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DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS DE BIORREMEDIAÇÃO
APLICADOS A DERRAMES DE PETRÓLEO EM ÁGUA DO MAR
– TESTES LABORATORIAIS
ELIANE SOARES DE SOUZA
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ii
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS DE BIORREMEDIAÇÃO
APLICADOS A DERRAMES DE PETRÓLEO EM ÁGUA DO MAR
- TESTES LABORATORIAIS
TESE DE DOUTORADO
ELIANE SOARES DE SOUZA
“Tese apresentada ao Centro de Ciência
e Tecnologia da Universidade Estadual
do Norte Fluminense, como parte das
exigências para obtenção do título de
Doutora em Engenharia de Reservatório
e de Exploração de Petróleo”.
Orientador: Jorge Alberto Trgüis, Ph.D.
Macaé / RJ
Janeiro de 2003
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iii
AGRADECIMENTOS
A Deus por me ajudar a transpor os obstáculos que fazem parte da jornada da vida.
Ao meu marido Guilherme pelo amor e respeito, e ainda pelos relevantes
comentários técnicos referentes às atividades de E&P da UN/BC – Petrobras.
Às minhas filhas Gisela e Gabriela pela paciência, por não ter dedicado a atenção
merecida durante os períodos mais críticos deste trabalho.
À minha família, especialmente aos meus pais e sogros pelo apoio e dedicação nos
cuidados dispensados às minhas filhas durante os períodos de minha ausência.
Ao meu orientador e amigo prof. Dr. Jorge Trigüis pela competência científica,
paciência e disponibilidade em abraçar comigo esta pesquisa.
Ao Laboratório de Fluidos da UN/BC-Petrobras pela realização das análises
cromatográficas, à Gerência de Geoquímica CENPES/Petrobras pelas análises de
compostos biomarcadores, e à Gerência de Biotecnologia e Tratamentos Ambientais
CENPES/Petrobras pelas análises microbiológicas e ecotoxicológicas, fundamentais
à condução desta pesquisa.
Aos professores do curso de pós-graduação do LENEP/UENF pelos conhecimentos
transmitidos, e a todos os funcionários, especialmente, Luciano Vitorino e Débora M.
Freire, pela amizade e boa vontade.
Às doutoras Silvana Maria Barbanti e Antonia G. Torres Volpon, CENPES/Petrobras
pelo auxílio na interpretação dos dados analíticos.
À Dra. Selma Gomes Ferreira Leite EQ/UFRJ pela condução da bioaumentação de
microrganismos degradadores de hidrocarbonetos usados nesta pesquisa.
Ao Dr. Pedro Henrique Monerat, do Laboratório de Fitotecnia CCTA/UENF, pela
realização das análises de quantificação de nitrogênio e fósforo residuais.
Ao Dr. Olney Vieira da Motta, do Laboratório de Sanidade Animal CCTA/UENF, pelo
isolamento e identificação preliminar de uma cepa de bactéria degradadora de
hidrocarboneto, presente na água do mar usada nesta pesquisa.
À Escola Técnica Federal de Campos UNED/Macaé, por disponibilizar seu
Laboratório de Química para as atividades de preparo de amostras.
Às professoras Dra. Sara Laís R. Lenharo e Dra. Themis Carageorgos,
LENEP/UENF, pela revisão criteriosa desta tese.
Aos amigos Fátima Kzan D. de Lacerda, Lilian Bahia, Carlos Maurício C. de Oliveira,
Roseane M. Missagia e Isa Veiga pelas palavras de afeto e pelo companheirismo.
iv
Aos colegas do LENEP/UENF, e em especial a Ligely D. Quitar, Flávio D. M. Uchoa,
Anabela P. Rosa, Marcela Francisco Coelho, Rafael C. da Cunha e Sandro B. Alves
pela colaboração nas diversas fases deste trabalho.
Ao PADCT pelo suporte financeiro através do projeto “Desenvolvimento de métodos
de biorremediação de derrames de petróleo no mar e em sedimentos costeiros”.
À UENF pela oportunidade de realizar esta pesquisa e a Fundação Estadual do
v
RESUMO
Souza, Eliane Soares. Desenvolvimento de métodos de biorremediação aplicados a
derrames de petróleo em água do mar – Testes Laboratoriais. Macaé: Universidade
Estadual do Norte Fluminense. Tese (Doutorado)
As atividades de E&P na Bacia de Campos (RJ) e o transporte de petróleo ao longo
da costa brasileira, podem causar impacto ambiental pelo derramamento de óleo no
mar. A melhor resposta a este problema é minimizar a quantidade de óleo que possa
vir a atingir a costa. Isto pode ser feito pela remoção do óleo, e ainda pela
estimulação de processos naturais de biodegradação. Biorremediação é uma
tecnologia que visa a aceleração da biodegradação de compostos poluentes como o
petróleo, reduzindo sua concentração e/ou toxicidade. Ela pode ser conduzida
através da bioaumentação – aplicação direta de microrganismos, ou por
bioestimulação - de suas atividades metabólicas, pela adição de oxigênio e
nutrientes. A biodegradação é influenciada por parâmetros ambientais,
especialmente pela temperatura, fazendo com que habitats tropicais sejam
potenciais candidatos à utilização da biorremediação. No Brasil a biorremediação
tem sido aplicada a solos contaminados por resíduos de refinarias, mas pouco tem
sido estudado sobre sua utilização em derrames de petróleo em ambientes
marinhos. Neste trabalho foram conduzidos experimentos aplicando a
biorremediação a derrames de óleo simulados em água do mar. Foram usados um
óleo leve e testados nutrientes tais como: melaço, fosfato de amônia, fertilizante
NPK e ainda microrganismos bioaumentados. Com o objetivo de aumentar o contato
entre as gotas de óleo e os microrganismos foram testados um surfactante e um
biosurfactante. A eficiência da biorremediação foi medida em função dos resultados
obtidos dos monitoramentos: geoquímico, microbiológico e ecotoxicológico. O
monitoramento geoquímico foi realizado através de análises por cromatografia
gasosa (GC-FID) e por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa
(GC/MS) das amostras de óleo degradado. Para essa avaliação foram usadas as
razões de n-C
17
/pristano e n-C
18
/fitano e observadas mudanças nos perfis de
compostos policíclicos saturados e aromáticos, quando comparadas às amostras de
óleo controle. O monitoramento microbiológico foi responsável pela avaliação do
número de bactérias presentes nas unidades de simulação. O monitoramento
ecotoxicológico avaliou a toxicidade dos produtos testados e a presença de possíveis
vi
metabólitos tóxicos gerados ao longo da biorremediação. Os resultados mostraram
que: a) A biorremediação com a utilização de NPK, na proporção de 10% p/v do
volume de óleo derramado, contribuiu para retirada de aproximadamente 30% dos
alcanos, além dos que foram retirados da mancha por evaporação, ao final de quatro
dias do experimento. A aplicação desta tecnologia alterou de forma positiva e rápida
o aspecto do óleo na superfície da água do mar, com a redução de seu caracter
viscoso. b) A evaporação natural retirou, aproximadamente, 60% dos n-alcanos
menores que n-C
16
, nos quatro primeiros dias da simulação, chegando a 80% após
um mês. c) O uso concomitante do fertilizante NPK com surfactante, microrganismos
bioaumentados, e com biosurfactante não acrescentou melhorias significativas à
biorremediação. d) A utilização de melaço não foi eficiente na aceleração do
processo de biodegradação dos componentes do óleo. e) Não foram detectadas
alterações relativas ao processo de biodegradação sobre os compostos policíclicos
saturados. Entretanto, considerando as condições experimentais desta pesquisa, a
biodegradação dos componentes da fração de aromáticos foi mais pronunciada na
ausência do fertilizante NPK.
vii
ABSTRACT
Souza, Eliane Soares. Desenvolvimento de métodos de biorremediação aplicados a
derrames de petróleo em água do mar – Testes laboratoriais. Macaé: Universidade
Estadual do Norte Fluminense. Tese (Doutorado)
The E&P activities in the Campos Basin (RJ) and the oil transportation along the
Brazilian coast may impact the environment by release of oil. The best response is to
minimize the amount of oil that reaches the shoreline. This can be realized by
removing the oil using physical barrier and by enhancing the naturally occurring
biodegradation process. Bioremediation is a technology that accelerate the
biodegradation in order to reduce the concentration and/or toxicity of various
chemical substances, such as petroleum. Bioremediation is accomplished by
bioaugmentation - the addition of microorganisms or, bioestimulation - by promoting
better conditions for their metabolic activities, such as incorporation of oxygen or
nutrients. The biodegradation is influenced by environmental parameters, mainly
temperature, making the tropical habitats potential candidates for bioremediation. In
Brazil, this technique has been applied in contaminated soils with refinery residues
and nowadays there is little research on the application of bioremediation in marine
environments. This research display a laboratory simulated bioremediation study
using seawater, a light crude oil and nutrients as molasse, ammonia phosphate, NPK
fertilizer and bioaugmented microorganisms. The study also tested a synthetic
surfactant and a biosurfactant in order to increase the contact between the oil drops
and the microorganisms. The efficiency of the bioremediation was measured through
the geochemical, microbiological and ecotoxicological monitoring results. The
geochemical monitoring was conducted by analyses of gas chromatography (GC-
FID) and gas chromatography – mass spectrometry (GC/MS) of biodegraded oil. This
evaluation used the n-C
17
/pristane, n-C
18
/phytane ratios, and changes in the profiles
of saturated and aromatic policyclic compounds, which were compared with non-
treated crude oil. The microbiological monitoring supplied the data of bacteria number
presents in the simulation units. The ecotoxicological monitoring was conducted to
evaluate the toxicity of the tested products during simulation and the occurrence of
toxic metabolites resulted from the biodegradation process. The results display that:
a) In a simulation with 10% w/v of spilled oil, the bioremediation with NPK contributed
for the loss of approximately 30% of the not evaporated alkanes in four days of the
viii
experiment. The bioremediation altered the aspect of oil slick on the seawater surface
in a rapid and positive way with the reduction of the viscous character; b) The natural
evaporation of 60% light n-alkanes (smaller than n-C
16
) occurred in the first four days
reaching 80% at the end of the first month of the experiment; c) The combination of
NPK with surfactant, microorganisms and biosurfactant did not enhance the
bioremediation more than what was reached with the individual NPK; d) The molasse
was not efficient on the acceleration of the oil components biodegradation; and e) No
changes were observed in the saturated policyclic compounds profiles by GC/MS.
However, considering the experimental conditions of this research, the
biodegradation of the components of aromatic fraction was more pronounced in the
absence of the NPK fertilizer.
ix
ÍNDICE
CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO
1
CAPÍTULO 2 - OBJETIVOS
7
CAPÍTULO 3 - ESTADO DA ARTE DA TÉCNICA DE BIORREMEDIAÇÃO
8
3.1. Fundamentos Teóricos 15
3.2. Aplicação da Técnica em Derrames de Petróleo Reais 18
3.3. Estudos Sobre a Aplicação da Biorremediação no Brasil 26
CAPÍTULO 4 - BIODEGRADAÇÃO DO PETRÓLEO NO MEIO AMBIENTE
31
4.1. Fatores Químicos e Físicos 31
4.1.1. Composição Química do Petróleo 32
4.1.2. Alterações do Estado Físico do Petróleo - Intemperismo 47
4.2. Fatores Bióticos 52
4.2.1. Microrganismos Degradadores de Hidrocarbonetos 53
4.2.2. Caminhos Metabólicos 55
4.2.3. Adaptação dos Microrganismos à Presença de Hidrocarbonetos 57
4.3. Fatores Abióticos 58
4.4. Mecanismos de Biodegradação dos Componentes de Petróleo 65
4.4.1. Consumo dos Hidrocarbonetos por Microrganismos Degradadores 66
4.4.2. Biodegradação de Hidrocarbonetos Alifáticos 72
4.4.3. Biodegradação de Hidrocarbonetos Cicloalifáticos 74
4.4.4. Biodegradação de Hidrocarbonetos Aromáticos 78
4.4.5. Biodegradação de Compostos NOS 82
CAPÍTULO 5 –
METODOLOGIA APLICADA AO MONITORAMENTO DA
TÉCNICA DE BIORREMEDIAÇÂO
84
5.1. Aplicação da Geoquímica Orgânica na Avaliação da Técnica de
Biorremediação
85
5.1.1. Análises por cromatografia em fase líquida e em fase gasosa 87
5.1.2. Monitoramento Geoquímico da Biodegradação de n-
Alcanos e
Isoprenóides
89
x
5.1.3. Análises por cromatografia gasosa - espectrometria de massa 90
5.1.4. Monitoramento geoquímico da biodegradação de hidrocarbonetos
policíclicos saturados e de compostos policíclicos aromáticos
93
5.2. Aplicação de ensaios Microbiológicos e Ecotoxicológicos na Avaliação
da Técnica de Biorremediação
96
6. CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS E ANALÍTICAS
99
6.1. Simulação de Derrames de Petróleo em Água do Mar 99
6.2. Análises Geoquímicas do Petróleo 99
6.2.1. Amostragem dos Óleos Degradados 101
6.2.2. Análise de n-alcanos e Isoprenóides por Cromatografia Gasosa 101
6.2.3. Fracionamento do Óleo por Cromatografia Líquida à Média
Pressão
103
6.2.4. Análise de Terpanos, Esteranos e Policíclicos aromáticos por
Cromatografia Gasosa - Espectrometria de Massa
104
6.3. Análises Microbiológicas e Ecotoxicológicas 105
6.3.1. Avaliação do Número de Bactérias Heterotróficas e Degradador
as
de Hidrocarbonetos
105
6.3.2. Avaliação Ecotoxicológica da Aplicação da Técnica de
Biorremediação
106
6.4. Análise da Concentração Residual dos Íons Amônio e Fosfato 106
CAPÍTULO 7 -
APRESENTAÇÃO DOS EXPERIMENTOS E DISCUSSÃO
DOS RESULTADOS.
108
7.1. Caracterização Geoquímica dos Óleos de Albacora e de Marlim 108
7.2. Experimento 1: Uso de Melaço Hidratado 119
7.2.1. Monitoramento geoquímico 120
7.3. Experimento 2: Comparação Entre o Uso de Melaço Desidratado e
Fosfato de Amônia
129
7.3.1. Monitoramento geoquímico 130
7.4. Experimento 3: Comparação Entre o Uso de NPK e de NPK em
Conjunto com um Surfactante
140
7.4.1. Monitoramento geoquímico 141
7.5. Experimento 4: Comparação Entre o Uso dos Fertilizantes NPK e NP 155
xi
7.5.1. Monitoramento geoquímico 156
7.5.2. Monitoramento microbiológico 161
7.6. Experimento 5: Uso do Fertilizante NPK em Conjunto com um
Biosurfactante e com uma População de Microrganismos Bioaumentados,
sob Condições de Aeração Elevada
163
7.6.1. Monitoramento geoquímico 164
7.6.2. Avaliação do aumento da aeração sobre a biorremediação 173
7.6.3. Monitoramento microbiológico 175
7.6.4. Avaliação da concentração residual dos íons amônio e fosfato 178
7.6.5. Monitoramento ecotoxicológico 180
7.7. Isolamento e Identificação Preliminar de Bactérias Degradadoras de
Hidrocarbonetos
186
CAPÍTULO 8 . CONCLUSÕES
187
CAPÍTULO 9. RECOMENDAÇÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
189
CAPÍTULO 10 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
190
ANEXOS A – Experimento 1
208
ANEXOS B – Experimento 2
222
ANEXOS C – Experimento 3
235
ANEXOS D – Experimento 4
275
ANEXOS E – Experimento 5
286
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.1
: Principais rotas de transporte de petróleo. A espessura das setas
é proporcional à quantidade do produto comercializada entre os continentes.
Fonte: International Energy Annual Report – U.S.A, 1988, apud Burger, 1997.
2
Figura 3.1: Representação esquemática da rede de oleodutos entre
as plataformas da Petrobrás e os terminais em terra, na Bacia de Campos.
11
Figura 3.2: Os mais importantes tipos de resíduos onde se aplica a técnica
de biorremediação. Fonte USA, EPA/540/N-93/001 apud Cookson, 1995.
15
Figura 4.1: Diagrama ternário mostrando a composição, em
função das percentagens de hidrocarbonetos saturados, aromáticos e
compostos NSO, de 636 diferentes tipos de óleo (Tissot e Welte, 1984).
32
Figura 4.2: Exemplos de n-alcanos (Tissot e Welte, 1984). 34
Figura 4.3: Exemplos de iso-alcanos (Tissot e Welte, 1984). 35
Figura 4.4: Exemplos de cicloalcanos (Tissot e Welte, 1984). 36
Figura 4.5: Exemplos de compostos aromáticos (Tissot e Welte, 1984). 37
Figura 4.6: Exemplos de compostos naftenoa
romáticos (Tissot e Welte,
1984).
38
Figura 4.7
: Exemplos de classes de biomarcadores acíclicos presentes no
petróleo (modificado de Peters e Moldowan, 1993).
41
Figura 4.8
: Exemplos de classes de biomarcadores cíclicos presentes no
petróleo (modificado de Peters e Moldowan, 1993).
42
Figura 4.9
: Fórmulas estruturais de esteranos e hopanos (Peters e
Moldowan, 1993).
44
Figura 4.10
: Exemplos de compostos contendo enxofre (Tissot e Welte,
1984).
45
Figura 4.11: Exemplos de compostos contendo nitr
ogênio (Tissot e Welte,
1984).
46
Figura 4.12: Conversão da molécula de clorofila em porfirinas onde M = VO
+2
ou Ni
+2
(Peters e Moldowan, 1993).
47
Figura 4.13
: Processos de intemperismo sobre o óleo derramado no mar.
Fonte: Pattern Recognition Associates, Texas, 1996.
49
Figura 4.14: Principais rotas metabólicas usadas na biodegradação de n-
alcanos (modificado de Baker e Herson, 1994).
72
Figura 4.15
: Principal rota metabólica usada na biodegradação de
ciclohexano (Morgan e Watkinson, 1994).
74
xiii
Figura 4.16
: Hipótese de formação de 25 norhopano a partir da
biodegradação aeróbica de 17α 21 β (H) hopano (Peters e Moldowan, 1993).
77
Figura 4.17
: Degradação inicial do anel benzênico sob ação de oxigenases,
em condições aeróbicas (Baker e Herson, 1994).
80
Figura 5.1
: Principais áreas de aplicação da geoquímica orgânica (Brooks e
Welte, 1984).
85
Figura 5.2
: Áreas de aplicação da geoquímica do petróleo (Brooks e Welte,
1984).
86
Figura 5.3
: Escala de medida da extensão da biodegradação das classes de
hidrocarbonetos que compõem o petróleo (modificada de Peters e Moldowan,
1993).
95
Figura 6.1
: Galpão onde foram instaladas as unidades de simulação dos 100
derrames
Figura 6.2: Simulação de um derrame em uma das unidades de simulação. 100
Figura 6.3: Fluxograma de análises geoquímicas das amostras de óleo. 102
Figura 7.1: Cromatogramas dos óleos originais de Albacora e Marlim. 109
Figura 7.2
: Localização dos óleos de Albacora e Marlim no diagrama ternário
das percentagens dos hidrocarbonetos saturados, aromáticos e de
compostos NOS (modificado de Tissot e Welte, 1984).
112
Figura 7.3
: Fragmentogramas dos terpanos (m/z=191) dos óleos de
Albacora e Marlim.
113
Figura 7.4
: Fragmentogramas dos esteranos (m/z=217) dos óleos de
Albacora e Marlim.
114
Figura 7.5
: Fragmentogramas m/z=177 dos óleos de Albacora e de Marlim,
onde (1) = C
28
25-nor α β hopano e (2) = C
29
25-nor α β hopano.
115
Figura 7.6
: Fragmentogramas de compostos metilados da fração de
policíclicos aromáticos, (A
) Os isômeros 3, 2, 9 e 1 metil fenantrenos
(m/z=192), (B) Os isômeros 4, 2/3 e 1 metil dibenzotiofenos
(m/z=198) dos
óleos de Albacora e Marlim.
117
Figura 7.7
: Cromatogramas das amostras de óleo coletadas das unidades de
controle e de biorremediação do experimento 1, na primeira, quarta e oitava
semanas.
120
Figura 7.8: Fragmentogramas (m/z=191) das
amostras do óleo de Albacora
e das unidades de controle e de biorremediação do experimento 1, na quinta
semana.
123
Figura 7.9
: Fragmentogramas (m/z=217) das amostras do óleo de Albacora
e das unidades de controle e de biorremediação do experimento 1, n
a quinta
124
xiv
semana.
Figura 7.10
: Fragmentogramas de compostos metilados da fração de
policíclicos aromáticos, (A
) Os isômeros 3, 2, 9 e 1 metil fenantrenos
(m/z=192), (B
) Os isômeros 4, 2/3 e 1 metil dibenzotiofenos (m/z=198) dos
óleos das unidades de
controle e de biorremediação com melaço, na quinta
semana.
126
Figura 7.11. Cromatogramas dos óleos das unidades de controle e de
biorremediação com melaço desidratado na primeira, segunda e quarta
semanas, do experimento 2.
131
Figura 7.12: Cromatogramas dos óleos das unidades de controle e de
biorremediação com fosfato de amônia na primeira, segunda e quarta
semanas, do experimento 2.
132
Figura 7.13: Fotografias das unidades de controle e de biorremediação
do óleo Albacora, com melaço e com fo
sfato de amônia, no experimento 2, na
segunda semana.
133
Figura 7.14
: Fragmentogramas (m/z=191) dos hopanos das amostras
coletadas das unidades de controle e de biorremediação com fosfato de
amônia do experimento 2, na primeira, terceira e quinta semanas.
136
Figura 7.15: Fragmentogramas (m/z=177) dos hopanos das amostras
coletadas das unidades de controle e de biorremediação com fosfato de
amônia do experimento 2, na primeira (A), terceira (B) e quinta (C) semanas.
Onde (1) = C
28
25-nor-αβ -hopano e (2) = C
29
25-nor-αβ -hopano.
137
Figura 7.16: Fragmentogramas (m/z=217) dos esteranos das amostras
coletadas das unidades de controle e de biorremediação com fosfato de
amônia do experimento 2, na primeira, terceira e quinta semanas.
138
Figura 7.17:
Cromatogramas das amostras dos óleos, das unidades de
controle e de biorremediação com NPK, coletadas nos dias 2, 4, 7, 15, 21 e
28 do experimento 3.
142
Figura 7.18: Cromatogramas das amostras dos óleos, das unidades de
controle e de biorremediação com NPK+Surfactante coletadas nos dias 2, 4,
7, 15, 21 e 28 do experimento 3.
143
Figura 7.19: Fragmentogramas (m/z = 191) das amostras dos óleos, das
unidades de controle e de biorremediação com NPK e com NPK+Surfactante
coletadas nos dias 7 e 28 do experimento 3.
145
Figura 7.20: Fragmento
gramas (m/z = 177) das amostras dos óleos, das
unidades de controle (A) e de biorremediação com NPK (B
) e com
NPK+Surfactante (C) coletadas nos dias 7 e 28 do experimento 3. Onde (1
) =
C
28
25-nor-αβ -hopano e (2) = C
29
25-nor-αβ -hopano.
146
Figura 7.21: Fragmento
gramas (m/z = 217) das amostras dos óleos, das
unidades de controle e de biorremediação com NPK e com NPK+Surfactante
coletadas nos dias 7 e 28 do experimento 3.
147
xv
Figura 7.22: Fragmentogramas d
os isômeros 3, 2, 9 e 1 metil fenantrenos
(m/z=192), dos óleos das unidades de controle e de biorremediação com
NPK e com NPK+Surfactante coletadas nos dias 0 e 28 do experimento 3.
149
Figura 7.23: Fragmentogramas dos isômeros 4, 2/3 e 1 metil dibenzo
tiofenos
(m/z=198) dos óleos, das unidades de controle e de biorremediação com
NPK e com NPK+Surfactante coletadas nos dias 0 e 28 do experimento 3.
150
Figura 7.24: Cromatogramas de massas da fração de compostos policíclicos
aromáticos presentes nas amostras de óleo coletadas das unidades de
controle e de biorremediação, logo após o derrame e ao final dos
28 dias do experimento.
152
Figura 7.25: Cromatogramas das amostras coletadas das unidades de
controle e de biorremediação com NPK e NP, nos dias 0 e 2, do
experimento 4.
157
Figura 7.26: Cromatogramas das amostras coletadas das unidades de
controle e de biorremediação com NPK e NP, nos dias 5 e 7, do
experimento 4.
157
Figura 7.27: Cromatogramas das amostras coletadas das unidades de
controle e de biorremediação com NPK e NP, nos dias 14 e 28, do
experimento 4
158
Figura 7.28: Comparação entre os cromatogramas dos óleos das
unidades de biorremediação com 10g de NPK (Experimento 3) e com 5 g
de NPK (Experimento 4) após sete dias de tratamento
158
Figura 7.29: Fotografias das unidades de controle e de biorremediação
usando os fertilizantes NPK e o NP, no quarto dia do experimento 4.
160
Figura 7.30: Gráficos dos valores médios da medida do número de
bactérias heterotróficas (A) e degradadoras de hidrocarbonetos (B), ao
longo do experimento 4.
161
Figura 7.31: Cromatogramas das amostras coletadas das unidades de
controle e de biorremediação com NPK, NPK + microrganismos (NPK + M)
e NPK + biosurfactante (NPK + B), nos dias 0 e 2, do experimento 5.
165
Figura 7.32: Cromatogramas das amostras coletadas das unidades de
controle e de biorremediação com NPK, NPK + microrganismos (NPK + M)
e NPK + biosurfactante (NPK + B), nos dias 4 e 7, do experimento 5.
166
Figura 7.33: Cromatogramas das amostras coletadas das unidades de
controle e de biorremediação com NPK, NPK + microrganismos (NPK + M)
e NPK + biosurfactante (NPK + B), nos dias 14 e 28, do experimento 5.
167
Figura 7.34: Fotografias das unidades de controle, biorremed
iação com NPK,
com NPK + microrganismos, e NPK + biosurfactante no quarto dia do
experimento 5.
168
xvi
Figura 7.35: Fotografias das unidades de controle, biorremediação com
NPK, NPK + microrganismos, e NPK + biosurfactante, no sétimo dia do
experimento 5.
179
Figura 7.36: Avaliação do crescimento de bactérias heterotróficas,
presentes nas amostras de água coletadas das unidades de simulação, ao
longo dos 28 dias do experimento 5.
175
Figura 7.37: Avaliação do crescimento de bactérias degradadoras de
hidrocarbonetos, presentes nas amostras de água coletadas das
unidades de simulação, ao longo dos 28 dias do experimento 5.
177
Figura 7.38: Gráfico da concentração residual média de nitrogênio
amoniacal nas amostras de água coletadas das unidades de biorremediação
ao longo dos 28 dias do experimento 5.
179
Figura 7.39
: Gráfico da concentração residual média de fósforo nas amostras
de água coletadas das unidades de biorremediação ao longo dos 28
dias do experimento 5.
180
xvii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 3.1: Os maiores derrames de petróleo ocorridos a partir de 1967.
9
Tabela 3.2: Aporte anual de hidrocarbonetos nos oceanos (10
6
ton/ano) 13
Tabela 4.1
: Composição média de hidrocarbonetos no petróleo (Tissot e
Welte, 1984).
33
Tabela 4.2
: Correlação entre grau API e densidade relativa (modificado de
North, 1985).
48
Tabela 7.1: Parâmetros físico-químicos dos óleos de Albacora e Marlim. 108
Tabela 7.2: Quantificação dos n-alcanos de n-C
8
a n-C
35
, pristano e fitano
presentes no óleo de Albacora.
110
Tabela 7.3: Relações entre os n-alcanos, n–C
17
, n–C
18
, pristano e fitano, dos
óleos de Albacora e Marlim. Onde P = pristano e F = fitano.
111
Tabela 7.4: Percentual de hidrocarbonetos saturados, aromáticos e de
compostos NSO, nos óleos de Albacora e de Marlim.
111
Tabela 7.5: P
rincipais relações entre os hidrocarbonetos policíclicos
saturados, do óleo de Albacora. Onde hopano = C
30
α β hopano, C
23
e C
24
=
terpanos tricíclicos, 25 norhopano = C
29
25-nor-α β hopano, e
C
35
(R) = C
35
α β 22R homohopano.
116
Tabela 7.6: Principais relações entre as abundâncias relativas de
isômeros alquilados de compostos policíclicos aromáticos, presentes nos
óleos de Albacora e de Marlim.
118
Tabela 7.7: Principais parâmetros de avaliação do grau de
biodegradação e intemperismo de n-alcanos e isoprenóides, no experimento
1. (C = amostras das unidades de controle, M = amostras da unidade de
biorremediação com melaço diluído, P = Pristano e F = Fitano).
122
Tabela 7.8: Principais
relações entre os hidrocarbonetos policíclicos
saturados das amostras de óleo de Albacora, provenientes das unidades de
simulação do experimento 1. Onde hopano = C
30
17α, 21β hopano, C
23
e C
24
= terpanos tricíclicos, 25 norhopano = C
29
25-nor-17α, 21β hopano, e C
35
(R) =
C
35
17α, 21β 22R homohopano. C = amostras das unidades de controle, M
=
amostra da unidade de biorremediação com melaço,
xviii
Tabela 7.10: Relações entre n-alcanos, pristano e fitano, nas quatro semanas
iniciais do Experimento 2. C = amostras das unidades de controle,
M = amostras da unidade de biorremediação com melaço, Ft = amostras da
unidade de biorremediação com fosfato de amônia, P = Pristano e F = Fitano.
134
Tabela 7.11: Relações entre n-
alcanos, pristano e fitano, nos 28 dias do
experimento 3.
144
Tabela 7.12
: Relações entre os hidrocarbonetos policíclicos saturados,
indicadores de alterações decorrentes do processo de biodegradação.
Onde
hopano = C
30
αβ hopano, C
23
e C
24
= terpanos tricíclicos, 25 norhopano = C
29
25-nor-αβ-hopano, e C
35
(R) = C
35
αβ22R homohopano.
148
Tabela 7.13: Relações entre as abundâncias relativas dos isômeros de
compostos policíclicos aromáticos.
151
Tabela 7.14: Relações entre n-
alcanos, pristano e fitano, durante os 28 dias
do experimento 4.
159
Tabela 7.15: Variação média da concentração de n-alcanos e isoprenóides,
medidas nos óleos das unidades de controle (C), de biorremediação com
NPK (N), NPK e microrganismos (N+Mc), e NPK e biosurfactante (N+B), e o
percentual de perda de n-alcanos e isoprenóides em relação ao óleo de
Albacora, no experimento 5.
170
Tabela 7.16: Relação entre n-alcanos, pristano e fitano, dos óleos
coletados das unidades de controle e de biorremediação, do experimento 5.
172
Tabela 7.17: Quantificação dos n-alcanos, pristano e fitano, das amostras de
óleo de Albacora, e daquelas coletadas da unidade de controle, nos 28
dias do experimento 5.
174
Tabela 7.18: Resultados dos testes de ecotoxicidade para Vibrio fischeri
pelo método MICROTOX®. Onde CE 50 % = concentração a partir da
qual, foi observado o efeito de redução de 50% na emissão de
luminescência pela bactéria marinha Vibrio fischeri.
181
Tabela 7.19: Resumo dos parâmetros de avaliação do grau de
biodegradação e intemperismo de n-alcanos e isoprenóides, para o óleo de
Albacora, após sete dias de biorremediação, para os cinco experimentos
conduzidos nesta pesquisa.
185
1
1. Introdução
O petróleo, derivado de distintos tipos de matéria orgânica, é constituído
basicamente de carbono e hidrogênio - hidrocarbonetos, gerados através de
processos bioquímicos, químicos e físicos que atuam sobre essa matéria orgânica,
tanto na sua deposição como durante seu soterramento. O petróleo se apresenta sob
a forma de gás, óleo ou asfalto.
Desde os tempos pré-históricos, o petróleo vem sendo usado como cimento
em construções, impermeabilizante de barcos, na preservação de múmias, com
propósitos medicinais e de magia, na iluminação e também como arma de guerra.
Nesse período o petróleo era coletado de exudações superficiais. As exudações
naturais vêm fazendo parte do ecossistema marinho há centenas de milhares de
anos sem, entretanto, causar prejuízos ao meio ambiente, devido a sua evaporação
e ao consumo de seus componentes por organismos geneticamente adaptados à
presença do óleo (Burger, 1997).
O uso comercial do petróleo na era moderna se iniciou a partir da metade do
século XIX. Em 1852, fazendeiros poloneses residentes na Pennsilvânia tentaram
produzir vodka a partir da destilação de um óleo proveniente de uma exudação
natural. O produto destilado, o querosene, não se assemelhava à vodka, entretanto,
queimava com muita facilidade. A invenção da lâmpada a querosene em 1854, em
substituição à lâmpada com óleo de baleia, levou a expansão do mercado consumidor
do querosene. Em 1859, o Coronel Edwin L. Drake perfurou o primeiro poço de
petróleo próximo a cidade de Titusville, Pennsilvânia, EUA. Com esse poço, que
tinha apenas 2 metros de profundidade, Drake obteve um fluxo constante de óleo e
promoveu o nascimento da moderna indústria de petróleo (Burger, 1997).
O petróleo foi pouco utilizado até se atingir o desenvolvimento dos motores a
explosão e suas aplicações em navios, automóveis, caminhões, tratores e aviões, nas
primeiras décadas do século XX. Mesmo nos anos sessenta combustíveis sólidos,
como lenha e carvão mineral, ainda eram as maiores fontes de energia do mundo. A
mudança para o combustível líquido ocorreu em parte, devido ao rápido crescimento
do setor de transporte de óleo e pelo avanço da tecnologia aplicada na exploração,
2
produção e refino do petróleo, tornando o custo de produção de seus derivados
economicamente viável.
Nas quatro últimas décadas do século XX o petróleo passou a ser a principal
fonte de energia deste planeta. Entretanto, sua produção não está uniformemente
distribuída entre os países consumidores, o que levou à formação de uma complexa
rede internacional de distribuição. Na figura 1.1 estão representadas as mais
importantes rotas de transporte do petróleo.
Figura 1.1: Principais rotas de transporte de petróleo. A espessura das setas é
proporcional à quantidade do produto comercializada entre os continentes. Fonte:
International Energy Annual Report – U.S.A, 1988, apud Burger, 1997.
O transporte do petróleo é realizado através de oleodutos terrestres e
marinhos e de navios tanque, podendo resultar, inevitavelmente, em acidentes com
vazamentos de óleo para o meio ambiente. Os vazamentos podem ocorrer também
no upstream (operações de exploração e produção do petróleo), ou no downstream
(refino e distribuição de seus derivados). Ocasionalmente, esses acidentes envolvem
grandes volumes de produto e são catastróficos, embora costumam ser pequenos e
crônicos. No upstream, a operação que envolve maiores riscos de derrames
acidentais é a de transferência do óleo produzido nas plataformas para os navios
tanques e oleodutos submersos (Reis, 1996). No downstream, os derrames
normalmente acontecem devido ao rompimento de dutos e tanques de reserva.
Outras fontes são os acidentes envolvendo navios tanque (Burger, 1997).
Apesar das principais atividades de transporte e transferência de óleo
ocorrerem no mar, portos e rios, os acidentes não estão limitados a essas áreas. Em
3
qualquer lugar em que o petróleo esteja sendo explorado, produzido, estocado,
refinado e transportado, existe o perigo potencial de derrames acidentais que podem
vir a causar danos à fauna e flora, e ainda alterar o meio ambiente, principalmente os
ecossistemas marinhos.
Muitos derrames no mar, envolvendo pequenos volumes de óleo, ocorrem
como resultado da lavagem de tanques de navios petroleiros e do descarregamento
de água de lastro contaminada por óleo. Apesar da contaminação provocada por
cada navio tanque ser pequena, a grande quantidade destes tanques, trafegando
pelas principais rotas de transporte, tem colaborado para o aumento do volume de
petróleo derramado no mar, levando eventualmente, à contaminação de regiões
costeiras (Wang et al. 1998a; Barakat et al, 1999).
Nos acidentes com derramamento de petróleo que ocorrem fora da costa, a
primeira providência é identificar a fonte poluidora e controlar o vazamento. Isto pode
ser feito através da estabilização do navio tanque, pela interrupção do fluxo de óleo
no oleoduto danificado, ou o reparo imediato do poço, devendo-se a seguir ser
acionado o plano de contingência e selecionadas as melhores tecnologias aplicáveis
à situação (Nordvik et al.,1995).
Uma vez que o óleo já esteja derramado no mar, devem ser colocadas
barreiras de contenção ao redor da mancha na tentativa de controlar seu
espalhamento. As regiões sensíveis da costa também podem ser isoladas pelo uso
destes materiais (Fingas, 1994). As barreiras flutuam movendo-se para cima e para
baixo com as ondas e as variações das marés e são usadas somente em ambientes
de baixa energia, como baías, rios e portos. Nesses ambientes protegidos, também
podem ser aplicadas mantas adsorventes sobre o óleo, produzidas com material
sintético oleofílico ou naturais como palha, turfa e serragem, que são descartadas e
incineradas depois de saturadas de óleo (Environmental Protection Agency, 1999).
Quando o óleo derramado, contido pelas barreiras, forma uma mancha
espessa que se move mais lentamente que aquelas produzidas por óleos leves,
pode ser coletado da superfície do mar através do uso de skimmers. Esses
equipamentos são classificados de acordo com seu princípio de operação: uso de
discos, esteiras rolantes ou escovas com superfície oleofílica; ou sucção do óleo
sobrenadante com a utilização de bombas de vácuo. Os skimmers normalmente são
4
adaptados a barcos que possuem um reservatório para o armazenamento temporário
do óleo coletado. Como no caso das barreiras de contenção, esta técnica mecânica
de remoção de petróleo só pode ser aplicada em ambientes protegidos de ondas e
ventos (Environmental Protection Agency, 1999).
Uma outra técnica de aplicação ainda mais restrita é a da queima dos
componentes do petróleo presentes na mancha. Ela deve ser usada somente em
derrames recentes, que ainda não sofreram evaporação dos compostos mais voláteis
e que estejam distantes o suficiente das comunidades costeiras (Fingas et al.,1996a;
Walavalkar e Kulkani, 1996).
A utilização de dispersantes, isto é, detergentes contendo surfactantes, é
largamente difundida desde a década de setenta, sendo uma das primeiras
estratégias usadas nos casos de derrames de petróleo no mar (American Petroleum
Institute, 1972, apud Fingas, 1998a). Surfactantes são constituídos por moléculas
anfipáticas, as quais possuem uma parte polar ou hidrofílica e outra apolar ou
hidrofóbica. Devido à presença desses grupos na mesma molécula, os surfactantes
acumulam-se na interface entre fases de diferentes graus de polaridade como óleo e
água, ocasionando reduções das tensões superficiais e interfaciais desses sistemas. A
aplicação de dispersantes tem como objetivo espalhar o óleo, na forma de pequenas
gotas ao longo da coluna de água, aumentando a dispersão natural causada pelo
movimento das ondas (Fingas, 1994; Fingas et al., 1995).
Nos últimos anos têm sido conduzidos estudos com o objetivo de viabilizar o
uso de dispersantes, em função do binômio: eficiência versus toxicidade. Pesquisas
realizadas no Mar do Norte, testaram e comprovaram a eficiência de dispersantes
especialmente desenvolvidos para uso em derrames de óleo pesado, através da
redução da concentração do óleo em água, que variou de 2 a 180 ppm no momento
do derrame, passando para menos de 1 ppm após 5 horas de aplicação do
dispersante (Lessad et al.,1998). Nessa mesma região, foram estudados os processos
de intemperismo sobre um derrame de petróleo e foi observado que a aplicação do
dispersante, após a formação da emulsão óleo-água, interrompeu o processo e ainda,
aumentou a taxa de dispersão natural da mancha. A aplicação de dispersantes,
entretanto, tem gerado muita controvérsia, pois pode aumentar a biodisponibilidade de
componentes tóxicos do petróleo, elevando sua toxicidade sobre os organismos
5
marinhos, sendo seu uso aprovado em alguns países, mas limitado à região de alto
mar (Wardrop, 1991; Singer et al., 1996).
