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UFRRJ
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA
VETERINÁRIA
DISSERTAÇÃO
CONTROLE DA SAÚVA MATA-PASTO Atta bisphaerica E SAÚVA
LIMÃO Atta sexdens rubropilosa ATRAVÉS DOS FUNGOS
ENTOMOPATOGÊNICOS Metarhizium anisopliae E Beauveria
bassiana
ALZIMIRO MARCELO CONTEIRO CASTILHO
2005
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2
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA
VETERINÁRIA
CONTROLE DA SAÚVA MATA-PASTO Atta bisphaerica E SAÚVA
LIMÃO Atta sexdens rubropilosa ATRAVÉS DOS FUNGOS
ENTOMOPATOGÊNICOS Metarhizium anisopliae E Beauveria
bassiana.
ALZIMIRO MARCELO CONTEIRO CASTILHO
Sob a Orientação do Professor
Carlos Alberto da Rocha Rosa
e Co-orientação do Professor
Marcelo Elias Fraga
Dissertação submetida como requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre em ciências, em
Microbiologa Veterinária.
Seropédica, RJ
Julho, de 2005
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA VETERINÁRIA
ALZIMIRO MARCELO CONTEIRO CASTILHO
Dissertação submetida ao Curso de Pós-Graduação em Microbiologia Veterinária, como
requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em ciências, em Microbiologia
Veterinária.
DISSERTAÇÃO APROVADA EM 29/07/2005
Carlos Alberto da Rocha Rosa Ph.D.
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
Marcelo Elias Fraga Dr.
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
_______________________________________________________
Elen de Lima Aguiar Menezes Dra.
EMBRAPA /Agrobiologia
4
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Sebastião Mello Castilho† e Edi
Conteiro Castilho pelo amor e dedicação e incentivo;
As minhas filhas Paula e Marcella e a minha Irmã
Kátia e minha tia Lucy, convivência e solidariedade;
À Mônica Nascimento Silva de Mattos pelo
companheirismo, carinho, compreensão e motivação
para novas conquistas.
5
AGRADECIMENTOS
• Aos professores Drs. Carlos Alberto da Rocha Rosa e Marcelo Elias Fraga do
Departamento de Microbiologia e Imunologia Veterinária do IV/UFRRJ pela
orientação e co-orientação confiança na realização deste trabalho.
• Aos professores Dr. Aldir de Oliveira de Carvalho e Dra. Margarida Goréte Ferreira
do Carmo do Departamento de Fitotecnia IA/UFRRJ pelo constante incentivo e
amizade.
• A coordenação do Curso de Pós-graduação em Microbiologia Veterinárias pela
atenção e disponibilidade.
• À pesquisadora Dra. Elen de Lima Aguiar Menezes do Laboratório de Entomologia e
Controle Biológico da EMBRAPA/Agrobiologia pela orientação no critério de
amostragem e estudos estatísticos empregados nos experimentos.
• À professora Dra. Vânia R. E. P. Bittencourt do Departamento de Parasitologia
IV/UFRRJ pela orientação no critério de amostragem e estudos estatísticos
empregados nos experimentos e constante incentivo.
• Aos professores do Departamento de Microbiologia e Imunologia Veterinária da
IV/UFRRJ.
• À pesquisadora Dra. Janaina Ribeiro Costa do Laboratório de Estatística da
EMBRAPA/Agrobiologia pela orientação no critério de amostragem e estudos
estatísticos empregados nos experimentos.
• À pesquisadora Dra. Maria do Carmo Araújo Fernandes da PESAGRO-RIO, pelo
constante incentivo.
• Aos alunos de Doutorado em Fitotecnia Arison José Pereira e Viviane Fernandes
Moreira, pelo constante incentivo, apoio e amizade.
• Ao aluno de graduação do curso de Engenharia Agronômica estudante Fábio Mathias
Correia.
• Aos funcionários do Departamento de Fitopatologia do IB/UFRRJ pelo auxílio
técnico.
• Ao amigo, Flávio de Souza Lopes, pelo apoio e amizade.
• A todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste
trabalho.
6
BIOGRAFIA
Alzimiro Marcelo Conteiro Castilho, filho de Sebastião Mello Castilho† e Edi
Conteiro Castilho, nasceu em 03 de junho 1968 no Hospital dos Servidores do Estado do
Rio de Janeiro na rua Sacadura Cabral Rio de Janeiro/RJ.
Iniciou suas atividades escolares no Centro Educacional Arlinda Donadello
Moreira em 1974, terminando-as no Colégio Campo Grande em 1982, ambos no Estado
do Rio de Janeiro.
O segundo grau foi realizado no período de 1984 a 1986 no Instituto de Educação
Geraldo de Almeida, Belfor Roxo - RJ, concomitantemente com o curso
profissionalizante Técnico em Contabilidade.
Em 1988, iniciou o Curso de Graduação em Ciências Biologia da Universidade de
Nova Iguaçu tendo concluído no ano de 1992.
Ingressou no ano 2000 no Curso de Especialização em Tecnologia de Sementes na
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro - Instituto de Agronomia - Departamento
de Fitotecnia, concluído em 2001.
Em março de 2004 ingressou no curso de Pós-Graduação em Microbiologia
Veterinária da UFRuralRJ à nível de mestrado, com concentração na área de micologia.
7
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO..............................................................................................................
01
1.1 Objetivos.........................................................................................................................
02
2. REVISÃO DE LITERATURA......................................................................................
03
2.1 Consideração geral sobre o gênero Atta.....................................................................
03
2.1.1 Histórico......................................................................................................................
03
2.1.2 Taxonomia...................................................................................................................
03
2.1.3 Distribuição geográfica..............................................................................................
03
2.1.4 Castas de formigas cortadeiras.................................................................................
04
2.1.5 Identificação das saúvas de maior importância econômica....................................
04
2.1.6 Biologia e ecologia.......................................................................................................
05
2.1.7 Fundação e estabelecimento de formigueiros..........................................................
06
2.1.8 Plantas cortadas, importância econômica, danos e prejuízo..................................
07
2.1.9 Arquitetura do formigueiro.......................................................................................
07
2.1.10 Inimigos naturais......................................................................................................
08
2.2 Controle de formigas cortadeiras indireto ou preventivo..........................................
09
2.3 Controle direto ou curativo..........................................................................................
09
2.3.1 Resistência de espécies florestais às formigas cortadeiras......................................
09
2.3.2 Controle mecânico e cultural.....................................................................................
10
2.3.3 Controle químico........................................................................................................
10
2.3.4 Controle biológico.......................................................................................................
11
3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................
16
3.1 Procedência dos isolados de M. anisopliae e B. bassiana............................................
16
3.2 Caracterização dos isolados de M. anisopliae e B. bassiana............................
17
3.3 Teste de patogenicidade dos isolados de M. anisopliae e B. bassiana sob formigas
do gênero Atta sexdens rubropilosa e Atta bisphaerica......................................................
17
3.4 Meios de cultura para produção de biomassa de M. anisopliae e B. bassiana......
18
3.5 Quantificação de esporos produzidos por M. anisopliae e B. bassiana nos sacos
de polipropileno com meio de arroz...................................................................................
18
3.6 Produção de biomassa inoculação e incubação dos fungos entomopatogênicos M.
8
anisopliae e B. bassiana.......................................................................................................
18
3.7 Teste de virulência.........................................................................................................
19
3.8 Teste de campo...............................................................................................................
20
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................................
22
4.1 Isolados...........................................................................................................................
22
4.2 Produção de biomassa dos entomopatógenos.............................................................
24
4.3 Teste de patogenicidade in vitro...................................................................................
24
4.4 Avaliação da virulência dos isolados selecionados.....................................................
24
4.5 Concentração letal.........................................................................................................
26
4.6 Avaliação da tecnologia de aplicação dos isolados selecionados no controle de A.
bisphaerica e A. sexdens rubropilosa em condições de campo..........................................
27
5. CONCLUSÕES................................................................................................................
29
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................
30
9
ÍNDICE
FIGURAS
Figura 01 Esquema geral de um sauveiro (redesenhado de GONÇALVES
(1964) por Nascimento..............................................................................................
08
Figura 02 Formigas “soldados” coletadas diretamente do campo com sinai
s de
enfraquecimento ou já mortas mantidas em câmara úmida até ocorrer à
exteriorização dos entomopatógenos.......................................................................
17
Figura 03 Formigas ‘soldados’ mantidas individualizadas, em câmara úmida
até que se ocorre a exteriorização dos fungos.........................................................
20
Figura 04 Dados climaticos observados durante o período de dezembro de
1997 à janeiro de 1998..............................................................................................
21
Figura 05 Patogenicidade de isolados de M. anisopliae e B. bassiana estimada
pela porcentagem de formigas soldados mortas de A. sexdens rubropilosa
através de pulverização com suspensão de conídios contendo
aproximadamente 10
8
ufc.mL
-1
.................................................................................
23
Figura 06 Patogenicidade de isolados de M. anisopliae e B. bassiana estimada
pela porcentagem de formigas soldados mortas de A. bisphaerica através de
pulverização com suspensão de conídios contendo aproximadamente 10
8
ufc.mL
-1
......................................................................................................................
23
QUADRO
Quadro 01 Etapas do desenvolvimento do sauveiro.............................................. 06
TABELAS
Tabela 01 Procedência dos isolados de M. anisopliae e B. bassiana utilizados
10
para seleção e caracterização de patogenicidade................................................... 16
Tabela 02 Classificação de isolados de M. anisopliae e B. bassiana
caracterizados a partir de sua morfologia e capacidade da viabilidade sob
formigas “soldados” de Atta sexdens rubropilosa e Atta bisphaerica....................
22
Tabela 03 Comparação dos tempos letais (TL
50
) entre os diferentes isolados
de M. anisopliae e B. bassiana para soldados de A. bisphaerica............................
25
Tabela 04 Comparação dos tempos letais (TL
50
) entre os diferentes isolados
de M. anisopliae e B. bassiana para soldados de A. sexdens rubropilosa..............
25
Tabela 05 Comparação das concentrações letais (CL
50
) entre os diferentes
isolados de M. anisopliae e B. bassiana para soldados de A. bisphaerica.............
28
Tabela 06 Comparação das concentrações letais (CL
50
) entre os diferentes
isolados de M. anisopliae e B. bassiana para soldados de Atta sexdens
rubropilosa..................................................................................................................
28
11
RESUMO
CASTILHO, Alzimiro Marcelo Conteiro. Controle da saúva mata-pasto Atta
bisphaerica e saúva limão Atta sexdens rubropilosa através dos fungos
entomopatogênicos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana. Seropédica: UFRRJ,
2005. 38p. (Dissertação, Mestrado em Microbiologia Veterinária).
Este trabalho foi conduzido em condições de laboratório e campo para se observar a
eficiência de fungos entomopatogênicos no controle de Atta sexdens rubropilosa e Atta
bisphaerica. Foram utilizados os isolados ENA 1 (Escola Nacional de Agronomia) ENA
2, ENA 3 e ENA 4 de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana, ENA 6, ENA 7,
ENA 13 e ENA 14, inoculados em soldados. Após coleta, exemplares de soldados foram
separados em grupos de 10 indivíduos e banhados em suspensões de conídios de 1,0 x
10
6
a 1,0 x 10
11
conídios.mL
-1
. Cada grupo de formiga foi transferido para câmara úmida
e mantido sob regime de fome a 27 ± 1° C. Os dois fungos foram patogênicos, embora os
isolados ENA 4 de M. anisopliae e ENA 6 e ENA 13 de B. bassiana tenham sido os mais
virulentos para A. bisphaerica e para A. sexdens rubropilosa dentre os testado. Esses
isolados foram aqueles que apresentaram maior porcentagem de mortalidade confirmada,
com TL
50
de 1,15 dias para o isolado ENA 4, 1,39 dias para o ENA 6 e 1,44 dias para o
ENA 13, para soldados de A. bisphaerica. Para A. sexdens rubropilosa a TL
50
foi de 1,37
dias para o isolado ENA 4, 1,68 dias para o isolado ENA 14, 1,95 dias para o ENA 13 e
2,14 dias para o ENA 6. Quanto ao parâmetro mortalidade, as concentrações testadas
proporcionaram a porcentagem de soldados mortos que variou de 45,0 a 71,67 %. Os
isolados ENA 4, ENA14, ENA 13 e ENA 6 causaram as maiores médias de mortalidade
de soldados em menor espaço de tempo. Os isolados ENA 4 e ENA 14 foram aplicados
na forma de pulverização e polvilhamento, em formigueiros adultos com mais de três
anos de idade, e após 30 dias da aplicação dos fungos entomopatogênicos, os olheiros
ainda apresentavam ativos.
