( PDF ) Contribuição da microbiota bacteriana para o processo digestivo e desenvolvimento da lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis) e caracterização de bactérias proteolíticas associadas ao seu trato intesti

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LILIANE EVANGELISTA VISÔTTO

CONTRIBUIÇÃO DA MICROBIOTA BACTERIANA PARA O PROCESSO

DIGESTIVO E DESENVOLVIMENTO DA LAGARTA DA SOJA (Anticarsia

gemmatalis) E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS PROTEOLÍTICAS

ASSOCIADAS AO SEU TRATO INTESTINAL

Tese apresentada à Universidade

Federal de Viçosa, como parte das

exigências do Programa de Pós-

Graduação em Bioquímica Agrícola,

para obtenção do título de Doctor

Scientiae

VIÇOSA

MINAS GERAIS – BRASIL

2007

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LILIANE EVANGELISTA VISÔTTO

CONTRIBUIÇÃO DA MICROBIOTA BACTERIANA PARA O PROCESSO

DIGESTIVO E DESENVOLVIMENTO DA LAGARTA DA SOJA (Anticarsia

gemmatalis) E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS PROTEOLÍTICAS

ASSOCIADAS AO SEU TRATO INTESTINAL

Tese apresentada à Universidade

Federal de Viçosa, como parte das

exigências do Programa de Pós-

Graduação em Bioquímica Agrícola, para

obtenção do título de Doctor Scientiae.

APROVADA: 15 de agosto de 2007

_______________________________ ____________________________

Prof. Milton H. Guerra Andrade Thiago Rennó dos Mares-Guia

_______________________________ ____________________________

Prof. Wellington Garcia Campos Profª Andréa de O. B. Ribon

(Coorientadora)

________________________________

Profª Maria Goreti Almeida de Oliveira

(Orientadora)

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iii

OFEREÇO

Aos meus pais Maria Donizetti E. Visôtto e Antônio Claret Visôtto

DEDICO

Ao meu amor Pedro e ao meu querido Théo (In Memorian)

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela sua bondade e grandiosidade infinita. Pela sua proteção,

auxílio e conforto nos momentos mais difíceis. Pela oportunidade que me

oferece de ver a beleza em cada manhã.

À minha família que mesmo distante me apoiou, incentivando meus

desejos e sonhos. Pelo amor e carinho dedicado dos meus pais. Pelo sorriso

contagiante do Juninho, pelo abraço afável do Leandro e pela doçura que

acalenta da Tatiane.

Ao meu esposo Pedro Ivo, pelo amor, compreensão e carinho

indispensáveis, que tornaram a minha vida mais cheia de luz.

À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Bioquímica e

Biologia Molecular, pela oportunidade de realização desse trabalho.

À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES)

e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

pela concessão da bolsa de estudos.

À minha Orientadora Professora Maria Goreti de Almeida Oliveira, pela

orientação, compreensão e acima de tudo pela amizade, respeito e confiança

demonstrados no correr desses anos.

À Professora Andréa de Oliveira Barros Ribon, pelas sugestões e idéias

imprescindíveis no projeto e nas análises microbiológicas, que foram de grande

importância na realização deste trabalho.

Ao Professor Raul Narciso de Carvalho Guedes, pela receptividade

sempre presente, pela paciência, pela colaboração nas análises estatísticas e

principalmente pelo incentivo na execução deste trabalho.

Aos demais Professores do Departamento de Bioquímica e Biologia

Molecular, pela convivência e pelos conhecimentos transmitidos.

Ao Professor Hilário Cuqueto Mantovani, pela colaboração e pelo

empréstimo da câmara de anaerobiose.

À Professora Elza Fernandes de Araújo, à Professora Maria Cristina

Dantas Vanetti e ao Professor Everaldo Gonçalves de Barros, pela concessão

de alguns reagentes.

Aos estagiários Fabrício, Fernanda e Thiago, pela dedicação e valiosa

contribuição aos trabalhos desenvolvidos.

A todos os funcionários do Departamento de Bioquímica e Biologia

Molecular, que contribuíram na execução deste trabalho, especialmente ao

Eduardo, Aloízio, Denilson e Fausto.

Aos funcionários da casa de apoio, José Carlos e Marcos (In Memorian)

pela ajuda na condução dos experimentos.

Aos funcionários do Departamento de Microbiologia, Antônio, Paulo e

Pablo, pelos inúmeros favores prestados.

Aos amigos do Laboratório de enzimologia: Lílian, Eduardo, Fabrícia,

Angélica, Anderson Pilon, Franciny, Camilla, Ana Paula, Jeanne, Sandra,

Fabrício, Fernanda, Thiago, Rita, Denise, Ronnie Vond, Anderson Fazolo e

Matheus, pela convivência sempre agradável e pela descontração no trabalho.

Aos amigos do Laboratório de Virologia: Danielle, Evando e Glória pelas

ajudas indispensáveis e pelos ótimos jantares realizados por vocês.

Às amigas do Laboratório de Análises de Seqüência de DNA: Beatriz,

Cassiana, Polyane, Márcia e Gisele pela ajuda nos experimentos e pelas dicas

de beleza.

Aos meus amigos que a muito não vejo e aqueles com quem falo

diariamente, obrigada pelo apoio, companheirismo, alegrias e bons momentos

de gostosas risadas.

E, finalmente, a todos desejo:

“...que a vida não seja apenas pintada de novo, remendada às

carreiras, mas seja nova nas sementinhas do vir-a-ser, nova

até no coração das coisas menos percebidas (a começar pelo

seu interior), nova espontânea, que de tão perfeita nem se

nota, mas com ela se come, se passeia, se ama, se

compreende, se trabalha...”

Carlos Drumond de Andrade

Que Deus proteja todos vocês!!!

BIOGRAFIA

LILIANE EVANGELISTA VISÔTTO, filha de Antônio Claret Visôtto e

Maria Donizetti Evangelista Visôtto, nasceu em Itajubá, no Estado de Minas

Gerais, no dia 6 de julho de 1976.

Em agosto de 1995, iniciou o curso de Farmácia e Bioquímica na

Universidade Federal de Juiz de Fora, MG, graduando-se em agosto de 2000.

Em abril de 2003, concluiu o Mestrado em Microbiologia Agrícola no

Departamento de Microbiologia, na Universidade Federal de Viçosa, Minas

Gerais.

Em 01 de agosto de 2003 iniciou o curso de Doutorado em Bioquímica

Agrícola no Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade

federal de Viçosa, em Viçosa, Minas Gerais, defendendo tese em 15 de agosto

de 2007.

vii

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS E TABELAS............................................................ ix

LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................... xi

RESUMO.................................................................................................. xiii

ABSTRACT............................................................................................... xv

1. REVISÃO DE LITERATURA................................................................. 1

1.1.Anticarsia gemmatalis (Hübner) (Insecta: Lepidoptera:

Noctuidae)..............................................................................................

1.2. Enzimas digestivas de insetos........................................................ 6

1.2.1. Lipases................................................................................... 8

1.2.2. Carboidrases........................................................................... 10

1.2.2.1. Amilases...................................................................... 10

1.2.2.2. Celulases..................................................................... 11

1.2.2.3. Xilanases..................................................................... 12

1.2.2.4. Pectinases................................................................... 13

1.2.2.5. Glicosidases................................................................ 13

1.2.4. Proteases................................................................................ 14

1.3. Proteases de insetos....................................................................... 15

1.4. Inibidores de proteases................................................................... 18

1.5. Microbiota bacteriana de insetos..................................................... 20

1.6. Fatores que influenciam a colonização microbiana do trato

intestinal de insetos................................................................................

1.7.Importância da Microbiota Bacteriana.............................................. 24

1.7.1. Função nutricional da microbiota............................................ 24

1.7.2. Resistência à colonização...................................................... 25

1.7.3. Interações multitróficas........................................................... 26

1.7.4. Transferência gênica bacteriana dentro do intestino.............. 26

1.7.5. Bactérias intestinais transgênicas no biocontrole................... 27

2. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................... 28

viii

CAPÍTULO I - Contribuição da microbiota bacteriana para o processo

digestivo e desenvolvimento de Anticarsia gemmatalis

(Lepidóptera).............................................................................................

RESUMO.................................................................................................. 48

1. INTRODUÇÃO...................................................................................... 49

2. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................... 52

2.1. Dieta artificial................................................................................... 52

2.2.Teste in vitro dos antibióticos sobre a microbiota

intestinal.................................................................................................

2.3. Tratamento dos insetos................................................................... 53

2.4. Detecção de microrganismos.......................................................... 53

2.5. Análises microscópicas................................................................... 54

2.6. Obtenção do extrato enzimático...................................................... 55

2.7. Ensaios enzimáticos e de proteína................................................. 55

2.8. Análise da performance do inseto................................................... 56

2.9. Análises estatísticas........................................................................ 56

3. RESULTADOS...................................................................................... 57

3.1. Antibiograma................................................................................... 57

3.2. Efeitos dos antibióticos sobre a microbiota intestinal...................... 57

3.3. Avaliação da presença de bactérias no trato intestinal através de

microscopia............................................................................................

3.4. Efeito dos antibióticos nas atividades enzimáticas......................... 62

3.5. Efeito dos antibióticos na performance do inseto........................... 68

4. DISCUSSÃO......................................................................................... 71

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................... 75

CAPÍTULO II - Caracterização de bactérias proteolíticas associadas ao

trato intestinal de Anticarsia gemmatalis (Lepidóptera)............................

RESUMO.................................................................................................. 82

1. INTRODUÇÃO...................................................................................... 83

2. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................... 85

2.1. Criação de Anticarsia gemmatalis................................................... 85

2.2. Isolamento de bactérias proteolíticas.............................................. 85

2.3. Extração de DNA genômico............................................................ 86

2.4. Amplificação do gene 16S rRNA bacteriano e análise por RFLP... 86

2.5. Sequenciamento do gene 16S rRNA e análises de dados............. 87

2.6. Testes bioquímicos......................................................................... 87

2.7. Teste de susceptibilidade a antimicrobianos................................... 87

2.8. Ensaios enzimáticos........................................................................ 87

2.9. Determinação da concentração de proteínas................................. 87

3. RESULTADOS...................................................................................... 89

3.1. Contagem microbiológica e isolamento de bactérias proteolíticas. 89

3.2. PCR-RFLP...................................................................................... 91

3.3. Caracterização fenotípica e identificação molecular dos isolados.. 92

3.4. Análise do perfil de resistência dos isolados aos antimicrobianos. 96

3.5. Análise dos ensaios enzimáticos.................................................... 96

4. DISCUSSÃO......................................................................................... 99

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................... 102

3. CONCLUSÕES..................................................................................... 108

4. PERSPECTIVAS.................................................................................. 109

5. AGRADECIMENTOS............................................................................ 110

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

FIGURA 1: Lagarta da soja (Larva), Anticarsia gemmatalis (Hübner)... 4

FIGURA 2: Lagarta da soja (adulta) Anticarsia gemmatalis.(Hübner)... 5

FIGURA 3: Representação esquemática dos compartimentos do

intestino dos insetos...............................................................................

FIGURA 4: Número de UFC total e proteolítica encontrado no trato

intestinal de Anticarsia gemmatalis........................................................

FIGURA 5: Micrografias eletrônicas de varredura e de luz do intestino

de larvas de Anticarsia gemmatalis.......................................................

FIGURA 6: Inibição da atividade amidásica em função da

concentração de tetraciclina..................................................................

FIGURA 7: Inibição da atividade lipásica em função da concentração

de tetraciclina.........................................................................................

FIGURA 8: Perfil da atividade proteolítica do extrato intestinal de

Anticarsia gemmatalis ao longo do desenvolvimento larval...................

FIGURA 9: Perfil da atividade amidásica do extrato intestinal de

Anticarsia gemmatalis ao longo do desenvolvimento larval...................

FIGURA 10: Perfil da atividade lipásica do extrato intestinal de

Anticarsia gemmatalis ao longo do desenvolvimento larval...................

FIGURA 11: Variação no tempo de duração do ciclo larval de

Anticarsia gemmatalis em função das concentrações de tetraciclina....

FIGURA 12: Variação na transformação em pupa de Anticarsia

gemmatalis em função das concentrações de tetraciclina.....................

FIGURA 13: Análise por RFLP do perfil de restrição do gene 16S

rRNA de bactérias isoladas do intestino de Anticarsia gemmatalis

obtidas pela digestão com Hae III (A) e Rsa I........................................

FIGURA 14: Dendrograma obtido pelo método do vizinho mais

próximo com base nos perfis de restrição dos doze isolados

proteolíticos, utilizando Hae III e Rsa I...................................................

TABELA 1: volume de antibiótico usado nos três tratamentos

testados..................................................................................................

TABELA 2: Efeito dos antibióticos no crescimento de bactérias

cultiváveis presentes no intestino de Anticarsia gemmatalis.................

TABELA 3: Inibição das atividades enzimáticas do intestino de

Anticarsia gemmatalis criadas com dieta adicionadas de cloranfenicol

e de uma combinação de antibióticos....................................................

TABELA 4: Inibição das atividades enzimáticas do intestino de

Anticarsia gemmatalis criadas com dieta adicionadas de tetraciclina...

TABELA 5: Parâmetros biológicos medidos ao longo dos dias do ciclo

de vida de Anticarsia gemmatalis alimentada com diferentes

concentrações de tetraciclina.................................................................

TABELA 6: Número de bactérias totais e proteolíticas presentes no

trato intestinal de Anticarsia gemmatalis criadas com dieta artificial e

folhas de soja.........................................................................................

TABELA 7: Identificação dos isolados com base no gene 16S rRNA... 97

TABELA 8: Análises morfológicas e bioquímicas das bactérias

proteolíticas isoladas..............................................................................

TABELA 9: Efeito dos antimicrobianos sobre as bactérias

proteolíticas isoladas do intestino de Anticarsia gemmatalis.................

TABELA 10: Atividade de proteases detectada nos sobrenadantes

das culturas das bactérias isoladas do intestino de Anticarsia

gemmatalis.............................................................................................

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

BHI: infusão cérebro coração

: concentração capaz de inibir 50% da atividade

CMC: carboximetilcelulose

DGGE: gel de eletroforese em gradiente desnaturante

DMF: dimetilformamida

DNA: ácido desoxirribonucléico

dNTP: desoxirribonucleotídeo

EDTA: ácido etilenodiaminotetraacético

HMDS: hexamethyldisilazane

KDa: Kilodaltons

M app

: constante de Michaelis-Menten aparente

LB: Luria-Bertaini

L-BApNA: N-benzoil-L-argininil p-nitroanilida

L-TAME: Nα-tosil-L-arginil metil éster

MAG: monoacilgliceróis

MM: massa molecular

mRNA: ácido ribonucléico mensageiro

Nipagin: metilparabeno

NPβGal: paranitrofenol-β-galactosídio

NPβGlu: paranitrofenol-β-glicosídio

PCR: reação em cadeia da polimerase

pI: ponto isoelétrico

PMSF: fluoreto de fenilmetilsulfonil

RAPD: DNA polimórfico amplificado ao acaso

RFLP: reação de polimorfismo de fragmentos de restrição

rRNA: ácido ribonucléico ribossomal

SBTI : inibidor de tripsina da soja

SDS: dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS

xiii

TAG: triacilgliceróis

Tampão TBE: Tris-Borato-EDTA

Tampão TE: Tris-EDTA

Tampão SET: salina-EDTA-Tris

TLCK: 1-cloro-3-tosilamido-7-amino-2-heptanona

T-RFLP: reação de polimorfismo de fragmentos de restrição terminal

Tris: Tris (hidroximetil) amino metano

UFC: unidade formadora de colônia

xiv

RESUMO

VISÔTTO, Liliane Evangelista, D. Sc., Universidade Federal de Viçosa, agosto

de 2007. Contribuição da microbiota bacteriana para o processo

digestivo e desenvolvimento da lagarta da soja (Anticarsia

gemmatalis) e caracterização de bactérias proteolíticas associadas ao

seu trato intestinal. Orientadora: Maria Goreti de Almeida Oliveira. Co-

orientadores: Andréa de Oliveira Barros Ribon, Raul Narciso Carvalho

Guedes e Joel Antônio de Oliveira.

Interações entre bactérias intestinais e insetos têm sido extensivamente

estudadas em alguns sistemas, como cupins e afídeos. Entretanto, pouco é

conhecido sobre a associação entre bactéria e Lepidoptera, uma das ordens

que compreende os principais insetos fitófagos, responsáveis por grandes

perdas na agricultura. Alguns autores acreditam que devido à ausência de

estruturas especializadas e ao trânsito alimentar rápido no trato intestinal de

Lepidopteras, os microrganismos contribuam pouco com a nutrição e digestão

desses insetos. Enquanto outros sugerem que a microbiota fornece nutrientes

e contribui com o metabolismo desses insetos. Essas divergências fazem com

que estudos da funcionalidade da microbiota associada às Lepidopteras

tenham um interesse particular. Portanto, a lagarta da soja, Anticarsia

gemmatalis Hübner (Lepidóptera: Noctuidae) torna-se um modelo interessante

para estudos dos processos fisiológicos envolvidos nessa associação. Neste

contexto, esse trabalho buscou compreender melhor se a microbiota afeta as

atividades das enzimas hidrolíticas do intestino de A. gemmatalis, bem como

os seus parâmetros biológicos de desenvolvimento. Tetraciclina, cloranfenicol

e uma combinação desses dois antibióticos mais ampicilina foram

incorporadas à dieta artificial em cinco doses específicas (0; 30; 40; 50; 60 e

70 µg/mL). Larvas foram alimentadas durante seu ciclo até o instar pupal. O

antibiótico mais eficiente na supressão do crescimento bacteriano foi a

tetraciclina, que alcançou uma inibição substancial nas doses testadas.

Análises microscópicas mostraram que o intestino de A. gemmatalis criadas

com dieta controle, possui uma abundante microbiota, porém com pouca

diversidade. Poucas bactérias foram visualizadas no lúmen de larvas

alimentadas com tetraciclina 70 µg/ mL, confirmando o resultado encontrado

pelo método convencional de plaqueamento. Atividades enzimáticas do

extrato intestinal de larvas criadas com tetraciclina, sobre quatorze substratos

mostraram que a redução da microbiota afetou significativamente a hidrólise de

L-BApNA e tributirato ditiopropanol. A concentração que apresentou maior

efeito inibitório da atividade foi tetraciclina 70 µg/ mL. Também foi realizada a

análise do perfil enzimático ao longo do desenvolvimento pós-embrionário de

larvas criadas com dieta controle e dieta com tetraciclina 70 µg/ mL. Observou-

se um pico máximo de atividade proteásica, amidásica e lipásica entre os 4º e

6º instars em larvas com a microbiota intacta, enquanto um perfil constante foi

verificado em larvas tratadas com tetraciclina. Tais resultados podem estar

correlacionados a pupação prematura, a baixa emergência e o aumento da

mortalidade em larvas com microbiota reduzida. Esses dados sugerem que a

presença da microbiota exerce influência sobre o processo digestivo e

desenvolvimento de A. gemmatalis, contribuindo possivelmente com a

produção de proteases e lipases. Como houve influência na digestão protéica,

bactérias cultiváveis com capacidade proteolítica presentes no trato intestinal

foram isoladas, identificadas e caracterizadas. Todos os isolados foram Gram

positivos e identificados como Bacillus subtilis, Bacillus sp., Enterococcus sp. e

Staphylococcus sp.. Análises das proteases de origem dos isolados foram

realizadas utilizando diferentes substratos. Todas as bactérias foram capazes

de degradar os substratos testados com eficiência, exceto Staphylococcus sp..

Os resultados advindos desse estudo, além de contribuir o conhecimento

científico a respeito da interação Lepidoptera-microrganismo, servem como

complemento para pesquisas futuras sobre implementação de novos métodos

direcionados ao controle de pragas.

xvi

ABSTRACT

VISÔTTO, Liliane Evangelista, D. Sc., Universidade Federal de Viçosa, August,

2007. Contribution of the bacterial microbiota to the digestive process

and development of velvetbean caterpillar (Anticarsia gemmatalis) and

characterization of proteolytic bacteria associated with intestinal tract.

Adviser: Maria Goreti de Almeida Oliveira. Co-Advisers: Andréa de Oliveira

Barros Ribon, Raul Narciso Carvalho Guedes and Joel Antônio de Oliveira.

