-85-
4.7 Western Blot
As amostras foram submetidas à análise em SDS-PAGE. Findada a corrida, o gel e
algumas folhas de papel de filtro foram embebidos em tampão de transferência (Tris-Cl pH
7,5 48 mM, glicina 39 mM, dodecilsulfato de sódio 0,037% (p/v), metanol 20%). Feito isto,
o gel foi posto sobre uma membrana de nitrocelulose e esta sobre uma camada de 3 folhas de
papel de filtro que, por sua vez, repousam sobre um eletrodo. Para finalizar este processo,
mais uma camada de folhas de papel de filtro foi colocada diretamente sobre o gel. Esse
material foi, então, submetido a uma corrente de 0,8 mA/cm
2
de membrana durante 4h. Após
a eletrotransferência, a membrana de nitrocelulose foi lavada em água Milli-Q e corada em
solução de Ponceau S 0,1% (p/v) em ácido acético 10% (v/v) por 1 min. O excesso de
corante foi retirado após lavagens sucessivas com água Milli-Q. Em seguida, a membrana
foi lavada com tampão TBST [Tris-Cl pH 8,0 5,0 mM, NaCl 75 mM, Tween 20 0,028%
(v/v)] e incubada por aproximadamente 18 h, sob agitação, em solução de albumina a 3% no
mesmo tampão, à temperatura ambiente. Após o tempo determinado, foram feitas 3 lavagens
com o próprio tampão, para retirar o excesso de albumina. Neste momento, foi realizada a
incubação com o primeiro anticorpo (anticorpo policlonal anti-FH feito em coelho –
gentilmente cedido pela Dra. Pilar Sánchez-Corral), diluído a 1:5000 em 25 ml do tampão
TBST, por 2h à temperatura ambiente, sob agitação. Novas lavagens foram feitas e, então,
realizada a incubação com o segundo anticorpo (1:10.000) (anticorpo policlonal anti-IgG de
coelho marcado com fosfatase alcalina – Calbiochem) em condições semelhantes às da
incubação anterior. Finalmente, após novas lavagens, foi realizada a etapa de revelação das
bandas, por meio da incubação da membrana com 10 ml de solução APB (NaCl 100 mM,
Tris-Cl pH 9,5 100 mM, MgCl
2
5 mM), acrescida de 6 µL de nitroazul tetrazólico [NBT,
Nitro Blue Tetrazolium) a 0,3 mg/ml (preparado em formamida 70% v/v)] e de 3 µL de 5-
bromo-4-cloro-3-indolil fosfato 0,15 mg/ml (preparado em formamida 100%). O processo de