Palavras chaves: fungo entomopatogênico, controle microbiano, Atta bisphaerica, Atta
sexdens rubropilosa
12
ABSTRACT
CASTILHO, Alzimiro Marcelo Conteiro. Control of saúva mata-pasto Atta
bisphaerica and saúva limão Atta sexdens rubropilosa by entomopatogenic fungi
Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana. Seropédica: UFRRJ, 2005. 38p.
(Dissertation, Veterinary Microbiology Msc).
This survey was carried out under laboratory and field conditions for evaluating the
efficiency of entomopathogenic fungi to control the ants Atta sexdens rubropilosa
and Atta bisphaerica. The isolates from Agronomy National school (Escola Nacional de
Agronomia) ENA1, ENA2, ENA3 and ENA4 of Metarhizium anisopliae as well as the
isolates ENA6, ENA7, ENA13 and ENA14 of Beauveria bassiana were tested and
inoculated on soldiers ants. After to have been collected, the soldiers were separated by
groups of 10 individuals and wetted on a conidia suspension of 1.0 x 10
6
to 1.0 x 10
11
conidia/ml .Each ants group was placed on a wet chamber and kept under no feeding
condition at 27 ± 1
0
C. Both fungi were pathogenic , although the isolates ENA 4 of
Metarhizium anisopliale and ENA 6 and ENA 13 of Beauveria bassiana were considered
the most virulent ones for A. bisphaerica, and for A. sexdens rubropilosa the isolates
ENA 4 of Metarhizium anisopliae and ENA 14, ENA 13 and ENA 6 of Beauveria
bassiana among the tested ones as well .The greatest mortality percentage was performed
by these isolates with Lethal time (LT
50
) of 1.15 days for the isolate ENA 4, 1.39 days for
ENA 6 and 1.44 days for ENA 13 ,for A. bisphaerica soldiers. For A. sexdens
rubropilosa the Lethal time (LT
50
) was 1.37 days for the isolate ENA 4, 1.68 days for
ENA 14, 1.95 days for ENA 13 and 2.14 days for ENA 6. In regard to the mortality
index, the percentage of dead soldiers at the tested concentrations ranged from 45% to
71,67% . The isolates ENA 4, ENA 14, ENA 13, and ENA 6 caused the greater soldiers
mortality averages in a shorter time period. The isolates ENA 4 and ENA 14 were applied
13
by pulverization and spraying over plus 3 years old adult ants’ nests and 30 days after
the entomopathogenic fungi application there still was some activity on the underground
galleries.
Key words: Entomopathogenic fungi, microbial control, Atta bisphaerica, Atta sexdens
rubropilosa
1- INTRODUÇÃO
As pastagens constituem-se em fonte de alimento para diversas espécies de
herbívoros, devendo ser conduzida de uma forma técnica à semelhança de outras culturas.
Está se explorando nestas áreas diferentes possibilidades de incrementar a produção de
gado, incluindo um manejo racional das savanas naturais e a introdução de espécies
forrageiras de alto valor nutritivo adaptado às condições climáticas e edáficas próprias de
cada região.
O estabelecimento e manutenção das pastagens, principalmente de gramíneas
tropicais, estão sujeitos a vários fatores que uma vez menosprezados podem comprometer
a produção de carne e leite. Entre esses fatores deve-se dar ênfase ao aparecimento de
insetos-pragas, que pelo aumento de suas populações podem causar danos econômicos às
pastagens com reflexo direto na produção (PUPO, 1977).
Apesar de existir cerca de 500 sp. de insetos vivendo nas pastagens, poucas são as
que provocam danos econômicos, sendo consideradas importantes.
Dentre os insetos que ultimamente tem causado maiores danos às pastagens
destacam-se cigarrinhas, percevejo das gramíneas, cochonilhas e saúvas.
As formigas conhecidas como saúvas, pertencem ao gênero Atta (Hymenoptera:
Formicidae) destacam-se a Atta bisphaerica Forel 1908, vulgarmente conhecida como
“saúva-mata-pastos” a qual é responsável pela redução da produção das pastagens em
14
virtude da diminuição do rendimento e capacidade de suporte (AMANTE, 1967). Outra
espécie é Atta sexdens rubropilosa, conhecida por “saúva limão” e forrageai quase todas
as plantas (algodoeiro, cafeeiros novos, eucaliptos, roseiras, laranjeiras, mandioca,
pereira, pessegueiro, couve, capins, etc).
Além dos danos diretos ocasionados pela redução da produtividade das pastagens
ocorrem, eventualmente, danos indiretos como acidentes, devido ao monte de terra solta,
onde localizam enormes câmaras que com freqüência após fortes chuvas podem
desmoronar formando enormes crateras. Poderá ocorrer, ainda, o encalhe de tratores por
ocasião da aração dos pastos, pondo em risco a vida do operador (AMANTE, 1964b).
O controle por meio de produtos químicos tem demonstrado inconveniências
devido à falta de especificidade, contaminação do meio ambiente e toxicidade para o
aplicador. Agentes biológicos tem se apresentado como uma alternativa promissora de
controle. Alguns fungos entomopatogênicos tais como Beauveria bassiana e Metarhizium
anisopliae, têm demonstrado eficiência e outras vantagens sobre os produtos químicos no
controle de pragas. SILVA e DIEHL-FLEIG (1988) testaram diferentes linhagens de B.
bassiana e M. anisopliae como possíveis agentes de controle microbiológico de Atta
sexdens piriventris, espécie de grande ocorrência no Estado do Rio Grande do Sul. Por
meio de bioensaios em laboratório e teste de campo os autores concluíram que os fungos
poderiam ser empregados como agentes de controle da formiga. Colônias de A. sexdens
piriventris, inoculadas com os fungos B. bassiana e M. anisopliae, apresentaram redução
total de atividade externa 60 dias após a aplicação dos patógenos e esta situação manteve-
se em observações realizadas até três anos após. Em áreas sem cobertura florestal, os
fungos M. anisopliae e B. bassiana foram encontrados infectando Solenopsis invicta e A.
sexdens piriventris (ALLEN & BUREN, 1974; DIEHL-FLEIG et al., 1988; PEREIRA,
1993a).
1.1 Objetivos
Objetivos gerais:
- Levantar aspectos relacionados com fungos entomopatogênicos Metarhizium anisopliae
e Beauveria bassiana no controle de Atta bisphaerica e Atta sexdens rubropilosa;
Objetivos específicos:
- Seleção de isolados
- Definir a melhor concentração de conídios a ser utilizado no controle em saúvas;
- Testar substratos alternativos visando à redução do tempo de produção de conídios
secos;
- Avaliar a melhor forma de aplicação desses fungos em condições de campo através de
pulverização e polvilhamento.
15
2 - REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Consideração geral sobre o gênero Atta
2.1.1 Histórico
Desde os primórdios do descobrimento do Brasil já se faziam relatos sobre as
saúvas, como o próprio padre José de Anchieta em 1560 realçando a importância das içás
como agentes destruidores de árvores. Acredita-se que, mesmo antes do descobrimento
do Brasil, as formigas cortadeiras eram a causa principal do nomadismo dos nossos
índios, nas regiões baixas da América do Sul (MARICONI, 1970)
Frases famosas alusivas às formigas cortadeiras foram mencionadas ao longo do
tempo. Mas, cientificamente só foram estudadas a partir do século XX, atingindo,
atualmente, uma boa bagagem de conhecimento das principais espécies (FOWLER,
1990).
2.1.2 Taxonomia
Dentre as ordens da Classe Insecta, destaca-se a ordem Hymenoptera, ocupando o
terceiro lugar em número de espécie. Nessa ordem encontram-se as formigas, as quais
pertencem à família Formicidae, cuja principal característica morfológica é presença de
pecíolo (MARICONI, 1970).
16
No Brasil existem 1.105 espécies de formigas, divididas em sete subfamílias. Na
subfamília Myrmicinae estão classificadas as formigas cortadeiras, que são conhecidas
vulgarmente por saúva e quenquém, referindo-se aos gêneros Atta e Acromyrmex,
respectivamente (DELLA LUCIA et al., 1993).
As saúvas diferem das quenquéns por serem maiores e possuírem apenas três
pares de espinhos dorso do tórax, enquanto que as quenquéns possuem quatro (JUSTI Jr.
et al., 1996).
2.1.3 Distribuição geográfica
O gênero Atta, que engloba todas as espécies de saúvas, ocorre somente nas Américas,
desde o sul dos EUA (latitude 33
0
N) até o centro da Argentina (latitude 33
0
S), não sendo
encontrado no Chile, Canadá e Ilhas das Antilhas (MARICONI, 1970).
Segundo DELLA LUCIA et al. (1993) e LOECK et al. (2002) no Brasil ocorrem
dez espécies e três subespécies taxonômicas, aceitas dentro do gênero Atta: Atta
bisphaerica Forel 1908; Atta capiguara Gonçalves 1944; Atta cephalotes L 1758; Atta
goiana Gonçalves 1942; Atta laevigata F Smith, 1858; Atta opaciceps Borgmeier, 1939;
Atta robusta Borgmeier 1939; Atta sexdens piriventri Santschi 1919; Atta sexdens
rubropilosa Forel 1908; Atta sexdens sexdens L 1758; Atta silvai Gonçalves 1982 e Atta
vollenweideri Forel 1839.
2.1.4 Castas de formigas cortadeiras
Segundo DELLA LUCIA et al. (1993), as formigas são consideradas insetos
verdadeiramente sociáveis, com organização complexa e organizada, apresentando
diferenciação morfológica (polimorfismo) e de acordo com o trabalho ou as funções que
desempenham na colônia (polietismo), constituindo diferentes castas.
Os mesmos autores relatam que as saúvas apresentam castas permanentes e
temporárias. Quando o sauveiro atinge a maturidade ocorre o surgimento dos indivíduos
temporários (alados) reprodutores, vulgarmente conhecidos como bitus (machos) e içás
(fêmeas). Os bitus diferenciam-se morfologicamente das içás ou tanajuras por serem
menores e apresentarem as mandíbulas menores e as pernas anteriores muito longas, as
quais são utilizadas para a cópula durante o vôo. Tanto os bitus como as içás apresentam
olhos compostos bem desenvolvidos, necessários para o vôo. As içás apresentam o
abdome e as mandíbulas bastante desenvolvidas.
Fazendo parte das castas permanentes, têm-se a rainha e as operárias. A rainha é a
içá copulada que perdeu suas asas. As operárias apresentam diferenças quanto ao
tamanho e comportamento. As operárias menores, denominadas de jardineiras e “babás”,
são encarregadas de cuidar dos fungos (hifas) e da trituração final das folhas para o
substrato, cuidam também da prole e permanecem sobre as cortadeiras durante o
transporte das folhas, com a finalidade de protegê-las do ataque de parasitóides
(forídeos), que eventualmente venham ovopositar em suas cabeças. As cortadeiras,
forrageadoras ou escavadoras, apresentam tamanho intermediário e têm como funções a
exploração, o corte e transporte das folhas e a escavação do ninho. Existe, ainda, uma
17
operária pouco menor do que esta que é generalistas dentro do ninho, desempenhando,
atividades como degradação da vegetação, antes da incorporação ao jardim de fungo,
transporte de outras operárias, assistência à prole durante a ecdise, cuidados com a rainha,
retirada do lixo e reconstrução de esponjas de fungo. As operárias maiores são chamadas
de soldados, defensoras ou cabeçudas e apresentam a função de defesa da colônia e
eventualmente transporte de folhas, os soldados ainda transportam seiva na cavidade
cibarial (DELLA LUCIA et al., 1990).
