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LUCIENE BARBOSA
CULTIVO PRIMÁRIO DO ÓRGÃO HEMATOPOIÉTICO
DE MOLUSCOS DO GÊNERO Biomphalaria :
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E FUNCIONAL
DAS CÉLULAS
2007
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TESE DE DOUTORADO APRESENTADA AO CURSO DE PÓS-
GRADUAÇÃO DO DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA DO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DA UNIVERSIDADE
FEDERAL DE MINAS GERAIS
ALUNA: LUCIENE BARBOSA
ORIENTADOR: DR. PAULO MARCOS ZECH COELHO
CO-ORIENTADORA: DR
A
CONSUELO LATORRE FORTES-DIAS
COLABORADORA: MS. LUCIANA MARIA SILVA
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Ao Dicélio,
pessoa iluminada,luz do meu caminho...
“Eu sei que as coisas mais importantes da vida não podem
ser compradas, como o amor, a amizade e pequenos
gestos de carinho compartilhados por duas pessoas.”
Faço-
lhe uma promessa a de transformar nossos dias em
momentos para serem Eternamente lembrados! Amo você.
4
Ao Guilherme e Beatriz, razão do
meu viver, amo vocês.
A minha mãe, Arlete, pelo e
xemplo de
vida, carinho e ajuda constante.
5
Ao Programa de Pós-
Graduação em
Parasitologia do Departamento de
Parasitologia do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Minas Gerais, meus
sinceros agradecimentos.
6
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela oportunidade da vida !!!!!
Ao Paulo Marcos Zech Coelho, pela orientação, paciência, tolerância, amizade, afeto
e, principalmente, pela compreensão nos momentos difíceis. Desculpe-me se em
algum momento te decepcionei, e se o fiz, não foi minha intenção, espero continuar
contando sempre com você......
À Consuelo Latorre Fortes-Dias, minha querida co-orientadora, pessoa maravilhosa
que o destino colocou em meu caminho, obrigada pela preciosa ajuda ao trabalho e
também pelo ouvido amigo nas horas difíceis....
À Luciana Maria Silva,por ter me recebido de portas e coração abertos,pelo otimismo
e confiança,pelo apoio nos momentos mais difíceis, não do trabalho, mas da vida.
Você mora no meu coração, muito obrigada! Não tenho palavras para lhe agradecer.
À Márcia Hermógenes, por estar sempre ao meu lado, na alegria, na tristeza e
principalmente por compartilhar pequenos e grandes momentos comigo. Você é uma
pessoa iluminada, amiga e com um coração tamanho família.
À Ana Carolina Mattos,colega que se tornou amiga, os momentos em que
convivemos foram sempre repletos de alegrias, sorrisos e ás vezes de lágrimas.
Nunca te esquecerei, obrigada pelo carinho e pela ajuda,continue assim...
Ao Paulo Pimenta, pela valiosa colaboração.
Aos colegas do laboratório de Cultivo Celular: Ana Carolina, Flávio, Telma, Raul,
Ronan, Rafael, Gisele, Fernanda, Laila, obrigada pelas horas agradáveis que
passamos juntos, foi muito bom trabalhar com vocês!
7
Aos colegas do laboratório de Esquistossomose: Ana Karine, Daniela, Suedale,
Vanessa, Áureo, Vanda, Neuza, pelo carinho que sempre me receberam e pela
agradável convivência
Aos colegas do laboratório de Entomologia Médica, em especial, á Tati, Cris,
Gustavo e Érica, muito obrigada pela paciência e presteza ....
À Rosilene Siray Bicalho, longe dos olhos mas sempre perto do meu
coração,obrigada por tudo, e principalmente por ter acreditado na minha
capacidade...
À Dílcia, Delza e Sueleny, pela boa vontade incondicional em me fornecer os
caramujos, vocês são valiosas!
Aos funcionários do GIDE, pelo carinho constante: Alberto, José Carlos, Airton,
Selma, Florence.
Ao Roney Elias, muito obrigada pela boa vontade demonstrada em todos os
momentos.
Aos meus amigos: Cláudio, Jussara, Giovana, Guilherme, Iara, Janet, Carlos
Alberto, Odília, obrigada por vocês fazerem parte da minha história e sempre
torceram por mim!!!
Ao saudoso professor Hélio Martins de Araújo Costa (in memorian) pela primeira
oportunidade, pessoa digna, sempre que me recordo do senhor, a saudade e as
lágrimas me vêem aos olhos, pessoas como o senhor jamais deveriam partir, o
senhor tem cadeira cativa no meu coração!!!!
À secretária da Pós-Graduação, Sumara pela ajuda constante.
Aqueles, que por inveja,tentaram a todo custo me prejudicar,eu me tornei mais forte
com isso e como diz um sábio pensamento: “ter problemas na vida é inevitável; ser
derrotado por eles é opcional.” Eu venci !!!!
8
Finalmente, gostaria de agradecer a todos aqueles que, de forma direta ou indireta,
contribuíram para a realização deste trabalho, por terem compartilhado lágrimas
sorrisos, palavras amigas alegrias e tristezas. Muito obrigada! ! !
9
“feliz é aquele que ensina o que sabe e aprende o que ensina...”
(Autor desconhecido)
10
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 17
2. JUSTIFICATIVA ....................................................................................... 31
3. OBJETIVOS ............................................................................................. 32
3.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................... 32
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................... 32
4. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 33
4.1. CARAMUJOS UTILIZADOS......................................................................... 33
4.2. PARASITO .............................................................................................. 34
4.3. INFECÇÃO DOS CARAMUJOS .................................................................... 34
4.4. CULTIVOS PRIMÁRIOS.............................................................................. 35
4.5. MATERIAIS ............................................................................................. 35
4.6. UTILIZAÇÃO DO MEBENDAZOL .................................................................. 36
4.7. OBTENÇÃO DE CÉLULAS DA HEMOLINFA DE BIOMPHALARIA ........................ 36
4.8. COLORAÇÃO POR AZUL DE METILENO ....................................................... 36
4.9. ANÁLISE CELULAR POR MICROSCOPIA CONFOCAL UTILIZANDO LECTINAS
CONJUGADAS COM FITC .................................................................................................... 37
4.10. OBTENÇÃO DE ANTÍGENOS SOLÚVEIS DE OVOS (SEA)............................ 38
4.11. OBTENÇÃO E TRANSFORMAÇÃO IN VITRO DE MIRACÍDIOS EM ESPOROCISTOS
PRIMÁRIOS 38
5. RESULTADOS ......................................................................................... 42
5.1. CULTIVO CELULAR .................................................................................. 42
5.2. TIPOS CELULARES EM CULTURA ............................................................... 43
B.glabrata .................................................................................................. 43
B. tenagophila do Taim e de Cabo Frio...................................................... 47
5.3. COMPORTAMENTO CELULAR EM CONTATO COM ANTÍGENOS DIVERSOS....... 48
B.glabrata .................................................................................................. 48
B. tenagophila............................................................................................ 51
5.4. COMPORTAMENTO CELULAR EM CONTATO COM ESPOROCISTOS ................ 54
B. glabrata ................................................................................................. 54
B. tenagophila Taim .................................................................................. 57
B. tenagophila Cabo Frio ........................................................................... 61
11
5.5. COMPORTAMENTO CELULAR EM CONTATO COM MIRACÍDIOS ...................... 63
Experimento realizado com caramujos B. tenagophila do Taim e Cabo Frio
e B. glabrata................................................................................................................. 63
5.6. ANÁLISE DAS CÉLULAS ATRAVÉS MICROSCOPIA CONFOCAL UTILIZANDO
LECTINAS CONJUGADAS COM FITC ..................................................................................... 63
WGA .......................................................................................................... 63
B. glabrata.............................................................................................. 63
B. tenagophila Taim ............................................................................... 64
B. tenagophila Cabo Frio........................................................................ 64
PNA ........................................................................................................... 66
B. glabrata.............................................................................................. 66
B. tenagophila Taim ............................................................................... 66
B. tenagophila Cabo Frio........................................................................ 66
LPL ............................................................................................................ 68
B. glabrata.............................................................................................. 68
B. tenagophila Taim ............................................................................... 68
B. tenagophila Cabo Frio........................................................................ 68
Con A......................................................................................................... 70
B. glabrata.............................................................................................. 70
B. tenagophila Taim ............................................................................... 70
B. tenagophila Cabo Frio........................................................................ 70
Lyso Tracker .............................................................................................. 72
B. glabrata.............................................................................................. 72
B. tenagophila Taim ............................................................................... 72
B. tenagophila Cabo Frio........................................................................ 72
Controle ..................................................................................................... 74
B. glabrata.............................................................................................. 74
B. tenagophila Taim ............................................................................... 74
B. tenagophila Cabo Frio........................................................................ 74
Aspecto Geral ............................................................................................ 76
B. glabrata.............................................................................................. 76
B. tenagophila Taim ............................................................................... 76
6. DISCUSSÃO ............................................................................................ 79
7. CONCLUSÕES ........................................................................................ 86
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................... 87
12
Lista de Abreviaturas
APO órgão produtor de amebócitos
VLS Vitelo de desova de caramujo
EGF Fator de Crescimento Epidérmico
PBS Solução Salina
PBT PBS/ Triton
BABB Benzil álcool / benzilbenzoato
EDTA ácido etilenodiamino tetra acético
SEA Antígeno Solúvel do Ovo
FITC Isotiocianato de Fluoresceína
CON A
Concanavalin A, extraída de Canavalia ensiformis (Jack Bean)
PNA
Peanut agglutinin, aglutinina de Arachis hypogaea
WGA
Wheat germ, aglutinina de Triticum vulgaris
LPL
Horseshoe crab, aglutinina de Limulus polyphemus
13
Resumo
Pela primeira vez conseguiu-se o cultivo primário do órgão hematopoiético
de caramujos do gênero Biomphalaria
O objetivo geral desse trabalho foi obter cultura primária de células do
órgão hematopóietico (APO) de caramujos B. glabrata e B. tenagophila (linhagens
Cabo Frio,suscetível e Taim resistente ao Schistosoma. mansoni) e caracterizá-las
funcional e morfologicamente. A cultura primária de tecido hematopoiético de
Biomphalaria é original e através desta será possível obter as células
hematopoiéticas em grandes quantidades e em meio definido. Esta nova
metodologia permitirá estudar a morfogênese destas células, sua ultraestrutura,
composição e comportamento frente a vários estímulos, inclusive frente a
esporocistos.
Três tipos celulares morfologicamente distintos, nomeados de tipo I, II e
III, cresceram na cultura. As células tipo I que predominam na cultura celular, são
arredondadas com núcleo grande para o tamanho do citoplasma. As células tipo II
possuem relativamente mais citoplasma que o tipo I. A presença de pseudópodes,
também foi observada. O último tipo celular, denominado tipo III são refringentes e
com núcleo não definido e menos abundante, inicialmente, que as outras. Divisão
celular atípica foi observada, com núcleo duplicando sem citocinese.
Nas culturas realizadas com APO de caramujos infectados (após 24 horas
de infecção) encontramos os mesmos tipos celulares encontrados nas culturas de
APO sem infecção, ou seja, tipos I, II e III. Não observamos nada de diferente em
relação às culturas de caramujos não infectados.
Em todos os experimentos em que as células da cultura foram colocadas
em contato com Zimosan foi observado a dispersão das células em direção a essas
partículas.
Em contato com LPS, foi observada com 72 horas nas culturas a
presença de um envoltório celular que se assemelha a uma cápsula e células tipo III.
As células de B.tenagophila de Cabo Frio apresentaram uma melhor resposta ao
antígeno. Um fato interessante observado em todas as culturas realizadas com
caramujos do gênero Biomphalaria foi a transformação das células tipo I em células
tipo III, com 7 dias ou mais. Entretanto, quando as células da cultura foram
14
colocadas em contato com SEA ou LPS, as células tipo III surgem em 48 ou 72
horas respectivamente.
Não houve alterações célulares frente a miracídios,com todas as
linhagens testadas.Fato que permite a inferência que os miracídios, ao contrário dos
esporocistos não estimulam as células hemocitárias.
As células de todas as espécies estudadas foram positivas para as
lectinas WGA, LPL, PNA. B. glabrata não teve células positivas para Con A,
entretanto as duas linhagens de B. tenagophila estudadas apresentaram
positividade para esta lectina.
Nas células de todas as linhagens estudadas foi possível a marcação de
lisossomos.
15
Abstract
Primary culture of the hematopoietic organ from Biomphalaria snails was
obtained for the first time.
The aim of this study was to perform primary culture of cells originating
from the hematopoietic organ (APO) of B. glabrata and B. tenagophila snails
(susceptible and resistant strains to S. mansoni, from Cabo Frio and Taim,
respectively), as well as their functional and morphological characterization. The
primary culture of the hematopoietic tissue from Biomphalaria snails is original, and
by means of this culture it will be possible to obtain hematopoietic cells in mass
scale, and in a defined culture medium. This new methodology will allow the study on
the morphogenesis of these cells, their ultrastructure, composition and behavior in
the presence of various stimuli, including sporocysts.
Three morphologically distinct cellular types, denominated types I, II and
III, were developed into the culture medium. The cells type I, which were
predominant in the cellular culture, are round shape and present a large nucleus in
relation to the cytoplasm size. The cells type II are relatively endowed with a larger
cytoplasm than the cells type I. The presence of pseudopodes was also observed.
The last cellular type, denominated type III, was found to be refringent, and with an
undefined and less abundant nucleus than the other ones, initially. Atypical cellular
division was observed, with a duplicated nucleus without cytokinesis.
In the cultures carried out with APO from infected snails (24 h after
infection), we were able to detect the same cellular types found in cultures performed
with APO without infection, that is, types I, II and III. No difference could be observed
in relation to the other cultures with uninfected snails.
In all the experiments in which the culture cells were put in contact with
Zymosan, we were able to observe migration of the cells in direction of these
particles.
