ads:
Universidade de São Paulo
Faculdade de Saúde Pública
Controle Genético de mosquitos
Culex quinquefasciatus
André Barretto Bruno Wilke
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação
em Saúde Pública para a
obtenção do titulo de Mestre
em Saúde Pública
Área de concentração:
Epidemiologia
ORIENTADOR: PROF
MAURO TOLEDO MARRELLI
São Paulo
-2008-
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Controle Genético de mosquitos
Culex quinquefasciatus
André Barretto Bruno Wilke
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação
em Saúde Pública para a
obtenção do titulo de Mestre
em Saúde Pública
Área de concentração:
Epidemiologia
ORIENTADOR: PROF
MAURO TOLEDO MARRELLI
São Paulo
-2008-
ads:
Esta estrutura [dupla hélice] tem características que são de
considerável interesse biológico. Não pudemos deixar de perceber que o
emparelhamento específico que postulamos imediatamente sugere um
possível mecanismo para a cópia do material genético.
Molecular Structure of Nucleic Acids, in nature [April 25, 1953]
James Dewey Watson & Francis Harry Compton Crick
Agradecimentos
Agradeço a meus pais Reynaldo e Regina e minha irmã Helena,
por todo o apoio e compreensão durante o período do desenvolvimento de
meu mestrado.
A minha namorada Betina por seu apoio e por muitas tardes de
sábado e domingo em que me acompanhou até a USP.
A toda minha família e amigos que sempre me motivaram.
Agradeço ao Dr. Mauro Toledo Marrelli por me aceitar como seu
aluno e se preocupar verdadeiramente com meu aprendizado e
desenvolvimento acadêmico. Sempre presente em horas difíceis e prazos
apertados. Espero que nossa parceria dure por muitos anos.
Ao Dr. Almério de Castro Gomes e ao Dr. Delsio Natal eu
agradeço pela pronta disposição em ajudar nas horas difíceis demonstrando
profundo companheirismo e amizade.
A Dra. Margareth de Lara-Capurro eu agradeço por abrir as portas
de seu laboratório e agir sempre com profundo profissionalismo. Agradeço
também a Bianca Burini que em todos os momentos difíceis me ajudou sem
nunca pedir nada em troca e certamente possui um papel importante no
desenvolvimento desta dissertação. A todos os outros estudantes do
laboratório, André, Céres, Talita, entre tantos outros com que não tive muito
tempo de convívio, demonstro minha sincera gratidão e os considero amigos.
A todos os amigos e pessoas que me ajudaram, mas que não
foram citadas porém, tiveram uma participação vital no desenvolvimento do
projeto.
A FAPESP pelo financiamento desse projeto (Bolsa de Mestrado
06/52738-0, Projeto Jovem Pesquisador 05/50225-2).
Índice
1 Introdução
3
1.1
Degradação do Ambiente e os Mosquitos Culex 5
1.2
Histórico das Intervenções nos rios Tietê e Pinheiros 7
1.3 O mosquito Culex quinquefasciatus 8
1.4
Importância Médica dos Mosquitos do Gênero Culex 13
1.5
Controle de Mosquitos 16
1.5.1 Controle Químico 17
1.5.2
Controle Biológico 19
1.6
Resistência 20
1.7
A Técnica do Inseto Estéril (SIT) 21
1.7.1 Sexismo Genético para uso na SIT 24
1.8
Controle Genético de Insetos: supressão e substituição da população 27
1.8.1
Patógenos 28
1.8.2 Elementos de Transposição (transposons) 29
1.8.3
Marcadores para a Seleção de Transformação 32
1.9
O melhoramento da Técnica SIT – O Sistema RIDL 35
1.10 O Sistema RIDL: potenciais melhorias para o SIT usando engenharia genética 37
2 Objetivos
42
2.1
Objetivo Geral 42
2.2
Objetivos específicos 42
3 Material e Método
43
3.1
Colônia de Mosquitos 43
3.2
Animais 43
3.3
Construções Utilizadas 44
3.4
Transformação e Clonagem 48
3.4.1
Meio de Cultura 48
3.4.2 Preparo de Células Eletro-Competentes 48
3.4.3
Purificação dos Plasmídeos 59
3.5
Microinjeção: procedimentos 51
3.5.1 Solução de Injeção 51
3.5.2
Preparação dos Capilares 52
3.5.3
Padronização da disposição dos ovos 53
3.5.4 Microinjeções em Embriões de Culex quinquefasciatus 53
3.6
Procedimentos após as Microinjeções: tentativa de se obter uma linhagem transgênica 54
3.7
Amplificação do gene Marcador DsRed2 55
4 Resultados e Discussão
57
4.1
Padronização da Manipulação dos Ovos 62
4.2
Microinjeções 66
4.2.1 Microinjeções com a Construção LA882 66
4.2.2
Microinjeções com a Construção LA513 68
4.2.3
Microinjeções com a Construção LA3653 69
4.3 Reação de Amplificação do Marcador DsRed2 71
4.4
Conclusões 72
4.5
Considerações Finais 73
5 Referências Bibliográficas
76
Anexos
Resumo
Wilke ABB Controle Genético de mosquitos Culex quinquefasciatus. São Paulo;
2008. [Dissertação de Mestrado – Faculdade de Saúde Pública da USP]
O mosquito Culex quinquefasciatus é considerado praga urbana e tem a
capacidade de se desenvolver em águas altamente poluídas atingindo elevada
densidade. Mosquitos desta espécie possuem importância vetorial na transmissão
de parasitas e arboviroses. Medidas de controle químico têm se mostrado
ineficazes, além de serem altamente prejudiciais ao meio ambiente. Desse modo,
novas tecnologias de controle foram desenvolvidas, entre elas o SIT (Sterile Insect
Technique) que utiliza radiação para esterilizar machos e liberá-los no ambiente
para copular com fêmeas selvagens. Posteriormente métodos genéticos baseados
nessa técnica têm sido propostos. O sistema RIDL (Liberação de Insetos
Carregando Gene Letal Dominante), consiste na integração de um gene letal
dominante associado a um promotor específico de fêmea, dispensando a etapa de
esterilização por radiação. Nesse processo os insetos recebem dieta suplementada
com um repressor químico. A expressão do gene letal dominante é mantida
desligada enquanto este repressor é adicionado ao meio das larvas. Para as
amostras que estariam sendo preparadas para liberação, o repressor é retirado, e o
gene letal dominante é ativado, causando a morte de todas as fêmeas, restando
apenas machos para liberação. Os machos homozigotos para o gene letal seriam
liberados para copular com fêmeas selvagens. A progênie seria heterozigota para o
gene letal, porém somente os machos sobreviveriam. Parte crucial para o sucesso
deste projeto foi a adaptação do método de microinjeção de embriões para a
espécie Culex quinquefasciatus tornando possível a injeção dos transgenes LA513,
LA882 e LA3653 com o objetivo de obtermos linhagens transgênicas. A obtenção de
linhagens transgênicas com estas construções se mostraram mais laboriosa do que
o previsto, dificultando a transgenia. Porém, as aplicações práticas em controle de
vetores utilizando a técnica do RIDL são imensas e pode se tornar uma importante
ferramenta do Manejo Integrado de vetores.
Descritores: Transgênicos, Culex quinquefasciatus, RIDL, Controle
Abstract
Wilke ABB Genetic control of Culex quinquefasciatus mosquitoes. São Paulo;
2008. [Dissertação de Mestrado – Faculdade de Saúde Pública da USP]
The Culex quinquefasciatus mosquitoes are considered urban plague and are able
to grown in polluted water achieving high density. This specie are important vectors
in the transmission of parasites and arbovirus. Chemical control methods shown to
be ineffective and highly hazards to the environment. In this way, new technologies
of control have been developed, among them there is SIT (Sterile Insect Technique)
that utilizes radiation to sterilize males and then release in the environment to mate
with wild females. New genetic methods are been proposed based on the SIT
technique, they relies on the integration of a dominant lethal gene associated to a
specific promoter of female avoiding the need for radiation (RIDL). In this process
the insects receive diet supplemented with a chemical repressor (tetracycline). The
expression of the dominant lethal gene is kept off while this repressor is added to the
larvae. For the samples that would be being prepared for release, the repressor is
removed, and the dominant lethal gene is activated, causing the death of all the
females, and consequently only leaving male for release. The homozygous males for
the lethal gene would be set free to mate with the wild females. The lineages would
be heterozygous for the lethal gene and only males would survive. Since that, the
capacity of mating of the transgenic males produced by method RDIL is an important
prerequisite for the success of the program. It was crucial to achieve the objectives
of this project adapt the microinjection method to Culex quinquefasciatus, so it
became possible inject the LA513, LA882 and LA3653 plasmids seeking for the
transgenic transformation. The obtaining of the transgenic mosquito Culex
quinquefasciatus seems to be more difficult then expected and its development was
harmed. The practical applications using RIDL in vector control is huge and can
become a useful tool in the Integrated Management of vectors.
Keywords: Transgenics, Culex quinquefasciatus, RIDL, Control
3
1 Introdução
Os insetos são animais com alta diversidade, apresentando
vários grupos com valor comercial e de importância médica. A classe
Insecta apresenta mais de um milhão de espécies descritas e
organizadas em aproximadamente 800 famílias que compreendem 32
ordens (Behura 2006). Dentre estes, alguns grupos, denominados
hematófagos, são adaptados para se alimentarem de sangue de
vertebrados. Este fato causa danos ao hospedeiro vertebrado, como
feridas e baixa na resistência imunológica. Entretanto, o principal
problema advindo da hematofagia dos insetos é a sua capacidade de
transmitir patógenos para o homem e outros vertebrados.
Estes organismos são transmissores de uma variedade de
patógenos, entre eles vírus, bactérias, protozoários e vermes. O papel
dos insetos, e outros invertebrados, como transmissores de agentes
causadores de doenças para os vertebrados foi comprovado
cientificamente no final do século XIX. A descoberta foi feita pelo médico
escocês, Patrick Manson, em 1877 (reportada em 1878), que descobriu
que vermes causadores da filariose (Wuchereria bancrofti) se
desenvolviam no interior de mosquitos (Culex pipiens quinquefasciatus).
Deste momento em diante, o papel de outros invertebrados como
transmissores de patógenos causadores de doenças foi comprovado,
como a malária transmitida por mosquitos do gênero Anopheles (1887); a
febre do gado “texana” transmitida por carrapatos (1893); a ”nagana”
transmitida por moscas tsetse (1895); a peste bubônica transmitida por
pulgas de ratos (1898), a febre amarela transmitida por mosquitos (1901),
a doença do sono transmitida por moscas tsetse (1903) e a doença de
Chagas transmitida por triatomíneos (1909) (Sanjad 2003).
No começo do século XX, medidas de controle de vetores com
o intuído de diminuir a transmissão de patógenos foram iniciadas. No
Brasil, a partir de janeiro de 1901, as comissões sanitárias que atuavam
no Estado de São Paulo, já incorporaram em sua rotina a supressão das
águas estagnadas com larvas de mosquitos. Em Sorocaba (1901) e São
4
Simão (1902) (Estado de São Paulo), o combate aos mosquitos integrou o
repertório híbrido de ações destinadas a anular tanto o contágio como a
infecção da febre amarela (Benchimol 2003).
No Rio de Janeiro, início do século XX, o sanitarista Dr.
Oswaldo Cruz estruturou a primeira grande campanha no combate a um
vetor. A campanha contra a febre amarela, que foi realizada em moldes
militares, dividiu a cidade em 10 distritos sanitários, cada qual chefiado
por um delegado de Saúde. Seu primeiro passo foi extinguir a dualidade
na direção dos serviços de Higiene (Sanjad 2003).
Naquela época, a polícia sanitária estabelecia medidas
rigorosas para o combate ao mal amarílico, inclusive multando e
intimando proprietários de imóveis insalubres a demoli-los ou reformá-los.
As chamadas brigadas “mata-mosquitos” percorriam a cidade, limpando
calhas e telhados, exigindo providências para proteção de caixas d'água,
colocando petróleo em ralos e bueiros e acabando com depósitos de
larvas e mosquitos (Benchimol 2003). Nas áreas de foco, expurgavam as
casas, pela queima de enxofre e piretróides e providenciavam o
isolamento domiciliar dos doentes ou sua remoção para o Hospital São
Sebastião.
O Dr. Oswaldo Cruz baseou o combate à febre amarela no
êxito da campanha realizada pelos americanos em Havana e em algumas
experiências realizadas no Brasil, que comprovavam o acerto da teoria do
médico cubano Dr. Carlos Finlay de que o transmissor da doença era um
mosquito: o Aedes aegypti, na época denominado Stegomyia fasciata ou
Culex aegypti (Ministério da Saúde 2003).
Desde então as estratégias de combate a vetores sofreram
grandes avanços com a introdução de inseticidas e posteriormente com o
desenvolvimento da técnica de liberação de insetos estéreis (Handler
2002).
No final do século XX e início do XXI, com o desenvolvimento
da genética, foram desenvolvidas técnicas que passaram a modificar o
vetor geneticamente, divididas em estratégias de substituição ou
5
supressão de uma população alvo. A possível liberação de insetos
geneticamente modificados para supressão de populações de mosquitos
(RIDL) apresenta grande potencial e se mostrou, até agora, como a mais
promissora das técnicas baseadas em transgenia para controle de
vetores (Alphey 2002).
Diante do exposto acima, justificam-se as preocupações com
os insetos, principalmente com os mosquitos de interesse médico e
epidemiológico. Desse modo, será revisado o que é conhecido sobre a
técnica de modificação genética para controle de insetos por supressão
de população, denominada por Thomas et al. (2000) e Heinrich & Scott
(2000) de RIDL (Releasing of Insects Carrying a Dominant Lethal Gene),
ou seja, liberação de insetos carregando um gene letal dominante.
Também será abordado aqui aspectos relacionados aos
mosquitos do gênero Culex, com destaque ao Culex quinquefasciatus, a
espécie mais importante do gênero no Brasil, sua importância
epidemiológica e as modificações no ambiente que levam à alta
infestação desses mosquitos. Tentativas de obtenção de linhagens
transgênicas dessa espécie de mosquito baseadas no RIDL está em
andamento. Os avanços na padronização das micro-injeções e os tipos
de construções transgênicas utilizadas também são discutidos nessa
dissertação.
1.1 Degradação do Ambiente e os Mosquitos Culex
O Brasil, semelhantemente a numerosos países em
desenvolvimento, vem sofrendo acentuado processo de urbanização,
porém, sem o respectivo progresso dos serviços de saneamento básico.
Dessa maneira, observa-se aumento da liberação de efluentes no meio
ambiente sem tratamento adequado. Ao mesmo tempo em que as
indústrias se expandem para atender às necessidades crescentes de
consumo, aumentam-se as cargas dos mais variados contaminantes
lançados no ambiente. Neste contexto, são os rios os receptores dos mais
6
diversos detritos produzidos pela sociedade. Nessas condições, o
mosquito Culex quinquefasciatus, cujos estádios imaturos são
dependentes de águas poluídas, encontra condições adequadas ao pleno
desenvolvimento (Taipe-Lagos & Natal 2003).
Na cidade de São Paulo, o rio Pinheiros e o rio Tietê compõem
cenários típicos onde se somam condições favoráveis para a explosão
populacional desse culicídeo. Esse problema vem afetando o bem-estar
dos indivíduos que habitam ou trabalham nas proximidades do rio. Se até
o presente as reclamações concentravam-se no incômodo provocado
pela picada do mosquito, para o futuro, prevê-se a elevação do risco de
introdução de vírus exóticos, com potencial de gerar processo epidêmico,
como no caso do vírus da encefalite do Nilo Ocidental. Alerta-se para a
reprodutividade desse quadro epidemiológico na maioria das cidades
brasileiras (Morais et al. 2006).
Nas dimensões da infestação em que o rio Pinheiros se
encontra, as estratégias químicas, biológicas e de manejo ambiental não
têm sido eficazes no combate a esse culicídeo. Estima-se uma população
de dois milhões de habitantes que são incomodados pelas picadas desse
hematófago, nas proximidades do Rio Pinheiros, na extensão de seus 25
km, que corta a cidade de São Paulo. A contínua manutenção de
densidades elevadas desse mosquito é condição potencial para o risco de
introdução do vírus da febre do Nilo Ocidental, podendo resultar em
epidemia de elevada proporção (Natal et al. 2004).
Atualmente, o rio Pinheiros recebe efluentes de 290 indústrias
e dejetos de 400 mil famílias. Obras governamentais continuam a
prometer a despoluição do rio e a volta de alguns tipos de peixes e
plantas em suas águas (São Paulo 450 anos). Segundo o Boletim Técnico
da Secretaria do Meio Ambiente, do Estado de São Paulo (SMA 2002), as
águas do rio Pinheiros possuem níveis elevados de temperatura e sais
minerais, como resultado da decomposição da matéria orgânica e
industrial, constantemente despejada no seu leito.
7
Como conseqüência, os dados de qualidade da água do rio
apontam ausência de oxigênio Dissolvido, o que as caracterizam como
sendo anóxicas. A estagnação das águas do rio Pinheiros o torna ainda
mais poluído e seu leito mais raso.
O soterramento contínuo do lixo e a disposição permanente
dos esgotos resultam no despojamento do solo e de seus elementos
nutritivos, que acompanhado da fertilização excessiva causada pela
decomposição de matéria orgânica, resultam na eutrofização e
posteriormente no envenenamento do solo do ar e da água (Murgel &
Branco 1990).
1.2 Histórico das Intervenções nos rios Tietê e Pinheiros
A cidade de São Paulo foi fundada na elevação existente entre
os rios Tietê e Tamanduateí e expandiu-se inicialmente por terrenos mais
altos e secos, pois as várzeas, sujeitas a constantes inundações, eram
então consideradas áreas de segunda categoria. Estas áreas serviam
como acessos aos importantes cursos d’água que eram vias de transporte
na época e foram palco de intensa atividade minerária (SMA 2002).
Segundo a Secretaria do Meio Ambiente do Estado de São
Paulo (2002), a demanda por eletricidade acarretou as primeiras
intervenções importantes nos rios. Em 1901 foi construída a primeira
usina hidrelétrica no rio Tietê, em Santana do Parnaíba. As características
originais dos rios Tietê e Pinheiros passaram, então, a ser profundamente
alteradas, restando hoje em dia poucos resquícios da situação original.
As intervenções na bacia do rio Pinheiros começaram no início
do século passado com a construção da Represa do Guarapiranga,
visando aumentar a capacidade de geração de energia (SMA 2002). A
retificação e a canalização do rio Pinheiros foram iniciadas em 1928 e
estenderam-se até os anos 50. Entre as várias intervenções no rio e em
suas várzeas, além da construção do canal e eliminação dos seus
meandros, vale destacar a reversão de suas águas, direcionadas rio
8
acima pelas estações elevatórias de Traição e Pedreira, indo desaguar no
reservatório Billings, dando impulso à geração de energia na Usina Henry
Borden e à expansão industrial em Cubatão (SMA 2002).
As intervenções no rio Tietê objetivaram solucionar questões
sanitárias e o problema das inundações, quando as várzeas foram sendo
tomadas por moradias. Sua retificação foi um importante estímulo para o
estabelecimento de novos bairros e o que se verificou, simultaneamente,
foi o agravamento dos problemas que se pretendia resolver (SMA 2002).
1.3 O Mosquito Culex quinquefasciatus
Os mosquitos (Diptera: Culicidae) têm sido intensamente
estudados desde o final do século XIX quando foram pela primeira vez
relacionados com a transmissão de patógenos ao homem e outros
vertebrados. Os gêneros Anopheles, Culex e Aedes incluem os vetores
dos três grupos principais de patógenos humanos: os parasitas
causadores das malárias do gênero Plasmodium, filárias dos gêneros
Wuchereria e Brugia e numerosos arbovírus (Taipe-Lagos & Natal 2003).
O gênero Culex foi criado por Linnaeus em 1758, vulgarmente
chamado de mosquitos, apresenta a maior variedade de espécies entre
os culicídeos, abrangendo uma grande variedade de nichos, dos
criadouros naturais, como bromélias, aos artificiais, como pneus e vasos
de plantas (Laporta et al. 2006).
