( PDF ) Construção e caracterização de vírus febre amarela 17D recombinantes expressando o domínio III da proteína e do vírus dengue 2 na região intergênica E/NS1 do vírus FA17D

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Mestrado em Biologia Parasitária

ANA LUIZA CHAVES VALADÃO

CONSTRUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VÍRUS FEBRE AMARELA (FA) 17D

RECOMBINANTES EXPRESSANDO O DOMÍNIO III DA PROTEÍNA E DE

DENGUE 2 NA REGIÃO INTERGÊNICA E/NS1 DO VÍRUS FA 17D

Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como

parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em

Biologia Parasitária

Orientadora: Drª. Myrna C. Bonaldo

RIO DE JANEIRO

Abril de 2008

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Mestrado em Biologia Parasitária

Esta dissertação intitulada:

CONSTRUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VÍRUS FEBRE AMARELA (FA) 17D

RECOMBINANTES EXPRESSANDO O DOMÍNIO III DA PROTEÍNA E DE DENGUE 2

NA REGIÃO INTERGÊNICA E/NS1 DO VÍRUS FA 17D

apresentada por

ANA LUIZA CHAVES VALADÃO

Será avaliada pela banca examinadora composta pelos seguintes membros:

Prof. Dr. Carlos Roberto Alves, Laboratório de Biologia Molecular e Doenças Endêmicas,

IOC, FIOCRUZ.

Prof. Dr. Andréa Cheble de Oliveira, Laboratório de Termodinâmica de Proteínas e

Estruturas Virais Gregorio Weber, Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ.

Prof. Dr. Marcos da Silva Freire, Gerente do Programa de Vacinas Virais, Bio-

Manguinhos, FIOCRUZ.

Rio de Janeiro, abril de 2008.

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V176

Valadão, Ana Luiza Chaves

Construção e caracterização de vírus febre amarela (FA) 17D recombinantes

expressando o domínio III da proteína e de dengue 2 na região intergênica e NS1 do vírus FA

17D / Ana Luiza Chaves Valadão. – Rio de Janeiro, 2008.

xix, 135 f. : il. ; 30 cm.

Dissertação (mestrado) – Instituto Oswaldo Cruz,

Biologia Parasitária, 2008.

Bibliografia: f. 113-128

1.Vírus recombinante. 2. Febre amarela. 3. Dengue. 4. Vírus da

dengue. 5. Vacina contra Dengue. 6. Domínio III. 7. Flavivirus I. Título.

CDD 614.541

iii

Trabalho realizado no Laboratório de Biologia Molecular de Flavivírus,

IOC, e no Laboratório de Tecnologia Virológica (LATEV) do

Departamento de Desenvolvimento Tecnológico/Bio-

Manguinhos/FIOCRUZ , sob a orientação da Dr

Myrna C. Bonaldo.

“Mas é preciso ter força, é preciso ter raça

É preciso ter gana sempre

(...)

Mas é preciso ter manha, é preciso ter graça

É preciso ter sonho sempre

Quem traz a fé nessa marca

Possui a estranha mania de ter fé na vida...”

Milton Nascimento

Dedico esta dissertação

a meus pais Antônio e Lisia, pela formação moral e educacional;

aos meus avôs Alcir e Manoel, pelo exemplo de vida; e

ao Gustavo, pelo amor, amizade e companheirismo

Agradecimentos

À Dra. Myrna Bonaldo, por ter me permitido integrar sua equipe, pelo crédito e confiança

depositados em mim e por ter me contemplado com um projeto audacioso e desafiador. Obrigada

pela oportunidade, aprendizado, crescimento profissional e orientação.

Ao Dr. Ricardo Galler, pelas grandiosas e valiosas discussões durante os seminários,

questionamentos e cobranças que me impulsionavam para seguir adiante. Pela objetividade,

praticidade, eficiência e inteligência imensurável.

À toda equipe do laboratório de Biologia Molecular de Flavivírus, em especial: à

Michelli Faria e Ana Paula Montenegro, duas guerreiras, companheiras de experimentos

“overday”, “overnight” e “overweekend”, muitíssimo obrigada pela colaboração, conversas

durante as incubações, que faziam o tempo passar muito mais rápido; pela companhia: durante as

caminhadas inevitáveis no campus da Fiocruz, durante os almoços, congressos e viagens a

trabalho e por vários outros motivos que não caberiam nesse breve agradecimento; à Adriana

Duarte, exemplar técnica do laboratório, por todo conhecimento compartilhado, palavras de

conforto quando algo não saía como o esperado e pela pessoa que és dentro e fora do ambiente de

trabalho; à Raquel Tayar, por sua inacreditável calma em tudo o que faz, obrigada pelo apoio nos

experimentos com as cobaias, e pelas caroninhas providenciais de volta para casa; à Gisela

Freitas, pelo auxílio durante os experimentos de imunofluorescência, obrigada por ter sempre

uma palavra amiga e de incentivo nos momentos em que mais precisei; ao Armindo Rocha, por

providenciar materiais em ótimas condições para o trabalho, por sempre atender aos meus

pedidos de última hora, e pelas maravilhosas tortas de sobremesa; à Samanta de Mello e Ingrid

Horbach, por resolver minhas dúvidas com uma simples olhadela em seus protocolos e pelos

agradáveis momentos que compartilhamos; ao Marlon, exemplo de dedicação, perseverança e de

vida, obrigada por ter sempre os artigos que precisava e por estar sempre por perto para resolver

probleminhas temperamentais de nossos computadores; à Adriana Vallochi, pela ajuda com a

estatística, com o EndNote, pela criteriosa leitura dessa dissertação, pelas sessões gratuitas de

terapia em grupo e por tentar descomplicar a tão temida Imunologia; à Danielle de Paula, nossa

ex-secretária, sinônimo de eficiência, obrigada por resolver todas as burocracias, por todas as

guloseimas e pelo bate-papo na hora do almoço; e à Patrícia Carvalho, nossa nova secretária, por

tornar o ambiente ainda mais descontraído.

Ao chefe do Laboratório de Tecnologia Virológica (LATEV), Dr. Marcos Freire, por

disponibilizar seu laboratório e toda a infra-estrutura necessária para a realização de parte dos

vii

experimentos desta dissertação. Agradeço também a toda sua equipe pela boa recepção,

companheirismo, atenção e simpatia.

Aos Drs. Richard Garratt e João Renato Muniz, pelo trabalho em colaboração de

modelagem molecular de DIII den-2 realizado na USP de São Carlos. Também a Lucas Bleisher,

pelo apoio bibliográfico e explicações super didáticas e à Nayara Cavalcante, cicerone nota

1.000!

À Dra. Aymara Rangel, pelo carinho, preocupação e exemplo de protocolo perfeito!

Ao Dr. Carlos Roberto Alves, revisor desta dissertação, pela cuidadosa leitura, sugestões,

acessibilidade e simpatia.

Aos membros da banca examinadora e aos suplentes desta, por terem aceitado o convite

para avaliar esta dissertação.

À FIOCRUZ, ao Instituto Oswaldo Cruz e ao CNPq, pelo suporte financeiro para

realização desta dissertação.

Aos meus pais, Antônio e Lisia, por estarem sempre a meu lado, me aconselhando e me

incentivando. Obrigada pela torcida constante, pelas caronas durante a semana e finais de semana

de trabalho. Obrigada pelas rezas, promessas, cafés, chocolates, amor e criação.

Aos meus avôs, Alcir e Manoel, dois lindos exemplos de vida, pela curiosidade em

entender como esta dissertação foi desenvolvida, apesar de não entenderam nada de Biologia

Molecular ou Virologia, e pelos numerosos estímulos positivos.

Ao meu namorado, Gustavo, por compartilhar todos os momentos desta dissertação

comigo, por me agüentar reclamando da vida, por rir e vibrar comigo a cada nova conquista e

pelo apoio incondicional. Muito obrigada pela “reforma geral” em meu computador, sem a qual

esta dissertação não teria acontecido.

Ao meu amigo Expedito, presente sempre nos momentos urgentes e que parecem

impossíveis!

À Tia Maria, Dona Rosa e Seu Zé, pelos ensinamentos, apoio e por tentar me ensinar a

forma simples de ver a vida.

À minha querida amiga Renyele Castelo, pela verdadeira amizade e por entender minha

ausência e as chamadas não atendidas.

Às minhas amigas de faculdade Cíntia Fernades e Caroline Passaes, por tanto me

encorajarem a fazer a prova de mestrado para Biologia Parasitária e por toda a ajuda durante

meus estudos.

viii

À toda minha turma de mestrado, em especial às amigas Joanna Reis e Érika Abi-Chacra,

vulgo chupa-cabra, pelas risadas, momentos descontraídos e por todas as chupiças!

À Deus, pela vida e força de cada dia.

A todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização desta

dissertação.

ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO ________________________________________________________ 1

1.1 Histórico da Dengue, sua Emergência e Patogenia ______________________________ 1

1.2 A Dengue no Mundo _____________________________________________________ 5

1.3 A Dengue no Brasil ______________________________________________________ 6

1.4 Ciclo Biológico _________________________________________________________ 8

1.5 O Vírus da Dengue: Etiologia, Genoma e Replicação ___________________________ 9

1.6 As Proteínas Estruturais e Não-estruturais de Flavivírus ________________________ 12

1.7 Ciclo Replicativo _______________________________________________________ 15

1.8 Domínio III da Proteína de Envelope dos Flavivírus ___________________________ 16

1.9 Desenvolvimento de Vacinas Dirigidas à Dengue _____________________________ 19

1.10 O Vírus Vacinal Febre Amarela 17D ____________________________________ 21

1.11 A Metodologia do Clone Infeccioso _____________________________________ 23

1.12 O Uso do Vírus da Febre Amarela 17D como Vetor de Expressão do Domínio III da

Proteína E dos Vírus Dengue 2 _______________________________________________ 24

2. JUSTIFICATIVA DO PROJETO __________________________________________ 29

3. OBJETIVOS __________________________________________________________ 30

4. MATERIAL E MÉTODOS _______________________________________________ 31

4.1 Certificados ___________________________________________________________ 31

4.2 Cultura de Células ______________________________________________________ 31

4.3 Amostras Virais Utilizadas _______________________________________________ 32

4.3.1 Vírus FA 17DD ______________________________________________________ 32

4.3.2 Vírus Parental FA 17D/G1.2-T3 _________________________________________ 32

4.3.3 Vírus Dengue-2 44/2 __________________________________________________ 33

4.4 Modelagem Molecular por Homologia do domínio III da proteína E do vírus dengue __ 34

4.5 Extração do RNA Viral __________________________________________________ 35

4.6 Construção dos Vírus FA Recombinantes ____________________________________ 36

4.6.1 Obtenção do Cassete de Expressão DIII den-2/HA trunc den-4 __________________ 36

4.6.2 RT-PCR para Ampliação do Domínio III do Vírus den-2 genótipo BR64022/98 ____ 36

4.6.3 PCR para Ampliação do Domínio III do Clone Infeccioso do Vírus Quimérico FA/den-

2________________________________________________________________________ 37

4.6.4 PCR para Amplificação da Região Truncada da Haste-Âncora (HA) da Proteína E do Vírus

Dengue-4 ________________________________________________________________ 38

4.6.5 Purificação dos Produtos de PCR por Eletroforese Preparativa em Gel de Agarose __ 38

4.6.6 PCR de Fusão dos Fragmentos de DNA para a Montagem do Cassete de Expressão do

Domínio III ______________________________________________________________ 39

4.6.7 Clonagem do Cassete de Expressão do Domínio III den-2 no Vetor PCR-Blunt II-TOPO

_______________________________________________________________________41

4.6.8 Extração em Pequena Escala dos Plasmídeos PCR-Blunt II-TOPO Recombinantes _ 43

4.6.9 Digestão das Minipreparações Plasmidiais com Eco RI _______________________ 44

4.6.10 Análise por Eletroforese de Ácidos Nucléicos em Gel de Agarose ______________ 44

4.6.11 Preparação de Estoque Bacteriano _______________________________________ 44

4.6.12 Seqüenciamento Nucleotídico __________________________________________ 45

4.7 Preparação do Molde de cDNA Viral _______________________________________ 46

4.7.1 Subclonagem do Cassete de Expressão DIII den-2 no Plasmídeo pT3 ____________ 46

4.7.1.2 Digestão de pT3 com Nar I ____________________________________________ 46

4.7.1.3 Precipitação de Ácidos Nucléicos _______________________________________ 47

4.7.1.4 Desfosforilação do Plasmídeo pT3/Nar I com SAP _________________________ 47

4.7.1.5 Digestão das Amostras Plasmidiais Recombinantes com Nar I ________________ 48

4.7.1.6 Ligação do Cassete de Expressão em pT3 _________________________________ 48

4.7.1.7 Subclonagem do Cassete de Expressão DIII den-2/HA trunc den-4 no Plasmídeo

pT3______________________________________________________________________49

4.7.1.8 Extração de Plasmídeos em Grande Escala ________________________________ 50

4.7.1.9 Montagem do Molde de cDNA Viral ____________________________________ 51

4.7.1.10 Digestão dos Plasmídeos com Nsi I e Sal I e Ligação dos Fragmentos _________ 51

4.7.1.11 Digestão da Preparação de DNA Ligado com Xho I ________________________ 52

4.7.1.12 Síntese in vitro do RNA Viral _________________________________________ 53

4.8 Transfecção do RNA Viral em Cultura de Células Vero_________________________ 53

4.9 Produção dos Estoques Virais _____________________________________________ 55

4.10 Caracterização dos Vírus FA Recombinantes ________________________________ 55

4.10.1 Titulação dos Vírus FA Recombinantes ___________________________________ 55

4.10.2 Cinética de Replicação Viral em Monocamadas de Células Vero _______________ 56

4.10.3 Estabilidade Genética Viral ____________________________________________ 57

4.10.4 Imunofluorescência e Microscopia Confocal _______________________________ 58

4.10.5 Microscopia em Contraste de Fase _______________________________________ 59

5. RESULTADOS ________________________________________________________ 60

5.1 Estudos Preliminares da Estrutura do Domínio III do Vírus Dengue-2: Análise por

Alinhamento Seqüencial e Modelagem Molecular ________________________________ 60

5.1.1 Mapeamento dos Sítios Antigênicos no Modelo tridimensional de DIII den-2 ______ 70

5.2 Estratégia para Construção de Vírus FA 17D Recombinantes, Expressando Domínio III de

Dengue-2 na Região Intergênica E/NS1 _____________________________ ____________75