When in contact with LPS, after 72 h it could be observed the presence of
a cellular mantle that was similar to a capsule and type III cells. The cells from B.
tenagophila Cabo Frio presented a better response to antigen. An interesting fact
observed in all the cultures carried out with Biomphalaria snails was the
16
transformation of type I cells into type III cells, after 7 days or more. Nevertheless,
when the culture cells are put into contact with SEA or LPS, type III cells appear after
48 or 72 h, respectively.
As far as miracidia were concerned, there were no cellular changes in all
the tested lineages. This fact allows the inference that miracidia, differently from
sporocysts, do not stimulate the hemocytary cells.
The cells related to all the studied species were positive for lectines WGA,
LPL, and PNA. B. glabrata did not show positive cells for Con A, however, the two
studied B. tenagophila lineages presented positivity related to this lectin.
It was possible to perform labelling of lysosomes in all the studied
lineages.
17
1. Introdução
As esquistossomoses são causadas por helmintos trematódeos,
digenêicos pertencentes ao gênero Schistosoma e são endêmicas em 76 países e
territórios distribuídos pela África, Ásia e Américas (Engels et al., 2002). As espécies
de Schistosoma, que têm importância epidemiológica humana são: Schistosoma
haematobium (Bilharz, 1852); Schistosoma japonicum (Katsurada, 1904);
Schistosoma mekongi (Voge, Brickner & Bruce, 1978); Schistosoma intercalatum
(Fischer, 1934); Schistosoma mansoni (Sambom, 1907). Essas espécies chegaram
às Américas durante o tráfico de escravos e com imigrantes orientais e asiáticos
(nos quais foram detectados numerosos indivíduos parasitados pelo S. haematobium
e S. japonicum), mas apenas o S.mansoni se instalou no Brasil, devido às condições
propícias tais como a presença de hospedeiros intermediários adequados e
condições ambientais semelhantes às da região de origem (Melo & Coelho, 2005). A
necessidade e as condições de trabalho dos escravos nas plantações de cana-de-
açúcar e posteriormente nas minas de ouro e diamante explicam, em grande parte, o
processo de expansão da esquistossomose mansoni no Brasil. A falta de condições
mínimas de higiene, o hábito de defecar próximo aos rios e riachos e a existência de
instalações sanitárias com descarga direta em coleções aquáticas, associados à
presença de caramujos suscetíveis à infecção criaram condições necessárias para
que os parasitos transportados pelos escravos pudessem se reproduzir.
O S. mansoni é transmitido ao homem através do contato com águas
infestadas por cercárias provenientes de caramujos infectados. Os vermes adultos
se localizam no sistema vascular visceral de mamíferos, causando uma doença
crônica e debilitante denominada esquistossomose mansoni. Essa doença é
endêmica em 54 países localizados na América do Sul, Caribe, África e região
18
oriental do Mediterrâneo (Chitsulo et al., 2000) e afeta cerca de 83 milhões de
pessoas (Crompton, 1999) constituindo-se, assim, em um grande problema de
saúde pública. A esquistossomose mansoni está associada à pobreza e ao baixo
desenvolvimento econômico, que gera falta de saneamento básico e a necessidade
de utilização de águas naturais contaminadas para o exercício da agricultura,
trabalhos domésticos e/ou lazer (Katz & Peixoto, 2000). No Brasil estima-se que oito
milhões de pessoas estejam infectadas e que trinta milhões estejam expostas ao
risco da infecção, por residirem em regiões nas quais a transmissão ocorre (Katz,
1997).
Apesar dos avanços obtidos em relação aos métodos de controle,
diminuindo a prevalência e morbidade, principalmente, pela quimioterapia em larga
escala, a esquistossomose continua se expandindo, pelo deslocamento humano à
procura de melhores fontes de trabalho, construção de barragens e implementação
de sistemas de irrigação (Barreto, 1967; Magalhães et al., 1973; Barbosa, 1986).
Marques (1979) ressaltou a importância das migrações internas de portadores de
esquistossomose, que contribuem para a instalação de novos focos estáveis da
parasitose ou para a ocorrência de transmissão ocasional em certas localidades do
nosso país, dependentes da existência de hospedeiros intermediários suscetíveis.
As áreas endêmicas no país localizam-se nos estados do Maranhão,
Pará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe, Bahia, Minas
Gerais, Espírito Santo, São Paulo, Santa Catarina, Rio de Janeiro e mais
recentemente no Rio Grande do Sul (Esteio). Em Minas Gerais, as áreas endêmicas
estão localizadas no Norte de Minas, Campo das Vertentes, Oeste de Minas,
Jequitinhonha, Vale do Mucuri, Vale do Rio Doce, Zona da Mata, e Região
metropolitana de Belo Horizonte (Souza et al., 2001).
19
O parasito necessita como hospedeiros intermediários de caramujos do
gênero Biomphalaria (Preston, 1910) (Mollusca: Pulmonata, Planorbidae). No Brasil
já foram descritas dez espécies e uma sub-espécie desse gênero. São elas: B.
glabrata (Say, 1818); B. tenagophila (Orbigny, 1835); B. straminea (Dunker, 1848);
B. peregrina (Orbigny, 1835); B. schrammi (Crosse, 1864); B. kuhniana (Clessin ,
1883), B. intermedia (Paraense & Deslandes, 1962); B. amazonica (Paraense,
1966); B. oligoza (Paraense, 1974); B. occidentalis (Paraense, 1981) e B. t.
guaibensis (Paraense, 1984). Somente as espécies B. glabrata, B. tenagophila e B.
straminea foram encontradas naturalmente infectadas e, portanto, consideradas
transmissoras da esquistossomose mansoni no Brasil. As espécies B. amazonica
(Paraense & Correa, 1985 e Correa & Paraense, 1971) e B. peregrina (Paraense &
Correa, 1973), por terem sido infectadas experimentalmente, podem ser
consideradas transmissoras em potencial desta doença.
B. glabrata é o mais importante hospedeiro intermediário do S. mansoni,
ocorrendo em grande parte do território nacional, sendo que sua presença sempre
coincide com a transmissão da esquistossomose (Paraense & Corrêa, 1963). Além
disso, essa espécie já foi encontrada em ambientes naturais com taxas de
positividade superiores a 80% (Coelho, 1995). Sua distribuição geográfica ocorre em
faixa contínua abrangendo os Estados brasileiros situados entre Rio Grande do
Norte e o Paraná, estando presente em algumas áreas do Pará, Maranhão, Piauí e,
recentemente, em Esteio, RS (Carvalho et al., 1998). É a espécie mais suscetível,
apresentando altos níveis de infecção, tanto experimental como natural (Paraense &
Corrêa, 1963) e se infecta com todas as linhagens geográficas de S. mansoni.
Paraense (2001), mostrou a progressão dessa espécie do estado do Paraná em
direção à fronteira com o Paraguai.
20
B. straminea é encontrada em quase todas as bacias hidrográficas do
Brasil. É a espécie predominante no nordeste do país (Paraense, 1986; Paraense &
Corrêa, 1989), sendo responsável por focos no Pará (Paraense et al., 1984) e em
Goiás (Goiânia) (Melo & Coelho, 2005). É a única transmissora da doença no Estado
do Ceará (Souza & Lima,1997). Apesar de apresentar taxas muito baixas de
infecção natural, a densidade de B. straminea nos criadouros da região Nordeste é
alta (Souza & Lima, 1997). Outro aspecto relevante é a alta especificidade dessa
espécie no que concerne à relação parasito-hospedeiro, só se infectando com as
cepas locais de S. mansoni.
B. tenagophila é encontrada, no Brasil, desde o sul da Bahia até o Rio
Grande do Sul (Paraense, 1970). Fora do país, na Argentina, Peru, Bolívia, Paraguai
e Uruguai (Paraense, 2001). No Estado de Minas Gerais foram registrados
exemplares infectados nas cidades de Jaboticatubas (Melo & Pereira, 1985), Itajubá
(Souza & Lima, 1997) e na lagoa da Pampulha, em Belo Horizonte (Milward de
Andrade, 1972). Além disso, essa espécie é responsável pela transmissão da
doença em extensas áreas do Estado de São Paulo, tais como o vale do Paraíba e
Tietê, sendo, também, encontrada naturalmente infectada em Cubatão (Ramos et
al., 1967), além de ser a única transmissora de um foco descoberto em São
Francisco do Sul, no Estado de Santa Catarina (Bernardini & Machado, 1981).
Paraense & Corrêa (1987) ressaltaram a forma lenta, mas constante, pela
qual a esquistossomose vem se expandindo no Brasil em todas as direções,
principalmente nas regiões sudeste e sul e chamam atenção para o papel importante
da B. tenagophila como vetora nestas regiões.
21
B. tenagophila apresenta grau variado de resistência à infecção por S.
mansoni, sendo encontradas tanto linhagens altamente suscetíveis como totalmente
resistentes (Coelho, 1995). Essa espécie apresenta também o notável fenômeno da
adaptabilidade entre linhagens geográficas do caramujo e linhagens geográficas do
S. mansoni (Corrêa et al., 1979). Segundo Abdel-Malek (1950), em uma área
endêmica podemos ter caramujos fisiologicamente distintos e estes caramujos
podem não vir a transmitir a esquistossomose, mostrando a importância do processo
de adaptabilidade do S. mansoni à linhagem local e vice-versa. Verifica-se, ainda,
que, quando comparada à B. glabrata as taxas de infecção natural e sob condições
laboratoriais de B. tenagophila são menores (Newton, 1953; Richards & Merrit,
1972).
Estudos realizados com B. tenagophila e B. glabrata têm demonstrado
que nos exemplares suscetíveis à infecção os esporocistos desenvolvem-se com
pouca reação tecidual do molusco. Por outro lado, em caramujos resistentes, a
destruição dos parasitos está freqüentemente associada ao encapsulamento do
organismo invasor por hemócitos (amebócitos) (Maldonado & Acosta-Matienzo,
1947; Files & Cram, 1949; Newton, 1952 e 1954; Brooks, 1953; Coelho, 1954, 1957,
1962; Tripp, 1961, 1970, 1974; Cheng & Snyder, 1962; Pan, 1963, 1965).
Sabe-se hoje que a suscetibilidade dos moluscos ao S. mansoni pode
variar entre áreas geográficas, entre populações de uma mesma área, entre
indivíduos de uma mesma população em moluscos de diferentes idades e frente a
diferentes cepas geográficas do parasito (Richards, 1976, 1977, Richards &
Shade,1987).
A primeira evidência de que a suscetibilidade dos moluscos ao S.
mansoni é condicionada por fatores genéticos, bem como por características etárias,
22
foi descrita por Newton (1953), trabalhando com B. glabrata. Richards (1973)
confirmou os resultados de Newton (1953) ao demonstrar a possibilidade de
caramujos jovens suscetíveis tornarem-se resistentes quando adultos. Richards &
Merritt (1972), usando a mesma linhagem de caramujos utilizada por Newton (1953),
concluíram que a suscetibilidade do molusco jovem é controlada por um conjunto de
quatro ou mais caracteres, assinalando a presença de genes que condicionam a
resistência também nos exemplares suscetíveis. Bastos et al. (1984), através da
análise da relação parasito-hospedeiro, admitiram que o padrão genético do
molusco é o fator de maior influência na suscetibilidade desses animais.
Recentemente, Rosa et al. (2005) apresentaram fortes evidencias que o caráter de
resistência em B. tenagophila é determinado por dois genes, um deles dominante.
A necessidade de adaptação entre o molusco e o parasito foi
demonstrada por Paraense & Corrêa (1963), constatando-se que as linhagens de S.
mansoni isoladas de B. glabrata de Minas Gerais e aquelas isoladas de B.
tenagophila de São Paulo apresentaram resistência cruzada. Com base neste fato,
os autores demonstraram a existência de duas linhagens de S. mansoni: uma de
Belo Horizonte (LE), adaptada à B. glabrata, e outra de São José dos Campos (SJ),
adaptada à B. tenagophila. Os autores levantaram a hipótese de que para cada
espécie de hospedeiro, o índice de infecção seria condicionado pela variação na
freqüência de genes responsáveis pela suscetibilidade e resistência, presentes em
uma determinada população de molusco.
Os mecanismos ligados à resistência de Biomphalaria contra S. mansoni
são complexos e necessitam de estudos mais aprofundados. Entretanto, alguns
aspectos desses mecanismos já foram elucidados. Assim, Fryer & Bayne (1990),
mostraram que substâncias provenientes do miracídio alteram a ação fagocitária dos
23
hemócitos de caramujos suscetíveis e resistentes. Esses autores mostraram, ainda,
que hemócitos de B. glabrata, após três horas de infecção com miracídios de S.
mansoni apresentavam capacidade fagocitária alterada. Os hemócitos de linhagens
de B. glabrata resistentes ao S. mansoni estavam com a capacidade fagocitária
exacerbada enquanto que os hemócitos de linhagens suscetíveis estavam com a
capacidade fagocitária diminuída.
O sistema de defesa dos moluscos é diferente do sistema imune de
mamíferos, pois faltam linfócitos, sistema de complemento, respostas a antígenos
específicos e imunoglobulinas (Bayne,1983; Klein, 1989). Apesar dessas limitações,
o sistema de defesa é capaz de discriminar, pelo menos grosseiramente, o próprio e
o não próprio. O sistema é composto por um mecanismo celular, constituído pelos
hemócitos e por fatores solúveis da hemolinfa, que agem juntos na destruição do
não próprio.
Apesar de vários estudos caracterizarem a função e estrutura das células
em gastrópodes, ainda não existe uma concordância entre o número e os tipos
celulares nestes animais.
Existem quatro tipos diferentes de células de defesa no caramujo (Van
Der Knaap & Loker ,1990), sendo três tipos representados por células fixas ou não
circulantes e o outro representado por células circulantes. As células fixas e não
circulantes são representadas por: células endoteliais bloqueadoras de antígenos,
células reticulares e as células do poro. As células bloqueadoras de antígenos
impedem a disseminação de microorganismos. As células reticulares estão presas
aos tecidos por fibrilas extra celulares, além de possuírem uma alta capacidade de
endocitar partículas de material não próprio. As células do poro estão ligadas às
células reticulares e caracterizam-se por apresentar um papel seletivo na endocitose
24
de proteínas. Entretanto, ainda não está claro se algumas dessas células fixas agem
na defesa de uma infecção por trematoda (Van Der Knaap & Loker, 1990).