Existem mais de 300 espécies de Culex descritas, das quais
algumas apresentam capacidade vetora e, portanto, tem interesse
médico. Entre eles encontra-se o Culex quinquefasciatus, que apresenta
um grande desafio para saúde pública devido a sua grande dispersão
pelo território nacional e capacidade vetora para arboviroses e filarioses
(Taipe-Lagos & Natal 2003).
Thomas Say (1823) estudou a taxonomia do gênero Culex e
descreveu o Culex quinquefasciatus usando como referência as cinco
faixas amplas e escuras presentes nos tergitos abdominais do mosquito o
9
que o caracteriza com o nome de Culex 5-fasciatus (Sirivanakarn & White
1978).
O Culex quinquefasciatus desenvolve-se por meio de ciclo
completo o que implica quatro etapas que contemplam formas distintas.
Nas fases de ovo, larva e pupa vivem na água (Figura 1), geralmente
estagnada, enquanto na fase adulta exploram os ambientes terrestres e
aéreos (Taipe-Lagos & Natal 2003).
Figura 1: Larvas de mosquitos do Gênero Culex.
Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Culex_sp_larvae.png
Os ovos são colocados aglutinados formando um conjunto em
forma de jangada. A oviposição ocorre diretamente na superfície da água,
completando seu desenvolvimento durante a fase de ovo e somente
quando o embrião estiver totalmente desenvolvido é que se dá a eclosão.
Esse processo corresponde, portanto à saída de dentro do ovo da larva
de primeiro estádio (Cardoso et al. 2005)
As larvas se desenvolvem em quatro estádios. A larva de
primeiro estádio mede em comprimento aproximadamente 1,5mm e a de
quarto estádio chega a atingir 10mm. As larvas apresentam corpo dividido
em três partes: cabeça, tórax e abdome.
10
A fase de pupa corresponde ao período de transição entre a
larva de quarto estádio e o mosquito adulto. A pupa tem o corpo dividido
em cefalotórax e abdome; não se alimentam e respiram por um par de
sifões existente no dorso da área correspondente à parte torácica do
cefalotórax. Nessa fase o mosquito sofre mudanças morfológicas e
fisiológicas profundas ao utilizar a matéria e a energia acumulada durante
a fase larvária, corresponde a um período de intensa atividade bioquímica
(Forattini 2002).
Uma única oviposição de Culex pode resultar em mais de 200
ovos. Esses resultarão em número semelhante de larvas de primeiro
estádio. O desenvolvimento desses indivíduos até quarto estádio e
posterior pupação, depende da pressão exercida por vários fatores sobre
a população de larvas (Barata et al. 2007).
O mosquito adulto, após a emergência, utiliza nos primeiros
momentos a exúvia pupal como local temporário de repouso. Esse tempo
é necessário para que se verifique o endurecimento do exoesqueleto.
Após esse evento, o mosquito estará apto a alçar vôo. O endurecimento
da probóscide é mais lento e no primeiro dia ainda é flácida, impedindo a
hematofagia. Nesse primeiro período da vida adulta, as fêmeas procuram
geralmente um local escuro, úmido e sem vento utilizando-o como abrigo
(Taipe-Lagos & Natal 2003).
Estando pronto para o vôo, ou tendo passado o período inicial
da vida adulta, as fêmeas serão fecundadas. Uma vez ocorrida a cópula,
os espermatozóides ficarão armazenados no organismo da fêmea, no
interior de cápsulas que recebem o nome de espermatécas. A fecundação
só ocorre quando o oócito (óvulo) chega ao duto da espermatéca, no
momento da oviposição. Uma fêmea que passou pelo processo da cópula
e que possui uma carga de espermatozóides acumuladas nas
espermatécas, torna-se fértil pelo restante da vida (Forattini 2002).
Na natureza, as fêmeas após o acasalamento iniciarão o
comportamento de alimentação (Figura 2). Podem alimentar-se de sucos
e néctar vegetais e são também hematófagas. O repasto alimentar
11
sanguíneo representa para fêmeas matéria-prima e energia, necessárias
ao desenvolvimento dos ovários. Assim, para haver a maturação dos
oócitos nos ovários é necessária a obtenção de sangue pela fêmea. No
momento da oviposição, os oócitos serão fecundados e transformar-se-ão
em nova geração (Gomes et al. 2003). A vida das fêmeas adultas reside
em ciclos que envolvem alimentação e oviposição (Figura 3).
Figura 2: Mosquito Culex quinquefasciatus fazendo hematofagia. Fonte:
http://en.wikipedia.org/wiki/Image:CulexNil.jpg
12
Figura 3: Fluxo esquemático da vida de uma fêmea de mosquito. Fonte: Delsio Natal
(comunicação pessoal).
Seus imaturos desenvolvem-se intensamente em coleções
aquáticas comprometidas com efluentes domésticos e industriais, e na
ausência de inimigos naturais, que sucumbem nas águas tóxicas, atingem
densidades elevadíssimas e dada sua capacidade vetora e sua elevada
antropofilia, tornam-se mosquitos de importância médica (Merritt et al.
1992).
As larvas de Cx. quinquefasciatus possuem o modo de
alimentação do tipo coletor-filtrador. Essa via de alimentação apresenta
um mecanismo de filtração bem desenvolvido, com adaptações
principalmente nos músculos da faringe, tendo, após a ingestão, um
seleto e pequeno conteúdo no estômago, mesmo com o meio externo
sobrecarregado de substâncias alimentares. Essa característica permite a
sobrevivência da espécie em meios aquáticos poluídos (Merritt et al.
1992)
13
Adiciona-se ainda o fato de que a alimentação dos imaturos de
Cx. quinquefasciatus se faz na coluna d’água, próxima à superfície do
meio líquido, o que facilita a permanência destes em ambiente anóxico
(Morais et al. 2006).
Estudos realizados na área periférica da grande São Paulo, no
Parque Ecológico do Tietê (PET), mostram que, devido à disponibilidade
de alimento, essa espécie é muito abundante, pois há intensa proliferação
dos imaturos em água estagnada com alta concentração de matéria
orgânica (Taipe-Lagos & Natal 2003). Sua presença no Parque é motivo
de incômodo para a população, em função da elevada antropofilia.
Quanto à distribuição espacial avaliada pela freqüência,
verificou-se que os mosquitos estiveram presentes em quaisquer tipos de
ambientes, da mata ao intradomicílio. A espécie Culex quinquefasciatus
foi um dos mais freqüentes (Taipe-Lagos & Natal 2003).
O Culex quinquefasciatus mostra comportamento endofílico e
elevada abundância, tendo importância por ser vetor primário da filariose
bancroftiana no Brasil.
1.4 Importância Médica dos Mosquitos do Gênero Culex
Os Culicidae (Diptera) de interesse epidemiológico são vetores
de agentes infecciosos, como filárias e arbovírus. Além disso, Natal
(1991) referiu que Culex quinquefasciatus Say, 1823 é considerado, pela
Saúde Pública, como fator de incômodo em inúmeras áreas urbanizadas
do Brasil. A presença dessa espécie, no ambiente urbano, é indesejável e
constitui diminuição da qualidade de vida (Laporta et al. 2006).
Situado em grande parte na região tropical, o Brasil enfrenta
vários problemas de Saúde Pública associados a mosquitos, destacando-
se malária, dengue, filarioses, além de várias arboviroses, incluindo-se a
febre amarela silvestre. Doenças emergentes, decorrentes de
desmatamento, deslocamentos humanos, alteração climática, entre outros
14
fatores podem surgir em qualquer ponto do território nacional, exigindo-se
ações rápidas e eficientes de controle (Cardoso et al. 2005).
A filariose linfática é endêmica em várias regiões tropicais,
sendo estimada em 800 milhões a população que vive em áreas
endêmicas e em aproximadamente 73 milhões o número de indivíduos
infectados pela W. bancrofti. O parasita é transmitido, comumente, por
mosquitos do gênero Culex, nos quais as microfilárias se desenvolvem e
atingem o estágio infectante (larva L3). Os vermes adultos da W. bancrofti
vivem nos linfonodos e vasos linfáticos, e as microfilárias, são
encontradas no sangue periférico humano (Fontes et al. 1994).
Mosquitos do gênero Culex também possuem potencial vetorial
para diversas arboviroses, algumas de grande importância em saúde
pública, entre elas a Encefalite do Nilo Ocidental (Huhn et al. 2003)
Os seres humanos são usualmente infectados pelo vírus do
Oeste do Nilo, um RNA vírus, através da picada de um mosquito
contaminado. O vírus se mantém enzoótico em um ciclo silvestre
(mosquitos-aves-mosquitos) que envolve primariamente a espécie de
mosquitos Culex. Humanos e cavalos geralmente são hospedeiros
acidentais porque não desenvolvem viremia suficiente para propagar o
vírus após serem picados por mosquitos (Figura 4). Alguns casos de
transmissão entre humanos foram relatados, com contaminação por
transfusão de sangue e transplante de órgãos (Luna & Pereira 2003).
A infecção do vírus do Nilo Ocidental parece ser igualmente
distribuída por todas as idades e sexos entre os seres humanos. No
entanto, a incidência de encefalite e morte aumenta 20 vezes em pessoas
com 50 anos ou mais e a maioria das pessoas infectadas com o vírus do
Nilo Ocidental são assintomáticas (Huhn et al. 2003).
Aproximadamente uma pessoa infectada em cinco desenvolve
quadro febril mediano, e aproximadamente uma em 150 desenvolve
manifestações neurológicas. Nenhuma vacina é conhecida para prevenir
a infecção pelo vírus do Nilo Ocidental em humanos, no entanto
pesquisas laboratoriais estão em andamento. Programas de controle de
15
mosquitos são essenciais na prevenção do vírus do Nilo Ocidental em
áreas endêmicas (Shieh et al. 2000).
Em 1999, o vírus do Nilo se espalhou pelos EUA e iniciou a
maior epidemia de encefalites causada por arbovírus na história
americana. Essa arbovirose foi registrada pela primeira vez em Nova
Iorque, (Shieh 2000) e no período de 10 de junho a 31 de dezembro de
2002, ocorreram 4156 casos de infecção pelo vírus do Nilo Ocidental
incluindo 284 mortes (Huhn et al. 2003). Sendo dispersa principalmente
por aves, espalhou-se pela América do Norte, e já atingiu extensas áreas
da América Central e do Caribe (Luna & Pereira 2003)..
Figura 4: Ciclo de transmissão do vírus do Nilo Ocidental. Fonte: Huhn GD 2003
Acredita-se que seja praticamente inevitável a introdução do
vírus da encefalite do Nilo Ocidental no Brasil. Publicação recente revela
que o Brasil está na rota de migração de aves que poderão introduzir
agentes infecciosos em nosso país. As autoridades de Saúde Pública das
16
diversas esferas do governo estão propondo a inclusão dessa virose
dentro do sistema de vigilância sanitária (Luna & Pereira 2003).
1.5 Controle de Mosquitos
No século passado, os programas oficiais de controle de
vetores no Brasil utilizaram estratégias químicas com o emprego em
demasia de inseticidas como o DDT. Foi assim, na luta contra o Aedes
aegypti, considerado erradicado em 1956, na campanha de erradicação
de malária com grandes esforços até os anos 1970 e nas posteriores
epidemias de dengue a partir da década de 1980. Entre sucessos e
fracassos, o emprego de estratégias químicas no controle de vetores foi e
tem sido bastante criticado, principalmente devido à contaminação
ambiental, aos efeitos sobre organismos não alvos e aos problemas
decorrentes da seleção de populações de mosquitos resistentes (Dorta el
al. 1993).
Axtell & Arends (1990) fundamentaram as bases filosóficas,
conceituais e estratégicas do manejo integrado de pragas, recomendando
o emprego de inseticidas sintéticos apenas em situações de emergência e
estimulando o controle biológico e o ordenamento ambiental como
prioridades, com o objetivo de obter maior eficiência e preservar o
ambiente de contaminações. Cresceu entre os aplicadores, a consciência
ecológica e entre os cientistas a busca por alternativas não prejudiciais ao
meio ambiente. Desse modo, campanhas contra a dengue no final do
século passado já priorizavam o processo educativo e o saneamento,
ficando a utilização de combate químico reduzida aos momentos de
epidemias. Entomopatógenos do gênero Bacillus passaram a ter papel
importante no controle biológico de vetores em muitos programas (Cuba
2005).
Tentativas de controle de mosquitos na maioria das vezes não
têm surtido efeito devido principalmente à grande capacidade de
reprodução e de flexibilidade genômica dos mosquitos. A flexibilidade
17
genômica pode ser demonstrada não somente pela rápida seleção de
linhagens resistentes a inseticidas químicos e biológicos utilizados no seu
controle ou ainda a resistência a diversas condições ambientais, como
também pela existência de variedade de espécies intimamente
relacionadas, formando complexos de espécies crípticas, algumas das
quais parecem estar sofrendo especiação no processo de adaptação ao
ambiente modificado pelo homem (Besansky & Collins 1992). A
resistência aos inseticidas tem levado a sérios problemas de saúde
pública, contribuindo para o ressurgimento de parasitoses e viroses
transmitidas por mosquitos. Por estes motivos é importante compreender
as bases moleculares da flexibilidade genômica dos mosquitos e por
consequência os mecanismos que levam à diversidade de suas
populações.
1.5.1 Controle Químico
Entende-se por esse tipo de controle, a aplicação auxiliar de
qualquer produto de natureza química, visando reduzir uma população de
culicídeos, de maneira a impedir a transmissão de doenças ou evitar
incômodo.
Segundo Campo & Andrade 2003, os larvicidas são produtos
naturais ou artificiais utilizados para controlar larvas e pupas. Os larvicidas
são aplicados em coleções aquáticas reconhecidas como criadouros de
mosquitos. Larvicidas de contato se inserem no grupo composto que é
efetivo mediante o contato de imaturos com o mesmo. O princípio ativo
penetra no corpo através da ingestão ou então, é absorvido via
exoesqueleto.
Os Adulticidas designam produtos químicos destinados ao
controle de formas aladas de mosquitos. Existem basicamente duas
estratégias de combate a adultos: aplicações em solo e aplicações aéreas
(Campo & Andrade 2003).
18
Os Organofosfatos, de maneira geral, são mais baratos que os
inseticidas modernos. Atuam bioquimicamente, inibindo a colinesterase
através de mecanismo que interfere na junção neuromuscular,
provocando um estado de paralisia no inseto (Dorta et al. 1993).
O DDT (Dicloro-Difenil-Tricloroetano), o primeiro pesticida
moderno, tem sido largamente usado após a Segunda Guerra Mundial
para o combate dos mosquitos causadores da malária e do tifo (Andrade
1990), e contribuiu para a erradicação da malária em muitos países na
década de 1950. Além dos carbamatos que são inibidores da
acetilcolinesterase, agem provocando uma superestimulação do sistema
nervoso central.
Outro grupo de inseticida bastante utilizado são os piretróides.
São produtos derivados das piretrinas naturais extraídas do
Chrysanthemums. Esses produtos atuam no sistema nervoso através da
inibição da bomba sódio-potássio, mecanismo necessário para repetições
de impulsos ao longo das fibras nervosas (Andrade 1990), matando
rapidamente os mosquitos adultos.
Uma outra abordagem alternativa do uso de inseticidas veio
com o Methoprene, que é um análogo sintético de hormônios de insetos
denominados hormônios juvenis, sendo reconhecido como regulador de
crescimento de inseto. Quando aplicado no habitat aquático e absorvido
pelos imaturos de mosquito, esses ficarão com o sistema hormonal
desbalanceado, levando ao impedimento da emergência do adulto
(Andrade 1990).
19
1.5.2 Controle Biológico:
Por aproximadamente 30 anos, várias cepas de Bacillus
thuringiensis foram utilizadas com sucesso como biopesticidas, em sua
maioria contra pragas agrícolas (Porter et al. 1993). No decorrer do curso
da esporulação, algumas cepas de B. sphaericus e B. thuringiensis
sintetizam uma inclusão de esporos ou “cristais”, que contém proteínas
tóxicas para larvas de uma variedade de espécies de mosquitos. Em sua
maioria, os componentes presentes no cristal são duas proteínas de 51 e
42 kDa, que isoladamente não são tóxicas, sua toxicidade é formada por
sua interação (Baumann et al. 1991).
Estudos de microscopia eletrônica indicam que quando ocorre
a ingestão dos cristais pelas larvas de mosquitos, as células epiteliais do
sistema digestivo são o primeiro alvo das toxinas (Baumann et al. 1991).
As proteínas tóxicas se dissolvem no pH alcalino do sistema digestivo do
inseto, onde são ativados proteoliticamente e se ligam às membranas das
células epiteliais. As células são destruídas, e a larva para de comer e
morre (Porter et al. 1993).
Seus cristais tóxicos são protegidos por um exósporo, o que os
torna estáveis a variações de temperatura e à capacidade de continuar
tóxico em águas poluídas. O potencial molecular de toxicidade dos
esporos é alto comparado com pesticidas químicos, cerca de 300 vezes
mais tóxico do que piretróides sintéticos e 80.000 vezes mais tóxico do
que organofosforados (Porter et al. 1993).
Comparado ao B. sphaenicus o B. thunrngiensis possui muito
mais diversidade em cepas de inseticidas conhecidos. Além do que certas
cepas de B. sphaericus são tóxicas exclusivamente para dípteros, já o B.
thunrngiensis pode ser tóxico a um amplo espectro de insetos,
nematóides e protozoários. Dependendo da cepa em particular do B.
thuringiensis, a proteína tóxica pode ser específica para membros de
Lepidoptera, Coleoptera, ou Diptera, porém algumas são específicas tanto
para Lepidoptera quanto para Diptera (Porter et al. 1993).
20
Alguns produtos atingiram sucesso comercial moderado em
países em desenvolvimento, porém os altos custos de produção
impediram sua implementação plena. Além do que, surgiram algumas
dúvidas em relação a sua utilização a longo prazo devido ao
desenvolvimento de resistência, que já foi notificado, ao B. sphaericus em
populações selvagens de mosquitos Culex em diversos países (Federici
et al. 2003).
As toxinas se degradam em alguns dias, e os bacilos parecem
não ser tóxicos a outros insetos, animais e ao meio ambiente. No entanto,
sucesso operacional contra os três maiores gêneros de mosquitos: Culex,
Anopheles e Aedes se mostraram limitados e confinados a regiões
temperadas do globo, onde estes mosquitos não apresentam seu
verdadeiro desafio em saúde pública (Porter et al. 1993).
O uso de peixes larvicidas tem sido bastante difundido em
vários países como alternativa auxiliar no controle de vetores de
patógenos (FUNASA 2001). Recentemente, vários estudos têm focalizado
o uso de fungos entomopatogênicos para o controle de mosquitos
(Blanford et al. 2005). Assim, por exemplo, a co-aplicação de fungos com
inseticidas, tem sido uma alternativa para solucionar problemas da
resistência aos piretróides utilizados no controle.
1.6 Resistência
Duas linhagens de Cx. quinquefasciatus foram usadas no
presente estudo: a linhagem suscetível IAL, usada como controle, e que
tem sido mantida em insetário desde 1983 na seção de virologia do
Instituto Adolfo Lutz, em São Paulo. Originária do Município de Iguape,
provavelmente nunca entrou em contato com inseticidas; a linhagem PIN
que foi estabelecida em 1995 com a coleta de aproximadamente 3.000
espécimes adultos nas margens do rio Pinheiros, na zona sul do
Município de São Paulo (Bracco et al. 1997).
21
A linhagem IAL mostrou-se suscetível a todos os inseticidas
testados. Já a linhagem PIN demonstrou uma mortalidade de 58,8% ao
malathion, 47,5% ao fenitrothion e 59,4% ao propoxur e completa
suscetibilidade tanto ao DDT quanto à permetrina. A mortalidade nos
controles nunca foi superior a 8%. Tais resultados mostram resistência, na
linhagem PIN, ao malathion, fenitrothion e propoxur e suscetibilidade ao
organoclorado DDT e ao piretróide permetrina (Bracco et al. 1997).
1.7 A Técnica do Inseto Estéril (SIT – Sterile Insect Technique)
Estratégias de controle de insetos baseadas em agentes
químico e/ou biológicos, têm sido ineficientes na maioria das vezes, além
de serem altamente prejudicais ao meio ambiente. Problemas associados
ao custo econômico, impactos ambientais, possíveis efeitos sobre a
saúde humana e principalmente a resistência dos mosquitos vetores de
patógenos aos inseticidas levaram a propostas de novas estratégias de
controle. Uma dessas estratégias, denominada SIT (Técnica do Inseto
Estéril) tem sido amplamente utilizada há décadas propiciando resultados
positivos no controle de pragas agrícolas (Bushland 1955).