2.1.5 Identificação das saúvas de maior importância econômica
Segundo BORGMEIER (1959), MARICONI (1970) e GONÇALVES (1982)
para as principais espécies de saúvas podem ser utilizados os seguintes caracteres:
Atta sexdens – saúva limão: a cabeça da operária quando esmagada exala um cheiro de
capim cidreira ou de folhas de limão. Cortam preferencialmente dicotiledôneas. A cabeça
dos soldados não tem brilho e apresentam pêlos avermelhados. Os ninhos são construídos
em lugares sombreados e os murunduns são depositados irregularmente. Nas regiões
Centro-Oeste e Sudeste ocorrem Atta sexdens rubropilosa.
Atta laevigata – saúva-cabeça-de-vidro: a cabeça do soldado é bastante brilhosa. Cortam
folhas de monocotiledôneas como de dicotiledôneas. Os soldados são os maiores
encontrados dentro do gênero Atta, chegando a atingir 15mm de comprimento. Os ninhos
são semelhantes aos da saúva limão, porém com uma quantidade menor de olheiros,
situados no centro das crateras, às vezes, rodeados de gravetos secos a nidificação ocorre
tanto em lugares ensolarados como sombreados.
Atta cephalotes – saúva-da-mata: a cabeça do soldado apresenta a parte dorsal brilhante e
lisa e bastante pilosa na parte frontal. Cortam apenas folhas de dicotiledôneas. Os ninhos
são construídos em lugares sombreados e úmidos e de baixa profundidade, sendo os
canais principais ligados ao monte principal de terra em sentido ascendente, a fim de
evitar a descida de águas às panelas.
Atta capiguara – saúva parda: os soldados são difíceis de serem reconhecidos devido as
suas características, pela pouca agressividade e pequena quantidade desses indivíduos. A
cabeça do soldado é semelhante ao da saúva limão, porém ao serem esmagada não exala
o odor cítrico, e sim o de gordura rançosa. O ninho apresenta um grande monte de terra
solta e diversos montes menores ao redor. Cortam gramíneas, tais como pastagem, arroz,
milho e cana-de-açúcar.
Atta bisphaerica – saúva-mata-pasto: a cabeça dos soldados apresenta-se dividida em
dois hemisférios com um sulco coronal bem profundo e são pouco menores do que os
soldados da saúva parda. A cabeça é brilhosa, porém mais opaca do que a da saúva
cabeça-de-vidro. O ninho apresenta murunduns sem crateras, com olheiros de aberturas
estreitas na superfície. Cortam gramíneas tais como: pastagens, arroz, milho, cana-de-
açúcar. Esta espécie está distribuída distribuida nos estados de São Paulo, Rio de Janeiro,
Minas Gerais e Goiás (Ilha do Bananal).
2.1.6 Biologia e ecologia
Ao atingir a maturidade, isto é, a partir de 38 meses de idade, ocorre, anualmente,
a saída de machos e fêmeos adultos alados dos sauveiros, com a finalidade de formarem
novos ninhos. O período de revoada, na Região Sudeste e em Mato Grosso, ocorre no
18
segundo semestre do ano, geralmente de setembro a novembro. De uma a cinco semanas
antes da revoada dá-se o período de pré-revoada, quando as formigas ficam alvoroçadas e
os olheiros muito limpos. Ao redor de meia hora antes da revoada, os soldados e as
operárias saem para o exterior do sauveiro, apresentando os soldados um comportamento
bastante agressivo atacando qualquer inimigo que se aproxime da sua área (MARICONI,
1970). O mesmo autor afirma que os primeiros alados ao saírem na superfície do solo são
os bitus e, após, as içás, mas só depois de terem saído muitos bitus.
O acasalamento ocorre durante o vôo e um sauveiro de A. sexdens rubropilosa,
em média, origina 2.900 içás e 14.250 bitus. A içá ao sair do sauveiro transporta na
cavidade posterior do cibário um pedaço do fungo, o qual permitirá a sobrevivência do
novo sauveiro. As revoadas ocorrem em dias quentes, claros e úmidos, após fortes chuvas
na véspera, todavia já foi observada revoada em dias nebulosos. A fêmea de A. sexdens
rubropilosa pode ser copulada por cinco a oito machos, no entanto o macho copula uma
única vez, vindo a morrer no mesmo dia após a cópula. Após ter sido copulada a içá
desce ao solo e livra-se das suas asas com o auxílio das mandíbulas e pernas. Após, a içá
inicia a escavação do canal inicial, medindo de 8,5 cm a 15 cm de profundidade e de
9mm a 12mm de diâmetro, que permitirá o acesso a uma câmara ou panela de 18 mm a
25 mm de maior altura e de 30 mm a 45 mm no maior diâmetro em sua base, também
construída pela içá. Essas estruturas são construídas em seis a 10 h de trabalho contínuo.
Terminada a escavação e obstruído o canal de acesso, a içá regurgita o fungo que estava
localizado na cavidade posterior do cibário, trazido do sauveiro anterior. O fungo será
cultivado com as fezes e secreções da rainha. Os primeiros ovos são colocados de cinco a
seis dias depois de iniciada a construção do sauveiro, sendo ovos de alimentação
(grandes) e de reprodução (pequenos) que irão originar as operárias do tipo jardineira e
cortadeira. Os ovos grandes serão utilizados na alimentação de larvas. Com o passar do
tempo à rainha passará a colocar ovos que irão originar todos os tipos de operárias e
inclusive ovos para originar bitus e içás. Há controvérsias quanto às espécies de fungo
utilizadas pelas formigas cortadeiras em sua alimentação. Isto é devido às dificuldades
encontradas pela ausência de frutificação e de esporos que são impedidos de serem
formados pelas próprias operárias. O primeiro fungo a ser identificado foi Rozites
gongylophora coletado por Möeller (1893), encontrado em um jardim de fungo
abandonado por Acromyrmex disciger. Atualmente, autores afirmam que o fungo
cultivado por todas as cortadeiras é Leucocoprinus gongylophorus. A alimentação do
fungo parece estar correlacionada com a vantagem que é trazida para as cortadeiras, ou
seja, a desintoxicação do material vegetal que contem compostos secundários prejudiciais
a sua sobrevivência. Após o período de 80 a 100 dias, cerca de três meses, as cortadeiras
retiram a terra que estava obstruindo o canal de acesso à superfície do solo e saem para
cortar as folhas. Os soldados surgem após 22 meses, praticamente dois anos após
(MARICONI, 1970).
2.1.7 Fundação e estabelecimento de formigueiros
Penetração da içá no solo e formação da panela inicial (Quadro 01):
Quadro 01. Etapas do desenvolvimento do sauveiro
19
Regurgitação do fungo
Colocação do primeiro ovo
Incubação dos ovos (1
a
larva)
Período larval (1
a
pupa)
Período pupal (1
a
adulto)
Abertura do primeiro olheiro
Abertura do segundo olheiro
Abertura do 3
o
ao 10
o
olheiro
Aparecimento dos soldados
120 olheiros
100 olheiros
Primeira revoada (vôo nupcial) – sauveiro adulto
48 horas
5 dias
30 dias
52 dias
62-66 dias
80-100 dias
17 meses
20 meses
22 meses
24 meses
36 meses
38 meses
Segundo de AUTUORI (1947)
Segundo AUTUORI (1950), a rainha de A. sexdens rubropilosa pode viver de 20
a 22 anos. Já Acromyrmex niger e A. octospinosus, em condições de laboratório, podem
viver sete e 10 anos, respectivamente. Cortadeira e os soldados podem apresentar uma
longevidade máxima de 120 e 390 dias, respectivamente.
A sobrevivência das içás é bastante difícil, chegando algumas vezes, atingir a
100 %. Para A. Sexdens rubropilosa a mortalidade das içás atinge 99,5 %, sobrevivendo,
portanto, apenas 0,05 % que originarão os novos sauveiros. Os responsáveis por esta alta
taxa de mortalidade são os inimigos naturais, tais como pássaros, tatus, tamanduás,
formigas, besouros predadores, parasitóides como as moscas da família Phoridade e
outros fatores abióticos, como a inundação das câmaras por ocasião do período chuvoso
(MARICONI, 1970).
2.1.8 Plantas cortadas, importância econômica, danos e prejuízo
As saúvas e quenquéns cortam as mais variadas espécies de plantas para servirem
de substrato para o fungo do qual se alimentam. Existem espécies que cortam
monocotiledôneas, dicotiledôneas, outras se especializaram em cortar folhas jovens e
ainda aquelas que cortam monocotiledônias e dicotiledônias. Além dos danos diretos
ocasionados pela redução da produtividade das pastagens ocorrem, eventualmente, danos
indiretos como acidentes, devido ao monte de terra solta, onde se localizam enormes
câmaras que com freqüência após fortes chuvas podem desmoronar formando enormes
crateras. Poderá ocorrer ainda, o encalhe de tratores por ocasião da aração dos pastos,
pondo em risco a vida do operador (AMANTE, 1964).
O mesmo autor afirma que o gênero Atta é responsável pela redução da produção
das pastagens em virtude da diminuição do rendimento e capacidade de suporte.
AMANTE (1967a) ressalta ainda que o corte das gramíneas e leguminosas proporcionam
um desenvolvimento de plantas daninhas e facilitam o processo de erosão.
20
Estimativas consideram que para manter um sauveiro pelo período de um ano são
necessárias 86 árvores de eucalipto, 161 árvores de pinos, ou seja, 1 ton de folhas, o
equivalente a 344 árvores de eucalipto 644 árvores de pinos, o que representa uma perda
de 15 % de árvore/ha. Todavia, esses dados não são reais, pois leva em consideração um
fator de conversão que não representa a realidade, podendo estar subestimado ou
superestimando (FOWLER et al., 1990).
DELLA LUCIA et al. (1993) afirmam que as saúvas têm trazido sérios problemas
às culturas florestais, chegando a trazer perdas totais de árvores em reflorestamentos, nos
quais não foram realizados os devidos controles. O eucalipto, de forma geral, suporta três
desfolhas sucessivas, ao passo que as coníferas não, isto sem contar que, mesmo não
ocorrendo essas desfolhas sucessivas, haverá perda no incremento volumétrico anual.
2.1.9 Arquitetura do formigueiro
As saúvas são insetos sociais que vivem em formigueiros que podem conter
milhares de indivíduos alojados, ninhos subterrâneos constituindo verdadeiras “cidades”.
Na superfície, as saúvas constroem caminhos que são denominados de trilhas ou
carreiros. As trilhas variam de local, de acordo com a necessidade de obtenção de folhas
das respectivas fontes, pois são construídas com o objetivo de transportarem este
material. As trilhas de saúvas podem atingir 70m de comprimento por 20 cm de largura
GONÇALVES (1964).
As câmaras ou panelas são construídas para diferentes propósitos e, sendo assim,
são classificados em câmaras de fungo, de terra, de lixo, de lixo + terra e vazia (fig. 1). O
acúmulo de terra na superfície é denominado de sede aparente e o conjunto de câmaras
debaixo do solo de sede real. Na espécie Atta capiguara, a sede aparente não coincide
com a sede real, o que dificulta o seu controle GONÇALVES (1964).