As células circulantes, denominadas anteriormente de amebócitos, e hoje
de hemócitos são encontradas na hemolinfa e são as principais células efetoras do
sistema de defesa do caramujo, fagocitando, encapsulando e destruindo agentes
infecciosos (Jeong et al., 1983). Como o sistema circulatório é aberto, os hemócitos
podem se mover livremente para dentro e fora dos tecidos (Van Der Knaap & Loker,
1990).
Sminia et al. (1983) consideraram que os gastrópodes possuem um único
tipo de hemócito que expressam variações morfológicas, correspondentes a
diferentes estágios de maturidade destas células. Assim, as células jovens seriam
arredondadas e apresentariam uma grande atividade mitótica. Já as células maduras
teriam prolongamentos citoplasmáticos e pouca atividade mitótica e seriam mais
ativas na fagocitose. Joky et al. (1983) fizeram distinção de quatro tipos de
hemócitos através de diferenças morfológicas e com a capacidade ou não de
expressar receptores de lectinas na superfície celular.
Ottaviani (1992) sugeriu que a população de hemócitos circulantes de
gastrópodes seja constituída por dois tipos: os hemócitos estrelados, que emitem
pseudópodes, apresentam atividade fagocitária e aderem ao vidro e os hemócitos
arredondados, que não apresentam atividade fagocitária e não aderem ao vidro. Os
autores concluíram que os hemócitos arredondados apresentam características
semelhantes às de linfócitos T de vertebrados, enquanto que os estrelados
assemelham-se aos macrófagos.
Outros autores (Harris, 1975; Yoshino, 1976; Cheng & Guida, 1980;
LoVerde et al., 1982; Barraco et al., 1993) também fizeram distinção de duas
25
subpopulações de hemócitos na hemolinfa de Biomphalaria: os granulócitos e os
hialinócitos. Os hialinócitos medem de 5 a 8 micrômetros de diâmetro, apresentam
contorno circular quando em contato com vidro liso, pouca tendência a formar
pseudópodes e pouca estrutura lisossomal e, além disso, representam menos que
10% dos hemócitos em circulação (Barraco et al., 1993). Segundo Jeong et al.
(1983), eles não são evidentes no órgão hematopoiético ou órgão produtor de
amebócitos, em inglês “amebocyte producing organ (APO)". Os granulócitos medem
de 7 a 11 micrômetros de diâmetro, formam pseudópodes, são ativos em fagocitose
e representam mais de 90% das células circulantes (Barraco et al., 1993). Bezerra et
al. (1997) mostraram que essas últimas são células fagocitárias e que se coram de
vermelho neutro (Sigma).
Matricon-Gondran & Letocart (1999), considerando o tamanho das células
e características ultra-estruturais reconheceram três tipos de células: hemócitos de
grande, de médio e de pequeno portes.
Os hemócitos são produzidos pelo órgão hematopoiético (APO). O APO é
formado por uma pequena quantidade de ameboblastos primários em repouso nas
células epiteliais próximas do pericárdio. Ele se localiza em um retículo frouxo
formado por extensões de músculos lisos e por algumas células fibroblásticas
(Jeong et al., 1983). Após contato com os miracídios surgem mudanças morfológicas
significativas no APO, grande quantidade de ameboblastos primários e secundários
aparecem e muitas dessas células sofrem mitoses. Totalmente ativado esse órgão
consiste de massas de células livres organizadas em zonas de progressiva
maturação. As células da hemolinfa de caramujos que tiveram contato com os
miracídios são mais largas que as que não tiveram esse contato (Jeong et al., 1983).
26
O uso de transplante do APO e de outros órgãos já foi realizado por
Sullivan (1990), Sullivan & Spence (1994, 1999), Sullivan et al. (1992, 1995, 1998)
Barbosa (2001) e Barbosa et al. (2006). Sullivan & Spence (1994) e Sullivan et al.
(1995) transferiram o APO de B. glabrata parcialmente resistente ao S. mansoni para
caramujos suscetíveis, resultando na aquisição de uma certa resistência nos
caramujos que receberam o transplante. Com uma abordagem inovadora, os
trabalhos de Barbosa (2001) e Barbosa et al. (2006) consistiram no transplante do
órgão hematopoiético de uma linhagem de B. tenagophila totalmente resistente
(Taim) ao S. mansoni para uma altamente suscetível ao parasito (Cabo Frio) com a
vantagem adicional de se comprovar o sucesso do transplante através da presença
nos hemócitos da linhagem receptora do marcador molecular típico da linhagem
resistente doadora do órgão. Estudos moleculares têm sido empregados com
sucesso na identificação específica de moluscos do gênero Biomphalaria (Caldeira
et al., 1998, Spatz et al., 1999; Vidigal et al., 1998, 2000). Esses autores utilizaram a
técnica de RFLP-PCR (Reação em cadeia da polimerase e análise de polimorfismos
de restrição) usando as regiões ITS (ITS1, ITS2 e 5.8S) do gene do RNA ribossomal.
Foi observado um perfil específico para cada uma das espécies estudadas, sendo
que os melhores perfis (com número de bandas suficientes e melhor visualizadas)
foram obtidos com a enzima de restrição DdeI. A espécie B. tenagophila apresentou
dois fragmentos de 800 e 470 pares de base (pb), respectivamente. Já as
populações dessa espécie, oriundas do Taim/RS, mostraram um fragmento adicional
de 350 pb (em alguns casos com ausência da banda de 800pb). Rosa et al. (2004)
mostraram que a banda de 350 pb, típica da linhagem Taim, é de gene dominante
do RNA ribossomol e segue a genética mendeliana clássica.
27
Os resultados obtidos após exposição aos miracídios de S. mansoni
mostraram uma taxa de infecção de 25% de eliminação de cercárias nos exemplares
da linhagem Cabo Frio que receberam o transplante e 53% dos controles. O fato
mais interessante foi a demonstração do marcador típico da linhagem Taim nos
hemócitos dos caramujos transplantados que não eliminaram cercárias e ausência
deste marcador nos hemócitos dos caramujos deste grupo transplantado que não
eliminaram cercárias (insucesso no transplante). Um outro resultado adicional
interessante verificado no experimento foi a comprovação de marcadores
moleculares do S. mansoni nos exemplares transplantados (Cabo Frio) que não
apresentaram a marca molecular do doador (Taim) nos seus hemócitos.
A resistência é específica para o APO, não ocorrendo com transplante de
tecidos não hematopoiéticos, como manto, coração, glândulas de albumina, cérebro,
glândula digestiva ou ovotestis (Sullivan et al., 1995, Sullivan & Spencer, 1999) e
essa resistência não é aumentada pelo transplante de dois APO's ou pelo
transplante de APO de doadores de maior porte (Sullivan & Spencer, 1999; Vasquez
& Sullivan, 2001). Barbosa et al. (2006) também mostraram que a presença de um
APO adicional não aumentou o número de hemócitos circulantes. O mecanismo de
transferência de resistência hipoteticamente envolve o APO produzindo hemócitos
citotóxicos resultando em um hemócito quimera (Granath & Yoshino, 1984) ou
fatores de resistência solúveis no plasma ou ambos (Sullivan & Spence, 1994).
Vasquez & Sullivan (2001) mostraram a ocorrência de fatores de resistência no
plasma de caramujos que receberam o APO e a falta destes fatores no plasma de
caramujos que sofreram transplante de manto. Esses autores levantaram a hipótese
do fator de resistência ser formado pelo receptor em resposta ao implante ou pelo
próprio implante. A ausência de fator de resistência no plasma de caramujos que
28
receberam o manto sugere que a resistência é secretada pelo implante de APO ou
provavelmente pelos hemócitos originados do APO.
A importância da fração solúvel da hemolinfa de Biomphalaria foi
confirmada in vivo e in vitro através de estudos de transferência desta fração.
Granath & Yoshino (1984) relataram que a transferência de plasma obtido de
linhagens resistentes de B. glabrata para linhagens suscetíveis resultou em uma
redução da taxa de infecção pelo S. mansoni nos receptores. Resultados
semelhantes foram obtidos por Coelho & Bezerra (2006) e Pereira et al. (submetido)
utilizando transferência in vivo de fatores solúveis da hemolinfa de B. tenagophila da
linhagem Taim para a linhagem Cabo Frio. Malagueño et al. (1998) sugeriram que o
plasma de B. straminea diminui a capacidade fagocítica de caramujos B.glabrata
suscetíveis em contato com leveduras de Saccharomyces sp. Bayne et al. (1980)
demonstraram que a transferência de plasma in vitro de B. glabrata resistente para
B. glabrata suscetível aumenta a capacidade fagocítica dos hemócitos,
demonstrando a interação entre fatores plasmáticos e hemócitos durante o
encapsulamento e o processo de fagocitose, que ocorre poucas horas após a
penetração do miracídio.
A resposta humoral nos moluscos ocorre de maneira diferente dos
vertebrados. Em invertebrados, que não produzem imunoglobulinas, o
reconhecimento é mediado por lectinas, que são proteínas com habilidade de se
ligar a carboidratos de maneira específica e reversível. Elas são secretadas pelos
hemócitos e podem estar solúveis na hemolinfa, opsonizando o objeto estranho, ou
na superfície de hemócitos circulantes (Richards & Renwrantz, 1991). A presença
dessas lectinas no plasma dos caramujos, que têm receptores para carboidratos, os
quais ocorrem também na superfície de esporocistos, sugere a base da interação
29
hemócito-esporocisto de S. mansoni (Fryer & Bayne, 1989; Richards & Renwrantz,
1991). Vários autores têm demonstrado a presença de carboidratos, especialmente
glicoproteínas e glicolipídeos, como os principais componentes do tegumento de
miracídios e esporocistos de S. mansoni (Zelck & Becker, 1990; Uchikawa & Loker,
1991). Johnston & Yoshino (1996) demonstraram que uma grande variedade de
glicoproteínas do tegumento de S. mansoni pode ser reconhecida por lectinas
presentes na fração solúvel da hemolinfa de B. glabrata. Alguns autores sugerem
que a resistência ou suscetibilidade de espécies ou linhagens de Biomphalaria a
infecção por S. mansoni pode estar relacionada à presença ou ausência de
determinadas lectinas na hemolinfa ou mesmo por diferenças quantitativas em
algumas lectinas. Moléculas com atividade imunológica, funcional e/ou biológica
semelhante à interleucina1 (IL-1) têm sido detectadas ou isoladas em caramujos
(Granath et al., 1994) e podem estar associadas à ativação dos hemócitos (Hughes
et al., 1991; Raftos et al., 1992); estimulação da proliferação celular (Raftos et al.,
1991 e 1992); aumento da fagocitose (Beck et al., 1993; Burke & Watkins, 1991) e
produção de superóxidos (Granath et al., 1994).
Caramujos de linhagens suscetíveis de B. glabrata têm significativamente
menos proteínas semelhantes a IL1 no seu plasma do que os de linhagens
resistentes. Além disso, caramujos resistentes mantêm quantidades
significativamente mais altas dessa proteína após exposição ao S.mansoni quando
comparados às linhagens suscetíveis (Granath et al., 1994). Foi verificado que a
inoculação da proteína recombinante humana de interleucin-1 (rhIL-1β) em
caramujos B. glabrata suscetíveis resulta em uma rápida ativação e produção de
superóxidos equivalentes aos níveis encontrados em caramujos resistentes; e
conseqüentemente em uma redução altamente significativa do número de cercarias
30
produzidas por estes caramujos (Connors et. al.;1995). Connors et al. (1998)
demonstraram que a diminuição na produção de cercárias, observada em B.
glabrata suscetíveis inoculados com rhIL-1β, é conseqüência da elevada mortalidade
observada de esporocistos primários. Embora a hemolinfa livre de células recolhida
de caramujos tratados com rhIL-1β tenha sido capaz de matar esporocistos de
S.mansoni, testes in vitro mostraram que rhIL-1β, per si, não apresenta efeito tóxico,
sugerindo que no processo de destruição do parasito esta proteína possa estar
atuando na estimulação da produção de fatores citotóxicos solúveis por B. glabrata.
31
2. Justificativa
A cultura primária de tecido hematopoiético de Biomphalaria é original e
através desta será possível obter as células hematopoiéticas em grandes
quantidades e em meio definido. Esta nova metodologia permitirá estudar a
morfogênese destas células, sua ultra-estrutura, composição e comportamento
frente a vários estímulos, facilitando estudos de interação parasito-hospedeiro in vivo
e in vitro.
Somando ao que foi dito anteriormente temos em nossos laboratórios
caramujos totalmente resistentes ao S.mansoni (B. tenagophila do Taim), que,
seguramente apresentam hemócitos com comportamento peculiares frente a
esporocistos em comparação com os hemócitos de linhagens suscetíveis (de outras
espécies, como da própria). São poucos os trabalhos envolvendo a interação
S.mansoni / B. tenagophila e esta abordagem seguramente enriquecerá o assunto
sobre esta espécie, importante na transmissão da doença em extensas áreas do
sudeste e sul do País.
32
3. Objetivos
3.1. Objetivo geral
Obter cultura primária de células do órgão hematopóietico (APO) de
moluscos B. glabrata e B. tenagophila (linhagens Cabo Frio e Taim) e caracterizá-las
funcional e morfologicamente.
3.2. Objetivos específicos
• Desenvolver e padronizar o processo de cultivo in vitro do órgão
hematopóietico (APO) de moluscos B. glabrata;
• aplicar a metodologia desenvolvida para cultivo do órgão
hematopoiético a moluscos B. tenagophila (linhagem suscetível - Cabo Frio e
resistente - Taim - ao S. mansoni);
• desenvolver e padronizar o processo de cultivo in vitro de um órgão
controle (ovotesti) de moluscos do gênero Biomphalaria;
• caracterizar morfologicamente as células no órgão hematopoiético de
moluscos do gênero Biomphalaria em crescimento nas culturas através de
microscopia confocal utilizando lectinas conjugadas com FITC;
• verificar o comportamento celular quando em contato com esporocistos
e miracídios;
• verificar o comportamento celular quando em contato com antígenos
solúveis de ovos de S. mansoni (SEA), Zimosan, LPS
• comparar as células obtidas no cultivo primário com as células da
hemolinfa.
