ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
Daniel Campos Villela
CONTRIBUIÇÃO DOS RECEPTORES 5-HT
1A
DA SUBSTÂNCIA
CINZENTA PERIAQUEDUTAL NA RESPOSTA CARDIOVASCULAR
PRODUZIDA PELA ATIVAÇÃO DO HIPOTÁLAMO DORSOMEDIAL
Belo Horizonte
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
DANIEL CAMPOS VILLELA
CONTRIBUIÇÃO DOS RECEPTORES 5-HT
1A
DA SUBSTÂNCIA
CINZENTA PERIAQUEDUTAL NA RESPOSTA CARDIOVASCULAR
PRODUZIDA PELA ATIVAÇÃO DO HIPOTÁLAMO DORSOMEDIA
Belo Horizonte
2007
Dissertação apresentada ao programa
de Pós-Graduação em Fisiologia e
Farmacologia da Universidade
Federal de Minas Gerais com o
requisito para obtenção do título de
Mestre em Fisiologia.
Orientador: Prof. Dr. Marco Antônio
Peliky Fontes.
ads:
Aos meus pais, Marcelo e Etelvina e aos
meus avós, Joaquim e Marina.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Marco Antônio Peliky Fontes, orientador que me acolheu
como estudante e me guiou verdadeiramente por todo o percurso deste trabalho.
Aos amigos e professores do laboratório de Hipertensão e a todos os outros
amigos que fiz no ICB.
Ao amigo Luiz Gonzaga que esta comigo neste afeto pela fisiologia desde
os tempos de monitoria.
Ao Zezé, pela sua ajuda e amizade que espero manter para sempre.
A todos os meus familiares e em especial à minha irmã Mariana.
Aos amigos de infância do acamari, Bené, Guilesmel, Meg, Capina,
Bigainhas, Jayjay, Chapinha, Naka, Gutão, Torão e aos que fiz aqui em Belo
Horizonte, Norberto, Cristiano, Guilherme e Rodrigo.
Ao meu pai, amigo e mestre que me ajudou tanto neste processo.
“Eu quase que nada não sei. Mas
desconfio de muita coisa.”
Guimarães Rosa
RESUMO
A ativação dos neurônios do hipotálamo dorsomedial (DMH) através da
microinjeção do antagonista GABA
A
, bicuculina (bic), resulta em alterações
cardiovasculares, comportamentais e endócrinas similares às observadas durante
o estresse emocional. Recentemente demonstramos que a taquicardia e o
aumento da pressão arterial produzido pela ativação do DMH através da
microinjeção de bic, dependem da integração com os neurônios da região
lateral/dorsolateral da substância cinzenta periaquedutal (l/dlPAG), que é uma
região moduladora das respostas comportamentais de defesa. Demonstramos
recentemente também que essa sinapse entre o DMH e a l/dlPAG é mediada pelo
receptor de aminoácido excitatório N-metil-D-aspartato (NMDA). Agonistas do
receptor serotoninérgico subtipo 1A (5-HT
1A
) possuem utilidade clínica como
agentes ansiolíticos e antihipertensivos. Adicionalmente, a ativação de receptores
5-HT
1A
no tronco encefálico reduz a resposta de aumento da pressão arterial e
simpatoexcitatória produzida pela ativação do DMH. No entanto, as regiões
específicas do sistema nervoso central onde a ativação destes receptores
produziria essas ações ainda não foram determinadas. Neste estudo, avaliamos
se a l/dlPAG pode ser uma das regiões do tronco encefálico onde a ativação dos
receptores 5-HT
1A
pode interferir nas respostas produzidas pela ativação do DMH.
Adicionalmente testamos se a ativação dos receptores 5-HT
1A
na l/dlPAG poderia
modular outros tipos de estresse emocional.
Os resultados do presente estudo mostram que a ativação de receptores 5-HT
1A
na l/dlPAG pode reduzir a resposta cardiovascular induzida pela (1) ativação dos
neurônios do DMH; (2) pela ativação dos receptores NMDA na própria l/dlPAG; e
(3) pelo estresse emocional por jato de ar. Em conjunto, os resultados do
presente estudo sugerem que a sinapse entre o DMH e a l/dlPAG pode ser
modulada por receptores 5-HT
1A
.
ABSTRACT
Neurons in the region of dorsomedial hypothalamus (DMH) are involved in the
organization of the physiological responses to emotional stress. Activation of the 5-
hydroxytryptamine 1A (5HT
1A
) receptors in the brain stem causes a potent and
selective suppression of the hypertensive and sympathoexcitatory response
evoked by stimulation of the DMH. However, the specific region in the brain stem
where activation of 5HT
1A
receptors could possibly suppress the response evoked
by activation of the DMH is still unknown. We have recently shown that the
lateral/dorsolateral region of the periaqueductal gray (l/dlPAG) is a synaptic relay in
the descending pathways mediating the cardiovascular response evoked from the
DMH. We have also shown that this synapse between DMH and l/dlPAG is
mediated by excitatory amino acid receptors, possibly N-methyl-D-aspartate
(NMDA). In this study, we aimed to investigate whether the l/dlPAG is one of the
regions of the brain stem where the 5-HT
1A
agonists may act and interfere in the
response evoked by activation of the DMH neurons and additionally, in two other
emotional stress models: 1) Air Jet stress; and 2) microinjection of NMDA into the
l/dlPAG. The results of the present study show that the activation of 5HT
1A
receptors in the l/dlPAG can modulate the cardiovascular response evoked by
activation of DMH neurons and by two other types of emotional stress. Altogether,
these findings indicate that the synapse between DMH and l/dlPAG may be
modulated by 5-HT
1A
receptors at the l/dlPAG.
LISTA DE ABREVIATURAS
3V Terceiro ventrículo
5-HT
1A
Receptor da 5-Hidroxitriptamina subtipo 1A
AAE Aminoácido excitatório
ACTH Hormônio adrenocorticotrópico
bic Bicuculina methiodide
bpm batimentos por minuto
DMC Porção compacta do DMH
DMD Porção difusa do DMH
DMH Hipotálamo dorsomedial
dPAG Coluna dorsal da PAG
DRN Núcleo dorsal da rafe
f Fórnix
FC Frequência cardíaca
GABA Ácido gama amino butírico
IML Coluna intermediolateral
l/dIPAG Coluna lateral e dorsolateral da PAG
8-OH-DPAT Agonista do receptor 5-HT
1A
mmHg milímetros de mercúrio
musc agonista do receptor GABA
A
, muscimol
NMDA Ácido n-metil d-aspártico
NTS Núcleo do trato solitário
PAG Substância cinzenta periaquedutal
PAM Pressão arterial média
PVN Núcleo paraventricular do hipotálamo
RP Rafe pallidus
RVLM Bulbo rostral ventrolateral
SNC Sistema nervoso central
vlPAG Coluna ventrolateral da PAG
VMH Hipotálamo ventromedial
WAY100635 Antagonista do receptor 5-HT
1
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................8
2 OBJETIVOS.......................................................................................................17
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................17
3 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................18
3.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS............................................................................18
3.2 ANIMAIS...........................................................................................................18
3.3 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS..................................................................18
3.4 MICROINJEÇÃO DE DROGAS.......................................................................20
3.5 ANÁLISE DA ATIVIDADE LOCOMOTORA.....................................................21
3.6 ESTRESSE POR JATO DE AR.......................................................................22
3.7 DROGAS..........................................................................................................23
3.8 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS..................................................................23
4 HISTOLOGIA.....................................................................................................31
5 ANÁLISE ESTATÍSTICA...................................................................................32
5 RESULTADOS...................................................................................................32
6 ANÁLISE HISTOLÓGICA..................................................................................50
7 DISCUSSÃO.......................................................................................................52
8 BIBLIOGRAFIA..................................................................................................62
1. Introdução
Cannon (1929) ampliando o conceito de milieu intérieur (“constância do
meio interno”) de Claude Bernard (1878) introduziu o conceito de homeostasia
(homoio, similar, parecido; stasis, parada) para descrever os processos
fisiológicos que mantém os estados de equilíbrio de um organismo e sugeriu que
o sistema nervoso simpático seria o principal responsável pelo controle da
homeostase após algum evento estressante (CANNON, 1929). No entanto, foi
Hans Selye (1936) que introduziu, como termo médico, a palavra estresse, à
comunidade científica. Em sua publicação na revista SCIENCE em 1955,
descreveu uma tríade patológica (aumento da adrenal, ulceração gastrointestinal e
involução do timo) gerada por qualquer agente estressor. Hans Selye conceituou
estresse como um componente inespecífico. Atualmente, é aceito que agentes
estressantes específicos podem causar respostas específicas e ativar diferentes
circuitos do sistema nervoso central (PACAK & PALKOVITS, 2001).
Em particular, a resposta fisiológica associada ao estresse emocional
consiste em um padrão integrado de alterações endócrinas, autonômicas e
comportamentais que foram evolutivamente conservadas nos mamíferos (HANS
SELYE, 1955; LEDOUX, 1994; DIMICCO et al., 2002). Sem dúvida, essas
alterações fisiológicas aumentam as chances de sobrevivência do animal frente à
circunstâncias ameaçadoras, sendo então fundamentais para a preservação das
espécies. No entanto, o homem urbanizado vivencia situações próprias que o faz
experimentar, muitas vezes de forma exagerada ou desbalanceada, as respostas
autonômicas ao estresse. O estresse contribui para o aparecimento de uma
grande variedade de doenças em humanos. Entre essas se destacam, a
hipertensão arterial (FOLKOW, 1987; HENRY et al., 1986), as arritmias cardíacas,
desordens da motilidade intestinal, formações de úlceras gástricas e duodenais
(FOSSEY & LYDIARD, 1990), a síndrome do pânico (STROHLE & HOSBOER,
2003), o infarto do miocárdio e até mesmo a morte súbita (GAVEY, 1954;
MEERSON, 1994).
Desde os primeiros estudos sobre o estresse, fica evidente a importância
da compreensão das vias neurais relacionadas às respostas produzidas pelo
estresse emocional (HANS SELYE, 1936).
Por mais de meio século, estudos mostram o envolvimento do hipotálamo
como uma estrutura chave na geração da resposta fisiológica ao estresse
emocional (KARPLUS & KREIDL, 1927; BARD, 1928). Mesmo assim, até os dias
atuais, os mecanismos e circuitos neurais responsáveis pela geração da resposta
ao estresse emocional permanecem em grande parte desconhecidos.
Estudos vêm apontando o núcleo dorsomedial do hipotálamo (DMH) como
sendo um componente importante das vias centrais mediadoras da respostas
cardiovasculares e comportamentais relacionadas ao estresse emocional
(DIMICCO et al., 1996; DIMICCO et al., 2002) (Figura 1).
O DMH é anatomicamente localizado adjacente ao terceiro ventrículo e
caudal ao núcleo paraventricular do hipotálamo (PAXINOS & WATSON, 1997). A
ativação dos neurônios do DMH por meio da microinjeção de aminoácidos
excitatórios ou do antagonista de receptores gabaérgicos subtipo A (GABA
A
),
bicuculline-methiodide (bic) resulta em aumento da pressão arterial (PA) e
importante aumento da frequência cardíaca (FC) (BAILEY et. al 2001; FONTES et
al., 2001; DE NOVELLIS et al., 1995) e da atividade simpática (FONTES et al.,
2001; CAO & MORISSON., 2004; HORIUCHI et al., 2004(b) ), além de alterações
neuroendócrinas que reproduzem aquelas observadas durante o estresse
emocional agudo (BAILEY et al., 2001).
Núcleo Dorsomedial
V
M
H
PVN
P
H
N
A
H
N
TÁLAMO
Figura 1. Corte sagital do cérebro mostrando o hipotálamo dorsomedial e alguns dos principais
núcleos hipotalâmicos que o circundam. VMH, hipotálamo ventromedial; AHN, hipotálamo anterior;
PHN, hipotálamo posterior, PVN, núcleo paraventricular do hipotálamo.
