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Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Tiana Gonçalves
CORRELAÇÃO ENTRE A DIFUSÃO DE MATERIAL ANTIGÊNICO DE
OVO DE SCHISTOSOMA MANSONI COM A EXPRESSÃO DE
MOLÉCULAS DE ADESÃO DE COMPLEXOS JUNCIONAIS EM
GRANULOMAS HEPÁTICOS MURINOS
Dissertação apresentada à Coordenação de Pós-
Graduação em Biologia Parasitária com vistas à
obtenção do Título de Mestre em Ciências na área de
Biologia Parasitária.
Orientador: Dr. Henrique Leonel Lenzi
Rio de Janeiro
Maio 2008
i
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Milhares de livros grátis para download.
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca de Ciências
Biomédicas/ ICICT / FIOCRUZ -RJ
G635
Gonçalves, Tiana
Correlação entre a difusão de material antigênico de ovo de
Schistosoma mansoni com a expressão de moléculas de adesão de
complexos juncionais em granulomas hepáticos murinos / Tiana
Gonçalves. – Rio de Janeiro, 2008.
xiv, 81 f. : il. ; 30 cm.
Dissertação (mestrado) – Instituto Oswaldo Cruz, Biologia
Parasitária, 2008.
Bibliografia: f. 65-81
1. Granuloma esquistossomótico. 2. Schistosoma mansoni. 3.
Moléculas de adesão. I. Título.
CDD 616.963
ii
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Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Tiana Gonçalves
Orientador: Dr. Henrique Leonel Lenzi
provada em : 06 de Junho de 2008
xaminadores:
Dr. Luiz Anastácio Alves - Presidente
Rio de Janeiro, 01 de Setembro de 2008
CORRELAÇÃO ENTRE A DIFUSÃO DE MATERIAL ANTIGÊNICO DE OVO DE
S CHISTOSOMA MANSONI COM A EXPRESSÃO DE MOLÉCULAS DE ADESÃO DE
COMPLEXOS JUNCIONAIS EM GRANULOMAS HEPÁTICOS MURINOS
A
E
Dr. José Roberto Machado e Silva
Dra. Maria Lúcia Zaidan Dagli
iii
Aos meus pais (Relindes e Luiz Carlos), pelo amor,
realização desse trabalho.
apoio e dedicação incondicional em todos os momentos
da minha vida. Seu incentivo foi fundamental na
iv
v
Eu fico com a pureza
Da resposta das crianças
É a vida, é bonita e é bonita...
onha de ser feliz
ndiz...
bonita...
ue é?
?
o?
em fale
o
ndo...
profundo
epleta de amor...
iver
o a força da fé
os a vida
.
eja errada
nças
Viver! E não ter a verg
Cantar e cantar e cantar
A beleza de ser um eterno apre
Ah meu Deus! Eu sei, eu sei
Que a vida devia ser
Bem melhor e será
Mas isso não impede que eu repita
É bonita, é bonita e é
E a vida! E a vida o q
Diga lá, meu irmão. Ela é a batida
de um coração
Ela é uma doce ilusão
Mas e a vida ela é maravida
Ou é sofrimento
Ela é alegria Ou lament
O que é? O que é?
Meu irmão... Há qu
Que a vida da gente
É um nada no mund
É uma gota é um tempo
Que nem dá um segu
Há quem fale
Que é um divino mistério
É o sopro do criador
Numa atitude r
Você diz que é luta e prazer
Ele diz que a vida e v
Ela diz que melhor é morrer
Pois amada não é
E o verbo é sofrer...
Eu só sei que confio na moça
E na moça eu ponh
Somos nós que fazem
Como der ou puder ou quiser..
Sempre desejada por mais que est
Ninguém quer a morte
Só saúde e sorte...
E a pergunta roda e a cabeça agita
Fico com a pureza
Da resposta das cria
É a vida, é bonita e é bonita...
Gonzaguinha
“We are such stuff as dream are made on”
William Shakespeare
“Afinal, mestrado é pra se divertir”
Luís Fernando Ferreira
vi
SUMÁRIO
Agradecimentos................................................................................................viii
Indíce de Tabelas e Figuras..............................................................................x
Resumo ............................................................................................................xiii
Abstract ............................................................................................................xiv
1-Fundamentação teórica...................................................................................1
1.1 -Granuloma...............................................................................................1
1.2-Esquistossomose mansônica....................................................................2
1.2.1-Histórico...........................................................................................2
1.2.2-Ciclo evolutivo.................................................................................2
1.2.3-Patologia e manifestações clínicas...................................................4
1.2.4-Granuloma esquistossomótico.........................................................5
1.2.5-Células estrelares hepáticas..............................................................7
1.2.6- Antígeno solúvel do ovo (SEA)......................................................9
1.3-Moléculas de adesão..................................................................................11
1.4-Anticorpos monoclonais.............................................................................23
2-Objetivo geral...................................................................................................25
2.1-Metas específicas.......................................................................................25
3-Justificativa......................................................................................................26
4-Material e métodos............................................................................................27
5-Resultados..........................................................................................
6-Discussão..........................................................................................................56
7-Conclusão geral.........................................................
8-
...............31
.......................................64
Referências bibliográficas................................................................................65
vii
Agradecimentos
Aos meus orientadores Henrique Leonel Lenzi e José Mauro
Peralta pela confiança, paciência e incentivo. Pelo convívio e por todas
imento
de tudo,
À Tatiane Andrade Costa e ao Arnon Jurberg pela fundamental
confocal,
a
três pela amizade, especialmente, nos momentos de adversidade e
or toda a
o e pelos
essário
ima G.
À Rosinei Miranda Ferreira e Alexandra Corrêa Pereira, pelo
auxílio e fundamental suporte burocrático além de agradáveis
momentos de descontração.
as maravilhosas discussões e idéias que ajudaram no meu cresc
profissional, me despertando para o mundo científico. Acima
pela amizade e pela oportunidade inestimável de conhecer pessoas tão
incomparáveis como os senhores.
contribuição na realização desse trabalho. Ao Bernardo Miguel de
Oliveira Pascarelli pelo auxílio na aquisição de imagens ao
mas, sobretudo, pela assistência metodológica que foi de extrem
importância para obtenção de resultados satisfatórios. Agradeço a vocês
sufoco. Espero que essa agradável convivência se mantenha p
vida.
Ao Dr. Marcelo Pelajo-Machado pelo incentivo, atençã
ensinamentos, me proporcionando o auxílio técnico e teórico nec .
À equipe técnica do laboratório de Patologia: Luzia Fát
Caputo, Luciana Silva Souza, Luzia Helena Pereira Barros, Marcelo
Barbosa dos Santos, Alexandra Menezes dos Santos, Iolanda Deolinda
Pedro, Filomena de Fátima Cruz, Andréa Natividade
A todos do Laboratório de Patologia, que ajudaram na realização
desta dissertação, seja através de apoio técnico e teórico ou através de
palavras amigas e muito incentivo.
viii
Aos amigos do Laboratório de Sorologia da UFRJ, pelo auxílio e
nciaram os caminhos do mestrado.
o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq) e à Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), pelo suporte financeiro
duran
amizade desde a época de iniciação científica. Apoio de vocês sempre de
extrema importância.
Às minhas amigas da graduação: Adriana Machado Fróes, Flavia
Calmon e Luciana Pessoa, que me acompanharam e ajudaram desde o
início desta jornada e também vive
À Coordenação do Programa de Pós-graduação em Biologia
Parasitária do Instituto Oswaldo Cruz pela estrutura e condições
necessárias ao desenvolvimento deste trabalho.
A todos os colegas do curso de Pós-graduação em Biologia
Parasitária pela amizade e apoio durante esta jornada.
A
te a realização desse trabalho.
ix
Índice de Tabelas e Figuras
Tabela 1............................................................................................................................5
Formas clínicas da esquistossomose mansônica, observáveis em uma comunidade,
classificadas segundo as fases e a duração ou gravidade da doença.
Tabela 3..........................................................................................................................63
Expressão seqüencial de moléculas de adesão em granulomas hepáticos de Swiss
Webste
Figura 2...........................................................................................................................12
Princip
............................13
Proteín nstituintes das junções aderentes.
Figura
.................................................................................................................17
rografias eletrônicas de junções de oclusão.
Figura 6...........................................................................................................................19
Representação esquemática de junções com
igura 7...........................................................................................................................20
esenho esquemático das possibilidades de arranjo dos conéxons para formar os
canais de junções comunicantes.
Figura 8...........................................................................................................................29
Representação esquemática do sistema ARK.
Figura 9...........................................................................................................................32
A-Granuloma exsudativo inicial com zona central alargada, composta por
macrófagos e adensamentos neutrofílicos. A zona paracentral, em vermelho, está
começando a ser definida. B-Granuloma exsudativo bem configurado, exibindo as
três zonas características.
Figura 10.........................................................................................................................33
A-Granuloma exsudativo com metaplasia hematopoética na zona periférica. B-
Granuloma exsudativo-produtivo com claro zoneamento em três zonas.
Tabela 2..........................................................................................................................28
Anticorpos primários empregados para imunomarcação.
r infectados com Schistosoma mansoni
Figura 1.............................................................................................................................3
Ciclo evolutivo de Schistosoma mansoni.
ais famílias de moléculas de adesão.
Figura 3...............................................................................................
as co
4...........................................................................................................................15
Representação esquemática das proteínas integrais de membrana localizadas nas
junções de oclusão
Figura 5..........
Esquema e mic
unicantes.
F
D
x
igura 11.........................................................................................................................34
-Granuloma exsudativo-produtivo, destacando a camada central rica em
..........................35
-Granuloma produtivo, com zonas central, paracentral e definição de
estrito à camada interna.
vo,
to-fluorescência indireta, em microscopia
onfocal de varredura a laser (CLSM).
.................................................................38
arcação de anticorpos monoclonais anti-antígeno de ovo de S. mansoni em
igura 16........................................................................................................................40
igura 17........................................................................................................................41
igura 18........................................................................................................................42
igura 19........................................................................................................................43
..................................................................................45
xpressão in situ de conexina-43 em granulomas esquistossomóticos hepáticos.
..............................................................46
resença de células alongadas e/ou estreladas em granulomas esquistossomóticos
F
A
macrófagos; B-Granuloma exsudativo produtivo com células gigantes na camada
central e camada paracentral nítida, mais delgada (em vermelho).
Figura 12..............................................................................................
A
pseudocápsula fibrótica na periferia. B-Granuloma exsudativo, transicional para
produtivo, com material PAS positivo, derivado do ovo, r
Figura 13........................................................................................................................36
A e B -Granulomas produtivos portais com material PAS positivo, derivado de o
restrito à camada central.
Figura 14........................................................................................................................37
Aplicação do META para remoção de au
c
Figura 15.......................................................
M
granulomas esquistossomóticos hepáticos.
F
Marcação com anticorpo monoclonal G12 em granulomas esquistossomóticos
hepáticos.
F
Marcação com anticorpo monoclonal F3 em granulomas esquistossomóticos hepáticos.
F
Marcação com anticorpos monoclonais em ovos de S. mansoni.
F
Expressão in situ de Mac-3 em granulomas esquistossomóticos hepáticos.
Figura 20......................................
E
Figura 21..........................................................
P
hepáticos.
Figura 22........................................................................................................................47
Expressão in situ de conexina-43 no parênquima hepático de camundongos após 192
dias de infecção.
Figura 23........................................................................................................................49
Expressão in situ de ocludina em granulomas esquistossomóticos hepáticos.
xi
Figura 24........................................................................................................................50
Expressão in situ de ocludina no parênquima hepático de camundongos após 120
dias de infeccção.
Figura 25.........................................................................................................................51
Expressão in situ de claudina 1 em granulomas de fígados de camundongos com 120
dias de infecção.
Figura 26.........................................................................................................................52
igura 27........................................................................................................................53
.........................................................................54
xpressão in situ de pan-caderina no parênquima hepático de camundongos
..................................................................55
upla-marcação de moléculas de adesão e monoclonais anti-SEA em granulomas
Expressão in situ de claudina 4 em granulomas de fígados de camundongos com 60
dias de infecção.
F
Expressão in situ de pan-caderina em granulomas esquistossomóticos hepáticos.
Figura 28...............................................
E
esquistossomóticos após 60 dias de infeccção.
Figura 29......................................................