A tomada de decisão do uso de dispersantes em um derrame no mar depende
da quantidade e do tipo do óleo ou produto derramado, da proximidade da costa, da
presença de populações e habitats sensíveis, das condições climáticas, do mar e dos
tipos de dispersantes disponíveis no mercado (Lunel et al. 1995; Etkin, 1998). A
aplicação de surfactantes nos derrames ocorridos em águas brasileiras ainda não foi
aprovada pelo IBAMA, pois não se conhecem os possíveis impactos de seu uso sobre
a fauna e flora marinhas.
Caso o derrame não tenha sido contido no mar, ele pode chegar à costa em
algumas horas ou dias. Na descontaminação de sedimentos de praias e rochas
podem ser usados jatos de água quente, detergentes, ou a retirada de areia saturada
com óleo, por meio de escavadeiras. Esses procedimentos, apesar de eficientes,
alteram drasticamente o ecossistema da região intermarés (Burger, 1997).
Uma outra técnica de remediação de ambientes contaminados, relativamente
nova, propõe a aceleração do processo de degradação natural do petróleo, por
microrganismos que utilizam os hidrocarbonetos como fonte de carbono em seus
processos metabólicos. A técnica de biorremediação é ecologicamente correta, pois
não altera o equilíbrio dos ecossistemas, visando somente a biodegradação dos
compostos poluentes, reduzindo sua concentração e/ou toxicidade (Atlas, 1977;
Pritchard e Costa, 1991; Prince, 1993; Atlas, 1995
a e b ).
Embora a biorremediação seja considerada uma tecnologia recente, o uso
rotineiro de microrganismos no tratamento de resíduos vem sendo aplicado há mais
de um século, tanto para o tratamento de esgotos domésticos como para o de
efluentes industriais. A novidade envolvendo a biorremediação é a aplicação de
processos microbiológicos na remediação de solos, aqüíferos, sedimentos de praia,
manguezais e outros ecossistemas contaminados (Hoff, 1992 e 1993; King et al.,
1997). Esses sistemas diferem dos tradicionais em função do tipo dos produtos a
serem degradados e da matriz na qual o processo pode ocorrer. Os contaminantes
são freqüentemente misturas complexas de compostos orgânicos como creosoto,
petróleo, ou combinações de solventes industriais, e os ambientes são heterogêneos
e multifásicos (Rosenberg et al., 1992; Baker e Herson, 1994; Cookson, 1995). Em
6
função dessa complexidade, para que se atinjam os objetivos num projeto de
biorremediação, é necessário um enfoque multidisciplinar que envolva a participação
de engenheiros, microbiologistas, ecologistas, geólogos e químicos.
As técnicas de biorremediação podem ser classificadas como ex situ ou in
situ. Tecnologias ex situ são modalidades de tratamento nas quais o material
contaminado é removido, para um lugar diferente, onde possa ser tratado.
Bioreatores, landfarmings, compostagem e algumas formas de tratamento em fase
sólida são exemplos de técnicas ex situ. Já as técnicas in situ são aplicadas no
próprio local onde ocorreu a contaminação, como a bioventilação de solos
contaminados e a bioestimulação de microrganismos presentes nos ecossistemas
marinhos e terrestres (Baker e Herson, 1994; Cookson, 1995; Lee, 1999).
Independente do tipo de técnica a ser empregada, o sucesso da
biorremediação depende da presença de microrganismos específicos e de condições
ambientais adequadas, para que a biodegradação ocorra. Os microrganismos devem
ser capazes de metabolizar os contaminantes. Em muitos casos, esses organismos
já fazem parte da microflora local (microrganismos indígenos ou autóctones) em
outras circunstâncias, em que se verifica sua carência, precisam ser adicionados
(microrganismos exógenos ou alóctones). Parâmetros ambientais devem ser
alterados ou controlados para otimizar o crescimento e as atividades metabólicas dos
microrganismos. Algumas dessas condições são: temperatura, presença de oxigênio
e de nutrientes, e pH (Adamassu e Korus, 1996).
Como qualquer outra tecnologia, a biorremediação tem suas limitações e
desvantagens. Produtos químicos como alguns compostos clorados e metais, não
são biodegradáveis, e para outras categorias de compostos a biodegradação pode
levar à produção de substâncias mais tóxicas ou com maior biodisponibilidade que o
contaminante original, inviabilizando sua aplicação no meio ambiente poluído (Baker
e Herson, 1994). No entanto, a biorremediação oferece muitas vantagens sobre as
outras técnicas de remediação. Freqüentemente, ela é conduzida no próprio local
contaminado, eliminando os custos de transporte e com um mínimo de interferência
nas atividades que são realizadas nas proximidades. Ela também pode ser
combinada com outras técnicas de descontaminação ambiental no caso de resíduos
complexos (Cookson, 1995).
7
2. Objetivos
Em face aos riscos ambientais inerentes às atividades desenvolvidas pela
maior região de produção de petróleo brasileira, localizada na Bacia de Campos, litoral
norte do Estado do Rio de Janeiro, e à ausência de pesquisas realizadas no Brasil
sobre a aplicação da técnica de biorremediação em derrames de petróleo em água do
mar, o presente trabalho apresenta uma expressiva relevância e ineditismo dentro do
cenário nacional de preservação ambiental, tendo como objetivos:
Objetivo principal
Estabelecer protocolos para utilização de produtos estimuladores da
biodegradação em derrames de petróleo no mar, simulados em laboratório, tais como
tipo, composição e freqüência de aplicação destes compostos. Avaliar os seus efeitos
através do monitoramento da variação da concentração dos componentes do petróleo
e de sua toxicidade ao ecossistema marinho.
Objetivos específicos
Avaliar a utilização de produtos contendo nitrogênio e fósforo como
bioestimulantes ou aceleradores do processo de biodegradação de componentes do
petróleo, tais como melaço, fosfato monoamônico e fertilizantes agrícolas.
Avaliar a eficiência da aplicação de microrganismos degradadores de
hidrocarbonetos, isolados da água do mar e bioaumentados em laboratório, na
aceleração do processo de biodegradação, isto é, na biorremediação.
Testar a eficácia de um dispersante químico e do biosurfactante Emulsan em
auxiliar a biorremediação, na disponibilização de gotas de óleo ao ataque microbiano.
8
3. Estado - da - arte da técnica de biorremediação
Os acidentes associados ao derramamento de grandes volumes de petróleo,
começaram a ser divulgados pela imprensa na década de sessenta, na mesma
época em que os primeiros superpetroleiros foram lançados ao mar. O primeiro
acidente noticiado ocorreu em março de 1967, em águas territoriais inglesas, devido
ao choque do navio tanque Torrey Canyon contra as rochas de uma pequena ilha,
despejando 150 milhões de litros de petróleo no mar, contaminando as praias da
região (Prince,1993; Hoff, 1993).
Outros grandes acidentes aconteceram desde então, como resultado de
falhas nas operações de poços de petróleo e tanques de reserva, incêndios,
encalhes seguidos por naufrágio de navios tanque, e até como estratégia de guerra.
Na tabela 3.1 estão descritos os dezessete maiores derrames, em volume de óleo,
ocorridos no mundo, a partir do acidente com o navio tanque Torrey Canyon em
1967, até o ocorrido com o Sea Express em 1996.
O derrame causado pelo petroleiro Exxon Valdez, em março de 1989, na
Baía Prince William, Alasca, é o vigésimo oitavo dessa lista, com a marca de 40
milhões de litros de óleo. Foi considerado um dos mais sérios acidentes ecológicos
ocorridos no mundo, em função da vulnerabilidade do ecossistema atingido pelo
derrame (Pritchard e Costa, 1991; Pritchard et al.,1992; Bragg et al.,1994).
No Brasil foram registrados, até o momento, quatro importantes derrames de
petróleo. Em março de 1975 o petroleiro grego Tarik Ibn Ziyad derramou 5 milhões
de litros de óleo na entrada da Baía de Guanabara. A mancha atingiu várias praias
oceânicas das cidades do Rio de Janeiro e Niterói, e a contaminação afetou
seriamente a biota da zona intermarés (Crapez et al., 2002). No litoral norte do
estado de São Paulo, em maio de 1994, 2,7 milhões de litros de óleo vazaram no
rompimento do oleoduto do terminal Marítimo Almirante Barroso (Oliveira e Maschio,
2000; Vieira 2000).
Os derrames mais recentes ocorreram em janeiro e julho de 2000. No
primeiro vazaram 1,3 milhões de litros de óleo combustível de um duto da Petrobrás
que liga o terminal da Ilha D’água à refinaria Duque de Caxias (REDUC). O local do
rompimento, na parte interna da Baía de Guanabara, levou a contaminação às praias
9
adjacentes e colocou em risco a Área de Proteção Ambiental de Guapimirim, uma
das poucas regiões de manguezal ainda preservadas (Crapez et al., 2002; Freire e
Conti, 2000; Oliveira e Câmara, 2000).
Um outro acidente, também ocasionado por um rompimento de oleoduto,
envolveu o duto que transporta petróleo do terminal de São Francisco do Sul para
ser refinado na refinaria Presidente Getúlio Vargas, Araucária, Paraná. Esse
vazamento despejou 4,0 milhões de litros de óleo no rio Barigüi, afluente do rio
Iguaçu. O óleo ficou limitado a 50 quilômetros do local do acidente, causando
impacto nas regiões de mata ciliar e várzea, onde vivem lontras, capivaras e aves
(Oliveira e Maschio, 2000).
Tabela 3.1: Os maiores derrames de petróleo ocorridos a partir de 1967.
Nome e local Ano Causa Volume (10
6
litros)
1- Terminais e tanques no Golfo Pérsico 1991 Guerra 980
2- Poço Ixtoc-1, Golfo do México 1979 Blowout 600
3- Campo de Nowruz, Arábia Saudita 1980 Operações 350
4- Fergana Valley, Uzbekistão 1992 Operações 350
5- Castillo de Bellver, costa da África do Sul 1983 Incêndio 320
6- Amoco Cadiz, costa nordeste da França 1978 Encalhe 290
7- Atlantic Express, Trinidade e Tobago 1979 Colisão 200
8- Poço próximo a Trípoli, Líbia 1980 Operações 180
9- Irenes Serenade, Grécia 1980 Encalhe 160
10- Torrey Canyon, costa da Inglaterra 1967 Encalhe 150
11- Sea Star, costa de Omã 1972 Colisão 140
12- Tanques de reserva, Shuaybah, Kuwait 1981 Operações 130
13- U
10
Alguns fatores têm contribuído para o crescimento do número de derrames
de petróleo no mar nos últimos anos. Entre eles, os mais importantes estão
relacionados ao aumento da capacidade de transporte de navios tanque e a
descoberta de novos campos de petróleo em regiões marinhas (offshore).
As atividades de exploração e produção de petróleo em águas profundas
são um dos grandes desafios da indústria do petróleo mundial. Essas atividades
requerem o desenvolvimento de novas tecnologias envolvendo, principalmente, o
armazenamento e o escoamento da produção no mar. Os processos de transferência
do óleo de plataformas para navios tanque ou para oleodutos submarinhos devem
ser realizados sob cuidados especiais, pois estão sujeitos a condições climáticas
muito variáveis (Burger, 1997). Uma tendência mundial, que tem como objetivo
diminuir os riscos de derrames de petróleo nas operações de transferência entre
plataformas e navios tanque, é a utilização de navios com posicionamento dinâmico.
O posicionamento dinâmico é um sistema de motores responsáveis pela manutenção
da posição da embarcação, compensando os efeitos causados por ondas, ventos e
correntes marinhas.
No Brasil, a produção de petróleo na Bacia de Campos, região norte do
estado do Rio de Janeiro, é estratégica, representando mais de 80% da extração
nacional. Uma de suas características é ser executada totalmente em offshore,
através de 40 sistemas de produção distribuídos entre plataformas fixas, flutuantes e
navios adaptados do tipo FPSO’s (Floating, Production, Storage and Offloading).
Esses navios ou unidades flutuantes de produção, armazenamento e escoamento,
têm capacidade de armazenar mais de 1 milhão de barris de petróleo. O
escoamento da produção da Bacia de Campos, 1,5 milhões de barris/dia, é realizado
por oleodutos e por navios. Na figura 3.1 é apresentada a malha de 4.200 km de
oleodutos, responsável por transferir 20% do total de petróleo produzido pelas
plataformas da Petrobrás, sendo que a maior parte da produção é transportada por
navios tanque (Cadernos Petrobras, 2002).
Essas atividades expõem a região a um risco potencial de acidentes, com
vazamentos de óleo, possibilitando a contaminação de ambientes costeiros como
praias e manguezais. Esse tipo de catástrofe, além do dano ao meio ambiente, pode
vir a causar graves impactos na imagem das companhias produtoras de petróleo.
11
Figura 3.1: Representação esquemática da rede de oleodutos entre as plataformas da
Petrobras e os terminais em terra, na Bacia de Campos.
A Petrobras, ciente de suas responsabilidades com a manutenção do
equilíbrio do ecossistema marinho, criou o Programa Ambiental da Bacia de Campos
que inclui o Monitoramento Ambiental da Atividade de Produção de Petróleo na Bacia
de Campos. O CENPES em conjunto com as universidades fluminenses UFRJ, UERJ,
UFF, UENF, UniRio e PUC, realizaram a primeira etapa do trabalho: o pré-
monitoramento ambiental da Bacia de Campos, o qual procurou enfocar os cenários
mais críticos da atividade petrolífera existente na região. Nesse contexto, foram
selecionadas duas plataformas fixas de produção, que descartam água produzida no
mar e se encontram em operação há aproximadamente 15 anos. Elas estão
posicionadas a nordeste e sudeste da Bacia de Campos, no sentido preferencial da
Corrente do Brasil.
Nesse trabalho procurou-se identificar a existência de uma relação de causa e
efeito entre as eventuais alterações de variáveis biológicas, químicas e físicas, e as
atividades de produção das plataformas, visando a compreensão de seus efeitos, a
proposição de parâmetros para o monitoramento contínuo da região, e a adoção de
B
B
a
a
c
c
i
i
a
a
d
d
e
e
C
C
a
a
m
m
p
p
o
o
s
s
12
medidas mitigadoras quando necessárias. Para isso, foram analisadas amostras de
água do mar e de sedimentos marinhos no entorno das plataformas e pôde-se concluir
que o panorama encontrado para a região estudada, tanto no compartimento água
como no de sedimentos, é melhor que aqueles verificados para outras regiões
offshore de produção de petróleo, como a do Golfo do México e a do Mar do Norte
(Monitoramento Ambiental da Atividade de Produção de Petróleo na Bacia de
Campos, 2001).
Em conformidade com esses resultados encontra-se o trabalho realizado pelo
Grupo de Especialistas em Aspectos Científicos da Poluição Marinha,
GESAMP/UNESCO, em 1993 (apud Figueiredo, 1999), onde foi verificado que o
volume de petróleo e derivados que flui para os oceanos a cada ano, excetuando os
grandes acidentes, tem como fonte primária o descarte de efluentes domésticos e
industriais e as operações de transporte envolvendo navios tanque realizadas
próximas da costa, com uma contribuição muito pequena das operações de
exploração e produção
offshore
. Na tabela 3.2 é apresentado um levantamento,
realizado em 1993, do aporte anual de hidrocarbonetos do petróleo nos oceanos.
Atualmente, 12% de todo o petróleo que chega aos oceanos é proveniente de
fontes naturais, como exudações submarinhas. Nos oceanos, o petróleo que sobe
através da coluna de água chega até a superfície, sendo degradado por processos de
intemperismo como evaporação, biodegradação e fotoxidação.
Entretanto, os ecossistemas como um todo, não possuem o mesmo grau de
vulnerabilidade a mudanças ambientais drásticas. Alguns são extremamente
exigentes, enquanto outros se adaptam com mais facilidade, recuperando-se
rapidamente de distúrbios, como derrames de petróleo. Os efeitos da contaminação
irão depender do tipo de organismo, seu histórico com relação a exposições
anteriores e do estágio do ciclo de vida em que ele se encontra. Fatores como o
volume de óleo derramado, sua composição química e a época do ano em que
ocorre o acidente, podem ser determinantes na avaliação dos danos causados a um
ecossistema contaminado e do tempo que ele levará para se recuperar (Reis, 1996).
13
Tabela 3.2 : Aporte anual de hidrocarbonetos nos oceanos (10
6
ton/ano)
FONTE (1993)
FONTES NATURAIS 0,25
Exudação Submarina 0,20
Erosão de sedimentos continentais 0,05
FONTES ANTRÓPICAS 1,80
14
compostos evaporam rapidamente em função da temperatura ambiente (Burger,
1997; Lee e Page, 1997).
O impacto dos hidrocarbonetos na saúde humana depende do tipo e do
período de exposição. Na ingestão podem ocasionar irritação na boca, garganta e
estômago e ainda indisposição digestiva. Pequenas quantidades de hidrocarbonetos
podem entrar nos pulmões causando problemas respiratórios. O efeito da ingestão
crônica pode incluir danos aos rins e fígado (Reis, 1996). A exposição prolongada e
repetida a hidrocarbonetos aromáticos, como benzeno, pode levar à leucemia. O
metabolismo de hidrocarbonetos poliaromáticos (HPA) pode resultar na formação de
derivados mutagênicos ou carcinogênicos (Cerniglia, 1992).
As alterações de comportamento observadas pela exposição de peixes e
outros animais marinhos a hidrocarbonetos do petróleo, envolvem mudanças nas
atividades motoras, alimentação e reprodução, assim como na taxa de consumo de
oxigênio, refletindo negativamente no crescimento. O impacto mais comum, causado
sobre aves e mamíferos marinhos, é o descontrole da temperatura corporal como
resultado do contato do óleo sobre as penas e a pele, podendo levar o animal à
morte por hipotermia. O óleo também pode causar impacto sobre o zooplancton e o
fitoplancton, inibindo seu crescimento e a fotossíntese (Burger, 1994).
O efeito do descarte de petróleo sobre ecossistemas marinhos tropicais, como
praias e manguezais, tem despertado o interesse de vários pesquisadores. Os
manguezais são estuários de baixa energia, localizados em regiões tropicais e
subtropicais, representando um ecossistema de transição entre o ambiente terrestre
e o marinho (Ramsay et al. 2000; Kingston, 2002).
O sistema de raízes, característico da vegetação de manguezal, capta detritos
flutuantes e reduz o fluxo de maré, levando à sedimentação de partículas em
suspensão, resultando em sedimentos finos, ricos em matéria orgânica. São
ecossistemas altamente produtivos em termos de espécies de peixes e invertebrados
(Lacerda e Ittekkof, 1995). Quando o petróleo atinge o manguezal adere às raízes
das plantas e cobre o sedimento, obstruindo os tecidos especializados na troca de
gases e impedindo a oxigenação do sistema radicular. No caso dos animais, pode
gerar o congestionamento de brânquias, cílios filtradores e sifões de invertebrados
marinhos, levando à redução imediata de suas populações (Proffit et al., 1995).
15
3.1. Fundamentos teóricos da biorremediação
Biorremediação é uma técnica de despoluição de ambientes contaminados, que
se baseia na aceleração do processo natural de biodegradação de determinadas
16
patogenicidade e crescimento rápido no meio ambiente natural. Após o isolamento, os
microrganismos são bioaumentados em laboratório e estocados (Hoff, 1992; Baker e
Herson, 1994).
A manipulação genética de cepas de microrganismos, visando a oxidação de
hidrocarbonetos alifáticos, aromáticos, terpenóides e HPA, também tem sido
estudada, principalmente através da introdução de plasmídeos em bactérias do
gênero Pseudomonas (Nour, 1997). Existe muita controvérsia com relação à
introdução de microrganismos geneticamente alterados no meio ambiente, sendo
necessária uma avaliação criteriosa dos possíveis danos ambientais (Leahy e Colwell,
1990).
Outra forma de se conduzir a biorremediação é pela aceleração da reprodução
microbiana e de suas atividades metabólicas, técnica conhecida como
bioestimulação,
através da adição de oxigênio, água, micronutrientes na forma de
traços de metais e principalmente, da aplicação de compostos contendo nitrogênio e
fósforo ao ambiente contaminado (Hoff, 1993; King et al., 1997; Santas et al
.
, 1999).
Compostos de nitrogênio são essenciais na biossíntese de proteínas e ácidos
nucleicos pelos microrganismos. O fósforo é um componente vital dos ácidos
nucleicos, dos fosfolipídios que compõem as membranas celulares e também
desempenha um papel central no processo de transferência de energia dentro da
célula, através da molécula de adenosina trifosfato, ATP (Atlas, 1977; Rosenberg et
al., 1996).
O uso de nutrientes ricos em nitrogênio e fósforo, com o objetivo de acelerar ou
estimular a biodegradação de óleos em sedimentos de praia, é muito difundido. Isto
pode ser explicado pelo fato de que a concentração destes compostos, no ambiente
marinho, é reduzida, pois são rapidamente assimilados pela maioria dos
microrganismos (Pritchard e Costa, 1991; Pritchard et al.,1992; Bragg et al., 1994).
A biorremediação com a aplicação de nutrientes envolve uma variedade de
técnicas e produtos comerciais. Alguns dos nutrientes são desenvolvidos
especificamente para uso em derrames de petróleo e outros para uso na agricultura,
como os fertilizantes. Esses produtos comerciais podem ser agrupados em três
categorias: nutrientes inorgânicos solúveis em água, formulações oleofílicas e aquelas
chamadas de slow release, com solubilização lenta dos componentes.
17
Os nutrientes solúveis são representados por uma grande variedade de
fertilizantes agrícolas, como os do tipo NPK, misturas com diferentes proporções de
compostos contendo nitrogênio, fósforo e potássio, normalmente aplicados dissolvidos
em água, sobre sedimentos contaminados. As vantagens do uso desse tipo de
nutriente são a sua disponibilidade no mercado e o baixo custo. Entretanto, por serem
solúveis, são rapidamente lavados dos locais contaminados, necessitando de
repetidas aplicações, o que pode levar a um aumento da toxicidade sobre os
organismos da zona intermarés (Hoff, 1992; Prince, 1993; Atlas, 1995b).
As formulações oleofílicas foram desenvolvidas para solucionar o problema da
lavagem dos nutrientes solúveis, aplicados sobre rochas e sedimentos contaminados.
Esses produtos têm grande afinidade pelo óleo, aderindo às manchas e liberando os
nutrientes na interface óleo-água, região onde os microrganismos degradadores
conduzem a metabolização dos componentes do petróleo. Entretanto, o substrato
oleofílico compete com os hidrocarbonetos como fonte de carbono para os
microrganismos, retardando o processo de biodegradação do petróleo (Hoff, 1992;
Rosenberg et al., 1996; Santas et al., 1999a).
Nutrientes do tipo slow release liberam pequenas quantidades de compostos
durante um longo período de tempo, mantendo sua concentração controlada a níveis
não tóxicos. Eles são produzidos sob a forma de cápsulas solúveis, que se movem
com a subida da maré, ou como grânulos que se prendem às rochas e aos
sedimentos na zona intermarés (Hoff, 1992; Herrington et al., 1994; Oudot et al., 1998,
Oh et al., 2001). Esses produtos são eficientes, entretanto apresentam custos
elevados.
A utilização de melaço, um subproduto da indústria açucareira e bastante
abundante na região Norte Fluminense, contendo compostos de nitrogênio e fósforo,
tem sido proposta por alguns pesquisadores como uma alternativa ao uso de
fertilizantes (Al–Hadhrami,1996;1997). Uma grande vantagem do uso do melaço em
relação aos fertilizantes é que ele é mais barato, fácil de ser encontrado no mercado
e biodegradável.
A medida da eficiência de uma técnica de biorremediação envolve a avaliação
da ecotoxicidade do petróleo e dos produtos usados na biorremediação, como
18
também, a eficiência do processo de biodegradação em função da redução da
concentração dos componentes do óleo.
Um programa de monitoramento da técnica de biorremediação deve incluir:
1) Medida da eficiência da biorremediação em função das alterações químicas de
compostos como hidrocarbonetos, usando métodos cromatográficos. Os parâmetros
clássicos mais usados são: Empobrecimento dos n-alcanos e alterações significativas
nas concentrações de outros compostos, incluindo os isoprenóides pristano (P) e
fitano (F). Óleos levemente biodegradados apresentam uma diminuição nos valores
das razões n-C
17
/P e n-C
18
/F, quando comparados àqueles não biodegradados
(Winters e Willians, 1969 apud Peters e Moldowan, 1993).
Nos casos mais severos de biodegradação, os óleos são caracterizados pela
ausência do envelope de n-alcanos e pela presença de uma mistura complexa de
compostos que não puderam ser separados por cromatografia, chamada de UCM –
unresolved complex mixture
. Nesses casos, será necessário o uso de outro
parâmetro, como os 25-norhopanos, que incluem uma série de compostos
identificados em óleos biodegradados, como resultado da remoção microbiana de um
grupo metila de hopanos regulares (Reed, 1977, apud Peters e Moldowan, 1993).
2) Condução de testes para avaliar a ecotoxicidade do petróleo e dos agentes de
biorremediação sobre organismos aquáticos, através de bioensaios. Monitoramento de
possíveis impactos ambientais sobre ecossistemas marinhos através de análises
químicas de sedimentos e da água, para detectar a presença de compostos
potencialmente tóxicos, que podem vir a fazer parte do produto usado na
biorremediação ou de eventuais metabólitos da biodegradação.
3.2. Aplicação da técnica de biorremediação em derrames reais
O histórico do desenvolvimento das técnicas de biorremediação usadas na
limpeza de derrames acidentais de óleo, demonstra que uma nova tecnologia barata,
eficiente e ecologicamente correta, se estabelece através da interação dos segmentos
19
científicos, tecnológicos e das agências de controle ambiental. Este histórico pode ser
dividido em três períodos (Hoff, 1993):
Antes de 1989 - Período de pesquisas acadêmicas, sendo a biorremediação pouco
conhecida fora da comunidade de microbiologistas, embora algumas publicações
desta época já documentassem o processo de degradação microbiana do petróleo
(Zobell,1946; Colwell e Walker, 1977 apud Prince, 1993; Atlas, 1977; Dibble e Bartha,
1979).
• Em 1978, nas costas da Bretanha, França, ocorreu um derrame de
aproximadamente 290 milhões de litros de óleo no mar, causado pelo petroleiro
Amoco Cadiz. Após o acidente foram conduzidos estudos para descrever a
degradação do óleo no ambiente marinho, e os resultados encontrados estabeleceram
que a biodegradação era uma importante componente do processo conhecido como
intemperismo do óleo, onde fenômenos químicos, físicos e microbiológicos promoviam
alterações nos seus componentes e que a taxa de biodegradação variava em função
de parâmetros ambientais. Os pesquisadores também observaram que houve uma
fase de adaptação rápida dos microrganismos autóctones logo após o derrame, e que
ela estava relacionada às exposições freqüentes da microflora local à água de lastro
de navios tanque. As condições ambientais ao longo da costa também contribuíram
para acelerar o processo natural de biodegradação do petróleo. Entre estas condições
foram observadas a constante aeração causada pela ação das ondas e a lixiviação
com o arraste de fertilizantes agrícolas, contendo os nutrientes necessários ao
crescimento de microrganismos (Hoff, 1993; Atlas, 1995a).
• No derrame causado pelo blow out do poço exploratório Ixtoc-I, localizado sob
48 metros de lâmina d’água, em junho de 1979 na Baía de Campeche, Golfo do
México, foi estimado que durante os quatro primeiros meses a vazão de óleo
derramado no mar variou de 1.800.000 a 5.300.000 litros/dia, chegando a um total de
600 milhões de litros de óleo.
Como no caso do acidente com o Amoco Cadiz, esperava-se que a degradação
do óleo ocorresse de forma rápida, considerando que no Golfo do México a população
microbiana também está adaptada à presença de petróleo. Entretanto, grande parte
do óleo formou uma emulsão ("mousse de chocolate"), o que restringiu o acesso dos
20
microrganismos à parte interna da massa de petróleo emulsionada (Atlas, 1995b).
Para mitigar o impacto ambiental causado pelo acidente foram usados dispersantes
químicos e barreiras flutuantes, com o objetivo de evitar que a mancha de óleo
atingisse a costa. O óleo liberado em subsuperfície formou uma pluma de gotas
suspensas num intervalo de 10 - 20 metros da coluna de água, com a concentração
de hidrocarbonetos variando de 20 a 10.600
µ
g/l, próximo ao local do
blow out
.
Estudos mostraram que as propriedades físicas do óleo (tamanho das gotas e
densidade), e a estrutura das correntes marinhas controlaram a dispersão da pluma,
impedindo a dissipação mais rápida do óleo (Boehm e Fiest, 1982).
Durante a década de 80 as pesquisas sobre biorremediação continuaram
evoluindo, mas a técnica era usada somente no tratamento de solos contaminados por
óleos provenientes de vazamentos de tanques de reserva. Com o desenvolvimento da
biotecnologia, muitos agentes aceleradores da biodegradação, como nutrientes e
microrganismos específicos foram lançados no mercado, mas neste período não se
tem conhecimento da aplicação da técnica em derrames de óleo no mar (Hoff, 1993).
De 1989 – 1991 – Período em que a técnica de biorremediação recebeu grande
atenção, despertando muito interesse da classe acadêmica e do público em geral,
principalmente depois do acidente causado pelo petroleiro Exxon Valdez na baía de
Prince William, Alasca.
•
Em março de 1989, após o derrame de 40 milhões de litros de óleo do Exxon
Valdez, uma forte tempestade espalhou a mancha, fazendo com que a maior parte do
óleo ficasse retida nas praias das diversas ilhas existentes na baía, contaminando
mais de 500 km de costa (Pritchard e Costa, 1991). Durante as primeiras semanas
depois do acidente, um grande número de produtos e técnicas foram apresentados
com o objetivo de limpar os locais contaminados. Entre esses produtos estava uma
série de agentes de biorremediação. Um comitê foi estabelecido para desenvolver
protocolos de avaliação, selecionando os produtos e técnicas mais promissoras.
Esses protocolos foram usados como ponto de partida para os testes de
biorremediação, controlados pela Agência de Proteção Ambiental Americana (EPA).
Os resultados positivos alcançados pelos testes de campo formaram a base
para que a nova tecnologia passasse a ser usada em maior extensão na limpeza da
21
costa (Pritchard e Costa, 1991; Hoff, 1993). Estava claro, por estudos anteriores ao
acidente, que existiam microrganismos degradadores de hidrocarbonetos nas águas
da Baía de Prince William, tendo os esforços iniciais sido conduzidos na direção da
aplicação de nutrientes para estimular a biodegradação do óleo (Horowitz e Atlas,
1977; Pritchard et. al, 1992).
Em 1989, 1990 e 1991, dois tipos de fertilizantes foram aplicados nas praias da
baía:
Inipol EAP 22
, um fertilizante líquido oleofílico contendo surfactantes, ácido
oleico (como fonte de carbono) e uréia (fonte de nitrogênio), que aderiam aos
sedimentos contaminados com óleo; e o
Customblem
, um fertilizante granular
encapsulado em óleo vegetal, de solubilização lenta em água, composto por nitrato de
amônia, fosfato de cálcio, e fosfato de amônia (Prince et al., 1994).
Essas aplicações foram monitoradas com o objetivo de se verificar a eficiência
dos fertilizantes em reduzir a contaminação. No entanto, a diminuição do óleo residual
poderia estar ocorrendo em função de outros processos não biológicos. As mudanças
na composição química do óleo, indicativas de biodegradação, foram confirmadas por
cromatografia gasosa, através da diminuição das razões de n-C
17
/P e n-C
18
/F, por
serem os alcanos lineares biodegradados mais rapidamente que os alcanos
ramificados, ou iso-alcanos, pristano e fitano
(Pritchard e Costa, 1991; Bence et al.,
1996).
Após alguns meses da aplicação dos fertilizantes foi observado que até
mesmo os iso-alcanos foram degradados, sendo necessária a escolha de um
composto mais resistente como parâmetro de controle da biodegradação. Para o óleo
derramado na baía de Prince William foi escolhido como padrão interno, o C
30
17α (H),
21 β (H) - hopano (biomarcador do grupo dos triterpanos, alcano pentacíclico contendo
30 átomos de carbono), o qual permitiu a quantificação da biodegradação e mostrou
que a adição de nutrientes aos sedimentos contaminados com óleo, estimulou a
biodegradação parcial dos hidrocarbonetos alifáticos de elevado peso molecular e dos
policíclicos aromáticos (Prince et al., 1994; Bragg et al, 1994).
Em paralelo à aplicação dos fertilizantes foi conduzido um estudo pela EPA
com o objetivo de testar a eficiência de culturas de microrganismos específicos,
oferecidas pelo mercado, com o objetivo de biodegradar o óleo derramado na baía. Os
dois melhores produtos avaliados pelos testes em laboratório foram testados no
22
campo, mas não contribuíram para a aceleração do processo de biodegradação, e por
isso, não foram utilizados microrganismos exógenos, durante o processo de limpeza
do derrame causado pelo Exxon Valdez (Hoff, 1993; Atlas, 1995b).
Como parte do monitoramento da biorremediação foram conduzidos
bioensaios utilizando larvas de ostras e moluscos e amostras de água retiradas das
praias, após a aplicação dos fertilizantes Inipol e Customblen. Os resultados
mostraram uma toxicidade leve. Não foram realizados testes de toxicidade crônica,
assim como o de toxicidade direta do Inipol, sobre os organismos da zona intermarés.
Outra verificação conduzida pelos pesquisadores foi a de que o enriquecimento em
nutrientes das águas das praias biorremediadas, não levou ao crescimento excessivo
de algas (Pritchard e Costa, 1991; Hoff, 1992)
Através dos resultados provenientes do monitoramento das técnicas de
biorremediação, aplicadas no derrame ocorrido com o Exxon Valdez, chegou-se à
conclusão de que a biodegradação não podia ser medida ou avaliada em minutos ou
horas, mas somente num período de dias ou semanas. E que a aplicação da técnica
de biorremediação, com a adição de nutrientes, acelerou a degradação microbiana do
petróleo, mesmo considerando as frias temperaturas do Alasca, inclusive para os
óleos residuais encontrados nos sedimentos de subsuperfície das praias (Pritchard et
al. 1992; Bragg et al, 1994).
A utilização da biorremediação no derrame do Exxon Valdez catalisou o uso
desta técnica em outros acidentes. Durante 1990 quatro derrames de óleo ocorridos
nos Estados Unidos da América foram tratados por biorremediação: Prall's Island em
Nova Jersey, Mega Borg no Golfo do México, Apex Barges no Texas e Seal Beach na
California (Hoff,1993).
• O derrame produzido pelo rompimento de um oleoduto da refinaria de Exxon
Bayway em Linden, Nova Jersey, em janeiro de 1990, contaminou uma praia da Prall’s
Island. A maior parte do óleo foi removida por meios mecânicos, mas em março o
trabalho de limpeza foi interrompido devido à chegada de aves migratórias à ilha. A
seguir foi iniciado um experimento de biorremediação com o uso do fertilizante
Customblen. Foram abertas duas trincheiras rasas, uma como controle e outra com
fertilizante, na região intermarés. Como resultado foi verificada a biodegradação do
óleo em ambos os pontos, provavelmente em função da lixiviação dos nutrientes da
23
área fertilizada para a de controle e dos níveis elevados de microrganismos
degradadores presentes naturalmente nos sedimentos, em função de exposiçôes
crônicas da microflora ao petróleo (Hoff, 1992).
• Em junho de 1990 ocorreu uma explosão durante a transferência de óleo do
navio tanque Mega Borg, próximo a Galveston, Texas. O óleo foi derramado
continuamente durante os nove dias seguintes. A
Texas Water Commission
recebeu
autorização para aplicar sobre a mancha microrganismos produzidos especificamente
para biorremediação, cujo nome comercial é Alpha BioSea. Essa aplicação foi feita no
sexto e nono dias após a explosão e foram retiradas amostras de água na superfície e
em subsuperfície, de 1 a 9 metros de profundidade. Os resultados das análises
cromatográficas não foram conclusivos, pois mostraram uma grande variabilidade
entre as amostras coletadas, comprovando a dificuldade de se conseguir amostras
representativas em mar aberto (Hoff, 1992; Atlas, 1995a).
• Uma colisão entre o navio tanque Shnoussa e as barcaças Apex, em julho de
1990 na Baia de Galveston, Texas, derramou 2.650.000 litros de um óleo parcialmente
refinado. A mancha de óleo contaminou ambientes costeiros após uma semana do
início do derrame. A Texas Water Commission , novamente, foi autorizada a aplicar o
produto Alpha BioSea e uma mistura de nutrientes em um pântano contaminado.
Amostras de água e de sedimentos foram coletadas antes e depois do tratamento nos
tempos: 24, 48 e 96 horas. Todas as amostras foram analisadas pela EPA e as razões
indicadoras de biodegradação (n-C
17
/P e n-C
18
/F) dos óleos presentes nas amostras
tratadas e de controle, foram alteradas de maneira similar. Foram propostas três
hipóteses para explicar esses resultados. a) A Baía de Galveston é cronicamente
afetada por derrames de petróleo, possuindo, portanto, populações de microrganismos
já adaptadas ao processo de biodegradação. b) O curto período de monitoramento
pode não ter sido suficiente para a detecção de alterações referentes ao processo. c)
O óleo derramado já era parcialmente degradado, não sendo um bom candidato à
biorremediação (Hoff, 1992; Atlas, 1995a).
•
O blowout de um poço localizado em offshore de Seal Beach, California,
ocorrido em novembro de 1990, derramou 1.500 litros de óleo no mar, contaminando
os pântanos da Reserva Nacional de Vida Selvagem de Seal Beach. Foi conduzido
um tratamento de biorremediação com microrganismos produzidos para aplicação em
24
estações de tratamento de esgotos. Os microrganismos juntamente com um
fertilizante foram aplicados uma semana depois do derrame, e duas semanas mais
tarde foi feita outra aplicação, somente de fertilizante. As amostras coletadas foram
analisadas pela EPA, e os resultados novamente não foram promissores, indicando
que a população de microrganismos não foi capaz de acelerar a biodegradação do
óleo (Hoff, 1992).
• Em 1991, durante a Guerra do Golfo Árabe, estima–se que 980 milhões de
litros de óleo cru tenham sido introduzidos no golfo, poluindo aproximadamente 640
km de costa. A biorremediação foi um dos métodos sugeridos para a limpeza, mas
como esta metodologia ainda não tinha sido testada no meio ambiente natural do
Golfo Pérsico muitas questões técnicas, relacionadas a sua eficácia e a segurança
dos organismos marinhos, precisavam ser respondidas. Alguns testes utilizando
agentes de biorremediação, como microrganismos exógenos ao meio, foram
realizados em laboratório e na maioria dos casos os resultados não foram positivos
(Fayad et al., 1992).
Um estudo feito em laboratório sobre a biodegradação dos óleos derramados
durante a Guerra do Golfo, mostrou que alguns grupos de hidrocarbonetos
poliaromáticos (HPA), inclusive aqueles contendo enxofre, eram suscetíveis à
biodegradação. Outra observação interessante foi feita com relação à adição de
nutrientes, pois esses aceleravam a degradação dos n-alcanos, mas atrasavam a dos
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (Fayad e Overton, 1995). Apesar dos
resultados positivos, a biorremediação não foi usada em larga escala na limpeza dos
óleos derramados durante a guerra.
De 1992 – presente - Durante os anos iniciais de utilização da tecnologia de
biorremediação não havia um controle, por parte do governo norte americano, sobre
os produtos industrializados usados como agentes de biorremediação. Assim, a partir
de 1993 foram criados os primeiros protocolos de testes, desenvolvidos pela EPA,
para avaliar a eficiência de um determinado produto em degradar um óleo padrão, sua
toxicidade a organismos marinhos e conduzidos testes de campo em pequena escala.
Esses protocolos estão auxiliando os órgãos ambientais nas tomadas de decisões
25
sobre o melhor produto ou metodologia de biorremediação a ser aplicada em
derrames de óleo de ocorrência mais recente (Hoff, 1993).
