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RODRIGO FONSECA DE SOUZA
RODRIGO FONSECA DE SOUZARODRIGO FONSECA DE SOUZA
RODRIGO FONSECA DE SOUZA
CONTROLE BIOLÓGICO DE
Rhizoctonia solani
:
ACTINOMICETOS E SUAS ENZIMAS
HIDROLÍTICAS
Rio de Janeiro
Agosto de 2006
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de
Microbiologia Prof. Paulo de Góes, da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, c
omo parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de
Doutor em Ciências
(Microbiologia).
Orientadores: Prof
a
. Rosangela M. de Araújo Soares
Prof
a
. Rosana Canuto Gomes
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Souza, R. F.
ii
FICHA CATALOGRÁFICA
Souza, Rodrigo Fonseca de.
Controle biológico de Rhizoctonia solani: actinomicetos e suas
enzimas hidrolíticas/ Rodrigo Fonseca de Souza. – Rio de Janeiro: UFRJ/
IMPPG, 2006.
Xviii, 152f.: il.; 29,7cm.
Orientadores: Rosangela M. de Araújo Soares e Rosana Canuto
Gomes
Tese (doutorado) – UFRJ/ Instituto de Microbiologia Prof. Paulo
de Góes/ Programa de Pós-graduação em Ciências (Microbiologia), 2006.
Referências Bibliográficas: f. 106-147.
1. Controle biológico. 2. Rhizoctonia solani. 3. Streptomyces. 4.
Interação. 5. Enzimas hidrolíticas. 6. Identificação. I. Soares, Rosangela
Maria de Araújo e Gomes, Rosana Canuto II. Universidade Federal do Rio
de Janeiro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Gós, Programa de
Pós-graduação em Ciências (Microbiologia). III. Título
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Souza, R. F.
iii
FOLHA DE APROVAÇÃO
Rodrigo Fonseca de Souza
CONTROLE BIOLÓGICO DE Rhizoctonia solani: ACTINOMICETOS E SUAS
ENZIMAS HIDROLÍTICAS
Rio de Janeiro, 31 de Agosto de 2006
_________________________________________________________
(Rosângela Maria de Araújo Soares, Drª em Ciências - Microbiologia,
Universidade Federal do Rio de Janeiro)
__________________________________________________________
(Rosalie Reed Rodrigues Coelho, Drª em Ciências - Microbiologia,
Universidade Federal do Rio de Janeiro)
__________________________________________________________
(Marta Helena Branquinha de Sá, Drª em Ciências - Microbiologia,
Universidade Federal do Rio de Janeiro)
__________________________________________________________
(Cirano Jose Ulhoa, Dr. em Genética e Bioquímica de Microorganismos,
Universidade Federal de Goiás)
__________________________________________________________
(Luzia Teixeira de Azevedo Soares Semêdo, Drª em Ciências -
Microbiologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro)
Souza, R. F.
iv
Trabalho realizado no Laboratório de
Biotecnologia de Actinomicetos do
Departamento de Microbiologia Geral do
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes, sob a orientação da Drª Rosangela
Maria de Araújo Soares e sob a co-
orientação da Drª. Rosana Canuto Gomes.
Souza, R. F.
v
Dedico aos meus pais Nelio Pereira de
Souza, Iclea Fonseca de Souza “in
memorian” e Ângela Maria de Souza
Nunes por me darem o apoio necessário
para seguir este caminho tão pleno de
oportunidades e alegrias.
Souza, R. F.
vi
AGRADECIMENTOS
Este trabalho só foi possível devido ao auxílio de diversas pessoas e instituições, às
quais gostaria de agradecer em especial.
À Profª. Rosângela Maria de Araújo Soares, minha orientadora, pelo constante
incentivo, paciência, sabedoria e confiança, que me proporcionaram um enorme crescimento
científico e acadêmico.
À Drª. Rosana Canuto Gomes pelo constante apoio, incentivo, sabedoria e confiança,
principalmente nas horas mais difíceis.
À Drª Rosalie Reed Rodrigues Coelho pelo incentivo, sabedoria sempre
demonstrados, além das valiosas oportunidades de co-orientação oferecidas, que me
proporcionaram um grande crescimento acadêmico e científico.
Ao prof. Luiz Fernando de Toledo Luna Linhares pela valiosa colaboração científica.
Às Profª
s
. Eliana Barreto Bergter, Marta Helena Branquinha, Alane Beatriz Vermelho
e Celuta Sales Alviano pelo apoio, colaboração e pela constante amizade demonstrados a todo
tempo.
Ao Prof. Andrew Macrae pela sua grande contribuição dedicada ao presente trabalho.
À bibliotecária do Instituto de Microbiologia, Dilma, que sempre com seu carinho, sua
atenção e presteza, emprestou-me mais do que simples livros.
Aos meus alunos de apoio técnico, Carlos Eduardo “kadu”, Pedro e Evilmar pela ajuda
inprescindível nos experimentos.
Agradeço muito à minha namorada, Elen Ribeiro dos Santos, pelos bons momentos
inprescindíveis que passamos juntos e pela grande contribuição neste trabalho. Sem você este
trabalho seria muito mais difícil.
À todos os meus colegas de laboratório, Luzia Teixeira de Azevedo Soares Semêdo,
Rodrigo Pires do Nascimento, Rosana Canuto Gomes, Adriana Alvarenga Linhares, Doralice
Rodrigues Sacramento, Erick Aniszweski, Marta de Sousa Ferreira, Luciana Aragão Insuelas,
Andre Grigorewski, , Adriana “bacilo” Fagundes, Juliana Pacheco, pela constante
colaboração, paciência e pelo carinho e amizade sempre demonstrados.
À Adriana Machado Fróes pela contribuição desprendida, principalmente nos
momentos mais complicados, essenciais para o desenvolvimento do trabalho, bem como ao
meu aprimoramento em orientações.
À todos aqueles que colaborarm de forma direta e indireta no desenvolvimento deste
trabalho.
Souza, R. F.
vii
Aos meus grandes amigos Lysianne Pinto, Elen Federowicz, Rodrigo Pires do
Nascimento, Claudia Masini D’ávila, Cíntia Cardoso Nunes Lopes, Felipe Almeida Salgado,
pela amizade e apoio sempre demonstrados em qualquer situação.
À coordenadora do curso de Pós-Graduação em Microbiologia e Imunologia Prof.
Thais Souto-Padrón pela competência em administrar o curso de pós-graduação em
Microbiologia e Imunologia dentro da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Aos colegas dos laboratórios situados no Departamento de Microbiologia Geral do
Instituto de Microbiologia pelo apoio, amizade e paciência sempre demonstrados.
À todo corpo docente e discente do Instituto de Microbiologia da UFRJ na pessoa de
sua diretora, Prof.ª Ângela Hampshire Lopes, pelos recursos materiais e humanos colocados a
nossa disposição.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), ao
Conselho de Ensino e para Graduados e Pesquisas da UFRJ (CEPG), à Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), à Fundação José Bonifácio (FUJB),
à Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) e à Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio de
Janeiro (FAPERJ) pelo auxílio financeiro dispensado durante a realização deste trabalho.
Souza, R. F.
viii
“É melhor tentar e falhar, que preocupar-
se e ver a vida passar; é melhor tentar,
ainda que em vão, que sentar-se fazendo
nada até o final. Eu prefiro na chuva
caminhar, que em dias tristes em casa me
esconder. Prefiro ser feliz, embora louco,
que em conformidade viver ..."
Martin Luther King
Souza, R. F.
ix
RESUMO
No presente trabalho, selecionamos a estirpe Streptomyces sp. RCQ1071 para emprego
no controle biológico do fungo fitopatogênico Rhizoctonia solani através da utilização de 2
formulações, identificamos a estirpe de Streptomyces através da taxonomia polifásica,
analisamos a sua interação com o fitopatógeno R. solani e avaliamos a produção de enzimas
micolíticas por este actinomiceto. A utilização de microrganismos no controle biológico
requer que este seja empregado através de formulações para que se tornem mais estáveis e
economicamente viáveis. Inicialmente 13 estirpes de actinomicetos foram avaliadas quanto ao
grau de inibição do crescimento de 6 fungos fitopatogênicos, sendo 3 destas selecionadas por
apresentarem forte inibição. A atividade quitinolítica destes actinomicetos foi analisada e o
Streptomyces sp. RCQ 1071 foi selecionado como a estirpe mais promissora no controle
biológico devido a alta produção de exoquitinase (8,4 U/mL), comparada as outras estirpes
em meio contendo micélio de R. solani como principal fonte de carbono. Este actinomiceto
também foi capaz de produzir β-1,3-glucanases (2,1 U/mg) e proteases (22 U/mL). Estas
enzimas apresentaram maior atividade a 40 ºC, sendo as β-1,3-glucanases e as proteases mais
ativas em pH 5,0 e 6,0, respectivamente. A exoquitinase produzida pelo Streptomyces sp.
RCQ 1071 apresentou massa molecular de 72,8 kDa, sendo mais ativa em pH 7.0. A produção
dessas enzimas hidrolíticas aliada a adesão das hifas do Streptomyces sp. RCQ 1071 às hifas
de R. solani, comprovada através de microscopia óptica, sugerem que a ação inibitória do
actinomiceto esteja associada com a degradação da parede celular do fitopatógeno. Através de
análise por “Western-blotting” e eletroforese bidimencional, foi identificado um polipeptídeo
de 61 kDa e pI 8,2 de Streptomyces sp. RCQ 1071 ativo no mecanismo de adesão. O
Streptomyces sp. RCQ 1071 foi capaz de controlar de forma eficiente os efeitos danosos
causados por R. solani em plântulas de tomate, quando comparado a utilização do agrotóxico
Monceren
®
, inclusive quando empregado através de formulações. Embora apenas a
formulação em pó molhável tenha apresentado uma viabilidade maior ao final de 6 meses de
estocagem, ambas as formulações apresentaram uma alta estabilidade durante os 3 primeiros
meses, tanto a 28 ºC quanto 4 ºC. A identificação do Streptomyces sp. RCQ 1071 através de
taxonomia polifásica revelou que esta estirpe não é semelhante a outras espécies atualmente
descritas, sendo considerada, portanto, como uma espécie nova, Streptomyces
lunalinharensis. Os resultados obtidos no presente trabalho demonstram a ação efetiva do
Streptomyces sp. RCQ 1071 no controle biológico de R. solani, com o envolvimento de
enzimas hidrolíticas e de um polipeptídeo na interação entre o fitopatógeno e o agente
biocontrolador. Ao final desse estudo foi obtido um biofungicida eficiente no controle das
doenças causadas por R. solani em tomate.
Souza, R. F.
x
ABSTRACT
In the present work, Streptomyces sp. RCQ 1071 was selected to be applied in
biological control of the soilborne plant pathogen fungus Rhizoctonia solani by using 2
formulations, it was identified using a polyphasic approach, its interaction with the plant
pathogen R. solani was analysed and its mycolytic enzyme production was evaluated.
Application of microorganisms in biological control requires it should be applied using
formulations, in order to be more stable and economically worthy. Initially, 13 actinomycetes
strains were screened for inhibitory activity on growth of 6 plant pathogen fungi, being
detected 3 with strong inhibitory activity. Chitinolytic activity of these strains was quantified
and Streptomyces sp, RCQ 1071 was selected as the most promised one to be used in
biological control due to its high exoquitinase production (8,4 U/mL) compared to others
strains, when R. solani mycelium was used in medium as main carbon source. This
actinomycete was also able to produce β-1,3-glucanases (2,1 U/mg) and proteases (22 U/mL).
These enzymes exhibited high activity at 40 ºC, being β-1,3-glucanases and proteases highest
activities at pH 5.0 and 6.0, respectively. An exochitinase produced by Streptomyces sp. RCQ
1071 had a molecular mass of 72,8 kDa, exhibiting more activity at pH 7.0. Production of
hydrolytic enzymes along with adhesion of Streptomyces sp. RCQ 1071 to R. solani hypha,
determined by optical microscopy, suggest that the actinomycete inhibitory activity is
associated with degradation of the plant pathogen cell wall. A peptide with molecular mass of
61 kDa and pI 8.2 from Streptomyces sp. RCQ 1071, involved in cellular adhesion, was
identified by western-blotting and 2-D electrophoresis. Streptomyces sp. RCQ 1071 was
efficient in supressing diseases caused by R. solani in tomato seedlings, when compared to
Monceren®, including when applied through formulations. Though only wettable powder
formulation was found to be most stable after 6 months of storage, both exhibited high
stability during 3 first months, at 28 ºC and 4 ºC. Identification of Streptomyces sp. RCQ 1071
by polyphasic taxonomy revealed that this strain differ from any other described species,
being considered, therefore, a new species, Streptomyces lunalinharensis. Results obtained in
this work have shown the effectiveness of Streptomyces sp. RCQ 1071 to biocontrol R. solani,
with hydrolytic enzymes and one polypeptide involved in interaction between plant pathogen
and biological control agent. Finalizing, it was obtained a biofungicide able to control
efficiently diseases caused by R. solani.
Souza, R. F.
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Modelo proposto da parede celular fúngica. (Retirado de Moore-Landecker, 1996a)
...........................................................................................................................................22
Figura 2 – Parede celular madura do micélio de 3 dias de crescimento de F. oxysporum f.sp.
lycopersici estirpe 2 observado através de microscopia eletrônica de transmissão. (A) A
parede celular está envolvida por uma camada interna (c) e por uma camada eletro-densa
mais externa (a) separada por uma camada eletro-transparente (b). (B) A extração com
SDS afeta a camada eletro-densa mais interna, mas não afeta a camada eletro-densa mais
externa (C) O tratamento com pronase afeta ambas as camadas eletro-densas.................22
Figura 3 – Microscopia óptica (400X) de Rhizoctonia solani. As áreas em destaque
representam a ramificação das hifas em ângulo de 90
0
. (Foto de Rodrigo Fonseca de
Souza). ...............................................................................................................................26
Figura 4 – Crescimento de Rhizoctonia solani em agar batata. (Foto de Rodrigo Fonseca de
Souza). ...............................................................................................................................26
Figura 5 – Reações de anastomose de Rhizoctonia solani. (a) C0, sem reação, ocorrendo
quando estirpes de diferentes grupos de anastomose não demonstram atração entre as
hifas. (b) C3, anastomose perfeita, quando estirpes do mesmo grupo de anastomose se
atraem e se fundem, formando uma rede contínua de hifas. (c) C2, anastomose imperfeita,
ocorre com estirpes do mesmo grupo de anastomose, mas com compatibilidade genética
diferente, se fundem, seguindo de morte celular do compartimento da hifa fundida. As
setas indicam as regiões mortas das hifas que se fundiram (Deacon, 2005). ....................28
Figura 6 – (A) Ampliação das regiões de fusão das hifas, mostrando o crescimento da
extremidade da hifa no interior do compartimento morto da outra hifa. (B)
Incompatibilidade do micélio entre duas estirpes de Rhizoctonia solani. A zona mais clara
entre as duas colônias resulta em morte após a fusão das hifas (Deacon, 2005)...............28
Figura 7 – Produtos comercializados pela Encore Technologies para utilização no controle
biológico. ...........................................................................................................................33
Figura 8 – Determinação do grupo de anastomose do isolado de R. solani através do
sequenciamento da região ITS1-5.8S-ITS2 com posterior análise filogética. (*) Sequência
do isolado de R. solani.......................................................................................................67
Figura 9 – Atividade inibitória das estirpes de actinomicetos sob F. oxysporum. 1-
Streptomyces drosdowiczii; 2- 103; 3- 68; 4- Q16; 5- 70; 6- 218; 7- M08; 8- 208; 9- M10;
10- 80; 11- 71; 12- Q11. ....................................................................................................69
Figura 10 – Atividade inibitória das estirpes de actinomicetos sob F. solani. 1- 208; 2- M08;
3- M10; 4- 80; 5- Q11; 6- 71; 7- Q16; 8- 103; 9- 68; 10- Streptomyces drosdowiczii 11-
70; 12- 218.........................................................................................................................70
Figura 11 – Atividade inibitória das estirpes de actinomicetos sob A.niger. 1- M08; 2- 208; 3-
68; 4- Streptomyces drosdowiczii; 5- Q16; 6- 103; 7- 71; 8- M10; 9- Q11; 10- 80. .........70
Souza, R. F.
xii
Figura 12 – Atividade inibitória das estirpes de actinomcetos sob F. graminearium. 1- 68; 2-
Streptomyces drosdowiczii; 3- Q16; 4- 103; 5- M08; 6- 208; 7 -70; 8 – 218;...................71
Figura 13 – Atividade inibitória das estirpes de actinomcetos sob Fusarium sp. 1- 103; 2-
Streptomyces drosdowiczii; 3- Q16; 4- 68; 5- 208; 6- M08; 7- 218; 8-70; 9- 71; 10- 80..71
Figura 14 - Atividade inibitória das estirpes de actinomcetos sob R. solani. 1- 68; 2- 71; 3- 80;
4- Q11; 5- 218; 6- 70; 7- Streptomyces drosdowiczii; 8- 208; 9- 103; 10- M08; 11- M10;
12- Q16..............................................................................................................................72
Figura 15 - Atividade quitinolítica do Streptomyces sp. RCQ 1071 crescido em meio de sais
minerais, contendo 0,5% de micélio de cada fungo fitopatogênico como única fonte de
carbono, por 4 dias a 28 ºC / 200 rpm. (A) Endoquitinase; (B) Exoquitinase;
Fusarium
graminearium;
Fusarium sp.;
Fusarium solani;
Aspergillus niger;
Aspergillus
parasiticcus;
Fusarium oxysporum;
Rhizoctonia solani...........................................74
Figura 16 - Atividade quitinolítica do Streptomyces sp. 80 crescido em meio de sais minerais,
contendo 0,5% de micélio de cada fungo fitopatogênico como única fonte de carbono, por
4 dias a 28 ºC / 200 rpm. (A) Endoquitinase; (B) Exoquitinase;
Fusarium
graminearium;
Fusarium sp.;
Fusarium solani;
Aspergillus niger;
Aspergillus
parasiticcus;
Fusarium oxysporum;
Rhizoctonia solani...........................................75
Figura 17 - Atividade quitinolítica do Streptomyces sp. Q11 crescido em meio de sais
minerais, contendo 0,5% de micélio de cada fungo fitopatogênico como única fonte de
carbono, por 4 dias a 28 ºC / 200 rpm. (A) Endoquitinase; (B) Exoquitinase;
Fusarium
graminearium;
Fusarium sp.;
Fusarium solani;
Aspergillus niger;
Aspergillus
parasiticcus;
Fusarium oxysporum;
Rhizoctonia solani...........................................76
Figura 18 – Cinética da produção de quitinase pelo Streptomyces sp. RCQ 1071 crescido em
meio de sais minerais, contendo 0,5% de micélio de R. solani como única fonte de
carbono, durante 36 horas a 28 ºC / 200 rpm. (-
-) Endoquitinase (-
-) Exoquitinase...77
Figura 19 - Cinética da produção de protease pelo Streptomyces sp. RCQ 1071 crescido em
meio de sais minerais, contendo 0,5% de micélio de R. solani como única fonte de
carbono, durante 36 horas a 28 ºC / 200 rpm.....................................................................78
Figura 20 – Cinética da produção de exoquitinase pelo Streptomyces sp. RCQ 1071 cultivado
durante 5 dias em meio TLE a 28 ºC / 200 rpm.................................................................79
Figura 21 – Cinética da produção de protease pelo Streptomyces sp. RCQ 1071 cultivado
durante 5 dias em meio TLE a 28 ºC / 200 rpm.................................................................80
Figura 22 – Cinética da produção de β-1,3-glucanase pelo Streptomyces sp. RCQ 1071
cultivado durante 5 dias em meio TLE a 28 ºC / 200 rpm.................................................80
Figura 23 – Curva de crescimento do Streptomyces sp. RCQ 1071 cultivado em meio TLE
durante 5 dias a 28 ºC / 200 rpm, determinada através de dosagem de proteína do
sobrenadante do meio de cultivo. ......................................................................................81
Figura 24 - Efeito da temperatura na atividade de exoquitinase do Streptomyces sp. RCQ
1071 após crescimento em meio TLE durante 4 dias / 28ºC / 200 rpm.............................82
Souza, R. F.
xiii
Figura 25 - Efeito do pH na atividade de exoquitinase do Streptomyces sp. RCQ 1071 após
crescimento em meio TLE durante 4 dias / 28ºC / 200 rpm..............................................82
Figura 26 - Efeito da temperatura na atividade proteolítica do Streptomyces sp. RCQ 1071
após crescimento em meio TLE durante 4 dias / 28ºC / 200 rpm. (A) 25 ºC; (B) 28 ºC; (C)
40ºC; (D) 50ºC...................................................................................................................83
Figura 27 – Efeito do pH na atividade proteolítica do Streptomyces sp RCQ 1071 após
crescimento em meio TLE durante 4 dias / 28 ºC / 200 rpm. (A) pH 3,0; (B) pH 5,0; (C)
pH 6,0; (D) pH 7,0; (E) pH 9,0..........................................................................................84
Figura 28 - Efeito da temperatura na atividade de β-1,3-glucanase do Streptomyces sp. RCQ
1071 após crescimento em meio TLE durante 4 dias / 28ºC / 200 rpm.............................85
Figura 29 - Efeito do pH na atividade de β-1,3-glucanase do Streptomyces sp. RCQ 1071 após
crescimento em meio TLE durante 4 dias / 28ºC / 200 rpm..............................................85
Figura 30 – Cromatografia de troca aniônica (Mono-Q) em sistema FPLC do sobrenadante de
cultivo do Streptomyces sp. RCQ 1071 obtidos após 4 dias de cultivo em meio TLE a 28
ºC / 200 rpm. (─) Proteína; (-
-) Exoquitinase; (---) NaCl..............................................86
Figura 31 – Eletroforese em SDS-PAGE 15% do sobrenadante de cultivo do Streptomyces sp.
RCQ 1071 (A) e da fração obtida após cromatografia de troca aniônica (Mono-Q) (B).
Padrão de massa molecular (C) .........................................................................................87
Figura 32 – Detecção da atividade quitinolítica do Streptomyces sp. RCQ 1071 crescido em
meio TLE durante 4 dias / 28ºC / 200 rpm, através de SDS-PAGE co-polimerizado com
glicol-quitina......................................................................................................................87
Figura 33 – Microscopia óptica (400x) do micélio de R. solani co-cultivado com o
Streptomyces sp. RCQ 1071. A, B e C – Co-cultivo do Streptomyces sp. RCQ 1071 e R.
solani. D – Hifas de R. solani (controle). As setas mostram a adesão das hifas do
Streptomyces sp. RCQ 1071 e as alterações ocasionadas às hifas de R. solani.................89
Figura 34 – Microscopia óptica (1000x) do micélio de R. solani co-cultivado com o
Streptomyces sp. RCQ 1071. .............................................................................................89
Figura 35 – Perfil polipeptídico dos extratos celulares de Streptomyces sp. RCQ1071(B), R.
solani (C) e Padrão de massa molecular (A) em SDS-PAGE 12,5%................................90
Figura 36 - Interação entre polipeptídeos de superfície do Streptomyces sp. RCQ1071 e
polipeptídeos de R. solani. 1 – Polipeptídeos do Streptomyces sp. RCQ1071 sem
marcação; 2 - Polipeptídeos de R. solani sem marcação; 3 - Polipeptídeos do
Streptomyces sp. RCQ1071 marcados com biotina; 4 – Polipeptídeos do Streptomyces sp.
RCQ1071 ligadas a polipeptídeos de R. solani, após interação durante 1 hora. A – Após
SDS-PAGE 12,5%; B – Após SDS-PAGE 15%. ..............................................................91
Figura 37 – Cromatografia de filtração em gel (Superose 12) do extrato polipeptídico do
Streptomyces sp. RCQ 1071 extraído da membrana de interação.....................................92
Figura 38 – (A) Eletroforese em SDS-PAGE sob condições desnaturantes da fração obtida
após cromatografia de filtração em gel (Superose 12) do extrato polipeptídico do
Souza, R. F.
xiv
Streptomyces sp. RCQ 1071; (B) Interação entre o polipeptídeo do Streptomyces sp. RCQ
1071, marcado com biotina, após “western-blotting” dos polipeptídeos de R. solani. .....92
Figura 39– Eletroforese bi-dimencional em SDS-PAGE 12,5% da fração obtida após
cromatografia de filtração em gel (Superose 12) do extrato polipeptídico do Streptomyces
sp. RCQ 1071.....................................................................................................................93
Figura 40 – Análise da estabilidade da formulação em grânulos de alginato do Streptomyces
sp. RCQ 1071 durante estocagem a 4 ºC ( --- ) e a 28 ºC ( ─ ) durante 6 meses...............94
Figura 41 – Análise da estabilidade da formulação em pó molhável do Streptomyces sp. RCQ
1071 durante estocagem a 4 ºC ( --- ) e a 28 ºC ( ─ ) durante 6 meses..............................94
Figura 42 - Avaliação do efeito controlador de Streptomyces sp. RCQ 1071 sobre R. solani em
pedaços de tomate. (A) Tomate infectado por R. solani; (B) Streptomyces sp RCQ1071 e
R. solani; (C) Controle; (D) Streptomyces sp. RCQ1071..................................................96
Figura 43 – Controle biológico de R. solani em plântulas de tomate, utilizando a suspensão de
esporos do Streptomyces sp. RCQ 1071.
Controle;
Suspensão de esporos do
Streptomyces sp. RCQ 1071;
R. solani;
R. solani + Suspensão de esporos do
Streptomyces sp.RCQ 71. ..................................................................................................97
Figura 44 – Controle biológico de R. solani utilizando a suspensão de esporos do
Streptomyces sp. RCQ 1071. (A) Suspensão de esporos do Streptomyces sp. RCQ 1071;
(B) R. solani; (C) R. solani + Suspensão de esporos do Streptomyces sp. RCQ 1071; (D)
Controle. ............................................................................................................................98
Figura 45 – Controle biológico de R. solani utilizando a formulação em pó molhável do
Streptomyces sp. RCQ 1071.
Controle;
Sementes revestidas com formulação + R.
solani;
Monceren + R. solani;
Formulação + R. solani;
R. solani.......................99
Figura 46 – Controle biológico de R. solani utilizando a formulação em grânulos do
Streptomyces sp. RCQ 1071.
Controle;
Monceren + R. solani;
Formulação + R.
solani;
R. solani...........................................................................................................100
Figura 47 – Filogenia da estirpe RCQ1071
T
e de estreptomicetos relacionados. A árvore foi
baseada no alinhamento de aproximadamente 1400 pares de base, a distância
evolucionária calculada utilizando o modelo de Galtier & Gouy e construída utilizando
Neighbour-Joining. Os números de acesso das sequências estão entre parenteses.
Streptomyces melanosporofaciens AJ391837 foi utilizado como “out group”. Os números
nas ramificações indicam o percentual de “bootstrap” baseado em 1000 rearranjos e
somente valores acima de 50% foram mostrados. A escala representa 0,01 de substituição
de nucleotídeo por posição. .............................................................................................105
Souza, R. F.
xv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Vendas de defensivos (x mil US$) agrícolas no Brasil, no período de 1992 a 2004.
Fonte: www.sindag.org.br .................................................................................................36
Tabela 2 – Iniciadores utilizados para o sequenciamento do RNA ribosomal 16S do
Streptomyces sp. RCQ 1071. .............................................................................................65
Tabela 3 – Resultados dos testes de inibição do crescimento dos fungos fitopatogênicos pelos
actinomicetos. (++) Halo > 5 mm; (+) Halo < 5 mm; (-) Negativo..................................68
Tabela 4 – Etapas do processo de purificação da exoquitinase produzida pelo Streptomyces
sp. RCQ 1071.....................................................................................................................88
Tabela 5 – Análise estatística dos resultados obtidos nos experimentos de controle biológico,
através do teste de χ
χχ
χ
2
. ......................................................................................................101
Tabela 6 - Características fenotípicas que diferenciam a estirpe 1, Streptomyces sp.
