mama (49)

Mama (33)

Esôfago (50)

Família Y58

Mutação Íntron 6,

sítio doador de

splicing

II:1 II:2

III:4 III:5

I:1 I:2

II:3 II:4 II:5 II:6 II:7II:8

III:6 III:7

II:9

III:8 III:9

II:10

III:10 III:11III:1III:2

IV:1

IV:2

III:3

Mama (26)

SPM (4)

Mama (27)

Fígado (36) SNC (40)

SPM (3)

Família Y59

Mutação Éxon 7, G245S,

GC>AGC

II:1 II:2

III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6

Mama (31) Mama (24) Mama (53) SPM (44) SNC (2) SNC (2)

Esofâgo (59)

III:7

IV:1 IV:2

Mama (31) Mama (24)

Família Y60

Mutação Éxon 10, R337H,

C>CAC

III:1III:2

IV:1 IV:2

II:1 II:2

III:3 III:4 III:5 III:6 III:7

I:1 I:2

II:3

I:3 I:4

II:4 II:5 II:6

CCR(45)

DR(18)

Mama(54) CCR(24)

C/P(60)

Família Y65

Mutação Éxon 6, V197M,

TG>ATG

III:2

IV:1 IV:2 IV:3

II:3 II:4

III:3 III:4 III:6 III:1

I:1 I:2

II:1 II:2

III:5

IV:4 IV:5

SPM (42)

Estômago (49)

Leucemia (26)

Leucemia(62)

Família Y2

Sem detecção de mutação no

gene TP53

II:5

III:2

II:3 II:4

III:3 III:5 III:7III:1

IV:1

III:6

IV:4 IV:5

III:4

IV:2 IV:3

I:1 I:2

II:1 II:2

Mama (44)

Bexiga (48)

Mama (36)

SNC (34) Mama (43)

Família Y3

Sem detecção de mutação no

gene TP53

II:1

I:1 I:2

II:2 II:3 II:4 II:5 II:6

III:1 III:2

SO (15)

Mama (32)

Família Y6

Sem detecção de mutação no gene

TP53

III:2

II:1 II:2

III:3 III:4

I:1 I:2

II:3 II:4 II:5 II:6

III:1

IV:1 IV:2 IV:3

SPM (37)

Mama (40)

Mama (35)

N/D (70)

Família Y7

Sem detecção de mutação no

gene TP53

II:5II:4

III:2 III:3 III:4III:1

I:1 I:2

II:1 II:2 II:3

I:3 I:4

II:6 II:7 II:8

SNC (25)

SNC (28)

Estomago (N/D)

Estomago (54)

N/D (N/D)

III:2 III:1

IV:1 IV:2

II:5 II:6

III:3 III:5

I:3 I:4

II:7 II:8 II:9 II:10 II:11 II:12 II:13 II:14

I: I:2

II:1 II:2 II:3 II:4

III:4

IV:3 IV:4 IV:5

SPM

Mama

(

)

SPM

(

)

TGF

(

)

Estoma

o Estoma

(

)

Pulmão

Família Y9

Sem detecção de

mutação no gene TP53

III:2III:1

IV:1 IV:3 IV:4 IV:2

V:1 V:2 V:3

II:1 II:2

III:3 III:4 III:5

I:1 I:2

II:3 II:5 II:6 II:7 II:8 II:9 II:10 II:12 II:14 II:15II:11

III:7 III:8

II:13

III:9

II:4

III:6

SPM (55)

Mama (36)

Pulmão (25)

CCR (50)

Estomago (38) Pulmão (35)

Família Y10

Sem detecção de mutação

no gene TP53

III:1

IV:1 IV:2 IV:3

II:7 II:8

III:3 III:4 III:5 III:6

I:3 I:4

II:9 II:10 II:12

I:1 I:2

II:1 II:2 II:3 II:4 II:5 II:6 II:11

III:7 III:8III:2

Tireoide (73)

Melanoma (75)

Pele (72)

Pancreas (63)

Melanoma (9)

Ca mama (53)

Mama (42)

CCR (60)

Família Y11

Sem detecção de mutação no

gene TP53

IV:8 IV:9

V:1

III:6 III:7

IV:2 IV:3 IV:4 IV:5 IV:6 IV:7

II:1 II:2

III:1 III:2 III:3

II:5 II:6

III:8 III:9 III:10 III:11

I:1 I:2

II:3 II:4

III:5III:4

IV:1

CCR (38) SPM (35)

Linfoma (55)

Próstata (63)

Mama (29)

Família Y14

Sem detecção de mutação

no gene TP53

IV:1

III:1 III:2

IV:2 IV:3 IV:4 IV:5 IV:6 IV:7 IV:8 IV:10IV:9

V:1 V:2 V:3 V:4

II:1 II:2

I:1 I:2

II:5 II:7II:3

III:3

II:6

III:7III:6

IV:12

II:4

III:5III:4

IV:11

Mama

Próstata

Linfoma

(

Pulmão

Mama

(

63 TGF

(

N/D C/P

Família Y17

Sem detecção de mutação no

gene TP53

IV:1

III:4 III:5

IV:2 IV:3

II:7 II:8

III:6 III:7 III:8

I:3 I:4

II:9 II:10 II:11II:5 II:6

III:1 III:2 III:3

I:1 I:2

II:1 II:2 II:3 II:4

Renal

(

)

SPM

(

)

SPM

(

)

SNC

(

)

SPM

(

)