Knipling (1955) propôs o conceito de liberação de insetos
estéreis para controlar populações de pragas de importância agrícola. O
paradigma deste novo método foi a eliminação bem sucedida do
Cochliomyia hominivorax nos estados ao sul dos EUA, México e toda
América Central. Esta área está atualmente protegida de uma re-invasão
pela América do Sul pela liberação de relativamente poucas moscas
estéreis através da barreira feita no Panamá. Moscas estéreis também
foram utilizadas para eliminar a potencialmente devastadora entrada
desta espécie no norte da África (Bushland et al. 1955).
Segundo Robinson (2002), a SIT se baseia na criação em
massa, esterilização e liberação de grandes números de insetos machos
estéreis em uma área alvo. Os machos liberados cruzarão com fêmeas
selvagens, reduzindo o potencial reprodutivo da população selvagem e,
22
portanto causando a redução da população nas gerações subseqüentes.
Se um número suficiente de machos estéreis for liberado por tempo
suficiente, a população alvo entrará em colapso, levando à sua supressão
ou até mesmo sua eliminação total da área alvo. Sendo assim esta
técnica é espécie específica e não agride o meio ambiente.
A Mosca da Fruta do mediterrâneo, Ceratitis capitata (Diptera:
Tephritidae), é uma praga de grande impacto ambiental, que causa danos
a uma variedade de espécies de frutas em todo o mundo. Com a
utilização da técnica do mosquito estéril por radiação a Mosca da Fruta
tem sido controlada e até mesmo erradicada em várias regiões (Robinson
2002).
A família Díptera Tephritidae consiste em mais de 4000
espécies, das quais aproximadamente 250 apresentam importância
econômica e são amplamente distribuídas em climas temperados, sub-
tropicais e tropicais, uma delas, a Bactrocera cucurbitae ataca mais de 81
espécies de plantas (Dhillon et al. 2005). O controle químico contra a
Bactrocera cucurbitae é relativamente ineficaz e o uso da técnica do
mosquito estéril se provou eficaz erradicando a Bactrocera cucurbitae do
Japão por mais de 24 anos (Koyama et al. 2004)
Existem diversos exemplos onde a SIT está sendo aplicada
como controle preventivo para evitar o estabelecimento de moscas
exóticas invasoras. No sul da Austrália, onde machos estéreis estão
sendo liberados perto de Adelaide para prevenir a invasão de moscas
originárias da parte oeste do país. Em Okinawa, Japão, está em
progresso a liberação de Bactrocera cucurbitae estéreis para evitar a re-
invasão de moscas vindo de Yaiwan (Endrichs et al. 2002).
Segundo Myers et al. (1998), a erradicação da Cochliomyia
hominivorax, (causadora de miíases) é um exemplo de estudo clássico de
controle de insetos envolvendo tanto a erradicação de uma espécie em
uma área onde estava estabelecida como a erradicação em ambientes
previamente exóticos à esta espécie.
23
A Cochliomyia hominivorax, agente da miíase, coloca seus
ovos em feridas de mamíferos e causa grandes perdas econômicas. A
erradicação da Cochliomyia hominivorax foi alcançada através da técnica
de liberação de mosquitos estéreis (SIT). Milhões de moscas macho
foram criadas, esterilizadas e soltas. Entre 1958 e 1960, a Cochliomyia
hominivorax foi erradicada da Flórida e programas subseqüentes com o
objetivo de impelir seus limites no México e América Central. Sua
erradicação dos EUA e México foi alcançada em 1991 a um custo
estimado de US$750 milhões (Myers et al. 1998).
Esforços para a erradicação ainda persistem na América
Central, com erradicações bem sucedidas em Belize no ano de 1993, em
El Salvador em 1994 e em Honduras em 1995 (Bermúdez et al. 2007).
Como descrito anteriormente, a técnica do mosquito estéril
(SIT) tem sido aplicada com sucesso em um grande número de pestes
agrícolas e foi utilizada contra o Anopheles albimanus, Wiedemann 1970,
com resultados encorajadores. Nos últimos anos o interesse pela
utilização do SIT em vetores da malária levou a estudos que investigaram
todos os aspectos do programa SIT, incluindo produção em massa,
esterilização e metodologias de soltura (Helinski et al. 2006).
Segundo Helinski et al. (2006), além de utilizar radiação, a SIT
pode ser baseada na esterilização de insetos pela esterilização química
ou modernas abordagens biotecnológicas. Esterilização por radiação foi
extensivamente pesquisada em mosquitos nos últimos 30 anos.
Resultados promissores foram obtidos com esterilização química pelo alto
nível de esterilização induzido e “fitness”, porém com a desvantagem de
serem agentes mutagênicos que apresentam perigo em potencial aos
humanos durante o manuseio e animais se existirem resíduos em insetos
liberados.
Apesar da quantidade de resíduo liberado no meio ambiente ter
sido baixa devido ao cuidadoso processo de liberação, a preocupação se
tornou maior aos possíveis efeitos negativos ao meio ambiente se um
grande número de insetos tratados forem liberados (Helinski et al. 2006).
24
Ainda assim, valeria a pena identificar componentes adicionais com
propriedades de esterilização química. Permanece duvidoso se os
agentes químicos disponíveis hoje em dia terão níveis de toxicidade
aceitáveis para o uso em futuros programas de controle genético.
Determinar a dose ótima para um programa SIT depende do
nível de esterilidade que se quer induzir e a competitividade dos machos
irradiados. Uma dose baixa pode resultar em esterilidade insuficiente, e
uma dose alta pode reduzir a eficiência da liberação.
Mosquitos, pupas e adultos podem ser irradiados. Irradiação de
pupas é mais simples, porém existem evidências de uma redução na
competitividade quando pupas macho são irradiadas com doses altas em
comparação com mosquitos adultos (Helinski et al. 2006).
1.7.1 Sexismo Genético para uso na SIT
Uma das dificuldades de se implementar o programa de
liberação de insetos estéreis é a necessidade da liberação apenas de
indivíduos machos. A separação manual além de ser extremamente
laboriosa, em algumas espécies, não apresenta níveis aceitáveis de
contaminação de fêmeas entre machos (Delprat et al. 2002).
Desse modo, sistemas que causam a morte de fêmeas em
algum estágio de sua vida têm sido desenvolvidos, separando
automaticamente os machos das fêmeas, eliminando o trabalho da
separação e diminuindo a níveis muito baixos a presença de fêmeas entre
machos liberados (Shearman 2002).
Sistemas que causam a morte de fêmeas têm a vantagem de
poderem ser aplicados à população como um todo. Por exemplo, 5
milhões de ovos de Ceratitis capitata, podem receber tratamento térmico
em 5 litros de água. Isso pode ser contrastado com o uso de 40
separadores de pupa por cor, que pode separar apenas 12 milhões de
25
pupas por hora. A manipulação extra individual de cada pupa pode causar
um efeito negativo na qualidade final (Robinson 2002).
Um sistema letal para fêmeas, no entanto requer que duas
colônias sejam operadas em uma instalação apropriada. Primeiramente
uma colônia produtora onde os tratamentos restritivos não sejam
aplicados, as fêmeas não sejam mortas e a colônia possa ser mantida.
Então, uma segunda colônia onde os tratamentos restritivos sejam
aplicados para produzir machos para esterilização e liberação. Isso
significa que existem duas populações, uma que é tratada com calor e
produzira apenas machos e a segunda que não é tratada e produzira
machos e fêmeas (Robinson 2002).
Para sistemas baseados em seleção, a separação dos sexos
pode ser aplicada na mesma população que é usada para a manutenção
da colônia uma vez que as fêmeas podem ser recolocadas na colônia
após a separação. É desejável sob ponto de vista econômico que o
procedimento de sexagem ou seleção sejam feitos o mais cedo possível
no desenvolvimento do inseto (Robinson 2002).
Geralmente sistemas baseados em letalidade condicional de
fêmeas requerem a aplicação de uma substância química ou alteração
física do ambiente (calor). Existem várias razões justificando que
substâncias químicas não são ideais. Não é sempre possível tratar
embriões em desenvolvimento, uma vez que o cório pode ser
impermeável. Se um estádio larval tiver de ser tratado em uma dieta que
receba relativamente grandes quantidades de substâncias químicas, esta
tem que ser adicionada a uma quantidade grande de ração, o que pode
ter algum impacto no resultado esperado (Robinson 2002).
O sucesso da técnica de separação genética em moscas é
diretamente atribuído ao fato de que embriões podem ser facilmente
tratados com altas temperaturas. Uma mutação sensível a temperatura
que só é expressa tarde no desenvolvimento, apresentará sérios
problemas operacionais, uma vez que não é fácil regular a temperatura de
grandes volumes de ração em salas grandes. (Meats et al. 2002).
26
Todas as linhagens baseadas em translocações e mutações do
macho requerem que as fêmeas sejam homozigotas recessivas para a
mutação. Isso restringe os tipos de mutações que podem ser utilizadas.
Para a manutenção rotineira dessas linhagens em laboratório, uma
redução do “fitness” das fêmeas não é um problema sério, no entanto, em
grandes instituições onde produção é o mais importante, fêmeas com
“fitness” muito ruim são inaceitáveis. Todas as mutações recessivas serão
lesivas em alguma maneira para a fêmea, a chave para a questão é
quanto. Por exemplo, a redução da produção de ovos requer que uma
colônia proporcionalmente maior seja requerida apenas para a
manutenção da colônia (Robinson 2002).
Os machos são heterozigotos para a mutação e não é
esperado que qualquer efeito negativo seja percebido. Eles, no entanto
carregam uma translocação que reduz a fertilidade de suas parceiras em
50%. Isso deve ser levado em consideração quando se planeja instalação
de liberação em massa. Protocolos de controle de qualidade para
produção em massa de moscas são componentes muito importantes do
programa SIT (Robinson et al. 2004).
O método de obtenção para separação de sexo por meio de
um fenótipo depende do tipo de mutação e o mecanismo de determinação
do sexo. Tais métodos foram revistos por Robinson (1989) e envolvem
translocação cromossômica que, para aplicação prática, devem ser
estáveis, e não deletérios para competitividade sexual, fisiológica ou
comportamental incluindo seleção do habitat (Shearman 2002).
Moscas da Fruta possuem determinação por sexo que é muito
influenciada pelo sistema de cromossomos sexuais XX/XY. Uma linhagem
genética de separação sexual pode ser concebida para espécies
localizando-se uma mutação recessiva autossomal que é letal em
situações específicas, como a sensibilidade a altas temperaturas, que é
ligado ao alelo selvagem ao cromossomo Y usando a translocação. A
linhagem mutante para separação sexual deve possuir fêmeas
27
homozigotas para sensibilidade a temperatura e os machos
fenotipicamente normais para esta característica (Meats et al. 2002).
A constante termal de sobrevivência da Bactrocera tryoni foi
dada por Meats et al. (2002). A habilidade de sobrevivência a
temperaturas (altas ou baixas) depende da duração da exposição e do
estágio de vida que se encontram. Sobreviver a um estresse térmico em
um estágio de desenvolvimento em particular, pode estar associado a
uma menor habilidade de sobreviver a um estresse em um estágio
subseqüente, podendo estar associado a uma taxa de sobrevivência
menor do que o normal, mesmo que as condições termais sejam ótimas.
A habilidade de sobreviver a uma temperatura extrema pode ser afetada
dramaticamente pelo estado de aclimatação (Meats et al. 2002).
1.8 Controle Genético de Insetos: supressão e substituição de
população
O controle genético de vetores não é uma única estratégia,
mas possui uma variedade de técnicas promissoras, que podem ser
subdivididas em duas categorias baseadas na produção de insetos
transgênicos: substituição ou supressão de uma população alvo. O fator
comum é que o mecanismo de controle genético é introduzido na
natureza por cruzamentos (Curtis 1968).
O uso das tecnologias de controle genético para limitar o
tamanho da população vetora (supressão da população), ou para alterar a
população para que eles sejam resistentes a patógenos (substituição de
população) é discutido a seguir (Jasinskiene et al. 2007).
O sistema de controle genético para supressão de uma
população alvo é baseado na técnica de insetos estéreis (SIT), que levou
ao desenvolvimento da tecnologia conhecida como “liberação de insetos
carregando um gene letal dominante” (RIDL). Nessa estratégia, o produto
do transgene suprime a reprodução dos insetos alvos, que cruzados com
28
os mosquitos transgênicos levam ao declínio da população (Kokoza et al.
2001).
A utilidade da supressão de uma população depende da
ecologia da população vetora alvo. Particularmente o tamanho da
população selvagem, a área em que a liberação em massa será
conduzida, a estrutura genética da população selvagem e a pressão da
re-invasão de áreas não alvo adjacentes (Coleman & Alphey 2004).
1.8.1 Patógenos
Na estratégia de controle genético para substituição da
população, os mosquitos transgênicos devem carregar algum gene que
iniba o desenvolvimento de patógenos e, quando liberados no meio
ambiente, o transgene seja introduzido na população, passando a ser
dominante e assim reduzindo a transmissão de doenças (Moreira et al.
2000).
A expressão de genes ativados por repasto sangüíneo é de
grande importância e especificidade. Regiões reguladoras destes genes
podem ser usadas para expressar moléculas efetoras anti-patogênicas
em mosquitos geneticamente modificados com precisão temporal e
espacial designada para maximizar o efeito no patógeno (Kokoza et al.
2001).
No caso da transmissão da malária, pela sua distribuição
geográfica, se enquadra na categoria de estratégias genéticas de
substituição de população. Esta estratégia requer dois conceitos
fundamentais: a criação de um laboratório onde uma linhagem
geneticamente modificada se tornará refratária ao patógeno relevante e o
desenvolvimento de um sistema onde a característica refratária seja
difundida na população selvagem. Se a freqüência da característica
refratária na população vetora possa ser aumentada a um nível critico
29
onde a transmissão do patógeno não ocorra, o fardo da doença será
eliminado (Coleman & Alphey 2004).
Com o desenvolvimento de métodos padronizados de
microinjeções (Jasinskiene et al. 2007), a possibilidade de utilização de
mosquitos transgênicos está rapidamente ganhando força. A descoberta
de elementos de transposição mais apropriados para transformação de
mosquitos, os achados de marcadores de transformação ideais para o
monitoramento das transformações, tais como proteínas fluorescentes
GFP e DsRed (Handler 2002), a caracterização de promotores específicos
que podem controlar a expressão de genes estranhos em tecidos e
estágios específicos, e a identificação e caracterização de moléculas que
podem interferir com o desenvolvimento de parasitas no hospedeiro
invertebrado (Moreira et al. 2000).
1.8.2 Elementos de Transposição (transposons)
A transformação genética de uma variedade de insetos usando
diversos sistemas foram revistas extensamente por diversos autores. A
inserção de genes em insetos abre uma gama de opções para o controle
de populações de mosquitos de importância médica ou como controle de
pragas agrícolas (Alphey 2002).
Os sistemas disponíveis incluem transformação de embriões
que resultam em integrações hereditárias estáveis, como também
sistemas que permitem expressão transiente extracromossomal de um
sistema gênico, geralmente mediado por um sistema de vírus ou bactérias
(Allen et al. 2001).
Para a aplicação prática do sistema de expressão gênica em
insetos de importância médica, a transformação embrionária é
tipicamente mediada por um elemento de transposição que atualmente é
o método mais promissor. Estes elementos tem a capacidade de se
moverem no genoma devido a ação da transposase, e ocupam porções
30
significativas do genoma da maioria dos eucariotos (Lander et al. 2001).
Os elementos de transposição tem basicamente a mesma estrutura:
repetições terminais invertidas (RTI) de 10 a 30 pb, e uma unidade
transcripcional interna que codifica a enzima transposase, responsável
pela integração do transposon (ou um transgene) em um genoma
hospedeiro (mosquito, por exemplo), em um tipo de mecanismo “cortar e
passar” (Figura 5), e podendo ser divididos em duas classes:
Classe I: Retrotransposons: Os Retrotransposons funcionam
copiando-se e colando cópias em diversos lugares do genoma.
Inicialmente retrotransposons transformam-se em RNA, porém ao serem
transcritos, o RNA é transformado em DNA por uma transcriptase reversa,
que geralmente é codificada pelo próprio transposon, e é inserida
novamente no genoma (Behura 2006).
Classe II: Transposons DNA: A maior diferença entre
transposons de Classe II e retrotransposons é que seus mecanismos de
transposição não são intermediados por RNA. Transposons de Classe II
normalmente se movem cortando e colando, ao invés de copiar e colar,
usando a enzima transposase. Diferentes tipos de transposase funcionam
de diversas maneiras. Algumas podem se ligar a qualquer parte da
molécula de DNA, enquanto outras se ligam e seqüências específicas
(Handler 2002).
A transposase faz um corte no sítio alvo produzindo uma
saliência, o transposon é cortado pela transposase e ligado no sítio alvo.
A DNA polimerase preenche os espaços vazios e a DNA ligase fecha a
ligação açúcar-fosfato inserindo-o no genoma celular (Kokoza et al. 2001).
RTI RTI
gene que codifica a enzima transposase
31
Figura 5: Estrutura de um elemento de transposição. RTI - repetições terminais invertidas
(RTI) de 10 a 30 pb. Unidade transcripcional interna que codifica a enzima transposase.
Existem quatro sistemas disponíveis que utilizam transposons
de classe II que podem ser utilizados em uma grande gama de insetos.
São eles o Hermes da Musca domestica, mariner da Drosophila
mauritiana, Minos da D. hydei, e o piggyBac da Trichoplusia ni.
Curiosamente, os primeiros transposons estudados para
transformação de não-drosófilas, elemento P e hobo, foram descobertos
em D. melanogaster e já foram usados rotineiramente para está espécie.
Ainda assim estes dois elementos não possuem, ou possuem muito
pouca função quando utilizados fora da Drosophila, enquanto os outros
sistemas citados funcionam efetivamente em drosofilideos e não-
drosofilideos (O’Brochta et al. 2003).
Similar ao mariner, o elemento de transposição piggyBac foi
descoberto muito antes de seu uso potencial em transformações em não-
drosofilideos se tornar aparente. Notavelmente, ele foi descoberto pela
capacidade de transpor material genético de seu hospedeiro dentro de um
plasmídeo (Fraser et al. 1983).
Posterior análise molecular do elemento e sua caracterização
funcional por sua mobilidade transiente, combinado com sua capacidade
de incisão precisa e transposição em células e embriões indicaram seu
potencial uso como vetor para transformações embrionárias em várias
espécies de insetos (Grossman et al. 2000).
Similar ao Minos, ele foi primeiro testado em moscas usando o
sistema de marcadores brancos, mas ao invés dos outros vetores que
utilizavam calor, o piggyBac usou uma transposase indicando que o
piggybac tem uma função autônoma em diversas ordens de insetos
(Handler et al. 1998).
32
Transformação embrionária com piggyBac foi alcançada em
outros dípteros incluindo D. melanogaster (Handler & Harrell 1999),
Bactrocera dorsalis (Handler & McCombs 2000), Anastrepha suspensa
(Handler & Harrell 2001a), M. domestica (Hediger et al. 2001), A. aegypti
(Lobo et al. 2002), Anopheles albimanus (Perera et al. 2002); Bombyx
mori (Tamura et al. 2000), Pectinophora gossypiella (Peloquin et al. 2000);
e T. castaneum (Berghammer et al. 1999).
Ao invés dos outros elementos de transposição, o piggyBac
não é um membro de uma grande família de elementos, outros elementos
dividem a especificidade de integração no sitio do tetranucleotídeo TTAA.
Buscas pelo piggyBac não apresentaram evidências de sua existência
além do plasmídeo, e foi então, surpreendente achar múltiplos elementos
muito parecidos com o piggyBac presentes no genoma da B. dorsalis
(Handler & McCombs 2000). Hibridizações iniciais e estudos com PCR
indicaram que existem de 10 a 20 elementos no genoma de selvagens e
linhagens transgênicas, porém nenhuma se provou funcional.
Estudos de hibridização indicaram que o piggyBac existe
também na Spodoptera frugiperda, porém 140 desses elementos são
provavelmente formas muito truncadas.