RCQ1071
T
das outras estirpes filogeneticamente relacionadas descritas de acordo com
Williams et al., 1983a e b (2, S. lydicus) e das espécies de Streptomyces quitinolíticos (3,
S. olivaceoviridis; 4, S. rimosus; 5, S. violaceoniger). (ND), - não determinado; (+),
positivo; (-) negativo........................................................................................................104
Souza, R. F.
xvi
LISTA DE ABREVIATURAS
AFLP – amplificação dos fragmentos de comprimento de polimorfismo
AG – grupo de anastomose
PDA – agar batata dextrosado
BSA – albumina soro fetal bovina
CFU – unidade formadora de colônia
DAB – 3,3’- tetrahidrocloreto de diaminobenzidina
DNA – ácido desoxiribonucléico
EC – comitê enzimático
FPLC – cromatografia líquida de alta performance
ISG – grupo intraespecífico
ITS – região interna transcrita
Min – minuto
MTT – brometo (3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolina)
PBS- tampão fosfato / salina
PCNB – pentacloronitrobenzeno
PCR – reação da polimerase em cadeia
PEG – polietilenoglicol
RDP – banco de dados ribossomal
RNA – ácido ribonucléico
RPM – rotações por minuto
SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida / dodecilsulfato de sódio
TBE – tampão Tris-HCl / ácido bórico / EDTA
TE – tampão de extração
UV – ultravioleta
YMA – agar extrato de malte / extrato de levedura
TLE – Trichoderma liquid enzyme médium
MACs – compostos que afetam a membrana
Souza, R. F.
xvii
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................................19
1.1. Os Actinomicetos.....................................................................................................................19
1.2. Reino Fungi .............................................................................................................................21
1.2.1. Características gerais.........................................................................................................21
1.2.2. Importância........................................................................................................................23
1.2.3. Rhizoctonia solani .............................................................................................................25
1.3. Controle de doenças em plantas ..............................................................................................31
1.4. Quitina .....................................................................................................................................36
1.5. Quitinases ................................................................................................................................37
1.6. β-1,3–glucanas.........................................................................................................................41
1.7. β-1,3-glucanases......................................................................................................................41
1.8. Proteases ..................................................................................................................................42
2. OBJETIVOS.................................................................................................................................45
3. MATERIAIS E MÉTODOS.........................................................................................................46
3.1. Obtenção e manutenção das estirpes .......................................................................................46
3.2. Determinação do grupo de anastomose da estirpe de Rhizoctonia solani...............................48
3.2.1. Isolamento do DNA genômico..........................................................................................48
3.2.2. Amplificação (PCR) da região ITS1-5.8S-ITS2 ...............................................................49
3.2.3. Reação de Seqüenciamento da região ITS1-5.8S-ITS2 ....................................................50
3.3. Obtenção do micélio dos fungos..............................................................................................50
3.4. Seleção das estirpes com atividade antifúngica.......................................................................51
3.5. Obtenção dos extratos enzimáticos e seleção da estirpe promissora.......................................51
3.6. Cinética da produção de quitinase e protease em meio contendo micélio de R. solani...........52
3.7. Cinética de produção das enzimas hidrolíticas em meio TLE.................................................52
3.8. Obtenção do sobrenadante.......................................................................................................52
3.9. Dosagem de proteína ...............................................................................................................52
3.10. Determinação da atividade quitinolítica..................................................................................53
3.11. Efeito do pH e da temperatura na atividade de exoquitinase...................................................53
3.12. Determinação da atividade proteolítica ...................................................................................54
3.13. Efeito do pH e da temperatura na atividade proteolítica .........................................................54
3.14. Determinação da atividade de β-1,3-glucanase.......................................................................55
3.15. Efeito do pH e da temperatura na atividade de β-1,3-glucanase .............................................55
3.16. Purificação parcial da exoquitinase .........................................................................................55
3.17. Co-cultivo de Rhizoctonia solani e Streptomyces sp. RCQ 1071 ...........................................56
3.18. Interação entre Rhizoctonia solani e Streptomyces sp. RCQ 1017 .........................................56
3.18.1. Obtenção do extrato polipeptídico de Rhizoctonia solani.................................................56
3.18.2. Obtenção do extrato polipeptídico do Streptomyces sp. RCQ 1071..................................57
3.18.3. “Western blotting” e reconhecimento de polipeptídeos de superfície...............................57
3.19. Purificação do polipeptídeo de reconhecimento......................................................................58
3.20. Eletroforese bi-dimensional.....................................................................................................58
3.21. Formulação do Streptomyces sp. RCQ 1071...........................................................................59
3.22. Análise da estabilidade das formulações.................................................................................60
3.23. Determinação da patogenicidade de Rhizoctonia solani .........................................................60
3.24. Controle biológico de Rhizoctonia solani................................................................................61
3.24.1. Ensaio com a suspensão de esporos ..................................................................................61
Souza, R. F.
xviii
3.24.1.1. No fruto ....................................................................................................................61
3.24.1.2. Nas plântulas ............................................................................................................61
3.24.2. Ensaio com as Formulações ..............................................................................................62
3.24.2.1. Formulação em pó molhável ....................................................................................62
3.24.2.2. Formulação em grânulos ..........................................................................................62
3.24.3. Análise estatística..............................................................................................................63
3.25. Identificação do Streptomyces sp. RCQ 1071.........................................................................63
3.25.1. Extração do DNA ..............................................................................................................63
3.25.2. Amplificação do DNA (PCR)............................................................................................64
3.25.3. Sequenciamento do DNAr16S e análise filogenética........................................................64
4. RESULTADOS ............................................................................................................................65
4.1. Determinação do grupo de anastomose de Rhizoctonia solani................................................66
4.2. Seleção das estirpes de actinomicetos .....................................................................................66
4.3. Obtenção dos extratos e seleção da estirpe promissora...........................................................72
4.4. Cinética da produção de quitinase e protease em meio de sais minerais.................................76
4.5. Cinética da produção das enzimas hidrolíticas em meio TLE.................................................78
4.6. Efeito do pH e da temperatura na atividade de exoquitinase...................................................81
4.7. Efeito do pH e da temperatura na atividade proteolítica .........................................................83
4.8. Efeito do pH e da temperatura na atividade de β-1,3-glucanase .............................................84
4.9. Purificação parcial da exoquitinase .........................................................................................86
4.10. Co-cultivo entre Rhizoctonia solani e Streptomyces sp. RCQ 1071 .......................................88
4.11. Interação entre Rhizoctonia solani e Streptomyces sp. RCQ 1071..........................................90
4.12. Purificação do polipeptídeo de reconhecimento......................................................................91
4.13. Formulação do Streptomyces sp. RCQ 1071 e análise da estabilidade ...................................93
4.14. Controle biológico ...................................................................................................................95
4.14.1. Ensaio com a suspensão de esporos ..................................................................................95
4.14.2. Ensaio com as formulações ...............................................................................................98
4.15. Análise estatística ..................................................................................................................100
4.16. Identificação do Streptomyces sp. RCQ 1071 .......................................................................101
5. DISCUSSÃO ..............................................................................................................................106
6. CONCLUSÃO............................................................................................................................119
7. REFERÊNCIAS..........................................................................................................................121
8. ANEXO ......................................................................................................................................143
Souza, R. F. Introdução
19
1. INTRODUÇÃO
1.1. Os Actinomicetos
Os actinomicetos são bactérias Gram positivas que apresentam um DNA rico em
guanina e citosina (G+C > 72%, no gênero Streptomyces e G+C de 64 a 72% no gênero
Nocardia) possuindo a capacidade de formar hifas em algum estágio de seu desenvolvimento
(Leblond & Decaris, 1994). As colônias de actinomicetos são formadas por uma massa de
hifas, formando o micélio. Essa massa é formada a partir do desenvolvimento inicial de
esporos, esporângios ou fragmentos de hifas em meio sólido, formando primeiramente o
micélio vegetativo, de caráter hidrofílico. Crescendo verticalmente, algumas estirpes de
actinomicetos diferenciam seu micélio vegetativo em micélio aéreo, de caráter hidrofóbico, o
que provoca uma alteração nas características morfogenéticas, fisiológicas e ultraestruturais.
Entretanto, alguns gêneros de actinomicetos não são capazes de formar o micélio aéreo em
meio sólido, formando somente o micélio vegetativo (Vobis, 1997).
Apesar da sua posição taxonômica junto às bactérias, a semelhança dos actinomicetos
como fungos é evidente em três propriedades: o micélio dos actinomicetos possuem
ramificações extensivas e características; ambos formam micélio aéreo, bem como conídios, e
seu crescimento em cultura líquida raramente resulta em turbidez, mas sim na formação de
massa (Holt et al., 1994).
Estes microrganismos se encontram distribuídos em diversos ambientes, incluindo,
águas, ar, material em compostagem e outros ambientes, sendo o solo o seu reservatório mais
comum (Goodfellow, Williams & Mordaski, 1984; Meyers et al., 2003; Grigorevski-Lima et
al., 2006). Estudos recentes demonstraram que os actinomicetos estão presentes nos oceanos e
amplamente distribuídos em diferentes ecossistemas marinhos. Várias espécies já foram
descritas em amostras de ambientes aquáticos, como por exemplo, em sedimentos marinhos
profundos, chegando a uma profundidade de até 3.800 metros. Dentre elas encontramos
espécies dos gêneros Streptomyces, Actinomadura, Nocardioides, Micromonospora, sendo
algumas espécies não cultiváveis, porém muitas cultiváveis. Como as condições ambientais
marinhas são extremamente diferentes daquelas terrestres, acredita-se que estes actinomicetos
marinhos possuem características diferentes daqueles encontrados nos ambientes terrestres e,
portanto, possam produzir diferentes tipos de compostos bioativos (Jensen et al., 2005; Lam,
2006; Ward & Bora, 2006).
Souza, R. F. Introdução
20
Os actinomicetos isolados de solo têm sido descritos como os principais produtores de
antibióticos, e também como um dos principais grupos microbianos produtores de enzimas de
interesse comercial e ambiental. São responsáveis por cerca de metade de todos os
metabólitos secundários bioativos já descobertos (Petrosyan et al., 2003; Jensen et al., 2005;
Mehdi et al., 2006; Lam, 2006). Além disso, exercem um papel importante na ciclagem de
compostos orgânicos nos ambientes naturais e desempenham um papel promissor na
agricultura, visto que alguns gêneros como Frankia são capazes de fixar o nitrogênio
atmosférico em plantas não-leguminosas (Ridgway et al., 2004). Por outro lado, têm sido
descritos na literatura como sendo causadores de doenças humanas (nocardioses,
actinomicoses e actinomicetomas), vegetais (podridão da batata) e animais (nocardioses)
(Corti & Fioti, 2003; Song et al., 2004; Kachi et al., 2006; Cokkinos et al., 2006). Os
actinomicetos também têm sido muito conhecidos por formar um importante componente da
microbiota indígena de humanos, especialmente na cavidade oral (Goodfellow, Williams &
Mordarski 1988; Sarkonen et al., 2000).
Além da produção de substâncias antimicrobianas, os estreptomicetos são uma fonte rica
de compostos bioativos de alto valor comercial, tais como, inibidores enzimáticos, compostos
agrobiológicos, agentes farmacologicamente ativos, como antivirais, antitumorais e
imunomoduladores (Goodfellow, Williams & Mordarski 1988; Sanglier et al., 1993, Kim et
al., 2000; Sacramento et al., 2004; Takahashi et al., 2005; Lam, 2006; Mehdi et al., 2006;
Park & Kilbane, 2006).
Várias enzimas de actinomicetos são de interesse na indústria, na terapia médica e na
agricultura. Essas enzimas são às vezes favorecidas, quando comparadas a outras fontes
microbianas ou vegetais, pelo fato de possuírem uma estabilidade maior a altas temperaturas e
diferentes valores de pH. Entre as enzimas de alto interesse comercial estão as xilanases e as
glicosidases como, por exemplo, amilases, celulases, e quitinases, todas importantes na
degradação da biomassa (Enger & Sleeper, 1965; Obi & Odibo, 1984; Nascimento et al.,
2003; Lima et al., 2005).
A heterogeneidade bioquímica dos actinomicetos, sua diversidade ecológica e sua
capacidade para a produção de metabólitos secundários os fazem um bom alvo para a
produção de enzimas, desempenhando novas atividades e/ou especificidades (Goodfellow,
Williams & Mordarski, 1988; Lam, 2006).
A taxonomia dos actinomicetos é bastante complexa, devido, sobretudo a grande
similaridade, tanto química quanto morfológica entre os diversos gêneros. Sendo assim, a
utilização somente de métodos convencionais e da quimiotaxonomia pode enquadrar um novo
Souza, R. F. Introdução
21
isolado dentro dos gêneros conhecidos, mas na grande maioria dos casos não é capaz de
definir a espécie a qual o isolado pertence. Com base nestas dificuldades, o estudo polifásico,
ou seja, a utilização de dados químicos, fisiológicos, morfológicos e genéticos juntos, tem
sido amplamente empregada para a classificação e identificação de actinomicetos. Assim
sendo, a delineação de novas espécies dentro de gêneros, e também de novos gêneros, deve
ser baseada na combinação de características genotípicas e fenotípicas (Anderson &
Wellington, 2001; Park & Kilbane II, 2006).
O gênero Streptomyces foi proposto por Waksman & Henrici (1943) e contém cerca de
600 espécies com identificação válida publicada
(http://www.dsmz.de/download/bactnom/bactname.pdf). É o mais comumente isolado e
amplamente estudado, apesar de vários outros gêneros também serem descritos na literatura.
Espécies pertencentes ao gênero Streptomyces são aeróbicas e formam colônias discretas, cuja
textura pode variar de rígida até viscosa. Inicialmente, as colônias têm a superfície
relativamente macia, e ao longo do crescimento, elas desenvolvem um micélio aéreo com
diferentes texturas (Holt et al., 1994). Não apresentam açúcares na parede celular (parede
celular de quimiotipo I sensu Lechevalier & Lechevalier, 1970) e o ácido diaminopimélico é
do tipo LL (Ping et al., 2004).
1.2. Reino Fungi
1.2.1. Características gerais
Os fungos são microrganismos eucarióticos aclorofilados, saprófitas ou parasitas, com
estruturas vegetativas unicelulares ou filamentosas. São envolvidos por uma parede celular
rígida composta por cerca de 80 a 90% de polissacarídeos, dos quais a quitina é encontrada
em maior abundância, além de proteínas, outros carboidratos, lipídios, polifosfatos e íons
inorgânicos constituindo a matriz cimentante. Os carboidratos são considerados importantes
como componentes estruturais. As proteínas podem exercer funções de enzimas, atuando
como defesa ou para a própria modelagem, ou ainda, quando conjugadas a carboidratos, são
responsáveis pelo reconhecimento celular. As proteínas são também encontradas formando
uma camada externa na parede celular de alguns fungos como, por exemplo, o Fusarium
oxysporum (Schoffelmeer et al., 1999). A maioria dos fungos apresenta quitina na
Souza, R. F. Introdução
22
composição da parede, porém alguns podem apresentar celulose ou ambos. As microfibrilas
de quitina ou celulose são interligadas e embebidas na matriz cimentante amorfa,
proporcionando uma rede que confere forma à célula. A propagação é por esporos e a
reprodução pode ser sexuada e/ou assexuada (Johnston, 1965; Ruiz-Herrera, 1967; Atlas,
1997).
As estruturas fúngicas tais como hifas, esporos e tubos germinativos, são geralmente
envolvidas por uma camada mucilaginosa. Esta camada pode ser produzida na superfície das
células que produzem esporocarpos, estruturas especializadas na produção de esporos durante
os ciclos reprodutivos. Em algumas espécies tal camada facilita a adesão das células às
superfícies, principalmente nas espécies parasitas. Abaixo desta, se encontra uma fina
camada composta por glucana, seguida por uma larga camada de quitina ou celulose (Moore-
Landecker, 1996a).
Figura 1 – Modelo proposto da parede celular fúngica. (Retirado de Moore-Landecker, 1996a)
Figura 2 – Parede celular madura do micélio de 3 dias de crescimento de F. oxysporum f.sp.
lycopersici estirpe 2 observado através de microscopia eletrônica de transmissão. (A) A
parede celular está envolvida por uma camada interna (c) e por uma camada eletro-densa mais
externa (a) separada por uma camada eletro-transparente (b). (B) A extração com SDS afeta a
camada eletro-densa mais interna, mas não afeta a camada eletro-densa mais externa (C) O
tratamento com pronase afeta ambas as camadas eletro-densas.
Souza, R. F. Introdução
23
O reino Fungi é extenso e diversificado, abrangendo um grande número de variedades
morfológicas e estruturais. Devido a isso, as definições sobre o reino são bastante complexas
e abrangentes. A classificação dos fungos está baseada principalmente nos meios de
reprodução, incluindo o ciclo de vida, as estruturas reprodutivas e os esporos reprodutivos. A
maioria dos métodos clássicos de classificação está baseada na observação da morfologia das
formas reprodutivas, mas atualmente características fisiológicas, bioquímicas e genéticas
também são utilizadas (Moore-Landecker, 1996b; Atlas, 1997; Madigan, Martinko & Parker,
2000).
1.2.2. Importância
Os fungos são importantes componentes no ecossistema. São encontrados
abundantemente em diversos ambientes nos quais se alimentam de material em
decomposição, desempenhando um papel importante no ciclo do carbono e no ciclo de
minerais. Alguns são aquáticos, e vivem em água doce, enquanto poucos são de ambiente
marinho. A maioria dos fungos é terrestre, sendo encontrados no solo ou em materiais de
origem vegetal em decomposição (Atlas, 1997). É estimado que os fungos são capazes de
reciclar toneladas de resíduos orgânicos nos seus habitats naturais anualmente (Moore-
Landecker, 1996c). O principal papel dos fungos nesta reciclagem está relacionado à
degradação de polímeros bastante complexos como a celulose, a lignina e a quitina,
originados da decomposição de matéria orgânica. Neste contexto produzem enzimas de
grande importância ambiental, tais como celulases, lignina-peroxidases e quitinases, capazes
de degradar tais compostos, tornando possível a sua assimilação por outros microrganismos
(Atlas, 1997).
Os fungos trazem benefícios para o homem em muitos aspectos. Muitos cogumelos e
outros fungos têm grande valor como alimentos e são amplamente cultivados pelo homem. As
leveduras são utilizadas para produzir cerveja, pão e vinhos. O sabor e a textura de alguns
alimentos como queijos, por exemplo, são proporcionados por leveduras e outros fungos
durante o seu preparo. Um dos mais importantes produtos comerciais é a penicilina, um
antibiótico produzido por estes microrganismos. Algumas espécies ainda são capazes de
produzir ácidos orgânicos e etanol para serem utilizados como reagentes na indústria
(Madigan, Martinko & Parker, 2000). Além disso, alguns são considerados muito
Souza, R. F. Introdução
24
importantes, pois servem como modelo de estudo de organismos eucariotas, podendo ser
facilmente manipulados em laboratório, ao contrário dos animais e plantas, nos fornecendo
informações importantes sobre a bioquímica, genética e biologia molecular dos mesmos. Uma
das espécies mais importantes talvez seja a Saccharomyces cerevisiae, uma levedura que
também é utilizada na produção de pão e bebidas alcoólicas (Moore-Landecker, 1996a).
Além dos aspectos ambientais citados, os fungos são também bastante estudados quanto
a sua patogenicidade em animais, principalmente ao homem. Uma pequena parcela dos
fungos é parasita em animais, incluindo o homem, apesar das bactérias e vírus serem mais
importantes neste aspecto do que os próprios fungos (Madigan, Martinko & Parker, 2000).
Micologistas estimam que existam 250.000 espécies de fungos descritas e que apenas cerca de
200 espécies são consideradas patogênicas para o homem e animais (Selintrennikoff, 2001).
Os fungos podem causar uma grande variedade de infecções, desde infecções sistêmicas e
potencialmente fatais (blastomicose e criptococcose) até infecções superficiais, cutâneas
localizadas, subcutâneas ou oportunistas (piedra negra, dermatofitose, lobomicose e
candidíase, respectivamente) (Bennett & Kwon-Chung, 1992; Fisher & Cook, 2001).
Entretanto, um grande número de fungos é parasita de plantas e causa a maioria das
doenças de importância comercial na agricultura. O número de fungos parasitas de plantas é
maior que o número de todos os outros parasitas combinados, incluindo vírus, bactérias e
vermes. Pelo menos 100.000 doenças de plantas são causadas por fungos (Moore-Landecker,
1996c). As espécies fitopatogênicas existem em todas as classes de fungos e são responsáveis
por aproximadamente 85% das doenças conhecidas em plantas. Dentre eles estão Fusarium
solani causador da podridão da raíz e infecção em ervilha (Lim, Kin & Kin, 1991), Fusarium
oxysporum que provoca doença no tomate (Sabuquillo, De Cal & Melgarejo, 2006),
Sclerotium rolfssi que infecta o feijão (Inbar & Chet, 1991), Pellicularia filamentosa que
causa infecção na planta do arroz, Alternaria kikuchiana que causa mancha negra em pêra
(Hunter, Darly & Russel, 1995), Rhizoctonia solani que causa doença no arroz e tombamento
em tomate (Thara & Guananamanickam, 1994; Lievens, et al., 2006), Sclerotinia
sclerotiorum que causa mofo branco do feijão (Huang et al., 2006). Os efeitos destas doenças
podem ser devastadores, variando desde uma redução no crescimento da planta até a sua
morte. A estrutura celular da planta pode ser destruída, suas funções fisiológicas prejudicadas
e o grau de metabolismo e vias metabólicas alterados. Atualmente doenças epidêmicas de
plantas podem destruir uma plantação inteira se condições favoráveis à doença se
desenvolverem. O rendimento das lavouras de cereais, que representa 80% de todo o alimento
fornecido ao homem, pode ser reduzido em 80% durante uma única epidemia de ferrugem de
Souza, R. F. Introdução
25
caules, por exemplo. Nos Estados Unidos, a média anual em perda de dólares por todos os
tipos de doenças em plantas tem sido estimada em bilhões de dólares. Mesmo pequenas
perdas de uma lavoura podem afetar seriamente o fornecimento de alimentos em uma
população mundial em crescimento (Moore-Landecker, 1996d). Em escala global, os
fitopatógenos destroem anualmente 19% das plantas cultivadas (Drozdowicz, 1991). Alguns
fitopatogênicos são parasitas obrigatórios, outros podem sobreviver no solo ou na planta como
saprófitas, revelando sua patogenicidade quando encontram uma planta sensível ou o estado
da planta hospedeira se torna apto à infecção. As doenças fúngicas em plantas são as
principais causas de perdas na agricultura. Dados mais recentes demonstram que a perda total
causada por doenças atinge 25% em países do ocidente e 50% do rendimento dos países em
desenvolvimento, sendo que desse total, um terço é devido a doenças fúngicas (Gohel et al.,
2006).
1.2.3. Rhizoctonia solani
O gênero Rhizoctonia (De Candolle, citado por Carling & Sumner (1992)) é um grande,
diversificado e complexo grupo de fungos. Desde a sua constatação, aproximadamente 120
espécies foram registradas. Algumas características morfológicas devem ser consideradas
para o seu enquadramento ao gênero anamorfo Rhizoctonia, tais como: ramificação em ângulo
reto, próxima ao septo distal em hifas jovens; presença de um septo na ramificação da hifa
próximo do seu ponto de origem; presença de septos do tipo doliporo; ramificações de hifas
que são constritas em sua extremidade basal; ausência de grampos de conexão; ausência de
conídios; córtex e medula (não é necessária a produção de escleródios, mas se presentes, não é
diferenciado); ausência de rizomorfos; e como característica adicional, a fase teleomórfica
deve pertencer ao Filo Basidiomycota (Parmeter, Sherwood & Platt, 1969; Parmeter &
Whitney, 1970; Ogoshi, 1987; Carling & Sumner, 1992). Outros critérios adicionais têm sido
utilizados para a subdivisão do gênero Rhizoctonia, como: número de núcleos por célula,
coloração e morfologia da colônia, diâmetro da hifa e patogenicidade (Carling & Sumner,
1992) (Figuras 1 e 2).
Rhizoctonia solani, a espécie mais amplamente reconhecida do gênero, foi descrita
originalmente em 1958, por Julius Kuhn, no cultivo de batata. A espécie Rhizoctonia solani
Kühn é multinucleada e corresponde ao teleomórfo Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk,
pertence ao Reino Fungi, Filo Basidiomycota, Classe Basidiomycetes, Ordem
Souza, R. F. Introdução
26
Ceratobasidiales, Família Ceratobasidiaceae. A espécie não produz esporos de origem
assexuada (conídios) e os esporos de origem sexuada (basidiósporos) são produzidos
ocasionalmente. Na natureza, R. solani se reproduz assexuadamente e existe principalmente
na forma de micélio vegetativo e/ou escleródio. Os basidiósporos foram observados pela
primeira vez em detalhes por Prillieux e Delacroiz em 1891 (Ogoshi, 1987; Sneh, Burpee &
Ogoshi, 1991; Carling & Sumner, 1992).
O micélio vegetativo de R. solani e das outras espécies do gênero é incolor quando
jovem, tornando-se levemente amarronzado com o envelhecimento da cultura, consistindo de
hifas divididas em células individualizadas por um septo contendo um poro, que permite a
movimentação do citoplasma e de outras organelas, como o núcleo e mitocôndria de célula a
célula.
Figura 3 – Microscopia óptica (400X) de Rhizoctonia solani. As áreas em destaque
representam a ramificação das hifas em ângulo de 90
0
. (Foto de Rodrigo Fonseca de Souza).
Figura 4 – Crescimento de Rhizoctonia solani em agar batata. (Foto de Rodrigo Fonseca de
Souza).
Souza, R. F. Introdução
27
Como R. solani e as outras espécies do gênero não produzem conídios e raramente
produzem basidiosporos, a sua classificação se torna difícil. Até a década de 60, os
pesquisadores baseavam-se principalmente na morfologia observada no cultivo do fungo em
um meio de cultura e/ou na patogenicidade causada em diferentes espécies de plantas, para
classificar o gênero. Em 1969, Parmeter e colaboradores, na Universidade da Califórnia em
Berkley, reintroduziram o conceito de anastomose para caracterizar e identificar Rhizoctonia.
Este conceito baseia-se no princípio de que cada isolado de Rhizoctonia que possui a
capacidade de reconhecer e fundir as hifas entre si (anastomose) é geneticamente relacionado,
enquanto aqueles que não o fazem não são geneticamente relacionados. O grupo de
anastomose (AG) representa um grupo de isolados relacionados capazes de auto
reconhecimento através da fusão de hifas (Sneh et al., 1991 Sneh, Burpee & Ogoshi, 1991). A
fusão entre indivíduos geneticamente diferentes dentro de um grupo de anastomose produz
uma resposta de incompatibilidade somática (vegetativa) distinta a nível celular, enquanto que
as anastomoses envolvendo indivíduos geneticamente idênticos resultam em fusão perfeita.
Interações entre isolados de diferentes AGs podem também resultar em incompatibilidade
somática através do contato de hifas, mas não envolvendo fusão direta de hifas. As hifas e
isolados pertencentes ao mesmo AG são atraídos e conectados, ou fundidas, umas às outras,
enquanto que isolados de diferentes AGs não exibem esse comportamento (Ogoshi, 1987).
Segundo Matsumoto et al. (1932), Flentje & Stretton (1964), Parmeter, Sherwood & Platt
(1969), Carling, Kuninaga & Leiner (1988), MacNish , Carling & Brainard (1993) e Cubeta &
Vilgalys (1997), quatro classes de reação podem ser diferenciados em função do grau de
interação entre hifas de isolados distintos, sendo representadas por C0, C1, C2 e C3. As
interações do tipo C0 e C1 resultam em ausência de fusão ou somente contato entre os
isolados, e acontecem quando isolados de diferentes AGs são pareados. Dentro do mesmo AG
podem ocorrer interações do tipo C2 e C3. As reações do tipo C2, também chamadas de
“reação de morte” ou “anastomose imperfeita”, representam incompatibilidade somática entre
indivíduos distintos geneticamente. Neste caso ocorre fusão de parede celular e morte de
algumas células em cada hifa envolvida na fusão. Já as reações do tipo C3, também
denominadas de “anastomose perfeita”, indicam identidade genética entre isolados. Estas
reações são caracterizadas por fusão de parede e membrana celular, onde o ponto de fusão não
fica claramente visível, não ocorrendo morte de células (Figuras 3 e 4). ISG (grupo
intraespecífico) representa um subgrupo de isolados dentro de um AG, cuja fusão de hifas é
mais freqüente entre os isolados do mesmo subgrupo, ou ainda possuem outras características
Souza, R. F. Introdução
28
particulares, incluindo diferenças genéticas baseadas em marcadores moleculares. A maioria
dos ISGs são geneticamente e, frequentemente, morfologicamente distintos uns dos outros.
Figura 5 – Reações de anastomose de Rhizoctonia solani. (a) C0, sem reação, ocorrendo
quando estirpes de diferentes grupos de anastomose não demonstram atração entre as hifas.
(b) C3, anastomose perfeita, quando estirpes do mesmo grupo de anastomose se atraem e se
fundem, formando uma rede contínua de hifas. (c) C2, anastomose imperfeita, ocorre com
estirpes do mesmo grupo de anastomose, mas com compatibilidade genética diferente, se
fundem, seguindo de morte celular do compartimento da hifa fundida. As setas indicam as
regiões mortas das hifas que se fundiram (Deacon, 2005).
Figura 6 – (A) Ampliação das regiões de fusão das hifas, mostrando o crescimento da
extremidade da hifa no interior do compartimento morto da outra hifa. (B) Incompatibilidade
do micélio entre duas estirpes de Rhizoctonia solani. A zona mais clara entre as duas colônias
resulta em morte após a fusão das hifas (Deacon, 2005).
A B
Souza, R. F. Introdução
29
O fungo R. solani se caracteriza como um dos patógenos mais importantes em diversas
plantas cultivadas, sendo composto por 14 grupos de anastomose: de AG-1 a AG-13 e o AG-
BI (bridging isolate AG). Além de AG o conceito de grupos intraespecíficos (ISG) baseado
em evidências de reação de anastomose, patogenicidade, morfologia, marcadores moleculares
e testes fisiológicos, permitiu a diferenciação de 24 ISG dentre os AGs de Rhizoctonia solani
(Carling, 2000; Fenille et al., 2003; Mohammdi et al., 2003).
Atualmente, para R. solani são relatados 4 ISGs dentro do AG-1 (IA, IB, IC e ID), 8
dentro do AG-2 (2-1 I, 2-1 II, 2-1 III, 2-2 IIIB, 2-2 IV, 2-2 LP, 2-3 e 2-t), 3 dentro do AG-4
(HGI, HGII e HGIII), 2 dentro do AG-6 (HGI e GV), 5 dentro do AG-8 (ZG1 1, ZG1 2, ZG1
3, ZG1 4 e ZG1 5) e 2 dentro do AG-9 (TP e TX) (Carling, 2000; Kuninaga & Carling, 2000;
MacNish & O’Brien, 2000; Priyatmojo et al., 2001).
Esses grupos de anastomose podem ser definidos por diferentes técnicas moleculares
como hibridização DNA/DNA (Vilgalys, 1988), reação da polimerase em cadeia (PCR) da
região interna transcrita (ITS) (Liu, Domier & Sinclair 1993; Boysen et al., 1996; Kuninaga et
al., 1997) e gel de eletroforese em campo pulsado (Keijer et al., 1996) e polimorfismo do
comprimento dos fragmentos amplificados (AFLP) (Ceresini et al., 2002). Além disso, várias
outras características podem ser empregadas para agrupar isolados de R. solani em AG e ISG,
dentre estas: requerimento de vitaminas, taxa de crescimento micelial, temperatura ótima de
crescimento, tipo de escleródios produzidos e gama de hospedeiros (Sneh, Burpee & Ogoshi,
1991; Carling & Sumner, 1992).
A identificação do AG ou de ISGs de Rhizoctonia solani trouxe grandes contribuições
para o estudo da resistência genética de plantas, estudos epidemiológicos e ecológicos de
várias doenças, proporcionando um controle mais direcionado (Ogoshi, 1987). Após o
estabelecimento de AG ou de ISG de Rhizoctonia solani o alvo para o melhoramento e para o
controle eficaz tornou-se mais claro e direcionado, uma vez sabido que o patógeno causador
de determinada doença numa planta pertence a um AG ou ISG específico. Dada a
variabilidade entre espécies e AGs de Rhizoctonia solani em muitas características, como
sensibilidade a agentes químicos (Kataria, Verma & Gisi, 1991; Smiley et al., 1990) e agentes
de controle biológico (Mazzola, Wong & Cook, 1996), o sucesso no manejo da doença requer
o entendimento deste agente causal.
O gênero Rhizoctonia é um dos mais difundidos no mundo em terras cultivadas, sendo
cerca de 3% do total de trabalhos publicados na área de fitopatologia a respeito desse gênero
(Ogoshi, 1996). A identificação da maioria das espécies e os AGs de Rhizoctonia não é fácil,
pois é um fungo ecologicamente diversificado e conhecido como patógeno em muitas
Souza, R. F. Introdução
30
culturas, assim como saprófita em solo e até componente da micorriza de orquídeas (Sneh et
al., 1996).
As espécies do gênero infectam tanto plantas jovens quanto plantas adultas. Podem
infectar em qualquer estágio da planta e em qualquer órgão, principalmente aqueles em
contato com o solo. A podridão de mudas em pré-emergência pode ser confundido com má
germinação das sementes, pois o fungo infecta a radícula e o caulículo antes da germinação,
provocando redução do estande. Neste caso, ocorre também podridão das sementes,
provocando seu encharcamento e deformação, sendo isto um indicativo de que já estavam
infectadas e o tratamento foi ineficiente ou a semeadura foi realizada em solo já infestado. Em
pós-emergência, ocorre estrangulamento, encharcamento e posterior necrose do colo,
provocando o tombamento e murcha de plântulas, sendo que o fungo pode colonizar até a
parte aerea, ocasionando a morte das plantas em reboleiras no campo. Isso ocorre devido ao
plantio sucessivo no mesmo local sob condições favoráveis à ocorrência da doença, sendo que
praticamente todas as hortaliças (herbácias, folhosas, tuberosas e de frutos) são susceptíveis.
Ocorre para hortaliças em geral, principalmente para aquelas que exigem transplante para o
campo definitivo de produção (Matsuoka et al., 1985). Os basidióforos são de disseminação a
longa distância e os responsáveis por causarem doenças foliares, além de serem importantes
fontes de variação genética. Os ecleródios (agregado de micélio somático) são estruturas de
resistência e importantes como fonte de inóculo. São formados no solo ou em restos da
plantação e podem sobreviver no solo por vários anos. Tanto os basidiósporos como os
escleródios podem germinar e formar micélio ou tubo germinativo para infecção. O micélio,
além de servir para a sobrevivência e disseminação, serve também para a infecção, pois pode
rapidamente crescer e colonizar o solo, além de sobreviver por um tempo relativamente longo
no solo e em restos da plantação (Sneh et al., 1991).