Interactions between intestinal bacteria and insects have been

extensively studied in systems such as termites and aphids. However, little is

known about the association between bacteria and the order Lepidoptera, which

comprises major phytophagous insects that cause heavy agricultural losses. A

number of authors believe that the lack of specialized structures and the rapid

food transit in the intestinal tract of Lepidopteras may cause the little

contribution of microorganisms to nutrition and digestion of these insects,

whereas other authors suggest that the microbiota provides nutrients and

contributes to insect metabolism. This difference raises particular interest in

studies on functionality of microbiota associated with Lepidopteras. The

velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera: Noctuidae),

becomes therefore a suitable model for studies on physiological processes

involved in the association. This work sought to examine whether the microbiota

may affect hydrolytic enzyme activity in A. gemmatalis intestine, as well as

developmental biological parameters. Tetracycline, chloramphenicol and a

combination of these two antibiotics along with ampicillin were added to the

artificial diet at five specific dose levels (0; 30; 40; 50; 60 and 70 µg/mL). Larvae

were fed until reach pupal stage. Tetracycline was found to be the most efficient

antibiotic for suppression of bacterial growth, with substantial inhibition at the

tested doses. Microscopic analyses showed that the intestine of A. gemmatalis

fed on control diet harbors abundant but not diverse microbiota. Few bacteria

were found in the lumen of larvae fed on 70 µg / mL tetracycline, confirming the

result found by the conventional plating method. Enzymatic activities of the

intestinal extract from larvae fed on tetracycline, on fourteen substrates, showed

that the reduction in microbiota significantly affected the hydrolysis of L-BApNA

and dithiopropanol tributyrate. Tetracycline at the dose of 70 µg / mL produced

xvii

the largest inhibitory effect. Analysis of enzymatic profile was also carried out

over the post-embryonic development of larvae fed on control diet and diet with

70 µg / mL tetracycline. Maximum proteolytic, amidolytic and lipase activities

were found between the 4th and 6th instars in larvae presenting intact

microbiota, whereas a constant profile was found in larvae fed on tetracycline.

These results can be correlated with premature pupation, low emergence and

increased mortality in larvae with reduced microbiota. The results suggest that

the presence of microbiota exerts influence on the digestive process and

development of A. gemmatalis, possibly contributing to protease and lipase

production. Because protein digestion was affected, culturable bacteria showing

proteolytic capacity were isolated from the intestinal tract, identified and

characterized. All the isolates were Gram-positive and identified as Bacillus

subtilis, Bacillus sp., Enterococcus sp. and Staphylococcus sp.. Analyses of

origin proteases from the isolates were carried out with different substrates. All

bacteria were efficiently capable of degrading the tested substrates, except

Staphylococcus sp.. These results, besides contributing to the scientific

knowledge on the insect-microorganism interaction, serve as a complement to

future research on new methods of pest control.

REVISÃO DE LITERATURA

1.1. Anticarsia gemmatalis (Hübner 1818) (Lepidoptera: Noctuidae)

A. gemmatalis, vulgarmente conhecida por lagarta da soja, é um inseto

cosmopolita, nativo das áreas tropicais e subtropicais do hemisfério ocidental

sendo permanentemente encontrado nas Américas, desde o Canadá até a

Argentina (FORD et al., 1975). No Brasil, o inseto ocorre desde o sul de Goiás

e Mato Grosso até o Rio Grande do Sul (PANIZZI et al., 1977). A larva desta

espécie é vulgarmente denominada nos EUA de “velvetbean caterpillar” devido

aos vários desfolhamentos causados a Stilozobium deeriugianum Bort,

conhecida como “velvetbean” (feijão veludo). No México ela é conhecida por

“gusano tercio pelo”, no Brasil é chamada de “lagarta-da-soja” e na Argentina é

denominada “oruga das leguminosas” (FORD et al., 1975).

Embora a soja esteja no topo da hierarquia de preferência alimentar de

A. gemmatalis, a fase imatura do inseto é generalista e pode se alimentar de

outras espécies de vegetais incluindo amendoim, kudzu (Pueraria

thunbergiana), feijão de cavalo (Cannavalia sp), algodão (HINDS &

OSTERBERGE, 1931), ervilha, erva daninha do café, folhas de trevo, arroz,

(TARRAGÓ et al., 1977) e pastagens (WILLE, 1943) dentre outras (WATERS &

BARFIELD, 1989).

A lagarta da soja é um inseto desfolhador que começa a se alimentar da

epiderme inferior e do mesófilo da folha. A partir do segundo ínstar, a lagarta já

consegue se alimentar da folha inteira, chegando a promover a completa

desfolhação da planta. O ciclo de vida da lagarta da soja se completa em cerca

de quatro semanas durante o verão, tendo sua duração aumentada no outono.

Os ovos são brancos, ligeiramente ovais, achatados na superfície inferior, com

tamanho variando entre 1 e 2 mm de diâmetro. Os ovos apresentam suportes

proeminentes para fixação ao substrato e são de cor branca no intervalo de

tempo que precede a eclosão, quando se tornam rosados (WATSON, 1916).

Pouco antes da eclosão podem apresentar coloração marrom-avermelhada

(ELISOR, 1942). Os ovos colocados nos meses de temperaturas mais altas

eclodem em cerca de três dias (ELISOR, 1942). WATSON (1916) relata que os

ovos colocados no mês de novembro (época mais fria no Hemisfério Norte) têm

um período de incubação de uma semana ou mais, o que pode torná-los

inviáveis. REID (1975) observou que os ovos que foram mantidos a 24 ± 2

eclodem em dois ou três dias. MOSCARDI et al. (1981) verificou o efeito da

temperatura sobre a oviposição, eclosão de lagartas e a longevidade de A.

gemmatalis. A fecundidade média variou de 310 ovos por fêmea a 32,2

C a

842,16 ovos por fêmea a 26,7

C. Em temperaturas extremas, a fecundidade

foi reduzida, sendo que as fêmeas mantidas a 21,1

C apresentaram uma

maior capacidade de postura do que as de 32,2

C . A porcentagem média de

eclosão variou de 68,6% a 21,1

C para 85,71% em temperaturas não

controladas. Os valores obtidos a 21,1

C foram significativamente baixos em

relação às outras temperaturas. WATSON (1916) observou que A. gemmatalis

faz postura isolada no lado abaxial das folhas de feijão veludo, sendo menos

freqüente nas hastes e nos pecíolos, exceto quando a densidade de ovos é

alta. GRENNE et al. (1973) verificaram que a postura é realizada durante a

noite, sendo que o pico de oviposição ocorre entre 21 e 23 horas e que a

postura é maior com o decréscimo da temperatura e o aumento da umidade,

diminuindo à medida que o orvalho acumula-se na planta. Após a eclosão, as

larvas recém-eclodidas se alimentam da casca dos ovos das quais eclodem

(WATSON, 1916).

Em geral, o estágio larval de A. gemmatalis consiste de seis instares

podendo variar de cinco a oito conforme a temperatura, idade da folha e

hospedeiro nas quais o inseto se desenvolve (WATSON, 1916; REID, 1975;

NICKLE, 1977). As lagartas criadas em temperaturas acima de 18,3

apresentaram de cinco a seis ínstares enquanto as que foram criadas em

temperaturas inferiores apresentaram de seis a sete instares (REID, 1975).

As lagartas se diferem não só pelo seu tamanho como também por

grandes diferenças morfológicas. As larvas de A. gemmatalis apresentam

variado padrão de manchas e coloração durante todo o ciclo de

desenvolvimento. A maioria das lagartas possui uma linha negra longitudinal e

um grande número de linhas estreitas brancas, amarelas ou róseas (Figura 1).

O primeiro instar tem duração de dois dias e a larva cresce de 2,5 mm a 6 ou 7

mm antes da muda. A cabeça é marrom clara, arredondada e bilobada. O

corpo da lagarta é verde claro sem nenhuma mancha e faixa longitudinal e os

prolegos do segmento abdominal 3 e 4 são menores do que os dos segmentos

5 e 6. No segundo instar, surge uma linha negra lateral e o primeiro e o

segundo par de prolegos abdominais estão cerca de 25 e 50% maiores que o

terceiro par, respectivamente. A duração do segundo ínstar varia de 3 a 4 dias

e a larva pode alcançar 9 mm de comprimento. O terceiro instar tem duração

de dois dias e a lagarta pode ter 16 mm de comprimento. O quarto e o quinto

instares duram entre 3 ou 4 dias e as lagartas alcançam 25 mm de

comprimento. No sexto instar a lagarta chega a quase duplicar de tamanho,

podendo medir 48 mm. O sexto instar dura cinco dias, completando 25 dias de

ciclo larval. No estágio pré-pupal a larva tem seu tamanho reduzido para 25

mm de comprimento, apresentando coloração marrom com poucas linhas

longitudinais, com duração de um dia (WATSON, 1916; GUYTON, 1940).

FIGURA 1- Lagarta da soja (Larva), Anticarsia gemmatalis (Hübner).

Fonte - http://www.biotecnologia.com.br/bio/12_h.htm.

No primeiro dia, a pupa da A. gemmatalis apresenta coloração verde

clara tornando-se marrom brilhante num período de 24 horas. A pupa é

obtecta, apresenta textura lisa e mede de 18 a 20 mm de comprimento e de 4 a

6 mm de largura. No campo, as lagartas de A. gemmatalis empupam em uma

profundidade de cerca de 2 cm da superfície do solo. A duração da fase de

pupa varia de sete a 10 dias dependendo da estação do ano (WATSON, 1916).

A mariposa adulta apresenta envergadura de 30 a 38 mm e possui asas com

distribuição de cores variando de em padrões de cinza, marrom amarelado

claro a marrom avermelhado escuro (Figura 2). Uma linha escura estende-se

nas duas asas dianteiras e ficam evidentes quando as asas são estendidas. As

pontas das asas têm coloração marrom clara com uma linha de pontos claros

próxima às margens (WATSON, 1916).

FIGURA 2 - Lagarta da soja (adulta) Anticarsia gemmatalis.(Hübner)

Fonte - http://www.gaipm.org/top50/velvetbean.html

As diferenças morfológicas entre os sexos foram descritas por

GREENE (1973) baseando-se no comprimento e na forma das escamas das

pernas do macho e da fêmea. GREENE et al. (1973) estudaram o

acasalamento em condições de campo, comprovando a liberação do feromônio

sexual pela fêmea como precursor da cópula. O pico de acasalamento ocorreu

duas horas após o pôr-do-sol, diminuindo gradativamente dentro de 12 horas.

LEPPLA (1976) estudou o acasalamento de A. gemmatalis em condições de

laboratório (27 ± 2

C), observando que o pico de acasalamento ocorreu

durante as primeiras 48 horas após emergências dos adultos, continuando em

nível reduzido até o sexto dia. A postura iniciou-se no terceiro dia, com o pico

de oviposição ocorrendo no quinto dia.

1.2. Enzimas digestivas de Insetos

Insetos são excelentes modelos para o estudo da função intestinal

principalmente porque existem espécies adaptadas a quase todos os tipos de

habitat e de hábitos alimentares. Além disso, o intestino é a maior interface

entre o inseto e o ambiente. Portanto, é essencial o entendimento do processo

digestivo para o desenvolvimento de métodos de controle biológico, como é o

caso do uso de plantas transgênicas no controle de insetos fitófagos. A

ocorrência de diferentes enzimas digestivas no canal digestivo de insetos é

principalmente devida à composição química da dieta ingerida por eles. É

possível que todos os insetos tenham enzimas digestivas complementares

àquelas utilizadas primariamente, em quantidades relativas que mudam em

resposta à composição da dieta (TERRA & FERREIRA, 1994).

Cerca de dois terços de todas as espécies de animais do mundo são da

classe Insecta. Este fenômeno tem sido explicado pela habilidade que os

insetos possuem em utilizar uma gama extensa de materiais orgânicos na sua

nutrição (madeira, húmus, cera, sangue, seiva, tecidos animais e vegetais, etc).

Além de digerirem materiais refratários (ex. madeira e cera), eles exploram

recursos tóxicos não acessíveis a outros animais, como os inibidores de

proteases. Essa capacidade digestiva depende das enzimas presentes e

compartimentalizadas no intestino do inseto. Por possuírem estas habilidades,

alguns podem ser classificados como pragas em culturas agrícolas, em

estocagem de alimentos e grãos, das indústrias e da saúde humana (TERRA et

al., 1996).

A organização do processo digestivo depende da compartimentalização

das enzimas digestivas e do fluxo do intestino médio que são responsáveis

pela translocação das enzimas e produtos da digestão. Segundo TERRA et al.

(1996), a digestão de polímeros dos alimentos (proteínas, amido, celulose e

hemicelulose) no intestino dos insetos acontece em três fases:

- Fase Inicial – nesta fase ocorre diminuição da massa molecular dos

polímeros através da ação de hidrolases, como tripsina, α-amilase, celulase e

hemicelulase;

- Fase Intermediária – os oligômeros resultantes da primeira fase são

hidrolisados em dímeros ou em dipeptídeos por hidrolases, tais como a α-

amilase e aminopeptidase;

- Fase Final – ocorre na digestão final dos dímeros que são transformados

em monômeros por hidrolases, tais como dipepetidases, maltase e celobiase.

Estes mesmos autores propuseram que a digestão inicial ocorre no

espaço endoperitrófico, a digestão intermediária e a final ocorrem no espaço

ectoperitrófico e nas células do intestino médio, respectivamente (Figura 3).

FIGURA 3- Representação esquemática dos compartimentos do intestino dos

insetos. (TERRA et al, 2000).

Os mecanismos fisiológicos da digestão extra oral e o seu

significado na organização dos processos digestivos de percevejos

predadores foram avaliados com determinações de pH, temperatura,

efeito de substratos, inibidores e parâmetros cinético-enzimáticos

(OLIVEIRA et al., 2006). Isto permitiu concluir que as glândulas salivares

de P. nigrispinus possuem enzimas hidrolíticas como amilase, lipase e

tripsina-like com pronunciada atividade catalítica as quais estão,

certamente, envolvidas no processo de predação zoofágica desse

inimigo natural.

O intestino médio de Lepidopteras é alvo de vários estudos relacionados

ao processo de digestão, mecanismo secretor de enzimas, caracterização de

proteases digestivas, absorção e movimento de íons, pois várias espécies

desta ordem são insetos de grande interesse econômico, pois atacam

variedades de culturas comerciais, como cereais, algodão, leguminosas, dentre

outros (TERRA et al., 1994).

SANTOS et al. (1986) demonstraram que não existe digestão no intestino

anterior em larvas de Erinnyis ello (Lepidoptera: Sphingidae). A digestão inicial

ocorre no espaço endoperitrófico do intestino médio, a digestão intermediária e

a final são realizadas por enzimas associadas ao glicocálice das células ou

ligadas a membrana microvilar. Em Spodoptera frugiperda (Lepidoptera:

Noctuidae) foram encontrados resultados similares.

Dados obtidos com larvas de Manduca sexta (Sphingidae) mostraram que

a atividade da tripsina é recuperada no lúmen do intestino médio anterior,

sendo que a maioria do mRNA para tripsina é encontrada na porção mediana

do intestino médio. Estes resultados levaram à proposição de que esta enzima

é secretada por células da porção mediana do intestino médio e carreada pelo

espaço ectoperitrófico para a porção anterior do intestino médio. Esta

organização espacial do processo digestivo é provavelmente comum para a

maioria das larvas, parecendo também ser similar em Lepidoptera adulta

(TERRA et al., 1996).

Os principais grupos de enzimas digestivas de insetos são constituídos

pelas lipases, carboidrases e proteases, sendo este último o grupo melhor

caracterizado.

1.2.1. Lipases

Lipídeos são importantes para insetos herbívoros como nutrientes e

surfactantes intestinais, os quais facilitam a absorção dos nutrientes. Os

glicero-fosfolipídeos e os fosfolipídeos das folhas (galactosil diglicerídeo,

fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina e os fosfatidilgliceróis) são

enzimaticamente hidrolisados no lúmen intestinal das larvas, sendo liberados

resíduos de açúcar, glicerol, ácido fosfatídico, colina e etanolamina. Pouco é

conhecido sobre as enzimas responsáveis. Esses componentes lipídicos

liberados são absorvidos pelo epitélio do intestino médio para que ocorra a

nova síntese de di- e triglicerídeos, e liberação como diacilgliceróis para as

lipoforinas, proteínas de transporte presentes na hemolinfa (CAMPBELL,

1990). Surfactantes presentes no lúmen intestinal solubilizam compostos

lipofílicos através da redução da tensão superficial dos fluidos intestinais.

Surfactantes produzidos por microrganismos têm sido isolados de intestino

médio de alguns insetos, embora suas contribuições in vivo não tenham sido

demonstradas (CAMPBELL, 1990).

Larvas se alimentam constantemente e esse comportamento somente é

interrompido durante a metamorfose (ZIEGLER, 1985). Como resultado, o

conteúdo dos corpos gordurosos aumenta de poucos miligramas para mais de

300 mg no final do estágio larval (FERNANDO-WARNAKULASURIYA et al.,

1988). Durante o período pupal, esses estoques de lipídeos são usados para

ajudar na metamorfose e a mariposa adulta utiliza esses estoques na demanda

de energia imposta na reprodução e vôo (ZIEGLER, 1991). Assim, a larva

acumula reservas enquanto o adulto a consome. Durante o desenvolvimento,

os corpos gordurosos mudam de tecido de reserva de lipídeos para um tecido

de mobilização de lipídeos (TSUCHIDA & WELLS, 1988); entretanto, no

presente não se tem informação sobre como essa profunda transição em

condições metabólicas dos corpos gordurosos é regulada.

De acordo com ARRESE et al. (2001), são conhecidos poucos detalhes

sobre o processo no qual ácidos graxos da dieta são digeridos e absorvidos

dentro do intestino médio e então transportados para os corpos gordurosos

para estocagem. Igualmente escasso é o conhecimento sobre como os ácidos

graxos são mobilizados dos corpos gordurosos e transportados para os tecidos

para utilização.

Uma das maiores funções do intestino médio é digerir lipídeos

provenientes da dieta, e absorver e processar os produtos da digestão para

exportar para a hemolinfa. O triacilglicerol é o mais abundante componente

lipídico da dieta e dos estoques de ácidos graxos (TURUNEN & CRAILSHEIM,

1996).

Sabe-se que a lipase atua hidrolisando os ésteres de glicerol de ácidos

graxos de cadeias longas (triacilgliceróis) em diglicerídeos, monoglicerídeos e

ácidos graxos livres. O processo digestivo tem sido caracterizado para sugerir

dois modelos de lipólise no lúmen do intestino médio, a completa hidrólise de

triacilgliceróis (TAG) a ácidos graxos e glicerol (WEINTRAB & TIETZ, 1973,

WEINTRAB & TIETZ, 1978; TSUCHIDA & WELLS, 1988) e a formação de

ácidos graxos e monoacilglicerol (MAG) (HOFFMAN & DOWNER, 1979; MALE

& STOREY, 1981). A lipase de triacilglicerol tem sido estudada somente em

preparações brutas de algumas poucas espécies de insetos. A enzima libera

ácidos graxos das posições 1 e 3 e mostra a preferência por ácidos graxos

insaturados (WEINTRAB & TIETZ, 1973).

1.2.2. Carboidrases

Enzimas que são capazes de realizar a completa hidrólise dos

carboidratos até monossacarídeos são denominadas carboidrases. Elas são

classificadas de acordo com a especificidade do substrato. Duas amplas

categorias distintas de carboidrases são conhecidas. Uma inclui as

despolimerases, enzimas que clivam ligações internas nos polissacarídeos e

usualmente possuem o nome do seu substrato especifico, por exemplo,

amilase, celulase e pectinase. Na segunda categoria estão incluídas as

glicosidases, que são enzimas que hidrolisam oligossacarídeos e

dissacarídeos.

1.2.2.1.Amilases

Três enzimas são conhecidas por hidrolisar preferencialmente ao longo

de cadeias glicosídicas com ligações α-1,4 que ocorrem, por exemplo, no

amido e no glicogênio. A α-amilase (EC 3.2.1.1) catalisa a endo-hidrólise das

ligações de maneira aleatória, β-amilase remove unidades de maltose

sucessivamente e glicoamilase remove sucessivas unidades de glicose a partir

da extremidade não redutora da cadeia (TERRA & FERREIRA, 1994).