A existência de um piggyBac em ambas, próximas e distantes
espécies sugere que ele recentemente foi transmitido por transmissão
horizontal e provavelmente existe em outras espécies. Esse movimento
teve de ser facilitado por elementos funcionais do piggyBac ou sistemas
de mobilidade cruzada, porém considerações sobre a estabilidade do
Hermes devem ser estendidas, assim como o piggyBac (Handler 2002).
1.8.3 Marcadores para a Seleção de Transformação
Para o monitoramento de parâmetros que influenciam o
sucesso de programas de liberação em massa de insetos, como no caso
da liberação de mosquitos estéreis pelo método SIT, é necessário que os
mosquitos liberados sejam discriminados dos selvagens. Estes
33
parâmetros incluem, a dispersão dos insetos a partir dos locais de
liberação, a sobrevivência desses em campo, e a competição por
acasalamento com os selvagens. Monitorar o tamanho de uma população
de campo, também seria outro parâmetro facilitado por um marcador que
discrimina os indivíduos liberados e os de selvagens (Alphey 2002).
Um dos métodos para marcação e monitoramento para
trabalho em campo utiliza a marcação de adultos liberados com pó-
fluorescente, que além de caro, compromete a capacidade de
acasalamento e competitividade dos insetos liberados.
No caso de manipulação genética de insetos, os genes
marcadores são utilizados para permitir a identificação de organismos
transgênicos. Expressando o gene marcador, o mosquito transgênico será
diferenciado dos não transgênicos verificando assim, o sucesso da
transformação. As primeiras tentativas de transformação de mosquitos
utilizavam inseticidas e genes de resistência a antibióticos como
marcadores da transformação (Miller et al. 1987; Morris et al. 1989). Este
método se tornou problemático devido às dificuldades de discriminar
larvas transformadas das não-transformadas. A concentração da droga
que deveria matar 100% das larvas não transformadas e que permitisse a
sobrevivência de cada larva transformada era de difícil determinação,
resultando na seleção de muitos falsos positivos.
Mais tarde, o uso de genes que resgatam a coloração do olho
passou a ser utilizado mostrando eficiência na identificação de Ae. aegypti
transgênico (Jasinskiene et al. 1998). No entanto, este marcador só se
aplicava em espécies que possuíam mutantes para a cor dos olhos, para
que o resgate da coloração original fosse possível, após a incorporação
do gene marcador.
Um grande avanço na técnica foi a utilização da proteína verde
fluorescente (green fluorescent protein ou GFP), pois esta tem a
vantagem de funcionar em várias espécies de animais, incluindo insetos
(Pinkerton et al. 2000, Horn e Wimmer, 2000, Catteruccia et al. 2000,
Kokoza et al. 2001), células de mamíferos (Cheng et al. 1996) e em
34
espécies de protozoários como P. berghei e P. falciparum (De Koning-
Ward et al. 1998, Kadekoppala et al. 2000).
O GFP controlado pelo promotor constitutivo de actina de
Drosophila foi utilizado pela primeira vez como marcador de mosquitos
transformados em A. aegypti (Pinkerton et al. 2000), tendo a vantagem de
ser detectado em qualquer fase de vida, economizando tempo e esforço
de criar mosquitos não transgênicos até a fase adulta (Moreira et al.
2002). Além de controlado pelo promotor de actina, outras construções
utilizando GFP com promotores de poliubiquitina e 3xP3 (específico de
olho) têm sido produzidos com sucesso. Destes, o promotor específico de
olho (3xP3) é o de preferência, uma vez que a expressão em tecidos do
olho pode reduzir um possível efeito tóxico da proteína GFP. Este
promotor, como os constitutivos, dirige a expressão em todos os estágios
de desenvolvimento. A expressão em sistemas ópticos permite a
identificação de transgênicos em organismos com cutículas espessas e
melanizadas.
O GFP tem sido o marcador de preferência em transformações
de mosquitos, e tem sido usado em A. aegypti (Pinkerton et al. 2000,
Kokoza et al, 2001), Culex quinquefasciatus (Allen et al. 2001) A.
stephensi e A. gambiae (Catteruccia et al. 2000, Ito et al. 2002).
Outro marcador bastante utilizado é o DsRed2, uma proteína
fluorescente vermelha, que foi clonada do coral Discosoma
homologamente a proteína fluorescente verde (GFP) da água viva
Aequorea. A proteína fluorescente vermelha (DsRed) tem um brilho mais
intenso e estabilidade contra variações de pH, desnaturações e foto
sensibilidade. Pode ainda, sofrer mutações para emitir maiores
comprimentos de onda e apresentar mais excitação (Gross et al. 2000).
Além das proteínas GFP e DsRed, outras proteínas
fluorescentes têm sido sugeridas para uso em organismos transformados,
como por exemplo, o AmCyan. Cada qual necessita de filtros com
comprimentos de onda específicos para visualização, possibilitando a
inserção de mais de um marcador fluorescente, permitindo que mais de
35
um gene seja inserido e monitorado no mesmo indivíduo. Pode-se
também, inserir dois marcadores fluorescentes com promotores ligados a
genes distintos propiciando expressões em locais e situações distintas
(Baird et al. 2000).
1.9 O Melhoramento da Técnica SIT
O controle de populações de insetos com a técnica SIT tem
sido realizado com sucesso em diversas ocasiões, erradicando pragas
agrícolas e ajudando no combate a vetores de patógenos. Este método
de controle, também conhecido como método de liberação de mosquitos
estéreis, é espécie-específico e não poluente ao meio ambiente. Ele está
baseado na liberação em massa de machos estéreis (Bushland 1955). O
acasalamento dos machos estéreis com as fêmeas selvagens leva a uma
diminuição no potencial reprodutivo das fêmeas, e se forem liberados em
número suficiente por um período de tempo, pode levar à uma
erradicação da população vetora ou peste de agricultura local.
Baseado nos princípios da técnica SIT havia grande otimismo
no final da década 1960 e início da década de 1970 no uso desta técnica
como estratégia alternativa no controle de mosquitos vetores de doenças.
Entretanto, a técnica SIT tem sido usada somente contra um número
restrito de espécies de mosquitos alvos. Este fato é devido em grande
parte a alguns problemas fundamentais do sistema.
Os insetos machos liberados devem competir por
acasalamento com os tipos selvagens e o processo de produção, e em
particular a necessidade de esterilizar os insetos machos por radiação
pode, em alguns casos, causar uma perda drástica na capacidade de
acasalamento destes insetos comparados aos machos selvagens. Os
machos irradiados podem ser menos competitivos e também apresentar
um tempo de vida reduzido (Alphey 2002). A combinação destes dois
fatores pode levar a uma redução nos parâmetros de fitness de Cx.
quinquefasciatus (acasalamento e sobrevida). Como exemplo, o método
de esterilizaçao usado para Mosca da Fruta, Ceratitis capitata, levou a
36
redução de quatro a dez vezes nos parâmetos de competividade
prejudicando o programa de erradicação dessa espécie (Rendón et al.
2000; Boake et al. 1994).
As instalações de irradiação são caras e potencialmente
perigosas (Alphey 2002). Há ainda a possibilidade de liberação de
indivíduos irradiados, porém ainda férteis, o que pode ser potencialmente
perigoso. A logística é prejudicada pela necessidade de soltura em
estágios de vida pré-estabelecidos e pela distância das instalações das
áreas alvo.
Além disso, e em todas situações, no esforço de suprimir
determinada população vetora de patógenos, é importante a liberação
exclusiva de mosquitos machos, por não exercerem a hematofagia.
Somente as fêmeas adultas fazem o respasto sanguíneo e são as
responsáveis pela transmissão de agentes patogênicos. A liberação em
massa de machos estéreis mesmo que contaminados com uma mínima
porcentagem de fêmeas não seria aceitável do ponto de vista ético, não
somente pelo incômodo que essas fêmeas poderiam provocar, mas
também pela possibilidade de contribuir com a transmissão.
Outro fato importante é que as fêmeas estéreis podem
comprometer o sucesso do programa ao inibir o acasalamento dos
machos estéreis com as fêmeas selvagens, podendo ocorrer neste caso
um efeito neutralizador quando liberadas junto aos machos estéreis. Tal
fenômeno foi demonstrado com Ce. capitata, ocasião em que a liberação
somente de machos foi três a cinco vezes mais efetiva do que a liberação
equivalente de machos misturados com fêmeas (McInnis et al. 2002).
Para algumas espécies de culicídeos, a separação entre
machos e fêmeas poderia ser feita por métodos físicos, baseados no
tamanho das pupas, porém, sob o ponto de vista prático, essa estratégia
seria extremamente trabalhosa e inviabilizaria qualquer projeto em grande
escala. Com moscas tse-tse, a separação mostrou-se exeqüível com base
no tempo de eclosão, que diferia entre os sexos. Na prática esses
métodos raramente mostram-se eficazes e seriam portanto de aplicações
37
restritas. Na Índia, centenas de milhares de machos de Culex e Aedes
foram diariamente produzidos, porém sempre com “contaminação” por
fêmeas nos lotes de pelo menos 0.2%, pelo uso de separadores de pupas
(Sharma et al. 1972).
Uma alternativa para produzir somente machos seria induzir o
dimorfismo sexual utilizando-se de estratégias da genética. Tais métodos,
são conhecidos como mecanismos de sexismo genético, citados
anteriormente. Os métodos mais usados são baseados na translocação
do cromossmo Y induzida por radiação como marcador seletivo
dominante, complementar a um gene ligado ao X ou autossomo, tal como
a cor da pupa, a letalidade sensível à temperatura ou a resistência a
inseticida (Robinson et al. 1999). Porém, como discutido anteriormente,
haveria ainda a necessidade de radiação, que causa perda na capacidade
de acasalamento destes insetos comparados aos machos selvagens.
Além disso, sistemas baseados em aberrações cromossômicas tendem a
ser instáveis, e a reversão pode ser um problema quando da produção e
liberação de insetos em larga escala, além de reduzir o fitness dos insetos
tornando-os menos efetivos em relação ao SIT (Thomas et al. 2000).
1.10 O Sistema RIDL: potenciais melhorias para o SIT usando
engenharia genética.
Seria claramente uma vantagem ser possível monitorar
parâmetros que influenciam ou buscam a eficiência de um programa de
liberação em massa. Isto inclui a dispersão dos insetos a partir de seu
ponto de soltura, sua sobrevivência na natureza e sua eficiência em
competir por fêmeas. Também seria útil ser capaz de monitorar o
tamanho da população selvagem.
Um sistema eficiente, de baixo custo para remover fêmeas da
população que será liberada seria o maior beneficio para os programas de
SIT. Isso pode ser alcançado introduzindo um gene letal especifico para
fêmeas que pode ser induzido (ou reprimido) na população a ser liberada,
levando a morte dessas fêmeas (Alphey 2002).
38
Este novo sistema pode ser considerado uma variante do SIT,
“liberação de insetos carregando um gene letal dominante” (RIDL), porque
os insetos na verdade não são estéreis, mas geneticamente modificados
(Thomas et al. 2000). O sistema de RIDL (do inglês “Release of Insects
carrying a Dominant Lethal gene”) proposto simultaneamente por Thomas
et al. (2000), e Heinrich & Scott (2000), consiste na integração de um
gene letal dominante associado a um promotor específico da fêmea,
como por exemplo o promotor do gene para vitelogenina.
O centro do sistema é o tTA, uma fusão de proteínas que
combinam a seqüência especifica de DNA tetraciclina repressível
adicionando propriedades da proteina Tn10 TetR com as propriedades de
ativação transcripcional eucariótica do Herpes vírus VP16. Na ausência
de tetraciclina, esta proteína se ligará a seqüência tetO e ativará a
transcrição de um promotor mínimo adjacente (Grether et al. 1995).
Colocando-se um gene efetor sobre o controle de tetO uma grande
variedade de genes se tornam disponíveis. Tudo que é requerido é que
eles matem a célula quando expressados (Fortini et al. 1992).
Uma forma de se tornar o sistema específico de fêmeas é se
colocar a proteína tTA sob o controle de um promotor específico de fêmea
(Figura 6). A proteína de tTA é então expressa apenas em fêmeas,
portanto os machos sobrevivem com ou sem tetraciclina porém, as
fêmeas perecem em sua ausência.
Figura 6: tTA e o sistema de expressão repressível de tetraciclina. Fonte: Alphey 2002
39
O sistema RIDL requer que uma linhagem do organismo alvo
possua um gene, dominante, condicional, sexo-específico e letal. Onde
uma condição permissiva possa ser criada em laboratório, mas não na
natureza. Thomas et al. (2000), construíram um sistema RIDL em
Dhrosophila melanogaster usando elementos de controle transcripcionais
para direcionar a expressão da proteína de fusão tetraciclina reprimível
(tTa).
Na ausência de tetraciclina, tTa expressará qualquer gene sob
o controle do elemento responsivo para tetraciclina (tRe). O tTa foi
primeiramente expresso sob ativador de corpo gorduroso yp3 que leva a
expressão em larvas fêmeas e adultas, porém não em machos (Thomas
et al. 2000). O corpo gorduroso é um órgão essencial cujas funções
incluem processamento e armazenamento de nutrientes e a síntese de
componentes para o sistema imune do inseto. É esperada então, a
expressão do gene citotóxico no padrão do yp3 para ser letal a fêmeas e
desta forma apenas machos sobreviveriam para ser liberados na natureza
criando um sistema genético de separação sexual hereditário (Thomas et
al. 2000).
Do mesmo modo, Heinrich & Scott (2000) desenvolveram um
sistema específico de fêmeas, tetraciclina-repressível na mosca
Drosophila melanogaster. Um dos componentes do sistema, que mais
tarde foi denominado de RIDL, é o gene sob o controle do corpo
gorduroso, e o aumento da transcrição do gene yolk protein 1 específico
de fêmeas controlado pela tetraciclina (Figura 6). Outro elemento
consiste no gene pró-apoptótico hid sob o controle de um elemento
sensível a tetraciclina. Linhagens de machos e fêmeas carregando os
dois componentes são viáveis em meio suplementado com tetraciclina,
mas apenas machos sobrevivem em meio normal. Uma linhagem com
estas propriedades seria ideal para um programa de liberação de insetos,
40
que é mais efetivo quando apenas machos são liberados (Heinrich &
Scott 2000).
Figura 7: O sistema letal especifico de fêmeas regulado por tetraciclina. Fonte: Heinrich
& Scott 2000
O RIDL possui algumas vantagens sobre o SIT, como por
exemplo, os insetos seriam mais competitivos na natureza do que os
produzidos por SIT. Não existe risco de radiação e soltura de animais não
irradiados. Pode ser aplicado em insetos que não toleram radiação, como
os mosquitos. Os insetos podem ser liberado em qualquer estágio de
desenvolvimento. O RIDL não necessita de radiação e, portanto não é
associada a altos custos ou danos ambientais (Alphey 2002).
Os insetos geneticamente modificados recebem uma dieta
suplementada com um repressor químico (tetraciclina), que mantém o
41
gene letal desligado. Ao remover o repressor químico todas as fêmeas
morrem restando apenas machos prontos para serem liberados na
natureza. Este processo possibilita a criação em massa de insetos
geneticamente modificados uma vez que com a adição do repressor
químico as fêmeas sobrevivem normalmente. Esta possibilidade
apresenta um grande avanço na logística de criação em massa e
liberação em áreas alvo (Phuc et al. 2007).
Machos geneticamente modificados quando liberados na
natureza irão cruzar com fêmeas selvagens. Tal cruzamento irá resultar
em nascimentos de machos viáveis, mas de fêmeas inviáveis, uma vez
que a letalidade dominante em fêmeas deve ser expressa na ausência do
repressor químico usado como supressor do gene letal. Os machos não
irão produzir nenhuma fêmea, e os machos que eclodirem possuirão a
construção do RIDL na forma heterozigótica, e contribuirão na eliminação
das fêmeas em gerações posteriores (Coleman & Alphey 2004).
42
2 Objetivos:
2.1 Objetivo Geral
Obter linhagens de mosquitos transgênicos Culex
quinquefasciatus carregando um gene letal dominante (sistema RIDL), as
quais poderiam ser utilizados no controle desses mosquitos, com vistas a
garantir estratégias de elevada eficiência, específica para o inseto alvo, e
de mínimo impacto ambiental.
2.2 Objetivos Específicos
01 Padronizar a técnica de microinjeção para Culex
quinquefasciatus para obtenção de uma taxa de eclosão viável aos
experimentos.
02 Padronizar o procedimento entre os cruzamentos de
indivíduos injetados e selvagens para Culex quinquefasciatus.
03 Obter linhagens de mosquitos transgênicos Culex
quinquefasciatus carregando um gene letal dominante.
43
3 Material e Métodos
3.1 Colônia de Mosquitos
Neste estudo foram utilizados mosquitos de uma colônia de
Culex quinquefasciatus mantida no insetário do Laboratório de Mosquitos
Geneticamente Modificados do Instituto de Ciências Biológicas 2 (ICB-II),
Departamento de Parasitologia da Universidade de São Paulo. Os
mosquitos que formaram a colônia foram originalmente capturados nas
margens do rio Pinheiros próximo a Cidade Universitária (USP).
Nesta colônia os mosquitos são mantidos sob temperatura
(27ºC ± 1ºC), umidade relativa (70 ± 10 %) e período luminoso
(fotoperíodo) com a duração de 14h. Estes insetos são alimentados com
sacarose 10% e semanalmente com camundongos da linhagem Balb-C
anestesiados com 100µl de uma solução de 50% de Acepram a 0,2% e
50% de Calmium por via muscular.
Quatro dias após a alimentação sangüínea, realizada no
período noturno, é colocado um recipiente com água autoclavada no
interior das gaiolas para que as fêmeas realizem a postura dos ovos.
Após 24 horas os recipientes contendo os ovos são retirados
das gaiolas e acompanhados até a eclosão das larvas. As larvas
eclodidas são então coletadas e concentradas em um recipiente, para que
sejam distribuídas em bacias plásticas contendo aproximadamente 1L de
água.
A alimentação das larvas é realizada diariamente com ração para
peixes (Goldfish Colour). As pupas obtidas são separadas em machos e
fêmeas e após a emersão os adultos são colocados em gaiolas.
3.2 Animais
Os camundongos adultos da linhagem Balb-C, utilizados na
alimentação sangüínea dos mosquitos, são produzidos pelo biotério do
ICB-II da USP. Todos os animais utilizados neste trabalho foram mantidos
44
e tratados sob condições estritas de ética de acordo com as
recomendações internacionais de bem-estar do animal (National
Research Council, 1996).
3.3 Construções Utilizadas
Foram utilizadas três construções denominadas LA513, LA882
e LA3653, descritas a seguir:
Estrutura e Função das Construções LA513 e LA882
O LA513 (Figura 8) e o LA882 (Figura 9) são construções que
utilizam o transposons piggyBac não autônomos (Classe II).
Os transgênicos obtidos a partir dessas construções podem ser
facilmente identificados devido a expressão do DsRed2. Nestas
construções, o tTAV (tetracycline-repressible transcription activator) é um
ativador transcripcional tetraciclina repressível que se encontra sobre o
controle de seu próprio sitio de ligação, teTO, um promotor mínimo de
Drosophila hsp70, e uma seqüência 3’ UTR de Drosophila fs(1)K10.
Na ausência de tetraciclina, tTAV se liga ao teTO o que leva a
expressão de mais tTAV, em um possível feedback positivo. Na presença
de tetraciclina, tTAV não se liga ao teTO, ligando-se a tetraciclina. A
tetraciclina não se liga ao teTO e portanto não leva a expressão de mais
tTAV.
Conseqüentemente, estas construções geram altos níveis de
expressão de tTAV na ausência de tetraciclina, mas apenas uma
expressão basal em sua presença. Altos níveis de expressão de tTAV é
tóxico, possivelmente por causa da interação do domínio VP16 com
fatores de transcrição chaves, então esta construção proporciona um
sistema letal tetraciclina-repressivel.
