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UNIOESTE
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CAMPUS DE MARECHAL CÂNDIDO RONDON
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
NÍVEL MESTRADO
ANDREA BECKER
CONTROLE DE DOENÇAS DE FINAL DE CICLO E OÍDIO DA SOJA
POR EXTRATOS AQUOSOS DE Cymbopogom citratus, Rosmarinus
officinalis E Curcuma longa E SOLUÇÃO DE CURCUMINA
MARECHAL CÂNDIDO RONDON
AGOSTO/2005
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ANDREA BECKER
CONTROLE DE DOENÇAS DE FINAL DE CICLO E OÍDIO DA SOJA
POR EXTRATOS AQUOSOS DE Cymbopogom citratus, Rosmarinus
officinalis E Cúrcuma longa E SOLUÇÃO DE CURCUMINA
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual do Oeste do Paraná, como parte das
exigências do Programa de Pós-Graduação em
Agronomia – Nível Mestrado, para obtenção do
título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. José Renato Stangarlin
MARECHAL CÂNDIDO RONDON
AGOSTO/2005
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AGRADECIMENTO
Agradeço a DEUS pelo dom da vida, coragem e força constantes,
imprescindíveis para a realização deste trabalho.
À Natureza, que é fonte inspiradora dos grandes questionamentos da
humanidade.
Ao professor e orientador Dr. José Renato Stangarlin, por acreditar no
trabalho, não mensurando esforços para sua realização, pela sua dedicação e
virtudes que o tornam uma pessoa extraordinária.
À minha família pelo amor, dedicação inigualável e apoio que me
proporcionaram durante esta etapa da minha vida acadêmica.
À Universidade Estadual do Oeste do Paraná – UNIOESTE, em especial ao
Centro de Ciências Agrárias pela oportunidade o mestrado.
À CAPES – Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino
Superior, pela concessão da bolsa.
As amigas Maria Isabel Balbi Pena, Celestina Klahold e Sandra Vigo Schultz
pelo incondicional auxílio na condução do experimento in vivo.
Às alunas da Graduação Bárbara e Luciana pelo auxílio das tarefas
realizadas no Laboratório de Fitopatologia
À todos os professores da UNIOESTE que colaboraram no realização desse
trabalho.
Obrigada
SUMÁRIO
FIGURA 1.....................................................................Erro! Indicador não definido.
FIGURA 2.....................................................................Erro! Indicador não definido.
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................1
2 REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................3
2.1 A cultura da soja...................................................................................................3
2.2 Doenças na cultura da soja..................................................................................3
2.2.1 Mancha parda ou septoriose.............................................................................4
2.2.2 Crestamento foliar de Cercospora e mancha púrpura da semente ...................5
2.2.3 Oídio..................................................................................................................7
2.3 Controle de doenças .............................................................................................8
2.4 Controle alternativo ..............................................................................................9
2.5 Alecrim (Rosmarinus officinalis) .........................................................................11
2.6 Capim limão (Cymbopogon citratus) ..................................................................12
2.7 Cúrcuma (Curcuma longa) ..................................................................................13
2.8 Mecanismos de defesa da planta........................................................................16
2.8.1 Peroxidase ......................................................................................................18
3 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................1
3.1 Plantas medicinais utilizadas.................................................................................1
3.2 Experimento in vitro..............................................................................................1
3.2.1 Obtenção dos fungos fitopatogênicos ...............................................................1
3.2.2 Obtenção do extrato bruto das plantas medicinais.............................................2
3.2.3 Efeito do EB sobre o crescimento micelial de C. kikuchii..................................2
3.3 Experimento in vivo...............................................................................................3
3.3.1 Solo utilizado no experimento ............................................................................4
3.3.2 Cultura e delineamento experimental.................................................................5
3.3.3 Implantação do experimento ..............................................................................5
3.3.4 Tratos culturais...................................................................................................6
3.3.5 Parâmetros avaliados.........................................................................................6
4
3.4 Dosagem de peroxidase........................................................................................8
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................10
4.1 Experimento in vitro.............................................................................................10
4.2 Experimento in vivo.............................................................................................12
4.3 Dosagem de peroxidase......................................................................................14
5 CONCLUSÃO........................................................................................................17
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................18
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Escala diagramática para avaliação de severidade de doenças de final de
ciclo (DFC) na cultura da soja. Painel superior: sintomas agregados; painel
inferior: sintomas distribuídos (Martins et al., 2004).............................................8
Figura 2. Atividade de peroxidase (U.E. min
-1
grama de peso fresco
–1
) em plantas de
soja Cultivar CD 215 tratadas com extrato bruto aquoso de C. citratus, R.
officinalis e C. longa e solução de curcumina, em condições de campo, no ano
agrícola 2004/2005. A) C. citratus; B) R. officinalis; C) C. longa; D) solução de
curcumina. Água (—◊—); Fungicida (piraclostrobin + epoxiconazol) (—+—);
extratos aquosos a 5% (—x— ) e 10 % (—▲—); solução de curcumina a 50 (—
x—) e 100 mg L
-1
(—▲—)..................................................................................16
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Tratamentos utilizados no ensaio de campo para controle de doenças de
final de ciclo e oídio na cultura da soja, no município de Toledo/PR. ..................4
Tabela 2. Características químicas do solo utilizado no experimento de campo para
controle de doenças de final de ciclo e oídio na cultura da soja, no município de
Toledo/PR. ...........................................................................................................5
Tabela 3. Inibição do crescimento micelial (%) de C. kikuchii em presença de extrato
bruto aquoso de C. citratus, R. officinalis e C. longa e solução de curcumina.
Marechal Cândido Rondon/PR...........................................................................11
Tabela 4. Controle de doenças de final de ciclo (DFC) (C. kikuchii e S. glycines) e
oídio (M. diffusa) em plantas de soja cv CD 215 tratadas com extrato bruto
aquoso de C. citratus, R. officinalis e C. longa e solução de Curcumina em
condições de campo, ano agrícola 2004/2005. Toledo/PR................................13
Tabela 5. Atividade total de peroxidase em plantas de soja cv. CD 215 tratadas com
extrato bruto aquoso de Cymbopogon citratus, Rosmarinus officinalis e Curcuma
longa e solução de curcumina em condições de campo, ano agrícola 2004/2005.
Marechal Cândido Rondon/PR...........................................................................14
RESUMO
CONTROLE DE DOENÇAS DE FINAL DE CICLO E OÍDIO DA SOJA POR
EXTRATOS AQUOSOS DE Cymbopogom citratus, Rosmarinus officinalis E
Curcuma longa E SOLUÇÃO DE CURCUMINA.
A ocorrência das doenças foliares de final de ciclo (DFC) causadas por Septoria
glycines e Cercospora kikuchii e oídio causada por Microsphaera difusa em soja
(Glycine max) são facilmente observadas no campo. Várias alternativas aos
fungicidas têm sido avaliadas nos últimos anos na busca de produtos que controlem
satisfatoriamente as doenças, que tenham pequeno impacto ambiental e baixa
toxicidade aos seres humanos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de
extratos Cymbopogom citratus, Rosmarinus officinalis e Curcuma longa e solução de
curcumina no controle de DFC e oídio. Foram realizados ensaios in vitro para
verificar a atividade antimicrobiana desses extratos, através da análise do
crescimento micelial em meio BDA bem como ensaios em condições de campo, com
a cultivar de soja CD 215. O fungicida pyraclostrobin+epoxiconazole (0,6 L p.c. ha
-1
)
foi utilizado como tratamento controle. Os extratos de C. citratus foram os que mais
inibiram o crescimento micelial de C. kikuchii, com valores de até 36,9% para
concentrações a partir de 10% do extrato. Para R. officinalis, as inibições foram
verificadas apenas a partir da concentração de 10% do extrato, alcançando o valor
de 42,8% de inibição, para o extrato a 20%. C. longa foi a planta com menor
atividade antimicrobiana, com inibição de apenas 17,9% para o extrato a 20%. Para
a curcumina, soluções a partir de 200 mg L
-1
, inibiram em média 15,1% o
crescimento micelial in vitro do patógeno. Com relação aos ensaios de campo,
verificou-se que a massa de 100 grãos do tratamento com C. longa (5%) foi superior
à testemunha, porém igual a C. citratus (5%) e R. officinalis (5 e 10 %). Todos esses
valores foram superiores ao tratamento com fungicida. Para a variável massa total o
tratamento com C. longa (10%) obteve produtividade de 3856 kg ha
-1
mostrando
também bom controle de DFC e oídio. Extrato de R. officinalis (5%) também
proporcionou produção de grãos estatisticamente superior ao tratamento com
fungicida. Nesses dois tratamentos a produção foi em média 15% superior àquela
com produto químico. O melhor controle de DFC ocorreu nos tratamentos com C.