• verificar a presença de lisossomos nas células órgão hematopoiético,
através da marcação com Lyso Tracker Red.
• verificar possíveis diferenças morfológicas nas células do órgão
hematopoiético de moluscos do gênero Biomphalaria infectados com S. mansoni
quando comparadas com as células do órgão hematopoiético de moluscos não
infectados.
33
4. Material e Métodos
4.1. Caramujos Utilizados
A linhagem de B. glabrata, usada neste trabalho, foi originária do bairro
Barreiro de Cima, em Belo Horizonte, mantida há mais de 30 anos no Centro de
Pesquisas René Rachou, Fiocruz. Foram utilizadas duas linhagens de B.
tenagophila: uma da região de Cabo Frio, Rio de Janeiro, altamente suscetível à
cepa SJ de S. mansoni (Santos et al., 1979) e a outra da região do Taim, Rio Grande
do Sul, totalmente resistente ao S. mansoni (Corrêa et al., 1979; Santos et al., 1979;
Bezerra et al.,1997, Coelho et al., 2004). As linhagens de B. tenagophila foram
isoladas pelo Grupo Interdepartamental de Estudos sobre Esquistossomose (GIDE-
UFMG) e os espécimes usados são de colônias mantidas no Centro de Pesquisas
René Rachou, Fiocruz por mais de três anos. Os caramujos são mantidos à
temperatura ambiente, em aquários com água corrente, terra adicionada de
carbonato de cálcio como substrato, iluminação artificial por um período médio de 10
horas diárias e alimentados com alface e ração para camundongo.
Antes da dissecação, esses animais eram divididos em grupos (de acordo
com o diâmetro da concha) e mantidos em beckers com 250 ml de água bidestilada.
Em função da alta freqüência de larvas de helmintos foram adicionados 2,5 mg/ml de
mebendazol por cerca de 48 horas, até que os caramujos apresentassem fezes
esbranquiçadas. Após esse tratamento, as conchas eram limpas com uma gaze
umedecida com álcool 70% e os caramujos eram transferidos para a capela de fluxo
laminar, onde a concha era limpa novamente
Foram utilizados 322 caramujos B. glabrata, 168 B. tenagophila do Taim e
141 B. tenagophila Cabo Frio.
34
4.2. Parasito
Foi utilizada a cepa LE de S. mansoni que vem sendo mantida no Centro
de Pesquisas René Rachou, Fiocruz por mais de 35 anos.
4.3. Infecção dos caramujos
Após 50 dias de infecção, hamsters infectados com a cepa LE de S.
mansoni foram sacrificados por fratura cervical para obtenção de miracídios
(Pellegrino & Katz, 1968). O fígado dos animais foi retirado e triturado em
liquidificador com salina 0,85%, por dois minutos. A mistura foi colocada em um
cálice de sedimentação, passando primeiramente por gaze, a fim de reter as
partículas maiores; em seguida completou-se o volume para 1L com salina 0,85%. O
cálice com a mistura foi mantido no escuro, por 30 minutos, para sedimentação.
Após esse período, o sobrenadante foi descartado, restando
aproximadamente 200ml de líquido. Completou-se o volume para 1L novamente,
agora com água sem cloro. O cálice continuou no escuro, por mais 20 min. Este
procedimento foi realizado mais uma vez até a obtenção de um líquido mais limpo e
com miracídios quase prontos para eclosão.
Após o descarte do sobrenadante, na última lavagem, o líquido e o
sedimento, foram colocados em um balão volumétrico e expostos à luz artificial
(apenas a parte superior exposta) para que ocorresse a eclosão dos miracídios.
Após 15 min já era possível ver os miracídios nadando. Amostras do material foram
recolhidas e dez miracídios contados com auxilio de microscópio estereoscópico.
Os caramujos foram colocados em placas de cultura de seis poços e em
seguida colocados em contato com os miracídios para realização da infecção
individual. A placa foi mantida sob luz artificial por aproximadamente 3 horas. Após
esse período os caramujos foram colocados em beckers com água e após 24 horas
foi feita a cultura dos órgãos hematopoiéticos (conforme técnica descrita a seguir).
35
4.4. Cultivos primários
A concha dos moluscos foi aberta com ajuda de uma tesoura. As partes
moles retiradas com auxílio de pinça cirúrgica e colocadas em placas de Petri. O
órgão hematopoiético (APO) foi removido como descrito por Sullivan (1990) e
colocado em 0,5 ml de PBS para manutenção da umidade. Em seguida, o APO foi
cortado em pequenos fragmentos, que foram semeados em placas de 12 e 24 poços
contendo 500µl e 250µl de meio de cultura, respectivamente. As placas foram
incubadas a 15 °C ou 20°C em estufa B.O.D. Após adesão, por tensão superficial,
dos fragmentos (24 ou 48h depois) os volumes de meio de cultura por poços foram
duplicados pela adição de meio novo. Foi realizado uma cultura controle utilizando o
ovotestis dos caramujos. O ovotestis foi retirado e a cultura foi feita nas mesmas
condições descritas para o APO.
Os meios de cultivo testados foram Ham’s F-10, Ham’s F-12, CMRL1415
e RPMI-1640, contendo 10% de soro fetal bovino, 4 mg/ml de fungizon e 10 mg/ml
de gentamicina. Foram testados colágenos de cascavel (Crotalus durissus terrificus)
e de cauda de rato (Rattus norvegicus) (Duarte et al., 1999), poly-L-lysine e ágar
como substratos para auxiliar a adesão celular. A poly-L-lysine foi preparada de
acordo com as instruções do fabricante e o ágar foi usado a 3% em solução nutritiva
de vitelo de desova dos caramujos (VLS). Nesse caso, os fragmentos do APO foram
explantados, em placas de 12 poços, sobre uma camada de ágar de 2-3 mm de
espessura e adicionados 250µl de meio de cultura por placa. Foram também
testados promotores de crescimento ou diferenciação celular como insulina (8,3
µg/ml), selenito de sódio (30mg/ml), putrescina (0,3µg/ml), transferrina (5µg/ml) e
fator de crescimento epidérmico (EGF) (0,1 mg/ml). As células da cultura primária
tiveram sua viabilidade celular determinada após uma semana de cultivo, após
tratamento com azul de tripan, que penetra apenas em células mortas. A contagem
de células viáveis e não viáveis foi feita em câmera de Neubauer.
4.5. Materiais
Mebendazol (100mg/comprimido) foi obtido da fábrica de medicamentos
da Fundação Ezequiel Dias (FUNED). O soro fetal bovino foi obtido de um estoque
do Laboratório de Cultivo Celular da FUNED, cuja produção (própria) foi
36
descontinuada ou alternativamente com o mesmo produto adquirido da Gibco
Limited (Paisley, Scotland). O meio de cultura CMRL 1415 foi preparado a partir de
componentes individuais (Morton, 1970). Os meios Ham’s F-10 (N6635), Ham’s F-12
(N6760) e RPMI-1640 (R6504) foram preparados de acordo com as instruções do
fabricante (Sigma Co.). As placas foram adquiridas da Costar Co. e poly-L-lysine
(P9155), selenito de sódio (S9133), putrescina (P5780), progesterona (P6149) e
fator de crescimento epidérmico (EGF E1257), lectinas, penicilina/estreptomicina,
RPMI 1640, gentamicina (Garamox, 80mg/Hipolabor), garrafas de 25cm
2
, tubos
plásticos de 50 ml (Falcon) foram adquiridos da Sigma Co. Todas as soluções,
plásticos e vidrarias utilizados eram estéreis.
4.6. Utilização do mebendazol
Os caramujos foram divididos em grupos de acordo com o tamanho da
concha. Foram colocados 5 exemplares de caramujos em beckers contendo 80ml de
água e adicionamos 25mg, 50mg, 75mg e 1 comprimido inteiro para determinar a
dose a ser utilizada.
4.7. Obtenção de células da hemolinfa de Biomphalaria
A hemolinfa de 10 caramujos (200µl/ indivíduo) foi retirada da região
cardíaca (Bezerra et al., 1997; Bezerra, 1998) com auxilio de seringa com agulha de
insulina. Após digestão enzimática com o mesmo volume de solução 0,025%
tripsina-0,02% EDTA por 10 min à temperatura ambiente, a solução foi centrifugada
a 3000 rpm por 2 min. O sedimento celular foi ressuspendido em 200µl de PBS.
4.8. Coloração por azul de metileno
As células da cultura primária e da hemolinfa foram coradas com azul de
metileno 1% em água destilada, usando partes iguais da suspensão celular e do
corante em lâmina. Após aquecimento suave em chama do bico de Bunsen, as
lâminas foram cobertas com lamínulas e examinadas ao microscópio.
37
4.9. Análise celular do APO por microscopia confocal
O APO foi lavado 3 vezes em PBS (solução salina) 1X e em seguida
fixado em paraformaldeído 4% por 24 horas. Após esse período foi lavado 5 vezes
em PBS 1X e em PBS/Triton 0,2% (PBT) por 15 minutos. Em seguida foi incubado
por 2 horas com a lectina (1:100) desejada e com Lyso Tracker Red DND. Após
esse período foi lavado 3 vezes em PBT por 5 minutos. Incubado em Topro-3
(1:1000), overnight em temperatura ambiente. No dia seguinte foi lavado 3 vezes em
PBT por 5 minutos e desidratado em série crescente de metanol (25%, 50%, 75% e
100% de MeOH) por 10 minutos cada. Em seguida o órgão foi transferido para 1:2
BABB (benzil álcool/ benzilbenzoato) overnight, para diafanização.
Através de lectinas conjugadas com FITC
As seguintes lectinas foram usadas: Con A, PNA, WGA, LPL.
Essas lectinas possuem as seguintes características:
• Con A: conhecida como Concanavalin A, é extraída de Canavalia
ensiformis (“Jack Bean”) possui afinidade por resíduos terminais de α-
D-mannosyl (α-man) e α-D-glucosyl (,α-glc);
• PNA: aglutinina de Arachis hypogaea (“Peanut agglutinin”) que
apresenta afinidade por resíduos terminais de β-galactosyl (β-gal) e
(1→3) N-acetyl-galactosamine ((1→3)galNAc);
• WGA: aglutinina de Triticum vulgaris (“Wheat germ”); apresenta
afinidade por N-acetyl-β-D-glucosaminyl e por oligômeros de N-acetyl-
β-D-glucosamine ((glcNAc)2);
• LPL: aglutinina de Limulus polyphemus (“Horseshoe crab”) com
afinidade por D-hexosaminas N-acetiladas como: N-acetyl-D-
galactosamine(galNAc), N-acetyl-D-glucosamine(glcNAc) e ácido N-
acetyl-neuramínico (NeuNAc).
Utilizando Lyso Tracker Red DND
Lyso Tracker Red DND é um marcador específico para lisossomos de
células de mamíferos, Dietl et al. (1996).
38
4.10. Obtenção de Antígenos Solúveis de Ovos (SEA)
O SEA foi obtido de acordo com a técnica modificada de Goes et al.,
(1989). Inicialmente, ovos do parasito foram obtidos a partir de fígados de
camundongos com cerca de 50 dias de infecção. Os fígados foram retirados e
colocados em tubo de centrífuga, com 1ml de salina 1,7%. O tubo de centrífuga foi
acondicionado em um béquer com gelo e levado ao triturador de tecidos (Virtis) por
40 minutos. Foi usado o microscópio óptico para verificar a existência ou não de
ovos inteiros. Em seguida o material foi centrifugado a 14000 rpm por 60 minutos e
dialisado a 4
0
C por 48 horas em salina 0,9%. Após a diálise foi feita a dosagem das
proteínas pelo método de Lowry.
O SEA foi utilizado em concentrações variadas, obtidas por diluição
seriada, conforme esquema abaixo:
Passo 1: Adição de 10µl SEA (concentração de 0,21 mg/ml) a Eppendorf
contendo 50 µl de meio CMRL 1415 (em banho de gelo).
Passo 2: transferência de 10µl meio + SEA entre os Eppendorf’s (todos
em gelo), conforme diagrama, gerando concentrações diversas.
Passo 3: aplicação de 50 µl de cada diluição na cultura de células.
4.11. Obtenção in vitro de miracídios
Dez camundongos infectados com 100 cercárias da cepa LE de S.
mansoni foram sacrificados, aos 50 dias de infecção, por deslocamento cervical.