45
#513 PB Red tetO-tTAV
11920 bp
tTAV
VP16
tetR
bla (amp[R])
DsRed2
tetOx7
Adh intron
piggyBac 5'
piggyBac 3'
hsp70 minpro
Act5C promoter
pUC ori
5' ITR
3' ITR
drosomycin 3
'
Asc
I (2470)
Not
I (6653)
Cla
I (4854)
Cla
I (6764)
Eco
RI (3011)
Eco
RI (6562)
Hin
dIII (8425)
Hin
dIII (11082)
Apa
LI (8647)
Apa
LI (9144)
Apa
LI (10390)
Sma
I (1)
Sma
I (1038)
Sma
I (6151)
Xma
I (1036)
Xma
I (6149)
Xma
I (11919)
Pst
I (3077)
Pst
I (3632)
Pst
I (6962)
Pst
I (11074)
Pst
I (11098)
Nco
I (186)
Nc o
I (845)
Nc o
I (1937)
Nc o
I (2502)
Nco
I (3546)
Nc o
I (4299)
Ava
I (300)
Ava
I (876)
Ava
I (1036)
Ava
I (1315)
Ava
I (2495)
Ava
I (3703)
Ava
I (6149)
Ava
I (11919)
Figura 8: Estrutura e Função dos Transposons LA513. Fonte: Phuc et al. 2007
A construção LA882 (Figura 9) é muito semelhante à LA513
(Figura 8), a principal diferença é no uso do promotor IE-2 derivado do
baculovirus OpNPV para comandar a expressão do marcador DsRed2, no
lugar do Act5C (Phuc et al. 2007).
46
#882,3 PB-Op-Red-teto-tTAV
9320 bp
tTAV
VP16
tetR
bla (amp[R])
DsRed2
tetOx7
Adh intron
piggyBac 5'
piggyBac 3'
nls
SV40 polyA
hsp70 minpro
OpIE2 promoter
pUC ori
5' ITR
3' ITR
nls
Bam
HI (8767)
Cla
I (112)
Hin
dIII (1773)
Hin
dIII (4430)
Sma
I (5269)
Sma
I (6307)
Xma
I (5267)
Xma
I (6305)
Apa
LI (1995)
Apa
LI (2492)
Apa
LI (37 38)
Pst
I (310)
Pst
I (4422)
Pst
I (4446)
Pst
I (8392)
Nc o
I (5455)
Nco
I (6114)
Nco
I (7206)
Nco
I (8306)
Nc o
I (8726)
Ava
I (5267)
Ava
I (5569)
Ava
I (6145)
Ava
I (6305)
Ava
I (6584)
Ava
I (8463)
Figura 9: Estrutura e Função dos Transposons LA882. Fonte: Phuc et al. 2007
A construção LA3653, apresentada na Figura 10 apresenta
dois promotores, um específico de olho 3xP3 e o quase onipresente
Hr5IE1, e dois marcadores diferentes, o DsRed2 e o AmCyan.
47
Figura 10: Estrutura da Construção LA3653
Este plasmídeo não possui integrado em sua construção um
gene letal, não possui a expressão da proteína tetraciclina-repressível
TTAV e, portanto não necessita do repressor químico tetraciclina, por isso
apresenta maior eficiência, por volta de 5 a 15% de sobrevivência.
48
3.4 Transformação e Clonagem
3.4.1 Meio de Cultura
Foram feitas placas de Meio LB-Agar para o cultivo de
bactérias competentes a fim de inserir os plasmídeos. Utilizamos 500 ml
de LB-Agar (para cada 20 placas), adicionamos 4,5g de Bacto Agar, 3g
de Triptona, 1,5g de estrato de levedura e 3g de NaCl. Essa mistura foi
autoclavada.
Após autoclavagem o meio foi distribuído nas placas. Foi
adicionado 100mM de IPTG (23,8 mg/ml de água), solução de XGAL a
2% (0,02g/1ml) e as placas foram mantidas a -20
o
C.
3.4.2 Preparo das Células Eletro-Competentes
Células eletro competentes DH10B foram preparadas para a
replicação dos plasmídeos. Foram plaqueadas células DH10B e mantidas
a 37ºC durante a noite (overnight). Utilizando um palito autoclavado uma
colônia isolada foi retirada e colocada em um tubo com 5ml de meio LB
pré-aquecido em banho-maria à 37ºC e o deixamos em agitação
“overnight”, também a 37ºC.
Foi retirado então, 5ml de meio com células competentes e
colocado em um recipiente com 500ml de meio de cultura LB, que foi
mantido novamente sob agitação até alcançar densidade óptica de 0,650.
A cultura foi então retirada e colocada no gelo por 30 minutos.
Foram feitas alíquotas em tubos tipo Falcon 50ml e
centrifugadas à 7000xG durante 5 minutos, a 4ºC. O sobrenadante foi
descartado, as células foram ressuspendidas em 500ml de água gelada e
centrifugadas novamente a 7000xG durante 5 minutos, a 4ºC. Repetindo
o procedimento, o sobrenadante foi descartado, as células foram
ressuspendidas em 250 ml de água gelada, e centrifugadas novamente a
7000xG durante 5 minutos, a 4ºC.
O sobrenadante foi descartado e as células foram
ressuspendidas em 10ml de glicerol gelado a 10%, centrifugando
49
novamente a 7000xG durante 5 minutos a 4ºC. Após descartar o
sobrenadante as células foram ressuspendidas em 1,5ml de glicerol a
10%, estando assim as células competentes pronto para uso.
Para a clonagem dos plasmídeos foi adicionado 5µl de cada
Plasmídeo a 100µl de células Competentes.
Para cada placa de Meio produzido previamente foi colocado:
40µl de XGAL, 4µl de IPTG, 100µl de água e 100µl da solução que foi
colocada no Shaker. As placas ficaram em estufa a 37ºC “overnight”.
Foram coletadas apenas colônias isoladas e colocadas
individualmente em tubo Falcon de 50ml. Foi adicionado então 3ml de LB
líquido e 3µl de Ampicilina. Os tubos foram colocados no agitador
“overnight” a 37ºC e 150 RPM.
3.4.3 Purificação dos Plasmídeos
Mini Preparação (Mini-Prep)
Foi realizada uma Mini Preparação para purificação dos
plasmídeos obtidos nas transformações das bactérias. Coletamos 2,5ml
de cultura das colônias mantidas “overnight” e centrifugamos a 12500
RPM, desprezando o sobrenadante. Foi adicionado 300µl de solução 1
(Glicose 2M, Tris HCl 1M pH 8) ao “pellet” de Bactérias, que foi então
ressuspendido com uma ponteira. Foi acrescentado 300µl da solução 2
(SDS 1%, NaOH 200nM), misturando por inversão. Incubamos 5 minutos
em temperatura ambiente.
Adicionamos 300µl da solução 3 (Acetato de Potássio 2M) e
misturamos por inversão. Incubamos em gelo por 10 minutos e
centrifugamos a 12500 RPM a 4ºC por 15 minutos. Recuperamos o
sobrenadante, transferindo-o para um novo tubo. Tratamos com RNAse,
adicionando 5µl de RNAse (10mg/ml) e incubamos a 37ºC por 30 minutos.
Acrescentamos então, 600µL de clorofórmio isoamílico e misturamos por
inversão. Centrifugamos a 12500 RPM a 4ºC por 15 minutos. Coletamos o
sobrenadante e transferimos para um novo tubo, adicionamos 600µL de
50
isopropanol absoluto e incubamos por 30 minutos. Centrifugamos a 12500
RPM a 4ºC por 15 minutos. Descartamos o sobrenadante. Lavamos o
pellet com 1000µl de ETOH a 70% e hidratamos o pellet com 50µl de T.E.
Mini Prep Qiagen
Foram selecionadas 3 amostras de cada plasmídeo,
adicionamos 1µl de plasmídeo a 40µl de células competentes e deixamos
sob agitação por 16 horas. A partir deste material foi feita uma Mini Prep
com um kit comercial da Qiagen.
Maxi Prep Qiagen
A partir dessas duas amostras purificadas com o Kit de Mini
Prep Qiagen, as amostras LA513, LA882 e Helper (Figura 11) foram
novamente inoculadas em bactérias competentes e purificadas com o Kit
Maxi Prep Qiagen. Obtivemos ainda uma nova construção de nosso
colaborador, Dr. Luke Alphey, o LA3653 que também foi submetido a uma
Maxi Prep Qiagen.
51
Figura 11: Gel de agarose 1,0% com as amostras obtidas pela Maxi Prep Qiagen.
Coluna 1 –Marcador de Peso Molecular com 10 mil pares de base. Coluna 2 –
Construção LA513, Coluna 3 – Construção LA882, Coluna 4 – Plasmídeo Helper.
3.5 Microinjeção: procedimentos
3.5.1 Solução de Injeção
A cada procedimento de micro-injeção foi feita uma solução de
cada um dos plasmídeos em tampão KCl 0,1nM, NaH
2
PO
4
.
Utilizamos o plasmídeo a 0,5ng/µl, o HELPER piggyBac a
0,3ng/µl e completamos a solução com tampão até atingir 40µl. Este
processo foi repetido em todos os lotes de injeção, utilizando sempre a
concentração de 0,5ng/µl para os plasmídeos (LA513, LA882 e LA3653) e
0,3ng/µl para o HELPER piggyBac.
52
3.5.2 Preparação dos Capilares
Os capilares de quartzo, utilizados na microinjeção, foram
confeccionados por estiramento no equipamento Sutter (Figura 12) nas
seguintes condições:
Ciclo 1: Heat 421, Pull 150, Velocidade 150 e Time 200.
Ciclo 2: Heat 421, Pull 200, Velocidade 200 e Time 200.
A mistura de DNAs, por volta de 2 µl, foi inserida nos capilares
com o auxílio de uma microponteira Eppendorf (microloader).
Figura 12: Capilar de quartzo após ser confeccionado por estiramento no equipamento
Sutter
.
53
3.5.3 Padronização da Disposição dos Ovos
Foram realizados 4 experimentos distintos (em 10 réplicas) com o
intuito de obter o maior número de eclosões. Partimos do princípio de que
os ovos tem de permanecer úmidos ou tocando a superfície da água. Os
ovos foram dispostos sempre com o pólo posterior para baixo e nunca
submerso.
No primeiro experimento (Tabela 1) os ovos foram alinhados em
lamínula e fixados em uma lâmina. Um papel filtro foi colocado em contato
com a parte posterior dos ovos e o inserido em um tubo Falcon de 50ml
disposto a 90
o
e com cerca de 30 ml de água com tetraciclina.
Em outro experimento (Tabela 2), o mesmo processo foi repetido
sem papel filtro, colocando água até que tocasse na base dos ovos.
Foi também testado a taxa de eclosão em placas de Petri,
dispondo a lâmina com a lamínula e os ovos em um ângulo de
aproximadamente 45º. O procedimento foi repetido encostando o papel
filtro no pólo posterior dos ovos (Tabela 3), ou colocando os ovos em
contato com superfície da água (Tabela 4).
O controle foi feito com jangadas intactas dispostas diretamente na
água. A água ou papel filtro fica e contato com os ovos sempre pela parte
posterior. Estes experimentos foram mantidos à mesma temperatura e
umidade controlada que o restante da colônia (27ºC ± 1ºC e 70 ± 10 % de
umidade)
3.5.4 Microinjeções em embriões de Culex quinquefasciatus
Machos e fêmeas de Culex quinquefasciatus adultos foram
colocados na mesma gaiola para realização da cópula. Após três dias foi
oferecido repasto sangüíneo em camundongos.
Quatro dias após o repasto sangüíneo, foram colocados
recipientes contendo água autoclavada nas gaiolas, no foto período
noturno. Após 30 minutos os recipientes foram removidos e as jangadas
54
de ovos retiradas e colocadas em papel filtro sob uma lupa
estereoscópica.
Os ovos então foram alinhados na mesma orientação, pois a
agulha deve penetrar sempre no pólo posterior (Figuras 13 e 14). Os ovos
depois de alinhados foram fixados em uma lamínula com uma fita dupla-
face, cobertos com óleo e levados ao microscópio óptico para a
microinjeção. Esta foi realizada no aparelho Fento-Jet da Eppendorf .
Figura 13: Alinhamento dos embriões Figura 14: Injeção no pólo posterior do embrião
3.6 Procedimentos Após as Microinjeções: tentativa de se obter uma
linhagem transgênica
Após realizadas as microinjeções, as lamínulas contendo os
ovos injetados foram coladas em uma lâmina com a parte posterior dos
ovos voltadas para baixo. Um papel filtro foi colado de forma a encostar-
se à parte posterior dos ovos. A lâmina então foi colocada em um tubo
falcon de 50ml contendo 30ml de água com Tetraciclina na concentração
de 30ug/ml e deixados por dois dias em uma sala com temperatura e
umidade controladas. Após esse período, a maioria dos ovos eclodiram,
porém algumas larvas ficaram presas na fita dupla-face e foram
removidas com água destilada. As larvas foram transferidas para uma
55
caixa de plástico com 1L de água com Tetraciclina na concentração de
30ug/ml e alimentadas com ração para peixe (Goldfish Colour).
Os embriões injetados com a construção LA3653 não
necessitam do repressor químico (tetraciclina) em seu meio, uma vez que
o plasmídeo não possui gene letal efetor. Todos os outros procedimentos
foram similares.
As pupas foram colocadas individualmente em copos, e após a
emergência dos adultos, para cada macho eram colocadas dez fêmeas
selvagens (agrupamento dos machos) e para cada fêmea eram colocados
três machos (agrupamento das fêmeas). Após três dias foi oferecido o
repasto sanguíneo, e novamente três dias depois eram colocados
pequenos béqueres contendo água com tetraciclina para a oviposição.
Após alguns dias as posturas eram retiradas e os ovos colocados em
recipientes com água e tetraciclina na concentração de 30ug/ml para a
eclosão.
As larvas eclodidas foram mantidas até aproximadamente o
estágio de L4 e então foram analisadas quanto à presença de DsRed.
3.7 Amplificação do Gene Marcador DsRed2 por meio da Reação em
Cadeia da Polimerase
Foi realizado amplificação do gene marcador DsRed com os
oligonucleotídeos (primers) :
dsRed-F 5´-GGCGCGCCATGAAGCTTGCCTCCTCCGAGA-3´ e
dsRed-R 5´-AGTACTGAATTCCTAGGTTAGTGGTGGTGGTGGT–3´
Em todas as Maxi-Prep para confirmação da presença das construções
nas purificações.
Além disso também foi realizado o mesmo procedimento (PCR)
utilizando o DNA de extraído de mosquitos injetados, que morreram no
decorrer do experimento. Estes mosquitos foram separados em 10
56
mosquitos por pool, macerados e submetidos a extração de DNA com o
kit comercial da Invitek
®
(Invisorb Spin Tissue Kit).
Após a extração do DNA executamos a PCR, mesmo nas
amostras que se mostraram negativas para a presença de DsRed.
57
4 Resultados e Discussão
Durante as décadas de 1950 e 1960 ocorreram, em muitas regiões
endêmicas de malária, a utilização em massa de inseticidas (DDT) de
forma bem organizada em domicílios e peri-domicílios contra populações
de mosquitos vetores suscetíveis aos plasmódios. Esse procedimento
erradicou com sucesso a malária do sul da Europa e Taiwan, reduzindo
ainda casos de malária na Índia de aproximadamente 75 milhões para
105.000 ao ano. Até mesmo na África tropical, com transmissão intensa, a
dedetização de casas reduziu a prevalência de malária a sua quase
erradicação em áreas limitadas, como por exemplo, em Zanzibar (Curtis &
Lines, 2000).
Entretanto, resultados recentes com o uso de DDT não foram tão
promissores na Índia ou em Zanzibar, devido à evolução da resistência de
alguns vetores a este tipo de inseticida. No sul da África, a resistência a
piretróides levou ao retorno do uso de DDT em domicílios, que foi seguido
de um aumento do número de casos de malária (Hargreaves et al., 2000).
Devido a este tipo de problema, outros métodos de controle devem
ser considerados, como os métodos de controle genético (técnica do
mosquito estéril e métodos relacionados) como opções alternativas de
controle. Ao invés de confiar inteiramente no fator humano na procura de
todas as casas, criadouros ou locais que necessitem de tratamento, o
controle genético busca a cobertura universal por se aproveitar do
comportamento altamente eficiente do macho em localizar fêmeas da
mesma espécie para acasalar (Wyss, 2000)
Resistência a inseticida é irrelevante ao sucesso desse tipo de
método, mas o fato de fêmeas selvagens evitarem acasalar com machos
criados artificialmente ou estéreis deve ser levado em consideração. No
entanto, existe a real possibilidade de que a liberação de mosquitos
estéreis possa erradicar populações alvo isoladas, uma vez que com o
início da supressão a densidade da população selvagem diminui
58
aumentando-se a taxa de mosquitos estéreis na população facilitando
cada vez mais o cruzamento entre machos estéreis e fêmeas selvagens.
Existem alguns exemplos de erradicação e controle de pragas
agrícolas e até mesmo de vetores de patógenos utilizando-se a técnica de
liberação de mosquitos estéreis (SIT), como a erradicação da Cochliomyia
macellaria da Flórida e por toda extensão do Texas até a Costa Rica
(Wyss, 2000) e a erradicação da mosca tsé-tsé, vetor dos agentes da
tripanosomíase do gado (doença do sono) em Zanzibar (Vreysen et al.
2000). Nos locais onde ocorre imigração continua de fêmeas que já
tenham copulado com machos selvagens, a liberação continua de
machos irradiados será necessária, uma vez que a maioria das fêmeas
dípteras tende a monogamia e se recusam a copular novamente com
machos estéreis após chegarem à área alvo de soltura (Parker & Mehta
2007).
No final dos anos de 1960 e início de 1970 existia grande
quantidade de pesquisa sobre mosquitos estéreis. No entanto, do ponto
de vista ético e de segurança, a liberação de mosquitos machos estéreis
somente seria aceitável se houvesse a separação total das fêmeas e sua
não liberação (Sharma et al., 1972). Os machos não realizam repasto
sangüíneo, portanto não transmitem patógenos, e não são fator de
incômodo como as fêmeas. Em mosquitos dos gêneros Culex e Aedes a
separação pode ser feita com base no tamanho das pupas, sendo que o
macho menor pode ser liberado e as fêmeas retidas (Ansari et al., 1977)
Este sistema foi utilizado na Índia e apenas 0,2% de fêmeas eram
liberadas entre os machos. Porém centenas de milhares de mosquitos
eram produzidos diariamente acarretando na liberação de grandes
quantidades de fêmeas entre os machos impossibilitando o processo
(Sharma et al., 1972).
A liberação de fêmeas entre os machos irradiados acarreta não só
no aumento de fêmeas no ambiente podendo causar incômodo e
transmitir doenças, como na possibilidade de cópula com machos
59
irradiados competindo com fêmeas selvagens e conseqüentemente
prejudicando o resultado final da liberação (Myers et al., 1998).
No caso do Anopheles, o método mecânico de separação por
tamanho de pupa não se mostra eficiente. Em seu lugar foram
desenvolvidos sistemas genéticos baseados na translocação do
cromossomo Y propiciando resistência a inseticidas. Este método parece
encorajador, porém quando se aumenta a escala de produção como foi
feito com a Ceratitis capitata em uma escala de milhões de moscas por
dia, até mesmo as mais improváveis formas de recombinação genética
podem ocorrer e causar um decaimento na perfeição da separação entre
machos e fêmeas (Curtis et al., 2000).
Como foi demonstrado por McDonald et al. (1977) quando buscava
introduzir machos estéreis de Aedes aegypti geneticamente modificados
pela translocação do cromossomo Y, com o objetivo de diminuir o nível de
mosquitos presentes no Litoral do Quênia. Para cada 1000 mosquitos
liberados 4 não possuíam a translocação e portanto não eram estéreis.
Esta taxa representa um grande empecilho na produção em massa
destes mosquitos uma vez que quando se aumenta a escala de produção
o número de machos saudáveis liberados é impraticável.
Lorimer et al. (1976) utilizou mosquitos Aedes aegypti com
translocações heterozigotas duplas como forma de controle genético, e
obteve um decréscimo no número de eclosões em ovos ovipostos por
fêmeas coletadas durante o experimento de 93% quando copuladas com
machos selvagens para eclosões entre 30 e 40 % dos ovos após a cópula
com machos modificados geneticamente.
Durante a primavera de 1981 em Serra Nevada, Califórnia,
aproximadamente 85 mil machos de Culex tarsalis irradiados foram
marcados com pó fluorescente e liberados em um cânion semi-isolado e
então foram monitorados por abundância e esterilidade. Os resultados
foram comparados a outros dois cânions próximos com características
similares. Os machos esterilizados se dispersaram de maneira satisfatória
pelo cânion e representaram 30% dos machos capturados. Porém a
60
população apresentou apenas 11% de esterilidade e este resultado se
mostrou insuficiente para suprimir ou mesmo causar algum decréscimo na
população de fêmeas. Em sua maioria os machos irradiados não eram
competitivos em relação aos selvagens quanto à cópula com fêmeas
locais selvagens (Milby et al., 1983).