A quantidade de olheiros de uma colônia varia de dois a 14, sendo que apenas
cinco são normalmente utilizados. Um formigueiro de saúva limão com 77 meses de
idade apresentou 1920 câmaras e a escavação de uma colônia de saúva cabeça-de-vidro
apresentou 7164 câmaras. Se o solo for do tipo arenoso as panelas podem ultrapassar 6m
de profundidade. As quenquéns apresentam formigueiros pequenos e geralmente
formados de apenas uma panela, mas podem chegar a três panelas. As câmaras são rasas
e situadas a poucos metros da superfície (GONÇALVES, 1964).
Na superfície do solo, pode ser observado um acúmulo de terra solta, chamado de
murundu, que é o produto das escavações subterrâneas. Nos meses que antecedem a
revoada o depósito de terra na superfície é mais intenso e praticamente não ocorrendo nos
períodos de chuva (dezembro a abril). O tipo de murundu varia de acordo com a espécie
(MARICONI, 1970).
Debaixo da superfície são encontrados os canais, galerias ou túneis que ligam as
câmaras ou que possibilitam o acesso à superfície. Na superfície as aberturas dos canais
recebem a denominação de olheiros. Os canais podem ser classificados em canais de
aterro, ventilação e alimentação (MARICONI, 1970).
21
Figura 1. Esquema geral de um sauveiro Gonçalves, 1964.
2.1.10 Inimigos naturais
TOWNSEND (1921) afirma que as aves e os pássaros domésticos estão dentre os
predadores mais eficazes das iças durante a revoada.
A ordem Coleoptera é relatada por BORGMEIER (1937) como sendo importantes
predadores das içás durante as revoadas. Esses coleópteros decapitam as içás de várias
espécies de Atta.
WEBER (1945) relata ter coletado endoparasitos (nematóides) de Acromyrmex
octospinosus, algumas espécies comumente deterioram ninhos.
LISBOA (1948) destaca as formigas lava-pés (Solenopsis spp.), que atacam tanto
operárias quanto ovos, larvas e pupas, não raramente chegando a extinguir os
formigueiros.
D’ARAÚJO e SLVA et al. (1968) relatam a presença de Taeniolobus sulcipes
(Coleóptera: Carabidae) e Vescia angrenis (Hemíptera: Reduvidae) em sauveiros iniciais
em São Paulo. Os mesmos autores destacam as formigas Nomamyrmex esenbecki e as
Nomamyrmex hartigi (Dorylianae).
Dentre os mamíferos, o tamanduá e o tatu são citados por MARICONI (1970), como
predadores das operárias nas trilhas ou diretamente no interior dos olheiros, porém com
pouca eficácia. O mesmo autor destaca como predadores, as aranhas e ácaros
desempenhando o papel de inimigo natural das formigas cortadeiras, e salienta as
primeiras como principais predadoras das içás na época da revoada.
Dentre os parasitas sociais destaca-se Pseudoatta Argentina, que invade os ninhos de
Agromyrmex descrita por WEBER (1972).
PASSOS Jr. et al. (1975) estudaram os efeitos da aplicação de Steinemema
carpocapsae sobre a saúva - limão Atta sexdens rubropilosa. Por inoculação no mais alto
nível populacional do nematóide sobre o alimento (folhas), obteve taxas de mortalidade
de 27,3 %, 90,7 % e 96,4 % para as castas de jardineiras, operárias e soldados,
respectivamente.
Segundo WALLER e MOSER (1990), os ácaros podem ser foréticos nas operárias e
formas aladas. Esses autores relatam que os dípteros da família Phoridae, representada
22
por mais de 20 espécies de diminutas moscas, são parasitas de operárias de Atta e
Acromyrmex.
SCHILINDWEIN (1991) cita que, além desses inimigos naturais, encontram-se os
lagartos, lagartixas e rãs e sapos como predadores de formigas.
2.2 Controle de formigas cortadeiras indireto ou preventivo
A presença de sub-bosque tem trazido resultados extremamente favoráveis em
relação à redução do número de formigueiros por área. Acredita-se que a dificuldade da
içá fundar e estabelecer um formigueiro em área com sub-bosque seja um dos fatores
desfavoráveis, além da maior presença de inimigos naturais que podem agir contra as
içás, por ocasião da fundação das novas colônias. A maior disponibilidade de alimento
existente em uma área com sub-bosque parece poupar a floresta plantada do ataque das
cortadeiras (ANJOS et al., 1998).
O fato tem demonstrado resultados interessantes, pois a incidência de sauveiros
chegam a ser 1800 % maior do que em uma área com sub-bosque denso. Em área cujo
sub-bosque foi mantido, observou-se uma redução de 11,5 vezes a média de novas
colônias, durante o período de dois anos de observações (FORTI, 1997).
2.3 Controle direto ou curativo
2.3.1 Resistência de espécies florestais às formigas cortadeiras
Diversas espécies de formigas cortadeiras encontram dificuldades em
estabelecerem seus formigueiros em determinadas áreas de reflorestamento, devido ao
seu habito alimentar. Isto é, as espécies que cortam seletivamente monocotiledôneas não
encontrarão condições de sobrevivência em reflorestamentos com dicotiledôneas
(Eucalipto, seringueira, teca etc.) ou com Gymnosperma (Pinus spp.) (FORTI, 1997).
Dentro do próprio gênero Eucalyptus ocorrem espécies mais resistentes aos
ataques das cortadeiras como é o exemplo de Eucalyptus citriodora em relação à saúva
cabeça-de-vidro (Atta laevigata). Segundo esses autores a adubação balanceada é fator de
promoção do aumento da resistência do vegetal, pois já foi verificado que a adubação
pesada com fósforo em eucalipto possibilitou uma redução de 35 % no desfolhamento.
Espécies florestais nativas e plantas não nativas tem apresentado efeito repelente
ou nocivo ao fungo e às saúvas (ANJOS et al., 1998).
2.3.2 Controle mecânico e cultural
O controle mecânico consiste na escavação do formigueiro com o objetivo de
localizar e matar a rainha. É recomendado para áreas muito pequenas e quando o
formigueiro tiver menos de quatro meses de idade, pois a partir daí a rainha passará a se
aprofundar no solo dificultando o trabalho (AMANTE, 1975).
Tratos culturais como aração e gradagem também podem eliminar formigueiros,
principalmente, para as formigas quenquéns e sauveiros com idade inferior a quatro
meses. Após essas operações deve-se fazer um repasse na área e destruir com enxadões
os formigueiros restantes. No entanto, as medidas culturais de controle não têm a
23
eficiência desejada e tendo que lançar mão de outros métodos (BERT FILHO et al.,
1993).
O uso de cultura armadilha tem despertado a atenção dos pesquisadores. O gergelim
é uma delas, sendo plantado entre as fileiras de árvores, visto que suas folhas são
altamente atacadas e exercem uma ação inibidora sobre o crescimento do fungo, além de
apresentar ação tóxica sobre as saúvas. Todavia, o uso de cultura armadilha não tem sido
bem sucedido. Outras plantas como Senna siamaeai uma leguminosa arbórea, apresenta
compostos voláteis em suas flores capazes de atrair Atta opaciceps, como também o
extrato de flores de Mahonia aquifolium para A. sexdens rubropilosa (BERT FILHO et
al., 1993).
2.3.3 Controle químico
Desde a década de 1950 o brometo de metila é utilizado no combate a saúva no
Brasil (DURVAL, 1949). AUTUORI (1950) conduziu extensas pesquisas com o MM33
contendo brometo de metila a 18 % dissolvido em bissulfureto de carbono, além de
outras substâncias. Segundo o mesmo autor ao final da década de 50 houve um amplo
emprego dos inseticidas formulados em pó secos e que eram insuflados através de
bombas manuais. Logo em seguida tais produtos passaram a ser adotados sob a forma de
concentrados emulsionáveis, destacando-se aldrin, clordane e heptacloro. Encontravam-
se também diversas formulações de pó formicidas misturados com fungicidas.
DORNA FILHO (1959) afirmou que quando foi introduzida a utilização do
bissulfeto de carbono, se iniciava a era de maior eficiência no combate a saúva.
AMANTE (1962) relata que o emprego de iscas granuladas é o método de combate
mais eficiente, econômico e prático. Daí em diante, foram muitas as tentativas de se
obterem iscas granuladas e doses eficientes (GONÇALVES, 1960; MARICONI &
CASTRO, 1962; VANNETTI & ALBUQUERQUE, 1963; FREIRE & VANETTI, 1968;
AMANTE, 1968abc; CHERRETT, 1969; KOBER et al., 1970; FREIRE, 1971).
A utilização da isca granulada Mirex descrita por ECHOLS (1965 e 1966 ab),
contendo 0,45 % de ingrediente ativo (Dodecacloro), 8,5 % de óleo de soja como atraente
efetivo e 91,05 % de polpa de citros como veículo foi a melhor opção até janeiro de 1993,
tendo existido várias marcas comerciais, com características semelhantes e mesmo
princípio ativo.
Os métodos de combate às saúvas diferem sensivelmente daquelas aplicadas no
combate aos insetos de modo geral isolados. E ainda as colônias reagem nitidamente
contra os agentes estranhos introduzidos no formigueiro, isolando a sede ou “amuando-
se”. Assim, torna-se imprescindível determinar qual a melhor técnica a ser utilizada para
combater as formigas cortadeiras, a qual representa séria ameaça nas áreas de culturas e
pastagens (AMANTE, 1975).
Segundo AMANTE (1975) os produtos químicos utilizados no combate as formigas
foram: verde paris, enxofre, arsênico e o cianureto, puros ou misturados, insuflados,
queimados ou dissolvidos. Eram colocados dentro das colônias através dos canais
naturais.
Segundo dados da ANDEF (1989) no Brasil foram comercializados 16000 toneladas
dessas iscas em 1989, correspondente a um aumento superior a 50 % no consumo de
iscas formicidas, em menos de cinco anos. Esse mercado movimentava mais de 11
24
milhões de dólares anuais. Entretanto, apesar dessas iscas terem constituído os únicos
meios de controle em grande escala, seu princípio ativo, o Dodecacloro, já era proibido
em quase todo o mundo. São pesticidas altamente persistentes e estáveis no ambiente, sua
movimentação nos ecossistemas é afetada pelas águas das enxurradas e pelo vento. Os
clorados são citados como responsáveis por efeitos mutagênicos, teratogênicos e
carcinogênicos (GIBSON et al., 1972; JONES & HODGES, 1974; BROOKS, 1975).
Os problemas advindos de seu uso tornavam-se ainda mais graves, em razão do
uso indiscriminado dos grânulos sobre as áreas, ignorando-se a localização do
formigueiro. A distribuição de iscas nos agroecossistemas visa baratear os custos de
controle de formigas saúvas (DELLA LUCIA, 1992). Segundo o mesmo autor tais
aspectos preocuparam os técnicos, pesquisadores e pessoas atuantes nessa área e a
procura de novos princípios ativos para serem incorporados às iscas com menor impacto
ambiental tem continuado intensamente.
O emprego de inibidores de quitina é encontrado nas iscas Formilin
(Diflubenzuron), as quais vem sendo estudada e empregada desde 1988 (BUSOLI et al.,
1988). Segundo LOECK et al. (1993), o diflubenzuron inibe o desenvolvimento do fungo
simbiótico.
Encontram-se disponíveis no mercado as iscas granuladas Lakree
à base de
Clorpirifrós para o controle de Atta capiguara. Os pricípios ativos Carbossulfan e
Terbufós são comercializados como Suscon
para proteção de mudas de eucaliptos,
roseiras e citros (DELLA LUCIA et al., 1993). ALVES et al. (2001) ressaltam ainda que
a utilização intensiva de agroquímicos tenha causado diversos problemas, entre eles
pode-se citar a resistência de pragas a inseticidas, exigindo um aumento da concentração
e do número de aplicações.
2.3.4 Controle biológico
O uso de microrganismos para o controle de pragas representa atualmente um
avanço ecológico para solucionar problemas ocasionados pelo emprego indiscriminado
de inseticidas. Sendo que os grupos mais importantes são os fungos, bactérias, vírus,
protozoários, nematóides, rikétsias e micoplasma. Dentre estes agentes biológicos de
controle de insetos, os fungos causam cerca de 80 das enfermidades (ALVES, 1986).