Retirado e adaptado de Berne/Levy. Physiology. 5th Edition, 2004
Ativação dos neurônios do DMH também produz alterações
comportamentais caracterizadas por aumento da atividade locomotora, aumento
seletivo de respostas motivadas pelo medo e aumento na ansiedade experimental
(SHEKHAR & DIMMICO, 1987). É interessante destacar que a disfunção crônica
de GABA no DMH revelou ser um modelo experimental de transtorno do pânico
(SHEKHAR et al., 1996). Ao contrário, a inibição do DMH reduz de forma
importante a resposta pressora e taquicárdica induzida pelo estresse emocional
em ratos acordados (STOTZ-POTTER et al., 1996). Sendo assim, todos esses
estudos em conjunto apontam o envolvimento do DMH nas respostas fisiológicas
relacionadas ao estresse emocional.
Estudos anatômicos mostraram que o DMH não contém neurônios que
enviam projeções diretas para os neurônios pré-ganglionares simpáticos
localizados na coluna intermediolateral da medula espinhal (TER HORST et al.,
1986; THOMPSON et al., 1996). Desta forma, como postulado por Fontes et al.
(2001) as alterações fisiológicas relacionadas à ativação dos neurônios do DMH
deveriam incluir integrações sinápticas em neurônios de núcleos supramedulares.
Neste sentido, esses autores mostraram que as respostas pressora e
simpatoexcitatória, mas não a resposta taquicárdica, produzidas pela microinjeção
de bicuculina methiodide (bic) no DMH foram abolidas pela inibição dos neurônios
da região rostroventrolateral do bulbo (RVLM). Em um estudo subsequente,
(SAMUELS et al., 2002; CAO & MORRISON, 2004) foi demonstrado que a
taquicardia produzida pela estimulação de neurônios do DMH é atenuada pela
inibição de um outro núcleo bulbar, a rafe pallidus (RP). Em conjunto, estes
estudos mostraram que as respostas cardiovasculares e simpatoexcitatórias
evocadas pela ativação dos neurônios do DMH seriam mediadas pela integração
de múltiplos relés sinápticos (FONTES et al., 2001; SAMUELS et al., 2002; CAO &
MORRISON, 2004).
Além dos relés sinápticos em nível bulbar descritos acima, estudos
anatômicos (TER HORST et al., 1986; THOMPSON et al., 1996 ) mostram a
existência de projeções do DMH para uma região mesencefálica que circunda o
aqueduto cerebral, a substância cinzenta periaquedutal (PAG). Os neurônios da
PAG possuem papel crucial na integração das respostas autonômicas e somáticas
características das reações de defesa (BANDLER & CARRIVE, 1988). De acordo
com esses autores, a reação de defesa é comumente referida a uma mudança
comportamental e cardiovascular característica do animal sob uma situação de
estresse emocional (BANDLER & CARRIVE, 1988).
A substância cinzenta periaquedutal controla um grande número de
funções, como a modulação da dor (BASBAUM, 1984; BEHBEHANI et al., 1990;
REYNOLDS, 1969), vocalização (JURGENS et al., 1979) e particulamente as
respostas autonômicas (LOVICK, 1991) e os diferentes padrões comportamentais
de defesa (BANDLER & CARRIVE, 1988; TRICKLEBANK, 1985).
A PAG não é uma estrutura homogenêamente funcional, desta forma,
diferentes tipos de padrões comportamentais e cardiovasculares podem ser
observados quando diferentes porções da PAG são estimuladas (CARRIVE,
1993). Em particular, a microinjeção de aminoácidos excitatórios (AAE) na porção
caudal da coluna lateral e dorsolateral da PAG (l/dlPAG) produz fuga, taquicardia
e hipertensão. Em contraste, a microinjeção de AAE realizada na coluna
ventrolateral da PAG (vlPAG) diminui a reatividade do gato à estimulos externos
(hiporreatividade) e esse comportamento é associado com hipotensão e
bradicardia (BANDLER et al., 2000). Desta forma, as respostas produzidas pela
ativação da l/dlPAG são semelhantes às observadas após ativação do DMH, o
que sugere o envolvimento dos neurônios desta região como um possível relé
sináptico nas vias cardiovasculares oriundas do DMH.
Com o objetivo de responder a esta sugestão, DA SILVA et al. (2003)
demonstraram que a resposta cardiovascular produzida pela ativação do DMH por
meio da microinjeção de bic em ratos acordados depende de conexões sinápticas
com a região l/dlPAG, pois a inibição dessa região por meio da microinjeção do
agonista do receptor GABA
A
, muscimol, abole tanto a resposta pressora como a
resposta taquicárdica produzida pela ativação do DMH (DA SILVA et al., 2003).
Em um estudo mais recente DA SILVA et al. (2006) demonstraram que as
conexões sinápticas entre os neurônios do DMH e os da l/dlPAG são mediadas
por aminoácidos excitatórios (AAE), possívelmente o N-Metil-D-Aspartato (NMDA)
(DA SILVA et al., 2006).
A serotonina (5-Hidroxitriptamina, 5-HT), é uma monoamina amplamente
distribuida pelo organismo dos mamíferos, sendo sintetizada a partir do
aminoácido essencial L-triptofano principalmente pelas células enterocromafins
gastrointestinais e por neurônios serotoninérgicos. Possui sete familias e quatorze
subtipos de receptores, até então descobertos (LEOPOLDO, 2004; para revisão
BARNES & SHARP, 1999).
Desde sua descoberta no cérebro de mamíferos (TWAROG & PAGE,1953)
os efeitos da serotonina às respostas relacionadas ao estresse vêm sendo
estudados (HEDGES, 2007). Nos últimos 50 anos, drogas que possuem como
alvo direto ou indireto o mecanismo de ação da serotonina, surgiram como uma
importante categoria de agentes terapêuticos, fornecendo tratamento para grande
quantidade de distúrbios clínicos (PEROUTKA et al., 1989).
Pesquisas em estresse e serotonina mostram que é plausível a hipótese
que os componentes dos sistemas serotoninérgicos centrais são sensíveis a
agentes estressores. Essa hipótese se enquadra nas respostas terapêuticas
observadas em pacientes com distúrbios de ansiedade e ou depressão, sugerindo
então que a 5-HT é um componente importante dos circuitos neurais que provêm
adaptação ao estresse (CHAOULOFF et al., 1999).
Entre as drogas ansiolíticas, é importante destacar os inibidores seletivos
da recaptação da serotonina, como a fluoxetina e paroxetina. Por seletivamente
bloquearem a recaptação de 5-HT, acredita-se que essas drogas funcionem via
modulação dos receptores 5-HT1A, conceito que foi reforçado pela ação ansiolítica
da buspirona que é um agonista parcial do receptor 5-HT1A (VAN DER BUUSE &
WEGENER, 2004).
Áreas do sistema nervoso central envolvidas com a regulação
cardiovascular recebem grande quantidade de projeções vindas de neurônios
serotoninérgicos (DAHLSTROM & FUXE, 1965).
Dos compostos que modulam a ação dos receptores de serotonina, é
importante destacar o agonista seletivo do receptor 5-HT
1A
8-hidroxi-2-(di-n-
propilamino)-tetralin (8-OH-DPAT) como sendo o composto mais estudado sobre
uma perspectiva cardiovascular (para revisão PEROUTKA et al.,1989, MCCALL &
CLEMENT, 1994). Particulamente com relação ao sistema cardiovascular, a
administração de 8-OH-DPAT resulta em redução da pressão arterial e da
frequência cardíaca em uma variedade de animais anestesiados ou não, incluindo
ratos normotensos e espontaneamente hipertensos (PEROUTKA et al., 1989,
MCCALL & CLEMENT, 1994). Estudos mostram também que o 8-OH-DPAT atua
via sistema nervoso central para produzir seu efeito cardiovascular. A
administração de 8-OH-DPAT no sistema nervoso central (via cisterna pontina),
produz redução mais acentuada dos parâmetros cardiovasculares quando
comparada aos efeitos da administração da mesma dose via intravenosa
(WOUTERS et al., 1988; DOODS et al., 1988). É importante destacar a alta
afinidade de receptores 5-HT
1A
à 5-HT e ao 8-OH-DPAT em regiões do tronco
encefálico, fato que não ocorre com outros ligantes também específicos ao
receptor 5-HT
1A
, como o MDL 73005 EF , BMY 7378 e a buspirona (ANDRADE &
NICOLL, 1987)
Em um estudo recente de HORIUCHI et al. (2005), foi sugerido que os
efeitos da ativação dos receptores 5-HT1A no tronco cerebral causa uma potente e
seletiva supressão da resposta hipertensiva e simpatoexcitatória evocada pela
estimulação do DMH. Desta forma, a resposta produzida pela estimulação do
DMH pode ser atenuada pela ativação de receptores 5-HT1A. No entanto, não foi
identificado o local específico do tronco cerebral onde os receptores 5-HT1A estão
produzindo sua ação inibitória sobre as respostas evocadas pelo DMH.
A l/dlPAG possui receptores 5HT1A que ao serem ativados levam à inibição
da atividade neuronal dessa mesma região. (PAZOS & PALACIOS, 1985). A
microinjeção do agonista dos receptores 5-HT1A, 8-OHDPAT na l/dlPAG pode
inibir as respostas simpatoexcitatórias e de pânico produzidas pela
eletroestimulação e estimulação química dessa mesma região (JOHNSON et al.,
2004). Adicionalmente, foi demonstrado que a resposta comportamental de
defesa produzida pela eletroestimulação do hipotálamo medial foi reduzida de uma
forma dose dependente pela microinjeção do agonista seletivo do receptor 5-HT1A,
8-OH-DPAT, na l/dlPAG de gatos (NOGUEIRA et al., 1995).
Em conjunto, estes estudos sugerem que a l/dlPAG possa ser a região do
tronco cerebral onde os efeitos da ativação dos receptores 5-HT1A reduzem as
respostas hipertensivas e simpatoexcitatórias evocadas pela estimulação do DMH.
Como existe uma via anatômica e funcional entre o hipotálamo dorsomedial
e a PAG (TER HORST et al., 1986; THOMPSON et al., 1996), é possível
especular sobre os efeitos da ativação dos receptores 5-HT1A na l/dlPAG sobre a
modulação das respostas produzidas pela ativação do DMH. Desta forma, a
ativação desses receptores serotoninérgicos capazes de inibir respostas
simpatoexcitatórias e de comportamento de emergência tipo “fuga ou luta”, pode
ser relevante na tentativa de explicar a eficácia de drogas serotoninérgicas no
tratamento da hipertensão, ansiedade e ataques de pânico.
A investigação do papel dos receptores serotoninérgicos da PAG na
resposta cardiovascular e comportamental produzida pela ativação dos neurônios
do DMH, torna-se relevante para o melhor entendimento das vias neurais que
controlam as respostas fisiológicas e comportamentais relacionadas ao estresse
emocional.
Torna-se relevante também, identificar a origem dessas sinapses
serotoninérgicas uma vez que estudos mostram a existência de um subgrupo de
neurônios serotoninérgicos da vlPAG, ou também denominados as asas laterais
do núcleo da rafe dorsal (DRN). Aparentemente, esse subgrupo de neurônios
está envolvido na inibição da resposta simpatoexcitatória e tipo pânico (fuga)
produzidas pela eletroestimulação da dlPAG (JOHNSON et al., 2004). Este
estudo também mostra evidências de uma possível modulação dos neurônios da
dlPAG por esse subgrupo de neurônios serotoninérgicos da vlPAG (JOHNSON et
al., 2004).
2. Objetivos
O objetivo geral do presente estudo é avaliar o papel dos receptores 5-HT
1A
da região lateral e dorsolateral da substância cinzenta periaquedutal (PAG) nas
respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas pela ativação dos
neurônios do hipotálamo dorsomedial.
2.1. Objetivos específicos
1- Avaliar os efeitos cardiovasculares e comportamentais produzidos pela
ativação dos neurônios do DMH após a microinjeção do agonista ou do
antagonista de receptores 5-HT1
A
na l/dlPAG.