Além da dificuldade inerente de irradiar mosquitos e localizar o
ponto exato de exposição à radiação que proporcione esterilidade, porém
não prejudique em demasia sua competitividade e expectativa de vida.
Adicionado à necessidade de uma instalação nuclear próxima a região
alvo, o que aumenta a complexidade e a logística, bem como eleva os
custos da operação.
A alta taxa de eclosão para os padrões atuais, a liberação de
indivíduos férteis juntamente com estéreis, a dificuldade de separação
entre machos e fêmeas e o alto custo criam empecilhos para utilização
destes processos como forma de controle para mosquitos vetores de
doenças (Alphey, 2002).
Desse modo, foi desenvolvido um novo sistema transgênico
baseado no SIT, porém com princípios totalmente diferentes e que une
suas melhores características a baixo custo, facilidade de produção e
logística já que não utiliza radiação, hereditariedade e a capacidade de
desativar a letalidade em laboratório eliminando a necessidade de se
repetir todo o processo a cada geração.
O sistema RIDL proposto por Thomas et al. (2000) pode proporcionar
tal sistema que consiste em um gene letal dominante associado a um
promotor específico de fêmeas, como por exemplo, o promotor de
vitelogenina de tal forma que a expressão do gene letal dominante possa
ser desativada na presença de tetraciclina para que se possa manter a
colônia. Quando for necessário separar machos e fêmeas, a tetraciclina é
removida causando a morte de todas as fêmeas.
O RIDL tem sido usado com sucesso em Drosophila melanogaster
(Thomas et al. 2000, Heinrich & Scott 2000, Alphey 2002) indicando que
pode ser adaptado para mosquitos e outros vetores de doenças. Phuc et
61
al. (2007) adaptaram o sistema para o mosquito Aedes aegypti utilizando
as construções LA513 e LA882, que poderão ser funcionais em Cx.
quinquefasciatus. Nestas construções, tTAV (uma variante de tTA) esta
sob controle de seu próprio sítio de ligação, o tetO, um promotor mínimo
de Drosophila hsp70, e uma sequência terminal de Drosophila fs
(1)K1032.
Na ausência de tetraciclina, tTAV se liga a tetO levando a
expressão de mais tTAV, em um tipo de feedback positivo. Na presença
de tetraciclina, tTAV se liga a tetraciclina, e não se liga a tetO, não
levando assim a mais expressão de tTAV. Há um nível basal de
expressão de tTAV na presença de tetraciclina. Altos níveis de tTAV é
tóxico, e assim esta construção provém um sistema letal tetraciclina-
repressível (Figura 15).
Figura 15: Estrutura e função do transgene LA513. Utilizando o elemento de
transposição piggyBac, os mosquitos transformados são identificados pela fluorescência
DsRed2. O transgene LA882 é muito similar ao LA513. A principal diferença é o uso do
promotor EI-2 do baculovirus OpNPV para dirigir a expressão do DsRed em lugar do Act-
5C (Puch et al., 2007)
Construções desse tipo estão sendo utilizadas para a obtenção de
linhagens RIDL de Culex quinquefasciastus pelo nosso grupo. Os
mosquitos transformados com esta construção poderão ser identificados
pela fluorescência DsRed2. O principal objetivo deste projeto foi a
obtenção de linhagens transgênicas de mosquitos Culex quinquefasciatus
pelo sistema RIDL. A liberação desses mosquitos em campo será parte
de um próximo projeto, dependendo dos resultados iniciais.
62
Os transgenes LA513, LA882 foram utilizados para transformar
bactérias E.coli DH5α, para obtenção de material purificado e quantidades
suficiente para as microinjeções. Utilizando o Kit comercial da Qiagen
para mini-preparações (Mini Prep) obtivemos concentrações de: LA513A:
550ng/µl, LA513B: 300ng/µl, LA882A: 500ng/µl, LA882B: 450ng/µl.
Tentativas para a obtenção de linhagens transgênicas com estas
construções foram frustradas (descrito a seguir) e assim, um novo
plasmídeo, denominado LA3653, foi cedido pelo nosso colaborador Dr.
Luke Alphey, na concentração de 3,60mg/µl. Este novo plasmídeo não
possui gene letal nem a proteína tetraciclina-repressível a tTAV, parte
central do sistema RIDL, porém possui dois promotores diferentes, o
específico de olho 3xP3 e o quase onipresente Hr5IE1, e dois marcadores
diferentes, o DsRed2 e o AmCyan.
Estas construções foram purificadas com o Kit Maxi Prep Qiagen
para obtenção de concentrações ideais para as microinjeções. Obtivemos
a concentração de: LA513: 2,85mg/µl, LA882: 6,05 mg/µl, LA3653
3,63mg/µl e HELPER pBac: 2,40 mg/µl.
Estão sendo providenciadas novas construções para uso futuro
com promotor Act4 específico de fêmeas imaturas (Muñoz et al. 2004),
que provavelmente será funcional em Culex. Uma vez obtidas às
linhagens serão caracterizadas quanto à expressão e funcionalidade dos
genes letais.
4.1 Padronização da Manipulação dos Ovos
Parte crucial para o sucesso do projeto foi a adaptação do método
de microinjeção de embriões para a espécie Culex quinquefasciatus, que
possui características muito distintas das espécies do gênero Aedes ou
Anopheles, pois espécies do gênero Culex depositam seus ovos unidos
em forma de jangadas. Para que seja possível a injeção do plasmídeo no
embrião, é necessário que os ovos sejam alinhados em uma lâmina,
obrigando a separação os ovos unidos em forma de jangada. Não é
possível recolocar os ovos em sua formação original, porém estes devem
63
ser mantidos em posição vertical, se colocados individualmente na água,
estes ovos afundam e não se desenvolvem. Adaptamos então, a técnica
descrita por Allen et al. (2001) para Culex quinquefasciatus, e de Aedes
aegypti descrita por Nijole Jasinskiene (comunicação pessoal).
Desse modo, foram realizados experimentos com a finalidade de
padronizarmos a manipulação dos ovos para o alinhamento e melhor taxa
de eclosão dos mesmo. Nesse processo os ovos foram sujeitos a mesma
manipulação que receberiam no procedimento de injeção, porém os ovos
não foram injetados. Estes experimentos tiveram como finalidade
descobrir a melhor disposição dos ovos, uma vez que a jangada deve ser
destruída para a separação e alinhamentos dos ovos, que não flutuam por
si só.
Os resultados mostram que quando os ovos manipulados ficaram
em contato direto com a superfície da água, a maioria não se desenvolve
ou não há eclosões, mostrando taxas de eclosão muito baixas (3,4% e
1,9%) (Tabelas 2, 3).
Além disso, concluiu-se que os ovos devem ser dispostos a 90
o
e
com papel filtro umedecido em contato com a fileira de ovos alinhados,
desse modo, foi obtido uma taxa de eclosão significativamente maior
(taxa de eclosão – 56,3%), e com um número razoável de eclosões para
realização dos experimentos (Tabela 1).
Os resultados dos experimentos em placa de petri a 45
o
e com
papel filtro em contato com a fileira alinhada de ovos (Tabela 4), também
não apresentaram uma taxa de eclosão suficiente para a realização dos
trabalhos (9,1%).
64
Tabela 1. Manipulação das jangadas de ovos de Culex quinquefasciatus colocados para
eclosão em Tubo Falcon a 90º com os ovos alinhados e em contato com papel filtro
umedecido.
Tubo Falcon + papel filtro Ovos Eclosões
controle 98 95
tubo 01 52 30
tubo 02 46 26
tubo 03 72 60
tubo 04 36 15
tubo 05 54 20
tubo 06 65 36
tubo 07 62 42
tubo 08 45 20
tubo 09 50 31
tubo 10 54 22
TOTAL 536 302 (56,3%)
Tabela 2. Manipulação das jangadas de ovos de Culex quinquefasciatus colocados para
eclosão em Tubo Falcon com os ovos alinhados em contato direto com a superfície da
água.
Tubo Falcon - ovos tocando
a superfície da água
Ovos Eclosões
controle 78 76
tubo 01 48 2
tubo 02 62 3
tubo 03 34 1
tubo 04 45 0
tubo 05 46 0
tubo 06 52 2
tubo 07 53 3
tubo 08 60 4
tubo 09 32 0
tubo 10 41 1
TOTAL 473 16 (3,4%)
65
Tabela 3. Manipulação das jangadas de ovos de Culex quinquefasciatus colocados para
eclosão em placas de petri - ovos alinhados dispostos a 45º em contato direto com a
superfície da água.
Placa de Petri - ovos a 45º
em contato com a superfície
da água
Ovos Eclosões
controle 87 83
Placa 01 35 1
Placa 02 38 0
Placa 03 52 0
Placa 04 56 2
Placa 05 61 1
Placa 06 29 0
Placa 07 35 0
Placa 08 62 2
Placa 09 41 3
Placa 10 49 0
TOTAL 458 9 (1,9%)
Tabela 4. Manipulação das jangadas de ovos de Culex quinquefasciatus colocados para
eclosão em placas de petri - ovos alinhados, dispostos a 45º em contato com papel filtro
umedecido
Placa de Petri - ovos a 45º
com papel filtro umedecido
Ovos Eclosões
controle 112 105
Placa 01 54 10
Placa 02 65 12
Placa 03 53 6
Placa 04 52 4
Placa 05 45 2
Placa 06 51 0
Placa 07 42 5
Placa 08 62 7
Placa 09 52 1
Placa 10 36 0
TOTAL 512 47 (9,1%)
66
4.2 Microinjeções
Conforme os resultados obtidos na padronização da
manipulação dos ovos (jangadas) para uma melhor taxa de eclosão dos
mesmos, as microinjeções foram iniciadas dispondo os ovos para eclosão
conforme descrito no experimento mostrado na Tabela 1.
Os ovos injetados devem, portanto, ser sempre mantidos a 90
o
e constantemente em contato com papel de filtro úmido. Desse modo, as
larvas eclodidas podem cair na água mantida no tubo e continuar o
desenvolvimento normal.
4.2.1 Microinjeções com a Construção LA882
Os experimentos foram iniciados com uma solução de
microinjeção com a construção LA882 (Figura 8).
Nesse caso, os experimentos de microinjeção foram divididos
em grupos lotes distintos e cada tubo Falcon (50 ml) recebeu uma
numeração individual. As larvas obtidas foram removidas e colocadas em
potes com 1 litro de água com tetraciclina na concentração de 30ug/ml
mantendo a numeração original.
Neste primeiro experimento, foram injetados um total de 908
ovos sendo que eclodiram apenas 131 larvas, das quais 53 chegaram ao
estádio de pupa e apenas 30 mosquitos chegaram a fase adulta, sendo
20 machos e 10 fêmeas. Os resultados estão resumidos no Quadro 1.
As pupas foram separadas individualmente, e para cada macho
que emergia eram adicionadas 10 fêmeas selvagens virgens em uma
pequena gaiola para acasalamento. Para cada fêmea que emergia eram
adicionados 3 machos selvagens.
Após 3 dias, necessários para que ocorresse os cruzamentos,
foi oferecido aos mosquitos camundongos anestesiados para realização
de respasto sangüíneo. A oviposição (geração G1) ocorria geralmente
após 3 ou 4 dias. Estes ovos eram então acompanhados até a eclosão
das larvas, que eram colocadas em potes separados e observadas no
67
estadio de L4 em uma lupa adaptada com filtros para verificação da
presença da fluorescência da proteína DsRed.
Para esta construção (LA882) foram analisadas para a
presença de DsRed2, aproximadamente 7000 larvas (G1) provenientes
dos cruzamentos entre indivíduos injetados e selvagens (G0). Entretanto,
nenhuma larva foi positiva para a presença da proteína fluorescente. Os
resultados detalhados dos experimentos e dos cruzamentos entre
injetados e selvagens estão no Anexo 1.
Devido a um problema na manutenção da temperatura e
umidade do insetário parte do experimento sofreu uma redução drástica
na taxa de eclosão, porém não condiz com os resultados observados
previamente, nos experimentos de padronização da manipulação dos
ovos.
Algumas microinjeções de embriões também foram realizadas
com um transgene que expressa apenas EGFP (sob controle de promotor
de olho), com o objetivo de obter linhagens transgênicas controles. No
entanto, nenhuma linhagem transgênica foi obtida (dados não mostrados).
Quadro 1. Resumo dos resultados obtidos nas microinjeções de embriões de Culex
quinquefasciatus com o transgene LA882. Total de ovos injetados, de eclosões, de
adultos obtidos e de larvas G1
TOTAL DE
OVOS
INJETADOS
908
TOTAL DE
MACHOS
ADULTOS
20
TOTAL DE
LARVAS
131
TOTAL DE
FÊMEAS
ADULTAS
10
TOTAL DE
PUPAS
53
TOTAL DE
LARVAS G1
ANALISADAS
7000
68
4.2.2 Microinjeções com a Construção LA513
No segundo grupo de injeções foi utilizado o plasmídeo LA513
(Figura 8), cuja construção é similar ao LA882. O mesmo procedimento foi
realizado: os ovos foram dispostos em uma lamínula que posteriormente
foi fixada a uma lâmina em contato com papel filtro umedecido e colocada
em um tubo Falcon (50 ml) com água. Neste lote todas as larvas obtidas
dos embriões injetados foram divididas em duas bacias com 1 litro de
água com tetraciclina. No total foram injetados 807 ovos, sendo que
eclodiram apenas 92 larvas, das quais 81 passaram ao estádio de pupa e
64 mosquitos alcançaram a fase adulta, sendo 23 machos e 41 fêmeas.
Os resultados estão resumidos no Quadro 2.
As pupas foram separadas individualmente e após sua
eclosão, cada macho injetado foi colocado em um copo com 10 fêmeas
selvagens virgens. Foi observado que no Lote 01 as fêmeas não
copularam de modo satisfatório quando colocadas individualmente com 3
machos. E então, para este segundo lote de experimentos foi feito um
pool de 10 fêmeas injetadas com 10 machos selvagens, obtendo
resultados significativamente melhores.
Para esta construção (LA513) foram analisadas para a
presença de DsRed2, em aproximadamente 7750 larvas (G1)
provenientes dos cruzamentos entre indivíduos injetados e selvagens,
porém, nenhuma larva foi positiva para a presença da proteína
fluorescente (detalhes no Anexo 2).
Quadro 2. Resumo dos resultados obtidos nas microinjeções de embriões de Culex
quinquefasciatus com o transgene LA513. Total de ovos injetados, de eclosões, de
adultos obtidos e de larvas G1
TOTAL DE
OVOS
INJETADOS
807
TOTAL DE
MACHOS
ADULTOS
23
TOTAL DE
LARVAS
92
TOTAL DE
FÊMEAS
ADULTAS
41
TOTAL DE
PUPAS
81
TOTAL DE
LARVAS G1
ANALISADAS
7750
69
4.2.3 Microinjeções com a Construção LA3563
Foram realizados, então, mais três lotes de microinjeções com
o terceiro plasmídeo fornecido por nosso colaborador Dr. Luke Alphey
(LA3563). Neste caso, apesar de um número similar de embriões ter sido
injetado, foi obtido uma taxa de eclosão muito maior, com maior
sobrevivência dos embriões até a fase adulta. Concluiu-se que a ausência
do gene letal (proteína tTAV) no plasmídeo, que é tóxico para o embrião,
adicionada à ausência de tetraciclina na água foi fator determinante para
este fenômeno.
Novamente as larvas obtidas foram dispostas em bacias com
água e posteriormente as pupas separadas individualmente. Cruzamos
cada macho com 10 fêmeas e devido aos bons resultados obtidos com as
fêmeas no lote anterior, foram feitos novamente pools de 10 fêmeas
injetadas com 10 machos selvagens, mantido para cópula durante 5 dias.
Devido às condições laboratoriais, tais como espaço e
dificuldade de propiciar um repasto sanguíneo adequado aos mosquitos,
foi definido que seria possível mantê-lo todos juntos em uma mesma
gaiola, já que os indivíduos injetados não copulariam entre si novamente,
pois já haviam copulado previamente com indivíduos selvagens virgens.
Passou-se, então, a adotar este método e caso fossem observadas larvas
transgênicas, trataríamos cada individuo como uma linhagem separada.
Ao unirmos os mosquitos em uma gaiola percebemos uma melhoria no
número de oviposições além da facilidade de manuseio e economia de
material.
Para o primeiro lote de injeções (Quadro 3), com a construção
LA3653, foram analisadas para a presença de DsRed2, aproximadamente
16700 larvas (G1) provenientes dos cruzamentos entre indivíduos
injetados e selvagens, porém nenhuma larva foi positiva para a presença
da proteína fluorescente (detalhes no Anexo 3).
70
Quadro 3. Resumo dos resultados obtidos nas microinjeções de embriões de Culex
quinquefasciatus com o transgene LA3653 (Lote 3). Total de ovos injetados, de
eclosões, de adultos obtidos e de larvas G1
TOTAL DE
OVOS
INJETADOS
727
TOTAL DE
MACHOS
ADULTOS
59
TOTAL DE
LARVAS
123
TOTAL DE
FÊMEAS
ADULTAS
48
TOTAL DE
PUPAS
114
TOTAL DE
LARVAS G1
ANALISADAS
16700
Foram realizados ainda mais dois lotes de microinjeções com o
mesmo plasmídeo, Para o Lote 4 (Quadro 4) e 5 (Quadro 5) utilizamos
novamente a construção LA3653 e utilizamos a mesma metodologia do
Lote 3. Foram analisadas para a presença de DsRed2, aproximadamente
32000 larvas do Lote 4 (Anexo 4) e 12250 larvas do Lote 5 (Anexo 5),
provenientes dos cruzamentos entre indivíduos injetados e selvagens,
porém nenhuma larva foi positiva para a presença da proteína
fluorescente.
Devido a problemas com a temperatura da sala de injeção o
Lote 5 foi prejudicado e sua taxa de eclosão não deve ser tomada como
parâmetro.
Quadro 4. Resumo dos resultados obtidos nas microinjeções de embriões de Culex
quinquefasciatus com o transgene LA3653 (Lote 04). Total de ovos injetados, de
eclosões, de adultos obtidos e de larvas G1.
TOTAL DE
OVOS
INJETADOS
833
TOTAL DE
MACHOS
ADULTOS
55
TOTAL DE
LARVAS
115
TOTAL DE
FÊMEAS
ADULTAS
52
TOTAL DE
PUPAS
109
TOTAL DE
LARVAS G1
ANALISADAS
32000
71
Quadro 5. Resumo dos resultados obtidos nas microinjeções de embriões de Culex
quinquefasciatus com o transgene LA3653 (Lote 5). Total de ovos injetados, de
eclosões, de adultos obtidos e de larvas G1.
TOTAL DE
OVOS
INJETADOS
892
TOTAL DE
MACHOS
ADULTOS
14
TOTAL DE
LARVAS
54
TOTAL DE
FÊMEAS
ADULTAS
13
TOTAL DE
PUPAS
33
TOTAL DE
LARVAS G1
ANALISADAS
12750
4.3 Reação de Amplificação do Marcador DsRed2
Para nos assegurarmos sobre a estabilidade dos plasmídeos,
após a reação de Maxi Prep, realizamos uma reação de amplificação
(PCR) com todas as construções disponíveis para a presença do gene
DsRed2. Observamos a presença de bandas exatamente no respectivo
tamanho para cada plasmídeo podendo visualizar a diferença de tamanho
entre eles.
Figura 16: Gel de agarose contendo amostras dos plasmídeos utilizados para
transformação de Culex quinquefasciatus, LA513A, LA513B, LA513C, LA882A, LA882B,
LA882C e LA3653, amplificados para a presença do gene DsRed2. O peso molecular
utilizado possui 10 mil pares de base
DsRed
72
4.4 Conclusões
Objetivo 01
Conseguiu-se através de experimentos a obtenção de uma taxa de
eclosão viável a fim de suprir as necessidades requeridas para obtenção
de uma linhagem transgênica.