Com auxílio de pinça e tesoura, tiveram as vísceras expostas e o fígado retirado. O
fígado foi mantido em salina 0,85% não heparinizada, contendo 10% de antibiótico
penicilina/estreptomicina (Sigma Co) por 30 minutos, à temperatura ambiente, em
capela de fluxo laminar. Após esse período, os fígados foram triturados e lavados,
: 50 µ
µµ
µl de
meio + 10 µ
µµ
µl
amostra
2,1 µg
: 50 µ
µµ
µl de
meio + 10 µ
µµ
µl
SEA
: 50 µ
µµ
µl de
meio + 10 µ
µµ
µl
amostra
: 50 µ
µµ
µl de
meio + 10 µ
µµ
µl
amostra
: 50 µ
µµ
µl de
meio + 10 µ
µµ
µl
amostra
10 µ
µµ
µl 10 µ
µµ
µl 10 µ
µµ
µl10 µ
µµ
µl
0,35 µg 0,057 µg 0,0097 µg 0,0016 µg
: 50 µ
µµ
µl de
meio + 10 µ
µµ
µl
amostra
2,1 µg2,1 µg
: 50 µ
µµ
µl de
meio + 10 µ
µµ
µl
SEA
: 50 µ
µµ
µl de
meio + 10 µ
µµ
µl
amostra
: 50 µ
µµ
µl de
meio + 10 µ
µµ
µl
amostra
: 50 µ
µµ
µl de
meio + 10 µ
µµ
µl
amostra
10 µ
µµ
µl 10 µ
µµ
µl 10 µ
µµ
µl10 µ
µµ
µl
0,35 µg0,35 µg 0,057 µg0,057 µg 0,0097 µg0,0097 µg 0,0016 µg0,0016 µg
39
seguindo-se a técnica descrita por Pelegrino & Katz (1968), foram feitas
modificações para obtenção de miracídio estéril, resumidamente: os fígados, em
salina 0,85% não heparinizada, foram triturados em um béquer usando-se um pistilo
de vidro (estéril). O líquido, contendo os fígados já triturados, foi “filtrado” com ajuda
de uma gaze estéril, colocado em um cálice estéril e o volume completado com
salina estéril 0,85%, não heparinizada, para 1litro. O líquido foi deixado no escuro, a
temperatura ambiente, por 30 minutos, para sedimentar. Após a sedimentação, o
sobrenadante foi retirado, com auxílio de bomba de vácuo e o volume novamente
completado para 1L, agora com água sem cloro estéril. O líquido foi deixado sob as
mesmas condições da lavagem anterior, no entanto, por 20 minutos. Este último
procedimento foi realizado duas vezes. Após as três lavagens, o sedimento restante
foi colocado em balão volumétrico e coberto com papel alumínio, de maneira que
apenas uma pequena parte da abertura do balão permanecesse descoberta. O
balão foi exposto à luz artificial, favorecendo, assim, a eclosão e a visualização dos
miracídios, devido ao fototropismo positivo.
Ao final desse procedimento, os miracídios foram utilizados da seguinte
maneira: contou-se 10µl 3 vezes para obter-se uma média de miracídios (média de 6
miracídios); em seguida colocou-se na placa de 24 poços, de modo que a 1ª coluna
recebeu 10µl, a 2ª 20µl, a 3ª 30µl, a 4ª 40µl, a 5ª 50µl e a 6ª colunas foram
controles. Cada volume foi feito, pelo menos, em duplicata. A análise foi realizada
após o contato e após 24 e 48 horas.
4.12. Obtenção e transformação in vitro de miracídios em
esporocistos primários
Dez camundongos infectados com 100 cercárias da cepa LE de S.
mansoni foram sacrificados, aos 50 dias de infecção, por deslocamento cervical.
Com auxílio de pinça e tesoura, tiveram as vísceras expostas e o fígado retirado. O
fígado foi mantido em salina 0,85% não heparinizada, contendo 10% de antibiótico
penicilina/estreptomicina (Sigma Co) por 30 minutos, à temperatura ambiente, em
capela de fluxo laminar. Após esse período, os fígados foram triturados e lavados,
seguindo-se a técnica descrita por Pelegrino & Katz (1968), foram feitas
modificações para obtenção de esporocisto estéril, resumidamente: os fígados, em
salina 0,85% não heparinizada, foram triturados em um béquer usando-se um pistilo
40
de vidro (estéril). O líquido, contendo os fígados já triturados, foi “filtrado” com ajuda
de uma gaze estéril, colocado em um cálice estéril e o volume completado com
salina estéril 0,85%, não heparinizada, para 1litro. O líquido foi deixado no escuro, a
temperatura ambiente, por 30 minutos, para sedimentar. Após a sedimentação, o
sobrenadante foi retirado, com auxílio de bomba de vácuo e o volume novamente
completado para 1L, agora com água sem cloro estéril. O líquido foi deixado sob as
mesmas condições da lavagem anterior, no entanto, por 20 minutos. Este último
procedimento foi realizado duas vezes. Após as três lavagens, o sedimento restante
foi colocado em balão volumétrico e coberto com papel alumínio, de maneira que
apenas uma pequena parte da abertura do balão permanecesse descoberta. O
balão foi exposto à luz artificial, favorecendo, assim, a eclosão e a visualização dos
miracídios, devido ao fototropismo positivo.
Os miracídios foram coletados em tubos Falcon de 50ml
(aproximadamente 8 tubos) e mantidos no gelo por aproximadamente 30 minutos.
Após esse tempo, o sobrenadante foi retirado e mantido 5ml do líquido em cada
tubo. Os líquidos contendo os miracídios foram então transferidos para um único
tubo e mantidos novamente por 30 minutos no gelo. Parte do sobrenadante foi
retirada, restando, mais uma vez, 5ml de líquido contendo os miracídios.
O cultivo/transformação dos miracídios foi realizado em meio de cultura
RPMI – 1640 pH 7,4 (Sigma Co) suplementado com 5% (v/v) de soro bovino fetal
inativado (SBF) e 20µg/ml de antibiótico gentamicina (Garamox). Em garrafas de
25cm
2
próprias para cultura de células, foi adicionado 1ml do líquido contendo os
miracídios para 15ml do meio de cultura já suplementado. As garrafas foram
mantidas fechadas, em estufa incubadora B.O.D., a 26°C, por 24 horas. Passado
esse período, as garrafas foram retiradas da B.O.D., observadas em microscópio
invertido (Zeiss), para verificar a liberação da placa ciliar miracidiana, o que
caracteriza a transformação.
O conteúdo das garrafas foi transferido para dois tubos plásticos de 50ml
e estes, mantidos à temperatura ambiente por 30 minutos. Após esse período,
retirou-se o sobrenadante, mantendo-se, aproximadamente, 5ml em cada tubo. Todo
o líquido foi transferido para um único tubo e o volume completado para 50ml, com
meio de cultura RPMI – 1640 (Sigma Co) não suplementado, em temperatura
ambiente. O tubo foi mantido por mais 30 minutos sob as mesmas condições
anteriores. Após os 30 minutos, o sobrenadante foi retirado, permanecendo apenas
41
5ml do líquido contendo os esporocistos. Ao final desse procedimento, os
esporocistos foram utilizados da seguinte maneira: contou-se 10µl 3 vezes para
obter-se uma média de esporocistos (média de 6 esporocistos); em seguida colocou-
se na placa de 24 poços, de modo que a 1ª coluna recebeu 10µl, a 2ª 20µl, a 3ª
30µl, a 4ª 40µl, a 5ª 50µl e a 6ª colunas foram controles. Cada volume foi feito,
pelo menos, em duplicata. A análise foi realizada após o contato e após 24 e 48
horas.
4.13. Zimosan e LPS
LPS foi utilizado 1mg/ml e o Zimosan foi doado sem dados da
concentração.
42
5. Resultados
5.1. Cultivo celular
Para desenvolver e padronizar o processo de cultivo in vitro do APO, foi
usado inicialmente apenas caramujos B.glabrata pelo fato desses serem mais
abundantes no Centro de Pesquisas René Rachou. Após padronização começamos
a utilizar os caramujos B. tenagophila do Taim e de Cabo Frio.
Inicialmente foram feitas culturas com caramujos cujo diâmetro da concha
variava entre 1mm e 40 mm (tabela 1). Cultivos foram obtidos somente com
diâmetro de concha entre 12mm e 18mm, uma vez que os menores eram difíceis de
serem dissecados e os maiores apresentavam uma grande contaminação por
endoparasitas
Tabela 1- Cultivos primários do APO de caramujos B. glabrata, agrupados
pelo diâmetro das conchas
Dos meios testados, o mais eficiente para a manutenção das células em
cultura foi o CMRL1415 suplementado com insulina, transferrina, selenito de sódio,
putrescina, EGF e soro fetal bovino. Sob essa condição, a viabilidade celular média
foi de 75%, após uma semana em cultura. Na ausência de EGF e de soro fetal
bovino não houve dispersão celular. A partir da segunda semana, observamos o
aparecimento gradual de sinais de morte celular, como a presença de granulações
no citoplasma e inchaço, seguidos por lise. A sobrevida das células foi de duas
semanas. Os meios RPMI-1640 e Ham’s F12, apresentaram pouca dispersão celular
e nos outros nenhuma dispersão foi observada. Não foram observadas diferenças
-3 0 - 4 09
-2 3 - 2 98
-1 9 - 2 27
+1 7 - 1 86
+1 4 - 1 65
+1 2 - 1 34
-1 0 - 1 13
-8 - 92
-1 - 71
C u lt i v o P r i m á r io d o A P OD i â m e t r o d a c o n c h a ( m m )G r u p o s
-3 0 - 4 09
-2 3 - 2 98
-1 9 - 2 27
+1 7 - 1 86
+1 4 - 1 65
+1 2 - 1 34
-1 0 - 1 13
-8 - 92
-1 - 71
C u lt i v o P r i m á r io d o A P OD i â m e t r o d a c o n c h a ( m m )G r u p o s
43
no padrão de crescimento na presença ou ausência dos substratos de adesão
testados.
Inicialmente não foi possível manter, nem por 24 horas, as culturas
primárias devido a grande contaminação por helmintos e protozoários. Os caramujos
foram limpos com detergente, hipoclorito de sódio, álcool absoluto e a combinação
entre eles, sem sucesso. Após 3 meses de tentativas, os caramujos foram tratados
com anti-helmíntico. Após o tratamento com mebendazol foi observado uma redução
de 90% na contaminação das culturas celulares. A partir desse momento as culturas
foram mantidas por mais tempo e como elas não estavam contaminadas, foi
possível trabalhar com as células, e começar com a outra linhagem de caramujo.
A temperatura ideal para o crescimento celular foi de 15°C, a qual
favoreceu a dispersão celular dos explantes. Em culturas mantidas a 15°C por uma
semana e transferidas para 20°C, a quantidade de células observadas caiu para 5%
em 24h e após 48h não existia mais nenhuma célula viva. Nas culturas já iniciadas
com 20ºC não foi observada dispersão celular.
5.2. Tipos celulares em cultura
B.glabrata
As células desprenderam-se e migraram facilmente do explante de APO,
ficando em suspensão, sendo desnecessário qualquer tratamento enzimático. Logo
após fragmentar o APO e colocá-lo na placa de cultura já foi possível observar
células migrando (fig. 1).
Três tipos celulares morfologicamente distintos, nomeados de tipo I, II e
III, cresceram na cultura (fig. 2). As células tipo I, (fig. 2 e ) que predominam na
cultura celular, são arredondadas com núcleo grande para o tamanho do citoplasma.
As células tipo II (fig. 2 e ) possuem relativamente mais citoplasma que o tipo I.
A presença de pseudópodes, também foi observada (fig.2 ). O último tipo celular,
denominado de tipo III (fig. 2 ) é refringente e com núcleo não definido e menos
abundante, inicialmente, que as outras. Divisão celular atípica foi observada, com
núcleo duplicando sem citocinese (fig.2 )
44
Células semelhantes ao tipo II foram encontradas também na hemolinfa
(fig. 2 e respectivamente). Foi possível manter algumas células tipo III por até
62 dias (fig. 3).
Fig. 1.Dispersão de células do explante de APO de B. glabrata
em cultura. Aumento de 100x.
Tempo em cultura:
1. Imediatamente após o início da cultura do APO: poucas células dispersando.
2. 4 horas depois: observa-se uma maior dispersão.
3. 36 horas depois: quase todas as células já dispersaram.
45
Fig. 2.Tipos celulares encontrados na cultura primária do APO e na hemolinfa de caramujos
B.
glabrata.
1. Células tipos I e II em cultura com predominância da primeira. Aumento: 400x.
2. Células tipos I, II e III em cultura. Aumento: 400x.
3. Pseudópodes emitidos pelas células em cultura. Aumento: 200x.
4. Células binucleadas em cultura. Aumento: 200x.
5. Células tipo II (indicada pela seta) na cultura do APO. Aumento: 400x.
6. Célula circulante similar na hemolinfa de B. glabrata, após fixadas e c
oradas com azul de
metileno. Aumento: 1.000x.
46
Fig. 4. Cultura primária do ovotesti de B. glabrata
usado como controle. Células em cachos e
fortemente aderidas. Aumento: 200x.
Fig. 3.Cultivo primário do APO de caramujos B. glabrata mostrando células tipo III
mantidas em
cultura por 62 dias. Aumento: 400x.
47
Na cultura primária do ovotesti (controle) as células crescem em cachos e
fortemente aderidas (fig. 4).
B. tenagophila do Taim e de Cabo Frio
O comportamento das culturas foi muito semelhante ao observado para B.
glabrata. As células também se desprenderam e migraram facilmente do explante de
APO, ficando em suspensão, sendo desnecessário qualquer tratamento enzimático.
Logo após fragmentar o APO e colocá-lo na placa de cultura já foi possível observar
algumas células migrando (fig. 5). Os tipos celulares I, II e III também foram
encontrados (fig. 6)
Fig. 5. Dispersão de células do explante de APO de B. tenagophila
Cabo Frio em cultura.
Aumento: 200x. As setas apontam algumas células migrando imediatamente após o i
nício da
cultura.
48
5.3. Comportamento celular em contato com antígenos diversos
B.glabrata
Em todos os experimentos nos quais foram utilizados Zimosan foi
observada a dispersão das células em direção a essas partículas (fig. 7).
Quando as células foram colocadas em contato com SEA foi observado
muito debri no meio (fig. 8-A), células com um envoltório celular que se assemelha a
uma cápsula (fig. 8-B, seta grande) e núcleo em divisão (fig. 8-B, setas pequenas).
Nas culturas realizadas com APO de caramujos infectados (após 24
horas de infecção) encontramos os mesmos tipos celulares encontrados nas culturas
de APO sem infecção, ou seja, tipos I, II e III. Não foram observadas diferenças em
relação às culturas de caramujos não infectados.
Fig. 6. Tipos celulares I, II e III encontrados na cultura primária do APO de caramujos
B.
tenagophila Taim. Aumento: 40x.
I
II
III
I
II
III
49
Fig. 7. Dispersão das células (setas grandes) da cultura primária do APO de caramujos B. glabrata
em direção às partículas de Zimosan (setas pequenas). Aumento: 100x.
50
Fig. 8. Cultivo primário APO de caramujo B. glabrata em contato com SEA. Aumento: 200x.
A. grande quantidade de debri celular.
B. seta grande: células com um envoltório celular que se assemelha a uma cápsula. Setas
pequenas: células com núcleo em divisão.
