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UFRRJ
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
MEDICINA VETERINÁRIA
CIÊNCIAS CLÍNICAS
DISSERTAÇÃO
Depleção Cerebral de Serotonina Durante o
Período Neonatal Programa a Homeostase
Metabólica Energética e a Expressão
Comportamental de Ratos Adultos
Rodrigo Mencalha Moreira
2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
CIÊNCIAS CLÍNICAS
DEPLEÇÃO CEREBRAL DE SEROTONINA DURANTE O
PERÍODO NEONATAL PROGRAMA A HOMEOSTASE
METABÓLICA ENERGÉTICA E A EXPRESSÃO
COMPORTAMENTAL DE RATOS ADULTOS
RODRIGO MENCALHA MOREIRA
Sob a Orientação do professor
LUIS CARLOS REIS
e Co-orientação do Professor
WELLINGTON DA SILVA CÔRTES
Dissertação submetida como
requisito parcial para obtenção
do grau de Magister Scientiae
em Medicina Veterinária, no
Curso de Pós-Graduação em
Medicina Veterinária, área de
concentração em Ciências
Clínicas
Seropédica, RJ
Agosto de 2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
(CIÊNCIAS CLÍNICAS)
RODRIGO MENCALHA MOREIRA
Dissertação/Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre
em Medicina Veterinária no Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, área
de Concentração em Patologia e Ciências Clínicas.
DISSERTAÇÃO (TESE) APROVADA EM -----/-----/------ (Data da defesa)
Luis Carlos Reis. Ph.D. UFRuralRJ
(Orientador)
Emerson Lopes Olivares. Ph.D. UFRuralRJ
Fabio Fagundes da Rocha. Ph.D. UFRuralRJ
Patrícia Fidelis de Oliveira Ph.D. UFU
DEDICATÓRIA
Aos meus amados pais, Antonio e Cidinéa, a
minha família, a minha namorada, e aos
meus verdadeiros amigos, com todo o meu
amor e carinho pelo apoio incondicional a
minha formação acadêmica.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Luis Carlos Reis, nosso eterno mestre, que me acolheu em um difícil
momento da minha vida, e, sobretudo, pela confiança depositada na realização, “em
tempo recorde”, do nosso projeto de pesquisa. Pelo exemplo de dedicação e humildade
que nos faz refletir a cada dia sobre os valores do ser humano. Pela amizade e respeito
conquistado durante este árduo período de trabalho.
Ao Prof. Dr. Wellington da Silva Côrtes, pelo esforço memorável de orientação que
antecedeu o ingresso na pós-graduação. Pelo exemplo de bondade, paciência, dedicação
e, sobretudo, pelo seu incrível caráter.
Ao Prof. Msc. Edgard Salomão Jr, meu eterno orientador, que me fez despertar o
interesse pela docência e participou ativamente do meu crescimento intelectual. Pela
amizade, orientação e pelo exemplo de dedicação incondicional a Medicina Veterinária.
As Professoras Dr. Rosana Botelho e Dr. Marta Fernanda pela amizade e pelo apoio nos
momentos de “depressão” e desilução. Pelas inúmeras oportunidades de exercer o
estágio a docência e pelo incentivo na jornada acadêmica.
Ao Prof. Dr. Fábio Fagundes da Rocha, pelo auxílio fundamental na avaliação dos testes
envolvendo os modelos comportamentais.
Aos todos os professores do Departamento de Ciências Fisiológicas (DCF) pelo apoio
incondicional para realização do meu experimento.
Aos Professores Doutores Emerson Lopes Olivares, Frederico Argollo Vanderlinde,
Eduardo Borges Viana, Marcelo Abidu e Adivaldo Henrique da Fonseca, professores
marcantes da minha graduação, pela influência na escolha da vida acadêmica.
Aos amigos e agregados do laboratório, André, Iracema, Gislaine, Fabrícia, Danilo,
Cláudio e demais, pelos muitos dias de convivência, trabalho e lazer. Pela acolhida
fantástica e amizade recíproca ao longo desse período.
Ao acadêmico de Medicina Veterinária, André de Souza Mecawi, meu “orientador”,
pela magnífica ajuda ao longo desse período e pelos diversos ensinamentos
proporcionados.
A Cidália, bibliotecária da Fundação Educacional Dom André Arcoverde, pelas
inúmeras gentilezas que prestou ao longo desse período.
Aos companheiros da “Bolha”, Victor, Vinícius, Pablo, Guilherme, Igor, Rômulo e
Agustinho pelos dias memoráveis e inesquecíveis de convívio. Pela amizade eterna que
surgiu nesse grupo. Amo demais todos vocês!!!!!
À minha namorada “obesa”, Patrícia, por todo amor e carinho a mim dedicados. Pela
paciência extrema que teve ao longo desses sete meses e companherismo inacreditável.
Aos meus grandes amigos, Rafael Teixeira e Danilo Lustrino, por toda ajuda e incentivo
em difíceis momentos vividos ao longo desse período.
Aos meus pais, Antonio e Cidinéa, e toda a minha família, que por mais três anos
compartilharam comigo as dificuldades enfrentadas, as derrotas e as vitórias
conquistadas.
A Deus, o mestre dos mestres, o grande maestro dessa orquestra chamada VIDA. Pela
serenidade, paz e dignidade proporcionadas. Meu senhor e meu Deus, EU TE AMO!
Aos animais utilizados neste trabalho, que mesmo em silêncio, proporcionaram a cada
dia novos conhecimentos a comunidade científica.
A Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, a minha eterna e amada Rural, por me
acolher durantes esses sete anos. Esta relação parece ter chegado ao fim, porém, algo
me diz para não lhe dar um adeus e sim um até breve!
“Toda uma corrente de acontecimentos brota da
decisão, fazendo surgir a nosso favor toda a sorte de
incidentes, encontros e assistência material que
nenhum homem sonharia que viesse em sua direção.
Qualquer coisa que possa fazer, ou sonhe que, possa
fazer, comece a fazê-la agora. A ousadia tem em si
genialidade, força e magia.”
Goethe
RESUMO
MENCALHA, Rodrigo. Depleção cerebral de serotonina durante o período
neonatal programa a homeostase metabólica energética e a expressão
comportamental de ratos adultos. 2008. 81p Dissertação (Mestrado em Medicina
Veterinária, Ciências Clínicas). Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do
Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.
A depleção cerebral de serotonina (5-HT) durante o período neonatal acarreta uma
alteração plástica na citoarquitetura do sistema serotonérgico influenciando diretamente
o desenvolvimento ontogênico de diversos sistemas cerebrais. Nesta dissertação
objetivou-se elucidar a influência da depleção cerebral de 5-HT durante o período
neonatal sobre a programação metabólica energética e expressão comportamental de
ratos adultos. A depleção cerebral de 5-HT foi evocada com a administração subcutânea
(s.c) de 100 mg. Kg
-1
, de para-clorofenilalanina (pCPA), um inibidor competitivo da
enzima triptofano hidroxilase, do oitavo ao décimo sexto dias pós-natais. A fim de
investigar a influência da pCPA, durante e após o tratamento, sobre a programação
metabólica do indivíduo, foram avaliadas a ingestão de leite e o ganho de peso corporal
do período neonatal à vida adulta. Ademais, avaliando indiretamente esta influência
sobre o metabolismo energético, foram investigadas as repercussões sobre a homeostase
glicêmica através da mensuração basal e sob jejum da glicemia do rato adulto. Em
relação ao comportamento ingestivo foram realizados protocolos em condições basais e
sob jejum. Nestes ensaios experimentais foram avaliadas as ingestões de água, ração,
sacarose 2% e NaCl 0,3 M. Outrossim, foram mensuradas as ingestões de NaCl 0,3 M
após depleção de sódio (furosemida 20mg. Kg
-1
, s.c) e de água após estímulo
hipertônico (NaCl 1,0 M, s.c). A expressão comportamental foi avaliada através de
modelos envolvidos com aspectos afetivo-comportamentais. Nesta análise, foi
investigado o status de ansiedade dos ratos através dos testes de campo aberto, labirinto
em cruz elevado (LCE), interação social e natação forçada. Os resultados demonstraram
que o tratamento com pCPA diminui a ingestão de leite (P˂0,001) e conseqüentemente
o ganho de peso corporal no período neonatal (P˂0,001), sustentando-se menor até a
vida adulta (P˂0,01). A homeostase glicêmica também foi afetada refletida nos menores
níveis glicêmicos em machos-pCPA (P˂0,01) e fêmeas pCPA (P˂0,001) após jejum
alimentar de 24 horas. Em relação às ingestões basais, foi observado um maior apetite
por sódio em fêmeas-pCPA (P˂0,05), além de uma maior procura pela solução de
sacarose 2% em ambas as fêmeas (P˂0,001). Sob jejum alimentar, foi observada uma
menor ingestão cumulativa de ração em machos-pCPA aos 120 min (P˂0,05) e maior
ingestão em fêmeas-pCPA aos 60 (P˂0,05) e 120 min (P˂0,01). Ademais, após jejum
hídrico, foi notada uma maior ingestão cumulativa de água em fêmeas-pCPA aos 120
min (P˂0,05) em relação aos machos-pCPA. Observou-se ainda uma maior ingestão de
água nos machos-pCPA aos 120 e 180 min (P˂0,001) após estímulo hipertônico, porém,
não foi observada diferença significativa na resposta natriorexigênica em ratos sódio-
depletados. Além disso, foi observada uma evidente atividade ansiolítica no LCE
expressa pelo maior tempo gasto no braço aberto (B.A) (P˂0,05), maior número de
episódios de head-dipping no B.A (P˂0,001), menos episódios de S.AP. (P˂0,001) e
grooming (P˂0,01). Em resumo, estes resultados demonstram que a depleção de 5-HT
durante o período neonatal programa a homeostase metabólica energética e a expressão
comportamental de ratos adultos.
Palavras-chave: serotonina, desenvolvimento ontogênico, programação metabólica.
ABSTRACT
MENCALHA, Rodrigo. Brain serotonin depletion during neonatal period
programme energetic metabolic homeostasis and behavioral expression of
adulthood rats. 2008. 81p. Dissertation (Master Science in Veterinary Medicine,
Clinical Sciences) Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.
Brain serotonin (5-HT) depletion during the neonatal period lead a plastic
cytoarchitecture change of the serotonergic system influencing directly several brain
systems ontogeny development. This dissertation was aimed to elucidate the influence
of brain 5-HT depletion during the neonatal period on the metabolic programming and
the behavioral expression of adulthood rats. Brain 5-HT depletion was raised with the
subcutaneous (s.c) administration of 100 mg. Kg
-1
para-chlorophenylalanine (pCPA), a
competitive inhibitor of the tryptophan hydroxylase enzyme, from the eighth at
sixteenth post-natal days. In order to investigate the influence of pCPA on the subject
metabolic programming, during and after treatment, the milk intake and body weight
gain from the neonatal period to adulthood were evaluated. Furthermore, evaluating
indirectly this influence on the energetic metabolism, the repercussions on the glycemic
homeostasis through of the glycemia baseline measurements and under fasting in the
adult rat were investigated. Around the ingestive behavior, baseline conditions paradigm
and under fasting were made. In these experimental trials, water intake, ration, 2%
sucrose and 0.3M NaCl were evaluated. Also, the 0.3 M NaCl intake after sodium
depletion (furosemide 20mg. Kg
-1
, s.c) and water intake after hypertonic stimulus (1.0
M NaCl, s.c) were measured. The behavioral expression was evaluated through models
involved with emotional-behavioral signals. In this analysis, the rat’s anxiety status was
investigated through of open field test, elevated plus-maze (EPM), social interaction and
forced swimming. The results showed that treatment with pCPA reduces milk intake
(P˂0.001) and therefore the body weight gain in the neonatal period (P˂0.001),
claiming to be smaller until adulthood (P˂0.01). The glycemic homeostasis was also
affected reflected in lower pCPA-male (P˂0.01) and pCPA-female (P˂0.001) levels
after 24 hours of fasting. About to baseline intake, a higher pCPA-female sodium
appetite (P˂0.05), related to a greater demand for 2% sucrose solution in both females
(P˂0,001) were observed. Under fasting, a lower male-pCPA cumulative ration intake
at 60 min (P˂0.05) and a higher female pCPA at 60 (P˂0.05) and 120 min (P˂0.01)
were observed. Furthermore, after water deprivation, a higher pCPA-female cumulative
water intake at 120 min (P˂0.05) compared with pCPA-male was rated. Was also
observed a greater pCPA-male water intake at 120 and 180 min (P˂0.001) after
hypertonic stimulus, however, it was not observed significant difference in the
natriorexigenic responses in sodium depleted rats. In addition, pCPA male showed a
evident anxiolytic activity in EPM test expressed by the higher time spent in the open
arm (O.A) (P˂0.05), higher head-dipping in the O.A episodes (P˂0.001), less S.A.P.
(P˂0.001) and grooming episodes (P˂0.01). Therefore, these results showed that 5-HT
depletion during the neonatal period programme the energetic metabolic homeostasis
and the behavioral expression of adulthood rats.
Key words: serotonin, ontogeny development, metabolic programming.
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 – Avaliação do Teste de Campo Aberto.................................................
40
Tabela 2 – Avaliação do Teste de Labirinto em Cruz Elevado (LCE).................
43
Tabela 3 – Avaliação do Teste de Interação Social..............................................
46
Tabela 4 – Avaliação do Teste de Natação Forçada.............................................
47
Tabela 5 – Ingestão Basal de Alimento.................................................................
48
Tabela 6 – Ingestão Basal de NaCl 0,3 M.............................................................
50
Tabela 7 – Ingestão Basal de Sacarose 2%...........................................................
52
Tabela 8 – Ingestão de Água Destilada Após Indução de Hipernatremia.............
62
Tabela 9 – Ingestão de NaCl 0,3 M na Depleção de Sódio...................................
64
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 - Síntese e metabolismo da serotonina........................................................
3
Figura 2 - Receptores serotoninérgicos e respectivas ações intracelulares...............
4
Figura 3 - Projeções serotoninérgicas........................................................................
6
Figura 4 – Teste de campo aberto..............................................................................
24
Figura 5 – Teste de labirinto em cruz elevado (LCE)...............................................
25
Figura 6 – Teste de natação forçada..........................................................................
26
Figura 7 – Gaiolas metabólicas.................................................................................
29
Figura 8 - Percentual da ingestão de leite em ratos neonatos durante o período
correspondente ao tratamento com pCPA (8-16 DPN) em relação à linha de base,
que corresponde à ingestão basal de leite do grupo controle e tratado......................
32
Figura 9 - Peso corporal de ratos neonatos do grupo controle e tratado durante o
período correspondente ao tratamento com pCPA (8-16 DPN).................................
33
Figura 10 - Ganho de peso corporal de ratos neonatos do grupo controle e tratado
durante o período correspondente ao tratamento com pCPA (8-16 DPN).................
34
Figura 11A - Avaliação semanal do ganho de peso corporal de ratos do desmame
(21 DPN) à vida adulta (56 DPN)...............................................................................
36
Figura 11B - Avaliação semanal do ganho de peso corporal de ratas do desmame
(21 DPN) à vida adulta (56 DPN)...............................................................................
36
Figura 12 - Avaliação do peso corporal de ratos na vida adulta (56 DPN)...............
37
Figura 13 - Número de quadrantes periféricos, médios e quadrante central
explorados pelos ratos dos grupos tratamento e controle, na vida adulta (60-75
DPN), durante a realização do teste do campo aberto................................................
39
Figura 14 - Episódios de grooming realizados pelos ratos dos grupos tratamento e
controle, na vida adulta (60-75 DPN), durante a realização do teste do campo
aberto..........................................................................................................................
39
Figura 15A - Número de entradas nos braços aberto e fechado realizadas pelos
grupos tratamento e controle, na vida adulta (60-75 DPN), durante a realização do
teste do labirinto em cruz elevado (LCE)...................................................................
44
Figura 15B - Tempo gasto no braço aberto expresso em porcentagem realizado
pelos grupos tratamento e controle, na vida adulta (60-75 DPN), durante a
realização do teste do labirinto em cruz elevado (LCE).............................................
44
Figura 16 - Número de head-dippings nos braços aberto e fechado, realizados
pelos grupos tratamento e controle, na vida adulta (60-75 DPN), durante a
realização do teste do labirinto em cruz elevado........................................................
45
Figura 17 - Número de S.A.P. realizados pelos grupos tratamento e controle, na
vida adulta (60-75 DPN), durante a realização do teste do labirinto em cruz
elevado........................................................................................................................
45
Figura 18 - Ingestão cumulativa de água nos grupos tratamento e controle, na vida
adulta (60-75 DPN), durante a realização do protocolo de privação hídrica..............
53
Figura 19 - Ingestão cumulativa de ração nos grupos tratamento e controle, na
vida adulta (60-75 DPN), durante a realização do protocolo de privação alimentar..
55
Figura 20 - Ingestão cumulativa de sacarose 2% nos grupos tratamento e controle,
na vida adulta (60-75 DPN), durante a realização do protocolo de privação
alimentar/preferência por sacarose.............................................................................
56
Figura 21 - Ingestão cumulativa de água nos grupos tratamento e controle, na vida
adulta (60-75 DPN), durante a realização do protocolo de privação
alimentar/preferência por sacarose.............................................................................
57
Figura 22 - Preferência por sacarose 2% nos grupos tratamento e controle, na vida
adulta (60-75 DPN), durante a realização do protocolo de privação
alimentar/preferência por sacarose.............................................................................
58
Figura 23 - Ingestão cumulativa de NaCl 0,3 M nos grupos tratamento e controle,
na vida adulta (60-75 DPN), durante a realização do protocolo de privação
alimentar/preferência por NaCl 0,3 M........................................................................
59
Figura 24 - Ingestão cumulativa de água nos grupos tratamento e controle, na vida
adulta (60-75 DPN), durante a realização do protocolo de privação
alimentar/preferência por NaCl 0,3 M........................................................................
60
Figura 25 - Preferência por NaCl 0,3 M nos grupos tratamento e controle, na vida
adulta (60-75 DPN), durante a realização do protocolo de privação
alimentar/preferência por NaCl 0,3 M........................................................................
61
Figura 26 - Avaliação da glicemia basal e sob jejum nos grupos tratamento e
controle, na vida adulta (60-75 DPN) e expressão do delta glicemia.........................
65
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS
5,7-DHT 5,7 dihidroxitriptamina
5-HT 5 hidroxitriptamina
5-HT1A Receptor 1A de 5 hidroxitriptamina
5-HT1B Receptor 1B de 5 hidroxitriptamina
5-HT2A Receptor 2A de 5 hidroxitriptamina
5-HT2C Receptor 2C de 5 hidroxitriptamina
5-HT3 Receptor 3 de 5 hidroxitriptamina
8-OH-DPAT Agonista de 5-HT1A
ADX Adrenalectomizados
AHL Área hipotalâmica lateral
ANG I Angiotensina I
ANG II Angiotensina II
ANP Peptídeo natriurético atrial
AP Área postrema
AT1 Receptor de angiotensina 1
CRF Hormônio liberador de corticotropina
DNR Núcleo dorsal da rafe mesencefálica
DPN Dia pós-natal
FEC Fluido extracelular
G Grupo
GABA Ácido gama amino butírico
icv intracerebroventricular
IMMO Tempo de imobilidade
H.D. Head-dipping
LCE Labirinto em cruz elevado
M Molar
MAO Monoaminaoxidase
MnPod Núcleo mediano pré-óptico dorsal
MnPov Núcleo mediano pré-óptico ventral
NMR Núcleo medial da rafe mesencefálica
NPBL Núcleo parabraquial lateral
NTS Núcleo do trato solitário
OCF Córtex orbitofrontal
OT Ocitocina
p.c Peso corporal
pCPA para-clorofenilalanina
PEG polietilenoglicol
PVN Núcleo paraventricular
SAD Desordens sazonais afetivas
S.A.P. Stretched attend posture
s.c Subcutâneo
SDAR Receptor somatodendrítico
SFO Órgão subfornicial
SHR Ratos hipertensos espontaneamente
SNC Sistema nervoso central
SON Núcleo supra-óptico
SRAA Sistema renina angiotensina aldosterona
TPH Triptofano- hidroxilase
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO............................................................................................................................
2. REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................................
1
1
2.1 Sistema Serotonérgico....................................................................................................
1
2.2 Regulação Hidroeletrolítica.............................................................................................
6
2.3 Regulação do Apetite por Sódio......................................................................................
8
2.4 Regulação da Ingestão Alimentar e do Balanço Energético............................................
11
2.5 Regulação da Sede e da Ingestão de Água......................................................................
12
2.6 Regulação da Emoção e Processos do Controle Comportamental..................................
15
2.7 Depleção de Serotonina...................................................................................................
17
3. OBJETIVOS...........................................................................................................
20
3.1 Objetivo Geral.................................................................................................................
20
3.2 Objetivos Específicos......................................................................................................
20
4. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................
21
4.1 Animais. ..........................................................................................................................
21
4.2 Drogas.............................................................................................................................
21
4.3 Desmame.........................................................................................................................
21
4.4 Tratamento.......................................................................................................................
22
4.5 Avaliações.......................................................................................................................
22
4.6 Protocolos Experimentais................................................................................................
22
4.7 Procedimentos Experimentais.........................................................................................
22
4.7.1 Avaliações neonatais..................................................................................................
22
4.7.1.1 ingestão de leite....................................................................................................
22
4.7.2 Avaliações basais.......................................................................................................
23
4.7.2.1 experimentos envolvendo a atividade afetivo-comportamental...........................
23
4.7.2.2 experimentos envolvendo o comportamento ingestivo: ingestões basais............
27
4.7.3 Avaliações sob estímulos...........................................................................................
28
4.7.3.1 experimentos envolvendo o comportamento ingestivo: ingestões sob jejum......
4.7.3.2 experimentos envolvendo o comportamento ingestivo: ingestões sob estímulos
específicos sobre a indução do apetite por sódio e da sede..............................................
28
29
4.7.4 Avaliações glicêmicas................................................................................................
4.7.4.1 experimentos envolvendo a glicemia: mensuração basal e sob jejum.................
30
30
4.8 Análise Estatística............................................................................................................
31
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................................
31
5.1 Avaliações do Peso Corporal e da Ingestão de Leite.......................................................
31
5.1.1 Avaliação da ingestão de leite durante o tratamento com pCPA (8-16 DPN)...........
31
5.1.2 Avaliação do peso corporal durante o tratamento com pCPA (8-16 DPN)...............
33
5.1.3Avaliação do ganho do peso corporal durante o tratamento com pCPA (8-16 DPN)
34
5.1.4 Avaliação semanal do peso corporal do desmame (21 DPN) a vida adulta (56
DPN)...................................................................................................................................
35
5.1.5 Avaliação do peso corporal na vida adulta (56 DPN)................................................
37
5.1.6 Avaliação da taxa de mortalidade durante o tratamento com pCPA (8-16 DPN).....
38
5.2 Avaliações Basais............................................................................................................
38
5.2.1 Avaliação da influência do tratamento neonatal com pCPA em ratos na vida
adulta no teste do campo aberto .........................................................................................
38
5.2.2 Avaliação da influência do tratamento neonatal com pCPA em ratos adultos no
teste do labirinto em cruz elevado (LCE) ..........................................................................
41
5.2.3 Avaliação da influência do tratamento neonatal com pCPA em ratos adultos no
teste de interação social ......................................................................................................
46
5.2.4 Avaliação da influência do tratamento neonatal com pCPA em ratos adultos no
teste de natação forçada......................................................................................................
47
5.2.5 Avaliação da ingestão basal de alimento durante a vida adulta (60-75 DPN)...........
48
5.2.6 Avaliação da ingestão basal de NaCl 0.3 M durante a vida adulta (60-75 DPN)......
49
5.2.7 Avaliação da ingestão basal de sacarose 2% durante a vida adulta (60-75 DPN).....
51
5.3 Avaliações Sob Estímulos...............................................................................................
53
5.3.1 Avaliação da Ingestão de água sob privação hídrica durante a vida adulta (60-75
DPN.....................................................................................................................................
53
5.3.2 Avaliação da Ingestão de ração sob privação alimentar (ração e água) durante a
vida adulta (60-75 DPN) ....................................................................................................
54
5.3.3 Avaliação da Ingestão de sacarose 2% sob privação alimentar (ração e água)
durante a vida adulta (60-75 DPN) ....................................................................................
56
5.3.4 Avaliação da ingestão de NaCl 0.3 M sob privação alimentar (ração e água)
durante a vida adulta (60-75 DPN) ....................................................................................
58
5.3.5 Avaliação da Ingestão de água após indução de hipernatremia (NaCl 1.0 M)
durante a vida adulta (60-75 DPN) ....................................................................................
62
5.3.6 Avaliação da Ingestão de NaCl 0.3 M após depleção de sódio durante a vida
adulta (60-75 DPN) ............................................................................................................
63
5.3.7 Avaliação da glicemia basal em ratos durante a vida adulta (60-75 DPN)................
65
5.3.8 Avaliação da glicemia sob jejum em ratos durante a vida adulta (60-75 DPN)........
65
6. CONCLUSÕES..................................................................................................................
66
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................
67
1
1 INTRODUÇÃO
O sistema serotonérgico exerce um papel bem conhecido sobre a homeostase
orgânica. Além de atuar sobre a modulação da motilidade gastrintestinal e função
plaquetária, a serotonina (5-HT) participa efetivamente da regulação hidroeletrolítica,
modulando a sede e o apetite por sódio, ingestão alimentar, balanço energético,
regulação da emoção e processos do controle comportamental. Ademais, este
neurotransmissor participa efetivamente do desenvolvimento ontogênico de diversos
sistemas cerebrais.
A depleção de 5-HT cerebral durante o período neonatal pode acarretar
conseqüências irreversíveis ou duradouras ao indivíduo adulto em virtude de uma
alteração plástica na citoarquitetura do sistema serotonérgico. Portanto, é reforçada a
hipótese que esta mudança na plasticidade neuronal possa alterar a programação
metabólica energética dos seres. Este complexo fenômeno epigenético que acontece
durante um período crítico da vida (i.e. lactação), é capaz de fornecer um fenótipo
racional ao organismo através de ativação gênica. Além disso, também se postula a
hipótese que esta alteração plástica do sistema serotoninérgico possa alterar a expressão
comportamental dos indivíduos.
Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência da depleção cerebral de
serotonina durante o período neonatal, com para-clorofenilalanina (pCPA), sobre o
desenvolvimento ontogênico de sistemas cerebrais, correlacionando suas repercussões
com a homeostase metabólica energética e expressão comportamental de ratos adultos.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Sistema Serotonérgico
A serotonina ou 5-hidroxitriptamina (5-HT) é uma indolamina, produto da
hidroxilação e descarboxilação do aminoácido L-triptofano. A maior parte da 5-HT no
organismo é encontrada nas células enterocromafins do trato gastrointestinal, sendo o
restante encontrado nas plaquetas e no sistema nervoso central (SNC). Diversos estudos
têm mostrado sua participação na modulação da motilidade gastrointestinal, tônus
vascular periférico, tônus vascular cerebral, além de exercer importante função
plaquetária e na fisiopatologia de diversas desordens de humor, vômito, enxaquecas,
síndrome do intestino irritável e hipertensão sistêmica e pulmonar (MOHAMMAD-
ZADEH et al., 2008).
Fisiologicamente, a serotonina exerce seus efeitos conjuntamente com uma
modulação geral da atividade psíquica. Assim sendo, a 5-HT influencia quase todas as
funções cerebrais, inibindo-a de forma direta ou estimulando o sistema GABA com
participação sobre a regulação do humor, sono, atividade sexual, apetite, ritmo
circadiano, funções neuroendócrinas, temperatura corporal, sensibilidade à dor,
atividade motora e funções cognitivas (MOHAMMAD-ZADEH et al., 2008).
Neurônios serotoninérgicos da rafe mesencefálica constituem um pequeno grupo
de células multipolares que são distribuídas na linha mediana cerebral particularmente
localizados nos núcleos mediano (NMR) e dorsal da rafe (NDR) (AZMITIA & SEGAL,
2
1978; AZMITIA, 2001; ABRAMS et al., 2004). Reis, (2007) enfatizou o NDR como
sendo o mais proeminente núcleo serotoninérgico cerebral, localizado na parte ventral
da substância cinzenta periaquedutal cerebral, estendendo-se caudalmente até a porção
rostral da ponte. Os neurônios serotoninérgicos do NDR são organizados em
aglomerados celulares, em diversas subdivisões topográficas. A área ventromedial
rostral é uma dessas regiões que possuem um contingente celular que é projetado para
regiões prosencefálicas envolvidas com a regulação hidroeletrolítica e cardiovascular
(AZMITIA & SEGAL, 1978; KUHN et al., 1980; BOSLER & DESCARRIES, 1988;
JACOBS & AZMITIA, 1992; AZMITIA, 2001). As projeções ascendentes do NDR são
organizadas de maneira onipresente em conexão com uma extensiva distribuição
cooperativa nas zonas terminais (AZMITIA, 1987, 2001). De acordo com a concepção
da autora supracitada, múltiplos subtipos de neurônios serotoninérgicos participam da
coordenação integrada de diferentes sistemas, como por exemplo, autonômico,
neuroendócrino e comportamental (AZMITIA, 1987, 2001; JACOBS & AZMITIA,
1992). Estudos eletrofisiológicos mostraram diferentes subtipos de neurônios
serotoninérgicos envolvidos exclusivamente em modelos comportamentais. Esta
observação postula a hipótese que subpopulações de neurônios serotoninérgicos
topograficamente organizados possam conter propriedades funcionais exclusivas
associadas com a modulação de sistemas específicos prosencefálicos (ABRAMS et al.,
2004). Neurônios serotoninérgicos sintetizam 5-HT a partir do aminoácido triptofano
(AZMITIA, 1987, 2001; BOADLE-BIBER, 1993; RUDDICK et al., 2006) (Fig. 1). A
transmissão serotoninérgica e subseqüente liberação sináptica de 5-HT ocorrem de
acordo com um modelo rítmico gerado espontaneamente e pode ser modulado por um
auto-feed-back somatodendrítico (AZMITIA, 1987, 2001). Este fino sistema modulador
é mediado através da ativação de auto-receptores 5-HT1A somatodendríticos (SDAR)
(BLIER et al., 1998). A ação da 5-HT neste receptor evoca um decréscimo na taxa de
ativação e subseqüente decréscimo no turnover de 5-HT. Contudo, há um aumento da 5-
HT nas sinapses somatodendríticas. Ocorre ainda um decréscimo proporcional na
liberação deste neurotransmissor nas zonas terminais dos neurônios serotoninérgicos
ascendentes no NDR (HUTSON et al., 1989; INVERNIZZI et al., 1991).
3
Figura 1. Síntese e Metabolismo da Serotonina. A serotonina é sintetizada a partir do aminoácido
essencial triptofano. Este aminoácido é hidroxilado na posição 5 do anel aromático, pela enzima
triptofano hidroxilase, dando origem ao 5-hidroxitriptofano (5-HTP). O 5-HTP é descarboxilado,
pela enzima L-aromático aminoácido descarboxilase, dando finalmente origem a 5-
hidroxitriptamina (5-HT ou serotonina). A 5-HT é metabolizada através de uma desaminação
realizada pela enzima monoamina oxidase e desidrogenada pela enzima aldeído desidrogenase
originando seu metabólito principal, o ácido 5-hidroxiindolacético (5-HIAA) (LAM & HESLER,
2007).
4
A serotonina possui diversos receptores que são amplamente distribuídos pelo
organismo. Esses receptores são divididos em 7 famílias, entre eles: 5-HT1, 5-HT2, 5-
HT3, 5-HT4, 5-HT5, 5-HT6, 5-HT7. Com exceção do receptor 5-HT3, pertencente à
família de receptores acoplados a canais iônicos seletivamente permeáveis a sódio
(Na
+
), potássio (K
+
) e cálcio (Ca
+
), os demais receptores estão incluídos na superfamília
de receptores acoplados a proteína G (metabotrópicos). Sua estimulação afeta vários
sistemas enzimáticos incluindo adenililato ciclase, fosfolipase A e C e canais de cátions,
especialmente canais de K
+
e Ca
++
, através da ativação de proteínas G específicas (Fig.
2).
Figura 2. Receptores serotoninérgicos e respectivas ações intracelulares. Os receptores
serotonérgicos (5-HTRs) são agrupados em sete famílias baseados nas vias efetoras intracelulares e
seqüência homóloga. Com exceção aos 5-HT
3
Rs, todos os receptores serotonérgicos são acoplados a
proteína G. Os 5-HT
4
Rs, 5-HT
6
Rs e 5-HT
7
Rs são acoplados a Gs ativando a adenilato ciclase (AC).
A AC sintetiza AMPc a partir do ATP. O AMPc ativa uma proteína quinase dependente de AMPc,
também conhecida como proteína quinase A (PKA). A PKA fosforila proteínas quinases
intermediárias (PKs), as quais modulam a atividade de canais catiônicos, resultando em
despolarização neuronal. Em contraste, os 5-HT
1
Rs são acoplados a Gi, a qual inibe AC, resultando
em hiperpolarização. Os 5-HT
2
Rs são acoplados a Gq, a qual ativa a fosfolipase C (PLC). A PLC
cliva fosfolipídeos (PL) a diacilglicerol (DAG) e inusitol trifosfato (IP
3
). O DAG ativa a proteína
quinase C (PKC), recrutando PK intermediárias para modular canais catiônicos e
conseqüentemente promover despolarização neuronal. O IP
3
atua liberando Ca
+2
dos estoques
intracelulares, auxiliando também na despolarização. Este Ca
+2
ativa o complexo Ca
+2
/calmodulina-
proteína quinase-dependente, que, conjuntamente a PKA e PKC, influencia a transcrição através
da fosforilação de fatores de transcrição (TFs). Os 5-HT
5
Rs acoplam-se negativamente a AC e
positivamente aos canais de Ca
+2
IP
3
-sensíveis. 5-HT
3
Rs são ligantes não seletivos de canais
catiônicos que resultam em rápida despolarização quando ativados. Linhas pontilhadas indicam
efeitos inibitórios (LAM & HESLER, 2007).
5
Existem no mínimo 14 subtipos diferentes de receptores serotoninérgicos que
foram clonados de tecidos de mamíferos (BANES & SHARP, 1999; RAYMOND et al.,
2001). A família 5-HT1 contém receptores que são acoplados negativamente a
adenililato ciclase e inclui os receptores 5-HT 1A, 1B, 1D, 1E e 1F. O receptor 5-HT1A
foi o primeiro a ser clonado e além de inibir a síntese de AMPc também leva a
hiperpolarização da célula através da ativação de canais de potássio. Agonistas 5-HT1A
induzem inibição da PKA e da fosforilação do fator de transcrição em culturas de
neurônios hipocampais. Este receptor nos núcleos da rafe atua como auto-receptor
enquanto que nas áreas alvo dos neurônios serotoninérgicos, como o hipocampo, ele
corresponde a heteroreceptores localizados em terminais pós-sinápticos (LANFUMEY
& HAMON, 2000). O receptor 5-HT1B é expresso tanto em neurônios serotoninérgicos
como não serotoninérgicos, atuando como auto-receptores e heterorreceptores,
respectivamente. Este receptor está distribuído em diferentes regiões do SNC e
encontra-se predominantemente ao nível pré-sináptico (SARI, 2004). Em diversos tipos
celulares este receptor também está associado à via das ERKs (RAYMOND et al.,
2001). O receptor 5-HT1D é conhecido por suas funções inibitórias atuando como auto-
receptor nos terminais serotoninérgicos (BANES & SHARP, 1999) inibindo a liberação
de serotonina na rafe mesencefálica, hipocampo e córtex frontal (RAYMOND et al.,
2001). A família 5-HT2 possui três subtipos de receptores sendo eles classificados como
5-HT2A, 5-HT2B e 5-HT2C. Eles atuam ativando a fosfolipase C aumentando os níveis
de Ca
++
intracelular (BANES & SHARP, 1999). O receptor 5-HT3, como mencionado
anteriormente, é um canal iônico seletivamente permeável a íons Na
+,
K
+
e Ca
++
, sendo
distribuído tanto centralmente como perifericamente nos tecidos (BARNES & SHARP,
1999). Os receptores 5-HT4, 5-HT6 e 5-HT7 estão acoplados a proteína 41 Gs a qual
ativa a adenililato ciclase. A família do receptor 5-HT5 contém dois subtipos 5-HT5A e
5-HT5B. Acredita-se que o tipo 5-HT5A esteja acoplado negativamente a adenililato
ciclase enquanto que o 5-HT5B está ligado a outro sistema efetor ainda não muito bem
caracterizado (BANES & SHARP, 1999). O NDR especialmente contém subtipos de
neurônios serotoninérgicos os quais são projetados para áreas em regiões
prosencefálicas relacionadas com a composição eletrolítica, volume do fluido
extracelular, bem como com a resposta cardiovascular (AZMITIA E SEGAL, 1978;
BOSLER & DECARRIES, 1988, AZMITIA, 2001). Entre elas, a área hipotalâmica
lateral (AHL), órgão subfornicial (SFO), órgão vasculoso da lâmina terminal (OVLT),
núcleos medianos pré-ópticos dorsal (MnPOd) e ventral (MnPOv), núcleo
paraventricular (PVN) e núcleo supra-óptico (SON) são as áreas mais proeminentes
inervadas por neurônios serotoninérgicos. Neurônios produtores de 5-HT constituem o
primeiro sistema neuronal primordial da placa cortical. Estes neurônios representam um
grupo celular entre os primeiros a sofrerem diferenciação cerebral e exercem um papel
importante na neurogênese (AZMITIA, 2001), interagindo com múltiplos tipos
celulares e subtipos de receptores (AZMITIA, 1987, 2001; HOYER et al., 2002). Além
disso, a distribuição onipotente dos terminais e a diversidade de receptores cerebrais de
5-HT têm reservado a elaboração da hipótese que o sistema serotoninérgico possa
interferir praticamente em todos os mecanismos integrativos de plasticidade neuronal,
como por exemplo, autonômico, neuroendócrino, comportamental e cognitivo
(AZMITIA & SEGAL, 1978; AZMITIA, 1987, 2001; JACOBS & AZMITIA, 1992).
6
Figura 3. Projeções Serotoninérgicas. Neurônios serotonérgicos são projetados virtualmente para
todas as áreas do cérebro. Estes neurônios são agrupados em nove grupos anatômicos no núcleo da
rafe cerebral: os grupos caudais, B1-4, que dão origem a maioria das projeções descendentes; os
grupos rostrais, B5-9, que dão origem a maioria das projeções ascendentes. A figura mostra fibras
representativas indicando vias serotonérgicas cerebrais do rato em diferentes cores. O grupo
celular (B1-9) está representado nas áreas em azul, Abreviações: 3V, terceiro ventrículo; 4V,
quarto ventrículo; ACC, córtex anterior cingulado; Aq, aqueduto; ARC, núcleo hipotalâmico
arqueado; DR; núcleo dorsal da rafe; FC, córtex frontal; ml, leminisco medial; NAcc; núcleo
accumbens; NTS, núcleo do trato solitário; PAG, substância cinzenta periaquedutal; PVH, núcleo
hipotalâmico paraventricular; RMg, núcleo magno da rafe; RMn, núcleo mediano da rafe; Rob,
núcleo obscuro da rafe; RPa, núcleo pálido da rafe; SC, medula espinhal; V1, córtex visual
primário (LAM & HESLER, 2007).