5.3 Obtenção do Molde de cDNA Genômico Contendo o Cassete de Expressão do DIII den-2

_______________________________________________________________________76

5.4 Obtenção dos Vírus FA Recombinantes Expressando DIII den-2 __________________ 85

5.5 Produção e Titulação de Estoques Virais ____________________________________ 87

5.6 Análise da Replicação Viral em Células Vero ________________________________ 88

5.7 Estabilidade Genética dos Vírus FA 17D Recombinantes _______________________ 93

5.7.1 Vírus FA 17D/DIII den-2 IGA ___________________________________________ 94

5.7.2 Vírus FA 17D/DIII den-2 VGA __________________________________________ 95

5.8 Análise da Expressão do Cassete DIII den-2 pelos Vírus Recombinantes FA 17D por

Microscopia Confocal de Fluorescência ________________________________________ 97

6. DISCUSSÃO _________________________________________________________ 99

7. CONCLUSÃO___________________________________________________________112

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS _________________ _____________________113

9. ANEXO________________________________________________________________129

9.1. Meios de Cultura e Soluções_______________________________________________129

xii

ABREVIATURAS E SIGLAS

(-) RNA Ácido ribonucléico de polaridade negativa

+ (+) RNA Ácido ribonucléico de polaridade positiva

-FA Anticorpo anti-Febre Amarela

A Adenina

aa Aminoácido

ADE Intensificação da infecção dependente de anticorpo (do inglês,

Antibody-Dependent Enhancement)

Asibi Linhagem Asibi selvagem do vírus da Febre Amarela

ATCC Coleção Americana de Culturas e Depósitos (American Type

Culture Collection)

BHK Células de rim de camundongo jovem. Do inglês, Baby Hamster

Kidney

BLAST Do inglês, Basic Local Alignment Search Tool

BSA Albumina sérica bovina (do inglês, Bovine Serum Albumin)

BHI Do inglês, Brain Heart Infusion

C 1. Citosina 2. Capsídeo ou proteína do capsídeo

C6/36 Linhagem de célula de mosquito Aedes albopictus

CCL Linhagem Celular Certificada (do inglês, Certified Cell Line)

cDNA DNA complementar

cap Resíduo G metilado (7-metil G) na extremidade 5´ do mRNA

CEF Fibroblasto de embrião de galinha (do inglês, Chicken Embryo

Fibroblast)

COS-7 Células de rim de macaco verde africano (do inglês: African

green monkey kidney)

CHO Do inglês, Chinese Hamster Ovarian Cell

CMC Carboximetilcelulose

CNTBio Comissão Técnica Nacional de Biossegurança

CPE Efeito citopático (do inglês, Cytopathic Effect)

CTBio Comissão Técnica de Biossegurança

DEDT Departamento de Desenvolvimento Tecnológico

den-1 Vírus dengue sorotipo 1

den-2 Vírus dengue sorotipo 2

den-3 Vírus dengue sorotipo 3

den-4 Vírus dengue sorotipo 4

DEPC Dietil pirocarbonato

DSS Síndrome de Choque por Dengue (do inglês, Dengue Shock

Syndrome)

DTT 1,4-ditiotreitol

E Envelope ou proteína do envelope viral

EB Tampão de eluição (do inglês, Elution Buffer)

EDTA Etileno-diamino tetra acetato de sódio

et al

e colaboradores

FA Vírus da Febre Amarela ou Febre Amarela

FD Febre por dengue ou dengue clássico

FHD Febre hemorrágica por dengue ou dengue hemorrágico

xiii

FRhL Do inglês, Fetal Rhesus Lung

G Guanina

GAG Glicosaminoglicanas

EGFP Do inglês, Enhanced Green Fluorescent Protein

GMP Boas práticas de fabricação (do inglês, Good Manufacturing

Practices)

ICTV Comissão Internacional de Taxonomia Viral (do inglês,

International Comission for the Taxonomy of Viruses)

IFN Interferon

IgG Imunoglobulina G

IgM Imunoglobulina M

JE Vírus da encefalite japonesa (do inglês, Japanese Encephalitis virus)

LA LipofectAmine® - lipídeo catiônico

LASV Lassa vírus

LB Luria-Bertani

Log ou log

Logarítmo de base 10

LPS Lipopolissacarídeo

LS Lote semente

M Proteína de Membrana

MDM Do inglês, Monocyte-Derived Macrophages

MHC Complexo principal de histocompatibilidade (do inglês, Major

Histocompatibility Complex)

m.o.i. Multiplicidade de infecção (do inglês, multiplicity of infection)

MOPS 3-N-ácido morfolino propanosulfônico

MVE Do inglês, Murray Valley Encephalitis Virus

N Concentração normal ou normalidade

n Nano (x10

-9

)

Número

NITD

Do inglês, Novartis Institute of Tropical Diseases

NGC Vírus dengue sorotipo 2 genótipo Nova Guinea C

NS Proteína não estrutural (do inglês, Non-Structural Protein)

nt Nucleotídeo

OMS Organização Mundial da Saúde (WHO – World Health

Organization)

ORF Fase de leitura aberta (do inglês, Open Reading Frame)

pb Par de bases

PBS Solução salina fosfato tamponada (do inglês, Phosphate Buffered

Saline solution)

PCR Reação em cadeia da polimerase (do inglês, Polimerase Chain

Reaction)

PDB Do inglês, Protein Data Bank

PDK Do inglês, Primary Dog Kidney

PDVI Do inglês, Pediatric Dengue Vaccine Initiative

pfu Unidade formadora de placa (do inglês, plaque forming unit)

PGMK Do inglês, Primary Green MonkeyKidney

pH Potencial de hidrogênio

xiv

p.i. Pós-infecção

PM Peso molecular

Poli-A Estrutura poliadenilada da extremidade 3’ do mRNA

POP Protocolo de Operação Padronizado

prM Precursor da proteína de membrana

PRNT Teste de neutralização da redução da formação de placas de lise (do

inglês, Plaque Reduction Neutralization Test)

q.s.p. Quantidade suficiente para preencher

RE Retículo endoplasmático

RNA Ácido ribonucléico

RNAm Ácido ribonucléico mensageiro

RNase Ribonuclease

RT 1. Transcriptase reversa ou RNA polimerase dependente de DNA;

2. Reação de transcrição reversa

SDS Dodecil sulfato de sódio (do inglês, Sodium Dodecil Sulfate)

SOC Meio SOC (do inglês, Super Optimal Catabolite)

SFB Soro fetal bovino

SPF Livre de patógeno específico (do inglês, Specific Pathogen Free)

SURE Do inglês, Stop Unwanted Rearrangement Events

T Timina

TA Temperatura ambiente

TAE Tampão tris-acetato-EDTA

TBE Vírus da Encefalite Tick-Borne (do inglês, Tick-Borne Encephalite

virus)

TE Tampão Tris-EDTA

TNF Fator de necrose tumoral (do inglês, Tumor Necrosis Factor)

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

U 1.Uracila 2. Unidade

UPR Do inglês, Unfolded Protein Response

UTR Região não traduzida (do inglês, Untranslated Region)

VLP Do inglês, Virus Like Particle

YF Yellow Fever

WNV Vírus do Oeste do Nilo (do inglês, West Nile Virus)

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1 - Distribuição geográfica do Aedes aegypti nas Américas em 1930, 1970 e

2001______________________________________________________________3

Figura 1.2 - Distribuição global de dengue, Febre Amarela e o seu vetor Aedes aegypti_______3

Figura 1.3 - Vírus da dengue evidenciando a proteína E e seus domínios__________________9

Figura 1.4 - Estrutura Genômica e Processamento da Poliproteína nos Flavivirus___________11

Figura 1.5 - Topologia de membrana das proteínas de Flavivírus no RE__________________12

Figura 1.6 - Estrutura da proteína E do vírus dengue 3 presente nas partículas virais

maduras___________________________________________________________13

Figura 1.7 - Representação dos ectodomínios da proteína E e seus domínios

transmembranares___________________________________________________14

Figura 1.8 - Ciclo de vida de um Flavivírus_________________________________________16

Figura 1.9 - Mapeamento das áreas de DIII relacionadas a mutantes de escape de neutralização

por anticorpos______________________________________________________18

Figura 1.10 - Comparação entre os resíduos não conservados entre os vírus den-2 e den-

3________________________________________________________________19

Figura 1.11 - Histórico de passagens do genótipo selvagem Asibi e sua derivação até os

genótipos vacinais

17D_____________________________________________________________22

Figura 1.12 - Representação esquemática da proteína E do vírus da Febre Amarela e das

plataformas de expressão referentes às Construções I e II, e a organização das

mesmas no retículo endoplasmático_____________________________________26

Figura 4.1 - Obtenção do cassete de expressão inserido na região intergênica E/NS1 do genoma

de FA 17DD_______________________________________________________40

Figura 4.2 - Mapa do vetor PCR-Blunt II-TOPO, parte do sistema comercial de clonagem Zero

Blunt TOPO, indicando os genes de resistência aos antibióticos canamicina e

zeocina___________________________________________________________42

Figura 4.3 - Mapas dos plasmídeos pT3 íntegro e pT3 recombinante, contendo a inserção do

domínio III de dengue-

2________________________________________________________________47

xvi

Figura 4.4 - Mapa do plasmídeo pG1.2. Este plasmídeo contém as regiões 3’ e 5’ do genoma do

vírus FA 17DD_____________________________________________________52

Figura 5.1 - Alinhamento múltiplo das seqüências de aminoácidos de DIII de diferentes

genótipos do vírus dengue, sorotipo 2, com suas respectivas fitas

________________________________________________________________62

Figura 5.2 - Alinhamento múltiplo das seqüências de aminoácidos de DIII entre os 4 sorotipos

do vírus dengue, incluindo o cassete de expressão__________________________63

Figura 5.3 - Análise seqüencial dos componentes do cassete de expressão DIII den-2 HA trunc

den-4_____________________________________________________________65

Figura 5.4 - Alinhamento múltiplo das seqüências molde para a realização da modelagem do

DIII den-2 utilizado para a geração do cassete de inserção___________________67

Figura 5.5 - Modelo do domínio III da proteína E de den-2 utilizado para a construção do vírus

recombinante FA 17D/DIII den-2______________________________________68

Figura 5.6 – Plot de Ramachandran gerado pelo programa PROCHECK__________________69

Figura 5.7 – Substituições de aminoácidos observadas entre os genótipos de den-2 (esferas

amarelas)__________________________________________________________70

Figura 5.8 - Epítopos mapeados no DIII den-2______________________________________71

Figura 5.9 - Modelo do DIII den-2 evidenciando o resíduo D390 (esfera violeta)___________72

Figura 5.10 - Modelo do DIII den-2- domínio de ligação a receptores celulares_____________73

Figura 5.11 - Mapa da superfície eletrostática do DIII den-2___________________________74

Figura 5.12 - Regiões da proteína E e NS1 do vírus Febre Amarela 17D usadas na montagem do

cassete de expressão do domínio III da proteína E dos vírus dengue

2________________________________________________________________76

Figura 5.13 - Obtenção do cassete de expressão DIII den-2 HA truncada den-4____________78

Figura 5.14 - Mapa do plasmídeo PCR-Blunt II TOPO recombinante, contendo o cassete de

expressão do domínio III de dengue-2___________________________________78

Figura 5.15 - Sub clonagem do cassete de expressão no vetor pT3 e transformação em E. coli

SURE____________________________________________________________81

Figura 5.16 - Obtenção do molde de cDNA do vírus FA 17DD DIII den-2 HA truncada den-

4________________________________________________________________82

Figura 5.17 - Transcrição in vitro dos moldes de cDNA do vírus FA 17DD DIII den-2 HA

truncada den-4_____________________________________________________83

xvii

Figura 5.18 - Clonagem e Sub-clonagem para obtenção do molde de cDNA completo viral

recombinante______________________________________________________84

Figura 5.19 - Cromatogramas dos vírus recombinantes FA 17D/DIII den-2 VGA – sem mutação

(A) e FA 17D/DIII den-2 IGA – mutado (B)______________________________86

Figura 5.20 - RT-PCR dos sobrenadantes de transfecção e infecção dos vírus recombinantes FA

17D/DIII den-2 IGA (mutado) e FA 17D/DIII den-2 VGA (sem

mutação)__________________________________________________________88

Figura 5.21 - Cinética de replicação dos vírus recombinantes FA 17D/DIII den-2 VGA e FA

17D/DIII den-2 IGA, e dos vírus controle FA 17DD e FA 17D/G1.2-T3 em

monocamadas de células

Vero_____________________________________________________________89

Figura 5.22 - Fotomicrografias da cinética de replicação viral__________________________92

Figura 5.23 - Estabilidade genética dos vírus FA 17D recombinantes____________________96

Figura 5. 24 - Detecção da expressão do DIII de den-2_______________________________98

xviii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.1 - Comparação entre doenças causadas por Flavivírus e transmitidas por

mosquitos_________________________________________________________6

Tabela 1.2 - Lista parcial das vacinas candidatas contra dengue em

desenvolvimento__________________________________________________21

Tabela 4.1 – Seqüência dos oligonucleotídeos utilizados para a construção do cassete de

expressão DIII den-2 HA den-4_______________________________________39

Tabela 4.2 - Características genotípicas da cepa bacteriana usada durante o processo de

transformação com o Kit de clonagem Zero Blunt TOPO__________________41

Tabela 4.3 - Seqüência dos oligonucleotídeos utilizados para o seqüenciamento do cassete de

expressão DIII den-2 HA den-4 clonado no vetor comercial PCR-Blunt II-TOPO___________45

Tabela 4.4 - Características genotípicas da cepa bacteriana usada durante o processo de

subclonagem do cassete de expressão no vetor pT3_______________________49

Tabela 4.5 - Seqüência dos oligonucleotídeos utilizados para o seqüenciamento do cassete de

expressão DIII Den-2 HA Den-4 subclonado em pT3_____________________50

Tabela 4.6 - Oligonucleotídeo sintético utilizados no seqüenciamento nucleotídico do cassete de

expressão do domínio III den-2, clonado na região intergênica E/NS1 de FA

17D____________________________________________________________55

Tabela 5.1 - Alterações observadas na seqüência de aminoácidos de DIII após alinhamento

múltiplo entre diferentes genótipos do vírus dengue

2_______________________________________________________________68

Tabela 5.2 - Identidade das seqüências de DIII e Haste-âncora da proteína E utilizadas na

montagem do cassete de expressão____________________________________71

Tabela 5.3 - Títulos dos vírus FA 17D controles e recombinantes_______________________93

Tabela 5.4 - Cinética de Replicação Viral em Cultura de Células Vero___________________95

Tabela 5.5 – Estabilidade Genética do vírus recombinante FA17D/DIII den-2 VGA________99

Tabela 5.6 - Estabilidade Genética do vírus recombinante FA17D/DIII den-2 IGA ________100

Tabela 5.7 – Mutações observadas no vírus recombinantes FA 17D/DIII den-2 IGA________102