citratus e C. longa, ambas a 5%, e com o fungicida. O melhor controle de oídio
ocorreu com extratos de C. citratus e R. officinalis (5%), C. longa (5 e 10%) e
fungicida. Os tratamentos com C. longa e C. citratus foram estatisticamente iguais ao
fungicida. Para a atividade de peroxidase, R. officinalis e C. longa (5%) resultaram
em valores estatisticamente diferentes da testemunha, porém inferiores a esta. Estes
resultados indicam que embora tenha ocorrido redução da severidade de DFC e
oídio em soja com os extratos de C. longa, C. citratus e R. officinalis, este evento
provavelmente não esteja relacionado com alguma possível ativação ou indução da
atividade de peroxidases e que, possivelmente, outros mecanismos de defesa da
planta, ou mesmo uma atividade antimicrobiana direta, possam estar envolvidos no
controle destas doenças.
ABSTRACT
CONTROL OF LATE SEASON LEAF DISEASES AND POWDERY MILDEW IN
SOYBEAN BY AQUEOUS EXTRACTS OF Cymbopogom citratus, Rosmarinus
officinalis and Curcuma longa AND BY CURCUMIN SOLUTIONS.
The occurrence of late season leaf diseases (DFC) caused by Septoria glycines and
Cercospora kikuchii and powdery mildew caused by Microsphaera diffusa in soybean
(Glycine max) are easily identified in field. In recent years, there has been a seach for
alternatives to fungicides that provide satisfactory disease control with low
environmental impact and low toxicity to human. The objective of this study was to
evaluate the effect of extract of C. citratus, R. officinalis and C. longa and by
curcumin solutions, to control DFC and powdery mildew. In vitro assays were
conduced to verify the antimicrobial activity of those plant extracts, by evaluation of
the mycelial growth of C. kikuchii in PDA medium. Additionally, assays under field
conditions were carried out with soybean cv. CD 215. The pyraclostrobin +
epoxiconazole fungicide (0,6 L c.p. ha
–1
) was used as control. Extract of C. citratus
inhibited the mycelial growth of C. kikuchii in 36,9%, to concenttrations up to 10% of
the extract. To R. officinalis, the inhibited was 42,8% to concentration 10%. The lower
antimicrobial activity was with C. longa with 17,9% of inhibition concentration 20%. In
relation to field assays extract of C. longa 5% was higher than the control with water
to the weight of one hundred seeds, like as C. citratus 5% and R. officinalis 5 and
10 %. The production of the extract of C. longa at 10% was 3856 kg ha
-1
with good
control of diseases. R. officinalis at 5% showed production higher than the control
with water. Those two treatments were 15% higher in relation of grain production
than fungicide. The C. citratus and C. longa, both with 5%, and the chemical reduced
the severity of late season diseases. The better control of powdery mildew was with
extract of C. citratus and R. officinalis at 5%, C. longa at 5 and 10% and the
fungicide. R. officinalis and C. longa at concentration of 5% were statistically different
in relation to enzymatic peroxidase activity, however lesser the control with water.
These results indicate that in spite of reducing diseases severity in soybean with the
use of C. longa, C. citratus and R. officinalis extracts, this is have not relations with a
probably activation of peroxidase activity and that, possibly, other plant defense
mechanisms, or a direct antimicrobial activity, maybe envolved in the control of late
season leaf disease and powdery mildew.
1 INTRODUÇÃO
A soja é a mais importante oleaginosa no mundo cuja produção mundial no
ano de 2003/04 foi de 189,12 milhões de toneladas (Agrianual, 2005). Seu alto teor
de proteínas proporciona múltiplas utilizações e a formação de um complexo
industrial destinado ao seu processamento (Roessing & Guedes, 1993).
A soja como as demais plantas, precisa estar sempre bem nutrida, livre de
doenças e protegida contra as pragas que possam lhe atacar e diminuir a sua
produção. Dessa forma, para se obter retorno econômico do investimento, o
agricultor necessita estar atento ao manejo adequado que a cultura requer (Bokert et
al., 1994).
Entre os fatores que limitam o rendimento da soja, as doenças são os mais
importantes por serem de difícil controle (EMBRAPA, 2004). A importância
econômica de cada doença varia de acordo com o ano e a região, dependendo da
condição climática de cada safra, podendo-se, no entanto, destacar as doenças de
final de ciclo ou DFC, causadas por Cercospora kikuchii e Septoria glycines, e o
oídio causado por Microsphaera diffusa. No Brasil, o valor das perdas anuais por
doenças é relativamente alta, e tende a aumentar pelo microclima favorável
proporcionado pelo sistema plantio direto (menor temperatura e aumento do teor de
umidade no solo), facilitando a disseminação dos patógenos (Bokert et al., 1994).
O controle das doenças de plantas através de resistência é o modo mais
eficaz e econômico, porém, para a maioria dos patógenos, não existem cultivares
resistentes. A eliminação ou a manutenção das doenças em nível de dano
2
econômico depende do conhecimento das exigências específicas de cada uma
delas e da integração de várias práticas culturais, onde se incluem: rotação/
sucessão de culturas, tratamento químico da semente, resistência varietal, calagem
e adubação equilibrada, população adequada de plantas, melhor época de
semeadura, controle de plantas daninhas e tratamento químico da parte aérea
(Bokert et al., 1994). O uso de fungicidas sintéticos tem sido o método mais utilizado
para controle de DFC e oídio na soja, o qual, embora apresente excelentes
resultados em curto prazo, pode acarretar em problemas de contaminação ambiental
e do homem, além de selecionar populações do patógeno insensíveis a estes
produtos. Adicionalmente, seu uso fica restrito aos cultivos convencionais de soja,
não sendo permitida a sua utilização em cultivos orgânicos ou ecológicos.
Com relação ao tratamento da parte aérea visando ao controle de doenças,
podem ser utilizados, além de fungicidas, produtos à base de microrganismos para
controle biológico, bem como os produtos naturais extraídos de plantas medicinais.
Estes últimos podem desempenhar tanto atividade antimicrobiana direta, através de
sua fungitoxicidade inerente, quanto induzir resistência, através da ativação dos
mecanismos de defesa da planta hospedeira. Assim as plantas medicinais, com
seus compostos secundários podem oferecer ao agricultor consideráveis recursos
para o controle de doenças.
Dessa forma, os objetivos desse trabalho foram avaliar o potencial dos
extratos das plantas medicinais Cymbopogon citratus (capim-limão), Rosmarinus
officinalis (alecrim) e Curcuma longa (cúrcuma ou açafrão) no controle de DFC e
oídio em soja in vitro e a campo.
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A cultura da soja
A soja (Glycine max (L.) Merril) já é cultivada a muito tempo na China, mas
pode ser considerada recente nas Américas. A adaptação ao continente americano
foi muito boa e atualmente mais de 75% da produção mundial encontra-se nas
Américas. No Brasil esta cultura começou a ter expressão econômica no Rio Grande
do Sul na década de 60, e passado pouco mais de 40 anos, em 2004, o país já era é
o segundo produtor mundial, com 25% da produção (EMBRAPA, 2004).
A soja assume grande relevância econômica no Brasil com produção anual
superior a 50 milhões de toneladas e área plantada de 21 milhões de hectares,
participando efetivamente no PIB nacional e trazendo progresso para as regiões
produtoras (Agrianual, 2005).
2.2 Doenças na cultura da soja
A expansão da área de cultivo da soja, aliada à falta de cuidados
fitossanitários e ao monocultivo de cultivares geneticamente semelhantes, favoreceu
a disseminação da maioria dos patógenos para as mais diversas regiões produtoras
(Martins et al., 2003).