Os fungos entomopatogênicos vêm sendo estudados no Brasil há mais de 60 anos.
Aproximadamente, 85 gêneros de fungos entomopatogênicos ocorrem no Brasil. Desses,
mais de 20 incidem enzoóticamente ou epzooticamente sobre pragas de importância
econômica (ALVES, 1986).
Esses fungos geralmente são amplamente distribuídos e apresentam elevado
número de hospedeiros. Dentre esses fungos mais comuns, destacam-se os gêneros
Enthomophthora, Hisurtella, Nomuraea, Beauveria e Metarhizium (FERRON, 1978).
O primeiro trabalho de controle microbiano foi realizado por METSCHNIKOFF
(1979), que aplicou o M. anisopliae para controle de larvas de um curculionídeo,
importante praga da cultura da beterraba. KRASSILSTSCHK continuou as pesquisas
chegando a produzir em 1874 cerca de 55 kg do mesmo fungo, conseguindo um controle
de 55 % a 80 % dos insetos em pequenas áreas, após 10 a 15 dias de aplicação
(BALFOUR-BROWNE, 1960; LATCH, 1965; MARTIGNONI, 1968).
25
A partir dessa época, as diversas raças de M. anisopliae vêm sendo estudadas
sobre muitas espécies de insetos. Acredita-se que esse patógeno ocorra naturalmente
sobre mais de 300 espécies de insetos das mais diferentes ordens, incluindo pragas
importantes das plantas cultivadas. (ALVES, 1986).
A variabilidade genética entre isolados de uma mesma espécie de fungos é
amplamente relatada na literatura. Muitos dos trabalhos conduzidos para espécies de
interesse entomológico foram feitos com M. anisopliae e B. bassiana, em muitos casos,
como testes iniciais visando a sua utilização em programas de controle microbiano. Este
procedimento tem sido empregado há muitos anos pelo Laboratório de patologia e
controle microbiano de insetos da ESALQ/USP, sendo na maioria dos casos, encontrados
materiais promissores para o controle de diferentes espécies de insetos (MOINO
JUNÍOR, 1993; VIEIRA et al., 1997; TAMAI, 1997; MANZINI et al., 1998; LOPES,
1999; TANZINI, 2002). Resultados destes trabalhos evidenciaram a grande variabilidade
genética existente entre os fungos entomopatogênicos, sendo assim importante e
necessária à realização de uma seleção de isolados altamente patogênicos para
determinada praga. No tocante a caracterização de raças do M. anisopliae pode ser
utilizada a especificidade, eletroforese, sorologia, cromatografia e virulência, além das
características morfológicas e culturais do fungo (ALVES, 1986; MOINO JUNIOR,
1993; VIEIRA et al., 1993; ALMEIDA et al., 1997; TAMAI, 1997; MANZINI et al.,
1998; LOPES, 1999; TANZINI, 2002).
Estudando diversos isolados de M. anisopliae provenientes de algumas regiões do
Brasil, SOUZA GÓMEZ e ALVES (1983) selecionaram os isolados SPL-52T e PL-39
como os mais apropriados para serem utilizados no controle microbiano de insetos. Os
caracteres considerados foi produção de conídios sobre cadáveres de Diatraea
saccharalis. Isolados de M. anisopliae tem sido selecionados para o controle de
Mahanarva posticata utilizando-se os caracteres mencionados nos perfis biológico e
bioquímico. Os isolados mais adequados ao controle da cigarrinha-das-folhas são os que
apresentam o padrão A de zimograma para esterase. Esse tipo de padrão eletroforético
ocorre em mais de 90 % dos fungos isolados de M. posticata nas regiões de Alagoas,
Pernambuco e Rio de Janeiro. O padrão B, menos específico para M. posticata tem sido
constatado sobre Deois. saccharalis, M. fimbriolata, Tyantha perditor, Deois flavopicta,
Notozulia enteriana e outros insetos (ALVES et al., 1983).
A idéia da utilização do M. anisopliae para controle de cigarrinha da cana-de-
açúcar vem desde 1910, quando RORER propôs a produção de fungo em larga escala. O
mesmo autor, em 1913, relatou que após ter efetuado aplicação de 2,8 Kg de “massa de
fungo” por hectare, conseguiu uma média de 92 insetos mortos por perfilho de cana-de-
açúcar, o que representava 460.000 insetos mortos por hectare. Após a introdução da
cigarrinha da folha no nordeste do Brasil, o fungo M. anisopliae passou a ser utilizado em
grande escala.
GUAGLIUMI (1970) relata ter obtido os primeiros resultados com o fungo, em
ensaios contra a cigarrinha das raízes. O autor, em 1971 e 1972, relatou que esse
entomopatógeno provocou 80 % de mortalidade de cigarrinha-das-folhas após 15 dias da
aplicação. GUAGLIUMI et al. (1974), efetuando experimento com M. anisopliae visando
o controle de M. posticata observaram 30 % a 40 % de mortalidade de ninfas e 20 % a
30 % de infecção em adulto.
26
No ano de 1976, o IAA/PLANALSUCAR iniciou um programa de produção do
M. anisopliae. Em 1977 foram tratados cerca de 2000 ha de cana-de-açúcar com o fungo,
em 1982 o patógeno foi aplicado em cerca de 85.000 ha. Esse projeto é o maior projeto
de controle microbiano por M. anisopliae existente no mundo. A área tratada com
inseticidas se manteve inalterada, durante os últimos anos, em torno de 20.000 ha e a área
tratada com o fungo passou de 6.000 ha em 1977 para 150.000 ha em 1984.
VEIGA (1979) relata ter obtido 65 % a 90 % de controle de Aeneolamia selecta
na região de Bonito e Agrestina.
Na União Soviética este patógeno é produzido e formulado com o nome de
Boverin, sendo aplicado em condições de campo contra L. decemlineata e C. pomonella
(FERRON, 1978; ALVES, 1986). A utilização de B. bassiana em larga escala é feita na
China visando o controle de Ostrinia nubialis e Dendrolimus punctatus (FERRON, 1981;
HUSSEY & TINSLEY, 1981). Nos Estados Unidos a pesquisa com este patógeno tem
sido realizada com mais de 750 espécies de insetos incluindo percevejos, besouro,
lagartas, formigas (Solenopsis spp.) e pragas de produtos armazenados (NAS, 1979).
A utilização de fungos entomopatogênicos no controle das formigas cortadeiras
teve destaque quando ALVES e SOUSA GÓMEZ (1983) isolaram uma linhagem de B.
bassiana e M. anisopliae a partir de rainhas de A. sexdens rubropilosa e determinaram
que o LT
50
do M. anisopliae isolado SPL-54-A para “cortadeiras” foi de 67,2 ± 0,06 hs,
sendo que para “soldados” o LT
50
foi de 97,4 ± 11,2 hs e por outro lado, o LT
50
de B.
bassiana isolado SA-63-A para “cortadeiras” foi de 85,9 ± 6,3 hs e “soldados” foi de 94,5
± 7,9 hs.
Tal alternativa foi reforçada após a coleta de machos de formigas Labidus
praedator infectados naturalmente com M. anisopliae. Esse isolado foi extremamente
virulento em bioensaios realizados com soldados de A. sexdens rubropilosa. (LIMA et
al., 1988).
STIMAC et al. (1993) constataram que a patogenicidade de B. bassiana para
formiga lava-pé variou com os diferentes isolados de fungos e diferentes técnicas
experimentais usadas.
LOUREIRO e MONTEIRO (2004) relatam ter obtido diferenças na capacidade
dos entre os fungos M. anisopliae e B. bassiana de produzirem a morte de formigas de
Atta sexdens sexdens, tendo os isolados AM 9 de B. bassiana, E9 de M. anisopliae e CG
189 de P. farinosus provocado as maiores médias de mortalidade de operárias de Atta
sexdens sexdens. Nas concentrações de 1,0 x 10
8
e 1,0 x 10
9
conídio.mL
-1
foram as mais
eficientes, tendo provocado menor tempo letal.
Segundo SOUSA GOMÉZ (1993), os isolados mais efetivos devem ser obtidos
pela seleção do comportamento dos conídios, taxa de potência dos isolados sobre insetos,
produção de conídios e crescimento das colônias, assim como atividades enzimáticas e
resistência a ultravioleta.
A produção de enzimas nesses patógenos tem sido estudada com várias
finalidades, dando uma delas a de correlacioná-la com os processos de patogenicidade e
virulência (ALVES, 1986).
KODAINI (1961, 1962) e ROBISON (1966) estudaram o processo de penetração
dos fungos Aspergillus flavus, B. bassiana, M. anisopliae, Paecelomyes farinosus e
Cordyceps militaris através do tegumento de Tenebrio molitor, comparando com outros
fungos não patogênicos e que não penetram a exocutícula. Os autores atribuíram a
27
capacidade de produção de enzimas quitinolíticas ou proteolíticas à eficiência de
penetração, embora estejam envolvidos no processo, aspectos de ordem mecânica como
pressão das hifas.
ZACHARUK (1970a) descreveu a penetração física devido a pressão causada
pelo grampo de penetração, que rompe as áreas membranosas e quitinosas do hospedeiro,
e a penetração química que é o resultado da formação de enzimas.
ALVES (1986) afirmou que via de penetração normal dos fungos é pelo
tegumento através de atividades enzimáticas ou pressão mecânica exercida pelo tubo
germinativo e apressório. Outra via de penetração que pode ocorrer em controle
biológico, é a oral ou penetração do fungo por espiráculos respiratórios.
PRASERTPHON e TANADA (1968) afirmam que os fungos M. anisopliae e B.
bassiana, se desenvolveram na hemolínfa de insetos e que não invadem tecidos e órgãos
até a morte do inseto.
PARIS e SEGRETON (1978) relatam que a virulência de B. bassiana estava
relacionada à produção de lípase, o que facilitaria a seleção das raças com essas
características.
AL-AIDROS e SEIFERT (1980) demonstraram que um mutante do M. anisopliae
possui habilidade de degradar amido e quando crescia sobre meios de cultura contendo
essa substância, comportava-se em forma hipervirulenta para o mosquito Culex pipiens
pipiens em teste in vitro.
ROBERTS (1981) relatou a presença de toxinas Beauvericina produzida por B.
bassiana e destruxina produzida por M. anisopliae que apresentam vantagens no seu
baixo período de carência em condições de campo.
A relação entre a produção de toxinas na patogenicidade dos fungos podem ser a
causa da morte dos insetos ao longo da infecção fúngica (FARGUES et al., 1984;
SAMUELS et al., 1988a; SAMUELS et al., 1988b; ALVES, 1986a).
ROBERTS e CAMPEBLL (1977) afirmaram que os fungos M. anisopliae e B.
bassiana são freqüentemente isolados de insetos com hábitos terrestres, sendo estas
espécies de entomopatógenos muito promissora para o controle microbiano.
FARGUES e ROBERT (1985) relatam que o solo é um meio caracterizado por
alta umidade, moderadas temperaturas e não é afetado diretamente pelas radiações
ultravioleta. Estas características conferem aos fungos entomopatogênicos um ambiente
apropriado para sua sobrevivência, podendo permanecer ativo por alguns meses ou anos.
Segundo ALVES (1986) os fungos entomopatogênicos podem ser isolados por diferentes
processos, como transferência da estrutura do fungo, do inseto colonizado de porções do
tecido atacado, através de semeadura direta ou indireta de conídios, indicando o meio de
BDA para cultura de fungo.
28
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Procedência dos isolados de M. anisopliae e B. bassiana
Foram utilizados dois isolados de M. anisopliae e B. bassiana, ENA 4 e ENA 5
respectivamente, provenientes da coleção do Departamento de Entomologia e
Fitopatologia (DENF) da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRuralRJ),
que estavam armazenados em tubos de ensaio contendo meio BDA (batata, dextrose e
Agar), sob condições não controladas de ambiente; e 13 isolados obtidos a partir de
formigas “soldados” do gênero Atta coletadas diretamente do campo em diferentes
localidades do Estado do Rio de Janeiro (Tabela 01), procurando-se selecionar
indivíduos que apresentavam sinais de enfraquecimento ou já mortos.