Tabela 5.8 – Mutações observadas no vírus recombinantes FA 17D/DIII den-2 IGA________103

xix

RESUMO

A dengue é uma arbovirose transmitida ao homem por meio da picada de insetos vetores

que albergam o vírus dengue (gênero Flavivírus, família Flaviviridae). Este vírus apresenta-se

como 4 sorotipos (den-1 a den-4), antigenicamente distintos, embora todos possuam mesma

epidemiologia e causem os mesmos sintomas. A infecção por dengue é caracterizada por amplo

espectro de manifestações clínicas e sua re-emergência é responsável por grande impacto na

saúde pública mundial. Apesar de diversas tentativas para o desenvolvimento de uma vacina

contra dengue, nenhuma ainda está disponível. Neste trabalho utilizamos o vírus vacinal da Febre

Amarela 17D (FA 17D) para expressão do domínio III (DIII) da proteína de envelope (E) de den-

2, na região intergênica E/NS1, baseado nas boas propriedades da vacina contra FA. A escolha do

DIII den-2 justifica-se por ele estar associado a processos de infecção celular e por ser o principal

indutor de resposta imune mediada por anticorpos neutralizantes dirigida à partícula viral. O

estudo de alinhamento do DIII de diferentes genótipos e a sua modelagem molecular permitiram

uma melhor caracterização desta região em relação à sua variabilidade, mutantes de escape de

neutralização e sítios de ligação a receptores celulares. A abordagem de expressão do DIII da

proteína E de den-2 no genoma do vírus FA 17D baseou-se na montagem do cassete de expressão

contendo motivos duplicados de aminoácidos conservados, flanqueadores da região intergênica E

e NS1 (Bonaldo et al., 2007), permitindo desta forma, o correto processamento da poliproteína

viral em associação ao retículo endoplasmático (RE) celular. Foram gerados dois diferentes vírus

FA recombinantes que albergavam a inserção heteróloga correspondente ao DIII den-2,

indicando que esta inserção não acarretou em um grande comprometimento da estrutura e função

virais. Estes vírus FA recombinantes diferiam entre si quanto à porção C-terminal do cassete de

expressão, onde um deles apresentava uma mutação no sítio de clivagem da enzima peptidase

sinal do hospedeiro, entre as proteínas E e NS1. A expressão do DIII den-2 por ambos os

recombinantes foi confirmada por imunofluorescência confocal. Seus perfis proliferativos foram

avaliados por meio de cinética de replicação em monocamadas de células Vero, onde os vírus

recombinantes exibiram menores taxas de replicação quando comparados aos controles. A

estabilidade genética destes recombinantes foi analisada por passagens seriadas em culturas de

células Vero, cujos sobrenadantes foram submetidos a RT-PCR para avaliação da presença da

inserção heteróloga. Ambos os vírus mostraram-se estáveis até a 5ª passagem seriada e

apresentaram perda total do cassete de expressão a partir da décima passagem. No entanto, o

vírus que apresentou a mutação em sua porção C-terminal foi ainda mais instável, pois mostrou

deleção de cerca de 300 aminoácidos no cassete de expressão. A perda da inserção heteróloga em

ambas as construções virais sugere que a clonagem e expressão de DIII den-2/HA truncada den-4

exerce um efeito deletério na viabilidade viral. No entanto, este fato não limita a utilização destes

vírus como modelo de estudos para vacinação e indução de anticorpos neutralizantes dirigidos ao

vírus den-2 ou outro Flavivírus.

ABSTRACT

Dengue is an arboviruse transmitted to human throught insect vector’s bite which bear the

dengue virus. Dengue virus consists of four serotypes (den-1 to den-4), which are antigenically

distinct, sharing the same endemic tropical and subtropical areas in the world. The dengue virus

infection is characterized by a wide range of clinical manifestations and its re-emergence is

responsible for a great impact on global public health. Despite all attempts towards a dengue

vaccine, there is no available one. In this work, we have employed the Yellow Fever 17D

Vaccine Virus (YF 17D) as a vector for expression of domain III (DIII) of dengue virus type 2

(den-2) envelope protein (E) within the intergenic region E/NS1, based on the advantageous

characteristics of YF 17D as a human vaccine. DIII den-2 was chosen due to its association with

cellular infection and for being the main inductor of immune response mediated by neutralizing

antibodies against the viral particle. Multiple alignments of different DIII genotypes and its

molecular modeling allowed a better characterization of this region in respect of the recognition

of amino acid sequence positions which are variable, involved in escape from neutralizing

antibodies and cellular receptor binding sites. The expression of envelope protein domain III of

dengue 2 virus was accomplished using a previously described approach to insert a foreign gene

in the E/NS1 intergenic region (Bonaldo et al., 2007). Thus, DIII gene was fused to functional

duplicated motifs of conserved amino acids sequences, which occur flanking the E/NS1

intergenic region and are important to the correct processing of the viral polyprotein precursor in

association with the endoplasmic reticulum (ER). It was generated two distinct viable YF

recombinant viruses bearing the heterologous DIII den-2 insertion, demonstrating the feasibility

of this methodology. One of these recombinant viruses has presented a mutation on the cleavage

site of the cellular signal peptidase, at the end of the last transmembrane of anchor domain,

between the proteins E and NS1. The expression of DIII den-2 by both recombinants virus was

confirmed by confocal immunofluorescence microscopy. Its proliferative profiles were assessed

by means of growth kinetic studies in Vero cells, which pointed to a lower replication capability

in comparing to the viral vaccine control viruses. The genetic stability of these recombinants was

also analyzed by serial passages in Vero cells and the RNA virus samples derived from different

passages were submitted to RT-PCR in order to evaluate the presence of the heterologous

insertion. Both recombinant viruses were genetically stable up to the fifth serial passage in Vero

cells and exhibited completely loss of the expression cassette starting from the tenth serial

passage. Nevertheless, the recombinant virus which carried the IGA motif mutation at the C-

terminal of the cassette was even more unstable, since it displayed a deletion of about 300 amino

acids in the expression cassete at fifth passage. The loss of the heterologous cassete in both of the

viral constructs suggests that the cloning of DIII den-2 fused to a portion of the stem anchor

region of den 4 E protein induced a deleterious effect on the viral viability. Notwithstanding, this

fact does not limit the use of these viruses as a model of vaccination for studies of induction of

neutralizing antibodies against den-2 virus or other Flavivirus.

1. INTRODUÇÃO

1.1 Histórico da Dengue, sua Emergência e Patogenia

A dengue é uma arbovirose transmitida ao homem por meio da picada de insetos vetores

que albergam o vírus da dengue (Mackenzie, 2004). Seus vetores são mosquitos do gênero Aedes

(Aedes aegypti e Aedes albopictus), tendo como o principal deles o mosquito Ae. aegypti. Uma

série de boas características contribuem para a preponderância deste vetor: ter ampla distribuição

mundial, ser altamente suscetível ao vírus dengue, alimentar-se preferencialmente de sangue

humano, ter hábitos diurnos e peridomiciliares, ter picada praticamente imperceptível, e ser capaz

de interromper seu repasto sanguíneo ao menor movimento, permitindo que um grande número

de indivíduos seja picado durante uma única alimentação (Gubler, 1998; Gibbons e Vaughn,

2006).

A dengue é caracterizada clinicamente por vasto espectro de doença que pode variar desde

uma infecção não-aparente, normalmente confundida com resfriados comuns, até casos mais

severos de febre hemorrágica da dengue (DHF) e síndrome de choque por dengue (DSS) (Gubler,

2004). É o único membro entre os arbovírus que teve sua evolução direcionada para a perfeita

adaptação ao homem como seu hospedeiro, eliminando a necessidade de manutenção de um ciclo

biológico restrito à vida silvestre (Gubler, 2002b).

Os primeiros registros de casos de dengue no mundo estão reunidos em uma enciclopédia

chinesa de sintomas e remediações de doenças, publicada durante a Dinastia Chinesa (265 a 420

DC) (Gubler, 1998). A doença era chamada de “água venenosa”, pois acreditavam que ela era

transmitida via insetos que tinham seu ciclo biológico associado à água (Gubler, 1998). O autor

ainda evidencia que houve surtos da doença em 1635 nas “French West Indies”, bem como no

Panamá, em 1699, fatos que comprovam a ampla distribuição geográfica da dengue antes do

século 18.

A inicial expansão geográfica desta doença está intimamente ligada à disseminação do

vetor Ae. aegypti a partir da África para outras regiões tropicais, no período de crescimento da

navegação e do comércio durante os séculos 17 e 18 (Gubler, 2004). Os navios armazenavam

água, onde era realizada a postura dos ovos e eclosão das larvas, assegurando, assim, a

manutenção do ciclo, mesmo em viagens de longas distâncias (Gubler, 2002a). Quando o navio

aportava no seu destino, ambos, mosquito e vírus, eram introduzidos e, devido à morosidade

desse tipo de transporte, as epidemias não eram freqüentes, tendo intervalos que variavam de 10 a

40 anos (Gubler, 2002a).

Uma vez presente vírus e seu vetor, a propagação de ambos foi possível nas regiões

portuárias, onde, por sua vez, estabeleceram-se e passaram a ser transportados para outras

localidades tropicais ao redor do mundo (Gubler, 2004). Todavia, a origem do vírus dengue ainda

permanece incerta e não é bem explicada pelos autores.

Diversas epidemias de dengue já foram reportadas nas Américas, desde a ocorrida em

1780 na Filadélfia. Na Ásia, a ocorrência da epidemia de dengue foi comum nos primeiros anos

do século 20 e, no continente Africano, cuja epidemiologia não é bem documentada, a presença

do vírus da dengue não foi notificada antes de 1960 (Gubler, 2004).

A erradicação do mosquito vetor Ae. aegypti ocorreu no ano de 1947, em toda a América

tropical, resultado do programa de controle da Febre Amarela urbana (doença que também tem

como vetor o Ae. aegypti), a partir do uso do inseticida diclorodifeniltricloroetano (DDT)

(Gubler, 2002a). Dessa forma, o índice epidêmico de dengue diminuiu e até desapareceu em

muitas regiões (Gubler, 2002a; Senior, 2007; Figura 1.1).

No entanto, no período após a 2ª Guerra Mundial, algumas condições formaram o

conjunto ideal para a continuidade da transmissão da dengue: o rápido crescimento populacional

somado à urbanização desordenada, as precárias condições sanitárias e a rapidez do transporte

aéreo, fato este que proporcionou meios para maior mobilidade das populações humanas entre as

regiões epidêmicas (Gubler, 1998). Devido a esses motivos, a dengue tomou proporções

mundiais e passou a ser considerada como uma pandemia, sendo encontrada em regiões tropicais

e subtropicais ao redor do mundo, em áreas urbanas e também rurais (Gubler, 1998; Monath,

1999; Chaturvedi, 2006; Figura. 1.2).

Figura 1.1 - Distribuição geográfica do Aedes aegypti nas Américas em 1930, 1970 e 2001 – cor verde

(Fonte: Gubler, 2002a).

Figura 1.2 - Distribuição global de dengue, Febre Amarela e o seu vetor Aedes aegypti. Em rosa, são

mostradas as áreas geográficas infestadas com o mosquito vetor. Em lilás, as áreas em que o Ae. aegypti e

atividades endêmicas para dengue estão presentes e nas áreas listradas, regiões endêmicas para Febre

Amarela. (Fonte: Monath, 2007).

O vírus dengue apresenta-se como 4 sorotipos distintos já descritos (den-1, den-2, den-3 e

den-4), classificados de tal forma devido a diferentes antígenos expressos na superfície viral, que

induzem a produção de anticorpos neutralizantes sorotipo-específico (Burke e Monath, 2001).

Embora haja grande reatividade cruzada entre esses vírus em testes sorológicos, a proteção

cruzada entre eles não é observada: uma primeira infecção causada por um sorotipo é capaz de

induzir imunidade protetora por toda a vida contra este sorotipo, embora a imunidade contra os

demais perdure somente alguns meses (Mackenzie et al., 2004). Este curto período de proteção

cruzada é resultado da presença de anticorpos neutralizantes reativos que diminuem rapidamente

após a infecção (Sabin, 1952). Por estes motivos, um indivíduo pode contrair a dengue por até

quatro vezes ao longo de sua vida (Mackenzie et al., 2004).

Todos os quatro sorotipos têm a mesma epidemiologia e causam os mesmos sintomas da

doença no homem (Gubler, 2002b). Um único sorotipo viral pode estar presente em uma região,

fato que caracteriza sua endemicidade, normalmente associado a doenças mais suaves, chamadas

de febre da dengue (DF), apresentando a seguinte sintomatologia: febre alta, dor de cabeça, dor

retro-orbital, mialgias e artralgias generalizadas, vômitos e coceira na pele (Monath, 2007).

Em outro panorama, vários sorotipos podem estar co-circulando em uma mesma

população, o que define a hiperendemicidade (Gubler, 2002b). Infecções secundárias, virulência

do sorotipo, carga genética e imunidade pré-existente do hospedeiro são fatores de risco para a

evolução em doenças mais severas, como a DHF e a DSS (Chaturvedi, 2006 e Guy, 2008). Estas

formas mais graves da DF, a princípio, lembram essa forma mais branda da doença, porém

evoluem para quadros de trombocitopenia; manifestações hemorrágicas causadas por fragilidade

capilar, como o sangramento de mucosas e trato gastrointestinal; aumento da permeabilidade

vascular com vazamento de fluido intravascular para o espaço intersticial (hipovolemia); ascite;

falência hepática (hepatomegalia) e, em se tratando de viremia, esta é normalmente de 10 a 100

vezes maior quando comparada com a forma clássica da doença (Gubler, 1998; Whitehead,

2007). A patogênese da DHF e DSS é bastante complexa e ainda não está completamente

entendida (Whitehead, 2007).

As alterações observadas quanto à coagulação e permeabilidade vascular podem estar

relacionadas ao aumento da taxa replicativa do vírus, morte acentuada das células pela infecção

ou por células citotóxicas do sistema imune ou ainda por anticorpos; ativação do complemento e

aumento da liberação de mediadores inflamatórios pelas células infectadas ou por células do

sistema imune. A resposta imune contra a infecção por dengue não apenas media a proteção

contra a doença, como também parece ser responsável pela patogenia observada em DHF e DSS,

além dos outros fatores já mencionados acima. Uma das possíveis explicações para este

fenômeno é chamado de ADE, do inglês “antibody-dependent enhancement” e é observada após

uma infecção secundária por um sorotipo diferente do responsável por ter causado a infecção

primária (Halstead, 1988). Anticorpos não neutralizantes pré-existentes adquiridos ativamente a

partir da primeira infecção, ou transmitidos passivamente pela mãe a recém-nascidos, ligam-se ao

vírus sorotipo distinto, formam um complexo e facilitam a acesso deste a porções Fc de

receptores presentes em células dendríticas e macrófagos (Monath, 2007 e Whitehead, 2007).

Este fato aumenta a carga viral, por facilitar a entrada de vírus nas células hospedeiras e sua

conseqüente replicação. Além disso, ocorre aumento na liberação de citocinas e mediadores pró-

inflamatórios responsáveis pelo choque hipovolêmico e morte, enquanto que o aumento da

replicação viral contribui para uma elevação no título do vírus na corrente sanguínea dos

pacientes com DHF e DSS (Monath, 2007 e Whitehead, 2007).