4
Entre as principais doenças foliares da soja estão a mancha parda (Septoria
glycines); o crestamento foliar (Cercospora kikuchii), a ferrugem asiática
(Phakopsora pachyrhizii), a antracnose (Colletotrichum truncatum) e o oídio
(Microsphaera diffusa) (Juliatti et al., 2003). Sob condições favoráveis, as doenças
foliares de final de ciclo (DFC), complexo causado por C. kikuchii e S. glycines
podem reduzir a produtividade de grãos em mais de 20%, equivalente a uma perda
anual de quatro milhões de toneladas de soja na produção nacional (EMBRAPA,
2004). As perdas podem ser ainda maiores se as DFC forem associadas aos danos
causados por outras doenças (cancro da haste, antracnose, nematóides de galhas,
nematóide de cisto e podridão branca da haste) (Hamawaki et al., 2003).
2.2.1 Mancha parda ou septoriose
O agente causal da mancha parda é o fungo Mycosphaerella uspenskajae
Mashk. & Tomil (Septoria glycines Hemmi). Esta doença está amplamente
disseminada no país, podendo causar reduções superiores a 30% na produtividade.
Inicialmente o fungo S. glycines é introduzido na lavoura por meio de sementes
infectadas e, posteriormente, os conídios produzidos nas folhas e restos culturais
são disseminados pela chuva e pelo vento (Yorinori, 1997).
Os primeiros sintomas provenientes de infecção na semente aparecem
cerca de duas semanas após a emergência, como pequenas manchas de contornos
angulares, de cor castanho-avermelhadas nas folhas unifoliadas. Sob situações
favoráveis, a doença pode atingir os primeiros trifolíolos e causar severa desfolha
em plantas de até 35-40 dias, sendo que após este período, as plantas se
5
recuperam. Um novo surto da doença ocorre ao final do enchimento das vagens,
após o estádio R6. Nas folhas verdes, surgem pontuações pardas, menores que 1
mm de diâmetro, que evoluem e formam manchas com halos amarelados, de
coloração parda na página superior e rosada na página inferior, medindo de 1 a 3
mm de diâmetro. Em infecções severas, causa desfolha e maturação prematura,
com conseqüente redução da produtividade (Almeida et al., 1997).
A ocorrência da mancha parda é normalmente acompanhada da incidência
de outra doença foliar denominada crestamento foliar de Cercospora. Ambas
ocorrem no final de granação da soja e, devido à dificuldade em quantificá-las
separadamente, são consideradas como um complexo de doenças de final de ciclo
(Yorinori, 1997).
2.2.2 Crestamento foliar de Cercospora e mancha púrpura da semente
O agente causal do crestamento de Cercospora e mancha púrpura da
semente é o fungo Cercospora kikuchii (Matsumoto & Tomoyasu) M. W. Gardner.
Assim como a mancha parda, esta doença está disseminada por todas as
regiões produtoras de soja no país. Porém o crestamento foliar é mais severo nas
regiões quentes e chuvosas dos cerrados. Seus efeitos são mais visíveis após os
estádios de completa formação de vagens (R6) e início da maturação (R7.1). Ambas
ocorrem na mesma época e, freqüentemente, devido às dificuldades que
apresentam nas avaliações individuais, são consideradas como um “complexo de
doenças de final de ciclo” (Yorinori, 1997).
6
A predominância de uma ou de outra doença pode ser notada sob condições
de campo, pela coloração das folhas na fase de maturação. Quando o
amarelecimento natural das folhas é rapidamente substituído por pequenas
manchas de coloração parda ou crestamento castanho-claro, a predominância é da
septoriose; e quando a coloração das folhas muda rapidamente para o castanho-
escuro ou castanho-avermalhado, a predominância é de crestamento de
Cercospora. Além do crestamento foliar, a elevada incidência da doença ocorrida no
campo pode ser observada também após a colheita, pela alta freqüência de
sementes com mancha púrpura. Em ambos os casos, a mudança de coloração das
folhas é seguida de rápida desfolha, enquanto as vagens ainda estão verdes. A
antecipação da desfolha força a maturação antes que haja a completa formação dos
grãos. A deficiência de granação pode atingir até 30% em relação a uma planta
sadia (Almeida et al., 1997).
Nas folhas os sintomas aparecem a partir do final da granação e são
caracterizadas por pontuações escuras, castanho-avermelhadas, as quais
coalescem e formam grandes manchas escuras que resultam em severo
crestamento e desfolha prematura. Nas vagens, aparecem pontuações vermelhas
que evoluem para manchas castanho-avermelhadas. Através da vagem, o fungo
atinge a semente e causa a mancha púrpura no tegumento. Nas hastes, o fungo
causa manchas vermelhas, geralmente superficiais, limitadas ao córtex. Em certas
situações, tal como em solos de baixa fertilidade nos primeiros anos de cultivo nos
cerrados, quando a infecção ocorre nos nós, o fungo pode penetrar na haste e
causar necrose de coloração avermelhada na medula. O fungo é introduzido em
7
lavouras por sementes contaminadas e sobrevive nos restos culturais (Yorinori,
1997).
2.2.3 Oídio
O agente causal do oídio é o fungo biotrófico Microspharea diffusa Cooke &
Peck. O esporo (conídio ou ascósporo) do fungo, ao cair na superfície da folha,
germina e produz uma teia de micélio que se espalha pela superfície da planta. O
micélio penetra nas células epidérmicas e, por meio de haustórios intracelulares,
nutre-se do conteúdo das células. Na superfície da planta forma-se uma fina camada
de micélio e esporos (conídios) pulverulentos que, de pequenos pontos brancos,
podem cobrir toda a folha, as vagens e parte da haste (Almeida et al., 1997).
Apesar de ser uma doença ainda de pouca expressão, a ocorrência de oídio
está aumentando nas regiões altas dos cerrados e em campos de multiplicação de
sementes na entressafra, sob irrigação (Yorinori, 1997). Porém, a partir da safra
1996/97, tem apresentado severa incidência em diversas cultivares em todas as
regiões produtoras, desde os Cerrados ao Rio Grande do Sul. As lavouras mais
atingidas podem apresentar perdas de produtividade de até 40-50% (EMBRAPA,
2004).
Os sintomas apresentados pelo oídio podem variar de clorose, ilhas verdes,
manchas ferruginosas, desfolha acentuada ou combinações desses sintomas,
dependendo da reação das cultivares. Todavia, o mais evidente é a própria estrutura
branca e pulverulenta do fungo sobre a superfície das partes infectadas (Yorinori,
1997).
8
2.3 Controle de doenças
As alternativas para o controle das DFC são a escolha de variedades
resistentes, épocas de plantio e rotação de culturas, além do uso de fungicidas no
tratamento das partes áreas. Entretanto, para que essa prática seja
economicamente viável, exige-se um melhor conhecimento do uso de fungicidas em
relação ao ciclo da cultura, produtos e suas misturas e época de aplicação, além de
conhecer o grau de resistência da(s) cultivar (es) utilizada(s) em determinada região,
bem como informações sobre condições ambientais que propiciam o aumento da
intensidade das referidas doenças (Uzeika et al., 2003; Juliatti et al., 2003).
O controle das doenças através de resistência é o modo mais eficaz e
econômico, porém, para a maioria dos patógenos, não existem cultivares
resistentes. Na prática, a medida de controle mais utilizada acaba sendo o químico,
através da pulverização de fungicidas para as doenças foliares de final de ciclo. O
uso dos fungicidas pode trazer soluções a curto prazo para os agricultores. Porém, a
longo prazo, pode acarretar em seleção de populações de fitopatógenos resistentes
às substâncias químicas utilizadas, causar efeitos colaterais negativos sobre fungos
benéficos, como Nomurea rileyi (favorecendo o aumento de populações da lagarta-
da-soja) (EMBRAPA, 2004), além do grande risco de contaminação do meio
ambiente e do homem (Kimati, 1995).
Neste contexto, termos como “agricultura alternativa” ou “agricultura
sustentável” obtém expressão política (Zadoks, 1992) e estimulam a busca de novas
medidas de proteção das plantas contra as doenças.