Os indivíduos foram mantidos em placas de Petri contendo papel de filtro
previamente esterilizados e umedecidos com água destilada e esterilizada (Figura 02). As
placas foram mantidas em temperatura ambiente.
Dos indivíduos que apresentaram exteriorização dos fungos foram transferidos
para placas de Petri contendo meio BDA tendo pH 7,0 acrescido de antibiótico. As
placas foram incubadas a 25
o
C em estufa BOD.
Tabela 1 - Procedência dos isolados de M. anisopliae e B. bassiana utilizados para seleção e
caracterização da patogenicidade.
Isolados N
o
de registro origem Hospedeiro
M. anisopliae ENA 01 UFRRJ* Atta sexdens rubropilosa
ENA02 ECOLOGIA/RJ* Atta sexdens rubropilosa
ENA03 INCRA/RJ Atta bisphaerica
ENA04 DENF Atta sexdens rubropilosa
ENA05 DENF Zullia enteriana
ENA09 CAMPO GRANDE/RJ Atta sexdens rubropilosa
ENA11 CACARIA/RJ* Atta sexdens rubropilosa
ENA12 VASSOURAS/RJ Atta sexdens rubropilosa
B. bassiana ENA06 CAMPO GRANDE/RJ Atta sexdens rubropilosa
ENA07 UFRRJ* Atta bisphaerica
ENA08 ITAGUAÍ/RJ Atta sexdens rubropilosa
ENA13 UFRRJ* Atta sexdens rubropilosa
ENA14 MIQUEL PEREIRA/RJ Atta sexdens rubropilosa
ENA15 VASSOURAS/RJ Atta sexdens rubropilosa
(*) Município de Seropédica, RJ.
ENA – Escola Nacional de Agronomia
Denf – Departamento de Entomologia e Fitopatologia
29
Figura 2. Formigas “soldados” coletadas diretamente do campo com sinais de enfraquecimento ou já
mortas mantidas em câmara úmida até ocorrer à exteriorização dos entomopatógenos.
3.2 Caracterização dos isolados de M. anisopliae e B. bassiana
A caracterização dos isolados de M. anisopliae e B. bassiana obtidos das formigas
e dos dois tubos do DENF foi efetuada após a germinação nas placas de isolamento e
foram observadas as características das colônias com base na chave de identificação de
SANSON (1988) e TULOCH (1978), que consiste no crescimento, coloração das
colônias dos fungos, formato e tamanho dos conídios em exames ao microscópio óptico.
Após sua caracterização, estes foram armazenados em tubos de ensaio contendo meio
BDA.
3.3 Teste de patogenicidade dos isolados de M. anisopliae e B. bassiana sob formigas
do gênero Atta sexdens rubropilosa e Atta bisphaerica
Foram coletadas formigas “soldados” do gênero Atta diretamente do formigueiro
que foram mantidas em Erlenmeyer de 250 mL previamente esterilizados. O
delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, onde cada tratamento
contou com 10 indivíduos e três repetições, e o tratamento testemunha recebeu 1,0 mL de
água destilada e esterilizada. Posteriormente, uma alíquota de 1,0 mL de cada suspensão
foi pulverizada sobre as formigas, utilizando-se pulverizador De Vilbes.
A partir dos isolados caracterizados que estavam armazenados em tubos de ensaio
com meio BDA foram efetuados testes de patogenicidade para comprovação dessas
características. Foram efetuados suspensões dos conídios acrescentando-se solução salina
0,85 % de NaCl acrescido de 0,05 % de Tween 80 aos tubos de ensaio, os quais foram
agitados em vortex por 3 min, obtendo-se uma suspensão bem densa de conídios. Estas
foram filtradas em lenço de papel escotex e aferidas com auxílio de hemacitômetro na
concentração de 2,5 x 10
8
conídios.mL
-1
. Após a pulverização os Erlenmeyer foram
mantidos em temperatura ambiente e eram observados diariamente por um período de
120 h para retirada das formigas mortas. Essas foram mantidas individualizadas em
30
recipientes plásticos, previamente esterilizados, acrescidos de papel de filtro umidecido
com água destilada e esterilizada, utilizada como câmara úmida para permitir a
esporulação dos fungos.
3.4 Meios de cultura para produção de biomassa de M. anisopliae e B. bassiana
Visando a redução no tempo de produção de conídios secos destes fungos
entomopatogênicos, foram experimentados quatro meios a base de arroz:
1) arroz parboilizado 100 g, caldo de batata 50 mL;
2) arroz parboilizado 100 g, caldo de batata 50 mL e dextrose 5,0 g;
3) arroz parboilizado 100 g, água destilada 50 mL e pepitona de soja 5,0 g;
4) arroz parboilizado 100 g e quitina líquida de uso agronômico 50 mL
5) testemunha arroz parboilizado 10 g e água destilada 5 0mL.
Os meios foram armazenados em sacos plásticos de polipropileno. Em cada saco
foi inoculado 3,0 mL de suspensão (3 x 10
7
conídios.mL
-1
). As culturas foram mantidas
em estufa incubadora tipo BOD a 25 ± 1
o
C. Foram avaliados os tempos de início de
esporulação em cada tratamento.
3.5 Quantificação de esporos produzidos por M. anisopliae e B. bassiana nos sacos
de polipropileno com meio de arroz
A quantificação dos conídios foi efetuada a partir dos testes de produção de
biomassa, inoculação e incubação. Nesses sacos foram testados três tratamentos com
cinco repetições, quando foram introduzidas farinhas de trigo comercial em diferentes
quantidades: 3,0, 6,0 e 9,0 g e o tratamento testemunha. Estes foram agitados
manualmente promovendo atrito necessário para soltura dos conídios. Logo após foram
peneirados, separando os grãos de arroz do “pó de conídios”, em seguida foram pesados
em balança de precisão para estimar a quantidade de conídios em cada tratamento. Após
a pesagem foram retiradas um grama de conídios de cada saco e diluído em 20 mL de
solução salina a 8,5 % de NaCl e 0,05 % de Tween 80 , estes foram diluídos
sucessivamente e semeados em placas contendo meio de cultura BDA (batata dextrose
Agar), acrescido de pentabiótico e colocados em estufa de crescimento a uma
temperatura de 25 ± 1
o
C por 48 h. Após este período foi estimada a quantidade de
células viáveis através do método de placas de contagem.
3.6 Produção de biomassa inoculação e incubação dos fungos entomopatogênicos M.
anisopliae e B. bassiana
O substrato utilizado como meio de cultura foi o arroz parboilizado, enriquecido
com vitaminas e sais minerais, que foram acondicionados em sacos plásticos de
polipropileno, medindo 35 cm de comprimento por 22 cm de largura, com 100 g de arroz
e 50 mL de água (ALVES, 1986). Estes foram lacrados e autoclavados por duas vezes, à
120
o
C espaçados de 24 h. Após autoclavagem estes foram agitados manualmente até que
todos os grãos estivessem totalmente soltos. Após a conclusão do meio de arroz, os
isolados que foram selecionados no teste de patogenicidade e que estavam armazenados
31
em tubos de ensaio contendo meio BDA foram suspensos em solução salina a 0,85 % de
NaCl e 0,05 % de Tween 80, posteriormente agitados em agitador de bancada por ± 3 a 4
min e em seguida filtrados em lenço de papel, cada suspensão foi quantificada com
auxílio de hemacitômetro 6 x 10
6
conídios.mL
-1
. Os ensaios foram realizados no
Laboratório do DENF da UFRRJ. De cada suspensão foram retiradas alíquotas de 3 mL
utilizando-se de seringas descartáveis e que foram introduzida em cada saco plástico
contendo o meio de arroz. Cada tratamento contou com cinco repetições, o delineamento
estatístico utilizado foi o inteiramente casualizado. Os sacos foram desinfetados com
algodão embebido em álcool 96
o
GL e após a retirada da agulha estes foram vedados com
fita adesiva e colocados em estufa incubadora do tipo BOD a uma temperatura de 25 ± 1
o
C. A cada 24 h os sacos eram agitados manualmente a fim de evitar que os grãos de
arroz ficassem aderidos uns aos outros.
3.7 Teste de virulência
Neste trabalho foram testados os fungos M. anisopliae e B. bassiana que foram
caracterizados nos testes de patogenicidade e que estavam armazenados em tubos de
ensaio contendo meio de cultivo BDA inclinado, em estufa tipo BOD e mantidos a
temperatura de 25 ± 1
o
C.
A partir dessas colônias foram preparadas suspensões de conídios em solução
salina 0,85 % de NaCl acrescido de Tween 80 a 0,05 % na concentração de 1,0 x 10
6
; 1,0
x 10
7
; 1,0 x 10
8
; 1,0 x 10
9
; 1,0 x 10
10
; 1,0 x 10
11
conídos.mL
-1
de suspensão.
De cada suspensão foram retiradas alíquotas de 1,0mL e estas foram pulverizadas
com auxílio de pulverizador De Vilbes, sobre as formigas ‘soldados’ de A. sexdens
rubropilosa e A. bisphaerica. Para cada concentração foram utilizados três Erlenmeyers
de 250 mL, previamente esterilizados, contendo 10 formigas cada mais o tratamento
testemunha onde foi pulverizado água destilada e esterilizada.
Os bioensaios, com formigas ‘soldados’, foram realizados a 22
o
C, fotoperíodo de
12 h e na ausência de alimentação.
Foram efetuadas observações diárias por um período de 120 h quando eram
retiradas as formigas mortas e colocadas individualizadas em recipientes plásticos forrado
com papel de filtro previamente esterilizados (Figura 02). Foram determinados a TL
50
(tempo letal para matar 50 % dos indivíduos) e CL
50
(concentração letal para matar 50 %
dos indivíduos), para cada isolado, através do método estatístico de Probit.
32
Figura 3. Formigas ‘soldados’ mantidas individualizadas, em câmara úmida até que se ocorre a
exteriorização dos fungos.
3.8 Teste de Campo
O ensaio foi desenvolvido no período de dezembro 1997 a janeiro de 1998 (figura
3) nos campos da UFRuralRJ e Pesagro-RJ, no município de Seropédica, RJ. Quando
foram localizados formigueiros de saúvas de A. sexdens rubropilosa e A. bisphaerica, de
aproximadamente três anos de idade e demarcadas com estacas, nas quais foram inscritos
os números dos isolados de fungos utilizados, os quais foram qualificados como melhores
nos testes de virulência (TL
50
e CL
50
). O experimento contou com 18 formigueiros e dois
tratamentos um com pulverização e outro com polvilhamento e mais o tratamento
testemunha que recebeu água e o outro que recebeu farinha de trigo comercial. Os
isolados de M. anisopliae e B. bassiana. A escolha dos olheiros de trabalho para a
aplicação dos isolados baseou-se no fluxo de entrada e saída de formigas, isto é,
escolheu-se aqueles que apresentaram maior movimentação. Em cada olheiro escolhido
foram inoculados 4 litros contendo aproximadamente 10
9
conídios.mL
-1
, utilizando-se um
pulverizador manual de 4 litros, distribuídos uniformemente em cada olheiro. O
polvilhamento foi efetuado utilizando-se 12 g de conídios que foram distribuídos
uniformemente com polvilhadeira manual.
A inoculação foi repetida semanalmente durante quatro semanas e todos os
formigueiros passaram a serem observados duas vezes por semana a partir da primeira
aplicação.
Após trinta dias da primeira aplicação foram recolhidas 100 formigas (soldados e
cortadeiras) diretamente de cada formigueiro tratado e levadas para laboratório e estas
eram deixadas em Erlenmeyers sem alimentação até a sua morte, quando eram lavadas
em álcool 70 % e colocadas individualizadas em caixas plásticas forradas com papel de
filtro para verificar a exteriorização dos respectivos entomopatógenos sobre os cadáveres
das formigas.