1.2 A Dengue no Mundo

O primeiro caso de DHF foi registrado em 1950, durante as epidemias de dengue nas

Filipinas e Tailândia. Somente nove países tinham apresentado casos de DHF antes de 1970,

enquanto que nos dias de hoje essa prevalência cresceu dramaticamente, com números que

norteiam mais de 100 países acometidos pela doença, em vários continentes (Chaturvedi, 2006).

Uma das causas para estes surtos é o aumento da migração das populações das áreas rurais em

direção às urbanas, o que leva a uma ocupação desordenada, com acúmulo de água parada,

gerando um ambiente ideal para a criação de mosquitos vetores (Normile, 2007).

Durante a década de 80, menos de 300.000 casos de dengue foram registrados pela OMS;

desde o ano de 2000, este número subiu para 925.000 e, devido ao fato de a vigilância ser

precária, estima-se que o verdadeiro número de casos anuais de dengue seja superior a 50

milhões, dentre os quais, 400 mil são representativos de DHF (Normile, 2007).

Aproximadamente 5% dos casos de DHF são fatais se não tratados, mas o tratamento adequado

reduz este índice para menos de 1% (Normile, 2007). Globalmente, cerca de 2,5 bilhões de

pessoas vivem em áreas onde a dengue é endêmica e 90% dos casos de DHF acometem crianças

com idade inferior a 15 anos (média de idade entre 5-10 anos) (Normile, 2007; Edelman, 2005 e

2007).

O Sudeste Asiático experimenta o pior surto de dengue registrado na última década, tendo

a dengue quase que superado outra doença comum neste continente, a malária, quanto ao índice

de hospitalizações pediátricas e de adultos e o número de mortes infantis (Hombach, 2007 e

Normile, 2007) (Tabela 1.1). Na Indonésia, mais de 100.000 indivíduos contraíram a doença e,

desses, 1.100 foram a óbito, com 93% dos 310 distritos desta província reportando casos da

doença (Edelman, 2005 e Nature, 2007).

Tabela 1.1 - Comparação entre doenças causadas por Flavivírus e transmitidas por mosquitos.

DOENÇAS TRANSMITIDAS POR MOSQUITOS

Doença

Agente

etiológico

Gênero do

mosquito

Casos

anuais

estimados

Mortes

anuais

estimadas

Países

afetados

Vacina

Dengue Vírus dengue Aedes

50-100

milhões

20.000 > 100

Em ensaios

clínicos

Febre

Amarela

Vírus da

Febre

Amarela

Aedes e

Haemagogus

200 mil 30.000 > 42 Disponível

Malária

Plasmodium

falciparum,

P. vivax, P.

malaria e P.

ovale

Anopheles 500 milhões > 1 milhão > 105

Em ensaios

clínicos

Fonte: Adaptado de Nature, 2007.

Uma vez que não há tratamento específico para dengue, faz-se necessário uma mudança

de paradigma para o controle desta doença, sendo inviável pensar que somente o tratamento com

inseticidas será responsável pela total contensão do Ae. aegypti (Senior, 2007). Medidas

preventivas que giram em torno da conscientização individual devem ser tomadas, além de haver

um fortalecimento das leis sanitárias, da qualidade da atenção médica para um diagnóstico mais

rápido e eficiente, maior acesso da população aos serviços de saúde e a promoção da educação

sanitária (Guy, 2008 e Guzman, 2007).

1.3 A Dengue no Brasil

A primeira epidemia de dengue confirmada por testes laboratoriais no Brasil ocorreu em

Boa Vista, Roraima, no final do ano de 1981, quando foram isolados a partir de soros de paciente

e “pool” de Ae. aegypti, os sorotipos 1 e 4 do vírus dengue (Osanai et al., 1983). Em 1986, no

estado do Rio de Janeiro, cidade de Nova Iguaçu, foi registrado o primeiro caso de dengue tipo 1

e uma epidemia causada por este sorotipo se estendeu até 1987, com aproximadamente 140.000

casos reportados (Schatzmayr et al., 1986; Miagostovich et al., 1993). Os estados de Alagoas e

Ceará, em 1986, e Mato Grosso do Sul, em 1987, também foram afetados pelo sorotipo 1 do vírus

dengue (Ministério da Saúde, 1990). Em 1987, um surto foi registrado em São Paulo, sendo

controlado em 1990 (Figueiredo, 1996).

A partir de abril de 1990, começaram a surgir casos de dengue tipo 2 no Rio de Janeiro e

Niterói, exatamente quatro anos após a primeira detecção de dengue-1, fato provavelmente

resultante de uma mesma rota de entrada utilizada pelos vetores durante o verão (Nogueira et al.,

1990). Entre os meses de maio e abril do mesmo ano, foram isoladas representantes do sorotipo 1

de dengue em Niterói, indicando a co-circulação desses dois sorotipos (Nogueira et al., 1990 e

1993). O sorotipo 2 de dengue também foi detectado em Tocantins e Alagoas, indicando a rápida

disseminação do vírus (Nogueira et al., 1993). A introdução do tipo 2 resultou no surgimento de

infecções mais graves acompanhadas de DHF/DSS, com 283 casos classificados como DHF em

1991 (Nogueira et al., 1991; Dias et al., 1991). O número de casos reportados de dengue sorotipo

1 diminuiu após 1991, fato que se deu pelo aumento do número de casos relacionados ao tipo 2,

ao status de imunidade atingido pela população contra o tipo 1, bem como a susceptibilidade ao

novo sorotipo (Nogueira et al., 1993).

O sorotipo 3 do vírus dengue foi isolado a partir de um caso importado de um paciente

residente em Limeira, estado de São Paulo, no ano de 1998 (Rocco et al., 2001). Em janeiro de

2001 na cidade de Nova Iguaçu, Rio de Janeiro, este sorotipo foi isolado de uma paciente que

apresentava sinais e sintomas de dengue clássico (Nogueira et al., 2001). O den-3 foi responsável

pela epidemia mais grave já observada, até então, no estado do Rio de Janeiro, durante os verões

de 2001 e 2002, com 288.245 casos notificados de dengue, incluindo 91 mortes por infecções

primárias causadas por esse sorotipo (De Simone et al., 2004; Nogueira et al., 2002).

De acordo com dados da Secretaria Municipal de Saúde, no ano de 2007 foram

registrados 23.399 casos de dengue no município do Rio de Janeiro, e só nos dois primeiros

meses de 2008, este número já atinge mais de 10.000 casos, mostrando a grave situação de surto

epidêmico nesta localidade. (Secretaria Municipal de Saúde – RJ). Dada a responsabilidade do

estado do Rio de Janeiro na introdução e disseminação dos sorotipos 1, 2 e 3 de dengue, sua

importância na epidemiologia desta doença no Brasil é clara e, como um importante centro

turístico, este estado merece atenção diferenciada, já que apresenta altos níveis de infestação pelo

mosquito Ae. aegypti (Nogueira et al., 2007).

1.4 Ciclo Biológico

Lourenço-de-Oliveira (2005) mostra que o ciclo inicia-se quando o mosquito fêmea, ao

realizar seu repasto sanguíneo, ingere sangue contendo partículas virais e, quanto mais altos

forem os títulos virais, maiores serão as chances de transmissão.

No estômago do inseto, o vírus é capaz de escapar da matriz peritrófica, dirigindo-se ou

para a hemolinfa ou para a rede de traquéias que oxigenam todos os tecidos do vetor. Alguns

tecidos têm preferência pelo vírus, como, por exemplo, o nervoso, o corpo gorduroso, os ovários

e as glândulas salivares. Nas glândulas salivares, as partículas virais replicam-se, acumulam-se e

são inoculadas num próximo vertebrado durante a alimentação com sangue realizada pelo

mosquito vetor (Lourenço-de-Oliveira, 2005). Este período é chamado de incubação extrínsico,

representado pelo tempo necessário para que ocorra a replicação e disseminação viral no

mosquito e ele se torne infectivo (8 a 12 dias) (McBride e Bielefeldt-Ohmann, 2000).

Após o homem ter sido picado por um mosquito infectado, o vírus passa por um período

de incubação entre 3 e 14 dias, depois do qual o vírus irá infectar primeiramente células

dendríticas imaturas da pele e células de Langerhans, com subseqüente infecção de macrófagos e

linfócitos (Gubler, 1998; Wu et al., 2000; Marovich, 2001). Depois desta replicação inicial, o

vírus é encontrado na corrente sanguínea nos períodos de febre aguda que duram de 3 a 5 dias,

fato responsável pela doença ser chamada de “febre de quebrar os ossos”, em algumas regiões do

mundo (Normile, 2007; Guy, 2008). Este período é chamado de fase virêmica, uma vez que é

nesta fase que ocorre a contaminação de mosquitos ao picar um indivíduo infectado. Outros

locais do corpo podem ser escolhidos pelo vírus como sítio replicativo, como é o caso do fígado,

timo e baço (Jessie et al., 2004).

O ciclo é mantido numa transmissão homem-mosquito-homem, sendo que a transmissão

pelo ciclo selvagem é vista em florestas da Ásia e África ocidental entre primatas não-humanos e

mosquitos do gênero Aedes. No entanto, a contribuição deste ciclo para a transmissão de

epidemias urbanas parece ser mínima (Whitehead, 2007).

1.5 O Vírus da Dengue: Etiologia, Genoma e Replicação

O vírus da dengue faz parte da família Flaviviridae e do Gênero Flavivírus. No entanto, o

primeiro vírus desse grupo a ser descrito foi o vírus da Febre Amarela e, por isso, o nome dado ao

grupo deve-se a ele (do latim flavus, amarelo). A família Flaviviridae ainda é formada por dois

outros Gêneros: Pestivus (do latim pestis, praga) e Hepacivirus (do latim hepar, fígado)

(Lindenbach e Rice, 2001).

A família Flaviviridae inclui 70 representantes, dos quais 40 destes estão relacionados a

doenças em animais e humanos, dentre elas: febre da dengue (“Dengue Fever”), encefalite

japonesa (“Japanese Encephalitis - JEV”), encefalite transmitida por carrapato (“Tick-Borne

Encephalitis - TBE”), Vírus do Oeste do Nilo (“West Nile - WNV”), e Vírus da Febre Amarela

(“Yellow Fever Virus - YFV”) (Burke e Monath, 2001). Estes representantes se dividem em dois

grupos de acordo com o vetor de transmissão: aqueles que são transmitidos por mosquitos como,

por exemplo, dengue e Febre Amarela, e aqueles transmitidos por carrapatos, como é o caso de

TBE, Vírus Langat (LGT), dentre outros (Lindenbach e Rice, 2001).

Os Flavivírus são vírus esféricos, pequenos, medindo de 40 a 60 nm de diâmetro,

envelopados e com capsídeo icosaédrico, que alberga em seu interior uma molécula de RNA fita

simples positiva (ssRNA+), sendo, portanto, seu próprio genoma infectivo (Burke e Monath,

2001; Ball, 2001).

A Figura 1.3 representa a estrutura de um vírus da dengue maduro. As diferentes cores

representam os distintos domínios da proteína E, a principal proteína do envelope viral dos

Flavivírus. Os domínios da proteína E serão melhores abordados posteriormente.

Domínio I

Domínio II

Domínio III

Peptídeo de fusão

Proteína do Envelope (E)

Figura 1.3 - Vírus da dengue evidenciando a proteína E e seus domínios. (Fonte: Adaptado de

Whitehead, 2007).

O genoma RNA fita simples positiva dos Flavivírus tem aproximadamente 11 kb de

comprimento (Figura 1.4), apresentando, na extremidade 5’, a estrutura “cap” e uma curta região

não traduzida (UTR); e, na extremidade 3’, não existe a cauda poliadenilada (Lindenbach e Rice,

2001). Estas regiões UTR virais têm extrema importância, uma vez elas são altamente

conservadas, responsáveis pela iniciação da replicação do vírus e pela tradução da poliproteína

precursora viral (Chambers et al., 1990; Zanotto et al., 1996; Corver et al., 2003; Lo et al., 2003;

Holden e Harris, 2004).

A organização genética do genoma do vírus da dengue é a mesma como em todos os

Flavivírus: o RNA fita positiva codifica para uma única poliproteína precursora de 3.411

aminoácidos, que sofre clivagem proteolítica, combinando proteases virais e celulares, dando

origem a 10 polipeptídeos específicos virais (Lindenbach e Rice, 2001).

Segundo Rice et al. (1985), na extremidade 5’ da molécula de RNA, ou seja, no primeiro

quarto do genoma, são codificadas 3 proteínas estruturais que estão envolvidas na incorporação e

na liberação da partícula viral a partir da célula hospedeira: a proteína do capsídeo (C; 12-14

kDa), a proteína de membrana (M; 8 kDa e seu precursor prM; 18-26 kDa) e a proteína do

envelope (E; 53-54 kDa). Em seguida, são codificadas as proteínas não estruturais (NS),

envolvidas na replicação viral, bem como no processamento deste polipeptídeo; são elas: NS1,

NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. (Rice et al., 1985). A ordem em que as proteínas

estruturais e não-estruturais são codificadas no genoma, a partir da extremidade 5’ em direção a

3’ é a seguinte: 5’-C-prM/M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’ (Rice et al., 1985)

(Figura 1.4).

A poliproteína precursora viral é sintetizada no citoplasma celular em associação com o

retículo endoplasmático (RE) rugoso. As proteínas estruturais são translocadas para o lúmen do

retículo sendo clivadas pela peptidase sinal da célula hospedeira e ali ancoradas, por meio dos

domínios âncoras transmembranares (Mukhopadhyay et al., 2005). A proteína C interage com o

RNA genômico e forma o nucleocapsídeo do virion (Lindenbach e Rice, 2001). Esta proteína

contém uma seqüência sinal hidrofóbica responsável por translocar a proteína prM para o lúmen

do RE (Mukhopadhyay et al., 2005). A proteína prM tem dois domínios transmembranares que

funcionam como seqüências de parada de transferência e também como seqüência sinal. Como

resultado, a proteína E também é translocada para o lúmen do RE (Mukhopadhyay et al., 2005)

(Figura 1.5).

Flavivírus: RNA genômico, polaridade positiva (~ 11 kb)

Protease viral

NS2B/NS3

Genes estruturais Genes não estruturais

5′ 3′

Tradução e processamento da poliproteína viral (3.411 aa)

CEprM NS54BNS3

2B2A

NS1 4A

Partícula viral

Proteínas do envelope: prM/M e E

Proteína C do nucleocapsídeo

Replicação do genoma viral

Signalase

Furina

Figura 1.4 - Estrutura Genômica e Processamento da Poliproteína nos Flavivírus. As setas verdes

indicam os sítios de corte da peptidase sinal da célula hospedeira, responsável por clivar as proteínas virais

importadas para o RE. As setas amarelas indicam os sítios de corte da protease viral NS2B/NS3. A seta

rosa indica o sítio de corte da furina celular que cliva a proteína precursora prM antes da liberação do vírus

pela célula hospedeira (Fonte: Laboratório de Biologia Molecular de Flavivírus - Fiocruz).