Em geral, as espécies de Rhizoctonia são favorecidas por temperaturas acima de 25ºC,
alta umidade relativa do ar e do solo, solos mal drenados, irrigações excessivas (gerando
microclima), semeaduras densas (tombamento), adubação nitrogenada em excesso (os tecidos
ficam mais tenros, aumentando a probabilidade de ocorrer ferimentos), alto teor de matéria
orgânica, cultivos sucessivos no mesmo local e pH ácido. Porém, solos muito secos ou muito
encharcados são muito desfavoráveis ao patógeno. (Sneh et al., 1996).
Estes fatores são muito variáveis entre as hortaliças, principalmente em relação à
temperatura e umidade do ar e do solo. Um exemplo típico é o da cultura de ervilha, na qual a
temperatura de crescimento da cultura é de 8ºC a 35ºC, sendo 25ºC a temperatura ótima para
crescimento do fungo (Café Filho et al., 1989). As faixas de temperatura são muito amplas
Souza, R. F. Introdução
31
para as hortaliças e geralmente a temperatura ideal para o desenvolvimento da cultura é
também ideal para o patógeno, independente do grupo de anastomose ao qual este pertence.
O gênero Rhizoctonia spp. está comumente presente no solo e pode causar
consideráveis perdas a várias culturas comerciais no Brasil e no mundo. No Brasil foi relatado
em culturas como hortaliças como alface, brócolis, espinafre, tomate (Kuramae et al., 2003),
pimentão (Almeida et al., 1980; Bolkan & Ribeiro, 1985), seringueira (Campaci &
Figueiredo, 1964; Gasparato, Trindade & Lieberei, 1981; Tanaka & Coqueiro, 1981), soja
(Yorinori, 1998, Fenille, Souza & Kuramae, 2002; Fenille et al., 2003), amendoinzeiro
(Campaci & Figueiredo, 1964; Ceresini, Fenille & Souza, 1996; Kuramae et al.,2002),
feijoeiro (Ceresini, Fenille & Souza, 1996; Ceresini & Souza, 1997; Kuramae et al., 2002;
Godoy-Lutz, Steadman & Powers, 2003), eucalipto (Silveira & Alfenas, 2002), cafeeiro
(Sussel et al., 2001; Priyatmojo et al., 2001), batata (Ceresini et al., 2002; Rosa et al., 2005),
Ao redor do mundo, é causador de doença em uma ampla variedade de culturas de
importância comercial, dentre elas o arroz (Leelasuphakul, Sivanunsakul & Phongpaichit,
2006), a batata ( Brewer & Larkin, 2005) e o tomate (Lievens et al., 2006). Dessa forma,
Rhizoctonia spp. apresenta grande importância econômica para diversas culturas.
Rhizoctonia solani Kuhn AG-4 é um fitopatógeno proveniente do solo economicamente
importante e possui uma ampla variedade de hospedeiros (Anderson, 1982; Chung, Huang &
Huang, 2005). De acordo com Mendes e colaboradores (1998), R. solani é capaz de infectar
mais de 60 culturas de importância comercial no Brasil, incluindo além das culturas já citadas
acima, várias outras, como por exemplo, quiabo, cebola, alho, café, melão, pepino.
Desta forma, o controle de R. solani é de extrema importância para o desenvolvimento
bem sucedido da agricultura tanto no Brasil quanto no mundo, de forma que proporcione uma
diminuição na incidência de doenças causadas por este patógeno e aumente o rendimento das
lavouras, para suprir a necessidade cada vez maior de insumos agrícolas causado pelo
aumento crescente da população mundial.
1.3. Controle de doenças em plantas
O controle das doenças em plantas pode ser feito de várias formas. Freqüentemente, o
controle é realizado por manipulação da cultura ou proteção da planta. Os métodos incluem
controle do ambiente, medidas sanitárias, rotação de culturas e aplicação de fungicidas nas
plantas em crescimento. Os agrônomos podem controlar doenças específicas em plantas
Souza, R. F. Introdução
32
modificando determinados aspectos do ambiente, a fim de que estes sejam favoráveis ao
crescimento da planta, mas desfavoráveis para o desenvolvimento de doenças. As medidas
sanitárias incluem destruição de partes doentes da planta e esterilização de equipamentos que
podem carrear o parasita e facilitar sua dispersão. Fungicidas químicos podem ser aplicados
externamente nas plantas por pulverizadores ou aplicações do pó diretamente nas lesões. Estes
fungicidas matam por inibição da síntese de quitina ou por causar distúrbios no plasmalema,
respiração, metabolismo de esterol, divisão nuclear ou síntese de DNA, RNA e proteínas. Um
único fungicida pode prejudicar uma ou várias destas funções. A utilização de pesticidas
químicos é o método mais empregado pelos agrônomos no controle de pragas em suas
plantações. Estes apresentam vantagens sobre os outros métodos por serem rápidos e de fácil
aplicação. Porém, o uso indiscriminado traz sérios problemas para o meio ambiente e
inclusive para o próprio homem, pois são altamente tóxicos. Estes agrotóxicos podem
infiltrar-se em lençóis d’água como também permanecerem nos alimentos que serão
consumidos pela população (Moore-Landecker, 1996c).
Todas as medidas já citadas são dispendiosas e freqüentemente ineficazes,
especialmente no controle de epidemias. O método ideal de controle, então, seria cultivar
plantas que sejam imunes aos parasitas e que não se tornem doentes. Entretanto, o
desenvolvimento de variedades imunes é bastante complexo porque existe um grande número
de variedades fisiológicas, estirpes e biotipos de fungos, diferindo na sua patogenicidade. O
aparecimento de novas formas de fungos fitopatogênicos significa que novas linhagens
genéticas de culturas vegetais deverão ser introduzidas. Além disso, os fungos podem sofrer
alterações genéticas para infectar uma planta hospedeira outrora resistente, como também
podem sofrer alterações e se tornarem resistentes aos fungicidas atualmente utilizados
(Moore-Landecker, 1996c).
O controle biológico, então, seria uma estratégia alternativa para todos os métodos já
citados, envolvendo a repressão de uma praga através de seus inimigos naturais. Existem
muitas vantagens em se utilizar este método. Os organismos utilizados não são poluentes e
são ambientalmente seguros. Normalmente são hospedeiro alvo-específicos, afetando somente
o hospedeiro. O uso de controle biológico minimiza o uso de agrotóxicos estendendo a sua
vida útil, pois com o emprego de um agente biocontrolador o aparecimento de pragas
resistentes é mais lento. A demanda para o controle biológico de pragas usando seus inimigos
naturais tem aumentado no Brasil em resposta à tendência mundial de produção agrícola
usando métodos menos agressivos ao meio ambiente. O controle biológico tem sido usado
com sucesso em diferentes partes do mundo, envolvendo predadores, parasitos, patógenos e
Souza, R. F. Introdução
33
antagonistas, visando controlar pragas que afetam a produção agrícola
(http://cipm.ncsu.edu/ent/biocontrol/). Formulações contendo microrganismos já vem sendo
comercialmente utilizadas nos Estados Unidos como controladores biológicos por mais de
quarenta anos. Como exemplo, podemos citar um produto chamado “Collego”,
comercializado pela Encore Technologies nos Estados Unidos. Este produto é composto por
esporos vivos do fungo fitopatogênico Colletotrichum gloeosporioides f. sp. Aeschynomente,
e é utilizado no controle da erva daninha “northern joinvetch” em culturas de arroz e soja
(www.encoretechllc.com). Um outro exemplo é o produto “InterceptWG”, produzido pela
mesma empresa, que é utilizado no controle de Sclerotiorum e Sclerotinia minor em diversas
culturas, incluindo girassol, canola e batata. Este produto é composto por esporos de
Coniothyrium minitans, um fungo parasita natural destes fungos citados acima (Figura 5).
Figura 7 – Produtos comercializados pela Encore Technologies para utilização no controle
biológico.
Souza, R. F. Introdução
34
Entretanto, comparado com os pesticidas químicos, o sucesso dos agentes
biocontroladores tem sido limitado pela sua habilidade em controlar apenas uma ou poucas
espécies e pela sua ação lenta. Cientistas estão se esforçando cada vez mais no sentido de
desenvolverem agentes biocontroladores mais eficazes e comercialmente competitivos. Novas
linhagens genéticas têm sido desenvolvidas, utilizando técnicas modernas tais como
recombinação de DNA ou fusão de protoplastos. Os fungos, bem como as bactérias, são
potencialmente úteis como agentes biocontroladores de insetos, nematóides e outros fungos
fitopatogênicos (Moore-Landecker, 1996c). Como os principais componentes da parede dos
fungos são quitina, glucana e proteína, as enzimas hidrolíticas desempenham um papel
importante na atividade inibitória dos fungos fitopatogênicos. Logo, o sinergismo destas
enzimas não só entre si como também com outros compostos sintetizados pelos
microrganismos, aumentam sensivelmente a ação lítica dessas hidrolases, até mesmo em
casos onde apenas uma única enzima possui pouco ou nenhum efeito na atividade antifúngica.
Tais compostos, também chamados de MACs (cell membrane-affecting compounds),
normalmente são antibióticos que auxiliam a atividade inibitória das enzimas hidrolíticas.
Alguns antibióticos, por exemplo, inibem enzimas envolvidas na síntese da parede celular,
impedindo que a parede seja recomposta após a ação dessas enzimas (Kubiec et al., 2001). As
glucanases e quitinases agem sinergisticamente no processo de inibição do crescimento de
fungos, tanto in vitro quanto na planta (Selitrennikoff, 2001).
O controle das doenças causadas por Rhizoctonia é difícil. Os solos de plantio devem
possuir um sistema de drenagem adequado, evitando assim a retenção excessiva de água, uma
condição bastante favorável para o desenvolvimento do patógeno. As sementes devem ser
livres do patógeno, e conseqüentemente de doenças causadas por este, e serem plantadas em
condições que favoreçam o crescimento rápido das mudas. O espaçamento entre as mudas
durante o plantio deve ser o suficiente para permitir uma boa aeração. Sempre que possível,
como por exemplo, no caso de estufas, o solo deve ser esterilizado com vapor ou pelo
tratamento com fungicidas. O pentacloronitrobenzeno (PCNB) pode ser utilizado no
tratamento de tombamento causado em sementeiras e estufas. Embora, para a maioria das
hortaliças, os fungicidas utilizados não sejam eficientes no controle, clorotalonil, metil-
tiofnato, iprodione, dentre outros, são recomendados algumas vezes na forma de spray, sendo
aplicados no solo antes do plantio e uma ou duas vezes logo após a emergência das mudas.
Um outro produto bastante utilizado é o Monceren PM
®
- Bayer, que pode ser aplicado para o
controle do tombamento e rhizoctoniose em culturas de alface, algodão, beterraba, café,
Souza, R. F. Introdução
35
cenoura, feijão, repolho e tomate (http://www.bayercropscience.com.br/PRD/busca/prd.asp).
Entretanto, este produto, bem como todos os outros fungicidas são altamente tóxicos e
poluentes para o meio ambiente, sendo na sua aplicação recomendada a utilização de vários
equipamentos de proteção individual, bem como vários cuidados no manuseio do produto
(Agrios, 1997).
Muito esforço tem sido feito para se desenvolver alternativas mais eficientes no controle
das doenças causadas por Rhizoctonia (Agrios, 1997). Uma dessas alternativas inclui a
solarização do solo, que consiste na cobertura do solo úmido com um plástico transparente
durante os meses mais quentes do ano, resultando no aquecimento da camada superficial e
conseqüente eliminação ou inibição dos patógenos (Patrício et al., 2006). Uma alternativa
seria a utilização do controle biológico, visto que Rhizoctonia é parasitada no solo por vários
microrganismos tais como fungos e bactérias, e ainda por nematóides. Entretanto, o controle
biológico ainda está em fase de experimento e ainda não está disponível para utilização pelos
agricultores (Agrios, 1997). Atualmente não existem produtos registrados e aprovados para o
controle biológico das doenças causadas por Rhizoctonia solani em tomateiro. Além disso,
dentre os produtos registrados no Brasil até o presente momento só encontramos
bioinseticidas, sendo a maioria composta por Bacillus thuringiensis. Desta forma, o estudo e
desenvolvimento de agentes de biocontrole, bem como a sua formulação são de extrema
importância para o desenvolvimento da agricultura do país, suprindo as necessidades e
minimizando assim a utilização de agrotóxicos cada vez mais crescente, conforme pode ser
observado na tabela a seguir (www.agricultura.gov.br; Chang, Chen & Jao, 2006).
Souza, R. F. Introdução
36
Ano
Acaricidas Inseticidas Fungicidas Herbicidas
Outros
defensivos Total
1992
64.360
194.594
144.827
515.714
27.914
947.409
1993
73.816
195.894
166.384
588.384
25.120
1.049.811
1994
90.826
300.246
211.080
775.762
26.133
1.404.047
1995
99.660
339.028
227.021
834.976
34.963
1.535.648
1996
92.237
375.548
276.331
1.005.112
43.443
1.792.671
1997
86.714
464.796
356.304
1.214.818
58.159
2.180.791
1998
105.619
581.693
436.235
1.368.723
65.579
2.557.849
1999
78.726
596.051
422.476
1.175.933
55.881
2.329.067
2000
65.560
689.953
380.418
1.300.515
63.512
2.499.958
2001
66.326
630.773
362.606
1.143.089
84.688
2.287.482
2002
72.107
467.849
360.394
987.554
63.878
1.951.782
2003
80.026
725.222
713.544
1.523.735
93.815
3.136.342
2004
77.963
1.066.600
1.388.177
1.830.732
131.476
4.494.948
Tabela 1 - Vendas de defensivos (x mil US$) agrícolas no Brasil, no período de 1992
a 2004. Fonte: www.sindag.org.br
1.4. Quitina
A quitina, um polímero formado por unidades de N-acetilglucosamina ligados por
ligações β-1,4, é um dos principais componentes da parede celular dos fungos, onde
corresponde a cerca de 22 a 40%, mas também pode ser encontrado em alguns invertebrados,
tais como crustáceos, aracnídeos, insetos, alguns protistas e em ovos de nematódeos. É
estimado que 10 gigatoneladas de quitina são produzidas anualmente, sendo mais de 80000
toneladas cúbicas obtidas de resíduos marinhos de crustáceos, tornando-se o polímero mais
abundante na natureza depois da celulose (Patil, Ghormade & Deshpande, 2000; Schrempf,
2001; Merzendorf & Zimoch, 2003; Kasprzewska, 2003; Gohel et al., 2006).
A cadeia de quitina possui tamanhos bastante variáveis, podendo ser diferentes entre
espécies e dentro da mesma espécie. Estas cadeias ou microfibrilas são interligadas através de
Souza, R. F. Introdução
37
fortes ligações, constituídas por pontes de hidrogênio, entre o grupamento amina de uma
cadeia e o grupamento acetil da cadeia adjacente, formando uma estrutura polimórfica. Esta
estrutura varia na sua forma de empacotamento, podendo ser arranjada de três formas: α-
quitina, β-quitina e γ-quitina. A α-quitina consiste de fibras adjacentes arranjadas
antiparalelamente e é encontrada na cutícula de artrópodes, na rádula de moluscos, em ovos
de nematelmintos e em rotíferos. A β-quitina consiste de cadeias adjacentes são paralelas e é
encontrada nas conchas de braquiopodos e de moluscos, no esqueleto de chocos, na concha
interna da lula e em diatomáceas marinhas. Existe ainda um terceiro tipo de fibra encontrada
em outros organismos marinhos, chamada de γ–quitina, no qual duas cadeias adjacentes são
paralelas e a terceira, antiparalela. Todas as formas são geralmente hidrofóbicas e insolúveis
na maioria dos solventes, exceto a β-quitina encontrada nas diatomáceas (Pangburn, Trescony
& Herller, 1984; Gooday, 1989; Schrempf, 2001; Merzendorf & Zimoch, 2003).
1.5. Quitinases
Segundo o “Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and
Molecular Biology” (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/), a hidrólise enzimática da
quitina a seus constituintes monoméricos é realizada por um sistema constituído por dois tipos
de atividade quitinolitica: a atividade de endoquitinase, que cliva aleatoriamente o polímero,
liberando oligômeros de diferentes tamanhos (Quitinase, EC 3.2.1.14) e exoquitinase, que
cliva os terminais não-redutores, liberando unidades de N-acetilglucosamina (β-N-
acetylhexosaminidase, EC 3.2.1.52) (Kubiec et al, 2001; Gohel et al., 2006).
Alguns autores ainda consideram uma outra classificação, na qual engloba 4 tipos de
quitinase: uma endoquitinase, semelhante a descrita acima; uma exoquitinase, que cliva a
partir dos terminais não redutores, liberando dímeros de N-acetilglucosamina; uma quitobiase,
que cliva estes dímeros de N-acetilglucosamina; e uma N-acetilglucosaminidase, que cliva a
partir dos terminais não redutores, liberando unidades de N-acetilglucosamina (Harman et al.,
1993; Ulhoa & Peberdy, 1993; Wang et al., 2001; Matsumoto et al., 2004). As exoquitinases
e quitobiases foram excluídas na nomenclatura internacional, sendo inseridas na classe EC
3.2.1.52. Embora esta classificação tenha sido utilizada por muitos anos, não tem sido
considerada satisfatória para o entendimento do mecanismo de ação dessas enzimas.
Estudos com base na similaridade da seqüência de aminoácidos de quitinases
produzidas por vários organismos foram realizados, sendo proposto assim cinco classes de
Souza, R. F. Introdução
38
quitinases. Essas classes podem ser agrupadas em três famílias de glicosil hidrolases, famílias
18, 19 e 20. Tanto a família 18 quanto a 19 compreendem endoquitinases de diferentes
organismos, tais como vírus, bactérias, fungos, insetos e plantas, sendo a família 19
constituída principalmente de quitinases de plantas das classes I, II e IV. Essas quitinases
possuem domínio amino-terminal rico em cisteína, peptídeo sinal rico em valina ou leucina e
localização em vacúolos. A classe III constitui quitinases de origem vegetal e fúngica, e não
possuem nenhuma estrutura relacionada com a família 19, e junto com a classe V formam a
família 18. A classe IV, encontrada principalmente em dicotiledônias, compreende quitinases
extracelulares com 41 – 47% de semelhança na seqüência do domínio catalítico com as da
classe I, e também possuem regiões semelhantes a domínios de ligação a quitina. Entretanto,
as quitinases desta classe são menores devido a deleções nestes dois domínios. Na classe V
são encontradas quitinases bacterianas, embora duas proteínas com atividade de
endoquitinase, semelhantes as quitinases bacterianas, tenham sido isoladas de tabaco e
incluídas nesta classe (Cohen-Kupiec & Chet, 1998). Patil, Ghormade & Deshpande (2000)
descrevem seis classes distintas na família 19. As quitinases da família 18 são variáveis no
tamanho e algumas possuem estruturas com multidomínios. Nesta família são encontradas
endo-β-N-acetilglucosaminidases, como a descrita por Henrissat & Bairoch (1993). Além
disso, também são encontradas nesta família quitobiases de eucariotos. As classes da família
19 possuem as mesmas características citadas acima, porém ressaltando-se que a classe I
possui atividade de endoquitinase e a classe II atividade de exoquitinase. As classes V e VI
incluem apenas alguns exemplos, como o precursor da lectina da urtiga, que possui dois
domínios de ligação a quitina em seqüência. A família 20 é relativamente pequena e contém
quitobiases bacterianas e hexosaminidases de eucaritotos. As quitobiases bacterianas são
bastante conservadas com 42% a 54% de identidade na seqüência total (Perrakis et al., 1996;
Patil, Ghormade & Deshpande, 2000).
A capacidade em degradar quitina é mais amplamente distribuída entre organismos
eucariotos e procariotos do que a habilidade de sintetizá-la, ou seja, organismos que não
contém quitina podem produzir quitinase para degradar o polímero como alimento. Nos
organismos que possuem quitina, essas enzimas estão freqüentemente envolvidas com a
morfogênese, como também no crescimento e divisão celular de hifas fúngicas ou movimento
em artrópodes (Hearn et al, 1997; Mulisch, 1993).
De uma forma geral, todos os organismos que possuem quitina também possuem
quitinases (Roberts & Selitrennikoff, 1988). Fungos filamentosos que possuem a quitina
como um dos principais componentes da parede celular produzem quitinases em todos os
Souza, R. F. Introdução
39
estágios ativos de desenvolvimento, como também durante a germinação de esporos e
crescimento exponencial e micelial, proporcionando maleabilidade das extremidades apicais
das hifas, e assim, permitindo o crescimento do fungo (Gooday, Zhu & O’Donnell, 1992;
Souza et al., 2003). Além disso, a quitinase de fungos também pode estar envolvida na
penetração em um hospedeiro por micoparasitas ou fungos entomopatogênicos (Flach, Pilet &
Jolles, 1992).
As plantas também possuem quitinases, que são sintetizadas geralmente por indução,
após um “stress” qualquer, ou por infecção por microrganismos que possuam quitina em sua
parede celular. Como não possuem quitina em sua parede celular, supõe-se que produzam
quitinase como defesa contra parasitos que contém quitina (fungos e insetos), indicando
fortemente sua participação nos mecanismos de defesa dos vegetais (Bokma et al., 2000;
Taira, Toma & Ishihara, 2005; Zhao et al., 2005a; Zhao et al., 2005b; Gohel et al., 2006).
Entretanto, algumas destas quitinases não possuem atividade inibitória de fungos comprovada
por teste “in vitro”, levando ao questionamento então de qual seriam as outras funções dessas
quitinases em plantas. Os vegetais superiores sintetizam 7 classes diferentes de quitinases,
diferindo na estrutura protéica, especificidade por substrato, mecanismo de catálise e na
sensibilidade a inibidores, sugerindo, devido a esta grande diversidade, a participação destas
enzimas em outras funções. As quitinases participam do crescimento e desenvolvimento da
planta, como por exemplo, nos processo de nodulação, podendo ser encontradas em todos os
órgãos e tecidos do vegetal.
Além disso, algumas quitinases são produzidas constitutivamente em plantas
consideradas saudáveis, reforçando mais uma vez outras funções dessas enzimas nos vegetais.
Estas quitinases podem regular o crescimento e desenvolvimento do vegetal gerando ou
degradando moléculas sinalizadoras, o que acontece, por exemplo, durante o processo de
nodulação, onde lipo-quitooligossacarídeos (Nod factors) são degradados por elas. Quando as
raízes de uma planta são infectadas por uma bactéria específica, as quitinases degradam e
inativam uma parte dos quitooligossacarídeos, reprimindo, portanto a intensidade de
nodulação. Quando a bactéria que infecta a raiz não é compatível com a planta, os
quitooligossacarídeos produzidos por elas são reconhecidos como fatores elicitores, ativando
os mecanismos de defesa da planta. Entretanto, quando o fungo que infecta a planta é
compatível, esses quitooligossacarídeos são hidrolisados pelas quitinases, e os mecanismos de
defesa da planta são reduzidos. Se o fungo não for simbionte, esses elicitores não são
clivados, ligam-se a receptores na membrana das células e ativam uma resposta
hipersensitiva. As quitinases também participam da morte programada das células, provado
Souza, R. F. Introdução
40
pela ativação prévia de genes relacionados à produção de quitinases nas células de Daucus
carota que entraram em apoptose. O papel das quitinases nos mecanismos de defesa da planta
é bem conhecido, mas nos processos de crescimento da planta ainda requer um estudo mais
detalhado (Kasprzewska, 2003).
As quitinases produzidas por insetos pertencem a família 18 e desempenham um papel
crucial no desenvolvimento pós-embrionário, especialmente durante a muda das larvas e na
formação da pupa. As quitinases também já foram encontradas em veneno de insetos
pertencentes à ordem hymenoptera e nos fluídos digestivos de aranhas, facilitando a entrada
de substâncias nocivas através da cutícula da presa (Merzendorfer & Zimoch, 2003). Schlein,
Jacobson e Shlomai (1991) observaram ainda que as quitinases secretadas por Leishmania
major são importantes para a evasão da membrana peritrófica e estabelecimento do parasita
no intestino médio do vetor. Trichomonas vaginalis produz quitinases para transpor, na fase
inicial da infecção, a barreira de mucina, rica em polímeros de N-acetilglucosamina (Loiseau,
Bories & Sanon, 2002). Huber, Cabib & Miller (1991) também observaram a produção de
quitinases pelo parasita da malária durante a ingestão pelo mosquito. Radwan e colaboradores
(1994) observaram que as quitinases também podiam exercer um papel de protease na própria
hidrólise, atuando assim como moduladores. Observou-se ainda que as quitinases em plantas
podem desempenhar atividade de lisozima (De La Cruz et al., 1992).
A atividade de quitinase tem sido observada em vários microrganismos, dentre eles os
fungos, principalmente os do gênero Trichoderma (De La Cruz et al., 1992). Nas bactérias, a
atividade de quitinase também tem sido bastante observada (Inbar & Chet, 1991; Tweddel,
Jabaji-Hare & Charest, 1994; Chernin et al., 1995). Muitos desses microrganismos têm se
mostrado agentes potenciais no biocontrole de doenças em plantas causadas por vários fungos
fitopatogênicos. Gupta e colaboradores (1995) sugeriram que a atividade quitinolítica de
Streptomyces viridificans está envolvida na atividade antagonista deste microrganismo frente
a alguns fungos fitopatogênicos, visto que tanto a enzima pura quanto o extrato bruto
apresentaram uma boa degradação da parede celular destes fungos. Chernin e colaboradores
(1995) também demonstraram a atividade quitinolítica em Enterobacter agglomerans,
antagonista a fungos fitopatogênicos e Lorito e colaboradores (1993) detectaram atividade
antifúngica em quitinases produzidas por Trichoderma harzianum. Mais recentemente, Hoster
e colaboradores (2005) demonstraram que quitinases produzidas por espécies de Bacillus e de
Streptomyces apresentavam atividade antifúngica contra diferentes espécies de fungos.
Várias quitinases vêm sendo estudadas, utilizando-se diferentes métodos de purificação
e caracterização. Dentre os métodos de purificação utilizados estão envolvidos as
Souza, R. F. Introdução
41
cromatografias de afinidade, filtração em gel e troca iônica (Wen et al., 2002; Tikhonov et al.,
2002), e precipitação com sulfato de amônio (Park et al., 2002). Os processos de
caracterização, utilizados para quitinases produzidas por diferentes microrganismos, dentre
eles bactérias e fungos, e vegetais, envolvem verificação dos ótimos de temperatura e pH,
estabilidade, determinação da massa molecular, seqüênciamento e efeito de íons metais,
dentre outros. Tais processos são importantes para se avaliar o emprego dessas enzimas na
biotecnologia (Gomes et al., 2001; Wang, Hsiao & Chang, 2002; Souza et al., 2003).
1.6.
β
ββ
β
-1,3–glucanas
As β-glucanas são polímeros de D-glicose unidos por ligações na configuração β, e
formam a classe de polissacarídeos mais abundante na natureza. Algumas são moléculas
relativamente simples consistindo de cadeias lineares de resíduos glicosil unidos por ligações
glicosídicas, outras são mais complexas e podem ser constituídas por vários tipos de ligações
nas cadeias lineares e/ou ramificações. Estes polissacarídeos são classificados de acordo com
sua configuração e os tipos de ligações predominantes (Pitson, Seviour & McDougall, 1993).
As β-glucanas são o principal componente da parede celular dos fungos, exercendo
função na biologia do fungo de forma variável, e isso dependerá do tamanho, estrutura,
propriedades físico-químicas e principalmente a sua localização. Na parece celular, atuam na
rigidez e proteção, constituindo os polímeros estruturais da célula e protegendo contra a
desidratação. Como fonte de nutrientes, este polímero atua nas modificações que ocorrem na
parede celular durante a morfogênese ou em caso de exaustão de nutrientes (Pitson, Seviour &
McDougall, 1993). Além disso, as β-glucanas são responsáveis pela atividade antitumoral e
anti-diabética detectadas em vários estudos com animais (Shu, Xu & Lin, 2006).
1.7.
β
ββ
β
-1,3-glucanases
A produção de enzimas que degradam β-glucanas é uma característica atribuída a uma
ampla variedade de organismos, incluindo bactérias e fungos (Pitson, Seviour & McDougall,
1993). Os fungos são os mais estudados quanto a produção destas enzimas, principalmente
das β-1,3-glucanases. Essas enzimas podem ser classificadas de acordo com os produtos de
hidrólise liberados da molécula de β-1,3-glucana. As exo-β-1,3 glucanases (EC 3.2.1.58)
hidrolisam a cadeia de β-1,3-glucanas pela clivagem seqüencial de resíduos de glicose a partir
Souza, R. F. Introdução
42
da extremidade não redutora, tendo conseqüentemente, monômero como produto de hidrólise.
As endo−β-1,3 glucanases (EC 3.2.1.39) clivam aleatoriamente a cadeia do polissacarídeo,
liberando oligossacarídeos menores.
As β-1,3-glucanases, produzidas por muitos fungos e bactérias são uma das enzimas
mais potentes na degradação da parede celular dos fungos (Leelasuphakul, Sivanunsakul &
Phongpaichit, 2006). Vários microrganismos são capazes de produzir β-1,3-glucanases, dentre
eles encontramos principalmente os fungos, além das bactérias (Martin et al., 2006; Noronha
et al., 2000; Bara, Lima & Ulhoa, 2003; Monteiro & Ulhoa, 2006). Entretanto, são poucos os
relatos de produção de β-1,3-glucanases por actinomicetos (Valois et al., 1996; El-Tarabily et
al., 2000).
A parede celular dos fungos serve de barreira às ações exercidas pelos microrganismos
antagonistas. A quitina e β-glucanas, os principais componentes da parede celular dos fungos,
estão embebidas na matriz de material amorfo, onde a primeira parece estar protegida pela
segunda, dificultando o acesso das quitinases (Selitrennikoff, 2001). Desta forma, é provável
que a atuação de quitinases seja precedida ou mesmo coincida com a atuação de β-1,3-
glucanases, e por isso estas enzimas extracelulares têm sido consideradas como as principais
hidrolases envolvidas no processo de micoparasitismo, um dos mecanismos envolvidos no
controle biológico.
1.8. Proteases
As proteases são uma classe única de enzimas degradativas que catalisam a hidrólise
total das proteínas através da quebra de ligações peptídicas. Elas executam uma grande
variedade de funções fisiológicas complexas (Rao et al., 1998). Devido à sua ocorrência em
todas as formas de vida, as proteases são importantes na condução de funções metabólicas e
regulatórias, e apresentam um papel crítico em muitos processos fisiopatológicos tendo
inclusive sido cogitadas como fatores de virulência numa variedade de doenças causadas por
microrganismos patogênicos (Brown, 1994; Sakata et al., 1993; Schaller et al., 2005). Em
contraste com a grande quantidade de trabalhos descritos na literatura referente às proteases,
os conhecimentos sobre os mecanismos pelos quais elas executam essas funções são muito
limitados.
As proteases podem ser classificadas quanto às condições hidrogeniônicas ótimas para
sua ação (ácidas, neutras e alcalinas), quanto à especificidade ao substrato (
colagenase,
elastase, etc) ou quanto à similaridade com proteases bem caracterizadas (pepsina, tripsina,
Souza, R. F. Introdução
43
catepsina, etc) (North, 1982). O sistema de classificação mais funcional baseia-se na
comparação de sítios ativos, de mecanismos de ação e da estrutura tridimensional. Até o
momento, seis classes são conhecidas pela “International Union of Biochemistry and
Molecular Biology” (http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/): serina protease, cisteína
protease, aspártico protease, glutâmico protease, metaloprotease e treonina protease.