• Em janeiro de 1997 aproximadamente 5 milhões de litros de óleo pesado foram
derramados no Mar do Japão. Esse acidente foi causado pelo naufrágio do navio
tanque russo Nakhodka, contaminando 1.200 km de costa. Com o objetivo de
biorremediar as regiões costeiras foram conduzidos experimentos utilizando culturas
comerciais de microrganismos, cuja marca registrada é TerraZyme, produzidos pela
Oppenheimer Biotechnology, Inc. Os resultados dos testes in vitro demonstraram que
os microrganismos contribuíram para biodegradação de 35% do óleo, com destaque
para a fração de asfaltenos, que teve sua concentração reduzida de 18% para 5%
(Hozumi et al., 2000). Antes da cultura comercial de microrganismos ser usada para
26
3.3. Estudos sobre a aplicação da técnica de biorremediação no
Brasil
No Brasil, as pesquisas sobre as diversas aplicações da técnica de
biorremediação de locais contaminados por petróleo e derivados, vêm sendo
desenvolvidas por universidades, isoladamente ou em conjunto com a Petrobras.
•
O Programa de Pós-Graduação em Biologia Marinha, da Universidade Federal
Fluminense, é pioneiro na identificação e no isolamento de bactérias
hidrocarbonoclásticas, presentes nas águas e nos sedimentos das baías da Ilha
Grande e da Guanabara, no estado do Rio de Janeiro. As baías são ambientes que
estão sob constantes ameaças de acidentes com derrame de petróleo porque, além
da intensa movimentação de embarcações em seu interior, em geral apresentam no
seu entorno grande densidade demográfica e a concentração de portos e indústrias
(Crapez et al., 2000a apud Crapez et al., 2002).
Esses pesquisadores também são responsáveis por pesquisas sobre as
respostas da microbiota das praias da Boa Viagem, do Forte do Rio Branco e da área
da Estação Hidroviária de Niterói (RJ), aos efeitos agudos e crônicos da exposição a
hidrocarbonetos aromáticos do petróleo. Os resultados revelaram que aumentando a
freqüência de entrada de benzeno, tolueno e xileno no sistema, as bactérias tornam-
se capazes de degradar quantidades crescentes desses poluentes (Crapez et al.,
2000b).
• Outras linhas de pesquisa, associadas à biorremediação e à biodegradação de
petróleo, derivados e seus resíduos, estão sendo conduzidas no Curso de Pós-
graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de Química
da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Entre essas pesquisas encontra-se a de Cunha e Leite (1997) que teve como
objetivo a otimização de condições ambientais para acelerar o processo de
biodegradação de gasolina em microcosmos constituídos de solos bioaumentados
com Pseudomonas putida (ATCC 12633), obtida de uma coleção de cepas. A
otimização dessas condições envolveu a aplicação, nos microcosmos contaminados,
de diferentes concentrações de duas fontes de nitrogênio - nitrato de amônia e sulfato
de amônia, uma de fósforo - fosfato de potássio, e uma fonte de oxigênio - peróxido de
27
hidrogênio. A degradação da gasolina foi avaliada pela medida de componentes como:
tolueno, etilbenzeno, n-nonano e n-tridecano, por cromatografia em fase gasosa. As
melhores taxas de degradação desses componentes foram alcançadas nos
experimentos em que se utilizaram nitrato de amônio e peróxido de hidrogênio, nas
concentrações de 30 µmol/g de solo e 0,1 mM, respectivamente. A aplicação de
fosfato de potássio não gerou resultados significativos, provavelmente devido à pré -
existência de uma concentração ótima desse componente no solo.
Dando continuidade à essa linha de pesquisa, Cunha e Leite (2000) publicaram
os resultados de seu trabalho, que objetivava o isolamento de microrganismos
autóctones capazes de crescer em solo contaminado por gasolina. Além disso, foram
conduzidos vários sistemas de biorremediação de solo contaminado, através do
consórcio desses microrganismos com as bactérias: Pseudomonas putida (ATCC
12633), Burkholderia cepacia, Pseudomonas alcaligenes e Klebsiella pneumoniae,
previamente isoladas de solos contaminados por gasolina. O sistema de tratamento
constituído somente pela microflora autóctone apresentou valores médios de
biodegradação de 50%. E aquele que associou as bactérias P. putida, P. alcaligenes,
e Burkholderia cepacia com a microflora autóctone mostrou reduções significativas na
concentração de n-undecano (88,7%), n-dodecano (61,3%), e n-tridecano (66,7%).
Ambos os sistemas se revelaram de potencial aplicação na biorremediação de solos
contaminados por gasolina.
Em 1998, Ururahy apresentou o resultado de sua pesquisa sobre a
biodegradação de resíduo oleoso, proveniente de refinaria de petróleo. Nesse trabalho
foram conduzidos experimentos em que foi utilizado um biorreator mecanicamente
aerado e agitado e um consórcio microbiano contendo bactérias e leveduras, isolados
do próprio resíduo e bioenriquecido ao longo do processo. Os resultados, após 42
dias, demonstraram um consumo de 68% de óleos e graxas, 97% de n-parafinas e
76% de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos.
O trabalho de Borges (2001) teve como objetivo principal o tratamento de um
solo argiloso contaminado por petróleo e água produzida, provenientes de vazamentos
ocorridos em tubulações deterioradas pelo tempo. Para isso foram caracterizados o
solo e as águas superficiais, e avaliados os processos de biodegradação aeróbica dos
contaminantes sob diferentes condições: variação da taxa de aeração, do teor da fonte
28
de nitrogênio e do percentual de areia. Sob condições anaeróbicas: variação do teor
da fonte de nitrogênio, da concentração dos aceptores finais de elétrons (nitrato e
sulfato), do percentual de areia e do tempo. Os melhores resultados estatísticos foram
obtidos dos ensaios aeróbicos, nos quais foram usados os níveis mais elevados das
variáveis citadas anteriormente. A porcentagem de remoção de óleos e graxas foi de
88%. Nos ensaios anaeróbicos as melhores condições também apontaram para os
níveis mais elevados de concentração dos produtos usados, e do maior intervalo de
tempo, com remoção de 64,5% de óleos e graxas.
Já as pesquisas de Oliveira (2001) objetivaram a biorremediação de um solo
arenoso proveniente da Baía de Guanabara, RJ, contaminado com petróleo árabe
(leve). As variáveis do processo incluíram a adição de um consórcio misto de
microrganismos, adição de fertilizante tipo NPK ou meio mineral definido e a correção
ou não do pH do solo a 7,0. Os melhores resultados com a remoção de 100% dos n-
alcanos compreendidos entre o decano e o eicosano e 40% de hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos, foram obtidos com o uso da combinação de cultura mista +
fertilizante, na proporção de C:N de 100:10.
• No Curso de Pós Graduação do Laboratório de Engenharia e Exploração de
Petróleo, da Universidade Estadual do Norte Fluminense, também estão sendo
desenvolvidas pesquisas, juntamente com a Petrobras, CENPES (Gerências de
Geoquímica e de Biotecnologia e Tratamentos Ambientais) e Unidade de Negócios da
Bacia de Campos (Laboratório de Fluidos) e a Universidade Federal do Estado do Rio
de Janeiro, Escola de Química, sobre a aplicação de técnicas de biorremediação de
derrames de petróleo em ambientes marinhos tropicais.
Rosa (2001) simulou, em laboratório, o derrame de petróleo em sedimentos
costeiros com o objetivo de testar a eficiência da técnica de biorremediação, com a
aplicação de nutrientes como fosfato de amônio e fertilizante do tipo NPK. Os
resultados das análises geoquímicas realizadas nas amostras de óleo biodegradado,
ao final de 30 dias de tratamento, revelaram a remoção completa dos n-alcanos e a
degradação parcial dos isoprenóides, especialmente naquelas amostras coletadas a 5
cm da superfície, quando comparadas àquelas coletadas em superfície. Com relação
ao comportamento dos compostos biomarcadores hopanos e esteranos e dos
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, naftaleno, fluoreno e dibenzotiofeno, não
29
foram observadas alterações composicionais típicas do processo de biodegradação.
No entanto, os resultados obtidos para os hidrocarbonetos alifáticos sinalizam de
maneira positiva, para a continuidade dos estudos da aplicação da técnica de
biorremediação em ambientes costeiros tropicais, como os desenvolvidos na presente
tese.
• A refinaria Presidente Getúlio Vargas – REPAR/Petrobras, em conjunto com a
Universidade Federal do Paraná, desenvolveu microrganismos especializados para
biorremediação de solos contaminados, com utilização tanto em áreas industriais
como em áreas urbanas. O produto é constituído por microrganismos
acondicionados em meio argiloso, sob baixos teores de umidade, o que facilita seu
manuseio e aplicação. Eles podem ser usados também em landfarmings, contendo
resíduos de refinaria, no tratamento de resíduos oleosos de atividades petrolíferas e
petroquímicas, ou em solos contaminados por derivados de petróleo em geral, como
os de postos de gasolina. Esses microrganismos foram usados na recuperação de
solos contaminados pelo derrame de petróleo resultante do rompimento de um
oleoduto da REPAR, ocorrido em 16 de julho de 2000 no rio Barigüi, afluente do rio
Iguaçu. Os estudo de remediação e caracterização do solo contaminado foram
desenvolvidos pelas equipes do Instituto para o Desenvolvimento do Meio Ambiente
ANTROPOSPHERA e o convênio firmado entre a PETROBRAS e a FUNPAR,
denominado: Meio Ambiente e Tecnologia de Resíduos.
A área atingida pelo derrame foi de 129.450 m
2
, desse total 58.000 m
2
foram
classificados como contendo alto nível de contaminação (acima de 30.000 mg de
Hidrocarbonetos Totais de Petróleo por quilograma de solo), 70.050 m
2
nível médio
de contaminação (de 10.000 a 30.000 mg/kg) e 1.400 m
2
como nível baixo de
contaminação (concentrações de hidrocarbonetos totais menores que 10.000 mg/kg)
(Carvalho et al., 2001).
Para avaliação da biodegradabilidade do óleo derramado no solo foram
executados experimentos de laboratório com a finalidade de se obter resultados
sobre a toxicidade e sobre a eficiência dos microrganismos degradadores presentes
no sistema de landfarming da REPAR. Em função dos resultados positivos, foi
realizada a inoculação, com os microrganismos da REPAR, de uma área piloto de
700 m
2
(subárea 1) classificada, por Carvalho et al. (2001) como nível médio de
30
contaminação. A eficiência da biorremediação foi medida por respirometria, isto é, a
quantidade em miligramas de CO
2
produzida pelo metabolismo aeróbico dos
microrganismos presentes em 100 gramas de solo ao longo de 1 dia. Os resultados
mostraram um aumento de 10 vezes quando comparados a uma amostra de solo
não tratada. A eficiência também foi avaliada pelo decréscimo da concentração dos
hidrocarbonetos totais do petróleo, medido por gravimetria, fornecendo uma taxa de
biodegradação de 84,7%, ao final de 1 mês. Esses resultados confirmaram a elevada
eficiência dos microrganismos produzidos pela REPAR em degradar o petróleo
presente na subárea 1, sendo seu uso expandido para as outras 11 subáreas
afetadas, com o objetivo de acelerar o processo de biodegradação e a devolução
dessas áreas ao meio ambiente, diminuindo assim os impactos decorrentes da
permanência de contaminantes nas regiões de floresta e banhado, atingidas pelo
derrame (Carvalho et al.
,
2001).
31
4. Biorremediação do petróleo no meio ambiente
O entendimento dos processos de biodegradação do petróleo é de grande
importância sob o aspecto da aplicação da técnica de biorremediação em ambientes
contaminados por derrames de óleo e derivados. A composição química dos
diferentes tipos de petróleo, provenientes de diversas regiões produtoras, o grande
número de produtos refinados e ainda a ação de processos de intemperismo, são
variáveis importantes a serem avaliadas no processo de biodegradação dos
componentes do óleo no meio ambiente natural.
O conhecimento das interações bióticas entre os diversos grupos de
microrganismos capazes de degradar o petróleo, dos fatores abióticos ou ambientais
propícios à condução do processo de biodegradação no ambiente contaminado e
dos principais caminhos metabólicos usados pelos microrganismos, é fundamental
para o desenvolvimento de técnicas de biorremediação eficientes na
descontaminação de locais atingidos por derrames de petróleo.
4.1. Fatores químicos e físicos
O comportamento de óleos derramados nos mais diversos ecossistemas, e
principalmente no mar, depende da composição química do petróleo e da atuação de
processos como evaporação, emulsificação, dissolução, biodegradação, foto-
oxidação e das interações entre óleo, sedimentos e água. A combinação destes
processos é conhecida como intemperismo, o qual reduz a concentração de
diferentes grupos de compostos, modificando as características químicas e físicas do
petróleo (Jordan e Payne, 1980, apud Wang e Fingas, 1994).
O petróleo é constituído por centenas de compostos, muitos deles com
diferentes propriedades e características. Eles podem ser agrupados em função
dessas características, resultando em quatro classes principais: saturados,
aromáticos, resinas e asfaltenos. Os compostos saturados são predominantes na
maioria dos óleos, e são os mais suscetíveis à evaporação, biodegradação e à
dispersão. Os compostos aromáticos de baixo peso molecular são parcialmente
32
solúveis em água, mas evaporam rapidamente após um derrame, enquanto os
aromáticos de elevado peso molecular não apresentam o mesmo comportamento.
As resinas e os asfaltenos possuem propriedades similares, sendo ambos os grupos
estáveis aos processos de evaporação, dispersão e biodegradação (Fingas, 1998a).
4.1.1. Composição química do petróleo
O petróleo pode ser definido como etC155m gse3.21801( e)1( b)-82.611-1(e)1(b(()-1(F)4(6(r)-6(o[(d)1(e)1)1(d)1(a)1(m)-5(5(o)1( )1( e)1(v7(c)-4(o)6((u)-1)6( )-300.821(s)-4( )]TJ-298.9m343)1(o)tu(d)1(e)1a )Tj0 07(tC155m)-1( )-s)1(o)1(x1(p)1(rj0 02)6(o)1( )-87(02)h)5( )-303(r)-82( )T-6(o[(d))-82(d)1(o)1n.16 TD[(o)1( )-41(a(02)s6(o[(d)tu(d)1(e(o)1(d)1(e(o)1( )-41(a(02)1( )-87(02)a3(r)-82( 4( )-34.67401( e)1( b6 Td[(a)r)-6( 6)1(i)6(d3)1(o).-87797919-24(d)11(o[(a)1(p)1(o7979)1(e(o)1( )-1)6( )-334.67401(-4( )]TJ-28hd)1 )-303(r)-82( )T-6)-169(e)-82(d)1(o)1n.16 T6b)-82.611-)1(l)1(a)1(r22.611- )-8))-82( )T( )-41(a22.tC155m)-1)1( )-6( )T( )-4t)6(c)-4(e)1311(s)1(z.16 TDm1(a)1(r22.p6(o[(d))-82t)6(p)1(ie)1311)-1(i)1(e)-1(e)1(s)-4( )3.134tam
33
Hidrocarbonetos
Hidrocarbonetos são grupos de compostos que apresentam apenas átomos
de carbono e hidrogênio em suas moléculas. A composição do petróleo em termos
de hidrocarbonetos é expressa em função da presença de: Compostos alifáticos, isto
é, aqueles que contêm ligações simples e formam cadeias lineares como nos n-
alcanos ou parafinas; ou cadeias ramificadas; e ainda os alcenos ou olefinas com
uma ou mais ligações duplas entre os átomos de carbono; Compostos cicloalifáticos
ou alicíclicos como os cicloalcanos e compostos aromáticos e cicloalcanoaromáticos.
A distribuição média dos principais grupos de hidrocarbonetos nos diferentes óleos já
analisados é bastante similar e isto pode ser confirmado em função dos resultados
analíticos obtidos do levantamento de 517 amostras de óleo, realizado pelo Instituto
Francês do Petróleo. Uma parte destes resultados é apresentada na tabela 4.1
(Tissot e Welte, 1984; Hunt, 1995).
Tabela 4.1: Composição média de hidrocarbonetos no petróleo (Tissot e Welte,
1984).
Grupos de hidrocarbonetos Valores médios nos óleos
(% em peso)
Alcanos normais (n) e ramificados
33,6
cicloalcanos 31,9
aromáticos 34,5
Os hidrocarbonetos alifáticos englobam substâncias gasosas, líquidas e
sólidas, sendo que o estado líquido prevalece em compostos de até vinte átomos de
carbono, considerando as condições normais de temperatura e pressão. Outra
característica de extrema importância sob o aspecto da biodegradação desses
compostos é serem todos hidrofóbicos.
34
a) Alcanos normais
São hidrocarbonetos de cadeia aberta e sem ramificações, que apresentam
somente ligações simples (saturados) entre seus átomos, como pode ser observado
na figura 4.2. Sua fórmula geral é: C
n
H
2n+2
. Todos os componentes da série
homóloga de alcanos normais (n-alcanos), contendo de 1 a 40 átomos de carbono
(C
1
a C
40
), podem ser identificados no petróleo. As concentrações deste grupo de
compostos variam de 15 a 20%, podendo ser bem mais baixa em óleos degradados,
ou elevada (35%) nos óleos leves (Hunt, 1995).
Figura 4.2: Exemplos de n-alcanos (Tissot e Welte, 1984).
b) Alcanos ramificados
São hidrocarbonetos de cadeia aberta com ramificações, apresentam somente
ligações simples (saturadas) entre seus átomos, sua fórmula geral é: C
n
H
2n+2
. A
maior concentração individual de alcanos ramificados no petróleo é encontrada na
forma de 2 metil ou 3 metil – hexano e/ou – heptano, podendo chegar a 1% no óleo
cru (Tissot e Welte, 1984; Hunt, 1995).
Os alcanos ramificados de médio peso molecular (C
9
a C
25
) são conhecidos
como isoprenóides, isto é, compostos saturados derivados do isopreno. Eles
possuem um radical metila ligado a cada 4 átomos de carbono da cadeia linear e têm
como precursores biológicos a cadeia lateral da molécula da clorofila e
arqueobactérias (Treibs, 1936 apud Peters e Moldowan, 1993).
Os isoprenóides mais abundantes no petróleo são o pristano (2, 6, 10, 14
tetrametil pentadecano – C
19
) e o fitano (2, 6, 10, 14 tetrametil hexadecano – C
20
),
n-C
6
H
14
n-C
27
H
56
ou
35
pois juntos somam mais que 55% de todos os isoprenóides acíclicos (Tissot e Welte,
1984; Hunt, 1995). Na figura 4.3 são apresentados alguns exemplos de alcanos
ramificados.
Figura 4.3
: Exemplos de alcanos ramificados (Tissot e Welte, 1984).
c) Alcenos
Alcenos são hidrocarbonetos de cadeia aberta, insaturados, isto é, com uma
ou mais ligações duplas (C = C), sua fórmula geral é: C
n
H
2n.
São instáveis e
conseqüentemente raros em óleos crus, podendo ocorrer em quantidades muito
pequenas como n-hexeno e n-hepteno (Tissot e Welte, 1984).
d) Cicloalcanos (naftenos)
Cicloalcanos são hidrocarbonetos saturados de cadeia fechada ou cíclica, e sua
fórmula geral é: C
n
H
2n.
Compostos como ciclopentano, ciclohexano e seus derivados
metilados de baixo peso molecular, isto é, contendo menos que 10 átomos de
carbono são importantes constituintes do petróleo, sendo o metilciclohexano o mais
iso
ante iso
isoprenóide
2, 2, 4 trimetil
pentano
2 metil, 3 etil
heptano
ou
ou
2,6,10,14 tetrametil
hexadecano
Fitano (C
20
H
42
)
36
abundante chegando a 2,4% em alguns óleos. Os compostos denominados como
mono e dicicloalcanos compõem aproximadamente 50% do total dos cicloalcanos
que contêm mais de 10 átomos de carbono. Estes cicloalcanos possuem
normalmente ramificações alquilas de diferentes números de carbono (Tissot e
Welte, 1984; Hunt, 1995).
Cicloalcanos de médio a elevado peso molecular (C
10
a C
35
) são produzidos
pelo arranjo de 1 a 6 ciclos, nesta classificação encontram-se duas categorias de
compostos: os esteranos (tetracíclicos) e os hopanos (pentacíclicos), constituídos de
anéis condensados de 5 e 6 átomos de carbono e múltiplas ramificações alquilas,
importantes como marcadores biológicos (Peters e Moldowan, 1993). Algumas
estruturas de cicloalcanos são apresentadas na figura 4.4.
Figura 4.4: Exemplos de cicloalcanos (Tissot e Welte, 1984).
Mono-
cicloalcano
dicicloalcano
policicloalcanos
ou
ou
C
6
H
12
ciclohexano
C
10
H
18
- decalina
C
10
H
16
- adamantano
C
27
H
48
- colestano
C
30
H
52
- gamacerano
37
e) Aromáticos
Hidrocarbonetos aromáticos são aqueles que possuem pelo menos um anel
benzênico em sua molécula. No benzeno, C
6
H
6
38
f) Cicloalcanoaromático (naftenoaromático)
Estes compostos, normalmente, são os constituintes da fração dos
hidrocarbonetos do petróleo de maior ponto de ebulição. Possuem um ou mais anéis
aromáticos fundidos com cicloalcanos, e ramificados por cadeias de radicais alquilas
(Fig. 4.6). As estruturas de maior ocorrência variam de 2 a 5 anéis, incluindo a parte
aromática e a naftênica (Tissot e Welte, 1984; Hunt, 1995).
Figura 4.6: Exemplos de compostos naftenoaromáticos (Tissot e Welte, 1984).
Compostos biomarcadores
O petróleo é o resultado de uma série de transformações biológicas, físicas e
químicas sofrida pela matéria orgânica e conhecidas como: diagênese, catagênese e
metagênese. Na diagênese os biopolímeros, lipídeos, proteínas e carbohidratos que
compõem a matéria orgânica são transformados em querogênio. Inicialmente,
proteínas e carbohidratos são degradados por microrganismos gerando aminoácidos
e açúcares, que juntamente com os lipídeos sofrem reações químicas de
policondensação e polimerização formando compostos como ácidos fúlvicos e
húmicos. Durante o progressivo soterramento dos sedimentos há um aumento das
reações de condensação e a perda de alguns grupos funcionais, e a transformação
dos ácidos fúlvicos e húmicos em querogênio. Algumas moléculas de
hidrocarbonetos derivadas dos lipídeos podem ser aprisionadas nos sedimentos,
juntamente com o querogênio, sendo posteriormente liberadas e caracterizadas como
C
10
H
12
tetralina
C
16
H
14
– dimetil
ciclohexano
isopropil naftaleno
C
18
H
16
– metil
ciclopentano
fenantreno
C
25
H
24
– dimetil
ciclohexano
metil
benzofenantreno
39
a primeira fonte de hidrocarbonetos para formação do petróleo. A próxima etapa de
transformação é a catagênese, na qual ocorre um aumento de temperatura e
pressão devido ao progressivo soterramento da matéria orgânica e dos sedimentos.
Nesta etapa, a degradação termal do querogênio é responsável pela geração da
maioria dos hidrocarbonetos que irão compor o petróleo.
Metagênese
é a última
etapa de evolução da matéria orgânica e só é alcançada a grandes profundidades, na
presença de elevadas temperaturas e pressões. Neste estágio o querogênio e os
hidrocarbonetos são craqueados, principalmente em metano e em resíduo de
carbono (Tissot e Welte, 1984).
Durante a diagênese e a catagênese algumas moléculas específicas dos
precursores biológicos do petróleo, apesar de terem participado de reações químicas,
mantiveram íntegras suas estruturas básicas. Esses compostos orgânicos são
conhecidos como marcadores biológicos ou biomarcadores (Eglinton et al., 1964;
Eglinton e Calvin, 1967 apud Peters e Moldowan, 1993). Sua origem pode estar
relacionada a organismos como: bactérias (arqueobactérias, cianobactérias, etc);
algas (diatomáceas e dinoflagelados); plantas terrestres (angiospermas e
gimnospermas) e animais invertebrados (Tissot e Welte, 1984).
Os precursores dos biomarcadores, conhecidos como terpenóides ou
isoprenóides (Nes e Mc Kean, 1977 apud Peters e Moldowan, 1993), foram
inicialmente biossintetizados por microrganismos e plantas, a partir da polimerização
de subunidades de isopreno (metil butadieno). Os compostos complexos resultantes
desta polimerização desempenham funções específicas nos organismos vivos, como
o bacteriohopanetetrol, componente da membrana celular de procariontes como
bactérias e cianobactérias (Rohmer, 1987 apud Peters e Moldowan, 1993); o
colesterol, componente da membrana celular de organismos eucariontes (Mackenzie
et al., 1982 apud Peters e Moldowan, 1993); e a clorofila, pigmento responsável pela
fixação fotossintética de carbono por plantas e certos tipos de bactérias (Baker e
Louda, 1986 apud Peters e Moldowan, 1993).
Os compostos biomarcadores são divididos em famílias, em função do número
aproximado de subunidades de isopreno que contém. As várias famílias são
compostas por estruturas acíclicas e cíclicas. Alguns exemplos de biomarcadores
pertencentes a essas categorias podem ser observados nas figuras 4.7 e 4.8. Os
40
hemiterpanos (C
5
), monoterpanos (C
10
), sesquiterpanos (C
15
), diterpanos (C
20
) e os
sesterpanos (C
25
), contêm respectivamente, 1, 2, 3, 4 e 5 unidades de isopreno. Os
triterpanos (hopanos) e esteranos (C
30
) diferem na estrutura, mas ambos são
derivados de seis unidades de isopreno, enquanto tetraterpanos (C
40
) contêm 8
unidades. Os que têm 9 ou mais unidades são os politerpanos (Devon e Scott, 1972
e Simoneit, 1986 apud Peters e Moldowan, 1993).
Os biomarcadores são utilizados na caracterização da qualidade da matéria
orgânica presente na rocha geradora, das condições de paleoambiente deposicional,
e da paleotemperatura em que um determinado tipo de petróleo foi gerado,
fornecendo informações importantes sobre correlações óleo X rocha geradora e óleo
X óleo (Seifert e Moldowan, 1980 apud Peters e Moldowan, 1993; Mackenzie, 1984;
Tissot e Welte, 1984; Philp, 1985, Petrov, 1987apud Peters e Moldowan, 1993).
Os biomarcadores também são usados no estudo dos parâmetros envolvidos
nos processos de migração e de preenchimento de reservatórios de petróleo (Seifert,
1977 e 1978
apud
Peters e Moldowan, 1993; Seifert e Moldowan, 1978
apud
Peters
e Moldowan, 1993; Seifert et al., 1984 apud Peters e Moldowan, 1993).
Além de possuírem razoável resistência térmica os compostos biomarcadores
são também resistentes à degradação microbiana, servindo como parâmetro de
avaliação do nível de biodegradação dos componentes de um óleo presente num
reservatório (Restle, 1983; Connan, 1984; Wardroper et al., 1984; Peters, 2000), ou
derramado no meio ambiente natural (Chosson et al., 1991; Wang e Fingas, 1994a;
Prince et al., 1994b; Douglas et al., 1994; Roques et al., 1994; Moldowan et al.,
1995). Uma outra aplicação mais recente está relacionada à responsabilidade legal
por derrames de petróleo e derivados no meio ambiente, através da identificação do
perfil de biomarcadores presente no óleo derramado, característico para cada tipo de
óleo, e da sua comparação com o perfil de biomarcadores do óleo proveniente da
suposta fonte poluidora (Wang e Fingas, 1995
a e b; Wang et al. 1996; Wang e
Fingas, 1998b; Barbanti et al., 1998; Wang et al., 1998c, 1999, 2001a).
41
Figura 4.7
: Exemplos de classes de biomarcadores acíclicos presentes no petróleo
(modificado de Peters e Moldowan, 1993).
42
Figura 4.8: Exemplos de classes de biomarcadores cíclicos presentes no petróleo
(modificado de Peters e Moldowan, 1993).
43
Dentre os terpenóides cíclicos encontram-se os hopanos e os esteranos. Os
hopanos com mais de 30 átomos de carbono são chamados de homohopanos, o
prefixo homo se refere a adição de grupos CH
2
à cadeia lateral ligada ao carbono 21
da molécula do hopano. Os homohopanos apresentam, normalmente, cadeias
laterais longas contendo um átomo de carbono assimétrico na posição 22, gerando a
série de homohopanos C
31
, C
32
, C
33
, C
34
, C
35
com seus respectivos epímeros 22R e
22S (Peters e Moldowan, 1993).
Os hopanos são compostos por três séries estereoisômeras, conhecidas por:
17β(H), 21β(H) – hopanos, 17β(H), 21α(H) – hopanos, 17α(H), 21β(H) – hopanos.
Compostos da série βα são também chamados de moretanos. A notação α e β indica
a posição do átomo de hidrogênio, ligado ao carbono 17 ou 21 do ciclo, em relação
ao plano que contem os ciclos, acima (α) ou abaixo (β). Hopanos com a configuração
17α(H), 21β(H) variando de 27 a 35 átomos de carbono são característicos do
petróleo devido à sua grande estabilidade termodinâmica, quando comparados com
as outras séries epiméricas (
ββ
e
βα).
A série
ββ
(22R), conhecida como
configuração biológica, geralmente não é encontrada no petróleo em função de sua
instabilidade térmica (Bauer et al., 1983, apud Peters e Maldowan, 1993).
Os esteranos são hidrocarbonetos da classe dos triterpanos tetracíclicos,
Aqueles que possuem 27 átomos de carbono são chamados de colestanos, 28
átomos de carbono de ergostanos, e com 29 átomos de estigmastano (figura 4.8).
Entre os precursores naturais dos esteranos, os mais abundantes são o colesterol
presente em animais e algas planctônicas,
β
-sitosterol e estigmasterol em vegetais
superiores e o ergosterol em fungos (Chosson et al., 1991). Durante a diagênese os
esteróis são convertidos à esteranos mantendo a configuração tridimensional
biológica
ααα 20
R (5
α
(H), 14
α
(H), 17
α
(H), 20R) de seus precursores. A
temperaturas de soterramento mais elevadas é gerada uma série adicional de
esteranos, termodinamicamente mais estável, αββ (5α (H), 14β (H), 17β (H)).
Simultaneamente, ocorre uma isomerização na cadeia lateral de algumas moléculas,
levando a uma mistura de epímeros, o biológico 20R e o geológico 20S, gerando as
séries
ααα 20
R,
ααα 20
S,
αββ
20 R
e
αββ
20S dos esteranos C
27
, C
28
e C
29
(Seifert e
Moldowan, 1979 apud Chosson et al., 1991; Peters e Moldowan, 1993). Na figura 4.9
44
são apresentadas as estruturas básicas de esteranos e de hopanos com seus
respectivos sistemas de numeração.
Figura 4.9: Fórmulas estruturais de esteranos e hopanos (Peters e Moldowan, 1993).
Compostos contendo: nitrogênio, enxofre e oxigênio
Os compostos do petróleo, cujo esqueleto básico da molécula é o de um
hidrocarboneto, mas que contêm heteroátomos como: nitrogênio, enxofre e oxigênio
são conhecidos como a fração de não - hidrocarbonetos. Dentre esses compostos,
aqueles contendo enxofre, com moléculas cujo número de átomos de carbono é
inferior a 25, pertencem a três classes principais: Tióis (mercaptans), Sulfetos
orgânicos, Tiofeno e seus derivados (figura 4.10).
Nas frações de elevado peso molecular o enxofre aparece incorporado às
moléculas de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, fazendo parte da fração mais
polar do petróleo, a de compostos NSO. O enxofre é o terceiro átomo mais
abundante no petróleo e sua concentração média é de 0,6% (Tissot e Welte, 1984;
Hunt, 1995).
45
Figura 4.10: Exemplos de compostos contendo enxofre (Tissot e Welte, 1984).
A concentração de compostos contendo nitrogênio no petróleo é muito
pequena, menos que 0,2%. Entre os de baixo a médio peso molecular encontram-se:
piridinas, quinolinas e carbazóis (Fig. 4.11). Entretanto, a principal participação dos
compostos nitrogenados, é encontrada nas frações de elevado peso molecular e
ponto de ebulição, na forma de compostos policíclicos aromáticos que contêm
nitrogênio, isto é, nos compostos NSO. Dos compostos que contêm oxigênio como
heteroátomo, os mais importantes são os fenóis, cetonas, ésteres e ácidos graxos
saturados (Tissot e Welte, 1984; Hunt, 1995).
Tiol
Sulfetos
ou
ou
ou
Tiofenos
ou
2, 3 dimetil dibenzotiofeno
2 metil benzotiofeno
2 etil-tiofeno
Tiociclohexano
Etil metil sulfeto
2- Butanotiol
46
Figura 4.11: Exemplos de compostos contendo nitrogênio (Tissot e Welte, 1984).
Compostos de elevado peso molecular contendo heteroátomos de enxofre,
nitrogênio e oxigênio, conhecidos como compostos NSO, são os constituintes da
fração mais polar do petróleo, a das resinas e asfaltenos. Os heteroátomos,
nitrogênio, enxofre e oxigênio, por serem átomos eletronegativos, conferem elevada
polaridade às moléculas de compostos NSO, resinas e asfaltenos. As resinas e os
asfaltenos possuem como estruturas básicas núcleos de compostos policíclicos
aromáticos ou naftenoaromáticos. As resinas são constituídas também de piridinas,
quinolinas, carbazóis e amidas; e os asfaltenos de fenóis, ácidos graxos, cetonas,
ésteres e porfirinas. A principal diferença entre esses dois grupos baseia-se na
solubilidade em n-hexano. As resinas são solúveis enquanto que os asfaltenos são
insolúveis e precipitam. Entretanto, ambos são solúveis em benzeno e clorofórmio.
Por possuírem propriedades semelhantes, as resinas e os asfaltenos freqüentemente
ocorrem associados, formando partículas coloidais (Tissot e Welte, 1984; Hunt,
1995).
ou
ou
ou
3 metilpiridina
Quinolina
Carbazol
47
Compostos Organometálicos
Os óleos contêm metais, principalmente níquel e vanádio, em quantidades
variáveis, de menos que 1 ppm a 1200 ppm de vanádio e de 1 ppm a 150 ppm de
níquel. Existe uma boa correlação entre os teores de metais, de enxofre e de
asfaltenos, pois normalmente os metais se encontram nessas frações. Uma parte
variável de níquel e vanádio está incorporada em moléculas complexas conhecidas
por porfirinas (Sundararaman, 1985 apud Peters e Moldowan, 1993; Filby e
Branthaver, 1987 apud Peters e Moldowan, 1993). Na figura 4.12 está representado
o possível mecanismo de conversão, ocorrido durante a diagênese do petróleo, da
clorofila para as porfirinas.
Outros metais como: ferro, zinco, cobre, chumbo, molibdênio, cobalto,
manganês, cromo, também podem ser encontrados no óleo, mas com concentrações
muito baixas (Tissot e Welte, 1984).
Figura 4.12
: Conversão da molécula de clorofila em porfirinas onde M = VO
+2
ou Ni
+2
(Peters e Moldowan, 1993).
4.1.2. Alterações do estado físico do petróleo – intemperismo.
Algumas propriedades físicas do petróleo devem ser consideradas na
avaliação de seu comportamento quando derramado no mar. A mais importante é a
viscosidade ou resistência ao fluxo. A viscosidade de um óleo define sua taxa de
Clorofila a
Porfirinas
48
espalhamento no mar e está relacionada à maioria dos outros processos de
intemperismo, principalmente devido a sua variabilidade em função da temperatura
ambiente. A densidade relativa (d) define a facilidade com que um óleo flutua em
água. Uma forma de se expressar densidade, especialmente para o petróleo, é
através da medida do grau API - American Petroleum Industry (API
o
= 141,5 / d -
131,5). Vale lembrar que o grau API foi calculado de forma que seu valor para água
pura, medido a 15,6
o
C, fosse igual a 10. Na tabela 4.2 estão relacionados alguns
valores de densidade e grau API medidos em amostras de petróleo.
Tabela 4.2: Correlação entre grau API e densidade relativa (modificado de North,
1985).
o
API 30 33 36
Densidade (kg/l) 0,876 0,860 0,845
Em função dos valores de API
o
os óleos são classificados como leves ou
pesados, isto é, possuindo uma maior ou menor concentração de compostos de
baixo peso molecular, respectivamente. Normalmente, os óleos cujos valores são
inferiores a 25 API
o
são considerados pesados e acima desse valor leves. A
biodegradação reduz o grau API
o
dos óleos e aumenta, relativamente, os teores de
compostos NSO pela remoção de saturados e aromáticos (Fingas, 1994; Hunt,
1995).
Quando um derrame de petróleo ocorre no mar, o óleo está sujeito a
processos de intemperismo, que podem ocorrer simultaneamente, mas a diferentes
velocidades. A velocidade e a extensão desses processos dependem das
propriedades físicas e químicas do óleo original e de condições ambientais, como:
temperatura, velocidade e direção dos ventos e das correntes marinhas. Na figura
4.13 são mostrados os principais processos de intemperismo sofridos pelo petróleo
após derrame no mar.
Em um estágio inicial, os processos mais importantes que alteram a
composição e o comportamento de um derrame de óleo no mar são:
• Evaporação dos componentes mais voláteis do óleo.
49
• Formação de emulsão óleo em água.
• Dispersão natural.
A evaporação é a responsável pelas mudanças mais importantes ocorridas no
óleo durante um derrame. Em poucos dias um petróleo leve, dependendo da sua
composição, pode perder até 75% de seu volume e os médios até 40%. Nos
ambientes tropicais, as temperaturas elevadas fazem com que a perda por
evaporação dos componentes voláteis do petróleo seja mais rápida, diminuindo seus
efeitos tóxicos sobre a microflora local (Fingas, 1998). A perda dos componentes leves
por evaporação causa um aumento na viscosidade e na densidade do óleo derramado
na superfície do mar. A evaporação também pode provocar mudanças nas
propriedades do óleo, em função da precipitação de compostos de peso molecular
elevados como resinas e asfaltenos, alterando suas propriedades de fluxo (Fingas,
1996,1997, 1998a, 1998b).
Figura 4.13
: Processos de intemperismo sobre o óleo derramado no mar.
Fonte: Pattern Recognition Associates, Texas, 1996.
PROCESSOS DE INTEMPERISMO SOBRE O PETRÓLEO NO MAR
Espalhamento
Direção do
Vento
Evaporação
Foto-oxidação
Estiramento
Espalhamento
Emulsificação
Direção da
Corrente
Assoalho Marinho
Dissolução
Dispersão
Biodegradação por organismos da coluna d`água
Biodegradação por organismos do fundo do mar
Sedimentação
50
A emulsificação, mistura de líquidos não miscíveis, acontece através do
equilíbrio de cargas elétricas existentes entre a superfície das pequenas gotas de
óleo e as moléculas de água ao seu redor. Ela causa um aumento no volume do
poluente, quando comparado com o volume do óleo derramado inicialmente, em
função da quantidade de água que é incorporada ao óleo durante a emulsificação.
Os valores de viscosidade da emulsão óleo - água também são maiores que os do
óleo original. A formação do chamado mousse diminui a disponibilidade do óleo ao
processo de evaporação e de biodegradação, conduzido por microrganismos
naturalmente presentes no mar (Fingas et al., 1995; Fingas et al., 1996c ; Fingas et
al.1998).
Estudos foram desenvolvidos sobre a estabilidade das emulsões óleo-água,
através da medida do teor de resinas e asfaltenos e secundariamente, pelas
propriedades visco-elásticas das emulsões (Fingas et al., 1996b). A principal
conclusão desta pesquisa foi que a presença de resinas e asfaltenos nos óleos ajudou
na estabilização da emulsão óleo – água, devido a esses compostos possuírem, em
suas moléculas, partes hidrofílicas e lipofílicas, fazendo-os agir como agentes tenso-
ativos.
A dispersão natural do petróleo no mar é o terceiro fator mais importante dos
processos de intemperismo. A dispersão é caraterizada pelo movimento de gotas de
óleo, com tamanhos que variam de 1 a 50 microns, na coluna d’água, intensificado
pela turbulência das ondas. Estudos mostraram que a dispersão ocorre
preferencialmente com os componentes da fração de hidrocarbonetos saturados e
que a presença de quantidades significativas de asfaltenos retarda esse processo,
pois como exposto anteriormente, os compostos polares do petróleo estabilizam a
emulsão óleo-água. (Fingas, 1998a). A dispersão do óleo em pequenas gotas
favorece o seu contato inicial com os microrganismos degradadores de
hidrocarbonetos naturalmente presentes no mar, através do mecanismo de adesão
descrito por Rosenberg e Ron (1996) e portanto, o processo de biodegradação.