9
2.4 Controle alternativo
Sob a denominação genérica de controle alternativo, estão incluídos o
controle biológico, o controle induzido, também conhecido como indução de
resistência, resistência induzida e imunização (Moraes, 1992) e o uso de extratos
vegetais com atividades antimicrobiana e/ou indutora de resistência (Schwan-
Estrada et al., 2003).
O controle biológico pode ser definido como o controle de um microrganismo
pela ação direta de outro mecanismo antagônico, o qual pode atuar por meio de
antibiose, parasitismo, competição, predação ou hipovirulência (Cook & Baker, 1983;
Moraes, 1992). Já a indução de resistência envolve a ativação de mecanismos de
defesa latentes existentes nas plantas em resposta aos tratamentos com agentes
bióticos ou abióticos (Hammerschmidt & Dann, 1997). Uma diferença fundamental
entre o controle biológico e o controle induzido é que, no primeiro, a ação
controladora se faz diretamente sobre o patógeno, enquanto que, no segundo, a
ação se dá sobre a planta hospedeira, modificando a sua ralação com o patógeno
(Moraes, 1992).
A indução de resistência (ou indução de proteção, imunidade adquirida, ou
resistência sistêmica adquirida) envolve a ativação de mecanismos de defesa
latentes nas plantas em resposta ao tratamento com agentes bióticos ou abióticos
(Hammerschmidt & Dann, 1997). Esses mecanismos podem ser estruturais ou
bioquímicos (Pascholati & Leite, 1995). Essa ativação pode ser obtida pelo
tratamento com agentes bióticos (como microrganismos viáveis ou inativados)
(Stangarlin e Pascholati, 1994) ou abióticos, como ácido 2,6-dicloroisonicotínico
10
(Hijwegwn et al., 1996) e acibenzolar-S-metil – BION
®
(Ciba, 1995). A proteção
conferida pelo tratamento é capaz de proteger a planta contra infecções
subseqüentes por diferentes patógenos (Kuc, 1995).
As plantas medicinais e seus produtos podem oferecer ao agricultor
considerável recurso para o controle de pragas, doenças e plantas invasoras que
prejudicam o rendimento das culturas, especialmente na pequena propriedade
(Guerra, 1995).
A exploração da atividade biológica de compostos secundários presentes no
extrato bruto de plantas medicinais pode constituir, ao lado da indução de
resistência, em uma forma potencial de controle alternativo de doenças em plantas
cultivadas (Stangarlin et al., 1999).
Nesse contexto, várias plantas medicinais têm mostrado atividade
antibacteriana e antifúngica como Ocimum sp. para controle de Phytophthora sp. e
Rhizoctoni solani (Benini et al., 1999), Artemisia canphorata para controle de
Bipolaris sorokiniana em trigo (Franzener et al., 2003), Azadirachta indica para o
controle de Oidium lycopersica em tomateiro (Carneiro, 2003), Eucalyptus citriodora
para controle de Colletotrichum lagenarium em pepino (Bonaldo et al.,2004), Mikania
glomerata para controle de Xanthomonas campestris pv. campestris em couve flor
(Vigo-Schltz, 2004), Zingiber officinalis para controle de Sclerotinia sclerotiorum em
alface (Rodrigues, 2004) e de Brassica rapa para controle de R. solani em feijoeiro
(Dhinghra et al., 2004).
11
2.5 Alecrim (Rosmarinus officinalis)
Originário da região do Mediterrâneo, o alecrim é um planta semi-arbustiva,
perene, lenhosa, ramificada, da família Lamiaceae, cuja altura oscila entre 50 cm a 2
m. As folhas possuem comprimento de 2 a 4 cm e largura de 1 a 4 mm, sendo
lineares, estreitas, opostas, sésseis, coriáceas, com bordos recurvados ou enrolados
para dentro ao longo da nervura central. A página superior das folhas é verde
rugosa, e a página inferior contém pêlos finos e é brilhante e esbranquiçada. As
flores estão dispostas em pequenos cachos na axila de brácteas e possuem cor
azul-violeta, rosa ou branca (Corrêa et al., 1998; Hertwig, 1986; Silva et al., 1995). A
produtividade média, quando plantada em condições ideais de clima e solo, pode
chegar ao redor de 11.500 kg/ha de planta fresca e 3.900 kg/ha de matéria seca
(Corrêa Jr. et al., 1994; Martins et al., 1994, Simões et al., 1989).
R. officinalis têm os seguintes princípios ativos: taninos, flavanóides, óleo
essencial rico em terpenos (cineol, pineno, borneol, canfeno, eucaliptol, acetato de
isobornila, valerianato de isonila, cânfora), além de saponinas, ácidos (cítrico,
glicólico, glicínico, rosmarínico), nicotinamida, colina, pectina, rosmaricina e vitamina
C ( Teske e Trentini, 2001).
O potencial de R. officinalis para controle de fitopatógenos foi verificado por
Becker (2003). Neste trabalho, os extratos de alecrim a 5% e 10% reduziram em
43% e 52%, respectivamente, a severidade da mancha angular causada por
Pseudomonas syringae pv. lachrymans em pepino cultivado organicamente e em
ambiente protegido. Estes resultados não diferiram, no entanto, do tratamento
padrão do agricultor, representado pela calda bordaleza. O extrato de alecrim neste
12
trabalho também apresentou atividade elicitora, induzindo a produção de fitoalexinas
em bioensaio com mesocótilos de sorgo.
Gasparini et al. (2000), em ensaio in vitro, utilizaram extrato aquoso de R.
officinalis isoladamente ou em mistura com Lippia alba nas concentrações de 5, 10,
15, 20, 25 e 50%, esterilizado por autoclavagem para verificar o efeito sobre o
crescimento micelial dos isolados de Colletotrichum graminicola, Alternaria
alternata, Phytophthora sp., Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. Este ensaio
indicou que em relação ao extrato bruto de alecrim, houve maior inibição na
concentração de 50% para os isolados estudados, com exceção a A. alternata, onde
a inibição foi maior nas concentrações de 10 e 15%. Com relação ao extrato bruto de
erva cidreira, os fungos S. rolfsii, A. alternata e R. solani apresentaram inibição do
crescimento micelial na concentração de 50%, o que não ocorreu com C.
graminicola, para o qual os melhores resultados estavam nas concentrações de
10% e de Phytophthora sp., onde a inibição ocorreu na concentração de 15%.
Quando em presença da mistura dos extratos, os resultados obtidos mostraram que
ocorreu inibição no crescimento micelial de C. graminicola, A. alternata e S. rolfsii, na
concentração de 50%, enquanto que para R. solani e Phytophthora sp. a inibição foi
maior nas concentrações de 25 e 15%, respectivamente.
2.6 Capim limão (Cymbopogon citratus)
Esta planta, originária da Índia, é herbácea, perene, cespitosa, da família
Gramineae, caule rizomatoso, curto, com nós bem demarcados, com até 2 m de
13
altura. As folhas são alongadas, limbo linear, lanceolado, áspero nas duas faces,
paralelinérvias, bordo liso, cortante e são recobertas por fina camada de cera
esbranquiçada. Possuem inflorescência do tipo panícula (Corrêa et al., 1998;
Hertwig, 1986; Martins et al., 1994; Silva et al., 1995).
C. citratus têm os seguintes princípios ativos: óleo essencial aromático, ricos
em terpenos, citral (mistura de neral e geranial), mirceno, canfeno, limoneno, mentol,
linalol, flavanóides, saponina, sisterol, taninos, álcoois saturados de cadeia longa
(hexaconsanol e triacontanol) e triterpenóides (Teske e Trentini, 2001).
O potencial de C. citratus para controle de fitopatógenos foi também
verificado por Becker (2003). Os extratos aquosos a 5% e 10% não foram capazes
de reduzir a severidade da mancha angular causada por P. syringae pv. lachrymans
em pepino cultivado organicamente e em ambiente protegido, embora o extrato a
1% tenha potencial elicitor, induzindo a síntese de fitoalexinas em mesocótilos de
sorgo.