Considerando a relação estrutural e a função das proteases, uma classificação mais minuciosa
incluindo 84 famílias de proteases foi proposta recentemente (Rawlings & Barret, 1993).
Essas classes são ainda subdivididas em clãs para acomodar grupos de proteases que
divergem de um ancestral comum (Priest, 1997).
São grosseiramente subdivididas em dois principais grupos dependendo do seu sítio de
ação: as exoproteases clivam a ligação peptídica próxima ao terminal amino ou carboxi das
cadeias peptídicas presentes no substrato. Baseado no seu sítio ativo de ação no terminal N ou
C, elas são ainda classificadas como amino e carboxiproteases, respectivamente. As
aminoproteases ocorrem em uma ampla variedade de espécies microbianas incuindo bactérias
e fungos (Morihara & Tsuzuki, 1971). Em geral, são enzimas intracelulares. As
carboxiproteases atuam no C terminal da cadeia polipeptídica e liberam um aminoácido
simples ou dipeptídico, e podem ser divididas em 3 grupos maiores, de acordo com a natureza
do seu sítio catalítico: serina carboxiproteases (EC 3.4.16), metalocarboxiproteases (EC
3.4.17) e cisteína carboxiproteases (EC 3.4.18). As endoproteases clivam ligações peptídicas
nas regiões interiores da cadeia polipeptídica distante do terminal do N e C (Rao et al., 1998).
Baseado no grupo funcional presente no sítio ativo, as endoproteases são classificadas em 4
grupos: serina proteases (EC 3.4.21), cisteína proteases (EC 3.4.24), aspártico proteases (EC
3.4.23) e metaloproteases (EC 3.4.24) (http://merops.sanger.ac.uk/;
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/).
Muitos fungos produzem proteases capazes de hidrolisar proteínas nativas, como a
proteinase A de Aspergillus niger e as proteinases A1, A2 e B de Scytalidium lignicolum. As
metaloproteinases produzidas por fungos apresentam zinco como parte de sua estrutura
(Markaryan et al.,1994). Fungos produzem também serinoproteases, como a proteinase K de
Tritirachium álbum (Ebeling et al., 1975) e a queratinase de A. fumigatus (Santos et al.,1996).
Por outro lado, a ocorrência de cisteinoproteases em fungo é bastante limitada.
Os estreptomicetos produzem uma grande variedade de proteases extracelulares (Aretz,
Kolle e Riess, 1989), incluindo serina, metalo, endoproteases, amino e carboxiproteases
(Petinate et al., 1999; De Azeredo et al., 2003; Nascimento et al., 2005; De Azeredo et al.,
2006).
Souza, R. F. Introdução
44
A parede celular de fungos filamentosos contém também proteínas, além de quitina e
glucanas. Estas proteínas são encontradas em todas as camadas da parede celular, porém
formam uma camada protetora mais externa revestindo toda a parede celular (Hunsley &
Burnett, 1970; Selitrennikoff, 2001). Sendo assim, as proteases desempenham um papel
importante no processo de degradação da parede celular fúngica. Entretanto, pouca atenção
tem sido dada às proteases dentro do contexto de controle biológico. Assim como as
proteases secretadas por bactérias e fungos oportunistas ou patogênicos medeiam no
hospedeiro uma série de processos patológicos (Maeda & Yamoto, 1996), inclusive o
crescimento de hifas através de proteínas fibrilares como colágeno e elastina (Reichard,
1998), as proteases de microrganismos antagônicos apresentam, possivelmente, funções bem
definidas nos processos de antagonismo, principalmente contra fungos.
Souza, R. F. Introdução
45
2. OBJETIVOS
O presente trabalho, elaborado no laboratório de Biotecnologia dos Actinomicetos do
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, se
iniciou a partir do isolamento de actinomicetos quitinolíticos de solos brasileiros. Tendo se
estudado estes microrganismos em experimentos prévios, e estes apresentado atividade contra
alguns fungos fitopatogênicos, tornou-se de grande interesse aprofundar os estudos com vista
a uma possível aplicação biotecnológica, baseada na ação de enzimas hidrolíticas sobre a
parede celular desses fungos.
Dessa forma, os principais objetivos deste trabalho foram: selecionar actinomicetos
promissores no controle biológico, realizar um estudo bioquímico mais detalhado do
mecanismo de inibição do crescimento de R. solani por um dos actinomicetos selecionados
pelo, estabelecer o controle biológico deste fitopatógeno e identificar taxonomicamente o
agente biocontrolador. Os objetivos específicos estão descritos nos itens abaixo.
• Selecionar actinomicetos com capacidade inibitória do crescimento de fungos
fitopatogênicos.
• Detectar e quantificar as atividades de endoquitinase e exoquitinase destes
actinomicetos.
• Avaliar a atividade de endoquitinase e exoquitinase dos actinomicetos com atividade
inibitória do crescimento de R. solani.
• Analisar a interação entre o Streptomyces sp. RCQ 1071 e R. solani.
• Detectar polipeptídeos relacionados com a interação entre R. solani e Streptomyces sp.
RCQ 1071.
• Purificar e caracterizar o polipeptídeo responsável pela interação entre R. solani e
Streptomyces sp. RCQ 1071.
• Detectar e caracterizar a atividade das enzimas hidrolíticas β-1,3-glucanase,
exoquitinase e protease do Streptomyces sp. RCQ 1071.
• Purificar a exoquitinase produzida pelo Streptomyces sp. RCQ 1071.
• Identificar taxonomicamente o Streptomyces sp. RCQ 1071.
• Avaliar o efeito biocontrolador do Streptomyces sp. RCQ 1071 sobre R. solani.
• Determinar uma formulação para utilização destes microrganismos no bicontrole de R.
solani.
Souza, R. F. Materiais e Métodos
46
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Obtenção e manutenção das estirpes
As estirpes de actinomicetos utilizadas (68, 70, 80, Q11, S5, Streptomyces sp.
RCQ1071, 208, Streptomyces drosdowicii, M10, 103, Q16, M08, 218) foram previamente
isoladas do solo e fazem parte da coleção de culturas do laboratório de Biotecnologia dos
Actinomicetos do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes – UFRJ. Todas as estirpes,
com exceção da S5, foram previamente identificadas com pertencentes ao gênero
Streptomyces (Semêdo et al., 2001). As estirpes de fungos fitopatogênicos Fusarium solani,
Fusarium graminearium, Fusarium sp., Aspergillus parasiticcus, Fusarium oxysporum,
Aspergillus niger foram cedidas gentilmente pela Micoteca localizada no Instituto Oswaldo
Cruz e Rhizoctonia solani pelo pesquisador Pedro Valarini da Embrapa Meio Ambiente
(Jaguariúna – SP). Os actinomicetos foram mantidos na forma de suspensão de esporos em
glicerol 20% a -4
0
C, obtidas conforme o esquema 1, e crescidas em placas de agar extrato de
malte-extrato de levedura (YMA) (Shirling & Gotilieb, 1966), contendo em g/L: extrato de
levedura 4, extrato de malte 10, glicose 4 e agar 13. Os fungos foram mantidos em água
destiladas, conforme o método de Castelani (Bueno, Ambrósio & Souza, 2006), e quando
necessário, repicados em placas de agar batata dextrosado (PDA).
Souza, R. F. Materiais e Métodos
47
Esquema 1 – Procedimento para obtenção da suspensão de esporos
Determinar a concentração de esporos
através do plaqueamento das várias
diluições em meio de ágar Extrato de Malte-
Extrato de Levedura (28
0
C / 21 dias),
seguido de contagem das colônias
Centrifugar e desprezar o sobrenadante
Inocular o microrganismo em 50 placas de Petri contendo meio de ágar extrato de malte-
extrato de levedura (Shirling & Gottlieb, 1966) e incubar à 28 °C por 15 - 20 dias
(formação do micélio aéreo)
Lavar as placas com 5 mL solução salina 0,85% (formação da suspensão de esporos)
Retirar os 5 mL de suspensão e passar em filtro contendo lã de vidro previamente esterilizado por autoclavação,
transferindo o filtrado para Tubos de Falcon (Separação dos esporos do micélio)
Centrifugar (3.000 rpm/20 min)
Desprezar o sobrenadante e ressuspender o "pellet" formado (esporos) em 5 mL de solução salina 0,85%
Retirar 1 mL e diluir em 9 mL de salina
0,85%, repetindo-se este procedimento
até perfazer 9 diluições (10
-9
)
Ressuspender o "pellet" formado em 4 mL
solução glicerol 20% e estocar a-4
0
C
Souza, R. F. Materiais e Métodos
48
3.2. Determinação do grupo de anastomose da estirpe de Rhizoctonia solani
A determinação do grupo de anstomose foi realizada em colaboração com o laboratório
do Prof. Nilton Luiz de Souza, na Universidade Federal de Viçosa.
3.2.1. Isolamento do DNA genômico
A massa micelial da Rhizoctonia solani foi obtida pelo cultivo em meio líquido de
batata (200g), sacarose (29g) e peptona (10g), por 10 dias a 28 ºC no escuro. O micélio foi
coletado por filtração a vácuo, lavado três vezes com água destilada estéril sendo então,
macerado com nitrogênio líquido até a formação de pó fino. A extração do DNA genômico
seguiu o protocolo descrito por Kuramae-Izioka (1997). O micélio após a maceração foi
ressuspendido em 700 µL de tampão de extração (100mM Tris, pH 8,0; 50mM EDTA, pH
8,0; 500mM NaCl; 20% dodecil sulfato de sódio). O homogeneizado foi agitado em vortex e
incubado por 30 minutos a 65 ºC, em banho-maria, sob agitação. Em seguida, adicionou-se
500 µL de acetato de potássio 5M à amostra, que foi colocada em banho de gelo por 30
minutos, sendo realizada a inversão a cada 5 minutos. Em seguida, a amostra foi centrifugada
por 10 minutos a 17.000g. O sobrenadante foi extraído com um volume de clorofórmio:
álcool isoamílico (24:1) seguido de agitação e centrifugação por 10 minutos a 17.000g.
O sobrenadante foi transferido para novo tubo e foi adicionado um volume de
isopropanol para precipitação do DNA, sendo realizada nova centrifugação por 10 minutos a
17.000g. O DNA precipitado foi lavado com 700 µL de etanol 70% e centrifugado por 5
minutos a 17.000g, e seco a vácuo (SpeedVac) por 10 minutos. O DNA obtido foi dissolvido
em 50 µL TE (10mM Tris, pH 8,0; 1mM EDTA) e tratado com 40 µg/ml de RNase DNase-
free a 37 ºC, durante 3 horas, sendo a quantificação do DNA realizada em GenQuant
(Pharmacia, Biotech, San Francisco, CA, EUA). Para verificar a integridade da amostra de
DNA, uma alíquota de 4 µL foi retirada, acrescida de tampão de carregamento (0,25 % de
azul de bromofenol e 40% de sacarose) (Sambrook, Maniats & Frisch, 1987) e analisada em
gel de agarose 0,8% contendo 10mg/ml de brometo de etídeo em tampão TBE 1X a 5V/cm.
Após a corrida, o gel foi visualizado sob luz ultravioleta, com auxílio de transiluminador UV.
A amostra de DNA obtida foi mantida a -20
o
C até o momento da reação de PCR.
Souza, R. F. Materiais e Métodos
49
3.2.2. Amplificação (PCR) da região ITS1-5.8S-ITS2
Após o isolamento do DNA genômico, a região ITS1-5.8S-ITS2, representada na figura
abaixo, foi submetida à amplificação dos fragmentos de DNA, com os pares de “primers”
ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) e ITS5 (5’-
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) (White et al., 1990). A reação foi realizada em
tubos de PCR de 200 µL contendo 100 ng de DNA genômico, 1,5mM MgCl
2
, 2 U Taq
polymerase (Invitrogen, Groningen, The Netherland), 0,2mM de cada dNTP, 50mM KCl, 10
mM Tris-HCl, e 0,2 µM de cada “primer”em 50 µL. No controle, o DNA foi substituído pelo
mesmo volume de água ultra pura esterilizada. A amplificação foi realizada em GeneAmp®
PCR System 9700 (Applied Biosystems, Nieuwerkerk aan de Ijssel, The Netherlands) com
uma desnaturação inicial de 94 °C por 2 min, seguido por 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a
55 °C e 72 °C por 2 min e uma extensão final de 72 °C por 5 min. Depois da amplificação, 7
µL de reação, misturados com 2 µL de tampão de carregamento (0,25 % de azul de
bromofenol e 40% de sacarose) (Sambrook, Maniats & Frisch, 1987) e 4 µL (200 ng) de
marcador 100 bp Ladder, também misturados com 2 µL de tampão de carregamento, foram
separados em gel de agarose a 1,0% em tampão TBE 1X, aproximadamente 5V/cm de gel,
para visualização dos fragmentos amplificados e determinação dos seus tamanhos, em pares
de bases.
Retirado de “Fungal Biology. In: Fungal genetics, molecular genetics and genomics”.
(Deacon, 2005)
Souza, R. F. Materiais e Métodos
50
3.2.3. Reação de Seqüenciamento da região ITS1-5.8S-ITS2
O produto de PCR foi purificado utilizando GFX
TM
PCR DNA Gel Band Purification Kit
(Amersham Biosciences, Roosendaal, The Netherlands) de acordo com as instruções do
fabricante. O DNA foi seqüenciado utilizando a fita dupla de DNA de cada produto de PCR
(20ng), 5 pmol de cada “primer” ITS4 ou ITS5 de acordo com o manual do fabricante, Big
Dye
TM
v3.1 kit (Applied Biosystems, Nieuwerkerk aan de Ijssel, The Netherlands) e acrescida
de água para um volume final de 10 µL. A reação de seqüenciamento foi conduzida em
termociclador Gene amp PCR system 9700 (Applied Biosystems Nieuwerkerk aan de Ijssel,
The Netherlands) com desnaturação do molde de 1 min a 95 °C; e 30 ciclos de 95 °C por 10
seg., e o anelamento do primer a 50 ºC por 5 seg., e a extensão final a 60
o
C por 4 min. O
produto da reação foi purificado com Sephadex filtration (G-50 fine, Amersham Biosciences,
Roosendaal, The Netherlands) e o seqüenciamento foi conduzido em ABI3730XL DNA
Analyzer (Applied Biosystems, Nieuwerkerk aan de Ijssel, The Netherlands).
Os fragmentos seqüenciados gerados pelos dois “primers” foram montados utilizando o
programa SeqMan version 5.03 (DNAStar, Madison, WI, U.S.A) e corrigidos manualmente.
As seqüências consenso foram alinhadas pelo programa clustal X 1.83 (Thompson, Higgins &
Gibson, 1994). O cladograma mostrando a relação filogenética entre isolados e os padrões
foram construídos com base na matriz de distância pelo método “neighbor-joining” com 1000
“bootstraps” e utilizando o modelo de substituição “uncorrected p” como melhor critério para
os dados gerados. As análises computacionais geraram um cladograma filogenético entre
representantes dos AGs e os isolados utilizando o programa computacional PAUP*
(Phylogenetic Analysis Using Parsimony, version 4.0) (Swofford, 2001) com "heuristic
search, 50 replicates and tree-bisection-reconnection as the branch-swapping algorithm”.
3.3. Obtenção do micélio dos fungos
Os micélios dos fungos fitopatogênicos foram obtidos a partir do crescimento de
aproximadamente 10 discos de 5 mm retirados de culturas de cada fungo em frascos de 2L
contendo meio líquido de YMA. Após inoculação, os frascos foram incubados a 28
0
C por
cerca de 10 dias, ou até que o crescimento micelial fosse abundante. Após a incubação, os
meios de cultura foram centrifugados a 10.000 rpm e filtrados em papel Whatman n
0
1. O
micélio obtido foi lavado 3x em tampão PBS, liofilizado e triturado em gral e pistilo. O
Souza, R. F. Materiais e Métodos
51
micélio triturado foi então passado em duas peneiras consecutivas de 0,42 mm e 0,21mm de
abertura.
3.4. Seleção das estirpes com atividade antifúngica
As estirpes de actinomicetos foram selecionadas quanto à capacidade de inibição em
placa dos fungos fitopatogênicos. Cada estirpe de actinomiceto foi inoculada na forma de um
“spot” em placas de Petri contendo meio YMA, enquanto que cada fungo fitopatogênico foi
inoculado no centro. O inóculo de cada fungo foi obtido através da retirada de um disco de
5mm de uma cultura de 5 – 7 dias em placa de YMA. As placas foram incubadas a 28 °C por
5 – 7 dias e as estirpes avaliadas de acordo com o tamanho da zona de inibição, sendo as
análises realizadas diariamente. Os experimentos foram realizados em triplicata.
3.5. Obtenção dos extratos enzimáticos e seleção da estirpe promissora
As estirpes de actinomicetos selecionadas no item anterior foram crescidas em frascos
Erlenmeyer de 125 mL contendo 25 mL de meio de sais minerais (em g/l, K
2
HPO
4
0,7 ,
KH
2
PO
4
0,3, MgSO
4
.5H
2
O 0,5, FeSO
4
.7H
2
O 0,01, ZnSO
4
0,001, MnCl
2
0,001), contendo
0,5% de micélio de cada fungo fitopatogênico como única fonte de carbono (Hsu &
Lockwood, 1975). Os frascos foram incubados por 4 dias com agitação em shaker a 28
o
C e o
extrato enzimático obtido por centrifugação a 10.000 rpm / 10 min e filtrado em papel
Whatman n
0
1. Os experimentos foram realizados em triplicata e os extratos enzimáticos
obtidos foram analisados quanto a atividade quitinolítica, conforme descrito no item 3.10.
Actinomicetos
Fungo fitopatogênico
Souza, R. F. Materiais e Métodos
52
3.6. Cinética da produção de quitinase e protease em meio contendo micélio
de R. solani
A determinação do melhor tempo para a produção de quitinase e protease foi realizada
em meio de meio de sais minerais contendo 0,5% de micélio de R. solani como única fonte de
carbono (Hsu & Lockwood, 1975). a 0,5%. O Streptomyces sp. RCQ 1071, selecionado de
acordo com o item 2.5, foi inoculado (10
7
esporos/mL de meio) em frasco Erlenmeyer de 500
mL contendo 200 mL de meio. O frasco foi incubado sob agitação a 200 rpm durante 36 horas
a 28
0
C, sendo a análise da atividade enzimática realizada em alíquotas de 1 mL retiradas de 6
em 6 horas. A dosagem de quitinase foi realizada conforme descrito no item 3.10 e a atividade
proteolítica conforme o item 3.11.
3.7. Cinética de produção das enzimas hidrolíticas em meio TLE
O Streptomyces sp. RCQ 1071 foi inoculado (concentração final de 10
7
esporos/mL de
meio) a partir da suspensão de esporos em frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 50 mL de
meio TLE , composto de (g/l) bactopeptona 1g, uréia 0,3, fosfato de potássio monobásico 2,
sulfato de amônia 14, glicose 0,3, solução de elementos traços 1 mL (sulfato de cobre 6,4,
sulfato de ferro II 1,1, cloreto de manganês 7,9 e sulato de zinco e micélio de R. solani 5
(Bara, Lima & Ulhoa, 2003). Os frascos foram incubados por 5 dias a 28
0
C, sendo os
sobrenadantes obtidos diariamente através de filtração em papel Whatman n
0
1 e centrifugação
a 10.000 rpm, para posterior determinação das atividades de protease, quitinase e glucanase.
3.8. Obtenção do sobrenadante
O Streptomyces sp. RCQ 1071 foi inoculado a partir da suspensão de esporos em frasco
Erlenmeyer de 500 mL contendo 200 mL de meio TLE de forma a obter uma concentração
final de 10
7
esporos por mL de meio. O frasco foi incubado por 5 dias a 28
0
C, sendo o
sobrenadante obtido através de filtração em papel Whatman n
0
1 e centrifugação a 10.000 rpm.
3.9. Dosagem de proteína
A dosagem de proteína foi realizada pelo método de Bradford (1976), utilizando
Coomassie
®
brilhante blue G-250 e BSA como padrão.
Souza, R. F. Materiais e Métodos
53
3.10. Determinação da atividade quitinolítica
A atividade quitinolitica foi determinada através de ensaios em microplacas utilizando
os substratos sintéticos fluorogênicos 4-metilumbeliferil-β-D-N,N’,N’triacetilquitotriose
(atividade de endoquitinase) e 4-metilumbeliferil-N-acetil-β-D-glucosamina (atividade de
exoquitinase). A mistura reacional continha 50 µL do substrato 50µM em tampão Tris-HCl
50mM, pH 7,4, 100 µL da amostra e 50 µL de tampão Tris-HCl 50mM, pH 7,4. Após
incubação a 50
0
C por 1 hora, a atividade foi quantificada através da leitura em Fluoroskan II
(355 nm de excitação e 460 nm de emissão) e comparação com uma curva padrão de
metilumbeliferona. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de
enzima necessária para liberar um µmol de metilumbeliferona por minuto, nas condições
acima descritas.
A atividade quitinolítica também foi determinada em SDS-PAGE co-polimerizado com
glicol-quitina. A amostra foi submetida à eletroforese em SDS-PAGE 10% por cerca de 3
horas a 120V e 30 mA a 4
0
C. Após a corrida, as enzimas foram renaturadas em Triton X-100
1% em água por 1 hora e, em seguida o gel foi incubado por 1 hora a 40
0
C em tampão Tris-
HCl 50 mM pH 7.4. As zonas de hidrólise foram observadas após revelação do gel com
vermelho congo 0,1% e sucessivas lavagens com solução NaCl 1M. Foi utilizado um padrão
de massa molecular (Cat. Nº. 10748-010 / Invitrogen), contendo proteínas com massas
variando de 181,8 kDa à 6.0 kDa.
3.11. Efeito do pH e da temperatura na atividade de exoquitinase
O efeito do pH na atividade das quitinases foi determinado variando-se os valores de pH
da mistura reacional e a atividade determinada como descrito no item 3.10. Os tampões
utilizados foram: ácido cítrico-citrato de sódio, com valores de pH de 3,0 a 6,0 e Tris-HCl,
com valores de pH de 7,0 a 9,0, e foram preparados de acordo com Dawson (1969). Os
resultados foram expressos em percentual de atividade relativa. O efeito da temperatura foi
determinado em pH 7,4 conforme descrito acima, com exceção das temperaturas utilizadas
que variaram de 28 a 70
0
C (Souza et al., 2003; Souza et al., 2005).
Souza, R. F. Materiais e Métodos
54
3.12. Determinação da atividade proteolítica
A atividade proteolítica foi determinada conforme descrito por Buroker-Kilgore &
Wang (1993). A mistura reacional, contendo 100 µL da amostra, 100 µL de tampão Tris-HCl
50 mM pH 7,4 e 50 µL de gelatina a 1 %, foi incubada a 37
0
C por 1 hora. Em seguida, foram
retirados 100 µL e adicionados 100 µL de comassie blue G250. Uma unidade de atividade
enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima necessária para reduzir 0,01
unidade de absorbância a 595 nm por minuto. A atividade enzimática também foi determinada
utilizando como substrato azocaseína, conforme descrito por Beynon & Bond (1989). A
mistura reacional contendo 250 µl de azocaseína 2% em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,4 e
150 µL da amostra foi incubada a 37
0
C por 1 hora. Em seguida, foram adicionados 1,2 mL de
ácido tricloroacético a 10%, e após 15 min a mistura foi centrifugada a 8000 g por 2-5 min.
Retirou-se então 1,2 mL e adicionou-se 1,4 mL de NaOH 1 M. A leitura foi realizada a 440
nm em espectrofotômetro. Uma unidade de atividade enzimática (U) foi definida como a
quantidade de enzima necessária para produzir um aumento de 0,01 unidade de absorbância a
440 nm por minuto.
3.13. Efeito do pH e da temperatura na atividade proteolítica
O efeito da temperatura na atividade proteolítica foi determinado através de gel de
poliacrilamida co-polimerizado com gelatina. A amostra foi submetida à eletroforese em
SDS-PAGE 12,5 % por cerca de 3 horas a 120 V e 30 mA a 4
0
C. Após a corrida, as enzimas
foram renaturadas em Triton X-100 1% em água por 1 hora e, em seguida o gel foi incubado
em diferentes temperaturas (25, 28, 40 e 50
0
C ) em tampão Tris-HCl 50mm pH 7,4. As zonas
de hidrólise foram observadas após revelação do gel com comassie blue G250 e lavagens com
solução descorante, quando necessário. O efeito do pH na atividade enzimática foi
determinado conforme descrito acima, porém variando-se os valores de pH durante a
incubação (pH 3,0, 5,0, 7,0 e 9,0), sendo a temperatura utilizada 40
0
C.
Souza, R. F. Materiais e Métodos
55
3.14. Determinação da atividade de
β
ββ
β
-1,3-glucanase
A dosagem da atividade de β-1,3-glucanase foi determinada conforme descrito por Bara,
Lima e Ulhoa (2003), com algumas modificações. A mistura reacional, contendo 100 µL da
amostra, 100 µL de laminarina 0,5% em tampão ácido cítrico-acetato de sódio 50 mM pH 5.0
e 200 µL de tampão foi incubada a 50
0
C por 1 hora. Após a incubação, a reação foi parada em
banho de gelo e pela adição de 400 µL do reagente de Somogyi. Em seguida, foram dosados
os açúcares redutores pelo método de Nelson & Somogyi (Woodward & Fincher, 1982). Uma
unidade de atividade enzimática oi definida como a quantidade de enzima necessária para
liberar 1 µM de glicose nas condições acima descritas.
3.15. Efeito do pH e da temperatura na atividade de
β
ββ
β
-1,3-glucanase
O efeito do pH na atividade enzimática foi determinado variando-se o valor de pH da
mistura reacional descrita no item 3.14 entre valores de 3,0 a 9,0. Os tampões utilizados para
a análise foram os mesmo descritos no item 3.11. O efeito da temperatura na atividade de β-
1,3-glucanase foi avaliado conforme descrito no item 3.14, porém variando-se a temperatura
de incubação da mistura reacional entre 30 e 60
0
C, utilizando o tampão ácido cítrico-citrato
de sódio pH 5,0.
3.16. Purificação parcial da exoquitinase
O sobrenadante obtido no ítem 3.8 foi aplicado em coluna de troca aniônica Mono-Q
(FPLC / Amersham Bioscience). A corrida foi realizada com fluxo de 1mL/min durante 40
minutos em tampão Tris-HCl 0,01 M pH 7,4 com gradiente de NaCl 1M entre 0 e 100 %,
sendo coletadas frações de 1 mL. As frações contendo atividade de exoquitinase foram
reunidas, concentradas por ultrafiltração em sistema AMICOM (cut off 10.000) e aplicadas
em uma coluna de filtração em gel (Superose 12 / FPLC Amersham Bioscience). A
cromatografia foi realizada em tampão Tris-HCl 0.1M pH 7,4 durante 90 minutos, sendo
coletadas frações de 0,4 mL (fluxo de 0,2 mL / min.). As frações obtidas foram monitoradas a
280 nm e a atividade quitinolítica foi determinada conforme descrito no item 3.10. Aquelas
apresentando atividade foram submetidas à eletroforese em SDS-PAGE co-polimerizado com
glicol-quitina sob condições desnaturantes (Laemmli, 1970; Souza et al., 2003; Souza et al.,
Souza, R. F. Materiais e Métodos
56
2005). As frações obtidas também foram monitoradas quanto à atividade de β-1,3-glucanase,
determinada conforme descrito no item 3.14.
3.17. Co-cultivo de Rhizoctonia solani e Streptomyces sp. RCQ 1071
O fungo R. solani foi inoculado, na forma de 4 discos de 5 mm, retirados de placas de
PDA crescidas previamente por 5 dias, em frasco Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de
meio PDA líquido. O frasco foi incubado por 36 a 48 horas a 28 ºC sob agitação a 120 rpm. A
massa de células obtida por centrifugação a 3000 rpm, lavada 3 x com solução salina estéril a
0,85% foi utilizada como inóculo em um outro frasco contendo meio PDA líquido. Em
seguida, o Streptomyces sp RCQ1071 foi inoculado (10
7
esporos/mL de concentração final).
O crescimento foi monitorado diariamente durante 14 dias de cultivo a 28 °C em repouso e
sob agitação a 120 rpm através de observações e por microscopia óptica.
O actinomiceto também foi inoculado (10
7
esporos/mL) juntamente com o R. solani (1
disco de 5 mm retirado de uma placa contendo PDA após 5 dias de crescimento) em meio
PDA líquido, e o crescimento de ambos os microrganismos foi monitorado conforme descrito
acima.
A viabilidade de ambos os microrganismos foi determinada através da incubação da
massa de células com MTT (brometo (3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium)). A
massa de célula obtida por centrifugação a 3000 rpm por 15 min foi transferida para um
frasco Erlenmeyer de 250 mL contendo 180 mL de meio PDA líquido. Em seguida, foram
adicionados 20 mL de uma solução contendo 5 mg / mL de MTT em solução PBS estéril.
Após incubação durante 3 horas a temperatura ambiente, foram preparadas lâminas a fresco a
partir desta massa de células tratada com MTT e estas foram observadas ao microscópio
óptico utilizando objetiva de 400X e 1000X (imersão) (Batanghari & Goldman, 1997).
3.18. Interação entre Rhizoctonia solani e Streptomyces sp. RCQ 1017
3.18.1. Obtenção do extrato polipeptídico de Rhizoctonia solani
O fungo Rhizoctonia solani foi inoculado, com discos retirados de placas de PDA, em
meio líquido PDA, e o os frascos incubados a 28 ºC por cerca de 36 a 48 horas. Após o
crescimento, a massa celular foi obtida por centrifugação a 3500 rpm por 15 min e filtração
em papel Whatman nº 1. A massa de células foi lavada três vezes com tampão fostato de
Souza, R. F. Materiais e Métodos
57
sódio 0,2 M / cloreto de sódio 7,4% (PBS) e lisada utilizando ultra-som e centrifugada a
10.000 rpm. O processo de lise foi feito através de cinco a seis ciclos de 1 min no ultra-som,
intercalados por intervalos de 1 min no gelo. Os restos celulares foram descartados e o
sobrenadante obtido foi concentrado através de precipitação com acetona (5:1 em água
destilada) sob refrigeração a 4 °C.
3.18.2. Obtenção do extrato polipeptídico do Streptomyces sp. RCQ 1071
O Streptomyces sp. RCQ 1071 foi inoculado em uma concentração de 10
7
células/mL de
meio de meio de sais minerais contendo 0,5% de micélio de R. solani e incubado por 3 dias à
28 °C , sob agitação a 200 rpm. Após a incubação, as células foram obtidas por filtração em
papel Whatman nº 1 e centrifugação a 10.000 rpm, seguido de 3 lavagens com solução PBS.
Em seguida, as células do estreptomiceto foram incubadas com “EZ-link NHS Biotin”
(Pierce) (0,5 mg/mL) por 60 min a temperatura ambiente sob agitação lenta em agitador
oscilante. Após a biotinilação, as células foram lavadas exaustivamente com tampão PBS e
lisadas em ultra-som, conforme descrito no item acima (Altin & Pagler, 1995; Masuoka,
Guthrie & Hazen, 2002). O extrato polipeptídico obtido foi concentrado através de
precipitação com acetona (5:1 em água destilada) sob refrigeração a 4°C.