2.2 Regulação Hidroeletrolítica
O sistema serotoninérgico é co-responsável pela regulação do equilíbrio
hidroeletrolítico. Estruturas das regiões prosencefálicas envolvidas no controle
hidroeletrolítico e cardiocirculatório são reciprocamente responsáveis pela inervação da
rafe mediana cerebral (TANAKA et al., 1998, 2001; CELADA et al., 2002). O
contingente de neurônios sensíveis a angiotensina II (ANG-II) do SFO projeta
neurônios serotoninérgicos para o NDR (TANAKA et al., 1998). Esta avaliação foi
realizada em um estudo onde foi concluído que neurônios sensíveis a ANG-II do SFO
monitoram os níveis circulantes de ANG II e depois transmitem a informação para o
NDR.
Este mesmo grupo de pesquisadores demonstrou que em um evento
hemorrágico, com sabido aumento no nível plasmático de ANG II, se excitam neurônios
serotoninérgicos do NDR os quais projetam fibras para o SFO, onde o aumento do
turnover de 5-HT foi detectado de uma forma mais contundente (TANAKA et al.,
2001). Como tal, incrementando-se os níveis plasmáticos de ANG II também se reflete
no decréscimo do volume do FEC (fluido extracelular) aumentado por hiponatremia e
isto é plausível, adicionalmente, para admitir que a restauração do volume circulante
7
seja correlacionada com alterações no turnover de 5-HT no NDR. Neste contexto,
múltiplos subtipos de receptores 5-HT (5-HT1A, 5-HT2A e 5-HT2C) são
farmacologicamente identificados no SFO (SCROGIN et al., 1998). Neste estudo, os
autores relataram que a liberação de 5-HT no SFO pode ser relacionada com o controle
da secreção de vasopressina. Contudo, considerando o papel do SFO na expressão por
apetite ao sódio e a identificação de receptores AT1 (angiotensina) nesta estrutura, a
hipótese da transmissão serotoninérgica nesta estrutura influenciando a atividade
angiotensinérgica não pode ser excluída.
Ademais, outro grupo de pesquisadores evidenciou, através de microdiálises,
que injeções de ANG II no SFO reduzem 5-HT extracelular e seus níveis metabólitos
(TANAKA et al., 2004). Além disso, a existência de uma possível alça de feedback
entre SFO e a rafe também é sugerida. Esta suposição é baseada na observação de sítios
ligantes da ANG-II e receptores AT1 identificados no NDR (MOULIK et al., 2002). É
possível uma interação entre o ANP carreado no sangue ou ANP liberado
sinapticamente pelo NDR. Alterações experimentais na homeostase hidrossalina
influência os níveis de ANP no NDR (PALKOVITS et al., 1990). Um decréscimo
significativo nos níveis de ANP foi detectado no NDR após o desenvolvimento de
hipertensão em ratos em comparação aos controles normotensivos (BAHNER et al.,
1988). Estas demonstrações reforçam a possibilidade que estas estruturas
procencefálicas e mesencefálicas reciprocamente ativam informações durante alterações
homeostáticas para a regulação da ingestão de água e sal e ajuste cardiocirculatório
(LIND, 1986).
Analisando concomitantemente, as observações acima constituem evidencias
circunstanciais para a existência de um circuito neuronal SFO-NDR-SFO que deve ser
atribuído a regulação do balanço hidroeletrolítico e cardiovascular como proposto
outrora (REIS et al., 1994, CAVALCANTE-LIMA et al., 2005a, b). Adicionalmente,
não se pode desprezar a possibilidade de outra interação recíproca entre áreas
prosencefálicas e rafe mediana, particularmente entre OVLT, MnPO, AHL e NDR.
Estas especulações experimentais, realizadas por Tanaka et al. (2004), aumentam a
possibilidade de que outros sinais humorais (níveis plasmáticos de ANP e OT) bem
como a liberação neural desses peptídeos em estruturas da lamina terminalis, integram
sistemas que monitoram o status hidroeletrolítico. A relação neuroanatômica
mencionada anteriormente pressupôs a elaboração de interações funcionais complexas
entre estruturas cerebrais prosencefálicas e mesencefálicas. Isto diz respeito ao controle
das funções autonômicas, neuroendócrinas e comportamentais durante alterações
homeostáticas presentes no ambiente.
Lesões eletrolíticas do NDR e MNR em ratos normohidratados induzem
antinatriurese, mas sem causar alterações significativas na resposta excretora de
potássio e diurese (REIS, et al., 1994). Neste estudo, a diminuição da excreção urinária
de sódio perdurou por quatro dias após a lesão e a resposta antinatriurética foi mais
intensa em ratos com lesão no NDR do que no MNR. A antinatriurese em ratos NDR-
lesionados se correlaciona com uma drástica redução nos níveis plasmáticos de ANP,
em condições basais e após expansão do volume sanguíneo. Foi demonstrado que ao
final da semana ratos NDR-lesionados recuperaram os valores normais da excreção de
sódio bem como os níveis de ANP plasmático. A depleção cerebral de serotonina
instalada pela administração intra-cerebroventricular (icv) de pCPA, similarmente,
evocou a redução urinária de sódio. A resposta antinatriurética foi expressa entre os
dias 3-7 após a administração central de pCPA. Adicionalmente, ratos 5-HT-depletados
apresentaram baixos níveis de ANP em condições basais e durante a expansão do
8
volume sanguíneo. Estas observações levantam a hipótese que neurônios-NDR,
serotoninérgicos, regulam a excreção renal de sódio pelo controle da liberação de ANP
(REIS et al., 1994).
2.3 Regulação do Apetite por Sódio
O sistema serotoninérgico exerce um papel primordial na regulação do apetite
por sódio e regulação da sede (REIS, 2007). Após déficit prolongado de sódio causado
por restrição na dieta alimentar, sistemas sensoriais são ativados conduzindo a
sinalização humoral. Em contraste, quando o sódio é oferecido em excesso
ultrapassando o set point fisiológico, a um incremento no volume do fluido extracelular
envolvendo uma depressão da atividade do sistema renina angiotensina aldosterona
(SRAA). Esta resposta é seguida por um concomitante aumento da liberação do
peptídeo natriurético atrial (ANP), e provavelmente, ocitocina (OT), e conseqüente
inibição do apetite por sódio (McCANN et al., 2003).
A primeira avaliação direta abordou à influência do sistema serotoninérgico no
apetite ao sódio, realizada em ratos sistemicamente tratados com agentes
serotoninérgicos (agonistas 5-HT, liberadores 5-HT ou inibidores pré-sinápticos da
recaptação 5-HT). Assim, a administração periférica aguda de agonistas (5-HT2C,
MK212 e mCPP), liberadores 5-HT (fenfluramina) ou inibidores pré-sinápticos da
recaptação 5-HT (fluoxetina), reduzem seletivamente o consumo de salina hipertônica
em ratos desidratados (NEILL & COOPER, 1989). Inversamente, baixas doses de
agonistas 5-HT1A, 8-OH-DPAT e gepirona administrados sistemicamente,
incrementam a ingestão de salina hipertônica em ratos reidratados, em um teste de 30
minutos, com ausência de efeito na ingestão de água (COOPER et al., 1988). Dados
similares foram obtidos de observações feitas em ratos sódio-depletados e tratados com
dexfenfluramina, um liberador de 5-HT cerebral, e metergolina, um antagonista 5-HT2
(ROUAH-ROSILIO et al., 1994). Neste estudo, foi demonstrado que a administração de
dexfenfluramina reduziu drasticamente a ingestão de NaCl 3% em ratos sódio-
depletados, assim como, o consumo espontâneo de NaCl 1,8%, sem nenhum efeito na
ingestão de água. Adicionalmente, foi evidenciado que administração de metergolina
incrementou a ingestão de salina hipertônica em circunstâncias livres em ratos com um
prévio histórico de depleção de sódio ou não. De acordo com Rouah-Rosilio et al.
(1994) estes dados dão suporte à hipótese que o sistema de transmissão serotoninérgica
exerce uma inibição tônica no consumo de sal.
O tratamento agudo sistêmico com o liberador de 5-HT cerebral, fenfluramina,
inibidor da recaptação 5-HT, fluoxetina, ou agonistas de receptores 5-HT2C, MK212 e
mCPP, reduziram significativamente a ingestão de salina hipertônica, em ambos, ratos
alimento-deprivados, ratos fluido-deprivados e ratos sódio-depletados (BADAUÊ-
PASSOS et al., 2003). Administração i.c.v de agonistas 5-HT confirmaram as
observações obtidas com o tratamento sistêmico e introduziram a provável participação
de outro receptor 5-HT. Assim, a estimulação central dos receptores 5-HT2C e 5-HT3,
através da microinjeção i.c.v de mCPP e m-CPBG, respectivamente, diminuíram a
ingestão de salina hipertônica em ratos sódio-depletados (CASTRO et al., 2003).
Baseando-se nesses resultados, pode ser admitida a hipótese que o sistema
serotoninérgico participa efetivamente da regulação do apetite por sódio, (I) após a
depleção de sódio, inibindo a indução por necessidade de ingestão de sal, e (II) em
9
condições basais, inibindo a indução livre de ingestão de sal. Por outro lado, Cooper &
Ciccocioppo (1993) mostraram que a administração aguda de agonistas 5-HT1A,
ipsapirona, gepirona, e 8-hidroxi-2(di-npropilamino) tetralina (8-OH-DPAT) induzem
um incremento na ingestão de sal em dois testes de privação hídrica em ratos. Os
autores atribuíram esses resultados como conseqüência de uma ação inibitória de
agonistas 5-HT1A, na SDAR, o qual resulta na redução da atividade serotoninérgica
central. Um recente estudo mostrou de um modo oposto que o tratamento crônico com
8-OH-DPAT diminuiu a ingestão de sal em ratos sódio-depletados (BADAUÊ-PASSOS
et al., dados não publicados). Este resultado possivelmente foi alcançado através da
dessensibilização da SDAR produzido pela exposição crônica a agonistas 5-HT1A
como demonstrado em outra oportunidade (BLIER & DE MONTIGNY, 1990;
HADDJERI et al., 1999).
A depleção de 5-HT cerebral e a lesão do NDR incrementou a ingestão de salina
hipertônica em condições basais e após alterações hidroeletrolíticas (REIS, 2007). Para
avaliar a participação de vias serotoninérgicas na modulação do apetite ao sódio, dois
modelos experimentais foram usados por este grupo: (I) depleção 5-HT cerebral, através
da administração sistêmica de pCPA (350mg. Kg
-1
, durante dois dias, ip) e (II) lesões
eletrolíticas ou excitotóxicas do NDR. A redução do índice cerebral de 5-HT
potencializa drasticamente a resposta natriorexigênica evocada pela depleção de sódio
em ratos tratados com furosemida (LIMA et al., 2004). Curiosamente, a resposta
exagerada ao apetite por sódio ocorreu três dias após a administração de pCPA. Em
contraste, sete dias após o tratamento com pCPA, a resposta natriorexigênica tornou-se
menor que os valores do grupo controle, provavelmente devido a uma superexpressão
de TPH (triptofano-hidroxilase) ou elevação dos níveis de transportadores RNAm,
como foi sugerido anteriormente (COOPER et al., 1996; RATTRAY et al., 1996). Estes
resultados corroboram com a hipótese que a depleção transitória de 5-HT ativa o seu
ciclo de restauração cuja evolução influencia o comportamento por ingestão de sal sobre
condições hiponatrêmicas e hipovolêmicas.
A administração periférica de isoproterenol (um potente agente dipsogênico, o
qual atua sobre a liberação de renina e estímulo hipotensor) em ratos pCPA-tratados,
induziu intensa ingestão de água e salina hipertônica enquanto que nos ratos-controle foi
observada a clássica resposta dipsogênica (LIMA et al., 2004). Lesões eletrolíticas da
porção ventral do NDR induziram um incremento na ingestão de salina hipertônica, em
condições basais. Entretanto, estes procedimentos experimentais foram realizados por
três dias. A ingestão de água foi também mais intensa da terceira hora até a décima
segunda hora pós-lesão, quando se tornou igual aos valores controle até o terceiro dia de
experimento (OLIVARES et al., 2003). Lesões eletrolíticas de ratos NDR-lesionados
indicaram uma resposta dipsogênica e natriorexigênica mais intensa provocado por
furosemida associada a baixas doses de captopril. Estas observações forneceram a
conclusão que lesões NDR-eletrolíticas suprimem uma atividade ascendente inibitória
do apetite por sódio. As lesões eletrolíticas selecionadas para o estudo foram limitadas a
área ventro-medial do NDR onde existe um contingente expressivo de pericário que se
projetam para o prosencéfalo. Entretanto, neste procedimento a passagem de fibras
axonais e neurônios não-serotoninérgicos também foram lesionados. Por esta razão,
estudos subseqüentes foram realizados para circunscrever a lesão somente no pericário
localizado na sub-região dorsal-ventral-medial do NDR através de microinjeções do
aminoácido excitatório, ácido ibotênico.
Lesões excitotóxicas do NDR produzem qualitativamente as mesmas respostas
alcançadas com lesões eletrolíticas e depleção de serotonina cerebral, rendendo as
10
interpretações mais acuradas concernindo o envolvimento de neurônios genuínos desta
estrutura (CAVALCANTE-LIMA et al., 2005a, b). Lesão do NDR induzidas pelo ácido
ibotênico incrementou a ingestão de salina hipertônica que se iniciou no terceiro dia de
injeção do ácido ibotênico e foi mantida num platô de 20 ml a do décimo primeiro dia,
sustentando-se por muitos dias. A ingestão de água não foi significativamente alterada,
conseqüentemente, a preferência por sódio foi sustentada em altos valores durante todo
período de observação. Quando ratos NDR-lesionados (dias 21 e 35 pós-injeção/intra-
NDR) foram deprivados de fluidos e alimento, uma intensa ingestão de salina
hipertônica foi observada quando a resposta dipsogênica foi comparada ao controle. A
resposta dipsogênica evocada por isoproterenol mostrou que os ratos lesionados (7, 21 e
35 dias após lesão ibotênica) apresentaram um alto apetite por sódio, quando a ingestão
de água foi comparada com os controles. A alta ingestão cumulativa de salina
hipertônica foi mantida por um longo período até o segundo dia de observação, quando
valores controle foram sustentados dentro de baixos níveis durante todo o período.
Resultados similares foram obtidos com a administração subcutânea de polietilenoglicol
(PEG). Ação coloidosmótica da PEG evoca uma hipovolemia associada à desidratação
extracelular. Nesta condição, ratos NDR-lesionados (21 dias após injeção de ácido
ibotênico) exibiram um precoce e intenso apetite por sódio em relação ao controle. A
resposta dipsogênica foi deflagrada de forma semelhante ao controle, sendo maior
depois de decorrido 5 horas da apresentação de fluidos. Por outro lado, ratos lesionados
e depletados exibiram uma associação entre uma intensa resposta natriorexigênica e
uma alta ingestão de água quando comparada ao controle.
O tratamento crônico com baixas doses de captopril, similarmente a sua adição a
água, incrementou níveis plasmáticos de ANG I devido à ação periférica
(FITZSIMONS, 1998). Esta condição induz uma supressão do feedback negativo nas
células justaglomerulares, subseqüente hipernatremia, e baixos níveis plasmáticos de
ANG II. Assim, uma alta disponibilidade de ANG I cerebral, permite um incremento da
sua conversão central para ANG II, particularmente no SFO. Neste contexto, isso
resulta em um incremento do apetite por sódio. Neste paradigma, ratos lesionados com
ácido ibotênico, após seis dias, exibiram um alto consumo de salina hipertônica e
incremento no apetite por sódio. Vinte e quatro horas após a remoção de captopril da
dieta, o consumo de salina hipertônica foi menor do que os níveis pré-tratamento. A
ingestão de água praticamente não se diferiu entre os grupos. Nos grupos de ratos
lesionados (21-35 dias pós-lesão) 48h após o término das observações experimentais,
mais de 50% deles prensaram e morderam um cristal de NaCl oferecido na ponta das
pinças. Analisando como um todo, resultados obtidos a partir da depleção de serotonina
cerebral e lesão eletrolítica ou exocitotóxica do NDR, divulgou-se uma alta
sensibilidade cerebral a modelos experimentais que evocaram incremento nos níveis
plasmáticos de ANG II ou atividade angiotensinérgica central. Esta observação levou a
suspeita que o déficit na transmissão ascendente serotoninérgica represente a supressão
de uma importante via modulatória no apetite ao sódio. Isto é apelativo para
compararmos este modelo experimental, ao menos parcialmente, com condição
funcional espontânea de ratos hipertensivos (SHR).
Ratos SHR desenvolvem um intenso apetite por sódio associado com incremento
na sensibilidade angiotensinérgica no loci cerebral relacionado com a homeostase
cardiocirculatória e eletrolítica (STOCKER et al., 2003). Isto é importante porque estas
alterações tem sido concomitantes com um déficit no turnover de 5-HT em regiões
prosencefálicas. Alternativamente, as vias ascendentes serotoninérgicas podem
constituir um sistema modulador envolvido com a liberação de ANP. A primeira
11
observação indireta favorável desta suposição foi realizada em um trabalho onde foi
demonstramos que depleção de 5-HT cerebral e as lesões do NDR induz um déficit nos
níveis de ANP, em condições basais, ou após a expansão do volume sanguíneo (REIS et
al., 1994). Isto pode ser considerado o fator predisponente para o incremento do apetite
por sódio, desenvolvidos em ratos 5-HT-depletados ou NDR-lesionados. Uma a duas
semanas após os procedimentos experimentais, os ratos já tinham recuperado a
capacidade da regulação da excreção de sódio. Contudo, estudos mais recentes
(CAVALCANTE-LIMA et al., 2005a, b) evidenciaram que um intenso apetite por sódio
persistiu por um longo período em ratos lesionado, indicando que outros sistemas
modulatórios possam estar envolvidos. Um deles pode ser representado pela ação da OT
no SFO. Estudos mostraram o papel inibitório da OT no apetite por sódio
(BLACKBURN, et al., 1995; STRICKER & VERBALIS, 1996). Este sistema
homeostático pode ser responsável por ajustes no volume do FEC através do aumento
da excreção renal de sódio e um decréscimo na ingestão de sal (SOARES et al., 1999;
ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004).
Estudos imunorreativos da proteína Fos mostraram que neurônios do NDR, area
postrema (AP) e núcleo para-braquial lateral (NPBL) e também a porção magnocelular
do núcleo para-ventricular (PVN), particularmente os neurônios produtores de OT, são
intensamente marcados, em ratos sódio-depletados com livre acesso a salina hipertônica
(FRANCHINI & VIVAS, 1995; FRANCHINI et al., 2002). Esta subregião é
densamente inervada por fibras serotoninérgicas projetadas para o NDR e assim a
estimulação serotoninérgica induz um incremento da liberação de OT (AZMITIA &
SEGAL, 1978; SAYDOFFET et al., 1991; JORGENSEN et al., 2003).
Conseqüentemente, o papel do sistema serotoninérgico no apetite por sódio pode
envolver a estimulação de neurônios ocitocinérgicos em um contexto fisiológico ainda
não identificado. Evidências recentes de Hiyama et al. (2004) mostraram que o SFO é o
local primário sensível aos níveis de sódio associado com a ingestão de sódio. Neste
estudo os autores descobriram que os especializados canais de sódio voltagem-
dependentes constituem um sensível mecanismo envolvido que evita o comportamento
salino em ratos desidratados. Significativo é que tais mecanismos funcionam de um
modo independente comparativamente ao mecanismo de apetite por sódio induzido por
ANG II no SFO. Lesões no NDR ou depleção de 5-HT cerebral potenciou o apetite por
sódio induzido por múltiplos paradigmas, incluindo desidratação. Conseqüentemente,
vias ascendentes serotoninérgicas intactas também podem modular a aversão ao
comportamento salino na desidratação, e possivelmente outras condições relacionadas à
depleção de sódio (inibindo).