O processo de dissolução ocorre somente em uma pequena porção do óleo,
mas é considerado um parâmetro importante na avaliação ecotoxicológica de um
derrame, pois envolve a solubilização parcial dos compostos aromáticos de baixos
pesos moleculares extremamente tóxicos aos organismos aquáticos, em função do
51
seu potencial carcinogênico e neurotóxico (Wang et al., 1995a; Wang e Fingas,
1998a).
O espalhamento e o estiramento da mancha de óleo sobre a superfície do
mar é facilitado pela tensão superficial existente entre a superfície da água e o óleo,
52
variações dos parâmetros experimentais foram desprezíveis, e que era esperada
uma atividade microbiana maior na primavera, os pesquisadores concluíram que o
aumento, de um fator de 2, da incidência de radiação ultravioleta, principalmente a
do tipo B, durante a primavera, pode ter sido responsável por causar alterações
genéticas, como lesões do DNA e inativações enzimáticas nos microrganismos
degradadores de hidrocarbonetos necessários à condução da biorremediação nesse
período.
O processo de sedimentação do petróleo é iniciado após o aumento de sua
densidade, como resultado da ação dos outros processos de intemperismo sobre a
mancha de óleo. A sedimentação pode ocorrer por adsorção do óleo intemperizado
ao material particulado, como argila em suspensão na água do mar, especialmente
se o óleo contiver teores acima de 10% de compostos polares. A ingestão do óleo
por zooplactons e sua posterior excreção associado às pelotas fecais também é um
dos mecanismos pelos quais se processa a sedimentação do petróleo. O processo
de biodegradação é controlado, em parte, pela disponibilidade do óleo no meio
líquido, o que faz da sedimentação um mecanismo que pode favorecer o ataque
microbiano ao petróleo (Bragg e Owens, 1994; Owens et al., 1994).
4.2. Fatores bióticos
Muitos microrganismos possuem a habilidade de utilizar hidrocarbonetos como
única fonte de carbono e energia. Esses microrganismos aumentam sua biomassa,
isto é, crescem e se reproduzem às custas, principalmente, do consumo de carbono
orgânico. Os microrganismos envolvidos no processo de biodegradação do petróleo
devem possuir características tais como: a presença de um grupo específico de
enzimas oxigenases ligadas à membrana citoplasmática e mecanismos para a
otimização do contato com os hidrocarbonetos insolúveis em água.
A biodegradação de componentes do petróleo nos mais variados ambientes
naturais é mediada primariamente por microrganismos dos grupos das bactérias e
dos fungos. As bactérias representam um grupo muito diverso de microrganismos
presente em toda a biosfera. Elas possuem características especiais como:
crescimento e metabolismo acelerados, plasticidade genética, capacidade de
53
produzir biosurfactantes e a habilidade de se ajustar rapidamente a uma variedade
de ambientes. Essas características fazem das bactérias os agentes mais
comumente envolvidos nos processos naturais de biodegradação.
4.2.1. Microrganismos degradadores de hidrocarbonetos
Zobell no seu clássico trabalho de 1946 (apud Al-Hadhrami et al., 1995),
demonstrou a extensa ação biodegradadora de bactérias, fungos filamentosos e
leveduras sobre os hidrocarbonetos do petróleo, através da seleção de mais de 100
espécies distribuídas entre 30 gêneros diferentes de microrganismos.
Floodgate (1984, apud Leahy e Colwell, 1990) isolou de ambientes marinhos
25 gêneros de bactérias e 27 de fungos capazes de degradar hidrocarbonetos do
petróleo. Uma compilação similar de microrganismos degradadores de
hidrocarbonetos presentes no solo foi realizada por Bossert e Bartha (1984), na qual
foram selecionados 22 gêneros de bactérias e 31 de fungos. Baseando–se nesses
trabalhos, os gêneros mais encontrados em ambientes marinhos e terrestres são
Pseudomonas, Achromobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Flavobacterium,
Arthrobacter, Micrococcus, Nocardia, Vibrio, Acinetobacter, Candida, Rhodotorula e
Sporobollomyces.
Uma espécie de fungo filamentoso tem sido particularmente estudada, o
Phanerochaete chrysosporium ou fungo da podridão branca. Ele produz uma enzima
extracelular, a ligninase, capaz de degradar substratos complexos como a lignina. As
ligninases possuem baixa especificidade e, portanto, um potencial maior de atuação
sobre poluentes orgânicos como os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
(Cerniglia, 1992).
Embora os microrganismos estejam presentes em ecossistemas terrestres e
aquáticos, as bactérias degradadoras de hidrocarbonetos e em menor proporção as
leveduras, são predominantes nos ambientes marinhos. Somente em regiões
próximas da costa como a zona intermarés, pântanos de água salgada e
manguezais, se verifica um aumento da população de fungos filamentosos, por
serem mais adaptados aos ambientes terrestres (Leahy e Colwell, 1990).
54
Os pesquisadores Zinjard e Pant (2002) analisaram 20 amostras de água do
mar coletadas na região tropical de Mumbai, Índia. Nessas amostras foram isoladas
cepas de levedura, todas pertencentes ao gênero Candida. A eficiência desses
microrganismos em degradar hidrocarbonetos do petróleo foi testada em laboratório,
na presença de um óleo indiano e os resultados mostraram que 78% dos compostos
da fração de alifáticos foram biodegradados. Entretanto, nenhuma cepa foi capaz de
degradar os componentes das frações de aromáticos e polares.
O estudo realizado por Garcia-Valdez et al. (1988) resultou no isolamento de
mais de 100 cepas de bactérias capazes de usar naftaleno como única fonte de
carbono e energia, a partir de sedimentos coletados na região costeira da área
metropolitana de Barcelona, considerada altamente poluída por hidrocarbonetos. As
bactérias isoladas foram caracterizadas e a maioria foi enquadrada no gênero
Pseudomonas. Entretanto, sete dessas não foram relacionadas a nenhuma categoria
taxonômica pré-existente possuindo, entretanto características bioquímicas, como
exigências nutricionais e atividades enzimáticas, semelhantes a
Pseudomonas
stutzeri e P. testosteroni, podendo ser consideradas novas subespécies.
Uma comunidade mista de 8 tipos diferentes de bactérias degradadoras de
petróleo foi isolada de areias contaminadas da praia de Al-Qurum no Golfo de
Omam. O isolamento foi realizado em meio de cultura contendo óleo árabe como
única fonte de carbono. As bactérias foram identificadas como Pseudomonas
aeruginosa, Micrococcus luteus, Klebsiella cepacia, Moraxella phenylpyruvica,
Xanthomonas maltophilia, Ochrobactrum anthoropi, Vibrio fisheri e Enterococcus
casseliflavens. Entretanto, nos testes de laboratório em que essa comunidade foi
inoculada em um mousse contendo 75% do óleo árabe, somente a bactéria P.
aeruginosa foi capaz de sobreviver às custas do consumo de n-alcanos, mantendo o
número de seus indivíduos praticamente constante ao longo dos 60 dias do
experimento(Al-Hadhrami et al.,1995).
As bactérias são consideradas as principais responsáveis pela biodegradação
de hidrocarbonetos, tanto nos solos como em ambientes marinhos. As bactérias são
organismos unicelulares que medem de 1 a 10
µ
m e se reproduzem por fissão
binária. Nesse processo, uma célula bacteriana se divide para formar duas novas
células, que se dividirão e formarão quatro células e assim sucessivamente. A
55
quantidade de tempo necessário para divisão celular e conseqüentemente a
duplicação da população, é denominada tempo de geração. Esse tempo
normalmente é muito curto, podendo ser medido em minutos ou horas (Baker e
Herson, 1994).
Estudos sobre o crescimento bacteriano, em sistemas fechados, resultaram na
determinação de quatro fases típicas, isto é, inicialmente a população tem um
período de pouco ou nenhum aumento no número de células, essa fase é chamada
de fase Lag. Durante a fase lag, os microrganismos sintetizam as moléculas
necessárias ao crescimento e a multiplicação, induzindo a produção de enzimas em
função das novas condições de crescimento. Após essa fase, a população entra na
fase de crescimento exponencial, atingindo o máximo da velocidade de crescimento
e o número de indivíduos da população duplica a cada tempo de geração. A
população entra então, numa nova etapa, chamada de fase estacionária, na qual a
taxa de crescimento é contrabalançada pela taxa de mortalidade, não havendo um
aumento no número total de células. Com a exaustão dos nutrientes e o drástico
aumento dos metabólitos tóxicos no meio de crescimento, dá-se início à fase de
morte da população (King et al, 1997).
Em contraste com o crescimento microbiano realizado em laboratório, é
impossível se determinar o perfil exato do crescimento de populações bacterianas no
meio ambiente natural, isto é, fora das condições ideais. Sob condições naturais, o
número de indivíduos normalmente não alcança valores tão elevados quanto aqueles
observados em condições ideais, em função de limitações geradas pelo próprio
ambiente.
4.2.2 Caminhos metabólicos
Os microrganismos podem degradar compostos orgânicos complexos através
de uma série de reações químicas. Para aqueles que utilizam o metabolismo
aeróbico, os principais caminhos são: Glicólise, Ciclo de Krebs e Sistema
transportador de elétrons.
O metabolismo aeróbico pode ser expresso, de uma forma generalizada,
através da reação apresentada a seguir, a qual representa a completa oxidação de
56
compostos orgânicos (substrato) a dióxido de carbono e água, um processo
conhecido como mineralização. Além destes produtos, resultantes do metabolismo
aeróbico, observa-se a geração de energia para célula e o aumento da biomassa.
(CH
2
O)
n
(compostos orgânicos) + O
2
CO
2
+ H
2
O + energia
Biomassa
Entretanto, nem sempre a biodegradação de compostos orgânicos complexos
resulta em mineralização. A degradação incompleta, também chamada de
transformação, pode ocorrer, gerando em determinadas condições, compostos mais
tóxicos que aqueles que lhes deram origem (Baker e Herson, 1994).
Para que um composto seja mineralizado, a célula bacteriana deve ser capaz
de converte-lo em um dos compostos envolvidos no seu caminho metabólico central.
A diversidade de mecanismos, já identificados, utilizados pelas bactérias para a
mineralização é grande, mas algumas reações ainda precisam ser elucidadas.
Somado a isso, tem-se verificado que na degradação de compostos em
ambientes naturais o processo é conduzido por populações mistas de
microrganismos. Quando uma espécie de microrganismo não é capaz de conduzir a
mineralização de um composto, este pode ser transformado em um produto que sirva
como substrato para um segundo grupo de microrganismos (Baker e Herson, 1994).
As reações bioquímicas, responsáveis pelos processos de degradação, são
viabilizadas por catalisadores conhecidos como enzimas. Enzimas são proteínas
complexas sintetizadas pela célula. As enzimas presentes nos diferentes tipos de
organismos catalisam uma variedade de reações químicas, que podem ocorrer
dentro ou fora da célula. A hidrólise, quebra de uma ligação química com a adição de
uma molécula de água, é freqüentemente conduzida no lado de fora da célula pelas
exoenzimas. Outras importantes reações catalisadas por enzimas são as de oxi-
redução, clivagem de ligações carbono-carbono, desidrogenação e substituição (King
et al, 1997).
57
Algumas enzimas, chamadas de constitutivas, estão constantemente sendo
sintetizadas pela célula. Isto não acontece para a maioria das fontes potenciais de
carbono e energia encontradas no meio ambiente, sendo necessário então, a síntese
de enzimas indutivas, tendo como objetivo a degradação de substratos mais
complexos, como os hidrocarbonetos presentes no petróleo (King et al, 1997).
Para que um microrganismo obtenha energia com a oxidação de um composto,
é necessário que este passe através de sua membrana. Alguns compostos possuem
moléculas tão grandes e/ou carregadas eletricamente que seu transporte para dentro
da célula é impedido. Mas se o composto representar uma fonte de energia em
potencial, poderão ser produzidas e excretadas exoenzimas que conduzirão à
quebra da macromolécula fora da célula, permitindo que as moléculas menores
sejam transportadas para dentro pela membrana. Uma vez que as exoenzimas são
produzidas a taxas inferiores que as endoenzimas, compostos de elevado peso
molecular, como aqueles encontrados nas frações mais pesadas do petróleo,
requerem longos períodos de aclimatação ou adaptação e são degradados mais
lentamente (Cookson, 1995).
4.2.3 Adaptação dos microrganismos à presença de hidrocarbonetos
A exposição continuada de uma comunidade microbiana a hidrocarbonetos,
tanto de fontes antropogênicas como nos casos de derrames acidentais de óleo,
quanto de fontes naturais como exudações, leva à adaptação dos microrganismos,
tendo como resultado o aumento progressivo de seu potencial de biodegradação
(Alexander, 1999).
Os três mecanismos, isolados ou em conjunto, pelos quais a adaptação pode
acontecer são: a) indução e/ou repressão de enzimas específicas, b) mudanças
genéticas que poderiam resultar em novas habilidades metabólicas e c)
enriquecimento seletivo de microrganismos capazes de transformar compostos de
interesse ao seu metabolismo.
O enriquecimento seletivo tem sido largamente observado em estudos de
biodegradação de hidrocarbonetos do petróleo no meio ambiente natural, através do
aumento do número de microrganismos que utilizam hidrocarbonetos e de sua
58
proporção dentro da comunidade de heterotróficos, após a exposição aos
componentes do petróleo. Fica claro também que a avaliação de efeitos mais
específicos, decorrentes da contaminação por hidrocarbonetos sobre a composição
de uma comunidade microbiana, depende diretamente das condições do meio
ambiente local (Leahy e Colwell, 1990).
A habilidade de um microrganismo em degradar compostos orgânicos como os
componentes do petróleo, é resultado, em última análise, do seu potencial genético.
As reações químicas envolvidas no metabolismo são mediadas por enzimas. O
grande número de enzimas que possui uma bactéria é o reflexo da complexidade da
informação genética presente em sua célula. Essa informação, como em todos os
organismos, está codificada na molécula de DNA e na célula bacteriana pode se
apresentar como cromossomo, e como plasmídeo (Baker e Herson, 1994).
Muitas bactérias possuem o DNA extracromossomial, conhecido como
plasmídeo. Os plasmídeos normalmente contêm os genes responsáveis pela indução
da síntese de enzimas necessárias à degradação de substâncias complexas como
os componentes do petróleo. Eles se auto-replicam e podem passar, sob condições
apropriadas, de uma célula para outra, conferindo à bactéria hospedeira uma maior
flexibilidade genética com relação à capacidade de degradação de compostos
orgânicos complexos (Alexander, 1999).
4.3. Fatores abióticos
O conhecimento dos fatores abióticos envolvidos na biodegradação dos
hidrocarbonetos do petróleo é muito importante para a avaliação das condições
ambientais, necessárias à condução da técnica de biorremediação. Os principais
fatores são: o conteúdo de água, a temperatura ambiente, o pH do meio líquido, a
presença de materiais tóxicos como metais, o tipo e a quantidade da fonte de
carbono, a disponibilidade de oxigênio e de nutrientes inorgânicos como nitrogênio e
fósforo.
59
Conteúdo de água
Como todas as células, as bactérias são dependentes de um suprimento
adequado de água para crescer e se reproduzir. Mais importante do que a
quantidade de água é a sua biodisponibilidade no meio ambiente. A água pode não
estar disponível aos microrganismos, quando se encontra adsorvida a substâncias
sólidas (argila hidratada) ou na presença de altas concentrações de soluto (lagos
hipersalinos).
A biodegradação de hidrocarbonetos em ecossistemas terrestres pode,
portanto, ser limitada pela presença de água disponível. Os depósitos de tarballs
(pelotas de asfalto) em praias podem representar uma outra situação, na qual a não
disponibilidade de água limita a biodegradação (Leahy e Colwell, 1990).
Temperatura
A velocidade com que os processos biológicos ocorrem, normalmente
aumenta com a elevação da temperatura, desde que esta não cause a desnaturação
de proteínas, levando a morte das células. Bactérias, como um grupo, apresentam
uma grande faixa de tolerância à temperatura, variando de 0
0
C a aproximadamente
100
0
C. Os microrganismos podem ser classificados como psicrófilos (temperatura
ótima de crescimento entre 5 e 15
0
C), mesófilos (25 e 40
0
C) e termófilos (40 e 60
0
C).
A temperatura ambiente influencia a biodegradação dos componentes do
petróleo, pois altera as constantes físicas do óleo e sua composição química, a taxa
de degradação dos hidrocarbonetos pelos microrganismos e a composição da
comunidade microbiana. A temperaturas baixas, a viscosidade do óleo aumenta, a
volatilização de alcanos de cadeia curta (tóxicos à membrana celular) é reduzida, e
sua solubilidade em água é aumentada, atrasando o processo de biodegradação
(Baker e Herson, 1994).
No entanto, temperaturas em torno de 30 ou 40
0
C aumentam a atividade
enzimática e conseqüentemente a taxa de biodegradação dos hidrocarbonetos em
ambientes tropicais. O clima e as estações do ano, também são responsáveis pela
seleção de populações de microrganismos degradadores de hidrocarbonetos
adaptados à temperatura ambiente (Leahy e Colwell, 1990).
60
pH
Em contraste com os ambientes marinhos, cujos valores de pH estão
próximos à 8,0 devido ao efeito tampão da água do mar, os solos podem apresentar
uma grande faixa de variação, indo de 2,5 até 11,0. O crescimento de
microrganismos normalmente é limitado a valores de pH de 6,0 a 8,0. Os fungos são
mais tolerantes às condições ácidas, quando comparados às bactérias presentes no
solo e em aqüíferos, mas de qualquer forma, valores extremos de pH influenciam
negativamente na habilidade dos microrganismos em degradar hidrocarbonetos
(Dibble e Bartha, 1979; Leahy e Colwell, 1990).
Presença de materiais tóxicos
Locais contaminados, freqüentemente estão impactados por misturas de
materiais, ao invés de um único composto. Nestes locais, a presença de elevados
níveis de metais, juntamente com compostos orgânicos, pode inibir ou intoxicar os
microrganismos. Enquanto alguns metais são necessários como elementos traços no
metabolismo de microrganismos, elevadas concentrações podem romper a
membrana celular e desnaturar proteínas, levando a célula à morte (Baker e Herson,
1994).
Tipo e quantidade da fonte de carbono
Para crescer e se reproduzir, os microrganismos precisam de substâncias
específicas à síntese de novas células. O composto mais comum em uma célula
bacteriana é a água, perfazendo de 70 a 85% de seu peso. Descontando a água,
95% dos compostos restantes são constituídos por cinco elementos – carbono,
oxigênio, nitrogênio, hidrogênio, e fósforo. O elemento mais necessário, em termos
de quantidade, é o carbono.
Em geral os microrganismos usam dióxido de carbono ou compostos
orgânicos como fonte de carbono. Os que usam o dióxido de carbono são os
autotróficos, os que usam carbono orgânico heterotróficos. Os microrganismos
também precisam de fontes de energia, aqueles que obtém esta energia de reações
fotossintéticas são fototróficos. Os microrganismos que obtém sua energia através
da oxidação de compostos orgânicos ou inorgânicos são os quimiotróficos.
61
O principal grupo de microrganismos responsável pela degradação de
hidrocarbonetos do petróleo, presentes no meio ambiente, é o quimioheterotrófico,
isto é, utilizam compostos orgânicos como fonte de carbono e energia. Os
quimioheterotróficos englobam um grande número de gêneros e espécies, sendo que
algumas espécies de microrganismos são bastante limitadas em relação ao tipo de
composto orgânico capazes de metabolizar, enquanto outras são extremamente
versáteis, como é o caso de algumas bactérias do gênero Pseudomonas, que
utilizam mais de 90 compostos diferentes (Baker e Herson, 1994).
Os microrganismos que degradam compostos orgânicos como fonte de
carbono e energia o fazem através de complexas reações de oxidação – redução,
isto é, reações onde ocorre a transferência de elétrons de um composto para outro.
Os elétrons, resultantes das reações de oxidação - redução, são conduzidos a
substâncias conhecidas como aceptores finais de elétrons, e dependendo da
natureza do aceptor, o processo metabólico pode ser dividido em fermentativo ou
respiratório. No caso da
fermentação
, tanto o doador como o aceptor de elétrons é
um composto orgânico. Este processo não conduz à oxidação completa do substrato,
mas à produção de uma mistura de compostos.
Na respiração ocorre a oxidação do composto orgânico e a redução de um
composto inorgânico. Quando o oxigênio é usado como aceptor final de elétrons o
organismo está conduzindo respiração aeróbica e os produtos finais são CO
2
e H
2
O,
caso o aceptor seja um dos radicais nitrato, sulfato ou o CO
2
o metabolismo é de
respiração anaeróbica. A energia liberada das reações de oxidação – redução é
absorvida na forma de ligações químicas entre moléculas de adenosina difosfato e
radicais fosfato para formação de adenosina trifosfato (ATP), e é usada em reações
de síntese de novos compostos celulares.
Oxigênio
Os organismos variam muito com relação ao uso do oxigênio molecular (O
2
).
Os aeróbicos estritos necessitam do oxigênio como aceptor final dos elétrons
resultantes do processo de respiração. Os anaeróbicos estritos não conseguem
crescer na presença de oxigênio, estes organismos utilizam os processos
metabólicos de fermentação ou respiração anaeróbica.
62
Os anaeróbicos facultativos podem crescer na presença ou ausência de
oxigênio e usam tanto a respiração como a fermentação. Os anaeróbicos
aerotolerantes podem crescer na presença de oxigênio, mas não o utilizam como
aceptor final de elétrons. Os microaerófilos necessitam de uma pressão parcial de
oxigênio reduzida.
As etapas iniciais do catabolismo de moléculas de hidrocarbonetos por fungos
ou bactérias, no meio ambiente, envolvem a oxidação do substrato por enzimas
oxigenases. Condições limitantes para o oxigênio, normalmente não são encontradas
nos níveis superiores da coluna de água de mares, rios e lagos, entretanto, os
sedimentos aquáticos são, em geral, anóxidos, exceto por uma fina camada na
superfície do sedimento (Baker e Herson, 1994).
A disponibilidade de oxigênio em solos depende da sua capacidade de difusão
em subsuperfície, das taxas de consumo pela flora microbiana local, e do tipo de
solo. A degradação anaeróbica de hidrocarbonetos do petróleo ocorre em velocidade
muito baixa, sendo considerada, normalmente, insignificante sob o ponto de vista de
despoluição ambiental (Dibble e Bartha, 1979; Leahy e Colwell, 1990).
Nutrientes
A energia, obtida nas reações de oxi-redução e armazenada pela célula na
forma da molécula de ATP, é usada na síntese de substâncias pertencentes as
seguintes classes de compostos: proteínas, lipídeos, carboidratos e ácidos nucleicos.
Nessas reações biossintéticas, além da presença de compostos contendo carbono,
são necessários compostos que contenham os elementos nitrogênio e fósforo,
considerados macronutrientes.
O nitrogênio é usado na síntese de proteínas, as quais desempenham dentro
da célula uma função estrutural (constituinte das membranas celulares) e outra
catalítica (na forma de enzimas), e de ácidos nucleicos (RNA e DNA) portadores da
informação genética. Entretanto, grande parte do nitrogênio presente na biosfera
está sob a forma de gás (N
2
), e um número muito limitado de espécies de bactéria
tem a habilidade de absorvê-lo, levando, a maioria das espécies de bactérias a
depender de fontes de nitrogênio na forma de radicais amônia, nitrato, nitrito e
63
nitrogênio orgânico, que freqüentemente são limitadas em ambientes marinhos, de
água doce e nos solos (Dibble e Bartha, 1979; Baker e Herson,1994).
O fósforo é essencial à célula microbiana na síntese de compostos como ATP
(adenosina trifosfato), ácidos nucleicos e dos fosfolipídios que compõem as
membranas celulares e é, normalmente, absorvido pelas células na forma de fosfato.
Sua ausência em solos e em ambientes aquáticos torna-se um fator limitante do
crescimento microbiano e conseqüentemente do processo de biodegradação (Dibble
e Bartha, 1979; Baker e Herson, 1994).
O ajuste das relações carbono/nitrogênio e carbono/fósforo em ambientes
contaminados por hidrocarbonetos é essencial para a estimulação do processo de
biodegradação dos componentes do petróleo. Na técnica de biorremediação, esse
ajuste pode ser realizado através da adição de fertilizantes, ou sais inorgânicos
contendo nitrogênio e fósforo, dependendo do tipo de ambiente a ser tratado (Leahy
e Colwell, 1990).
Sveum et al. (1994) avaliaram o efeito de diferentes fontes de carbono,
nitrogênio e fósforo na biorremediação de sedimentos costeiros contaminados por
derrames simulados, usando um petróleo produzido no Mar do Norte. Os
experimentos foram conduzidos ao longo de 50 dias em tanques contendo água do
mar fresca e uma linha de costa construída com sedimentos de praia. Como agentes
de biodegradação foram usados os próprios microrganismos indígenos da água do
mar e dos sedimentos. Os nutrientes aplicados sobre os sedimentos, numa
proporção de 10% do volume de óleo derramado, foram os seguintes: comida de
peixe (10,5% de nitrogênio, 2,0% de fósforo, 46,8% de carbono, e o restante de
gordura, água, sais minerais e vitaminas); óleo de soja (75% de carbono); efluente
aquoso de origem protéica (11,3% de nitrogênio, 1,4% de fósforo, 41,8% de carbono,
30% de água, e aproximadamente 15% de sais minerais e vitaminas; e o fertilizante
oleofílico Inipol EAP22, cuja composição química é 26,2% de ácido oléico, 23,7%
lauril fosfato, 10,8% de butoxi-1-etanol, 15,7% de uréia, e 23,6% de água, numa
proporção de C:N:P = 62:5:1. Os efeitos das diferentes combinações entre as fontes
de carbono, nitrogênio e fósforo foram investigados através do monitoramento do
crescimento bacteriano e da biodegradação do óleo, indicada pela diminuição da
razão n-C
17
/P. Os melhores resultados foram conseguidos com a aplicação de
64
comida de peixe e do efluente de origem protéica, os quais possuem proporções
similares entre os compostos que contém carbono, nitrogênio e fósforo. Além dessa
semelhança, ambos os produtos apresentam teores significativos de sais minerais e
vitaminas, considerados micronutrientes importantes para a maioria dos
microrganismos. Entretanto, no experimento em que foi aplicado o Inipol EAP22, não
foram observadas diferenças entre os valores da razão de n-C
17
/P para as amostras
coletadas nos diferentes pontos da costa, como também, não foram detectadas
alterações ao longo do tempo.
Em outro trabalho, Santas et al. (1999) avaliaram a biorremediação de um
petróleo leve iraniano, sob as condições do Mediterrâneo, utilizando dois tipos de
nutrientes oleofílicos: Inipol EAP-22 e F1 (comida de peixe modificada), sobre
derrames simulados em tanques, similares aos descritos anteriormente por Sveum et
al. (1994). A proporção entre C:N:P presente no Inipol é de 62:5:1, e no fertilizante
F1 é de 24:18:3,5. A avaliação do processo de biodegradação foi feita pela medida
da razão de
n
-C
17
/P nas amostras de óleo coletadas na superfície da água, e os
resultados mais promissores foram conseguidos com uso do fertilizante F1,
provavelmente por conter mais nitrogênio, fósforo e micronutrientes por unidade de
massa, que o Inipol. Entretanto, em relação ao aspecto da mancha de óleo, o inipol
agiu como um dispersante, tornando a água limpida, exceto pela presença de alguns
filmes iridescentes, após 15 dias de experimento.
Foght et al. (1998b) testaram in vitro o efeito de duas fontes de nitrogênio,
íons amônio e nitrato, e uma de fósforo (usado como nutriente e como tampão do pH
do meio de cultura), na biodegradação de um óleo. Eles utilizaram um consórcio de
bactérias degradadoras, água do mar sintética, e os experimentos foram conduzidos
a 10
0
C. Nos testes em que foi utilizado o íon amônio, isoladamente, como em
conjunto com o nitrato, foi observado uma acidificação do meio de cultura e um
aumento da taxa de biodegradação de n-alcanos (perda de 95%). Entretanto, a
biodegradação dos compostos saturados (perda de 60%) e de aromáticos (perda de
45%) foi estimulada na presença de fosfato e de nitrato, a uma concentração no meio
de cultura de 24 mM e 40mM, respectivamente.
Al-Hadhrami et al. (1996) avaliaram os efeitos da adição de surfactantes
como os Corexit, de melaço, e de uma solução de sais contendo principalmente, íons
65
fosfato e amônio, na biodegradação in vitro de um petróleo produzido no Golfo de
Omã. Como agentes da biodegradação foram usadas Pseudomonas aeruginosa e
66
de hidrocarbonetos à membrana e da produção de emulsificante ou biosurfactantes.
Outros fatores como a composição e a concentração dos componentes do petróleo,
seu estado físico e condições ambientais, também devem ser considerados neste
processo (Leahy e Colwell,1990; Rosenberg e Ron, 1996).
Estudos realizados em laboratório e no campo têm mostrado que os
hidrocarbonetos saturados e aromáticos e as frações de resinas e asfaltenos,
diferem em relação à suscetibilidade ao ataque microbiano, normalmente seguindo
uma ordem decrescente de biodegradabilidade relativa: n-alcanos > iso-alcanos >
aromáticos de baixo peso molecular > alcanos cíclicos (incluindo os biomarcadores,
esteranos > hopanos) > esteróides aromáticos > aromáticos de elevado peso
molecular > resinas e asfaltenos (Connan, 1984; Peters e Moldowan,1993).
4.4.1. Consumo dos hidrocarbonetos por microrganismos degradadores.
A maioria dos hidrocarbonetos do petróleo se encontra no estado líquido ou
sólido, considerando as temperaturas normais de crescimento microbiano. Como
pode ser visto na tabela 4.3, a solubilidade em água dos hidrocarbonetos é
extremamente limitada, normalmente decrescendo com o aumento do peso
molecular.
Como conseqüência, os microrganismos têm desenvolvido um número de
adaptações para serem capazes de utilizar hidrocarbonetos como substrato em seus
metabolismos. O primeiro passo na biodegradação de petróleo envolve a atuação de
enzimas oxigenases localizadas na membrana celular, isso faz com que o contato
direto da bactéria com o substrato seja essencial.
67
Tabela 4.3: Propriedades físicas de alguns hidrocarbonetos alifáticos, cicloalifáticos,
aromáticos e policíclicos aromáticos.
Composto N
o
de átomos de
carbono
Peso molecular
(g/gmol)
Solubilidade em
água (mg/l)
n-hexano 6 86,2 12,3
n-decano 10 128,3 0,05
n-hexadecano 16 226,4 5,2 x 10
-5
n-eicosano 20 282,6 3,1 x 10
-7
n-hexacosano 26 366,7 1,3 x 10
-10
2-metilpentano 6 86,2 13,8
2,2,4 trimetilpentano 8 114,2 2,4
4-metiloctano 9 128,3 0,12
Ciclohexano 6 84,2 57,5
Metilciclohexano 7 98,2 16,0
Propilciclopentano 8 112,2 2,0
Pentilciclopentano 10 140,3 0,12
Benzeno 6 78,1 7,0
Tolueno 7 92,1 5,0
Etilbenzeno 8 106,2 1,0
Xilenos (orto, meta, para)
8 106,2 insolúveis
Naftaleno 10 128,2 31,7
Antraceno 14 178,2 0,07
Fenantreno 14 178,2 1,3
Pireno 16 202,3 0,14
Benzo(a) antraceno 18 228,3 0,002
Benzo(a)pireno 19 252,3 0,003
Fonte: Adaptado de Cerniglia, 1992 e Morgan e Watkinson, 1994.
Para se entender as propriedades especiais da superfície celular, as quais
permitem o crescimento microbiano na presença de hidrocarbonetos, é necessário
primeiramente, considerar a dinâmica da degradação do petróleo em ambientes
naturais. Ao longo de um derrame de óleo no mar, por exemplo, os hidrocarbonetos
chegam à superfície e entram em contato com o ar; aqueles de peso molecular mais
baixo se volatilizam e os solúveis em água são metabolizados por bactérias capazes
de absorve-los através da membrana celular (Rosenberg et al., 1992; Rosenberg e
Ron, 1996; Alexander, 1999).
68
O próximo estágio da biodegradação envolve a presença de outro grupo de
bactérias que possui a capacidade de se aderir às gotas de óleo. A adesão é
proporcionada por interações lipofílicas entre a superfície externa da membrana
celular e a gota de óleo. Foi observado que estas interações são mais fortes a
temperaturas elevadas e em soluções iônicas. Após a adesão, verifica-se um
aumento do crescimento microbiano como resultado do consumo dos
hidrocarbonetos insolúveis na água. Para que esse crescimento continue as células
precisarão se desprender da gota de óleo biodegradado, que já não oferece os
hidrocarbonetos passíveis de serem metabolizados. A desorção da gota de óleo
pela célula é uma etapa crítica no ciclo de crescimento das bactérias degradadoras
de hidrocarbonetos do petróleo, para isso, elas envolvem a gota com um filme
emulsificante. Esse filme possui características hidrofílicas em sua camada externa,
as quais previnem uma re–adesão desse grupo de bactérias a gotas de óleo já
biodegradado. (Rosenberg et al., 1992; Rosenberg e Ron, 1996; Alexander, 1999).
Presume-se que outros grupos de bactérias, diferentes das descritas
anteriormente, sejam capazes de aderir a superfície hidrofílica, proporcionada pelo
filme emulsificante e assim degradarem os hidrocarbonetos cíclicos e aromáticos,
dando continuidade ao processo de biodegradação do petróleo, em ambientes
marinhos (Rosenberg e Ron, 1996).
Os emulsificantes ou biosurfactantes resultantes do metabolismo microbiano
podem ser intra, extracelulares ou constituintes da parede celular. Eles possuem
propriedades semelhantes aos surfactantes sintéticos, como a redução da tensão
interfacial, por também apresentarem em uma mesma molécula, grupos polares e
apolares. Em geral, o grupo hidrofóbico é constituído por longas cadeias de ácidos
graxos, enquanto que a parte hidrofílica pode ser um carboidrato, aminoácido,
peptídeo, fosfato, ácido carboxílico e álcool entre outros. Portanto, de acordo com
seus constituintes os biosurfactantes podem ser agrupados nas seguintes classes:
glicolipídeos, ácidos graxos, lipídeos neutros, fosfolipídeos, biosurfactantes
poliméricos e lipopeptídeos (Kosaric et al., 1987 apud Mayol et al., 1998; Reis, 1998).
Os glicolipídeos são os surfactantes microbianos mais conhecidos. Dentre os
glicolipídeos mais estudados estão os ramnolipídeos, produzidos em grandes
quantidades por várias espécies do gênero Pseudomonas. A produção de
69
ramnolipídeos favorece o crescimento de microrganismos degradadores de petróleo
em meios contendo fonte de carbono hidrofóbica como os hidrocarbonetos (Karl,
1992, apud Mayol et al., 1998).
Outra classe importante é a dos biosurfactantes poliméricos, melhor definidos
como bioemulsificantes em função de sua principal característica que é propiciar a
formação de emulsões estáveis de óleo em água. Um dos bioemulsificantes mais
conhecidos é o Emulsan, produzido pela bactéria Acinetobacter calcoaceticus RAG1,
um heteropolissacarídeo aniônico constituído de unidades de açúcares aminados
ligados a ácidos graxos. Essa bactéria desenvolve o mecanismo de desorsão,
descrito anteriormente para o consumo de hidrocarbonetos, através do envolvimento
da gota de óleo biodegradado por uma cápsula emulsificante de Emulsan
(Rosenberg et al., 1992).
Em conformidade com esses estudos
Josefsen et al. (1995) testaram a
eficiência de duas cepas de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos, isoladas da
água do mar, em dispersar um
mousse
produzido com óleo do Mar do Norte. Essas
cepas foram selecionadas em função de sua comprovada capacidade emulsificante.
Os testes foram conduzidos em experimentos de meso-escala, sob simulação das
condições naturais de temperatura, vento e ondas. Após 15 horas da aplicação das
bactérias o mousse foi disperso completamente na água formando gotas de 0,1 a 1
mm de diâmetro. Depois de dois dias o tamanho médio das gotas foi reduzido para
19 µm e ao final do experimento, passados cinco dias, foi para 10 µm. Uma rápida
biodegradação da fração de alifáticos, dispersos na água, foi observada através da
diminuição das razões de n-C
17
/P e n-C
18
/F, quando comparada com resultados
obtidos nas simulações sem a adição de bactérias.
Num trabalho que teve como objetivo determinar o potencial de um consórcio
de bactérias em degradar petróleo indiano, foram isolados 35 organismos diferentes
de um lodo ativado, por meio de crescimento seletivo em um biorreator semicontínuo
alimentado com óleo cru, durante 5 meses. Quatro membros desse consórcio foram
capazes de degradar 70% do óleo. Uma das bactérias foi caracterizada como
produtora de biosurfactante, as custas do consumo de compostos alifáticos de
cadeia curta como o dodecano. O biosurfactante foi extraído do meio e identificado
como um ramnolipídico. Sua análise por espectrometria na região do Infravermelho
70
indicou uma grande semelhança com o biosurfactante produzido por Pseudomonas
aeruginosa. A adição da bactéria produtora de biosurfactante, ao meio contendo 1%
de petróleo, resultou na sua emulsificação e posterior biodegradação pelos outros
membros do grupo. A capacidade hidrocarbonoclástica desses organismos,
juntamente com a de Pseudomonas putida MTCC 102, foi responsável pela
degradação parcial das frações de alifáticos (81%) e de aromáticos (65%) presentes
no petróleo, após 72 horas de crescimento em frascos agitados e mantidos a uma
temperatura de 30
0
C (Chhatre et al. 1996).
No trabalho desenvolvido por Rocha e Infante (1997) foram identificadas as
melhores condições de pH, temperatura e agitação, para a dispersão e a
biodegradação de uma lama oleosa, usando como agente tenso-ativo um
biosurfactante ramnolipídico produzido por Pseudomonas aeruginosa USB-CS1,
surfactante e nutrientes sintético; e como agente de biodegradação a microflora
nativa. A amostra de lama oleosa, poluente muito comum na Venezuela, continha
óleo pesado, produtos químicos usados na estimulação de poços e fluidos de
perfuração. Na sua caracterização foram identificados 40,9% de compostos
saturados, 28,1% de aromáticos, 22,4% de resinas, 8,6% de asfaltenos, 117 ppm de
vanádio, 13,9% de níquel, 69,7% de carbono, e 28,1% de água. A produção do
biosurfactante foi conduzida em frascos agitados, em meio contendo peptona, extrato
de lêvedo e glicose, a uma temperatura de 30
0
C. A biodegradação da lama oleosa
foi facilitada pela ação do biosurfactante em pH igual a 6,5, temperatura de 30
0
C e
agitação de 150 ver/min. Os sistemas de biodegradação mediados pela presença do
biosurfactante e microflora nativa, ou do complexo biosurfactante - P. aeruginosa
USB-CS1 e microflora nativa, mostraram os melhores resultados para o consumo de
hidrocarbonetos totais, saturados e aromáticos, após 30 dias de experimento.
Entretanto, nos sistemas em que foi aplicado o biosurfactante foi observado um
aumento drástico da tensão superficial dos meios entre 30 e 60 dias do experimento.
Os pesquisadores sugerem a possibilidade de que o biosurfactante tenha se
adsorvido à superfície de resinas e asfaltenos, indisponibilizando-o para as
atividades de redução da tensão interfacial.