Muitos insetos dependentes de amido utilizam α-amilases para o

metabolismo de carboidratos, liberando misturas de oligossacarídeos para

produção de energia. Pela sua importância, diferentes formas de α-amilases

podem ser encontradas em uma única espécie de inseto, para garantir um

eficiente processo digestivo (BAKER, 1983). Além disso, como esses insetos

são totalmente dependentes de α-amilases para sobreviverem, essas enzimas

são boas candidatas a alvo para biopesticidas usando inibidores de α-amilases

(FRANCO et al., 2002, SVENSSON et al., 2003).

Inibidores de α-amilase são extensivamente encontrados em muitas

sementes de plantas e em tubérculos, sendo particularmente abundantes em

cereais e legumes (FRANCO et al., 2002). Essas moléculas desempenham um

papel fundamental contra pragas e patógenos, os quais causam grandes

danos a plantações e grãos estocados. Ultimamente, inibidores de proteases e

de α-amilases estão disponíveis como fonte genética para produção de

culturas transgênicas resistentes a insetos (GATEHOUSE & GATEHOUSE,

1998).

1.2.2.2. Celulases

A digestão de celulose é realizada por uma mistura de enzimas com

diferentes especificidades. O sistema mais conhecido consiste em três classes

de enzimas: (1) exo-β-1,4-glicanases (atividade β-1,4-glicanocelobiohidrolase

EC 3.2.1.91), as quais clivam unidades de celobiose nas cadeias finais não

redutoras presentes na celulose cristalina; (2) endo-β-1,4-glicanases (EC

3.2.1.4), que clivam aleatoriamente ligações β-1,4-glicosídicas presentes nas

cadeias de celulose e (3) β-1,4-glicosidases (celobiases, EC 3.2.1.21),

responsáveis pela hidrólise de celobiose e pequenas oligocelodextrinas a

glicose (TERRA & FERREIRA, 1994).

A digestão de celulose em insetos é rara, porque o fator da dieta que

limita o crescimento dos herbívoros é a qualidade da proteína e não o tipo de

carboidrato presente. Assim, a digestão de celulose é improvável por ser

desvantajosa para o inseto que pode encontrar requerimentos nutricionais

mais fáceis de serem digeridos. Entretanto, a digestão de celulose ocorre em

vários insetos que se alimentam de dietas nutricionalmente pobres

(CAMPBELL, 1990).

Acreditava-se que insetos eram dependentes de simbiontes para a

digestão de celulose (MARTIN, 1983 e 1991), porém existem evidências de

que insetos secretam enzimas capazes de hidrolisar celulose cristalina

(SLAYTOR, 1992). Várias celulases de insetos têm sido purificadas e

caracterizadas. O sistema de celulase de larvas de Ergates faber (Coleóptera:

Cerambycidae) foi demonstrado em três enzimas homogêneas. A enzima 1

(MM

25 KDa; pH ótimo 4,5) é uma típica exo-β-1,4-glicanase, enquanto que as

enzimas 2 (MM 57 KDa; pH ótimo 5,2), a enzima 3 (MM 70 KDa; pH ótimo 5,2)

são ativas contra celobiose, carboximetilcelulose e celulose cristalina

(CHACARAS et al., 1983). O papel dos simbiontes de insetos que digerem

celulose está se tornando controverso, embora acredita-se que organismos

simbiontes fixadores de nitrogênio estão certamente envolvidos com o

aumento do valor nutritivo da dieta de muitos insetos.

1.2.2.3. Xilanases

Xilana é o segundo principal constituinte da fração hemicelulose presente

na parede celular de plantas, depois da celulose. A xilana é constituída por

uma cadeia principal de resíduos β-1,4-xilopiranose, que é frequentemente

substituída por unidades α-arabinofuranose e ácido metilglicurônico. Quando

ingerido pelo inseto, esse complexo polissacarídico deve ser hidrolisado à

monômeros de açúcar para a realização do metabolismo. A degradação da

biomassa hemicelulolítica e a recaptura de carbono na natureza é resultado da

ação de uma série de enzimas hidrolíticas que sequencialmente reduz o

polímero de açúcar à pequenas unidades metabolizáveis. A principal enzima

envolvida na clivagem da xilana é a endo-1, 4 β-xilanase (EC 3.2.1.8) que é

responsável pela clivagem aleatória das ligações glicosídicas internas ou em

posições específicas. Essa especificidade posicional, análoga à das proteases,

leva à hidrólise padrão de polímeros específicos até pequenos oligômeros

(BRECCIA et al., 1998).

Recentes estudos permitiram a construção de bibliotecas genômicas de

DNA microbiano isolado de tratos intestinais de insetos das ordens Isoptera

(termitas) e Lepidóptera (BRENNAN et al., 2004). Essas bibliotecas foram

avaliadas para genes que codificam proteínas com atividade de xilanase.

Várias novas xilanases com seqüências primárias e novos domínios com

funcionalidade desconhecida foram descobertos. A análise filogenética

demonstrou uma distância considerável entre a seqüência dessas enzimas e

outras xilanases conhecidas.

1.2.2.4. Pectinases

A pectina é um polissacarídeo ramificado constituído principalmente de

polímeros de ácido galacturônico, ramnose, arabinose e galactose. É um dos

principais componentes da parede celular das plantas, o principal componente

da lamela média e age como um cimento para agregar as células vegetais. As

enzimas pécticas são enzimas capazes de hidrolisar a pectina e são

produzidas por bactérias, fungos, leveduras, insetos, nematóides e

protozoários. Essas enzimas são classificadas de acordo com sua atividade

(SEARLE-VAN LEEUWEN et al., 1992). Não existem relatos da presença de

outras enzimas pécticas em insetos, somente de pectinases. As pectinases

(Poligalacturonases, EC 3.2.1.15) ocorrem em Orthoptera, Hemiptera,

Coleoptera, Diptera e Trichoptera (TERRA & FERREIRA, 1994).

Existem estudos relacionados a simbiontes de insetos capazes de

degradar pectina e outros carboidratos presentes nas plantas, contribuindo,

dessa forma, para a nutrição do inseto. Como é o caso das formigas

cortadoras de folhas dos gêneros Atta e Acromyrmex, que não são capazes de

se alimentar da planta bruta, mas utilizam os nutrientes líquidos que saem das

folhas que cortam como também dos fungos, Leucoagaricus gongylophorus,

que elas cultivam. Esses fungos são capazes de degradar celulose, amido,

xilana e pectina. A degradação da pectina separa as células da planta

permitindo a invasão do tecido por esses fungos. Assim, as altas

concentrações de pectinase e pectina degradada são, primariamente,

utilizadas pelo fungo para degradar os tecidos das folhas e posteriormente

liberar os nutrientes necessários para as formigas (SIQUEIRA et al., 1998).

1.2.2.5. Glicosidases

As α-glicosidases (EC 3.2.1.20) catalisam a hidrólise de resíduos não-

redutores α-1,4- glicose de aril-glicosídicos, dissacarídeos ou oligossacarídeos.

A denominação das glicosidases se baseia no monossacarídeo que doa o

grupo redutor para a ligação glicosídica e a configuração (α ou β) dessa

ligação (TERRA & FERREIRA, 1994).

As α-glicosidases já foram purificadas de várias ordens de insetos, como

Hemiptera, Coleoptera, Hymenoptera, Díptera e Lepidoptera. Várias

propriedades das α-glicosidases são similares entre as diferentes ordens,

como inibição pelo Tris, valores de MM que variam de 60 KDa – 80 KDa ou

são múltiplos desses valores, sugerindo a presença de enzimas oligoméricas

(ERTHAL et al., 2004; TERRA & FERREIRA, 1994).

As β-glicosidases catalisam a hidrólise de resíduos não-redutores β-1,4-

monossacarídeos de um determinado glicosídeo. Dependendo do

monossacarídeo que será removido, a β-glicosidase é denominada de β-

glicosidase, β-galactosidase, β-xilosidase e etc. Frequentemente, a mesma β-

glicosidase é capaz de hidrolisar diferentes monossacarídeos presentes nos

glicosídeos. Nesse caso, o nome β-glicosidase é usado para todas as enzimas

que removem a glicose com eficiência. As β-glicosidases de insetos são

divididas dentro de três classes, baseadas na especificidade de seus

substratos. A classe 1 inclui enzimas com atividade glicosil β-glicosidase e aril

β-glicosidase, que são ativas sobre celobiose, NPβGlu, NPβGal e lactose. A

classe 2 inclui enzimas que possuem somente atividade glicosil β-glicosidase,

por exemplo, aquelas que apenas hidrolisam celobiose e lactose com

eficiência. Finalmente, a classe 3 que é composta por enzimas com atividade

aril β-glicosidase, que atuam somente sobre NPβGlu e substratos similares

(ERTHAL et al.,2004; TERRA & FERREIRA, 1994).

1.2.3. Proteases

As proteases são responsáveis pela hidrólise de proteínas, agindo em

ligações peptídicas. São classificadas dentro do grupo 3 (hidrolases), subgrupo

4. Elas também são classificadas com base em três critérios: (1) tipo de

reação catalizada, (2) natureza química do sítio catalítico e (3) relação

evolucionária de acordo com a estrutura (BARETT, 1994).

As proteases são subdivididas em dois principais grupos, exopeptidases e

endopeptidase, dependendo do seu sítio de ação. As exopeptidases clivam as

ligações peptídicas próximas do grupamento amino ou carboxi terminal no

substrato, enquanto as endopeptidases clivam ligações peptídicas distantes do

grupo terminal do substrato. Baseado no grupo funcional presente no sítio

ativo, as proteases são classificadas dentro de quatro grupos, serino

proteases, aspartil proteases, cisteíno proteases e metalo proteases (RAO et

al., 1998).

1.3. Proteases de insetos

As proteases digestivas de insetos catalisam a produção de peptídeos e

aminoácidos de uma dieta protéica e são encontradas na região do intestino

médio do trato digestivo dos insetos. As serino proteases são as enzimas mais

estudadas, sendo seus representantes mais conhecidos a tripsina e a

quimiotripsina e participam de uma grande diversidade de processos

fisiológicos que incluem, além da digestão, ativação de proteínas específicas,

como nas cascatas de coagulação, no sistema imune de insetos e plantas

(WILSON et al., 1997), desenvolvimento e produção de peptídeos

biologicamente ativos (GILL et al., 1996).

Dentro das serino proteases, tripsinas e quimiotripsinas são as enzimas

mais encontradas. As tripsinas clivam, preferencialmente, as cadeias protéicas

no lado carboxila dos aminoácidos básicos, como arginina e lisina. Essa

enzima é inibida por TLCK, que promove a alquilação da histidina. O valor da

massa molecular de tripsinas varia entre 20 e 35 KDa e seus valores de pI

estão entre 4 - 5. Seu pH ótimo é alcalino, entre 8 e 9 (MARES-GUIA & SHAW,

1965). Contudo, as tripsinas isoladas de Lepidopteras possuem um pH ótimo

maior do que os valores de pH encontrados nos intestinos médios de outros

insetos (LEMOS et al., 1992).

As atividades de enzimas tripsina-like são amplamente estudadas em

várias espécies de Lepidoptera e diversas ordens como Coleoptera,

Auchenorrhyncha, Blattodea e Diptera (MUHARSINI et al., 2001; FOISSAC et

al., 2002; WAGNER et al., 2002; LOPES & TERRA, 2003, OLIVEIRA et al.,

2005; XAVIER et al., 2005). Algumas de suas propriedades assemelham-se às

tripsinas de vertebrados. No entanto, determinadas características da tripsina

de insetos contrastam com as tripsinas de vertebrados, como pH ótimo, peso

molecular, sensibilidade a íon, ponto isoelétrico e sensibilidade aos inibidores

de proteases da planta. Foi verificado que os íons cálcio não causaram

aumento da atividade ou da estabilidade nas tripsinas de insetos e que elas

são instáveis em pH ácido (SAKAL et al., 1988). O efeito de íons cálcio foi

avaliado na atividade de protease presente no intestino médio de A.

gemmatalis, onde foi observado um aumento de atividade na presença de 10 -

30 mM de CaCl

(OLIVEIRA et al., 2005).

Em vertebrados o íon cálcio impede

a agregação de moléculas da enzima, protegendo-a da autólise e

desnaturação por calor, induzindo uma mudança conformacional em sua

estrutura para uma forma mais compacta, a qual é necessária para a atividade

catalítica (SIPOS & MERKEL, 1970).

Estudos realizados em larvas de Spodoptera littoralis (Lepidoptera:

Noctuidae) e em Melolontha melolontha (Coleoptera: Scarabaeidae) sobre o

efeito de íons cálcio na atividade de tripsina em presença de EGTA e/ou

EDTA, quelantes de cálcio, demonstraram que esta enzima sofreu pequena

queda em sua atividade (5%) (LEE et al., 1995; WAGNER et al., 2002). Esse

resultado sugere que o cálcio talvez possa ter uma função na enzima desses

insetos, provavelmente, como co-fator.

OLIVEIRA et al. (2005) purificaram parcialmente a enzima tripsina-like de

A. gemmatalis. A fração parcialmente purificada mostrou três bandas com

atividade proteolítica e massas moleculares de 66 KDa, 71 KDa e 91KDa em

gel SDS-PAGE. Ensaios de especificidade enzimática, usando sete peptídeos

sintéticos contendo 13 resíduos de aminoácidos com diferença somente no 5º

resíduo foram realizados, tendo tripsina e quimiotripsina como controle.

Somente os peptídeos contendo os aminoácidos lisina e arginina (específicos

para tripsina) foram clivados por ambas, tripsina e enzima parcialmente

purificada. Esses resultados demonstraram que o intestino médio de larvas de

A. gemmatalis possui uma serino protease tripsina-like.

XAVIER et al. (2005) identificaram e caracterizaram proteases ligadas à

membrana, presentes no intestino médio de A. gemmatalis. Seus resultados

demonstraram que o extrato enzimático insolúvel foi capaz de hidrolisar a

caseína e os substratos sintéticos L-BApNA e L-TAME. Usando L-BApNA como

substrato, a atividade foi investigada na presença de vários inibidores de

proteases. Assim, EDTA, PMSF, TLCK, benzamidina e aprotinina, foram todos

capazes de inibir a atividade, com maior efeito de inibição observado com o

uso de TLCK e benzamidina. De acordo com estes resultados, concluiu-se que

o intestino médio de larvas de A. gemmatalis possui tripsina-like ligada à

membrana. Com o propósito de caracterizar melhor a atividade tripsina-like, foi

determinada a atividade ótima para o extrato insolúvel. O pH ótimo usando L-

BApNA e L-TAME foi 8,5 e 8,0, respectivamente, e a temperatura ótima foi de

C para ambos substratos. O efeito de cálcio na atividade foi investigado

usando L-BApNA como substrato. A atividade máxima foi obtida na

concentração de 20 mM de cálcio. Valores de K

Mapp

para L-BApNA e L-TAME

foram de 0,23 mM e 95,4 μM, respectivamente.

Múltiplas isoenzimas de tripsinas têm sido reconhecidas e o

seqüenciamento da multifamília de genes codificadores de tripsinas de insetos

tem recebido recente atenção (MAZUMDAR-LEIGTON et al., 2000;

MAZUMDAR-LEIGTON et al., 2001; DE LEO et al., 2001). As proteases

induzidas explicam o desenvolvimento da resistência do inseto aos inibidores

de proteases presentes em plantas nativas ou transgênicas (JOGSMA et al.,

1995; BROADWAY, 1995, 1996; BROWN et al., 1997; BRITO et al., 2001).

As quimiotripsinas são serino proteases, tripsina-like, que clivam

proteínas nos grupos carboxilas presentes nos aminoácidos aromáticos. A

quimiotripsina é inibida por TPCK, o qual reage na histidina. A atividade da

quimiotripsina é baixa no intestino médio de Lepidoptera. A massa molecular

varia de 20 a 30 KDa e seu pH ótimo varia entre 8-9 (TERRA et al., 1994).

A quimiotripsina de Lepidoptera possui uma atividade baixa, o que explica

o fato dela ter sido caracterizada com detalhes somente em Pieris brassicae. A

quimiotripsina dessa Lepidoptera possui um pH ótimo maior, pH 10, sua massa

molecular é de 32 KDa e foi inibida eficientemente por DFP e SBTI (LECADET

& DEDONDER, 1966). A seqüência da quimiotripsina-like de Vespa orientalis

foi determinada e mostrou semelhança com a de quimiotripsina de vertebrados

(JANY et al., 1983). Ela também age sobre o glucagon e insulina, de maneira

similar à quimiotripsina de vertebrados (BAUMANN, 1990). Entretanto possui

algumas propriedades diferentes, como sua instabilidade a pH ácido e sua

forte inibição por SBTI (SAKAL et al., 1988).

Cisteíno-proteases são enzimas proteolíticas que agem via ataque

nucleofílico do ânion sulfeto, no sítio ativo, à ligação peptídica (KUNAKBAEVA

et al., 2003). O sítio ativo de uma cisteíno protease é composto por um resíduo

de cisteína, um de asparagina e um de histidina na tríade catalítica. O ataque

nucleofílico do grupo tiol da cisteína ao carbono da carbonila do substrato,

resulta num intermediário tetraédrico. Uma ligação covalente acil-enzima é

formada após a clivagem da ligação peptídica. A hidrólise do acil-enzima leva à

regeneração da enzima livre (BAIRD et al., 2006).

1.4. Inibidores de Proteases

É postulado que os inibidores de proteases atuam no mecanismo de

defesa de plantas contra ataque de insetos e patógenos. Foi demonstrado em

plantas de tomate que quando ocorrem ferimentos em folhas, ocorre

rapidamente síntese de inibidores de proteases no local do ferimento (resposta

local), como também em folhas mais distantes (resposta sistêmica) (FARMER

& RYAN, 1992). Isto também já foi observado por VIEIRA et al., (2001); SILVA

et al., (2002) e FORTUNATO et al., (2004 e 2007) utilizando plantas de soja.

Diversos compostos identificados em plantas que podem regular a

expressão dos genes que codificam os inibidores de proteases são induzidos

por ferimentos; dentre eles estão oligouronídeos, ácido abscísico, metil

jasmonatos, ácido jasmônico e a sistemina. Os inibidores de proteases

representam cerca de 6% das proteínas presentes no grão de soja (BRANDON

et al., 1987)

Os inibidores de proteases exercem uma importante função de defesa

das plantas (RYAN, 1990). Os inibidores têm efeito de proteger as plantas

contra danos causados por vários tipos de pragas agrícolas, inibindo

significativamente atividades proteolíticas no intestino dos insetos (HILDER et

al., 1987). Danos causados em folhas de tomateiro por insetos mastigadores

ou por outros meios mecânicos resultam numa rápida ativação transcripcional

de inibidores de proteases. O modelo proposto por FARMER & RYAN (1992)

para genes que codificam inibidores de proteases em tomateiro mostra que um

sinal sistêmico é aparentemente necessário para a indução desses genes de

defesa.

Foi demonstrado o aumento de inibidores de proteases nas folhas ao

provocar estresse biótico e abiótico na soja, tais como, ferimento mecânico

(VIEIRA et al., 2001), infecção pelo agente causador do cancro da haste

(SILVA, et al., 2001), pulverização com ácidos graxos (BATISTA et al., 2002 a

e b), ataque por A. gemmatalis (SILVA et al., 2002; FORTUNATO et al., 2004 e

2007), pulverização com ácido jasmônico (OLIVEIRA et al., 2002), ataque por

mosca-branca (SILVA, et al., 2004), retirada de primórdios florais (FERREIRA

et al., 2004, 2005).

Existem quatro famílias de inibidores de proteases que atuam sobre

serino, cisteíno, metalo ou aspartil proteases (XAVIER-FILHO & CAMPOS,

1989). As mais estudadas são aquelas capazes de inibir as serino proteases,

tripsina e quimiotripsina, enzimas encontradas majoritariamente em insetos da

ordem Lepidoptera (TERRA & FERREIRA, 1994) e aqueles que inibem

cisteíno proteases comumente encontrados em insetos da ordem Coleoptera

(TERRA & FERREIRA, 1994; MATSUMOTO et al., 1997; KOIWA et al., 2000).

Geralmente os inibidores se associam fortemente com as enzimas que

eles inibem, com constante de associação da ordem de 10

a 10

-1

. Esta

relação é do tipo competitiva, abolindo todas as atividades da enzima cognata

(LASKOVSKI & KATO, 1980).

Tem sido sugerido que a ingestão de inibidores enzimáticos não elimina

a digestão proteolítica no intestino médio dos insetos, mas em vez disto resulta

na hiperprodução de enzimas proteolíticas. O efeito adverso ocorre de acordo

com a ingestão crônica de inibidores, o que resulta na hiperprodução

perniciosa de proteases alimentares, levando à limitação de aminoácidos

essenciais para a síntese protéica, e conseqüentemente, redução do

crescimento e do desenvolvimento do inseto (BROADWAY & DUFFEY, 1986;

BROADWAY, 1995).