2- Avaliar os efeitos cardiovasculares produzidos pelo estresse por jato de ar
após a microinjeção do agonista ou do antagonista de receptores 5-HT1A
na
l/dlPAG.
3- Avaliar o possível envolvimento dos receptores 5-HT
1A
na l/dlPAG na
modulação da resposta cardiovascular e comportamental produzida pela
microinjeção do agonista do receptor NMDA, NMDA, na l/dlPAG.
4- Avaliar os efeitos cardiovasculares e comportamentais produzidos pela
ativação dos neurônios do DMH após inibição bilateral dos neurônios da
vlPAG.
3. Materiais e Métodos
3.1. Considerações éticas
Todos os procedimentos metodológicos realizados neste trabalho foram
aprovados pelo comitê de ética em experimentaçao animal da Universidade
Federal de Minas Gerais. Protocolo:
3.2. Animais
Os experimentos foram realizados usando ratos Wistar (270-330g de peso
corporal) provenientes do Centro de Bioterismo (CEBIO) do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais. Os animais foram alojados
em gaiolas individuais (47 cm x 31 cm x 16 cm) tendo livre acesso à água e ração.
3.3. Procedimentos cirúrgicos
Os ratos foram anestesiados com tribromoetanol (250 mg/kg i.p.,
suplementados quando necessário) para implante de cânulas guia (agulha 25G,
16mm) bilateralmente na l/ dlPAG e unilateralmente no DMH. Para realização do
procedimento de implante das cânulas guia, os ratos foram posicionados em um
aparelho estereotáxico (Stoelting, IL, USA) (figura 2) com a barra incisora fixada a
-3.3mm da linha interaural.
As cânulas-guia foram posicionadas usando o bregma como ponto de
referência, de acordo com as coordenadas determinadas pelo atlas de Paxinos e
Watson (1997): 1) DMH 3.2 mm posterior, 0.6 mm lateral e 8,5mm ventral; 2)
l/dlPAG 7.8 mm posterior, 0.7 mm lateral e 4.8 ventral ; 3) vlPAG 7.8 mm posterior,
0.8 mm lateral e 5.6 ventral. As cânulas guia foram fixadas usando acrílico dental
autopolimerisável que foi ancorado por dois parafusos fixados na calota craniana
do rato.
Ajustes
Canula guia
Crânio
Figura 2. Ilustração de um rato posicionado em um aparelho estereotáxico para o procedimento de
implante das cânulas guia.
Após, no mínimo, quatro dias de recuperação da cirurgia de implante de
cânulas-guia os ratos foram anestesiados novamente com tribromoetanol, e uma
pequena incisão foi feita na região inguinal para expor a artéria femoral. Um
catéter de polietileno (Clay Adams, 0.011 I.D.), preenchido com salina
heparinizada, foi usado para o procedimento de canulação. Aproximadamente 4
cm desse catéter (soldado por aquecimento a um tubo PE-50 de 15 cm) foram
inseridos na aorta abdominal, via artéria femoral, para realização de registro da
pressão arterial e freqüência cardíaca. A outra extremidade (tubo PE-50 de 15
cm) foi conduzida até a região interescapular através do tecido subcutâneo e
exteriorizada. O catéter foi fixado com linha de sutura e as incisões da região
inguinal e interescapular foram suturadas. Os animais se recuperaram por no
mínimo 24 h após a cirurgia de implante do catéter e somente após esse período
de recuperação, os experimentos foram iniciados. Foi observada a aparência, o
comportamento e a perda de peso corporal dos animais como forma de avaliar o
estado de saúde desses. Apenas foram utilizados os animais que mantiverem um
bom estado de saúde após os procedimentos cirúrgicos e durante o experimento.
3.4. Microinjeção de drogas
O registro de pressão arterial (PA) e freqüência cardíaca (FC) foram
monitorados durante todo o experimento com a utilização de um aparelho (Biopac
systems, CA, USA modelo MP100 A-CE). Para as microinjeções, foram usadas
agulhas (33G, 17mm) sendo o início das microinjeções após 15 minutos de
registro da PA e FC. As agulhas foram conectadas a um tubo de polietileno
(Norton, 0.010 I.D) preenchido com a droga. Em sua outra extremidade, foi fixada
uma seringa (Hamilton) de 5µl, preenchida com água deionizada. Entre os dois
líquidos havia uma pequena bolha de ar, assim o experimentador sabia,
observando o movimento da bolha, se a droga estava ou não sendo microinjetada.
Após o processo de microinjeção, o êmbolo da seringa microinjetora era
pressionado e se, imediatamente após a pressão do êmbolo, saisse líquido na
ponta da agulha microinjetora, era sinal de que a agulha não estava obstruída e
que o procedimento foi bem sucedido. O volume das microinjeções foi de 100 nl
e o tempo de cada microinjeção de aproximadamente 20 segundos.
3.5. Análise da atividade Locomotora (Comportamental)
Foram avaliadas a atividade locomotora e exploratória dos animais. A caixa
do animal foi dividida igualmente em quatro áreas de 23 cm x 15,5 cm. Uma
câmera de vídeo foi fixada acima da caixa para filmar o comportamento do rato
após as microinjeções por um período de 10 minutos. Ao término dos
experimentos os filmes foram analisados para quantificar o número de vezes
(episódios) em que o rato atravessa de um quadrante para o outro (running)
(figura 3.1.1) e o número de vezes em que o animal fica apoiado nas patas
traseiras (rearing) (figura 3.1.2). A atividade do animal foi expressa em número
total de episódios (running + rearing) por um período de 10 minutos.
2
1
Figura 3.1.1 Avaliação da atividade locomotora e exploratória dos animais (running). Podem ser
vistos dois movimentos 1 e 2, onde o animal atravessa de um quadrante para outro.
A B C
1
Figura 3.1.2 Avaliação da atividade locomotora e exploratória dos animais (rearing). As três
figuras A, B e C mostram, da esquerda para direita, um movimento de rearing. Em A o animal esta
apoiado nas quatro patas, em B ele faz o movimento e fica apoiado nas patas trazeira e em C ele
volta para o apoio nas quatro patas.
3.6. Estresse por jato de ar
Imediatamente após a microinjeção das drogas na l/dlPAG, os ratos foram
colocados em um cilindro de acrílico para retenção e viabilização do procedimento
de jato de ar. Após 10 minutos de registro dos parâmetros cardiovasculares, de
pressão arterial e de frequência cardíaca, dentro do cilindro, os ratos foram
submetidos a um jato de ar de 1.5 L/min na cabeça. Após 20 minutos de jato de
ar os ratos foram então retirados do cilindro.
3.7. Drogas
As drogas usadas foram: o antagonista seletivo do receptor GABA
A
Bicucculina methiodide (Bic) (Sigma; 10 pmol), o agonista do receptor GABA
A
muscimol (Sigma; 1nmol); o agonista seletivo do receptor 5-HT1
A
, 8-hydroxy-2-(di-
n-propylamino) tetralin (8-OH-DPAT) (Sigma; 0.1, 1 e 3 nmol), o antagonista
seletivo do receptor 5-HT1
A
, WAY-100635 (Sigma;0.5 e 3 nmol ); o agonista
seletivo do receptor NMDA, NMDA, (Sigma; 6 pmol) e salina (NaCl 0.9 %) que foi
usada como veículo. Todas as drogas foram microinjetadas em um volume de
100nl.
3.8. Protocolos experimentais
PROTOCOLO 1: Efeito da ativação de receptores 5-HT1A da l/dlPAG sobre
as respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas pela ativação
dos neurônios do DMH
Com o objetivo de avaliar se a ativação dos receptores 5-HT
1A
na l/dlPAG
são capazes de modular as respostas produzidas pela ativação dos neurônios do
DMH, nesta primeira série de experimentos foram avaliados os efeitos
cardiovasculares e comportamentais produzidos pela microinjeção unilateral do
antagonista do receptor GABA
A
, Bic, (10 pmol) no DMH antes e após a
microinjeção bilateral de 8-OH-DPAT, (0.1nmol; 1 e 3 nmol) na l/dlPAG em ratos
acordados. Este protocolo experimental foi realizado como ilustrado na figura 3.2.
Figura 3.2. Sequência temporal da microinjeção de Bic no DMH antes e após a microinjeção de 8-
OH-DPAT na l/dlPAG em ratos acordados.
PROTOCOLO 2: Efeito da inibição dos receptores 5-HT
1A
da l/dlPAG sobre
as respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas pela ativação
dos neurônios do DMH
Com o objetivo de avaliar se o bloqueio dos receptores 5-HT
1A
na l/dlPAG
são capazes de modular as respostas produzidas pela ativação dos neurônios do
DMH, nesta série de experimentos foram avaliados os efeitos cardiovasculares e
comportamentais produzidos pela microinjeção unilateral de bic (10 pmol) no DMH
antes e após a microinjeção bilateral de WAY100635, (0.5 e 3 nmol) na l/dlPAG.
Este protocolo experimental foi realizado como ilustrado na figura 3.3.
Figura 3.3. Sequência temporal da microinjeção de Bic no DMH antes e após a microinjeção de
WAY100635 na l/dlPAG.
PROTOCOLO 3: Efeito da interação do agonista e do antagonista dos
receptores 5-HT
1A
da l/dlPAG sobre as respostas cardiovasculares e
comportamentais produzidas pela ativação dos neurônios do DMH.
Com o objetivo de avaliar se os efeitos da microinjeção do 8-OH-DPAT
observados no protocolo 1 eram específicos à sua ligação aos receptores 5-HT
1A
,
propos-se administrar o antagonista específico do receptor 5-HT
1A
antes da
microinjeção do 8-OH-DPAT
.
Neste sentido, avaliou-se os efeitos
cardiovasculares e comportamentais produzidos pela microinjeção unilateral de bic
(10 pmol) no DMH antes e após a microinjeção bilateral do antagonista do
receptor 5-HT
1A
, WAY100635, (0.5 nmol) seguida da microinjeção do agonista do
receptor 5HT
1A
, 8-OH-DPAT (3 nmol) na l/dlPAG. Este protocolo experimental foi
realizado como ilustrado na figura 3.4.
Figura 3.4. Sequência temporal da microinjeção de Bic no DMH antes e após a microinjeção de
WAY100635 seguida pela microinjeção de 8-OH-DPAT na l/dlPAG.
Em um grupo separado de ratos, foram realizados experimentos controle.
Nesta série, avaliou-se a magnitude das respostas cardiovasculares e
comportamentais produzidas por duas microinjeções sucessivas de bic
unilateralmente no DMH, após a microinjeção bilateral de veículo salina (NaCl
0.9%) na l/dlPAG, separadas por um intervalo de ~35 min. Este protocolo
experimental foi realizado como ilustrado na figura 3.5.
Figura 3.5. Sequência temporal da microinjeção de bic antes e após a microinjeção de salina na
l/dlPAG.
PROTOCOLO 4: Efeito da ativação dos receptores 5-HT
1A
da l/dlPAG sobre
as respostas cardiovasculares produzidas pelo estresse por jato de ar em
ratos.
Com o objetivo de avaliar se a ativação dos receptores 5-HT
1A
na l/dlPAG
são capazes de modular as respostas produzidas durante um estresse emocional
puro, nesta série de experimentos foram avaliados os efeitos cardiovasculares
produzidos pelo estresse por jato de ar (1.5 L/min) antes e após a microinjeção
bilateral do agonista do receptor 5-HT
1A
, 8-OH-DPAT na l/dlPAG. Este protocolo
experimental foi realizado como ilustrado na figura 3.6.
Figura 3.6. Sequência temporal da realização do estresse por jato de ar, antes e após a
microinjeção de 8-OH-DPAT na l/dlPAG.
PROTOCOLO 5: Efeito do bloqueio dos receptores 5-HT
1A
da l/dlPAG sobre
as respostas cardiovasculares produzidas pelo estresse por jato de ar em
ratos.