Decorridos trinta dias após a aplicação foram coletadas formigas diretamente dos
formigueiros que sofreram aplicações e coletadas 100 formigas e levadas para laboratório
a fim de observar a exteriorização dos fungos M. anisopliae e B. bassiana. Todas as
33
formigas (soldados e cortadeiras), coletadas 30 dias após a aplicação dos fungos, estavam
apenas infectadas por Aspergillus sp. Todavia, das amostras de solo foi encontrado um
nível de 3,3 x 10
7
conídios.g de solo.
Figura 4. Dados climáticos observados durante o período de dezembro de 1997 à de janeiro 1998
UR Média = 66,8 %
Temp. Média = 28,3 ºC
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
1ªs
e
man
a
2
ªse
ma
na
3ªsemana
4ªs
e
man
a
5ªse
ma
na
6ªsemana
7ªs
e
man
a
8
ªse
ma
na
9ªsemana
Período
Umidade Relativa (%)
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
Temperatura (ºC)
UR (%)
Temp.(ºC)
34
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Isolados
Das 12 diferentes localidades do Estado do Rio de Janeiro, obteveram-se as formigas
naturalmente infectadas por M. anisopliae e B. bassiana, pois quando colocadas em meio
BDA formaram-se colônias morfologicamente características dessas espécies, baseando-
se na chave de classificação de SANSON (1988) e TULOCH (1978)
Todos os oitos isolados testados promoveram a morte das formigas ‘soldados’ Atta
sexdens rubropilosa e Atta bisphaerica, os isolados foram classificados em dois grupos
(Tabela 02) sendo mais virulentos, os que causaram uma porcentagem igual ou acima de
50 % dentro de 72 h; e os menos virulentos, os que levaram acima desse tempo para
causar essa mesma porcentagem de mortalidade (figura 03 e 04). Quando comparados
com o tempo que cada isolado levou para matar todos os indivíduos.
Nos experimentos realizados in vitro, por meio de pulverização sobre formigas
soldados de A. sexdens rubropilosa e A. bisphaerica foi possível estimar a porcentagem
da mortalidade causada por todos os isolados, sendo que ao final de 168 h todas as
formigas estavam mortas.
Com base nos resultados do teste de patogenicidade efetuado pode-se verificar a
eficiência dos isolados ENA 1, ENA 2, ENA 3 e ENA 4 de M. anisopliae e ENA 6, ENA
7, ENA 13, ENA 14 de B. bassiana em relação aos outros isolados testados.
Apesar de promoverem a morte dos indivíduos os isolados ENA 5, ENA 8, ENA 9
ENA 10, ENA 11 e ENA 15 levaram maior tempo para matar as formigas.
Mesmo passado 11 anos de armazenamento em água mineral não gasosa e esterilizada,
sob condições de laboratório, o isolado (um dos oito isolados de M. anisopliae),
adquirido da micoteca do DENF/UFRuralRJ, ENA 4 apresentou-se viável (Tabela 02).
Tabela 02 - Classificação de isolados de M. anisopliae e B. bassiana caracterizados a partir de sua
morfologia e capacidade da virulência sob formigas “soldados” de Atta sexdens rubropilosa e Atta
bisphaerica.
Isolados Capacidade de virulência
ENA 1 +
ENA 2 +
ENA 3 +
ENA 4 +
ENA 5 -
ENA 6 +
ENA 7 +
ENA 8 -
ENA 9 -
ENA 11 -
ENA 12 -
ENA 13 +
ENA 14 + -
ENA 15 -
(+) mais virulento, (-) menos virulento.
35
Figura 5. Patogenicidade de isolados de M. anisopliae e B. bassiana estimada pela porcentagem de
formigas soldados mortas de A. sexdens rubropilosa através de pulverização com suspensão de
conídios contendo aproximadamente 10
8
ufc.mL
-1
.
Horas após inoculação
24 48 72 96 120
Mortalidade confirmada (%)
0
20
40
60
80
100
Isolado ENA 1
Isolado ENA 2
Isolado ENA 3
Isolado ENA 4
Isolado ENA 6
Isolado ENA 7
Isolado ENA 13
Isolado ENA 14
Testemunha
Figura 6. Patogenicidade de isolados de M. anisopliae e B. bassiana estimada pela porcentagem de
formigas soldados mortas de A. bisphaerica através de pulverização com suspensão de conídios contendo
aproximadamente 10
8
ufc.mL
-1
.
H o ra s a p ós in o c u la ç ã o
2 4 48 7 2 9 6 1 2 0
Mortalidade confirmada (%)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
10 0
Is ola d o E N A 1
Is ola d o E N A 2
Is ola d o E N A 3
Is ola d o E N A 4
Is ola d o E N A 6
Is ola d o E N A 7
Is ola d o E N A 1 3
Is ola d o E N A 1 4
T es te m un h a
36
4.2 Produção de biomassa dos entomopatógenos
Os resultados obtidos no experimento 2 indicaram que o meio de arroz
parboilizado é o mais indicado para produção em relação aos outros meios testados
quando comparados a quantidade de conídios produzidos no tempo inicial de produção
que após 14 dias apresentaram colonização total dos fungos M. anisopliae e B. bassiana.
No meio de arroz parboilizado + caldo de batata e o arroz parboilizado + caldo de
batata + dextrose ocorreu fermentação e não havendo produção de conídios em todas as
repetições. Essa fermentação pode ter sido decorrente da quantidade utilizada do caldo da
batata e da dextrose uma vez que a Universidade da Florida produz B. bassiana em meio
líquido contendo de 1 % a 2 % de levedura e de 1 % a 2 % de açúcar, que é então usada
na inoculação de arroz cozido.
O meio com arroz parboilizado + peptona de soja apresentou uma esporulação
fraca, obtendo-se 3,0 g de conídios com aproximadamente 10
7
conídios.g
-1
e o arroz
parboilizado + quitina líquida também apresentou fraca esporulação obtendo-se 5,0 g de
conídios com aproximadamente 10
8
conídios.g
-1
, já o arroz parboilizado + água foram
obtidos 9,0 g de conídios com aproximadamente 10
9
conídios.g
-1
. Resultados semelhantes
foram obtidos por ALVES (1986).
4.3 Teste de patogenicidade in vitro
Os resultados obtidos no experimento três demonstram que após 120 h a 2,5 x 10
8
conídios.mL
-1
quatro isolados de M. anisopliae e B. bassiana apresentaram valores de
mortalidade confirmada entre 77,50 % e 20 % para soldados de A. bisphaerica e 66,66 %
a 31,66 % para soldados de A. sexdens rubropilosa. Sendo que quatro isolados de M.
anisopliae apresentaram mortalidade confirmada acima de 50 % já os isolados de B.
bassiana apresentaram três isolados acima de 50 % e um apresentou 20 % de mortalidade
confirmada para soldados de A. bisphaerica.
Para A. sexdens rubropilosa três isolados de M. anisopliae apresentaram
mortalidade confirmada acima de 50 % e um isolado ficou abaixo apresentando 46,66 %
para o isolado de B. bassiana a mortalidade confirmada foi de três isolados acima de 50
% e um isolado abaixo apresentando 31,66 %.
A partir desses resultados os isolados com maior desempenho para A. bisphaerica
foram (ENA 4, ENA 6, ENA 13, ENA 2, ENA 3, ENA 14, ENA 1 e ENA 7) e para A.
sexdens rubropilosa (ENA 4, ENA 13, ENA 14, ENA 2, ENA 3, ENA 6, ENA 1 e ENA
7). Os valores da concentração letal (CL
50
) de M. anisopliae variaram de 1,29 x 10
2
até
1,74 x 10
12
e para B. bassiana a CL
50
variaram de 7,49 x 10
5
até 2,88 x 10
8
para A.
bisphaerica.
4.4 Avaliação da virulência dos isolados selecionados
A porcentagem de mortalidade dos isolados para TL
50
demonstram que houve
diferenças significativas entre eles sendo que os isolados ENA 4 de M. anisopliae foi o
melhor para soldados de Atta bisphaerica e para B. bassiana foram os isolados ENA 6 e
ENA 13 que não apresentaram diferenças significativas entre eles, os isolados ENA 2,
ENA 3, ENA 14 e ENA 7 também provocaram a morte dos soldados. Para soldados de A.
sexdens rubropilosa o isolado ENA 4 também apresentou maior eficiência já para B.
37
bassiana os melhores isolados e que não apresentaram diferença significativa entre eles
foram os isolados ENA 13, ENA 14, ENA 2 , ENA 3 e ENA 4 respectivamente os
isolados ENA 1 e ENA 7 também provocaram a morte dos soldados porém levaram
maior tempo para promover a morte dos soldados (Tabela 3 e 4). Esses resultados são
discordantes do encontrados por PEREIRA et al. (1993a) com o isolado 447, em
operárias de Solenopsis invicta, que obtiveram 100 % de infecção e mortalidade.
STIMAC et al. (1993) verificaram que o tratamento de colônias de S. invicta, em
laboratório, com 1 g e 2 g de conídios de B. bassiana, matou cerca de 90 % das formigas.
BROOME (1974) citado por PEREIRA et al. (1993b), relatou que a mortalidade de
operárias de Solenopsis sp. Provocada pelo fungo B. bassiana em laboratório, variou em
torno de 35 % e QUATTLEBAUUM (1980), citado por PEREIRA et al. (1993b)
constatou que a mortalidade de operárias de Solenopsis sp., na mesma condição anterior,
foi de 94 %. Resultados semelhantes foram obtidos por SILVA e DIELH-FLEIG (1988).
Tabela 3 Comparação dos tempos letais (TL
50
) entre os diferentes isolados de M. anisopliae e B. bassiana para
soldados de A. bisphaerica
Isolados
Mortalidade
confirmada
(%)
1
TL
50
e IC
2
(dias) Equação da reta
X
2
Calculado
----------------------------------------------------- Metarhizium anisopliae --------------------------------------------------------
-----------------------
ENA 1 53,33 C 2,21 (1,28 – 3,82) Y= 4,251724 + 2,168331 logX 11,50
ENA 2 60,00 B 1,87 (1,19 – 2,94) Y= 4,226904 + 2,842559 logX 4,06
ENA 3 55,00 C 2,08 (1,09 – 3,97) Y= 4,415365 + 1,833416 logX 5,86
ENA 4 77,50 A 1,15 (0,61 – 2,19) Y= 4,81504 + 2,894167 logX 1,41
----------------------------------------------------- Beauveria bassiana------------------------------------------------------------
-------------------------
ENA 6 64,16 B 1,39 (0,52 – 3,75) Y= 4,777481 + 1,550309 logX 2,14
ENA 7 20,00 C 5,15 (2,21– 12,06) Y= 2,676178 + 3,262102 logX 3,99
ENA 13 63,33 B 1,44 (0,55 – 3,78) Y= 4,755611 + 1,543221 logX 4,07
ENA14 55,00 C 2,05 (0,92 – 4,59) Y= 4,543898 + 1,454963 logX 2,37
Testemunha 6,66
C.V.(%) = 13,87
1
Médias com letras iguais na coluna não diferem entre si, pelo teste de Scott-Knott (p≤0,05).
2
TL
50
= Tempo letal / IC (95 %) = Intervalo de confiança. Significância ao nível de 5 % de probabilidade.