Outros pesquisadores avaliaram o potencial de solubilização de
hidrocarbonetos do petróleo dispersos em água, através da ação de biosurfactantes
71
produzidos pela bactéria Nocardia erythropolis ATCC 4277 (American Type Culture
Collection), quando crescida em meio contendo hexadecano como única fonte de
carbono. Os resultados da pesquisa demonstraram que os biosurfactantes
produzidos por N. erythropolis ATCC 4277 possuem características tenso-ativas
semelhantes aos surfactantes sintéticos, como a formação de micelas, com tolueno,
p-xileno e trimetilbenzeno, aumentando a solubilidade desses compostos, nos casos
de contaminação em aqüíferos, e sua desorsão da matriz mineral do solo
contaminado. Portanto os biosurfactantes produzidos por N. erythropolis ATCC 4277,
podem ser usados como auxiliares na biorremediação de solos e aqüíferos
contaminados por aromáticos de baixo peso molecular, sem apresentarem os níveis
elevados de toxicidade, normalmente verificados para os surfactantes sintéticos
(Park et al. 1998).
Pesquisadores nacionais publicaram um trabalho em que foi avaliada a
produção de biosurfactantes por 5 cepas de bactérias do gênero Rhodococcus, com
o objetivo de produzi-los comercialmente para aplicação na remediação de derrames
de petróleo. Esses microrganismos foram isolados de sítios de prospecção de
petróleo na Rússia e são capazes de biodegradar ou utilizar uma grande variedade
de compostos hidrofóbicos como hidrocarbonetos, fenóis, esteróis, ligninas e
petróleo, o que tem contribuído para o aumento da sua importância comercial.
Inicialmente, foram conduzidos experimentos visando a seleção das melhores cepas
em função de sua velocidade de crescimento em meio mineral e Bushnell e Haas
(meio contendo hidrocarbonetos) a temperatura de 37
0
C, durante um período de
incubação de 96 horas. Foram selecionadas 3 cepas de R. ruber e avaliadas em
função da produção de biosurfactantes e de sua eficiência na emulsificação de óleo
diesel, através da medida da tensão superficial do meio líquido. A cepa de R. ruber
identificada como AC 239 foi selecionada para a otimização dos experimentos de
produção do biosurfactante, por ter mostrado maior velocidade de crescimento e
melhor eficiência na redução da tensão superficial. Para a escolha do meio ótimo de
produção do biosurfactante foram testadas 3 fontes de carbono em conjunto com o
óleo diesel a 1%: lactose (1,0 g/l), extrato de lêvedo (0,10 g/l) e glicose (10,0 g/l). O
meio com extrato de lêvedo mostrou ser o mais eficiente tanto para o crescimento
celular como para a produção de biosurfactante (Bicca et al. 1999).
72
4.4.2. Biodegradação de hidrocarbonetos alifáticos
a) Biodegradação de n-alcanos
Os hidrocarbonetos da classe dos n-alcanos são facilmente biodegradados no
meio ambiente natural por bactérias, fungos filamentosos e leveduras, e até mesmo
em experimentos laboratoriais realizados com culturas puras de microrganismos
degradadores como bactérias do gênero Pseudomonas. Os caminhos metabólicos
responsáveis por sua biodegradação têm sido exaustivamente estudados.
Na figura 4.14 estão representadas algumas das etapas deste metabolismo. A
primeira é realizada pelo ataque das enzimas alcano hidrolases (monoxigenases)
sobre o grupo metila terminal dos n-alcanos, oxidando-os a álcoois que depois serão
convertidos, enzimaticamente a aldeídos e a seguir em ácidos graxos. Os ácidos
graxos seguem então o caminho metabólico da
β
-oxidação (clivagem da molécula
entre o segundo e o terceiro átomo de carbono da cadeia), entram no Ciclo de Krebs,
chegando a CO
2
e H
2
O, produtos finais do metabolismo aeróbico de fontes de
carbono orgânico (Morgan e Watkinson, 1994; Baker e Herson, 1994).
Figura 4.14: Principais rotas metabólicas usadas na biodegradação de n-alcanos
(modificado de Baker e Herson, 1994).
Hidrocarboneto
Álcool
Aldeído
Ácido graxo
β
β β
β
- oxidação
Ciclo de Krebs
Acetil
CoenzimaA
73
b) Biodegradação de alcanos ramificados
Geralmente, alcanos ramificados são biodegradados mais lentamente que seus
correspondentes de cadeia linear e quando misturados, observa-se que a
degradação dos alcanos ramificados pode ser reprimida pela presença dos alcanos
lineares. Essa característica faz com que as relações entre os n-alcanos contendo 17
e 18 átomos de carbono, respectivamente n-C
17
e n-C
18
, e os alcanos ramificados
pristano (19 átomos de carbono) e fitano (20 átomos de carbono), n-C
17
/Pristano
e
n-
C
18
/Fitano,
sejam usadas como parâmetros na avaliação do nível de biodegradação
de óleos, tanto em reservatórios de petróleo, como no meio ambiente natural (Peters
e Moldowan, 1993).
Alcanos com elevado número de ramificações são mais recalcitrantes,
particularmente aqueles com carbono quaternário, apresentando assim, um
impedimento estérico à ação de enzimas envolvidas na reação de oxidação. A
biodegradação dos isoprenóides pristano (2,6,10,14 tetrametilpentadecano) e fitano
(2,6,10,14 tetrametilhexadecano) por bactérias dos gêneros Brevibacterium,
Corynebacterium e Rhodococcus tem sido particularmente estudada (Morgan e
Watkinson, 1994). O caminho metabólico para degradação envolve a oxidação
enzimática dos isoprenóides até sua transformação em succinato e posteriormente,
através de sua entrada no ciclo de Krebs, a CO
2
e H
2
O.
c) Biodegradação anaeróbica de alcanos
O potencial para biodegradação anaeróbica de hidrocarbonetos vem sendo
discutido por alguns pesquisadores e pesquisas mostraram evidências da
degradação anaeróbica de n-alcanos através da ação de bactérias redutoras de
sulfato. Entretanto, deve-se lembrar que o processo anaeróbico é sempre muito mais
lento que o aeróbico, sendo normalmente desconsiderado nos estudos de
biodegradação de hidrocarbonetos do petróleo em ambientes naturais (Bertrand et
al., 1989; Baker e Herson, 1994).
74
4.4.3. Biodegradação de hidrocarbonetos cicloalifáticos
Em contraste com os hidrocarbonetos alifáticos saturados existem poucos
estudos que descrevem a utilização de cicloalifáticos, como fonte de carbono e de
energia, por culturas puras de microrganismos. A biodegradação de cicloalifáticos
geralmente envolve culturas mistas e cometabolismo, isto é, a degradação de um
composto na presença de outro composto orgânico que sirva como fonte de energia.
O cometabolismo se inicia pela conversão dos cicloalifáticos a álcoois, que
então sofrem desidrogenação, se transformando em cetonas por meio de reações
catalisadas por enzimas monooxigenases, de baixa especificidade. Numa etapa
posterior, ocorre a abertura do ciclo e sua conversão em AcetilCoenzima A. Tais
mecanismos, conduzidos por espécies dos gêneros Pseudomonas e Nocardia,
durante a biodegradação do ciclohexano, estão representados de maneira
simplificada na figura 4.15. A degradação de cicloalifáticos ramificados como metil e
etil - ciclohexanos pode ser conduzida por culturas puras, mas para aqueles que
possuem longas ramificações alquilas, o ataque, via metabolismo de
β
-oxidação,
pode ocorrer tanto na ramificação, quanto no ciclo, dependendo dos organismos e
dos substratos que se encontram disponíveis (Morgan e Watkinson
,
1994;
Rosenberg e Ron, 1996).
Figura 4.15
: Principal rota metabólica usada na biodegradação de ciclohexano
(Morgan e Watkinson, 1994).
Compostos policíclicos alifáticos são também muito comuns no petróleo. Os
dois grupos principais são formados por esteranos (tetracíclicos) e hopanos
(pentacíclicos). Devido ao fato de possuírem conformação tridimensional,
apresentam grandes variações na estrutura química gerando numerosos
estereoisômeros, tornam o estudo de seus mecanismos de biodegradação bastante
75
complexo (Conan, 1984). Esses compostos são particularmente resistentes ao
ataque microbiano, servindo como parâmetro na avaliação de óleos biodegradados,
quando já não se encontram presentes os n-alcanos e isoprenóides (Goodwin et al.,
1983; Prince et al., 1994b, Douglas et al., 1994). Entretanto, existem evidências de
que em determinadas condições, até mesmo esses compostos são biodegradados e
o caminho metabólico seguido é o do cometabolismo (Morgan e Watkinson, 1994;
Moldowan et al., 1995; Wang et al., 2001b).
a) Biodegradação de esteranos e diasteranos
A biodegradação de esteranos ocorre, muitas vezes, depois da completa
degradação dos isoprenóides que contém de 15 a 20 átomos de carbono (C
15
a C
20
) e,
normalmente, antes dos hopanos. Em geral, os esteranos (C
27
,C
28
,C
29
) e seus
estereoisômeros são biodegradados na seguinte ordem:
ααα
20R >
ααα
20S
>
αββ
20R >
αββ
20S > diasteranos. Quando ocorre uma biodegradação parcial, os
primeiros a serem degradados são aqueles com a configuração tridimensional
ααα 20R, refletindo uma maior especificidade enzimática das bactérias degradadoras
sobre a conformação biológica dos esteranos na seguinte ordem:
ααα
20R C
27
>
ααα
20R C
28
>
ααα
20R C
29
(Seifert e Moldowan, 1979 apud Peters e Moldowan,
1993; Cassani e Eglinton, 1991; Wang et al., 2001b).
Em corformidade com as informações descritas anteriormente, pesquisadores
investigaram a capacidade de 73 bactérias aeróbicas em degradar a fração de
esteranos, isolada de um petróleo americano enriquecido em esteranos C
27
, C
28
, C
29
ααα
20R. As bactérias usadas foram selecionadas de coleções internacionais, exceto
a bactéria Nocardia sp. SEBR 16, isolada de uma amostra de solo. Os gêneros
examinados foram Nocardia (25 cepas), Mycobacterium (11), Corynebacterium (1),
Arthrobacter (2), Protoaminobacter (1) e Pseudomonas (33). Desse total, foram
selecionadas 7 cepas degradadoras de esteranos, todas Gram positivas, 1
pertencente ao gênero Arthrobacter, outra ao Mycobacterium e as 5 restantes ao
gênero Nocardia. Os pesquisadores optaram por utilizar a bactéria Nocardia sp.
SEBR 16, por produzir a biodegradação mais extensa sobre os esteranos. Os
resultados desses experimentos, ao final de 6 dias de incubação, mostraram a
76
seguinte ordem de biodegradação: C
27
> C
28
> C
29
, e com relação às séries,
ααα 20R > αββ 20R > αββ 20S > ααα 20S, confirmando a tendência de que a
conformação 20R é mais facilmente reconhecida pelo sítio ativo das enzimas
envolvidas no processo de biodegradação dos esteranos (Chosson et al., 1991).
Os diasteranos são particularmente resistentes à biodegradação. Análises
geoquímicas realizadas em amostras de óleo biodegradado, nos próprios
reservatórios, mostraram a completa ausência da série de esteranos de C
27
a C
29
,
enquanto que os diasteranos permaneceram inalterados (Seifert e Moldowan, 1979
apud Peters e Moldowan, 1993; Conann, 1984). Seifert e Moldowan (1979)
observaram também que a biodegradação dos diasteranos parecia ser
estereoseletiva privilegiando o diasterano 13β, 17α (H) C
27
20S sobre o 13β, 17α (H)
C
27
20R.
b) Biodegradação de hopanos
Hopanos degradados foram observados pela primeira vez por Reed (1977 apud
Peters e Moldowan, 1993) em depósitos asfálticos da Bacia de Uinta. Seifert e
Moldowan (1979 apud Peters e Moldowan, 1993) reportaram a degradação de
hopanos em óleos biodegradados da Califórnia, e postularam a formação de
hopanos desmetilados (25 norhopanos). Os 25 norhopanos são uma série de
compostos, normalmente presentes em óleos biodegradados. Esses compostos
aparecem como resultado da remoção microbiana de um grupo metila numerado
como 25, ligado ao carbono 10, e pertencente ao anel de hopanos regulares. Peters
e Moldowan (1993) sugerem que a retirada do radical metila é altamente dependente
do tipo de população microbiana envolvida no processo de biodegradação do óleo.
Na figura 4.16 está representada esta provável transformação.
77
Figura 4.16: Hipótese de formação de 25 norhopano a partir da biodegradação
aeróbica de 17α 21 β (H) hopano (Peters e Moldowan, 1993).
Entretanto, alguns pesquisadores observaram a perda de hopanos, sem a
formação de 25 norhopanos, em óleos biodegradados provenientes do Golfo do
México (Seifert e Moldowan, 1979 apud Peters e Moldowan, 1993); de depósitos
asfálticos na Suíça (Conann, 1984) e de exudações na Grécia (Seifert et al., 1984
apud Peters e Moldowan, 1993). Com isso foi levantada a hipótese de que existam
pelo menos dois caminhos distintos para a degradação dos hopanos, com ou sem a
formação dos 25 norhopanos (desmetil hopanos). Nesses óleos a série dos 17α (H)
hopanos se mostrou mais suscetível à biodegradação que o 18 α (H) oleanano e o
gamacerano.
Os 22R homohopanos são mais resistentes a degradação que os esteranos
20R. Como os isômeros 20R dos esteranos, os 22R dos 17
α,
21
β
(H) homohopanos
são mais suscetíveis à biodegradação que seus pares em configuração 22S
(Hoffman e Strausz, 1986 apud Peters e Moldowan, 1993).
c) Biodegradação de terpanos tricíclicos
Pesquisadores têm observado que terpanos tricíclicos contendo de 19 a 45
átomos de carbono, importantes componentes da fração de saturados do petróleo,
são resistentes à biodegradação, até mesmo quando presentes em óleos
severamente degradados, nos quais já não se encontram hopanos. Eles
normalmente possuem o mesmo grau de suscetibilidade ao ataque microbiano que
os diasteranos (Reed, 1977 apud Peters e Moldowan, 1993; Seifert e Moldowan,
1979 apud Peters e Moldowan, 1993).
Biodegradação
aeróbica
78
Estudos sobre a distribuição de terpanos tricíclicos no petróleo, sua
estereoquímica e propriedades cromatográficas mostraram que em uma separação
cromatográfica de alta resolução apareciam dois picos para cada composto
pertencente a série de C
26
a C
29
, como consequência da estereoisomerização no
carbono de número 22, com a formação dos epímeros 22R e 22S. Foi observado
também que o segundo pico de cada composto era mais facilmente biodegradado
que o primeiro, com ou sem a desmetilação microbiana que gera os 17-nor-terpanos
tricíclicos (Peters, 2000).
4.4.4. Biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos
A biodegradação aeróbica do anel aromático é dependente da habilidade das
enzimas produzidas por bactérias e fungos de incorporarem átomos de oxigênio à
estrutura do anel. A ativação inicial é catalisada pela ação de mono e dioxigenases,
tendo como resultado a formação do 1,2 dihidroxibenzeno, conhecido como catecol.
A oxidação inicial do anel é a etapa limitante nas reações de biodegradação, sendo
as outras etapas relativamente rápidas, com pouco ou nenhum acúmulo de
intermediários bioquímicos. Essas transformações podem ser observadas de forma
generalizada, para compostos aromáticos e policíclicos aromáticos, na figura 4.17
(Baker e Herson, 1994).
Após a formação do catecol se dá o rompimento do anel na ligação entre os
dois átomos de carbono que contêm radicais hidroxilas (OH). A partir deste ponto o
caminho metabólico leva à formação de produtos, como piruvato, succinato,
fumarato, acetaldeído e
β
-cetoadipato, que serão então utilizados pela célula
microbiana como fonte de carbono e energia, com produção de gás carbônico e água
(Cerniglia, 1992; Morgan e Watkinson, 1994; Baker e Herson, 1994) .
A presença no petróleo de compostos monoaromáticos, contendo ramificações
alquilas longas, possibilita a existência de formas alternativas de biodegradação.
Esses caminhos levam, preferencialmente, ao ataque microbiano das cadeias
laterais, provavelmente por grupos de microrganismos diferentes daqueles
envolvidos na quebra do anel benzênico. As cadeias laterais alquilas oferecem uma
fonte de carbono necessária à manutenção e crescimento dos microrganismos,
79
sendo mais facilmente degradadas que o anel benzênico propriamente dito
(Rosenberg e Ron, 1996).
a) Biodegradação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) possuem dois ou mais anéis
benzênicos fundidos, são constituintes naturais do petróleo e de alguns de seus
subprodutos, como o óleo diesel. Os compostos de 2 ou 3 anéis como o naftaleno e
o fenantreno, respectivamente, e seus derivados alquilados são os mais abundantes.
Os HPA têm baixa solubilidade em água e tendem a se associar a partículas, tanto
em ambientes terrestres como nos aquáticos, por isso estão menos disponíveis a
processos como volatilização, fotoxidação e biodegradação, sendo considerados
compostos recalcitrantes quando presentes no meio ambiente (Cerniglia, 1992).
Alguns HPA possuem atividades carcinogênicas e mutagênicas sobre animais e
seres humanos, e sua toxicidade aumenta com o número de anéis. Em função
dessas características 16 HPA foram listados como poluentes prioritários pela
Agência de Proteção Ambiental Americana (USEPA). Em geral, eles são
biodegradados mais lentamente que os monoaromáticos, mas seguem basicamente
o mecanismo descrito na figura 4.17 para a degradação do anel aromático (Cerniglia,
1992; Baker e Herson, 1994; Rosenberg e Ron, 1996).
O trabalho de revisão sobre a biodegradação de hidrocarbonetos policíclicos
aromáticos realizado por Cerniglia (1992) aponta para a biodegradação como o
principal processo a ser usado na descontaminação do meio ambiente atingido por
essa categoria de compostos. Os HPA podem ser totalmente degradados
(mineralizados), ou parcialmente transformados por um determinado microrganismo
ou por uma comunidade microbiana. Os caminhos metabólicos usados por culturas
puras e mistas têm sido muito estudados. Entretanto, é necessário que se conheça
mais sobre os processos enzimáticos dos microrganismos envolvidos, sobre as
condições ambientais propícias à degradação desses compostos, e sobre a
biodegradação de misturas complexas de HPA, especialmente o efeito da presença
de um determinado componente, na biodegradabilidade dos demais compostos.
80
Figura 4.17: Degradação inicial do anel benzênico sob ação de oxigenases, em
condições aeróbicas (Baker e Herson, 1994).
Nos estudos sobre alguns fatores que afetam a taxa e a extensão da
biodegradação de fenantrenos em água do mar, na Baía Guayanilla em Puerto Rico,
Caribe, foram examinados os parâmetros: 1) adição de nutrientes contendo
nitrogênio e fósforo; 2) variação do pH; 3) pré- tratamento do substrato com peróxido
de hidrogênio e surfactante; 4) aumento da temperatura. A biodegradação mediada
pelos microrganismos indígenos foi avaliada por respirometria. Os resultados mais
importantes mostraram que a adição de KNO
3
aumentou em 10 vezes a taxa de
degradação, após 125 horas. Entretanto, a aplicação de K
2
HPO
4
não provocou
alterações significativas. A alteração dos valores de pH para 10,0 reduziu
drasticamente a taxa de biodegradação. Já o pré-tratamento com 1% de peróxido de
hidrogênio aumentou em 16 vezes a produção de CO
2
, em 10 horas, quando
HPA
Benzeno
Ácido salicílico
Catecol
Tolueno
Ácido benzóico
Fenol
Rompimento
do anel
81
comparado com o controle, provavelmente devido à aceleração da primeira etapa da
biodegradção, isto é, a oxidação do anel aromático (Zaidi e Imam, 1999).
A composição química, em termos dos HPA, de óleos biodegradados no próprio
reservatório foi comparada com a de um óleo biodegradado no laboratório. Para a
biodegradação foi usada a microflora naturalmente existente em sedimentos de praia
da Baía de Dunstaffnage, Escócia. Os experimentos foram conduzidos em frascos
agitados por um período de 14 dias, a 20
o
C. As análises comprovaram que as
mudanças observadas na distribuição de alquil aromáticos nos óleos avaliados eram
resultantes do processo de biodegradação. Os autores observaram, para todos os
óleos analisados, que a suscetibilidade à biodegradação decrescia com o aumento
do número de radicais alquilas presentes no composto. Eles verificaram também que
a biodegradação era um processo isômeroespecífico para dimetil naftalenos, trimetil
naftalenos e metil fenantrenos, em ambas as condições estudadas, in vitro e no
reservatório. Para os alquil naftalenos foi observado que os
αα
dimetil naftalenos
eram mais resistentes à biodegradação que seus pares, já para os trimetil naftalenos,
os ααβ foram os mais persistentes. O 9 metil fenantreno apresentou taxa de
degradação mais lenta que seus isômeros (Rowland et al. 1986).
Outra característica relacionada à biodegradabilidade dos HPA, foi verificada
como resultado de trabalhos que envolveram a biorremediação de solos
contaminados por petróleo. Nesses estudos foi observado que hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos contendo 3 anéis condensados, como naftaleno, antraceno, e
um com 4 anéis, o pireno, foram biodegradados mais rapidamente que aqueles com
4 anéis ou mais, considerados recalcitrantes em função de sua baixa solubilidade em
água e da energia de ressonância típica de suas estruturas aromáticas condensadas
(Alexander, 1999).
b) Biodegradação de esteróides aromáticos
Os esteróides aromáticos são hidrocarbonetos pertencentes ao grupo dos
naftenoaromáticos que contêm de 1 (esteróide monoaromático) a 3 (esteróide
triaromático) anéis benzênicos e são considerados compostos biomarcadores por
terem como precursor biológico o colesterol. O conhecimento da distribuição e da
82
concentração desses compostos no petróleo pode ser aplicado à resolução de
questões relacionadas à maturação e correlações óleo-rocha. Outra característica é
sua elevada resistência à biodegradação, considerada superior a dos esteranos e
hopanos (Seifert e Moldowan, 1979 apud Peters e Moldowan, 1993).
O estudo mais detalhado sobre a biodegradação dos esteróide aromáticos foi
realizado por Wardropper et al. (1984). Nesse trabalho foi analisada a distribuição de
certos esteróides aromáticos em 10 amostras de óleo biodegradado. Foram
conduzidos experimentos laboratoriais envolvendo a biodegradação aeróbica de três
deles em meio mineral, mas sem inoculação de microrganismos. Como resultado foi
observado, que em casos extremos de biodegradação, havia uma depletação
preferencial dos isômeros de configuração 20R, tanto para os esteróides
monoaromáticos como para os triaromáticos, que continham mais que 22 átomos de
carbono. Foi verificado que os esteroides triaromáticos C
20
e C
21
,
também se
encontravam alterados nas amostras analisadas, mas os autores não puderam
afirmar se esse comportamento era resultado do processo de biodegradação ou
waterwashing.
No trabalho desenvolvido por Cassani e Eglington (1991), no qual foi
avaliada a extensão da biodegradação em óleos extra-pesados provenientes do
cinturão asfáltico do Orinoco, foi observado que os esteróides triaromáticos de
elevado peso molecular encontravam-se intocados pelo processo de biodegradação.
Entretanto, aqueles contendo 20 e 21 átomos de carbono estavam ausentes nas
amostras analisadas, provavelmente devido ao ataque microbiano do óleo no próprio
reservatório.
4.3.5. Biodegradação dos compostos NSO
a) Compostos contendo nitrogênio
Transformações microbianas em compostos nitroaromáticos têm sido
observadas em ambientes aeróbicos, demostrando, inclusive, a habilidade de alguns
microrganismos em aproveitá-los como fonte de carbono e nitrogênio. Normalmente,
durante a biodegradação, o grupo nitro é eliminado na forma de nitrito, e a seguir
ocorre a clivagem do anel aromático através da ação de mono e dioxigenases e a
83
entrada no caminho metabólico característico para a degradação dos compostos
aromáticos (Funk et al. 1996).
b) Compostos contendo enxofre
A biodegradação de compostos como tiofeno, benzotiofeno e dibenzotiofeno,
tem sido amplamente divulgada em estudos onde eles foram utilizados como
substrato, tanto isoladamente como fazendo parte do petróleo. A degradação
aeróbica destes compostos por populações microbianas do meio ambiente natural,
também tem sido observada. Algumas cepas, principalmente do gênero
Pseudomonas, capazes de degradar estes compostos de enxofre, foram isoladas e
caracterizadas. A degradação de n-alquil benzotiofenos por culturas puras ou
mistas, tem sido menos estudada, mas sabe-se que quanto maior o número de
átomos de carbono da cadeia alquila, menor será a taxa de degradação (Morgan e
Watkinson, 1994).
c) Compostos contendo oxigênio
Com exceção de compostos fenólicos, ácidos graxos alifáticos e ácidos graxos
cicloalifáticos, cujo metabolismo ocorre via
β
-oxidação , a degradação de compostos
mais complexos contendo oxigênio tem sido pouco estudada. Alguns compostos
específicos têm recebido especial atenção, tais como: fluorenona, furanos e
dibenzofurano. Os poucos estudos mostram que estes compostos podem ser
metabolizados, sob condições aeróbicas, em diversos ambientes naturais,
principalmente por bactérias do gênero Pseudomonas (Morgan e Watkinson, 1994).
84
5. Metodologia aplicada ao monitoramento da técnica de
biorremediação
Para que se conheça o comportamento de um óleo derramado no meio
ambiente e se avalie a eficiência dos agentes usados na sua biorremediação, é
necessária uma seleção apropriada de métodos analíticos aplicáveis ao
monitoramento das mudanças composicionais decorrentes do processo de
biodegradação. O petróleo é uma mistura complexa, na qual os componentes podem
variar de moléculas simples como n-alcanos de baixo peso molecular a compostos
asfálticos. Conseqüentemente, as análises geoquímicas devem ser capazes de
separar, identificar e quantificar esses compostos.
O desenvolvimento de novos métodos e técnicas analíticas tem alcançado
êxito, tanto no fracionamento do petróleo em compostos saturados, aromáticos e
polares, através da cromatografia em fase líquida, como na análise qualitativa e
quantitativa dos componentes dessas frações. Para as análises qualitativas e
quantitavas desses componentes as técnicas mais empregadas são a cromatografia
em fase gasosa capilar, ou de alta resolução; e a cromatografia em fase gasosa
capilar acoplada à espectrometria de massa.
Para avaliações in situ da eficiência da técnica de biorremediação, tem sido
usada a respirometria, isto é, a medida do CO
2
produzido pelos microrganismos
degradadores durante a mineralização dos componentes do petróleo, aplicada
principalmente a solos e sedimentos (Pritchard et al., 1992; Swannell et al., 1994). A
verificação do aumento do número de microrganismos potencialmente degradadores
de hidrocarbonetos, através de seu isolamento em meios específicos e da contagem
das células viáveis, também tem sido aplicada no monitoramento de estudos sobre
biorremediação (Wrenn e Venosa, 1996; Balba et al., 1998; Ramsay et al., 2000).
A eficiência da técnica de biorremediação deve ser avaliada não somente pela
evidência química da degradação do óleo, como também em função da toxicidade
dos componentes do petróleo, dos produtos usados para acelerar sua
biodegradação, e dos metabólitos gerados ao longo do processo. A redução da
toxicidade, como resultado da biodegradação, é medida por ensaios toxicológicos e
85
tem sido usada como parâmetro indicativo para a finalização dos trabalhos de
descontaminação de ambientes impactados por derrames de petróleo (Prince et al.,
1994a; Wrabel e Peckol, 2000).
5.1. Aplicação da geoquímica orgânica na avaliação da técnica de
biorremediação
A geoquímica tem sido definida como “a ciência que estuda a distribuição e a
movimentação dos elementos químicos no nosso planeta”. Assim como a química, a
geoquímica pode ser subdividida em inorgânica e orgânica. Na figura 5.1 são
apresentadas as principais áreas de atuação da geoquímica orgânica (Brooks e Welte,
1984).
Figura 5.1: Principais áreas de aplicação da geoquímica orgânica (Brooks e Welte,
1984).
Uma das aplicações da geoquímica orgânica está diretamente ligada aos
estudos da origem, geração, processos de migração, acumulação e alterações da
composição química do petróleo, e é conhecida como Geoquímica do Petróleo. A
utilização da geoquímica do petróleo é relativamente recente, se iniciou a partir da
década de 70, mas foi em 1936 que o químico alemão Alfred Treibs identificou
importantes compostos orgânicos, conhecidos como porfirinas, em amostras de
Geoquímica
Orgânica
Estudos
Ambientais
Paleoquímica
Química de fósseis
Estratigrafia bioquímica
Origem e
distribuição de
combustíveis
fósseis
Sedimentos antigos
e
recentes
Oceanografia
Orgânica
Cosmoquímica
Vida extra-terrestre
Vida no
Précambriano
Origem da
vida
86
petróleo, folhelhos e carvões. Esses compostos, ape
87
procedência do petróleo presente em amostras retiradas de locais contaminados
(Wang e Fingas, 1997 e 1998; Wang et al, 1998a, 1998c; Barakat et al., 1999).
As informações obtidas das análises geoquímicas de amostras de óleo,
coletadas no meio ambiente, são extremamente importantes na solução de questões
relacionadas à responsabilidade legal por um derrame (Barbanti et al., 1998; Wang et
al., 1999; 2001a) e nas medidas de minimização do impacto ambiental que ele venha
a causar, através da escolha de técnicas de limpeza apropriadas, como a
biorremediação (Prince et al., 1994a; Bragg et al., 1994; Roques et al., 1994;
Moldowan et al., 1995; Hoff et al., 1995; Blenkinsopp et al., 1998; Oudot et al., 1998).
A identificação precisa de óleos derramados no meio ambiente é um desafio
para os geoquímicos e durante as duas últimas décadas tem-se observado um
grande avanço nas técnicas e metodologias de análise de hidrocarbonetos em
petróleo e derivados, e em amostras complexas, relacionadas à contaminação
ambiental (Roques et al. 1994; Wang et al., 1995b; Wang et al., 1998b; Wang et al.,
1999).
A seleção apropriada de métodos analíticos e sua aplicação de forma
padronizada são os requerimentos necessários para a avaliação de danos causados
por derrames de petróleo ao meio ambiente e aos recursos naturais, para a indicação
da estratégia de limpeza mais eficaz, avaliação da eficiência de produtos de
biorremediação e outros agentes de tratamento de derrames e ainda, para entender o
comportamento e o destino de óleos derramados nos ecossistemas marinhos e
terrestres (Pritchard e Costa, 1991; Pritchard et al.,1992; Fayad et al. 1992; Wang e
Fingas, 1995b).
5.1.1. Análises por cromatografia em fase líquida e em fase gasosa
Entre os métodos modernos de análise, a cromatografia ocupa um lugar de
destaque devido à sua facilidade em efetuar a separação, identificação e
quantificação de espécies químicas, especialmente em misturas complexas como o
petróleo. A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes
de uma mistura, realizada através da distribuição destes componentes entre duas
fases, onde uma permanece estacionada enquanto a outra se move através dela.
88
Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da
mistura são distribuídos entre elas, de tal forma que cada um dos componentes é
seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais
desses compostos. As técnicas cromatográficas mais empregadas nas análises de
petróleo e derivados são aquelas em fase líquida e gasosa (Collins et al., 1990).
A cromatografia líquida é empregada na separação das principais frações de
compostos do petróleo:
Fração de hidrocarbonetos saturados
– representada pelos
alcanos normais e ramificados, e pelos cicloalcanos. Fração de hidrocarbonetos
aromáticos
– que contém compostos com um ou mais anéis benzênicos, como os
HPA. Fração de compostos polares – constituída de resinas e asfaltenos. Essa
separação está baseada no princípio de que um soluto pode ser dissolvido por um
solvente de polaridade similar. Ela pode ser realizada em colunas de vidro recheadas
com adsorventes como sílica gel, florisil ou alumina, a pressão ambiente ou em colunas
de aço onde a amostra e os solventes são aplicados sob pressão. Dentre as técnicas
em que se aplicam os solventes sob pressão, encontram-se: as de cromatografia
líquida sob média pressão-MPLC (Medium Pressure Liquid Chromatografy),
normalmente utilizada no fracionamento do petróleo e a cromatografia líquida de alta
eficiência–HPLC (High Performance Liquid Chromatography), empregada em análises
quantitativas (Peters e Moldowan, 1993).
As frações do petróleo separadas por cromatografia líquida, podem ser
analisadas por métodos gravimétricos, por espectroscopia do infra–vermelho,
espectroscopia de fluorescência e do ultra–violeta. Entretanto, os métodos mais
utilizados são a cromatografia em fase gasosa e a cromatografia em fase gasosa
acoplada à espectrometria de massa (Wang e Fingas, 1995b).
Na técnica de cromatografia gasosa, a fase móvel empregada é um gás e sua
grande aplicação é na análise de compostos voláteis ou que possam ser volatilizados
sem ter suas estruturas alteradas pelo aquecimento. Atualmente, uma das técnicas
analíticas mais usadas em laboratório, principalmente na separação de misturas
complexas como petróleo e derivados e na identificação de seus numerosos
componentes é a cromatografia gasosa capilar ou de alta resolução. Nesta técnica a
fase estacionária é um líquido de elevado ponto de ebulição, depositado sobre as
89
paredes internas de colunas capilares flexíveis de sílica fundida, extremamente finas e
90
dessas razões ao longo da biorremediação, caracteriza o processo de
biodegradação, pois os hidrocarbonetos lineares, n-C
17
e n-C
18
são mais facilmente
biodegradados que os isoprenóides pristano e fitano (Winters e Willians, 1969 apud
Peters e Moldowan, 1993).
Em estágios mais avançados de biodegradação já não se identificam no
cromatograma os n-alcanos e os isoprenóides, restando somente uma mistura
complexa que não pode ser separada (resolvida) pela coluna cromatográfica,
chamada de UCM (Unresolved Complex Mixture). Essa mistura complexa é
identificada pela subida da linha de base do cromatograma e pelo aumento relativo
dos picos correspondentes aos compostos biomarcadores policíclicos. A elevação da
linha de base, conhecida como hump, é característica para alguns derivados do
petróleo, como óleos lubrificantes, e é especialmente pronunciada em óleos
biodegradados (Milner et al., 1977; Rubinstein et al., 1977 apud Peters e Moldowan,
1993).
Um conjunto de indicadores foram sugeridos para descrever a
biodegradabilidade de hidrocarbonetos alifáticos, baseado nas mudanças
composicionais características do processo de biodegradação (Wang et al. 1996).
Conforme o prosseguimento da biodegradação, preferencialmente sobre os n-
alcanos, observa-se a diminuição dos valores das razões apresentadas a seguir:
1. n-C
17
/ Pristano e n-C
18
/ Fitano
2.
Σ
n-alcanos/ (Pristano + Fitano)
3.
Σ
áreas dos picos resolvido por CG/ área da UCM
5.1.3. Análises por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa
Devido a não especificidade do detector de ionização de chama na
quantificação dos compostos mono e poliaromáticos e na identificação e
quantificação de moléculas complexas como os biomarcadores, das famílias dos
triterpanos e esteranos, a técnica mais apropriada é a de cromatografia gasosa de
alta resolução acoplada à espectrometria de massa (CG/EM), a qual combina
91
separação química com elevada resolução espectral (McFadden, 1973 apud Peters e
Moldowan, 1993; Roques et al.1994).
Um equipamento de cromatografia gasosa acoplado a um espectrômetro de
massa é constituído das seguintes unidades funcionais:
1. Cromatógrafo em fase gasosa com coluna capilar de alta resolução
2. Linha de transferência dos compostos
3. Câmara de ionização
4. Analisador de massa
5. Detetor de íons
6. Computador para aquisição, processamento e apresentação dos dados.
Após a separação dos componentes da mistura por cromatografia gasosa, os
compostos são transferidos para o espectrômetro de massa (CG/EM). Nos sistemas
mais modernos de CG/EM, em que são usadas colunas capilares, todos os
compostos que eluem da coluna passam diretamente para a câmara de ionização.
A ionização de cada composto que chega ao espectrômetro normalmente é
feita por impacto de elétrons. Os elétrons são gerados pelo aquecimento de um
filamento de tungstênio, e após serem acelerados adquirem a capacidade de ionizar
compostos que variam de 50 a 600 unidades de massa atômica (uma), em
intervalos de tempo inferiores a 3 segundos. Os elétrons acelerados bombardeiam
as moléculas do composto formando íons moleculares (M
+
), fragmentos menores e
moléculas neutras de menor peso molecular (Silverstein et al., 1979; Peters e
Moldowan, 1993).
Os íons e fragmentos formados são levados ao analisador de massa, do tipo
quadrupolo, e avaliados em função de sua razão massa/carga (m/z) e a seguir são
detectados por um multiplicador de elétrons que gera um perfil de fragmentação
característico do composto, conhecido como seu espectro de massa. O espectro de
massa de um determinado composto é obtido fixando-se o número de varreduras ou
tempo de retenção e plotando-se a razão m/z X resposta do detetor. Cada espectro
consiste de uma série de fragmentos de íons que podem ser usados na elucidação
da estrutura do composto, até mesmo a de estereoisômeros característicos de
92
compostos biomarcadores do petróleo. Um cromatograma de massa é obtido fixando-
se m/z e plotando-se tempo de retenção X resposta do detetor. Ele pode ser usado
para monitorar uma série de compostos de pesos moleculares variados, formados
após a fragmentação (Silverstein et al., 1979; Peters e Moldowan, 1993).
Para a aquisição e o processamento da grande quantidade de dados gerada
ao longo de uma análise, é necessário o uso de um computador. Durante uma
análise de CG/EM que dure aproximadamente 90 minutos, o espectrômetro de
massa analisa cerca de 1800 espectros, comparando cada um deles com aqueles
previamente existentes em sua biblioteca. Na identificação de componentes
desconhecidos em uma mistura de compostos a utilização da biblioteca é de grande
utilidade, pois o sistema compara o espectro de massas, obtido para o componente
desconhecido, com aqueles já padronizados, fornecendo, normalmente, duas opções
para a identificação do componente em questão.
A esse tipo de análise denomina-se full-scan (varredura completa), na qual
todo o espectro de íons - massa (50 – 600 uma) gerados pela fonte de ionização é
analisado, não havendo perdas de informações. Mas para isso é necessário que se
utilize um computador capaz de adquirir e processar uma grande quantidade de
dados. Na modalidade de full scan, é gerado um espectro de massa completo que
serve para ser usado na identificação qualitativa de compostos (Peters e Moldowan,
1993).
A modalidade mais empregada na análise quantitativa de biomarcadores do
petróleo já identificados é a de Detecção de Múltiplos Íons (MID–Multiple Ion
Detection), algumas vezes chamada de Monitoramento Seletivo de Íons (SIM–
Selected Ion Monitoring). Essa modalidade é usada no estudo de classes de
compostos como esteranos e hopanos, através da definição da razão massa/carga
(m/z) do fragmento base (o de maior abundância relativa, no espectro de massa do
principal representante da família) gerado por todos os componentes de uma família
(Steen, 1986 apud Peters e Moldowan, 1993).
Na técnica de Monitoramento Seletivo de Íons são escolhidos íons específicos
ou valores de m/z, obtendo-se perfis de distribuição chamados de fragmentogramas
de famílias de compostos que possuem estruturas moleculares semelhantes entre si.
No caso dos biomarcadores os íons mais usados são: triterpanos (m/z=191) e
93
esteranos (m/z=217). Para os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos alquilados:
naftalenos (m/z=157 e 170), fenantrenos (m/z=192), dibenzotiofenos (m/z=198),
fluorenos (m/z=180), e esteróides triaromáticos (m/z=231 e 245).
5.1.4. Monitoramento geoquímico da biodegradação de hidrocarbonetos
policíclicos saturados e de compostos policíclicos aromáticos
Os compostos policíclicos saturados pertencentes aos grupos dos terpanos
tricíclicos, tetracíclicos e pentacíclicos; e dos esteranos e metil esteranos, têm
desempenhado um importante papel na avaliação do processo de biodegradação.
Alguns desses compostos, por serem mais resistentes às intempéries e ao ataque
microbiano, atuam muitas vezes como padrões internos no monitoramento da
eficiência da técnica de biorremediação. O composto mais utilizado tem sido o C
30
17
α
(H) 21
β
(H)
−
hopano por ser um constituinte comumente encontrado no petróleo
(Prince et al., 1994b; Roques et al., 1994; Bragg et al., 1994; Douglas et al., 1994;
Bence et al., 1996).