Com o objetivo de avaliar se as respostas observadas no protocolo 2 se
repetiam durante um estresse emocional puro. Nesta série de experimentos
foram avaliados os efeitos cardiovasculares produzidos pelo estresse por jato de
ar (1.5 L/min) antes e após a microinjeção bilateral do antagonista do receptor 5-
HT
1A
na l/dlPAG. Este protocolo experimental foi realizado como ilustrado na
figura 3.7.
Figura 3.7. Sequência temporal da realização do estresse por jato de ar, antes e após a
microinjeção de WAY100635 na l/dlPAG.
PROTOCOLO 6: Efeito da ativação dos receptores 5-HT
1A
da l/dlPAG sobre
as respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas pela
microinjeção bilateral do agonista dos receptores NMDA na l/dlPAG.
Com a finalidade de avaliar o possível envolvimento dos receptores 5-HT
1A
na l/dlPAG na modulação da resposta produzida pela microinjeção do agonista do
receptor NMDA, NMDA, na l/dlPAG, foram avaliados os efeitos cardiovasculares e
comportamentais produzidos pela microinjeção de NMDA, (10 pmol / 100nl) antes
e após a microinjeção bilateral do agonista do receptor 5-HT
1A
, 8-OH-DPAT, (3
nmol) na l/dlPAG. Este protocolo experimental foi realizado como ilustrado na
figura 3.8.
Figura 3.8. Sequência temporal da microinjeção de NMDA na l/dlPAG antes e após a microinjeção
de 8-OH-DPAT na mesma região.
PROTOCOLO 7: Efeito da inibição dos neurônios da vlPAG sobre as
respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas pela ativação
dos neurônios do DMH
Com o objetivo de investigar se a vlPAG poderia ser uma região cuja
inibição dos seus neurônios (posivelmente serotoninérgicos) interferem nas
respostas produzidas pela ativação do DMH, foram avaliados os efeitos
cardiovasculares e comportamentais produzidos pela microinjeção unilateral de bic
(10 pmol) no DMH antes e após a microinjeção bilateral do agonista do receptor
GABA
A
, Muscimol, (1nmol / 100nl) na vlPAG. Este protocolo experimental foi
realizado como ilustrado na figura 3.9.
DMH
Muscimol
(1nmol/ 100nl)
vlPAG
Fim do
Experimento
5 min
~ 35 min
Sal (100nl)
vlPAG
Bic
(10pmol/100nl)
DMH
Bic
(10pmol/100nl)
DMH
~ 20 min
Controle
5 min
~15min
vlPAG
Figura 3.9. Sequência temporal da microinjeção de Bic antes e após a microinjeção de muscimol
na vlPAG.
4. Histologia
No final dos experimentos os ratos foram sacrificados com overdose de
anestésico. Em seguida, foi microinjetado o corante Alcian Blue (100nl) nos sítios
de injeção para confirmação histológica. O cérebro, após ser removido, foi
mantido por 24 h em paraformaldeído a 4%. Após esse período, o cérebro foi
armazenado em sacarose 30% por, no mínimo, dois dias. Subseqüentemente, o
hipotálamo e a PAG foram cortados com a utilização de micrótomo, em fatias
coronais de 50 – 100 μm. Os cortes foram colocadas em lâminas e corados com
Vermelho Neutro para a confirmação dos sítios de microinjeção nas regiões do
DMH e PAG usando como referência o Atlas de Paxinos e Watson (1997).
5. Análise Estatística
Comparações entre as respostas evocadas pela microinjeção de bic no
DMH após as diferentes microinjeções de drogas na PAG, em grupos diferentes
de ratos, foram determinadas pelos teste-t de student (STEEL et al., 1997). A
significância das respostas cardiovasculares e comportamentais evocadas pela
microinjeção de bic no DMH após microinjeções de salina ou de diferentes drogas
na PAG em um mesmo animal foram determinadas pelo teste-t pareado STEEL et
al., 1997). O valor de significância foi estabelecido quando P< 0,05. Os dados
foram expressos como média ± epm.
6. Resultados
Os resultados aqui apresentados correspondem aos dados obtidos nos protocolos
experimentais descritos na seção 3.7 do Materiais e Métodos, páginas 16 – 29.
1- Efeito da ativação de receptores 5-HT
1A
da l/dlPAG sobre as respostas
cardiovasculares e comportamentais produzidas pela ativação dos
neurônios do DMH
A tabela 1. mostra que a microinjeção do agonista do receptor 5-HT
1A
, 8-
OH-DPAT, na l/dlPAG não alterou os parâmetros basais, cardiovasculares, em
nenhuma das doses testadas.
A tabela 2, mostra que duas microinjeções de salina na l/dlPAG, separadas
por um período de aproximadamente 40 minutos, não alteram os parâmetros
cardiovasculares basais. Nenhuma diferença foi observada na magnitude das
respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas por duas microinjeções
de Bic no DMH após a microinjeção de salina na l/dlPAG, em um mesmo rato
(Figura 5).
A microinjeção de 8-OH-DPAT (1nmol) na l/dlPAG reduziu em 66% o
aumento da FC (173 ± 24 bpm) evocado pela ativação do DMH (figura 4). A dose
de 3nmol microinjetada na l/dlPAG reduziu em 64% e 56%, os aumentos de FC e
PAM (177 ± 25 bpm e 21 ± 4 mmHg, respectivamente), produzidos pela ativação
do DMH (figura 4, 8A e 8B). A microinjeção de 8-OH-DPAT (0.1nmol) na l/dlPAG
não alterou os aumentos de PAM, FC e alterações comportamentais evocados
pela ativação do DMH (figura 4). Nenhuma das doses testadas alterou o efeito
sobre o comportamento (18 ± 7 número de episódios) produzido pela ativação do
DMH (figura 4).
Tabela 1. Valores basais de pressão arterial média e frequência cardíaca e alterações
cardiovasculares produzidas pela microinjeção de 8-OH-DPAT ou salina na coluna
lateral/dorsolateral da substância cinzenta periaquedutal (l/dlPAG).
Tabela 2 . Valores basais de PAM e FC e alterações na PAM e FC produzidas por duas
microinjeções sucessivas de salina na l/dlPAG, separadas por um período de 40 minutos.
Valores Basais
Alterações na PAM e FC
PAM FC
(mmHg) (bpm)
PAM FC
(mmHg) (bpm)
Salina antes do 8-OH-
DPAT 0.1nmol n=5
101± 2 361 ± 9
1 ± 1 -7 ± 7
8-OH-DPAT 0.1nmol
n=5
109 ± 3 376 ± 17
2 ± 1 -8 ± 5
Salina antes do 8-OH-
DPAT 1nmol n=6
104 ± 3 347 ± 12
2 ± 2 4 ± 1
8-OH-DPAT
1nmol n=6
108 ± 4 381 ± 12
-2 ± 1 -13 ± 4
Salina antes do 8-OH-
DPAT 3nmol n=5
98 ± 5 340 ± 10
1 ± 1 -10 ± 5
8-OH-DPAT
3nmol n=5
104 ± 6 319 ± 18
-5 ± 3 -34 ± 15
Valores Basais
Alterações na PAM e FC
PAM FC
(mmHg) (bpm)
PAM FC
(mmHg) (bpm)
Salina l/dlPAG n=3
108 ± 5 368 ± 8
5 ± 1 14 ± 5
Salina l/dlPAG n=3
111 ± 6 384 ± 19
1 ± 1 3 ± 6
0.1nmol
n=5
0
10
20
30
Alterações na PAM
(mmHg)
1nmol
n=6
0
10
20
30
3nmol
n=5
0
10
20
30
sal/bic
dpat/bic
0.1nmol
0
50
100
150
200
250
Alterações na FC
(bpm)
1nmol
0
50
100
150
200
250
3nmol
0
50
100
150
200
250
0.1nmol
0
25
50
Atividade
(número de episódios)
1nmol
0
25
50
*
*
3nmol
0
25
50
*
Figura 4. Alterações na pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC) e comportamentais
produzidas pela microinjeção de Bic (10 pmol / 100 nl) no DMH, após salina, e 40 minutos mais tarde,
após a microinjeção de 8-OH-DPAT (0.1, 1 e 3 nmol / 100 nl) na l/dlPAG. * p<0,05 comparado com o
efeito produzido pela microinjeção de Bic no DMH após a microinjeção de salina na l/dlPAG (teste t
pareado).
n=3
0
10
20
30
sal / bic
sal / bic
Alterações na PAM
(mmHg)
0
50
100
150
200
250
Alterações na FC
(bpm)
0
25
50
Atividade
(número de episódios)
Figura 5. Alterações na PAM, FC e de comportamento produzidas pela microinjeção de bic ( 10
pmol/100 nl) no DMH, após salina na l/dlPAG e, 40 minutos mais tarde, após salina novamente na
l/dlPAG.
2- Efeito do bloqueio dos receptores 5-HT
1A
na l/dlPAG sobre as respostas
cardiovasculares e comportamentais produzidas pela ativação dos
neurônios do DMH
A tabela 3 mostra que a microinjeção isolada do antagonista do receptor 5-
HT
1A
, WAY100635, na l/dlPAG não alterou os parâmetros cardiovasculares
basais em nenhuma das doses testadas.
A microinjeção do antagonista do receptor 5-HT
1A
, WAY100635, ( 0.5 e 3
nmol / 100nl ) na l/dlPAG não interferiu sobre os aumentos de PAM, FC e
alterações de comportamento evocados pela ativação do DMH (figura 6).
Tabela 3. Valores basais de PAM e FC e alterações cardiovasculares produzidas pela microinjeção
de duas diferentes doses (0.5 nmol/100nl e 3nmol/100nl) do antagonista seletivivo do receptor 5-
HT
1A
, WAY100635, e salina 0.9% (100nl) na l/dlPAG.
Valores Basais
Alterações na PAM e FC
PAM FC
(mmHg) (bpm)
PAM FC
(mmHg) (bpm)
Salina n=6
104 ± 2 378 ± 12
2 ± 1 7 ± 6
WAY 0.5 nmol
l/dlPAG n=6
107 ± 3 386 ± 13
1 ± 2 1 ± 4
Salina n=7
114 ± 3 392 ± 6
1 ± 2 2 ± 1
WAY 3 nmol
l/dlPAG n=7
118 ± 3 389 ± 10
2 ± 1 1 ± 5
0.5nmol
n= 6
0
10
20
Alterações na PAM
(mmHg)
3nmol
n= 7
0
10
20
sal/bic
way/bic
0
50
100
150
Alterações na FC
(bpm)
0
50
100
150
0
50
100
150
Atividade
(número de episódios)
0
50
100
150
Figura 6. Alterações na PAM, FC e de comportamento produzidas pela microinjeção de bic
(10 pmol / 100 nl) no DMH, após salina, e 40 minutos mais tarde, após a microinjeção do
antagonista do receptor 5-HT
1A
, WAY100635, ( 0.5 - 3 nmol / 100 nl) na l/dlPAG.
3- Efeito da interação do agonista e do antagonista dos receptores 5-HT
1A
da l/dlPAG sobre as respostas cardiovasculares e comportamentais
produzidas pela ativação dos neurônios do DMH.
A tabela 4, mostra que a microinjeção do antagonista do receptor 5-HT
1A
WAY100635, seguida pela microinjeção do agonista do receptor 5-HT
1A
8-OH-
DPAT, na l/dlPAG não alterou os parâmetros basais, cardiovasculares, em
nenhuma das doses testadas.
A microinjecão, na l/dlPAG, de WAY100635 (0.5 nmol/100nl), antes da
microinjecão de 8-OH-DPAT (3 nmol/100 nl) reverteu o efeito observado pela
microinjeção de 8-OH-DPAT na resposta de aumento da PAM e FC produzida
pela ativação do DMH (Figura 7 e 8C).
Tabela 4. Valores basais de PAM e FC produzidas pela microinjeção do antagonista do receptor
5-HT
1A
, WAY100635, seguido pelo agonista seletivo do receptor 5-HT1A, 8-OH-DPAT, e salina
0.9% (100nl) na l/dlPAG.