PILON et al., (2006) estudaram a determinação da digestibilidade e dos

efeitos no crescimento e desenvolvimento de larvas de A. gemmatalis, assim

como a avaliaram a atividade das proteases digestivas presentes no intestino

médio da lagarta, quando alimentadas com o inibidor de tripsina benzamidina

nas concentrações 0; 0,25; 0,50 e 0,75 (% p/p de dieta artificial). Foi verificado

que a adição de benzamidina alterou significativamente a digestibilidade do

alimento protéico. Tal alteração está correlacionada com impactos negativos

ocasionados na fase larval desse inseto, tais como aumento do ciclo larval,

diminuição de ganho de peso e aumento da mortalidade. Foi verificado

também, que tanto a atividade proteolítica quanto a atividade amidásica

apresentaram maiores índices em lagartas de 5º instar. A presença do inibidor

alterou os perfis de atividades, sugerindo que os insetos, após a ingestão de

altas doses de inibidores de proteases, podem apresentar respostas de defesa

através da hiperprodução de proteases sensíveis à benzamidina e/ou síntese

de proteases insensíveis ao inibidor. Portanto, estes dados sugerem que

estudos aprofundados do conjunto de proteases presentes na lagarta são

necessários, para que a utilização de inibidores de protease possa ser uma

estratégia promissora no controle de A. gemmatalis.

A transferência de genes pode ser considerada como um passo crucial

no desenvolvimento de plantas resistentes a insetos, juntamente com vários

resultados positivos em plantas transgênicas resistentes a pragas via

expressão de genes de inibidores de proteases (HILDER et al., 1987; DUAN et

al., 1996; GATEHOUSE et al., 1998).

A utilização de genes que codificam inibidores de enzimas digestivas

para a obtenção de plantas resistentes contra o ataque de insetos é uma

estratégia promissora. Entretanto, para que isto ocorra é necessário que

selecione estes inibidores levando-se em consideração a fisiologia do inseto e

a bioquímica de sua digestão (FRANCO et al., 2002). Neste sentido, os

inibidores de proteases apresentam grande potencial por reduzirem ou

impedirem a atividade das enzimas digestivas dos insetos, causando-lhes

desnutrição e redução do desenvolvimento, podendo chegar até à morte.

1.5. Microbiota bacteriana de insetos

Para melhor compreensão sobre a bioquímica e fisiologia de insetos, é

necessário também que eles sejam estudados dentro de um contexto

ecológico juntamente com os microrganismos, sendo estes importantes

componentes do sistema (STEINHAUS, 1960). A microbiota intestinal

representa todo aspecto da relação microbiana, tanto de patógenos como de

mutualismo obrigatório. Os primeiros estudos realizados sobre simbiose inseto-

bactéria consideraram apenas a relação entre inseto e microrganismo

patogênico e a conseqüente produção de inseticidas microbianos. Recentes

pesquisas no campo da endosimbiose têm enfatizado a relação de como os

microrganismos interagem com os insetos (DILLON & DILLON, 2004).

Os insetos apresentam uma grande variação em espécies, habitat, dieta

e características estruturais de seus sistemas digestivos, fatores que afetarão

a composição de suas microbiotas gastrintestinais (STEVENS & HUME, 1998).

Microrganismos desempenham um importante papel no crescimento e

desenvolvimento de muitas espécies de insetos. Simbiontes contribuem para

reprodução, digestão, nutrição e produção de feromônio (CAMPBELL, 1990;

DASCH et al., 1984). Relações simbióticas entre insetos e suas bactérias

intestinais têm sido estudados extensivamente em muitos sistemas,

particularmente em termites e afídeos, os quais se alimentam da madeira e do

floema, respectivamente (BREZNAK & BRUNE, 1994). Entretanto, pouco é

conhecido sobre a microbiota em outros grupos de insetos, principalmente

aqueles que se alimentam de folhagens.

A quantidade de microrganismos que habitam o intestino humano (10

)

excede o das células somáticas e germinativas do organismo (10

) e essa

microbiota realiza uma atividade metabólica equivalente ao fígado humano

(BERG, 1996). Muitas espécies de insetos também são habitadas por uma

grande comunidade de microrganismos. Embora haja uma enorme variação no

número de microrganismos colonizadores de insetos, é provável que a maioria

dessas espécies abrigue uma microbiota que excede o número de suas

próprias células (DASCH et al., 1984).

Existem poucos estudos sobre o papel funcional da microbiota digestiva

dos insetos. Assim, a função da microbiota normal dos insetos, comparada à

dos seus patógenos obrigatórios, é pouco explorada. O que explica em parte,

uma das dificuldades no reconhecimento dos benefícios dessa relação

(DILLON & DILLON, 2004).

Relações descritas entre insetos e sua microbiota associada têm sido

um desafio porque muitos dos microrganismos associados não são

prontamente cultiváveis. A utilização de métodos independentes de cultura,

como 16S rRNA – DGGE (HUI, et al., 2006; REESON et al., 2003;

SCHABEREITER-GURTNER et al., 2003), RAPD (DE VRIES et al., 2001),

PCR-RFLP (LI et al., 2005), T-RFLP (MINKLEY, et al., 2006, EGERT, et al.,

2005) hibridização in situ (BERCHTOLD et al., 1999; DOMINGO et al., 1998) e

outros, fornecem uma oportunidade de detectar e classificar microrganismos

que não podem ser cultivados pelos métodos existentes.

Em Apis mellifera, os ovos, pupas e abelhas operárias ao emergirem

como adultos são usualmente livres de bactérias (GILLIAM, 1997). Os adultos

adquirem uma microbiota bacteriana intestinal pelo intercâmbio de alimento

com outros indivíduos na colônia e através do consumo de pólen. Os

microrganismos da microbiota de insetos - notadamente espécies de Bacillus -

são importantes para a conversão do pólen estocado em alimento para as

abelhas operárias, bem como para complementação e preservação do

alimento, sintetizando aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, enzimas e

substâncias antimicrobianas, além de protegerem a saúde da colônia pela

produção de antibióticos (GILLIAM, 1997).

Devido aos hábitos alimentares de dípteros adultos na natureza, a

ingestão de bactérias é inevitável. Dependendo das relações que esses

insetos possam ter desenvolvido com seus microrganismos, as bactérias

poderão ou não serem transmitidas às larvas, seja via contaminação dos ovos

ou do seu substrato alimentar no ato da oviposição. Ainda que as larvas

tenham herdado bactérias intestinais de suas progenitoras e que estas tenham

se estabelecido em seu trato alimentar, a microbiota intestinal será

continuamente renovada com a alimentação do inseto adulto na natureza

(GILLIAM, 1997).

A microbiota que tem sido alvo de estudos é a do trato digestivo de

Lutzomyia longipalpis (Díptero), do grupo dos flebotomíneos é associada à

transmissão de Leishmania spp que são agentes etiológicos de diversas

formas de leishmaniose (OLIVEIRA, et al., 2000). Os flebotomíneos, tanto os

machos como as fêmeas, alimentam-se de açúcares, provenientes de várias

fontes, como folhas, frutos e secreções de afídeos, possibilitando a ingestão de

microrganismos. As fêmeas de algumas espécies procuram proteínas

adicionais, como o sangue de vertebrados ou fluidos do corpo de outros

insetos (OLIVEIRA, et al., 2001).

A importância prática do estudo da composição da microbiota

bacteriana de L. longipalpis, assim como de outros insetos hematófagos,

reside no fato destes poderem ser importantes fontes de infecções tanto para

animais quanto para humanos. A presença de bactérias potencialmente

patogênicas em seus tratos digestivos representaria um risco de contaminação

no momento da alimentação (OLIVEIRA, et al., 2001).

Muitos dos microrganismos ainda não detectados devido a limitações

técnicas podem ser membros de associações importantes no trato digestivo de

cupins. Em cupins, a espécie em que a microbiota intestinal é a mais bem

estudada é a Reticulitermes flavipes. Estudos desenvolvidos com essa

espécie, empregando técnicas de biologia molecular para detecção de

microrganismos, mostram que a comunidade microbiana de seu trato intestinal

apresenta uma alta diversidade de nichos. Isto corresponde a uma grande

diversidade de espécies de microrganismos ocupando o ecossistema intestinal

de R. flavipes. Os principais grupos bacterianos já detectados, havendo

considerável diversidade de microrganismos, são bactérias pertencentes aos

grupos dos Enterococcus e Lactococcus, incluindo espécies de Desulfovibrio.

Contudo, faltam ainda maiores informações quanto à identificação de espécies

potencialmente importantes do ponto de vista nutricional e funcional para

esses insetos (BRUNE et al.,1995; THOLEN et al., 1997; HONGOH et al.,

2003).

1.6. Fatores que influenciam a colonização microbiana do trato intestinal

de insetos

A diversidade da microbiota está relacionada em parte com estruturas

especializadas presentes no intestino e com o efeito de pH, condições redox,

enzimas digestivas presentes e tipo de alimento ingerido pelo inseto (DILLON

& DILLON, 2004). Algumas considerações foram feitas a respeito da estrutura

e compartimentalização do trato digestivo de insetos. Observou-se que insetos

que apresentavam estruturas mais complexas tinham uma ampla variedade

microbiana, quando comparados com insetos cuja estrutura intestinal era mais

simples (TANADA & KAYA, 1993).

O pH e o potencial redox são importantes fatores selecionadores para

algumas espécies bacterinas. A maioria das bactérias tem um pH ótimo para o

crescimento na faixa de 6 – 7, porém existem numerosas exceções, incluindo

bactérias láticas que podem crescer em pH ácido (SHANNON et al., 2001).

Microrganismos aeróbios estritos crescem somente em ambientes com

potencial redox positivo e anaeróbios em potencial redox negativo. Múltiplas

adaptações têm surgido no intestino dos insetos para capacitá-los a digerir

eficientemente suas dietas e importantes variações no pH e potencial redox

fazem parte dessa adaptação (DILLON & DILLON, 2004). Algumas bactérias

ácido-tolerantes criam seu próprio ambiente com pH baixo, através da

produção de ácidos, tais como ácido lático produzido por Enterococcus no

intestino de Lymantria dispar (BRODERICK et al., 2004).

Compostos secundários de plantas têm propriedades antimicrobianas e

juntamente com o pH do intestino alteram a composição da microbiota e

particularmente favorecem espécies que são capazes de destoxificar esses

compostos tóxicos. De fato, é através dos taninos derivados da dieta que

ocorre a alteração da composição bacteriana intestinal em larvas de Acentria

ephemerella, um herbívoro aquático (WALENCIAK et al., 2002).

1.7. Importância da microbiota bacteriana de insetos

Uma das características mais comuns do sistema digestivo de uma

ampla gama de espécies de animais vertebrados e invertebrados é a presença

de microrganismos simbiontes. Os microrganismos intestinais contribuem na

digestão dos alimentos, na produção de vitaminas essenciais para o

hospedeiro e na defesa contra a patogênese bacteriana, por meio de

competição com organismos que compartilham nutrientes e sítios de anexação

(DILLON & DILLON, 2004).

1.7.1. Função nutricional da microbiota

As contribuições nutricionais da microbiota intestinal podem ocorrer de

várias formas, como a melhoria da habilidade de viver em condições de dietas

subótimas, o aumento da eficiência da digestão, a aquisição de enzimas

digestivas e o abastecimento de vitaminas. Contribuições nutricionais estão

bem estabelecidas entre o endosimbionte Buchnera sp. e afídeos (ADAMS &

DOUGLAS, 1997; DOUGLAS et al., 2001). A bactéria simbionte Buchnera sp.

fornece aos afídeos aminoácidos essenciais e nutrientes que são ausentes em

sua dieta. Vários trabalhos realizados com cupins reportaram que

microrganismos associados ao trato digestivo de diversas espécies desses

insetos são essenciais para sua sobrevivência, por serem fontes potenciais de

enzimas que degradam celulose e lignina, fornecendo aos seus hospedeiros

glicose e ácidos graxos que serão utilizados como fonte de energia (EUTICK et

al., 1978; SCHULTZ & BREZNAK, 1978; BRUNE & FRIEDRICH, 2000;

TANADA et al., 2006). As espiroquetas fornecem carbono, nitrogênio e a

energia necessária para a nutrição de cupins via acetogenese e fixação de

nitrogênio (OHKUMA et al., 1999; BRAUMAN et al., 2001; BREZNAK et al.,

2002). Além disso, os próprios microrganismos podem servir como fonte de

alimento para seus hospedeiros (BREZNAK et al., 1994; SLAYTOR et al.,

1997; MINKLEY et al., 2006).

Além do mais, microrganismos possuem propriedades metabólicas que

estão ausentes nos insetos e devido a isso eles agem como “microrganismos

corretores”, capacitando insetos fitófagos a superar suas barreiras bioquímicas

(DOUGLAS, 1998). Alguns microrganismos destoxificam aleloquímicos

presentes nas plantas, tais como flavonóides, taninos e alcalóides (BHAT et

al., 1998). Degradação microbiana de compostos aromáticos da planta pode

ocorrer no trato intestinal de cupins e pode contribuir com requerimento de

carbono e energia para o hospedeiro (BRUNE et al., 1995). Enzimas digestivas

de alguns insetos podem ser derivadas da microbiota, porém existem poucos

estudos que mostram contribuição da produção de hidrolases pelos

microrganismos (DILLON & DILLON, 2004).

1.7.2. Resistência à colonização

A principal função benéfica da microbiota intestinal residente em

humanos e animais domésticos é sua habilidade de resistir a colonização do

intestino por espécies não residentes, incluindo patógenos e,

conseqüentemente, prevenir infecções entéricas (BERG, 1996).

Microrganismos residentes em alguns insetos têm sido suprimidos por agentes

antimicrobianos e comparados com outros insetos que contêm uma microbiota

intacta. Larvas de Lepidoptera Homona magnanima criadas assepticamente,

mantiveram um crescimento 20 vezes maior de Bacillus thuringiensis do que

larvas criadas em ambientes não assépticos, o que sugere que as bactérias

intestinais influenciam o crescimento de microrganismos patogênicos nas

larvas (TAKATSUKA et al., 2000). Schistocerca gregaria germ-free foram

alimentados com dieta adicionada de Serratia marcescens, uma bactéria

patogênica de insetos (DILLON et al., 2005). Os resultados mostraram que a

densidade de S. marcescens encontrada em insetos germ-free foi cinco vezes

maior do que em insetos controle, sugerindo que a microbiota intestinal de S.

gregaria fornece proteção contra o estabelecimento de patógenos no intestino

do hospedeiro.

1.7.3. Interações Multitróficas

Alguns insetos seqüestram componentes da planta para serem usados

diretamente como componentes de feromônios ou produzirem modificações

nos precursores da sua dieta (TILLMAN, et al., 1999).

Existem evidências que compostos metabólicos produzidos por algumas

bactérias intestinais de lepidópteras estão envolvidos na síntese de produtos

importantes nas interações multitróficas. Insetos que se alimentam de plantas

são conhecidos por desencadearem várias respostas sistêmicas na planta.

Uma dessas respostas é a emissão de compostos voláteis que atraem

predadores contra seus herbívoros (ARIMURA et al., 2000). N-acilaminoácidos

são amplamente encontrados nas secreções orais de insetos, conhecidos por

serem indutores da biossíntese de compostos voláteis em plantas. Alguns

trabalhos consideram que bactérias presentes no trato digestivo de larvas de

Spodoptera littoralis estão envolvidas na síntese de N-acilaminoácidos,

sugerindo assim que essas bactérias poderiam ser incluídas em outro nível

trófico nos estudos das interações entre insetos, suas plantas hospedeiras e

predadores (SPITELLER, et al., 2000).

1.7.4. Transferência Gênica Bacteriana dentro do Intestino

As comunidades microbianas se adaptam através de várias

transferências de genes e pela transconjugação entre cepas bacterianas

presentes nos intestinos dos insetos, sendo essa adaptação importante tanto

para os microrganismos quanto para o inseto hospedeiro (WATANABE et al.,

1998). O bacilo Yersinia pestis é encontrado na flora intestinal de pulgas.

Estudos realizados com E. coli contendo plasmídeo de resistência a antibiótico,

mostraram que a transferência do gene para Y. pestis ocorreu no intestino

médio da pulga após 3 dias de coinfecção, e 95% das pulgas coinfectadas

continham Y. pestis transconjugantes resistentes a antibiótico após 4 semanas

(HINNEBUSCH et al., 2002).

1.7.5. Bactérias Intestinais Transgênicas no Biocontrole

Bactérias intestinais transgênicas são uma alternativa na estratégia de

controle de insetos-praga e doenças, porém um estudo mais detalhado sobre a

colonização, persistência e mecanismos de transmissão dessas bactérias é

necessário antes da implementação dessa estratégia. Bactérias simbiontes de

Rhagoletis completa foram modificadas via transformação para expressar

proteínas transgênicas no intestino de moscas (PELOQUIN et al., 2002).

Bactérias residentes no intestino de Cydia pomonella L. (Lepidoptera:

Tortricidae) foram isoladas e testadas quanto a capacidade inseticida contra

esse inseto (ERTÜRK & DEMIRBAG, 2006).

Esta Tese segue as normas da Associação Brasileira de Normas

Técnicas (ABNT) com os seguintes capítulos:

1 Contribuição da microbiota bacteriana para o processo digestivo e

desenvolvimento de Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera: Noctuidae).

2 Caracterização de bactérias proteolíticas associadas ao trato

intestinal de Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera: Noctuidae).

2.0. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CAPÍTULO I

CONTRIBUIÇÃO DA MICROBIOTA BACTERIANA PARA

O PROCESSO DIGESTIVO E DESENVOLVIMENTO DE

Anticarsia gemmatalis (LEPIDOPTERA)

CONTRIBUIÇÃO DA MICROBIOTA BACTERIANA PARA O PROCESSO

DIGESTIVO E DESENVOLVIMENTO DE Anticarsia gemmatalis

(LEPIDOPTERA)

RESUMO- Muitos estudos têm sido realizados a respeito da caracterização da

diversidade da microbiota intestinal de insetos. Entretanto, pouco se conhece

sobre o papel funcional desses microrganismos, principalmente em

Lepidopteras, um grupo que compreende insetos fitófagos, sendo muitos deles

pragas agrícolas. Neste contexto, esse trabalho buscou compreender melhor

se a presença da microbiota afeta as atividades das enzimas hidrolíticas do

intestino de Anticarsia gemmatalis (Hübner) (Lepidóptera: Noctidae), bem como

os seus parâmetros biológicos de desenvolvimento. Tetraciclina, cloranfenicol e

uma combinação desses dois antibióticos mais ampicilina foram incorporadas à

dieta artificial em cinco doses específicas. Larvas foram alimentadas durante

seu ciclo até o instar pupal. A inibição das atividades enzimáticas foi

determinada utilizando-se extrato intestinal de larvas do 5º instar. A influência

da microbiota sobre o perfil enzimático durante o período larval foi avaliada em

todos os instars, na presença de quatorze diferentes substratos. O efeito dos

antibióticos sobre a microbiota foi avaliado através de métodos microbiológicos

de cultivo convencionais e microscopia. Os resultados mostraram que o

tratamento com tetraciclina foi eficiente na inibição da atividade amidásica e

lipásica, o que foi reforçado pela análise do perfil dessas enzimas durante o

desenvolvimento do inseto. O tratamento com tetraciclina também apresentou

um melhor efeito inibitório sobre bactérias cultiváveis totais e proteolíticas.

Verificou-se que o ganho de peso larval foi mais rápido nas concentrações

acima de 50 µg x mL

-1

de tetraciclina. Como conseqüência observou-se uma

pupação prematura e uma diferença significativa na viabilidade pupal entre

larvas controle e larvas criadas com tetraciclina. A mortalidade foi maior entre

os insetos alimentados com tetraciclina do que nos insetos controle. Deste

modo, conclui-se que bactérias presentes no trato intestinal de A. gemmatalis

possuem um papel importante na digestão de proteínas, lipídios e no

desenvolvimento desse inseto.