Entretanto, alguns trabalhos de pesquisa sinalizam que os biomarcadores
podem ser parcialmente biodegradados, tanto pela ação de processos de
intemperismo sobre o óleo derramado, como pela aplicação da técnica de
biorremediação (Wang et al., 2001b; Moldowan et al., 1995). Wang et al., (2001b)
avaliaram os efeitos do intemperismo e da biodegradação sobre os componentes do
petróleo derramado pelo navio tanque Metula em 1974, na Baía de Quintero, Chile.
Para avaliação do processo de biodegradação sobre os biomarcadores, os
pesquisadores utilizaram razões entre as concentrações de compostos “alvo”, como
indicadores da extensão da degradação. As relações que forneceram os resultados
mais significativos são apresentadas a seguir. Os biomarcadores mais suscetíveis à
biodegradação, em cada relação, são indicados em negrito.
94
C
23
/C
24
C
35
(S)/C
30
C
32
(S)/C
29
-nor
C
31
(S)/C
31
(R) C
35
(R)/C
30
C
32
(R)/C
29
-nor
C
32
(S)/C
32
(R)
C
27
αββ
αββαββ
αββ/ C
29
αββ-esteranos
C
33
(S)/C
29
-nor
C
33
(S)/C
33
(R)
C
29
(20S)
αββ
/ C
29
αββ
αββαββ
αββ
-esteranos
C
33
(R)/C
29
-nor
C
23
/C
30
C
23
/C
29
-nor Ts/ C
29
-nor
C
23
/C
30
C
29
/C
29
-nor Ts/Tm
C
33
(R)/C
30
C
30
/C
29
-nor Tm/ C
29
-nor
C
34
(S)/C
30
C
31
(S)/C
29
-nor
C
27
αββ
αββαββ
αββ
/C
29
-nor
C
34
(R)
/C
30
C
31
(R)
/C
29
-nor
Onde:
C
23
= C
23
terpano tricíclico; C
24
= C
24
terpano tricíclico; C
30
= 17α(H),21β(H)-hopano;
C
29
= 17α(H),21β(H)-30-norhopano (25 nor-hopano);
C
29
-nor = C
29
18 α(H), 21β(H) - 30 norneohopano;
Ts = 18α(H), 21β(H) - 22, 29, 30 - trisnorhopano;
Tm = 17α(H), 21β(H) - 22, 29, 30 - trisnorhopano;
C
31
(S) = 22(S) 17α(H), 21β(H) - 30 - homohopano;
C
31
(R) = 22(R) 17
α
(H), 21
β
(H) - 30 - homohopano;
C
32
(S) = 22 (S) 17
α
(H), 21
β
(H) - 30, 31 - bishomohopano;
C
32
(R) = 22 (R) 17
α
(H), 21
β
(H) - 30, 31 - bishomohopano;
C
33
(S) = 22 (S) 17
α
(H), 21
β
(H) - 30, 31, 32 - trishomohopano;
C
33
(R) = 22 (R) 17α(H), 21β(H) - 30, 31, 32 - trishomohopano;
C
34
(S) = 22 (S) 17α(H), 21β(H) - 30, 31, 32, 33 - tetrakishomohopano;
C
34
(R) = 22 (R) 17α(H), 21β(H) - 30, 31, 32, 33 - tetrakishomohopano;
C
35
(S) = 22 (S) 17α(H), 21β(H) - 30, 31, 32, 33, 34 - pentakishomohopano;
C
35
(S) = 22 (S) 17α(H), 21β(H) - 30, 31, 32, 33, 34 - pentakishomohopano;
C
27
αββ = C
27
αββ (20R+20S) colestanos;
C
29
αββ
esteranos = C
29
αββ
(20R) estigmastano + C
29
αββ
(20S) estigmastano;
C
29
(20S)
αββ
= C
29
αββ
(20S) estigmastano.
Num trabalho onde foi avaliado o progresso da biorremediação, em landfarm,
de resíduos oleosos provenientes de refinaria, foi usada uma escala de medida da
extensão da biodegradação (figura 5.3) dos principais componentes presentes no
95
petróleo, baseada em resultados obtidos de análises geoquímicas de óleos maturos
naturalmente biodegradados em reservatório. As análises realizadas em amostras de
solos, coletadas em diferentes pontos do landfarm, mostraram que compostos como
os biomarcadores e os HPA estavam presentes, embora estivessem sendo
removidos com o progresso da biodegradação. A utilização da escala de medida da
biodegradação mostrou ser um instrumento válido no monitoramento da técnica de
biorremediação, necessitanto, entretanto, ser recalibrada para as condições naturais
de biodegradação encontradas no solo (Moldowan et al. 1995).
Escala n-parafinas
isoprenóides esteranos
hopanos
diasteranos
aromáticos
Leve
1
2
3
Média
4
5
Forte
6
7
Muito
forte
8
9
Severa
10
Figura 5.3: Escala de medida da extensão da biodegradação das classes de
hidrocarbonetos que compõem o petróleo (modificada de Peters e Moldowan, 1993).
No trabalho de pesquisa desenvolvido por Wang et al. (1996) foram avaliadas
as mudanças composicionais ocorridas em um óleo submetido à biorremediação em
laboratório. No monitoramento da eficiência da técnica de biorremediação sobre a
fração de hidrocarbonetos aromáticos, foram selecionados cinco grupos de
policíclicos aromáticos alquilados. Como resultado das análises de CG/EM das
amostras de óleo biodegradado, foi observada a seguinte ordem decrescente de
96
degradação: naftalenos > fluorenos > dibenzotiofenos > fenantrenos > crisenos, e
ainda, um decréscimo na suscetibilidade à biodegradação em função do aumento do
número de radicais alquila. Os autores também verificaram que o processo de
biodegradação dos homólogos alquilados era isômero específico, isto é, priorizava
um determinado homólogo dentro de um grupo de HPA, gerando razões indicadoras
de biodegradação para esses grupos de compostos. A seguir são apresentadas as
principais razões selecionadas pelos pesquisadores. Os compostos identificados
como os mais suscetíveis ao processo de biodegradação encontram-se em negrito.
1. 2/3 metil dibenzotiofeno / 4 metil dibenzotiofeno.
2. (
3 metil fenantreno
+
2 metil fenantreno
) / (9 metil fenantreno + 1 metil
fenantreno)
3. (1,3 dimetil naftaleno + 1,6 dimetil naftaleno) / Σ dimetil naftalenos
4. metil fluoreno / Σ metil fluorenos
5.2. Aplicação de ensaios microbiológicos e ecotoxicológicos na
avaliação da técnica de biorremediação
A biorremediação é considerada uma tecnologia ecologicamente correta e de
baixo custo, particularmente quando aplicada a locais contaminados por petróleo.
Entretanto, as taxas de biodegradação dos componentes do óleo variam com o local
e com fatores ambientais e são limitadas pela capacidade metabólica das
populações de microrganismos indígenos degradadores de hidrocarbonetos. A
eficiência da técnica de biorremediação depende do sucesso na identificação dos
fatores limitantes e de sua otimização, através de testes de monitoramento. Ensaios
microbiológicos são normalmente usados na determinação do potencial degradador
da microflora local, da taxa e da extensão com que a biodegradação acontece
durante a biorremediação (Balba et al., 1998).
A técnica de análise microbiológica mais usada no monitoramento da
biorremediação é a de contagem em placas do número de microrganismos
heterotróficos e degradadores de hidrocarbonetos, através do método do Número
Mais Provável (NMP). Wrenn e Venosa (1996) desenvolveram um procedimento
97
analítico em que foi possível selecionar bactérias degradadoras de hidrocarbonetos
alifáticos daquelas que cresciam às custas de aromáticos. Essa seleção foi
conseguida através da utilização de meios de crescimento contendo substratos
específicos. Para a seleção das bactérias degradadoras de alcanos foi usado o
hexadecano e para aquelas degradadoras de compostos aromáticos, uma mistura de
fenantreno, antraceno, fluoreno e dibenzotiofeno. Essa contagem pode ser feita em
amostras do local a ser remediado, com o objetivo de fornecer informações sobre a
atividade biológica, e sobre o nível de aclimatação da população indígena, isto é, sua
capacidade de conduzir o processo de biodegradação. O monitoramento do
crescimento de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos também é usado ao
longo da biorremediação, visando a medida de sua eficiência (Balba et al., 1998;
Ramsay et al., 2000).
Outra técnica de monitoramento da biorremediação, a respirometria, está
relacionada aos estudos de mineralização de contaminantes, presentes
especialmente em solos e sedimentos. A medida da produção de CO
2
pode fornecer
excelentes informações, num curto espaço de tempo, sobre o potencial de
biodegradabilidade de hidrocarbonetos encontrados em ambientes contaminados,
quando submetidos à suplementação de nutrientes ou à inoculação de
microrganismos degradadores (Pritchard et al., 1992; Swannell et al., 1994; Balba et
al., 1998, Carvalho et al., 2001).
Além da comprovação da eficiência da técnica de biorremediação, com a
redução da concentração de contaminantes no meio ambiente, é necessária a
demonstração de que a biorremediação não produz compostos intermediários ou
metabólitos tóxicos aos organismos. É igualmente necessário que não se promova
efeitos ecológicos indesejáveis como a eutrofização, isto é, a proliferação de algas
devido ao aumento da concentração de nutrientes (Prince et al., 1994a; Lee, 1999;
Ramsay et al., 2000).
Um dos testes usados para a medida da toxicidade aguda de produtos ou
metabólitos sobre um ecossistema, é o teste MICROTOX®, um bioensaio rápido,
com duração aproximada de 1 hora, e que pode ser aplicado a amostras de solos,
sedimentos, água doce e água do mar, contaminados por petróleo (Prince et al.,
1994a; Balba et al., 1998). Ele se baseia na quantificação da luminescência natural
98
emitida por bactérias bioluminescentes, como resultado do seu metabolismo
respiratório. Nesse teste é usada a bactéria marinha Vibrio fischeri, que na presença
de substâncias tóxicas tem sua bioluminescência reduzida, proporcionalmente à
toxicidade do composto em questão.
99
6. Condições experimentais e analíticas
6.1. Simulação de derrames de petróleo em água do mar
Os experimentos de biorremediação desenvolvidos para testar a eficiência
dos diferentes produtos em biodegradar os componentes do petróleo, foram
conduzidos em unidades de simulação de derrames no mar. As unidades de vidro
com as dimensões de 60 cm de largura, 80 cm de profundidade e 20 cm de altura,
foram preenchidas com 50 litros de água do mar, coletada na Praia de Cavaleiros,
Macaé –RJ.
As unidades foram instaladas em um galpão de 15 m
2
, construído em madeira
com as paredes laterais revestidas de tela, e coberto por telhas transparentes. Todo
o conjunto foi projetado com a finalidade de facilitar a ventilação e a entrada de luz
solar (figura 6.1).
Sobre a superfície da água foi simulado o derrame de 50 ml de petróleo
perfazendo uma concentração de 1g/l de água do mar. As unidades foram
equipadas com bombas para aeração da água e simulação de ondas (figura 6.2). Foi
mantido o volume de água presente em cada unidade de simulação, através da
adição em partes iguais de água do mar fresca e água destilada a cada 3 dias, ao
longo de cada experimento.
6.2 Análises geoquímicas do petróleo
Nesta pesquisa foram realizadas análises geoquímicas dos óleos originais e
das amostras de óleo biodegradado ao longo dos experimentos, com o objetivo de
qualificar e quantificar as mudanças na composição química do óleo submetido aos
diferentes produtos usados na biorremediação. Na figura 6.3 é apresentado o
fluxograma de análise para as amostras de óleo.
100
Figura 6.1
: Galpão onde foram instaladas as unidades de simulação dos derrames.
Figura 6.2: Simulação de um derrame em uma das unidades de simulação.
101
6.2.1. Amostragem dos óleos degradados
A técnica de coleta de amostra de óleo utilizada nos experimentos foi a de
amostragem composta. Foram coletadas amostras de quatro locais diferentes da
superfície da mancha de óleo sobrenadante, presente em cada uma das unidades
de simulação, as quais foram homogeneizadas e agrupadas formando uma única
amostra composta. A quantidade de amostra coletada foi de aproximadamente 0,5 g
de óleo degradado. Após a coleta as amostras foram processadas, conforme
fluxograma apresentado na figura 6.3, para as análises geoquímicas.
6.2.2. Análise de n-alcanos e isoprenóides por cromatografia gasosa capilar
O monitoramento da biorremediação de n-alcanos e isoprenóides, foi feito por
cromatografia gasosa capilar acoplada a um detector de ionização de chama. Essa
técnica é capaz de identificar e quantificar alcanos normais e ramificados em
amostras de óleo. O processo de biodegradação foi avaliado através da diminuição
das razões de n-C
17
/P e n-C
18
/F, considerando-se que os hidrocarbonetos normais,
n-C
17
e n-C
18
,
são mais facilmente biodegradados que os isoprenóides pristano e
fitano. As análises por cromatografia gasosa capilar foram realizadas no Laboratório
de Cromatografia da UN/BC – SOP/LF - PETROBRAS. As condições analíticas
foram:
Condições Cromatográficas:
- Cromatógrafo em fase gasosa Hewlett- Packard – modelo 6890
- Detector de ionização de chama (FID), gases de chama: ar sintético + H
2
+ N
2
- Gás de arraste: H
2
- Fluxo do gás de arraste: 2,2 ml/min
- Coluna HP 5% fenilmetilsiloxano, comprimento 30 m X 320
µ
m X 0,25
µ
m
- Temperatura do injetor: 280
0
C
- Temperatura do detector: 340
0
C
- Temperatura do forno: T. inicial: 40
0
C (2,5
0
C / min), T. final: 320
0
C (18 min)
- Tempo de corrida: 130 minutos
102
103
Todo o conjunto foi evaporado em capela, a temperatura ambiente, e o volume
completado a 1 ml, com diclorometano, para posterior injeção no cromatógrafo. O
padrão utilizado tem pureza de 98%, e o fornecedor é o Cambridge Isotope Lab. Esse
padrão foi cedido pela Gerência de Geoquímica – CENPES/PETROBRAS.
6.2.3. Fracionamento das amostras de óleo por cromatografia líquida à média
pressão (MPLC)
As amostras de óleo coletadas das unidades de simulação, para serem
analisadas por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG/EM),
passaram inicialmente por um processo de separação, gerando três frações:
hidrocarbonetos saturados, hidrocarbonetos aromáticos, compostos polares ou NSO.
A separação foi realizada em um sistema MPLC (Medium Pressure Liquid
Cromatograph). O sistema constitui-se de uma bomba para fornecimento da fase
móvel líquida, um módulo para injeção da amostra, um detector UV (ultravioleta) e um
detector IR (índice de refração) para monitorar a eluição das frações, e um coletor
automático de frações.
Na primeira etapa da separação cromatográfica os compostos polares foram
retirados do óleo, através da passagem da amostra por uma pré-coluna. Os
hidrocarbonetos saturados e aromáticos que atravessaram a pré-coluna sem sofrerem
retenção, foram concentrados na coluna principal, a qual realiza a separação das
frações de saturados e aromáticos. A coluna principal foi recheada com sílica
termicamente desativada, e o solvente usado como eluente ou fase móvel foi o n-
hexano. A saída da coluna dos hidrocarbonetos saturados, sensíveis ao detector de
IR, foi registrada sob a forma de um pico e o extrato obtido foi coletado em um
recipiente apropriado. Após a retirada completa dos saturados, indicada pela queda
de intensidade do registro (final do pico), foi invertido o sentido do fluxo de n-hexano
que passava pela coluna, tendo nted[(r)-1(e)1(843)1(n)1(ted(ta)1( )1(a)1(d)-103e)1(n)1-103enboto-5(r)-1(oe103e)1(n)16( )-82()-108(a)1()1-1(b)1(o)341tio(m)-5(p)-108.(a)1()1-118-103endo n
104
As frações de hidrocarbonetos saturados, aromáticos e a de compostos polares
(NSO), separadas por cromatografia líquida, foram evaporadas à temperatura
ambiente. Após a evaporação as frações foram transferidas com diclorometano, para
vidros previamente tarados. Os frascos contendo as frações e o solvente foram
levados novamente para evaporar em capela e pesados até peso constante para
obtenção da porcentagem em peso de cada grupo de compostos presente na amostra
de óleo analisada (Frota, 1996). Essas análises foram realizadas nos laboratórios da
Gerência de Geoquímica – CENPES/PETROBRAS.
6.2.4. Análise de terpanos, esteranos e policícliclos aromáticos por
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa
Para se monitorar as alterações sofridas por compostos biomarcadores do
grupo dos triterpanos e esteranos, e policíclicos aromáticos, foram conduzidas
análises por cromatografia em fase gasosa acoplada a um espectrômetro de massa.
O sistema CG/EM utilizado consiste de um cromatógrafo em fase gasosa conectado a
um espectrômetro de massa, controlados por computador para aquisição e edição de
dados. As condições analíticas foram:
Condições cromatográficas
:
- Cromatógrafo em fase gasosa Hewlett-Packard - modelo 5890/II
- Coluna capilar J&W Scientific DB-5 (30 m X 0,25 mm DI, filme da fase
estacionária com 0,25 µm de espessura)
- Programação de temperatura
55
0
C (2 min)
55
0
C 190
0
C (30
0
C/min)
190
0
C 250
0
C (1,5
0
C/min)
250
0
C 300
0
C (2,0
0
C/min)
300
0
C (20 min)
105
Condições do espectrômetro de massa:
- Espectrômetro de massa Hewlett-Packard - modelo 5870 MSD.
- Temperatura da interface; 285
0
C
- Ionização por impacto de elétrons
- Energia do feixe de elétrons de 70 eV
- Varredura por monitoramento seletivo de íons (SIM).
Os íons monitorados ao longo dos experimentos, na fração de
hidrocarbonetos saturados, foram: m/z=191 e 177 para os triterpanos e m/z=217
para os esteranos. Na fração de aromáticos foram monitorados os seguintes íons
correspondentes às famílias dos policíclicos aromáticos alquilados: naftalenos m/z=
156 e 170; fenantrenos m/z= 192; dibenzotiofenos m/z= 198. Essas análises foram
realizadas nos laboratórios da Gerência de Geoquímica – CENPES/PETROBRAS,
sob a responsabilidade da Dra. Silvana Maria Barbanti.
6.3. Análises microbiológicas e ecotoxicológicas
6.3.1. Avaliação do número de bactérias heterotróficas e degradadoras de
hidrocarbonetos
A contagem do número de células bacterianas presentes na água do mar, na
qual foram simulados os derrames, foi realizada para monitorar o aumento da
população microbiana ao longo dos experimentos de biorremediação. Foi avaliado o
crescimento de dois grupos de bactérias: as heterotróficas que utilizam compostos
orgânicos como fonte de carbono e energia, e as heterotróficas pertencentes a um
grupo mais específico, as bactérias degradadoras de hidrocarbonetos. O
monitoramento do aumento dessas populações foi usado como um parâmetro de
avaliação da eficiência da técnica de biorremediação.
A metodologia utilizada para avaliação do número de bactérias foi a do NMP -
Número Mais Provável de células. Para a avaliação do número das bactérias
heterotróficas foi usado o meio Tryptic Soy Broth – TSB, e para as degradadoras de
hidrocarbonetos o meio mineral Bushnell-Haas. Essas análises foram realizadas em
106
amostras de água coletadas semanalmente das unidades de simulação e enviadas
refrigeradas para análise num prazo inferior a 48 horas. As análises foram conduzidas
pelos laboratórios da Gerência de Biotecnologia e Tratamentos Ambientais –
CENPES/PETROBRAS, sob responsabilidade da Dra. Antônia Garcia Torres Volpon.
.
6.3.2. Avaliação ecotoxicológica dos produtos testados nos experimentos de
biorremediação
A avaliação toxicológica dos produtos usados nestes experimentos foi realizada
utilizando a técnica do MICROTOX®. Nessa pesquisa, as análises foram realizadas
em amostras de água do mar, retiradas das unidades de simulação, semanalmente, e
enviadas ao laboratório sob refrigeração, num prazo não superior a 24 horas após a
coleta. As análises foram realizadas somente no último experimento, no qual foram
definidos os produtos e as concentrações mais eficientes. Essas análises também
foram realizadas pelos laboratórios da Gerência de Biotecnologia e Tratamentos
Ambientais – CENPES/PETROBRAS, sob responsabilidade da Dra. Antônia Garcia
Torres Volpon.
6.4. Análise da concentração residual dos íons amônio e fosfato
Com o objetivo de se avaliar o consumo pelos microrganismos das fontes de
nitrogênio e fósforo, provenientes do fertilizante NPK ao longo do último experimento,
foram coletadas amostras de água das unidades de simulação e medidas as
concentrações residuais dos compostos contendo nitrogênio e fósforo. O fertilizante
NPK é composto por fosfato monoamônico, sulfato de amônia, cloreto de potássio, e
farelo de algodão, como carga inerte. Na formulação do NPK (10:10:10) são usadas
as seguintes proporções entre seus componentes: 10% do íon fosfato, 10% do íon
amônio e 10% do de potássio, perfazendo uma concentração de 0,1g de cada íon
para um grama de fertilizante.
A preparação das amostras de água para a medida da concentração residual
dos íons amônio e fosfato, envolveu a retirada dos microrganismos presentes nas
amostras, com o objetivo de garantir a interrupção da absorção desses nutrientes pela
107
microflora. A separação foi realizada por filtração da água em membranas de éster de
celulose com porosidade de 0,2 µm e 25 mm de diâmetro. As amostras foram
congeladas e mantidas no freezer até sua análise.
As concentrações residuais de nitrogênio amoniacal e de fosfato, presentes na
água, foram determinadas por espectrofotometria, através da medida da absorbância
dos produtos coloridos obtidos para cada um dos íons, contra uma curva padrão de
sulfato de amônia e de fosfato de potássio, respectivamente. A absorbância do
produto contendo nitrogênio amoniacal foi medida a um comprimento de onda de 480
nm, e a do produto com fosfato a 725 nm. Essas análises foram realizadas no
Laboratório de Fitotecnia, CCTA/UENF, sob responsabilidade do Prof. Dr. Pedro
Henrique Monerat.
7. APRESENTAÇÃO DOS EXPERIMENTOS E DISCUSSÃO
DOS RESULTADOS
Neste capítulo são apresentados os experimentos desenvolvidos e os
resultados alcançados nesta pesquisa, que visaram avaliar a aplicação de
determinados produtos na técnica de biorremediação de derrames de petróleo em
água do mar, simulados em laboratório. São igualmente discutidos os resultados
obtidos dos monitoramentos: geoquímico, realizado em amostras de óleo, do
microbiológico e do ecotoxicológico, realizados em amostras de água, coletadas
das unidades de simulação, visando a medida da eficiência dos diferentes
produtos testados, como aceleradores do processo de biodegradação dos
componentes do petróleo.
7.1. Caracterização geoquímica dos óleos de Marlim e Albacora
Na avaliação do tipo de óleo a ser usado nos experimentos foram utilizadas
amostras provenientes de dois campos gigantes, Marlim e Albacora, situados na
maior região de exploração e produção de petróleo do Brasil: Bacia de Campos
(UN/BC – Petrobras), localizada na região norte do Estado do Rio de Janeiro.
A avaliação geoquímica desses óleos teve como objetivo, servir de base
para comparação dos resultados obtidos das análises geoquímicas das amostras
de óleo degradado, coletadas das unidades de simulação nas diferentes
condições experimentais. Os óleos foram caracterizados em função de parâmetros
físico – químicos pelo Laboratório de Fluidos da UN/BC, fornecendo os resultados
apresentados na tabela 7.1.
Tabela 7.1: Parâmetros físico-químicos dos óleos de Albacora e Marlim.
Tipo de óleo Densidade (kg/l) API ° Viscosidade (cp a 20
o
C)
Albacora 0,8892 26,9 54,2
Marlim 0,9338 19,4 467,5
A caracterização geoquímica do óleo total através da técnica de
cromatografia gasosa, com a utilização de uma mistura padrão de n-alcanos,
gerou os cromatogramas apresentados na figura 7.1.
Figura 7.1: Cromatogramas dos óleos originais de Albacora e Marlim.
Comparando-se os perfis cromatográficos dos dois óleos, observa-se que o
de Marlim apresenta-se empobrecido em n-alcanos e mostra um desvio da linha
base do cromatograma. Esse hump representa uma mistura complexa de
componentes do óleo que não puderam ser separados pela coluna cromatográfica
(UCM).
Óleo original de Albacora
Óleo original de Marlim
Para o óleo de Albacora foi realizada a quantificação dos n-alcanos e dos
isoprenóides, pristano e fitano presentes numa amostra pesada a
aproximadamente 50 mg, ao décimo de miligrama, e adicionado um volume pré-
definido da solução do padrão cromatográfico n-tetracosano deuterado. O resultado
dessa análise cromatográfica é apresentado na tabela 7.2.
Tabela 7.2
: Quantificação dos n-alcanos de n-C
8
a n-C
35
, pristano e fitano
presentes no óleo de Albacora.
Albacora mg/g
n-C
8
56,65
n-C
9
42,60
n-C
10
31,68
n-C
11
26,82
n-C
12
25,61
n-C
13
25,88
n-C
14
34,58
n
-C
15
27,02
n-C
16
20,46
n-C
17
17,39
Pristano 8,95
n-C
18
13,10
Fitano 5,15
n-C
19
12,14
n-C
20
10,61
n-C
21
8,67
n-C
22
8,18
n-C
23
7,87
n-C
24
7,45
n-C
25
7,56
n-C
26
7,14
n-C
27
7,02
n-C
28
6,28
n-C
29
6,02
n-C
30
6,24
n-C
31
4,36
n-C
32
3,89
n-C
33
2,4
n-C
34
1,6
n-C
35
1,37
TOTAL 444,69
Com base nessa quantificação foram calculadas as razões de
n
-C
17
/P e
n
-
C
18
/F para o óleo de Albacora. Para o de Marlim, os cálculos foram realizados
através da medida manual das alturas dos picos, no cromatograma, referentes aos
n–C
17
, n–C
18
, pristano e fitano. Os resultados obtidos para ambos os óleos são
apresentados na tabela 7.3.
Tabela 7.3: Relações entre os n-alcanos, n–C
17
, n–C
18
, pristano e fitano dos óleos
de Albacora e Marlim. Onde P = pristano e F = fitano.
Tipo de óleo n-C
17
/P n-C
18
/F P/F
Albacora 1,9 2,5 1,7
Marlim
0,4 0,6 2,0
O perfil cromatográfico do óleo de Marlim, empobrecido em n-alcanos com
baixos valores obtidos para as relações de n-C
17
/P e n-C
18
/F e a presença de uma
mistura complexa de compostos não separados pela coluna cromatográfica, indica
que o mesmo apresenta-se biodegradado.
A análise por cromatografia líquida forneceu os percentuais das frações de
hidrocarbonetos saturados, aromáticos e de compostos NSO presentes nos dois
óleos (tabela 7.4), demonstrando que o de Marlim apresenta uma maior
percentagem de compostos NSO, podendo caracterizar o processo de
biodegradação.
Tabela 7.4: Percentual de hidrocarbonetos saturados, aromáticos e de compostos
NSO, nos óleos de Albacora e de Marlim.
Tipo de óleo % Hidroc. Saturados % Hidroc. Aromáticos % NSO
Albacora 51,9 24,9 23,2
Marlin 41,9 26,9 31,2
Os resultados obtidos do fracionamento por cromatografia líquida dos óleos
originais de Marlim e Albacora foram plotados em um diagrama ternário (Tissot e
Welte, 1984). Observa-se que o óleo de Marlim está localizado próximo à região
dos óleos biodegradados (figura 7.2).
Figura 7.2: Localização dos óleos de Albacora e Marlim no diagrama ternário das
percentagens dos hidrocarbonetos saturados, aromáticos e de compostos NSO
(modificado de Tissot e Welte, 1984)
A avaliação geoquímica da distribuição dos hidrocarbonetos policíclicos
saturados das categorias dos terpanos e esteranos foi realizada por cromatografia
gasosa acoplada à espectrometria de massa. Os resultados obtidos são
apresentados nas figuras 7.3 e 7.4, na forma de fragmentogramas dos íons
m/z=191 e 217.
Figura 7.3
: Fragmentogramas dos terpanos (m/z=191) dos óleos de Albacora e
Marlim.
1 Tricíclico C
20
2 Tricíclico C
21
3 Tricíclico C
22
4 Tricíclico C
23
5 Tricíclico C
24
6
Tricíclicos C
25
α e β
7
Tetracíclico C
24,
Tricíclicos C
26
α
e
β
8
Tricíclicos C
28
α e β
9
Tricíclicos C
29
α e β
10
C
27
18
α
(H) 22, 29, 30 Trisnorneohopano (Ts)
11
C
27
17 α (H) 22, 29, 30 Trisnorhopano (Tm)
12
C
29
17
α
21
β
30 norhopano
13
C
30
17 α 21 β hopano
14
C
31
17 α 21 β homohopanos 22 S e 22 R
15
C
32
17
α
21
β
homohopanos 22 S e 22 R
16
C
33
17 α 21 β homohopanos 22 S e 22 R
17
C
34
17
α
21
β
homohopanos 22 S e 22 R
18
C
35
17
α
21
β
homohopanos 22 S e 22 R
Figura 7.4: Fragmentogramas dos esteranos (m/z=217) dos óleos de Albacora e
Marlim.
1
C
27
13 β, 17 α diacolestano 20 S
2
C
27
13 β, 17 α diacolestano 20 R
3
C
27
5
α,
14
α,
17
α,
colestano 20 S
4
C
27
5 α, 14 β, 17 β, colestano 20 R
5
C
27
5
α,
14
β,
17
β,
colestano 20 S
6
C
27
5 α, 14 α, 17 α, colestano 20 R
7
C
28
5 α, 14 α, 17 α, ergostano 20 S
8
C
28
5
α,
14
β,
17
β,
ergostano 20 R
9
C
28
5 α, 14 β, 17 β, ergostano 20 S
10
C
28
5
α,
14
α,
17
α,
ergostano 20 R
11
C
29
5 α, 14 α, 17 α, estigmastano 20 S
12
C
29
5 α, 14 β, 17 β, estigmastano 20 R e 20 S
13
C
29
5
α,
14
α,
17
α,
estigmastano 20 R
A similaridade dos perfis de distribuição dos terpanos e esteranos indica a
existência de uma origem comum a ambos os óleos. No entanto, podem ser
observadas diferenças, quando se comparam os fragmentogramas m/z=217 de
Marlim e Albacora, entre as abundâncias relativas dos picos correspondentes a
C
27
α α α
20S e C
27
α β β
20R (1) e dos C
29
α α α
20S e C
29
α β β
20R e 20S (2). A
redução da abundância relativa dos picos C
27
α β β 20R e C
29
α β β 20R
e
20S, no
óleo de Marlim, pode ser conseqüência de biodegradação. Outra diferença
observada envolve as medidas das abundâncias relativas dos dois maiores picos,
C
29
α β hopano e o C
30
α β hopano, nos fragmentogramas (m/z=191) dos óleos de
Marlim e Albacora, podendo ser indicativa da biodegradação do C
30
α β hopano.
Para complementar essa análise, na figura 7.5 são mostrados os
fragmentogramas m/z=177 dos óleos de Albacora e de Marlim, em que são
apresentados os hopanos demetilados: C
28
25-nor-17α, 21β -hopano e o C
29
25-
nor-α β hopano, resultantes do processo de biodegradação sobre C
29
α β hopano e
o C
30
α β hopano, respectivamente.
Figura 7.5: Fragmentogramas m/z=177 dos óleos de Albacora e de Marlim, onde
(1) = C
28
25-nor
α β
hopano e (2) = C
29
25-nor
α β
hopano.
A relação entre a abundância relativa do C
29
α β
hopano e a do C
28
25-nor-
α β
hopano, no óleo de Marlim, é de 2,6. No caso do óleo de Albacora essa
relação é de 3,0. Essa diferença está relacionada a uma maior quantidade do C
28
25-nor-α β hopano, no óleo de Marlim, indicando um processo de biodegradação.
A análise quantitativa dos hidrocarbonetos policíclicos saturados foi realizada
somente para o óleo de Albacora. Na tabela 7.5 são apresentadas as principais
relações envolvendo os compostos passíveis de sofrerem alterações em função
dos processos de biodegradação e evaporação e aquele considerado mais
resistente, o C
30
α β hopano (Wang et al., 2001b). O C
30
α β hopano tem sido
usado por alguns pesquisadores como padrão interno na medida de alterações,
decorrentes da ação de processos de intemperismo sobre a composição química
de óleos (Prince et al., 1994b; Roques et al., 1994; Bragg et al., 1994; Douglas et
al., 1994; Bence et al., 1996)
Tabela 7.5: Principais relações entre os hidrocarbonetos policíclicos saturados do
óleo de Albacora. Onde hopano = C
30
α β
hopano, C
23
e C
24
= terpanos tricíclicos,
25 norhopano = C
29
25-nor-
α β
hopano, e C
35
(R) = C
35
α β
22R homohopano.
Parâmetros Albacora
C
23
/ C
24
1,50
C
23
/hopano 3,45
25
norhopano/hopano 0,90
C
35
(R) / hopano
0,79
Esterano C
27
αββ
αββαββ
αββ
(R) /hopano
0,84
A caracterização geoquímica da fração de compostos policíclicos
aromáticos presentes nos óleos de Albacora e Marlim foi realizada por
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa. Essa análise gerou
fragmentogramas dos principais grupos de compostos metilados: metil
fenantrenos (m/z=192) e metil dibenzotiofenos (m/z=198). Esses resultados
encontram-se na figura 7.6.
Figura 7.6: Fragmentogramas de compostos metilados da fração de policíclicos
aromáticos, (A) Os isômeros 3, 2, 9 e 1 metil fenantrenos (m/z=192), (B) Os
isômeros 4, 2/3 e 1 metil dibenzotiofenos (m/z=198) dos óleos de Albacora e
Marlim.
A partir da análise desses fragmentogramas observa-se que praticamente
não existem diferenças entre as abundâncias relativas dos isômeros 4, 2/3 e 1
metil dibenzotiofeno, provenientes dos óleos de Albacora e de Marlim. No entanto,
o mesmo não acontece para as abundâncias relativas dos isômeros do metil
fenantreno, as quais indicaram uma diminuição dos compostos 2 metil fenantreno
e 3 metil fenantreno em relação ao 9 metil fenantreno, que poderia ser resultante
do processo de biodegradação. Os isômeros metilados 4 metil dibenzotiofeno, 9
metil fenantreno e 1 metil fenantreno, por serem mais resistentes ao processo de
biodegradação, têm sido usados como padrões na avaliação do grau de
biodegradação dos componentes desses grupos de policíclicos aromáticos (Wang
e Fingas, 1995c; Wang et al., 1996). Na tabela 7.6 são apresentadas as principais
relações entre as abundâncias relativas de isômeros alquilados de compostos
policíclicos aromáticos das amostras dos óleos de Albacora e de Marlim.
A
B
Tabela 7.6: Principais relações entre as abundâncias relativas de isômeros
alquilados de compostos policíclicos aromáticos, presentes nos óleos de Albacora
e de Marlim.
Tipo de óleo Albacora Marlim
2/3 metil dibenzotiofeno/
4 metil dibenzotiofeno
0,40 0,38
3 metil fenantreno + 2 metil fenantreno/
9 metil fenantreno + 1 metil fenantreno
0,90 0,84
7.2. Experimento 1:
Uso de melaço hidratado
No primeiro experimento testou-se a utilização de melaço hidratado, como
fonte de nitrogênio e fósforo, no processo de estimulação da biodegradação dos
componentes do petróleo – biorremediação. O melaço é um sub-produto da
indústria açucareira, que ainda ocupa lugar de destaque na agricultura da região
Norte Fluminense. É produzido em grande quantidade, a um custo relativamente
baixo, podendo ser encontrado com facilidade no mercado. O melaço hidratado,
utilizado neste experimento, foi fornecido pela Usina Central Quissamã, Quissamã,
RJ. Ele foi analisado em função do teor de água (30%), fósforo (0,05%) e de
nitrogênio em termos de proteína crua (2,5%), nos laboratórios do Centro de
Ciências e Tecnologias Agrárias - CCTA/UENF.
A utilização de melaço como estimulador da biodegradação de
hidrocarbonetos do petróleo, não é inédita, tendo sido avaliada por Al-Hadhrami et
al. (1996 e 1997). Em suas pesquisas foi estudado o efeito da adição de uma fonte
de carbono orgânico, isto é, melaço, na estimulação da biodegradação de n-
alcanos presentes num óleo árabe e em três grupos de n-alcanos puros. Ficou
caracterizada que a adição de melaço a um meio de cultura contendo bactérias
isoladas de sedimentos de praia contaminados com petróleo, contribuiu para a
redução significativa de
n
-alcanos, especialmente aqueles contendo até 25 átomos
de carbono.
Neste experimento a concentração utilizada de melaço hidratado foi de 50%
(v/v água), com uma freqüência de aplicação de 1 ml/dia nos dez dias iniciais e
1ml/semana até completar 8 semanas de experimento, perfazendo uma proporção
de 5 gramas de melaço (em base seca) para 50 ml de óleo derramado, por unidade
de simulação. A variação de temperatura ambiente, medida no período da
condução do experimento, foi de 25 – 38
o
C e os valores de pH da água foram de
7,5 ± 0,2. As unidades de simulação são definidas como:
1. Controle – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo.
2. Melaço hidratado – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo + melaço.
7.2.1. Monitoramento geoquímico
Para o monitoramento geoquímico do óleo, submetido ao teste de
biorremediação com aplicação de melaço diluído, foram retiradas, semanalmente,
alíquotas de óleo de cada uma das unidades de controle e de biorremediação.
Essas alíquotas foram tratadas conforme fluxograma de análises apresentado na
figura 6.3. Os resultados obtidos desse monitoramento, expressos na forma de
cromatogramas, fragmentogramas de terpanos e esteranos e dos policíclicos
aromáticos, encontram-se no
anexo A.
Na figura 7.7 podem ser observados os
cromatogramas das amostras de óleo coletadas das unidades de cont
Figura 7.7: Cromatogramas das amostras de óleo coletadas das unidades de
controle e de biorremediação do experimento 1, na primeira, quarta e oitava
semanas.
Comparando-se os cromatogramas dos óleos, provenientes das unidades
de controle e biorremediação, observou-se que os perfis cromatográficos obtidos
para o óleo, após oito semanas de experimento, não apresentaram alterações
significativas na composição em termos de n-alcanos e isoprenóides. No entanto,
verificou-se que o intemperismo do óleo foi muito expressivo, resultando na
eliminação completa dos n- alcanos que continham menos que 16 átomos de
carbono, na primeira semana do derrame simulado. Os resultados obtidos da
análise quantitativa dos componentes, de n-C
8
a n-C
35
do óleo de Albacora (tabela
7.2), foram usados na quantificação aproximada das perdas, principalmente por
evaporação, dos componentes do óleo coletado da unidade de controle na
primeira semana do experimento e pode-se concluir que foram evaporados, pelo
menos, 60% dos n-alcanos presentes no óleo original.
Esse comportamento está de acordo com os resultados obtidos para os
estudos realizados por Wang e Fingas (1994a), sobre as mudanças provocadas
na composição química de um óleo, quando submetido a um processo de
evaporação controlada. Na pesquisa desses autores a evaporação foi conduzida
em rota-evaporador, sob temperaturas de 20, 40, 60 e 80
o
C, gerando alterações
no peso do óleo, que variaram de 0 a 45% p/p. Observou-se que a principal
mudança ocorrida no óleo intemperizado, analisado por cromatografia gasosa, foi
a perda de compostos voláteis, seguida do aumento da abundância relativa dos
menos voláteis. Outra mudança observada no cromatograma foi a subida da linha
de base conhecida por hump, representando uma mistura complexa de compostos
não separados pela coluna cromatográfica (UCM).