2.4 Regulação da Ingestão Alimentar e do Balanço Energético
A serotonina é uma importante reguladora da ingestão alimentar e do balanço
energético. No cérebro, fibras serotoninérgicas dos núcleos da rafe mesencefálica são
projetadas para os principais centros alimentares, onde a serotonina atua distalmente em
receptores específicos para modular a atividade de vários sistemas serotoninérgicos e
vias autonômicas. Deste modo, o comportamento de ingestão e o gasto energético são
diretamente afetados por esta indolamina. Este importante neurotransmissor, liberados
pelas células enterocromoafins, também parece regular a homeostase energética através
de mecanismos periféricos. Efeitos serotoninérgicos sobre o balanço energético levam a
12
influências secundárias na homeostase da glicose, baseada em uma bem estabelecida
ligação entre obesidade e resistência a insulina. Contudo, vias serotoninérgicas também
podem afetar diretamente a homeostase da glicose através da regulação de eferentes
autonômicos e/ou ação em tecidos periféricos. Muitos compostos serotoninérgicos têm
sido avaliados para uso clínico no tratamento da obesidade e diabetes tipo 2 (LAM &
HEISLER, 2007).
Algumas evidências têm relacionado à transmissão serotoninérgica com o
comportamento alimentar. O núcleo basomedial hipotalâmico e a área hipotalâmica
lateral, estruturas relacionadas ao controle do comportamento alimentar, são inervados
por neurônios serotoninérgicos da rafe mesencefálica (AZMITIA & SEGAL, 1978).
Estudos envolvendo agentes que atuam de diferentes formas no sistema serotoninérgico
(BLUNDELL, 1984; 1991) corroboram com a hipótese da relação direta da serotonina
na modulação do apetite. Receptores pós-sinápticos 5-HT1B e 5-HT2C são os mais
relevantes na resposta anorexigênica em mamíferos e aves (BLUNDELL, 1984, 1991)
Adicionalmente, hiperfagia e obesidade acarretada após depleção de serotonina, através
de um inibidor da enzima triptofano hidroxilase ou após lesões neurotóxicas de
neurônios serotoninérgicos, reforçam esta hipótese serotoninérgica (SALLER &
STRICKER, 1976).
Sabidamente, outros dois sistemas estão envolvidos com a ingestão alimentar, o
hormônio leptina e o neuropeptídeo orexina A que é expresso no hipotálamo lateral
após jejum e subseqüente depleção energética (RODGERS et al., 2002). A leptina reduz
a ingestão alimentar e adicionalmente estimula mecanismos dentro do hipotálamo
basomedial para oxidação da gordura, que concerne balanço energético e,
conseqüentemente, mantendo o peso corporal (GRILL & KAPLAN, 2002). O
subconjunto de neurônios serotoninérgicos no núcleo da rafe co-expressa o transporte
de RNAm de serotonina e o RNAm do receptor de leptina (FINN et al., 2001).
Recentemente, foi evidenciado a recaptação de leptina por neurônios serotoninérgicos
do NDR (FERNÁNDEZ-GALAZ et al., 2002) e demonstrado que o efeito hipofágico
da leptina é mediado por atividade serotoninérgica e subseqüente estimulação de
receptores 5-HT2C (YAMADA et al., 2003). Por outro lado, receptores de orexina A
foram identificados nos neurônios serotoninérgicos do NDR em que a sua excitação
possivelmente constitui um ciclo de feedback negativo para o controle da ingestão
alimentar, particularmente de carboidratos (BROWN et al., 2001).
2.5 Regulação da Sede e da Ingestão de Água
A regulação homeostática da ingestão de fluídos pelo cérebro é multifatorial.
Sinais osmóticos, iônicos, hormonais, e nervosos são convergidos e integrados pelo
SNC. Regiões clássicas envolvidas neste controle hídrico são os órgãos
circunventriculares (OVLT e SFO) situados na parede anterior do terceiro ventrículo
(lamina terminalis). A saciedade ou extinção da sede na seqüência da ingestão de água
envolve a participação de outras vias neurais sensoriais e integradoras que também
interagem com este circuito (McKINLEY & JOHNSON, 2004).
Adicionalmente ao controle do apetite por sódio, o sistema serotoninérgico é
envolvido na regulação da sede e na ingestão de água (REIS, 2007). A administração
icv de MK212, um agonista 5-HT2C, induziu a ingestão de água após privação hídrica
(REIS et al., 1990a, b, 1992). De outro modo, foi demonstrada em um estudo que lesões
13
eletrolíticas do NDR, induziram uma intensa resposta dipsogênica em ratos com acesso
somente a água (REIS et al., 1994). Em ambas as condições, após injeção central de
agonistas 5-HT ou lesão do NDR, os ratos tiveram livre acesso somente a água.
O núcleo parabraquial lateral (NPBL) é um importante circuito pontino
envolvido na regulação do apetite por sódio (MENANI et al., 1996, 1998a, b). As fibras
aferentes mais densas para o NPBL são oriundas da AP e NTS. Conseqüentemente, o
NPBL recebe sinais sensoriais que convergem em direção ao NTS. Adicionalmente,
sinalizações viscerais e plasmáticas e informação do fluido cérebro espinhal são
integradas na AP. Um contingente particular de neurônios oriundos da AP e NTS são
produtores de 5-HT, porém, eles não representam neurônios serotoninérgicos clássicos
como os da região mesencefálica (AZMITIA & SEGAL, 1978; PARENT et al., 1981,
AZMITIA, 1987, FRANCHINI et al., 2002). O grupo de fibras projetadas do NDR que
constituem a inervação eferente do NPBL é composto por típicos neurônios
serotoninérgicos e não serotoninérgicos (PETROV et al., 1992a, b). Por outro lado, o
NPBL envia fibras peptidérgicas para o NDR. Conseqüentemente, muitos estudos
mostraram que impulsos serotoninérgicos para o NPBL é relevante especificamente
para o controle do apetite por sódio (MENANI et al., 1996; JOHNSON &
THURNHORST, 1997; McKINLEY & JOHNSON, 2004). Este importante papel
atribuído ao NPBL é parcialmente conseqüência da sua posição estratégica, a qual
permite uma troca de informação com outro relevante núcleo como NDR, bem como
AP e NTS. A administração bilateral do antagonista 5-HT1/5-HT2, metilsergida ou
agonista 5-HT2A/5-HT2C, DOI, no NPBL influencia o aumento do apetite por sódio
por diversos paradigmas experimentais. O incremento da ingestão de salina hipertônica
provocado por microinjeções i.c.v de ANG II ou de furosemida associada ao captopril
s.c foi evocado pela administração de antagonistas 5-HT1/2 intra-NPBL. Em contraste,
administração de DOI no NPBL diminuiu a ingestão de salina hipertônica induzido por
furosemida associada ao captopril (MENANI et al., 1996). Resultados similares foram
obtidos em modelos de ingestão de sal induzido por DOCA, privação hídrica, depleção
de sódio ou estimulação beta-adrenérgica (MENANI et al., 1998a, DE GOBBI et al.,
2000). Estes autores demonstraram que o antagonista de AT1, losartan, administrado
dentro do SFO reduziu a ingestão adicional de sal causado pelo bloqueio dos receptores
5-HT1/2 do NPBL em ratos tratados com furosemida associada ao captopril
(COLOMBARI et al., 1996, MENANI et al., 1998b). Adicionalmente, foi evidenciado
que a estimulação colinérgica com administração i.c.v de carbacol, que classicamente
evoca uma resposta dipsogênica, induziu uma intensa ingestão de salina hipertônica
após o bloqueio dos receptores 5-HT1/2 no NPBL (MENANI et al., 2002). Estas
observações mostram claramente o papel funcional do NPBL onde são encontrados
mecanismos serotoninérgicos inibitórios do apetite por sódio (MENANI et al., 1996,
McKINLEY & JOHNSON, 2004). Como examinado acima, o NPBL faz parte de um
sistema inibitório de coordenação do apetite por sódio que também pode incorporar AP
e NDR para o controle integrativo da ingestão de sal.
Neurônios serotoninérgicos no NDR são mediadores das respostas
neuroendócrinas e comportamentais em condições estressoras (GRAEFF et al., 1997;
MAIER & WATKINS, 1998; CHAOULOFF, 2000; LOWRY, 2002). Neste contexto, a
administração intra-NDR de agonistas de receptores de hormônio liberador de
corticotropina 1 (CRF1) inibe a atividade serotoninérgica enquanto que agonistas CRF2
incrementam o efluxo de 5-HT na região ântero-cerebral (KIRBY et al., 2000; AMAT
et al., 2004). Por outro lado, a administração de hormônios corticosteróides, uma
manobra que imita a condição de estresse, influencia o índice de TPH cerebral. O
14
tratamento agudo de ratos adrenalectomizados (ADX) com glicocorticóide,
dexametasona, induziu um incremento nos níveis de RNAm de TPH na rafe (AZMITIA
et al., 1993). Ao contrário, durante o tratamento crônico de ratos-ADX com
dexametasona por uma semana há um grande decréscimo nos níveis de RNAm de TPH
no NDR (CLARK & RUSSO, 1997). Este último achado constitui uma evidência
importante que o estresse crônico é capaz de reduzir o turnover de 5-HT no loci
cerebral. É razoável conjecturar que o estresse crônico está ligado com a depleção de 5-
HT cerebral e hipofunção serotoninérgica. Entre as desordens afetivas, a depressão pode
coexistir com o desenvolvimento de distúrbios circulatórios (BRASZKO et al., 2003).
Nesta condição é freqüente o diagnóstico de hipofunção serotoninérgica realizada
através da prova de capacidade de liberação de prolactina após administração de um
liberador de 5-HT (MELTZER & LOWY, 1987). Isto significa que a depleção de
triptofano e serotonina é um amplo paradigma envolvido no estudo de mecanismos
relacionados com o sistema serotoninérgico e no desenvolvimento da depressão
(NEUMEISTER, 2003; ELHWUEGI, 2004; O’REARDON et al., 2004). Isto é
convincente para especular que os conflitos durante a interação com o meio ambiente
possam gerar distúrbios na regulação do volume do FEC e na pressão sanguínea. Estas
perturbações homeostáticas podem ser relacionadas com o déficit de transmissão
serotoninérgica para regiões cerebrais implicadas com o controle autonômico,
neuroendócrino e comportamental do balanço cardiocirculatório e hidroeletrolítico.
Neste contexto, alguns relatos têm mostrado que pacientes depressivos freqüentemente
desenvolvem hipertensão (BRAZKO et al., 2003). Por outro lado, no modelo de
depleção de 5-HT cerebral através de administração i.p de pCPA ou lesão no NDR, foi
demonstrado à expressão de uma exagerada resposta natriorexigênica após depleção de
sódio em ratos (OLIVARES et al., 2003; LIMA et al., 2004; CAVALCANTE-LIMA et
al., 2005a, b). Entretanto, não existem estudos sistemáticos correlacionando o
desenvolvimento do excessivo consumo de sal e a incidência de hipertensão em
pacientes depressivos com déficit na atividade serotoninérgica.
Projeções neurais do sistema serotoninérgico são distribuídas por todo o
encéfalo durante o desenvolvimento ontogênico do sistema nervoso. De acordo com
Azmitia, literalmente todas as atividades cerebrais podem sofrer influência
serotoninérgica, dos níveis homeostáticos, autonômico, neuroendócrino e
comportamental até funções cognitivas. Consequentemente, quando se refere à
regulação do balanço hidroeletrolítico é possível que a atividade serotoninérgica
estenda-se a todos os níveis de coordenação da função cerebral. Quando essa atividade
regula a excreção eletrolítica através da atividade eferente do controle autonômico para
os túbulos renais e pela secreção de ANP, circuitos serotoninérgicos do NDR,
possivelmente integram o NPBL, que parece ser responsável pela estimulação de
diferentes mecanismos da inibição do apetite por sódio. Reis (2007) propôs que de
acordo com o controle da saciedade por sal, as evidências recentes convergem para
cinco possibilidades: 1) vias serotoninérgicas podem interagir com neurônios
ANPérgicos da lamina terminalis excitando o circuito neural de saciedade ao sódio após
o período de ingestão de sal; 2) a estimulação da liberação de ANP cardíaco, por
mecanismo neuroendócrino, mediado por estruturas da lamina terminalis que pode
contribuir também por algum contexto em modular o apetite por sódio; 3) vias
serotoninérgicas ascendentes podem modular a atividade dos neurônios ANG-II-
sensíveis do SFO implicados com a ativação de circuitos excitatórios do apetite por
sódio durante o déficit de volume do FEC; 4) neurônios serotoninérgicos do NDR
podem ser indiretamente envolvidos na modulação do apetite por sódio através da
15
ativação de neurônios ocitocinérgicos que devem transmitir sinais inibitórios para
expressão deste comportamento; 5) após evidencias recentes no qual canais de sódio
sensíveis (HIYAMA et al., 2002, 2004) são envolvidos com o comportamento salino
aversivo, é aceitável postular que as vias serotoninérgicas ascendentes possam também
modular o apetite por sódio na desidratação e, possivelmente, em outras condições
relacionadas à depleção de sódio. Até este momento, não há conhecimentos
substanciais, que demonstrem o envolvimento do sistema serotoninérgico no controle de
detectação e reconhecimento do paladar salino. Somente em um estudo, o
reconhecimento e percepção do paladar foram avaliados através de quatro sensações
gustatórias primárias (doce, amargo, sal e azedo) em pacientes com desordens sazonais
afetivas (SAD) (ARBISI et al., 1996). Usualmente esta condição é expressa com um
incremento do apetite associado à fome por carboidrato que são sintomas característicos
de SAD e são atribuídos ao decréscimo da função serotoninérgica central (WURTMAN
& WURTMAN, 1989). Eles concluíram que a chegada do inverno exerceu efeitos
significativos na detecção de doce, amargo e azedo e não influenciou a detecção de sal.
Diversos aspectos permanecem para serem elucidados, entre os quais, como pacientes
portadores de SAD se comportariam em vista do modelo de depleção de volume e
hiponatremia no que concerne a detecção do paladar salino.
A relação entre estímulos viscero-sensoriais (depleção de volume, decréscimo
da carga de filtração de sódio ao longo da mácula densa, etc), níveis plasmáticos de
ANG II, ANP, OT e vias serotoninérgicas ascendentes foi demonstrada ilustramente por
Reis (2007). Relações recíprocas entre SFO e NDR e entre NDR e NPBL também
foram representadas mostrando a plasticidade das reações comportamentais adaptativas
induzidas por depleção de volume através da (i) sinalização das alterações viscero-
sensoriais e (ii) monitoração dos níveis plasmáticos de ANG II, ANP e OT executados
por estruturas prosencefálicas. Entretanto, permanecem para ser elucidados: (i) a relação
funcional recíproca entre NDR e NPBL (ii) a origem da transmissão dos sinais viscero-
sensoriais no déficit da concentração de sódio e volume do FEC e da carga de filtração
de sódio nos túbulos renais e (iii) a existência de sinais de estruturas prosencefálicas
para regiões mesencefálicas, transmitindo informações sobre monitoração da
concentração plasmática de sódio, ANG II, ANP e outros fatores humorais. Os
contextos fisiológicos precisam ser investigados para esclarecer com estes sistemas
homeostáticos funcionam. Além disso, qual é curso temporal da ativação desses fatores
e, a correlação clínica entre o distúrbio funcional de cada sistema.
2.6 Regulação da Emoção e Processos do Controle Comportamental
A serotonina foi durante muito tempo relacionada com uma ampla variedade de
processos emocionais, cognitivos e comportamentais. Entretanto, sua precisa
contribuição continua ainda sem total esclarecimento (COOLS et al., 2008).
Dentre os neurotransmissores monoaminérgicos, a 5-HT apresenta
provavelmente o maior desafio em termos de dedução do seu principal papel.
Considerando a diversidade de ramificações neuroanatômicas dos núcleos dorsal e
mediano da rafe mesencefálica para virtualmente todas as regiões do cérebro e, pelo fato
de suas ações serem mediadas por pelo menos 17 receptores distintos, torna-se difícil
discernir suas ações adjacentes em um princípio simples (COOLS et al., 2008).
Não há dúvida da importância da 5-HT, não só em termos de modulação da
atividade motora e sensorial, mas também em relação ao seu papel central na cognição e
16
emoção e sua implicação nos transtornos afetivos, tais como ansiedade e depressão.
Dado o impacto que estudos funcionais serotonérgicos obtiveram em modelos recentes
de reforço da aprendizagem e de controle cognitivo, muitos pesquisadores concentraram
as suas atenções para investigações funcionais da 5-HT em humanos, apesar de a
variedade de métodos para manipular a função serotoninérgica em seres humanos é
muito mais restrita do que aquela para modelos animais.
Alguma parte do ímpeto no avanço do entendimento da fisiologia da serotonina
veio a partir da necessidade de explicar um grande paradoxo clínico, ou seja, por um
lado, os efeitos ansiolíticos dos benzodiazepínicos, que reduzem a transmissão
serotoninérgica (DEAKIN & GRAEFF, 1991), e, por outro lado, os bons resultados, em
longo prazo, da utilização dos inibidores seletivos da recaptação de serotonina (SSRIs),
que aumentam a transmissão serotoninérgica, na depressão e pânico (GRIEBEL, 1995;
HOLLANDER, 1998). Este paradoxo é pertinente dado que a ansiedade é muitas vezes
co-morbidade da depressão, e que ambos os distúrbios estão associados ao aumento
aversivo do processo e da sensibilidade ao estresse. A serotonina também está envolvida
em distúrbios de caráter impulsivos. Seus níveis estão reduzidos em pacientes com
manias, agressões decorrentes de alcoolismo e também em depressivos que tentaram
suicídio (THAKORE et al., 1996; EVENDEN, 1999).
Estes achados são relacionados com hipóteses, derivadas de estudos com
animais, que a serotonina medeia à inibição comportamental (SOUBRIÉ, 1986). A
redução da ansiedade pode ser interpretada como a remoção da repressão
comportamental. Isto proporciona uma ligação entre o potencial dos benzodiazepínicos
de redução da ansiedade e falhas no controle dos impulsos visto em seqüência na
redução da transmissão serotoninérgica. A discussão continua em torno da possibilidade
da desinibição comportamental associada com baixos níveis de 5-HT ser melhor
explicada em termos motivacionais ou motor, ou seja, se ele reflete remoção da
ansiedade ou resposta facilitadora por si só. Qualquer destas explicações poderia
envolver um relacionamento mutuamente inibitório com mecanismos
neuromoduladores dopaminérgicos, por exemplo, na amígdala, núcleo accumbens ou o
putamen caudado, que envolve o comportamento do apetite, efeitos de recompensa ou
reforço e controle motor.
Na última década do século passado, Deakin & Graeff (1991) tentaram resolver
este paradoxo com a hipótese que a ansiedade, o pânico e a depressão surgem a partir de
distintos sistemas neurais. Cools et al. (2007) em sua revisão, reformularam está
controvérsia em uma análise mais contemporânea que focou sobre os efeitos paradoxais
da serotonina envolvida em processos aversivos e controles inibitórios. Baseados nessa
análise, este grupo de pesquisadores levantou a hipótese que em nível subcortical, a
atividade serotonérgica pode promover um processo motivacional oposto aquele
mediado pela atividade dopaminérgica. Entretanto, modulações serotonérgicas diretas
do córtex orbitofrontal (OCF), podem estar envolvidas com uma diferente função, como
por exemplo, facilitando o controle inibitório descendente de mecanismos subcorticais
que regulam os processos emocionais e comportamentais.
17
2.7 Depleção de Serotonina
A serotonina ou 5-hidroxitriptamina (5-HT) realiza um importante papel no
desenvolvimento ontogênico do SNC de mamíferos (AZMITIA & GANNON, 1986)
tendo importante participação na proliferação celular, migração celular, diferenciação
neuronal, sinaptogênese e prevenção da morte celular programada (LAUDER &
KREBS, 1976; LAUDER, 1990; WHITAKER-AZMITIA et al., 1996; LAVDAS et al.,
1997; YAN et al., 1997a, b).