Em ensaio in vitro contra Cladosporium fulvium isolado de tomateiro, o
extrato de C. citratus, em concentração maior de 20%, apresentou inibição total de
até 61% para esporulação, 21% para germinação de esporos e 60% para
crescimento micelial do patógeno (Baldo et al., 2005)
2.7 Cúrcuma (Curcuma longa)
A cúrcuma uma planta da família Zingiberaceae, originária do sudoeste da
Ásia (Cecílio Filho et al., 2000), é também conhecida vulgarmente no Brasil por
14
açafrão da Índia ou açafrão da terra. Pode ser cultivada praticamente em locais que
apresentam clima tropical e subtropical (Pereira & Stringheta, 1998).
A planta é do tipo herbácea e perene, atinge em média 120 a 150 cm de
altura em condições favoráveis de clima e solo (Cecílio Filho et al., 2000). É uma
planta com caule tipo rizomas de onde partem quatro ou cinco folhas com pecíolos
longos e disposição alternada. As folhas são de formato lanceolado, liso de cor
verde pálida, apresentam sulcos oblíquos na face inferior, com 30 a 50 cm de
comprimento com 10 a 15 cm de largura. Na parte inferior, a justaposição dos
pecíolos forma uma espécie de estirpe (Peckolt & Peckolt, 1899
1
apud Cúrcuma,
2003).
Os rizomas representam o interesse econômico da cultura, apresentando
características como: 12% de proteína, 30 a 50% de amido, 5,5% de fibras e 2 a 9%
de cinzas. No entanto, não são os atributos nutritivos os principais componentes
qualitativos dos rizomas de cúrcuma, sendo caracterizado e avaliado pela presença
do corante curcumina e de óleos essenciais (Cecílio Filho, 1996). Atualmente, são
três os produtos de cúrcuma no mercado: o pó de cúrcuma, que consiste em raízes
secas e moídas; a oleosina, que é obtida por extração com solventes do pó da
cúrcuma, com rendimentos de 12%, sendo que este apresenta 30 a 40% de
pigmentos expressos em curcumina e de 15 a 25% de óleo volátil, sendo um produto
altamente viscoso e de cor marrom alaranjada, e, o terceiro produto é o extrato de
curcumina purificado, que se apresenta sem o aroma ou sabor residual (Pereira &
Stringheta, 1998).
1
PECKOLT, T & PECKOLT, G. História das plantas medicinais e úteis do Brasil. 7º fascículo –
Rio de Janeiro: Cia. Typographica do Brasil, p. 1119-1369, 1899.
15
Utilizada desde a antiguidade na medicina e gastronomia popular do oriente,
a cúrcuma vem se tornando importante para a ciência moderna no combate a vários
problemas, podendo destacar-se alguns efeitos de seus como: antiinflamatório,
antioxidante, antiprotozoário, antibacteriano, antifúngico e antinematóide. Podem ser
acrescentados os efeitos conhecidos pela farmacopéia asiática como estomáquico,
estimulante, carminativo, expectorante e anti-helmíntico (Cecílio Filho & Souza,
1999; Teske e Trentini, 2001).
Trabalhos sobre o potencial de C. longa no controle de fitopatógenos
referem-se basicamente ao estudo da atividade antimicrobiama in vitro de seus
compostos, como contra Colletotrichum gloesporioides, Sphaceloma cardamoni,
Pestalotia palmarum, Rhizoctoniz solani, Aspergillus sp. e Fusarium sp. (Saju et al.,
1998), Fusarium udum (Singh & Rai, 2000), Machophomina phaseolina (Raja &
Kurucheve, 1998), Colletotrichum falcatum, Fusarium moniliforme, Curvularia
pallescens, Aspergillus niger e Fusarium oxysporum (Singh et al., 2002)
São poucos os trabalhos verificando o potencial in vivo de cúrcuma no
controle de doenças a campo. Um deles é o de Kuhn (2003) no qual foi estudado o
efeito de C. longa em Xanthomonas axonopodis pv. manihotis. In vitro, o extrato
apresentou ação bactericida para concentrações que variam de 10 a 20%
dependendo da procedência dos rizomas. No entanto, in vivo, nas concentrações
utilizadas, não houve efeito curativo em manivas de mandioca infectadas com o
patógeno. Trabalhando em casa de vegetação, Balbi-Peña (2005), observou que a
curcumina e os extratos brutos de cúrcuma apresentaram níveis de controle de pinta
preta (Alternaria solani) do tomateiro similares ao tratamento com fungicida cúprico,
mas inferior ao azoxystrobin. Não houve diferenças estatísticas na produção
16
comercial de tomate entre tratamento. Somente o tratamento de curcumina 50 mg L
-
1
apresentou maior porcentagem de frutos grandes em relação a testemunha. In
vitro, os extratos de cúrcuma a 10 e 15% não autoclavados inibiram em 38,2% e
23,2%, respectivamente, o crescimento micelial e 71,7% e 87%, respectivamente, a
esporulação do fungo. Quando autoclavados, não apresentam inibição do
crescimento micelial nem da germinação de esporos e a inibição da esporulação foi
menor, indicando a presença de compostos antimicrobianos termolábeis. O extrato
não autoclavado na concentração de 5% inibiu em até 15% a germinação dos
esporos. A curcumina inibiu em 29,5% na maior concentração testada, sem,
contudo, afetar a esporulação e a germinação de esporos de A. solani.
Também Kim (2003), utilizando soluções de curcumina (125, 250, 500 e
1000 mg L
-1
), em casa de vegetação, conseguiu inibição completa dos fungos
Phytophthora infestans, em tomate e Puccinia recondita, em trigo, na concentração
de 500 mg L
-1
. Para Botrytis cinerea, em pepino e Rhizoctonia solani em arroz,
houve um controle de 63 e 40%, respectivamente. No entanto os fungos Pyricularia
grisea, em arroz e Erysiphe graminis, em trigo se mostraram insensíveis aos
tratamentos utilizados.
2.8 Mecanismos de defesa da planta
A resistência do hospedeiro a uma doença pode ser definida como a
capacidade da planta em atrasar ou evitar a entrada e/ou a subseqüente atividade
de um patógeno nos tecidos da mesma (Goodman et al., 1986). Para atingir esse
17
objetivo a planta utiliza-se de fatores de resistência ou mecanismos de defesa
divididos em duas categorias: pré-formados, presentes na planta antes do contato
com o patógeno e pós-formados, que se mostram ausentes ou presentes em baixos
níveis antes da infecção, sendo produzidos ou ativados em resposta à presença do
patógeno (Misaghi, 1982). Para Pascholati & Leite (1994, 1995) esses mecanismos
podem ser:
A. Pré-formados (passivos ou constitutivos):
a) Estruturais: cutícula, tricomas, estômatos, fibras/vasos condutores;
b) Boquímicos: fenóis, alcalóides glicosídicos, lactonas insaturadas,
glicosídeos fenólicos e cianogênicos, inibidores protéicos, fitoalexinas,
quitinases e β-1,3 glucanases.
B. Pós-formados (ativos ou induzíveis):
a) Estruturais: papilas, halos, lignificação, camadas de cortiça, tiloses.
b) Bioquímicos: fitoalexinas e proteínas relacionadas à patogênese.
A seqüência de eventos relacionados à indução e expressão da resistência
ou resposta de defesa inicia-se com o reconhecimento pelo hospedeiro de alguma
característica química ou estrutural do patógeno, ou agente de estresse ou dano
associado com a invasão. Esta percepção resulta na produção ou liberação de um
composto sinalizador que é responsável pela indução de resposta de defesa da
planta (Johal et al., 1995)
Os mecanismos ativos de defesa das plantas contra fitopatógenos envolvem
alterações metabólicas que estão relacionadas com mudanças na atividade de
18
enzimas chaves, como a peroxidase, nos metabolismos primário e secundário (Fric,
1976).
2.8.1 Peroxidase
A enzima peroxidase participa de vários processos fisiológicos nas plantas,
catalisando a oxidação e a eventual polimerização de álcool hidroxicinâmico em
presença de peróxido de hidrogênio (Gaspar et al., 1982), compostos estes
relacionados à produção de lignina, e que são depositadas nas paredes celulares e
papila, impedindo o crescimento e desenvolvimento do patógeno (Ride, 1983). A
lignina é uma das mais importantes substâncias da parede celular, e pode estar
presente em todas as três camadas da parede: lamela média, parede primária e
secundária (Taiz & Zeiger, 2004).