Valores Basais
Alterações na PAM e FC
PAM FC
(mmHg) (bpm)
PAM FC
(mmHg) (bpm)
Salina l/dlPAG
n=5
117 ± 2 330 ± 10
2 ± 3 4 ± 9
WAY100635 + 8-OH-
DPAT l/dlPAG n=5
122 ± 1 339 ± 8
2 ± 3 2 ± 4
n=5
0
10
20
30
sal / bic
way + dpat / bic
Alterações na PAM
(mmHg)
0
50
100
150
200
250
Alterações na FC
(bpm)
0
25
50
75
100
Atividade
(número de episódios)
Figura 7. Alterações na PAM, FC e de comportamento produzidas pela microinjeção de bic (10
pmol / 100 nl) no DMH, após salina, e 40 minutos mais tarde, após a microinjeção do WAY100635,
( 0.5nmol / 100 nl) seguido por 8-OH-DPAT (3nmol) na l/dlPAG.
Bic DMH após 8-OH-DPAT na l/dlPAG
Bic DMH após sal na l/dlPAG
1min
Bic DMH após Way100635 + 8-OH-DPAT na l/dlPAG
300
Pressão
Arterial
(mmHg)
160
100
40
160
100
40
600
450
Pressão
Arterial
média
(mmHg)
Frequência
cardíaca
(bpm)
300
160
100
40
160
100
40
600
450
300
160
100
40
160
100
40
600
450
Pressão
Arterial
(mmHg)
Pressão
Arterial
média
(mmHg)
Frequência
cardíaca
(bpm)
Pressão
Arterial
(mmHg)
Pressão
Arterial
média
(mmHg)
Frequência
cardíaca
(bpm)
Figura 8. Registros de experimentos mostrando as respostas cardiovasculares produzidas pela
microinjeção de Bic no DMH após: (A) microinjeção de salina (100 nl), (B) microinjeção de 8-OH-DPAT
(3 nmol / 100 nl) ou (C) microinjeção de WAY100635 (0.5 nmol / 100nl) seguido por 8-OH-DPAT (3
nmol / 100 nl) na l/dlPAG. Em (A) e (B) as microinjeções foram feitas em um mesmo rato. Em (C) o
registro mostra um experimento realizado em um rato separado.
A
B
C
5- Efeito da ativação dos receptores 5-HT
1A
da l/dlPAG sobre as respostas
cardiovasculares produzidas pelo estresse por jato de ar em ratos.
A tabela 5 mostra os valores cardiovasculares basais antes e após a
entrada do rato no cilindro de acrílico. Não houve alteração nos parâmetros
cardiovasculares basais mensurados após a microinjeção de salina ou 8-OH-
DPAT na l/dlPAG seguido pela entrada do rato no cilindro de acrílico. Nenhuma
diferença foi observada na magnitude das respostas cardiovasculares produzidas
por duas sessões de estresse por jato de ar, após a microinjeção de salina na
l/dlPAG, em um mesmo rato (tabela 6).
Quando comparada ao efeito obtido no grupo controle, a microinjeção de 8-
OH-DPAT ( 3nmol / 100nl ) na l/dlPAG reduziu em 54% a taquicardia induzida
pelo jato de ar (controle 122 ± 22 bpm vs. 8-OH-DPAT 56 ± 11 bpm). Da mesma
forma 8-OH-DPAT reduziu em 40% o efeito pressor evocado pelo jato de ar
(controle 20 ± 5 mmHg, 8-OH-DPAT 12 ± 3 mmHg). (figura 9)
Tabela 5 . Valores basais de PAM e FC e alterações na PAM e FC produzidas após a
microinjeção de salina ou 8-OH-DPAT na l/dlPAG seguido pela entrada do rato no cilindro,
separadas por um período de 3 horas.
Valores Basais
Fora do cilindro
Valores Basais
Dentro do cilindro
PAM FC
(mmHg) (bpm)
PAM FC
(mmHg) (bpm)
Salina
l/dlPAG n=5
103 ± 3 363 ± 13
108 ± 4 382 ± 31
DPAT 3nmol
l/dlPAG n=5
104 ± 4 358 ± 18
105 ± 2 346 ± 18
Tabela 6 . Valores basais de PAM e FC e alterações na PAM e FC produzidas por duas sessões
de estresse por jato de ar após duas microinjeções sucessivas de salina na l/dlPAG, separadas por
um período de 3 horas. n=4
n=5
0
10
20
30
sal / jato
dpat / jato
Alterações na PAM
(mmHg)
0
50
100
150
Alterações na FC
(bpm)
*
*
Figura 9. Alterações na PAM, FC produzidas pelo estresse por jato de ar, após salina na l/dlPAG,
3 horas mais tarde, após a microinjeção de 8-OH-DPAT (3nmol / 100 nl) na l/dlPAG. * p<0,05
comparado com o efeito produzido pelo estresse por jato de ar após a microinjeção de salina na
l/dlPAG (teste t pareado).
Valores Basais
Alterações na PAM
e FC após sal na
l/dlPAG
Alterações na PAM
e FC após sal na
l/dlPAG
PAM FC
(mmHg) (bpm)
PAM FC
(mmHg) (bpm)
PAM FC
(mmHg) (bpm)
Jato de ar
n=4
124 ± 4 371 ± 20
11 ± 6 70 ± 28
11 ± 6 60 ± 16
6- Efeito do bloqueio dos receptores 5-HT
1A
da l/dlPAG sobre as respostas
cardiovasculares produzidas pelo estresse por jato de ar em ratos.
A tabela 7 mostra os valores cardiovasculares basais antes e após o rato
entrar no cilindro de acrílico.
A microinjeção do antagonista do receptor 5-HT
1A
, WAY 100635, na
l/dlPAG (3nmol / 100nl ) não alterou a taquicardia ou o aumento de pressão
arterial evocados pelo estresse por jato de ar (Figura 10).
Tabela 7 . Valores basais de PAM e FC e alterações na PAM e FC produzidas após a microinjeção
de salina ou WAY100635 na l/dlPAG seguido pela entrada do rato no cilindro, separadas por um
período de 3 horas.
Valores Basais
Fora do cilindro
Valores Basais
Dentro do cilindro
PAM FC
(mmHg) (bpm)
PAM FC
(mmHg) (bpm)
Salina
l/dlPAG
113 ± 3 370 ± 12
119 ± 2 412 ± 27
WAY 3nmol
l/dlPAG
120 ± 4 374 ± 10
122 ± 3 388 ± 13
n=7
0
5
10
sal / jato
way / jato
Alterações na PAM
(mmHg)
0
25
50
75
100
Alterações na FC
(bpm)
7- Efeito da ativação dos receptores 5-HT
1A
da l/dlPAG sobre as respostas
cardiovasculares e comportamentais produzidas pela microinjeção bilateral
do agonista dos receptores NMDA na l/dlPAG.
Quando comparada ao efeito obtido no grupo controle, a microinjeção de
8-OH-DPAT (3nmol) na l/dlPAG reduziu em 94% a taquicardia induzida pela
microinjeção de NMDA (controle 90± 20 bpm Vs 6 ± 5 bpm após 8-OH-DPAT).
Da mesma forma 8-OH-DPAT reduziu em 73% o efeito pressor evocado pela
Figura 10. Alterações na PAM, FC produzidas pelo estresse por jato de ar, após salina na l/dlPAG, 3
horas mais tarde, após a microinjeção de WAY100635 (3nmol / 100 nl) na l/dlPAG.
microinjeção de NMDA na l/dlPAG (controle 11 ± 2mmHg) (Figura 11). Nenhuma
diferença foi observada na magnitude das respostas cardiovasculares produzidas
pela microinjeção de NMDA na l/dlPAG, após a microinjeção de salina na mesma
(tabela 8).
0
10
20
sal / nmda
dpat / nmda
Alterações na PAM
(mmHg)
0
50
100
150
Alterações na FC
(bpm)
0
5
10
15
20
Atividade
(número de episódios)
*
*
Figura 8 . Alterações na PAM e FC produzidas pela microinjeção de NMDA após salina na l/dlPAG,
24 horas mais tarde, após a microinjeção de 8-OH-DPAT (3nmol / 100 nl) na l/dlPAG. * p<0,05
comparado com o efeito produzido pela administração de NMDA após a microinjeção de salina na
l/dlPAG (teste t pareado).
Figura 11. Alterações na PAM e FC produzidas pela microinjeção de NMDA após salina na l/dlPAG,
24 horas mais tarde, após a microinjeção de 8-OH-DPAT (3nmol / 100 nl) na l/dlPAG. * p<0,05
Tabela 8 . Valores basais de PAM e FC e alterações na PAM e FC produzidas pela microinjeção de
NMDA na l/dlPAG após duas microinjeções sucessivas de salina na l/dlPAG, separadas por um
período de 24 horas. n=4
8- Efeito da inibição dos neurônios da vlPAG sobre as respostas
cardiovasculares e comportamentais produzidas pela ativação dos
neurônios do DMH
A tabela 9 mostra que a microinjeção do agonista do receptor GABA
A
,
muscimol (musc), na vlPAG não alterou os parâmetros basais, cardiovasculares,
na dose testada (1nmol).
Quando comparada ao efeito obtido no grupo controle, a microinjeção de
muscimol (1nmol) na vlPAG aumentou significantemente a resposta
comportamental (número de épisódios) produzida pela ativação do DMH (15 ± 5
numero de episódios após salina 0,9% na vlPAG vs. 58 ± 3 número de episódios
após mus na vlPAG). No entanto, ao microinjeção de muscimol na vlPAG não
alterou as respostas cardiovasculares produzidas pela ativação do DMH (figura
12).
Valores Basais
Alterações na PAM
e FC após sal na
l/dlPAG
Alterações na PAM
e FC após sal na
l/dlPAG
PAM FC
(mmHg) (bpm)
PAM FC
(mmHg) (bpm)
PAM FC
(mmHg) (bpm)
NMDA l/dlPAG
97 ± 12 334 ± 23
18 ± 5 114 ± 28
12 ± 3 131 ± 12
Tabela 9. Valores basais de PAM e FC e alterações cardiovasculares produzidas pela microinjeção
de muscimol (1nmol/100nl) e salina 0.9% (100nl) na vlPAG. n=6
Valores Basais
Alterações na PAM e FC
PAM FC
(mmHg) (bpm)
PAM FC
(mmHg) (bpm)
Salina vlPAG
109 ± 2 369 ± 2
2 ± 1 -1 ± 16
Musc vlPAG
113 ± 5 381 ± 12
3 ± 2 30 ± 19
n=6
0
10
20
sal / bic
musc / bic
Alterações na PAM
(mmHg)
0
50
100
150
200
Alterações na FC
(bpm)
0
25
50
75
Atividade
(número de episódios)
*
Figura 12. Alterações na PAM, FC e atividade locomotora produzidas pela microinjeção de bic no
DMH após microinjeção bilateral de salina ou muscimol (1nmol) na vlPAG. * P < 0.05, comparado
com o efeito do Bic no DMH após sal na vlPAG.
6. Análise Histológica
A análise histológica mostrou que a os sítios de injeção estavam
localizados dentro ou na borda do DMH e dos sitios ojetivados por cada protocolo
na PAG . Os sítios de injeção localizados no hipotálamo encontravam-se dentro ou
na vizinhança da zona compacta do DMH (aproximadamente -3,3 mm caudal ao
bregma) (Paxinos e Watson, 1986). Os sítios de microinjeção na PAG
encontravam-se do nível -7,64 a -8,0 mm caudal ao bregma. Os sítios onde a
microinjeção de 8-OH-DPAT reduziram a resposta cardiovascular produzida por
bic no DMH, e ainda onde a microinjeção de NMDA produziu respostas pressoras,
taquicárdicas e de alteração de atividade locomotora estavam localizados dentro
da região lateral e dorsolateral da PAG. Os sítios onde a microinjeção de
muscimol potenciou a resposta comportamental produzida pela ativação do DMH
estavam localizados dentro da região ventrolateral da PAG.