O inibidor enzimático mais utilizado em trabalhos experimentais é a para-
clorofenilalanina (pCPA). In vivo, a pCPA inibe irreversivelmente a enzima triptofano
hidroxilase, via enzimática limitante na síntese de 5-HT (NAKAMURA &
HASEGAWA, 2007). A pCPA incorpora-se à enzima para produzir uma proteína
inativa. Esta inativação produz marcante depleção de estoques de serotonina no cérebro,
tecidos periféricos e sangue de ratos e cães (KOE & WEISSMAN, 1966). Seu pico de
ação é alcançado rapidamente, 2-3 dias após a administração, podendo diminuir até 90%
os níveis de serotonina. Ao contrario das outras drogas utilizadas para depletar a
serotonina, como anfetaminas, diidroxitriptamina que são neurotoxinas, a pCPA não
produz dano á inervação serotoninérgica. Mesmo com a acentuada diminuição dos
níveis de serotonina, os níveis de outras catecolaminas sofrem pouca ação desta droga,
deixando evidente a especificidade da pCPA (KOE, 1971).
Evidências envolvendo a 5-HT no desenvolvimento do SNC são baseadas em
experimentos com neurotoxinas capazes de depletar este neurotransmissor. Lauder &
Krebs (1976) demonstraram que o tratamento materno durante o segundo trimestre
gestacional com pCPA induziu um retardo na diferenciação embrionária de neurônios
em ratos. Recentemente, alterações morfológicas pós-natais foram encontradas na
cortical neuronal de camundongos após tratamento com pCPA no nono dia gestacional
(KHOZHAI et al., 2006). Estudos em animais neonatos revelaram outro exemplo do
efeito da depleção de 5-HT no desenvolvimento neuronal, demonstrando um
decréscimo permanente no número de espinhas das células dendríticas do hipocampo
em ratos expostos a para-cloroanfetamina (PCA) ou 5,7-dihidroxitriptamina (5,7-DHT)
nos dias três e quatro pós-natais (DPN) (YAN et al., 1997a, b).
De fato, as diferentes anomalias que aparecem no desenvolvimento neuronal
resultado da depleção de serotonina nos períodos pré-natal e natal são bem
caracterizadas (CASES et al., 1996; YAN et al., 1997a, b; VITALIS et al., 1998;
ALVAREZ et al., 2002; ESAKI et al., 2005; UEDA et al., 2005; KHOZHAI et al.,
2006; HOHMANN et al., 2007), entretanto, pouco se sabe ainda sobre a correlação
entre as conseqüências fisiológicas e comportamentais. Farabollini et al. (1988)
reportaram que ratos machos adultos submetidos ao tratamento com pCPA durante a
segunda semana pós-natal mostram clara redução da ansiedade baseada em testes
comportamentais. Neste estudo, o tratamento com pCPA durante a primeira semana
pós-natal não produziu efeitos significativos. Por outro lado, Hohmann et al. (2007)
demonstraram que a injeção de 5,7-DHT no feixe medial prosencefálico (PD 1) resultou
na degradação na inervação serotoninérgica para o córtex e hipocampo, além de
exacerbar a ansiedade no rato adulto. Foi relatado ainda que tal tratamento não acarretou
déficit cognitivo. Volpe et al. (1992) e Ueda et al. (2005) também não obtiveram êxito
em obter dados para discussão em relação ao retardo da aprendizagem de ratos albinos
expostos a 5,7-DHT na PD 3, embora tenha havido considerável perda de neurônios
serotoninérgicos (VOLPE et al., 1992) e um decréscimo na neurogênese do gyrus
18
dentato (UEDA et al., 2005) resultante da administração de 5,7-DHT. Em relação aos
experimentos pré-natais, Butkevich et al. (2005) demonstraram que o tratamento com
pCPA no dia nove de gestação realçou o impacto do estresse de limitação maternal
durante o último trimestre de gestação com produção de dor induzida por formalina na
prole do rato adulto. O tratamento exclusivamente materno no mesmo dia de gestação
com pCPA produziu anormalidades morfológicas no núcleo dorsal da rafe, porém, com
efeitos mínimos sobre os aspectos comportamentais. Estes dados conjuntamente com
resultados similares obtidos em experimentos com ratos neonatos indicam que a
depleção de 5-HT durante o desenvolvimento precoce tem um significativo efeito em
estruturas cerebrais específicas, quando os comportamentos correspondentes
permanecem inalterados.
Vataeva et al. (2007) examinaram a hipótese de que o tratamento pré-natal com
pCPA sobre o comportamento do rato depende do tempo de exposição à droga durante o
período gestacional. Os achados mais relevantes deste estudo revelaram que a
administração de pCPA em ratas gestantes pode causar alterações comportamentais nos
seus descendentes, dependendo consideravelmente do período gestacional de exposição
à droga. Este estudo mostrou ainda que os efeitos pré-natais da pCPA, nos ratos
submetidos ao teste de campo aberto, foram mais expressivos quando as ratas eram
expostas entre os dias gestacionais 14-17 do que entre os dias 8-11. Além disso, apenas
a ninhada tratada entre esses dias mostrou um aumento da imobilidade no teste de
natação forçada e um significativo prejuízo no aprendizado no teste do labirinto de
Morris. Estes dados provam adicionalmente que a influência adversa pode exercer
maiores efeitos severos na função cerebral durante o segundo trimestre do que no último
semestre da gestação (PETERS, 1988; LORDI et al., 1997; VATEAVA et al., 2001).
Uma possível explicação para as diversas formas de alterações nas funções
cerebrais pela depleção de serotonina advém supostamente de diferentes mecanismos 5-
HT-dependentes de regulação do desenvolvimento embrionário cerebral em dois
períodos gestacionais. Os níveis embrionários de 5-HT no rato permanecem baixos
durante o início da gestação. É possível, que neste período, a serotonina possa ser
essencial para diferenciação de estruturas cerebrais. As evidências levam a crer que a 5-
HT embrionária no início da gestação é de origem materna (CÔTÉ et al., 2007) e a
depleção deste neurotransmissor durante este período provavelmente acarrete um
retardamento embrionário somático e desenvolvimento cerebral como um todo. O
incremento de 5-HT, particularmente em estruturas cerebrais embrionárias, acontece no
último trimestre de gestação (VITALIS & PARNAVELAS, 2003). Com isso, o
tratamento pré-natal com pCPA nos dias gestacionais 14-17 corresponde ao período em
que a 5-HT pode especificamente afetar a maturação neuronal no córtex frontal,
estruturas hipocampais e amígdala que estão envolvidos no controle comportamental.
Estes achados mostram que o tratamento materno durante a gestação com pCPA
acarreta alterações comportamentais na vida adulta da ninhada que pode ser
amplamente comparada com aquelas causadas pelo stress pré-natal (WEINSTOCK,
2002). Isto inclui um aumento da atividade motora no teste de campo aberto, revelado
previamente em outros estudos usando diferentes formas de estresse materno (PETERS,
1986; VATAEVA, 2001). Ratos pré-natais tratados com pCPA, assim como animais
estressados no período pré-natal (ALONSO et al., 1991), têm um aumento da
imobilidade no teste de natação forçada de Porsolt e podem ser considerados como um
modelo animal de comportamento depressivo. Este teste é sensível as principais classes
de agentes antidepressivos, como os componentes tricíclicos (amitriptilina), inibidores
da MAO (monoamina oxidase), antidepressivos atípicos e inibidores seletivos da
19
recaptação de serotonina. E finalmente, como no caso de estresse pré-natal (LORDI et
al., 1997; VALLÉE et al., 1999; BOWMAN et al., 2004) a administração materna de
pCPA induz déficit da habilidade de aprendizado nos seus descendentes. Todos esses
dados indicam que experimentos com exposição materna de pCPA são apropriados
como modelos de estudos dos mecanismos responsáveis pela ação do estresse materno
no desenvolvimento cerebral e comportamental da sua ninhada. No geral, os presentes
achados corroboram com o envolvimento da 5-HT na regulação comportamental
associada à depressão, desempenho da memória e atividade locomotora no campo
aberto. Um importante papel da 5-HT nas manifestações depressivas é pontualmente
documentado por Nemeroff (1998), porém, menor é o conhecimento sobre o papel da 5-
HT no aprendizado e memória (BUHOT et al., 2003). Neumeister (2003) também
revisou o papel do triptofano na depressão. Escassos dados disponíveis indicam a
participação da 5-HT sobre o comportamento no campo aberto. Não obstante, o efeito
do tratamento com inibidores da MAO que induzem uma redução significativa da
densidade do terminal serotoninérgico e incrementa a atividade locomotora em ratos no
teste do campo aberto foi previamente reportado por Whitaker-Azmitia et al. (1994).
Esses achados demonstram que o tratamento pré-natal com pCPA, o qual leva a
depleção de serotonina cerebral, induzem alterações comportamentais. Contudo, para
concluir que as alterações comportamentais observadas em estudos prévios
(VATAEVA et al., 2007) são produzidas unicamente por depleção de 5-HT necessita-se
de mais investigações. Outra interpretação que também não se pode desprezar norteia a
evidência que a pCPA produz um não tão significativo, mas um apreciável efeito nas
catecolaminas cerebrais (VATAEVA et al., 2007). O incremento da atividade motora
tem sido por muito tempo atribuído a alterações no sistema dopaminérgico. Esta
hipótese é baseada em observações de hiperatividade em animais com lesões no sistema
dopaminérgico e a eficácia de agentes dopaminomiméticos, como a anfetamina, em
diminuir a hiperatividade em seres humanos e em modelos animais de hiperatividade
(ARNSTEN, 2006; ADVOKAT, 2007). Atualmente há uma clara indicação da
contribuição da 5-HT nesta patologia comportamental. Brus et al. (2004) acharam em
ratos que as alterações na atividade motora foram substancialmente pronunciadas
quando ambos os neurônios serotoninérgicos e dopaminérgicos foram lesados no
período sensível do desenvolvimento.
Os efeitos pré-natais de pCPA no comportamento da vida adulta podem
envolver uma variedade de fatores, como pela manipulação da transmissão de 5-HT que
pode alterar o número de neurotransmissores e sistemas endócrinos (ALVES et al.,
2002). Adicionalmente, ação de drogas (incluindo pCPA) no embrião é dependente de
graus consideráveis dos seus efeitos no organismo materno. Existem evidencias que as
conhecidas modificações nos componentes hormonais maternos exerçam um
significativo papel nas alterações do desenvolvimento cerebral embrionário no estresse
induzido (WEINSTOCK, 2002; VILTART et al., 2006). Em animais adultos, a
administração de PCPA mostrou produzir elevação nos níveis hormonais do eixo
hipotálamo-hipófise-adrenal (CHUNG et al., 1999). Isto mostra que o tratamento de
ratas gestantes com pCPA pode ser acompanhado por um incremento de seus níveis de
corticosterona plasmática, contudo, existe a necessidade de trabalhos realizados na área
antes da compreensão completa de como esses mecanismos regulatórios são alterados
após o tratamento materno com pCPA e como a 5-HT regula o desenvolvimento
cerebral sob condições normais e sob estresse.
No período neonatal, a depleção sistêmica da inervação cortical serotoninérgica
atrasa a modulação talamocortical (BLUE et al., 1991) e diminui o tamanho da área do
20
barro (BENNETT-CLARKE et al., 1994). Fato interessante é que o incremento da
neurotransmissão serotoninérgica durante o período crítico também altera o
desenvolvimento do campo barrado (VITALLIS et al., 1998; SALICHON et al., 2001).
A importância da serotonina na maturação talamocortical é norteada pela expressão
transitória da alta afinidade nos sítios de recaptação de serotonina, e receptores aferentes
talamocorticais 5-HT1B na área do campo barrado durante as primeiras semanas pós-
natais (BENNETT-CLARKE et al., 1991; BENNETT-CLARKE et al., 1993;
HANSSON et al., 1998). A depleção neonatal de serotonina pela administração de pCA
ou 5,7-DHT conduz a poucas espinhas e uma tendência da diminuição da árvore
dendrítica nos neurônios do gyrus dentato (YAN et al., 1997). Esta depleção
serotoninérgica nos dias 10-20 pós-natais acarreta diminuição permanente da expressão
na MAP-2 no hipocampo, sugerindo alterar assim a formação dendrítica (MAZER et
al., 1997). Efeitos no desenvolvimento neuroquímico da cortical de interneurônios
(DURING & HORNUNG, 2000) e aumento da LTP no córtex pré-frontal (OHASHI et
al., 2003) também foram observados após depleção serotoninérgica neonatal. Em
conjunto, estes dados morfológicos fornecem um seguro suporte que as alterações na
morfogênese e na plasticidade possam estar envolvidas em alterações na saúde mental
com envolvimento serotoninérgico. Mazer et al. (1997) demonstraram um déficit
substancial no aprendizado espacial de ratos serotonina-depletados entre os dias 10-20
do período neonatal.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar indiretamente a influência da depleção cerebral de serotonina durante o
período neonatal sobre o desenvolvimento ontogênico de sistemas cerebrais,
correlacionando suas repercussões com a homeostase metabólica energética e
expressão comportamental de ratos adultos
3.2 Objetivos Específicos
Avaliar indiretamente o metabolismo energético dos ratos adultos através das
mensurações basais e sob jejum da glicemia correlacionando a influência da
depleção neonatal de serotonina com os mecanismos compensatórios glicêmicos
Avaliar a expressão de comportamentos motivados (ingestão de ração e fluidos) em
condições basais, sob jejum e sob estímulos específicos correlacionando a influência
da depleção neonatal de serotonina com o apetite e saciedade sob diferentes
circunstâncias
Avaliar a ingestão neonatal de leite durante o tratamento com pCPA correlacionando
a influência da depleção de serotonina com o apetite e a saciedade do neonato
Avaliar o ganho de peso corporal do período neonatal a vida adulta correlacionando
a influência da depleção cerebral de serotonina durante o período neonatal com a
programação metabólica energética dos indivíduos adultos
21
Avaliar a taxa de mortalidade durante o tratamento com pCPA
Avaliar a expressão de comportamentos afetivos correlacionando a influência do
tratamento com pCPA com o status de ansiedade do rato adulto
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Animais
Foram utilizados ratos Wistar, entre o oitavo e décimo sexto dias pós-natal
(DPN), provenientes de seis ninhadas diferentes, com 5 a 12 animais, para o tratamento
de depleção neonatal de serotonina com p-clorofenilalanina (pCPA). Os neonatos
permaneceram em gaiolas com seus progenitores até o vigésimo primeiro dia pós-natal
onde foram desmamados e alocados em caixas de acrílico brancas de acordo com a
ninhada e sexo. No período correspondente ao inicio da fase adulta (60-75 DPN) foram
realizados os estudos experimentais.
Os ratos permaneceram acomodados durante este estudo em gaiolas metabólicas
com acesso a bebedouros volumétricos contendo água destilada e ração ad libitum por
um período de sete dias para habituação, sendo manuseados diariamente. As salas de
manutenção e experimentação tinham ambiente climatizado (temperatura de 24 ± 2
º
C e
umidade 60 ± 10%) com ciclo claro-escuro 12-12h. Após os experimentos os animais
foram eutanasiados com overdose barbitúrica (Tiopental Sódico 100 mg. Kg
-1
).
Todos os procedimentos, aos quais os animais utilizados neste estudo foram
submetidos, estavam de acordo com as normas e princípios éticos preconizados pela
Comissão de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal Rural do Rio
de Janeiro, que segue o Guide for the Care and Use of Laboratory animals (NIH
Publicação Nº 85-23, revisado 1996).
4.2 Drogas
Para a indução de depleção neonatal de serotonina, foi utilizado a pCPA, 4-
cloro-DL-fenil-alanina, (Sigma-Aldrich), um inibidor competitivo da enzima triptofano
hidroxilase, etapa esta limitante na biossíntese da serotonina. O fármaco foi diluído em
solução salina fisiológica e permaneceu sob refrigeração em alíquotas contendo
10mg/ml. Para indução da depleção de sódio, foi utilizado o diurético inibidor do co-
transportador de Na
+
/K
+
/2Cl
-
presente no ramo ascendente espesso da alça de Henle,
furosemida (Lasix
®
), na sua forma original.
4.3 Desmame
No vigésimo primeiro DPN, foi realizado o desmame dos animais, que foram
alocados em caixas de acrílico individuais, de acordo com a ninhada e sexo, onde
permaneceram até o período de avaliações (60-75 DPN).
22
4.4 Tratamento
Os animais foram alocados em dois grupos experimentais, o grupo controle e o
grupo tratado. Os animais controle receberam injeções diárias de solução salina (NaCl
0,9%) por via subcutânea isovolumétricamente ao grupo tratado que receberam injeções
diárias de pCPA, na dose de 100mg. Kg
-1
diluído em solução salina fisiológica. Ambos
os grupos foram tratados do oitavo ao décimo sexto dia pós-natal (DPN).
4.5 Avaliações
Os animais durante o período de tratamento (8-16 DPN) foram avaliados
diariamente quanto à taxa de mortalidade, ganho de peso corporal e ingestão de leite.
Após o período do tratamento os animais foram avaliados semanalmente quanto ao
ganho de peso corporal.
No período em que os animais foram considerados adultos (60-75 DPN),
ocorreram às avaliações que envolveram o comportamento ingestivo e atividade afetivo-
comportamental. Os animais foram submetidos a protocolos consagrados na literatura
para avaliação da ingestão basal e sob estímulos de fluídos/alimentos e modelos
comportamentais envolvidos com a ansiedade. A fim de evitar possíveis influências
com a presença dos avaliadores, todos os testes envolvendo os modelos
comportamentais foram filmados e os videotapes analisados posteriormente. Durante
todo esse período os ratos permaneceram em gaiolas metabólicas alocadas em salas
climatizadas (temperatura de 24 ± 2
º
C e umidade 60 ± 10%) com ciclo claro-escuro 12-
12h.
4.6 Protocolos Experimentais
A fim de observar os ratos durante suas atividades normais, as avaliações
aconteceram entre 19 e 23 horas, quando as atividades viscero-sensoriais (gustatórias,
olfatórias e receptores de volume) e movimentos hedônicos parecem estar aumentados
no rato (REF).
4.7 Procedimentos Experimentais
4.7.1 Avaliações neonatais
4.7.1.1 ingestão de leite
A avaliação da ingestão neonatal de leite foi realizada segundo adaptação do
protocolo descrito por Perillan et al. (2007). O dia do nascimento dos animais foi
designado como dia zero. A ninhada, usualmente 8-12 filhotes, foi mantida intacta até o
23
dia do teste. O protocolo consistiu em quatro etapas: A) Privação: Quatro horas antes do
teste, a ninhada foi ajustada para oito filhotes, que foram separados da mãe durante as
últimas duas horas e alocados em caixas acrílicas com maravalha sob aquecimento com
auxílio de uma lâmpada de 25-W. A temperatura cutânea foi monitorada através de um
termistor e mantida a 33ºC. B) Pesagem: Os neonatos foram pesados com auxílio de
uma balança de precisão antes e depois da privação. C) Ingestão: Os neonatos foram
realocados junto as suas progenitoras durante uma hora e posteriormente repesados. D)
Cálculo da ingestão: Ao final do período do teste os ratos foram repesados
individualmente e a porcentagem de ganho de peso foi calculada tomando como base a
média percentual de ganho de peso dos animais em relação à média percentual da
ingestão basal (dia zero), considerada 100%. O ganho de peso corporal foi usado como
a mensuração da ingestão de leite, uma vez que não havia nenhuma outra fonte de
ganho de peso. De acordo com Wirth & Epstein (1976) que primeiramente designaram
este teste de ingestão, perdas por evaporação presume-se ser a mesma para todos os
neonatos, tratados ou controles, e que não há excreção espontânea em ratos lactantes.
4.7.2 Avaliações basais
4.7.2.1 experimentos envolvendo a atividade afetivo-comportamental
Foram realizados quatro modelos experimentais como descritos a seguir.