Esta enzima participa da biossíntese do hormônio vegetal etileno (Ishige et
al., 1993), da oxidação de compostos fenólicos, os quais acumulam-se em resposta
à infecção (Fry, 1986), oxidação do ácido indolil-3-acético (AIA) e na biossíntese da
lignina (Hoagland, 1990). Mudanças na atividade das peroxidases têm sido
freqüentemente correlacionadas a resposta de resistência ou suscetibilidade em
diferentes patossistemas (Bonatti et al., 1994), como em folhas de uva inoculada
com Plasmopora viticola (Kortekamp & Zyrprian, 2003), folhas de feijão inoculadas
com Botrytis fabae (Nawar & Kuti,2003).
A lignificação é um fator de resistência estrutural formada após a infecção do
patógeno, interferindo no crescimento do patógeno através da modificação química
das paredes celulares, produção de compostos fenólicos de baixo peso molecular e
19
os patógenos também podem ser lignificados, sendo o crescimento dos mesmos
interrompidos (Pascholati & Leite, 1995).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Plantas medicinais utilizadas
Foram utilizadas três espécies de plantas medicinais: Curcuma longa
(cúrcuma), Cymbopogon citratus (capim limão) e Rosmarinus officinalis (alecrim),
cultivadas na propriedade indicada no item 3.3 e coletadas frescas no dia do preparo
do extrato e da aplicação.
3.2 Experimento in vitro
O experimento foi desenvolvido no Laboratório de Fitopatologia da
UNIOESTE – Universidade Estadual do Oeste do Paraná, no período compreendido
entre os meses de abril de 2004 a julho de 2005.
3.2.1 Obtenção dos fungos fitopatogênicos
Os inóculos foram obtidos a partir do isolamento dos fungos C. kikuchii
presentes em lesões de sementes de soja infectadas naturalmente no campo. Os
isolados foram mantidos em meio de cultura BDA, e meio de folhas de cenoura
(Dhingra & Sinclair, 1995), em câmara de crescimento a ± 25 ºC e fotoperíodo de 12
h.
2
3.2.2 Obtenção do extrato bruto das plantas medicinais
O extrato bruto (EB) foi obtido de acordo com Stangarlin et al. (1999) a partir
da trituração das plantas medicinais, em liquidificador, com água destilada contendo
0,25% do antioxidante sulfito de sódio (Na
2
SO
3
) por 1 min (Franzener et al., 2001). O
homogeneizado resultante foi filtrado em gaze e em papel de filtro Whatman n
o
41 e,
posteriormente, diluído para concentrações de 1, 5, 10, 15 e 20%.
3.2.3 Efeito do EB sobre o crescimento micelial de C. kikuchii
O EB nas concentrações indicadas foi misturado ao meio de cultura BDA e
autoclavado durante 20 min a 120 ºC sendo, em seguida, transferidos 15 mL para
placas de Petri de 90 mm de diâmetro. Um disco de 7 mm de diâmetro, contendo o
micélio do fungo C. kikuchii foi transferido para o centro de cada placa de Petri.
As avaliações foram realizadas por meio da mensuração diária do diâmetro
das colônias, correspondente à média de duas medidas diametralmente opostas da
colônia fúngica, iniciando-se 24 h após a instalação do experimento e perdurando
até o momento em que as colônias do tratamento controle colonizaram 2/3 da
superfície total do meio de cultura na placa de Petri. Os valores obtidos para o
crescimento micelial foram transformados em porcentagem de inibição do
crescimento micelial (PIC) utilizando-se fórmula descrita por Bastos (1997).
Além do EB das plantas medicinais, foi utilizada também uma testemunha
(BDA), testemunha (Alcool), um fungicida (indicado no item 3.3) e solução de
curcumina nas concentrações de 25, 50, 100, 200 e 400 mg L
-1
. A curcumina,
3
purificada a partir da C. longa é uma substância comercial disponível e neste
trabalho foi utilizada CURCUMINA PS da Merck (nº produto 820354).
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado (DIC)
com três repetições e 23 tratamentos, sendo cada repetição representada por uma
placa de Petri. Os dados foram submetidos a análise de variância e as médias
comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, pelo Programa ESTAT.
3.3 Experimento in vivo
Este experimento foi desenvolvido na propriedade do Sr. Waldir Ivo Becker,
no município de Toledo/PR (sob infecção natural no campo), em convênio com a
UNIOESTE - Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Campus de Marechal
Cândido Rondon/PR, no período de outubro de 2004 a abril de 2005. Os tratamentos
utilizados no ensaio estão no Tabela 1.
OPERA
®
é um fungicida sistêmico, do grupo químico das estrobilurinas e
triazóis, com formulação do tipo suspo/emulsão e com classe toxicológica II –
altamente tóxico (Andrei, 2003).
4
Tabela 1. Tratamentos utilizados no ensaio de campo para controle de doenças de
final de ciclo e oídio na cultura da soja, no município de Toledo/PR.
TRATAMENTO
PRODUTO
COMERCIAL
DOSAGEM
Testemunha
1
—
2
_
Fungicida
3
OPERA
®
0,6 L ha
-1
Capim Limão — 5%
Capim Limão — 10%
Cúrcuma — 5%
Cúrcuma — 10%
Alecrim — 5%
Alecrim — 10%
Curcumina CURCUMINA 5 g i.a. 100 mL
–1
(50 mg L
-1
)
Curcumina CURCUMINA
10 g i.a. 100 mL
–1
(100 mg
L
-1
)
1
Plantas m antidas sem controle de doenças
2
não há produto comercial
3
Pyraclostrobin + epoxiconazole
3.3.1 Solo utilizado no experimento
O experimento foi realizado em Latossolo Vermelho Eutrófico. O solo foi
caracterizado quimicamente no Laboratório de Química Agrícola e Ambiental
(UNIOESTE) antes da instalação do trabalho para fins de correção e adubação
(Tabela 2).
5
Tabela 2. Características químicas do solo utilizado no experimento de campo para
controle de doenças de final de ciclo e oídio na cultura da soja, no município de
Toledo/PR.
CARACTERÍSTICAS VALOR
Matéria Orgânica (g dm
-3
) 35,89
P (mg dm
-3
) 7,87
K (cmol
c
dm
-3
) 0,36
Ca
2+
(cmol
c
dm
-3
) 6,18
Mg
2+
(cmol
c
dm
-3
) 2,70
pH (CaCl
2
0,01 mol L
-1
) 5,00
SB (cmol
c
dm
-3
)
1
9,23
CTC (cmol
c
dm
-3
)
2
15,71
V%
3
58,80
Al
3+
(cmol
c
dm
-3
) 0,25
1
Soma das bases
2
Capacidade de troca de cátions
3
Saturação por bases
3.3.2 Cultura e delineamento experimental
Foram utilizadas sementes de soja da cultivar COODETEC 215, que tem as
seguintes características: grupo de maturação: precoce, com média de 115 dias e
hábito de crescimento determinado, sendo moderadamente resistente ao
acamamento, resistente ao cancro da haste e mancha “olho de rã”, moderadamente
resistente ao oídio e suscetível ao nematóide de galha, Meloidogyne. incognita.
O delineamento experimental utilizado foi de blocos ao acaso, sendo os
blocos constituídos por 10 tratamentos e quatro repetições (Tabel 1).
3.3.3 Implantação do experimento
No preparo da área para a semeadura foi realizada a dessecação das
plantas daninhas com o herbicida glyfosate 2 L p.c. ha
-1
. Após a emergência da soja,
6
o controle das plantas daninhas foi realizado com o uso de herbicidas pós-
emergentes, quando necessário, permanecendo assim a cultura livre das mesmas.