SPM

(

)

Leucemia

(

)

Mama

(

)

Mama

(

)

Próstata

(

)

Leucemia

(

N/D

)

(

)

Família Y20

Sem detecção de mutação

no gene TP53

IV:3

III:9 III:10

IV:6 IV:7 IV:8IV:4

V:1 V:2 V:3

IV:5

V:4 V:5

II:9 II:10

III:11 III:12 III:13 III:14

II:7 II:8

III:6 III:7 III:8

I:1 I:2

II:1 II:3 II:5 II:6

III:5

II:2

III:1 III:2

IV:1

II:4

III:4III:3

IV:2

SPM

(

)

SPM

(

)

SPM

(

)

SPM

(

)

SPM

(

)

Linfoma

(

)

Linfoma (69) 69

Bexi

(

)

Próstata(78)

Estoma

(

)

Estoma

(

)

Melanoma

(

)

N/D

(

)

N/D

(

)

Família Y21

Sem detecção de mutação

no gene TP53

IV:3

III:2 III:3

IV:4 IV:5

III:1

IV:2IV:1

II:1 II:2

III:4 III:5 III:6 III:7 III:8

I:1 I:2

II:3 II:4 II:5

SPM (14)

Estômago (21)

Estômago (45)

Estômago (N/D)

N/D (N/D)

Família Y22

Sem detecção de mutação

no gene TP53

Anexo 8 - Laudos fornecidos aos probandos

Paciente:

Gene analizado: TP53

Data de Coleta:

Médico: Maria Isabel Waddington Achatz

Análise de mutações no gene TP53

Exame Realizado: Após a coleta do sangue e extração do DNA dos linfócitos, os 10 exons

codificadores do gene TP53 (2 a 11) foram amplificados através da reação em cadeia da

polimerase (PCR). Os exons 4, 5, 6, 7, 8 e 9 do gene TP53 foram analisados através da

técnica de cromatografia líquida desnaturante de alta performance (DHPLC). Todos os

exons que apresentaram suspeita de alteração foram analisados por sequenciamento. Os

exons 2, 3,10 e 11 foram analisados por sequenciamento direto. Os relatos na literatura

indicam que mutações germinativas no gene TP53 devem ser encontradas em 77% das

famílias com síndrome de Li-Fraumeni clássica (LFS) e entre 20 a 40% das famílias com

síndrome de Li-Fraumeni like (LFL).

Resultado: Foi observada a presença das seguintes alterações:

• R337H : C

GC (Arg) →CAC (His) no codon 337 do exon 10.

• Os demais exons estudados não apresentaram evidências moleculares de

polimorfismo ou mutação.

Interpretação: A análise de fragmentos de DNA por cromatografia líquida desnaturante de

alta performance (DHPLC – Denaturing High Performance Liquid Chromatography) é um

dos mais precisos métodos disponíveis para a detecção de alterações de sequência em

fragmentos de DNA, com sensibilidade de virtualmente 100% na região analisada.

• A substituição de uma arginina por uma histidina no codon 337 já foi descrita como

relacionada à alta incidência de tumores adrenocorticais e em estudos funcionais foi

considerada como

mutação.

II, III

É descrita como mutação no Banco de Dados da

Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (IARC/WHO).

Esta

substituição altera a sequência de aminoácidos levando a produção anômala da

proteina p53 e caracterizando molecularmente a síndrome de Li-Fraumeni.

Fonte: Banco de Dados da Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (IARC/WHO) (IARC

TP53 Database R10).

http://www.iarc.fr/p53/Germline.htm

Varley JM, Evans DG, Birch JM. Li-Fraumeni syndrome--a molecular and clinical review. Br J Cancer 1997; 76:1-14.

Longui CA, Lemos-Marini SH, Figueiredo B, et al. Inhibin alpha-subunit (INHA) gene and locus changes in paediatric

adrenocortical tumours from TP53 R337H mutation heterozygote carriers. J Med Genet 2004; 41:354-9.

III

Pinto EM, Billerbeck AE, Villares MC, Domenice S, Mendonca BB, Latronico AC. Founder effect for the highly prevalent R337H

mutation of tumor suppressor p53 in Brazilian patients with adrenocortical tumors. Arq Bras Endocrinol Metabol 2004; 48:647-50.

Olivier M, Eeles R, Hollstein M, Khan MA, Harris CC, Hainaut P. The IARC TP53 Database: new online mutation analysis and

recommendations to users. Version: R10, July 2005. Hum Mutat 2002; 19:607-14.

Anexo 9 - Laudos fornecidos aos familiares

Paciente:

Gene analizado: éxon 10 do gene TP53

Data de Coleta:

Médico: Maria Isabel Waddington Achatz

Análise da mutação R337H no éxon 10 do gene TP53

Exame Realizado: Após a coleta do sangue e extração do DNA dos linfócitos, o

éxon10 do gene TP53 foi amplificado através da reação em cadeia da polimerase

(PCR). Em seguida foi analisado por sequenciamento direto. Os relatos na literatura

indicam que mutações germinativas no gene TP53 devem ser encontradas em 77%

das famílias com Síndrome de Li-Fraumeni clássica (SLF) e entre 20 a 40% das

famílias com síndrome de Li-Fraumeni like (LFL).

Resultado: O éxon 10 não apresentou evidências moleculares de polimorfismo ou

mutação.

Interpretação: Não foram caracterizadas mutações germinativas pelos métodos

utilizados.

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