D
esquistossomóticos hepáticos.
xii
Resumo
lares, ao longo da progressão do granuloma, correlacionando-
,
190 dias de infecção), congelados em nitrogênio líquido e
ina e
-
aderina nos granulomas. As duas primeiras eram expressas tanto na periferia
us de intensidade variáveis nos diferentes estágios
o processo granulomatoso. Claudina 1 foi detectada apenas aos 120 dias de
fecção em células fibroblastoides, claudina 4, por outro lado, apareceu na
riferia do granuloma, apenas aos 60 dias de infecção. Com o uso de
nticorpos monoclonais anti SEA (soluble egg antigen= antígeno solúvel de
o), detectaram-se três padrões básicos de difusão antigênica: padrão 1 =
strito ao territorio da casca do ovo; padrão 2 = antígenos com uma
apacidade dispersora maior, que permeavam a região macrofágica central do
ranuloma, sem atingir a camada paracentral, padrão 3= com localizações em
struturas específicas do miracídio. Os resultados evidenciam que os
ntígenos liberados pelo miracídio apresentam padrões diferentes de difusão, e
ugerem ainda que os mecanismos de restrição antigênica começam a ocorrer
nos eventos iniciais de formação do granuloma. O efeito de barragem central
m principalmente, a participação de conexina-43 e de ocludina, além da
gocitose por macrófagos.
s Através de estudo seqüencial in situ analisou-se a difusão de antígeno
parasitários ovu
se o limite dessa dispersão com o fechamento do granuloma. Foram coletados
espécimes de fígados de camundongos Swiss Webster (sacrificados aos 45
0, 90, 120 e 6
submetidos à imunofluorescência para microscopia confocal, aplicando
anticorpos contra conexina-43, ocludina, claudinas 1 e 4, e pan-cader
monoclonais contra produtos de ovo de Schistosoma mansoni. Observou-se, já
a partir de 45 dias de infecção, a expressão de ocludina, conexina-43 e pan
c
como na parte central do granuloma, enquanto a última apresentava marcaçã
em todas as zonas, com gra
o
d
in
pe
a
ov
re
c
g
e
a
s
já
te
fa
xiii
xiv
Abstract
ith a sequential in situ study it was possible to analyze the dispersion of W
schistosomal egg products during granulome progression. The limit of this
diffusion was correlated with the granuloma closure. Livers of Swiss Webster
mice were examined at 45, 60, 90, 120 and 190 days after subcutaneous
infection with Schistosoma mansoni. Cryostat liver sections were analyzed by
indirect immunofluorescence and confocal microscopy using specific antibodies
against adhesion molecules (connexin-43, ocludin, claudins 1 and 4 and pan-
cadherin) and monoclonal antibodies against Schistosoma mansoni soluble egg
antigens (SEA). Before the complete organization of the granuloma, at 45 days
of infection, the expression of ocludin, connexin-43 and pan-cadherin were
observed. Ocludin and connexin-43 were expressed at the periphery and at the
central part of the granuloma, while pan-cadherin was observed with variable
intensity levels in all zones at the different stages of granulomatous process.
Claudin 1 was detected in fibroblastoid cells only at 120 days of infection, while
claudin 4 was observed at the periphery of the granuloma only at 60 days of
infection. Three different patterns were observed when monoclonal antibodies
against SEA were applied: pattern 1- attained to the egg shell territory; pattern
2- antigens with a greater diffusion pattern; pattern 3- localization in specific
miracidium structures. These results indicate that antigens released by the
miracidium present different diffusion patterns and it further demonstrates that
antigenic restriction starts in the very beginning of the granuloma formation.
Conexin-43 and ocludin together with the fagocitosis by macrophages are the
main components of the central barrier effect that occurs in the schistosomal
granulomatous inflammation.
1 – Fundamentação teórica
1.1 - Granuloma
A inflamação granulomatosa é uma das respostas imunes celulares mais
complexas, envolvendo o recrutamento e a ativação de uma série de células da
corrente sanguínea para o local da infecção. A maior parte dessas células é
componente do sistema fagocítico mononuclear que se agregam de forma
compacta e organizada em torno do agente agressor (Adams, 1976). A formação
desse agregado de monócitos/macrófagos gera um nódulo organóide que delimita
o agente granulomatogênico e apresenta estágios de maturação e involução
durante seu desenvolvimento, até que finalmente desaparece (Lenzi et al., 1991).
O granuloma é um tipo especial de reação inflamatória crônica, que na
maioria das vezes sucede a uma inflamação aguda não resolvida. Sua formação
está principalmente associada à proteção do hospedeiro contra altas
concentrações locais de substâncias agressoras de origem exógena ou endógena,
impedindo a difusão dessas para o sistema vascular (Williams & Williams, 1983;
Lenzi et al., 1991; Co et al., 2004). A inflamação granulomatosa é típica da
resposta tecidual provocada por infecções fúngicas, tuberculose, hanseníase,
esquistossomose e outras, bem como pela presença de materiais estranhos
(p.ex., sutura, sílica ou talco) (Co et al., 2004).
O dinamismo do processo granulomatoso é influenciado pela natureza do
agente etiológico, podendo esse ser intracelular, intra e extracelular ou
extracelular (Lenzi et al., 1991). O ovo de Schistosoma mansoni é um dos
melhores exemplos de agente granulomatogênico extracelular (Lenzi et al., 1991).
O granuloma esquistossomótico resulta de uma reação de hipersensibilidade
tardia, dependente de células T, em resposta a antígenos, principalmente
glicoproteínas ou glicoconjugados, secretados pelo ovo (Boros & Warren 1970,
Boros & Lukacs, 1992; Van de Vijver et al., 2006).
1
1.2 - Esquistossomose mansônica
1.2.1 - Histórico
Ovos de Schistosoma foram encontrados em múmias egípcias datando de
3500 a.C. No entanto, apenas em 1852 a doença foi descrita por Bilharz que
encontrou vermes adultos em múmias egípcias durante a realização de
necropsias, denominando-os de Distoma haematobia. Em 1858, o gênero foi
modificado para Schistosoma por Weinland, e a espécie passou a ser designada
por Schistosoma haematobium. Em 1902, Patrick Manson encontrou ovos com
espículas laterais em um paciente nas Antilhas, descrevendo uma infecção
causada por uma espécie diferente daquela descrita por Bilharz. Sambon, em
1907, denominou a nova espécie de Schistosoma mansoni em homenagem à
descrição feita por Manson. Essa mesma espécie teve sua presença confirmada
no Brasil em casos descritos por Pirajá da Silva, na Bahia, em 1908. Katzurada,
em 1904, também descreveu outra nova espécie que denominou de Schistosoma
japonicum (apud Pessoa & Martins, 1982).
1.2.2 - Ciclo Evolutivo do Schistosoma mansoni.
Os ovos maduros medem cerca de 150 μm de comprimento por 70 µm de
largura (Ashton et al., 2001) e são eliminados nas fezes do hospedeiro definitivo.
Eles eclodem ao entrarem em contato com a água doce, liberando miracídios. Tais
larvas penetram no hospedeiro intermediário: moluscos susceptíveis do gênero
Biomphalaria. No molusco, ocorrem transformações morfológicas e processos de
multiplicação assexuada, dando origem aos esporocistos primários. Esses sofrem
novas transformações, originando esporocistos secundários, que finalmente dão
origem às cercárias. Elas então saem do molusco, nadam até o encontro do
hospedeiro definitivo e penetram por sua pele. Durante a penetração, as cercárias
perdem a cauda e transformam-se em esquistossômulos. Esses inicialmente
migram na derme, passam para a corrente sanguínea e são levados aos pulmões.
Posteriormente, atingem o sistema porta intra-hepático, onde amadurecem. Os
vermes adultos (machos e fêmeas) acasalam-se e migram para as vênulas da
mucosa e submucosa intestinais, onde as fêmeas liberam seus ovos. Parte dos
2
ovos alcança o lúmen intestinal é excretada com as fezes, completando o ciclo do
parasito (Rey, 2001).
Figura 1. Ciclo evolutivo de Schistosoma mansoni. A, vermes adultos; B, paciente
eliminando ovos; C, eclosão de miracídio que vai infectar molusco do gênero
Biomphalaria; D, esporocistos; E, cercária (Rey, 2001).
3
1.2.3 - Patologia e manifestações clínicas
Na maioria dos casos, a infecção humana pelo S. mansoni é assintomática.
As possíveis manifestações clínicas da doença dependem de múltiplos fatores,
como a intensidade e o número de infecções, características do hospedeiro
(constituição genética, idade e estado nutricional) e, principalmente, o perfil
imunitário desenvolvido ao longo do tempo (Rey, 2001).
A esquistossomose é uma doença sistêmica que pode atingir diferentes
órgãos do hospedeiro, como fígado, intestino, pulmões, baço, pâncreas e outros.
As principais alterações patológicas observadas ocorrem na fase crônica. A
fibrose de Symmers e a formação de granuloma são as principais conseqüências
da infecção humana por S. mansoni (Raso & Bogliolo, 1970). A fibrose de
Symmers caracteriza-se pelo acúmulo intenso de tecido conjuntivo no espaço-
porta. O desenvolvimento dessa expansão fibrosa pode levar ao bloqueio da
circulação pré-sinuisoidal e, conseqüentemente, à hipertensão porta (Raso &
Bogliolo, 1970; Rey, 2001). Segundo Raso & Bogliolo (1970), o desenvolvimento
da fibrose de Symmers é desencadeada pela inflamação crônica granulomatosa
formada ao redor do ovo de S. mansoni.
4
Tabela 1. Formas clínicas da esquistossomose mansônica, observáveis em uma
comunidade, classificadas segundo as fases e a duração ou a gravidade da
doença (Rey, 2001)
Características da infecção
Fases Parasitológicas Clínicas Patológicas
Invasiva
Cercárias penetram
e esquistossômulos
migram
Dermatite
cercariana, seguida
ou não de febre e
tosse
Dermatite papular e reação
inflamatória no pulmão e
fígado
Aguda
Macho e fêmea
maduros iniciam a
oviposição
Quadro agudo, com
aspecto toxêmico,
aparece 2-3
semanas depois da
infecção
Reação hiperérgica a
produtos dos vermes jovens
e ovos
Crônica
inicial
Ovos postos e
excretados em
grande número;
carga parasitária
aumentando
Esquistossomose
intestinal
Acúmulo de ovos nos
tecidos, inflamação e
produção de granulomas;
hipergamaglobulinemia
Crônica
tardia
(grave)
Carga parasitária
crescente ou em
declínio; excreção
de ovos geralmente
diminui
Esquistossomose
hepatointestinal ou
hepatoesplênica
Fibrose local e nos órgãos
que recebem ovos vai
aumentando
progressivamente, levando à
hipertensão porta e
esplenomegalia com
circulação colateral
1.2.4 Granuloma esquistossomótico
Muitos dos ovos, liberados pelas fêmeas de S. mansoni, não conseguem
deixar o organismo e ficam retidos em vários órgãos (parede intestinal, fígado,
pâncreas, pulmões, etc), causando a inflamação granulomatosa (Raso & Bogliolo,
1970). O granuloma periovular hepático representa a lesão patológica típica da
infecção por S. mansoni, podendo haver progressão para fibrose e hipertensão
porta (Andrade & Warren, 1964).
5
Apesar dos granulomas periovulares serem danosos para o organismo,
essas lesões apresentam função importante na proteção do hospedeiro (Reis &
Andrade, 1987). Os ovos de S. mansoni e suas secreções fornecem um estímulo
antigênico contínuo para a resposta imunitária. A formação do granuloma leva ao
seqüestro desses antígenos, evitando danos aos tecidos (von Lichtenberg, 1964).
Vários estudos demonstraram que camundongos imunossuprimidos (Nude, SCID
e depletados de célula T) ou tolerizados contra ovos de S. mansoni eram
incapazes de montar uma resposta granulomatosa eficiente, apresentando reação
hepatotóxica aguda. Esse dano hepático foi relacionado à extensa difusão de
hepatotoxinas liberadas pelo ovo, e em muitos casos levava a morte prematura
dos camundongos (Byram & Von Lichtenberg, 1977; Byram et al., 1979; Doenhoff
et al., 1981; Dunne & Doenhoff, 1983; Fallon & Dunne, 1999).
Além de seu efeito protetor, o granuloma esquistossomótico auxilia também
no extravasamento de ovos viáveis para o lúmen intestinal, possibilitando sua
excreção com as fezes e, conseqüentemente, perpetuando o ciclo do parasito. A
participação da resposta inflamatória, nesse processo, pôde ser evidenciada em
estudos com camundongos imunocomprometidos, nos quais esses animais
apresentavam redução na eliminação de ovos do parasito (Doenhoff et al., 1986;
Doenhoff, 1997). Além disso, Torres & Pinto (1945) e Lenzi et al. (1987)
observaram que os ovos liberados para as fezes, em tatus (Euphractus
sexcinctus) e camundongos, estavam sempre envoltos por células inflamatórias,
especialmente macrófagos e eosinófilos, sugerindo então que a passagem dos
ovos de S. mansoni para o lúmen intestinal é dependente desses componentes
celulares.