3.18.3. “Western blotting” e reconhecimento de polipeptídeos de superfície
Quarenta microgramas de polipeptídeos de R. solani foram aplicadas em SDS-PAGE
10% (Laemmli, 1970), sendo a eletroforese realizada por cerca de 2 horas a 120V e 30 mA
sob refrigeração a 4ºC. Após eletroforese, os polipeptídeos foram transferidos para uma
membrana de nitrocelulose (Hybond-C Extra/Amersham Biosciences) a 100 V e 300 mA por
cerca de 2 horas em tampão de transferência. Após a transferência, a membrana foi
submetida à interação com 40 µg dos polipeptídeos do Streptomyces sp. RCQ1071 marcados
com biotina dissolvidos em 4 mL de tampão TBS-Tween sob agitação lenta em agitador
orbital. Em seguida, a membrana foi incubada com 4 mL de tampão TBS adicionado de
streptoavidina conjugada a peroxidase (5 pmol/mL) a temperatura ambiente sob agitação lenta
em agitador orbital. Após 90 min de incubação, a interação pode ser observada pela incubação
da membrana por aproximadamente 3 a 5 min com uma solução de DAB (3,3’-
diaminobenzidine tetrahydrochloride) e H
2
O
2
em tampão Tris-HCl 1,5 M pH 7.4. (Towbin,
Staeheling & Gordon, 1979; Masuoka, Guthrie & Hazen, 2002; Dong, et al., 2003).
Souza, R. F. Materiais e Métodos
58
3.19. Purificação do polipeptídeo de reconhecimento
A obtenção dos polipeptídeos de reconhecimento foi realizada a partir da etapa de
interação entre os polipeptídeos de supefície do Streptomyces sp. RCQ1071 e de R. solani,
descrita no item 3.18. Após o reconhecimento dos polipeptídeos do fitopatógeno pelos
polipeptídeos marcados com biotina do actinomiceto, estes foram removidos da membrana de
nitrocelulose através da incubação por 5 min em tampão glicina-HCl 0,1M. Imediatamente
após o desligamento desses polipeptídeos, a solução resultante foi ajustada para pH 7.4 com
NaOH 0,5M e concentrada por ultrafiltração em sistema AMICON “cut off” 10.000. Em
seguida foi realizado um fracionamento desses polipeptídeoss em coluna de filtração em gel
Superose 12 (Amersham Biosciences). A corrida foi realizada em sistema FPLC (Fast
Performance Liquid Chromatography - Amersham Biosciences) em tampão Tris-HCl 0,1 M
pH 8,9 durante 40 min com um fluxo de 0,4 mL/min, sendo coletada frações de 0,4 mL. A
fração contendo o polipeptídeo de reconhecimento foi concentrada por ultrafiltração em
sistema Centricon, “cut off” 10.000 e analisada por eletroforese em SDS-PAGE. A
eletroforese foi realizada em gel de poliacrilamida 10% a 120 V e 100 mA por 2 horas. Após
eletroforese, o gel foi revelado através de coloração pela prata, conforme descrito por
Gonçalves, Nehme & Morel (1984).
Após a análise por SDS-PAGE, o polipeptídeo foi novamente marcado com biotina e foi
realizado um novo experimento de reconhecimento, conforme descrito no item 3.18.3,
utilizando o polipeptídeo purificado do Streptomyces sp. RCQ1071.
3.20. Eletroforese bi-dimensional
O polipeptídeo purificado responsável pela interação entre o Streptomyces sp. RCQ1071
e R. solani foi submetido a uma eletroforese bi-dimensional para a confirmação da massa
molecular e determinação do ponto isolelétrico. A primeira etapa, chamada de primeira
dimensão foi realizada no sitema Multiphor ™ II Electroforesis Unit (GE Healthcare),
utilizando um gradiente de pH em gel imobilizado em uma fita de 11 cm, variando de 3.0 a
10.0 (Cat. Nº 18-1016-61). A amostra foi aplicada durante o processo de rehidratação do gel,
através da mistura com a solução de rehidratação, conforme as instruções do fabricante. Os
procedimentos, bem como todas as soluções foram realizados conforme descrito por
Berkelman & Stenstedt (1998). Após a eletroforese no gradiente de pH imobilizado, a fita foi
equilibrada com uma solução de equilíbrio e submetida à segunda etapa, chamada de segunda
Souza, R. F. Materiais e Métodos
59
dimensão. Esta etapa foi realizada em SDS-PAGE 12,5% em sistema de eletroforese vertical,
sendo a corrida realizada por cerca de 6 horas a 120 V e 100 mA. Após eletroforese, o gel foi
revelado através de coloração pela prata, conforme descrito por Gonçalves, Nehme & Morel
(1984). A confirmação da massa molecular foi realizada através da comparação com a
migração de um padrão de massa molecular (Cat. Nº 17-0615-01) com massas moleculares de
220 kDa, 170 kDa, 116 kDa, 76 kDa e 53 kDa. A massa molecular do peptídeo foi calculada
com o auxílio do programa ImageMaster Platinum da GE HealthCare.
3.21. Formulação do Streptomyces sp. RCQ 1071
A aplicação de microrganismos bicontroladores no campo requer que estes sejam
preparados de forma adequada e que esta preparação seja o suficientemente estável por um
determinado período de tempo, de forma que sua utilização se torne economicamente viável.
Dessa forma, a formulação do Streptomyces sp. RCQ 1071 foi preparada de acordo com
Sabaratnam & Traquair (2002), com algumas modificações. Foram preparadas dois tipos de
formulações, sendo uma formada por grânulos e outra em pó molhável.
Na formulação com alginato, 20 g de caolim foram misturados com 1mL da suspensão
de esporos do actinomiceto contendo 1,9 x 10
10
esporos/mL. Uma solução aquosa de alginato
de sódio a 2 % foi adicionada à esta mistura numa proporção de 1:2. A suspensão obtida foi
gotejada em uma solução de cloreto de cálcio a 0,1 M. Para homogeneização do tamanho das
partículas, uma pipeta pasteur foi utilizada como gotejador, com o auxílio de uma bomba
peristáltica. Após 30 min imersas nesta solução, os grânulos foram separados através de
filtração em filtro de Buchner e lavados com água destilada. Os grânulos foram secos a
temperatura ambiente em fluxo laminar e dispersos em uma folha de papel de filtro.
Na formulação em pó molhável, foram misturados 40 g de caolim, 160 g de talco e 1mL
de uma suspensão de esporos do actinomiceto contendo 1,9 x 10
10
esporos/mL. Essa mistura
foi então homogeinizada em blender por 10 min e passado em duas peneiras consecutivas de
0,42 mm e 0,21mm de abertura. As duas formulações foram conservadas a 4
0
C e a 28
0
C,
para as análises posteriores.
Souza, R. F. Materiais e Métodos
60
3.22. Análise da estabilidade das formulações
A estabilidade das formulações armazenadas a 4
0
C e 28
0
C foi determinada em
intervalos de 20 dias através de contagem padrão em placa durante um período de 6 meses. A
formulação em pó molhável (1 g) foi adicionada a 9 mL de solução salina. Foram feitas
diluições seriadas até a diluição necessária para se obter uma contagem em placa entre 30 e
300 colônias. Os resultados foram expressos em log CFU/g de produto. A estabilidade da
formulação em grânulos de alginato foi determinada conforme descrito acima, porém 1g dos
grânulos de alginato foi previamente masserado e dissolvido em 9 mL de solução salina
estéril.
3.23. Determinação da patogenicidade de Rhizoctonia solani
(Sabaratnam &
Traquair, 2002)
A determinação da patogenicidade em plântulas de tomate foi realizada em casa de
vegetação a +/- 28ºC sob iluminação artificial, utilizando duas lâmpadas Luz do Dia Plus
F40W T12 e uma Grolux F40W T12 com um fotoperíodo de 14 horas. Foi utilizado como
inóculo um substrato constituído de 3 partes de esterco de vaca, 1 parte de areia lavada, 2% de
aveia, acrescentado de 30 mL de água para cada 100 mL da mistura. O substrato (150g) foi
autoclavado em saco de polipropileno 2 x durante 1 hora em intervalos de 24 horas entre cada
autoclavação. Em seguida, R. solani foi inoculado na forma de discos de 5 mm retirados de
placas com 5 dias de incubação a 28ºC (dois discos para cada 150g de substrato), e este
incubado a 28ºC por 10 dias. Após o crescimento, o substrato inoculado foi misturado ao solo
na proporção de 20g de substrato para cada 1,2 litros de solo, concomitantemente ao plantio
das sementes (Bueno, 2001). Foram utilizadas 2 bandejas de fundo cônico com 6 orifícios de
3,5 X 3,5 cm cada, com aproximadamente 10g de solo infestado por R. solani, sendo
plantadas duas sementes em cada orifício. O crescimento das mudas foi monitorado
diariamente durante 30 dias a 28ºC e a amostra foi considerada efetiva em causar doença
quando pelo menos 90% das plântulas apresentaram os sintomas típicos causados por R.
solani. As sementes utilizadas (tomate híbrido grandeur T-70 / TAKII & CO. LTD, Kyoto,
Japão) foram fornecidas pela empresa TOMATEC (Campinas, SP -
http://www.tomatec.com.br/; http://www.takii.com.br/tomategrandeur.html) e estavam isentas
de agrotóxicos. Foi utilizado um solo comercial produzido pela West Garden, localizada em
São Paulo, SP (
http://www.westgarden.com.br/), isento de pragas, doenças e ervas daninhas.
Souza, R. F. Materiais e Métodos
61
A determinação da patogenicidade foi realizada antes de cada experimento de controle
biológico, descritos no item 3.24.
3.24. Controle biológico de Rhizoctonia solani
3.24.1. Ensaio com a suspensão de esporos
3.24.1.1. No fruto
R. solani (disco de 5mm retirado de uma placa com 7 dias de incubação a 28 ºC) foi
inoculada em placa de Petri revestida com papel de filtro estéril umedecido. Em seguida, um
pedaço de tomate, previamente esterilizado em hipoclorito de sódio 2.5% por 1 hora, foi
adicionado, e inoculado com esporos de Streptomyces sp. RCQ 1071 (1 mL da suspensão a
10
7
esporos/mL), conforme esquema abaixo. As placas foram incubadas por 7 dias a 28 ºC e
observadas diariamente.
3.24.1.2. Nas plântulas
O Streptomyces sp. RCQ 1071 foi inoculado em solo na proporção de 5 mL de
suspensão de esporos a uma concentração de 10
7
esporos / mL para cada 10 g de solo
infestado com R. solani, sendo esta infestação e os experimentos realizados em casa de
vegetação, conforme descrito no item 3.23.
R. solani
Placa de Petri
Pedaço de tomate inoculado com
o Streptomyces. sp RCQ 1071
Disco de papel de filtro
Souza, R. F. Materiais e Métodos
62
3.24.2. Ensaio com as Formulações
As formulações foram testadas quanto a eficiência em reduzir os efeitos danosos
causados por R. solani nas plântulas de tomate, sendo os experimento realizados sob
condições controladas em casa de vegetação. O agrotóxio Monceren® foi utilizado com
controle positivo para a inibição de R. solani no solo. A aplicação do agrotóxio foi realizada
através do revestimento da semente, conforme as instruções do fabricante (Bayer s/a). O
cultivo das plântulas isento de agrotóxico, Streptomyces sp. RCQ 1071 e R. solani foi
considerado o controle positivo de germinação das sementes, enquanto que o cultivo
inoculado com R. solani foi considerado ocontrole positivo de patogenicidade, apresentando
sintomas típicos causados pelo fitopatógeno.
3.24.2.1. Formulação em pó molhável
A formulação em pó molhável foi previamente dissolvida na proporção de 1 g em 9 mL
de solução salina 0,85 % estéril, sendo feitas diluições seriadas até a diluição 10
-3
. A última
diluição foi utilizada para regar o solo logo após o plantio das sementes. A inoculação da R.
solani, bem como as condições de cultivo das plântulas foram realizadas conforme descrito no
item 3.23. A formulação também foi avaliada através de revestimento das sementes. As
sementes foram imersas em água estéril por aproximadamente 15 min, o excesso de água
removido com auxílio de papel de filtro e, em seguida, recobertas através de imersão da
semente úmida na formulação, de forma que a semente ficasse totalmente revestida, para
serem então semeadas.
3.24.2.2. Formulação em grânulos
A formulação em grânulos de alginato foi testada dissolvendo-se previamente 1g dos
grânulos em 9mL de solução salina 0,85 % estéril. Em seguida, foram feitas diluições seriadas
até a diluição 10
-3
. A última diluição foi utilizada para regar o solo logo após o plantio das
sementes. A inoculação da R. solani , bem como as condições de cultivo das plântulas foram
realizadas conforme descrito no item 3.23.
Souza, R. F. Materiais e Métodos
63
3.24.3. Análise estatística
Foram realizados no mínimo 2 experimentos independentes, e os resultados obtidos
submetidos à análise estatística utilizando o programa EPI-INFO Ver. 6.04
(http://www.cdc.gov/epiinfo/Epi6/EI6dnjp.htm). Foi utilizado o teste Qui-quadrado (χ
2
) para
as variáveis categóricas, sendo as diferenças consideradas estatisticamente significantes
quando o valor p foi menor que 0,05. Os resultados expressos representam a média dos
experimentos.
3.25. Identificação do Streptomyces sp. RCQ 1071
A identificação do Streptomyces. sp. RCQ 1071 foi realizada utilizando a taxonomia
polifásica, que inclui a taxonomia convencional, a taxonomia numérica e a taxonomia
molecular. A análise por taxonomia convencional, baseada em testes morfológicos e
quimitaxonomia, foi realizada em experimentos prévios por Gomes e colaboradores (2001), e
revelou que a estirpe pertence ao Gênero Streptomyces. No presente trabalho, a estirpe foi
submetida a taxonomia numérica utilizando-se 75 testes fisiológicos, descritos na Tabela 6, no
item 4.16, conforme descrito por Shirling & Gottlieb (1966 e 1972) e Williams et al., (1983a
e 1983b). A taxonomia molecular foi baseada no sequenciamento do RNA ribossomal 16S,
seguido por análise filogenética, conforme descrito a seguir.
3.25.1. Extração do DNA
A extração de DNA foi realizada baseada em publicações anteriores, com algumas
modificações (Orgram et al., 1987; Steffan et al., 1988; Tsai & Olson, 1991; Smalla et al.,
1993; Rintala et al., 2001). Uma massa de células do Streptomyces. sp. RCQ 1071, obtida
pelo crescimento do mesmo em meio YMA líquido por 3 dias a 28 ºC sob agitação a 200 rpm,
foi congelada com nitrogênio líquido e macerada até se tornar pó. Em tubos de 2 mL foram
acrescentados 500 µL de tampão fosfato de sódio 120 mM pH 8.0 e 500 µL de
fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1, v/v) ao pó das células, sendo então agitados em
vortex por aproximadamente 2 min e centrifugados a 12 rpm por 5 min a 4 ºC. A fase aquosa
foi recolhida em um novo tubo e 250 µL do tampão e 250 µL de fenol/clorofórmio/álccol
isoamílico foram adicionados e novamente agitados em vortex por 2 min e centrifugados por
5 min a 12000 rpm. A fase aquosa foi misturada à anterior e novamente procedeu-se a
Souza, R. F. Materiais e Métodos
64
lavagem com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico. Em seguida, foi adicionado à fase aquosa
NaCl 5M e PEG 30% na proporção 9:1:10 esta foi deixada em repouso à temperatura
ambiente por 2 h. A amostra foi então centrifugada a 12000 rpm por 5 min à 4 ºC e o
sobrenadante descartado. O pellet obtido foi ressuspendido em 250 µL de etanol 80% a 4 ºC e
centrifugado por 2 min a 12000 rpm, sendo o sobrenadante descartado. A lavagem com etanol
foi repetida e os tubos foram deixados a temperatura ambiente para a total evaporação do
etanol. O pellet de DNA obtido foi ressuspendido em 50 µL do tampão de extração e
armazenado a -20 ºC.
3.25.2. Amplificação do DNA (PCR)
A reação de PCR foi realizada utilizando-se os iniciadores desenhados para o
anelamento em regiões conservadas dentro do DNAr 16S. Os iniciadores utilizados foram o
primer universal 27f 5’ - AGAGTTTGATCACTGGCTCAG - 3’, que corresponde às
posições 8-28 no DNAr 16S de E.coli e o primer universal 1492r 5’ - TACGGCTTACCT
TGT TACGAC TT - 3’, correspondendo à posição 1492-1471 (Edwards et al., 1989). O PCR
foi realizado utilizando-se 2,5 µl de DNA, 5 µl de 10X PCR buffer minus Mg++, 2 µl de
MgCl2 50 mM, 50 µl contendo 2 unidades de Taq polimerase, 20 pmol de cada primer e 1 µl
de uma mistura de dNTP 10 mM em volume de reação total de 50 µl. A amplificação foi
realizada com uma desnaturação preliminar a 98 ºC por 5 min, seguido de trinta ciclos
térmicos de 95 ºC por 1 min, 55 ºC por 40 s e 72 ºC por dois minutos. Todas as reações foram
realizadas com controle negativo (reação sem o DNA molde) e controle positivo (DNA molde
conhecido e amplificável). Os produtos de PCR foram verificados em gel de agarose,
purificados e quantificados com o Pure Link PCR Purification Kit (Invitrogen Life
Technologies – Cat. Nº LT3100-01) para o posterior sequenciamento.
3.25.3. Sequenciamento do DNAr16S e análise filogenética
Os produtos do PCR foram diretamente seqüenciados utilizando o seqüenciador
automático ABI PRISM 310 com os iniciadores descritos na Tabela 2. As seqüências foram
verificadas quanto à fidelidade com o auxílio do programa CHECK-CHIMERA no RDP
(Maidak et al., 1994). Aquelas consideradas válidas foram submetidas à busca por
similaridade nas bases de dados do RDP e BLAST (Altschul et al., 1997). O alinhamento das
seqüências foi realizado com o programa CLUSTAL X (Thompson et al., 1994). O programa
Souza, R. F. Materiais e Métodos
65
TREE-COM (Van der Peer & De Wachter 1993) foi utilizado para construir as árvores
filogenéticas, empregando a distância correta de Galtier & Gouy (1995) e Neighbour Joining
(Saitou & Nei, 1987).
Primer
Seqüência de bases
27f 5’ – AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG – 3’
342r 5’ – CTG CTG C(GC) (CT) CCC GTA G – 3’
357f 5’ – CTC CTA CGG GAG GCA GCA G – 3’
530f 5’ – GTG CCA GC(AC) GCC GCG G – 3’
1100r 5’ – GGG TTG CGC TCG TTG – 3’
1114f 5’ – GCA ACG AGC GCA ACC C – 3’
1492r 5’ – TAC GG(CT) TAC CTT GTT ACG ACT T – 3’
Tabela 2 – Iniciadores utilizados para o sequenciamento do RNA ribosomal 16S do
Streptomyces sp. RCQ 1071.
4. RESULTADOS
Souza, R. F. Resultados
66
4.1. Determinação do grupo de anastomose de Rhizoctonia solani
A determinação do grupo de anastomose traz grandes contribuições para o entendimento
dos processos de patogenia através da identificação da especificidade na relação patógeno e
hospedeiro, e dessa forma, proporcionando a utilização de formas de controle tanto químico
quanto biológico mais direcionados. A análise filogenética da região ITS1-5.8S-ITS2 inseriu
o isolado de Rhizoctonia solani utilizado neste trabalho em um mesmo cluster, representado
por estirpes pertencentes ao AG 4, como pode ser observado na Figura 6.
4.2. Seleção das estirpes de actinomicetos
As estirpes escolhidas, previamente selecionadas como produtoras de quitinase em meio
de meio de sais minerais contendo 0,5% de micélio de cada fungo fitopatogênico como única
fonte de carbono, foram testadas no presente trabalho quanto à inibição do crescimento em
placa dos fungos fitopatogênicos listados no item 3.1 em “Materiais e Métodos”. Foi
observado que todas as estirpes foram capazes de inibir o crescimento de pelo menos um
fungo fitopatogênico, sendo as estirpes 80, Q11 e Streptomyces sp. RCQ1071, as únicas
capazes de inibir todos os fungos testados. Foi observado também que a estirpe Streptomyces
sp. RCQ1071 teve o maior grau de inibição do crescimento de todos os fungos
fitopatogênicos quando comparado às outras estirpes. A estirpe S5 foi a única que não
apresentou atividade inibitória do crescimento dos fungos analisados. Além disso, pode-se
verificar que 6 estirpes de actinomicetos foram capazes de inibir o crescimento de R. solani e
dentre elas, apenas as estirpes 80, Q11, Streptomyces sp. RCQ1071 e 218 apresentaram um
alto grau de inibição, como pode ser observado na Tabela 3 e Figura 7 à Figura 12.
Souza, R. F. Resultados
67
Figura 8 – Determinação do grupo de anastomose do isolado de R. solani através do
sequenciamento da região ITS1-5.8S-ITS2 com posterior análise filogética. (*) Sequência do
isolado de R. solani.
Souza, R. F. Resultados
68
ESTIRPES
Rhizoctonia
solani
Fusarium
oxysporum
Fusarium
solani
Fusarium
graminearium
Fusarium
sp.
Aspergillus
niger
68 + - - ++ + -
70 - - ++ + + -
80 ++ ++ ++ + ++ ++
Q11 ++ ++ ++ + ++ ++
S5 - - - - - -
71 ++ ++ ++ ++ ++ ++
208 - - - ++ - -
M7a - - - ++ - ++
M10 - - ++ + ++ -
103 - + - - - -
Q16 - + - - - -
M08 + - - - - -
218 ++ + ++ + - -
Tabela 3 – Resultados dos testes de inibição do crescimento dos fungos fitopatogênicos pelos
actinomicetos. (++) Halo > 5 mm; (+) Halo < 5 mm; (-) Negativo.
Souza, R. F. Resultados
69
Figura 9 – Atividade inibitória das estirpes de actinomicetos sob F. oxysporum. 1-
Streptomyces drosdowiczii; 2- 103; 3- 68; 4- Q16; 5- 70; 6- 218; 7- M08; 8- 208; 9- M10; 10-
80; 11- 71; 12- Q11.
1 2
4 3
5
6
7
11
10
9
8
12
F. oxysporum
4
3
F. solani
Souza, R. F. Resultados
70
Figura 10 – Atividade inibitória das estirpes de actinomicetos sob F. solani. 1- 208; 2- M08;
3- M10; 4- 80; 5- Q11; 6- 71; 7- Q16; 8- 103; 9- 68; 10- Streptomyces drosdowiczii 11- 70;
12- 218
Figura 11 – Atividade inibitória das estirpes de actinomicetos sob A.niger. 1- M08; 2- 208; 3-
68; 4- Streptomyces drosdowiczii; 5- Q16; 6- 103; 7- 71; 8- M10; 9- Q11; 10- 80.
3
5 6
4
7 8
9
10
1
2
A. niger
7
8
1
2
F. graminearium
Souza, R. F. Resultados
71
Figura 12 – Atividade inibitória das estirpes de actinomcetos sob F. graminearium. 1- 68; 2-
Streptomyces drosdowiczii; 3- Q16; 4- 103; 5- M08; 6- 208; 7 -70; 8 – 218;
Figura 13 – Atividade inibitória das estirpes de actinomcetos sob Fusarium sp. 1- 103; 2-
Streptomyces drosdowiczii; 3- Q16; 4- 68; 5- 208; 6- M08; 7- 218; 8-70; 9- 71; 10- 80.
1
2
4
3
5
8
7
6
9
10
Fusari
um sp
.
Fusarium sp.
Souza, R. F. Resultados
72
Figura 14 - Atividade inibitória das estirpes de actinomcetos sob R. solani. 1- 68; 2- 71; 3- 80;
4- Q11; 5- 218; 6- 70; 7- Streptomyces drosdowiczii; 8- 208; 9- 103; 10- M08; 11- M10; 12-
Q16.
4.3. Obtenção dos extratos e seleção da estirpe promissora
1 2 3
4
6
8
9
11
12
5
10
7
Actinomiceto R. solani
Souza, R. F. Resultados
73
Após os testes de inibição do crescimento em placa dos fungos fitopatogênicos pelos
actinomicetos, foi observado que as estirpes Q11, 80 e RCQ1071 foram as mais promissoras
visto que foram as que apresentaram o maior grau de inibição em 5 dos 6 fungos testados.
Sendo assim, estas estirpes foram analisadas quanto à produção de quitinase em meio de sais
minerais contendo 0,5% de micélio dos fungos fitopatogênicos.
O Streptomyces sp RCQ1071 foi capaz de produzir endoquitinase utilizando o micélio
de 5 fungos fitopatogênicos. A maior produção foi detectada em meio contendo micélio de A.
niger (0,45 U/mL). Entretanto, os níveis de produção foram baixos quando foi utilizado
micélio de Fusarium. sp (0,025 U/mL), F. solani (0,065 U/mL), F. oxysporum (0,084 U/mL)
e R. solani (0,044 U/mL). Níveis de endoquitinase não foram detectados na presença de
micélio de F. graminearium e A. parasiticcus (Fig. 13A). A produção de exoquitinase foi
detectada em apenas duas condições de cultivo, contendo micélio de Fusarium sp. (0,002
U/mL) e R. solani (0,75 U/mL), sendo a maior produção observada quando se utilizou micélio
de R. solani (Fig. 13B).
O Streptomyces sp. 80 foi capaz de produzir endoquitinase utilizando como substrato o
micélio de todos os fungos, sendo a maior produção detectada quando foi utilizado o micélio
de Fusarium sp. e A. parasiticcus, com 0,5 U/mL. A produção de endoquitinase utilizando
como substrato micélio de A. niger foi menor (0,313 U/mL) quando comparado à produção
em micélio de Fusarium sp. e A. parasiticcus. Entretanto, quando foi utilizado micélio dos
outros fungos, a produção foi bastante inferior, sendo detectado um máximo de 0,102 U/mL
de endoquitinase (Fig. 14A). A produção de exoquitinase foi detectada quando foi utilizado
apenas micélio de F. graminearium (0,036 U/mL), F. oxysporum (0,012) U/mL e R. solani
(0,45 U/mL), sendo a maior produção observada na presença de micélio de R. solani (Fig.
14B).
O Streptomyces sp. Q11 produziu um alto nível de endoquiinase quando cultivado em
meio contendo micélio de A. niger. Entretanto os níveis de produção foram mais baixos na
presença de micélio de Fusarium sp., F. solani, F. oxysporum e R. solani, atingindo níveis
máximos de 0,22 U/mL (Fig. 15A). A produção de exoquitinase foi detectada em meio
contendo micélio de Fusarium sp. e R. solani, sendo a maior produção observada neste
último, em torno de 0,43 U/mL. Entretanto, não foram detectadas exoquitinase quando se
utilizou o micélio dos outros fungos fitopatogênicos (Fig. 15B).
0,4
0,5
Endoquitinase (U/mL)
A
Souza, R. F. Resultados
74
Figura 15 - Atividade quitinolítica do Streptomyces sp. RCQ 1071 crescido em meio de sais
minerais, contendo 0,5% de micélio de cada fungo fitopatogênico como única fonte de
carbono, por 4 dias a 28 ºC / 200 rpm. (A) Endoquitinase; (B) Exoquitinase;
Fusarium
graminearium;
Fusarium sp.;
Fusarium solani;
Aspergillus niger;
Aspergillus
parasiticcus;
Fusarium oxysporum;
Rhizoctonia solani.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Exoquitinase (U/mL)
B
0,4
0,5
0,6
Endoquitinase (U/mL)
A
Souza, R. F. Resultados
75
Figura 16 - Atividade quitinolítica do Streptomyces sp. 80 crescido em meio de sais minerais,
contendo 0,5% de micélio de cada fungo fitopatogênico como única fonte de carbono, por 4
dias a 28 ºC / 200 rpm. (A) Endoquitinase; (B) Exoquitinase;
Fusarium graminearium;
Fusarium sp.;
Fusarium solani;
Aspergillus niger;
Aspergillus parasiticcus;
Fusarium oxysporum;
Rhizoctonia solani.
2,0
2,5
3,0
Endoquitinase (U/mL)
A
Souza, R. F. Resultados
76
Figura 17 - Atividade quitinolítica do Streptomyces sp. Q11 crescido em meio de sais
minerais, contendo 0,5% de micélio de cada fungo fitopatogênico como única fonte de
carbono, por 4 dias a 28 ºC / 200 rpm. (A) Endoquitinase; (B) Exoquitinase;
Fusarium
graminearium;
Fusarium sp.;
Fusarium solani;
Aspergillus niger;
Aspergillus
parasiticcus;
Fusarium oxysporum;
Rhizoctonia solani.
4.4. Cinética da produção de quitinase e protease em meio de sais minerais
Souza, R. F. Resultados
77
Foi verificado que dentre as 3 estirpes testadas, o Streptomyces sp. RCQ 1071 foi a
única estirpe capaz de inibir o crescimento de todos os fungos fitopatogênicos testados, com
um alto grau de inibição (halo > 5 mmm), e ainda por ter apresentado a maior produção de
exoquitinase. Desta forma, esta estirpe foi selecionada para as próximas estapas do trabalho.
O Streptomyces sp. RCQ 1071 foi cultivado em meio de sais minerais contendo 0,5% de
micélio de R. solani durante 36 horas, conforme descrito no item 3.6, sendo a atividade
quitinolítica e proteolítica determinada em intervalos de 6 horas. Foram detectadas atividade
de endoquitinase e exoquitinase, sendo a maior produção observada para exoquitinase em 18
horas de cultivo (0,35 U/mL). A produção de endoquitinase foi bastante inferior, atingindo o
máximo de atividade (0,06 U/mL) com 30 horas de cultivo (Fig. 16). A atividade proteolítica
também foi detectada, sendo a maior produção com 12 horas de cultivo (22 U/mL). Após este
tempo, a produção foi reduzida atingindo níveis 4 vezes mais baixos, em torno de 6 U/mL
(Fig. 17).
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
6 12 18 24 30 36
Tempo (horas)
Atividade exoquitinase (U/mL)
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
Atividade endoquitinase (U/mL)
Figura 18 – Cinética da produção de quitinase pelo Streptomyces sp. RCQ 1071 crescido em
meio de sais minerais, contendo 0,5% de micélio de R. solani como única fonte de carbono,
durante 36 horas a 28 ºC / 200 rpm. (--) Endoquitinase (--) Exoquitinase.
Souza, R. F. Resultados
78
0
5
10
15
20
25
6h 12h 18h 24h 30h 36h
Tempo (horas)
Atividade proteolítica (U/mL)
Figura 19 - Cinética da produção de protease pelo Streptomyces sp. RCQ 1071 crescido em
meio de sais minerais, contendo 0,5% de micélio de R. solani como única fonte de carbono,
durante 36 horas a 28 ºC / 200 rpm.
4.5. Cinética da produção das enzimas hidrolíticas em meio TLE
A produção de exoquitinase, protease e β-1,3-glucanase foi avaliada diariamente em
meio TLE, contendo micélio de R. solani como fonte de carbono. Este meio de cultivo foi
utilizado com o objetivo de aumentar a expressão dessas enzimas hidrolíticas, visto que o
meio de cultivo utilizado anteriormente (sais minerais contendo 0,5% de micélio de R.
solani), apresentava como única fonte de carbono e nitrogênio, o micélio de R. solani. Foi
observado que o Streptomyces sp. RCQ 1071 foi capaz de produzir altos níveis de
exoquitinase, sendo a maior produção detectada no quarto dia de cultivo (8,4 U/mL). No
quinto dia, os níveis de exoquitinase foram bastante reduzidos, chegando a aproximadamente
0,77 U/mL (Fig. 18). A atividade de endoquitinase não foi detectada nas condições de cultivo
descritas acima.