PALAVRAS-CHAVE: contribuição da microbiota intestinal, digestão de insetos,

serino-protease, lipase, desenvolvimento, Anticarsia gemmatalis

1. INTRODUÇÃO

O trato intestinal de insetos abriga uma ampla variedade de

microrganismos devido a sua contínua exposição ao ambiente externo. Uma

vez no intestino, os microrganismos podem crescer, ser lisados por enzimas ou

excretados (WALKER et al., 1999). Algumas espécies permanecem no

intestino e exercem papéis importantes na nutrição, desenvolvimento,

resistência a patógenos e reprodução do inseto hospedeiro.

Interações simbióticas nutricionais entre inseto-microrganismo têm sido

amplamente pesquisadas nas últimas décadas em vários sistemas (SCHULTZ

& BREZNAK, 1978; CRUDEN & MARKOVETZ, 1987; BREZNAK & BRUNE,

1994; DOUGLAS et al., 2001; GENTA et al., 2006). Sabe-se que a contribuição

nutricional da microbiota intestinal pode ocorrer de várias formas como a maior

habilidade de sobrevivência em condições de dietas subótimas, o aumento da

eficiência da digestão, a aquisição de enzimas digestivas e o abastecimento de

vitaminas (DILLON & DILLON, 2004). Por exemplo, os microrganismos

associados ao trato digestivo das diversas espécies de cupins são essenciais

para a sobrevivência desses insetos por serem fontes potenciais de enzimas

que degradam celulose e lignina, fornecendo aos seus hospedeiros glicose e

ácidos graxos que serão utilizados como fonte de energia. Espiroquetas

fornecem carbono, nitrogênio e energia necessários para a nutrição de cupins

via acetogênese e fixação de nitrogênio (BREZNAK, 2002). A eliminação de

bactérias presentes em Periplaneta americana resultou na diminuição da

capacidade reprodutiva e na incapacidade de biosíntese da metionina e

cisteína (CRUDEN & MARKOVETZ, 1987).

Novas xilanases com seqüências primárias não usuais e novos domínios

de funcionalidade desconhecida foram descobertas numa análise realizada

com métodos independentes de cultivo em tratos intestinais de insetos das

ordens Isoptera e Lepidoptera (BRENNAN et al., 2004). A análise filogenética

demonstrou uma diversidade considerável entre a seqüência dessas enzimas e

outras xilanases conhecidas, sugerindo que são de origem microbiana.

Sabe-se também que a eliminação de simbiontes intracelulares

(Buchnera) em afídeos afeta diretamente a nutrição e fisiologia do inseto,

causando redução no seu desenvolvimento e falência reprodutiva

(WILKINSON, 1998; DOUGLAS et al., 2001). Além do mais, os microrganismos

possuem propriedades metabólicas que estão ausentes nos insetos e devido a

isso eles agem como “microrganismos corretores”, capacitando insetos

fitófagos a superar barreiras bioquímicas (DOUGLAS, 1998).

Vários estudos investigaram a diversidade microbiana, utilizando

técnicas de cultivo tradicionais e métodos independentes de cultivo, presente

no intestino de Lepidopteras, uma ordem que compreende mais de 150.000

espécies de insetos (SHANNON et al., 2001; SITTENFELD et al., 2001;

BRODERICK et al., 2004; ERTÜRK & DEMIRBAG, 2006). Entretanto, pouco

se conhece sobre o papel funcional dos microrganismos associados à

Lepidopteras. Alguns autores acreditam que devido à ausência de estruturas

especializadas e ao trânsito alimentar rápido no trato intestinal de

Lepidopteras, microrganismos contribuam pouco com a sua nutrição e digestão

(APPEL, 1994; BIGNELL & EGGLETON, 1995). Enquanto outros sugerem que

a microbiota fornece nutrientes e contribui com o metabolismo desses insetos

(CAMPBELL, 1990; BRODERICK et al., 2004). Essas divergências fazem com

que estudos da funcionalidade da microbiota associada às Lepidopteras

tenham um interesse particular.

Como estudo preliminar do papel das bactérias intestinais em

Lepidopteras, foi utilizado como modelo Anticarsia gemmatalis, que é

considerada praga da cultura da soja, sendo economicamente importante em

função das grandes perdas que ocasiona a esta lavoura (GALLO et al., 2002).

Esse trabalho investigou a possibilidade da microbiota intestinal de A.

gemmatalis aumentar a eficiência da digestão através do fornecimento de

enzimas digestivas, tais como carboidrases, lipase, proteases e

consequentemente melhorar o desenvolvimento desse hospedeiro. Embora,

estudos de caracterização das proteases digestivas deste inseto tenham sido

realizados (OLIVEIRA et al., 2005; XAVIER, et al., 2005; PILON, et al., 2006),

nenhum levou em consideração se essas enzimas são de origem bacteriana.

Espera-se, com o presente trabalho averiguar se as enzimas digestivas

de A. gemmatalis são oriundas do próprio inseto ou se os microrganismos

participam dessa produção, ao ponto de afetar a atividade dessas enzimas e

os parâmetros biológicos desse inseto. Essa hipótese foi testada utilizando

larvas de A. gemmatalis criadas com dieta artificial controle (sem antibiótico) e

adicionada de antibiótico. Foi avaliada a percentagem de inibição da atividade

enzimática no trato intestinal desses insetos usando diversos substratos

protéicos, polissacarídeos e lipídicos. Os parâmetros de desenvolvimento

larval pós-embrionário e a influência na fisiologia do inseto também foram

considerados.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram realizados no Laboratório de Enzimologia,

Bioquímica de Proteínas e Peptídeos do Instituto de Biotecnologia - BIOAGRO

da Universidade Federal de Viçosa.

2.1. Dieta artificial

A dieta artificial utilizada para a criação dos insetos foi desenvolvida por

HOFFMAN-CAMPO et al. (1985), autoclavada e estocada a 4°C. Todos os

reagentes foram adquiridos da Sigma – Aldrich Química Brasil (São Paulo, SP,

Brasil), exceto o ácido ascórbico e o nipagin, os quais foram obtidos da Synth-

LabSynth (São Paulo, SP, Brasil). O feijão, o germe de trigo, a proteína de soja,

o levedo de cerveja e a solução vitamínica foram obtidos no mercado local.

2.2. Teste in vitro dos antibióticos sobre a microbiota intestinal

Antibióticos foram testados para avaliar a sensibilidade da microbiota

intestinal e determinar quais seriam os mais efetivos na eliminação dos

microrganismos. Foi utilizada a técnica de disco de difusão em meio sólido,

também chamada de antibiograma, onde 100 µL de extrato intestinal de A.

gemmatalis no 5° instar foram inoculados em meio Luria-Bertaini (LB) e discos

contendo antibióticos com concentrações conhecidas foram aplicados de

acordo com as recomendações do fabricante (Oxoid Unipath Limited,

Basingstoke, Hamphire, United Kingdom), em câmara de fluxo lâminar. Os

antibióticos testados foram: espiramicina (100µg), espectomicina (10µg),

norfloxacina (2µg), nitrofurantoína (50µg), furazolidona (15µg), sulfato de

colistina (10µg), neomicina (10µg), cefalotina (30µg), cefotaxima (30µg),

vancomicina (30µg), cefoxitina (30µg), penicilina G (10µg), estreptomicina

(10µg), tetraciclina (30µg), ácido nalidíxico (30µg), cloranfenicol (30µg),

imipenema (10µg), gentamicina (10µg), perfloxacina (5µg), oxacilina (1µg),

ampicilina (10µg), eritromicina (15µg). As placas foram incubadas em duplicata

por 24h a 30°C. Os halos de inibição formados ao redor dos discos de

antibióticos foram medidos em milímetros, analisados quanto ao grau de

sensibilidade ou resistência utilizando a tabela de interpretação do diâmetro de

halo de diferentes antibióticos (MADIGAN et al., 2000) e representados por R

(Resistente), I (Intermediário) e S (Sensível).

2.3. Tratamento dos insetos

O experimento foi realizado com três tratamentos diferentes, utilizando

os antibióticos que foram mais eficazes no teste in vitro. Os antibióticos foram

adicionados à dieta artificial durante seu preparo: tetraciclina solução estoque

10 mg/ mL (tratamento 1), cloranfenicol solução estoque 5 mg/ mL (tratamento

2) e uma mistura de tetraciclina, cloranfenicol e ampicilina solução estoque 5

mg/ mL (tratamento 3). Os tratamentos eram constituídos de seis

concentrações finais diferentes de cada antibiótico (0, 30, 40, 50, 60 e 70 µg/

mL). Após a eclosão dos ovos, 100 lagartas foram coletadas para cada uma

das concentrações de cada tratamento e criadas individualmente dentro de

potes plásticos, em câmaras climatizadas a 25 °C, com umidade relativa de 60

± 10% e fotoperíodo de 14 horas. Toda manipulação da dieta e lagartas foram

realizadas em câmaras de fluxo laminar.

TABELA 1-

Volume dos antibióticos utilizados nos três tratamentos testados

Volume de antibiótico (mL)

Concentração final (µg/ mL) de

antibiótico em 500 mL de dieta

Tetraciclina

Cloranfenicol Ampicilina

0 0 0 0

30 1,5 3 3

40 2,0 4 4

50 2,5 5 5

60 3,0 6 6

70 3,5 7 7

2.4. Detecção de microrganismos

Cinco lagartas de cada tratamento foram selecionadas no 5º instar,

colocadas a -20 °C para a diminuição de suas atividades vitais e,

posteriormente, processadas em câmara de fluxo laminar, onde foram

submetidas à desinfecção superficial em etanol 70 % (v/v) seguida por duas

lavagens em água destilada estéril. As lagartas foram dissecadas e os tratos

digestivos obtidos foram mergulhados em solução salina 0,85% estéril, onde

foram homogenatos. Para a contagem das unidades formadoras de colônia

(UFCs), diluições seriadas foram realizadas, em 900 μL de solução salina 0,85

% estéril e 100 μL destas diluições foram plaqueadas no meio Luria-Bertaini

(LB), composto por 10 g de triptona bacteriológica, 5 g de extrato de levedura,

10 g de cloreto de sódio e 15 g de ágar em 1000 mL de água destilada e no

meio ágar caseinato de cálcio segundo Frazier e Rupp modificado (Merck) para

detecção de bactérias proteolíticas. O meio caseinato de cálcio é indicador de

proteólise, ou seja, bactérias que produzem proteases extracelulares formam

um halo de clarificação ao redor de suas colônias, indicando que houve

degradação do caseinato. As placas foram incubadas em triplicata a 30 °C, por

24 horas.

2.5. Análises microscópicas

As imagens de estereomicroscopia foram obtidas dos tratos intestinais

de lagartas no 5º instar criadas com dieta sem a adição de antibiótico e com

dieta adicionada de tetraciclina 70 µg/ mL. Os intestinos foram dissecados em

solução fisiológica 0,85% em estereomicroscópio e tiveram seus intestinos

transferidos para solução fixadora de paraformaldeido a 4% em tampão fosfato

0,1 M pH 7,2 e deixados “overnight”. A seguir, os intestinos foram desidratados

em uma série crescente de álcool (70%, 80%, 90%, 95%), sendo deixados por

10 minutos em cada solução. Para a realização da microscopia eletrônica de

varredura, os intestinos foram transferidos para HMDS (hexamethyldisilazane)

por 5 min, secados ao ar livre, recobertas com uma camada de 20 nm de ouro

e analisados em microscópio de varredura JEOL. Para a microscopia de luz,

após a desidratação em etanol 95% as amostras foram transferidas para

embebição em resina metacrilato e deixados “overnight”. Foi feita a substituição

de resina de embebição pela resina de inclusão. Os intestinos foram então

transferidos para suportes para endurecimento por 24 h. Os blocos foram

colocados em suportes e cortados em micrótomo. A espessura dos cortes foi

de 5 µm. Os cortes foram pescados em lâminas, deixados secar ao ar por

cerca de 12 h. Após esse período as lâminas foram coradas com Hematoxilina

e Eosina por 7 e 2 minutos, respectivamente.

2.6. Obtenção do extrato enzimático

Para análise do efeito dos antibióticos, intestinos de lagartas no 5° instar

de todos os tratamentos foram extraídos após dissecação em presença de HCl

-3

M a 4 ºC. Para avaliação do perfil de atividade enzimática ao longo do

desenvolvimento, tratos intestinais foram extraídos de larvas de 1°, 2°, 3°, 4°,

5°, 6° instar e pré-pupa em presença de HCl 10

-3

M a 4°C. Os extratos

enzimáticos foram obtidos através do rompimento celular resultante de nove

ciclos de congelamento em nitrogênio líquido e descongelamento em banho-

maria a 37 ºC, conforme metodologia utilizada por OLIVEIRA et al., (2005).

Após os ciclos, frações de 1 mL dos extratos foram centrifugadas em tubos

plásticos de 2 mL com tampas a 10.000 g por 30 min a 4 ºC. Os sobrenadantes

contendo o material solúvel foram retirados e mantidos a -18ºC para análises

posteriores.

2.7. Ensaios enzimáticos e de proteína

A concentração de proteína foi determinada segundo a metodologia de

BRADFORD (1976), usando soluções de albumina sérica bovina (BSA) de 0 a

0,2 mg/ mL como padrão.

A atividade proteolítica foi determinada usando azocaseína como

substrato na concentração final de 2 % (p/v). O tempo de incubação foi de 30

min, o qual foi interrompido por adição de ácido tricloroacético 10 % (p/v). Após

a interrupção, as amostras foram centrifugadas a 8.000 g por 5 min para

remover a proteína precipitada e NaOH 1 M foi adicionado ao sobrenadante e a

atividade, então, foi determinada a 440 nm de acordo com KUNITZ, (1947)

modificado por OLIVEIRA et al. (1993). A atividade amidásica foi determinada

como descrito por ERLANGER et al. (1961), utilizando N-α-benzoil-L-Arg-p-

nitroanilida (L-BApNA) como substrato na concentração final de 0,5 mM em

tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 8,2 a 25 °C) contendo 20 mM CaCl

e 1 % de

dimetilformamida (DMF, v/v). A atividade de cisteíno protease foi determinada

como citado para a atividade amidásica com adição de inibidor de tripsina-like,

benzamidina na concentração de 1,0 mM. A atividade esterásica foi

determinada utilizando N-α-p-tosyl-L-Arg metil ester (L-TAME; 0,10 mM) como

substrato em tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 8,2) (HUMMEL, 1959).

Os ensaios de atividade de carboidrases sobre os açúcares redutores,

melibiose, lactose, manose e maltose (todos na concentração 40 mM) foram

realizados por meio da medida de formação de glicose, pelo método da glicose

oxidase (STENBERG et al., 1970), utilizando um kit comercial (BIOCLIN).

Ensaios para a atividade de carboidrases foram realizados com os açúcares

não redutores rafinose (40 mM), xilana (1 %), carboximetilcelulose (CMC) (1 %)

e pectina (1 %) com o uso do reagente dinitrossalicilato (DNS) (MILLER, 1956).

A atividade de amilase foi determinada utilizando-se o kit enzimático (BIOCLIN)

baseado na metodologia de CARAWAY (1959) modificada.

A atividade de lipase foi determinada com o kit enzimático (BIOCLIN),

utilizando tributirato ditiopropanol como substrato, segundo a metodologia de

CHERRY & CRANDALL (1932) modificada. Todos os ensaios enzimáticos

foram realizados numa série de três repetições.

2.8. Análise da performance do inseto

O experimento foi montado em delineamento de blocos ao acaso, sendo

que cada concentração de antibiótico foi testado através de cinco repetições,

cada uma constituindo-se de grupos de 10 lagartas individualizadas. Dietas

com e sem antibióticos foram oferecidas aos insetos de acordo com cada

tratamento estabelecido. O estágio pós-embrionário e os parâmetros

fisiológicos de cada lagarta foram acompanhados até a fase adulta (PILON et

al., 2006). As lagartas foram mantidas em condições de temperatura a 25°C e

a pesagem das lagartas foi feita diariamente em balança analítica.

2.9. Análises estatísticas

A relação entre efeito inibitório da atividade e concentração-resposta foi

submetida à análise de regressão, por intermédio do procedimento PROC

PROBIT (SAS Institute, 1989. As análises do perfil enzimático e da

performance do inseto foram realizadas utilizando regressão do programa

SIGMA PLOt (versão 10.0).

3. RESULTADOS

3.1. Antibiograma

A eficiência dos antibióticos em reduzir o crescimento bacteriano do

extrato intestinal de A. gemmatalis foi avaliada in vitro e os resultados estão

apresentados na tabela 2. Dos 22 antibióticos testados, 10 foram capazes de

inibir o crescimento bacteriano. Três mais efetivos foram selecionados,

tetraciclina, cloranfenicol e ampicilina, devido à ação bactericida e a facilidade

de compra. Depois foram administrados às larvas de A. gemmatalis através de

três tratamentos diferentes: tetraciclina, cloranfenicol e uma combinação de

antibióticos (tetraciclina + cloranfenicol + ampicilina) nas concentrações de 0,

30, 40, 50, 60, 70 µg/ mL. Os antibióticos foram adicionados à dieta artificial e

seus efeitos no número de bactérias totais, proteolíticas e no desenvolvimento

do inseto foram avaliados.

3.2. Efeitos dos antibióticos sobre a microbiota intestinal

O resultado do efeito dos antibióticos sobre a microbiota total aeróbica

cultivável, determinado pela contagem do número de unidades formadoras de

colônia por mg de intestino, está representado na figura 1A. Dos três

tratamentos avaliados, o tratamento com tetraciclina foi o que obteve melhor

desempenho na redução do número de bactérias viáveis, quando comparado

aos tratamentos com cloranfenicol e a combinação de tetraciclina +

cloranfenicol + ampicilina. A contagem de bactérias totais variou entre 0,704 x

a 0,536 UFC x mg

-1

de intestino no tratamento com cloranfenicol, entre

1,144 x 10

a 0,376 UFC x mg

-1

de intestino no tratamento com a combinação

de antibióticos e entre 0,692 x 10

a 0,204 UFC x mg

-1

de intestino no

tratamento com tetraciclina. Nos três tratamentos nota-se um grande número

de bactérias presentes no trato intestinal de A. gemmatalis quando exposta a

dieta sem antibiótico. Porém essa população diminui com o aumento da

concentração do antimicrobiano, principalmente nas concentrações superiores

a 50 µg/ mL. No tratamento com tetraciclina as concentrações que

apresentaram melhor efeito inibitório foram a partir de 30 µg/ mL, alcançando

uma redução significativa, quando comparada ao tratamento sem antibiótico.

TABELA 2

Efeito dos antibióticos no crescimento de bactérias cultiváveis presentes no

intestino de Anticarsia gemmatalis

Antibióticos Concentração por disco

(µg)

Inibição do crescimento

bacteriano

Ácido nalidíxico 30 R

Ampicilina 10 S

Cefalotina 30 R

Cefotaxima 30 R

Cefoxitina 30 R

Cloranfenicol 30 S

Eritromicina 15 S

Espectomicina 10 R

Espiramicina 100 S

Estreptomicina 10 R

Furazolidona 15 I

Gentamicina 10 R

Imipemena 10 S

Neomicina 10 R

Nitrofurantoína 50 S

Norfloxacina 2 R

Oxacilina 1 R

Penicilina G 10 I

Perfloxacina 5 R

Sulfato de

colistina

10 R

Tetraciclina 30 S

Vancomicina 30 S

R= resistente

S= sensível

I= intermediário

Concentração de antibióticos (mg x mL

-1

)

0 20406080

UFC Proteolítica x mg

-1

intestino (Escala Log)

0.001

0.01

0.1

100

1000

10000

FIGURA 1- Número médio de bactérias totais (A) e proteolíticas (B)

encontradas no trato intestinal de larvas de Anticarsia gemmatalis criadas com

diferentes concentrações de tetraciclina (●), cloranfenicol (○) e tetraciclina,

cloranfenicol e ampicilina (▼).

Concentração de antibióticos (μg x mL

-1

)

0 20406080

UFC Total x mg

-1

intestino (Escala Log)

0.01

0.1

100

1000

10000

Também foi avaliada a eficiência dos antibióticos na diminuição do

número de bactérias produtoras de proteases em meio indicador agar

caseinato de cálcio. A figura 1B compara o número de bactérias proteolíticas

encontradas nos três tratamentos. A contagem de bactérias proteolíticas variou

entre 400 a 0,12 UFC x mg

-1

de intestino utilizando cloranfenicol, entre 520 a

0,16 UFC x mg

-1

de intestino utilizando a combinação de antibióticos e 280 a

0,004 UFC x mg

-1

de intestino utilizando tetraciclina. Deste modo verificou-se

que todos os antibióticos administrados foram eficientes na inibição do

crescimento de bactérias proteolíticas. Porém a tetraciclina obteve melhor

resposta independente da concentração testada.