Essa resposta do hospedeiro ao ovo de S. mansoni é um processo
dinâmico no qual participam uma série de células e moléculas de adesão (Jacobs
& Marck, 1998; Romanha, 1999, Lenzi et al., 2006). Inicialmente, células
mononucleares, neutrófilos e eosinófilos começam a envolver gradualmente o ovo
(fase reativa inicial). Depois, ocorre um acúmulo de leucócitos,
predominantemente neutrófilos e eosinófilos, entorno do ovo já maduro, levando à
formação de micro-abcesso (fase exsudativa). Aos poucos, esses leucócitos são
6
substituídos por células epitelióides e histiócitos, podendo ocorrer degeneração e
necrose de leucócitos remanescentes. Nessa etapa, pode haver ainda uma parcial
degeneração do miracídio. Às vezes, pode ocorrer a formação de células gigantes
ao redor do ovo (fase exsudativa-produtiva). Posteriormente, há uma ausência
total de leucócitos e o granuloma apresenta três zonas diferentes: uma zona
central de células epitelióides, histiócitos e células gigantes ocasionais; uma zona
paracentral de fibroblastos e fibrócitos, além de uma zona periférica de linfócitos,
histiócitos, plasmócitos e, algumas vezes, eosinófilos. Nas etapas mais avançadas
dessa fase, as células do interior e das zonas mais externas diminuem. Os
fibrócitos e as fibras de colágeno da camada intermediária tornam-se
predominantes (fase produtiva). Por fim, há uma redução no tamanho do ovo, e
sua casca vazia apresenta-se envolta por algumas fibras de colágeno, ocorrendo
total desintegração do ovo, com uma possível calcificação (fase involutiva) (Li
Hsü et al., 1972).
Baseados na classificação de Li Hsü et al. (1972), com algumas
modificações, Lenzi et al. (1998) dividiram a progressão da lesão granulomatosa
em dois estágios principais: o estágio pré-granulomatoso, que engloba a fase
reativa inicial e a exsudativa, e o estágio granulomatoso, que é composto pelas
fases exsudativa-produtiva, produtiva e involutiva. Em linhas gerais, observa-se
que inicialmente há um agregado celular desorganizado no estágio pré-
granulomatoso, que passa por um processo de organização nas fases exsudativa-
produtiva e produtiva, sendo seguido por uma etapa final de involução.
1.2.5 - Células estrelares hepáticas
As células estrelares hepáticas (HSCs) tem um papel importante na
patogênese de doenças hepáticas (Friedman, 2000). Esse tipo celular não-
parenquimal se localiza no espaço de Disse, região delimitada pelo pólo apical
(sinusoidal) dos hepatócitos e a parede dos sinusóides (Gressner, 1998). No
fígado normal, as HSCs são células quiescentes cujas principais funções são
armazenar vitamina A e remodelar constantemente a matriz extracelular (ECM).
Em condições patológicas, como a fibrose hepática, por exemplo, essas células se
7
tornam ativadas e sintetizam uma grande quantidade de componentes de ECM,
como colágeno, proteoglicanos e fibronectina (Sato et al., 2003).
Essas moléculas de ECM produzidas pelas HSCs ativadas são os
principais componentes matriciais do granuloma esquistossomótico. A secreção
simultânea de fatores específicos dos ovos e citocinas agem em células do tecido
conjuntivo, induzindo a secreção local de várias proteínas de ECM
(glicosaminoglicanos, glicoproteínas não colagênicas como a fibronectina, a
laminina e isotipos de colágeno) (Grimaud, 1987). Os granulomas hepáticos são
essencialmente compostos de proteoglicanos, fibronectina e colágenos. Colágeno
do tipo III, fibronectina e glicoproteínas não colagênicas são os principais
componentes das fibras reticulares, que são densamente depositadas em volta do
ovo de S.mansoni (Lenzi, 1991). A organização desses componentes sofre
alterações durante o processo evolutivo granulomatoso (Adnani, 1985; Grimaud,
1987). No início da formação do granuloma, a fibronectina produzida
majoritariamente por macrófagos está presente ao redor das células inflamatórias,
sendo o principal componente matricial, juntamente com heparansulfato, seguido
pela deposição de colágenos intersticiais do tipo I e III (Adnani, 1985; Grimaud,
1987; Lenzi et al., 1999).
Inicialmente, as fibras de colágeno se localizam apenas ao redor das
células secretórias internas (fibroblastos/miofibroblastos) e sua quantidade
aumenta progressivamente, envolvendo inteiramente a lesão (Junqueira et al.,
1986; Lenzi et al., 1999). As fibras de colágeno se arranjam em centros de
radiação, formando pontos de ancoragem ou unidades de crescimento, que
derivam centripetamente de HSCs e centrifugamente de resquícios de parede
vascular justa-ovular. Esses centros acabam confluindo, definindo o arcabouço
tridimensional da trama matricial dos granulomas, que caracteriza uma estrutura
fractal (Lenzi et al., 1999, 2006). A laminina e o colágeno tipo IV, no entanto, só
foram visualizados em vasos novos na periferia do granuloma (Parise et al., 1985;
Baptista & Andrade, 2005), revelados também pela expressão de fator de Von
Willibrand (Antígeno relacionado ao Fator VIII [Lenzi et al., 1988a]).
8
Células de músculo liso e fibroblastos ativados localmente são os principais
componentes celulares da fibrose periovular (Grimaud & Borojevic, 1986;
Borojevic et al., 1985). No interior do granuloma, os fibroblastos e os
miofibroblastos, que são provavelmente resultado da diferenciação de células
lisas, estão em íntimo contato com células inflamatórias, ao passo que ao redor do
granuloma, eles apenas delineiam o limite celular com o parênquima (Grimaud,
1987).
Atualmente, atribuem-se duas possíveis origens às células estrelares
hepáticas, que seriam as principais responsáveis pela fibrose hepática em
granuloma intrahepático (Barbosa et al., 1993; Chang et al., 2006; Lenzi et al.,
2006): uma mesenquimal [vimentina (+), desmina (+), α-actina de músculo-liso (+)]
e outra neural/neuroendócrina [positiva para: N-CAM, reelina, nestina,
neurotrofinas, sinaptofisina, proteína-fibrilar acídica] (Roskams et al., 2004;
Bataller & Brenner, 2005).
1.2.6 - Antígeno solúvel de ovo (SEA)
Os ovos maduros de S.mansoni retidos no “fígado” do hospedeiro secretam
uma variedade de produtos solúveis, que induzem a formação do granuloma
esquistossomótico. Eles são coletivamente denominados de antígeno solúvel de
ovo (SEA) (Boros & Warren, 1970; Hang et al., 1974). Esses antígenos extraídos
com salina tamponada de ovos viáveis homogeneizados contêm uma mistura
complexa de glicolipídeos e glicoproteínas. O SEA consiste em pelo menos 30
componentes com peso molecular variando entre 10 a > 200kDa (Lukacs & Boros,
1992; Stadecker et al., 2001; Van de Vijver et al., 2006). Sem a adição de
adjuvante, esse extrato bruto induziu a sensibilização e a formação de
hipersensibilidade tardia granulomatosa em camundongos (Boros & Warren,
1970).
A natureza antigênica das secreções ovulares de S. mansoni foi
inicialmente demonstrada em 1954, através de reação de precipitação periovular.
Os autores evidenciaram a formação de precipitados periovulares, após a
incubação dos ovos com soros de indivíduos esquistossomóticos. Essa reação era
9
observada em ovos viáveis, mas não em ovos desintegrados, sugerindo que
essas substâncias fossem secreções ativas do miracídio (Oliver-González, 1954).
As respostas imunológicas produzidas a partir desses antígenos, além da
formação da reação granulomatosa, envolvem processos como: adesão dos ovos
ao endotélio e migração celular (Ngaiza et al., 1993; File, 1995; Lejoly-Boisseau et
al., 1999) e proliferação e apoptose de células endoteliais, promovendo
angiogênese nos granulomas hepáticos (Loeffler et al., 2002; Van de Vijver et al.,
2006).
Devido à sua importância na imunopatologia da esquistossomose, muitos
estudos têm focado no isolamento e identificação dos componentes imunogênicos
dos ovos (Harn et al., 1989; Dunne et al., 1991; Lukacs & Boros, 1992; Ashton et
al., 2001; Stadecker et al., 2001; Asahi & Stadecker, 2003; Cass et al., 2007).
Dentre os componentes identificados, encontram-se a SM-p40, uma proteína de
40kDa que apresenta homologia com pequenas proteínas de choque térmico e α-
cristalina (Stadecker et al., 2001; Asahi & Stadecker, 2003). Fitzsimmons et al.
(2005) caracterizaram a proteína hepatotóxica omega-1 (Dunne et al., 1981, 1991)
como uma ribonuclease. Foram identificadas ainda, uma proteína antioxidante, a
tioredoxina peroxidase-1 (Sm-TPx-1) e uma glutationa S transferase, entre outras
(Asahi & Stadecker, 2003). No entanto, o estudo mais detalhado nesse assunto,
só foi publicado recentemente através de extensiva análise proteômica das
secreções produzidas pelos ovos de S. mansoni (Cass et al., 2007). Através da
Técnica Multidimensional para Identificação de Proteínas (MudPIT), os autores
analisaram o secretoma dos ovos do parasito, identificando 188 componentes.
Foram observadas proteínas envolvidas no balanço redox, no desenvolvimento e
sinalização de vias metabólicas, na modulação da resposta imunológica, além de
32 proteínas que ainda não haviam sido caracterizadas anteriormente.
10
1.3. Moléculas de adesão
A resposta imunitária de linfócitos T a antígenos e as atividades efetoras
dos leucócitos em resposta a inflamação requerem contato e adesão célula-célula
e célula-matriz extracelular. Essas conexões são promovidas por moléculas de
adesão celular (CAMs). Elas são elementos essenciais na inflamação, mediando
várias interações celulares (Abbas & Lichtman, 2003). Podem funcionar como
receptores, ativando vias intracelulares e participando em processos celulares
como migração, proliferação, diferenciação e morte celular (Rojas & Ahmed,
1999).
Há quatro classes principais de CAMs: caderinas, selectinas, integrinas e
moléculas da superfamília das imunoglobulinas (Igs). A adesão entre as células
envolvendo os dois primeiros grupos de moléculas é dependente de íons cálcio,
enquanto as interações mediadas pela superfamília das imunoglubulinas e
integrinas não têm essa dependência. As integrinas e moléculas da super família
das Igs compõem os principais mediadores da adesão de células à matriz
extracelular (SAMs =Substrate Adhesion Molecules), enquanto os outros tipos
participam da adesão célula-célula (Alberts et al., 2002; Kierszenbaum, 2002). Um
esquema mostrando a estrutura básica desses quatro grupos de moléculas pode
ser visualizado na figura 2.
11
Figura 2. Principais famílias de moléculas de adesão (Lodish et al., 2003).
As caderinas (Fig.3) são as principais moléculas de adesão célula-célula.
Elas são proteínas de membrana, com peso molecular de aproximadamente 130
kDa. Formam uma superfamília com mais de 40 membros diferentes,
desempenhando importante papel durante a diferenciação tecidual (Rojas &
Ahmed, 1999; Alberts et al., 2002). Tipicamente, elas interagem com outras
caderinas na superfície de células adjacentes. Seu domínio citoplasmático
funcional se liga a um grupo de proteínas chamadas cateninas, que estão
associadas aos filamentos intermediários do citoesqueleto. Esse complexo
conecta efetivamente o citoesqueleto às alterações que ocorrem fora da célula. As
principais representantes dessa classe são as caderinas E, P e N (as três
pertencem à subfamília de caderinas clássicas. Existem também as caderinas
desmossomais e as proto-caderinas) (Lodish et al., 2003).
12
Figura 3. Proteínas constituintes das junções aderentes. O domínio citosólico de caderinas-E se
liga direta ou indiretamente a múltiplas proteínas adaptadoras que conectam as junções a
filamentos de actina (F-actina) do esqueleto (Lodish et al., 2003).
As selectinas, glicoproteínas que se ligam a carboidrato, são importantes
nas interações entre leucócitos e endotélio e nas respostas inflamatórias. Os
leucócitos do sangue periférico se ligam às selectinas expressas no endotélio
ativado (Rojas & Ahmed, 1999). As selectinas são expressas, de modo diferente,
nos leucócitos, plaquetas e células endoteliais. Entre os integrantes dessa família,
as P-selectinas são encontradas em plaquetas ativadas e em células endoteliais e
medeiam a adesão a glicoproteína específicas nos leucócitos. As L-selectinas são
encontradas em leucócitos e estão envolvidas no endereçamento (“homing”) de
linfócitos aos linfonodos. As E-selectinas são expressas em células endoteliais
depois da ativação por citocinas e participam do processo de rolagem (“rolling”)
dos leucócitos (Abbas & Lichtman, 2003; Lodish et al., 2003).