Tabela 4 Comparação dos tempos letais (TL
50
) entre os diferentes isolados de M. anisopliae e B. bassiana para
soldados de A.sexdens rubropilosa
Isolados
Mortalidade
confirmada
(%)
1
TL
50
e IC
2
(dias) Equação da reta
X
2
Calculado
------------------------------------------------------------ Metarhizium anisopliae -------------------------------------------------
----------------
ENA 1 46,66 C 2,65 (1,69 – 4,16) Y= 3,824226 + 2,776277 logX 14,68
ENA 2 57,50 B 1,96 (1,17 – 3,31) Y= 4,306917 + 2,358944 logX 1,60
ENA 3 54,16 B 2,14 (1,04 – 4,39) Y= 4,463943 + 1,620698 logX 4,38
ENA 4 66,66 A 1,37 (0,61 – 3,11) Y= 4,738206 + 1,909517 logX 0,97
--------------------------------------------------------------- Beauveria bassiana ---------------------------------------------------
----------------
ENA 6 54,16 B 2,14 (1,11 – 4,16) Y= 4,413738 + 1,768307 logX 6,60
ENA 7 31,66 D 3,57 (2,25 – 5,68) Y= 3,092711 + 3,447097 logX 2,39
ENA 13 59,16 B 1,95 (1,37 – 2,82) Y= 3,963908 + 3,571529 logX 11,14
ENA 14 59,16 B 1,68 (0,66 – 4,31) Y= 4,686997 + 1,383894 logX 2,67
Testemunha 6,66
C.V. (%) = 17,75
1
Médias com letras iguais na coluna não diferem entre si, pelo teste de Scott-Knott (p≤0,05).
2
TL
50
= Tempo letal / IC (95 %) = Intervalo de confiança. Significância ao nível de 5 % de probabilidade.
38
Comparações dos limites fidiciais mostraram que TL
50
para o isolado ENA 7 de B.
bassiana diferiu significativamente do TL
50
do isolado ENA 4 de M. anisopliae tanto
para “soldados” de A. bisphaerica e A. sexdens rubropilosa.
4.5 Concentração letal
Os resultados deste experimento (Tabela 5 e 6) referem-se as porcentagens de
mortalidade de formigas para as soldados A. bisphaerica e A. sexdens rubropilosa para
diferentes isolados de M. anisopliae e B. bassiana.
Com base na analise estatística, as porcentagens de mortalidade confirmada de
soldados de A. bisphaerica demonstram que os isolados ENA 14, ENA 13 e ENA 6 não
diferem entre si proporcionando uma taxa de mortalidade superior acima de 66,44% a
68,33 % em concentrações que variaram entre 10
5
e 10
6
, seguida dos isolados ENA 2,
ENA 4, ENA 7, ENA 1 e ENA 3, que apresentaram porcentagens de mortalidade entre
63,89% a 43,89% e concentração variando de 10
6
a 10
12
conídios.mL
-1
. Para as formigas
soldados de A. sexdens rubropilosa os melhores isolado foram ENA 14 e ENA 6 que
apresentaram porcentagens de mortalidade variando de 71,67 % a 68,33 % seguidos dois
isolados ENA 2, ENA 4, ENA 13, ENA 1, ENA 3 e ENA 7 que apresentaram
porcentagem de mortalidade entre 63,89 % a 43,89 % respectivamente.
As Tabelas 5 e 6 também sumarizam a virulência relativa para formigas
“soldados” de A. bisphaerica e A. sexdens rubropilosa expostas a oito isolados de fungos.
A concentração letal mediana (CL
50
) dos isolados testados contra A. bisphaerica variou
de 1,29 x 10
2
a 2,94 x10
9
conídios.mL
-1
, e baseando-se nos limites fiduciais, não houve
diferença significativa entre os isolados.
Para A. sexdens rubropilosa, os valores de (CL
50
) variaram de 1,08x10
-5
a 2,93 x
10
10
conídios.mL
-1
, e também não houve diferença significativa entre isolados.
Quando comparamos os resultados verifica-se que B. bassiana apresenta dois
isolados como melhores para A. bisphaerica e um isolado de M. anisopliae ENA 6, que
diferente nas concentrações variando de 10
5
e 10
6
conídios.mL
-1
, e o tempo letal varia de
2,05 dias a 1,44 dias respectivamente. No caso de A. sexdens rubropilosa os isolados que
apresentaram maior eficiência foram os isolados ENA 14 de B. bassiana e o isolado ENA
6 de M. anisopliae que apresentaram concentração letal entre 71,67 % a 68,33 %
conídios.mL
-1
e o tempo letal variou de 1,68 dias a 2,14 dias. Os resultados estão de
acordo com estão de acordo com (LOUREIRO, 2004) que quando comparou os valores
dos intervalos de confiança, observou que ocorre diferença significativa entra as
concentrações testadas. Verificou-se que as concentrações 1,0 x 10
9
1,0 x 10
8
conídios.mL
-1
do isolado E9 de M. anisopliae causaram tempos letais de 2,50 e 3,26 dias
respectivamente. Já para o isolado AL observou-se um TL
50
de 3,27 dias para a
concentração de 1,0 x 10
6
conídios.mL
-1
.
ALVES et al. (1983) testaram a patogenicidade de uma linhagem de B. bassiana e
uma de linhagem de M. anisopliae, isolado de A. sexdens rubropilosa, proveniente da
região de Piracicaba, SP, sobre soldados e cortadeiras desta mesma espécie. Constataram
que ambos os fungos foram patogênicos a formiga, sendo que os soldados foram mais
sensíveis à B. bassiana e as cortadeiras à M. anisopliae. A patogenicidade de B. bassiana
para a formiga lava-pés variou com os diferentes isolados de fungos de diferentes
técnicas experimentais usadas (STIMAC et al., 1993).
39
4.6 Avaliação da tecnologia de aplicação dos isolados selecionados no controle de A.
bisphaerica e A. sexdens rubropilosa em condições de campo.
Os resultados indicaram que em termos de atividade e mortalidade de formigas
nos ninhos, na primeira semana após a aplicação, o nível de atividade diminuiu em todos
os olheiros onde foram pulverizados e polvilhados com os isolados ENA 4 de M.
anisopliae e ENA 13 de B. bassiana, os quais foram os melhores qualificados no teste in
vitro. No 15
o
dia, mais de 40 % dos olheiros não apresentaram atividade de formigas.
Passados 20 dias, 65,5 % dos ninhos estavam inativos. Após 30 dias os olheiros ainda
apresentavam pouca atividade.
Todas as formigas (soldados e cortadeiras), coletadas 30 dias após a aplicação dos
fungos, estavam apenas infectadas por Aspergillus sp. Todavia, das amostras de solo foi
encontrado um nível de 3,3 x 10
7
conídios.g/solo.
Esses resultados são discordantes aos obtidos por STIMAC et al. (1988) que
obteve uma variação de mortalidade de 60,7 % a 100 % utilizando uma dose mínima de
12,5 g e máxima de 200 g.
Tabela 5 Comparação das concentrações letais (CL
50
) entre os diferentes isolados de M. anisopliae e B. bassiana para soldados de A. bisphaerica
Isolados
Mortalidade
Confirmada
(%)
1
CL
50
e IC
2
(Conídios mL
-1
) Equação da reta
X
2
Calculado
------------------------------------------------------------ Metarhizium anisopliae ------------------------------------------------------
ENA 1 45,00 C 1,29 x 10
2
(5,87 x 10
-39
- 1,70 x 10
38
) Y= 4,977174 - 0,001210235 logX 9,61
ENA 2 63,89 B 5,44 x 10
6
(9,26 x 10
6
– 3,19 x 10
8
) Y= 3,567308 + 0,2127025 logX 29,94
ENA 3 43,89 C 2,94 x 10
9
(4,40 x 10
7
– 1,96 x 10
11
) Y= 3,444598 + 0,1645811 logX 8,47
ENA 4 60,56 B 1,74 x 10
12
(3,19 x 10
7
– 9,53 x 10
20
) Y= 5,882606 - 0,007209718 logX 6,73
--------------------------------------------------------------- Beauveria bassiana -------------------------------------------------------
ENA 6 68,33 A 1,12 x 10
6
(7,38 x 10
3
– 1,89 x 10
8
) Y= 3,735052 + 0,20822868 logX 23,53
ENA 7 50,56 C 2,88 x 10
8
(2,62 x 10
7
– 3,18 x 10
9
) Y= 2,820892 + 0,2575522 logX 30,36
ENA 13 68,89 A 4,39 x 10
5
(6,02 x 10
2
– 3,19 x 10
8
) Y= 3,9787993 + 0,1809966 logX 5,81
ENA 14 69,44 A 7,49 x 10
5
(3,17 x 10
3
– 1,76 x 10
8
) Y= 3,794259 + 0,205272 logX 14,53
testemunha 0,00
C.V.(%) = 18,03
1
Médias com letras iguais na coluna não diferem entre si, pelo teste de Scott-Knott (p≤0,05).
2
CL
50
= Concentração letal / IC (95 %) = Intervalo de confiança. Significância ao nível de 5% de probabilidade.
Tabela 6 Comparação das concentrações letais (CL
50
) entre os diferentes isolados de M. anisopliae e B. bassiana para soldados de Atta sexdens rubropilosa
Isolados
Mortalidade
Confirmada
(%)
1
CL
50
e IC
2
(Conídios/ml) Equação da reta
X
2
Calculado
------------------------------------------------------------ Metarhizium anisopliae ---------------------------------------------------------------
ENA 1 45,56 C 1,24 x 10
10
(3,90 x 10
6
– 4,00 x 10
13
) Y= 3,975456 + 0,1014714 logX 8,04
ENA 2 62,78 B 3,83 x 10
6
(1,21 x 10
4
– 1,20 x 10
9
) Y= 3,967355 + 0,15683 logX 27,46
ENA 3 43,89 C 7,75 x 10
9
(4,57 x 10
7
– 1,31 x 10
12
) Y= 3,510174 + 0,150628 logX 12,13
ENA 4 62,22 B 1,08 x 10
-5
(5,87 x 10
-39
– 1,70 x 10
38
) Y= 5,102262 + 0,0206044 logX 5,82
--------------------------------------------------------------- Beauveria bassiana -------------------------------------------------------------------
ENA 6 68,33 A 1,12 x 10
5
(3,36 – 3,73 x 10
9
) Y= 4,3320092 + 0,1322844 logX 19,34
ENA 7 43,89 C 2,93 x 10
10
(4,92 x 10
6
– 1,75 x 10
14
) Y= 3,900324 + 0,1050544 logX 11,64
ENA 13 58,89 B 2,55 x 10
6
(77,21 – 8,47 x 10
10
) Y= 4,41728 + 0,009093858 logX 18,15
ENA 14 71,67 A 6,94 x 10
4
(5,04 – 9,53 x 10
8
) Y= 4,255732 + 0,153721 logX 12,62
Testemunha 3,33
C.V.(%) = 18,95
1
Médias com letras iguais na coluna não diferem entre si, pelo teste de Scott-Knott (p≤0,05).
2
CL
50
= Concentração letal / IC (95 %) = Intervalo de confiança. Significância ao nível de 5 % de probabilidade.
2
5 – CONCLUSÕES
Atta sexdens rubropilosa e Atta bisphaerica são suscetível à ação patogênica dos fungos
Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae na concentração de 10
6
ate 10
11
observada em
cadáveres inoculados com suspensões de todos os fungos testados.
Os fungos Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae mostraram diferentes
capacidades de produzir a morte de formigas, tendo os isolados ENA 4 de M. anisopliae e de
ENA14, ENA 13 e ENA 6 B. bassiana provocado as maiores médias de mortalidade de
soldados de Atta sexdens rubropilosa e Atta bisphaerica.
Os isolados ENA 1, ENA 2, ENA 3, ENA 4, ENA 6, ENA 13 e ENA 14 causaram
mortalidade em menor tempo do que o isolado ENA 7.
A concentração de conídios de todos os isolados necessária para matar 50% da
população de Atta bisphaerica e Atta sexdens rubropilosa é a mesma.
Os isolados ENA 4 Metarhizium anisopliae e ENA 13 de Beauveria bassiana são
capazes de reduzir a atividade das formigas Atta bisphaerica e Atta sexdens rubropilosa quando
aplicados nos olheiro, seja por pulverização ou por polvilhamento.
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