Já as proteínas NS permanecem na face citoplasmática desta organela, sofrendo

processamento proteolítico pelo complexo viral NS2B-NS3, produzindo as proteínas NS2B, NS3,

NS4A e NS5 (Rice et al., 1985; Chambers et al., 1990; Mukhopadhyay et al., 2005) (Figura 1.5).

Assim, as proteínas NS1, prM e E encontram-se no lúmen do RE, as proteínas NS3 e NS5 no

citoplasma e NS2A, NS2B, NS4A e NS4B são predominantemente proteínas transmembranas,

associadas à membrana do RE (Figura 1.5). A translocação das proteínas prM e E para o lúmen

do retículo é o primeiro passo para a formação da partícula viral neste compartimento celular

(Mackenzie et al., 2004).

tidase sinal

NS1

NS3

NS5

Protease viral

NS2B/NS3

Peptidase sinal

Furina

Citoplasma

Figura 1.5 - Topologia de membrana das proteínas de Flavivírus no RE. As proteínas estruturais (em

vermelho) e as não-estruturais (em azul) são mostradas na membrana do RE, após a tradução e o

processamento da poliproteína viral pelas enzimas peptidase sinal, protease viral NS2B/NS3 e furina. A

interrogação representa a enzima responsável pela clivagem entre as proteínas NS1 e NS2A, ainda não

descrita na literatura. As linhas em vermelho representam os domínios transmembranares das proteínas

estruturais (Fonte: Laboratório de Biologia Molecular de Flavivírus - Fiocruz).

1.6 As Proteínas Estruturais e Não-estruturais de Flavivírus

O envelope viral é formado por uma bicamada lipídica proveniente da membrana da

célula hospedeira e possui duas proteínas de superfície (prM/M e E), que determinam importantes

funções biológicas, como a hemaglutinação, neutralização e ligação a receptores das células

hospedeiras. Além disso, é onde estão localizados os determinantes antigênicos, principais alvos

de ligação a anticorpos neutralizantes (Monath, 1999).

A proteína prM (associada à proteína M) forma um heterodímero intracelular, que tem por

função estabilizar a proteína E (Lorenz, 2002). A proteína prM é clivada por uma furina celular,

durante a exocitose e liberação do virion maduro, gerando a proteína M (Lindenbach e Rice,

2001). Acredita-se que prM também tenha função de impedir que E seja prematuramente ativada

pelo baixo pH durante o transporte do vírus no interior dos compartimentos ácidos nas cisternas

do Golgi (Heinz et al., 1994). Em seguida à exocitose, a proteína M adquire nova mudança

conformacional, que é necessária para a correta disposição de E, fato que sugere uma função

“chaperona-like” à proteína M (Lorenz et al., 2002). Em contraste com a superfície lisa dos

virions maduros, os virions imaturos, os quais a prM ainda não foi clivada, apresentam uma

superfície rugosa e assimétrica caracterizada por espículas que se projetam para fora deste,

mostrando ainda um diâmetro maior (600 Å) quando comparado ao observado nos virions

maduros (500 Å) (Kuhn et al., 2002 e Zhang et al., 2003).

A proteína E recobre a superfície viral com seus 90 dímeros, sendo o constituinte

majoritário da superfície dos Flavivírus, além de ser determinante de tropismo, ser o principal

alvo para anticorpos neutralizantes e ter papel central na fusão da membrana viral à membrana da

célula hospedeira (Figura 1.3) (Lindenbach e Rice, 2001; Kuhn et al., 2002). Anticorpos dirigidos

à E impedem a infecção das células por bloquear a ligação do vírus a receptores celulares (Crill e

Roehrig, 2001; He et al., 1995) ou por bloquear a fusão com a membrana da célula antes do

ancoramento viral (Butrapet et al., 1998; Gollins e Porterfield, 1986; Guirakhoo et al., 1991;

Roehrig et al., 1998; Stiasny et al., 2002).

Figura 1.6 - Estrutura da proteína E do vírus dengue 3 presente nas partículas virais maduras. (A):

Estrutura primária da proteína E solúvel, apresentando seus três domínios (sem a região de haste e âncora).

O domínio I ou central é representado em vermelho, o domínio II ou de dimerização, em amarelo e o

domínio III ou tipo Ig, em azul. Os aminoácidos de 393 a 493 representam a região haste âncora (HA) da

proteína E, sendo que esta última porção consiste no C-terminal transmembranar desta proteína. (B): Visão

frontal com o eixo duplo de simetria. (C): Vista perpendicular do dímero. Os resíduos glicanas são

indicados nos resíduos 67 e 153 do domínio II (Modis et al., 2005).

A proteína do envelope do vírus da encefalite transmitida por carrapato (“TBE vírus”) e

do vírus dengue tiveram sua estrutura cristalográfica determinada (Rey et al., 1995; Modis et al.,

2003). Esta proteína apresenta três domínios estruturais: o domínio I (DI) ou domínio central,

com aproximadamente 120 resíduos de aminoácidos; o domínio II (DII), ou domínio de

dimerização da proteína, representando a interface entre os outros dois domínios, e o domínio III

(DIII), que contém a região de estrutura semelhante a imunoglobulinas (Rey et al., 1995). Todos

esses três domínios são formados, na sua maioria, por estruturas em folhas -pregueadas e duas

curtas -hélices no DII (Rey et al., 1995) (Figuras 1.6 e 1.7) e participam dos contatos entre os

monômeros da proteína E (Rey et al., 1995). Estudos de crio-eletron microscopia eletrônica

mostraram que a proteína E é arranjada como um dímero na superfície viral, projetando-se

levemente para fora desta superfície, o que permite acesso dessa região a moléculas e anticorpos

(Kuhn et al., 2002; Mukhopadhyay et al., 2003).

Figura 1.7 - Representação dos ectodomínios da proteína E e seus domínios transmembranares. O

volume ocupado pelo domínio I está representado em vermelho, o domínio II em amarelo e o domínio III

em azul. As alças das proteínas E e M estão representadas em azul claro e laranja, respectivamente.

(Fonte: Adaptado de Zhang et al., 2003 e Mukhopadhyay et al., 2005).

As proteínas não estruturais estão basicamente envolvidas na replicação do vírus e seu

papel na patogênese ainda não está bem definido (Lindenbach e Rice, 2001; Umareddy et al.,

2006). A proteína NS1 (46 kDa) é encontrada tanto em formas oligoméricas secretadas pela

célula, como sob a forma de homodímero associado à membrana plasmática (Flamand et al.,

1999) e sua capacidade de induzir resposta imune protetora já foi comprovada (Schlesinger et al.,

1987; Costa et al., 2006). Sugere-se que a proteína hidrofóbica NS2A (22 kDa) se ligue a NS3 e

NS5, bem como à porção 3’ dos transcritos de RNA (Mackenzie et al., 1998) e sabe-se que ela é

a maior supressora da transcrição de IFN- (Liu et al., 2004). Já a NS2B (14 kDa), associada à

membrana, forma um complexo com a NS3 e é cofator para a função de serino-protease de NS3

(Chambers et al., 1991). A proteína citoplasmática NS3 (70 kDa) é bastante conservada entre os

Flavivírus e apresenta domínios com atividade enzimática: de helicase, NTPase e 5’ trifosfatase

(RTPase) em sua região C-terminal, e de serino-protease, na N-terminal, fato responsável pela

clivagem da poliproteína viral quando associada à NS2b durante a replicação do RNA (Murthy et

al., 1999; Sampath et al., 2006). A proteína hidrofóbica NS4A (16 kDa) também participa da

inibição de IFN-, como a NS2A (Munoz-Jordan et al., 2003), além de colaborar de alguma

forma com a replicação do RNA (Lindenbach e Rice, 2001). Já a NS4B (27 kDa), também

hidrofóbica, parece modular a replicação do vírus dengue via interação com a NS3 (Umareddy et

al., 2006). A última proteína NS maior e mais conservada entre Flavivírus, a NS5 (103 kDa),

funciona como uma RNA polimerase dependente de RNA durante a replicação viral e como

metiltransferase para a metilação do cap 5’ (Rice et al., 1985; Monath et al., 2007)

1.7 Ciclo Replicativo

O ciclo de infecção se inicia quando o vírus infecta uma célula pelo processo de

endocitose mediada por receptores, via reconhecimento entre os receptores celulares específicos e

as proteínas do envelope viral (Figura 1.8). Após esse reconhecimento, os vírus são

internalizados em vesículas pré-lisossomais endocíticas, onde ocorre acidificação gradativa. Com

o pH ácido, a proteína E sofre trimerização, ou seja, ocorre um rearranjo conformacional do

dímero em trímero, expondo seu domínio fusogênico conhecido como peptídeo de fusão ou alça

“cd”, localizado no domínio II da proteína E, resíduos 98 a 102 em den-2 (Modis et al., 2003 e

2004). A transição para o estado trimérico é irreversível e este é mais estável que a forma

dimérica da proteína E (Modis et al., 2004; Bressanelli et al., 2004). Essa alteração

conformacional favorece a fusão da membrana viral e da membrana do endossoma da célula

hospedeira, com conseqüente liberação do nucleocapsídeo do vírus no citoplasma da célula

infectada (Gollins e Poterfield, 1986; Stiasny et al., 1996; Stiasny et al., 2001; Heinz e Allison,

2001).

No citoplasma, o nucleocapsídeo viral dará início à sua replicação pela síntese de um

intermediário de RNA fita negativa que serve como molde para produção de novas fitas positivas

de RNA (Rice, 1996). Os virions maduros são montados na membrana do RE, fato que também

pode levar à formação de partículas virais imaturas. Os novos vírus brotam do RE adquirindo

uma membrana lipídica que formará o envelope, mantendo-se solúveis no interior deste

compartimento celular. Por meio de brotamento, a partir das membranas intracelulares do RE,

são formadas vesículas, cujo conteúdo está repleto de partículas virais. Estas partículas seguem o

caminho da via secretora celular, em direção ao Complexo de Golgi e fusionam-se com a

membrana plasmática, liberando os virions maduros no meio extracelular por exocitose

(Chambers et al., 1990; Lindenbach e Rice, 2001).

Figura 1.8 - Ciclo de vida de um Flavivírus (Fonte: Mukhopadhyay et al., 2005).

1.8 Domínio III da Proteína de Envelope dos Flavivírus

Devido à conformação “Imunoglobulina-like” adotada por DIII, foi proposto que este

domínio tenha função de se ligar a receptores da célula hospedeira, além do fato de albergar uma

alça que contém o motivo de ligação a integrinas (Arg-Gly-Asp - RGD), presente em diversas

flaviviroses (Rey et al., 1995; Crill e Roehrig, 2001; Hung et al., 2004; Chin et al., 2007). A

ocorrência ampla destes modelos Ig em proteínas de adesão celular está em consonância com a

noção de que este domínio participa da ligação a receptores celulares (Modis et al., 2005). Já

foram demonstradas duas estratégias eficientes de se impedir a infecção pelo vírus dengue. A

primeira consta em bloquear a sua entrada na célula hospedeira com o emprego de DIII

recombinante que irá bloquear os receptores celulares, e a segunda, utiliza a ligação de anticorpos

neutralizantes que neutralizam o vírus, impedindo assim, que esses se liguem aos receptores

celulares (Hung et al., 2004; Chu et al., 2005; Chin et al., 2007).

Células da linhagem monocítica são consideradas como os primeiros alvos para a infecção

pelo vírus dengue (McBridee e Bielefeldt-Ohmann, 2000), porém as moléculas da superfície

celular às quais o vírus se liga para que se proceda o início da infecção, ainda permanecem

obscuras (Bielefeldt-Ohmann et al., 2001).

Estudos mostraram que receptores do tipo heparan sulfato estão envolvidos na ligação do

vírus dengue a celulas de mamíferos, dentre elas Vero, CHO e células de hepatoma humano

(Chen et al., 1997; Germi et al., 2002; Hilgard e Stokert 2000). Essa ligação parece ser mediada

pela interação de resíduos de cargas positivas na superfície de DIII que se ligariam a cargas

negativas do receptor na superfície celular (Chen et al., 1997; Hung et al., 2004; Lee et al.,

2006). Já o DIII do vírus do Oeste do Nilo media a infecção celular através da ligação a

integrinas do tipo V3 (Chu e Ng, 2004; Lee et al., 2006). No caso de células de inseto, Hung et

al. (2004) indicaram que a ligação de DIII a estas células possa ser realizada por meio de uma

alça lateral exposta presente nesta região.

Foram identificadas diferenças entre o DIII dos membros dos grupos virais transmitidos

por mosquitos e carrapatos, onde, no primeiro grupo, esta região é pouco maior devido à presença

de quatro resíduos de aminoácidos localizados em uma alça lateral, representados pelo motivo

RGD em FA, MVE e WNV (Yu et al., 2004; Hung et al., 2004).

Anticorpos dirigidos ao DIII são eficientes na neutralização da infecciosidade dos

Flavivírus e são vírus/sorotipo-específicos (Roehrig, 2003). Diversos estudos com painéis de

anticorpos monoclonais foram realizados na tentativa de mapear os epítopos presentes no DIII da

proteína E de diversos Flavivírus (Lin et al., 1994; Serafin e Aaskov, 2001; Thullier et al., 2001;

Beasley e Barrett, 2002; Lin e Wu, 2003; Nybakken et al., 2005; Sánchez et al., 2005;

Gromowski e Barret, 2007; Sukupolvi-Petty et al., 2007). Crill e Roehrig (2001) mostraram que

anticorpos monoclonais contra o DIII inibem fortemente a adsorção do vírus dengue em células

Vero.

Os vírus que apresentam mutações de escape também são de extrema importância no

entendimento dos sítios de ligação a anticorpos e no mapeamento de epítopos neutralizantes

(Hiramatsu et al., 1996; Lin e Wu, 2003; Li et al., 2005; Modis et al., 2005) (Figura 1.9).

Mutações em DIII estão associadas com atenuação da virulência/neurovirulência ou à habilidade

de o vírus escapar da neutralização via sistema imune, fatos que corroboram a relação entre DIII

e o reconhecimento de receptores celulares (Hahn et al., 1987; Sanchez e Ruiz 1996; Ryman et

al., 1998; Ni e Barret 1998; Leitmeyer et al., 1999).

Figura 1.9 - Mapeamento das áreas de DIII relacionadas a mutantes de escape de neutralização por

anticorpos. (A) Três epítopos sorotipo-específicos foram mapeados: resíduo 291 (Beasley e Askov,

2001), resíduos 301 a 307 (Lin et al., 1994), e resíduos 381 a 383 (Hiramatsu et al., 1996; Hung et al.,

2004). As cadeias laterais dos três epítopos são evidenciadas em violeta, em representação de

preenchimento espacial. Modificações no resíduo 388, também não conservado e exposto na superfície

viral, correlacionam-se com virulência – em rosa (Leitmeyer et al., 1999). Em verde, o resíduo Phe-277

conservado em todos os sorotipos de dengue-2. (B) Visão lateral de (A) (Fonte: Modis et al., 2005).