No grupo da superfamília das imunoglobulinas, as moléculas de adesão
celular são constituídas por domínios “imunoglobulina-símiles”. Esse tipo de
domínio parece fornecer um suporte estrutural rígido para manter a conformação
tridimensional e conferir especificidade. Essas duas funções são essenciais tanto
para as imunoglobulinas como para as moléculas de adesão dessa superfamília.
Esse grupo inclui moléculas envolvidas no reconhecimento celular e antigênico
pelos linfócitos e outras células, sendo por isso, importantes nas interações da
célula T e no processo de migração (“homing”) durante a inflamação. Os membros
dessa família incluem as moléculas de MHC, ICAM-1, VCAM-1 e as co-
13
estimulatórias B7/1 e 2 (Freeman et al., 1993; Kierszenbaum, 2002; Abbas &
Lichtman, 2003).
As integrinas estão envolvidas tanto nas interações célula-célula (CAMs =
cellular adhesion molecules) como em ligações à matriz extracelular (SAMs =
substrate adhesion molecules). São glicoproteínas heterodiméricas compostas de
subunidades α e β associadas não covalentemente. Há em torno de 22
heterodímeros, consistindo de 17 formas de subunidades α e oito formas de
subunidades β. As integrinas são expressas por uma ampla variedade de células e
têm um papel importante na embriogênese, na resposta imune, na manutenção de
tecidos adultos e na oncogênese (Hynes, 1992; Kierszenbaum, 2002).
Geralmente, a adesão entre células é iniciada por uma ou mais das
moléculas de adesão anteriormente descritas. Para que haja integração entre as
células dos tecidos, são necessárias junções especializadas, que se formam pelo
agrupamento dessas moléculas. Apesar de centenas de interações mediadas
individualmente por CAMS serem suficientes para promover adesão entre as
células, as junções têm papel especial em conferir força, rigidez e estabilidade aos
tecidos. Os três principais tipos de junções são: junções de oclusão, junções de
ancoragem e junções comunicantes. As duas primeiras são fundamentais para
manter as células arranjadas em tecidos. Essas junções são organizadas em três
partes: as CAMs; filamentos do citoesqueleto e proteínas adaptadoras que
conectam as CAMS ou receptores de adesão a filamentos do citoesqueleto ou a
moléculas sinalizadoras. As junções comunicantes possibilitam a rápida difusão de
pequenas moléculas solúveis em água entre o citoplasma e células adjacentes.
São comuns em tecidos epiteliais e são muito diferentes estruturalmente das
junções ancorantes e de oclusão (Kierszenbaum, 2002; Niessen, 2007).
As junções de oclusão (Tight junctions =TJ) são regiões especializadas de
contato célula a célula no terminal apical da membrana lateral de células epiteliais.
Formam uma barreira contínua à permeabilidade entre células adjacentes, que
regulam o fluxo de moléculas através do espaço paracelular. Além disso, criam
uma delimitação na bicamada da membrana plasmática, separando a superfície
celular em dois domínios distintos, o apical e o basolateral, possibilitando que a
14
célula realize o transporte polarizado. Dessa forma, pode haver o movimento de
solutos através da via paracelular, restringindo a difusão intramembranosa de
lipídeos e proteínas entre os dois domínios (Gumbiner, 1993; Alberts et al., 2002).
Ao nível das junções de oclusão (TJ) são encontradas cinco tipos de proteinas
integrais: ocludina, claudinas, tricelulina, moléculas de adesão juncional
(JAMs), e Crumbs (Furuse et al., 1993, 1998a, b; Martin-Padura et al., 1998;
Schneeberger & Lynch, 2004, González-Mariscal et al., 2007) (Fig. 4).
Figura 4. Representação esquemática das proteínas integrais de membrana localizadas nas junções de
oclusão (González-Mariscal et al., 2007)
15
A ocludina foi o primeiro componente transmembranoso a ser identificado
nesses complexos juncionais e foi originalmente isolada de fígados de galinha.
Expressa-se predominantemente em células epiteliais e endoteliais (Furuse et al.,
1993). Embora ainda não se saiba exatamente as funções fisiológicas das ocludinas
nas junções de oclusão, sua expressão parece estar relacionada com a formação de
barreira em vários tecidos (Rubin et al., 1991; Hirase et al., 1997; Kevil et al., 1998).
As células endoteliais da barreira hematoencefálica possuem junções de oclusão com
baixa permeabilidade, enquanto as junções de tecidos não neuronais são
consideravelmente mais permeáveis (Rubin et al., 1991). Através de técnicas de
imunoblotting e imunoistoquímica, Hirase et al. (1997) associaram essa diferença na
permeabilidade das junções de oclusão com os níveis de expressão de ocludina. Os
autores demonstraram que a ocludina era expressa de maneira contínua e em maior
quantidade nas células do endotélio cerebral se comparadas às outras células
endoteliais. Em 1998, Kevil et al., observaram que células endoteliais arteriais
expressam 18 vezes mais ocludina do que as células endoteliais venosas, formando
uma barreira mais impermeável aos solutos.
As claudinas são uma família de proteínas transmembranosas, que
formam fibrilas lineares nas junções de oclusão. Existem pelo menos 24 membros
nessa família e sua distribuição nas células de órgãos e tecidos apresenta
padrões específicos (Kiuchi-Saishin et al., 2002; Reyes et al., 2002). Atualmente,
são considerados os principais componentes estruturais das junções de oclusão.
Além disso, a diferente combinação de claudinas em um determinado tecido é
responsável pela força, tamanho e especificidade das barreiras formadas pelas
junções de oclusão (Furuse et al., 1998b; Anderson et al., 2004; Furuse & Tsukita,
2006).
16
Figura 5. Esquema e micrografias eletrônicas de junções de oclusão
(Kierszenbaum, 2002).
As Moléculas de Adesão Juncional (Junctional Adhesion Molecules =
JAMs) são membros da superfamília das imunoglobulinas encontradas em
junções de oclusão de células endoteliais e epiteliais (Martin-Padura et al., 1998).
Apesar de não estarem envolvidas na formação das junções de oclusão, essas
proteínas parecem estar relacionadas com a regulação da permeabilidade
paracelular (Liu et al., 2000; Hirabayashi et al., 2003). Essas moléculas são
também encontradas em células que não formam junções de oclusão como os
leucócitos, contribuindo, nesse caso, na migração transendotelial (Ebnet et al.,
2004).
A tricelulina (Fig. 4) foi a mais recente das proteínas integrais a ser
identificada nas junções de oclusão (Tight Junction=TJ). Elas se concentram nas
fitas das TJs orientadas verticalmente nos contatos tricelulares. Essas proteínas
parecem exercer um papel crucial no mecanismo de barreira paracelular, já que
17
ao silenciadas por RNAi inibem seletivamente, por tamanho, o desenvolvimento da
Resistência Elétrica Transepitelial (TER = Transepithelial Electrical Resistance) no
tráfico paracelular de moléculas (Gonzáles-Mariscal et al., 2007).
Crumbs (Fig. 4) também são proteínas transmembranosas das junções de
oclusão. Foram identificadas inicialmente em Drosophila, como proteínas com 30
repetições de fator de crescimento epitelial-símile e quatro repetições de domínio-
G de laminina A-símile, em seu domínio extracelular. Em mamíferos, são
expressos três homólogos de Crumbs: CRB3, Sdt e PATJ (Gonzalez-Mariscal et
al., 2007).
As junções de ancoragem conectam as membranas laterais de células
epiteliais adjacentes e se localizam geralmente perto da superfície apical, bem
abaixo das junções de oclusão (Kierszenbaum, 2002). Essas junções são cruciais
nos eventos iniciais e na manutenção da adesão intercelular em diversos tecidos e
populações celulares (Gumbiner, 2005). As junções de ancoragem são formadas
por duas unidades adesivas básicas: o complexo nectina-afadina
e o complexo
caderina-catenina (Takeichi, 1995; Gumbiner, 1996; Nagafuchi, 2001).
O complexo caderina-catenina tem um papel importante tanto na adesão
celular e na transdução de sinais, como na manutenção da organização estrutural
e funcional de células e tecidos (Kemler, 1993; Hinck et al., 1994; Aberle et al.,
1996). A ligação adesiva específica desses complexos é conferida pelo
ectodomínio da caderina, que se liga a uma molécula idêntica na superfície de
uma célula adjacente (Leckband & Sivasankar, 2000). As caderinas se associam
ao citoesqueleto de actina através de ligação com as cateninas (Kemler, 1993).
As nectinas são membros da superfamília das Igs e seus domínios
citoplasmáticos interagem com proteínas que se ligam às actinas conhecidas
como afadinas (Takahashi et al., 1999). Tachibana et al. (2000) demonstraram que
os sistemas nectina-afadina e caderina-catenina interagem mutuamente,
provavelmente, através de interação entre afadina e alfa-catenina. A interação
desses sistemas serve de estrutura para as junções aderentes, fornecendo ainda
a força e especificidade adesiva necessárias para esses complexos juncionais
(Nagafuchi, 2001).
18
As junções comunicantes (gap junctions) (Fig 6) conectam
funcionalmente duas células adjacentes e constituem um denso agregado de
canais multiméricos, os conéxons, que são formados por conexinas (Alberts et al.,
2002). Esses canais conectam o citoplasma das células e fornecem um meio para
a troca de íons (K
+
e Ca
2+
), mensageiros secundários, e pequenos metabólitos,
possibilitando o acoplamento bioquímico e elétrico entre as células (Kumar &
Gilula, 1996; White & Paul, 1999; Bedner et al., 2006). As junções comunicantes
estão envolvidas em vários processos biológicos importantes, incluindo a rápida
transmissão de sinais elétricos para coordenar as contrações dos músculos
cardíacos e lisos e a sincronização de atividades das células em um agregado
celular (Meşe et al., 2007).
Figura 6. Representação esquemática de junções comunicantes (Kierzenbaum,
2002)
19
As conexinas (Fig. 7) são classificadas de acordo com suas massas
moleculares (p. ex., Cx43 representa uma conexina de 43kDa) ou agrupadas nos
subtipos α, β e γ, baseado na similaridade de suas seqüências (Cx43 se refere a
conexina α
1
, Cx32 é a conexina β
1
, etc). Atualmente, foram identificados 20 genes
de conexina no genoma de camundongos e 21 no de humanos (Söhl & Willecke,
2003). A maioria das células e tecidos expressa mais de um isotipo de conexinas.
Os conéxons podem ser compostos por seis subunidades idênticas de conexinas
(homomérico) ou por mais de um isotipo (heteromérico). Além disso, dois
conéxons idênticos podem formar um canal homotípico, ou um canal heterotípico
pode ser gerado por dois conéxons com diferentes isotipos de conexinas. A
diferente combinação de conexinas e conéxons forma canais com propriedades
funcionais únicas, incluindo a diferença no tamanho e carga das moléculas e íons
que podem transpassar o canal (Kumar & Gilula, 1996; Goodenough et al., 1996).
Figure 2. Schematic Drawing of Possible Arrangements of Connexons to Form
Gap Junction ChannelsConnexons consisting of six connexin subunits (red and
blue) are illustrated in various configurations. Connexons may be homomeric
(composed of six identical connexin subunits) or heteromeric (composed of more
than one species of connexins). Connexons associate end to end to form a double
Figura 7. Desenho esquemático das possibilidades de arranjo dos conéxons para formar os
canais das junções comunicantes (Kumar & Gilula, 1996).
20
Estudos recentes usando modelos de camundongos nocaute têm atribuído
às conexinas papel indispensável no desenvolvimento e função de uma série de
tecidos e órgãos (Willecke et al., 2002; Levin, 2007). Além disso, a etiologia de
várias doenças hereditárias, algumas doenças de pele, e outras desordens, como
surdez e catarata, foi relacionada à mutação em genes de conexina (White & Paul,
1999; Willeck et al., 2002; Wei et al., 2004). A associação dessas mutações com a
formação de patologias humanas demonstra que as conexinas e a comunicação
mediada por suas junções são cruciais para diversos processos fisiológicos.
A importância das moléculas de adesão na granulomatogênese foi
destacada por Langley & Boros (1995) ao demonstrarem que o bloqueio das
moléculas de adesão ICAM-I, LFA-I e VLA-4 resultava na inibição da secreção da
citocina IL-2 e IL-4 das células do baço e do granuloma de camundongos
infectados com S. mansoni. Tanto IL-2 como IL-4 são citocinas essenciais nos
eventos inicias da formação do granuloma de Schistosoma (Lukacs & Boros,
1993). Alguns trabalhos demonstraram que a formação do granuloma é mediada
por TNF-alfa em resposta a produção de ICAM-1 (Lucaks et al., 1994), e que a
expressão de ICAM-1 poderia ser induzida por antígenos de ovos de S. mansoni
(Ritter & McKerrow, 1996).