1- Campo Aberto
Este teste é um simples protocolo, cuja avaliação dos seus componentes têm sido
amplamente utilizada para mensuração de emocionalidade, exploração (MATTO &
ALLIKMETS, 1999), atividade geral ou locomotora (COURVOISIER et al., 1996),
medo (COURVOISIER et al., 1996) e ansiedade. Neste experimento os animais foram
submetidos individualmente a análise de sua capacidade locomotora/exploratória e
avaliados através de diferentes parâmetros. Este teste é considerado um excelente
modelo sensível a drogas/atividade ansiolítica (PRUT & BELZUNG, 2003). O ensaio
experimental foi realizado em uma sala escura com luz vermelha onde os ratos foram
individualmente inseridos em uma caixa de acrílico branca (80 x 80 x 30 cm) dividida
igualmente em 25 quadrantes. Durante 5 minutos eles puderam livremente explorar os
quadrantes, onde foram avaliados os seguintes parâmetros comportamentais:
ambulação, tempo de imobilidade, grooming (tempo gasto e episódios), atividade
vertical e emissão de bolo fecal. A ambulação foi avaliada quantificando o número de
quadrantes periféricos, médios e central explorados pelos animais.
24
2- Labirinto em Cruz Elevado (LCE)
O LCE tem sido amplamente utilizado em roedores como um protocolo de
avaliação do medo, ansiedade (PELLOW et al., 1985), e mais recentemente, da
avaliação de risco em camundongos (RODGERS et al., 1996) e ratos (MIKICS et al.,
2005). O teste do labirinto em cruz elevado consiste em dois braços opostos (50 x 10
cm) cruzados por dois braços opostos fechados de mesmas dimensões e com 40 cm de
altura. Os braços são conectados por uma plataforma central (10 x 10 cm) dando ao
aparato um aspecto de sinal de soma. O aparato permaneceu elevado por uma altura de
50 cm do piso em uma sala com luz vermelha. Os ratos foram inseridos individualmente
na plataforma central da cruz com a cabeça voltada para um dos braços fechados. O
tempo gasto e o número de entradas feitas pelos ratos, nos braços abertos e fechados do
aparato foram registrados durante 5 minutos. A entrada no braço é definida quando os
quatro membros do animal estão em um dos braços da cruz. Adicionalmente, stretched
attend posture (S.A.P.) e head-dipping (H.D.) nos braços abertos e na area protegida
(braços fechados e plataforma central) foram avaliados. As medidas comportamentais
registradas no LCE como citado acima foram: frequência de entradas e o tempo
despedido nos braços fechados e nos abertos. A freqüência total de entradas foi obtida
pela soma simples das freqüências de entrada nos braços abertos e nos fechados. Para
análise estatística dos dados e confecção dos gráficos a percentagem de entrada no
braço aberto foi calculada dividindo-se a freqüência de entrada pela freqüência total de
entradas, e esse índice multiplicado por 100. De maneira semelhante foi calculada a
percentagem de tempo em que os animais permanecerem nos braços em relação ao
somatório do tempo de permanência nos braços abertos e fechados, sendo o quociente
obtido multiplicado por 100. Foram também registrados no labirinto medidas de
avaliação etológica como o número de head-dipping (imersão de cabeça), rearing
(movimento vertical), que avaliam a atividade exploratória. Estas são medidas do
comportamento de avaliação de risco (Rodgers & Cole, 1993), assim como o tempo de
permanência na plataforma central (que correlaciona com uma tomada de decisão) e o
número de bolos fecais (emocionalidade). Um aumento seletivo nos parâmetros
Figura 4. Teste de campo aberto
25
correspondentes aos braços abertos (entrada e tempo) revela um efeito ansiolítico, e o
inverso é verdade. O número de entradas no braço fechado avalia a atividade motora
dos animais.
Este teste é considerado um excelente modelo de avaliação do status de
ansiedade, particularmente, envolvendo a transmissão GABAérgica (RODGERS &
DALVI, 1997). Além disso, durante este teste é possível avaliar aspectos que envolvem
emocionalidade e a tomada de decisão dos animais que está diretamente relacionado
com o status de ansiedade.
3- Interação Social
Neste experimento os animais foram submetidos individualmente a interagir
com outro animal desconhecido do mesmo sexo em uma caixa de acrílico (60 x 60 x 30
cm) com um piso sólido. A análise realizada para quantificar o tempo de interação do
modelo experimental abrangeu os episódios de grooming, cheirar, seguir, chutar, socar,
montar ou permitir a monta. Os ratos foram pareados baseados no teste e inseridos na
área de testes por 10 minutos.
4- Natação Forçada
Neste experimento os animais foram submetidos individualmente à análise do
status depressivo, através de um modelo adaptado de Porsolt et al. (1977) que abrangeu
a latência da tentativa de escape por cima e o periodo de imobilidade (IMMO) que
foram avaliados durante um período de 5 minutos. Neste teste, os ratos foram inseridos
Figura 5. Teste de labirinto em cruz elevado
26
individualmente dentro de um cilíndro de acrílico de 25 cm de diâmetro contendo água
a 25°C e uma profundidade de 30 cm, sendo incapazes de escapar ou tocar no fundo do
cilindro. Vinte e quatro horas antes, os ratos foram submetidos em ordem a 15 min de
sessões de nado forçado para reconhecimento e adaptação do teste programado. No dia
seguinte, os ratos foram submetidos ao teste válido da natação forçada.
Figura 6. Teste de natação forçada
27
4.7.2.2 experimentos envolvendo o comportamento ingestivo: ingestões basais
Foram realizados três experimentos a fim de avaliar a ingestão basal dos
animais.
1- Ingestão de alimento
A ingestão basal de alimento foi mensurada por um período de 24 horas a fim de
avaliar a influência da depleção de serotonina sobre o apetite e saciedade. Durante esta
avaliação os animais tiveram acesso ad libitum à ração moída nos comedouros e água
destilada em buretas volumétricas graduadas. Para análise dos resultados as vasilhas
contendo as rações foram pesadas imediatamente antes da introdução dos ratos nas
gaiolas metabólicas e após um período de 24 horas.
2- Ingestão de água e salina
Com o objetivo de avaliar a resposta dipsogênica e o apetite por sódio, a
preferência dos animais por água ou NaCl 0.3 M, solução normalmente aversiva a
percepção gustatória do rato, foram mensuradas por um período de 24 horas sendo
ofertadas em buretas volumétricas graduadas. Os fluidos e a ração em pellets foram
ofertados ad libitum.
3- Ingestão de água e sacarose
Durante este experimento foi mensurada a preferência dos animais por água ou
sacarose por um período de 24 horas, sendo ofertadas em buretas volumétricas
graduadas. Os fluidos e a ração em pellets foram ofertados ad libitum.
28
4.7.3 Avaliações sob estímulos
4.7.3.1 Experimentos envolvendo o comportamento ingestivo: Ingestões sob jejum
Foram realizados três experimentos a fim de avaliar a ingestão sob jejum dos
animais. Os protocolos utilizados foram baseados naqueles descritos outrora por Reis et
al. 1990; Badauê-Passos et al. 2001; De-Luca et al. 2002.
1- Privação Hídrica
Nesta condição, a ingestão de água foi mensurada após 24 horas de privação
hídrica com objetivo de avaliar a influência da depleção de serotonina sobre o fenômeno
da sede no animal em jejum. Durante este período o acesso a ração foi oferecida ad
libitum.
2- Privação Alimentar
Nesta condição, a ingestão de ração foi mensurada após 24 horas de privação
alimentar com objetivo de avaliar a influência da depleção de serotonina sobre o apetite
e a saciedade no animal em jejum. Durante este período não houve acesso a ingestão de
fluidos.
3- Ingestão de sacarose
Nesta condição, a ingestão de sacarose e água foi mensurada após 24 horas de
privação alimentar com objetivo de avaliar a influência da depleção de serotonina sobre
a preferência entre água e sacarose 2% no animal em jejum. Durante este período não
houve acesso a ingestão de fluidos.
4- Ingestão de salina
Nesta condição, a ingestão de NaCl 0.3 M e água foram mensuradas após 24
horas de privação alimentar com objetivo de avaliar a influência da depleção de
serotonina sobre a preferência entre água e NaCl 0.3 M no animal em jejum. Durante
este período não houve acesso a ingestão de fluidos.
29
Figura 7 - Gaiolas metabólicas
4.7.3.2 experimentos envolvendo o comportamento ingestivo: ingestões sob
estímulos específicos sobre a indução do apetite por sódio e da sede
Foram realizados dois experimentos a fim de avaliar a ingestão em animais
sódio-depletados e após estímulo de hipertonicidade.
1- Indução da sede
Com o objetivo de avaliar a influência da depleção de serotonina sobre a
sensação da sede, os animais receberam por via subcutânea solução salina hipertônica
(1M) a fim de induzir uma hipertonicidade plasmática. Durante este experimento os
animais tiveram acesso ad libitum à ração e água destilada. Após um período de 24
horas, a ingestão de água foi mensurada em quatro momentos distintos: 30, 60, 120 e
180 minutos. Neste protocolo os animais receberam administração tópica de Cloridrato
de Lidocaína 2% sem vasoconstrictor (0.1 – 0.2 ml s.c) seguido de NaCl 1M (1ml/100g.
p.c
-1
). A utilização prévia deste anestésico local é recomendada pela possibilidade de
irritação cutânea por parte da solução de salina hipertônica (Penny et al. 2005).
30
Posteriormente, os animais retornaram as gaiolas metabólicas com acesso aos fluidos e
alimento.
2- Depleção de sódio e privação hidrossalina
Com o objetivo de avaliar a influência da depleção de serotonina sobre o apetite
por sódio em animais hiponatrêmicos, os ratos receberam por via subcutânea
Furosemida (20 mg. Kg
-1
) a fim de induzir hiponatremia pela espoliação de sódio
peculiar a este fármaco. Este diurético foi administrado 24 horas antes da
reapresentação dos fluidos. Durante este experimento os animais tiveram acesso ad
libitum à dieta hiponatrêmica (farinha de milho) e permaneceram sob privação hídrica.
Após um período de 24 horas, o apetite por sódio foi avaliado mensurando-se a ingestão
de NaCl 0.3 M em quatro momentos distintos: 30, 60, 120 e 180 minutos.
4.7.4 Avaliações glicêmicas
4.7.4.1 experimentos envolvendo a glicemia: mensuração basal e sob jejum
A coleta das amostras de sangue foi realizada com auxílio de uma agulha
hipodérmica que foi introduzida na base da cauda dos animais. Em seguida, uma fita de
glicosímetro foi cuidadosamente posicionada sobre a gotícula de sangue proveniente da
coleta e conectada ao equipamento responsável pela leitura.
1- Mensuração basal
A mensuração da glicemia basal dos animais foi realizada com auxílio de um
glicosímetro portátil no primeiro dia de experimento.
2- Mensuração sob jejum
A mensuração da glicemia sob jejum dos animais foi realizada com auxílio de
um glicosímetro portátil onde estes permaneceram sob privação alimentar por um
período de 24 horas.
31
4.8 Análise Estatística
Os resultados obtidos foram expressos em valores de média e erro padrão da
média. Para comparação entre mais de dois grupos sob apenas um fator de variação
comum, foi realizada a análise da variância para variáveis paramétricas por ANOVA
uma via, seguida pela determinação da significância das diferenças entre os grupos, pelo
teste de Bonferroni. Mais de dois grupos submetidos à interferência simultânea de dois
fatores de variação, foram analisados por ANOVA duas vias, seguida do teste de
Bonferroni. Para comparação entre dois grupos com um único fator de variação,
utilizou-se o teste t de student. O nível crítico fixado foi de 5% (P˂0,05) para se admitir
uma diferença de médias como estatisticamente significativa.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Avaliações do Peso Corporal e da Ingestão de Leite
5.1.1 Avaliação da ingestão de leite durante o tratamento com pCPA (8-16 DPN)
Durante o tratamento com pCPA houve uma diminuição significativa da média
percentual da ingestão de leite nos dias quatro e seis da avaliação, em relação à média
percentual da ingestão basal dos animais (29,4 ± 12,3 versus 213,7 ± 14,4 % P ˂ 0, 001
e 25,0 ± 10,7 versus 115,8 ± 22,0 %; P ˂ 0,001) (Fig. 8).
Estes resultados indicam que possa ocorrer uma influência da depleção neonatal
de serotonina sobre o desenvolvimento ontogênico de sistemas cerebrais (AZMITIA,
1999) que participam do controle metabólico e energético dos indivíduos. Ademais, o
próprio sistema serotonérgico, envolvido diretamente com o comportamento ingestivo
(MEDEIROS et al., 2005), parece estar supra-regulado. Com esta hipótese, haveria um
aumento da expressão da leptina com subseqüente diminuição da ingestão alimentar nos
neonatos tratados com pCPA. Além disso, este hormônio suscita um estimulo do
hipotálamo basomedial, que é diretamente envolvido com a regulação da oxidação de
gordura, balanço energético e com o peso corporal (GRILL & KAPLAN, 2002;
BLUNDELL et al., 2001; McMINN et al., 2000). Este efeito anorexigênico da leptina
mediado por atividade serotoninérgica deve-se a estimulação de receptores 5-HT2C
(YAMADA et al., 2003). Estas recentes evidências justificam a participação da
circuitaria do NDR em mecanismos envolvidos com o controle do apetite e da
saciedade. No entanto, não se pode descartar o envolvimento de outros sistemas
cerebrais co-participadores para explicar estes resultados.
32
Figura 8. Percentual da ingestão de leite em ratos neonatos durante o período correspondente ao
tratamento com pCPA (8-16 DPN) em relação à linha de base, que corresponde à ingestão basal de leite
do grupo controle e tratado. ( ) início do tratamento; (***) P ˂ 0,001, comparado ao grupo controle
(ANOVA duas vias).
33
5.1.2 Avaliação do peso corporal durante o tratamento com pCPA (8-16 DPN)
O tratamento neonatal com pCPA não interferiu significativamente no peso
corporal do 1º ao 5º dia do protocolo. Entretanto, foi considerado significativamente
menor nos dias seis (22,0 ± 0.5 versus 24,4 ± 0,6 g; P ˂ 0,05), sete (23,4 ± 0,5 versus
26,6 ± 0,6 g; P ˂ 0,001), oito (24,7 ± 0,6 versus 28,1 ± 0,6 g; P ˂ 0,001) e nove (25,3 ±
0,5 versus 30,1 ± 0,7 g; P ˂ 0,001) do tratamento em relação ao grupo controle (Fig. 9).
Estes resultados se correlacionam com a menor ingestão de leite observada nos
animais tratados com pCPA, discutido anteriormente, indicando a influência da
depleção neonatal de serotonina sobre o desenvolvimento ontogênico de sistemas
cerebrais (AZMITIA, 1999) que participam do controle metabólico e energético dos
indivíduos.
Figura 9. Peso corporal de ratos neonatos do grupo controle e tratado durante o período correspondente ao
tratamento com pCPA (8-16 DPN). ( ) início do tratamento (*)P ˂ 0,05 e (***)P ˂ 0,001, comparado ao
grupo controle (ANOVA duas vias).
34
5.1.3 Avaliação do ganho de peso corporal durante o tratamento com pCPA (8-16
DPN)
Durante o tratamento com pCPA o ganho de peso corporal foi significativamente
menor em relação ao grupo controle (9,2 ± 0,7 versus 15,7 ± 0,5 g; P ˂ 0,001) (Fig. 10).
Estes resultados se correlacionam com a menor ingestão de leite observada nos
animais tratados com pCPA, discutido anteriormente, indicando a influência da
depleção neonatal de serotonina sobre o desenvolvimento ontogênico de sistemas
cerebrais (AZMITIA, 1999) que participam do controle metabólico e energético dos
indivíduos.
Figura 10. Ganho de peso corporal de ratos neonatos do grupo controle e tratado durante o período
correspondente ao tratamento com pCPA (8-16 DPN). (***) P ˂ 0,001, comparado ao grupo controle
(Teste t não pareado).
0
3
6
9
12
15
18
Controle (n=55)
pCPA (n=54)
***
Ganho de peso 8-16 DPN (g)
35
5.1.4 Avaliação semanal do peso corporal do desmame (21 DPN) a vida adulta (56
DPN)
O peso corporal foi significativamente maior nos machos tratados (95,3 ± 3,5
versus 80,0 ± 3,6 g; P ˂ 0,05) (Fig.11A) em relação aos machos do grupo controle no
28º dia de vida, entretanto, foi significativamente menor nos dias 42 (150,0 ± 2,3 versus
161,1 ± 5,6 g; P ˂ 0,05) e 56 (228,2 ± 4,9 versus 253,3 ± 5,1g; P ˂ 0,05) (Fig.11A). Em
relação às fêmeas, o peso corporal foi significativamente menor nos dias 21 (37,7 ± 2,7
versus 49,2 ± 3,5 g; P ˂ 0,05) e 56 (167,0 ± 6,3 versus 185,0 ± 4,0 g; P ˂ 0,05)
(Fig.11B).
Os resultados obtidos durante esta avaliação evidenciam que mesmo após o
desmame os animais tratados com pCPA permaneceram com o peso corporal menor em
relação aos animais do grupo controle até a vida adulta. Estes dados corroboram com a
hipótese que a depleção cerebral de serotonina no período neonatal acarretou alterações
na programação metabólica e energética dos indivíduos em função da sua influência no
desenvolvimento ontogênico dos sistemas cerebrais envolvidos. Segundo de Moura &
Passos (2005) a programação metabólica é um fenômeno epigenético de cunho
hormonal, genético, físico, psicológico ou qualquer outro evento estressor acarretado
durante um período crítica da vida, como a gestação e a lactação, que tenha habilidade
de modificar de maneira prolongada certas funções fisiológicas. Este processo foi
preservado pela seleção natural como uma importante ferramenta adaptativa para a
sobrevivência de organismos que vivem em áreas de difícil acesso ao alimento.
Portanto, uma má nutrição durante a gestação ou lactação é capaz de ativar diferentes
genes que fornecem um fenótipo racional ao organismo. Em resumo, é plausível
conjecturar que o decréscimo dos níveis cerebrais de 5-HT durante o desenvolvimento
neuronal possa ter acarretado uma alteração plástica na citoarquitetura do sistema
serotoninérgico cerebral (AZMITIA, 1999) que ocasionou esta suposta modificação na
programação metabólica e energética dos indivíduos.
36
Figura 11A. Avaliação semanal do ganho de peso corporal de ratos do desmame (21 DPN) à vida adulta
(56 DPN). (*) P ˂ 0,05, comparado ao grupo controle (ANOVA duas vias).
Figura 11B. Avaliação semanal do ganho de peso corporal de ratas do desmame (21 DPN) à vida adulta
(56 DPN). (*) P ˂ 0,05, comparado ao grupo controle (ANOVA duas vias).
37
5.1.5 Avaliação do peso corporal na vida adulta (56 DPN)
O peso corporal foi significativamente menor nos machos tratados (228,2 ± 4,9
versus 253,3 ± 5,1 g; P ˂ 0,001) em relação aos machos do grupo controle e nas fêmeas
tratadas (167,5 ± 6,3 versus 185,0 ± 4,0 g; P ˂ 0,001) em comparação as fêmeas do
grupo controle (Fig. 12).
Os resultados desta avaliação são similares aos obtidos no item 5.1.4 e, portanto,
foi discutido anteriormente.
Figura 12. Avaliação do peso corporal de ratos na vida adulta (56 DPN). (*) P ˂ 0,05, comparado ao
grupo controle (Teste t não pareado).
38
5.1.6 Avaliação da taxa de mortalidade durante o tratamento com pCPA (8-16
DPN)
Durante o tratamento com pCPA não houve incidência de óbitos em nenhum dos
grupos experimentais.
Este resultado demonstra que a depleção precoce de serotonina cerebral, com
pCPA (KOE & WEISMANN, 1966), não acarreta danos letais nos indivíduo mesmo
durante este período crítico de maturação de diversos sistemas cerebrais.