Resultados semelhantes foram obtidos no monitoramento geoquímico de
um óleo derramado na costa leste do Mediterrâneo (Ezra et al., 2000). Observou-
se que nas amostras coletadas após três semanas do derrame a evaporação tinha
retirado do óleo os n-alcanos com menos de 15 átomos de carbono. A
evaporação, na região onde ocorreu o derrame, é menos intensa que aquela
observada em ambiente tropical, principalmente durante o verão, período em que
foi realizado o experimento 1.
Na tabela 7.7 são apresentados os resultados obtidos para os principais
parâmetros indicadores do processo de biodegradação, tanto para as amostras de
óleo coletadas da unidade de controle (
C
), como para aquelas referentes à de
biorremediação com aplicação de melaço diluído (M).
Tabela 7.7: Principais parâmetros de avaliação do grau de biodegradação e
intemperismo de n-alcanos e isoprenóides, no experimento 1. (
A = óleo original de
Albacora,
C
= amostras das unidades de controle,
M
= amostras da unidade de biorremediação
com melaço diluído, P = Pristano e F = Fitano).
Tempo
semanas
1 2 3 4 5 6 7 8
A
C
M
C
M
C
M
C
M
C
M
C
M
C
M
C
M
n-
C
17
/P
1,9
2,4
2,2
2,3
2,6
2,0
2,4
2,0
2,5
2,0
2,3
2,0
1,8
1,8
2,0
1,5
2,0
n-
C
18
/F
2,5
2,7
2,7
2,9
2,9
2,9
2,9
2,9
3,0
2,6
2,6
2,7
2,6
2,3
2,6
2,3
2,5
P/F
1,7
0,8
0,8
0,3
0,3
0,3
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,1
0,1
0,1
0,1
As variações observadas nas relações de n-C
17
/P e n-C
18
/F durante o
período da simulação não devem ter sido causadas pela biodegradação dos n-
alcanos e sim devidas ao processo de intensa evaporação sofrida pelo óleo
derramado. A diminuição dos valores da relação P/F confirmou a suscetibilidade
do pristano, em comparação com o fitano, ao processo de evaporação. Vale
lembrar que esse experimento foi realizado no verão, com a temperatura ambiente
variando de 25 a 38
o
C.
Foram realizadas análises por cromatografia gasosa acoplada à
espectrometria de massa (CG/EM) nas amostras coletadas da unidade controle,
ao longo de oito semanas, gerando os fragmentogramas (m/z = 191 e 217). O
objetivo foi o de verificar possíveis alterações na concentração dos
hidrocarbonetos cíclicos saturados, resultantes do processo de evaporação. Nas
amostras provenientes das unidades de controle e de biorremediação, na quinta
semana do experimento, foram quantificados os hidrocarbonetos policíclicos
saturados e registrados os fragmentogramas para m/z = 191 e 217, assim como
os fragmentogramas dos compostos policíclicos aromáticos metilados (m/z = 192
e 198) (Anexo A).
Nas figuras 7.8 e 7.9 são apresentados os fragmentogramas (m/z=191 e
217) contendo os perfis de distribuição dos biomarcadores das famílias dos
terpanos e esteranos, do óleo originalo 06M<d( 0 )-22bigfopao
Figura 7.8: Fragmentogramas (m/z=191) das amostras do óleo de Albacora e das
unidades de controle e de biorremediação do experimento 1, na quinta semana.
Figura 7.9: Fragmentogramas (m/z=217) das amostras do óleo de Albacora e das
unidades de controle e de biorremediação do experimento 1, na quinta semana.
Comparando-se os fragmentogramas, de ambos os íons, obtidos para as
amostras do óleo original de Albacora e para as amostras das unidades de
simulação, na quinta semana, não se verificaram diferenças entre as abundâncias
relativas dos terpanos e esteranos.
Na tabela 7.8 são apresentados os resultados das principais relações entre
as concentrações dos hidrocarbonetos policíclicos saturados. Essas relações
envolvem os compostos passíveis de sofrerem alterações em função dos
processos de biodegradação e evaporação e o C
30
αβ hopano (Wang et al.,
2001b).
Tabela 7.8
: Principais relações entre os hidrocarbonetos policíclicos saturados das
amostras de óleo de Albacora, provenientes das unidades de simulação do
experimento 1. Onde hopano = C
30
17α, 21β hopano, C
23
e C
24
= terpanos
tricíclicos, 25 norhopano = C
29
25-nor-
17α,
21
β
hopano, e C
35
(R) = C
35
17α, 21β 22R homohopano.
A = óleo original de Albacora, C = amostras das unidades de
controle, M = amostra da unidade de biorremediação com melaço,
Tempo (semanas) 1 2 3 4 5 6 7 8
Parâmetros A C C C C C M C C C
C
23
/ C
24
1,5
1,4 1,4 1,5 1,5 1,4 1,5 1,4 1,4 1,4
C
23
/ hopano 3,5
2,6 2,6 2,5 2,6 2,8 2,7 2,9 3,0 2,6
25 norhopano
/hopano
0,9
0,9 0,8 0,9 0,9 0,9 0,9 1,0 1,0 0,9
C
35
(R) / hopano 0,8
0,9 0,9 0,9 0,9 0,8 0,9 1,0 1,1 0,9
Esterano C
27
αββ
αββαββ
αββ
(R) / hopano
0,8
0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,9 0,9 0,7
Figura 7.10: Fragmentogramas de compostos metilados da fração de policíclicos
aromáticos, (A) Os isômeros 3, 2, 9 e 1 metil fenantrenos (m/z=192); (B) Os
isômeros 4, 2/3 e 1 metil dibenzotiofenos (m/z=198) dos óleos das unidades de
controle e de biorremediação com melaço, na quinta semana.
Observa-se que não existem diferenças significativas entre os
fragmentogramas, tanto para os fenantrenos alquilados como para os isômeros do
dibenzotiofeno, das amostras de óleo coletadas das unidades de controle e
daquela em que foi adicionado melaço desidratado, ao final de cinco semanas do
experimento. Para confirmação desse comportamento foi medida a abundância
relativa dos isômeros alquilados: 3, 2, 9 e 1 metil fenantrenos (m/z=192) e dos
isômeros 4, 2/3 e 1 metil dibenzotiofenos (m/z=198). Os resultados das principais
relações são apresentados na tabela 7.9.
Tabela 7.9: Principais relações entre as abundâncias relativas de isômeros
alquilados de compostos policíclicos aromáticos das amostras de óleo de
Albacora, provenientes das unidades de simulação do experimento 1, na quinta
semana.
Tempo (semanas)
5
Parâmetros Albacora Controle Melaço
2/3 metil dibenzotiofeno/
4 metil dibenzotiofeno
0,4 0,5 0,5
B
3 metil fenantreno + 2 metil fenantreno/
9 metil fenantreno + 1 metil fenantreno
0,9 0,8 0,9
Os resultados alcançados não indicaram alterações relativas ao processo
de intemperismo do óleo.
Conclusões do Experimento 1:
a)
A aplicação de melaço diluído não foi eficiente como um produto
estimulador da biodegradação natural dos componentes do petróleo pelos
microrganismos presentes na água do mar. Provavelmente, devido à baixa
concentração de melaço usada nesse experimento.
b)
A principal mudança ocorrida na composição química das amostras de
óleo Albacora, coletadas das unidades de simulação, foi a perda de n
-
alcanos voláteis, com menos de 16 átomos de carbono, na primeira
semana e a evaporação preferencial do prista
no em relação ao fitano, ao
longo do experimento.
c) Comparando-
se os resultados obtidos da análise quantitativa dos alcanos
do óleo de Albacora com o cromatograma da amostra de óleo coletada da
unidade de controle na primeira semana do experimento pode-se c
oncluir
que foram evaporados pelo menos 60% dos alcanos presentes no óleo
original, após a primeira semana do experimento 1.
d)
Os processos de biodegradação e evaporação não atingiram os
biomarcadores policíclicos saturados, nem os isômeros metilados dos
compostos policíclicos aromáticos.
7.3. Experimento 2:
Comparação entre o uso de melaço
desidratado e de fosfato de amônio
Como os resultados do primeiro experimento não foram promissores,
utilizando-se melaço diluído, efetuou-se neste segundo experimento: a aplicação
de melaço desidratado, numa concentração mais elevada que a anterior,
perfazendo um total de 40 gramas, ao final de quatro semanas, para 50 gramas de
óleo derramado (proporção de 80% p/p). A definição sobre a quantidade de melaço
que deveria ser aplicada teve como base o trabalho de Al-Hadhrami et al. (1997),
em que foram conduzidos testes de biodegradação de misturas sintéticas de n-
alcanos puros na presença de melaço e de Pseudomonas aeruginosa. Nessa
pesquisa o melaço foi aplicado numa proporção de 50% em relação à massa de
cada um dos três grupos de n-alcanos e os resultados da análise cromatográfica
quantitativa das amostras após 24 horas mostraram que houve uma redução média
de 75% da mistura de hidrocarbonetos composta por n-C
14
a n-C
17
; de 30% para n-
C
18
a n-C
22
; e de 9% para a mistura de n-C
23
a n-C
30
.
O melaço em pó, usado no experimento 2, foi fornecido pela fábrica Indumel,
Viçosa, MG, e analisado pelo Laboratório de nutrição animal do Departamento
de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa
. O resultado da análise
mostrou uma concentração de 80% de açúcares, 3,5% de proteína bruta, 0,2% de
fósforo, 4,5% de potássio, 4,8% de cálcio e sais minerais de magnésio, sódio,
cobre, ferro, cobalto, manganês e zinco; além de vitaminas e aminoácidos com
concentrações em partes por milhão (ppm).
Neste experimento comparou-se a eficiência do melaço desidratado com a
do reagente fosfato de amônio (NH
4
H
2
PO
4
) PA, marca Vetec, na estimulação do
processo de biodegradação dos hidrocarbonetos presentes no óleo de Albacora.
Cada um dos nutrientes foi individualmente aplicado, com o objetivo de se avaliar
seu potencial de promover a bioestimulação da microflora pré - existente na água
do mar.
A freqüência de aplicação do melaço desidratado, por unidade de
biorremediação, foi de 10 gramas/semana, iniciando logo após o derrame e durante
as 3 semanas subsequentes, num total de 40 gramas de melaço desidratado. A
freqüência de aplicação para o fosfato de amônia foi de 10 gramas/semana, com a
primeira aplicação realizada logo após o derrame, totalizando 50 gramas ao final de
5 semanas. A variação de temperatura ambiente, medida no período da condução
do experimento foi de 12 – 29
o
C e os valores de pH da água variaram de 7,5 ± 0,2.
As unidades de simulação foram definidas como:
1. Controle – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo.
2. Melaço – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo + melaço.
3. Fosfato – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo + fosfato de amônia.
7.3.1. Monitoramento geoquímico
Para as análises geoquímicas foram retiradas, semanalmente, alíquotas de
óleo de cada uma das unidades de simulação e tratadas conforme o fluxograma
de análise apresentado anteriormente na figura 6.3. Os cromatogramas e os
fragmentogramas dos hidrocarbonetos policíclicos saturados obtidos das análises
dos óleos, provenientes das unidades de controle e de biorremediação,
encontram-se no anexo B.
Nas figuras 7.11 e 7.12 podem ser observados os cromatogramas das
amostras de óleo referentes às unidades de controle e de biorremediação em que
foram usados melaço desidratado e fosfato de amônia, respectivamente,
coletadas na primeira, segunda e quarta semanas do experimento.
Figura 7.11. Cromatogramas dos óleos das unidades de controle e de
biorremediação com melaço desidratado na primeira, segunda e quarta semanas
do experimento 2.
Nos cromatogramas das amostras de controle e de biorremediação foram
observados os efeitos da evaporação dos compostos mais voláteis, presentes no
óleo de Albacora, ao longo do derrame simulado. Esse comportamento vem
confirmar o observado no experimento 1. Nos cromatogramas das amostras de
óleo provenientes das unidades de biorremediação em que foi aplicado melaço
desidratado, praticamente não foram verificadas as feições típicas do processo de
biodegradação, provavelmente devido ao consumo preferencial dos açúcares
presentes no melaço, em detrimento da fonte de carbono mais complexa
representada pelos hidrocarbonetos do petróleo.
Figura 7.12: Cromatogramas dos óleos das unidades de controle e de
biorremediação com fosfato de amônio na primeira, segunda e quarta semanas do
experimento 2.
A utilização de fosfato de amônio, como fonte de nitrogênio e fósforo,
provocou alterações que caracterizaram o processo de biodegradação de n-
alcanos e isoprenóides, já na primeira semana do experimento (figura 7.12). O
processo de biodegradação também pôde ser confirmado visualmente, na
segunda semana, através da redução da mancha de óleo sobrenadante, presente
na unidade de biorremediação em que foi aplicado fosfato de amônia (figura 7.13).
Figura 7.13: Fotografias das unidades de controle e de biorremediação do óleo
Albacora, com melaço e com fosfato de amônio, no experimento 2, na segunda
semana.
Na tabela 7.10 encontram-se os valores dos principais parâmetros de
avaliação do grau de intemperismo, medidos através das relações entre n-alcanos
e isoprenóides, ao longo das quatro semanas iniciais do experimento.
Tabela 7.10
: Relações entre n-alcanos, pristano e fitano, nas quatro semanas
iniciais do Experimento 2.
C = amostras das unidades de controle, M = amostras da unidade
de biorremediação com melaço, Ft = amostras da unidade de biorremediação com fosfato de
amônio, P = Pristano e F = Fitano.
Tempo (semanas) 1 2 3 4
Parâmetros Albacora C M
Ft C M
Ft C M
Ft
C M
Ft
n-C
17
/P 1,9 1,9
1,9
0,4
1,8
1,8
0,0
1,7 1,7
0,0
1,7
1,4
0,0
n-C
18
/F
2,5 2,3
2,5
0,5
2,2
2,3
0,0
2,1 2,1
evaporação retirou, aproximadamente, 100% dos alcanos após a terceira semana
do experimento.
Nos experimentos de campo, conduzidos pelo projeto de biorremediação do
derrame causado pelo navio Exxon Valdez foram obtidas respostas positivas em
relação a biodegradação de alcanos (Pritchard e Costa, 1991). Nesse projeto,
patrocinado pela Agência Americana de Proteção Ambiental (EPA), foi testado o
nutriente oleofílico Inipol EAP22, contendo íons amônio e fosfato, para aplicação
em sedimentos de praia, com uma concentração de 0,1 galão/m
2
. O resultado do
monitoramento geoquímico das amostras de óleo biorremediado, mostrou que
houve uma redução de aproximadamente 70% nos valores medidos para a razão
n-C
18
/F, ao final de quatro semanas da aplicação do nutriente.
Nos testes de biorremediação de derrames simulados de óleo em
sedimentos de praia conduzidos por Rosa (2001), foi usado fosfato de amônia
como estimulador da biodegradação, na proporção de 1,4 g de fosfato de amônia
para 16 ml de óleo derramado. O valor obtido para a relação de n-C
18
/F ao final de
quatro semanas indicou uma redução de 100% do valor encontrado para o óleo
original de Albacora, tanto para as amostras de sedimentos contaminados
coletadas na superfície, como para aquelas de sub-superfície.
Os resultados obtidos para o experimento 2, em que foi utilizado fosfato de
amônio, mostraram um aumento da taxa de biodegradação de n-alcanos e
isoprenóides, quando comparados com os resultados alcançados na
biorremediação do derrame do Exxon Valdez, em sedimentos de praia (Pritchard e
Costa, 1991) e na biorremediação de derrames simulados em sedimentos (Rosa,
2001). Esse aumento pode ser avaliado através da redução de 80% no valor da
relação n-C
18
/F, já na primeira semana de biorremediação.
Amostras do óleo retiradas das unidades de controle (C) e daquelas em que
foi aplicado fosfato de amônio (Ft), ao longo das cinco semanas iniciais, foram
analisadas também por CG/EM. Os fragmentogramas (m/z=191, m/z=177 e
m/z=217) obtidos das análises realizadas nas amostras das unidades de controle
e de biorremediação com fosfato de amônia, na primeira, terceira e quinta
semanas de biorremediação são apresentados nas figuras 7.14, 7.15 e 7.16.
Controle Fosfato de amônio
Figura 7.14: Fragmentogramas (m/z=191) dos hopanos das amostras coletadas
das unidades de controle e de biorremediação com fosfato de amônio do
experimento 2, na primeira, terceira e quinta semanas.
Controle Fosfato de amônio
Figura 7.16: Fragmentogramas (m/z=217) dos esteranos das amostras coletadas
das unidades de controle e de biorremediação com fosfato de amônio do
experimento 2, na primeira, terceira e quinta semanas.
A comparação visual entre os fragmentogramas dos esteranos e terpanos
não mostrou alterações significativas nos valores de abundância relativa dos
compostos, com relação às amostras de óleo provenientes das unidades de
simulação na primeira, terceira e quinta semanas.
Pesquisadores canadenses realizaram estudos laboratoriais nos quais foi
avaliada a eficiência da biorremediação de óleos transportados na região do
Alasca. Os experimentos foram realizados em frascos contendo óleo e uma
solução dos seguintes sais: NH
4
Cl, KNO
3
e K
2
HPO
4
. Nesse meio foram inoculadas
seis cepas de microrganismos, três degradadores de compostos alifáticos e três
degradadores de compostos aromáticos, os frascos foram mantidos a 10
o
C, sob
agitação por um período de 28 dias. As análises por cromatografia gasosa
acoplada à espectrometria de massa das amostras dos diferentes tipos de óleo
testados indicaram que não ocorreram mudanças na composição química dos
compostos biomarcadores policíclicos saturados (Wang et al., 1997). Esses
resultados estão de acordo com os obtidos no experimento 2 para o
monitoramento da biorremediação com uso de fosfato de amônio, sobre os
hidrocarbonetos policíclicos saturados.
Conclusões do Experimento 2:
a)
O uso de melaço desidratado como fonte de nutrientes não foi eficiente na
aceleração da biodegradação dos componentes do
petróleo, provavelmente
devido ao consumo dos açúcares, substrato de fácil metabolização presente
em elevada concentração no melaço, em detrimento da fonte de carbono
mais complexa representada pelos hidrocarbonetos do petróleo.
b) A aplicação de fosfato d
e amônio como fonte de nitrogênio e de fósforo, nas
condições em que o experimento 2 foi conduzido, se mostrou eficiente na
biodegradação completa dos n-
alcanos e isoprenóides, como pristano e
fitano, presentes no óleo de Albacora, após duas semanas de
biorremediação.
c)
O aspecto da mancha de óleo residual observado após duas semanas,
mostrou o nível de biodegradação que poderá ser atingido, em casos de
derrames reais, com a aplicação da técnica de biorremediação, através da
estimulação do metabolismo de mi
crorganismos naturalmente presentes na
7.4. Experimento 3:
Uso do fertilizante agrícola NPK isoladamente
e em conjunto com um surfactante sintético
Em função dos resultados positivos alcançados com a utilização do fosfato
de amônio, sugeriu-se, para o terceiro experimento, o uso de um produto
comercial que tivesse composição química semelhante ao fosfato de amônia e que
fosse facilmente encontrado no mercado em quantidade suficiente para aplicação
em derrames de óleo. Foi escolhido um fertilizante agrícola do tipo NPK. O uso de
fertilizantes, especialmente modificados para aplicação na biorremediação de
derrames reais de óleo em sedimentos, tem sido divulgado em alguns trabalhos
encontrados na literatura (Pritchard, et al., 1991 e 1992; Bragg, et al.,1994; Santas
et al.,1999a). No entanto, a aplicação direta de fertilizantes do tipo NPK na
biorremediação de derrames de petróleo em água do mar, não foi verificada pelo
levantamento bibliográfico realizado para essa pesquisa.
O fertilizante comercial usado foi o NPK, cuja proporção entre os compostos
(NH
4
)
2
SO
4
, (NH
4
)
3
PO
4
e KCl é de 10:10:10 e a concentração dos íons amônio,
fosfato e potássio é de 0,10 g/g de fertilizante. Ele é fabricado pela empresa
AGROFOR localizada em São Paulo e seu preço médio no varejo é de R$ 2,00/Kg.
A partir deste experimento a aplicação do produto se concentrou nos primeiros dias
após o derrame de óleo.
O fertilizante foi testado separadamente e em conjunto com o surfactante
sintético Ultraspers II, com o objetivo de verificar sua eficiência em biodisponibilizar
as gotas de óleo, favorecendo a biodegradação. O surfactante, fabricado pela
Oxiteno, foi aprovado nos testes ecotoxicológicos conduzidos pelo Laboratório de
Toxicologia do CENPES/Petrobras, para aplicação em alto mar.
A freqüência de aplicação do fertilizante, por unidade de simulação da
biorremediação, foi de 4 gramas nos tempos 0 e 2 dias e 2 gramas no tempo 4
dias, 10 gramas nos tempos 15 e 21 dias, totalizando 30 gramas.
A aplicação de 2 ml do surfactante diluído, numa proporção de 1:10 em água
destilada, foi realizada segundo a orientação do fabricante, levando em
consideração o volume de óleo derramado (50 ml) e acompanhando a aplicação do
fertilizante nos tempos 0, 2, 4, 15 e 21 dias, no decorrer dos 28 dias de
experimento. A variação de temperatura ambiente medida no período da condução
do experimento foi de 23 – 36
o
C, e os valores de pH da água variaram de 7,5 ± 0,2.
As unidades de simulação foram definidas como:
1. Controle – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo.
2. NPK 1 – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo + NPK.
3. NPK 2 – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo + NPK.
4. NPK+ Surfactante 1 – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo + NPK +
surfactante.
5. NPK + Surfactante 2 – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo + NPK +
surfactante.
As unidades nomeadas de
1
e
2
representam os testes conduzidos em
duplicata.
Alíquotas do óleo foram retiradas das unidades de simulação, nos tempos 0,
2, 4, 7, 15, 21 e 28 dias e tratadas conforme o fluxograma de análises geoquímicas
(figura 6.3). Os cromatogramas de cada uma das amostras de óleo coletadas das
unidades de simulação, assim como os fragmentogramas de terpanos, esteranos e
dos compostos policíclicos aromáticos alquilados encontram-se no
anexo C
.
7.4.1. Monitoramento geoquímico
O monitoramento geoquímico da biorremediação foi conduzido através de
análises cromatográficas. Os cromatogramas das amostras de óleo, referentes às
unidades de controle e àquelas em que foi aplicado o fertilizante NPK encontram-se
na figura 7.17. Os cromatogramas das amostras coletadas das unidades em que
foram aplicados NPK em conjunto com o surfactante podem ser verificadas nas
figuras 7.18.
Figura 7.17: Cromatogramas das amostras dos óleos das unidades de controle e
de biorremediação com NPK coletadas nos dias 2, 4, 7, 15, 21 e 28 do
experimento 3.
Figura 7.18: Cromatogramas das amostras dos óleos das unidades de controle e
de biorremediação com NPK+Surfactante coletadas nos dias 2, 4, 7, 15, 21 e 28
do experimento 3.
Os resultados da avaliação dos cromatogramas mostraram que a aplicação
do fertilizante, isoladamente ou em conjunto com o surfactante, quando realizada
de forma mais freqüente, ao longo da primeira semana, foi capaz de acelerar a
biodegradação do óleo para ambas as condições de biorremediação. Os perfis
cromatográficos das amostras em duplicata apresentaram um comportamento
muito semelhante com relação à abundância dos alcanos (Anexo C) e deles
foram obtidos os valores médios das relações entre n-alcanos e isoprenóides,
calculadas para as amostras coletadas nos 28 dias do experimento (Tabela 7.11).
Tabela 7.11: Relações entre n-alcanos, pristano e fitano no experimento 3.
Tempo (dias) n-C
17
/P n-C
18
/F P/F
Controle
Tempo 0
1,8
2,3
1,6
NPK (4g) 1,8 2,4 1,7
NPK (4g)+Surfac. (2 ml)
1,8 2,4 1,7
Controle
Tempo 2
1,9
2,4
1,4
NPK (4g) 1,6 2,0 1,5
NPK (4g)+Surfac. (2 ml)
1,6 2,0 1,4
Controle
Tempo 4
1,7
2,5
1,2
NPK (2g) 0,4 0,5 1,3
NPK (2g) +Surfac.(2 ml)
0,4 0,5 1,2
Controle
Tempo 7
1,8
2,3
0,7
NPK 0,0 0,0 1,0
NPK+Surfac.
0,0 0,0 0,8
Controle
Tempo 15
1,6
2,5
0,4
NPK (10g) 0,0 0,0 0,0
NPK(10g)+Surfac.(2 ml)
0,0 0,0 0,6
Controle
Tempo 21
1,7
1,8
0,2
NPK (10g) 0,0 0,0 0,0
NPK(10g)+Surfac. (2ml)
0,0 0,0 0,0
Controle
Tempo 28
0,0
2,0
0,0
NPK 0,0 0,0 0,0
NPK+Surfac. 0,0 0,0 0,0
Os resultados obtidos para as relações entre n-alcanos e isoprenóides
mostraram que o processo de biodegradação de n-C
17
e de n-C
18
, para ambas as
condições de biorremediação já era evidente no segundo dia do experimento
sendo completado ao final de uma semana da biorremediação.
As amostras de óleo retiradas semanalmente das unidades de controle
(C),
daquelas em que foi aplicado fertilizante (Ft) e da combinação de fertilizante +
surfactante
(S)
foram analisadas por CG/EM. Os fragmentogramas dos terpanos e
esteranos das amostras coletadas nos dias 7 e 28 são apresentados nas figuras
7.19, 7.20, 7.21.
7 dias 28 dias
Figura 7.19
: Fragmentogramas (m/z = 191) das amostras dos óleos das unidades
de controle e de biorremediação com NPK e com NPK+Surfactante coletadas nos
dias 7 e 28 do experimento 3.
7 dias 28 dias
Figura 7.20: Fragmentogramas (m/z = 177) das amostras dos óleos das unidades
de controle (A) e de biorremediação com NPK (B) e com NPK+Surfactante (C)
coletadas nos dias 7 e 28 do experimento 3. Onde (1) = C
28
25-nor-
αβ
-hopano e
(2) = C
29
25-nor-
αβ
-hopano.
A
B
C
7 dias 28 dias
abundância relativa do esterano C
27
ααα 20S já no sétimo dia (Anexo C),
permanecendo com esse perfil até o término do experimento, devido
provavelmente à heterogeneidade das amostras coletadas.
Os resultados das principais relações envolvendo os hidrocarbonetos
policíclicos saturados, terpanos e esteranos, passíveis de serem biodegradados,
segundo Wang et al. (2001b), podem ser observados na tabela 7.12.
Tabela 7.12: Relações entre os hidrocarbonetos policíclicos saturados indicadores
de alterações decorrentes do processo de biodegradação. Onde hopano = C
30
αβ hopano, C
23
e C
24
= terpanos tricíclicos, 25 norhopano = C
29
25-nor-αβ-hopano,
e C
35
(R) = C
35
αβ
22R homohopano.
Tempo (dias)
0
7
15
21
28
Parâmetros
C
Ft
S
C
Ft
S
C
Ft
S
C
Ft
S
C
Ft
S
C
23
/ C
24
1,6
1,6
1,6
1,5
1,5
1,5
1,6
1,5
1,5
1,6
1,5
1,5
1,5
1,5
1,6
C
23
/ hopano
3,1
3,0
2,9
3,1
3,1
2,9
3,1
2,9
2,9
2,8
3,0
2,8
3,0
2,7
3,0
25norhopano
/hopano
0,9
0,9
0,9
0,9
1,0
0,9
0,9
1,0
0,9
0,9
1,0
0,9
0,9
1,0
1,0
C
35
(R) /
hopano
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,8
0,7
0,7
0,7
0,7
C
27
αββ
αββαββ
αββ
(R) /
hopano
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,8
0,7
0,7
0,7
0,8
Esses resultados indicaram que o uso do fertilizante NPK, isoladamente ou
em conjunto com o surfactante sintético não foi eficiente na biodegradação dos
hidrocarbonetos policíclicos saturados considerados nessas relações, devido,
provavelmente, ao curto espaço de tempo em que o experimento 3 foi conduzido.
As alterações na composição química dos compostos policíclicos
aromáticos também foram avaliadas. Para isso utilizaram-se os fragmentogramas
dos íons correspondentes aos grupos dos fenantrenos (m/z=192) e
dibenzotiofenos (m/z=198) das amostras referentes ao controle e as unidades de
biorremediação com NPK e NPK + Surfactante nos tempos 0 e 28 dias (figuras
7.22 e 7.23).
Figura 7.22: Fragmentogramas dos isômeros 3, 2, 9 e 1 metil fenantrenos
(m/z=192) dos óleos das unidades de controle e de biorremediação com NPK e
com NPK+Surfactante coletadas nos dias 0 e 28 do experimento 3.
Figura 7.23: Fragmentogramas dos isômeros 4, 2/3 e 1 metil dibenzotiofenos
(m/z=198) dos óleos das unidades de controle e de biorremediação com NPK e
com NPK+Surfactante coletadas nos dias 0 e 28 do experimento 3.
As razões entre as abundâncias relativas dos isômeros metilados do grupo
do dibenzotiofeno (m-DBT) e do fenantreno (m-Fen.) foram resumidas na tabela
7.13.
Tabela 7.13
: Relações entre as abundâncias relativas dos isômeros de compostos
policíclicos aromáticos.
Tempo (dias)
0
7
15
21
28
Parâmetros
C Ft S
C Ft S
C Ft S
C Ft S
C Ft S
2/3 m- DBT/
4 m- DBT
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,5
0,5
0,5
0,5
0,6
0,4
0,5
0,6
0,5
0,4
3+2 m- Fen./
9+1 m- Fen.
0,9 0,9 0,9
0,9 0,9 0,9
0,8 0,8 0,9
0,7 0,9 0,8
0,7 0,8 0,9
Os resultados obtidos das relações entre as abundâncias relativas dos
isômeros metilados dos compostos policíclicos aromáticos indicaram que
praticamente não ocorreram alterações entre a aplicação do fertilizante
isoladamente, ou em conjunto com o surfactante, quando comparados com o óleo
original de Albacora. Os valores verificados para as amostras coletadas da
unidade de controle mostraram uma tendência de elevação, para a relação de 2/3
m - DBT/ 4 m- DBT, e de queda para a de 3+2 m- Fen./9+1 m - Fen. Esse
comportamento foi resultante, provavelmente, da biodegradação preferencial do 4
metil-dibenzotiofeno e dos isômeros 3 metil e 2 metil – Fenantreno. A
biodegradação do 4 metil-dibenzotiofeno não está de acordo com as observações
apresentadas por Wang et al. (1996), já a biodegradação preferencial dos 3 metil
e 2 metil – Fenantreno foi verificada nos trabalhos publicados por Rowland et al.
(1986) e Wang et al. (1996).
Na figura 7.24 encontram-se, com o propósito de verificação do processo
de biodegradação, os cromatogramas de massas referentes à fração dos
compostos policíclicos aromáticos identificados nas amostras coletadas das
unidades de controle e de biorremediação, logo após o derrame e no final da
biorremediação, isto é, no vigésimo oitavo dia.
0 dia 28 dias
Figura 7.24: Cromatogramas de massas da fração de compostos policíclicos
aromáticos presentes nas amostras de óleo coletadas das unidades de controle e
de biorremediação, logo após o derrame e ao final dos 28 dias do experimento.
O resultado da avaliação dos cromatogramas de massa da fração dos
policíclicos aromáticos, tanto da unidade de controle, como das unidades de
biorremediação, mostrou uma redução das abundâncias relativas de todos os
grupos de compostos, em relação aos esteróides triaromáticos, seguindo uma
ordem decrescente em função do aumento do número de anéis e de ramificações,
ao longo dos 28 dias. Esse efeito foi mais pronunciado, sobre aqueles compostos
policíclicos aromáticos presentes em maior concentração no óleo, os dimetil e
trimetil naftalenos, provavelmente devido à sua suscetibilidade ao processo de
evaporação. Os resultados observados estão de acordo com os obtidos por Wang
e Fingas (1994a) no estudo dos efeitos do intemperismo sobre a composição
química de um petróleo leve, descrito no experimento 1.
A avaliação do processo de biodegradação sobre a fração de aromáticos
concentrou-se nos resultados obtidos para a amostra de óleo referente à unidade
de controle, após 28 dias do experimento, a qual apresentou um cromatograma de
massas empobrecido, principalmente em fenantreno, nos isômeros metilados do
dibenzotiofeno e no 3 metil fenantreno, quando comparados com as amostras das
unidades de biorremediação. Esse comportamento tem sido observado por vários
pesquisadores (Fayad e Overton, 1995; Wang et al., 1997; Blenkinsopp, et al.,
1997), os quais sugeriram que a presença de nutrientes inibe a biodegradação,
devido a uma redução dos valores de pH do meio, como resultado do metabolismo
do íon amônio. No entanto, não foram observadas alterações nos valores de pH
dos experimentos de biorremediação de óleo no mar desenvolvidos nesta tese.
Conclusões do Experimento 3:
a)
A aplicação do fertilizante NPK, isoladamente ou em conjunto com o
surfactante, realizada de forma mais freqüente, ao longo da primeira
semana, foi capaz de acelerar a biodegradação dos n-
alcanos e
isoprenóides, quando comparada com os resultados obtidos para o
experimento 2, no qual a adição da mesma quantidade de fosfato de
amônia foi efetuada logo após o derrame.
b) Não foram verificadas alterações composicionais s
ignificativas dos
compostos policíclicos saturados, em função dos processos de evaporação
e biodegradação monitorados neste experimento.
c)
Na fração dos policíclicos aromáticos foi observada uma redução das
abundâncias relativas de todos os grupos de compos
tos, tanto nas
amostras de controle como naquelas de biorremediação, em relação aos
esteróides triaromáticos, seguindo uma ordem decrescente em função do
aumento do número de anéis e de ramificações. Esse efeito foi mais
pronunciado sobre os dimetil e trim
etil naftalenos, provavelmente devido à
sua maior suscetibilidade ao processo de evaporação.
d)
O processo de biodegradação sobre a fração de aromáticos foi mais
eficiente nas amostras de óleo referentes à unidade de controle, isto é, na
ausência de fertiliz
ante e de surfactante, conforme observado por outros
autores. As amostras se apresentaram empobrecidas,
1
55
7.5. Experimento 4:
Comparação entre o uso dos fertilizantes NPK e
NP
Tomando como base os resultados favoráveis conseguidos com a utilização
do fertilizante NPK, o quarto experimento foi montado com o objetivo de se
comparar a eficiência de dois fertilizantes como fontes de nitrogênio e fósforo, um
comercial o NPK–10:10:10, cuja concentração dos íons amônio, fosfato e potássio é
de 0,10g/g de fertilizante e o NP–17:16, onde a concentração dos íons amônio e
fosfato é de 0,17 e 0,16 g/g, respectivamente. O fertilizante NP 17:16 foi preparado
especialmente pela empresa AGROFOR para ser usado nessa pesquisa, sem a
presença do íon potássio, por não ser considerado um nutriente essencial aos
processos metabólicos envolvidos na biodegradação dos componentes do petróleo.
Outro objetivo desse experimento foi o de otimizar a relação entre a
quantidade do produto a ser aplicada para condução da biorremediação e o volume
de óleo derramado, tornando mais viável seu uso em derrames reais. Levando em
consideração os resultados obtidos no experimento anterior, no qual a massa total
usada de fertilizante foi de 30 gramas, optou-se por reduzir para um total de 15
gramas, mantendo-se constante a quantidade de óleo na simulação.
A freqüência de aplicação dos fertilizantes, por unidade de simulação da
biorremediação, foi de 2 gramas nos tempos 0 e 2 dias e 1 grama no tempo 5 dias, 5
gramas nos tempos 7 e 14 dias, durante os 28 dias de experimento. A variação de
temperatura ambiente, medida no período da realização do experimento, foi de 20 –
32
o
C e os valores de pH da água variaram de 8,0 ± 0,2. As unidades de simulação
foram definidas como:
1. Controle – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo.
2. NPK 1 – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo + NPK.
3. NPK 2 – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo + NPK.
4. NP 1 – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo + NP.
5. NP 2 – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo + NP.
1
56
As unidades nomeadas de 1 e 2 representam os testes conduzidos em
duplicata.
Para as análises foram retiradas alíquotas de óleo de cada uma das unidades
de simulação, nos tempos 0, 2, 5, 7, 14, 21 e 28 dias. Essas alíquotas foram tratadas
conforme o fluxograma de análise apresentado anteriormente (figura 6.3). Os
cromatogramas de cada uma das amostras de óleo coletadas das unidades de
simulação encontram-se no
anexo D
.
A partir do experimento 4, os laboratórios da Gerência de Geoquímica do
CENPES/Petrobrás não puderam analisar as amostras de óleo por cromatografia
gasosa acoplada à espectrometria de massa, devido a problemas técnicos ocorridos
no equipamento de cromatografia líquida à média pressão, usado para a separação
das frações de hidrocarbonetos saturados, aromáticos e compostos NSO. Assim
sendo, decidiu-se por não analisar as amostras restantes em outro laboratório,
evitando a introdução de novas variáveis na avaliação geral dos resultados.
7.5.1. Monitoramento geoquímico
Os resultados do monitoramento geoquímico da biorremediação podem ser
conferidos nos cromatogramas das amostras de óleo, referentes às unidades de
controle e de biorremediação, após 0, 2, 5, 7, 14 e 28 dias de experimento,
apresentados nas figuras 7.25, 7.26 e 7.27.
1
57
Figura 7.25
: Cromatogramas das amostras coletadas das unidades de controle e de
biorremediação com NPK e NP, nos dias 0 e 2, do experimento 4.
Figura 7.26: Cromatogramas das amostras coletadas das unidades de controle e de
biorremediação com NPK e NP, nos dias 5 e 7, do experimento 4.
1
58
Figura 7.27: Cromatogramas das amostras coletadas das unidades de controle e de
biorremediação com NPK e NP, nos dias 14 e 28, do experimento 4.
Quando se comparam os perfis cromatográficos das amostras de óleo
provenientes das unidades de biorremediação em que foi utilizado NPK com aquelas
em que se utilizou NP, observa-se que não ocorreram alterações significativas com
relação à velocidade de degradação de n-alcanos e isoprenóides. A diminuição pela
metade da quantidade usada dos fertilizantes também não comprometeu a
aceleração do processo de biodegradação, quando comparada com os resultados
obtidos no experimento 3, no mesmo intervalo de sete dias de biorremediação (figura
7.28).
Figura 7.28
: Comparação entre os cromatogramas dos óleos das unidades de
biorremediação com 10g de NPK (Experimento 3) e com 5 g de NPK (Experimento 4)
após sete dias de tratamento.
1
59
Na tabela 7.14 encontram-se os valores médios das relações entre n-alcanos
e isoprenóides, identificados por cromatografia gasosa nas amostras de óleo
coletadas das unidades de controle (C) e daquelas em que foram aplicados os
fertilizantes NPK (NPK) e NP (NP). Vale observar que os perfis cromatográficos
obtidos dos testes conduzidos em duplicata, tanto para o NPK como para o NP, não
apresentaram diferenças significativas com relação à abundância dos n-alcanos e
dos isoprenóides.
Tabela 7.14: Relações entre n-alcanos, pristano e fitano durante os 28 dias do
experimento 4.
Tempo (dias) n-C
17
/P n-C
18
/F P/F
1
60
O processo de biodegradação pôde também ser observado, já nos primeiros
quatro dias de experimento, através das fotografias apresentadas na figura 7.29.
Figura 7.29: Fotografias das unidades de controle e de biorremediação usando os
fertilizantes NPK e o NP, no quarto dia do experimento 4.
1
61
Este resultado demonstrou a eficiência da aplicação da técnica de
biorremediação com uso de fertilizante do tipo NPK, nas simulações de derrames de
óleo no mar, desenvolvidas por esta tese.
7.5.2. Monitoramento microbiológico
Para o monitoramento microbiológico foram coletadas amostras de água das
unidades de controle e de biorremediação, em que foram aplicados os fertilizantes
NPK e NP, nos tempos 0, 7, 14, 21 e 28 dias, e enviadas à
Gerência de
Biotecnologia e Tratamentos Ambientais – CENPES/PETROBRAS. Nessas
amostras foi quantificado o número de indivíduos pertencentes às populações de
bactérias heterotróficas e degradadoras de hidrocarbonetos. Os resultados podem
ser observados na figura 7.30.