Ritter & McKerrow (1996) mostraram, por técnicas de imunohistoquímica,
que o recrutamento de células na formação do granuloma se correlaciona com a
indução da molécula de adesão de células endoteliais ICAM-1 e também com a
interação dessa molécula com sua integrina congnata LFA-1. Os autores
observaram que os níveis de expressão de ICAM-1 eram paralelos ao crescimento
celular do granuloma e diminuíam à medida que a celularidade do granuloma se
tornava menor devido a fibrose.
Romanha (1999) definiu a distribuição de várias moléculas de adesão nas
três camadas do granuloma exsudativo-produtivo, sendo a zona central
constituída, quase exclusivamente, por macrófagos positivos para CD44, MAC-1,
MAC-3, B7.2, ICAM-1 e V-CAM. A zona intermediária, por outro lado, apresentou
características fibroblastóides com células expressando B7.1 e B7.2. O perfil de
expressão de moléculas de adesão na camada periférica foi bem mais
21
heterogêneo, com eosinófilos positivos para CD18, CD11a e b, integrina β7, VLA-4
e -5, além de macrófagos CD44 positivos e outras células positivas para B7.1 e
CD28. O autor caracterizou o granuloma como uma estrutura organóide bem
definida, a qual depende principalmente da expressão de CD44 para formar um
centro de adesividade entre as células.
As moléculas de adesão atuam também na modulação do granuloma. El
Ridi et al. (1996) observaram a presença “in situ” de L-selectinas na superfície das
membranas do miracídio e sugeriram que a formação desse complexo poderia
impedir a liberação de antígenos do ovo e, conseqüentemente, participar da
modulação do granuloma hepático.
Além de integrinas, selectinas e moléculas da superfamília das
imunoglobulinas (El Ridi et al., 1996; Ritter & McKerrow 1996; Jacobs & Van Mark
1998, Jacobs et al., 1997a, b), outras moléculas de adesão também parecem
conectar as células do granuloma. Oloris et al. (2007), através de PCR em tempo
real e técnicas de imunoistoquímica, notaram que as células do granuloma eram
conectadas por junções comunicantes, formadas por conexina 43 (Cx43). Usando
o modelo de camundongos nocautes heterozigotos para Cx43, os autores
observaram ainda, que a deficiência na produção dessa proteína levava a um
decréscimo na proliferação de células do granuloma e, conseqüentemente, na
deposição de colágeno (Oloris et al., 2007).
Lenzi et al. (2006) demonstraram a presença “in situ” de conexina 43, pan-
caderina e ocludina atuando na adesão e comunicação entre as células e
fornecendo estabilidade ao granuloma hepático esquistossomótico. A presença
dessas moléculas estaria relacionada ao mecanismo de restrição dos antígenos
liberados pelos ovos ou no “fechamento (“closure”) do granuloma”.
O granuloma é geralmente uma estrutura avascular e acredita-se que esteja
sob a influência balanceada de estimulação ou inibição angiogênica,
principalmente nas lesões mais avançadas (Lenzi et al., 1988a,b). Eventualmente,
podem ser observados vasos na zona periférica do granuloma (Baptista &
Andrade, 2005). No entanto, apesar de ser uma estrutura destituída, ou com
poucos vasos sanguíneos, ocorrem no granuloma, fluxos de células e produtos
22
não celulares solúveis, tanto na direção do ovo como na direção oposta. Produtos
do miracídio costumam se difundir, em gradiente, do centro para a periferia. Por
outro lado, esses mesmos produtos, direta ou indiretamente, podem exercer um
efeito quimioatrator, atraindo células para o interior do granuloma. Sabe-se que as
moléculas de adesão têm papel fundamental na regulação desses fluxos, mas os
mecanismos que geram esse processo ainda não foram totalmente elucidados.
Também não se sabe ao certo se essas moléculas bloqueiam total ou
parcialmente a difusão de produtos do ovo para os tecidos adjacentes.
2.9-Anticorpos monoclonais
Os anticorpos monoclonais (AcMns.) têm sido produzidos contra antígenos
de vários parasitos patogênicos para o homem. A produção da maioria dos
AcMns. envolve a fusão de linfócitos B produtores de anticorpos com células de
mieloma, compondo dessa forma um híbrido celular secretor de um AcMn.
Diferente dos anticorpos policlonais que reconhecem uma série de epítopos de um
antígeno, os AcMns são específicos para um único epítopo. Dessa forma, muitas
pesquisas em AcMns têm se detido no estudo da relação parasito-hospedeiro
(Maddison, 1991; Nelson et al., 2000).
No estudo da esquistossomose, os anticorpos monoclonais têm sido
principalmente empregados na identificação e caracterização de antígenos de
superfície das espécies de Schistosoma (Harn et al., 1987; Vignali et al., 1990;
Toledo et al., 1994).
Os anticorpos monoclonais empregados nesse trabalho foram previamente
caracterizados por Peralta (1986). Foram utilizados seis anticorpos monoclonais
diferentes, um deles é do isotipo IgG1 (A8) e os outros cinco são do isotipo IgM
(B6, C1, C2, F3, G12) e provocam a reação de precipitação periovular (COPT).
Os Ac.Mn. A8 apresenta reatividade com cercárias, vermes adultos e ovos.
Ao ser testado em cortes de fígado de animais infectados, observa-se
fluorescência na parte interna do ovo, sugerindo reação com os miracídios.
Os Acs.Mns, B6, C1 e C2 exibem uma reação interna difusa em cortes de
vermes adultos, sem fluorescência ao nível de membrana. Em cortes de fígado,
23
ocorre intensificação da fluorescência das cascas dos ovos dos parasitos, assim
como uma reação com antígenos internos.
Os Acs.Mns. F3 e G12 mostram uma reação bem definida ao nível de tubo
digestivo de vermes adultos de S. mansoni. Em relação aos cortes de fígado,
formam padrões de fluorescência semelhantes aos encontrados com os Acs.Mns.
B6, C1 e C2.
24
2 – Objetivo Geral
Estudar a difusão de produtos do ovo ao longo da evolução da resposta
granulomatosa esquistossomótica e associar o limite dessa dispersão, com o
efeito barreira (restrição da difusão de produtos/antígenos ovulares) imposto pela
estrutura do granuloma, procurando entender como ocorre esse processo, quais
os níveis de dispersão de diferentes antígenos nas camadas dos granulomas e
quais seriam suas conseqüências.
Metas Específicas
1- Analisar a dispersão de antígenos parasitários ovulares diversos,
individualizados por anticorpos monoclonais, ao longo da progressão do
granuloma esquistossomótico;
2- Detectar a presença de moléculas de adesão de diversas famílias
(caderinas, conexinas, ocludinas) em diferentes estágios do processo
granulomatoso.
25
3 - Justificativa
O granuloma não é formado, teleologicamente, com o intuito de atacar o
agente granulomatogênico, mas visa proteger o hospedeiro dos produtos
antigênicos e/ou tóxicos liberados pelo miracídio do interior do ovo (Reis &
Andrade, 1987). Assim, os componentes do granuloma se arranjam de maneira tal
que há a formação de uma eficiente barreira, protegendo os tecidos adjacentes.
No entanto, os mecanismos de restrição desses antígenos [efeito barragem ou
fechamento (closure)], provocados por várias moléculas de adesão, ainda não
foram totalmente compreendidos.
Recentemente, foi mostrada a presença “in situ” de caderinas, ocludina e
conexina-43, atuando na adesão celular e na comunicação entre células hepáticas
do granuloma, fornecendo forte estabilidade a essas conexões (Lenzi et al., 2006).
Essas moléculas atuariam, juntamente com integrinas e moléculas da superfamília
das imunoglobulinas, na formação do efeito barragem, limitando assim a difusão
de produtos ovulares (Ritter & McKerrow, 1996; Jacobs & Van Marck 1998, Jacobs
et al., 1998). Apesar de detectada a existência dessas moléculas, não se sabe ao
certo como se comporta sua expressão ao longo da evolução do granuloma, nem
como os produtos antigênicos são limitados ou até onde eles podem se difundir,
ou ainda se alguns antígenos de baixo peso molecular, por exemplo, não são
eficientemente bloqueados.
Portanto, o objetivo desse projeto foi estudar como ocorre a difusão de
alguns antígenos ovulares ao longo da evolução da resposta granulomatosa. Para
isso foram utilizados anticorpos monoclonais específicos para produtos do ovo de
S. mansoni, na tentativa de melhor compreender como se comportam os fluxos
dos produtos antigênicos ovulares, do início da maturação até a involução do
granuloma, após a morte do miracídio. A utilização desses monoclonais auxiliou
ainda, na visualização do nível e dos locais de bloqueio formado pelo conjunto das
referidas moléculas de adesão, que contribuem para o efeito barreira ou o
fechamento do granuloma.
26
4 - Material e métodos
Infecção e necropsia
Foram empregados camundongos Swiss Webster, provenientes do
Centro de Criação de Animais de Laboratório (CECAL) da Fundação Oswaldo
Cruz. Os animais foram infectados percutaneamente, aos cinco dias de idade,
com 70 cercárias da cepa BH (Belo Horizonte) de S. mansoni. Após 45, 60, 90,
120 e 190 dias da infecção, os animais foram eutanasiados em câmera de
CO2 (3 animais/ponto). Fragmentos de fígados foram removidos e fixados em
Formalina-Millonig de Carson (Carson et al., 1973) para histologia ou foram
incluídos em OCT Tissue Tek® e congelados em nitrogênio líquido para estudo
imunohistológico.
Histologia
Os espécimes de fígado, fixados em Formalina-Millonig de Carson (Carson
et al., 1973), foram incluídos em parafina. Secções (5μm) foram coradas em
Hematoxilina & Eosina, Giemsa de Lennert (Lennert, 1978); Reticulina de Gomori;
Tricromática de Masson; PAS; PAS-Azul de Alciano pH 2,5 e 1,0; Sirius red pH
10,2 (para eosinófilos) (Dolber & Spach, 1993).
Imunofluorescência em cortes congelados.
Os fragmentos de fígado, em nitrogênio líquido, foram utilizados para
obtenção de cortes de cinco μm, em criostato. Após a obtenção dos cortes, as
lâminas foram fixadas em Acetona P.A. a – 20°C, durante 15 minutos e incubadas,
por 30 minutos, com solução bloqueadora, contendo soro fetal bovino (SFB),
albumina de soro bovino (BSA) 2,5% e leite em pó desnatado (Molico®) a 1%,
diluído em tampão fosfato (PBS) 0,01M em pH= 7,2. (Na
2
HPO
4
0,0075 M;
NaH
2
PO
4
0,0025 M; NaCl 0,15 M). Após a etapa de bloqueio, as lâminas foram
lavadas três vezes em banhos sucessivos (3, 5 e 7 minutos) em PBS e incubadas
com os anticorpos primários (conjugados ou não a FITC [tabela 2], diluídos em
27
PBS, mantidos em câmara úmida por uma hora, a 37°C ou durante a noite, a 4°C,
Foi realizada outra série de lavagens em PBS, e, em seguida, as lâminas foram
incubadas com o anticorpo secundário adequado. Após a imunomarcação, as
lâminas foram novamente lavadas, incubadas com DAPI (1:10.000) por 15
minutos e, então, contra-coradas com azul de Evans (1:10.000), por cinco
minutos. Em seguida, as lâminas foram montadas em glicerina, contendo p-
fenilenediamina, e guardadas em câmara úmida a 4°C. As lâminas
imunomarcadas foram analisadas em microscópio confocal de varredura a laser
LSM 510 META (Zeiss), empregando Ar488 e filtro BP505-550nm
(AlexaFluor488/FITC), ou laser HeNe543 e filtro LP560nm (AlexaFluor546/ azul de
Evans) e laser 405 e filtro LP420 (DAPI).
Tabela 2 - Anticorpos primários empregados para imunomarcação
Hospedeiro e especificidade isotipo Diluição Fabricante
Anti-moléculas de camundongo
Coelho anti- ocludina
IgG 1:80 Zymed
Coelho anti-pancaderina
IgG 1:150 Sigma
Coelho anti-conexina-43
Rato-anti-Mac3 conjugado a FITC
Rato-anti-CD44 conjugado a FITC
Anti-antígenos de ovo de S.mansoni*
Camundongo F3
Camundongo G12
Camundongo B6
Camundongo C2
Camundongo C1
Camundongo A8
IgG
IgG1
IgG2b
IgM
IgM
IgM
IgM
IgM
IgG
1:400
1:70
1:70
1:300
1:300
1:300
1:300
1:300
1:300
Sigma
Pharmingen
Pharmingen
Peralta,1986
Peralta,1986
Peralta,1986
Peralta,1986
Peralta,1986
Peralta,1986
* Os anticorpos monoclonais empregados foram previamente obtidos e caracterizados por
Peralta (1986). Para testá-los foi utilizado o animal research KIT (ARK) (DAKO).