A estrutura tridimensional do DIII da proteína E de diversos Flavivírus já foi resolvida

por cristalografia de raios-X ou por RMN para TBE (Rey et al., 1995), dengue-2 (Modis et al.,

2003), vírus da encefalite japonesa (Wu et al., 2003), dengue-3 (Modis et al., 2005), vírus do

Oeste do Nilo (Kanai et al., 2006; Nybakken et al., 2006) e dengue-4 (Volk et al., 2007). Estes

estudos mostraram que as estruturas diméricas e o dobramento da proteína E são bastante

semelhantes, com exceção do vírus do Oeste do Nilo, cuja proteína E não formou dímero nem em

solução, nem após a cristalização (Kanai et al., 2006). As principais diferenças observadas entre

as proteínas E destes Flavivírus são em relação ao número de fitas  que compõem o DIII,

evidenciando uma maior conservação entre as estruturas secundárias quando comparadas às

primárias; a orientação entre DI e DII; a posição das glicanas e no conjunto de resíduos para

neutralização, os quais são vírus/sorotipo específicos (Rey et al., 1995; Modis et al., 2003 Wu et

al., 2003 Modis et al., 2005 Kanai et al., 2006 Nybakken et al., 2006 Volk et al., 2007).

Apesar da semelhança tridimensional verificada entre os modelos de DIII de Flavivírus,

cada um deles possui cargas eletrostáticas de superfície únicas, às quais contribuem para as

diferenciadas afinidades de ligação a uma série de receptores e anticorpos neutralizantes (Volk et

al., 2007).

Modis e colaboradores (2005) compararam os resíduos da proteína E de den-2 e den-3 e

identificaram que 86 deles (ou seja, um terço) não são conservados e, dentre esses, 56 estão

expostos na superfície viral, os quais acredita-se serem os principais contribuintes nas diferenças

de ligações dos anticorpos entre esses sorotipos de dengue (Figura 1.10).

Figura 1.10 - Comparação entre os resíduos não conservados entre os vírus den-2 e den-3. (A): Vista

superior do dímero da proteína E do sorotipo 3 de dengue, onde estão representados os resíduos não

conservados no sorotipo 2 em representação de preenchimento espacial. Os resíduos que se encontram

expostos na superfície estão assinalados em roxo e aqueles não estão expostos são indicados em cinza. (B)

vista perpendicular de (A) (Fonte: Modis et al., 2005).

Assim, devido ao conjunto destas características do DIII, este poderia ser utilizado para

obtenção de uma vacina dirigida a dengue, de modo a induzir resposta específica a estes

determinantes antigênicos sorotipo-específicos.

1.9 Desenvolvimento de Vacinas Dirigidas à Dengue

Os primeiros esforços para o desenvolvimento de uma vacina contra dengue iniciaram-se

em 1920, com o emprego de extratos inativados de Ae. aegypti infectados com o vírus dengue

(Hombach, 2007). O primeiro relato de uma vacina bem sucedida contra a doença data de 1945,

quando Sabin e Schlesinger atenuaram o genótipo do Havaí de den-1 por meio de passagens

sucessivas em cérebro de camundongo e a empregaram para imunizar dezesseis voluntários

durante a 2ª Guerra Mundial (Sabin, 1952).

Até o presente momento, não há vacina para dengue, apesar de já existirem várias

possíveis candidatas, em diversos estágios de desenvolvimento (Mackenzie et al., 2004). Dentre

os fatores limitantes estão: a complexa patologia da doença; a vacina deve ser tetravalente e

promover imunidade em alto grau, além de duradoura, contra os quatro sorotipos, a fim de não

contribuir com a ADE; ser segura o suficiente para ser administrada em crianças entre 9 e 12

meses de idade; a dificuldade de propagar o vírus em cultura; a falta de um modelo experimental,

uma vez que, apesar de os macacos serem susceptíveis à infecção pelo vírus dengue, produzirem

anticorpos, fornecerem dados sobre viremia, imunogenicidade e neurovirulência, eles não sofrem

da doença, nem mesmo após uma segunda infecção, limitando seu valor experimental; o modelo

murino de neurovirulência vem sendo utilizado para a discriminação de neurotropismo de

diferentes candidatos à vacinação, mas está longe de ser considerado como ideal; devido às

limitações do modelo experimental, é necessária uma série de testes em voluntários humanos

para ter acesso aos dados de reatogenicidade e imunogenicidade e, por isso, estudos em

populações vacinadas requerem um acompanhamento por longos períodos de tempo destes

indivíduos, fato que encarece o desenvolvimento destas vacinas (Halstead, 1973; Pugachev et al.,

2005; Normile, 2007; Hombach, 2007; Guy, 2008).

A Organização Mundial de Saúde colocou como prioridade o desenvolvimento de uma

vacina contra dengue (WHO, 2002). A fim de alcançar esse objetivo, uma série de estratégias já

foram traçadas (vacinas de vírus atenuados, vacinas inativadas e de subunidades, vacinas de DNA

e vacinas de vírus recombinantes), dentre as quais, algumas já se encontram em estágios mais

avançados de desenvolvimento e já são apontadas como possíveis candidatas a vacina (Tabela

1.2).

Algumas fundações estão investindo muitos recursos para o desenvolvimento de drogas

ou vacinas contra dengue. Uma delas é a firma suíça Novartis, que no ano de 2003 investiu 7

milhões de dólares no Instituto de Doenças Tropicais (NITD), em Singapura, para a produção de

drogas no combate à dengue, algumas com previsão de estarem prontas para teste em 2009

(Nature, 2007). O maior investimento no ramo de desenvolvimento de vacinas contra dengue

veio da Fundação Bill e Melinda Gates, que criou a organização não-governamental Iniciativa

para uma Vacina Pediátrica contra Dengue (PDVI), na Coréia do Sul (WHO, 2005; Edelman,

2007). Em julho de 2003, foram investidos 55 milhões de dólares a fim de acelerar o processo de

geração e testes clínicos dessas vacinas (Edelman, 2007; Normile, 2007).

Tabela 1.2 - Lista parcial das vacinas candidatas contra dengue em desenvolvimento

Responsável pelo projeto Tipo de abordagem Estágio de desenvolvimento

Universidade de Mahidol

(Bangkok)/Sanofi Pasteur

Vacina atenuada, produzida em

células PDK, formulação

tetravalente

Ensaios clínicos de fase II e

acompanhamento de indivíduos

vacinados por mais de oito anos

Instituto de Pesquisa Walter

Reed/GlaxoSmithKline

Vacina atenuada, produzida em

células FRhL, formulação

tetravalente

Ensaios clínicos de fase II

Acambis/Sanofi Pasteur

Vacina atenuada empregando o

vírus FA 17D como vetor,

formulação tetravalente

Ensaios clínicos de fase II

CDC/Inviragen/Santha (India) Vacina quimérica DEN/DEN Ensaios pré-clínicos

Hawaii Biotech

Vacina de subunidade com

proteínas de dengue e adjuvantes

Pré-clínico (primatas não

humanos) e testes em humanos já

agendados

Fonte: Adaptado de Normile, 2007; Monath, 2007; Hombach, 2007

1.10 O Vírus Vacinal Febre Amarela 17D

Nesta dissertação, utilizou-se o vírus vacinal FA para expressão do domínio III dos vírus

dengue sorotipo 2. O uso do vírus FA com vetor vacinal está fundamentado nas boas

propriedades da vacina contra Febre Amarela, que consiste no vírus atenuado FA 17D. Esta é

utilizada há mais de 70 anos (introduzida em 1937), tendo 2 milhões de pessoas vacinadas

somente entre os anos de 1938 e 1941 devido à campanha de vacinação em massa iniciada em

1938 (Monath et al., 2007). Desde então, cerca de 400 milhões de doses já foram administradas,

com baixo custo, excelentes registros de eficácia e segurança, uma vez que a vacina pode ser

administrada a partir dos nove meses de idade, com incidência mínima de efeitos adversos

(Monath, 2001 e 2003).

Uma única dose da vacina FA 17D é capaz de promover proteção duradoura, de cerca de

98% por um período médio de 10 anos, entretanto, alguns indivíduos apresentam anticorpos

neutralizantes mesmo após 35 anos pós-vacinação (Poland et al., 1981; Niedrig et al., 1999).

Além desse fator, a imunização com o vírus FA 17D é capaz de promover resposta imune

mediada por linfócitos T (Co et al., 2002). Um dos possíveis mecanismos envolvidos consistiria

na infecção de células dendríticas humanas imaturas e maturas, com a posterior ativação de

linfócitos T (Barba-Spaeth et al., 2005).

A vacina contra Febre Amarela, utilizada como referência nesta dissertação, utiliza o sub-

genótipo 17DD (FA 17DD) e é produzida por Bio-Manguinhos/FIOCRUZ, sob a forma

liofilizada, nas apresentações de 5, 10 ou 50 doses. Este vírus é derivado do genótipo selvagem

Asibi, obtido originalmente de um paciente de mesmo nome com Febre Amarela no Senagal, em

1927 (Stokes et al., 1928). Este genótipo foi cultivado em tecido embrionário de camundongo e

após 18 sub-culturas foi passado em culturas de embrião de galinha, com e sem tecido nervoso e

na passagem de número 58 foi designado como 17D (Theiler e Smith, 1937). Na passagem 195,

foi derivado o subgenótipo 17DD, que sofreu outras passagens em cultura de tecidos até a de

número 243 (Monath et al., 2007). Neste estágio, o genótipo 17DD foi submetido a outras 43

passagens em ovos embrionados de galinha até a passagem 284, genótipo este que foi utilizado

do ano de 1984 até 2002 (Marchevsky et al., 2006) (Figura 1.11). Passagens adicionais em foram

realizadas a fim de se preparar um novo lote semente denominado 13Z, que se encontra na

passagem atual, de número 287 (Marchevsky et al., 2006). O vírus regenerado a partir do

homogenato de ovos de galinha embrionados livres de agentes patogênicos é administrado aos

humanos sob a forma de vacina (Galler et al., 1998). Atualmente, existem dois genótipos

utilizados mundialmente: o 17DD e o 17D-204, que diferem entre si em apenas 10 resíduos de

aminoácidos (Galler et al., 1998; Monath et al., 2007).

Figura 1.11 - Histórico de passagens do genótipo selvagem Asibi e sua derivação até os lotes

sementes utilizados para a produção da vacina no Brasil. (Fonte: Marchevsky et al., 2006).

No Brasil, a vacina contra Febre Amarela constitui-se do genótipo 17DD, produzida por

Bio-Manguinhos/FIOCRUZ – o maior produtor mundial desta vacina, fato que evidencia todas as

condições favoráveis para o desenvolvimento e produção de novas vacinas amarílicas em nossa

Instituição, permitindo o desenvolvimento do vírus 17D como um vetor vacinal de expressão de

antígenos de interesse vacinal.

Devido ao conjunto destas boas características, acredita-se o vírus FA 17D possa ser

usado como uma plataforma vacinal de expressão para antígenos de patógenos humanos, com a

finalidade de desenvolvimento de novas vacinas humanas.

1.11 A Metodologia do Clone Infeccioso

O manuseio do genoma de FA, RNA fita positiva, é possível pela disponibilidade da

metodologia de clones infecciosos, primeiramente descrita por Racaniello e Baltimore (1981),

que demonstraram ser possível regenerar vírus a partir do DNA complementar (cDNA) do vírus

da poliomielite clonado em plasmídeos bacterianos.

A tecnologia do clone infeccioso foi aplicada em um segundo trabalho, realizado por Rice

et al. (1989), no qual os autores clonaram o genoma completo do vírus da Febre Amarela 17D-

204, como cDNA, utilizando um plasmídeo bacteriano como vetor de expressão. A partir da

metodologia de transcrição in vitro, foi produzido RNA viral, indistinguível em diversos

aspectos, de seu parental, o 17D-204, usado para clonagem do cDNA. Esse RNA transcrito foi

transfectado em cultura de células o que resultou na produção de novos virions, comprovando,

então, a infecciosidade do RNA viral.

O desenvolvimento da tecnologia do clone infeccioso tornou possível a manipulação de

genomas de RNA que podem ser transcritos in vitro em cDNA e, dessa forma, permitindo a

introdução de modificações genéticas em quaisquer regiões do genoma viral. Além disso, esse

sistema de transcrição in vitro permite a síntese da molécula completa de RNA com muito mais

eficiência quando comparada à transcrição de cDNA na célula (Bonaldo et al., 2000; Ball, 2001;

Van Epps, 2005). Os autores ratificam o emprego desta metodologia, haja vista a instabilidade

dos vírus que apresentam RNA como seu material genético.

No laboratório de Biologia Molecular de Flavivírus, Fiocruz, Brasil, a metodologia do

clone infeccioso é empregada rotineiramente e alguns trabalhos foram recentemente publicados

pelo grupo, tendo como objetivo a construção de vírus quiméricos e recombinantes,

que utilizam sempre como plataforma de expressão, o vírus vacinal da Febre Amarela 17D

(Bonaldo et al., 2002; Bonaldo et al., 2005; Galler et al., 2005; Bonaldo et al., 2006; Bonaldo et

al., 2007; Mateu et al., 2007).

1.12 O Uso do Vírus da Febre Amarela 17D como Vetor de Expressão do Domínio III da

Proteína E dos Vírus Dengue 2

A metodologia do clone infeccioso abriu caminho para que diversas abordagens fossem

realizadas na tentativa de manipular o genoma do vírus FA.

A primeira delas e a de maior sucesso diz respeito à produção de vírus quiméricos pela

troca dos genes prM/E de FA pelos genes homólogos de outro Flavivírus (Bray e Lai, 1991).

Alguns trabalhos já foram desenvolvidos por nosso grupo empregando esta estratégia (Caufour et

al., 2001; Galler et al., 2005).

Uma segunda abordagem refere-se à inserção de epítopos na região intergênica

flanqueada pelo motivo de clivagem da protease NS2B/NS3, que permitem que o peptídeo

inserido nesta região da poliproteína viral seja possivelmente liberado no citoplasma celular

(McAllister et al., 2000; US patent 6,589,531). Apesar de alguns resultados promissores (Tao et

al., 2005), esta região sofre uma limitação em relação ao tamanho do inserto e nosso grupo tentou

inserir o gene da proteína fluorescente verde de algas (EGFP) nas regiões intergênicas NS2A-2B

e NS2B-NS3, sem sucesso (Bonaldo e Galler, dados não publicados).