Figura 7.30: Gráficos dos valores médios do número de bactérias heterotróficas (A)
e degradadoras de hidrocarbonetos (B), ao longo do experimento 4.
Contagem do número de bactérias
heterotróficas
1,00E+00
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
0 7 14 21 28
tempo (dias)
Heterotróficas
(NMP/ml)
controle
NP
NPK
Contagem do número de bactérias
degradadoras de hidrocarbonetos
1,00E+00
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
0 7 14 21 28
tempo (dias)
Bact. degradadoras
(NMP/ml)
Controle
NP
NPK
(B)
(A)
1
62
A análise dos perfis apresentados nesses gráficos indicou que não houve
diferença entre a aplicação dos fertilizantes NPK e NP, em relação à promoção do
crescimento da população de bactérias heterotróficas e das degradadoras de
hidrocarbonetos. Observou-se também que o número de indivíduos, para ambos os
grupos quantificados, começou a aumentar a partir do décimo quarto dia do
experimento, justamente quando todos os alcanos já tinham sido biodegradados,
provavelmente devido ao início da fase exponencial de reprodução celular. O
aumento da população de bactérias heterotróficas acompanhou o das bactérias
degradadoras, fato considerado normal, tendo em vista que as bactérias
degradadoras também fazem parte do grupo das heterotróficas.
Conclusões do Experimento 4:
a) A utilização do fertilizante NP não se mostrou nem mais nem menos
eficiente que a do NPK na aceleração do processo de biodegradação dos
n-alcanos e isoprenóides presentes no óleo de Albacora.
b) A diminuição pela metade da quantidade usada dos fertilizantes não
comprometeu a aceleração do processo de biodegradação, o qual foi
responsável, juntamente com a evaporação, pela retirada de praticamente
todos os alcanos presentes no óleo no décimo quarto dia do experimento.
c) Os resultados obtidos dos monitoramentos geoquímico e microbiológico,
indicaram que o uso de ambos os fertilizantes foi eficiente no crescimento
da população de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos e na
aceleração do processo de biodegradação de alcanos presentes no óleo
de Albacora.
d) O aspecto da mancha de óleo biodegradado, após 4 dias de tratamento
com NPK e NP, evidenciou a eficiência da técnica na biorremediação de
derrames de óleo em água do mar, considerando as condições
ambientais em que a pesquisa foi conduzida.
1
63
7.6. Experimento 5
: Uso do fertilizante NPK em conjunto com um
biosurfactante e com uma população de microrganismos
bioaumentados, sob condição de aeração elevada
No quinto experimento foram testadas combinações do fertilizante NPK com
um biosurfactante e com microrganismos degradadores de hidrocarbonetos,
bioaumentados da água do mar, com o objetivo de avaliar o processo de
biodegradação. O biosurfactante usado, denominado Emulsan, trata-se de um
biopolímero composto por lipopolissacarídeos, cuja ação tenso-ativa leva à
diminuição do tamanho das gotas de óleo, possibilitando uma maior disponibilidade
do óleo ao ataque microbiano.
Para a bioaumentação dos microrganismos contidos na água da praia de
Cavaleiros em Macaé, foi colocada uma alíquota dessa água em um meio de cultura
contendo óleo de Albacora como única fonte de carbono, para que se fizesse uma
seleção inicial das cepas hidrocarbonoclásticas. Após essa etapa, os microrganismos
selecionados foram bioaumentados e conservados liofilizados. Antes da aplicação dos
microrganismos nas unidades de biorremediação, eles foram suspensos em 20 ml de
água destilada. Um volume de 10 ml dessa suspensão, com aproximadamente 10
5
NMP/ml, foi inoculado em cada uma das unidades. A aplicação foi realizada somente
no tempo 0 do experimento. Todos os procedimentos necessários à bioaumentação
foram realizados pela Dra. Selma Gomes Ferreira Leite, professora do Departamento
de Engenharia Bioquímica - Escola de Química/Universidade Federal do Rio de
Janeiro.
A quantidade total de fertilizante aplicada no experimento 5, foi reduzida a um
valor três vezes menor que o aplicado anteriormente, no experimento 4, com o
objetivo de se diminuir a relação entre o volume de óleo derramado e a massa de
produto, que passou para 10% (massa de fertilizante/volume de óleo).
A freqüência de aplicação do fertilizante e do biosurfactante, por unidade de
simulação da biorremediação, foi de 2 gramas nos tempos 0 e 2 dias e 1 grama no
tempo 4 dias, totalizando 5 gramas, para ambos os produtos.
1
64
Neste experimento foram utilizadas duas bombas de aeração, em cada unidade
de simulação, para avaliação do parâmetro de oxigenação da água na
biorremediação. A variação de temperatura ambiente medida no período da execução
do experimento foi de 22 – 34
o
C e os valores de pH da água variaram de 8,0 ± 0,2.
As unidades de simulação foram definidas como:
1. Controle – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo.
2. NPK – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo + NPK.
3. NPK + M 1 – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo + NPK + Microrganismos.
4. NPK + M 2 – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo + NPK + Microrganismos.
5. NPK+ Biosurfactante 1 – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo + NPK +
biosurfactante.
6. NPK + Biosurfactante 2 – 50 l de água do mar + 50 ml de óleo + NPK +
biosurfactante.
As unidades nomeadas de
1
e
2
representam os testes conduzidos em
duplicata.
7.6.1. Monitoramento Geoquímico
Para o monitoramento geoquímico da biodegradação sobre os componentes
do óleo foram coletadas amostras do derrame nas unidades de controle e de
biorremediação, nos tempos 0, 2, 4, 7, 14, 21 e 28 dias. As amostras de óleo, tratadas
conforme o fluxograma de análises para as determinações geoquímicas (figura 6.3),
foram analisadas por cromatografia gasosa (Anexo E) e as concentrações de n-
alcanos e dos isoprenóides foram quantificadas através da utilização do padrão
cromatográfico n-tetracosano deuterado.
Os resultados do monitoramento geoquímico, expresso pelas análises
cromatográficas das amostras de óleo referentes às unidades de controle e àquelas
em que foram aplicados o fertilizante NPK e o NPK em conjunto com os
microrganismos bioaumentados e com o biosurfactante, nos 28 dias do experimento,
podem ser observados nas figuras 7.31, 7.32 e 7.33.
1
65
Figura 7.31: Cromatogramas das amostras coletadas das unidades de controle e de
biorremediação com NPK, NPK + microrganismos (NPK + M) e NPK + biosurfactante
(NPK + B), nos dias 0 e 2, do experimento 5.
1
66
Figura 7.32: Cromatogramas das amostras coletadas das unidades de controle e de
biorremediação com NPK, NPK + microrganismos (NPK + M) e NPK + biosurfactante
(NPK + B), nos dias 4 e 7, do experimento 5.
1
67
Figura 7.33: Cromatogramas das amostras coletadas das unidades de controle e de
biorremediação com NPK, NPK + microrganismos (NPK + M) e NPK + biosurfactante
(NPK + B), nos dias 14 e 28, do experimento 5.
A análise desses perfis cromatográficos, tanto para os óleos coletados nos
quatro dias iniciais como para aqueles coletados no sétimo dia de tratamento,
confirmou a eficiência do uso do fertilizante NPK no processo de biodegradação. No
entanto, a sua combinação com os outros produtos não acrescentou melhorias
significativas ao processo.
As mudanças visuais do comportamento da mancha de óleo ao longo da
biorremediação com os diferentes produtos, podem ser observadas nas fotografias
apresentadas nas figuras 7.34 e 7.35.
1
68
Figura 7.34: Fotografias das unidades de controle, biorremediação com NPK, com
NPK + microrganismos, e NPK + biosurfactante no quarto dia do experimento 5.
A mancha de óleo presente na unidade de biorremediação em que foi aplicado
NPK + microrganismos adquiriu um aspecto semelhante àquele desenvolvido pelo
óleo tratado somente com NPK. Na unidade em que foi aplicado NPK +
biosurfactante, o óleo formou pequenos grumos. No entanto, esse comportamento
não interferiu na eficiência do NPK em acelerar a biodegradação dos n-alcanos e
isoprenóides.
1
69
Figura 7.35: Fotografias das unidades de controle, biorremediação com NPK, NPK +
microrganismos, e NPK + biosurfactante, no sétimo dia do experimento 5.
Essas observações podem ser confirmadas pelos resultados obtidos da
quantificação das amostras de óleo, realizada por cromatografia gasosa, e
apresentados na tabela 7.15. Deve-se salientar que os perfis cromatográficos obtidos
dos testes conduzidos em duplicata, tanto para o NPK + microrganismos como para
o NPK + biosurfactante não apresentaram diferenças significativas, com relação à
abundância relativa dos n-alcanos e dos isoprenóides.
1
70
Tabela 7.15: Variação média das concentrações de n-alcanos e isoprenóides
medidas nos óleos das unidades de controle (C), de biorremediação com NPK (N),
NPK e microrganismos (N+Mc) e NPK e biosurfactante (N+B) e o percentual de
perda de n-alcanos e isoprenóides em relação ao óleo de Albacora, no experimento
5.
Tempo
0 dia 4 dias 7 dias
mg/g
C
N
N+Mc
N+B
C
N
N+Mc
N+B
C
N
N+Mc
N+B
n-C
10
0
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
0
n-C
11
4,0
1,8 2,0
8,2 0
0 0
0 0
0 0
0
n-C
12
13,3
9,2 9,5
16,6
0
0 0
0 0
0 0
0
n-C
13
22,4
18,1
18,8
22,8
0
0 0
0 0
0 0
0
n-C
14
35,9
30,3
31,8
33,4
0
0 0
0 0
0 0
0
n-C
15
30,1
26,1
27,3
28,1
1,3
0 0
0 0
0 0
0
n
-C
16
23,5
21,0
21,3
21,5
8,6
0 0
0 2,2
0 0
0
n-C
17
20,5
18,5
18,9
18,9
15,3
0 0
0 9,5
0 0
0
P
10,1
8,9 7,9
9,6 7,5
7,6 6,6
6,9 4,3
3,6 4,6
2,5
n-C
18
15,6
13,7
14,4
14,0
12,2
0 0
0 11,4
0 0
0
F
5,4
4,9 5,1
5,1 4,5
5,3 4,6
4,9 4,3
3,8 4,1
2,6
n-C
19
14,1
12,7
13,5
13,2
11,7
0 0
0 10,9
0 0
0
n-C
20
12,2
10,8
11,6
11,3
10,7
0 0
0 9,9
0 0
0
1
71
Nesta tabela podem ser observados os resultados das aplicações de NPK
isoladamente e combinada com microrganismos bioaumentados e NPK com
biosurfactante. As três condições de biorremediação foram favoráveis ao processo
de biodegradação, num curto intervalo de tempo, sem apresentarem diferenças
significativas na aceleração do processo. Essa observação pode ser confirmada
pelos resultados obtidos para os principais parâmetros usados na identificação do
processo de biodegradação sobre a fração de n-alcanos e de isoprenóides,
apresentados na tabela 7.16. Nota-se também que a percentagem de perda dos
alcanos por biorremediação esteve próxima de 30%, considerando-se que a perda
por evaporação até o quarto dia do experimento foi de 66%.
Comparando-se os valores obtidos no Experimento 5 para as relações entre n-
alcanos, pristano e fitano das amostras de óleo provenientes da unidade de
biorremediação com NPK com aqueles do Experimento 3 (tabela 7.11) verifica-se
que, embora a quantidade aplicada do fertilizante tenha sido diminuída pela metade,
o processo de biodegradação foi mais acelerado no Experimento 5. A comparação
dos resultados atingidos no Experimento 5 com aqueles do Experimento 4 (tabela
7.14), em que foram aplicadas as mesmas quantidades do fertilizante até o sétimo
dia, mostrou que no Experimento 5 o consumo dos n-alcanos n-C
17
e n-C
18
foi
completado num intervalo de tempo menor, após quatro dias de biorremediação.
1
72
Tabela 7.16: Relação entre n-alcanos, pristano e fitano, dos óleos coletados das
unidades de controle e de biorremediação do experimento 5.
Tempo (dias) n-C
17
/P n-C
18
/F P/F
Controle
Tempo 0
2,0
2,8
1,9
NPK (2g) 2,1 2,8 1,8
NPK (2g)+Mc (10
5
cel./ml)
2,0 2,8 1,9
NPK (2g)+ B (2g) 2,0 2,8 1,9
Controle
Tempo 2
2,1
2,8
1,7
NPK (2g) 1,5 2,0 1,6
NPK (2g) + Mc 1,6 2,1 1,7
NPK (2g)+ B (2g) 1,4 1,9 1,7
Controle
Tempo 4
2,1
2,7
1,6
NPK (1g) 0,0 0,0 1,4
NPK (1g) + Mc 0,0 0,0 1,4
NPK (1g) + B (1g) 0,0 0,0 1,4
Controle
Tempo 7
2,2
2,7
1,0
NPK 0,0 0,0 0,9
NPK + Mc 0,0 0,0 1,1
NPK + B 0,0 0,0 1,0
Controle
Tempo 14
2,2
2,7
0,3
NPK 0,0 0,0 0,0
NPK + Mc 0,0 0,0 0,0
NPK + B 0,0 0,0 0,0
Controle
Tempo 21
0,0
2,5
0,0
NPK 0,0 0,0 0,0
NPK + Mc 0,0 0,0 0,0
NPK + B 0,0 0,0 0,0
Controle
Tempo 28
0,0
2,1
0,0
NPK 0,0 0,0 0,0
NPK + Mc 0,0 0,0 0,0
NPK + B 0,0 0,0 0,0
1
73
7.6.2. Avaliação do aumento da aeração sobre a biorremediação
A oxigenação do meio líquido foi aumentada nesse experimento com a
presença de mais uma bomba de aeração. O aumento do teor de oxigênio dissolvido
foi provavelmente o responsável pela aceleração do processo de biodegradação
observado no Experimento 5. Os resultados mostraram a importância da oxigenação
sobre o processo de biodegradação, conduzido principalmente por microrganismos
aeróbicos com capacidade de introduzir átomos de oxigênio às moléculas dos
hidrocarbonetos, via ação das oxigenases, logo na primeira etapa da biodegradação
(Morgan e Watkinson, 1994).
As ondas no meio ambiente marinho, são responsáveis pelo aumento da
aeração. O seu efeito sobre a biodegradação de hidrocarbonetos saturados, na
presença de um nutriente oleofílico, foi estudado por pesquisadores gregos em
derrames simulados. Os resultados desse trabalho, após 30 dias de monitoramento,
indicaram que a biodegradação dos
n
-alcanos nos testes realizados na superfície da
água, na presença de ondas moderadas, foi superior àqueles realizados em
sedimentos (Santas e Santas, 2000).
Nos estudos sobre os efeitos da aeração na biodegradação de resíduos de
petróleo em um biorreator também foi comprovada a importância da aeração na
aceleração da atividade microbiana envolvida no consumo de n-alcanos, pristano e
fitano (Ururahy et al., 1998).
Com o objetivo de avaliar o percentual de n-alcanos e isoprenóides que foram
evaporados ou sofreram outros processos de intemperismo, durante os 28 dias do
derrame simulado em água do mar, foram tabeladas as concentrações de cada um
dos alcanos de n-C
8
a n-C
35
, presentes nas amostras de óleo coletadas das
unidades de controle e comparadas com aquelas referentes ao óleo original de
Albacora. Essa comparação pode ser observada na tabela 7.17.
1
74
Tabela 7.17: Quantificação dos n-alcanos, pristano e fitano, das amostras de óleo de
Albacora, e daquelas coletadas da unidade de controle nos 28 dias do experimento
5.
CONTROLE
mg/g
Albacora
2 dias 4 dias
7 dias 14 dias
21 dias
28 dias
n-C
8
56,65
0 0
0 0
0 0
n-C
9
42,60
0 0
0 0
0 0
n-C
10
31,68
0 0
0 0
0 0
n-C
11
26,82
0 0
0 0
0 0
n-C
12
25,61
0 0
0 0
0 0
n-C
13
25,88
0 0
0 0
0 0
n-C
14
34,58
0 0
0 0
0 0
n-C
15
27,02
9,27 1,33
0 0
0 0
n-C
16
20,46
14,80 8,57
2,20 0
0 0
n-C
17
17,39
16,30 15,29
9,52 2,02
0 0
P
8,95
7,81 7,46
4,31 0,86
0 0
n-C
18
13,10
12,98 12,16
11,40 6,89
4,22 2,28
F
5,15
4,66 4,53
4,25 2,52
1,66 1,07
n-C
19
12,14
12,28 11,7
10,90 10,9
8,56 8,34
n-C
20
10,61
10,81 10,67
9,90 9,86
9,74 7,47
n-C
21
8,67
9,00 8,22
8,20 8,56
8,78 7,39
n-C
22
8,18
8,58 8,56
8,50 8,60
8,63 6,98
n-C
23
7,87
8,24 7,95
8,20 8,45
7,88 6,06
n-C
24
7,45
7,72 7,65
7,17 7,25
7,38 6,37
n-C
25
7,56
7,31 7,11
7,20 7,15
7,25 5,63
n-C
26
7,14
6,61 6,24
6,24 6,53
6,59 5,37
n-C
27
7,02
6,46 6,67
6,98 6,74
6,39 5,07
n-C
28
6,28
5,72 5,50
5,31 5,69
5,68 4,78
n-C
29
6,02
5,96 5,58
5,55 5,73
5,37 4,88
n-C
30
6,24
5,51 5,32
5,38 5,45
5,34 3,74
n-C
31
4,36
4,34 4,17
4,43 4,14
3,67 3,24
n-C
32
3,89
3,81 3,95
3,99 3,68
3,30 2,65
n-C
33
2,40
1,98 2,06
2,20 1,87
1,76 1,38
n-C
34
1,60
1,41 1,28
1,26 1,24
1,27 0,98
n-C
35
1,37
1,39 1,13
1,20 1,00
1,10 0,76
Total
(mg/g)
444,69
172,95 153,15
134,29 115,04
104,57 84,44
% de perda por
intemperismo
61 66
70 74
77 81
Pode-se observar que o percentual de perda por intemperismo, principalmente
por evaporação dos alcanos normais e ramificados é bastante elevado. No entanto, o
1
75
óleo sobrenadante presente na unidade de controle após sete dias do derrame
(figura 7.35), continuou recobrindo toda a superfície da unidade de simulação e
manteve seu aspecto viscoso. Além do percentual de óleo biorremediado estar
próximo de 30% ao final de uma semana de biorremediação (tabela 7.15), verificou-
se que o processo de biodegradação sobre os n-alcanos alterou de forma positiva o
aspecto e o comportamento do óleo residual na superfície da água do mar.
7.6.3. Monitoramento microbiológico
Foram coletadas amostras de água das unidades de simulação, nos tempos 0,
7, 14, 21 e 28 dias e enviadas a
Gerência de Biotecnologia e Tratamentos
Ambientais – CENPES/PETROBRAS para verificação do número de indivíduos
presentes nas populações de bactérias heterotróficas e degradadoras de
hidrocarbonetos. Os resultados do monitoramento microbiológico realizado ao longo
dos 28 dias de experimento podem ser observados nas figuras 7.36 e 7.37.
Contagem do número de bactérias
heterotróficas
1,00E+00
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
0 7 14 21 28
tempo (dias)
Heterotróficas (NMP/ml)
controle
NPK
NPK+ Mc
NPK+ B
Figura 7.36: Avaliação do número de bactérias heterotróficas, presentes nas
amostras de água coletadas das unidades de simulação, ao longo dos 28 dias do
experimento 5.
1
76
Antes de se iniciar a avaliação do monitoramento microbiológico da
biorremediação deve-se lembrar que a aplicação de 2g, 2g, e 1g do fertilizante NPK
se deu nos tempos 0, 2 e 4 dias do experimento, respectivamente. A análise dos
perfis apresentados na figura 7.36 para as quatro condições experimentais, indicou
que houve uma tendência de manutenção do número de bactérias heterotróficas na
primeira semana. Na amostra referente à unidade de biorremediação com NPK
observou-se que o número inicial de indivíduos presentes na água do mar foi inferior
àquele determinado para as outras unidades de simulação. Esse resultado anômalo
pode ter sido conseqüência de um erro experimental, principalmente levando-se em
consideração que a coleta de água do mar foi realizada sob as mesmas condições
para todas as unidades de simulação.
Entre o sétimo e o vigésimo primeiro dia do experimento observou-se uma
diminuição da população das bactérias heterotróficas para as amostras provenientes
do controle e de uma forma menos expressiva para as amostras das unidades de
biorremediação. O decréscimo da população na unidade de controle, desde o início
do experimento, pode estar relacionado à incapacidade de metabolização dos
alcanos, única fonte de carbono disponível, pelos microrganismos, na ausência de
compostos de nitrogênio e fósforo.
Nas unidades de biorremediação, a diminuição do número de indivíduos,
provavelmente, se deve à ausência de fontes de carbono de fácil metabolização, a
partir do sétimo dia, em função do consumo completo dos n-alcanos nos primeiros
dias do experimento.
O comportamento anômalo para a amostra de água coletada da unidade de
biorremediação com NPK, assim como em menor proporção para aquelas das
unidades com NPK+Mc e NPK+B, representado por um crescimento da população
no décimo quarto dia, pode indicar a presença de um grupo específico de bactérias
heterotróficas responsável pela biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos. Essa
hipótese foi levantada em função da combinação de duas condições observadas
nesta fase da biorremediação e consideradas importantes para a degradação de
aromáticos:
- A biodegradação de todos os alcanos, confirmada pelo monitoramento
geoquímico; e
1
77
- A ausência de nutrientes, em função do consumo praticamente completo
dos compostos de nitrogênio e fósforo, apresentado a seguir nas figuras
7.38 e 7.39.
Os perfis, nos quais foram plotados o número de bactérias degradadoras de
hidrocarbonetos, para as amostras de água coletadas das unidades de simulação
são apresentados na figura 7.37.
Contagem do número de bactérias
degradadoras de hidrocarbonetos
1,00E+00
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
0 7 14 21 28
tempo (dias)
Degradadoras de
hidrocarbonetos
(NMP/ml)
controle
NPK
NPK+ Mc
NPK+ B
Figura 7.37: Avaliação do número de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos,
presentes nas amostras de água coletadas das unidades de simulação, ao longo dos
28 dias do experimento 5.
Na unidade de controle observou-se um decréscimo da população de
bactérias degradadoras de hidrocarbonetos, provavelmente, devido à incapacidade
desses microrganismos em degradar os hidrocarbonetos na ausência de fontes de
nitrogênio e fósforo. Esse fato foi confirmado pelos resultados obtidos do
monitoramento geoquímico, no qual verificou-se que o processo de evaporação foi o
principal responsável pela mudança na composição química do óleo derramado
nessa unidade, ao longo dos 28 dias do experimento.
A análise do perfil do número de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos
presentes na unidade de biorremediação contendo somente NPK indicou que o
número de indivíduos alcançou valores próximos a 10
1
(NMP/ml). No entanto,
1
78
embora os valores medidos tenham sido inferiores àqueles registrados para as
amostras provenientes das outras unidades de biorremediação, a taxa de
biodegradação foi praticamente a mesma encontrada para as outras condições.
Nas amostras coletadas das unidades de biorremediação em que foram
aplicados NPK e biosurfactante, pode-se dizer que o número de indivíduos dessa
população se manteve praticamente constante ao longo do tempo.
O aumento no número de indivíduos da população de bactérias degradadoras
de hidrocarbonetos, no caso das amostras coletadas das unidades em que foram
adicionados microrganismos bioaumentados, já era esperado, pois no início do
experimento foi aplicado um inóculo com concentração média de 10
5
NMP/ml. Essas
células rapidamente se adaptaram à presença dos hidrocarbonetos, por terem sido
bioaumentadas em meio de cultura contendo óleo como fonte de carbono, não
sofrendo, desta forma, com os efeitos naturais de aclimatação a um novo substrato.
No entanto, o número médio dessas bactérias retornou aos valores iniciais após o
consumo dos nutrientes e dos alcanos, ao final dos quatorze dias do experimento.
7.6.4. Avaliação da concentração residual dos íons amônio e fosfato
Com o objetivo de se avaliar o consumo dos íons amônio e fosfato que
compõem o fertilizante NPK, pela população microbiana ao longo da biorremediação,
foram realizadas medidas da concentração residual de nitrogênio amoniacal e de
fósforo na água das unidades de simulação. As amostras foram coletadas nos
tempos: 0, 2, 4, 7, 14, 21 e 28 dias, e enviadas ao Laboratório de Fitotecnia,
CCTA/UENF.
Vale lembrar que a aplicação do fertilizante NPK se deu logo após o derrame
(2g), no segundo dia (2g), e no quarto dia (1g). Os gráficos apresentados nas figuras
7.38 e 7.39 mostram os perfis da concentração residual ao longo do experimento.
Para facilitar a visualização das informações contidas nos gráficos, as medidas
referentes à unidade de controle não foram plotadas, pois representaram valores
inferiores a 0,5 mg/l.
1
79
Concentração residual do nitrogênio
amoniacal
1
80
Concentração residual de fósforo
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 2 4 7 14 21 28
tempo (dias)
fósforo (mg/l)
1
81
CE 50%, isto é, a concentração (ppm) a partir da qual foi observado o efeito de
redução de 50% na emissão de luminescência pela bactéria marinha Vibrio fischeri.
Os resultados obtidos para os diferentes produtos testados nesse experimento
encontram-se na tabela 7.18.
Tabela 7.18: Resultados dos testes de ecotoxicidade para Vibrio fischeri pelo método
MICROTOX®. Onde CE 50 % = concentração a partir da qual, foi observado o efeito
de redução de 50% na emissão de luminescência pela bactéria.
Tempo
(dias)
Descrição da amostra CE 50 % (ppm)
(efeito em 15 minutos)
Controle
> 90
Fertilizante (NPK) > 90
0 Microrganismos + NPK (1) > 90
Microrganismos + NPK (2) > 90
Biosurfactante + NPK (1) > 90
Biosurfactante + NPK (2) > 90
Controle
> 90
Fertilizante (NPK) > 90
Microrganismos + NPK (1) > 90
7 Microrganismos + NPK (2) > 90
Biosurfactante + NPK (1) > 90
Biosurfactante + NPK (2) > 90
Controle
> 90
Fertilizante (NPK) 75,29
14 Microrganismos + NPK (1) > 90
Biosurfactante + NPK (1) > 90
Biosurfactante + NPK (2) > 90
Controle
> 90
Fertilizante (NPK) 45,16
21 Microrganismos + NPK (1) 52,18
Biosurfactante + NPK (1) 74,40
Biosurfactante + NPK (2) 74,22
Controle
> 90
Fertilizante (NPK) > 90
28 Microrganismos + NPK (1) > 90
Biosurfactante + NPK (1) 61,13
Biosurfactante + NPK (2) > 90
Os valores de CE 50%, medidos após 15 minutos de exposição, indicaram a
ausência de toxicidade (valores > 90) para todas as amostras de água coletadas das
1
82
unidades de controle e de biorremediação, tanto na primeira como na segunda
semana de tratamento, quando a maior parte dos compostos saturados já tinha sido
degradada. Esse comportamento não se manteve após a terceira semana,
provavelmente devido à presença de metabólitos tóxicos produzidos pelo primeiro
estágio do processo de biodegradação de compostos policíclicos aromáticos, no qual
são introduzidos radicais hidroxilas nos anéis benzênicos através da ação de
enzimas oxigenases. Os produtos dessa reação são, normalmente, polifenóis,
considerados tóxicos. Essa hipótese pode ser corroborada pelo fato da toxicidade do
meio voltar a diminuir aos vinte e oito dias do experimento, possivelmente como
resultado da continuidade do processo de biodegradação sobre os polifenóis.
A ausência de dados relacionados à unidade de biorremediação contendo
NPK + microrganismos de número 2, a partir da primeira semana, é conseqüência do
cancelamento desta duplicata devido a uma rachadura no fundo da unidade de
simulação, pela qual vazou quase a totalidade da água contida na unidade.
1
83
Conclusões do Experimento 5:
a)
Foi confirmada neste experimento a eficiência do uso do fertilizante NPK no
processo de biodegradação de n-alcanos, pristano e fitano. A sua combinação
com microrganismos bioaumentados e com biosurfactante não acrescentou
melhorias significativas à técnica de biorremediação.
b) O aumento da oxigenação do meio aquoso para as três condições de
biorremediação foi favorável ao processo de biodegradação, diminuindo para
quatro dias o tempo necessário ao consumo de n-C
17
e n-C
18
pela microflora
naturalmente presente na água do mar.
c) O percentual de perda por intemperismo, principalmente por evaporação, dos
alcanos normais e ramificados foi bastante elevado, variando de
aproximadamente 60% após 2 dias, chegando a 80% no final de 28 dias do
experimento.
d) O percentualn-1(c)1(e)1( )-77(p)1(o )-2r evioau1(e)1(me)1(d)1( p)1(r)-dadão fos e anos n c123(2ta)1(d)1(e)(p)1(e)1(r)66(c)-4 1(ma)1(d)1(o)1( )-2
1
84
f)
Na análise do crescimento da população das bactérias degradadoras de
hidrocarbonetos observou-se que não houve aumento da população. Embora
os valores registrados para as amostras provenientes da unidade de
biorremediação com NPK tenham sido inferiores aos de outras unidades de
biorremediação, a taxa de biodegradação foi praticamente a mesma.
g)
O consumo do íon amônio pela população microbiana, presente nas unidades
de biorremediação, foi mais acelerado nas unidades de biorremediação
contendo NPK e microrganismos bioaumentados, provavelmente devido à
presença de um número maior de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos.
h) O óleo de Albacora derramado na unidade de controle não apresentou
toxicidade, considerando o teste realizado. O processo de biodegradação de
alcanos não foi responsável pelo aumento da toxicidade do meio. No entanto,
com a continuidade do processo de biodegradação de outras categorias de
compostos, provavelmente os policíclicos aromáticos, verificou-se um aumento
da toxicidade em função da presença de polifenóis, considerados tóxicos.
1
85
Com o objetivo de resumir os resultados obtidos dos cinco experimentos
apresentados nesta pesquisa encontram-se na tabela 7.19 os valores referentes às
relações de n-alcanos, pristano e fitano, obtidos para os diferentes produtos e
condições experimentais aplicados nos testes de biorremediação para o óleo de
Albacora, ao final de uma semana de tratamento.
Tabela 7.19
: Resumo dos parâmetros de avaliação do grau de biodegradação e
intemperismo de n-alcanos e isoprenóides, para o óleo de Albacora, após sete dias
de biorremediação, para os cinco experimentos conduzidos nesta pesquisa.
Parâmetros
n-C
17
/P n-C
18
/F P/F
Exp.
Produto testado Quantidade
aplicada
Cont.
Bior. Cont.
Bior. Cont.
Bior.
1 Melaço hidratado 2 g 2,3
2,3 2,7
2,7 0,8
0,8
Melaço desidratado 10 g 1,9
1,9 2,3
2,5 1,1
1,3
2
NH
4
H
2
PO
4
10 g 1,9
0,4 2,3
0,5 1,1
1,3
NPK (10:10:10) 10 g 1,8
0,1 2,3
0,1 0,7
1,0
3
NPK + Surf. 10 g +10 ml
1,8
0,1 2,3
0,1 0,7
0,8
NPK (10:10:10) 2,0
0,0 2,7
0,0 1,1
1,3
4
NP (17:16)
5 g
2,0
0,0 2,7
0,0 1,1
1,2
NPK (10:10:10) 5 g 2,3
0,0 2,7
0,0 1,0
1,0
NPK + Microrg. 5g +10
5
cel.
2,3
0,0 2,7
0,0 1,0
1,1
5
NPK + Biosurfac. 5 g + 5 g 2,3
0,0 2,7
0,0 1,0
1,0
Demonstra-se que os melhores resultados obtidos em termos da
biodegradação, isto é, o consumo completo dos n-alcanos, são aqueles em foram
aplicados o fertilizante NPK na proporção de 10%, em relação ao volume de óleo
derramado, com a aplicação sendo realizada ao longo dos sete dias após o derrame,
experimentos 4 e 5.
1
86
7.7. Isolamento e identificação de bactérias degradadoras de
hidrocarbonetos
Com o objetivo de identificar o tipo de bactéria presente na água do mar usada
nesta pesquisa e capaz de degradar hidrocarbonetos do petróleo, foram
reproduzidas em microcosmos as condições experimentais conduzidas no quinto
experimento, utilizando somente o fertilizante NPK, na concentração de 0,1 g/l e o
óleo de Albacora (1 g/l). Todos os procedimentos necessários ao isolamento e à
identificação da bactéria degradadora de hidrocarbonetos foram realizados no
Laboratório de Sanidade Animal, do CCTA/UENF, sob responsabilidade do Prof.
Dr. Olney Vieira da Motta.
O experimento foi realizado à temperatura ambiente utilizando garrafas do tipo
Corning, sem tampa e em triplicatas. Ao final de 15 dias foram coletadas amostras do
meio líquido para serem centrifugadas, visando o isolamento das células bacterianas.
Uma parte dessas células foi corada pelo método de Gram, o qual indicou a
presença de bactérias Gram-negativas na forma de bastonetes. As células presentes
na fração centrifugada foram isoladas e posteriormente as culturas puras foram
inoculadas em um caldo nutriente.
As colônias das bactérias isoladas pelo método do esgotamento, foram
classificadas em um sistema automático de identificação de bactérias Gram -
negativas, através de um kit diagnóstico fabricado pela BioMérieux. Os resultados
fornecidos por este kit foram analisados por um aparelho Mini-API, o qual identifica o
gênero e a espécie do microrganismo em questão, por comparação dos resultados
obtidos com aqueles armazenados em seu banco de dados. A classificação da
bactéria, natural da água do mar e que sobreviveu às custas do consumo dos
alcanos, ao final de 15 dias de incubação, indicou que ela pertence à categoria de
Pseudomonas mesophilica. Vale lembrar que essa classificação não é definitiva,
considerando que o método usado indicou uma probabilidade de 94% de acerto. No
entanto, esta verificação serve como um incentivo à identificação mais rigorosa de
espécies marinhas degradadoras dos componentes do petróleo, típicas do litoral
brasileiro e consequentemente, de seus processos metabólicos de biodegradação.
1
87
8. CONCLUSÕES
• A biorremediação com a utilização de NPK, na proporção de 10% do volume de
óleo derramado, contribuiu para retirada de 30% dos alcanos normais e
ramificados, ao final de 4 dias do experimento. Em função dessa taxa de
biodegradação, a aplicação da biorremediação alterou de forma positiva e rápida
o aspecto do óleo na superfície da água do mar, fazendo com que perdesse seu
caráter viscoso e reduzisse a extensão da mancha de óleo derramado.
•
Para as condições de simulação usadas em todos os experimentos foi verificada
a perda, principalmente por evaporação, dos alcanos normais e ramificados, que
variou de aproximadamente 60% no segundo dia do derrame a 80% após 1 mês
da simulação. Também foi observada a degradação parcial dos compostos
policíclicos aromáticos, principalmente os dimetil e trimetil naftalenos.
• A utilização de melaço como nutriente, não foi eficiente na aceleração do
processo de biodegradação, provavelmente, devido ao seu elevado teor de
açúcares, fonte de carbono de fácil metabolização, quando comparado com os
hidrocarbonetos presentes no petróleo.
• O uso de 10g/semana de fosfato de amônio (NH
4
H
2
PO
4
) levou a biodegradação
de n-alcanos e isoprenóides, mas os resultados analíticos não indicaram a
biodegradação dos hidrocarbonetos policíclicos saturados nem dos compostos
policíclicos aromáticos, considerados os mais recalcitrantes.
•
A biorremediação com a utilização do fertilizante NPK, demonstrou ser eficiente
na degradação completa de alcanos normais e ramificados, principalmente
quando a freqüência de aplicação sobre o óleo derramado se concentrou na
primeira semana do experimento. Entretanto, o uso concomitante do fertilizante
1
88
com surfactante sintético, microrganismos bioaumentados e com biosurfactante
não acrescentou melhorias significativas à eficiência da biorremediação.
• O processo de biodegradação sobre os componentes da fração de aromáticos,
principalmente de fenantreno, dos isômeros metilados do dibenzotiofeno e do 3
metil fenantreno foi mais pronunciado na unidade de controle, isto é, na ausência
do fertilizante NPK, conforme observado por outros autores.
•
Os resultados encontrados para os testes de comparação entre os fertilizantes
NPK e NP indicaram que não se justifica a utilização de um produto fora de linha
de produção (NP), por apresentar uma performance muito similar ao produto
comercial, tanto sob o aspecto da estimulação do crescimento de bactérias
heterotróficas e degradadoras, como da aceleração do processo de
biodegradação.
•
O aumento da oxigenação nas unidades de biorremediação foi favorável ao
processo de biodegradação, diminuindo para quatro dias o tempo necessário ao
consumo dos n-alcanos de peso molecular menores que n-C
18
, considerando as
condições experimentais desta pesquisa.
• A biorremediação com a aplicação do fertilizante NPK, isoladamente ou em
conjunto com microrganismos bioaumentados ou com biosurfactante, produziu
metabólitos tóxicos, provavelmente polifenóis, resultantes da primeira etapa de
biodegradação dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. Entretanto, com a
continuidade do processo foram restabelecidos os níveis de não toxicidade após
vinte e oito dias do experimento.
1
89
9. RECOMENDAÇÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
1) Otimizar futuras condições experimentais e analíticas visando a biorremediação
dos compostos policíclicos aromáticos presentes no petróleo, levando em
consideração sua elevada recalcitrância no meio ambiente e seu potencial
tóxico.
2) Desenvolver estudos envolvendo o controle da solubilidade de nutrientes na
água do mar, utilizando, por exemplo, suportes constituídos de polímeros
naturais biodegradáveis como a quitosana, extraída da carapaça de crustáceos,
que já vem sendo produzida no Brasil.
3) Avaliar a possibilidade de se utilizar fontes de nitrogênio e fósforo
economicamente viáveis, como a apatita, um fosfato de baixa solubilidade em
água e mineral fonte de fósforo, encontrado em diversas jazidas do país. A
utilização de apatita como fonte de fosfato tornaria a aplicação da
biorremediação uma técnica ambientalmente correta, passível de receber um
“selo verde” de qualidade.
4) Testar mecanismos de fixação de nutrientes nas bordas das barreiras de
contenção, mantendo uma concentração ótima nas camadas mais superficiais
da lâmina d’água, região na qual se encontram o maior número de
microrganismos degradadores de hidrocarbonetos e a aeração é mais intensa.
5) Por último, recomenda-se a realização de testes de biorremediação em
derrames simulados no mar, isto é, in situ, com a devida supervisão da UN/BC-
Petrobras e do órgão de controle ambiental do Estado do Rio de Janeiro –
FEEMA, com o objetivo de se obter dados mais próximos de um derrame real.
190
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208
Anexo A
209
EXPERIMENTO 1
CROMATOGRAMAS
210
211
212
213
214
FRAGMENTOGRAMAS
m/z=191
m/z=217
215
216
217
218
219
220
FRAGMENTOGRAMAS
m/z=192
m/z=198
221
222
Anexo B
223
EXPERIMENTO 2
CROMATOGRAMAS
224
225
226
227
FRAGMENTOGRAMAS
m/z=191, m/z=177
m/z=217
228
229
230
231
232
233
234
235
Anexo C
236
EXPERIMENTO 3
CROMATOGRAMAS
237
238
239
240
241
242
243
244
245
246
FRAGMENTOGRAMAS
m/z=191, m/z=177
m/z=217
247
248
249
250
251
252
253
254
255
256
257
258
259
260
FRAGMENTOGRAMAS
m/z=192, m/z=198
261
262
263
264
265
266
267
268
269
270
FRAGMENTOGRAMAS
Scan dos aromáticos
271
272
273
274
275
Anexo D
276
EXPERIMENTO 4
CROMATOGRAMAS
277
278
279
280
281
282
283
NPK (2)
14 dias
284
NPK (1)
21 dias
NPK (2)
21 dias
285
286
Anexo E
287
EXPERIMENTO 5
CROMATOGRAMAS
288
Controle
0 dia
289
290
291
292
293
294
295
296
297
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