3.3. Avaliação da presença de bactérias no trato intestinal através de

microscopia

A análise microscópica das amostras obtidas do intestino de A.

gemmatalis mostrou a presença de um abundante número de bactérias, porém

com tipos morfológicos limitados. O tipo bacteriano predominante foram cocos,

os quais estavam arranjados isolados, aos pares e em cadeias curtas. Os

bacilos também estavam presentes em menor número. Não foi visualizada a

presença de espiroquetas, fungos e protozoários.

A microscopia eletrônica de varredura mostrou a presença de cocos

aderidos ao epitélio intestinal assim como no lúmen do intestino (Figura 2). Nos

dois tratamentos estudados percebe-se a presença de microbiota associada ao

intestino da A. gemmatalis, com uma abundância maior verificada na parte

posterior do intestino médio. Poucas bactérias foram observadas no intestino

de lagartas criadas com dieta acrescentada de tetraciclina. O resultado obtido

através da microscopia de luz reforça tanto a microscopia eletrônica de

varredura como a contagem de UFC. Nota-se a presença de um número

variável de bactérias no lúmen intestinal, sendo esse número reduzido em

lagartas criadas com dieta com tetraciclina.

FIGURA 2. Micrografias eletrônicas de varredura e de luz do intestino de larvas

de Anticarsia gemmatalis. (A) Epitélio do intestino de lagartas criadas em dieta

artificial na ausência de antibiótico, barra = 30 µm; (B) lúmen intestinal de

lagartas criadas em dieta artificial na ausência de antibiótico, barra = 20 µm;

de tetraciclina, barra = 10 µm e 20 µm, respectivamente; (E) lúmen intestinal de

lagartas criadas em dieta artificial na ausência de antibiótico (400x), (F) lúmen

e parte do epitélio intestinal de lagartas criadas em dieta artificial com 70µg/ mL

de tetraciclina (100x), barra = 20 µm. As setas mostram a presença de

bactérias.

E F

3.4. Efeito dos antibióticos nas atividades enzimáticas

O efeito dos antibióticos sobre as enzimas digestivas de A. gemmatalis

foi avaliado nos três tratamentos realizados e expresso em porcentagem de

inibição. Foram utilizados 14 diferentes substratos para averiguar a

porcentagem de inibição das atividades de proteases, lipases e carboidrases

provenientes de lagartas no 5º instar tratadas com diferentes concentrações

dos antimicrobianos. No tratamento com cloranfenicol e com a combinação de

antibióticos todos os substratos sofreram hidrólise, porém em todos os casos a

análise de regressão mostrou que não houve diferença significativa (P > 0,05)

entre as porcentagens de inibição nos diferentes níveis de concentração do

antibiótico, indicando desse modo que esses tratamentos não afetaram as

atividades das enzimas digestivas de A. gemmatalis (Tabela 3).

Na presença de tetraciclina, não houve diferença significativa (P > 0,05)

entre as concentrações de antibiótico e a porcentagem de inibição da atividade

sobre os substratos amido, melibiose, rafinose, carboximetilcelulose, pectina, L-

TAME e L-BApNA com benzamidina (Tabela 4). Já a inibição das atividades

sobre lactose, maltose, manose e xilana foi significativa (P < 0,01), porém

esses resultados foram altamente variáveis, não havendo uma relação

proporcional entre a inibição e o aumento da dose de tetraciclina (Tabela 4). A

atividade proteolítica total apresentou uma inibição crescente com o aumento

da concentração de tetraciclina, conforme ocorreu com as atividades amidásica

e lipásica, porém os resultados das análises estatísticas não foram

significativos (χ

= 44,09; g.l. erro= 3; P < 0,0001).

Constatou-se uma inibição significativa para a atividade amidásica (χ

7,32; g.l. erro= 3; P = 0,06) e atividade lipásica (χ

= 5,92; g.l. erro= 3 ; P = 0,11)

no tratamento com tetraciclina (Figura 3 e 4). Indicando uma relação dose

dependente, uma vez que o aumento da concentração de tetraciclina aumenta

o efeito inibitório da atividade. Os resultados de inibição da atividade

enzimática em função da concentração-resposta foram utilizados para estimar

as CL

do antibiótico em questão através da análise de logística do Probit. A

encontrada para as atividades proteásica, amidásica e lipásica foi de

56,18, 43,95 e 52,18 µg/ mL respectivamente. Das concentrações de

tetraciclina avaliadas a que obteve maior efeito inibitório foi a concentração de

70 µg/ mL.

TABELA 3

Porcentagem de inibição das atividades enzimáticas detectadas no trato

intestinal de larvas de Anticarsia gemmatalis de 5º instar criadas com dieta

adicionadas de antibiótico

Concentração de cloranfenicol (µg x mL

-1

)

Substratos 0 30 40 50 60 70

Azocaseína 51,3 70,7 21,3 76,4 66,7 54,9

L-BApNA 65,9 48,6 9,1 73,6 25,3 7,3

L-TAME 56,5 64,0 46,4 49,6 53,0 7,52

L-BApNA +

Benzamidina

50,7 87,5 48,6 74,6 91,6 44,1

Tributirato

ditiopropanol

96,7 33,8 54,2 90,4 21,0 29,6

Amido 53,6 71,9 34,0 32,4 62,4 16,5

Lactose 70,9 68,4 21,6 81,7 63,7 56,8

Maltose 41,3 45,5 27,4 45,7 12,5 16,8

Manose 76,1 44,2 10,5 49,2 46,9 17,5

Melibiose 77,5 70,8 23,0 81,4 60,8 54,3

Pectina 53,8 35,0 48,3 59,3 49,4 38,0

Rafinose 40,6 33,4 18,4 45,1 26,0 20,8

Xilana 88,6 65,6 41,1 53,4 67,1 40,0

CMC 83,8 60,8 55,2 77,8 77,3 15,8

Concentração de T+C+A (µg x mL

-1

)

Substratos 0 30 40 50 60 70

Azocaseína 27,0 80,6 30,1 88,1 14,7 73,3

L-BApNA 23,0 75,5 82,2 77,5 10,2 48,5

L-TAME 47,5 92,5 88,0 82,0 29,5 78,9

L-BApNA +

Benzamidina

37,5 77,4 85,8 89,5 32,3 65,2

Tributirato

ditiopropanol

47,7 90,7 80,5 98,4 64,2 76,3

Amido 30,4 87,4 81,7 85,0 24,2 71,7

Lactose 51,4 85,5 87,2 96,8 55,6 82,3

Maltose 47,7 82,9 85,9 92,2 34,5 71,5

Manose 46,3 82,3 88,1 93,7 51,3 69,0

Melibiose 41,6 88,0 89,3 96,8 55,6 80,8

Pectina 26,1 77,5 78,3 86,5 28,6 65,9

Rafinose 36,1 73,5 79,2 80,6 18,0 59,8

Xilana 39,5 76,8 78,8 88,4 13,6 62,8

CMC 36,5 62,6 84,5 74,8 19,8 64,5

T= tetraciclina

C= cloranfenicol

A= ampicilina

CMC= carboximetilcelulose

TABELA 4

Porcentagem de inibição das atividades enzimáticas detectadas no trato

intestinal de larvas de Anticarsia gemmatalis de 5º instar criadas com dieta

artificial adicionada de tetraciclina

Concentração de tetraciclina (µg x mL

-1

)

Substratos 0 30 40 50 60 70

Azocaseína 9,5 21,6 38,8 64,3 60,6 75,6

L-TAME 67,9 33,2 27,6 42,0 64,4 64,3

L-BApNA +

Benzamidina

62,0 63,0 37,9 74,5 69,6 63,4

Amido 56,9 33,8 46,3 57,0 78,5 71,3

Lactose 42,9 17,9 51,0 59,6 70,2 80,9

Maltose 89,0 42,5 24,9 46,6 72,1 72,4

Manose 80,8 26,8 53,2 54,0 73,5 63,5

Melibiose 81,3 50,9 48,9 62,5 78,6 86,7

Pectina 75,5 27,8 70,9 42,0 88,5 77,5

Rafinose 62,1 41,4 30,2 42,4 73,1 78,8

Xilana 74,3 24,0 67,2 61,1 82,9 76,6

CMC 71,9 53,0 61,3 58,0 73,2 78,3

CMC= carboximetilcelulose

FIGURA 3- Inibição da atividade amidásica em função da concentração de

tetraciclina. Cada ponto representa a média de três repetições contendo 5

larvas de 5º instar cada (n = 3; χ

= 7,32; g.l. erro= 3; P = 0,06).

FIGURA 4- Inibição da atividade lipásica em função da concentração de

tetraciclina. Cada símbolo representa a média de três repetições contendo 5

larvas de 5º instar cada (n= 3; χ

= 5,92; g.l. erro= 3 ; P = 0,11).

Concentração de tetraciclina (μg/ mL)

20 30 40 50 60 70 80

Inibição da atividade amidásica (%)

Concentra

ão de tetraciclina

(

/ mL

)

20 30 40 50 60 70 80

Inibição da atividade lipásica (%)

= 0,98; F= 22,5; P= 0,15

= 0,99; F= 75,5; P< 0,001

Os perfis das atividades enzimáticas foram avaliadas durante todo o

ciclo larval até a fase pré-pupa em lagartas criadas com dieta controle e dieta

adicionada de tetraciclina 70 µg/ mL. Os instars foram representados como dias

de desenvolvimento, sendo que os períodos entre os dias 0 e 2; 2 e 5; 5 e 9; 9

e 12; 12 e 15; 15 e 18; 18 e 21 correspondem respectivamente aos 1º; 2º; 3º;

4º; 5º; 6º instares e pré-pupa. O efeito da tetraciclina foi significativamente

refletido na produção de enzimas que hidrolisam azocaseína, L-BApNA, e

tributirato ditiopropanol (Figuras 5, 6, 7). As atividades foram afetadas

principalmente nos últimos instares de desenvolvimento (4º, 5º e 6º instar).

Verificou-se que os picos máximos das atividades ocorreram entre o 12º e 18º

dia de desenvolvimento, para larvas criadas com dieta controle. Entretanto,

para larvas alimentadas com tetraciclina não foi observado um pico

máximo de atividade, ou seja, o perfil enzimático manteve-se constante

ao longo do desenvolvimento do inseto.

FIGURA 5- Perfil da atividade proteolítica do extrato intestinal de Anticarsia

gemmatalis ao longo do desenvolvimento larval, utilizando azocaseína como

substrato. Os insetos foram criados com dieta sem antibiótico (●) e dieta

adicionada de tetraciclina 70 µg/ mL (○). Cada símbolo representa a média de

três repetições contendo 5 lagartas de 5º instar cada (n= 3).

Dias após a eclosão

0 5 10 15 20 25

Absorvância (440nm)/mg proteína

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

= 0,83 F= 10,29; P< 0,05

= 0,10 F= 0,58; P= 0,47

FIGURA 6- Perfil da atividade amidásica do extrato intestinal de Anticarsia

gemmatalis ao longo do desenvolvimento larval, utilizando L-BApNA como

substrato. Os insetos foram criados com dieta sem antibiótico (●) e dieta

adicionada de tetraciclina 70 µg/ mL (○). Cada símbolo representa a média de

três repetições contendo 5 lagartas de 5º instar cada (n= 3).

FIGURA 7- Perfil da atividade lipásica do extrato intestinal de Anticarsia

gemmatalis ao longo do desenvolvimento larval, utilizando tributirato

ditiopropanol como substrato. Os insetos foram criados com dieta sem

antibiótico (●) e dieta adicionada de tetraciclina 70 µg/ mL (○). Cada símbolo

representa a média de três repetições contendo 5 lagartas de 5º instar cada (n=

3).

Dias após a eclosão

0 5 10 15 20 25

V, nM.s

-1

/ mg proteína

Dias após a eclosão

0 5 10 15 20 25

UI/ mg proteína

100

120

= 0,85; F= 11,78; P<0,05

= 0,29; F= 2,14; P= 0,20

= 0,97; F= 33,86; P< 0,01

= 0,17; F= 1,02; P= 0,35

3.5. Efeito dos antibióticos na performance do inseto

A redução da microbiota de A. gemmatalis não afetou significativamente

os seguintes parâmetros fisiológicos analisados, duração da fase larval (12,89

± 1,09: F= 2,21; g.l.= 2; P= 0,32) (Figura 8), transformação em pupa (39,5 ±

5,8: F= 8,38; g.l.= 2; P= 0,10) (Figura 9). Verificou-se que o ganho de peso

larval foi mais rápido nas concentrações acima de 50 µg x mL

-1

de tetraciclina

(Tabela 5). Como conseqüência ocorreu uma pupação prematura de

aproximadamente 70% das larvas criadas com tetraciclina no 15º dia (Tabela

5). A pupação prematura afetou a sua emergência, dessa forma observou-se

diferença significativa na viabilidade pupal entre larvas controle e larvas criadas

com antibiótico (Tabela5). Observou-se um número maior de mortalidade entre

os insetos alimentados com tetraciclina do que nos insetos controle (Tabela 5).

Verificou-se uma diferença significativa na análise de variância entre o controle

e as diferentes concentrações de tetraciclina avaliadas (F= 50,32; g.l.= 12; P <

0,0001). Realizou-se, em seguida, o teste de Scheffé para avaliação do

contraste entre dois grupos, o controle (sem tetraciclina) e a média das

diferentes concentrações de tetraciclina utilizadas. A mortalidade observada

com a utilização de tetraciclina (19 ± 5,7) foi significativamente maior que a

observada no controle sem tetraciclina (4 ± 0,5).

Concentração de tetraciclina (μg x mL

-1

)

0 20406080

Duração do ciclo larval (dias)

10.5

11.0

11.5

12.0

12.5

13.0

13.5

14.0

FIGURA 8- Variação no tempo de duração do ciclo larval em função da

concentração de tetraciclina administrada as larvas de Anticarsia gemmatalis

após a eclosão dos ovos.

Concentração de tetraciclina (μg x mL

-1

)

0 20406080

Transformação em pupa (%)

FIGURA 9- Variação na transformação em pupa em função da concentração de

tetraciclina administrada as larvas de Anticarsia gemmatalis após a eclosão dos

ovos.

= 0,76; F=2,21; P= 0,32

= 0,92; F= 8,38; P= 0,10

TABELA 5

Parâmetros biológicos medidos ao longo dos dias do ciclo de vida de Anticarsia gemmatalis alimentada com dieta

artificial adicionada de diferentes concentrações de tetraciclina.

n= número de larvas (50),

a,b,c

= indicam a diferença entre o peso das larvas e da viabilidade das pupas de A. gemmatalis criadas com diferentes

concentrações de tetraciclina durante o ciclo larval, teste Tukey

5% (P<0,05)

Tetraciclina

(µg x mL

-1

)

Peso larval (g) Número de pupas Emergência

(%)

Mortalidade

5 dias 10 dias 15 dias 7 dias 15 dias 5 dias 10 dias 15 dias 20 dias

0 0,013

0,112

0,119

0 15 80

6 8 8 8

30 0,004

0,054

0,106

0 13 40

19 22 23 28

40 0,007

0,138

0,140

0 18 62

4 7 9 17

50 0,010

0,193

0,064

0 30 66

2 2 3 13

60 0,018

0,128

0,076

3 37 60

7 8 11 25

70 0,032

0,149

0,062

6 40 68

4 5 6 16

4. DISCUSSÃO

Enzimas que contribuem para a hidrólise de polissacarídeos são vistas

como elementos-chave para a nutrição de insetos que se alimentam de

material vegetal (ERTHAL et al., 2004). Assim, muitos trabalhos são realizados

sobre a composição da microbiota intestinal e seu papel na degradação de

carboidratos. Porém, pouco se conhece sobre a contribuição dessas bactérias

para o metabolismo digestivo de proteínas, lipídeos e no desenvolvimento e

fisiologia do inseto. A. gemmatalis é um inseto polífago, considerada uma

importante praga desfolhadora da cultura da soja (GALLO et al.,2002). As

folhas de soja são ricas em carboidratos, proteínas e lipídeos, além de conter

microrganismos do ambiente. O nosso trabalho avaliou o papel potencial da

microbiota intestinal quanto à produção de enzimas hidrolíticas no processo

digestivo e no desenvolvimento de A. gemmatalis, utilizando administração oral

de antibióticos para a supressão do crescimento de microrganismos. Vale

ressaltar que esse trabalho é um dos poucos que investigou a função da

microbiota em um inseto-praga.

O uso de antibióticos para a eliminação de microrganismos intestinais de

insetos tem sido frequentemente utilizado devido à conveniência e o baixo

custo desse método. Além disto, a esterilização via administração oral de

antimicrobianos facilita estudos fisiológicos e das relações nutricionais entre a

microbiota e seu hospedeiro. Entretanto, a composição da microbiota intestinal

é extremamente variável e a eficácia dos antibióticos na eliminação das

bactérias varia consideravelmente entre as espécies (JOHNSON et al., 2004).

Desta forma, torna-se necessário um estudo preliminar do efeito que

determinados antimicrobianos irão exercer sobre o conjunto de microrganismos

presentes no trato intestinal do hospedeiro e a dosagem correta a fim de

minimizar efeitos deletérios. Nesse estudo foi realizada uma triagem afim de

verificar qual o antimicrobiano atuaria melhor na eliminação da microbiota

intestinal de A. gemmatalis. Nossos resultados demonstraram que, tetraciclina,

cloranfenicol e ampicilina foram os antibióticos mais efetivos. Dentre os

testados, todos reduziram significativamente o número de bactérias totais e

proteolíticas, porém a tetraciclina obteve um melhor desempenho sendo capaz

de inibir substancialmente bactérias proteolíticas cultiváveis sendo portanto, o

antibiótico de escolha. Vários trabalhos utilizaram tetraciclina para a eliminação

da microbiota (KELLEN et al., 1981; KAMBHAMPATI et al., 1993; NOGGE &

GERRESHEIM, 1992; GIRIN & BOULETREAUN, 1995; WILKINSON, 1998;

HOERAUF et al., 1999). A escolha da tetraciclina deve-se à sua atuação na

síntese protéica, o que propicia esse antibiótico ter um amplo espectro de ação.

Além disso, a tetraciclina é muito utilizada em experimentos nos quais se

deseja eliminar microorganismos intracelulares, devido à sua capacidade de

penetrar estruturas como bacteriócitos, onde se localizam simbiontes

intracelulares.

A presença de uma diversidade limitada de microrganismos no intestino

de A. gemmatalis, observada pela microscopia, pode ser explicada pela

estrutura do seu trato digestivo. A relação entre estrutura e colonização

microbiana considera que insetos que possuem um trato digestivo linear e

simples provavelmente possuem uma menor diversidade microbiana do que

aqueles que possuem compartimentos mais complexos, como é o caso dos

cupins (TANADA & KAYA, 1993). Foram observadas células bacterianas

aderidas à membrana peritrófica e muitas no lúmen intestinal. Outros trabalhos

de microscopia, com insetos que não possuem bacteriócitos, reportaram a

presença de bactérias aderidas a cutículas do intestino posterior (HUNT &

CHARNLEY, 1981), incorporadas dentro da matriz peritrófica (MEAD et al.,

1988) ocupando o lúmen intestinal e colonizando o epitélio do intestino

posterior (MURPHY et al., 1994).

Sabe-se que não existem estruturas especializadas, usualmente

associadas a microrganismos, no intestino de larvas de Lepidopteras e em

muitos desses herbívoros o fluxo alimentar é rápido dificultando a permanência

de uma microbiota estável. Consequentemente, acredita-se que

microrganismos intestinais têm pouca participação na nutrição e digestão

desses insetos (DILLON & DILLON, 2004). Porém, no presente trabalho foi

observado que, na ausência da microbiota, a atividade de serino protease e de

lipase foram significativamente inibidas. A avaliação do perfil dessas atividades

ao longo do desenvolvimento da lagarta da soja reforça a influência de

bactérias sobre a síntese dessas enzimas. Embora alguns estudos a respeito

das enzimas digestivas da lagarta da soja tenham sugerido que esse inseto

sintetize suas próprias proteases (OLIVEIRA et al., 2005; XAVIER et al., 2005),

nenhum desses estudos considerou a possibilidade de que a atividade

proteásica possa ser de origem bacteriana. O presente estudo é o primeiro que

enfoca essa possibilidade. Esses resultados sugerem que bactérias presentes

no trato intestinal da lagarta da soja influenciem a produção de proteases e

lipases extracelulares contribuindo, dessa forma, com o processo digestivo

desse inseto. Diferente resultado foi obtido por WALKER et al. (1999) que não

verificaram uma redução significativa na atividade proteolítica do sistema

digestivo de Deroceras reticulatum, quando comparados indivíduos

alimentados com dieta artificial adicionada e livre de antibióticos. Uma das

hipóteses sugeridas pelos autores, é que tenha ocorrido um aumento na

síntese de proteases pelo próprio D. reticulatum, mascarando a diminuição de

atividade proteásica causada pela ausência da microbiota. Outra hipótese seria

o aumento da atividade proteolítica intracelular, ocasionado pela elevação da

taxa de endocitose após a morte das células bacterianas.