5.2 Avaliações basais
5.2.1 Avaliação da influência do tratamento neonatal com pCPA em ratos na vida
adulta no teste do campo aberto
Ocorreu um aumento significativo do número de quadrantes periféricos
explorados pelas fêmeas do grupo tratado em relação às fêmeas do grupo controle
(137,7 ± 8,5 versus 101.8 ± 3.8; P ˂ 0.01) e em relação aos machos tratados (137,7 ±
8,5 versus 96,0 ± 4,8; P ˂ 0,01) (Fig. 13). Houve também um aumento significativo no
número de quadrantes médios explorados pelas fêmeas tratadas em relação aos machos
tratados (22,5 ± 2,1 versus 13,5 ± 1,6; P ˂ 0,01) (Fig. 13). Em contrapartida, a análise
do número de vezes que o quadrante central foi explorado não foi estatisticamente
significativa entre os grupos (Fig. 13). Em relação ao número de grooming houve uma
diferença significativa entre os machos tratados em comparação aos machos do grupo
controle (6,0 ± 0,5 versus 2,4 ± 0,3; P ˂ 0,001) e em relação às fêmeas tratadas (6,0 ±
0,5 versus 1,0 ± 0,4; P ˂ 0,001) (Fig 14). No entanto, avaliando o tempo gasto nos
episódios de grooming houve apenas uma diferença significativa dos machos tratados
em relação às fêmeas tratadas (12,8 ± 4,2 versus 1,5 ± 0,9; P ˂ 0,05) (Tab. 1). O tempo
de imobilidade foi significativamente menor nos machos tratados em comparação aos
machos do grupo controle (45,7 ± 2,9 versus 66,7 ± 8,4; P ˂ 0,05), havendo ainda uma
diferença significativa entre estes em relação às fêmeas do grupo controle (66,7 ± 8,4
versus 37,7 ± 1,6; P ˂ 0,01) (Tab. 1). Não houve diferença significativa no número de
movimentos verticais realizados pelos dois grupos experimentais (Tab. 1).
Os resultados acima nos permitem especular a existência de um aumento da
atividade motora das fêmeas do grupo tratado com pCPA em função da maior atividade
exploratória dos quadrantes periféricos (WALSH & CUMMINS, 1976). Estes dados
corroboram com a discussão de Adlard & Smart (1974) que demonstraram aumento da
atividade locomotora em ratos adultos tratados no período neonatal com pCPA.
Ademais, não se pode descartar a hipótese da influência das diferentes fases do ciclo
estral sobre esta atividade motora (LIGHTFOOT, 2008; MORGAN & PFAFF, 2002),
tendo em vista que as ratas deste estudo eram inteiras e sem controle estral.
Em relação aos machos, não foi observado nenhuma alteração significativa de
cunho motor. Entretanto, o maior número de episódios de grooming realizados pelos
animais tratados com pCPA postula a hipótese que houve uma atividade ansiogênica,
pois, este parâmetro etológico parece ser um indicador da percepção de estresse e
reatividade (SPRUIJT et al., 1992).
39
Figura 13. Número de quadrantes periféricos, médios e quadrante central explorados pelos ratos dos
grupos tratamento e controle, na vida adulta (60-75 DPN), durante a realização do teste do campo aberto
(**) P ˂0,01, comparado ao grupo controle e (++) P ˂ 0,01, comparado ao grupo de machos tratados com
pCPA (ANOVA uma via).
Figura 14. Episódios de grooming realizados pelos ratos dos grupos tratamento e controle, na vida adulta
(60-75 DPN), durante a realização do teste do campo aberto (***) P ˂ 0,001, comparado ao grupo
controle e (+++) P ˂ 0,001, comparado ao grupo tratamento (ANOVA uma via).
40
Tabela 1 Avaliação do teste de campo aberto
Variáveis Controle ♂ Controle ♀ pCPA ♂ pCPA ♀
Quadrantes percorridos (n)
Periféricos 89,2± 6,8 101,8 ± 3,8 96,0 ± 4,8 137,7 ± 8,5**
Médios 9,8 ± 1,5 15,9 ± 1,3 13,5 ± 1,6 22,5 ± 2,1++
Central 1,6±0,5 2,9±0,3 1,9±0,3 3,1±0,4
Grooming
Episódios 2,4±0,3 2,2±0,5 6,0±0,5*** 1,0±0,4
Tempo gasto (s) 2,6±0,8 1,5±0,3 12,8±4,2+ 1,5±0,9
Movimento vertical 24,8±2,5 25,0±1,9 25,2±1,5 26,8±2,3
Tempo de imobilidade (s) 66,7±8,4++ 37,7±1,6 45,7±2,9* 36,9±6,9
Influência do tratamento neonatal com pCPA no teste de campo aberto. Dados são representados
como média ± SEM. (***)P˂0,001 e (*)P˂0,05, comparando ao grupo controle; (+++)P˂0,001 e
(+)P(*)P˂0,05, comparando entre o grupo controle (ANOVA uma via).
++
+++
41
5.2.2 Avaliação da influência do tratamento neonatal com pCPA em ratos adultos
no teste do labirinto em cruz elevado (LCE)
Ocorreu um aumento significativo do número de entradas das fêmeas tratadas no
braço aberto em relação as do grupo controle (7,8 ± 0,3 versus 4,9 ± 0.4; P ˂ 0,001) e
em comparação aos machos tratados (7,8 ± 0,3 versus 4,6 ± 0,4; P ˂ 0,001) (Fig. 15A).
Além disso, houve um aumento significativo do número de entradas no braço fechado
das fêmeas tratadas em relação as do grupo controle (10,2 ± 0,6 versus 6,2 ± 0,4; P ˂
0,001) e em comparação aos machos tratados (7,8 ± 0,3versus 5,0 ± 0,3; P ˂ 0,001)
(Fig. 15A). Ademais, o tempo gasto pelos machos tratados no braço aberto foi
significativamente maior em comparação aos do grupo controle (148,8 ± 8,8 versus 99,7
± 21,4 s; P ˂ 0,05) e significativamente maior nas fêmeas tratadas em relação as do
grupo controle (140,7 ± 3,1 versus 78,0 ± 7,9 s; P ˂ 0,01) (Tab. 2). O tempo gasto pelas
fêmeas do grupo tratado no braço fechado foi significativamente menor do que as
fêmeas do grupo controle (102,9 ± 3,6 versus 162,2 ± 9,6 s; P ˂ 0,01) (Tab. 2). A
porcentagem do número de entradas no braço aberto não foi estatisticamente
significativa em nenhum dos grupos experimentais, em contrapartida, esta porcentagem
relacionada ao tempo gasto pelas fêmeas do grupo tratado no braço aberto foi
significativamente maior em relação às fêmeas do grupo controle (58,2 ± 0,8 versus
32,9 ± 3,3%; P ˂ 0,001) e em relação aos machos tratados e controles (53,6 ± 2.8 versus
36,2 ± 5,2; P ˂ 0,05 (Tab. 2 e Fig 15B). O número de H.D. realizado pelos machos
tratados no braço aberto foi significativamente maior em comparação aos machos do
grupo controle (12,9 ± 1,3 versus 5.0 ± 1,4; P ˂ 0,001), que foi significativamente
menor em relação às fêmeas do grupo controle (5,0 ± 1,4 versus 12,9 ± 1,3; P ˂ 0,001)
(Fig. 16). Em relação ao número de H.D. na área protegida, as fêmeas do grupo tratado
realizaram um menor número de episódios, estatisticamente significativo, em relação às
fêmeas do grupo controle (4,7 ± 0,7 versus 8,3 ± 0,6; P ˂ 0,01) (Fig. 15). O número de
S.A.P. foi significativamente menor nos machos do grupo tratado em relação aos
machos do grupo controle (2,5 ± 0,5 versus 8,0 ± 1,4; P ˂ 0,001) e significativamente
menor nas fêmeas tratadas em comparação às fêmeas do grupo controle (2,2 ± 0,2
versus 9,4 ± 0,6; P ˂ 0,001) (Fig. 17). O número de movimentos verticais realizado
pelos machos tratados foi significativamente menor em relação aos do grupo controle
(9,8 ± 1,1versus 17,1 ± 2,0; P ˂ 0,01) (Tab. 2). O número de grooming foi
significativamente menor nos machos do grupo tratado em relação aos do grupo
controle (2,1 ± 0,2 versus 4,4 ± 0,6; P ˂ 0,01) (Tab. 2). Em relação aos bolos fecais
emitidos não houve diferença estatisticamente significativa (Tab. 2).
A partir dos resultados obtidos nos machos tratados com pCPA ficou evidente a
presença de uma atividade ansiolítica refletida no maior tempo gasto no braço aberto do
aparato, além de diferenças significativas nos parâmetros etológicos: maior número de
head-dipping no braço aberto e menor número de grooming e S.A.P. Ademais, o tempo
de permanência dos machos nos braços fechados não foi significativo em relação aos do
grupo controle. Em relação às fêmeas tratadas com pCPA, os resultados nos permitem
especular a existência de uma atividade ansiolítica refletida em um maior número de
entradas e maior tempo de permanência no braço aberto, além da redução de parâmetros
etológicos como o head-dipping na área protegida e S.A.P (CRUZ et al., 1994;
RODGERS E JOHNSON, 1995; RAMOS et al., 1997). Esta observação corrobora com
os dados obtidos por Wilson et al. (1992) que observaram uma atividade ansiolítica em
fêmeas intactas e androgenizadas tratadas com pCPA no mesmo período neonatal. Estes
42
dados reforçam a hipótese de que realmente ocorreu uma atividade ansiolítica nas
fêmeas, porém, associado ao incremento da atividade motora. Esta atividade ansiolítica
observada nos animais tratados com pCPA corrobora com os resultados obtidos por
Farabollini et al. (1988) que realizaram o tratamento de depleção de serotonina no
mesmo período neonatal.
Entretanto, em função do aumento da atividade motora, refletida pelo maior
número de entradas e menor tempo de permanência no braço fechado pode-se
conjecturar que esta suposta atividade ansiolítica esteja sendo influenciada pelo
incremento da atividade motora. Neste caso, é provável que esta redução dos parâmetros
etológicos e maior tempo despendido no braço aberto do aparato não sejam reflexos de
uma atividade ansiolítica, mas sim da exacerbação da atividade motora. Ademais, como
já foi observado um aumento da atividade motora no teste do campo aberto, mesmo
sendo sobre influência estral, torna-se plausível acreditar que a atividade ansiolítica
observada no LCE possa ter sofrido influência pelo incremento da atividade motora.
Além disso, estes resultados ansiolíticos observados principalmente no LCE são
similares aos descritos outrora (FARABOLLINI et al., 1988; VATAEVA et al., 2007)
que correlacionaram níveis diminuídos de 5-HT cerebral durante os períodos pré-natal
e neonatal levam a comportamentos ansiolíticos na vida adulta. Portanto, é plausível
conjecturar que o decréscimo dos níveis cerebrais de 5-HT durante o desenvolvimento
neuronal possa ter acarretado uma alteração plástica na citoarquitetura do sistema
serotoninérgico cerebral (AZMITIA, 1999).
43
Tabela 2 Avaliação do teste de labirinto em cruz elevado (LCE)
Variáveis Controle ♂ Controle ♀ pCPA ♂ pCPA ♀
Número de entradas
B.A. 3,2± 0,4 4,9 ± 0,4 4,6 ± 0,4 7,8 ± 0,3***
B.F. 4,7 ± 0,4 6,2 ± 0,4 5,0 ± 0,3 10.2 ± 0,6***
Tempo gasto (s)
B.A. 99,7±21,4 78,0±7,9 148,8±8,8* 140,7±3,1**
B.F. 165,9±19,9 162,2±9,6 141,9±9,0 102,9±3,6**
B.A./B.F.+B.A. (%)
Número de entradas 40,3±3,9 42,4±2,1 46,8±1,6 43,9±1,6
Tempo gasto (s) 36,2±9,2 32,9±3,3 53,6±2,8* 58,2±0,8***
H.D. no B.A (n) 5,0±1,4+++ 13,0±0,7 12,9±1,3*** 15,3±0,9
H.D. área protegida (n) 7,2±0,9 8,3±0,6 5,0±0,5 4,7±0,7**
S.A.P. (n) 8,0±1,4 9,4±0,6 2,5±0,5*** 2,2±0,2***
Movimentos verticais (n) 17,1±2,0 16,0±1,1 9,8±1,1** 13,0±0,7
Grooming (n) 4,4±0,6 2,8±0,5 2,1±0,2** 2,5±0,4
Bolos fecais (n) 3,1±0,5 3,3±0,2 1,5±0,4 2,0±0,4
Influência do tratamento neonatal com pCPA no teste de labirinto em cruz elevado (LCE). Dados são
representados como média ± SEM. B.A. = braço aberto; B.F. = braço fechado; H.D. = Head-dipping;
S.A.P. = stretched attend posture. (***)P˂0,001, (**)P˂0,01 e (*)P˂0,05, comparando ao grupo controle;
(+++)P˂0,001, comparando entre o grupo controle (ANOVA uma via).
+++
+++
44
Figura 15A. Número de entradas nos braços aberto e fechado realizadas pelos ratos dos grupos tratamento
e controle, na vida adulta (60-75 DPN), durante a realização do teste do labirinto em cruz elevado (LCE).
(***)P˂0,001, comparado ao grupo controle e (+++)P˂0,001, comparado ao grupo tratamento (ANOVA
uma via).
Figura 15B. Tempo gasto no braço aberto expresso em porcentagem realizado pelos ratos dos grupos
tratamento e controle, na vida adulta (60-75 DPN), durante a realização do teste do labirinto em cruz
elevado (LCE). B.A = braço aberto e B.F = braço fechado; (***)P˂0,001, (*)P˂0,05 comparado ao grupo
controle (ANOVA uma via).
45
Figura 16. Número de head-dipping nos braços aberto e fechado, realizados pelos ratos dos grupos
tratamento e controle, na vida adulta (60-75 DPN), durante a realização do teste do labirinto em cruz
elevado (LCE). (***)P˂0,001 e (**)P˂0,01 comparado ao grupo controle (ANOVA uma via).
Figura 17. Número de S.A.P. realizados pelos ratos dos grupos tratamento e controle, na vida adulta (60-
75 DPN), durante a realização do teste do labirinto em cruz elevado (LCE). S.A.P. = stretched attend
posture; (***)P˂0,001 comparado ao grupo controle (ANOVA uma via).
46
5.2.3 Avaliação da influência do tratamento neonatal com pCPA em ratos adultos
no teste de interação social
Nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos no tempo gasto
de interação social (Tab. 3).
Estes resultados postulam a hipótese que não houve influência do tratamento
neonatal com pCPA sobre o modelo de interação social nos animais adultos. Para
explicar estes diferentes resultados de cunho ansiolítico, devem-se levar em
consideração os diversos tipos de ansiedade avaliados pelos diferentes testes
comportamentais. O teste de interação social tem sido proposto como um modelo que
avalia de uma forma geral as desordens de ansiedade, enquanto que primariamente a
avaliação no LCE reflete alguns aspectos relacionados a desordens de pânico (CHEETA
et al., 2000). Também têm sido descrito que a resposta as diferentes classes
farmacológicas nestes modelos possam variar. Entretanto, estes modelos são altamente
sensíveis para avaliar os efeitos ansiolíticos de drogas a transmissão GABAérgica (FILE
& SETH, 2003; RODGERS et al., 1997). Ademais, o papel exercido por outros
neurotransmissores, como a serotonina, não foram completamente elucidados.
Além disso, neste modelo de interação social, foi observado clinicamente um
efeito ansiogênico com o tratamento agudo com antidepressivos, porém, um efeito
ansiolítico foi obtido com a administração de agonistas de receptores 5-HT1A e de
antidepressivos como a paroxetina (FILE & SETH, 2003). Estes resultados fornecem
um suporte farmacológico para a hipótese de que diferentes vias neurobiológicas
possam estar envolvidas em cada modelo comportamental e podem explicar as
diferenças de respostas acarretadas pela depleção cerebral no período neonatal de
serotonina com pCPA nos diferentes testes realizados.
Tabela 3 Avaliação do teste interação social
Controle ♂ Controle ♀ pCPA ♂ pCPA ♀
Tempo de interação (s) 111,7±16,6 105,3±9,5 112,6±8,1 125,1±13,8
Influência do tratamento neonatal com pCPA no teste de interação social. Dados são representados
como média ± SEM. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos (ANOVA uma
via).
47
5.2.4 Avaliação da influência do tratamento neonatal com pCPA em ratos adultos
no teste de natação forçada
Houve um menor tempo de imobilidade dos machos tratados com pCPA em
relação aos machos do grupo controle (109,0 ± 7.8 versus 158,1 ± 18,2 S; P ˂ 0,01) e
em relação às fêmeas tratadas com pCPA em comparação às fêmeas do grupo controle
(85,3 ± 13,1 versus 168,0 ± 3,4; P ˂ 0,001) (Fig. 14). Entretanto, não houve diferença
estatisticamente significativa no tempo de latência dos animais em ambos os grupos
experimentais.
Apesar de se tratar de um modelo que primariamente avalia a susceptibilidade
do desenvolvimento de depressão em roedores (PETIT-DEMOULIERE et al., 2005),
faz-se necessário conjecturar que devido à inter-relação de diversos sistemas envolvidos
com a ansiedade (e.x. sistema serotoninérgico) estes resultados postulam a hipótese da
existência de uma atividade ansiolítica nos animais tratados com pCPA refletida no
menor tempo de imobilidade dos animais durante a realização do teste da natação
forçada (BORSINI, 1995). Estes dados reforçam a já referida hipótese, uma vez que
esses resultados são normalmente imputados ao estado do sistema serotoninérgico
cerebral e são desafiados por ensaios afetivos, tal como anteriormente proposto
(BROEKKAMP et al., 1989).
Tabela 4 Avaliação do teste da natação forçada
Controle ♂ Controle ♀ pCPA ♂ pCPA ♀
Tempo de imobilidade (s) 158,1±18,2 168,0±3,4 109,0±7,8** 85,3±13,1***
Latência (s) 34,2±8,7 25,0±3,5 44,8±7,0 33,4±4,7
Influência do tratamento neonatal com pCPA no teste da natação forçada. Dados são representados
como média ± SEM. (***)P˂0,001; (**)P ˂0,01 comparado ao grupo controle (ANOVA uma via).
48
Experimentos envolvendo o comportamento ingestivo: Ingestões basais
5.2.5 Avaliação da ingestão basal de alimento durante a vida adulta (60-75 DPN)
O tratamento com pCPA não influenciou de forma significativa a ingestão de
ração (6,1 ± 0,3 versus 6,7 ± 0,6 g/100g) e água (7,9 ± 0,5 versus 7,9 ± 0,6 ml/100g) em
ratos machos adultos e ração (7,6 ± 0,6 versus 7,2 ± 0,2 g/100g) e água (9,1 ± 0,9 versus
9,1 ± 0,5 ml/100g) em ratas adultas (Tab.5).
Estes resultados postulam a hipótese que a depleção cerebral de serotonina no
período neonatal, apesar da suposta supra-regulação do sistema serotoninérgico e
alteração na programação metabólica energética do indivíduo adulto, não altera de
forma significativa a ingestão basal de alimentos (ração e água).
Tabela 5 Ingestão basal de alimento
Variável Controle ♂ Controle ♀ pCPA ♂ pCPA ♀
Ração 6,7± 0,6 7,2 ± 0,2 6,1 ± 0,3 7,6 ± 0,6
Água 7,9 ± 0,6 9,1 ± 0,5 7,9 ± 0,5 9,1 ± 0,9
Influência do tratamento neonatal com pCPA sobre a ingestão basal de alimento em ratos adultos.
Dados são representados como média ± SEM. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os
grupos (ANOVA uma via).
49
5.2.6 Avaliação da ingestão basal de NaCl 0.3 M durante a vida adulta (60-75 DPN)
Houve uma maior ingestão basal de NaCl 0.3 M em fêmeas do grupo tratado em
relação às fêmeas do grupo controle (6,9 ± 1,1 versus 3,4 ± 0,7 ml/100g P ˂ 0,05) e em
comparação aos machos do grupo tratado (7,9 ± 0,5 versus 7,9 ± 0,6 ml/100g P ˂ 0,01).
Analisando a preferência pela solução de NaCl 0,3 M, houve uma maior procura por
parte das fêmeas tratadas em relação aos machos tratados (41,7 ± 4,7 versus 22,9 ± 3,6
%). (Tab. 6).