A
B
A
B
51
B. tenagophila
Em todos os experimentos nos quais foram utilizados Zimosan foi
observada a dispersão das células em direção a essas partículas (fig. 9-A e 9-B).
Fig. 9. Dispersão das células da cultura primária do APO em caramujo Biomphalaria
(setas
grandes) em direção às partículas de Zimosan (setas pequenas). Aumento: 100x.
A. B. tenegophila Taim.
B. B. tenagophila Cabo Frio.
A
B
A
B
52
Em contato com LPS, foi observada com 72 horas nas culturas a
presença de um envoltório celular que se assemelha a uma cápsula (fig. 10, seta
grande) e células tipo III (fig. 10, seta pequena). Essas modificações estavam
presentes nas espécimes do Taim e do Cabo Frio, entretanto as células de
B.tenagophila de Cabo Frio apresentaram uma melhor resposta ao antígeno.
Em contato com SEA foram feitas as mesmas observações encontradas
em B. glabrata.
Nas culturas realizadas com APO de caramujos infectados (após 24 horas
de infecção) foram encontrados os mesmos tipos celulares observados nas culturas
de APO sem infecção, ou seja , tipos I, II e III.
Um fato interessante observado em todas as culturas realizadas com
caramujos do gênero Biomphalaria foi a transformação das células tipo I em células
tipo III, com 7 dias ou mais (Fig 11-A). Entretanto, quando se colocam as células da
cultura em contato com SEA ou LPS, as células tipo III surgem em 48 ou 72 horas
respectivamente (fig. 11-B).
Fig. 10. Cultivo Primário do APO de caramujo B. tenagophila Cabo Frio
em contato com LPS.
Aumento: 200x.
Seta pequena: indica a presença de células tipo III.
Seta grande: indica a presença de um envoltório celular.
53
Fig. 11. Cultivo Primário do APO de caramujos Biomphalaria. Aumento: 200x.
A. Transformação das células tipo I de B. tenagophila em células tipo III após 7 dias ou mais.
B. Transformação das células tipo I de B. glabrata em células tipo III após 48 horas de cont
ato da
cultura com SEA.
A
B
A
B
54
5.4. Comportamento celular em contato com esporocistos
B. glabrata
Células tipo I se aglomeram formando uma extensa rede (fig. 12-A) e já se
observam células aderidas ao esporocisto (fig. 12-B) logo após contato.
A
B
Fig. 12. Cultivo Primário do APO de caramujos B. glabrata log
o após contato com esporocistos
(30µl). Aumento: 200x.
A. As células tipo I se aglomeram formando uma extensa rede.
B. Células aderidas ao esporocisto.
55
Após 24 horas de contato, células tipo I que formaram rede estão
próximas dos esporocistos (fig. 13-A). Também foram observadas muitas células tipo
I e II com núcleo em divisão e os esporocistos livres entre elas com bastante
movimento (fig. 13-B). Presença de células tipo III.
Fig. 13. Cultivo Primário do APO de caramujos B. glabrata após
24 horas de contato com
esporocistos (18 esporocistos). Aumento: 200x.
A. As células que formaram rede estão próximas ao esporocisto.
B. Esporocisto vivo entre as células. Células tipos I, II e III. Células tipo I com núc
leos em divisão
(seta grande). Células tipo II com núcleos em divisão (seta pequena).
A
B
I
II
III
A
B
I
II
III
56
Após 48 horas, observa-se a presença de células em rede e de células
livres ao redor do esporocisto, que permanece vivo
Em um outro experimento, esporocistos foram colocados em contato com
células de B. glabrata que já estavam uma semana em cultura, e já apresentavam
células tipo III (fig.14-A). Após 24 horas de contato, os esporocistos estavam vivos
no meio das células tipo III e do tipo I (fig. 14-B) com movimento ativo.
Fig. 14. Cultivo Primário do APO de caramujo B. glabrata
mantidos por uma semana em cultura.
Aumento: 200x.
A. Logo após contato com esporocistos (18 esporocistos): não ho
uve reação por parte das células
tipo I e já era visível a presença de células tipo I e tipo III.
B. Após 24 horas de contato (18 esporocistos): esporocistos vivos entre as células tipo I e tipo III.
A
B
A
B
57
B. tenagophila Taim
Da mesma forma como observado para B. glabrata, células tipo I se
aglomeram formando uma extensa rede (fig. 15-A), migram em direção ao
esporocisto e já se observam células ao redor do esporocisto (fig.15-B).
Fig. 15. Cultivo Primário APO de caramujo B. tenagophila T
aim logo após contato com
esporocistos (18 esporocistos). Aumento: 200x.
A. As células se aglomeram formando uma rede.
B. As células aglomeradas em rede aderidas ao esporocisto (seta).
A
B
A
B
58
Após 24 horas de contato, observa-se células com dois núcleos ao redor
do esporocisto e muito debri no meio, semelhante ao verificado nas células em
presença do SEA (fig.16-A, seta azul). Foram observadas células aderidas ao
esporocisto (fig.16-B) e células tipo I aglomeradas (fig. 16-C). Ao redor das células
observa-se um material denso (provável secreção celular) em forma de gel (fig.17-A,
seta vermelha) e os esporocistos presos nesse material geliforme (fig.17-B e 17-C,
setas vermelhas) apresentavam pouco movimento.
Após 48 horas de contato, esporocistos apresentaram-se mortos (sem
movimento) entre as células (fig.18, seta azul).
59
Fig. 16. Cultivo Primário APO de caramujo B. tenagophila do TAIM após 24 hor
as de contato com
esporocistos (18 esporocistos). Aumento: 200X.
A. Seta azul: célula com 2 núcleos ao redor do esporocisto e excesso de debri.
B. Células aderidas ao esporocisto.
C. Ainda se observam células tipo I aglomeradas em rede.
A
B
C
A
B
C
60
Fig. 17. Cultivo Primário APO de caramujo B. tenagophila
do Taim após 24 horas de contato com
esporocistos (18 esporocistos). Aumento: 200x
A. Seta: observa-se ao redor das células um material denso em forma de gel.
B. Seta: esporocisto preso no material geliforme.
C. Seta: esporocisto preso no material geliforme.
A
B
C
A
B
C
61
B. tenagophila Cabo Frio
Da mesma forma como observado para B. glabrata, células tipo I se
aglomeram, logo após o contato com os esporocistos, formando uma extensa rede
de células. Próximo aos esporocistos foram observadas células e estes
apresentavam bastante movimento. Não existem células tipo III.
Após 24 horas ainda se observam células em rede, porém em menor
quantidade que nos outros experimentos (fig.19-A), células ao redor do esporocisto
(fig.19-B). Presença de células tipo III (fig.19-A).
Após 48 horas poucas e pequenas redes, esporocisto mortos e vivos
entre as células (fig. 20).
Fig. 18. Cultivo Primário APO de caramujo B. tenagophila
do TAIM após 48 horas de contato com
esporocistos (18 esporocistos). Aumento: 200x. Observam-
se os esporocistos sem movimento
(mortos e degenerados) entre as células (seta).
62
Fig. 19. Cultivo Primário APO de caramujo B. tenagophila
Cabo Frio após 24 horas de contato com
esporocistos (18 esporocistos). Aumento: 200x.
A. Células aglomeradas em rede . Observa-se a presença de células tipo III (seta).
B. Células aderidas ao esporocisto.
A
B
A
B
63
5.5. Comportamento celular em contato com miracídios
Experimento realizado com caramujos B. tenagophila do Taim e Cabo Frio
e B. glabrata.
Não houve resposta das células de nenhum dos caramujos testados
frente a miracídios. Não houve nenhuma alteração visível nas células, elas
permaneceram idênticas as células de cultura que não receberam qualquer estímulo.
5.6. Análise das células através microscopia confocal utilizando
lectinas conjugadas com FITC
WGA
B. glabrata
Na figura 21-A é possível observar o aspecto geral do órgão
hematopoiético, em pequeno aumento, corado pela lectina. É possível observar
Fig. 20. Cultivo Primário APO de caramujo B. tenagophila
Cabo Frio após 48 horas de contato com
esporocistos (18 esporocistos). Aumento: 400x. Observa-
se a presença de esporocistos vivos
entre as células.
64
septos de tecidos não corados (setas). Na figura 21-B observa-se o alinhamento de
células. O citoplasma celular dos hemócitos foram corados pela lectina mostrando os
esboços das células (setas brancas). Observa-se também a forte reação na matriz
extracelular (setas amarelas) e os núcleos arredondados e de diferentes tamanhos e
sem coloração.
B. tenagophila Taim
Na figura 22-A é possível observar o aspecto geral do órgão
hematopoiético, em pequeno aumento, corado pela lectina. É possível observar
septos de tecidos não corados (setas) de maneira semelhante ao órgão do B.
glabrata.
Na figura 22-B observa-se que as células foram coradas uniformemente
porém mais fracamente do que os órgãos do B. glabrata e do B.tenagophila Cabo
Frio. Nota-se também a fraca reação na matriz extracelular (setas amarelas).
B. tenagophila Cabo Frio
Na figura 23-A é possível observar o aspecto geral do órgão
hematopoiético, em pequeno aumento, corado pela lectina. Pode-se observar uma
coloração da lectina mais forte na região da superfície do órgão (setas brancas)
A figura 23-B mostra uma reação intermediária quando comparada nos
aspectos gerais com B. glabrata e com B. tenagophila Taim. Observa-se também
uma fraca reação na matriz extracelular contrastando (setas amarelas) com uma
forte reação “granulosa” mostrando organelas citoplasmáticas (setas brancas).
65
A
B
B. glabrata
n
n
n
A
B
B. glabrata
n
n
n
Fig. 21. WGA - B. glabrata
A. Septos de tecidos não corados (setas brancas).
B.
Alinhamento de células. Citoplasma celular dos hemócitos corado pela lectina (setas brancas).
Forte reação na matriz extracelular (setas amarelas) e núcleos arredondados de diferentes
tamanhos e sem coloração (n).
A
B
B. tenagophila Taim
A
B
B. tenagophila Taim
Fig. 22. WGA - B. tenagophila Taim
A. Septos de tecidos não corados (setas brancas)
B. Células coradas uniformemente e fraca reação na matriz extracelular (setas amarelas).
A
B
B. tenagophila Cabo Frio
A
B
B. tenagophila Cabo Frio
Fig. 23. WGA - B. tenagophila Cabo Frio
A. Coloração da lectina mais forte na região da superfície do órgão (setas brancas) .
B.
Fraca reação na matriz extracelular (setas amarelas) contrastando com uma forte reação
“granulosa” mostrando organelas citoplasmáticas (setas brancas).
66
PNA
B. glabrata
Na figura 24-A observa-se o aspecto geral do órgão corado pela lectina. É
possível observar a coloração granular e não uniforme do órgão completamente
distinta de B. tenagophila Taim e de B. tenagophila Cabo Frio.
A figura 24-B mostra um alinhamento perfeito das células. O citoplasma
celular dos hemócitos e a matriz extracelular (setas amarelas) foram coradas de
maneira similar, porém o citoplasma celular apresenta granulações (setas brancas).
B. tenagophila Taim
Na figura 25-A temos um pequeno aumento do órgão mostrando aspecto
geral corado fracamente em algumas regiões contrastando com outras fortemente
coradas completamente diferente do B. glabrata, porém similar ao B. tenagophila
Cabo Frio.
Na figura 25-B é possível observar grupos de células vizinhas fracamente
coradas (setas brancas) nos seus citoplasmas contrastando com outras fortemente
coradas (setas amarelas).
B. tenagophila Cabo Frio
Na figura 26-A observa-se algumas células fortemente coradas
entremeadas com a maioria das células fracamente positivas com vários grânulos
citoplasmáticos não corados. No aspecto geral, o órgão é completamente diferente
do B. glabrata, porém similar ao B. tenagophila Taim.
Na figura 26-B é possível observar a existência de células variando a
coloração, desde células fracamente coradas (setas amarelas), células com
aspectos intermediários (seta vermelha) de coloração e células fortemente coradas
(seta branca). Além disto, percebe-se que as células positivas estão com os
citoplasmas bastante delineados.
67
A
B
B. glabrata
n
n
n
A
B
B. glabrata
n
n
n
Fig. 24. PNA - B. glabrata
A. Coloração granular e não uniforme do órgão hematopoiético.
B.
Alinhamento perfeito das células. Citoplasma celular dos hemócitos e a matriz extracelular
(setas amarelas) corados de maneira similar. Citoplasma celular apresenta granulações (setas
brancas). (n) = núcleo.
A
B
B. tenagophila Taim
n
n
n
A
B
B. tenagophila Taim
n
n
n
Fig. 25. PNA - B. tenagophila Taim
A.
Aspecto geral corado fracamente em algumas regiões contrastando com outras fortemente
coradas.
B.
Grupos de células vizinhas fracamente coradas (setas brancas) nos seus citoplasmas
contrastando com outras fortemente coradas (setas amarelas).
A
B
B. tenagophila Cabo Frio
n
n
A
B
B. tenagophila Cabo Frio
n
n
Fig. 26. PNA - B. tenagophila Cabo Frio
A.
Algumas células fortemente coradas entremeadas com a maioria das células fracamente
positivas com vários grânulos citoplasmáticos não corados.
B. Células variando a coloração, desde células fracamente coradas (setas amarelas
), células
com aspectos intermediários de coloração (setas vermelhas) e células fortemente coradas
(setas brancas). As células positivas estão com os citoplasmas bastante delineados.
68
LPL
B. glabrata
Na figura 27-A observa-se o alinhamento das células. O citoplasma
celular dos hemócitos e a matriz extracelular foram corados de maneira similar. Em
alguns locais é possível observar granulações no espaço entre as células e a matriz
(setas brancas).
Na figura 27-B é possível observar células com citoplasma bem delineado
e corado (setas brancas). As granulações (setas amarelas) entre as células e a
matriz estão bem evidentes.