O experimento foi instalado dentro de uma lavoura comercial que está sob
sistema de plantio direto na palha por 10 anos. A semeadura foi realizada em
meados de outubro em profundidade de 3 a 5 cm e com densidade de 12 a 15
sementes por metro linear. Cada parcela foi composta por cinco linhas com 5 m de
comprimento e espaçadas de 0,45 m. Considerou-se como área útil 4 m das três
linhas centrais, totalizando 5,4 m
2
. A adubação foi realizada na semeadura de
acordo com a análise de solo e a colheita foi realizada no final de fevereiro de 2005.
A aplicação dos fungicidas e dos demais tratamentos foi realizada quando a
cultura se apresentava no estádio R5.1 (Souza Neto & Zagomel, 2002). A aplicação
foi realizada com um pulverizador de CO
2
com volume de calda de 285 ml por
parcela, que equivale a 207 L ha
-1
.
3.3.4 Tratos culturais
Os tratos culturais do experimento foram os mesmos utilizados na condução
da lavoura comercial que estava cercando o experimento, sendo realizadas
aplicações de inseticidas para controle da lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis) e
para controle de percevejos da soja.
3.3.5 Parâmetros avaliados
Os seguintes parâmetros foram avaliados:
7
Produtividade – a colheita foi feita manualmente com auxílio de uma foice.
As plantas da parcela útil foram levadas ao terreiro para a abertura das vagens,
separando-se os grãos e a palhada com auxílio de peneira e transformando-se a
massa obtida em Kg ha
-1
, corrigida para 13% de umidade.
Massa de 100 grãos – para caracterização da massa de 100 grãos foi
utilizada metodologia própria onde foram coletadas 10 amostras de 100 grãos de
cada parcela. Estas foram pesadas e colocadas na estufa a 100
o
C. Após 24 horas
foram novamente pesados os 100 grãos, obtendo-se assim, a umidade dos grãos de
cada parcela, pela média aritmética das 10 amostras. A massa de 100 grãos foi
corrigida para 13% de umidade.
Avaliação da quantidade de doença – para análise da severidade de
doenças utilizou-se a escala de nota visual segundo Azevedo (1998), no estádio R6
a R7, dando-se notas de 0 a 5 para Oídio que correspondem a: ausência de
doenças – 0, 1-10% da área foliar infectada – 1, 11-30% da área foliar infectada – 2,
31-50% da área foliar infectada – 3, 51-70% da área foliar infectada – 4 e mais de
70% da área foliar infectada – 5. Para análise da severidade das DFC utilizou-se a
escala diagramática elaborada por Martins et al. (2004), no estádio R6 a R7, dando-
se notas de 0 a 5 para: ausência de doenças – 0, até 2,4% da área foliar infectada –
1, 2,5-15,2% da área foliar infectada – 2, 15,3-25,9% da área foliar infectada – 3, 26-
40,5% da área foliar infectada – 4, 40,6-66,6% da área foliar infectada – 5 e mais de
66,6% da área foliar infectada – 6 (Figura 1).
8
Figura 1. Escala diagramática para avaliação de severidade de doenças de final de
ciclo (DFC) na cultura da soja. Painel superior: sintomas agregados; painel inferior:
sintomas distribuídos (Martins et al., 2004).
3.4 Dosagem de peroxidase
No momento dos tratamentos, e também após 1, 3, 5 e 7 dias, foram
retiradas amostras foliares para determinação da atividade de peroxidase, utilizando-
se para isto um furador de rolha com diâmetro de 7 mm. Cada amostra continha 10
discos que foram retirados uniformemente de diferentes partes do terço superior das
plantas. Imediatamente após a coleta os discos eram colocados em envelopes feitos
com papel alumínio e mantidos em gelo, sendo posteriormente, congelados e
9
armazenados a –15 ºC. Foram coletadas quatro repetições por tratamento e por
tempo de amostragem.
As amostras coletadas e congeladas foram homogeneizadas em 2 mL de
tampão fosfato de sódio 0,01 M (pH 6,0) em almofariz de porcelana. O
homogeneizado foi centrifugado a 6.000g durante 10 min. O sobrenadante obtido,
considerado como fração contendo as peroxidases solúveis, foi congelado para
posterior determinação da atividade enzimática. Todo o processo de extração das
peroxidases foi conduzido a 4 ºC (Lusso & Pascholati, 1999). A atividade das
peroxidases foi determinada a 30 ºC, através do método espectofotométrico direto
(Hammerschmidt et al., 1982). A mistura da solução continha de 2,9 mL de uma
solução contendo 250 μL de guaiacol e 306 μL de peróxido de oxigênio em 100 mL
de tampão fosfato de sódio 0,01 M (pH 6,0). A reação foi seguida em
espectofotômetro a 470 nm. Os valores foram expressos em unidades de Δ
absorbância min
-1
mg
-1
de peso fresco.
10
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Experimento in vitro
Os extratos de C. citratus foram os que mais inibiram o crescimento micelial
de C. kikuchii, com valores de até 36,9% para concentrações a partir de 10% do
extrato (Tabela 3). Para R. officinalis, as inibições foram verificadas apenas a partir
da concentração de 10% do extrato, alcançando o valor de 42,8% de inibição, para o
extrato a 20%. C. longa foi a planta com menor atividade antimicrobiana, com
inibição de apenas 17,9% para o extrato a 20%. Para a curcumina soluções a partir
de 200 mg L
-1
inibiram em média 15,1% o crescimento micelial in vitro do patógeno.
A maior inibição observada foi com o tratamento fungicida, com valor de 84,6%.
O potencial antimicrobiano de R. officinalis já foi verificado com outros
fungos fitopatogênicos. Nozaki et al. (1999) estudando o efeito de alecrim no
crescimento micelial de Alternaria sp., Alternaria carthami e Sclerotium rolfsii,
verificaram que alíquotas acima de 60 µL do óleo essencial promoveram a inibição
completa de S. rolfsii enquanto que alíquotas acima de 200 µL causaram inibição de
100% no crescimento de Alternaria sp..
Para C. citratus, Bonaldo et al. (1999) estudaram o potencial desta planta e
também de Eucalyptus citriodora, sobre Alternaria alternata, A. solani e A. steviae.
Os mesmos autores observaram que o extrato bruto de capim-limão, em
concentrações de 25 e 50%, inibiu o crescimento micelial de A. alternata em 19 e
36% e de A. steviae em 29 e 30%, respectivamente, enquanto que para A. solani a
inibição foi em torno de 12%.
11
Tabela 3. Inibição do crescimento micelial (%) de C. kikuchii em presença de extrato
bruto aquoso de C. citratus, R. officinalis e C. longa e solução de curcumina.
Marechal Cândido Rondon/PR
Concentração do extrato bruto aquoso (%)
TRATAMENTOS
1 5 10 15 20
MÉDIA
C. citratus
0,0
1
e
2
8,8 d 35,1 b 36,9 b 36,5 b 23,5
3
B
R. officinalis
15,9 c 16,1 c 16,8 c 17,6 c 42,8 b 21,8 B
C. longa
0,0 e 2,1 e 3,9 d 5,6 d 17,9 c 5,9 D
Concentração em mg L
-1
25 50 100 200 400
MÉDIA
Curcumina
12,6
5
c 8,8 d 2,1 d 12,3 c 17,9 c 10,7 C
Controle (H
2
O) 0,0 E
Fungicida
4
84,6 A
CV 16,37
1
Valores expressos em porcentagem de inibição do crescimento micelial em relação ao controle H
2
O;
2
Médias seguidas da mesma letra não diferem estatistícamente entre si pelo teste de Tukey 5%;
3
Médias em porcentagem das cinco concentrações de cada tratamento;
4
Piraclostrobin + epoxoconazole (0,6 L ha
-1
);
5
Valores expressos em porcentagem de inibição do crescimento micelial em relação ao controle com
Álcool.
Com relação à C. longa, Balbi-Peña (2005) estudou o efeito do rizoma de
cúrcuma em A. solani. Os extratos a 10 e 15% não autoclavados inibiram 38,2 e
23,2%, respectivamente, o crescimento micelial e 71,7 e 87% respectivamente, a
esporulação do fungo. Quando autoclavado, não apresentaram inibição do
crescimento micelial nem da germinação dos esporos, e a inibição da esporulação
foi menor, indicando a presença de compostos antimicrobianos termolábeis. A autora
também trabalhou com solução de curcumina a 50, 100, 200 e 400 mg L
-1
, as quais,
no entanto, não inibiram a esporulação e a germinação de esporos in vitro,
reduzindo apenas o crescimento micelial em 29,5% na maior concentração testada.