O micélio de R. solani foi capaz de induzir a produção de proteases, sendo detectados
dois picos de produção, um no primeiro dia de cultivo (2,6 U/mL) e outro no quarto dia (0,9
U/mL). Embora a maior produção tenha sido detectada no primeiro dia de cultivo, pode-se
observar que a atividade proteolítica foi crescente a partir do 2º dia de cultivo (Fig. 19).
A produção de β-1,3-glucanase se iniciou no terceiro dia de cultivo, atingindo o máximo
de produção no quarto dia, com aproximadamente 2,1 U/mg. No quinto dia a quantidade de
Souza, R. F. Resultados
79
enzima produzida foi reduzida para cerca de 1,6 U/mg (Fig. 20). A produção dessas enzimas
hidrolíticas foi acompanhada pelo aumento do crescimento celular, que foi monitorado
através da dosagem de proteína dos sobrenadantes obtidos (Fig. 21).
Figura 20 – Cinética da produção de exoquitinase pelo Streptomyces sp. RCQ 1071 cultivado
durante 5 dias em meio TLE a 28 ºC / 200 rpm.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (dias)
Atividade de exoquitinase (U/mL)
Souza, R. F. Resultados
80
Figura 21 – Cinética da produção de protease pelo Streptomyces sp. RCQ 1071 cultivado
durante 5 dias em meio TLE a 28 ºC / 200 rpm.
Figura 22 – Cinética da produção de β-1,3-glucanase pelo Streptomyces sp. RCQ 1071
cultivado durante 5 dias em meio TLE a 28 ºC / 200 rpm.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia
Tempo (dias)
Glucanase (U/mg)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (dias)
Protease (U/mL)
Souza, R. F. Resultados
81
Figura 23 – Curva de crescimento do Streptomyces sp. RCQ 1071 cultivado em meio TLE
durante 5 dias a 28 ºC / 200 rpm, determinada através de dosagem de proteína do
sobrenadante do meio de cultivo.
4.6. Efeito do pH e da temperatura na atividade de exoquitinase
O efeito da temperatura e do pH na atividade de exoquitinase foi determinado conforme
descrito no item 3.10 e 3.11. Foi observado que a exoquitinase produzida pelo Streptomyces
sp. RCQ 1071 foi capaz de atuar no substrato em uma ampla faixa de temperatura, variando
de 28 ºC à 70 ºC. A melhor temperatura observada para a atividade enzimática foi 50 ºC,
embora a diferença não tenha sido significativa quando foi utilizada a temperatura de 40 ºC.
À 60 ºC, a atividade foi reduzida pela metade e a 28 ºC a atividade foi de aproximadamente
24% (Fig. 22).
A exoquitinase produzida pelo Streptomyces sp. RCQ 1071 foi capaz de atuar em uma
ampla faixa de pH, variando de 3,0 a 10,0. A maior atividade foi observada em pH 7,0,
embora tenha sido detectada níveis significativos de exoquitinase em valores de pH 8,0 e 6,0.
Nos valores de pH 4,0 e 5,0, a atividade foi reduzida para 50% e se manteve constante. Nos
valores de pH extremos (3,0, 9,0 e 10,0) a atividade foi bastante reduzida, atingindo no
máximo 30 % de atividade (Fig. 23).
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5
Tempo (Dias)
Proteína (
µ
g/mL)
Souza, R. F. Resultados
82
Figura 24 - Efeito da temperatura na atividade de exoquitinase do Streptomyces sp. RCQ
1071 após crescimento em meio TLE durante 4 dias / 28ºC / 200 rpm.
Figura 25 - Efeito do pH na atividade de exoquitinase do Streptomyces sp. RCQ 1071 após
crescimento em meio TLE durante 4 dias / 28ºC / 200 rpm.
0
20
40
60
80
100
120
28 40 50 60 70
Temperatura (ºC)
Atividade relativa (%)
0
20
40
60
80
100
120
3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
pH
Atividade relativa (%)
Souza, R. F. Resultados
83
4.7. Efeito do pH e da temperatura na atividade proteolítica
O efeito do pH e da temperatura na atividade proteolítica foi determinado através de
eletroforese em gel de poliacrilamida co-polimerizado com gelatina. Após eletroforese, o gel
foi incubado nas diferentes condições e, através da análise da intensidade das bandas, foram
determinadas as melhores condições para atividade da enzima. Foram detectadas duas zonas
de hidrólise, com pesos moleculares bastante distintos, sendo estas mais facilmente
observadas quando o gel foi incubado a 40 ºC. A protease de menor massa molecular não foi
observada nas outras temperaturas testadas, enquanto que a de massa molecular maior teve a
sua atividade intensificada quando incubada a 50 ºC. Pode ser observado que esta mesma
protease foi capaz de clivar o substrato em uma ampla faixa de temperatura, variando de 25 a
50 ºC (Fig. 24).
Figura 26 - Efeito da temperatura na atividade proteolítica do Streptomyces sp. RCQ 1071
após crescimento em meio TLE durante 4 dias / 28ºC / 200 rpm. (A) 25 ºC; (B) 28 ºC; (C)
40ºC; (D) 50ºC.
Entretanto, foram observadas 4 zonas de hidrólise com pesos moleculares distintos
quando o gel foi incubado em diferentes valores de pH. Pode-se verificar que as proteases
produzidas pelo Streptomyces sp. RCQ1071 atuaram em uma ampla faixa de pH, desde
valores ácidos (3,0) até alcalinos (9,0). Embora a degradação do substrato fosse mais intensa
em pH 9,0, também pode ser observada uma atividade bastante intensa em valores de pH 7,0 e
A B C D
Protease 3
Protease 4
Souza, R. F. Resultados
84
6,0. Em valores de pH mais ácidos (pH 3,0 e 5,0), apenas 3 zonas de hidrólise foram
observadas, sendo 3,0 o valor de pH menos favorável para a atuação dessas enzimas (Fig. 25).
Figura 27 – Efeito do pH na atividade proteolítica do Streptomyces sp RCQ 1071 após
crescimento em meio TLE durante 4 dias / 28 ºC / 200 rpm. (A) pH 3,0; (B) pH 5,0; (C) pH
6,0; (D) pH 7,0; (E) pH 9,0
4.8. Efeito do pH e da temperatura na atividade de
β
ββ
β
-1,3-glucanase
Foi observado que as β-1,3-glucanases produzidas pelo Streptomyces sp RCQ 1071
foram capazes de atuar em uma faixa de temperatura entre 30 e 50 ºC. Entretanto, quando a
temperatura foi elevada para 60 ºC, a atividade não foi detectada. Não foi observada uma
diferença significatica entre a atividade detectada a 40 e a 60 ºC, enquanto que a 30 ºC a
atividade reduzida em torno de 65% (Fig. 26). As β-1,3-glucanases produzidas pelo
Streptomyces sp RCQ 1071 foram capazes de atuar em uma ampla faixa de pH, variando de
3,0 à 7,0, apresentando maior atividade em pH 5,0. Pode ser observado que estas enzimas
apresentaram a maior faixa de atuação em valores de pH ácidos. Em pH 7,0, a atividade
enzimática foi reduzida para cerca de 20%, enquanto que em valores de pH ácidos a menor
atividade detectada foi de 65% (Fig. 27).
A B C E D
Protease 2
Protease 3
Protease 1
Protease 4
Souza, R. F. Resultados
85
Figura 28 - Efeito da temperatura na atividade de β-1,3-glucanase do Streptomyces sp. RCQ
1071 após crescimento em meio TLE durante 4 dias / 28ºC / 200 rpm.
Figura 29 - Efeito do pH na atividade de β-1,3-glucanase do Streptomyces sp. RCQ 1071
após crescimento em meio TLE durante 4 dias / 28ºC / 200 rpm.
0
20
40
60
80
100
120
3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0
Valores de pH
Atividade relativa
0
20
40
60
80
100
120
20 30 40 50 60 70
Temperatura (ºC)
Atividade relativa
Souza, R. F. Resultados
86
4.9. Purificação parcial da exoquitinase
O sobrenadante obtido após 4 dias de cultivo do Streptomyces sp. RCQ 1071 em meio
TLE foi aplicado em coluna de troca aniônica Mono-Q em sistema FPLC. Foram detectados
pelo menos 5 picos de proteína diferentes, sendo a atividade de exoquitinase detectada apenas
entre as frações 11 e 25 (Fig. 28). Estas frações foram reunidas, concentradas em sistema
AMICON e aplicadas em SDS-PAGE sob condições desnaturantes (Fig.29). A detecção da
atividade quitinolítica da fração em SDS-PAGE co-polimerizado com glicol-quitina revelou a
presença de apenas uma exoquitinase produzida pelo Streptomyces sp. RCQ 1071, com massa
molecular de aproximadamente 72,8 kDa (Fig. 30). Ao final do processo foi observado um
rendimento de 80 % na atividade de exoquitinase, conforme pode ser observado na Tabela 4.
Entretanto, não foi detectada atividade de exoquitinase após cromatografia de filtração em gel
(Superose 12). A atividade de β-1,3-glucanase não foi detectada nas frações obtidas após
cromatografia de troca aniônica.
Figura 30 – Cromatografia de troca aniônica (Mono-Q) em sistema FPLC do sobrenadante de
cultivo do Streptomyces sp. RCQ 1071 obtidos após 4 dias de cultivo em meio TLE a 28 ºC /
200 rpm. (
─) Proteína; (--) Exoquitinase; (---) NaCl.
0
20
40
60
80
100
120
1 6 11 16 21 26 31 36 41
Frações
Atividade de exoquitinase (U/mL)
NaCL (%)
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0,2
Proteina (280 nm)
1
2
3
4
5
Souza, R. F. Resultados
87
Figura 31 – Eletroforese em SDS-PAGE 15% do sobrenadante de cultivo do Streptomyces sp.
RCQ 1071 (A) e da fração obtida após cromatografia de troca aniônica (Mono-Q) (B). Padrão
de massa molecular (C)
Figura 32 – Detecção da atividade quitinolítica do Streptomyces sp. RCQ 1071 crescido em
meio TLE durante 4 dias / 28ºC / 200 rpm, através de SDS-PAGE co-polimerizado com
glicol-quitina.
72,8
181,8
115,5
82,2
64,2
48,8
37,1
kDa
59,2
115,5
181,8
25,9
82,2
64,2
48,8
37,1
19,4
A B C
64,2
48,8
52,6
70,6
24,9
36,2
31,1
Souza, R. F. Resultados
88
Etapas
Proteina
(µ
µµ
µg/mL)
Exoquitinase
(U/mL)
Atividade específica
(U/mg)
Recuperação
(%)
Purificação
(vezes)
Extrato bruto
52,6 8,4 158,9 - -
Extrato bruto filtrado
em membrana 0.22 υ
υυ
υm
25,7 7,8 304,3 93 1,9
Mono-Q
6,04 6,7 1107,8 80 3,6
Tabela 4 – Etapas do processo de purificação da exoquitinase produzida pelo Streptomyces
sp. RCQ 1071.
4.10. Co-cultivo entre Rhizoctonia solani e Streptomyces sp. RCQ 1071
O Streptomyces sp. RCQ 1071 foi capaz de crescer tanto em meio contendo micélio de
R. solani não viável, conforme mostrado nos resultados descritos anteriormente, como em
micélio viável. Durante o co-cultivo foi observado que as hifas de R. solani foram lisadas,
quando estas foram observadas em microscópio óptico (Fig. 31) e reveladas com MTT
(brometo (3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium)) (dados não mostrado). Estas
observações do co-cultivo revelaram que o Streptomyces sp RCQ1071 cresceu, aderiu e
enovelou-se às hifas de R. solani, degradando-as, como pode ser observado na Figura 32.
Souza, R. F. Resultados
89
Figura 33 – Microscopia óptica (400x) do micélio de R. solani co-cultivado com o
Streptomyces sp. RCQ 1071. A, B e C – Co-cultivo do Streptomyces sp. RCQ 1071 e R.
solani. D – Hifas de R. solani (controle). As setas mostram a adesão das hifas do
Streptomyces sp. RCQ 1071 e as alterações ocasionadas às hifas de R. solani.
Figura 34 – Microscopia óptica (1000x) do micélio de R. solani co-cultivado com o
Streptomyces sp. RCQ 1071.
A B
C
D
R. solani
Streptomyces
sp. RCQ 1071
Souza, R. F. Resultados
90
4.11. Interação entre Rhizoctonia solani e Streptomyces sp. RCQ 1071
A análise da interação entre os dois microrganismos foi realizada através de western-
blotting, utilizando o extrato polipeptídico de superfície de Streptomyces sp. RCQ 1071 e o
extrato polipeptídico total de R. solani. Os extratos celulares obtidos foram inicialmente
analisados por SDS-PAGE, conforme pode ser observado na Figura 33. Foram observados
perfis polipeptídicos bastante complexos nos extratos celulares de ambos os microrganismos,
com massas moleculares variando desde maiores que 176 kDa a menores que 14 kDa. Em
destaque, pode-se observar o polipeptídeo de superfície do Streptomyces sp. RCQ 1071
relacionado com a interação entre os dois microrganismos. Após a incubação da membrana
contendo os polipeptídeos de R. solani com o extrato polipeptídico de Streptomyces sp. RCQ
1071 marcado com biotina, pode-se verificar a presença de diversas bandas de interação, com
massas moleculares variando de 66,4 kDa a 17,1 kDa (Fig. 34).
Figura 35 – Perfil polipeptídico dos extratos celulares de Streptomyces sp. RCQ1071(B), R.
solani (C) e Padrão de massa molecular (A) em SDS-PAGE 12,5%.
19
50
81
A B
C
113
64
37
26
176
14
Polipeptídeo de
interação
Souza, R. F. Resultados
91
Figura 36 - Interação entre polipeptídeos de superfície do Streptomyces sp. RCQ1071 e
polipeptídeos de R. solani. 1 – Polipeptídeos do Streptomyces sp. RCQ1071 sem marcação; 2
- Polipeptídeos de R. solani sem marcação; 3 - Polipeptídeos do Streptomyces sp. RCQ1071
marcados com biotina; 4 – Polipeptídeos do Streptomyces sp. RCQ1071 ligadas a
polipeptídeos de R. solani, após interação durante 1 hora. A – Após SDS-PAGE 12,5%; B –
Após SDS-PAGE 15%.
4.12. Purificação do polipeptídeo de reconhecimento
Após a interação entre os polipeptídeos de superfície de Streptomyces sp. RCQ1071 e R.
solani, a membrana foi submetida a um processo de desligamento, conforme descrito no item
3.19. Em seguida, o extrato obtido foi submetido a cromatografia de filtração em gel em
coluna Superose 12. Pode-se verificar a presença de um polipeptídeo majoritário que foi
recolhido nas frações de 29 a 38 (Fig. 35).
As frações contendo este polipeptídeo foram reunidas, concentradas em sistema
centricon “cut off” 10.000, e o extrato obtido analisado em SDS-PAGE desnaturante. Após
revelação através de coloração pela prata, verificou-se a presença de apenas uma banda, com
uma massa molecular de aproximadamente 61 kDa (Fig. 36A). Em seguida, o extrato foi
submetido a interação com os polipeptídeos de R. solani, conforme descrito no item 2.19.
Após o processo de interação, observou-se o reconhecimento entre o polipeptídeo de
superfície purificado do Streptomyces sp. RCQ1071 e um polipeptídeo de R. solani (Fig.
36B). A massa molecular do polipeptídeo também foi determinada pela eletroforese bi-
dimensional em 60 kDa, com um ponto isoelétrico de 8,22 (Fig. 37).
1
2
3
4
A
B
kDa
176
81
50
19
113
64
37
26
kDa
66,4
55,4
41,2
31
34,6
61,8
44,3
26,9
20,5
18,4
17,1
32,8
21,6
kDa
64
37
176
113
81
50
26
Souza, R. F. Resultados
92
Figura 37 – Cromatografia de filtração em gel (Superose 12) do extrato polipeptídico do
Streptomyces sp. RCQ 1071 extraído da membrana de interação.
Figura 38 – (A) Eletroforese em SDS-PAGE sob condições desnaturantes da fração obtida
após cromatografia de filtração em gel (Superose 12) do extrato polipeptídico do
Streptomyces sp. RCQ 1071; (B) Interação entre o polipeptídeo do Streptomyces sp. RCQ
1071, marcado com biotina, após “western-blotting” dos polipeptídeos de R. solani.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Frações
Proteína (280 nm)
A
B
61 kDa
Polipeptídeo de reconhecimento
Souza, R. F. Resultados
93
Figura 39– Eletroforese bi-dimencional em SDS-PAGE 12,5% da fração obtida após
cromatografia de filtração em gel (Superose 12) do extrato polipeptídico do Streptomyces sp.
RCQ 1071.
4.13. Formulação do Streptomyces sp. RCQ 1071 e análise da estabilidade
A durabilidade das formulações foi analisada através de UFC durante 6 meses em
intervalos de 20 dias. Foi verificado que a duas formulações apresentaram uma grande
quantidade de esporos viáveis imediatamente após o preparo das mesmas (8,0 x 10
7
esporos/g). A formulação em grânulos de alginato apresentou grande estabilidade nos
primeiros 80 dias de armazenamento, tanto a 4 ºC quanto a 28 ºC. A partir do 100º dia, a
quantidade de esporos viáveis foi sendo reduzida, e ao final de 6 meses de armazenamento,
apresentou uma quantidade de esporos viáveis cerca de 50% menor (Fig. 38).
A formulação em pó molhável apresentou uma grande estabilidade até o 100º dia de
armazenamento, apresentando uma pequena queda até o 180º dia. Ao final do processo, a
quantidade de esporos viáveis foi de aproximadamente 80% a 4 ºC e de 76% a 28 ºC (Fig. 39)
kDa
220
116
176
76
53
60 kDa
pI 8,2
Souza, R. F. Resultados
94
Figura 40 – Análise da estabilidade da formulação em grânulos de alginato do Streptomyces
sp. RCQ 1071 durante estocagem a 4 ºC ( --- ) e a 28 ºC ( ─ ) durante 6 meses.
Figura 41 – Análise da estabilidade da formulação em pó molhável do Streptomyces sp. RCQ
1071 durante estocagem a 4 ºC ( --- ) e a 28 ºC ( ─ ) durante 6 meses.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Tempo de estocagem (dias)
Esporos viáveis (log CFU/g)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Tempo de estocagem (dias)
Esporos viáveis (log CFU/g)
Souza, R. F.
Resultados
95
4.14. Controle biológico
4.14.1. Ensaio com a suspensão de esporos
A eficiência do
Streptomyces
sp. RCQ 1071 em controlar os efeitos danosos de
R. solani
nas plântulas de tomate e no fruto foi avaliada através de ensaios em casa de vegetação e “in
vitro”, respectivamente, conforme descrito nos ítens 3.24.1.2 e 3.24.1.2. Foi observado que o
Streptomyces
sp. RCQ 1071 impediu a colonização dos frutos por
R. solani
, impedindo assim
os efeitos danosos causados pelo fitopatógeno (Fig. 40).
O
Streptomyces
sp. RCQ 1071 foi capaz de controlar eficientemente os efeitos danosos
causado por
R. solani
nas plântulas de tomate. Verificou-se que o
Streptomyces
sp. RCQ 1071
reduziu a incidência da doença causada pelo fitopatógeno em aproximadamente 44 %, com a
o percentual de plântulas saudáveis em torno de 79,2%, valor este semelhante ao controle.
Também foi observado que o
Streptomyces
sp. RCQ 1071 não causou doença nas plântulas
(Fig. 41 e 42).
Souza, R. F.
Resultados
96
Figura 42 - Avaliação do efeito controlador de
Streptomyces
sp. RCQ 1071 sobre
R. solani
em
pedaços de tomate. (A) Tomate infectado por
R. solani
; (B) Streptomyces sp RCQ1071 e
R.
solani
; (C) Controle; (D)
Streptomyces
sp. RCQ1071.
Inóculo
R. solani
A B
C D
Inóculo
R. solani
Souza, R. F.
Resultados
97
Figura 43 – Controle biológico de
R. solani
em plântulas de tomate, utilizando a suspensão de
esporos do
Streptomyces
sp. RCQ 1071.
Controle;
Suspensão de esporos do
Streptomyces
sp. RCQ 1071;
R. solani
;
R. solani +
Suspensão de esporos do
Streptomyces
sp.RCQ 71.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tratamentos
Percentual de plântulas saudáveis
Souza, R. F.
Resultados
98
Figura 44 – Controle biológico de
R. solani
utilizando a suspensão de esporos do
Streptomyces
sp. RCQ 1071. (A) Suspensão de esporos do
Streptomyces
sp.
RCQ 1071; (B)
R. solani
; (C)
R. solani +
Suspensão de esporos do
Streptomyces
sp.
RCQ 1071; (D)
Controle.
4.14.2. Ensaio com as formulações
As formulações foram analisadas quanto a capacidade de controlar os efeitos danosos de
R. solani
nas plântulas de tomate em casa de vegetação, conforme as condições descritas no
item 3.23. Foi observado que a formulação em pó molhável foi capaz de controlar as doenças
causadas por
R. solani
. O percentual de plantas saudáveis foi semelhante ao obtido tanto no
tratamento com Monceren
®
quanto no controle. O efeito biocontrolador do
Streptomyces
sp.
RCQ 1071 foi eficiente quando utilizado através do revestimento das sementes ou diretamente
A
D
C
B
Souza, R. F.
Resultados
99
no solo (Fig. 43). Os resultados foram semelhantes quando foi testada a formulação em
grânulos (Fig. 44).
Figura 45 – Controle biológico de
R. solani
utilizando a formulação em pó molhável do
Streptomyces
sp. RCQ 1071.
Controle;
Sementes revestidas com formulação +
R.
solani
;
Monceren +
R. solani
;
Formulação
+ R. solani
;
R. solani
.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tratamentos
Percentual de plântulas saudáveis
0
20
40
60
80
100
120
Tratamentos
Percentual de plântulas saudáveis
Souza, R. F.
Resultados
100
Figura 46 – Controle biológico de
R. solani
utilizando a formulação em grânulos do
Streptomyces
sp. RCQ 1071.
Controle;
Monceren +
R. solani
;
Formulação +
R.
solani
;
R. solani
.
4.15. Análise estatística
Os resultados obtidos nos experimentos de controle biológico foram submetidos a
análise estatística utilizando o teste de
χ
2
. A análise demonstrou a validade de todos os
resultados obtidos, apresentando diferenças significativas entre os diferentes tratamentos nos
experimentos realizados. Estas diferenças podem ser obsrevados nos resultados do teste de
χ
2
apresentados na Tabela 5.
SUSPENSÃO DE ESPOROS
TRATAMENTOS VALOR P
Controle x suspensão de esporos do
Streptomyces
sp.
RCQ 1071
0,48
Controle x
R. solani
0,00044
Controle x
R. solani
+ suspensão de esporos do
Streptomyces
sp.RCQ 1071
1
R.solani
x
R. solani
+ suspensão de esporos do
Streptomyces
sp.RCQ 1071
0,001372
R. solani
x suspensão de esporos do
Streptomyces
sp.RCQ 1071
0,00377
FORMULAÇÃO EM GRÂNULOS
TRATAMENTOS VALOR P
Controle x Monceren 1
Controle x formulação 0,344
Souza, R. F.
Resultados
101
Controle x
R. solani
1
Monceren x formulação 0,66
Formulação x
R. solani
0,000004
FORMULAÇÃO EM PÓ MOLHÁVEL
Controle x Sementes revestidas com formulação 0,41
Controle x Monceren 0,25
Controle x Formulação
0,66
Controle x
R. solani
0,000001
Formulação x
R. solani
0,000015
Sementes revestidas com formulação x
R. solani
0,000055
Sementes revestidas com formulação x Monceren 0,73
Formulação x Monceren 0,48
Tabela 5 – Análise estatística dos resultados obtidos nos experimentos de controle biológico,
através do teste de
χ
2
.
4.16. Identificação do Streptomyces sp. RCQ 1071
A taxonomia do
Streptomyces
sp. RCQ 1071 foi realizada através de uma abordagem
polifásica, compreendendo testes pertencentes a taxonomia convencional, numérica e
molecular. Foram realizados 75 testes de taxonomia numérica que estão representados na
Tabela 6. Nesta tabela, pode-se observar que o
Streptomyces
sp. RCQ 1071 apresentou
algumas características peculiares que o diferencia das outras espécies analisadas. Dentre
estas características podemos citar a coloração do micélio substrato, a atividade proteolítica e
lipolítica, resistência a sulfato de estreptomicina, crescimento a 45 ºC, na presença de telurito
de potássio e azida sódica, degradação de hipoxantina, arbutina, elastina, dentre outros testes.
O RNA ribossomal 16S do
Streptomyces
sp. RCQ 1071, depositado no GenBank
(DQ094838), foi seqüenciado quase completamente (1480 nucleotídeos), e submetido à
Souza, R. F.
Resultados
102
análise filogenética com sequências semelhantes obtidas dos bancos de dados (Fig. 45). Pode-
se verificar que o
Streptomyces
sp. RCQ 1071 não apresentou semelhança com as espécies
analisadas, demonstrando que esta estirpe é filogeneticamente distante de outros
estreptomicetos, sendo assim sugerida uma nova espécie,
Streptomyces lunalinharensis
. A
estirpe foi depositada na “American Type Culture Colection”, no “Centre de Ressources
Biologiques de Institut Pasteur” e no “German Resource Centre for Biological Material”, sob
os números BAA-1231
T
, CRBIP- 108852
T
e DSMZ-41876
T
, respectivamente.
Características
1
2
3
4
5
Morfologia e pigmentação:
Presença de esporos (micélio
aéreo)
+ + + - +
Produção de massa de esporos
aéreos
+ + + - +
Morfologia da cadeia de esporos:
Verticilado + - - - -
Espiralado - + + - +
Retinaculiaperti - - - - -
Retoflexível - - - - -
Pigmentação do micélio substrato
:
Cor da massa de esporos cinza cinza cinza - cinza
Cor do micélio substrato Amarelo
/marron
- verde - -
Produção de pigmentos difusíveis +
Amarelo
/marron
- +
Amarelo/ma
rron
- -
Sensibilidade do pigmento
substrato ao pH
- - - - -
Sensibilidade do pigmento
difusível ao pH
- - - - -
Produção de melanina em agar
tirosina
- - - - -
Produção de melanina em agar
peptona/extrato de levedura/ferro
- - - - -
Produção de H
2
S + ND ND ND ND
Atividade enzimática:
Hidrólise de pectina - - - - -
Redução de nitrato - - - -
-
Catalase + ND ND ND ND
Atividade em meio de gema de
ovo
:
Lecitinase - - - - -
Souza, R. F.
Resultados
103
Proteólise + - + - -
Lipólise + - - + +
Degradação de:
Alantoina + - - - -
Arbutina - + - - +
Caseina + + + + +
Quitina + - + + +
Elastina + - - + -
Gelatina + + + + +
Pectina - - - - -
Queratina - ND ND ND ND
Xilana - - - - -
Amido + + + - +
L-Tirosina + + + + +
Xantina - - - - -
Guanina - + + - -
Hipoxantina + + - + -
Crescimento em fontes de
carbono:
Glicose + + + + +
Inulina - - - - -
D-Xilose - - - - -
D-Melibiose - - + + -
Rafinose - - + - -
Celobiose + - + + +
L-Ramnose + - + - -
D-Frutose + + - - -
D-Manose + + + + +
Adonitol + - + + -
Resistência a antibióticos:
Sulfato de neomicina (50
µ
g ml
-1
)
- - - + -
Oleandomicina (100
µ
g ml
-1
)
- - - - -
Penicilin G (10 i.u. ml
-1
) + + - + -
Rifampicina (50
µ
g ml
-1
)
- - - + -
Sulfato de estreptomicina (100
µ
g
ml
-1
)
+/- - - + -
Sulfato de gentamicina (100
µ
g
ml
-1
)
- - - - -
Dimetilclortetraciclina (500
µ
g ml
-
1
)
- - - - -
Novobiocina (100
µ
g ml
-1
)
+ ND ND ND ND
Metaciclina (100
µ
g ml
-1
)
+ ND ND ND ND
Ampicilina (100
µ
g ml
-1
)
+ ND ND ND ND
Cicloheximida (100
µ
g ml
-1
)
+ ND ND ND ND
Crescimento em/a:
Cloreto de sódio (7% w/v) + - - + -
Azida sódica (0,01% w/v) + - - - -
Souza, R. F.
Resultados
104
Fenol (0,1 % w/v) - - - - -
Telurito de potássio (0,001% w/v) + - - - -
45
0
C - - - - -
Atividade antimicrobiana contra:
Aspergillus niger (NIG)
+ + - + -
Micrococcus luteus (LUT)
+ + - - +
Streptomyces. murinus (MUR)
+ - - + -
Bacillus subtillis (SUB)
- - - + -
Saccharomyces cerevisiae (CER)
- - - - -
Candida albicans (ALB)
+ - - - -
Crescimento em fonte de
nitrogênio:
L-fenilalanina + + - - -
L-Hidroxiprolina + - - - -
L-Histidina + - + + +
L-Metionina + - - - -
Ácido amino-n-butírico + - - - +
L-Arginina + + + - -
L-Cisteína - - + - -
L-Valina + - - - -
L-Asparagina + ND ND ND ND
Tabela 6 - Características fenotípicas que diferenciam a estirpe 1,
Streptomyces
sp.
RCQ1071
T
das outras estirpes filogeneticamente relacionadas descritas de acordo com
Williams
et al
., 1983a e b (2,
S. lydicus
) e das espécies de
Streptomyces
quitinolíticos (3,
S.
olivaceoviridis
;
4,
S. rimosus
; 5,
S. violaceoniger
). (ND), - não determinado; (+), positivo; (-)
negativo.
Souza, R. F.
Resultados
105
Figura 47 – Filogenia da estirpe RCQ1071
T
e de estreptomicetos relacionados. A árvore foi
baseada no alinhamento de aproximadamente 1400 pares de base, a distância evolucionária
calculada utilizando o modelo de Galtier & Gouy e construída utilizando Neighbour-Joining.
Os números de acesso das sequências estão entre parenteses.
Streptomyces
melanosporofaciens
AJ391837 foi utilizado como “out group”. Os números nas ramificações
indicam o percentual de “bootstrap” baseado em 1000 rearranjos e somente valores acima de
50% foram mostrados. A escala representa 0,01 de substituição de nucleotídeo por posição.
60
84
0.01
S. melanosporofaciens NRRL B-12234T (AJ391837)
S. rutgersensis subsp. castelarensis DSM 40830T (AY508511)
S. kasugaensis M338-M1T (AB024441)
S. indonesiensis A4R2 (S34)T (AJ391835)
S. sparsogenes NRRL 2940T (AJ391817)
S. griseocarneus DSM40004T (X99943)
S. mobaraensis var. ladakanum DSM 40587T ISP 5587 (X53167)
S. griseus ATCC 23345T (AF056711)
S. violaceusniger NRRL-ISP 5563T (AJ391823)
S. cebimarensis DSM 41798T (AJ560629)
S. platensis JCM 4662T (AB045882)
S. sclerotialus DSM 43032T (AJ621608)
S. argenteolus JCM 4623T (AB045872)
S. chattanoogensis DSM 40002T (AJ621611)
S. chrestomyceticus DSM 40545T (AJ621609)
S. erumpens DSM 40941T (AJ621603)
S. lydicus ATCC 25470T (Y15507)
Streptomyces. sp RCQ 1071 (DQ094838)
S. albulus MF861-C4T (AB024443)
S. yunnanensis YIM 41004T (AF346818)
S. rimosus subsp. paromomycinus DSM 41429T (AJ621610)
S. albofaciens JCM 4342T (AB045880)
S. albus subsp. albus DSM 40313T (AJ621602)
S. mashuensis DSM40221T (X79323)
S. violens DSM 40597T (AJ621605)
S. purpurogeneiscleroticus DSM 43156T (AJ621604)
S. catenulae DSM 40258T (AJ621613)
S. tubercidicus DSM 40261T (AJ621612)
S. olivaceiscleroticus DSM 40595T (AJ621606)
S. niger DSM 43049T (AJ621607)
S. olivoreticuli ssp. cellulophilum DPDU 0278T (X53166)
S. cinnamoneus spp. cinnamoneum DPDU 0093T ISP 5005 (X53171)
S. salmonis DPDU 0098T (X53169)
S. abikoensis DSM 40831T (X53168)
S. neyagawaensis ATCC 27449T (D63869)
S. galbus DSM40089T (X79852)
S. setonii ATCC 25497T (D63872)
S. caviscabies ATCC51928T (AF112160)
100
100
82
59
51
100
96
52
98
99
99
Souza, R. F.