28
Animal Research KIT (ARK) (DAKO)
O sistema ARK, com algumas modificações, foi utilizado nas
imunomarcações feitas com os anticorpos monoclonais de camundongo anti-
antígenos de ovo de S.mansoni. A aplicação desse sistema foi feita com a
finalidade de reduzir a reatividade de anticorpos secundários anti-camundongo
com imunoglobulinas endógenas, presentes no tecido de camundongo infectado
com S. mansoni. A técnica usada no ARK é baseada nas metodologias de avidina-
biotina (Figura 8)
Figura 8. Representação esquemática do sistema ARK.
Os procedimentos de fixação e bloqueio de sítios inespecíficos foram os
mesmos utilizados na imunofluorescência indireta. Para reduzir a atividade
endógena de ligação da avidina, em seções de fígado, foi utilizado o Biotin
Blocking System (DAKO).
Posteriormente foram aplicados os anticorpos biotinilados, preparados de
acordo com as especificações do fabricante. Os anticorpos primários, diluídos em
PBS, foram incubados com o reagente de biotinilação à temperatura ambiente por
15 minutos. Após essa etapa, foi adicionado o reagente de bloqueio e a mistura foi
incubada por cinco minutos à temperatura ambiente. Após incubação com os
29
anticorpos biotinilados, por 15 minutos, as lâminas foram lavadas duas vezes por
cinco minutos.
Na etapa seguinte, as lâminas foram incubadas com estreptavidina
conjugada a FITC (1:300) por 15 minutos, à temperatura ambiente. Em seguida,
foi realizada nova série de lavagens e as lâminas incubadas com DAPI e contra-
coradas com azul de Evans, como descrito anteriormente. Após, as lâminas foram
montadas em glicerina, contendo p-fenilenediamina e guardadas em câmara
úmida a 4°C.
Imunomarcação dupla
Para melhor relacionar a presença de moléculas de adesão com a difusão
antigênica, lâminas, contendo espécimes de fígado de camundongos com 60 dias
de infecção, foram imunomarcadas duplamente com anticorpos monoclonais anti-
SEA e anticorpos anti-moléculas de adesão. O kit ARK foi utilizado para revelação
dos antígenos de ovo de S.mansoni, como descrito anteriormente. Em seguida, foi
realizada uma série de lavagens com PBS e as lâminas foram incubadas durante
a noite a 4°C, com anticorpos contra as moléculas de adesão conexina-43,
ocludina e pan-caderina. Após a série de lavagens com PBS, as lâminas foram
incubadas com anti-IgG de coelho, conjugada a AlexaFluor 546 (Molecular
Probes), por uma hora a 37°C. Em seguida, as lâminas foram montadas em
glicerina, contendo p-fenilenediamina e guardadas em câmara úmida a 4°C. As
lâminas imunomarcadas foram analisadas em microscópio confocal de varredura a
laser LSM 510-META (Zeiss), empregando Ar 488 e filtro BP505-550nm
(AlexaFluor 488/FITC) e o laser HeNe 543 e filtro LP560nm (AlexaFluor 546).
30
31
6 – Resultados
Histopatologia dos granulomas hepáticos
O estudo histopatológico dos granulomas hepáticos mostrou aspectos já
tradicionalmente bem descritos e conhecidos, revelando granulomas em diferentes
fases evolutivas, chegando até involução parcial. Para contextualizar melhor o
estudo imunohistológico, procurou-se exemplificar exsudativo inicial, exsudativo
bem configurado, exsudativo com metaplasia hematopoética na zona externa,
ocorrência de clara definição das três zonas (central, paracentral e periférica),
granulomas produtivos, e granulomas corados com Azul de Alciano-PAS, em pH
1, mostrando a difusão antigênica restrita à camada central (Figs 9 – 13)
Fig 9. A- Granuloma exsudativo inicial com zona central alargada, composta por
macrófagos e adensamentos neutrofílicos. A zona paracentral, em vermelho, está
começando a ser definida. B-Granuloma exsudativo bem configurado, exibindo as
três zonas cracterísticas (A –picrosirius - 95 dias de infecção Objetiva-20x; B-PAS -
192 dias de infecção Objetiva-20x).
32
Fig 10. A-Granuloma exsudativo com metaplasia hematopoética na zona
periférica. B-Granuloma exsudativo-produtivo com claro zoneamento em três
zonas (95 dias de infecção; A-PAS Objetiva-40x; B-Reticulina de Gomori
objetiva 40x).
33
Fig 11.A-Granuloma exsudativo-produtivo, destacando a camada central rica em macrófagos;
B-Granuloma exsudativo produtivo com células gigantes na camada central e camada
paracentral nítida, mais delgada (em vermelho) (95 dias de infecção objetiva -40x ; A-HE;
objetiva- 40x).
34
Fig 12. A- Granuloma produtivo, com zonas central, paracentral e definição de pseudocápsula
fibrótica na periferia. B-Granuloma exsudativo, transicional para produtivo, com material PAS
positivo, derivado do ovo, restrito à camada interna (95 dias de infecção; A-Picrosirius objetiva 20x;
B-Azul de Alciano-PAS pH 1,0 objetiva-40x
).
35
Fig 13. A e B -Granulomas produtivos portais com material PAS positivo, derivado de ovo,
restrito à camada central (192 dias de infecção objetiva -20x; Azul de Alciano-PAS, pH 1,0
objetiva-20x).
36
Anticorpos monoclonais anti-antígeno de ovo de S.mansoni
Os ovos de S.mansoni, assim como a hemozoína (pigmento
esquistossomótico), são autofluorescentes. Para eliminar esse efeito foi usado
o detector META, quando necessário, possibilitando uma melhor análise dos
resultados (Figura 14 A-D). Além disso, inicialmente os primeiros testes foram
realizados com alexa 488 anti-IgM e anti-IgG de camundongo como anticorpos
secundários, porém os controles apresentaram reação com imunoglobulinas
endógenas do tecido, particularmente com plasmócitos (Figs.15 A,D). Por isso,
passou-se, posteriormente, a utilizar o kit ARK.
B
A
D
C
Figura 14. Aplicação do META para remoção de auto-fluorescência. Imunofluorescência
indireta, em microscopia confocal de varredura a laser (CLSM).(A) Anticorpo A8 sem META.
(B) Anticorpo A8 com META (C) Anticorpo F3 sem META. (D) Anticorpo F3 com META.
37
Diferentes padrões de reatividade para produtos ovulares de
Schistosoma mansoni foram observados quando espécimes de fígado foram
analisados com os anticorpos monoclonais (Peralta, 1986), através de
imunofluorescência indireta (Figs 15 A-C). Os padrões básicos observados
foram os seguintes: (a) difusão periovular de intensidade variável (Fig. 15 A);
(b) restrito ao território do ovo ou aderido interna e/ou externamente à casca
(Fig. 15 B); (c) com localizações em estruturas específicas do miracídio (Fig. 15
C).
A
B
C D
Figura 15. Marcação de anticorpos monoclonais anti-antígeno de ovo de S.mansoni em
granulomas esquistossomóticos hepáticos. Imunofluorescência indireta, em microscopia
confocal de varredura a laser (CLSM).(A) Anticorpo G12 com padrão de difusão. (B)
Anticorpo C2 com marcação restrita ao território do ovo, ou aderido interna e/ou
externamente à casca. (C) Anticorpo A8 com localizações em estruturas específicas do
miracídio. (D) Controle do anticorpo secundário, em verde auto-fluorescência da casca do
ovo de S.mansoni. Em azul evidenciação dos núcleos por DAPI, e em vermelho azul de
evans.
38
Os Acs. Mns, G12 (Fig.16 A-D) e F3 (Fig. 17 A-C) apresentaram um
padrão granular de difusão, além de marcação na parte interna do ovo. Foi
verificada fluorescência na região macrofágica central do granuloma, com
observação de difusão antigênica entre as células dessa zona. Esse padrão
granular pôde ser observado já a partir de 45 dias de infecção em granulomas
ainda em formação e se manteve até os 90 dias de infecção, sendo apenas
observado em ovos maduros e íntegros. Esse padrão de difusão em reações
pré-granulomatosas era granular e bastante disperso (Fig. 16 A; 17 A). A
medida que os granulomas se organizavam a difusão ficava restrita a camada
periovular ou central formando adensamentos de intensidade variável (Fig 16.
B; 17. B, C) . A partir de 120 dias de infecção em diante nenhum tipo de
secreção ovular foi observado (Fig. 16 D). A difusão antigênica expressa pelos
dois anticorpos referidos se restringiu, em todos os pontos de infecção, à
camada central ou periovular do granuloma.
39
A
B
D
C
Figura 16. Marcação com anticorpo monoclonal G12 em granulomas esquistossomóticos
hepáticos. Imunofluorescência indireta, em microscopia confocal de varredura a laser
(CLSM). (A) 45 dias de infecção (B) 60 dias de infecção com META (C) 90 dias de infecção
(D) 120 dias de infecção.
40
Figura 17. Marcação com anticorpo monoclonal F3 em granulomas esquistossomóticos
hepáticos. Imunofluorescência indireta, em microscopia confocal de varredura a laser (CLSM).
(A) 45 dias de infecção (B) 60 dias de infecção (C) 90 dias de infecção (D) controle kit ARK.
O anticorpo C1 apresentou marcação na periferia do sistema nervoso do
miracídio, exibindo também depósitos granulares na parte posterior do
miracídio sem possibilitar a definição de estrutura-alvo (Fig 18 A). O anticorpo
B6, excetuando a parte central, recobre toda a superfície do miracídio, de
forma homogênea, também sem definição de estruturas-alvo (Fig. 18 B). O Ac
Mn. C2 apresentou aspecto globular ou flocoso aderido na face externa e
interna da casca (Fig. 18 C). Ac. Mn. A8 apresentou fluorescência na parte
interna dos ovos, sugerindo uma reação com a musculatura subtegumentar dos
miracídios (Fig.18 D).
C
E
D
A
B
D
41
A
B
C D
Figura 18. Marcação com anticorpos monoclonais em ovos de S. mansoni.
Imunofluorescência indireta, em microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). (A) AcMn
C1 (B) AcMn B6 (C) AcMn C2 com Meta (D) AcMn A8.
42
Expressão de moléculas de adesão em granuloma esquistossómotico
Mac-3
Este marcador foi detectado em macrófagos constituintes da zona
central de granulomas exsudativo-produtivos (60 e 90 dias) (Figs 19 A,C). Em
granulomas produtivos, incluindo aos 120 dias, a expressão de Mac-3 foi
intensamente positiva em células fibroblastóides (Figs. 19 B,D). Não ocorreu
expressão na região externa dos granulomas.
B
A
C D
Figura 19. Expressão in situ de Mac-3 em granulomas esquistossomóticos hepáticos.
Imunofluorescência indireta, em microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). (A)
Granuloma exsudativo-produtivo com macrófagos positivos na região central (60 dias).(B)
Granuloma produtivo com positividade de células fibroblastóides na região paracentral (60
dias). (C) Granuloma exsudativo-produtivo com positividade na camada central (90 dias). (D)
Granuloma produtivo com células fibroblastóides intensamente positivas (120 dias).
43
Conexina-43
Esse tipo de molécula foi encontrado principalmente na região central dos
granulomas, sob um padrão punctiforme típico, expresso por um par de
pontos adjacentes (Fig. 20 -A,D), que começou a ser detectado em animais
com 45 dias de infecção. A medida que a infecção avançava e os granulomas
tendiam a ser mais produtivos, a conexina passou a apresentar um padrão
híbrido, compreendido pelo padrão punctiforme referido, adicionado a um novo
padrão, caracterizado pela expressão citoplasmática da conexina. Esse
padrão manifestava-se mais em células fibroblastóides dos granulomas, a partir
de 120 dias de infecção, principalmente nas células localizadas mais
perifericamente (Figs. 20 E; 21 A-C).