A figura 13.1 ilustra o mapa com a descrição dos sítios de microinjeção, de
dois dos protocolos incluídos neste trabalho, onde foi realizado a microinjeção de:
(A) 8-OHDPAT na l/dlPAG; (D) Muscimol na vlPAG e (B; C; E; F) bic no DMH.
Experimentos em que os sítios de microinjeção encontravam-se fora dos limites do
DMH ou das regiões específicas da PAG não foram incluídos na análise. A figura
13.2 representa fotomicrografia de um corte coronal da PAG (A) e um do DMH (B).
vl
d
dr
d
dl
l
dr
d
dl
l
dr
Figura 13.1 Diagrama esquemático das secções coronais do cérebro do rato ilustrando os sítios
de microinjeção no hipotálamo (B, C, E e F) e na PAG (A e D) em dois protocolos experimentais.
DMC, porção compacta do hipotálamo dorsomedial; DMD, porção difusa do hipotálamo
dorsomedial; VMH, hipotálamo ventromedial; f, fórnix; 3V, terceiro ventrículo; d PAG dorsal; dl,
PAG dorsolateral; l, PAG lateral; vl, PAG ventrolateral; dr, núcleo da rafe dorsal. A distancia ao
bregma é indicada. Modificado de Paxinos e Watson, (1986).
A B
vl
l
dl
d
dr
DMC
DMD
3V
VMH
Fig. 13.2 Fotomicrografia de um corte coronal (50 µm) ao nível da (A) PAG e (B) ao nível do DMH
para verificação histológica do sítio de microinjeção. d, PAG dorsal; dl, PAG dorsolateral; l, PAG
lateral; vl, PAG ventrolateral; dr, núcleo da rafe dorsal; DMC, porção compacta do hipotálamo
dorsomedial; DMD, porção difusa do hipotálamo dorsomedial; VMH, hipotálamo ventromedial; 3V,
terceiro ventrículo.
7. Discussão
Os resultados deste estudo indicam que a ativação dos receptores 5-HT
1A
na l/dlPAG reduz o aumento da freqüência cardíaca e da pressão arterial
observados durante (1) a ativação do hipotálamo dorsomedial (2) o estresse por
jato de ar (3) pela microinjeção de NMDA na l/dlPAG. Adicionalmente, a redução
observada na resposta cardiovascular após a microinjeção de 8-OH-DPAT na
l/dlPAG foi revertida pela subseqüente administração do antagonista seletivo do
receptor 5-HT
1A
WAY100635, mostrando que os efeitos foram mediados
especificamente pelo receptor 5-HT
1A
. A seguir, faremos algumas considerações
metodológicas que serão sucedidas pela discussão mais detalhada dos resultados
observados no presente estudo.
No presente estudo as microinjeções de 8-OH-DPAT e WAY100635 na
l/dlPAG não produziram alterações significantes nos parâmetros cardiovasculares
e comportamentais basais. Estudos em animais anestesiados que avaliaram a
ação cardiovascular do 8-OH-DPAT (HORIUCHI et al., 2004; BAGO & DEAN,
2001; DI FRANCESCO et al., 1988), demonstram que a administração (intra
cistrena pontina, no bulbo rostral ventro lateral e intra peritonial respectivamente)
do 8-OH-DPAT causa bradicardia e redução da pressão arterial de forma dose
dependente. Ao contrário, no presente estudo e nos poucos estudos realizados
em animais acordados, os efeitos de bradicardia e de redução da pressão arterial
não foram observados ou foram pouco conclusivos (NALIVAIKO et al., 2006;
KOLBASA et al., 1991; DI FRANCESCO et al., 1988). Possivelmente, a
divergência de resultados quanto a esse efeito possa ser devido às diferentes vias
de administração do 8-OH-DPAT, que então deve atuar em diferentes sitios do
sistema nervoso central ou em vários sitios ao mesmo tempo. Desta forma, a
ativação de receptores 5-HT
1A
em diferents sitios do SNC pode produzir diferente
resposta sobre os parametros cardiovasculares basais.
Poderia ser questionado se o aumento na freqüência cardíaca e na pressão
arterial produzido pela microinjeção de bic no DMH não ser uma conseqüência
indireta do aumento da atividade locomotora, e não uma conseqüência direta da
ativação dos neurônios do DMH. No entanto, estudos mostram que a
microinjeção de bic no DMH em ratos anestesiados também resultam em
aumentos de pressão arterial e frequência cardíaca, assim como um grande
aumento na atividade simpática (FONTES et al. 2001; CAO E MORRISON 2004;
HORIUCHI et al. 2004). Adicionalmente, no presente estudo observou-se que a
administração de 8-OH-DPAT reduziu os parâmetros cardiovasculares produzidos
pela ativação do DMH, mesmo enquanto a atividade do rato permanecia elevada.
Poderia também ser questinado se a redução na magnitude da resposta
cardiovascular produzida após uma segunda injeção de bic no DMH não seria
devido a microinjeção do 8-OH-DPAT na PAG e sim a um efeito taquifilático da bic
sobre os neurônio do DMH. Em um grupo separado de animais observamos que
a intensidade das respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas por
duas microinjeções de bic no DMH após veículo na l/dlPAG não diferiu. Esse
resultado descarta a possibilidade de que o efeito produzido após uma segunda
microinjeção de bic no DMH decorresse de um efeito taquifilático.
Recentemente, Da Silva et al. (2003) demonstraram que a resposta
cardiovascular e comportamental produzida pela ativação do hipotálamo
dorsomedial é dependente de um relé sináptico na coluna lateral/dorsolateral da
substância cinzenta periaquedutal (l/dlPAG), e que essa sinapse é mediada pelo
receptor de aminoácido excitatório do subtipo NMDA (DA SILVA et al., 2003; DA
SILVA et al., (2006). O presente estudo soma-se aos resultados de Da Silva et al.,
mostrando que a ativação dos receptores 5-HT
1A
na l/dlPAG pode modular as
respostas cardiovasculares produzidas pela ativação do DMH.
Horiuchi et al. (2005) observaram que os aumentos na PAM, FC e na
atividade simpática do nervo renal produzidos pela ativação do DMH foram
reduzidos de forma importante após a administração do agonista 5-HT
1A
, 8-OH-
DPAT, sistêmica ou pela microinjeção no tronco encefálico, via intracisterna, em
ratos anestesiados. No entanto, as regiões especificas do tronco encefálico onde a
ativação dos receptores 5-HT
1A
poderiam reduzir as respostas produzidas pelo
DMH não foram identificadas (HORIUCHI et al., 2005).
Vários subtipos de receptores serotoninérgicos ja foram identificados na
PAG ( PAZOS & PALACIOS, 1985; POMPEIANO et al., 1992). Estudos “in vitro” e
“in vivo” mostram que a ativação específica dos receptores 5-HT
1A
na PAG dorsal
inibe de forma importante a frequência de disparos dos neurônios da mesma
(BEHBEHANI et al., 1993). Adicionalmente, a administração de uma dose
semelhante à usada no presente estudo, 3nmol de 8-OH-DPAT na PAG dorsal,
reduz a resposta do tipo pânico (fuga) produzida pela microinjeção do ácido D,L-
homocisteico na mesma. Esta resposta foi revertida pela administração sistêmica
do antagonista 5-HT
1A
, WAY100635, ( BECKETT & MARSDEN, 1997).
Em conjunto com os estudos acima citados, é possível sugerir que os
resultados do presente estudo, indicam que a l/dlPAG possa ser uma região do
tronco encefálico onde a ativação dos receptores 5-HT
1A
modula as respostas
cardiovasculares produzidas pela estimulação do DMH.
É importantes ressaltar que não descartamos o envolvimento de outras
regiões do tronco encefálico onde os receptores 5-HT
1A
possam também
influenciar as respostas produzidas pela ativação do DMH. Dentre essas outras
possíveis regiões, destaca-se o núcleo bulbar da rafe pallidus (RP). Esse núcleo é
um relé sináptico que também modula as respostas cardíacas produzidas pela
ativação do DMH (ZARETSKY et al., 2003a, ZARETSKY et al., 2003b, HORIUCHI
et al., 2004) e possui grande densidade de receptores 5-HT
1A
. Recentemente,
Nalivaiko et al. (2006) avaliaram, em coelhos acordados, a resposta
cardiovascular produzida por três tipos de estresse emocional, após administração
de 8-OH-DPAT. Esses autores, observaram que a administração de 8-OH-DPAT,
sistêmica ou pela microinjeção na rafe pallidus (RP), reduz as respostas
cardiovasculares produzidas por esses três tipos de estresse emocional.
Estudos indicam que a ativação dos receptores 5-HT
1A
na PAG reduzem
respostas comportamentais do tipo fuga e luta geradas pela estimulação do
hipotálamo medial (SHAIKH et al., 1997) e pela estimulação elétrica (NOGUEIRA
& GRAEFF, 1995) ou química (BECKETT & MARSDEN, 1997) da própria PAG.
Adicionalmente, a ativação dos receptores 5-HT
1A
na PAG produz uma resposta
ansiolítica em ratos submetidos a testes comportamentais de conflito (ZANOVELI
et al., 2003). No presente estudo a resposta comportamental produzida pela
ativação do DMH não foi alterada pela administração do 8-OH-DPAT na l/dlPAG.
Desta forma, uma divergência de resultados pode ser sugerido. No entanto, é
importante ressaltar que o presente estudo foi o primeiro a estudar a ativação dos
receptores 5-HT
1A
na PAG sobre a resposta cardiovascular e comportamental
produzida especificamente pela ativação do DMH. Pode-se sugerir então, que os
receptores serotoninérgicos da l/dlPAG modulam especificamente as respostas
cardiovasculares produzidas pela ativação dos neurônios do DMH.
Adicionalmente, quando no presente estudo avalou-se a ativação dos receptores
5-HT
1A
na PAG sobre a resposta cardiovascular e comportamental produzida pela
estimulação química da mesma, observamos respostas similares às relatadas
pela literatura (BECKETT & MARSDEN, 1997).
O estresse por jato de ar é visto como um estresse emocional puro, sendo
bastante diferente de um estresse físico como, por exemplo, o estresse por frio
(YAMAZATO et al., 2005). Considerando que a reatividade cardiovascular
produzida pelo estresse por jato de ar depende da atividade dos neurônios do
DMH (STOTZ-POTTER et al., 1996), a ativação dos receptores 5-HT
1A
na l/dlPAG
deveria também atenuar a resposta cardiovascular produzida por um estresse
emocional puro. Em favor desta hipótese os resultados do presente estudo
mostram que a ativação dos receptores 5-HT
1A
na l/dlPAG também inibe o
aumento de freqüência cardíaca e da pressão arterial observados durante o
estresse por jato de ar. Assim como o bloqueio desses receptores com o
antagonista 5-HT
1A
na l/dlPAG não alterou a reatividade cardiovascular produzida
pelo jato de ar. Em conjunto, nossos resultados sugerem que receptores 5-HT
1A
na l/dlPAG podem modular as respostas cardiovasculares produzidas por um
estresse emocional em ratos acordados de forma similar à modulação observada
sobre as respostas produzidas pela ativação do DMH com bicuculina.
No presente estudo a microinjeção de 8-OH-DPAT na l/dlPAG reduziu de
forma importante os efeitos cardiovasculares produzidos pela microinjeção de
NMDA na l/dlPAG.
Recentemente mostramos que a resposta cardiovascular produzida pela
ativação do DMH com bicuculina depende de conexões sinápticas com a região
l/dlPAG (DA SILVA et al., 2003) e que as conexões sinápticas entre os neurônios
do DMH e os da l/dlPAG são mediadas por aminoácidos excitatórios (AAE),
possívelmente o receptor glutamatergico N-Metil-D-Aspartato (NMDA) (DA SILVA
et al. 2006).