Discussão
106
5. DISCUSSÃO
Os actinomicetos apresentam uma grande importância ambiental, devido a sua
capacidade de produção de diversas enzimas de interesse econômico, tais como proteases,
quitinases e
β
-1,3 glucanases (Lam, 2006; Petrosyan
et al.,
2003). Algumas dessas enzimas
têm sido descritas na literatura como importantes moléculas envolvidas na atividade inibitória
de fungos fitopatogênicos, devido à parede celular destes microrganismos ser constituída em
sua maioria por quitina, glucanas e proteínas. As glucanases e quitinases agem de forma
sinérgica no processo de inibição do crescimento de fungos, tanto
in vitro
quanto na planta
(Selitrennikoff, 2001; Kubiec
et al
., 2001). Sendo assim, estas enzimas podem ser
consideradas parte integrante do mecanismo de controle biológico.
O fungo
Rhizoctonia solani
é um fitopatógeno de grande importância não só no Brasil,
mas em diversos outros países. O gênero
Rhizoctonia
é um dos mais difundidos no mundo em
terras cultivadas, compreendendo cerca de 3% do total de trabalhos publicados na área de
fitopatologia (Ogoshi, 1996). Esse fungo é comumente encontrado no solo e pode causar
consideráveis perdas a várias culturas comerciais no Brasil e no mundo. No Brasil foi relatado
sua importância na perda de culturas de hortaliças como alface, brócolis, espinafre, tomate
(Kuramae
et al
., 2003), pimentão (Almeida
et al
., 1980; Bolkan & Ribeiro, 1985), seringueira
(Campaci & Figueiredo, 1964; Gasparato, Trindade & Lieberei, 1981; Tanaka & Coqueiro,
1981), soja (Yorinori, 1998; Fenille, Souza & Kuramae, 2002; Fenille
et al
., 2003),
amendoinzeiro (Campaci & Figueiredo, 1964; Ceresini, Fenille & Souza, 1996; Kuramae
et
al
.,2002), feijoeiro (Ceresini, Fenille & Souza, 1996; Ceresini & Souza, 1997; Kuramae
et al
.,
2002; Godoy-Lutz, Steadman & Powers, 2003), eucalipto (Silveira & Alfenas, 2002), cafeeiro
(Sussel
et al
., 2001; Garcia Júnior
et al
., 2003), melancia (Nechet & Halfeld-Vieira, 2005),
batata (Ceresini
et al
., 2002; Rosa
et al
., 2005). Ao redor do mundo, é causador de doença em
uma ampla variedade de culturas de importância comercial, dentre elas o arroz
(Leelasuphakul, Sivanunsakul & Phongpaichit, 2006), a batata (Brewer & Larkin, 2005) e o
tomate (Lievens
et al
., 2006).
O controle das doenças causadas pelo gênero
Rhizoctonia
é difícil e influenciado
diretamente pelas condições de cultivo, tais como drenagem do solo e aeração. O controle
químico é bastante empregado, porém os efeitos dos agrotóxicos no meio ambiente e no
próprio homem são bastante preocupantes. Além disso, para a maioria das hortaliças, os
fungicidas utilizados não são eficientes no controle (Agrios, 1997). Sendo assim, seu controle
é de extrema importância para o desenvolvimento bem sucedido da agricultura tanto no Brasil
Souza, R. F.
Discussão
107
quanto no mundo, de forma que proporcione uma diminuição na incidência de doenças
causadas por este patógeno e aumente o rendimento das lavouras, para suprir a necessidade
cada vez maior de insumos agrícolas causado pelo aumento crescente da população mundial.
Os resultados obtidos no presente trabalho demonstram a ação efetiva do
Streptomyces
sp. RCQ 1071 no controle biológico de
R. solani
, através da ação de enzimas hidrolíticas e do
reconhecimento polipeptídeo-polipeptídeo na interação entre o fitopatógeno e o agente
biocontrolador, e o desenvolvimento de um biofungicida eficiente no controle de tombamento
causado por
R. solani
em tomate.
Inicialmente, determinamos o grupo de anastomose (AG) da estirpe de
R. solani
utilizada no trabalho, isolada pelo laboratório do Prof. Pedro Valarini (Embrapa Meio
Ambiente – Jaguariúna/SP), de amostras de solo com cultivares apresentando sintomas típicos
causados por este fitopatógeno. A identificação do AG ou de ISGs (grupos intraespecíficos)
de
R. solani
é de grande importância para o estudo da resistência genética de plantas, estudos
epidemiológicos e ecológicos de várias doenças, proporcionando um controle mais
direcionado, pois este fitopatógeno apresenta alta variabilidade fenotípica e genotípica
(Ogoshi, 1987).
Várias metodologias são empregadas para a determinação do AG, sendo estas baseadas
em características morfológicas, fisiológicas, genéticas e patogênicas. Silveira e Alfenas
(2002) utilizaram o perfil eletroforético de proteínas e isoenzimas de isolados de
R. solani
para a diferenciação entre isolados de diferentes grupos e subgrupos de anastomose.
Entretanto, alguns isolados do mesmo grupo ou subgrupo de anastomose apresentaram
diferenças significativas nos padrões de proteínas e isoenzimas, principalmente aqueles que
eram de origem geográfica distante. Hietala e colaboradores (2005) utilizaram duas
metodologias para identificar o grupo de anastomose de um isolado causador de podridão em
faias. Esses autores utilizaram testes de anastomose das hifas e análise filogenética da região
ITS1-5.8S-ITS2 do RNA ribossomal. Tais técnicas permitiram os autores classificarem o
isolado como pertencente ao AG2-1. Lubeck & Poulsen (2001) utilizaram “fingerprinting”
associado à técnica de hibridização como metodologia para determinação de AGs. A
validação dos resultados dos 21 isolados pertencentes a 11 AGs foi realizada através da
análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição da região ITS1-5.8S-ITS2. Johnk &
Jones (2001) utilizaram a análise do perfil de ácidos graxos de 70 isolados pertencentes ao
AG4 como técnica para diferenciação entre os subgrupos. Carling e colaboradores (2002)
demonstraram que o comprimento e a seqüência da região ITS1-5.8S-ITS2 era única entre
isolados de AG13, mas diferente entre os isolados de AG13 e de outros AGs. Devido à
Souza, R. F.
Discussão
108
variedade de técnicas para a determinação do AG e, principalmente, a importância da análise
através de técnicas moleculares, utilizamos no presente trabalho o seqüenciamento da região
ITS1-5.8S-ITS2. Foi observado que o isolado utilizado no presente trabalho pertence ao AG4,
visto que a análise da região ITS1-5.8S-ITS2 o inseriu no mesmo cluster de outros isolados
pertencentes ao AG4. Este resultado está de acordo com a origem do isolado, visto que
isolados pertencentes ao AG4 são os principais causadores de tombamento em tomateiro,
dentre algumas doenças em outras culturas (Mendes
et al
., 1998; Johnk & Jones, 2001).
Neste trabalho, a atividade inibitória de 13 estirpes de actinomicetos, selecionadas
anteriormente como quitinolíticos (Gomes
et al
., 1999; Gomes
et al
., 2000a; Gomes
et al
.,
2000b), foi analisada contra seis espécies de fungos fitopatogênicos. Foram selecionadas 3
estirpes de estreptomicetos (Q11, 80 e RCQ1071) com forte atividade inibitória do
crescimento de pelo menos 5 espécies de fungos fitopatogênicos (
Fusarium oxysporum
,
F.
solani
,
F.
sp.,
Aspergillus niger
e
R. solani
), embora 12 estirpes apresentassem atividade
inibitória do crescimento de pelo menos um fitopatógeno. Dessa forma, pode-se concluir que
as espécies de
Streptomyces
selecionadas são estirpes promissoras no controle biológico de
fungos fitopatogênicos.
Várias espécies de actinomicetos com atividade inibitória do crescimento de fungos
fitopatogênicos vêem sendo descritas na literatura. El-Tarabily e colaboradores (2000)
isolaram 58 estreptomicetos de rizosfera de pepino e, dentre os isolados, 8 apresentaram
atividade inibitória frente à
Pythium aphanidermatum
, sendo apenas 4 considerados fortes
inibidores do fitopatógeno. Lee e Hwang (2002) relataram o isolamento de várias espécies de
actinomicetos com atividade antifúngica, sendo mais de 50% pertencentes ao gênero
Streptomyces
. Hoster, Schmitz e Daniel (2005) isolaram 13 bactérias quitinolíticas de
amostras de solo e sedimento, dos quais 5 apresentaram atividade antifúngica e, uma das
estirpes pertencia ao gênero
Streptomyces.
As 3 estirpes selecionadas,
Streptomyces
sp. Q11,
Streptomyces
sp. 80 e
Streptomyces
sp. RCQ 1071 foram avaliadas quanto à produção de quitinases em meio contendo micélio
dos diferentes fungos fitopatogênicos, sendo detectadas atividades de endoquitinase e
exoquitinase.
O
Streptomyces
sp. RCQ 1071 foi capaz de produzir endoquitinases utilizando como
única fonte de carbono e nitrogênio o micélio de todos os fungos fitopatogênicos testados,
com exceção do
Aspergillus parasiticcus
. Os níveis de endoquitinase detectados foram bem
mais altos quando este foi cultivado em micélio de
A. niger
(0,45 U/mL). Nas outras
condições, a expressão de endoquitinase foi bastante reduzida, atingindo níveis máximos de
Souza, R. F.
Discussão
109
0,08 U/mL. A produção de exoquitinase foi detectada apenas quando esta estirpe foi cultivada
em meio contendo micélio de
R. solani
, apresentando um alto nível de atividade (0,7 U/mL).
O
Streptomyces
sp. Q11 foi a estirpe que produziu o maior nível de endoquitinase (2,7
U/mL), quando cultivado em micélio de
A. niger
, resultado semelhante ao observado com a
estirpe
Streptomyces
sp. RCQ 1071. Na presença do micélio dos outros fungos, a produção foi
bastante reduzida, sendo maior atividade detectada em micélio de
F. solani.
Entretanto, não
foram detectadas atividades de endoquitinase e exoquitinase quando o S
treptomyces
sp.
Q11
foi cultivado em micélio de
A. parasiticcus
. Também foram detectadas atividades de
exoquitinase quando a estirpe Q11 foi cultivada em micélio de
Fusarium
sp. e
R. solani
, com
níveis de 0,26 U/mL e 0,43 U/mL, respectivamente. Entretanto, os níveis de exoquitinase
foram inferiores aos detectados com a estirpe
Streptomyces
sp.RCQ 1071.
A estirpe
Streptomyces
sp. 80 foi capaz de produzir endoquitinases em meio contendo
micélio dos 7 fungos fitopatogênicos. Os maiores níveis (0,5 U/mL) foram observados
quando utilizado o micélio de
Fusarium
sp. e
A. parasiticcus
. Entretanto, as outras espécies
de
Fusarium
não foram fontes capazes de induzir níveis significativos de endoquitinase. O
micélio de
A
.
niger
e
A. parasiticcus
foram capazes de induzir apenas a produção de
endoquitinase, enquanto que as exoquitinases foram detectadas em quantidade significativa
somente em meio contendo micélio de
R. solani
.
Ruiz-Herrera já havia demonstrado, em 1967, que uma espécie de
Aspergillus
isolada de
amostra de solo apresentava cerca de 18 % de quitina e 40% de glucana na composição da
parede celular, sendo a quitina, portanto, um dos componentes majoritários destas espécies.
Desta forma, conclui-se que esta composição favoreceu a alta expressão de endoquitinase por
estes actinomicetos. Em 1970, Bull determinou a composição da parede celular de
A
.
niger
e
verificou que o percentual de N-acetilglucosamina era de apenas 2,3%. Schneider & Wardrop,
em 1978 também demonstraram que a parede celular de
F. sulphureum
é composta por uma
camada de microfibrilas de quitina arranjadas randomicamente. Schoffelmeer e colaboradores
(1999) descreveram a composição da parede celular de
F. solani
e detectaram que o
percentual de N-acetilglucosamina variou de 8 a 11%. Selitrennikoff (2001) descreveu que a
composição química da parede celular dos fungos apresenta diferenças claras e discerníveis
entre as espécies. Este mesmo autor propôs um modelo de parede celular, onde se pode
verificar que a quitina é encontrada em uma camada interna, revestida por uma espessa
camada de
β
-1,3-glucana e, mais externamente por uma fina camada de proteínas e
β
-1,6-
glucana. Pérez & Ribas, em 2004, demonstraram que a parede celular de
Schizosaccharomyces pombe
é constituída por aproximadamente 80% de glucana. Dahiya,
Souza, R. F.
Discussão
110
Tewari & Hoondal (2005) descreve que a parede celular de fungos filamentosos é constituída
por 16% de quitina. Entretanto, Gohel e colaboradores (2006) relataram que a maioria dos
fungos possui de 22 a 40% de quitina na parede celular. Desta forma, sugere-se que esta
expressão diferenciada de endoquitinases e exoquitinases na presença do micélio de diferentes
fungos pode estar relacionada com a variação do percentual de quitina na composição de suas
paredes celulares.
Além disso, fatores como, por exemplo, aeração, pH, tempo e temperatura de
incubação, composição do meio de cultivo, principalmente em relação à fonte de carbono e
nitrogênio, também são fatores que afetam a produção de enzimas (Pitson, Seviour &
McDougall, 1997; Noronha
et al
., 2000; Jayus, McDougall & Seviour, 2005). Souza e
colaboradores (2005) demonstraram que as condições de cultivo influenciaram de forma
significativa à expressão de quitinases pelo fungo
Colletotrichum gloeosporioides
. Dahiya,
Tewari & Hoondal (2006) relataram que a produção de quitinases é influenciada pela
composição do meio de cultivo, tais como fonte de carbono e nitrogênio. Dessa forma, as
diferenças na produção de quitinases por estes microrganismos podem ainda ter sido
influenciada pelas condições de cultivo, visto que foi utilizada apenas uma condição de
cultivo.
Foi verificado que a expressão de endoquitinases pelas estirpes selecionadas foi elevada
em meio de cultivo contendo micélio de
Aspergillus niger
, sendo estas enzimas mais
expressas que as exoquitinases. De uma forma geral, a expressão de exoquitinases foi limitada
em meio contendo micélio de algumas espécies de fungos, sendo os níveis mais altos
observados quando cultivado com micélio de
R. solani
. O micélio das espécies de
Fusarium
testadas não foram substratos capazes de induzir níveis significativos de endoquitinases e
exoquitinases produzidas pelas estirpes de actinomicetos, com exceção da estirpe
Streptomyces
sp. 80, que apresentou níveis semelhantes ao observado quando foi utilizado o
micélio de
Aspergillus
. Dahiya e colaboradores (2005) observaram que
Enterobacter
sp.
NGR4 foi capaz de produzir níveis bem mais altos de quitinase (1,2 U/mL) em meio contendo
micélio de
Candida albicans
e suplementado com 0,5% de quitina coloidal, comparada a
produção em meio contendo apenas micélio (0,05 U/mL). Estes mesmos autores
demonstraram também que a expressão de quitinases apresenta diferenças significativas
quando o microrganismo é cultivado em meio contendo micélio de diferentes fungos.
As enzimas quitinolíticas já vêm sendo descritas na literatura como fatores importantes
nos processos de inibição do crescimento de microrganismos que apresentam quitina na
composição da parede celular. Várias bactérias quitinolíticas, tais como,
Serratia marcescens,
Souza, R. F.
Discussão
111
Aeromonas caviae, Enterobacter agglomerans e Bacillus sp.
BG-11 são consideradas agentes
promissores no controle biológico de fitopatógenos (Inbar & Chat, 1991; Chernin
et al
., 1997;
Bhushan, 2000; Chang,
Chen & Wang, 2003). Gomes e colaboradores (2000a e 2000b)
detectaram atividade antifúngica de 5 estirpes de actinomicetos quitinolíticos isolados de solo.
Esses mesmos autores, em 2001, demonstraram a inibição do crescimento de
A. parasiticcus
pelo
Streptomyces
sp. RCQ 1071 através da ação de uma endoquitinase, causando inibição da
germinação dos esporos e estreitamento das hifas. Gohel
et al
(2006) descreveram vários
microrganismos quitinolítcos e seus respectivos genes, utilizados no controle biológico
através da transformação de plantas, tornado-as resistentes a um ou mais fungos
fitopatogênicos. A estratégia mais amplamente utilizada no controle biológico envolve a
expressão de genes de quitinases e glucanases em plantas, fortalecendo os mecanismos de
defesa. Os níveis dessas enzimas aumentam consideravelmente imediatamente após o ataque
do patógeno (Ferraris, Gentile & Matta, 1987). Essas enzimas são responsáveis pela lise da
parede celular fúngica e/ou prevenção do crescimento das hifas (Vaidya
et al
., 2001; Gohel
et
al
., 2004). Vários autores já demonstraram a ação lítica de enzimas hidrolíticas como
quitinases, proteases e glucanases na parede celular de fungos (Tweddell, Jabaji-Hare &
Charest, 1994; Chiu & Tzean, 1995; Inbar & Chet, 1995; Podile & Prakash, 1996; Zeilinger
et
al
., 1999; De Marco, Valadaris-Inglis & Felix, 2003; Leelasuphakul, Sivanunsakul &
Phongpaichit, 2006).
A expressão de quitinases pelas estirpes de actinomicetos em meio de cultivo contendo
micélio de fungo, aliada ao alto grau de inibição do crescimento dos mesmos, sugere uma
possível aplicação destas estirpes no controle biológico. Dentre 3 estirpes de actinomicetos, o
Streptomyces
sp. RCQ 1071 produziu altos níveis de exoquitinase e apresentou forte atividade
inibitória do crescimento dos fungos fitopatogênicos, portanto, esta estirpe foi selecionada
para avaliação quanto à produção das enzimas hidrolíticas exoquitinase, protease e
β
-1,3-
glucanase.
A produção destas enzimas foi avaliada em meio de sias minerais contendo, como única
fonte de carbono e nitrogênio, micélio de
R. solani
, fitopatógeno selecionado devido a sua
importância econômica, como causadora de doenças em uma grande variedade de culturas de
importância comercial no Brasil (Mendes
et al
., 1998). Foi observado que a produção de
exoquitinase apresentou um aumento significativo na sua expressão entre 12 e 30 horas de
cultivo, atingindo o máximo em 18 horas, com 0,35 U/mL. A expressão de proteases se
iniciou antes de 6 horas de cultivo atingindo o ápice de produção com 12 horas, antecedendo a
produção de exoquitinase. De Marco e Felix (2002), demonstraram que uma protease, com
Souza, R. F.
Discussão
112
ação lítica na parede celular do fitopatógeno
Crinipellis perniciosa
, foi produzida por
Trichoderma harzianum
a partir de 24 horas de cultivo. Esta mesma estirpe teve sua produção
de exoquitinase detectada em quantidades significativas a partir de 48h, atingindo o máximo
em 72 horas (0,41 U/mL), um tempo de cultivo maior que para a protease (De Marco,
Valadares-Inglis & Felix, 2003). Entretanto, esta atividade de exoquitinase foi bastante
reduzida quando comparada à produzida pelo
Streptomyces
sp. RCQ 1071 (0,75 U/mL),
principalmente considerando o fato que estes autores utilizaram meio enriquecido com quitina
para a produção das enzimas. Gomes e colaboradores (2000a e 2000b) analisaram a atividade
de exoquitinase de 5 actinomicetos isolados de solo e observaram que a maior atividade
detectada foi em torno de 2,06 U/mg, bastante inferior a atividade expressa pelo
Streptomyces
sp. RCQ 1071 (159 U/mg).
Objetivando uma maior produção de enzimas hidrolíticas pelo
Streptomyces
sp. RCQ
1071, esta estirpe foi cultivada durante 5 dias em meio TLE, contendo como principal fonte
de carbono micélio de
R. solani
. A análise das atividades enzimáticas foi realizada
diariamente e observou-se que houve um aumento significativo apenas na expressão de
exoquitinase (8,4 U/mL), enquanto os níveis de protease foram reduzidos para 2,6 U/mL.
Embora, a atividade de
β
-1,3-glucanase não tenha sido detectada quando o
Streptomyces
sp.
RCQ 1071 foi cultivado em meio de sais minerais contendo 0,5% de micélio de
R. solani
,
níveis significativos desta enzima (2,1 U/mg) foram encontrados quando cultivado em meio
TLE, aumento este provavelmente relacionado a adição de outras fontes de nitrogênio,
incluindo fontes e fácil assimilação.
A análise da atividade quitinolítica do
Streptomyces
sp. RCQ 1071 em SDS-PAGE
revelou a presença de apenas uma exoquitinase no sobrenadante de cultivo em meio TLE,
sendo a massa molecular estimada em 72,8 kDa. Esses resultados foram confirmados através
de cromatografia de troca aniônica, onde também foi verificada a presença de apenas um pico
correspondendo à atividade de exoquitinase. As frações com atividade de exoquitinase, foram
reunidas e aplicadas em SDS-PAGE, demonstrando ainda a presença de outras proteínas. A
massa molecular determinada é semelhante a quitinases descritas na literatura. Mabuchi,
Hashizume e Araki (2000) detectaram a produção de 4 quitinases com massas moleculares de
35, 47, 58 e 64 kDa. Gomes e colaboradores (2001) identificaram uma endoquitinase
produzida pelo
Streptomyces
sp. RCQ 1071 com massa molecular de 70 kDa. Silva e
colaboradores (2004) purificaram uma exoquitinase produzida por
T. harzianum
com 64 kDa.
Guo, Chen e Lee (2004) caracterizaram uma quitinase de 75 kDa, produzida por
Aeromonas
schubertii
. Conforme relatos da literatura, a massa molecular das quitinases pode ser bastante
Souza, R. F.
Discussão
113
variável entre os microrganismos, inclusive para os estreptomicetos (Ohno
et al
., 1996; Kang,
Park & Lee, 1999; Tanabe
et al
., 2000; De Marco, Valadares-Inglis & Felix, 2004; Nawani &
Kapadnis, 2004; Souza
et al
., 2005).
Vários actinomicetos produtores de protease são descritos na literatura (De Azeredo
et
al
., 2003; Hoskisson, Sharples & Hobbs, 2005; Nascimento
et al
., 2005; Petrova, Derekova &
Vlahov, 2006). No presente trabalho, foi verificado que o
Streptomyces
sp. RCQ 1071 foi
capaz de produzir proteases em meio contendo micélio de
R. solani
como principal fonte de
carbono. A análise da atividade proteolítica através de SDS-PAGE co-polimeizado com
gelatina revelou que a estirpe produziu quatro proteases, sendo as proteases 3 e 4 com massas
moleculares bastante distintas. O perfil de atividade foi variado em diferentes valores de pH e
temperatura. As proteases de menor massa molecular (proteases 3 e 4) apresentaram maior
atividade em pH 9.0. Proteases alcalinas de diferentes bactérias têm sido amplamente
estudadas, entretanto, pouca atenção têm sido dispensada para os actinomicetos. Resultados
semelhantes foram observados por alguns autores. Ignatova e colaboradores (1999), que
descreveram uma protease produzida por
Thermoactinomyces candidus
com ótimo de
atividade em pH 8,6. Dixit e Pant (2000), detectaram a presença de duas proteases produzidas
por
Nocardiopsis
sp., com ótimos de pH 10 e 11. Mehta, Thumar & Singh (2006) também
relataram a produção de proteases alcalinas por
Streptomyces
sp., sendo a atividade avaliada
em pH 10.0. As proteases 3 e 4, produzidas pelo
Streptomyces
sp. RCQ 1071, apresentaram
ótimo de pH 6.0, embora a atividade tenha sido observada em todos os valores de pH testados.
A atividade proteolítica também foi bastante influenciada pela temperatura, sendo detectadas
apenas duas proteases (proteases 3 e 4) com maior atividade à 40 ºC. A atividade da protease
de menor massa molecular (protease 4) não foi significativa nas outras temperaturas, bem
como observado para as proteases 1 e 2. A protease 1 também demonstrou alta atividade a 50
ºC, resultado semelhante ao observado por Sampath, Subramanian & Chandrakasan (1997).
Alguns autores demonstram que proteases produzidas por actinomicetos apresentam atividade
em uma ampla variedade de valores de pH e temperatura (Patke & Dey, 1998; Nascimento
et
al
., 2005; De Azeredo
et al
., 2006; Vitale, Vukelié & Križaj, 2006). Nossos resultados
demonstram que o
Streptomyces
sp. RCQ 1071 expressou 4 diferentes enzimas proteolíticas
quando cultivado em meio contendo micélio de
R. solani
como fonte de carbono.
Algumas espécies de actinomicetos produtoras de glucanases vêem sendo descritas na
literatura. Valois e colaboradores (1996) selecionaram, entre 200 estirpes de actinomicetos
isolados de amostras ambientais, 13 capazes de crescer em fragmentos de micélio de
Phytophthora
spp. Estas estirpes foram analisadas quanto à produção de
β
-1,3-glucanase e foi
Souza, R. F.
Discussão
114
observado que os níveis destas enzimas eram bastante variados dentre as estirpes (0,015 a
2,21 U/mL). Hong
et al
. (2002) isolaram e caracterizaram uma
β
-1,3-glucanase de
Streptomyces sioyaensis
com atividade de endo-
β
-1,3-glucanase, visto que o sítio catalítico
desta enzima apresentava ação preferencial por glucanas com ligações
β
-1,3, com uma ação
endolítica. Mais recentemente, Masuda e colaboradores (2006) observaram que
Nocardiopsis
sp. F96 foi capaz de produzir 3 isoenzimas de
β
-1,3-glucanases, codificadas por apenas um
gene, identificado como
bg1F
. Ferrer (2006) descreveu a produção de 3
β
-1,3-glucanases por
Cellulomonas cellulans
, capazes de atuar na lise celular de leveduras.
Embora outros relatos a respeito da produção de glucanases sejam encontrados na
literatura, poucos descrevem a atividade de
β
-1,3-glucanase em actinomicetos. Nestes relatos,
observa-se que algumas espécies de actinomicetos também são capazes de produzir
β
-1,6-
glucanases. Fayad
et al
. (2001) analisaram a produção de glucanases pela estirpe
Streptomyces
sp. EF-14 e observaram que esta estirpe produziu níveis significativos de
β
-1,3-
glucanase e
β
-1,6-glucanase em meio contendo como nutriente células de
Candida utilis
, com
atividade de aproximadamente 1,3 e 0,4 U/mL. Esta alta produção de
β
-1,3-glucanase foi
observada com 72 horas de cultivo e sempre após a maior produção de
β
-1,6-glucanase. Wu,
Shimoi & Ito (2002) purificaram e caracterizaram uma
β
-1,6-glucanase em uma mistura
comercial de enzimas hidrolíticas produzidas por
Streptomyces rocheii,
contendo
β
-1,3-
glucanase e
β
-1,6-glucanase.
A análise da cinética de produção de enzimas hidrolíticas pelo
Streptomyces
sp. RCQ
1071 em meio de sais minerais contendo 0,5% de micélio de
R. solani
e TLE revelou um
comportamento semelhante ao observado pelos autores acima. A produção de exoquitinase e
β
-1,3-glucanase se iniciou a partir do terceiro dia de cultivo, atingindo o máximo no quarto
dia, enquanto que a maior produção de protease foi observada no primeiro dia de cultivo.
Estes resultados sugerem que o aumento da expressão de exoquitinase e a produção de
β
-1,3-
glucanase em meio TLE está relacionada com a baixa expressão de proteases, comparada ao
meio de sais minerais contendo 0,5% de micélio de
R. solani
. Observou-se, ainda, que o
aumento dos níveis de exoquitinase e
β
-1,3-glucanase ao longo do tempo de cultivo foi
acompanhado pela expressão de proteínas, sugerindo assim que a produção dessas enzimas
hidrolíticas está relacionada com as etapas de crescimento da estirpe, sendo mais produzidas
durante o crescimento ativo do
Streptomyces
sp. RCQ 1071. Sendo assim, conclui-se que o
enriquecimento do meio de cultivo, principalmente pela adição de fonte de nitrogênio,
Souza, R. F.
Discussão
115
ocasionou um aumento do crescimento do actinomiceto e, consequentemente da produção
destas enzimas.
Embora a composição exata da parede celular de
R. solani
não seja conhecida, é
sugerido, baseado em modelos descritos, que esta é constituída por camadas, das quais a mais
externa é composta por várias proteínas (Selitrennikoff, 2001). Desta forma, a produção
inicial de proteases pelo
Streptomyces
sp. RCQ 1071 pode estar relacionada à composição da
parede celular, e pode ser considerada como uma etapa essencial para o início do processo de
lise, expondo outros constituintes da parede celular e induzindo a produção de outras enzimas
micolíticas tais como quitinases e glucanases. Essas enzimas agem sinergisticamente no
processo de degradação da parede celular dos fungos, sendo, portanto, consideradas fatores
importantes no controle biológico (Lorito
et al
., 1994; Budi
et al
., 2000).
Vários relatos podem ser encontrados na literatura a respeito da importância de enzimas
hidrolíticas no controle biológico, agindo na parede celular de fungos fitopatogênicos (Chiu &
Tzean, 1995; Gupta
et al
., 1995; Lim & Kim, 1995; Cohen-Kupiec
et al
., 1999; El-Tarabily
et
al
., 2000; Viswanathan & Samiyappan, 2001; Dahiya
et al
., 2005; Hoster, Schmitz & Daniel,
2005). Budi e colaboradores (2000) demonstraram que
Phytophtora parasitica
apresentava
alterações drásticas na morfologia das hifas quando era cultivada na presença de
Paenibacillus
sp. Esses mesmos autores mostraram que enzimas hidrolíticas comerciais tais
como quitinases e proteases, apresentavam atividade inibitória de
P. parasitica,
causando
redução no crescimento deste fitopatógeno. De Marco e Felix (2002) caracterizaram uma
protease produzida por
T. harzianum
com ação lítica de
Crinipellis perniciosa
que afetou
substancialmente a parede celular do fitopatógeno.
A determinação das condições ótimas para a atividade dessas enzimas hidrolíticas
produzidas pelo o
Streptomyces
sp. RCQ 1071 mostrou que estas são capazes de atuar em
uma ampla faixa de temperatura e pH, variando de 25 a 70 ºC e 3,0 a 9,0, respectivamente,
sugerindo uma possível aplicação desta estirpe no controle biológico de
R. solani
.
Análises por microscopia óptica do co-cultivo entre
R. solani
e
Streptomyces
sp.