Bactérias capazes de degradar celulose, pectina, xilana e amido foram

isoladas do trato intestinal de A. gemmatalis, criadas com dieta artificial e folhas

de soja, durante um estudo preliminar. Porém as atividades enzimáticas sobre

esses substratos não foram afetadas significativamente quando larvas desse

inseto foram criadas com dieta artificial controle e com dieta adicionada com

antibióticos. Esses resultados sugerem várias possibilidades: a primeira é que

embora bactérias que produzam enzimas que degradam carboidratos estejam

presentes, elas têm pouca importância no processo digestivo de A. gemmatalis,

já que a digestão de celulose em insetos é rara, porque o fator da dieta que

limita o crescimento dos herbívoros é a qualidade protéica e não o tipo de

carboidrato presente. Assim, a digestão de celulose é improvável por ser

desvantajosa para o inseto, que pode encontrar requerimentos nutricionais

mais fáceis de serem digeridos (MELLO & SILVA-FILHO, 2002). A segunda

hipótese relaciona-se à composição da dieta artificial oferecida ao inseto, que é

composta principalmente por proteínas e vitaminas, o que pode ter inibido a

expressão de carboidrases e estimulado um mecanismo compensatório de

proteases e lipases devido ao substrato ingerido. E uma outra resposta estaria

relacionada a ação do antibiótico testado, ou seja, a tetraciclina pode não ser

efetiva contra bactérias produtoras de carboidrases.

A eliminação da microbiota cultivável do trato intestinal de A. gemmatalis

não afetou os parâmetros biológicos como duração da fase larval e

transformação em pupa. Entretanto, foram observados um aumento rápido no

peso larval, pupação prematura, inviabilidade pupal e uma mortalidade maior

entre os insetos tratados com tetraciclina do que entre os insetos controle. A

inibição da atividade proteolítica e amidásica pode ter contribuído para uma

deficiência na absorção de aminoácidos essenciais, acarretando em um

aumento da mortalidade. GENTA et al. (2006), trabalhando com larvas de

Tenebrio molitor, mostraram que a ausência da microbiota resultou em perda

de massa larval e pupação prematura. DOUGLAS et al. (2001) verificaram que

a mortalidade de afídeos aposimbiontes foi elevada, sugerindo que a ausência

de aminoácidos derivados de bactérias e a baixa taxa de assimilação destes

aminoácidos contribuem para o pobre crescimento desses insetos. Resultados

obtidos por ZUREK & KEDDIE (1996) mostram que, ao reduzirem a população

bacteriana no intestino de Periplaneta americana através de dieta artificial

adicionada de metronidazol, houve uma diminuição significativa na

concentração de ácidos graxos voláteis, a redução no ganho de peso do inseto

e o aumento do tempo de duração no ciclo de vida.

O conjunto desses dados mostram que, a atividade de serino protease,

lipase e alguns parâmetros biológicos da lagarta da soja foram afetadas pela

redução da microbiota. Isso sugere que bactérias intestinais fornecem enzimas

importantes para a digestão de proteínas e de lipídeos, contribuindo com o

processo digestivo e com o desenvolvimento de A. gemmatalis. Além do mais,

a inibição da atividade proteolítica verificada nesse trabalho mostra a

necessidade de isolamento, caracterização de bactérias proteolíticas e um

estudo bioquímico-cinético mais detalhado sobre as proteases por elas

produzidas, visando à complementação de pesquisas que buscam novas

técnicas de controle dessa praga.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CAPÍTULO II

CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS PROTEOLÍTICAS

ASSOCIADAS AO TRATO INTESTINAL DE Anticarsia

gemmatalis (LEPIDOPTERA)

CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS PROTEOLÍTICAS

ASSOCIADAS AO TRATO INTESTINAL DE Anticarsia gemmatalis

(LEPIDOPTERA)

RESUMO- A presença de bactérias intestinais têm sido reportada em várias

espécies de insetos. Muitos desses microrganimos contribuem com o processo

digestivo e nutricional do inseto, através do fornecimento de enzimas

digestivas, aminoácidos e vitaminas essenciais. Sabe-se que no intestino de

Anticarsia gemmatalis existe a presença de proteases e que provavelmente

esta seje a principal enzima envolvida na sua digestão. Com o objetivo de

conhecer se proteases também são oriundas da microbiota, espécies

bacterianas cultiváveis presentes no intestino da lagarta da soja que são

capazes de produzir proteases foram isoladas, identificadas e caracterizadas.

Doze bactérias proteolíticas foram isoladas de lagartas de quinto instar em

meio agar caseinato de cálcio em condições aeróbias e anaeróbias. A análise

por PCR-RFLP reuniu os 12 isolados em cinco grupos. Um isolado de cada

grupo foi selecionado para caracterizações posteriores. As seqüências do gene

16S rRNA e testes bioquímicos identificaram as bactérias como Bacillus

subtilis, Bacillus sp., Staphylococcus sp. e duas espécies de Enterococcus sp..

As atividades proteolíticas foram determinadas para todas as cinco espécies.

Quando se comparou a produção enzimática entre os isolados, verificou-se

uma diferença significativa (P < 0,01) na atividade, sobre todos os substratos.

Os isolados foram capazes de hidrolisar todos os substratos testados, exceto

Staphylococcus sp., que não degradou

L-BApNA e L-TAME, substratos

específicos de tripsina-like. O Enterococcus sp. mostrou maior atividade

proteolítica, porém Bacillus sp. e B. subtillis apresentaram melhor atividade

específica de serino e cisteíno protease. Esse trabalho fornece base para a

caracterização bioquímico-cinética de proteases de origem microbiana,

importantes para a complementação de estudos relacionados ao uso de

inibidores de proteases como método alternativo de controle dessa praga.

PALAVRAS-CHAVE: bactérias proteolíticas, proteases, caracterização

bioquímica, 16S rRNA, Anticarsia gemmatalis

1. INTRODUÇÃO

A ordem Lepidoptera é um grupo primariamente fitófago que engloba

mais de 150.000 espécies de insetos. Ela inclui algumas das mais danosas

pragas agrícolas e florestais do mundo, compreendendo espécies que superam

as medidas de controle existentes, como inseticidas sintéticos, inseticidas

microbianos e plantas hospedeiras geneticamente resistentes (SCOBLE, 1992).

Das enzimas envolvidas com o processo de digestão em Lepidopteras, o

grupo mais importante é o das proteases, que são classificadas em quatro

grupos, baseado no grupo funcional presente no sítio ativo: serino proteases,

aspártil proteases, cisteíno proteases e metalo proteases (TERRA & FERREIRA,

1994). Inibidores potentes contra quase todas as classes de proteases têm sido

descritos (POMPERMAYER et al., 2001; TIFFIN et al., 2001; FRANCO et al.,

2002). Alguns deles são naturalmente produzidos pelas plantas e estão

intimamente relacionados ao mecanismo de defesa contra a herbivoria. Porém,

os insetos utilizam diferentes modos para contornar os efeitos negativos dos

inibidores (JONGSMA & BOLTER, 1997), através do uso de proteases que não

são facilmente inibidas (PAULILLO et al., 2000), da degradação proteolítica dos

inibidores (GIRARD et al., 1998) e da aquisição de proteases insensíveis aos

inibidores (BRITO et al., 2001).

A utilização de genes que codificam inibidores de proteases para a

obtenção de plantas resistentes ao ataque de insetos é uma estratégia

promissora (JONGSMA & BOLTER, 1997). Porém, para que isso ocorra é

importante que a planta expresse uma combinação de inibidores que cubra o

espectro total de proteases intestinais. Por esse motivo, é fundamental o

conhecimento do conjunto de proteases digestivas presentes no intestino do

inseto (OLIVEIRA et al., 2005).

A Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera: Noctuidae), conhecida

como lagarta da soja, é um inseto polífago que tem por principal hospedeiro a

soja (Glycine max). Ela é considerada uma das pragas-chave da sojicultura,

sendo economicamente importante em função das grandes perdas que

ocasionam (GALLO et al., 2002). Estudos têm demonstrado que serino

proteases são as principais proteases expressas no trato intestinal da lagarta da

soja (OLIVEIRA et al., 2005, XAVIER et al., 2005; PEREIRA et al., 2005).

Proteases solúveis e ligadas à membrana foram extraídas do intestino médio de

A. gemmatalis purificadas e caracterizadas bioquímica e cineticamente

(OLIVEIRA et al., 2005, XAVIER et al., 2005). Os resultados demonstraram que

as enzimas parcialmente purificadas apresentam o mesmo padrão hidrolítico e

parâmetros cinéticos observados para a tripsina bovina.

Sabe-se que relações simbióticas estabelecidas com microrganismos

ajudam a definir o perfil metabólico do inseto, contribuindo, entre outras, para

uma eficiente transformação de macromoléculas a nutrientes essenciais

(BRENNAN et al., 2004). No entanto, antes de avaliar o impacto da comunidade

bacteriana na fisiologia do inseto, faz-se necessária uma caracterização da

microbiota intestinal. Em Lymantria díspar (Lepidoptera) a diversidade

bacteriana existente no intestino médio de larvas no 3° instar, usando técnicas

independentes de cultivo, é composta por 23 filotipos (BRODERICK et al., 2004).

Muitos dos genes 16S rRNA amplificados consistiam de seqüências ainda não

descritas na literatura. Mas, o mais surpreendente desse estudo foi que

numerosas espécies de bactérias cultiváveis divergiam totalmente de espécies e

gêneros conhecidos. Estudos utilizando larvas de Automeris zugana alimentada

com diferentes dietas mostraram a presença de 22 espécies de bactérias

cultiváveis dentro de 12 gêneros (SITTENFELD et al., 2002). Enterobacter,

presente em 81,8% das amostras, foi o gênero mais encontrado. Bacillus

thuringiensis foi isolado de 30,3% das larvas dissecadas, mas estava presente

somente em larvas alimentadas com determinadas plantas testadas.

Com o objetivo de conhecer as principais espécies bacterianas cultiváveis

que são capazes de produzir proteases em A. gemmatalis, bactérias

proteolíticas presentes no intestino da lagarta da soja foram isoladas,

identificadas e caracterizadas.

2. MATERIAL E METÓDOS

Os experimentos foram realizados no Laboratório de Enzimologia,

Bioquímica de Proteínas e Peptídeos do Instituto de Biotecnologia - BIOAGRO

da Universidade Federal de Viçosa.

2.1. Criação de Anticarsia gemmatalis

Aos insetos foram fornecidas dieta artificial (HOFFMAN-CAMPO, 1985) e

folhas de soja “ad libitum”. A criação foi mantida sobre condições controladas de

25°C ± 5°C, 70 ± 10% de umidade relativa e fotoperíodo de 14 horas.

2.2. Isolamento de bactérias proteolíticas

Lagartas de A. gemmatalis de quinto ínstar foram colocadas à -18ºC por

aproximadamente 3 min, para diminuição das atividades vitais e submetidas à

desinfecção superficial com etanol 70% (v/v), seguida de lavagens em água

destilada estéril. Para o isolamento de bactérias anaeróbias, cinco lagartas

foram dissecadas em câmara de anaerobiose (COY Laboratory Products Inc.,

Grass Lake, MI, USA), sendo os intestinos transferidos para cadinho contendo 1

mL de solução salina estéril (NaCl 0,85% p/v) e resazurina (agente indicador de

oxi-redução). Após a maceração, 100 µL de diluições seriadas (10

-1

a 10

-6

)

foram plaqueados em ágar caseinato de cálcio (MERCK), que é um meio

indicador de proteólise. As bactérias que crescem e produzem proteases

extracelulares degradam o caseinato presente no meio e formam halos

clarificados ao redor da colônia, sendo assim, consideradas bactérias

proteolíticas. As placas de Petri foram mantidas sob atmosfera de CO

(95:5%), a 30°C. Para o isolamento de bactérias aeróbias, o mesmo

procedimento foi feito, porém em câmara de fluxo laminar. Todas as diluições

foram plaqueadas em triplicata. Após 48 h, as colônias formadoras de halos que

apresentaram características morfológicas diferentes foram selecionadas e

estriadas em ágar Luria Bertaini (LB), composto por 10 g de triptona, 5 g de

extrato de levedura, 5 g de NaCl, 20 g de ágar, até a obtenção de colônias

puras.

2.3. Extração de DNA genômico

As bactérias proteolíticas foram inoculadas em 3 mL de BHI líquido a

37°C por 16 h e 200 rpm de rotação. As culturas foram centrifugadas a 3000 g

por 5 min. O sedimento foi ressuspendido em 400 µL de tampão SET (75 mM

NaCl, 25 mM EDTA e 20 mM Tris-HCl, pH 7,5). Em seguida, 10 µL de lisozima

(50 mg/ mL) foram adicionados e a reação foi incubada à 37°C por 1h, com

inversões espaçadas. Foram acrescentados 1/10 do volume de SDS 10 % e 10

µL de proteinase K (20 mg/ mL) e novamente, a mistura foi incubada a 60°C por

1 h. Após esse tempo foram adicionados 1/3 do volume de NaCl 5 M e seguido

de desproteinização com 1 volume de fenol-clorofórmio (1:1) e clorofórmio. Os

ácidos nucléicos foram precipitados com isopropanol, lavados com etanol 70%.

Finalmente, o “pellet” seco foi ressuspendido em 30 µL de tampão TE (100 mM

Tris-HCl e 10 mM EDTA, pH, 7,5).

2.4. Amplificação do gene 16S rRNA bacteriano e análise por RFLP

Para análise por PCR-RFLP, o DNA total foi amplificado com

oligonucleotídeos específicos para o gene 16S rRNA, a saber: 5’-

AGAGTTTGATCMTGG-3’ (16SF) e 5’-TACCTTGTTACGACTT-3’ (16SR). As

reações de amplificação foram efetuadas em um volume total de 25 µL

contendo: 2,5 mM de MgCl

; tampão da Taq polimerase 1X; 200 µM de

desoxirribonucleotídeo (dNTP); 0,4 µM de cada “primer”; uma unidade da

enzima Taq polimerase e finalmente 50 ng/µL de DNA. O programa de

amplificação consistiu de uma desnaturação inicial a 94°C por 2 min, seguido

por 35 ciclos a 94°C por 1 min, 50°C por 1 min, 72°C por 2 min e finalizando com

uma etapa de extensão final a 72° por 5 min. Uma alíquota de 5 µL foi analisada

em gel de agarose 0,8%, sendo o restante incubado separadamente, com 5U

das enzimas de restrição Hae III e Rsa I (PROMEGA). Após a incubação por 5h,

as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 2 % em tampão

TBE 1X, a voltagem constante de 100 V. Com base no perfil de restrição,

diferentes isolados foram selecionados para identificação bioquímica, molecular

e avaliação das atividades proteolíticas.

2.5. Sequenciamento do gene 16S rRNA e análises de dados

Para identificação molecular, os produtos de PCR foram purificados do

gel de agarose usando-se o QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen Inc, Valencia

CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Os amplicons foram

submetidos ao seqüenciamento em aparelho MegaBACE 500. As seqüências

obtidas foram comparadas às disponíveis no banco de seqüências de DNA

GenBank, usando o programa BLASTn. As análises filogenéticas foram

realizadas com o programa Genes e o método do vizinho mais próximo foi usado

para construir a árvore filogenética.

2.6. Testes bioquímicos

Os isolados foram caracterizados pela coloração de Gram e por meio de

20 testes bioquímicos. O procedimento de identificação das bactérias isoladas

foi realizado de acordo com o “Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology” e

“Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology” (SNEATH et al., 1986;

KONEMAN, 1992).

2.7. Teste de susceptibilidade a antimicrobianos

Placas contendo BHI foram inoculadas com 100 µL de cultura bacteriana

e discos contendo antibióticos foram aplicados de acordo com as

recomendações do fabricante (Oxoid Unipath Limited, Basingstoke, Hamphire,

United Kingdom). Os antibióticos testados foram estreptomicina (10 µg),

cloranfenicol (30 µg), penicilina (10 µg), tetraciclina (30 µg), gentamicina (10 µg),

eritromicina (15 µg), neomicina (10 µg), ampicilina (10 µg) e ácido nalidíxico (30

µg). O experimento foi realizado em duplicata e incubado a 30°C por 24h. Após

o período de incubação, zonas de inibição ao redor dos discos foram medidas e

a susceptibilidade ou resistência ao antibiótico foi inferida com base no descrito

na literatura (MADIGAN et al., 2000).

2.8. Ensaios Enzimáticos

As bactérias proteolíticas isoladas foram cultivadas em 50 mL de BHI a

37°C por 48 h e 200 rpm de rotação. Depois do tempo de incubação, as culturas

foram centrifugadas a 10.000 g por 10 min à 4°C. O sobrenadante foi coletado e

usado para os ensaios enzimáticos.

A atividade proteolítica foi determinada utilizando-se azocaseína como

substrato numa concentração de 2 %. O tempo de incubação foi de 30 min, o

qual foi interrompido por adição de ácido tricloroacético 10 % (p/v). Após a

interrupção, as amostras foram centrifugadas para remover a proteína

precipitada, NaOH 1M foi adicionado ao sobrenadante e a atividade, então, foi

determinada a 440 nm de acordo com o método descrito por KUNITZ (1947),

adaptado por OLIVEIRA et al. (1993). A atividade amidásica foi realizada pelo

método descrito por ERLANGER et al. (1961), utilizando-se o substrato

cromogênico N-benzoil-L-arginil p-nitroanilida (L-BapNA, substrato para enzimas

tripsina-like) na concentração final de 0,5 mM, a 25°C em tampão Tris-HCl 0,1

M, pH 8,2 contendo 20 mM de CaCl

e 1 % (v/v) de dimetilformamida (DMF). A

atividade esterásica foi realizada pelo método descrito por HUMMEL et al.

(1959), utilizando o substrato L-TAME na concentração final de 0,10 mM, a 25 °C

em tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 8,2 contendo 20 mM de CaCl

. As velocidades

iniciais foram determinadas pela medida da absorvância a 247 nm em função do

tempo (2,5 min), utilizando-se para os cálculos o coeficiente de extinção molar

de 540 M

-1

x cm

-1

para o produto. A atividade de cisteíno protease foi

determinada como citado para a atividade amidásica com adição de inibidor de

tripsina-like, benzamidina na concentração de 1,0 mM. Todos os experimentos

foram realizados em uma série de três repetições.

2.9. Determinação da concentração de proteína

A determinação da concentração da proteína foi obtida de acordo com o

método descrito por BRADFORD (1976), utilizando como padrões soluções de 0

a 0,2 mg/ mL de albumina sérica bovina (BSA).

3. RESULTADOS

3.1. Contagem microbiológica e isolamento de bactérias proteolíticas

O número de unidades formadoras de colônias (UFC) totais e

proteolíticas, obtido de intestinos de lagartas criadas em dieta artificial e folhas

de soja, em condições aeróbias e anaeróbias, está apresentado na tabela 1.

Verificou-se que, em lagartas criadas em dieta a contagem de UFC foi maior

em ambas as atmosferas de incubação quando comparada a lagartas criadas

com folhas. Notou-se também que o número de UFC encontrado em condições

aeróbias foi de aproximadamente dez vezes maior do que em anaerobiose. As

condições de incubação avaliadas afetaram significativamente a contagem (P

< 0,05). Já a diferença entre o número de UFC encontrado em lagartas criadas

com dieta e folhas em condições aeróbias não foi significativa. O número de

bactérias proteolíticas encontrado foi significativamente (P < 0,05) maior em

lagartas criadas com dieta artificial. Em condições anaeróbicas nenhuma

bactéria capaz de produzir protease foi detectada. Um total de doze bactérias

proteolíticas, morfologicamente distintas foi isolado, sendo que sete foram

obtidas do intestino de lagartas criadas com dieta artificial e cinco de lagartas

criadas com folhas de soja.