Desta forma, baseando-se nos estudos acima citados e nos resultados do
nosso presente estudo, sugerimos que as projeções serotoninérgicas para a
l/dlPAG possivelmente modulam, via receptores 5-HT
1A
, as projeções
cardiovasculares excitatórias originadas do DMH que são mediadas pelo
neurotransmissor NMDA. (Figura 14).
A ação dos agonistas 5-HT
1A
possivelmente modula as projeções da
l/dlPAG para os neurônios pré-motores simpáticos bulbares como o núcleo
rostoventrolateral (RVLM) e o núcleo da rafe palidus (RP), regiões essas que
estão relacionadas com o controle das respostas cardiovasculares produzidas
pela ativação do DMH (FONTES et al., 2001, CAO et al., 2004, HORIUCHI et al.,
2004).
No presente estudo não apresentamos nenhuma evidência mostrando se
a modulação observada pela administração do agonista 5-HT
1A
na l/dlPAG sobre
as respostas cardiovasculares produzidas pela ativação do DMH é devido a uma
transmissão pré ou pós-sináptica. Experimentos mostram que a ativação de
receptores 5-HT
1A
pós-sinápticos causa hiperpolarização neuronal em diferentes
regiões cerebrais (VAN DEN HOOFF & GALVAN, 1992; BARNES & SHARP,
1999). Evidências sobre a inibição de neurônios da PAG após ativação de
receptores 5-HT
1A
na mesma região foram também observadas (BEHBEHANI et
al., 1993). Esses achados nos permitem especular que a ativação dos receptores
5-HT
1A
na l/dlPAG seja de forma pós-sináptica, pois as respostas observadas em
nosso trabalho mostram também uma ação inibitória produzida pela ativação dos
receptores 5-HT
1A
na l/dlPAG . É possível que a ativação dos receptores 5-HT
1A
na l/dlPAG inibe a via excitatória cardiovascular oriunda do DMH, mediada pelo
neurotransmissor NMDA na l/dlPAG (figura 14). No entanto, essa ação inibitória
não aparenta ser tônica sobre o relé sináptico entre o DMH e a l/dlPAG, pois
observamos que a microinjeção isolada do WAY100635 na l/dlPAG não alterou os
valores cardiovasculares basais e também não potenciou as respostas
produzidas pela ativação do DMH assim como as produzidas pelo estresse
emocional por jato de ar.
É possivel especular que os receptores de 5-HT
1A
presentes na l/dlPAG
(PAZOS & PALACIOS, 1985), sejam ativados fisiologicamente somente após um
acumulo de serotonina na l/dlPAG. Provavelmente um estresse emocional crônico
possa levar a esse acúmulo de serotonina na l/dlPAG. Essa hipótese se
fundamenta em pesquisas realizadas em humanos, onde o efeito do agonista do
receptor 5-HT
1A
e de inibidores da recaptação de 5-HT demoram meses para
produzirem ação ansiolítica (WONG et al, 2007).
Um aspecto importante a ser discutido seria o da origem das projeções
serotoninérgicas endógenas para os neurônios da l/dlPAG. Estudos anatômicos e
funcionais destacam, dentre as possíveis regiões do sistema nervoso central, o
núcleo dorsal da rafe (DRN) (KISER et al 1980, JACOBS et al 1992, VIANA et al.,
1997 ;JOHNSON et al., 2004 ; ABRAMS et al, 2005). O núcleo da rafe dorsal
(DRN) se localiza na região ventral ao aqueduto cerebral e seus neurônios fazem
fronteira com a PAG. O DRN possui grande quantidade de neurônios
serotoninérgicos que enviam projeções para quase todo telencéfalo (para revisão
JACOBS et al., 1992; BARNES & SHARP, 1999). Estudos recentes têm mostrado
a existência de um subgrupo de neurônios serotoninérgicos da região ventrolateral
da substância cinzenta periaquedutal (vlPAG) contidos nas asas laterais do núcleo
da rafe dorsal (JACOBS et al.,1992; JOHNSON et al., 2004) . Sua estimulação
aumenta em quinze vezes a concentração de serotonina na l/dlPAG (VIANA et al.,
1996) e aparentemente, esse subgrupo de neurônios está envolvido na inibição da
resposta simpatoexcitatória e comportamental produzidas pela eletroestimulação
da dlPAG (JOHNSON et al 2004). Estudos também mostram evidências de uma
possível modulação dos neurônios da dlPAG por esse subgrupo de neurônios
serotoninérgicos da vlPAG (KISER et al 1980; JOHNSON et al 2004). Assim,
seria possível especular que é da vlPAG que se originam as projeções
serotoninérgicas que modulam, na l/dlPAG, as respostas produzidas pela ativação
do DMH. (figura 14)
Em um estudo recente, DA SILVA et al.,(2003) observaram que a inibição
unilateral da vlPAG não alterou de forma significativa as respostas
cardiovasculares produzidas pela ativação dos neurônios do DMH. No entanto, é
importante ressaltar que estudos anatômicos demonstram projeções neuronais do
DMH para a vlPAG (TER HORST et al., 1986; THOMPSON et al., 1996), o que
então levanta uma questão sobre o possível papel funcional destas projeções.
Uma proposta seria avaliar os efeitos da inibição bilateral da vlPAG não só
nas respostas cardiovasculares mas também nas respostas comportamentais
produzidas pela ativação dos neurônios do DMH. Desta forma, os resultados do
presente estudo mostram que a inibição bilateral da vlPAG com o agonista do
receptor GABA
A
muscimol, potenciou somente a resposta comportamental
produzida pela ativação do DMH. Esse resultado sugere que os neurônios da
vlPAG somente participam da modulação da resposta comportamental, mas não
da resposta cardiovascular, produzida pela ativação do DMH. Sendo assim, não
observamos, com os resultados desse protocolo, nenhuma evidência aparente de
haver qualquer modulação dos neurônios da vlPAG sobre a sinapse entre o DMH
e os neuronios serotoninergicos da l/dlPAG.
Certamente mais estudos serão necessários para uma avaliação mais
completa sobre a origem das projeções serotoninérgicas endógenas para os
neurônios da l/dlPAG.
Figura 14. Diagrama ilustrando a possivel ação modulatória mediada pelos receptores 5-HT
1A
sobre a via excitatória entre o DMH e a l/dlPAG. A ativação dos receptores 5-HT
1A
reduziria a
magnitude da resposta cardiovascular ao estresse emocional. Essa hipótese tem suporte científico
nas seguintes referências. (Kriser et al., 1980 ; Jacobs et al., 1992; Viana et al., 1997; Barnes &
Sharp, 1999; Da Silva et al. 2003; Da Silva et al., 2006).
Em síntese, os experimentos realizados no presente estudo mostram que a
ativação de receptores 5-HT
1A
na l/dlPAG reduzem a taquicardia e o aumento na
pressão arterial produzidos pela ativação farmacológica dos neurônios do DMH e
da própria l/dlPAG bem como a taquicardia e o aumento na pressão arterial
observados durante um estresse emocional em ratos. Desta forma, o relé
sináptico entre o DMH e a l/dlPAG pode ser considerado um importante sítio de
ação onde os agonistas de receptores 5-HT
1A
podem atuar produzindo respostas
ansiolíticas.
8. Bibliografia
ABRAMS JK, JOHNSON PL, HAY-SCHMIDT A, MIKKELSEN JD, SHEKHAR A,
LOWRY CA. Serotonergic systems associated with arousal and vigilance
behaviors following administration of anxiogenic drugs. Neuroscience. 133:983-97,
2005.
AMAT J, BARATTA MV, PAUL E, BLAND ST, WALKINS LR, MAIER SF. Medial
prefrontal cortex determines how stressors controllability affects behavior and
dorsal raphe nucleus. Nature Neuroscience. 8:365-371, 2005.
ANDRADE R, NICOLL RA. Pharmacologically distinct actions of serotonin on
single pyramidal neurones of the rat hippocampus recorded in vitro. J Physiol.
394:99-124, 1987
BAILEY TW, DIMICCO JA. Chemical stimulation of the dorsalmedial
hypothalamus elevates plama ACTH in conscious rats. Am J Physiol, 280:R7-R15,
2001.
BAGO M AND DEAN C. Sympathoinhibition from ventrolateral periaqueductal
gray mediated by 5-HT(1A) receptors in the RVLM. Am J Physiol Regul Integr
Comp Physiol, 280: R976-984, 2001.
BANDLER R, CARRIVE P. Integrated defence reaction elicited by excitatory
amino acid microinjection in the midbrain periaqueductal gray region of the
unrestraind cat. Brain Res. 439: 95-106, 1988.
BANDLER R, KEAY AK, FLOYD N AND PRINCE J. Central circuits mediating
patterned autonomic activity during active vs. Passive emotional coping. Brain
Research Bulletin. 53:95-104, 2000.
BARNES NM, SHARP T. A review of central 5-HT receptors and their function.
Neuropharmacology. 38:1083-152,1999.
BARD P. A diencephalic mecanism for the expression of rage with special
reference to the sympathetic nervous sistem. Am. J. Physiol 84: 490-515, 1928.
BASBAUM AI, FIELDS HL. Endogenous pain control system. Brain stem spinal
pathways and endorphin circuitry. Annu. Ver. Neurosci. 7:309-338, 1984.
BECKETT S, AND MARSDEN CA. The effect of central and systemic injection of
the 5-HT1A receptor agonist 8-OHDPAT and the 5-HT1A receptor antagonist
WAY100635 on periaqueductal grey-induced defence behaviour. J
Psychopharmacol, 11: 35-40, 1997.
BEHBEHANI MM, JIANG MR, CHANDLER SD, ENISS M. The effect in of GABA
and its antagonists on midbrain periaqueductal gray neurons in the rat. Pain
40:195-204, 1990.
BEHBEHANI MM, LIO H, JIANG M, PUN RYK, SHIPLEY MT. Activation of
seronton
1A
receptors inhibits midbrain periaqueductal gray neurons of the rat. Brain
Research 612:56-60, 1993.
CANNON WB. Bodily changes in pain, hunger, fear and rage: an account of
recent researches into the function of emotional excitement. 2
nd
ed. Appleton, New
York, 1929.
CARRIVE P. The periaqueductal gray and defensive behavior: functional
representation and neuronal organization. Behav Brain Res 58: 27-47, 1993.
CAO WH, FAN W, AND MORRISON SF. Medullary pathways mediating specific
sympathetic responses to activation of dorsomedial hypothalamus. Neuroscience.
126(1): 229-40, 2004.
CHAOULOFF F, BERTON O, MORMÈDE P. Serotonin and Stress
Neuropsychopharmacology 21:28S–32S, 1999
DAHLSTROM A, FUXE K, OLSON L, AND UNGERSTEDT U. On the distribution
and possible function of monamine nerve terminals in the olfactory bulb of the
rabbit. Life Sci, 4: 2071-2074, 1965.
DA SILVA LG, DE MENEZES RC, DOS SANTOS RA, CAMPAGNOLE-SANTOS
MJ, AND FONTES MA. Role of periaqueductal gray on the cardiovascular
response evoked by disinhibition of the dorsomedial hypothalamus. Brain Res,
984: 206-214, 2003.
DA SILVA LG, MENEZES RC, VILLELA DC, AND FONTES MA. Excitatory amino
acid receptors in the periaqueductal gray mediate the cardiovascular response
evoked by activation of dorsomedial hypothalamic neurons. Neuroscience 2006.
DE NOVELLIS V, STOTZ-POTTER EH, MORIN SM, ROSSI F, AND DIMICCO JA.
Hypothalamic sites mediating cardiovascular effects of microinjected bicuculline
and EAAs in rats. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. 269: R131-
R140, 1995.
DI FRANCESCO GF, PETTY MA, FOZARD JR. Antihypertensive effects of 8-
hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin (8-OH-DPAT) in conscious dogs. Eur J
Pharmacol.147:287-90. 1988
DIMICCO JA, SAMUELS BC, ZARETSKAIA MV, ZARETSKY DV. The
dorsomedial hypothalamus and the response to stress: part renaissance, part
revolution. Pharmacol Biochem Behav. Mar;71(3):469-80. Review, 2002.