12
4.2 Experimento in vivo
Verificou-se que a massa de 100 grãos do tratamento com C. longa a 5% foi
superior à testemunha, porém igual a C. citratus a 5% e R. officinalis a 5 e 10 %
(Tabela 4). Todos esses valores foram superiores ao tratamento com fungicida.
Para a variável peso total, o tratamento com C. longa a 10% obteve uma
produtividade de 3856 kg ha
-1
(Tabela 4) mostrando também um bom controle de
DFC e oídio. Além deste tratamento, extrato de R. officinalis a 5% proporcionou
produção de grãos estatisticamente superiores ao tratamento com fungicida. Nesses
dois tratamentos a produção foi em média 15% superior àquela com produto
químico.
Na literatura não há nenhum relato sobre controle alternativo de doenças em
soja pelo uso de produtos naturais, tanto para ensaios sob condições controladas
quanto a campo. No caso das plantas medicinais utilizadas neste trabalho, há
referências de tal tipo de controle em outros patossistemas. Balbi-Peña (2005),
utilizando extratos de C. longa (1 e 10%) e soluções de curcumina (50 e 100 mg L
-1
)
conseguiu níveis de controle da pinta preta (A. solani) do tomateiro, em condições de
cultivo protegido similares ao tratamento com fungicida cúprico, mas inferior ao
fungicida azoxystrobin. No entanto, solução de curcumina a 50 mg L
-1
foi o único
tratamento que proporcionou maior porcentagem de frutos grandes em relação à
testemunha sem controle.
Kim (2003) utilizando soluções de curcumina (125, 250, 500 e 1000 mg L
-1
),
em casa de vegetação, conseguiu inibição completa dos fungos Phytophthora
13
infestans, em tomate e Puccinia recondita, em trigo, na concentração de 500 mg L
-1
,
já para Botrytis cinerea, em pepino e Rhizoctonia solani em arroz, houve um controle
de 63 e 40%, respectivamente. No entanto os fungos Pyricularia grisea, em arroz e
Erysiphe graminis, em trigo foram insensíveis aos tratamentos utilizados.
Tabela 4. Controle de doenças de final de ciclo (DFC) (C. kikuchii e S. glycines) e
oídio (M. diffusa) em plantas de soja cv CD 215 tratadas com extrato bruto aquoso
de C. citratus, R. officinalis e C. longa e solução de Curcumina em condições de
campo, ano agrícola 2004/2005. Toledo/PR.
Massa 100 sementes Peso total Severidade (%)
Tratamentos
(g) (kg ha
-1
) DFC Oídio
C. citratus (%)
5 14,36
ab
1
3699
abc
2 b 10 b
10 13,90 cde 3605 abc
13 ab 22 ab
R. officinalis (%)
5 14,38 ab 3746 ab
13 ab 10 b
10 14,19 abc 3667 bcde
23 a 21 ab
C. longa (%)
5 14,42 a 3243 e
2 b 10 b
10 13,93 cde 3856 a
11 ab 10 b
Curcumina(mg L
-1
)
50 13,92 cde 3652 abc
11 ab 13 ab
100 14,06 bcd 3557 abcd
23 a 13 ab
Fungicida
2
13,74 de 3321 de
2 b 10 b
Testemunha (H
2
O) 13,69 e 3416 cde
30 a 29 a
CV (%) 1,0 3,4
34,6 6,9
1
Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey 5% de
probabilidade;
2
Piraclostrobin + epoxoconazole (0,6 L ha
-1
).
O melhor controle de DFC ocorreu nos tratamentos com C. citratus e C.
longa, ambas a 5%, e com o fungicida. O melhor controle de oídio ocorreu com
extratos de C. citratus e R. officinalis a 5% e C. longa a 5 e 10% e fungicida. Para a
avaliação da severidade de DFC realizadas no estádio R7, os tratamentos com C.
longa e C. citratus foram estatisticamente iguais ao fungicida.
14
4.3 Dosagem de peroxidase
Os resultados da atividade de peroxidase podem ser observados na Tabela
5. Verificou-se que apenas R. officinalis e C. longa a 5% resultaram em atividade de
peroxidase estatisticamente diferente da testemunha, porém inferior a esta.
O comportamento individual, de cada tratamento, com relação à atividade de
peroxidase, em diferentes tempos após a aplicação, pode ser observado na Figura
2. Todos os tratamentos resultaram em incrementos na atividade enzimática 24 h
após as aplicações. No entanto, somente com o extrato de R. officinalis a 10% é que
se verificou diferença nesse incremento, em relação aos demais tratamentos, para
esse tempo de amostragem, embora com relação à atividade total da peroxidase
(Tabela 5), esse tratamento não tenha diferido da testemunha.
Tabela 5. Atividade total de peroxidase em plantas de soja cv. CD 215 tratadas com
extrato bruto aquoso de Cymbopogon citratus, Rosmarinus officinalis e Curcuma
longa e solução de curcumina em condições de campo, ano agrícola 2004/2005.
Marechal Cândido Rondon/PR.
Tratamentos
Atividade de peroxidase
1
(U. E. min
-1
g.p.f
-1
)
C. citratus (%)
5
2,74
cde
3
10 2,94
a
R. officinalis (%)
5 2,64
de
15
10 2,87
ab
C. longa (%)
5 2,64
e
10 2,76 bcd
Curcumina (mg L
-1
)
50 2,77
bc
100 2,83 abc
Fungicida
2
2,72 cde
Testemunha (H
2
O) 2,84 abc
1
Atividade em unidade enzimática (U.E.) a 470 nm por minuto de reação por grama de peso fresco
(g.p.f);
2
Piraclostrobin + Epoxiconazole (0,6 L ha
-1
);
3
Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey 5% de probabilidade.
Estes resultados (Figura 2) indicam que embora tenha ocorrido redução da
severidade de DFC e oídio em soja com os extratos de C. longa, C. citratus e R.
officinalis, este evento provavelmente não esteja relacionado com alguma possível
ativação ou indução da atividade de peroxidases e que, possivelmente, outros
mecanismos de defesa da planta, ou mesmo uma atividade antimicrobiana direta,
possam estar envolvidos no controle destas doenças.
16
A
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
01357
Dias após tratamento
U.E. min
-1
g.p.f.
-1
5%
10%
Água
Fung
B
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
01357
Dias após tratamento
U.E. min
-1
g.p.f.
-1
5%
10%
Água
Fung
C
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
01357
Dias após tratamento
U.E min
-1
g.p.f.
-1
5%
10%
Água
Fung
D
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
01357
Dias após tratamento
U.E. min
-1
g.p.F
-1
50 mg/L
100 mg/L
Água
Fung
Figura 2. Atividade de peroxidase (U.E. min
-1
grama de peso fresco
–1
) em plantas de
soja Cultivar CD 215 tratadas com extrato bruto aquoso de C. citratus, R. officinalis e
C. longa e solução de curcumina, em condições de campo, no ano agrícola
2004/2005. A) C. citratus; B) R. officinalis; C) C. longa; D) solução de curcumina.
Água (—◊—); Fungicida (piraclostrobin + epoxiconazol) (—+—); extratos aquosos a
5% (—x— ) e 10 % (—▲—); solução de curcumina a 50 (—x—) e 100 mg L
-1
(—
▲—)
17
5 CONCLUSÃO
A planta medicinal C. citratus apresenta maior atividade antimicrobiana
média in vitro contra Cercospora kikuchii, inibindo o crescimento micelial deste fungo
fitopatogênico.
Extrato bruto aquoso de Rosmarinus officinalis e Curcuma longa conferem
proteção em soja contra doenças de final de ciclo (Cercospora kikuchii e Septoria
glycines) e oídio (Microsphaera diffusa), resultando em ganhos de produtividade.
A proteção conferida contra doenças de final de ciclo e oídio em plantas de
soja por extratos aquosos de R. officinalis e C. longa não envolve a ativação de
peroxidases.
18
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