TABELA 1

Número de bactérias totais e proteolíticas presentes no trato intestinal de Anticarsia gemmatalis criadas com dieta artificial e

folhas de soja

=média de três repetições;

DP = desvio padrão

Dieta

Atmosfera de

incubação

Bactérias Totais (UFC x mg

-1

intestino)

Bactérias proteolíticas (UFC x

-1

de intestino)

Dieta artificial aerobiose 4,520 x 10

± 0,393 17,333 x 10

± 6,110

Dieta artificial anaerobiose 5,186 x 10

± 0,560 0

Folhas de soja aerobiose 3,677 x 10

± 0,433 5,533 x 10

± 3,868

Folhas de soja anaerobiose 2,999 x 10

± 0,404 0

3.2. PCR - RFLP

A figura 1 mostra os resultados da análise por RFLP dos produtos

amplificados. As amostras de DNA nas posições 1 a 7 e 8 a 12 correspondem

aos DNAs amplificados de bactérias isoladas do intestino de lagartas criadas

com dieta artificial e folhas de soja, respectivamente. O DNA total das doze

bactérias isoladas foi clivada com HaeIII (Figura 1A). As amostras que

apresentaram o mesmo perfil de restrição foram clivadas posteriormente com

RsaI para a avaliação se elas pertenciam ao mesmo grupo de microrganismos

(Figura 1B).

FIGURA 1- Análise por PCR-RFLP do perfil de restrição do gene que codifica

16S rRNA de bactérias isoladas do intestino de Anticarsia gemmatalis obtidas

pela digestão com HaeIII (A) e RsaI (B) . MM é marcador molecular e os

números 1-12 são os isolados proteolíticos.

MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

MM 1 2 5 7 3 8 11 4 6 9 10 12

Na figura 2, observa-se o dendrograma obtido do agrupamento dos

doze isolados proteolíticos dado pelo método do vizinho mais próximo, com

base nas distâncias obtidas pelo índice de diversidade multicategórico-binário.

O dendrograma foi construído a partir das informações contidas na figura 1,

usando 1 para presença e 0 para ausência de bandas em cada posição no gel.

Foram consideradas duas categorias, cada qual correspondendo às duas

enzimas de restrição utilizadas. Foram obtidos cinco grupos baseados nas

diferenças apresentadas pelos padrões de restrição: grupo 1 (isolado 1), grupo

2 (isolados 2, 5 e 7), grupo 3 (isolados 3, 8 e 11), grupo 4 (isolados 4 e 6) e

grupo 5 (isolados 9, 10 e 12). Com base nos resultados, um isolado de cada

grupo foi selecionado para as caracterizações posteriores.

FIGURA 2- Dendrograma obtido pelo método do vizinho mais próximo com

base nos perfis de restrição dos doze isolados proteolíticos, utilizando Hae III e

Rsa I.

3.3. Caracterização fenotípica e identificação molecular dos isolados

A seqüência do gene 16S rRNA foi obtida para um representante de

cada grupo e usada para confirmar a identidade dos isolados. Os produtos de

PCR foram seqüenciados com “primers” específicos, gerando uma seqüência

contínua de aproximadamente 1400 pares de bases. A análise molecular

permitiu a identificação dos isolados ao nível de gênero (Tabela 2).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Grupo 5- 9, 10, 12

Grupo 1- 1

Grupo 2- 2, 5, 7

Grupo 3- 3, 8, 11

Grupo 4- 4, 6

TABELA 2

Identificação dos isolados com base no gene 16S rRNA

GRUPOS

ANÁLISES

MOLECULARES

1 2 3 4 5

Nº de bases

sequenciadas

1419 329 1337 1408 1397

Espécies

relacionadas

B. subitilis

Bacillus sp.

B. cereus

Bacillus sp.

E. mundtii

E. durans

Enterococcus sp.

E. casseliflavus

E. gallinarum

Enterococcus sp.

Staphylococcus sp.

S. saprophyticus

S. xylosus

S. cohnii

Similaridade (%) 97% 91% 99% 99% 99%

Nº de acesso no

GenBank

IDENTIFICAÇÃO

Bacillus subtilis Bacillus sp. Enterococcus sp. Enterococcus sp. Staphylococcus sp.

Com base nas características morfológicas e bioquímicas descritas na

tabela 3, o gênero de todos os isolados foi identificado. Os isolados 1 e 2 foram

identificados como Bacillus sp., pois tinham forma de bastonetes, eram

aeróbios, produtores de catalase, móveis. Os isolados 3 e 4 foram identificados

como estreptococos do grupo D (Enterococcus), apresentando forma de

diplococos Gram positivos. As características que o diferenciaram dos

Streptococcus, além do arranjo, foram sua capacidade de hidrolisar esculina

na presença de 40 % de bile e o crescimento em NaCl 6,5 %. E finalmente, o

isolado 5 apresentou características de estafilococos, devido a sua forma e

arranjo serem de cocos agrupados irregularmente, catalase positiva, oxidase

negativa e resistentes a bacitracina. Duas características importantes

apresentada por esse isolado, classificaram-no dentro do grupo dos

Staphylococcus sp., coagulase negativa, resistente a novobiocina.

TABELA 3

Análise morfológica e bioquímica das bactérias proteolíticas isoladas

ND – não determinado

S – sensível

R – resistente

ISOLADOS

CARACTERÍSTICAS 1 2 3 4 5

MORFOLOGIA

Forma Bacilo Bacilo Cocos Cocos Cocos

Arranjo Isolado Isolado Diplococo Diplococo Grumos

Coloração de Gram + + + + +

TESTES

BIOQUÍMICOS

Motilidade + + ND ND ND

Prova da Oxidase - - - - -

Prova da Catalase + + - - +

Prova da coagulase - - - + -

Prova da Hemólise β β α α α

Prova Camp Test ND ND - - -

Tolerância a NaCl

6,5%

+ + + + +

Hidrólise da Esculina + - + + -

Hidrólise do Manitol + - - + +

Crescimento em

MacConkey

+ - - - -

Resistência a

Optoquina

ND ND R R R

Resistência a

Bacitracina

ND ND R R R

Resistência a

Novobiocina

ND ND ND ND R

Resistência a

Vancomicina

ND ND S S S

Fermentação

Sacarose

+ + - + +

Fermentação Xilose - - + - +

Fermentação

Rafinose

+ + - + -

Fermentação

Manose

- - - - -

Fermentação

Lactose

- - - - -

Fermentação

Maltose

- + - + +

IDENTIFICAÇÃO

Bacillus

sp.

Bacillus

sp.

Enterococcus

sp.

Enterococcus

sp.

Staphylococcus

sp.

3.4. Análise do perfil de resistência dos isolados aos antimicrobianos

Na análise de resistência aos antimicrobianos, a determinação do grau

de sensibilidade ou de resistência da bactéria está relacionada com o diâmetro

das zonas de inibição (mm) formadas em torno dos discos impregnados com

antibióticos. Desse modo, os halos foram medidos e as bactérias classificadas

como sensíveis (S), intermediárias (I) e resistentes (R). Os isolados mostraram

grau de resistência variável como mostra a tabela 4. Todas bactérias foram

resistentes ao ácido nalidíxico. Os antimicrobianos que apresentaram melhor

eficácia foram tetraciclina, cloranfenicol e eritromicina.

3.5. Análise dos ensaios enzimáticos

Para averiguar que tipo de proteases as bactérias proteolíticas isoladas

são capazes de sintetizar, ensaios enzimáticos para detecção de proteases

totais, serino protease e cisteíno protease foram realizados. A atividade

proteolítica foi detectada com o substrato azocazeína, enquanto a atividade de

cisteíno protease foi detectada utilizando o substrato L-BApNA na presença de

inibidor de tripsina-like, a benzamidina. Para a análise da atividade de tripsina-

like foram utilizados o substrato amidolítico L-BApNA e o substrato esterolítico

L-TAME. Os isolados foram avaliados com base na sua capacidade de

produzir protease não específica, serino protease e cisteíno protease. Os

valores das atividades proteolíticas produzidas pelos isolados foram

determinados como atividades específicas e estão apresentados na tabela 5.

Quando se comparou a produção enzimática entre os isolados, verificou-se

uma diferença significativa na atividade (P < 0,01), sobre todos os substratos

testados. Observou-se também, que os isolados foram capazes de hidrolisar

todos os substratos testados, exceto o Staphylococcus sp., que não degradou

L-BApNA e L-TAME, substratos específicos de tripsina-like. O grupo que

mostrou maior atividade proteolítica foi o grupo dos Enterococcus sp., já o

grupo dos Bacillus cereus apresentaram melhor atividade específica de serino

e cisteíno protease.

TABELA 4

Efeito dos antimicrobianos sobre as bactérias proteolíticas isoladas do intestino de Anticarsia gemmatalis

ANTIBIÓTICOS

ISOLADOS Est C Pen Tet Gen E N Amp Nal

Bacillus subtilis

R I R S R I I R R

Bacillus sp.

S I R I R I I R R

Enterococcus sp.

R S I S R I R S R

Enterococcus sp.

I I I S R I R S R

Staphylococcus sp.

S S R I S S S R R

Est – estreptomicina, C – cloranfenicol, Pen – penicilina, Tet – tetraciclina, Gen – gentamicina, E – eritromicina, N – neomicina,

Amp – ampicilina, Nal – ácido nalidíxico

TABELA 5

Atividade de proteases detectada nos sobrenadantes das culturas das bactérias isoladas do intestino de Anticarsia

gemmatalis

SUBSTRATOS

ISOLADOS Azocaseína(Abs

440

/mg proteína) L-BApNA (nM/s/mg) L-BApNA com benzamidina

(nM/s/mg)

L-TAME

(nM/s/mg)

Bacillus subtilis

0.225 ± 0.05

0,263 ± 0,06

1,197 ± 0,63

46,98 ± 6,5

Bacillus sp.

0,132 ± 0,01

2,416 ± 0,63

4,149 ± 0,39

68,75 ± 9,0

Enterococcus sp.

0.318 ± 0.14

0,178 ± 0,03

3,412 ± 1,76

0,49 ± 0,04

Enterococcus sp.

0.046 ± 0.006

0,902 ± 0,2

2,164 ± 0,09

8,75 ± 0,05

Staphylococcus sp.

0.0632 ± 0.001

1,378 ± 0,21

Os resultados foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e as atividades para cada substrato foram

comparadas usando teste de Duncan, com nível de significância de 0,01. Cada atividade refere-se à média de três

repetições (n=3).

4. DISCUSSÃO

Esse estudo comprova, pela primeira vez, a existência de comunidade

bacteriana no intestino da lagarta da soja. Por métodos dependentes de cultivo

foi detectada uma influência significativa da atmosfera de incubação na

enumeração de microrganismos, obtendo-se os maiores valores de UFC sob

condições de aerobiose. Os baixos níveis de O

no intestino permitem a

sobrevivência de bactérias anaeróbias facultativas. A compartimentalização do

trato intestinal de A. gemmatalis é relativamente simples, então sugere-se que

seus microambientes não sejam totalmente anóxicos devido ao maior fluxo de

o que propiciaria o desenvolvimento de bactérias aeróbias e anaeróbias

facultativas. Gradientes de O

e H

obtidos com o uso de microsensores no trato

intestinal de cupins revelaram que, devido à estrutura complexa todos os

compartimentos centrais, exceto o intestino médio e as regiões menos dilatadas

do intestino posterior, são anóxicos, favorecendo o desenvolvimento de

anaeróbios (BERCHTOLD et al., 1999; BRUNE & FRIEDRICH, 2000). É possível

que o meio utilizado para a contagem microbiológica tenha sido nutricionalmente

incapaz de promover o crescimento de bactérias intestinais anaeróbias, o que

justifica as baixas contagens obtidas. É estimado que 99% dos microrganismos

presentes no trato intestinal de insetos não sejam cultiváveis (DILLON &

DILLON, 2004). Porém, foi registrada a contagem na ordem de 1 x 10

a 3 x 10

UFC por intestino de Acheta domesticus (SANTO DOMINGO et al., 1998).

O tipo de dieta fornecida não teve influência significativa na enumeração

de bactérias totais, semelhante resultado foi encontrado por SANTO DOMINGO

et al. (1998). Entretanto, o número de bactérias proteolíticas encontrado em

larvas criadas com dieta artificial foi superior ao encontrado em larvas criadas

com folhas de soja. Isso pode ser explicado pelo maior teor protéico encontrado

na dieta, o que favorece o aumento na população de microrganismos capazes

de degradar proteínas.

Embora a escolha dos isolados tenha inicialmente sido baseada em

diferenças morfológicas, o PCR-RFLP mostrou a existência de apenas cinco

bactérias proteolíticas diferentes. Por sequenciamento do gene 16S rRNA

identificaram-se três gêneros distintos, Bacillus, Enterococcus e Staphylococcus.

Um dos Bacillus foi classificado ao nível de espécie, Bacillus subtilis e o outro ao

100

nível de gênero, Bacillus sp., provavelmente devido o sequenciamento de

apenas 329 pb de gene 16S rRNA. Os isolados dos grupos 3 e 4 foram

identificados como sendo Enterococcus sp., porém pertencentes a espécies

distintas. O PCR-RFLP mostrou um padrão de restrição diferente, quando os

Enterococcus desses dois grupos foram clivados com HaeIII sendo confirmada

pela análise de similaridade, obtida pelo índice de diversidade multicategórico-

binária . Além disso, não houve semelhança entre as espécies dos dois grupos,

quando as seqüências do gene 16S rRNA foram comparadas as depositadas no

Genbank. Isso tudo reforça a possibilidade deles pertencerem a espécies

diferentes. O grupo 5 apresentou alta similaridade (99%) com três espécies do

grupo dos estafilococos coagulase negativo, resistente a novobiocina,

Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus xylosus e Staphylococcus cohnii.

Estudos sobre relações filogenéticas foram realizados com 38 espécies do

gênero Staphylococcus baseado na análise da seqüência do gene 16S rRNA

(KLOOS & WOLFSHOHL, 1982; TAKAHASHI, et al., 1999). Seus resultados

demonstram que há uma forte homologia entre essas três espécies e que elas

estão intimamente relacionadas, o que dificulta a identificação ao nível de

espécie.

A presença de Bacillus, Staphylococcus e Enterococcus já foi relatada no

trato intestinal de outros insetos, como abelhas (GILLIAM, 1997), formigas (LI et

al., 2005) e flebotomíneos (OLIVEIRA et al., 2001). Nenhuma bactéria Gram-

negativa proteolítica foi encontrada em A. gemmatalis. Resultado diferente foi

reportado por ERTÜRK & DEMIRBAG (2006), quando investigaram a microbiota

presente no trato digestivo de Cydia pomonella L. (Lepidoptera: Tortricidae).

Através de testes morfológicos e bioquímicos foram identificadas oito bactérias,

a maioria Gram-negativa, três Gram-positivos, sendo uma identificada como

Bacillus laterosporus. Em outra lepidóptera, Pecnophora gossypiella, também foi

observada a presença de muitas bactérias Gram-negativas e Enterococcus sp.

(KUZINA et al., 2002). Porém, microrganismos identificados como

numericamente dominantes não são necessariamente aqueles que têm

relevância biológica (DILLON & DILLON, 2004). Deve-se considerar sempre o

meio de cultura utilizado no isolamento além de fatores ambientais como pH e

disponibilidade de nutrientes no intestino do inseto.

101

A resistência aos antimicrobianos variou entre os grupos isolados, mas

não dentro do mesmo gênero. Os Bacillus apresentaram resistência aos β-

lactâmicos e gentamicina. De acordo com o Manual de Bergey`s, B. cereus

geralmente tem alta resistência a ampicilina, colistina e polimixina, poucas cepas

mostraram-se resistentes a bacitracina, kanamicina e tetraciclina. Bacillus

subtilis são resistentes principalmente a estreptomicina. Os Enterococcus sp.

apresentaram resistência aos aminoglicosídeos, gentamicina e neomicina.

Segundo LECLERCQ et al. (1992) o alto grau de resistência aos

aminoglicosídeos é decorrente da produção de enzimas modificadoras desses

antimicrobianos, tais como 6`-acetil transferase e 2`-fosfotransferase. Essas

enzimas geralmente são expressas por genes localizados em plasmídeos. A

resistência aos β-lactâmicos, apresentada pelo Staphylococcus coagulase

negativo isolado, é tradicionalmente associada à produção de β-lactamases.

O presente estudo verificou que todas as bactérias proteolíticas isoladas

do trato intestinal de A. gemmatalis foram capazes de hidrolisar azocaseína,

substrato para proteases não específicas e L-BApNA na presença benzamidina,

substrato específico para cisteíno-proteases. Os substratos para a verificação da

produção de tripsina-like, pelas bactérias isoladas, foram L-BApNA e L-TAME .

Todos isolados proteolíticos apresentaram atividade de tripsina-like, exceto o

Staphylococcus sp. , que mostrou apenas produção de cisteíno protease. O

Bacillus sp. foi o que melhor hidrolisou a maioria dos substratos protéicos.

Relata-se que a maioria das serino proteases comerciais são produzidas por

organismos que pertencem ao gênero Bacillus (MANACHINI et al., 1988; RAO et

al., 1998; OLAJUYIGBE & AJELE, 2005). Os resultados obtidos sugerem que

além das proteases produzidas pelo próprio inseto há também a produção por

parte da microbiota local.

102

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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108

3. CONCLUSÕES

Com base nos objetivos e nos resultados obtidos, conclui-se que a

redução substancial do número de UFC total e proteolítica foi alcançada com

tetraciclina através do tratamento das larvas recém eclodidas.

As carboidrases não foram afetadas pela redução da microbiota,

sugerindo então, que a digestão desse inseto seja primariamente protéica, ou

que a tetraciclina não tenha sido eficiente na inibição do crescimento de

bactérias produtoras dessas enzimas. Já as lipases e proteases foram inibidas

com o aumento da concentração de tetraciclina e conseqüente aumento na

redução do número de bactériass. O efeito da redução da microbiota utilizando-

se tetraciclina foi também significativamente refletido na atividade de enzimas

que hidrolisam azocaseína, L-BApNA, e tributirato ditiopropanol ao longo da

fase larval. As atividades foram afetadas principalmente nos últimos instares de

desenvolvimento (4º, 5º e 6º instar). Esses resultados sugerem que proteases e

lipases, enzimas importantes para o processo digestivo de A. gemmatalis são

oriundas tanto do inseto como da microbiota residente em seu trato intestinal.

Os resultados das análises da performance de A. gemmatalis indicaram

que a redução da microbiota interferiu em alguns parâmetros biológicos do

inseto, sugerindo dessa forma, que bactérias intestinais também influenciam o

desenvolvimento do inseto.

Bactérias cultiváveis foram isoladas do trato intestinal da lagarta da soja

e sua capacidade proteolítica foi testada. Os isolados degradaram todos os

substratos protéicos com eficiência, confirmando a hipótese de que as

proteases presentes no intestino da lagarta não são exclusivamente

secretadas pelas células do próprio inseto, sendo as bactérias responsáveis

por parte dessa produção.

109

4. PERSPECTIVAS

Esse trabalho é o primeiro relacionado a contribuição da microbiota

intestinal na produção de enzimas hidrolíticas, principalmente proteases

envolvidas no processo digestivo de Lepidoptera. Como os resultados

demonstraram a influência da microbiota na atividade de proteases tornam-se

necessários estudos de digestibilidade do inseto e estudos bioquímico-

cinéticos que detalhem as proteases oriundas das bactérias, visando à

complementação de pesquisas que buscam técnicas alternativas de controle

de Lepidópteras.

Investigações futuras também, poderão ser realizadas para uma melhor

caracterização da comunidade microbiana presente em A. gemmatalis.

Métodos moleculares qualitativos e quantitativos, que são mais sensíveis e

seletivos do que os métodos tradicionais poderão ser empregados. Assim,

informações a respeito da diversidade e distribuição das bactérias no trato

intestinal, incluindo as não cultiváveis, poderão ser obtidas e o seu

envolvimento na associação planta-inseto-microrganismo esclarecido.

110

5. AGRADECIMENTOS

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq) e a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais

(FAPEMIG).

“O cientista não estuda a natureza somente por ela ser útil; estuda-a

porque ela lhe apraz, e ela lhe apraz por ser bela. Se a natureza não fosse

bela, não mereceria ser conhecida, e se não merecesse ser conhecida, não

valeria a pena viver”

Henri Poincaré

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