Estes resultados corroboram com os dados obtidos por Chow et al. (1992) e
Curtis et al. (2004) que propuseram a existência de um dimorfismo sexual na ingestão
de sódio, norteado por uma caraterística sexual secundária modulada pela testosterona.
Este primeiro grupo de pesquisadores observou que ratos orquiectomizados no período
neonatal ingerem solução salina de maneira semelhante às fêmeas durante a vida adulta.
Ademais, não foi observado alteração na ingestão de sódio nos animais adultos
orquiectomizados ou ovariectomizados. Entretanto, quando estes animais, adultos e
castrados, receberam testosterona, a ingestão basal de NaCl foi suprimida em ambos os
sexos enquanto que a ingestão induzida de NaCl foi reduzida somente em fêmeas. Estes
dados indicam que a ingestão de sódio em ratos é um comportamento sexualmente
dimórfico que é organizado no período neonatal e pode ser ativamente suprimida no
rato adulto pela testosterona. Por outro lado, Kensicki et al. (2002) demonstraram que o
incremento nos níveis plasmáticos de estradiol acarreta um aumento significativo da
ingestão de sódio em ratas normotensas e hipertensas.
Em suma, a partir dos dados obtidos neste protocolo, é possível especular que a
depleção cerebral de serotonina no período neonatal possa ter influenciado o apetite por
sódio em ratas adultas. Entretanto, deve-se ressaltar que este estudo foi realizado com
animais intactos, machos e fêmeas, e sem controle de ciclo estral. Portanto, deve-se
especular a presença de animais em diferentes fases de ciclo estral que possam estar
influenciando diretamente na avaliação dos resultados.
50
Tabela 6 Ingestão basal de NaCl 0,3 M
Tempo Controle ♂ Controle ♀ pCPA ♂ pCPA ♀
NaCl (ml/100g) 2,3± 0,6 3,4 ± 0,7 2,2 ± 0,7 6,9 ± 1,1* ++
Água (ml/100g) 6,5 ± 0,9 10,6 ± 1,1 8,2 ± 0,5 9,4 ± 1,2
Preferência (%) 25,6±6,4 22,9±3,6 18,3±4,6 41,7±4,7 +
Influência do tratamento neonatal com pCPA sobre a ingestão basal de NaCl 0.3 M em ratos adultos.
Dados representados como média ± SEM. (*)P˂0,05, comparando ao grupo controle; (+)P˂0,05 e
(++)P˂0,01, comparando entre o grupo tratado. (ANOVA uma via).
51
5.2.7 Avaliação da ingestão basal de sacarose 2% durante a vida adulta (60-75
DPN)
Houve uma maior procura pela solução de sacarose 2% em fêmeas do grupo
tratado em ralação aos machos do grupo tratado (30,7 ± 2,6 versus 11,8 ± 2,3 ml/100g P
˂ 0,001) e das fêmeas do grupo controle em relação aos machos controle (32,8 ± 3,0
versus 12,1 ± 3,8 ml/100g P ˂ 0,01) (Tab. 7).
Estes resultados contradizem os obtidos por Curtis et al. (2004) que observaram
uma menor ingestão de sacarose nas fêmeas intactas e ovariectomizadas em relação aos
machos, porém, corroboram com os dados obtidos por Konkle et al. (2003) que
relataram uma maior ingestão e preferência pela solução de sacarose em fêmeas
intactas, sob controle de ciclo estral e estresse induzido. Ademais, a diferença sexual na
percepção gustatória sugere um papel dos hormônios reprodutivos, em especial o
estradiol (CLARKE & OSSENKOPP, 1998). Estes autores demonstraram ainda uma
diferença significativa na resposta ingestiva de ratas no diestro e proestro em relação
aos machos, e menor resposta aversiva em comparação aos machos e fêmeas durante o
estro e metaestro.
Em resumo, a partir dos dados obtidos neste protocolo, é possível especular que
a depleção cerebral de serotonina no período neonatal não tenha influenciado a procura
por sacarose em fêmeas adultas. Entretanto, deve-se ressaltar novamente que este estudo
foi realizado com animais intactos, machos e fêmeas, e sem controle de ciclo estral.
Portanto, deve-se especular a presença de animais em diferentes fases de ciclo estral que
possam estar influenciando diretamente na avaliação dos resultados.
52
Tabela 7 Ingestão basal de sacarose 2%
Tempo Controle ♂ Controle ♀ pCPA ♂ pCPA ♀
Sacarose (ml/100g) 12,1± 3,8 32,8 ± 3,0 11,8 ± 2,2 30,7 ± 2,6+++
Água (ml/100g) 3,7 ± 1,2 3,6 ± 1,5 5,0 ± 0,9 4,9 ± 1,1
Preferência (%) 59,3±14,6 90,2±4,1 66,0±8,1 85,8±2,9
Influência do tratamento neonatal com pCPA sobre a ingestão basal de sacarose 2% em ratos adultos.
Dados são representados como média ± SEM. (+++)P˂0,001, comparando entre o grupo tratado.
(ANOVA uma via).
+++
53
5.3 Avaliações Sob Estímulos
Experimentos envolvendo o comportamento ingestivo: Ingestões sob jejum
5.3.1 Avaliação da Ingestão de água sob privação hídrica durante a vida adulta
(60-75 DPN)
Na ingestão cumulativa de água, sob privação hídrica, não houve diferença
significativa entre os grupos experimentais em nenhum dos momentos avaliados (30, 60
e 120 minutos) (Fig. 18).
Estes resultados postulam a hipótese que a depleção cerebral de serotonina no
período neonatal, apesar da suposta supra-regulação do sistema serotoninérgico e
alteração na programação metabólica energética do indivíduo adulto, não altera de
forma significativa a ingestão de água sob privação hídrica. Ademais, esta hipótese
reforça a existência de uma regulação multifatorial na ingestão de fluidos como descrito
outrora (McKINLEY & JOHNSON, 2004).
Figura 18. Ingestão cumulativa de água nos grupos tratamento e controle, na vida adulta (60-75 DPN),
durante a realização do protocolo de privação hídrica. Não foi observada diferença estatisticamente
significativa entre os grupos (ANOVA duas vias).
54
5.3.2 Avaliação da Ingestão de ração sob privação alimentar (ração e água)
durante a vida adulta (60-75 DPN)
Houve um aumento significativo na ingestão cumulativa de ração nas fêmeas
tratadas quando avaliadas aos 60 (3,3 ± 0,2 versus 2,3 ± 0,2 g/100g P ˂ 0,05) e 120
minutos (4,3 ± 0,3 versus 3,0 ± 0,3 g/100g P ˂ 0,01) em comparação as fêmeas do
grupo controle, e aos 120 minutos em relação aos machos tratados (4,3 ± 0,3 versus 2.2
± 0.2 g/100g P ˂ 0,05) (Fig. 19). Em contrapartida, houve uma diminuição significativa
na ingestão cumulativa de ração nos machos tratados aos 120 minutos (2,2 ± 0,2 versus
3,1 ± 0,1 g/100g P ˂ 0,05) (Fig. 19).
Estes resultados analisados nos machos tratados com pCPA nos permitem
especular que a depleção cerebral no período neonatal alterou o desenvolvimento
ontogênico de sistemas cerebrais responsáveis pela homeostase metabólica energética.
Recentemente, Medeiros et al. (2005) demonstraram que ratos machos, sob jejum
alimentar, tratados com pCPA durante a vida adulta expressaram uma maior resposta
ingestiva em relação aos machos do grupo controle, presumivelmente em função desta
depleção de serotonina ter exacerbado a ativação de vias orexigênicas. A partir destes
dados é possível concluir que de fato houve uma influência direta na depleção cerebral
de serotonina no período neonatal sobre este comportamento ingestivo nos ratos machos
durante a vida adulta. Em relação às fêmeas, os resultados obtidos contradizem com
Gayle et al. (2006) que observaram uma maior ingestão de ração em fêmeas sob
restrição alimentar de 12 horas em comparação aos machos sob mesmas condições. Em
adição a esta maior ingestão alimentar em fêmeas, o jejum induziu um significativo
incremento dos níveis plasmáticos orexigênicos de grelina associado a um decréscimo
significativo dos níveis anorexigênicos de leptina. Entretanto, deve-se ressaltar que as
fêmeas utilizadas em nosso estudo eram intactas e sem controle de ciclo estral. Em
resumo, podemos concluir que o efeito anorexigênico exercido pela serotonina é
modulado pelo sexo e fase do ciclo estral (ECKEL et al., 2005; ASARIAN & GEARY,
2006).
55
Figura 19. Ingestão cumulativa de ração nos grupos tratamento e controle, na vida adulta (60-75 DPN),
durante a realização do protocolo de privação alimentar. (**)P˂0,01; (*)P˂0,05 comparado ao grupo
controle e (+)P˂0,05 comparado ao grupo tratado (ANOVA duas vias).
56
5.3.3 Avaliação da Ingestão de sacarose 2% sob privação alimentar (ração e água)
durante a vida adulta (60-75 DPN)
Não foi observada nenhuma diferença significativa nas ingestões de sacarose,
água e nem na avaliação da preferência por sacarose em nenhum dos tempos
mensurados (30, 60 e 120 minutos) (Fig. 21 e 22).
Com os resultados obtidos nesta avaliação é possível especular que a depleção
cerebral de serotonina no período neonatal possa ter influenciado a procura por sacarose
em fêmeas adultas, pois, em condições basais, estas tiveram uma maior procura pela
solução. Entretanto, deve-se ressaltar que este estudo foi realizado com animais intactos,
machos e fêmeas, e sem controle de ciclo estral. Ademais, já foi descrito outrora
(ATCHLEY et al., 2005) que a percepção gustatória pela solução de sacarose é
modulada de acordo com a fase do ciclo estral. Portanto, não se pode descartar a
presença de animais em diferentes fases de ciclo estral, que possam estar influenciando
diretamente na avaliação dos resultados.
Figura 20. Ingestão cumulativa de sacarose 2% nos grupos tratamento e controle, na vida adulta (60-75
DPN), durante a realização do protocolo de privação alimentar/preferência por sacarose. (***)P˂0,001
comparado ao grupo controle (ANOVA duas vias).
57
Figura 21. Ingestão cumulativa de água nos grupos tratamento e controle, na vida adulta (60-75 DPN),
durante a realização do protocolo de privação alimentar/preferência por sacarose. Não foi observada
diferença estatisticamente significativa entre os grupos (ANOVA duas vias).
58
Figura 22. Preferência por sacarose 2% nos grupos tratamento e controle, na vida adulta (60-75 DPN),
durante a realização do protocolo de privação alimentar/preferência por sacarose. Não foi observada
diferença estatisticamente significativa entre os grupos (ANOVA duas vias).
5.3.4 Avaliação da ingestão de NaCl 0,3 M sob privação alimentar (ração e água)
durante a vida adulta (60-75 DPN)
Foi observada uma ingestão cumulativa de NaCl 0.3 M significativamente maior
aos 120 minutos em fêmeas tratadas (3,5 ± 1,0 versus 1,7 ± 0,5 ml/100g P ˂ 0,05) em
relação aos machos tratados (Fig. 23). Em relação à ingestão de água, houve uma
ingestão cumulativa significativamente menor nos machos tratados (2,8 ± 0,5 versus 5,5
± 1,0 ml/100g P ˂ 0,05) em comparação as fêmeas tratadas (Fig. 24). Ademais, não foi
observada nenhuma diferença significativa nas ingestões de NaCl 0,3 M, água e nem na
avaliação da preferência por NaCl 0.3 M em nenhum dos tempos mensurados (30, 60 e
120 minutos) (Fig. 23, 24 e 25).
Em relação à ingestão de salina avaliada neste protocolo, os resultados permitem
especular que a depleção cerebral de serotonina durante o período neonatal não
influenciou a procura pela solução de NaCl em animais sob privação alimentar.
Ademais, como já discutido no item 5.2.6, este estudo foi realizado com animais
intactos, machos e fêmeas, e sem controle de ciclo estral. Portanto, deve-se especular a
presença de animais em diferentes fases de ciclo estral que possam estar influenciando
diretamente na avaliação dos resultados.
59
Figura 23. Ingestão cumulativa de NaCl 0.3 M nos grupos tratamento e controle, na vida adulta (60-75
DPN), durante a realização do protocolo de privação alimentar/preferência por NaCl 0,3 M. (+)P˂0,05
comparado ao grupo tratamento (ANOVA duas vias).
60
Figura 24. Ingestão cumulativa de água nos grupos tratamento e controle, na vida adulta (60-75 DPN),
durante a realização do protocolo de privação alimentar/preferência por NaCl 0,3 M. Não foi observada
diferença estatisticamente significativa entre os grupos (ANOVA duas vias).
61
Figura 25. Preferência por NaCl 0.3 M nos grupos tratamento e controle, na vida adulta (60-75 DPN),
durante a realização do protocolo de privação alimentar/preferência por NaCl 0,3 M. Não foi observada
diferença estatisticamente significativa entre os grupos (ANOVA duas vias).
62
Experimentos envolvendo o comportamento ingestivo: Ingestões sob estímulos
específicos sobre a indução do apetite por sódio e da sede
5.3.5 Avaliação da Ingestão de água após estímulo hipertônico (NaCl 1,0 M)
durante a vida adulta (60-75 DPN)
Foi observada uma ingestão cumulativa de água significativamente maior nos
machos tratados com pCPA aos 120 minutos (3,6 ± 0,5 versus 2,4 ± 0,5 ml/100g P ˂
0,001) e aos 180 minutos (4,3 ± 0,8 versus 3,0 ± 0,5 ml/100g P ˂ 0,001) em comparação
aos machos do grupo controle (Tab. 8).
A partir desses resultados, é postulada a hipótese que a depleção de serotonina
cerebral no período neonatal, influenciou a sede osmótica em ratos machos evidenciado
pela maior ingestão cumulativa de água após administração de NaCl 1,0 M por via
subcutânea.
Tabela 8 Ingestão de água após estímulo hipertônico
Tempo Controle ♂ Controle ♀ pCPA ♂ pCPA ♀
30 min 1,5 ± 0,2 1,2 ± 0,3 1,8 ± 0,3 1,6 ± 0,6
60 min 2,1 ± 0,5 1,5 ± 0,4 2,7 ± 0,4 2,0 ± 0,8
120 min 2,4 ± 0,5 2,3 ± 0,5 3,6 ± 0,5*** 2,7± 0,9
180 min 3,0 ± 0,5 2,8 ± 0,6 4,3 ± 0,8*** 3,7 ± 0,8
Influência do tratamento neonatal de pCPA sobre a ingestão de água destilada em ratos adultos após
injeção de NaCl 1 M. Dados são representados como média ± SEM. (***) P˂0,001 comparado ao
grupo controle (ANOVA duas vias).
63
5.3.6 Avaliação da Ingestão de NaCl 0,3 M após depleção de sódio durante a vida
adulta (60-75 DPN)
Foi observada uma maior ingestão cumulativa de NaCl 0,3 M em fêmeas do
grupo controle aos 120 minutos (7,6 ± 0,7 versus 6,6 ± 0,5 ml/100g P ˂ 0,05) e aos 180
minutos (8,4 ± 0,6 versus 7,2 ± 0,7 ml/100g P ˂ 0,01) em relação aos machos do grupo
controle. Ademais, não foi observada diferença estatisticamente significativa, na
ingestão de NaCl 0,3 M nas demais comparações (Tab. 9).
Estes resultados postulam a hipótese que a depleção cerebral de serotonina no
período neonatal não influenciou a resposta natriorexigênica em ratos adultos após
depleção de sódio. Segundo Castro et al. (2003), o sistema serotoninérgico participa
efetivamente da regulação do apetite por sódio, (I) após a depleção de sódio, inibindo a
indução por necessidade de ingestão de sal, e (II) em condições basais, inibindo a
indução livre de ingestão de sal. Ademais, segundo Lima et al. (2004), a redução dos
níveis cerebrais de serotonina potencializa drasticamente a resposta natriorexigênica
evocada pela depleção de sódio em ratos tratados com furosemida. Portanto, apesar da
suposta supra-regulação do sistema serotoninérgico, proposta em nosso estudo, não foi
observada alterações significativas na resposta natriorexigênica em ratos adultos após
depleção de serotonina com pCPA durante o período neonatal.
64
Tabela 9 Ingestão de NaCl 0,3 M na depleção de sódio
Tempo Controle ♂ Controle ♀ pCPA ♂ pCPA ♀
30 min 4,2 ± 0,7 4,7 ± 0,7 4,2 ± 0,3 4,7 ± 0,6
60 min 5,5 ± 0,7 6,2 ± 0,6 5,7 ± 0,4 5,7 ± 0,8
120 min 6,6 ± 0,5 7,6 ± 0,7+ 6,5 ± 0,5 7,8 ± 1,2
180 min 7,2 ± 0,7 8,4 ± 0,6++ 7,3 ± 0,5 9,1 ± 1,7
Influência do tratamento neonatal de pCPA sobre a ingestão de NaCl 0.3 M em ratos adultos sódio-
depletados. Dados são representados como média ± SEM. (++) P˂0,01; (+) P˂0,05 comparado ao
grupo controle (ANOVA duas vias).
65
Experimentos envolvendo a glicemia: Mensuração basal e sob jejum
5.3.7 Avaliação da glicemia basal em ratos durante a vida adulta (60-75 DPN)
Não foi observada diferença estatisticamente significativa na glicemia nos
grupos experimentais (Fig. 26).
5.3.8 Avaliação da glicemia sob jejum em ratos durante a vida adulta (60-75 DPN)
A glicemia sob jejum foi significativamente menor nos machos tratados (75,3 ±
1,2 versus 83,8 ± 1,8 mg. dl
-1
; P ˂ 0,01) em relação aos machos do grupo controle e nas
fêmeas tratadas (69,5 ± 2,5 versus 81,5 ± 1,1 mg. dl
-1
; P ˂ 0,001) em comparação as
fêmeas do grupo controle (Fig. 26).
Através da análise destes resultados podemos especular que a depleção neonatal
de serotonina afetou o desenvolvimento ontogênico de sistemas cerebrais envolvidos
com a homeostase glicêmica. Provavelmente, os mecanismos compensatórios
glicêmicos, como a glicogenólise, possam estar afetados. Estes dados corroboram com a
hipótese que o tratamento com pCPA, durante este período crítico, acarretou alterações
na programação metabólica e energética dos indivíduos (DE MOURA & PASSOS,
2005) em função da sua influência no desenvolvimento ontogênico dos sistemas
cerebrais envolvidos
Figura 26. Avaliação da glicemia basal e sob jejum nos grupos tratamento e controle, na vida adulta (60-
75 DPN) e expressão do delta glicemia (diferença entre os valores basais e sob jejum). (***)P˂0,001 e
(**)P˂0,01 comparado ao grupo controle (ANOVA uma via).
66
6 CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos neste estudo, podemos concluir que a depleção
cerebral de serotonina durante o período neonatal afeta o desenvolvimento ontogênico de
sistemas cerebrais acarretando alterações:
1- Na homeostase metabólica energética e na expressão comportamental em ratos na vida
adulta.
2- Nos mecanismos compensatórios glicêmicos que norteiam a manutenção da glicemia
durante jejum alimentar.
3- Na expressão de comportamentos motivados (ingestão de ração e fluidos) em condições
basais, sob jejum e sob estímulos específicos (depleção de sódio e estímulo hipertônico)
indicando a alteração do set point do apetite e da saciedade do rato adulto.
4- No apetite e na saciedade do neonato, refletido pela menor ingestão de leite, sugerindo a
supra-regulação do sistema serotoninérgico com subseqüente aumento da atividade
anorexigênica da leptina.
5- No ganho de peso corporal do neonato, em virtude da menor ingestão de leite, à vida
adulta, indicando modificações na programação metabólica energética do rato adulto.
6- Na expressão de comportamentos afetivos, refletido em uma atividade ansiolítica
observada no modelo comportamento do labirinto em cruz elevado.
Ademais, a depleção cerebral de serotonina durante o período neonatal com para-
clorofenilalanina, período crítico do desenvolvimento de diversos sistemas cerebrais, não
ocasiona índice de letalidade.
67
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