Nosso grupo foi pioneiro na inserção de seqüências exógenas de 10 a 25 aminoácidos na

alça fg da proteína E (Bonaldo et al., 2002; Bonaldo et al., 2005; Bonaldo et al., 2006). Um

segundo sítio de inserção na alça EoFo da proteína E foi determinado e estudos estão em vias de

finalização (Bonaldo, em preparação).

Outra possibilidade de uso do vírus FA 17D como vetor de expressão refere-se à inserção

de genes na região 3´ não traduzida (NTR) (Andino e McAllister, PCT WO 02/089840). No

entanto, todos os vírus FA 17D obtidos em nosso laboratório por meio desta metodologia foram

instáveis geneticamente, levando à perda da seqüência heteróloga logo na primeira passagem em

monocamadas celulares, resultados estes corroborados por dados de Pierson e colaboradores

(2005).

O vírus FA 17D pode também expressar antígenos heterólogos por meio do

desenvolvimento de replicons, moléculas que correspondem a partes do genoma viral de onde

foram removidos os genes estruturais necessários para a produção de partículas virais, embora

mantenham todos os elementos necessários para a replicação do RNA. Esta estratégia permite a

expressão transitória de genes heterólogos, sugerindo a possibilidade de uso em vacinação

(Khromykh, 2000; Westaway et al., 2003; Harvey et al., 2004; Tannis et al., 2005). No entanto,

as aplicações principais deste sistema de expressão, baseado no genoma do vírus FA 17D,

limitam-se a estudos sobre mecanismos de replicação e empacotamento do RNA viral e formação

de partículas virais.

Recentemente, uma nova abordagem foi desenvolvida por nosso grupo, a qual trata da

expressão de cassetes protéicos longos, maiores que 36 aminoácidos,

na região intergênica

E/NS1, metodologia inovadora que foi alvo de um depósito de patente efetuado em outubro de

2005 (Bonaldo, MC e Galler, R; Depósito 20050121605 realizado em 31/10/2005). Esta nova

abordagem de expressão de proteínas heterólogas no genoma do vírus FA 17D respeitou os

motivos funcionais e a seqüência de aminoácidos conservados flanqueadores da região

intergênica E e NS1, os quais foram duplicados e fusionados ao gene heterólogo, permitindo

desta forma, o correto processamento da poliproteína viral e da inserção exógena.

A primeira geração de vírus construídos por meio desta estratégia expressava a proteína

fluorescente verde (EGFP) de Aquorea victoria entre os genes E/NS1, com a HA duplicada

completa ou truncada de FA (Bonaldo et al., 2007; Mello, 2007). Estas plataformas de expressão

possuíam, fusionado ao gene da EGFP, em sua porção N-terminal, os 9 primeiros aminoácidos da

proteína NS1 e, em sua porção C-terminal, a região duplicada de Haste-âncora da proteína E de

FA completa ou truncada, a qual contém o sinal de translocação para NS1 e o sítio para clivagem

da peptidase sinal celular (Figura 1.12).

A região C-terminal da proteína E, ou seja, seus últimos 100 resíduos de aminoácidos é

denominada Haste e Âncora (HA) (Rey et al., 1995). A porção correspondente à Haste é formada

por duas regiões -hélices, denominadas H1 e H2, separadas por uma seqüência de conexão CS,

bastante conservada entre os Flavivírus. A região Âncora é formada por dois elementos

transmembranares chamados TM1 e TM2, mantendo-a associada à membrana do (RE) (Allison et

al., 1999). O primeiro elemento da haste, H1, forma um ângulo com a superfície externa da

bicamada lipídica, enquanto que H2 permanece fora da membrana, com sua porção hidrofóbica

arranjada em direção a ela (Zhang et al., 2003). A região TM1 serve como âncora da proteína E,

ao passo que TM2 é seqüência sinal para NS1 e interações entre essas duas têm papel importante

na formação do envelope viral (Op De Beeck et al., 2003). A região que conecta essas duas

porções transmembranares é muito variável tanto em seqüência como em comprimento dentre os

Flaviviridae, fato que sugere interações específicas (Cocquerel et al., 2000).

Figura 1.12 - Representação esquemática da proteína E do vírus da Febre Amarela e das

plataformas de expressão referentes às Construções I e II, e a organização das mesmas no retículo

endoplasmático. (A) Proteína E do vírus da Febre Amarela ancorada na membrana do RE. (B)

Construção I: cassete de expressão contendo a proteína heteróloga EEGFP fusionada à região HA

completa do vírus FA, na região intergência E/NS1 do vírus FA 17D. (C) Construção II: cassete de

expressão contendo a proteína heteróloga EEGFP fusionada à região HA truncada do vírus FA, sem os

elementos H1 e CS, na região intergência E/NS1, do vírus FA 17D.

Essa construção permitiu o adequado processamento da proteína E, ancorada na

membrana do RE, assim como a proteína NS1, garantiu a expressão da proteína heteróloga EGFP

e mostrou haver a produção de anticorpos específicos tanto para FA como para EGFP (Mello,

2007; Bonaldo et al., 2007). No entanto, estes vírus recombinantes mostraram-se menos

imunogênicos quando comparados ao vacinal FA 17DD, além de certo grau de instabilidade

genética provavelmente devido a um pareamento inespecífico entre as regiões de HA fusionada

ao 3’terminal do gene EGFP e a seqüência da HA natural do vírus FA (Mello, 2007; Bonaldo et

al., 2007). Sendo assim, algumas modificações fizeram-se necessárias a fim de aprimorar esta

estratégia que utiliza o vírus FA 17D como vetor de expressão de proteínas heterólogas, em sua

região gênica E/NS1.

Para esta dissertação, foi construída uma segunda geração de vírus que expressavam o

domínio III den-2 nesta mesma região, porém, com HA truncada (sem os domínios H1 e CS) do

vírus dengue 4, com objetivo de diminuir a identidade seqüencial entre essas duas porções,

tentando assim, melhorar a plataforma de expressão de antígenos heterólogos, visando a uma

nova e futura proposta de vacina contra dengue.

A obtenção destes vírus FA recombinantes, expressando epítopos de dengue, é

interessante no sentido de que é uma abordagem inteiramente nova, onde apenas os domínios III

dos vírus dengues seriam expressos em um vírus FA, onde a composição da partícula infecciosa e

a maquinaria de replicação viral seriam a do vírus FA. Isto pode consistir em uma vantagem na

obtenção de uma vacina tetravalente, pois as diferenças de propagação entre os vírus

recombinantes seriam minimizadas, o que poderia ser refletido em uma mesma capacidade de

estimulação do sistema imune.

2. JUSTIFICATIVA DO PROJETO

• O uso do vírus da Febre Amarela 17D como vetor de expressão de antígenos heterólogos

é extremamente válido, uma vez que esse genótipo vacinal vem sendo utilizado há mais

de 70 anos, mostrando-se bastante estável, eficaz e seguro;

• Esta estratégia de inserção de antígenos heterólogos no vírus de Febre Amarela 17D na

região intergênica E/NS1 representa uma abordagem nova, que tem mostrado bons

resultados em nosso laboratório;

• Possibilidade de desenvolvimento futuro de uma vacina quimérica FA/Domínio III de

Dengue pode resultar numa abordagem inovadora, de importância para Fiocruz, o maior

produtor mundial da vacina dirigida à Febre Amarela.

3. OBJETIVOS

Objetivo Geral

Desenvolver o Vírus Vacinal da Febre Amarela (FA) 17D como um vetor de expressão do

domínio III da proteína E do vírus dengue-2.

Objetivos Específicos

• Analisar a identidade seqüencial nucleotídica e de aminoácidos do DIII do vírus

dengue 2 e de outras seqüências de Flavivirus utilizadas na montagem do cassete

de expressão;

• Realizar estudos de modelagem molecular do DIII den-2;

• Construção de vírus FA 17D recombinante por inserção do domínio III da proteína

de envelope do sorotipo 2 do vírus dengue na região intergênica E/NS1 do genoma

do vírus da Febre Amarela 17D;

• Obter um lote semente viral caracterizado de estoque viral na segunda passagem

em células Vero para uso em todas as etapas deste projeto;

• Caracterização biológica do vírus FA 17D recombinante: estabelecer o potencial

replicativo dos vírus FA 17D recombinantes, analisar a expressão da proteína

heteróloga e analisar a estabilidade genética viral.

4. MATERIAL E MÉTODOS

As composições dos meios e soluções empregados neste trabalho encontram-se descritos

na seção de anexos desta dissertação.

4.1 Certificados

As etapas desta metodologia que abrangeram clonagem molecular para obtenção de vírus

recombinantes, por meio de manipulação do DNA in vitro e em culturas de células, foram

executadas no Laboratório de Biologia Molecular de Flavivírus, IOC, FIOCRUZ, classificado

como nível 1 para OGM, conforme licença emitida pela Comissão Técnica Nacional de

Biossegurança (CTNBio - CQB 105/99).

Os trabalhos que envolveram cultura de células eucariotas, regeneração e caracterização

biológica dos vírus obtidos, bem como o vírus dengue e o FA 17DD, foram realizados em

colaboração com o Laboratório de Tecnologia Virológica (LATEV/Bio-

Manguinhos/FIOCRUZ), classificado como nível 2, em concordância com o CQB 110/99 da

CTNBio. Todos os reagentes utilizados durantes estas etapas foram produzidos pelo Laboratório

de Sarampo (LASA/DEPRO/Bio-Manguinhos/FIOCRUZ), seguindo as normas de controle de

qualidade já estabelecidos pela instituição.

4.2 Cultura de Células

Para a propagação dos vírus FA em cultura celular, foram utilizadas preparações de

células epiteliais de rim de macaco verde africano (Cercopithecus aethiops) - células Vero -

originalmente obtidas a partir da Coleção Americana de Culturas e Depósitos (ATCC, 1994).

Esta linhagem Vero é certificada sob o registro CCL-81 (Certified Cell Line-81) e foi escolhida

para a realização de nosso trabalho por ser adequada para a produção e padronização de vacinas.

A manutenção das células foi feita por técnicos do LATEV, segundo as normas dos

Protocolos de Operação Padronizados (POP) desenvolvidos na FIOCRUZ.

Nos procedimentos de obtenção ou caracterização viral, culturas de células Vero foram

plaqueadas com 24 horas de antecedência em densidades variáveis de acordo com a técnica a ser

realizada. Por se tratar de uma linhagem celular aderente, a sua dissociação das garrafas de

cultura foi realizada adicionando-se uma solução de 50 mL verseno e 500 µL de tripsina. A

monocamada foi lavada levemente duas vezes com esta solução e sofreu incubação a 37

C em

atmosfera de CO

por 5 min. As células foram então ressuspensas em 5 mL de meio de cultura

199/Earle contendo 0,22% de NaHCO

e o número de células foi estimado por contagem em

câmara de Neubauer.

4.3 Amostras Virais Utilizadas

4.3.1 Vírus FA 17DD

O vírus usado como controle de todas as etapas de caracterização dos vírus

recombinantes foi o vírus vacinal FA 17DD produzido por Bio-Manguinhos/FIOCRUZ. Para a

reconstituição da vacina liofilizada, foi adicionado ao frasco 2 mL de água bidestilada, estéril e

gelada. O frasco foi homogeneizado em vortex por 30 s e a suspensão mantida em gelo por 10

min. A esta suspensão, foram adicionados 3 mL de meio 199/Earle completo com 0,11% de

NaHCO

e este homogeneizado foi propagado em monocamada de células Vero (frascos de 175

sistema fechado - 80.000 células/cm

) até visualização de CPE intensa (4º dia pós-infecção),

quando o sobrenadante de cultura foi recolhido juntamente com o estabilizador sorbitol 8% e

armazenado a -70ºC. Esse estoque foi titulado em placas de 24 poços (seção 4.10.1) e apresentou

título médio de 3,21 x 10

pfu/mL ou 7,51 log

pfu/mL.

4.3.2 Vírus Parental FA 17D/G1.2-T3

O vírus parental FA 17D/G1.2-T3 foi construído a partir de um clone infeccioso

modificado. O clone infeccioso original do vírus FA 17D, proveniente do genótipo 204, é

formado pelos plasmídeos pYF5’3’IV e pYFM5.2 (Rice et al., 1989), a partir dos quais foram

introduzidas uma série de modificações genéticas, tais como, criação de sítios de enzimas de

restrição únicos, e alguns marcadores genéticos específicos do genótipo 17DD pelo processo de

mutagênese sítio-específica dirigida por oligonucleotídeos (Jabor, 2001).

Assim, o plasmídeo G1.2, que contém os extremos 5´e 3´do genoma viral, foi originado a

partir do pYF5’3’IV com as alterações nucleotídicas nas posições

: 1.140, 1.436/1.437, 8.656,

8.808 e 9.605; além do sítio para a enzima BstE II. Já o plasmídeo T3 foi originado a partir do

pYFM5.2, que contém as alterações nucleotídicas nas posições

: 1.946, 2.219/2.220, 8.656 e

8.808; além do sítio para as enzimas Sal I e BstE II, tornando esse novo plasmídeo mais longo

(de 9.229 pb para 9.939 pb). Essas alterações situam-se na proteína de envelope (E) e na proteína

não-estrutural NS5.

Foi preparado um estoque do vírus parental FA 17D/G1.2-T3 a partir de 2,0 mL de

sobrenadante de transfecção completado com 1 mL de meio 199/Earle completo 2,5% de

NaHCO

Os 3 mL de suspensão foram utilizados para infecção de monocamadas de células Vero

com densidade de 80.000 células/cm

em frascos de 175 cm

sistema fechado. A suspensão viral

foi recolhida, 72 h após a infecção, quando CPE foi detectada no frasco. Essa suspensão foi

suplementada com o estabilizador sorbitol para uma concentração final de 8 % e armazenada a -

80°C. Após titulação em placas de 24 poços (seção 4.10.1), este estoque viral apresentou título

médio de 4,49 X 10

pfu/mL ou 7,65

log

pfu/mL.

4.3.3 Vírus Dengue-2 44/2

O vírus DEN-2 44/2 originou-se da purificação de uma placa viral em monocamadas de

células Vero, a partir de uma amostra previamente isolada de soro de paciente (Caufour et al.,

2001). Foi preparado um estoque viral a partir da amostra cedida pelo Dr. Marcos S. Freire do

LATEV/DEDET/Bio-Manguinhos, que apresentou um título de 2,52 X 10

pfu/mL ou 6,40 log

pfu/mL.

Essa numeração refere-se à posição do nucleotídeo no genoma do vírus FA 17DD.

4.4 Modelagem Molecular por Homologia do Domínio III da Proteína E do Vírus Dengue

A modelagem molecular por homologia, também conhecida por modelagem comparativa,

é uma ferramenta utilizada para a predição de estruturas tridimensionais de proteínas. Este

método baseia-se no fato de que uma pequena variação na seqüência de aminoácidos resulta,

geralmente, em uma pequena mudança na estrutura tridimensional da molécula. Portanto, pode-

se predizer a estrutura de uma proteína a partir da similaridade seqüencial desta com outras

proteínas que já foram determinadas experimentalmente por cristalografia por difração de raios-

X e ressonância magnética nuclear – principais métodos experimentais (Sali e Blundell, 1993;

Sali et al., 1995).