B. tenagophila Taim
Na figura 28-A observa-se algumas células coradas entremeadas com a
maioria das células fracamente positivas e algumas com citoplasma bem delineado
(setas brancas). É possível observar septos de tecidos não corados (setas
amarelas).
Na figura 28-B é possível observar a maioria das células fracamente
coradas (setas vermelhas) entremeadas com células fracamente positivas (setas
brancas). Observam-se septos de tecidos não corados (setas amarelas).
B. tenagophila Cabo Frio
Na figura 29-A observa-se algumas células fortemente coradas (setas
brancas) entremeadas com a maioria das células fracamente positivas com vários
grânulos citoplasmáticos não corados (setas vermelhas). No aspecto geral, o órgão
é completamente diferente do B. glabrata, porém similar ao B. tenagophila Taim.
Observam-se septos de tecidos não corados (setas amarelas).
Na figura 29-B é possível observar a existência de células variando a
coloração, desde células fracamente coradas (setas amarelas), células com
aspectos intermediários (seta vermelha) de coloração e células fortemente coradas
(seta branca). Também é possível perceber a presença de grânulos citoplasmáticos
não corados e corados. Observam-se septos de tecidos não corados.
69
A
B. glabrata
B
A
B. glabrata
B
B. tenagophila Taim
A
B
B. tenagophila Taim
A
B
A
B
B. tenagophila Cabo Frio
A
B
B. tenagophila Cabo Frio
Fig. 28. LPL - B. tenagophila Taim
A. Algumas células coradas entremeadas com a maioria das células fracamente positivas e
outras com citoplasma bem delineado (setas brancas). Septos de tecidos não corados (setas
amarelas).
B. Maioria das células fracamente coradas (setas vermelhas) entremeadas com células
fracamente positivas (setas brancas). Septos de tecidos não corados (setas amarelas).
Fig. 29. LPL - B. tenagophila Cabo Frio
A. Algumas células fortemente coradas entremeadas com a maioria das células fracamente
positivas com vários grânulos citoplasmáticos não corados (setas vermelhas). Septos de
tecidos não corados (setas amarelas).
B. Células variando a coloração, desde células fracamente coradas (seta amarela), células com
aspectos intermediários de coloração (seta vermelha) e células fortemente coradas (seta
branca). Presença de grânulos citoplasmáticos não corados e corados. Observam-se septos
de tecidos não corados.
Fig. 27. LPL - B. glabrata
A. Alinhamento das células. O citoplasma celular dos hemócitos e matriz extracelular corados de
maneira similar. Granulações no espaço entre as células e a matriz (setas brancas).
B. Células com citoplasma bem delineado e corado (setas brancas). Estão bem evidentes as
granulações no espaço entre as células e a matriz.
70
Con A
B. glabrata
Na figura 30-A e B observa-se uma reação negativa do órgão para com a
lectina.
B. tenagophila Taim
Na figura 31-A é possível observar o aspecto geral do órgão corado pela
lectina. É possível observar septos de tecidos não corados (setas brancas) de
maneira similar ao órgão do B. tenagophila Cabo Frio e bem diferente do B. glabrata
Na figura 31-B é possível observar a existência de células coradas (seta
amarela), com os citoplasmas bastante delineados. Células não coradas (seta
vermelha). Nota-se também a presença de núcleos arredondados de diferentes
tamanhos e sem coloração (setas brancas).
B. tenagophila Cabo Frio
Na figura 32-A é possível observar o aspecto geral do órgão corado pela
lectina. É possível observar septos de tecidos não corados (setas brancas) de
maneira similar ao órgão do B. tenagophila Taim e bem diferente do B. glabrata.
Na figura 32-B nota-se a presença de granulações na matriz extracelular
(setas amarelas) e também a presença de núcleos arredondados de diferentes
tamanhos (setas brancas).
71
B. glabrata
A
B
B. glabrata
A
B
Fig. 30. Con A - B. glabrata
A e B Reação negativa do órgão para com a lectina.
B. tenagophila Taim
A
B
B. tenagophila Taim
A
B
Fig. 31. Con A - B. tenagophila Taim
A. Septos de tecidos não corados (seta branca).
B.
Células coradas (seta amarela), com os citoplasmas bastante delineados. Células não
coradas (seta vermelha). Presença de núcleos arredondados de diferentes tamanhos e sem
coloração (setas brancas).
A
B
B. tenagophila Cabo Frio
A
B
B. tenagophila Cabo Frio
Fig. 32. Con A - B. tenagophila Cabo Frio
A. Septos de tecidos não corados (setas brancas).
B.
Granulações na matriz extracelular (setas amarelas) e presença de núcleos arredondados de
diferentes tamanhos (setas brancas).
72
Lyso Tracker Red
B. glabrata
Na figura 33-A é possível observar a existência de lisossomos na maioria
das células (setas brancas).
Na figura 33-B observa-se a existência de lisossomos em algumas células
(setas vermelhas). Nota-se também a presença de núcleos arredondados de
diferentes tamanhos (setas brancas).
B. tenagophila Taim
Na figura 34-A é possível observar a existência de lisossomos em
algumas células (setas brancas).
Na figura 34-B observam-se detalhes dos lisossomos (setas brancas).
B. tenagophila Cabo Frio
Na figura 35-A é possível observar a existência de lisossomos em
algumas células (setas brancas), porém em quantidade maior que B. tenagophila
Taim.
Na figura 35-B observa-se a existência de lisossomos em algumas células
(setas vermelhas). Nota-se também a presença de núcleos arredondados de
diferentes tamanhos (setas brancas).
73
B. glabrata
A
B
B. glabrata
A
B
Fig. 33. Lysotracker - B. glabrata
A. Existência de lisossomos na maioria das células (setas brancas).
B.
Existência de lisossomos em algumas células (setas vermelhas). Presença de núcleos
arredondados de diferentes tamanhos (setas brancas).
B. tenagophila Taim
A
B
B. tenagophila Taim
A
B
Fig. 34. Lysotracker - B. tenagophila Taim
A. Existência de lisossomos em algumas células (seta branca).
B. Detalhes dos lisossomos (seta branca).
B. tenagophila Cabo Frio
A
B
B. tenagophila Cabo Frio
A
B
Fig. 35. Lysotracker - B. tenagophila Cabo Frio
A. Existência de lisossomos em algumas células (setas brancas).
B. Existência de lisossomos em algu
mas células (setas vermelhas). Presença de núcleos
arredondados de diferentes tamanhos (setas brancas).
74
Controle
B. glabrata
Na figura 36-A observa-se o aspecto geral do órgão mostrando a auto
fluorescência, a presença de septos não fluorescentes (seta branca) e a organização
celular. Assemelha-se ao B. tenagophila Cabo Frio.
B. tenagophila Taim
Na figura 36-B observa-se o aspecto geral do órgão mostrando a auto
fluorescência e a presença de septos não fluorescentes (seta branca).
B. tenagophila Cabo Frio
Na figura 36-C observa-se o aspecto geral do órgão mostrando a auto
fluorescência, a presença de septos não fluorescentes (seta vermelha) e a
organização celular com núcleos arredondados e de diferentes tamanhos (seta
branca). Assemelha-se ao B. glabrata.
75
B. glabrata
A
B. glabrata
A
B. tenagophila Taim
B
B. tenagophila Taim
B
B. tenagophila Cabo Frio
C
B. tenagophila Cabo Frio
C
Fig. 36. Controle
A. B. glabrata.
Auto fluorescência, a presença
de septos não fluorescentes (seta branca) e
a organização celular.
B. tenagophila Taim. Auto
fluorescência e a
presença de septos não fluorescentes (seta
branca).
C. B. tenagophila
Cabo Frio. Auto
fluorescência, a presença de septos não
fluorescentes (seta vermelha) e a
organização celular com núcleos
arredondados e de diferentes tamanhos
(setas brancas).
76
Aspecto Geral
B. glabrata
Na figura 37-A observa-se o pequeno aumento do órgão corado pela
lectina WGA, a qual praticamente corou todo o órgão mostrando os aspectos gerais
do tecido inclusive núcleo corado (n) com Topro-3, um marcador nuclear de cor
marrom avermelhado. Nota-se o espaço entre as células mostrando material fibroso
fortemente corado provavelmente representando parte do tecido conjuntivo presente
no órgão (asteriscos).
Na figura 37-B observam-se detalhes do órgão corado pela lectina WGA
mostrando regiões fluorescentes do órgão (asteriscos) e os núcleos corados (n) com
Topro-3. Notam-se septos entremeados no meio do órgão sem reatividade (setas).
B. tenagophila Taim
Na figura 37-C observa-se pequeno aumento do órgão corado pela lectina
WGA, a qual praticamente corou todo o órgão, porém fracamente (setas). Notam-se
os núcleos corados em marrom avermelhados (n) característico do Topro-3. Notam-
se também os septos de tecido não corados (setas azuis).
Na figura 37-D observa-se detalhes da marcação das células pela WGA
(setas) evidenciando o citoplasma celular e os núcleos (n) em marrom
avermelhados. Os septos são vistos não corados (setas azuis).
77
n
n
n
A
B
B. glabrata
n
n
n
n
n
n
A
B
B. glabrata
n
n
n
B. tenagophila Taim
n
n
n
C
D
n
n
n
B. tenagophila Taim
n
n
n
C
D
n
n
n
Fig. 37.
Aspecto Geral
B. glabrata –
A. Praticamente todo o órgão corado. A
spectos gerais do tecido, inclusive núcleo corado (n)
com Topro-3. Nota-se
o espaço entre as células mostrando material fibroso fortemente
corado (setas azuis).
B. Regiões fluorescentes do órgão (setas azuis) e os núcleos corados (n) com Topro-
3.
Septos entremeados no meio do órgão sem reatividade (setas brancas).
B. tenagophila Taim
C. Praticamente todo o órgão corado, porém fracamente (setas brancas). N
úcleos corados
em marrom avermelhado (n) característico do Topro-3. S
eptos de tecido não corados
(setas azuis).
D. Detalhes da marcação das células pela WGA (setas brancas) evidenciando o
citoplasma
celular e os núcleos (n) em marrom avermelhado. Os septos são vistos não corados (setas
azuis).
78
Todos os órgãos hematopoiéticos foram positivos para WGA. Em B.
glabrata observamos uma reação mais nítida da lectina quando comparado com B.
tenagophila Taim e Cabo Frio.
Todos os órgãos hematopoiéticos foram positivos para PNA. EM B.
tenagophila Cabo Frio observamos uma reação mais nítida da lectina quando
comparado com B. tenagophila Taim e B. glabrata.
Todos os órgãos hematopoiéticos foram positivos para LPL. Em B.
glabrata observamos uma reação mais nítida da lectina quando comparado com B.
tenagophila Taim e Cabo Frio.
B. glabrata foi negativa para Con A. Em B. tenagophila Taim observamos
uma reação mais nítida da lectina quando comparado com B. tenagophila Cabo
Frio.
79
6. Discussão
Inicialmente foram feitas culturas com caramujos cujo diâmetro da concha
variava entre 1mm e 40mm. Nos moluscos com concha de tamanho inferior a 10
mm, o insucesso deveu-se à dificuldade em se retirar o APO com segurança, pois
não se utiliza microscópio estereoscópico para este procedimento. Já os espécimes
mais velhos (diâmetro de concha superior a 19mm) apresentaram alta carga
parasitária (leveduras, bactérias, helmintos e protozoários) não responsiva ao
tratamento empregado com mebendazol.
A heterogeneidade da população de hemócitos circulantes na hemolinfa
de caramujos do gênero Biomphalaria vem sendo demonstrada por vários autores,
sendo levados em consideração aspectos morfológicos, bioquímicos e funcionais
(Harris, 1975; Yoshino, 1976; Joky et al., 1983; Lie et al., 1987; Ottaviani, 1992;
Barraco et al., 1993; Bezerra et al., 1997; Matricon-Gondran & Letocart, 1999;
Johnston & Yoshino, 2001 e Martins-Souza et al., 2003). Entretanto não existe um
consenso em relação ao número de tipos celulares presentes na hemolinfa ou ao
critério para diferenciação dos mesmos (Sminia, 1981).
Nas culturas celulares do APO foram encontrados 3 tipos celulares
distintos, tipos I, II e III. Os tipos I e II são semelhantes às células que ocorrem na
hemolinfa de Biomphalaria. As células tipo I são morfologicamente semelhantes aos
hialinócitos da hemolinfa (Van Der Knaap & Loker, 1990), são arredondadas com
núcleo grande para o tamanho do citoplasma. As do tipo II são morfologicamente
semelhantes à descrição dos granulócitos da hemolinfa (Van Der Knaap & Loker,
1990), possuem relativamente mais citoplasma que o tipo I e também foram
observados pseudópodes, reportados como uma importante habilidade dos
granulócitos. Baseado nos aspectos morfológicos encontrados e no tamanho do
núcleo em relação ao citoplasma, esses achados vão ao encontro do trabalho de
Joky et al. (1993) que afirmaram que os hemócitos de Biomphalaria se originam no
APO e não se diferenciam na hemolinfa e nem derivam uns dos outros. O último tipo
celular, denominado de tipo III era refringente e com núcleo não definido e menos
abundante, inicialmente, que os outros.
Amen et al. (1991) descrevem os hialinócitos como precursores dos
granulócitos. Esta hipótese também foi sugerida por Martins-Souza et al. (2003) que
demonstraram que a inoculação de sílica em caramujos B. tenagophila acarretava
80
uma diminuição passageira no número de granulócitos circulantes e à medida que a
população de granulócitos se reestabelecia, era observado um aumento
considerável na população de hialinócitos, sugerindo que os hialinócitos possam
estar envolvidos na reposição do nível de granulócitos. Esses achados não vão ao
encontro do observado nas culturas do APO, pois em todas as culturas realizadas
sempre foram encontrados os 2 tipos celulares, ou seja o tipo I e o tipo II.
Fato interessante, que ocorreu nas culturas primárias, foi a transformação
das células tipo I em tipo III e a grande capacidade de permanecerem em cultura por
mais de 60 dias, sugerindo ter ocorrido um amadurecimento celular. O encontro de
células aderidas e com pseudópodes emitidos corroboram os achados de Sminia
(1981), segundo o qual os granulócitos da hemolinfa quando em contato com
superfícies de plástico ou vidro, achatam-se e emitem pseudópodes.