Objetivo 02
Foi padronizado o procedimento para cruzamentos entre indivíduos
injetados e selvagens com resultados satisfatórios.
Objetivo 03
Não obtivemos transgenia em indivíduos injetados.
73
4.5 Considerações finais
De acordo com o Dr. Luke Alphey, os transgenes LA882 e
LA513 são de difícil integração ao genoma dos mosquitos e um número
muito maior de ovos deveriam ter sido injetados para a obtenção de um
maior número de adultos e a possibilidade de sucesso na obtenção de um
linhagem transgênica (comunicação pessoal). Obtivemos apenas 30
adultos após injeção de mais de 900 ovos em nosso primeiro lote
(construção LA882). Segundo o Dr. Alphey, para a obtenção de apenas
uma família de Aedes aegypti com a mesma construção foram injetados
cerca de 30.000 embriões.
Com as dificuldades na padronização e relativa baixa taxa de
eclosão dos ovos de Culex quando comparados com os de Aedes
aegypti, devido a manipulação demasiada dos ovos, pela impossibilidade
de ressecá-los para facilitar a penetração da agulha e a dificuldade de
dispor os ovos de forma que possam eclodir após o alinhamento, uma vez
que a jangada não pode ser refeita, refletindo diretamente na quantidade
de adultos obtidos e na complexa logística que envolve a injeção e seus
passos subseqüentes tornando por várias razões como falta de espaço
físico no insetário, grande carga de trabalho durante a montagem e
análise do lote e falta de tempo hábil, tornam inviável o número de
embriões necessários para alcançar o sucesso na transgenia. A produção
de embriões injetados, por fim, se restringe ao espaço disponível para
embriões injetados e seus respectivos selvagens.
O sucesso de nossos colegas na obtenção de mosquitos
transgênicos se deve também ao fato de que possuem grande infra-
estrutura laboratorial possibilitando a injeção de embriões em larga
escala. Nosso colaborador Dr. Luke Alphey, para a obtenção do Aedes
aegypti transgênico com o plasmídeo LA882, injetou mais de 30 mil ovos.
Este número seria impossível para se alcançar nas condições atuais do
espaço do insetário e com o tempo disponível durante este projeto.
74
As microinjeções foram continuadas com uma nova construção
similar ao plasmídeo LA882, o LA513. Esta construção foi utilizada com
sucesso na transgenia de mosquitos Aedes aegypti e assim como o
LA882 possui um gene letal e marcador fluorescente DsRed2. O
procedimento deste lote foi exatamente igual ao anterior, sendo que a
única mudança foi a não separação das larvas injetadas em lotes, mas
matendo-as juntas e as separando posteriormente na fase de pupa. Este
segundo lote apresentou as mesmas dificuldades do primeiro, porém com
uma taxa de eclosão ligeiramente melhor.
Passamos então a utilizar uma nova construção, a LA3653,
que tem a característica de não necessitar do repressor químico uma vez
que não possui gene letal e a proteína tetraciclina-repressível (tTAV), mas
apenas os marcadores fluorescentes. Ao recebermos este novo
plasmídeo demos preferência por sua injeção já que por não possuir
gente letal é significantemente menos tóxico para os embriões e deve
conseqüentemente ser de mais fácil integração, além de não necessitar
do repressor químico tetraciclina. Assim como os demais plasmídeos, o
LA3653 possui marcador DsRed2 ligado a um promotor de actina. Neste
caso, após as microinjeções, obteve-se uma maior taxa de sobrevivência
com um número maior de larvas G1 analisadas, levando a conclusão que
a obtenção de uma linhagem com esta construção pode ser obtida com
tempo maior de trabalho, mesmo com o espaço inferior ao ideal. A
questão de espaço influi diretamente no número possível de embriões a
serem injetados, levando-se em conta que para cada embrião injetado
necessita-se de indivíduos selvagens para a realização dos cruzamentos.
Como a inserção do plasmídeo no genoma do mosquito é uma
questão de probabilidade podemos aferir que como o espaço disponível
foi fator limitante para nossa produção, precisaríamos dispor de mais
tempo para obtenção de linhagens transgênicas. Porém sua viabilidade é
clara e novos procedimentos estão sendo adaptados para nossa
realidade podendo suprimir este empecilho em projetos futuros.
75
O potencial real desta nova técnica para controle em campo
ainda é desconhecido, porém as inúmeras vantagens sobre outras
técnicas de controle de vetores como facilidade de manutenção da
colônia e separação entre machos e fêmeas, baixo custo de produção e
alta eficácia poderá credenciá-lo futuramente como importante ferramenta
do manejo integrado para controle de insetos de interesse médico e
pragas agrícolas.
76
5 Referências Bibliográficas
[SMA] São Paulo. Secretaria do Estado do Meio Ambiente.
Coordenadoria de Planejamento Ambiental. Informações básicas para
o planejamento ambiental. SMA 2002.
Allen ML, Christensen BM. Flight muscle-specific expression of act88f:
GFP in transgenic Culex quinquefasciatus Say (Diptera; Culicidae).
Parasitol Int. 2004; 53: 307-314.
Allen ML, O’Brochta DA, Atkinson PW, Levesque CS. Stable, germ-line
transformation of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J. Med.
Entomol. 2001; 38(5): 701-710.
Alphey L, Andreasen M. Dominant lethality and insect population control.
Mol Biochem Parasitol. 2002; 121: 173-/178.
Alphey L. Re-engineering the sterile insect technique. Insect Biochem
Mol Biol. 2002; 32: 1243–1247.
Andrade CFS. Avaliação da sensibilidade de adultos de Culex
quinquefasciatus say a inseticidas químicos de contato. Rev. Saude
Publica. 1990; 24(4): 259-264.
Ansari MA, Singh KR, Brooks GD, Malhotra PR. A device for separation of
pupae from larvae of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). J Med
Entomol. 1977 25; 14(2): 241-3.
77
Atkinson MP, Su Z, Alphey N, Alphey L, Coleman PG, Wein LM.
Analyzing the control of mosquito-borne diseases by a dominant lethal
genetic system. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104(22): 9540–9545.
Atkinson PW, Michel K. What’s Buzzing? Mosquito Genomics and
Transgenic Mosquitoes. Genesis. 2002; 32: 42–48.
Axtell RC, Arends JJ. Ecology and Management of Arthropod Pests of
Poultry. 1979. Annu Rev Entomol. 1990; 35:101-126. .
Baird GS, Zacharias DA, Tsien RY. Biochemistry, mutagenesis, and
oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc
Natl Acad Sci USA. 2000; 97: 11984–11989.
Barata EAMF, Chiaravalloti Neto F, Dibo MR Macoris MLG, Barbosa AAC,
Natal D, Barata JMS, Andriguetti MTM. Captura de culicídeos em área
urbana: avaliação do método das caixas de repouso. Rev Saude
Publica. 2007; 41(3): 375-82.
Baumann P, Clark MA, Baumann L, Broadwell AH. Bacillus sphaericus as
a mosquito pathogen: properties of the organism and its toxins.
Microbiol Rev. 1991; 55(3): 425-436.
Behura SK. Molecular marker systems in insects: current trends and future
avenues. Mol Ecol. 2006; 15: 3087–3113.
Benchimol JL .Adolpho Lutz: um esboço biográfico: História, Ciências,
Saúde. Manguinhos. 2003; 10(1): 13-83
78
Benedict MQ, Robinson AS. The first releases of transgenic mosquitoes:
an argument for the sterile insect technique. Trends Parasitol. 2003;
8(19): 349-355.
Berghammer A, Bucher G, Maderspacher F, Klingler M. A system to
efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle
Tribolium castaneum. Dev Genes Evol. 1999; 209(6): 382-389.
Bermúdez SE, Espinosa JD, Cielo AB, Clavel F, Subía J, Barrios S,
Medianero E. Incidence of myiasis in Panama during the eradication of
Cochliomyia hominivorax (Coquerel 1858, Diptera: Calliphoridae)(2002-
2005). Mem Inst Oswaldo Cruz. 2007; 102(6): 675-679.
Besansky NJ, Collins FH. The mosquito genome: organization, evolution
and manipulation. Parasitol Today. 1992; 8(6):186-192.
Blandford S, Chan BH, Jenkins N, Sim D, Turner RJ, Read AF, Thomas
MB. Fungal pathogen reduces potential of malaria transmission.
Science. 2005; 308(5728): 1638-1641
Boake CR, Shelly TE, Kaneshiro KY. Sexual selection in relation to pest-
management strategies. Annu Rev Entomol. 1996; 41: 211-29.
Boëte C, Koella JC. A theoretical approach to predicting the success of
genetic manipulation of malaria mosquitoes in malaria control. Malar J.
2002; 1:3.
Bracco JE, Dalbon M, Marinotti O, Barata JMS. Resistência a inseticidas
organofosforados e carbamatos em população de Culex
quinquefasciatus. Rev. Saude Publica. 1997; 31(2): 182-183.
79
Bushland RC, Lindquist AW, Knipling EF. Eradication of Screw-Worms
through Release of Sterilized Males. Science. 1955; 122(3163): 287-
288.
Campos J, Andrade CFS. Susceptibilidade larval de populações de Aedes
aegypti e Culex quinquefasciatus a inseticidas químicos. Rev Saude
Publica 2003; 37(4):523-527.
Cardoso JC, Corseuil E, Barata JMS. Culicinae (Diptera, Culicidae)
ocorrentes no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Rev Bras
Entomol. 2005; 49(2): 275-287.
Catterruccia F, Nolan T, Blass C, Muller HM, Crisanti A, Kafatos FC,
Loukeris TG. Toward Anopheles transformation: Minos element activity
in anopheline cells and embryos. Proc. Natl. Acad. USA. 2000a; 97:
2157-2162
Catterruccia F, Nolan T, Loukeris TG, Blass C, Savakis C, Kafatos FC,
Crisanti A. Stable germline transformation of the malaria mosquito
Anopheles stephensi. Nature. 2000b; 405: 959-962
Cheng L, Fu J, Tsukamoto A, Hawley RG. Use of green fluorescent
protein variants to monitor gene transfer and expression in mammalian
cells. Nat Biotechnol. 1996; 14: 606-609
Claro LBL, Tomassini HBC, Rosa MLG. Dengue prevention and
Control: a review of studies on knowledge, beliefs, and
practices. Cad. Saúde Pública. 2004, 20(6): Disponível on
80
line:www.scielosp.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S010
2311X2004000600002&lng=en&nrm=iso&tlng=en
Coleman PG, Alphey L. Genetic control of vector populations: an
imminent prospect. Trop Med Int Health. 2004; 9: 433–437.
Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental, Secretaria de
Estado do Meio Ambiente. Índice de qualidade das águas. [on line].
Disponivel em http://www.cetesb.sp.gov.br/Agua/ugrhis/u06.asp
Cuba LM. Situação atual do controle biológico no manejo integrado de
mosquitos (Diptera: Culicidae). Apresentada a Universidade de São
Paulo. Faculdade de Saúde Pública. Departamento de Epidemiologia
para obtenção do grau de Mestre. São Paulo; s.n; 2005. 91 p.
Curtis CF, Lines JD. Should DDT be banned by international treaty?.
Parasitol Today. 2000; 16(3):119-121
Curtis CF. A possible genetic method for the control of insect pests, with
special reference to tsetse flies. Bull Entomol Res. 1968; 57(4):509-23
Dafa’alla TH, Condon GC, Condon KC, Phillips CE, Morrison NI, Jin L,
Epton MJ, Fu G, Alphey L. Transposon-free insertions for insect genetic
engineering. Nat Biotechnol. [on line]. 2006; Disponível em
<http://www.nature.com/nbt/journal/v24/n7/abs/nbt1221.html;jsessionid
=E9778B506E7551B9E58FCAF4E4D232E2>
De Koning-Ward TF, Thomas AW, Waters AP, Janse CJ. Stable
expression of green fluorescent protein in blood and mosquito stages of
Plasmodium berghei. Mol. Biochem. Parasitol. 1998; 97: 247-252
81
Delprat MA, Stolar CE, Manso FC, Cladera JL. Genetic stability of sexing
strains based on the lócus sw of Ceratitis capitata. Genetica. 2002;
116: 85–95.
Dhillon MK, Singh R, NareshJS Sharma HC. The melon fruit fly,
Bactrocera cucurbitae: A review of its biology and management. J
Insect Sci. 2005; 5(40): available online: insectscience.org/5.40
Dorta DM, Vasuki V, Rajavel A. Evaluation of organophosphorus and
synthetic pyrethroid insecticides against six vector mosquitoe species.
Rev Saude Publica. 1993; 27(6): 391-397.
Endrichs JH, Obinson ASR, Ayol JPC, Nkerlin WE. Medfly \\sreawide
Sterile Insect Technique Programmes For Prevention, Suppression or
Eradication: The Importance of Mating Behavior Studies. Florida
Entomologist. 2002; 85(1): 1-13.
Federici BA, Park HW, Bideshi DK, Wirth MC, Johnson JJ. Recombinant
bacteria for mosquito control. J Exp Biol. 2003; 206: 3877-3885
Fontes G, Brito AC, Calheiros CML, Antunes CMF, Rocha EMM. Situação
Atual da Filariose Bancroftiana na Cidade de Maceió, Estado de
Alagoas, Brasil. Cad. Saúde Públ. 1994; 10(2): 293-300.
Forattini OP. Espécie de Culex (Culex). Culicidologia Médica. 2002; 2:
693–722.
Fortini M, Simon M, Rubin G.. Signalling by the sevenless protein tyrosine
kinase is mimicked by Ras1 activation. Nature 1992; 355: 559–561.
82
Fraser MJ, Smith GE, Summers MD. Acquisition of Host Cell DNA
Sequences by Baculoviruses: Relationship Between Host DNA
Insertions and FP Mutants of Autographa californica and Galleria
mellonella Nuclear Polyhedrosis Viruses. J Virol. 1983; 47(2): 287-300.
Fu G, Condon KC, Epton MJ, Gong P, Jin L, Condon GC, Morrison NI,
Dafa’alla TH, Alphey L. Female-specific insect lethality engineered
using alternative splicing. Nat Biotechnol. 2007; 25(3).
FUNASA – Fundação Nacional de Saúde. Controle biológico e manejo
ambiental. Brasília (DF). 2001; 65
Gomes AC, Silva NN, Marques GRAM, Brito M. Host-feeding patterns of
potential human disease vectors in the Paraíba Valley Region, State of
São Paulo, Brazil. J Vector Ecol. 2003; 28(1): 74-78.
Grether M, Abrams J, Agapite J, White K, Steller H,. The head involution
defective gene of Drosophila melanogaster functions in programmed
cell death. Gene Dev. 1995; 9: 1694–1708.
Gross LA, Baird GS, Hoffman RC, Baldridge KK, Tsien RY. The structure
of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 97: 11990–11995.
Grossman GL, Rafferty CS, Fraser MJ, Benedict MQ. The piggyBac
element is capable of precise excision and transposition in cells and
embryos of the mosquito, Anopheles gambiae. Insect Biochem Mol
Biol. 2000; 30(10): 909-914.
83
Handler AM, Harrell RA. Germline transformation of Drosophila
melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Mol Biol.
1999; 8(4): 449-457.
Handler AM, Harrell RA. Transformation of the Caribbean fruit fly,
Anastrepha suspensa, with a piggyBac vector marked with
polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 2001; 31(2):
199-205.
Handler AM, McCombs SD, Fraser MJ, Saul SH. The lepidopteran
transposon vector, piggyBac, mediates germ-line transformation in the
Mediterranean fruit fly. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95(13): 7520-
7525.
Handler AM, McCombs SD. The piggyBac transposon mediates germ-line
transformation in the Oriental fruit fly and closely related elements exist
in its genome. Insect Mol Biol. 2000; (6): 605-612.
Handler AM. Prospects for using genetic transformation for improved SIT
and new biocontrol methods. Genetica. 2002; 116: 137–149.
Handler AM. Understanding and improving transgene stability and
expression in insects for SIT and conditional lethal release programs.
Insect Biochem Mol Biol. 2004; 34: 121–130.
Hargreaves K, Koekemoer LL, Brooke BD, Hunt RH, Mthembu J, Coetzee
M. Anopheles funestus resistant to pyrethroid insecticides in South
Africa. Med Vet Entomol. 2000; 14(2):181-189.
84
Hediger M, Niessen M, Wimmer EA, Dübendorfer A, Bopp D. Genetic
transformation of the housefly Musca domestica with the lepidopteran
derived transposon piggyBac. Insect Mol Biol. 2001; 10(2): 113-119.
Heinrich JC, Scott MJ. A repressible female-specific lethal genetic system
for making transgenic insect suitable for a sterile-reliase program. Proc
Natl Acad Sci USA. 2000; 97(15): 8229-8232.
Helinski MEH, Parker AG, Knols BGJ. Radiation-induced sterility for pupal
and adult stages of the malaria mosquito Anopheles arabiensis. Malar
J. 2006; 5(41).
Hiscox A, Epton MJ, Fu G, Scaife S, Hiscox A, Condon KC, Condon GC,
Morrison NI, Kelly DW, Dafa’alla T, Coleman PG, Alphey L. A Dominant
Lethal Gene Sistem for Autocidal Controlo of the Mediterranian FruitFly.
Nat Biotechnol. 2005; 23(4).
Hood-Nowotny R, Mayr L, Knols BGJ. Use of carbon-13 as a population
marker for Anopheles arabiensis in a sterile insect technique (SIT)
context. Malar J. 2006; 5(6).
Horn C, Wimmer EA. A transgene-based, embryo-specific lethality system
for insect pest management. Nat Biotechnol. 2003; 21: 64-70.
Horn C, Wimmer EA. A versatile vector set for animal transgenesis. Dev.
Genes Evol. 2000; 210: 630-637
Huhn GD, Sejvar JJ, Montgomery SP, Dworkin MS. West Nile Virus in the
United States: An Update on an Emerging Infectious Disease. Am Fam
Physician. 2003; 68(4): 653-660.
85
Ito, J, Ghosh A, Moreira LA, Wimmer EA, Jacobs-Lorena M. Transgenic
anopheline mosquitoes impaired in transmission of a malaria parasite.
Nature. 2002; 417: 452-455
Jasinskiene N, Coates CJ, Benedict MQ, Cornel AJ, Raffarty CS, James
AA, Collins FH. Stable transformation of the yellow fever mosquitoe,
Aedes aegypti with the Hermes element from the housefly. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 1998; 95: 3743-3747
Jasinskiene N, Coleman J, Ashikyan A, Salampessy M, Marinotti O,
James AA. Genetic control of malaria parasite transmission: threshold
levels for infection in an avian model system. Am J Trop Med Hyg.
2007; 76(6): 1072–1078.
Kadekoppala JM, Kline K, Akompong T, Haldar K. Stable expression of a
new Chimeric fluorescent reporter in the human malaria parasite
Plasmodium falciparum. Infect Immun. 2000; 68: 2328-2332
Kokoza V, Ahmed A, Wimmer EA, Raikhel AS. Efficient transformation of
the yellow fever mosquito Aedes aegypti using the piggyBac
transposable element vector pBac[3xP3-EGFP afm]. Insect Biochem
Mol Biol. 2001; 31: 1137–1143.
Koyama J, Kakinohana H, Miyatake T. Eradication of themelon fly,
bactrocera Cucurbitae, in japan: Importance of Behavior, Ecology,
Genetics, and Evolution. Annu Rev Entomol. 2004; 49: 331-349.
86
Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J, Devon
K. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001;
409: 860-921
Laporta GZ, Urbinatti PR, Natal D. Aspectos ecológicos da população de
Culex quinquefasciatus Say (Diptera, Culicidae) em abrigos situados no
Parque Ecológico do Tietê, São Paulo, SP. Rev Bras Entomol. 2006;
50(1): 125-127.
Li F, Patra KP, Vinetz JM. An Anti-Chitinase Malaria Transmission–
Blocking Single-Chain Antibody as an Effector Molecule for Creating a
Plasmodium falciparum–Refractory Mosquito. J Infect Dis. 2005; 192:
878–87,
Lobo N, Li X, Hua-Van A, Fraser Jr MJ. Mobility of the piggyBac
Transposon in Embryos of the vectors of Dengue fever (Aedes
albopictus) and La Crosse encephalitis (Ae. Triseriatus). Mol Genet
Genomics. 2001; 265: 66-71.