DIMICCO JA, STOTZ-POTTER EH, MONROE AJ E MORIN SM. Role of the
dorsomedial hypothalamus in the cardiovascular response to stress. Clin Exp
Pharmacol Physiol 23(2): 171-6,1996.
DOODS, H. N., BODDEKE, H. W.,KALKMAN, H. O.,HOYER, D.,MATHY, M. J.,
VANZWIETEN,P. A. Central 5-HT1A receptors and the mechanism of the central
hypotensive effect of (+)8-OH-DPAT, DP-5-CT, R28935, and urapidil. J Cardiovasc
Pharmacol 11(4): 432-7, 1988.
FONTES MAP, TAGAWA T, CAVANAGH S, POLSON JW, AND DAMPNEY RAL.
Descending pathways mediating cardiovascular response from the dorsomedial
hypothalamic nucleus. Am J Physiol, 280:H2891-H2901, 2001.
FOSSEY MD, LYDIARD RB. Anxiety and the gastrointestinal system. Psychiatr
Med. 8:175-86, 1990.
FOWKOW B. Psycholsocial and central nervos influences in primary hypertension.
Circular 76:110-9, 1987.
GRAEFF FG, VIANA MB, MORA PO. Dual role of 5-HT in defense and anxiety.
Neurosci. Biobehav.Rev. 21: 791-799. 1997.
GRAEFF FG, GUIMARAES FS, DE ANDRADE TG, DEAKIN JF. Role of 5-HT in
stress, anxiety, and depression. Pharmacol. Biochem. Behav. 54: 129-141, 1996.
GAVEY CJ. Stress and the cardiovascular system. Practitioner 172(1027):16-22,
1954.
GRACE WJ. Life stress and gastro-intestinal diseases. Am Pract Dig Treat
4(12):848-52, 1953.
HANS SELYE. A syndrome produced by diverse nocious agents.
Nature 138:32, 1936.
HANS SELYE. Stress and Disease. Science 122(3171): 625-631,1955
HEDGES DW, BROWN BL, SHWALB DA, GODFREY K, AND LARCHER AM.
The efficacy of selective serotonin reuptake inhibitors in adult social anxiety
disorder: a meta-analysis of double-blind, placebo-controlled trials. J
Psychopharmacol 21: 102-111, 2007.
HENRY JP, STEPHENS PM, ELY DL. Psychosocial hypertension and the defence
and defeat reactions. J Hypertens. 4:687-97, 1986
HORIUCHI J, MCALLEN RM, ALLEN AM, KILLINGER S, FONTES MA,
DAMPNEY RA. Descending vasomotor pathways from the dorsomedial
hypothalamic nucleus: role of medullary raphe and RVLM. Am J Physiol Regul
Integr Comp Physiol. 287:R824-32, 2004(a).
HORIUCHI J, KILLINGER S. DAMPNEY RA. Contribution to sympathetic
vasomotor tone of tonic glutamatergic inputs to neurons in the RVLM. Am J Physiol
Regul Integr Comp Physiol. 287(6):R1335-43, 2004(b).
HORIUCHI J, WAKABAYASHI S, AND DAMPNEY RA. Activation of 5-
hydroxytryptamine 1A receptors suppresses the cardiovascular response evoked
from the dorsomedial hypothalamic nucleus. Hypertension 46: 173-179, 2005.
JACOBS BL, AND AZMITIA EC. Structure and function of the brain serotonin
system. Physiol Rev 72: 165-229, 1992.
JOHNSON P, LIGHTMAN SL, LOWRY CA. A funtional subset of serotonergic
neurons in the rat ventrolateral periaqueductal gray implicated in the inhibition of
sympathoexitation and panic. Ann N Y acad Sci, 1018:58-64, 2004.
JURGENS U, PRATT R. Role of the periaqueductal gray in vocal expression of
emotion. Brain Res. 167:367-378, 1979.
KARPLUS JP AND KREIDEL A. Gehirn und Sympathicus. VII: Uber beziehungen
der hypothalamuszentren zu blutdruck und innerer sekretion. Pfluegers Arch.
Gesamte Physiol. Menschen Tiere 215:667-670, 1927.
KISER RS, BROWN CA, SANGHERA MK, AND GERMAN DC. Dorsal raphe
nucleus stimulation reduces centrally-elicited fearlike behavior. Brain Res, 191:
265-272, 1980.
KOLBASA KP, MCCALL RB, LUDENS JH. Effect of chronic treatment on the
cardiovascular and behavioral responses of 8-OH-DPAT in conscious
normotensive rats. Eur J Pharmacol 193:275-81, 1991.
LEDOUX JE. Emotion, Memory and the Brain. Scientific America 270(6):50-7,
1994.
LEOPOLDO M. Serotonin(7) receptors (5-HT(7)Rs) and their ligands. Curr Med
Chem 11: 629-661, 2004.
LOVICK TA. Interactions between descending pathways from the dorsal and
ventrolateral periaqueductal gray matter in the rat. In: Depaulis A, Bandler R, eds.
The midbrain periaqueductal gray matter functional, anatomical and neurochemical
organization. New York: Plenum Press. 101-120, 1991.
MCCALL RB, AND CLEMENT ME. Role of serotonin1A and serotonin2 receptors
in the central regulation of the cardiovascular system. Pharmacol Rev 46: 231-243,
1994.
MEERSON FZ. Stress-induced arrhythmic disease of the heart (Parts I and II).
Clin Cardiol 17:362-71,422-6, 1994.
NALIVAIKO E. 5-HT(1A) receptors in stress-induced cardiac changes: a possible
link between mental and cardiac disorders. Clin Exp Pharmacol Physiol, 33: 1259-
1264, 2006.
NOGUEIRA RL, AND GRAEFF FG. Role of 5-HT receptor subtypes in the
modulation of dorsal periaqueductal gray generated aversion. Pharmacol Biochem
Behav 52: 1-6, 1995.
PACAK K, PALKOVITS M. Stressor specificity of central neuroendocrine
responses: implications for stress-related disorders. Endocr Rev 22:502-48, 2001
PASCAL CARRIVE. The periaqueductal gray and defensive behavior: functional
representation and neuronal orhanization. Behavioral Brain Research. 58:27-47,
1993.
PAXINOS G, AND WATSON C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (3rd
ed). Sidney: Academic Press, 1997.
PAZOS A, PALACIOS JM. Quantitative autoradiographic mapping of serotonin
receptors in the rat brain. I. Serotonin-1 receptors. Brain Res. 346:205–230, 1985.
PEROUTKA SJ, SLEIGHT AJ, MCCARTHY BG, PIERCE PA, SCHMIDT AW,
HEKMATPANAH CR. The clinical utility of pharmacological agents that act at
serotonin receptors. J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 1989;1:253-62.
POMPEIANO M, PALACIOS JM, AND MENGOD G. Distribution and cellular
localization of mRNA coding for 5-HT1A receptor in the rat brain: correlation with
receptor binding. J Neurosci 12: 440-453, 1992.
REYNOLDS DV. Surgery in the rat during electrical analgesia induced by focal
brain stimulation. Science 164:444-445, 1969.
SAMUELS BC, ZARETSKY DV & DIMICCO JA. Tachycardia evoked by
disinhibition of the dorsolmedial hypothalamus in rats is mediated through
medullary raphe. J Physiol, 538: 941-6, 2002.
SCHUBERT K, SHAIKH MB, SIEGEL A. NMDA receptors in the midbrain
periaqueductal gray mediate hypothalamically evoked hissing behavior in the cat.
Brain Res., 726:80-90, 1996.
SHAIKH MB, DE LANEROLLE NC, AND SIEGEL A. Serotonin 5-HT1A and 5-
HT2/1C receptors in the midbrain periaqueductal gray differentially modulate
defensive rage behavior elicited from the medial hypothalamus of the cat. Brain
Res 765: 198-207, 1997.
SHEKHAR A, DIMICCO JA. Defense reaction elicited by injection of GABA
antagonists and synthesis inhibitors into the posterior hypothalamus in rats.
Neuropharmacology. 26:407-17, 1987.
SHEKHAR A, KEIM SR, SIMON JR, MCBRIDE WJ. Dorsomedial Hypothalamic
GABA dysfunction produces pysiological arousal following sodium lactate
infusions. Pharmacol Biochem Behav, 55(2): 249-56, 1996.
STROHLE A, HOSBOER F. Stress responsive neurohormones in depression and
anxiety. Pharmacopsychiatry 36:207-214, 2003.
STEEL RGD , TORRIE JH, DICKY DA. Principles and procedures of statistics. 3
ed New York: McGraw Hill Book, 666p. 1997.
STOTZ-POTTER EH, WILLEIS LR, AND DIMICCO JA. Muscimol acts in
dorsomedial but not paraventricular hypothalamus in the cardiovascular effects of
stress. J Neurosci 16:1173-1179, 1996.
TWAROG BM AND PAGE IH. Serotonin content of some mammalian tissues and
urine and a method for its determination. Am. J. Physiol. 175:157–161, 1953.
TER HORST G.J., LUITEN P.G.M. The projections fo the dorsomedial
hypothalamus nucleus in the rat, Brain Res. Bull. 16:231-248, 1986.
THOMPSON RH, CANTERAS NS E SWANSON LW. Organization of projections
from the dorsomedial nucleus of the hypothalamus: a PHA-L study in the rat. J
Comp Neurol 376(1): 143-73, 1996.
TRICKLEBANK MD. The beravioral response to 5-HT receptor agonists and
subtypes of the central 5-HT receptor. Elsev. Scien Pub. 403-407, 1985.
VAN DER BUUSE M, WEGENER N. Involvement of serotonin1A receptors
in cardiovascular responses to stress: a radio-telemetry study in four rat
strains. European Journal of Pharmacology. 507: 187– 198, 2004.
VAN DEN HOOFF P, AND GALVAN M. Actions of 5-hydroxytryptamine and 5-
HT1A receptor ligands on rat dorso-lateral septal neurones in vitro. Br J
Pharmaco,l 106: 893-899, 1992.
VIANA MB, GRAEFF FG, AND LOSCHMANN PA. Kainate microinjection into the
dorsal raphe nucleus induces 5-HT release in the amygdala and periaqueductal
gray. Pharmacol Biochem Behav 58: 167-172, 1997
.
WONG H, DOCKENS RC, PAJOR L, YEOLA S, GRACE JR JE, STARK AD,
TAUB RA, YOCCA FD, ZACZEK RC, LI YW. 6-OH Buspirone is a Major Active
Metabolite of Buspirone: Assessment of Pharmacokinetics and 5-HT1A Receptor
Occupancy in Rats. Drug Metab Dispos. 2007.
WOUTERS W , MARTIN TM. TULP AND BEVAN P. Fiesinoxan lowers blood
pressure and heart rate in cats via 5-HT1A receptors. European Journal of
Pharmacology. 149: 213-223, 1988.
YAMAZATO M, OHYA Y, NAKAMOTO M. Sympathetic hyperreactivity to air-jet
stress in the chromosome 1 blood pressure quantitative trait locus congenic rats.
Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 290: R709-14, 2006.
ZANOVELI JM, NOGUEIRA RL, AND ZANGROSSI H, JR. Serotonin in the dorsal
periaqueductal gray modulates inhibitory avoidance and one-way escape
behaviors in the elevated T-maze. Eur J Pharmacol 473: 153-161, 2003. J Physio,l
546: 243-250, 2003(b).
ZARETSKY DV, ZARETSKAIA MV, AND DIMICCO JA. Stimulation and blockade
of GABA(A) receptors in the raphe pallidus: effects on body temperature, heart
rate, and blood pressure in conscious rats. Am J Physiol Regul, Integr Comp
Physiol 285: R110-116, 2003(a).
ZARETSKY DV, ZARETSKAIA MV, SAMUELS BC, CLUXTON LK, AND DIMICCO
JA. Microinjection of muscimol into raphe pallidus suppresses tachycardia
associated with air stress in conscious rats. J Physiol 546: 243-250, 2003.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