Não foi necessário o tratamento enzimático para dispersão celular,pois as
células se desprenderam facilmente dos explantes de APO. No primeiro dia de
cultura já era possível observar células dispersas no meio, confirmando os achados
de Lynn (2001) quanto à facilidade de obtenção de hemócitos.
Devido à falta de dados para se cultivar tecidos hematopoiéticos de
invertebrados, o modelo utilizado foi o de estudos com vertebrados, nos quais a
proliferação das células e sua diferenciação são geradas por hormônios, fatores de
crescimento, citocinas, receptores de superfície e genes. Embora alguns autores
tenham afirmado que, em geral, culturas de invertebrados são insensíveis a muitos
dos fatores que afetam sistemas de vertebrados (Slack, 2000; Nishino &
Mitsuhashi,1995; Watt & Hogan, 2000). Lebel et. al., (1996) mostraram um efeito
positivo de promotores de crescimento de vertebrados, em culturas de células de
invertebrados, como por exemplo, soro fetal bovino e fator de crescimento
epidérmico (EGF). Essa observação foi confirmada nas culturas primárias do APO,
onde os dois promotores facilitaram o crescimento celular.
Por se tratar do cultivo primário do APO, partiu-se do principio que seriam
cultivadas células de invertebrados similares às células tronco de vertebrados e
esperava-se que, como células tronco, as culturas permanecessem viáveis por
tempo indeterminado, o que não ocorreu.
Lynn (2001) chama a atenção para a dificuldade de se obter crescimento
celular de hemócitos in vitro, atribuído principalmente, à baixa taxa de proliferação
celular (Lebel et al., 1996).
81
Existe uma grande controvérsia quanto ao local onde as células de defesa
dos caramujos são produzidas. Parece-nos claro que são produzidas em uma região
denominada órgão produtor de amebócitos (APO). Fato comprovado pelo
transplante do APO de caramujos totalmente resistentes (B. tenagophila Taim) para
caramujos altamente suscetíveis (B. tenagophila Cabo Frio) (Barbosa, 2001;
Barbosa et al., 2006), onde os autores obtiveram uma significativa diferença de
positividade entre caramujos transplantados e seus respectivos controles.
Entretanto, quando se transplantaram órgãos como manto, coração, rim, glândulas
de albumina e ovotestis não houve transferência de resistência.
Lie et al. (1976) mostraram que o tecido conectivo da porção sacular do
rim, próximo da artéria renal é um local onde freqüentemente se encontra uma
concentração de hemócitos. As células produzidas no APO passam pelo coração e
outros tecidos e ainda apresentam capacidade de se dividir e produzir novos focos
de hemócitos, como os observados na parede interna do átrio. Esses autores
afirmaram que o APO produz células rapidamente e que as células encontradas na
porção sacular dos rins apresentam células em divisão e que a população de células
nesse local é bem menor que no APO. Recentemente, baseado em achados
morfológicos, Souza & Andrade (2006) apontaram para uma origem multicêntrica
dos hemócitos, a partir do endotélio dos espaços vasculares.
Durante vários meses foram testados meios diferentes enriquecidos de
maneiras diversas, até que se conseguiu um meio ideal, onde a sobrevida celular
era maior e também ocorria uma maior dispersão celular, pois, segundo Mitsuhashi
(2001), há vários fatores que afetam o crescimento das células na cultura e um
desses fatores é a composição do meio.
O fato de não ocorrer nenhuma modificação nas células da cultura do
APO em contato com os miracídios já era esperado por nós. Primeiramente porque
as células, mesmo as da hemolinfa, não têm contato com o miracídio, pois quando
esse penetra nas partes moles do caramujo perde a placa ciliada e se transforma em
esporocistos. Acredita-se que os receptores de superfície estão abaixo das placas
ciliares, assim, eles não são reconhecidos pelos hemócitos.
Araque et al. (2003) relataram que ao colocar miracídios em contato com
hemócitos da hemolinfa houve uma interação, ressaltando três aspectos: dispersão
dos hemócitos em direção aos miracídios, emissão de extensão citoplasmática dos
hemócitos; confluência dos hemócitos para os miracídios para imobilizá-los
82
totalmente. Isto não foi observado, provavelmente porque os autores utilizaram os
miracídios após incubação por 90 minutos a 27ºC, o que pode ter ocasionado a
perda da placa ciliada. Os resultados obtidos nesse trabalho coincidem com os
publicados e observou-se ao microscópio que os hemócitos envolvem totalmente os
esporocistos com as extensões citoplasmáticas, antes de imobilizá-los. Este
fenômeno foi claramente observado com as células em contato com os esporocistos
transformados in vitro.
O papel dos hemócitos na destruição de parasitos tem sido bastante
estudado. Segundo, Bahgat et al. (2002), essas células possuem função análoga
aos macrófagos de mamíferos. Essas células são capazes de montar uma resposta
citotóxica contra os parasitos (Ratcliffe et al., 1985; Loker et al., 1992) e estão
evidentemente envolvidas na destruição dos esporocistos ( Bayne et al., 1980).
Em caramujos resistentes, os hemócitos são capazes de encapsular e
destruir esporocistos primários in vivo e in vitro (Bayne et al., 1980, Loker et al.,
1992). Em contraste, hemócitos de caramujos suscetíveis que não reagem aos
esporocistos primários in vivo, são capazes de atacar a superfície do esporocisto “in
vitro” (Bahgat et al., 2002; Osman et al., 2003). Esses achados vão ao encontro dos
experimentos realizados com caramujos suscetíveis, B. glabrata e B. tenagophila de
Cabo Frio, onde observou-se uma resposta das células aos esporocistos. Entretanto,
ao contrário da resposta dos hemócitos de caramujos resistentes, a encapsulação
de caramujos suscetíveis não é citotóxica para os esporocistos e esses continuam
vivos, não afetados pelos hemócitos aderentes (Castilho & Yoshino, 2002).
Uma possível explicação para a diferente reação dos hemócitos de
caramujos resistentes e suscetíveis frente aos esporocistos é que essas células
diferem em relação aos receptores de superfície, originando hemócitos incapazes de
reconhecer e/ou reagir bioquimicamente com o parasito (Coustau & Yoshino,1994).
Os hemócitos são capazes de fagocitar bactérias e pequenas partículas
estranhas, além de encapsular os esporocistos (Bayne et. al.; 1980). Fato
semelhante foi observado ao se colocar as células do cultivo primário do APO de
caramujos Biomphalaria em contato com Zimosan e Sea. Acredita-se na existência
de receptores nas células que seriam capazes de reconhecer e destruir pequenos
antígenos.
As lectinas estão incluídas como importante mediadores internos na
defesa dos moluscos contra patógenos (Olafsen, 1986; Renwrantz, 1986; Vasta &
83
Ahmed, 1996; Horák & Van der Knaap, 1997). A interação de lectinas com
carboidratos também possui um importante papel neste sistema de defesa (Fryer et
al., 1989). Van der Knaap & Loker (1990) descreveram a importância das lectinas
como sendo responsáveis pela ligação entre os hemócitos e esporocistos de S.
mansoni.
O tegumento do esporocisto de S. mansoni é outro fator de fundamental
importância para o reconhecimento dos hemócitos, pois através do tegumento os
hemócitos reconhecem, encapsulam e destroem os esporocistos após invasão em
caramujos resistentes (Bayne & Yoshino, 1989; Loker, 1994). Acredita-se que o
principal mecanismo de ligação dos hemócitos ao tegumento dos esporocistos se dê
através do reconhecimento, por parte das lectinas, dos carboidratos presentes no
tegumento do parasito (Johnston & Yoshino, 1996).
Os resultados apresentados no presente trabalho sugerem que os
hemócitos presentes no órgão hematopoiético de caramujos Biomphalaria
apresentam uma variedade de receptores em sua superfície, o que se justifica pela
marcação de várias lectinas (Con A, WGA, PNA, LPL).
O papel exato dos resíduos de carboidratos no reconhecimento ou não
dos esporocistos pelos caramujo hospedeiro ainda é desconhecido (Zelck & Becker
1990).
Vários receptores de lectinas têm sido mostrados como ocorrendo na
superfície de esporocistos de S. mansoni (Zelck & Becker, 1990). Alguns autores
mostram que a galactose, glucose, mannose, N-acetil - galactosamina e N-acetil-
glucosamina encontram-se presentes na porção terminal dos miracídios (Yoshino et
al., 1977), nas cercárias (Linder, 1985) e na superfície de vermes adultos (Simpson
& Smithers, 1980; Hayunga & Sumner, 1986).
A presença de diversas lectinas em esporocistos transformados in vitro ou
presentes em cortes histológicos de tecidos de caramujos também já foi descrita,
utilizando-se marcadores fluorescentes específicos (Yoshino et al., 1977; Zelck &
Becker, 1990; Uchikawa & Loker, 1991; Johnston & Yoshino, 1996).
A mannose, glucose e a, N-acetil – galactosamina estão presentes nos
esporocistos em culturas in vitro (Yoshino et al., 1977). Esses resultados vão ao
encontro deste trabalho onde observou-se que as células do APO apresentaram
receptores de superfície para as lectinas usadas (Con A, WGA, PNA, LPL).
84
LysoTracker é um marcador acidotrópico, específico para lisossomos e
compartimentos ácidos em células vivas. Diversos trabalhos já utilizaram o marcador
LysoTracker para demonstrar a presença e a ausência desses compartimentos
ácidos nas diferentes fases evolutivas de S.mansoni.
Carneiro-Santos et al. (2001) demonstraram a presença dessas organelas
em esquistossômulos e a ausência em cercarias, dados confirmadas por Al-Adhami
et al. (2003, 2005). Neste último trabalho foi mostrado, ainda, que os miracídios não
revelam a presença de vesículas quando expostos ao LysoTracker demonstrando
que nesta fase do ciclo do parasito essas vesículas também não estão presentes.
Os autores sugerem que os lisossomos estejam envolvidos em processos de
sobrevivência e adaptação dos esquistossômulos ao seu novo ambiente (hospedeiro
vertebrado), o que explicaria o desenvolvimento dessas organelas imediatamente
após a transformação das cercárias em esquistossômulos.
O mesmo pode ocorrer durante a transformação do miracídio em
esporocistos. Durante esta transformação ocorrem mudanças metabólicas que
podem levar ao surgimento dessas vesículas ácidas. Provavelmente estas estruturas
exercem um papel fundamental na sobrevivência e na adaptação dos esporocistos
no seu novo ambiente (hospedeiro invertebrado). Outro evento que pode ocorrer
durante essas transformações é a autofagia. Trata-se de um processo utilizado pelas
células para eliminar componentes celulares desnecessários durante a diferenciação
celular (De Duve & Wattiaux, 1966). Sabe-se que esses componentes celulares sem
função são capturados e degradados pelos lisossomos para posterior eliminação
(Jans et al., 2004). Dessa forma, sugere-se que, durante a transformação, tanto de
cercárias para esquistossômulos quanto de miracídio para esporocistos, ocorra um
estímulo do processo de autofagia, levando ao desenvolvimento dessas vesículas
ácidas.
Lisossomos têm sido descritos em células que encapsulam parasitos em
caramujos (Harris & Cheng, 1975; Cheng & Garrabrant, 1977). Vários autores
mostraram que os hemócitos liberam enzimas lisossomais quando desafiados com
material não próprio (Cheng et al., 1975; Cheng & Yoshino, 1976; Cheng et al.,
1977). Bayne et al. (1980) afirmaram que faltam evidências ultraestruturais de que
os hemócitos liberam enzimas lisossomais na superfície dos esporocistos.
Granath & Yoshino (1983) analisaram a distribuição e abundância de
enzimas lisossomais, como fosfatase ácida, esterase não específica e peroxidase
85
em hemócitos de B. glabrata. Neste estudo, foi mostrado que, de maneira geral, os
hemócitos aderentes ao vidro, isolados de linhagens resistentes e suscetíveis ao S.
mansoni apresentam reação para as três enzimas testadas isoladamente e para
fosfatase ácida e esterase não específica testadas simultaneamente. Porém, na
linhagem resistente, a quantidade de hemócitos contendo grânulos de fosfatase
ácida e esterase não específica foi significativamente maior do que a quantidade de
hemócitos com grânulos de peroxidase.
Neste trabalho foi mostrada a presença de lisossomos nas células do
APO de caramujos Biomphalaria uma vez que essas células foram tratadas com
LysoTracker que é um marcador específico para lisossomos e compartimentos
ácidos em células vivas e obteve-se um resultado positivo.
86
7. Conclusões
Foi estabelecida a metodologia para cultivar células do órgão
hematopoiético de caramujos Biomphalaria.
O órgão hematopoiético apresenta uma estrutura organizada e não
representa um mero aglomerado de células.
Foi possível determinar dois tipos básicos de células no APO. Um terceiro
tipo aparece após semanas de cultura ou em 24 horas após contato com SEA, LPS
e esporocistos.
As células de B. tenagophila Taim, B. tenagophila Cabo Frio e B. glabrata
foram positivas para as lectinas: WGA, LPL, PNA.
B. glabrata não teve células positivas para Con A, entretanto as duas
linhagens de B. tenagophila estudadas apresentaram positividade para esta lectina.
Nas células de todas as linhagens estudadas foi possível a marcação de
lisossomos.
O comportamento in vitro de células de cultura de B. tenagophila do Taim
com esporocistos recém transformados de S.mansoni mostrou uma intensa
aglomeração em torno do parasito, com formação de uma massa gelatinosa e
resultando em morte dos esporocistos entre 24 a 48 horas.
No confronto de células de cultura de B. glabrata com esporocistos
verificou-se pouca adesão celular em torno dos parasitos, que sobreviveram por
vários dias nas culturas.
Os melhores resultados frente aos esporocistos em ordem crescente de
importância foram B. tenagophila Taim, B. tenagophila Cabo Frio e B. glabrata.
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