Lobo NF, Clayton JR, Fraser MJ, Kafatos F, Collins FH. High efficiency
germ-line transformation of mosquitoes. Nat Protoc. 2006; 1(3): 1312-
1317.
Lobo NF, Hua-Van A, Li X, Nolen BM, Fraser Jr MJ. Germ line
transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, mediated
by transpositional insertion of a piggyBac vector. Insect Mol Biol. 2002;
11(2): 133–139.
87
Lorimer N, Lounibos LP, Petersen JL. Field trials with a translocation
homozygote in Aedes aegypti for population replacement. J Econ
Entomol. 1976; 69(3):405-409.
Luna EJA, Pereira LE, Souza RP. Encefalite do Nilo Ocidental, nossa
próxima epidemia?. Epidemiol Serv Saúde. 2003; 12(1): 7-19.
Lycett GJ, Kafatos FC, Loukeris TG. Conditional expression in the malaria
mosquito Anopheles stephensi with Tet-on and Tet-off systems.
Genetics. 2004; 167:1781-1790.
Marrelli MT, Li C, Rasgon JL, Jacobs-Lorena M. Transgenic malaria-
resistant mosquitoes have a fitness advantage when feeding on
Plasmodium-infected blood. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104(13):
5580–5583.
Marrelli MT, Moreira CK, Kelly D, Alphey L, Jacobs-Lorena M. Mosquito
Transgenesis: what is the fitness cost?. Trends Parasitol. 2006; 22(5):
197-202.
Mayer DG, Atzeni MG, Stuarta MA, Anaman KA, Butler DG. Mating
competitiveness of irradiated flies for screwworm fly eradication
campaigns. Preventive Veterinary Medicine. 1998; 36: 1-9.
McDonald PT. Population characteristics of domestic Aedes aegypti
(diptera: culicidae) in villages on the Kenya coast. II. Dispersal within
and between villages. J Med Entomol. 1977; 14(1): 49-53.
88
McInnis DO, Shelly TE, Komatsu J. Improving male mating
competitiveness and survival in the field for medfly, Ceratitis capitata
(Diptera: Tephritidae) SIT programs. Genetica. 2002; 116(1): 117-124.
Meats A, Maheswaran P, Frommer M, Sved J. Towards a male-only
release system for SIT with the Queensland fruit fly, Bactrocera tryoni,
using a genetic sexing strain with a temperature-sensitive lethal
mutation. Genetica. 2002; 116: 97–106.
Merritt RW, Dadd RH, Walker ED. Feeding behavior, natural food, and
nutritional relationships of larval mosquitoes. Annu Rev Entomol.
1992; 37: 349–76.
Milby MM, Reisen WK, Reeves WC. Intercanyon movement of marked
Culex tarsalis (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 1983; 20(2): 193-
198.
Miller LH, Sakai RK, Romans P, Gwadz RW, Kantoff P, Coon HG. Stable
integration and expression of a bacterial gene in the mosquitoe
Anopheles gambiae. Science. 1987; 247(4816): 779-781
Ministério da Saúde. Oswaldo Cruz. [on line]. Disponível em:
http://www.invivo.fiocruz.br/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?infoid=114&sid
=6
Morais SA, Marrelli MT, Natal D. Aspectos da distribuição de Culex
(Culex) quinquefasciatus Say (Diptera, Culicidae) na região do rio
Pinheiros, na cidade de São Paulo, Estado de São Paulo, Brasil. Rev
Bras Entomol. 2006; 30(3): 413-418.
89
Morais SA, Marrelli MT, Natal D. Aspectos da distribuição de Culex
(Culex) quinquefasciatus Say (Diptera, Culicidae) na região do rio
Pinheiros, na cidade de São Paulo, Estado de São Paulo, Brasil. Rev
Bras Entomol. 2006; 50(3): 413-418.
Moreira LA, Edwards MJ, Adhami F, Jasinskiene N, James AA, Jacobs-
Lorena M. Robust gut-specific gene expression in transgenic Aedes
aegypti mosquitoes. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97(20): 10895–
10898.
Moreira LA, Ito J, Ghosh A, Devenport M, Zieler H, Abrahan EG, Crisanti
A, Nolan T, Catteruccia F, Jacobs-Lorena M. Bee venom phospholipase
Inhibits malaria parasite development in transgenic mosquitoes. J Biol
Chem. 2002; 277(43): 40839-40843.
Moreira LA, Wang J, Collins FH, Jacobs-Lorena M. Fitness of Anopheline
Mosquitoes Expressing Transgenes That Inhibit Plasmodium
Development. Genetics. 2004; 166: 1337–1341.
Morris AC, Egglestone P, Crampton JM. Genetic transformation of the
mosquitoe Aedes aegypti by micro-injection of DNA. Med. Vet.
Entomol. 1989; 3(1): 1-7
Muñoz D, Jimenez A, Marinotti O, James AA. The AeAct-4 gene is
expressed in the developing flight muscles of female Aedes aegypti.
Insect Mol Biol. 2004; 13(5): 563–568.
Murgel S, Branco S. Ecossistêmica. Uma abordagem integrada dos
problemas do meio ambiente. Rev Saude Publica. 1990; 24(1): 84-90
90
Myers JH, Savoi A, Randen E. Eradication and pest management. Annu.
Rev. Entomol. 1998; 43: 471–491.
Natal D, Araújo FAA, Vianna RST, Pereira LE, Ueno HM. O mosquito das
águas poluídas. Saneas. 2004; 26-31
Nimmo DD, Alphey L, Meredith JM, Eggleston P. High efficiency site-
specific genetic engineering of the mosquito Genome. Insect Mol Biol.
2006; 15(2): 129–136.
O’Brochta DA, Sethuraman N, Wilson R, Hice R, Pinkerton H, Levesque
AC, Bideshi DK, Jasinskiene N, Coates CJ, James AA, Lehane MJ,
Atkinson PW. Gene vector and transposable element behavior in
mosquitoes. J. Exp. Biol. 2003; 206: 3823-3834.
Parker A, Mehta K. Sterile Insect Technique: a Model for Dose
Optimization for Improved Sterile Insect Quality. Florida Entomologist.
2007; 90(1): 88–95
Peloquin JJ, Thibault ST, Staten R, Miller TA. Germ-line transformation of
pink bollworm (Lepidoptera: gelechiidae) mediated by the piggyBac
transposable element. Insect Mol Biol. 2000; 9(3): 323-333.
Perera OP, Harrell II RA, Handler AM. Germ-line transformation of the
South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a
piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient. Insect
Mol Biol. 2002; 11(4): 291-297.
Phuc HK, Andreasen MH, Burton RS, Vass C, Epton MJ, Pape G, Fu G,
Condon KC, Scaife S, Donnelly CA, Coleman PG, White-Cooper H,
91
Alphey L. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito
control. BMC Biol. 2007; 5(11).
Pilon AF. Twenty steps for developing a healthy cities project. World
Health Organization. Regional Office for Europe. Copenhagen, 1992.
Rev Saude Publica. 1993; 27(4): 308-310.
Pinkerton AC, Michael K, O’Brochta DA, Atkinson PW. Green fluorescent
protein as a genetic marker in transgenic Aedes aegypti. Insect. Mol.
Biol. 2000; 9: 1-10
Porter AG, Davidson EW, Liu JW. Mosquitocidal toxins of bacilli and their
genetic manipulation for effective biological control of mosquitoes.
Microbiol Rev. 1993; 57(4): 838-861
Rendón P, McInnis D, Lance D, Stewart J. Medfly (Diptera: Tephritidae)
genetic sexing: large-scale field comparison of males-only and bisexual
sterile fly releases in Guatemala. J Econ Entomol. 2004; 97(5):1547-
1553.
Robinson A. Genetic sexing methods in the Mediterranean fruit fly,
Ceratitis capitata. Elsevier. 1989; 57–65.
Robinson AS, Franz G, Atkinson PW. Insect transgenesis and its potencial
role in agriculture and human health. Insect Biochem Mol Biol. 2004;
34: 113-120.
Robinson AS. Genetic sexing strains in medfly, Ceratitis capitata, sterile
insect technique programmes. Genetica. 2002; 116: 5–13.
92
Rodrigues FG, Oliveira SB, Rocha BC, Moreira LA. Germline
transformation of Aedes fluviatilis (Diptera:Culicidae) with the piggyBac
transposable element. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2006; 101(7): 755-
757.
Sanjad N. Da abominável profissão de vampiros: Emílio Goeldi e Os
mosquitos no Pará (1905). Manguinhos. 2003; vol. 10(1): 85-111
São Paulo 450 anos. OS RIOS E SEUS AFLUENTES. [on line].
Disponivel em
http://www.aprenda450anos.com.br/450anos/vila_metropole/1-
5_rio_pinheiros.asp
Secretaria do Meio Ambiente do Estado de São Paulo. Os Rios Que
Fazem Nossa História. [on line]. Disponível em
<http://www.ambiente.sp.gov.br/pomar2/osrios.htm>
Sethuramana N, Fraser Jr. MJ, Egglestonc P, O’Brochta DA. Post-
integration stability of piggyBac in Aedes aegypti. Insect Biochem Mol
Biol. 2007; 37: 941–951.
Sharma VP, Patterson RS, Ford HR. A device for the rapid separation of
male and female mosquito pupae. Bull World Health Organ. 1972;
47(3):429-432.
Shearman DC. The evolution of sex determination systems in dipteran
insects other than Drosophila. Genetica. 2002; 116(1):25-43.
93
Shieh WJ, Guarner J, Layton M, Fine A, Miller J, Nash D, Campbell GL,
Roehrig JT, Gubler DJ, Zaki SR. The role of pathology in an
investigation of an outbreak of West Nile encephalitis in New York,
1999. Emerg Infect Dis. 2000; 6(4): 370-372.
Simberloff D. Eradication—preventing invasions at the outset. Weed
Science. 2003; 51: 247–253.
Sirivanakarn S, White GB. Neotype designation of Culex quinquefasciatus
Say (Diptera:Culicidae). Proc. Entomol. Soc Washington. 1978;
80(3): 360-372.
Taipe-Lagos CB, Natal D. Abundância de culicídeos em área
metropolitana Preservada e suas Implicações Epidemiológicas. Rev
Saude Publica. 2003; 37(3): 275-9.
Tamura T, Thibert C, Royer C, Kanda T, Abraham E, Kamba M, Komoto
N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G, Shirk P, Fraser M,
Prudhomme JC, Couble P. Germline transformation of the silkworm
Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat
Biotechnol. 2000; 18(1):81-84.
Teixeira MG, Costa MCN, Barreto ML, Mota E. Dengue and dengue
hemorrhagic fever epidemics in Brazil: what research is needed based
on trends, surveillance, and control experiences?. Cad. Saúde Pública.
2005; 21(5): 1307-1315.
94
Thomas DD, Donnelly CA, Wood RJ, Alphey L. Insect Population Control
Using a Dominant, Repressible, Lethal genetic Sistem. Science. 2000;
287(5462): 2474-2476.
Vreysen MJ, Saleh KM, Ali MY, Abdulla AM, Zhu ZR, Juma KG, Dyck VA,
Msangi AR, Mkonyi PA, Feldmann HU. Glossina austeni (Diptera:
Glossinidae) eradicated on the island of Unguja, Zanzibar, using the
sterile insect technique. J Econ Entomol. 2000; 93(1):123-135.
Wyss JH. Screwworm eradication in the Americas. Ann N Y Acad Sci.
2000; 916: 186-193.
Anexos
Anexo 1
Lote 1: Embriões injetados e posterior desenvolvimento
LÂMINAS OVOS FÊMEAS Larvas G0
Controle 76 X
Grupo 1
1 36 0
2 41 0
3 64 0
4 85 1
TOTAL 226 1 350
Grupo 2
5 29 2
6 45 2
7 47 3
TOTAL 121 7 5900
Grupo 3
8 54
9 54 0
10 50 0
TOTAL 158 0 250
Grupo 4
11 44 0
12 48 0
13 36 1
14 64 0
15 60 1
16 75 0
TOTAL 327 2 500
Cruzamentos entre fêmeas injetadas e machos selvagens,
e número de larvas G1 obtidas
FÊMEAS LARVAS
1 10F + 15M 750
Cruzamentos entre machos injetados e fêmeas selvagens,
e número de larvas G1 obtidas.
MACHOS
FÊMEAS
SELVAGENS
POOL LARVAS
GRUPO 1 10F
GRUPO 2 10F
GRUPO 3 10F
1 950
GRUPO 4 10F
GRUPO 5 10F
GRUPO 6 10F
2 900
GRUPO 7 10F
GRUPO 8 10F
GRUPO 9 10F
3 800
GRUPO 10 10F
GRUPO 11 10F
GRUPO 12 10F
4 1050
GRUPO 13 10F
GRUPO 14 10F
GRUPO 15 10F
5 700
GRUPO 16 10F
GRUPO 17 10F
GRUPO 18 10F
6 1150
GRUPO 19 10F
GRUPO 20 10F
7 700
Anexo 2
Lote 2: Embriões injetados e posterior desenvolvimento
OVOS LARVAS PUPAS MACHOS FÊMEAS
61 x x x x
79 x x x x
86
41
7 7 2 2
76 x x x x
64 2 1 X 1
49 8 5 2 3
104 2 2 X 1
74 2 1 X 1
63
88
91
71
71 65 19 33
Cruzamentos entre pool de fêmeas injetadas e machos selvagens,
e número de larvas G1 obtidas
POOL DE FÊMEAS REPASTO OVIPOSIÇÃO LARVAS
GRUPO 1
10F +
15M
2 1 0
GRUPO 2
10F +
15M
2 1 0
GRUPO 3
10F +
15M
2 1 0
GRUPO 4
11F +
15M
2 2 300
Cruzamentos entre machos injetados e fêmeas selvagens,
e número de larvas G1 obtidas.
MACHOS
FÊMEAS
SELVAGENS
POOL REPASTO OVIPOSIÇÃO LARVAS
GRUPO 1 10 F
GRUPO 2 10F
GRUPO 3 10F
1 2 2 1050
GRUPO 4 10F 2 2 2 1350
GRUPO 5 10F
GRUPO 6 10F
GRUPO 7 10F
GRUPO 8 10F
GRUPO 9 10F
3 2 2 1550
GRUPO 10 10F
GRUPO 11 10F
GRUPO 12 10F
4 2 2 800
GRUPO 13 10F
GRUPO 14 10F
GRUPO 15 10F
5 2 2 1150
GRUPO 16 10F
GRUPO 17 10F
GRUPO 18 10F
6 2 2 1550
GRUPO 19 10F
GRUPO 20 10F
GRUPO 21 10F
GRUPO 22 10F
7 2 1 900
Anexo 3
Lote 3: Embriões injetados e posterior desenvolvimento até adultos.
OVOS LARVAS PUPAS MACHOS FÊMEAS
42
71
62
67
77
73
80 78 40 34
94
46
82
113
43 36 19 14
Cruzamentos entre pool de fêmeas injetadas e machos selvagens,
e número de larvas G1 obtidas
POOL DE FÊMEAS LARVAS
GRUPO 1
10F +
10M
1400
GRUPO 2
10F +
10M
500
GRUPO 3
10F +
10M
1050
GRUPO 4
10F +
10M
1400
GRUPO 5
08F +
10M
1200
Cruzamentos entre machos injetados e fêmeas selvagens,
e número de larvas G1 obtidas.
MACHOS POOL LARVAS
GRUPO 1 10F
GRUPO 2 10F
GRUPO 3 10F
1 1000
GRUPO 4 10F
GRUPO 5 10F
GRUPO 6 10F
2 400
GRUPO 7 10F
GRUPO 8 10F
GRUPO 9 10F
3 400
GRUPO 10 10F
GRUPO 11 10F
GRUPO 12 10F
4 500
GRUPO 13 10F
GRUPO 14 10F
GRUPO 15 10F
5 950
GRUPO 16 10F
GRUPO 17 10F
GRUPO 18 10F
6 800
GRUPO 19 10F
GRUPO 20 10F
GRUPO 21 10F
7 550
GRUPO 22 10F
GRUPO 23 10F
GRUPO 24 10F
8
MACHOS POOL LARVAS
GRUPO 25 10F
GRUPO 26 10F
GRUPO 27 10F
9
GRUPO 28 10F
GRUPO 29 10F
GRUPO 30 10F
10
GRUPO 31 10F
GRUPO 32 10F
GRUPO 33 10F
11 1050
GRUPO 34 10F
GRUPO 35 10F
GRUPO 36 10F
12 850
GRUPO 37 10F
GRUPO 38 10F
GRUPO 39 10F
13 650
GRUPO 40 10F
GRUPO 41 10F
GRUPO 42 10F
14 900
GRUPO 43 10F
GRUPO 44 10F
GRUPO 45 10F
15 600
GRUPO 46 10F
GRUPO 47 10F
GRUPO 48 10F
16 400
GRUPO 49 10F
GRUPO 50 10F
GRUPO 51 10F
17 950
GRUPO 52 10F
GRUPO 53 10F
GRUPO 54 10F
18
GRUPO 55 10F
GRUPO 56 10F
GRUPO 57 10F
19 550
GRUPO 58 10F
GRUPO 59 10F
20 600
Anexo 4
Lote 4:Embriões injetados, posterior desenvolvimento, ;
OVOS LARVAS PUPAS MACHOS G0 FÊMEAS G0
833 115 109 55 52
Cruzamentos entre indivíduos injetados e selvagens, e larvas G1 obtidas.
MACHOS SELVAGENS FÊMEAS SELVAGENS
1 10 FÊMEAS 1
2 10 FÊMEAS 2
3 10 FÊMEAS 3
4 10 FÊMEAS 4
5 10 FÊMEAS 5
6 10 FÊMEAS 6
7 10 FÊMEAS 7
8 10 FÊMEAS 8
9 10 FÊMEAS 9
10 10 FÊMEAS 10
10 MACHOS
11 10 FÊMEAS 11
12 10 FÊMEAS 12
13 10 FÊMEAS 13
14 10 FÊMEAS 14
15 10 FÊMEAS 15
16 10 FÊMEAS 16
17 10 FÊMEAS 17
18 10 FÊMEAS 18
19 10 FÊMEAS 19
20 10 FÊMEAS 20
10 MACHOS
21 10 FÊMEAS 21
22 10 FÊMEAS 22
23 10 FÊMEAS 23
24 10 FÊMEAS 24
25 10 FÊMEAS 25
26 10 FÊMEAS 26
27 10 FÊMEAS 27
28 10 FÊMEAS 28
29 10 FÊMEAS 29
30 10 FÊMEAS 30
10 MACHOS
31 10 FÊMEAS 31
32 10 FÊMEAS 32
33 10 FÊMEAS 33
34 10 FÊMEAS 34
10 MACHOS
MACHOS SELVAGENS FÊMEAS SELVAGENS
35 10 FÊMEAS 35
36 10 FÊMEAS 36
37 10 FÊMEAS 37
38 10 FÊMEAS 38
39 10 FÊMEAS 39
40 10 FÊMEAS 40
41 10 FÊMEAS 41
42 10 FÊMEAS 42
43 10 FÊMEAS 43
44 10 FÊMEAS 44
45 10 FÊMEAS 45
46 10 FÊMEAS 46
47 10 FÊMEAS 47
48 10 FÊMEAS 48
49 10 FÊMEAS 49
50 10 FÊMEAS 50
51 10 FÊMEAS 51
52 10 FÊMEAS 52
13 MACHOS
53 10 FÊMEAS
54 10 FÊMEAS
55 10 FÊMEAS
TOTAL G1 32.000
Anexo 5
Lote 5: Embriões injetados e posterior desenvolvimento;
OVOS LARVAS PUPAS MACHOS G0 FÊMEAS G0
892 54 33 14 13
Cruzamentos entre indivíduos injetados e selvagens, e larvas G1 obtidas.
MACHOS SELVAGENS FÊMEAS SELVAGENS
1 10 FÊMEAS 1
2 10 FÊMEAS 2
3 10 FÊMEAS 3
4 10 FÊMEAS 4
5 10 FÊMEAS 5
6 10 FÊMEAS 6
7 10 FÊMEAS 7
8 10 FÊMEAS 8
9 10 FÊMEAS 9
10 10 FÊMEAS 10
11 10 FÊMEAS 11
12 10 FÊMEAS 12
13 10 FÊMEAS 13
13 MACHOS
14 10 FÊMEAS TOTAL G1 12.750
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