RCQ1071 demonstraram que o actinomiceto foi capaz de crescer abundantemente e aderir às
hifas do fitopatógeno. Este crescimento, associado à secreção de enzimas hidrolíticas,
ocasionaram a degradação e morte das hifas, conforme observado após incubação das células
com o corante vital MTT. Resultados semelhantes foram observados por Jung e colaboradores
(2003), que demonstraram que o co-cultivo entre
Paenibacillus illinoisensis
e
R. solani
causou deformações nas hifas do fitopatógeno, causadas provavelmente pela ação de
quitinases produzidas pela bactéria. Análises por “Western-blotting” e eletroforese bi-
Souza, R. F.
Discussão
116
dimensional revelaram que o
Streptomyces
sp. RCQ 1071 expressa um polipeptídeo de
aproximadamente 61 kDa e ponto isoelétrico 8,2 que reconhece proteínas de
R. solani
,
sugerindo um reconhecimento proteína-proteína na interação entre os dois microrganismos.
Até o presente momento, este é o primeiro relato de caracterização de um polipeptídeo de
actinomiceto associado à interação entre um agente biocontrolador e o fitopatógeno.
Baseado nos resultados obtidos, a estirpe
Streptomyces
sp. RCQ 1071 foi avaliada
quanto a capacidade de controlar os efeitos danosos causados por
R. solani
, através de ensaios
“in vivo” realizados em casa de vegetação. Foi observado que esta estirpe apresentou uma
grande eficiência em controlar a infestação por
R. solani
tanto das plântulas quanto dos frutos
de tomate. Nos ensaios “in vitro”, foi observado que o fitopatógeno foi incapaz de colonizar
os frutos de tomate quando este foi recoberto com uma suspensão de esporos do
Streptomyces
sp. RCQ 1071. Quando esta mesma suspensão foi utilizada para controlar a infestação do solo
por
R
.
solani
observou-se que o
Streptomyces
sp. RCQ 1071 foi capaz de aumentar o
percentual de plantas saudáveis de 35% para 79%, semelhante ao observado na ausência do
patógeno (83%). Estes resultados demonstram que este actinomiceto é uma estirpe bastante
promissora para a utilização no controle biológico de
R. solani
em tomateiro.
A utilização de microrganismos no controle biológico geralmente não é realizada
através do emprego direto do agente biocontrolador no campo ou nas estufas por não ser
economicamente viável. Dessa forma, os agentes biocontroladores são preparados para
utilização comercial misturando-se o microrganismo com carreadores inertes (ex. caolim) e
nutrientes (ex. glicose), para produzir formulações em grânulos ou pó molhável que
estabilizam e melhoram o crescimento do agente, e que sejam adequados para o
armazenamento e aplicação em casa de vegetação e no campo (Sabaratnam & Traquair,
2002). Vários agentes biocontroladores têm sido formulados em suspensões líquidas, sólidos e
pó (Lewis
et al
., 1995; Jackson, Shasha & Schisler, 1996; Lewis & Lumsden, 2001; Comare
et al
., 2002; Batta, 2004; Chung, Huang & Huang, 2005). Formulações desidratadas (em pó
ou grânulos) são geralmente preferidas porque proporcionam uma meia vida alta e facilidade
no armazenamento e transporte. Além disso, estas formulações podem posteriormente ser
aplicadas na forma líquida através de regas ou pulverizações (Lewis
et al
., 1995). Vários
relatos podem ser encontrados na literatura a respeito da ação antifúngica e/ou
biocontroladora de actinomicetos, entretanto poucos descrevem a formulação com
estreptomicetos (Hiltunen, Linfield & White, 1995; Jones & Samac, 1996; El-Tarabily
et al
.,
2000; Xiao, Kinkel & Samac, 2002; Sabaratnam & Traquair, 2002; El-Tarabily &
Sivasithamparam, 2006). O controle biológico de
R. solani
também já vêm sendo proposto
Souza, R. F.
Discussão
117
por diversos autores, entretanto, poucos são os relatos de controle biológico de
R. solani
em
tomate, utilizando actinomicetos (Lewis & Larkin, 1998; Hwang, Chilton & Benson, 2002;
Jung
et al
., 2003; El-Tarabily, 2004; Kazempour, 2004; Brewer & Larkin, 2005; Chung,
Huang & Huang, 2005). Até o presente momento, somente Mycostop®
(Verdera Oy, Spool,
Finland), uma preparação a base de esporos de
Streptomcyces griseoviridis
,
está disponível
comercialmente para ser utilizado no controle biológico de fitopatógenos, tornando-se
imprescindível o desenvolvimento de novas formulações.
Sendo assim, o
Streptomyces
sp. RCQ 1071 foi avaliado quanto a eficiência em
controlar as infecções de
R. solani
em plântulas de tomate, através do emprego de
formulações desidratadas (granulada e em pó molhável). Esta estirpe se mostrou bastante
eficiente no biocontrole
R. solani
, tanto quando utilizada no revestimento das sementes
quanto na aplicação direta no solo, causando uma redução de 60% na incidência de doenças.
O percentual de plantas saudáveis foi semelhante ao observado no controle e com a utilização
do agrotóxico Monceren®. Sabaratnam e Traquair (2002) observaram resultados semelhantes
com uma estirpe de
Streptomyces
. Estes autores demonstraram que a formulação em pó
molhável foi eficiente em controlar
R. solani
, e ainda, de forma mais eficiente que a
formulação em grânulos e ao controle químico com Benomyl. Entretanto estas formulações
foram preparadas a partir de células vegetativas, e apresentaram uma estabilidade menor do
que as formulações desenvolvidas no presente trabalho. Dessa forma, os resultados
observados no nosso trabalho sugerem uma possível aplicação das diferentes formulações do
Streptomyces
sp. RCQ 1071 para fins comerciais.
O gênero
Streptomyces
é um dos gêneros que têm sido mais estudados na sistemática de
identificação não somente por serem considerados apenas uma fonte promissora de compostos
de importância comercial, mas também devido ao grande impacto que os métodos
moleculares têm causado na sistemática convencional (Williams
et al
., 1983a,b; Goodfellow,
Ferguson & Sanglier, 1992; Huang
et al
., 2004). Além disso, estes microrganismos
representam uma considerável proporção na comunidade de actinomicetos no solo. O
laboratório de Biotecnologia do Actinomicetos possui uma coleção de aproximadamente 500
actinomicetos que têm sido isolados de diferentes solos brasileiros com o intuito de selecionar
estirpes promissoras em aplicações biotecnológicas, principalmente na produção de enzimas
(Coelho & Drosdowicz, 1978; Semêdo
et al.
, 2004). A estirpe
Streptomyces
sp. RCQ 1071 foi
isolada de solo brasileiro sob vegetação de cerrado e selecionada como grande produtora de
quitinase com ação do tipo endo e atividade antifúngica contra seis fungos fitopatogênicos,
sugerindo uma possível aplicação no controle biológico (Gomes
et al
., 2001).
Souza, R. F.
Discussão
118
Os resultados do presente trabalho comprovam não apenas a alta atividade antifúngica
desta estirpe como também a sua capacidade em controlar os efeitos danosos causados pelo
fungo fitopatogênico
R. solani.
Sendo assim,
esta estirpe foi submetida à sistemática de
identificação através de uma abordagem polifásica baseada na taxonomia convencional,
taxonomia numérica e taxonomia molecular. A análise por taxonomia convencional, baseada
em testes morfológicos e quimiotaxonomia, realizada em experimentos prévios por Gomes e
colaboradores (2001), revelou que a estirpe RCQ 1071 pertence ao gênero S
treptomyces
. A
análise filogenética da seqüência do rDNA 16S da estirpe com seqüências semelhantes no
NCBI (“National Center for Biotechnology Information”), obtidas através de alinhamento
múltiplo, agrupou a estirpe com
Streptomyces lydicus
Y15507
T
. Entretanto, o valor de
“bootstrap” desta relação foi fraco (menor que 50%). O
Streptomyces albogriseus
AF51322
foi a estirpe mais semelhante, com 99% de similaridade na seqüência, entretanto, não foi
incluída nas análises por ainda não ter sido depositada uma estirpe tipo. A análise da
seqüência do rDNA 16S
do
Streptomyces
sp. RCQ 1071 demonstrou alta similaridade (98%)
com
Streptomyces albulus
, entretanto, esta estirpe não se inseriu no mesmo grupo. Os testes
fisiológicos demonstraram que esta estirpe apresenta muitas características diferentes quando
comparado às estirpes acima descritas e a alguns estreptomicetos quitinolíticos. Esses
resultados demonstram que a estirpe
Streptomyces
sp. RCQ 1071 é filogeneticamente distante,
sendo assim sugerida como uma nova espécie,
Streptomyces lunalinharensis
.
O entendimento do mecanismo de ação de agentes biocontroladores é um pré-requisito
para o desenvolvimento de procedimentos apropriados para a seleção de microrganismos
antagonistas e de metodologias para a produção e formulação adequada de agentes
biocontroladores. Sendo assim, conclui-se que o presente trabalho trouxe contribuições
significativas tanto para o entendimento dos mecanismos de interação entre agentes
biocontroladores e fitopatógenos, bem como no desenvolvimento de um agente
biocontrolador de um dos patógenos mais importantes na agricultura brasileira.
Souza, R. F.
Conclusão
119
6. CONCLUSÃO
•
A análise da região ITS1-5.8S-ITS2 do DNA de
Rhizoctonia solani
revelou que este
isolado pertence ao AG4, visto que o inseriu no mesmo cluster de outros isolados com
aspectos morfológicos e patológicos pertencentes ao AG4, patogênicos para tomateiro.
•
Foram selecionadas 3 estirpes de estreptomicetos (Q11, 80 e RCQ1071) com forte
atividade inibitória do crescimento de pelo menos 5 espécies de fungos fitopatogênicos
(
Fusarium oxysporum
,
F. solani
,
F.
sp.,
Aspergillus niger
e
R. solani
).
•
As estirpes
Streptomyces
sp. Q11,
Streptomyces
sp. 80 e
Streptomyces
sp. RCQ 1071
foram capazes de produzir níveis significativos de endoquitinase e exoquitinase em meio
de cultivo contendo micélio dos diferentes fungos fitopatogênicos, como única fonte de
carbono, sendo esta produção influenciada pela composição da parede celular destes
fungos.
•
A cinética de produção das enzimas hidrolíticas sugere que o aumento da expressão de
exoquitinase e a produção de
β
-1,3-glucanase em meio TLE, quando comparada ao meio
de sais minerais contendo 0,5% de micélio de
R. solani
, está relacionada com a baixa
expressão de proteases,.
•
A produção inicial de proteases pelo
Streptomyces
sp. RCQ 1071 está relacionada à
composição da parede celular utilizada no meio de cultivo, e pode ser considerada como
uma etapa essencial para o início do processo de lise “
in vivo
”, com posterior produção
das outras enzimas micolíticas (quitinases e glucanases).
•
A determinação das condições ótimas para a atividade das enzimas hidrolíticas produzidas
pelo
Streptomyces
sp. RCQ 1071 mostrou que estas são capazes de atuar em uma ampla
faixa de temperatura e pH, variando de 25 a 70 ºC e 3,0 a 9,0, respectivamente, sugerindo
uma possível aplicação desta estirpe no controle biológico de
R. solani
.
•
A análise da atividade de exoquitinase por SDS-PAGE revelou que o
Streptomyces
sp.
RCQ 1071 produziu apenas uma exoquitinase, com massa molecular de 72,8 e valores
ótimos de temperatura de 40 a 50 ºC e pH 7.0, respectivamente.
Souza, R. F.
Conclusão
120
•
A análise por “Western-blotting” e eletroforese bi-dimensional revelaram que o
Streptomyces
sp. RCQ 1071 produziu um polipeptídeo de aproximadamente 61 kDa e
ponto isoelétrico 8,2, sendo este implicado com a interação entre os dois microrganismos.
Até o presente momento, este é o primeiro relato de um polipeptídeo de actinomiceto
associado à interação entre um agente biocontrolador e o fitopatógeno.
•
As formulações do
Streptomyces
sp. RCQ 1071 apresentaram uma alta estabilidade
durante o armazenamento a 28 ºC e 4 ºC, e se mostraram eficientes no controle biológico
de
R. solani
, sugerindo uma possível aplicação comercial.
•
A taxonomia polifásica da estirpe
Streptomyces
sp. RCQ 1071 demonstrou que esta
estirpe é filogeneticamente distante de outras espécies de estreptomicetos descritas, sendo
assim sugerida como uma nova espécie,
Streptomyces lunalinharensis
.
Souza, R. F.
Referências
121
7. REFERÊNCIAS
•
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•
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Souza, R. F.
Anexo
143
8. ANEXO
Trabalho submetido à International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology
Streptomyces lunalinharensis sp. nov., a novel chitinolytic streptomycete isolated from
Cerrado soil, Brazil.
Rodrigo Fonseca de Souza
1
, Rosalie Reed Rodrigues Coelho
1
, Débora Costa Morato Nery
1
,
Andrew Macrae
1
, Rosangela Maria Araújo Soares
1
, Luzia Teixeira Azevedo Soares
Semêdo
1,2
, Celuta Sales Alviano
1
and Rosana Canuto Gomes
1,2
1
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Universidade do Brasil, UFRJ, CCS, Bloco I,
Ilha do Fundão, Rio de Janeiro (RJ), 21941-590, Brazil.
2
Centro de Ciências e da Saúde, Universidade Severino Sombra, USS, Av. Expedicionário
Oswaldo de Almeida Ramos - 280, Centro, Vassouras, Rio de Janeiro, 27700-000, Brazil.
Correspondence
Rodrigo Souza
Tel/fax: +55 21 25626741/25608344
The GenBank accession number for the 16S rRNA gene sequences of Streptomyces
lunalinharensis strain RCQ1071 is DQ094838.
The taxonomic position of a chitinolytic actinomycete strain isolated from a Brazilian cerrado
soil was examined using a polyphasic approach. The strain, designated RCQ1071
T
, was
assigned to the genus Streptomyces on the basis of chemical and morphological
characteristics. The almost complete nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of strain
RCQ1071
T
was determined and its comparison with the 16S rDNA sequences of previously
studied Streptomyces confirmed the assignment of the novel strain to this genus. The most
closely related species was Streptomyces lydicus, with 98% nucleotide similarity. It also
differed from other chitinolytic strains in its phenotypic characteristics. On the basis of
genomic and physiological properties, the novel species Streptomyces lunalinharensis sp.
nov. is proposed. The type strain is RCQ1071
T
(=ATCC BAA-1231
T
=CIP 108852
T
).
Souza, R. F.
Anexo
144
Actinomycetes are filamentous gram-positive bacteria widely distributed in terrestrial
environments, where they are responsible for degradation and recycling of natural
biopolymers. This fact, plus their broad metabolic capabilities, and their ability to produce
pigments, antibiotics and hydrolytic enzymes, makes them fascinating and suitable for
biotechnological applications. The genus Streptomyces remains a focus for systematic
research, not only because streptomycetes are still the most promising source of
commercially significant compounds, but also because current molecular biology methods
are having an increasing impact on conventional streptomycete systematics.(Williams et al.,
1983a,b; Goodfellow et al., 1992; Huang et al., 2004). Moreover, Streptomycetes represent a
considerable proportion of the actinomycete communities in soils. Our laboratory has been
isolating Streptomyces from different Brazilian soils, with the purpose of selecting strains for
biotechnological applications, mainly enzyme production (Coelho et al¸1978; Semêdo et al.,
2004). Strain RC1071 was isolated from an acid orthic ferralsol from central Brazil, under
cerrado vegetation, and selected as chitinolytic in colloidal chitin agar medium (Gomes et al.,
2001). This isolate exhibited high endochitinase activity when using glycol chitin as substrate
at temperature and pH values of 40 °C and 8.0, resp ectively. The enzyme was stable at
temperatures up to 70 °C and pH values from 4.0 to 9.0, which are promising characteristics
for biotechnological purposes, such as the degradation of chitin-containing waste (Sakai et
al., 1998). The purified endochitinase also showed antifungal activity when tested against
seven phytopathogenic fungi (Gomes et al., 2001), suggesting a possible application in
biological control of plant fungal pathogens.
Preliminary taxonomic characterization, based upon analysis of morphological features
(aerial hyphae with verticillati spores chains) and chemotaxonomic data (the presence of LL-
diaminopimelic acid, and the absence of diagnostic cell wall sugar, which characterizes it as
cell wall chemotype I, sensu Lechevalier & Lechevalier, 1970), revealed that the strain
belonged to the genus Streptomyces. Numerical taxonomic analysis was performed
according to Williams et al. (1983). Seventy-one tests were performed, but the strain could
not be fitted into any known cluster of the identification matrix. Spore chain morphology and
spore ornamentation were examined by light microscopy and TEM (EM 900; Zeiss) analysis
of cultures grown on malt extract/yeast extract agar for 14 days on inorganic salts/starch
agar and glycerol/asparagines agar (Shirling & Gottlieb, 1966). Aerial spore-mass colour,
substrate mycelial pigmentation and production of diffusible pigments were recorded after
incubation at 28 °C for 14 days on inorganic salts/ starch agar and glycerol/asparagine agar
(Shirling & Gottlieb, 1966). Melanin production was observed on tyrosine agar medium and
peptone/yeast extract/iron agar (Shirling & Gottlieb, 1966).
Souza, R. F.
Anexo
145
The ability of the strain to grow in modified Bennett’s agar (MBA) supplemented with
neomycin sulfate (50 µg ml
-1
), oleandomycin (100 µg ml
-1
), penicillin G sodium salt (10 i.u. ml
-
1
), rifampicin (50 µg ml
-1
), streptomycin sulfate (100 µg ml
-1
), gentamicin sulfate (100 µg ml
-1
),
dimethylchlortetracycline (500 µg ml
-1
), novobiocin (100 µg ml
-1
), methacycline hydrochloride
(100 µg ml
-1
), ampicilline sodium salt (100 µg ml
-1
) and cycloheximide (100 µg ml
-1
) was
examined following incubation of plates at 28 °C fo r 7 days. Similarly, the organism was
examined for its ability to grow in MBA supplemented with phenol (0,1 % w/v), potassium
tellurite (0,001% w/v), sodium chloride (7% w/v), sodium azide (0,01% w/v) and at 45 °C. The
antimicrobial activity of the strain was determined against fungi and bacteria. All other
physiological and biochemical characteristics were determined according to Williams et al.
(1983).
Cell wall amino acids were analyzed after acid hydrolysis of the cell mass using 6 M HCl.
Hydrolyzed material was dried, resuspended in the appropriate buffer, and injected into an
automatic analyzer (High Performance Amino Acid Analyser, system 6300; Beckman),
according to the manufacturer’s instructions. Amino acids were identified automatically, by
comparison with retention times of a standard mixture.The major amino acids found in cell
wall hydrolisates were alanine (predominant) and glycine, followed by glutamic acid, leucine,
treonine methionine and lysine, which are consistent with patterns obtained for amino acids
analysis of another streptomycete isolated from Brazilian soil (Semêdo et al., 2004).
Extraction of genomic DNA from strain RCQ1071 was carried out as described previously
(Orgram et al., 1987; Steffan et al., 1988; Tsai & Olson, 1991; Smalla et al., 1993; Rintala et
al., 2001) with minor modifications. PCR amplification was carried out in the thermal cycler
Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystem). Amplified fragments were purified using
the PureLink PCR Purification Kit (Invitrogen) and sequenced directly using an ABI Prism
dye terminator cycle sequencing reaction kit (ABI Prism 310 Genetic; Analyzer). The 16S
rDNA sequence obtained was analyzed by CHEK-CHIMERA (Maidak et al., 1997) and
subjected to a similarity search against data from the Ribosomal Database Project (Maidak
et al., 1997) and Genbank (BLAST-N, Altschul et al., 1997). Sequences retrieved were
aligned using CLUSTAL-X version 1.83 (Thompson et al., 1994). Evolutionary distance
matrices and trees were generated using the Galtier and Gouy distance estimation model
(Galtier & Gouy, 1995) and neighbour-joining algorithm (Saitou & Nei, 1987) and drawn using
TREECON Version 1.3b software (Van der Peer & De Wachter, 1993). The 16S rDNA of
Souza, R. F.
Anexo
146
Streptomyces melanosporofaciens AJ391837 was used as an outgroup. The resultant tree
topologies were evaluated by bootstrap analyses based on 1000 resamplings.
An almost complete 16S rDNA sequence of strain RCQ1071
T
(1480 nucleotides) was
deposited at GenBank (DQ094838). Comparisons of the 16S rDNA sequence of strain
RCQ1071 with other most similar 16S rDNA sequences available at GenBank were made.
Similar sequences were retrieved for multiple alignment comparison (Fig 1). Strain
RCQ1071
T
grouped with Streptomyces lydicus Y15507
T
(Fig. 1), however, bootstrap support
for the relationship was weak (below 50). Streptomyces albogriseus AF51322 was the most
similar strain retrieved from NCBI using BLAST, with 99% sequence similarity. This strain
was not included in phylogenetic analyses because, as yet a type strain has not been
deposited into publicly available culture collection thus making difficult polyphasic
comparisons. Streptomyces albulus 16S rDNA shared a highly similar sequence (98%),
however this sequence fell outside the clade containing strain RCQ1071
T
. In summary,
sequence analysis results demonstrate that Strain RCQ1071 is phylogenetically distant from
other chitinolytic strains.
Strain RCQ1071
T
can be differentiated from the non-chitinolytic Streptomyces lydicus
Y15507
T
and other described chitinolytic streptomycetes species, by many features (Table 1)
(Williams et al.,1983). Compared with Streptomyces olivaceoviridis, strain RCQ1071
T
differed in a number of characteristics, including spore chain morphology, substrate
mycelium colour, lipolysis, degradation of allantoin, arbutin, elastin, guanine, hypoxantin,
growth on D-mellibiose, raffinose, D-fructose, sodium chloride, sodium azide, potassium
tellurite, resistance to penicillin G and antimicrobial activity against Candida albicans and
Aspergillus niger. Strain RCQ1071
T
differed from S. lydicus and S. rimosus on spore chain
morphology, substrate mycelium colour, diffusible pigment production, proteolysis,
degradation of allantoin, growth on L-rhaminose, sodium azide, potassium tellurite, L-
hydroxyprolin, l-methionin, amino-n-butyric acid. S. violaceoniger produced a spirales spore
chain while strain RCQ1071
T
produced a verticillati spore chain. Many other characteristics
differentiated both strains, including substrate mycelium colour, diffusible pigment production,
proteolysis, degradation of allantoin, elastin, hypoxantin, growth on L-rhaminose, D-fructose,
adonitol, sodium chloride, sodium azide, potassium tellurite and so on.
In conclusion, the chitinolytic strain RCQ1071
T
(Gomes et al., 2001), isolated from an acid
orthic ferralsol from central Brazil (pH 4.5) under cerrado vegetation, is clearly distinct from
other phylogenetically and phenotypically related Streptomyces species described in the
literature, and thus represents a novel species. Therefore, it is proposed that strain
Souza, R. F.
Anexo
147
RCQ1071
T
should be included in the genus Streptomyces as a representative of a novel
species, Streptomyces lunalinharensis sp. nov.
Description of Streptomyces lunalinharensis sp. Nov.
Streptomyces lunalinharensis (lu.na.lin.ha.ren.sis. N.L. masc. adj. lunalinharensis referring to
Luiz Fernando de Toledo Luna Linhares, a brazilian soil microbiologist).
Aerobic, Gram-positive, catalase-positive actinomycete that forms a grey coloured aerial
mycelium and yellow-brown substrate mycelium. The color of the substrate mycelium is not
pH-sensitive. Produces a yellow-brown diffusable pigment, not pH-sensitive. Melanin is not
produced. Cell wall hydrolysates contain LL-diaminopimelic acid. The predominant amino
acids in the cell wall hydrolysate are alanine and glycine, followed by glutamic acid, leucine,
treonine methionine and lysine. Very good growth occurs on yeast extract/malt extract agar
and modified Bennett’s agar. Antibiotic activity is exhibited against Aspergillus niger and
Candida albicans but is not observed against Micrococcus luteus, Streptomyces murinus,
Bacillus subtillis and Saccharomyces cerevisiae. The organism is resistant to novobiocin
(100 µg ml
-1
), methacycline hydrochloride (100 µg ml
-1
), ampicilline sodium salt (100 µg ml
-1
),
cycloheximide (100 µg ml
-1
) and penicillin G sodium salt (10 i.u ml
-1
). Isolated from an acid
orthic ferralsol from central Brazil (pH 4.5) under cerrado vegetation. A detailed description of
phenotypic features is presented in Table 1. The species description is based on a single
strain and hence serves as the type strain description. The type strain is RCQ1071
T
. (=ATCC
BAA-1231 =CIP 108852T).
Table 1. Phenotypic properties that separate strain 1, S. lunalinharensis RCQ1071
T
from
other phylogenetically related according Williams et al., 1983 (2, S. lydicus) and chitinolytic
Streptomyces species (3, S. olivaceoviridis; 4, S. rimosus; 5, S. violaceoniger).
Characteristic
1
2
3
4
5
Morphology and
pigmentation:
Presence of spores (aerial
mycelium)
+ + + - +
Production of aerial spore
mass
+ + + - +
Spore chain morphology:
Verticillati + - - - -
Spirales - + + - +
Retinaculiaperti - - - - -
Rectiflexibles - - - - -
Souza, R. F.
Anexo
148
Pigmentation of substrate
mycelium:
Spore-mass colour Grey Grey Grey - Grey
Substrate mycelium colour Yellow-brown - Green - -
Diffusable pigment production +(Yellow-
brown)
- +(Yellow-
brown)
- -
Sensitivity of substrate
pigment to pH
- - - - -
Sensitivity of diffusible
pigment to pH
- - - - -
Melanin production in tyrosin
agar
- - - - -
Melanin production in
peptone/yeast extract/iron
agar
- - - - -
Enzymatic activity:
Pectin hydrolisis - - - - -
Nitrate reduction - - - - -
Catalase + ND ND ND ND
Enzymatic activity on egg-yolk
medium:
Lecithinase - - - - -
Proteolysis + - + - -
Lipolysis + - - + +
Degradation of:
Allantoin + - - - -
Arbutin + + - - +
Casein + + + + +
Chitin + - + + +
Elastin + - - + -
Gelatin + + + + +
Pectin - - - - -
Keratin - ND ND ND ND
Xylan - - - - -
Starch + + + - +
L-Tyrosin + + + + +
Xantin - - - - -
Guanin - + + - -
Hypoxantin + + - + -
Growth on sole carbon
source:
Glucose + + + + +
Inulin - - - - -
D-Xylose - - - - -
D-Melibiose - - + + -
Raffinose - - + - -
Cellobiose + - + + +
L-Rhamnose + - + - -
D-Fructose + + - - -
D-Mannose + + + + +
Adonitol + - + + -
Resistance to antibiotics:
Neomycin sulfate(50 µg ml
-1
)
- - - + -
Souza, R. F.
Anexo
149
Oleandomycin (100 µg ml
-1
)
- - - - -
Penicillin G sodium salt (10 i.u
ml
-1
)
+ + - + -
Rifampicin (50 µg ml
-1
)
- - - + -
Streptomycin sulfate (100 µg
ml
-1
)
+/- - - + -
Gentamicin sulfate (100 µg
ml
-1
)
- - - - -
Dimethylchlortetracycline (500
µg ml
-1
)
- - - - -
Novobiocin (100 µg ml
-1
)
+ ND ND ND ND
Methacycline
hydrochloride(100 µg ml
-1
)
+ ND ND ND ND
Ampicilline sodium salt(100
µg ml
-1
)
+ ND ND ND ND
Cycloheximide (100 µg ml
-1
)
+ ND ND ND ND
Growth at/in:
Sodium chloride (7% w/v) + - - + -
Sodium azide (0,01% w/v) + - - - -
Phenol (0,1 % w/v) - - - - -
Potassium tellurite (0,001%
w/v)
+ - - - -
45
0
C - - - - -
Antimicrobial activity against:
Aspergillus niger (NIG) + + - + -
Micrococcus luteus (LUT) - + - - +
Streptomyces. murinus
(MUR)
- - - + -
Bacillus subtillis (SUB) - - - + -
Saccharomyces cerevisiae
(CER)
- - - - -
Candida albicans (ALB) + - - - -
Growth on sole nitrogen
source:
L-Phenylalanine + + - - -
L-Hydroxyprolin + - - - -
L-Histidine + - + + +
L-Methionin + - - - -
Amino-n-butyric acid + - - - +
L-Arginine + + + - -
L-Cisteína - - + - -
L-Valina + - - - -
L-Asparagine + ND ND ND ND
Souza, R. F.
Anexo
150
60
84
0.01
S. melanosporofaciens NRRL B-12234T (AJ391837)
S. rutgersensis subsp. castelarensis DSM 40830T (AY508511)
S. kasugaensis M338-M1T (AB024441)
S. indonesiensis A4R2 (S34)T (AJ391835)
S. sparsogenes NRRL 2940T (AJ391817)
S. griseocarneus DSM40004T (X99943)
S. mobaraensis var. ladakanum DSM 40587T ISP 5587 (X53167)
S. griseus ATCC 23345T (AF056711)
S. violaceusniger NRRL-ISP 5563T (AJ391823)
S. cebimarensis DSM 41798T (AJ560629)
S. platensis JCM 4662T (AB045882)
S. sclerotialus DSM 43032T (AJ621608)
S. argenteolus JCM 4623T (AB045872)
S. chattanoogensis DSM 40002T (AJ621611)
S. chrestomyceticus DSM 40545T (AJ621609)
S. erumpens DSM 40941T (AJ621603)
S. lydicus ATCC 25470T (Y15507)
Streptomyces. sp RCQ 1071 (DQ094838)
S. albulus MF861-C4T (AB024443)
S. yunnanensis YIM 41004T (AF346818)
S. rimosus subsp. paromomycinus DSM 41429T (AJ621610)
S. albofaciens JCM 4342T (AB045880)
S. albus subsp. albus DSM 40313T (AJ621602)
S. mashuensis DSM40221T (X79323)
S. violens DSM 40597T (AJ621605)
S. purpurogeneiscleroticus DSM 43156T (AJ621604)
S. catenulae DSM 40258T (AJ621613)
S. tubercidicus DSM 40261T (AJ621612)
S. olivaceiscleroticus DSM 40595T (AJ621606)
S. niger DSM 43049T (AJ621607)
S. olivoreticuli ssp. cellulophilum DPDU 0278T (X53166)
S. cinnamoneus spp. cinnamoneum DPDU 0093T ISP 5005 (X53171)
S. salmonis DPDU 0098T (X53169)
S. abikoensis DSM 40831T (X53168)
S. neyagawaensis ATCC 27449T (D63869)
S. galbus DSM40089T (X79852)
S. setonii ATCC 25497T (D63872)
S. caviscabies ATCC51928T (AF112160)
100
100
82
59
51
100
96
52
98
99
99
Fig. 1. Phylogeny of strain RCQ1071
T
and related streptomycetes. The tree was based on an alignment
of aproximately 1400 bases, evolutionary distance were calculated using the model of Galtier & Gouy
and constructed using Neighbour-Joining. Sequence accession numbers are shown in parentheses.
Streptomyces melanosporofaciens AJ391837 was used as the out group. Numbers on branch nodes
indicate percentage bootstrap values based on 1000 resampled datasets, only values above 50% are
shown. The scale bar represents 0.01 substitution per nucleotide position.
Souza, R. F.
Anexo
151
Acknowledgements
This work was supported by grants from Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior
(CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ), Financiadora de
Estudos e Projetos (FINEP), Programa Nacional de Excelência (PRONEX, CNPq) and
Fundação Universitária José Bonifácio (FUJB-UFRJ).
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