B
C D
44
45
Figura 20. Expressão in situ de conexina-43 em granulomas esquistossomóticos
hepáticos. Imunofluorescência indireta, em microscopia confocal de varredura a
laser (CLSM).(A) Padrão punctiforme na região central (45 dias de infecção). (B)
Padrão punctiforme na periferia dos granulomas (C) Granuloma exsudativo-
produtivo (60 dias de infecção). (D) Granuloma com padrão puntiforme de conexina-
43 (90 dias de infecção).(E) Padrão citoplasmático de expressão de conexina-43 na
periferia de granuloma (120 dias de infecção). (F) Granuloma apresentando padrão
de marcação citoplasmático (seta)
e o padrão puntiforme (cabeça de seta) (190
dias de infecção).
A conexina, a partir de 120, com exacerbação aos 190 dias de infecção,
foi intensa nas células estrelares hepáticas (HSCs) (Figs. 20 E,F; 21 A-C e 22
A,B). Essas células se posicionavam, às vezes, na periferia de alguns
granulomas, dando a impressão de penetrarem em sua estrutura (Fig 21 A-C).
A
B
C D
Figura 21. Presença de células alongadas e/ou estreladas em granulomas esquistossomóticos hepáticos.
Imunofluorescência indireta, em microscopia confocal de varredura a laser (CLSM).(A) Células com
marcação citoplasmástica de conexina-43 na periferia de granulomas (192 dias de infecção). (B) Área
destacada em A em maior aumento, célula estrelada (seta) marcada com conexina-43. (C) Periferia de
granuloma com presença de células estreladas . (D) Controle com secundário anti-coelho, hemozoína
(autofluorescente em verde, evidenciada com as setas).
46
Figura 22. Expressão in situ de conexina-43 no parênquima hepático de camundongos após 192 dias de infecção.
Imunofluorescência indireta, em microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) . Células estrelares hepáticas.
47
Ocludina
Aos 45 dias, houve fraca expressão de ocludina no interior dos granulomas
exsudativo-produtivos (Fig. 23 A). Com 60 dias de infecção, a ocludina passou
a expressar-se intensamente na região central (Fig. 23 C). Posteriormente, a
partir de 90 dias, passou a localizar-se mais perifericamente, em granulomas
produtivos mantendo-se, contudo presente, em menor intensidade, na região
central (Figs. 23 D-F).
A ocludina marcou todo o desenho da árvore biliar ao nível do parênquima
hepático (Fig. 24 A, B) e, eventualmente, resíduo de dúctulos foram vistos na
zona periférica de granulomas exsudativo-produtivos (Fig. 23 B).
48
A
A
B
C
C
D
E
E
F
Figura 23. Expressão in situ de ocludina em granulomas esquistossomóticos
hepáticos. Imunofluorescência indireta, em microscopia confocal de varredura a
laser (CLSM). (A) Granuloma exsudativo-produtivo fracamente marcado com
ocludina (45 dias de infecção). (B) Periferia de granuloma exsudativo-produtivo
com incorporação de dúctulo biliar (Seta). (C) Expressão periovular de ocludina
(60 dias de infecção). (D) Periferia de granuloma produtivo fortemente positiva (90
dias). (E, F) Granuloma produtivo (120 dias e 192 dias) DB-ductos biliares
49
A
B
Figura 24. Expressão in situ de ocludina no parênquima hepático de camundongos após 120 dias de
infecção. Imunofluorescência indireta, em microscopia confocal de varredura a laser (CLSM).
Claudinas 1 e 4
A molécula de claudina-1, em granuloma, não foi detectada aos 60 e 90
dias de infecção, aparecendo somente aos 120 dias. Expressava-se no
citoplasma de células fibroblastóides, especialmente em granulomas produtivos
(Fig. 25 A) e involutivos iniciais (Fig. 25 B).
50
A
B
A Claudina-4, por sua vez, somente foi positiva aos 60 dias de infecção, sendo
negativa aos 90 e 120 dias. Aparecia em agregados celulares na periferia de
granulomas, em células isoladas em sinusóides ou em pequenas células na
zona paracentral de granulomas (Figs. 26 A, B).
Figura 25. Expressão in situ de claudina 1 em granulomas de fígados de camundongos com
120 dias de infecção. Imunofluorescência indireta, em microscopia confocal de varredura a
laser (CLSM). A – Granuloma produtivo. B- Granulomas involutivos iniciais.
51
A
B
Pan-caderina
Figura 26. Expressão in situ de claudina 4 em granulomas de fígados de camundongos com 60
dias de infecção. Imunofluorescência indireta em microscopia confocal de varredura a laser
(CLSM).
A marcação de pan-caderina foi bastante intensa já aos 45 dias de
infecção, em granulomas ainda em estruturação. A expressão ocorreu em
todas as camadas dos granulomas ou variava de intensidade de granuloma
para granuloma, sendo, às vezes, mais intensa no centro ou na periferia, ou
então se distribuía de forma mais ou menos homogênea por toda a área do
granuloma (Fig 27 A-E).
A expressão na periferia de hepatócitos conferiu um padrão em mosaico ao
parênquima hepático (Fig. 28 A, B). Ás vezes se expressava nos sinusóides,
sem definir estruturas (endotélio?).
52
B
A
D
C
D
F
E
F
Figura 27. Expressão in situ de pan-caderina em granulomas esquistossomóticos
hepáticos. Imunofluorescência indireta em microscopia confocal de varredura a
laser (CLSM). (A) células positivas na periferia e na parte central do granuloma (45
dias). (B) Forte positividade em todas as camadas de granulomas aos 60 dias de
infecção. (C) Aos 90 dias, granuloma produtivo fibrótico com forte positividade
(vermelho) e abaixo granuloma exsudativo-produtivo com expressão mais delicada
nas zonas central e periférica (vermelho). (D) Granuloma produtivo apresentando
forte postividade na periferia (vermelho). (E) Granuloma aos 192 dias de infecção.
(F) Controle anti-coellho alexa 546, omissão do anticorpo primário.
53
Imunomarcação dupla
B
A
Figura 28. Expressão in situ de pan-caderina no parênquima hepático de camundongo esquistossomótico após 60 dias
de infecção. Imunofluorescência indireta em microscopia confocal de varredura a laser (CLSM).
Para melhor analisar o limite da difusão de antígenos com o efeito
barreira ou de fechamento (closure) do granuloma, foram feitas marcações
duplas com os monoclonais F3 e G12 e as diferentes moléculas de adesão, no
ponto de 60 dias de infecção.
Como observado anteriormente, os anticorpos monoclonais reagiram
com produtos que se difundem apenas até o limite externo da camada central
do granuloma, atingindo o bordo interno da camada paracentral. A partir desse
local, começou-se a detectar a expressão punctiforme de conexina-43 (Figs. 29
A,B) e ocludina (Figs. 29 C). A marcação de pan-caderina, por sua vez, foi
positiva nas três zonas do granuloma (Fig. 29 D).
54
A
B
D
C
Figura 29. Dupla marcação de moléculas de adesão e monoclonais anti-SEA em granulomas
esquistossomóticos hepáticos. Imunofluorescência indireta em microscopia confocal de varredura a laser
(CLSM). (A) granuloma exsudativo-produtivo, conexina-43(vermelho) na região paracentral e difusão na
zona central do AcMn G12 (verde). (B) Difusão de F3 (verde) delimitada pela expressão de conexina-43
(vermelho) na zona paracentral. (C) Granuloma G12 (verde) e ocludina (vermelho). (D) Granuloma
exsudativo-produtivo F3 (verde) pancaderina (vermelho)
55
7- Discussão
O granuloma esquistossomótico é uma estrutura híbrida composta por
células e moléculas do hospedeiro, além do ovo do parasito e seus
componentes, funcionando como uma interface entre dois organismos
filogeneticamente diferentes (Lenzi et al., 1998). A sua formação está
principalmente associada à proteção do hospedeiro, na tentativa de evitar que
substâncias tóxicas liberadas pelo ovo do helminto atinjam o parênquima do
fígado, causando necrose hepática (Byram & Von Licthenberg, 1977; Dunne &
Doenhoff, 1983). Nesse trabalho, demonstrou-se, com a utilização de seis
monoclonais, específicos para componentes do ovo de S. mansoni, que
produtos do miracídio apresentam três padrões básicos de localização no
interior de granuloma: difusão extra-ovo, restritos ao território circunscrito pela
casca e localizados em estruturas específicas do miracídio. Pelo lado do
hospedeiro, verificou-se a expressão dinâmica, com modulação no transcurso
da infecção, de três tipos básicos de moléculas adesivas: moléculas de junções
comunicantes (conexina-43), junções oclusivas (ocludina e claudina 1 e 4) e de
junções aderentes (pancaderinas).
Como essa resposta inflamatória do hospedeiro é formada contra antígenos
secretados pelo ovo do S.mansoni, grande parte dos trabalhos tem focado na
imunogenicidade e na caracterização dessas substâncias ovulares (Dunne et
al., 1981, 1991; Lukacs & Boros, 1992; Ashton et al. 2001; Cass et al., 2007).
No entanto, a sua dispersão no interior do granuloma, e os mecanismos
responsáveis por sua retenção, ainda não foram estudados.
Os anticorpos monoclonais (AcMns.), aqui utilizados, foram produzidos
contra componentes do antígeno solúvel do ovo (SEA=Soluble Egg Antigens),
com intuito diagnóstico (Peralta, 1986). Através deles, estudou-se a dinâmica
de difusão dos produtos secretados pelo ovo do parasito na dinâmica espaço-
temporal, confrontando com o estudo da expressão das moléculas de adesão
referidas. Tal abordagem foi feita através de estudo seqüencial onde foi
possível observar os eventos iniciais de formação do granuloma até seu
processo de involução e desaparecimento, após a morte do agente
granulomatogênico (miracídio).
56
Inicialmente, verificaram-se diferentes padrões de reatividade dos
anticorpos monoclonais aplicados, exemplificando a complexidade da
composição do SEA, observando-se reatividade não só contra componentes
estruturais do miracídio, mas contra componentes extravasados para fora da
casca. O anticorpo A8 apresentou reconhecimento de estruturas musculares
presentes no miracídio, enquanto outros anticorpos se ligaram ao miracídio,
sem definição de estruturas, ou aderiram-se na face interna ou externa da
casca, ou difundiram-se para a vizinhança do ovo. A variedade de
componentes presentes no SEA tem sido bastante estudada (Harn et al., 1989;
Dunne et al., 1991; Lukacs & Boros, 1992; Ashton et al., 2001; Stadecker et al.,
2001; Asahi & Stadecker, 2003; Cass et al., 2007). Em 2007, Cass et al.
identificaram 188 proteínas presentes no secretoma do ovo de S.mansoni.
Além disso, Ashton et al., em 2001, observaram que o conteúdo protéico
presente no SEA era diferente do identificado nas secreções ovulares.
Atualmente, não se sabe o papel dessas proteínas não-secretadas na
formação do granuloma, no entanto, a aplicação desses monoclonais, que
reconheceram proteínas estruturais, poderia servir, como já está sendo feito
pelos pesquisadores do Laboratório de Patologia, em colaboração com Dr.
Peralta, para o estudo da estrutura e desenvolvimento do miracídio. Com a
morte espontânea do miracídio no interior do granuloma, esses componentes
estruturais podem se difundir e participar nos processos de involução do
granuloma.
Através do estudo seqüencial da infecção de S.mansoni em camundongos,
observaram-se os eventos iniciais de secreção de alguns antígenos até o seu
desaparecimento. Dois anticorpos monoclonais revelaram componentes
ovulares que se dispersavam no início da formação do granuloma. Aos 45 dias
de infecção, ainda na fase pré-granulomatosa, ocorria extenso espalhamento
de antígeno por entre as células, que diminui no transcurso da infecção. Em
granulomas exsudativos-produtivos, a detecção desses antígenos restringia-se
à camada central do granuloma, desaparecendo totalmente aos 120 dias de
infecção. Portanto, é provável que a extensão máxima de dispersão desses
produtos ocorra na fase pré-granulomatosa e, à medida que ocorre o
orquestramento de células e moléculas para a organização completa do
granuloma, esses antígenos passam a ficar bloqueados na camada central e
57
vão aos poucos sendo totalmente digeridos pelos macrófagos presentes nessa
camada. Os antígenos de difusão intragranulomatosa, revelados pelos
anticorpos monoclonais F3 e G12 (ambos são IgM) provavelmente fazem parte
dos antígenos ovulares responsáveis pelas reações de precipitação
periovulares (Circumoval Precipitin Test = COPT) (Peralta, 1986). O anticorpo
C2, que revelou antígenos ovulares com padrão flocoso, aderido à parte interna
e externa da casca, também correspondeu a antígenos participantes de COPT
(Peralta, 1986). Não houve relação da capacidade de dispersão dos antígenos
ovulares com seus respectivos pesos moleculares. Isto é, tanto os anticorpos
que se ligaram apenas com estruturas do miracídio (sem difusão) (B6, C1 e
C2), como aqueles que revelaram antígenos de dispersão periovular (F3 e
G12), em reação imunoenzimática em membrana de nitrocelulose (Western
Blot), reagiram, de forma similar, com antígenos ovulares por todo o gel,
revelando bandas desde mais de 200 kDa, até bandas de 43 kDa (Peralta,
1986).
Outro assunto abordado nesse trabalho se relaciona com os mecanismos
de barreira à difusão dos produtos ovulares. Em 2006, Lenzi et al.,
evidenciaram a presença de ocludina, conexina-43 e pan-caderina em
granulomas esquistossomóticos murinos, além das várias outras moléculas de
adesão já descritas em granulomas. Sugeriram que a presença dessas
moléculas estaria relacionada com o fechamento (closure) do granuloma. De
fato, constatou-se que, em granulomas bem constituídos, os antígenos nunca
ultrapassavam a camada central ou periovular. Frente ao limitado número de
monoclonais estudados, faz-se importante ressaltar, que é possível que
antígenos com baixos pesos moleculares e alta solubilidade possam atingir a
parte externa do granuloma. Esses antígenos porém, não seriam os principais
agentes hepatotóxicos dessa infecção, e atuariam apenas como quimioatrantes
celulares participando da apresentação de antígenos observada na periferia do
granuloma. No entanto, levando em consideração a composição
majoritariamente glicoprotéica do SEA, os resultados obtidos com a coloração
de PAS corroborariam os resultados observados em imunofluorescência, já que
o material PAS-positivo também se mostrou presente apenas na região central
do granuloma. Apesar dos antígenos de difusão ficarem aparentemente
restritos à camada central, não ultrapassando a paracentral, a maioria das
58
células positivas para MHC da classe II, em camundongos, se posiciona na
periferia de granulomas, tanto na 6 ½, como na 12 ½ semanas (Rathore et al.,
1996). Isso levanta as seguintes questões: que antígenos essas células
processam? Ou, terão elas outras funções que não a de apresentadoras de
antígenos? Há a possibilidade dessas células entrarem em contato com
antígenos ovulares nas fases iniciais da infecção, quando a dispersão é maior
devido à imaturidade organizacional dos granulomas ou, como referido acima,
com antígenos de baixo peso molecular e alta difusibilidade. Elas poderão
também estar lidando com antígenos externos aos granulomas. Esse assunto
merece uma investigação posterior. Os antígenos ou componentes ovulares de
maior difusibilidade periovular podem pesar entre 43 a mais de 200kDA
(Peralta, 1986) e devem ser os responsáveis principais pela
granulomatogênese. Boros & Lukacs (1992) mostraram, usando “beads”
recobertas com diferentes componentes do SEA, que granulomas pulmonares
dependiam de diferentes frações de SEA, a depender do tempo de infecção
dos animais. As frações <21, 25-30, 32-38, 60-66, 70-90, 93-125 e >200 kDa
desencadearam granulomas pulmonares na fase aguda, e, na fase crônica,
um número menor de frações foi responsável pela formação de granulomas
(60-66, 70-90, 93-125 e >200 kDa).
As moléculas de adesão mostraram características bastante variáveis e
dinâmicas. As moléculas de expressão mais constante foram as caderinas
(vistas em todos os pontos de infecção). As moléculas de junção de oclusão
tiveram comportamentos individualizados. Isto é, a ocludina compareceu em
granulomas de todos os pontos de infecção, localizando-se central e/ou
perifericamente. A claudina -1 só foi vista aos 120 dias de infecção, enquanto a
claudina-4 apareceu apenas aos 60 dias. O Mac-3 expressou-se nos três
pontos intermediários de infecção: 60, 90 e 120 dias de infecção. A conexina-
43 exibiu dois padrões distintos: um punctiforme clássico e outro
intracitoplasmático. O primeiro ocorreu em todos os pontos de infecção e o
segundo surgiu apenas a partir de 120 dias de infecção. Com exceção da
claudina-4, todos os marcadores ocorreram in situ no interior de granulomas
aos 120 dias (Tabela 3). Nesse tempo de infecção, a conexina-43 passa a
apresentar, além do padrão clássico, o padrão citoplasmático. Não há nenhum
trabalho na literatura que explique as características peculiares desse tempo de
59
infecção (120 dias), pois do ponto de vista morfológico, ao nível dos
granulomas, não há nada de particular (Lenzi et al., 1995). A deficiência de
estudos ou de análises espaço-temporais detalhadas dificulta uma melhor
intelecção da infecção. Os dados da literatura são excessivamente
fragmentados e incompletos. Os nossos resultados, in vivo, não coincidem com
os achados in vitro de Duffy et al (2000), empregando cultura primária de
astrócito fetais humanos. Eles mostraram que o tratamento das culturas com
IL-1β causava rápida indução de claudina-1 e perda simultânea do padrão de
expressão de conexina-43. Nos granulomas, por sua vez, quando aparece a
expressão de claudina-1, a expressão de conexina-43 não diminui, mas ao
contrário passa a apresentar um padrão adicional (citoplasmático). Esse
padrão citoplasmático tem sido observado com conexina-26 em células
estrelares de ratos (Fisher et al., 2005). Essa mudança de padrões fenotípicos
pode indicar uma transição de fenótipo epitelial para fenótipo mesenquimal,
como ocorre com junções de oclusão (Gonzáles-Mariscal et al., 2007).
As junções de oclusão são complexos juncionais, aos quais é atribuída a
função de formação de uma barreira paracelular para íons, proteínas e outros
solutos (De Vos & Desmet, 1978; Hirase et al., 1997). A ocludina é uma
proteína integral de membrana encontrada nessas junções, e a sua presença
tem sido principalmente associada à criação dessa barreira nos tecidos (Rubin
et al., 1991; Hirase et al., 1997; Kevil et al., 1998). Esse tipo de junção foi, e
ainda continua sendo por muito pesquisadores, considerado como um mero
selo intercelular. Todavia, evidências mais recentes comprovam a importância
dessas junções na sinalização celular, interferindo em diferentes processos
celulares, tais como expressão gênica, proliferação e diferenciação celulares
(Gonzáles-Mariscal et al., 2007). Esses complexos juncionais sofrem
modulações positivas e negativas por citocinas e fatores de crescimento,
mostrando que a família das claudinas, por exemplo, não atua com todas as
moléculas ao mesmo tempo e nem com a mesma intensidade. Por exemplo, o
Fator de Crescimento Epitelial (Epithelial Growth Factor = EGF) é essencial
para a regulação da proliferação e diferenciação celulares (Gonzáles-Mariscal
et al., 2007). Em células epiteliais (Chen et al., 2005) e em células MDCK
(Madin-Darby canine kidney cells (Singh & Harris, 2004), EGF aumenta a
Resistência Elétrica Transepitelial (TER = Transepithelial Electrical Resistance).
60
Nas células da linhagem epitelial, EGF regula positivamente a expressão de
claudinas 4 e 7, inibindo, por outro lado, a expressão das claudinas 3 e 5. Em
células MDCK, o tratamento com o mesmo fator de crescimento inibe a
expressão de claudina 2 e aumenta e a expressão das claudinas 1, 3 e 4.
Provavelmente, nos granulomas, essas moléculas também sofrem
interferências reguladoras por diferentes citocinas e fatores de crescimento ali
localmente existentes, como demonstrado pela literatura (Cheever et al., 2002;
Stavitsky, 2004; Lenzi et al., 2006). Como salientamos acima, não há
coincidência espaço-temporal entre as expressões de claudina 1 e 4 e de
ocludina. Muitas conexinas (Ex: Cx43, Cx45 e Cx37) tem meia vida de uma a
cinco horas (Saffitz et al., 2000), denotando a rotatividade dessas moléculas,
que também estão sujeitas a mecanismos reguladores, interferindo no
crescimento celular (Yamasaki & Naus, 1996). Isso explica a variabilidade de
expressão no interior de granulomas. Granulomas desenvolvidos em
camundongos Cx43
+/+
apresentam mais células em proliferação e menor
depósito de elementos de matriz extracelular, quando comparado com animais
Cx+/- (Oloris et al., 2007). De fato, em nosso material, o padrão citoplasmático
ou mesenquimal da conexina-43 se superpôs com áreas mais densas de
colágeno, em camadas mais periféricas de granulomas produtivos. O fato de
células estrelares hepáticas, a partir de 120 dias de infecção, expressarem
positividade citoplasmática para Cx-43 e se posicionarem também na
proximidade de granulomas positivos para células Cx43, padrão citoplasmático,
sugere a possibilidade dessas células terem a capacidade de migrar para o
interior do granuloma (Fig 20. E,F). O padrão citoplasmático pode decorrer
também de falta de migração da conexina da área de síntese citoplasmática
para o complexo juncional (GAP Junction Intercellular Complex = GJIC). Isso
ocasiona deficiência da capacidade adesiva do complexo juncional,
contribuindo, em alguns tumores, para uma maior proliferação e fenótipo
agressivo (Torres et al., 2005).
Outro complexo molecular de adesão estudado em nosso trabalho
relacionava-se à junção aderente, visto através da detecção de pancaderina.
Essas moléculas são as principais moléculas mediadoras da adesão célula-
célula (Gumbiner, 1996), promovendo tanto interações laterais como
intercelulares. Essa adesão é responsável por fornecer força e rigidez aos
61
tecidos (Lodish et al., 2003). A abundante localização de pan-caderina no
granuloma esquistossomótico, observada no presente trabalho, nos dá idéia do
forte comprometimento desse tipo de molécula no grau de coesão da estrutura
granulomatosa, tendo, talvez, uma participação secundária no efeito barreira.
Em conclusão, esse estudo mostra que os produtos ovulares, a depender
de seus componentes, exibem ou não maior ou menor difusibilidade,
independente do seu peso molecular. Parece que o efeito barreira é exercido
mais pelas moléculas de conexina-43 e de ocludina, principalmente na camada
central ou periovular. Essas moléculas apresentaram fenótipos variáveis e
dinâmicos no interior do granuloma e, além do efeito barreira, podem também
participar em outros eventos celulares, como proliferação e diferenciação. O
ponto de infecção de 120 dias comportou-se como o marco divisório entre as
variações fenotípicas in situ, ao nível de granulomas hepáticos, das moléculas
de adesão estudadas no transcurso da infecção. Estudos abordando a
expressão gênica (histogenômica) e protéica (histoproteômica) in situ, em
granulomas isolados, junto com avaliações da resposta imunitária e
morfológica sequencial (séries temporais pormenorizadas) será a forma mais
adequada para continuar esse tipo de estudo, com enfoques de Biologia de
Sistemas, incluindo modelagens.
62
Tabela 3. Expressão seqüencial de moléculas de adesão em granulomas hepáticos de Swiss Webster
infectados com Schistosoma mansoni
Dias de infec
ç
ão
Moléculas de adesão 45 60 90 120 190
Mac-3 - ++ ++ +++ -
Ocludina +/- ++ (C) ++ (P) + (C) ++(P) +(C) ++
Claudina 1 - - - ++ -
Claudina 4 - + - - -
Pan-caderina ++ ++ ++ ++ ++
Conexina-43
Puntiforme +/- + + + +
Citoplasmática
- - - + +
+ até +++ cruzes = níveis de intensidade
(C) Central
(P) Periférica
63
64
8- CONCLUSÃO GERAL
1-Componentes do ovo de S. mansoni, no contexto do granuloma hepático
murino apresentaram, quando avaliados por sete monoclonais específicos para
SEA (Soluble Egg antigens = SEA), três padrões básicos de difusibilidade,
definindo: (a) difusão periovular em graus e aspectos variados (granular,
flocoso, etc); (b) restrito ao território limitado pela casca, sem definição de
estruturas do miracídio; (c) restrito ao miracídio, com definição de estruturas
específicas. A capacidade de difusão maior ou menor não estava relacionada
ao peso molecular do componente ovular. Provavelmente, os componentes
com maior difusão periovular são os responsáveis pela granulomatogênese.
2- Granuloma esquistosssomótico hepático murino expressa moléculas de
diferentes complexos juncionais, tais como: junções aderentes (caderinas);
junção de oclusão (ocludina e claudinas 1 e 4); junções comunicantes
(Conexina-43). Essas moléculas exibiram um comportamento dinâmico, com
modulações para mais e para menos, no transcurso da infecção. O efeito
barreira pareceu ser mais dependente de Ocludina, com localização
preferencial na zona central ou periovular.
3-O tempo de infecção de 120 dias comportou-se como um marco crítico, a
partir do qual ocorreram alterações mais expressivas ao nível das moléculas de
adesão estudadas.
4-Células estrelares hepáticas mostraram-se positivas para Conexina-43, com
expressão citoplasmática.
65
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