Todos os métodos de modelagem comparativa atuais baseiam-se em quatro passos

sucessivos. O primeiro deles visa a identificação e a seleção de proteínas-molde, ou seja, aquelas

que já tiveram suas estruturas tridimensionais determinadas. Já que a qualidade do modelo

depende muito da estrutura da proteína-molde utilizada, é preciso que esta última tenha sido

obtida com resolução igual ou superior a 2 Å (Filho e Alencastro, 2003). Assim, a probabilidade

de ocorrência de erros no modelo é inversamente proporcional ao grau de identidade entre as

seqüências de resíduos utilizadas (Filho e Alencastro, 2003). Além disso, é desejável que o grau

de identidade entre as seqüências das proteínas molde e do modelo seja igual ou superior a 25%,

quando o número de resíduos é superior a 80, pois estes parâmetros aumentam a probabilidade

de que estas proteínas tenham estruturas tridimensionais semelhantes (Sander e Schneider,

1991).

A busca por seqüências homólogas ao domínio III de dengue-2 genótipo NGC foi

realizada no programa BlastP (Altschul et al., 1990;

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi), utilizando-se como banco de dados o PBD

(Berman et al., 2000; http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do), o qual contém as seqüências de

proteínas cujas estruturas já foram determinadas experimentalmente.

No segundo passo, é realizado um alinhamento entre as seqüências de aminoácidos da

proteína-molde com as seqüências da proteína-alvo ou modelo (aquela que será modelada).

Quanto maior o número de moldes escolhidos para serem alinhados ao modelo, mais confiável é

o alinhamento, pois o alinhamento múltiplo permite identificar com maior facilidade as regiões

conservadas e variáveis. As regiões conservadas correspondem a conformações muito

semelhantes. Já este fato não é observado nas regiões variáveis, que localizam-se principalmente

nas regiões de alças entre as fitas que constituem o modelo (Filho e Alencastro, 2003). O

alinhamento foi realizado com auxílio do programa Clustal W2, versão 2.01 (Jeanmougin et al.,

1998; http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).

O terceiro passo é a construção das coordenadas do modelo a partir do alinhamento

seqüencial. Nesse trabalho, para a geração do modelo foi empregado o programa Modeller,

versão 9v2, r5542 (Sali e Blundel, 1993; http://salilab.org/modeller/), que se baseia na

modelagem por satisfação de restrições espaciais. Estas restrições podem ser distâncias entre os

pares de átomos (C-C, N-O etc), combinações de ângulos torcionais (Ø e ) dentre outros.

Tais restrições podem ser modificadas pelo usuário caso seja desejável relaxar ou restringir tais

parâmetros (Sali e Blundel, 1993). Uma segunda fonte de restrições espaciais considerada pelo

Modeller são as restrições estereoquímicas, que descrevem a geometria da cadeia polipeptídica,

são elas: distâncias interatômicas, ângulos diedros, planaridade de grupos peptídicos e anéis de

cadeia lateral, comprimento de ligação, dentre outras (Sali e Blundel, 1993).

No quarto passo, é realizada a validação do modelo, a partir de critérios de

estereoquímica, ambiente químico, contatos interatômicos, dentre outros (Sanchez e Sali, 1997;

Filho e Alencastro, 2003). Para a validação da qualidade do modelo, foram empregados os

programas PROCHECK (Laskowski et al., 1998) e Verify 3D (Luthy et al., 1992).

Foi gerado também o modelo das cargas eletrostáticas de superfície do domínio III

dengue-2 e para tal, foi utilizado o programa PyMol (http://pymol.sourceforge.net).

4.5 Extração do RNA Viral

Foram empregados dois métodos alternativos para a obtenção de amostras de RNA viral.

Todo o material utilizado para a extração de RNA foi tratado adequadamente para evitar

contaminação por RNases e a manipulação foi feita com luvas e jalecos descartáveis. No

primeiro método, empregou-se o sistema “QIAamp Viral RNA Mini Kit” (Qiagen). As amostras

foram submetidas ao tampão de lise AVL, em condições desnaturantes, a fim de inativar RNases

e garantir o isolamento do RNA viral. O RNA ligou-se à coluna formada por sílica, que foi

lavada com os tampões AW1 e AW2, para que os contaminantes fossem retirados do processo. O

RNA puro foi eluído em 60 µL de tampão AVE, livre de RNases.

Na segunda alternativa, o RNA viral foi extraído do sobrenadante da cultura pelo método

Trizol LS (Invitrogen), uma solução monofásica de fenol e guanidina isotiocianato comercial.

Adicionou-se 750 µL de Trizol LS (Invitrogen) a 250 µL de cada amostra de suspensão

viral. Em seguida, esta mistura foi homogeneizada e incubada por 5 min/TA. Após este

intervalo, foram adicionados 200 µL de clorofórmio (Merck) e a mistura foi homogeneizada em

vortex (15 s) e incubada (5 min/TA). Após esta etapa, as amostras foram centrifugadas (12.000

g/15 min) para separação de fases. A fase aquosa superior e transparente, onde se encontrava o

RNA viral, foi cuidadosamente retirada e transferida para um novo tubo de 1,5 mL. Foi

adicionado a ela 1 µL de glicogênio (20 µg/µL; Invitrogen) e 500 µL de isopropanol absoluto

(Merck). As amostras foram, mais uma vez, incubadas (15 min) e centrifugadas (12.000 g/15

min). O sobrenadante foi retirado e ao precipitado foi adicionado 1 mL de etanol 75 %, seguido

de última centrifugação (12.000 g/5 min). O sobrenadante foi descartado, o RNA viral obtido foi

seco à TA, ressuspenso em 20 µL de água livre de RNase, e incubado (5 min/65ºC) em

termobloco (Thermostat plus, Eppendorf). Em seguida, o RNA foi resfriado (5 min/TA),

aliquotado em alíquotas de 3 µL e estocado a – 70 ºC.

4.6 Construção dos Vírus FA Recombinantes

4.6.1 Obtenção do Cassete de Expressão DIII den-2/HA trunc den-4

Utilizou-se duas fontes para obtenção de uma seqüência codante do domínio III da

proteína E do vírus den-2, empregadas na síntese do cassete de expressão deste domínio no

genoma FA: o RNA viral do isolado genótipo BR64022/98, cedido pela Dra. Rita Nogueira do

Laboratório de Flavivírus do IOC, e o clone infeccioso FA 17D/Den 2 P/S (Caufour et al., 2001).

4.6.2 RT-PCR para Ampliação do Domínio III do Vírus den-2 genótipo BR64022/98

A extração de RNA do vírus den-2 genótipo BR64022/98 foi efetuada pelo sistema

“QIAamp Viral RNA Mini Kit” (Qiagen; seção 4.5). Para a obtenção da região gênica codante

para o domínio III do vírus dengue-2, preparações de RNA do vírus dengue-2 foram submetidas

à reação de RT-PCR, na qual foram empregados os oligonucleotídeos RG 392 (+) e RG 393 (-)

(Tabela 4.1). O desenho desses iniciadores abrangeu, além de seqüências nucleotídicas

homólogas aos extremos 5’ e 3’ do gene do domínio III, outras seqüências a fim de facilitar o

processo de clonagem molecular no genoma do vírus FA. O oligonucleotídeo RG 392 (+) possui,

na sua porção 5’, uma seqüência que não se pareia durante a reação, que corresponde à parte da

região codante para os 15 nucleotídeos 3´ terminais do gene E, contendo o sítio de restrição da

enzima Nar I, seguida dos 27 primeiros nucleotídeos do gene da proteína NS1. Já o RG 393 (-)

também possui uma seqüência nucleotídica que não se pareia durante a reação, correspondendo a

um fragmento da região codante para os 27 primeiros nucleotídeos da região haste âncora (HA)

do gene E, na sua porção 3’ (Figura 4.1).

Primeiramente, à preparação de RNA do vírus dengue-2 foram adicionados 20 pmoles do

RG 393 (sentido reverso) e essa mistura foi incubada (2 min/90

C) e mantida em banho de gelo.

Para a reação de transcrição reversa foram empregadas 200 U da enzima transcriptase reversa M-

MLV (“Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase”; Promega), tampão MULV 1X

(Promega), dNTPs a 1 mM cada (Promega) e 1 mM MgCl

(Promega), 20 U RNasin (Promega)

e água livre de nucleases para 20 µL de volume final. As reações foram incubadas em

termociclador Mastercycle ep (Eppendorf) por 1 ciclo (42ºC/60 min e 99ºC/5 min) e ciclo final

de 4ºC. Para a reação de PCR foi preparada uma mistura contendo tampão High Fidelity 1X

(Invitrogen), 1 mM MgSO

(Invitrogen), 1 U da enzima Taq Polimerase High Fidelity

(Invitrogen) e água livre de nucleases para volume final de 30 µL. Esses reagentes foram

adicionados ao DNA complementar sintetizado na etapa de transcrição reversa e submetidos à

ciclagem a partir de uma incubação inicial (94ºC/30 s) seguida de 30 ciclos: 94ºC/15 s, 55ºC/30

s, 68ºC/5 min e extensão final a 68ºC/5 min. Ao final, esta reação foi incubada (4ºC) e

armazenada a -70ºC. Alíquotas de 3 µL foram analisadas por eletroforese em gel de agarose

(seção 4.6.10).

4.6.3 PCR para Ampliação do Domínio III do Clone Infeccioso do Vírus Quimérico

FA/den-2

Alternativamente, outra fonte da região gênica do domínio III den-2 foi utilizada. Foi

realizado PCR do clone infeccioso 17D/Den 2 P/S (Caufour et al., 2001). O genoma desta

quimera é formado pelos genes codantes das proteínas estruturais prM/M e E do vírus dengue-2

Nova Guinea C (NGC) e o restante de seu genoma é compreendido pelas extremidades não

traduzidas, pelo gene C e pelos genes não estruturais do vírus FA 17D. Este plasmídeo do clone

infeccioso completo do vírus quimérico FA/den-2 foi utilizado como molde para reação de PCR

seguindo-se o mesmo protocolo descrito acima, com emprego dos mesmos oligonucleotídeos RG

392 (+) e RG 393 (-) (Tabela 4.1). Alíquotas de 3 µL foram analisadas por eletroforese em gel de

agarose (seção 4.6.10).

4.6.4 PCR para Amplificação da Região Truncada da Haste-Âncora (HA) da Proteína E

do Vírus Dengue-4

A amplificação da região C-terminal da proteína E, correspondente à haste-âncora (HA)

do gene E, foi realizada a partir de um segundo PCR. Essa região HA corresponde à HA

truncada do vírus dengue 4, uma vez que foram removidos seus elementos H1 e CS do domínio

Haste. Como molde, foi utilizado o plasmídeo que abrange o clone infeccioso completo do vírus

quimérico Den4/FA, contendo os genes E e prM do genótipo Venezuela 88 (R. Galler, em

preparação). O oligonucleotídeo RG 380 (Tabela 4.1), sentido reverso, possui em sua seqüência

a região N-terminal da proteína não-estrutural NS1 que não se pareia durante a reação, a porção

C-terminal da HA de den-4 e a seqüência correspondente ao sítio de restrição da enzima Nar I,

entre estas duas regiões (Figura 4.1.). Já o RG 394, sentido positivo, é formado pela região C-

terminal do DIII den-2 e pela porção N-terminal da HA de den-4 (Figura 4.1.).

Cerca de 10 ng do DNA do clone infeccioso completo Den4/FA foi amplificado na

presença de 20 pmoles dos oligonucleotídeos RG 394 e RG 380 e de 1 U da enzima Taq

polimerase High Fidelity (Invitrogen), segundo as especificações do fabricante. Essa reação foi

submetida ao mesmo programa de ciclagem, já descrito no item 4.6.2. Os fragmentos gerados

foram analisados por eletroforese em gel de agarose (seção 4.6.10).

4.6.5 Purificação dos Produtos de PCR por Eletroforese Preparativa em Gel de Agarose

As amostras contendo os produtos de PCR foram submetidas a eletroforese em gel de

agarose 0,8 % TAE (seção 4.6.10). Após a eletroforese, o fragmento de PCR correspondente à

HA truncada de den-4, contido no gel já corado com brometo de etídeo, foi cortado da matriz de

agarose, com auxílio de um estilete, e transferido para um tubo de 1,5 mL. Para a extração do

DNA, empregou-se o sistema “QIAquick Gel Extraction kit” (Qiagen). Adicionou-se ao

fragmento de gel, 3 V da solução QG (medido em relação ao peso, em gramas, do fragmento de

agarose extraído do gel), que foi mantida a 50

C/10 min. A amostra foi aplicada na coluna de

sílica, lavada com 0,75 mL da solução PE e o DNA eluído em 30 ou 40 µL da solução EB,

dependendo de sua concentração. A passagem pela coluna foi facilitada por centrifugação

(12.000 g/1 min/TA).

4.6.6 PCR de Fusão dos Fragmentos de DNA para a Montagem do Cassete de Expressão

do Domínio III

A última etapa para a construção do cassete de expressão do domínio III da proteína E do

vírus den-2 consistiu no PCR de fusão dos dois fragmentos de DNA já amplificados,

correspondentes ao DIII da proteína E de den-2 e à região da HA truncada do gene E de den-4.

Foi utilizado na reação o par de oligonucleotídeos RG 392 (+) e RG 380 (-) (Tabela 4.1). Esses

iniciadores pareiam-se nas extremidades opostas desses dois produtos de PCR, que por sua vez,

possuem regiões complementares (Figura 4.1). Isto permite que, após a síntese por PCR,

obtenha-se um único fragmento maior, correspondente aos dois fragmentos iniciais fusionados.

Para a reação, 40 ng do produto de RT-PCR ou PCR contendo o gene DIII den-2 (374pb), 30 ng

do produto de PCR contendo o gene da região HA truncada (253 pb), dNTPs (1 mM Promega),

MgSO

(1 mM Invitrogen), 20 pmoles de cada oligonucleotídeo (RG 380 e RG 392), 1 U de Taq

polimerase High Fidelity, segundo as especificações do fabricante, e água livre de nucleases para

50 µL de volume final. As reações sofreram um primeiro ciclo de incubação (94ºC/30 s) seguido

de 30 ciclos de incubação: 94ºC/15 s, 55ºC/30 s, 68ºC/35 s. Adicionalmente foi feita uma

incubação final de 68ºC/5 min e outra por tempo indeterminado a 4ºC. Os fragmentos foram

analisados por eletroforese em gel de agarose (seção 4.6.10).

Assim, o cassete de expressão DIII den-2 HA trunc den-4 deve conter, no sentido 5’ 

3’: a região 3’ do gene da proteína E, o sítio de restrição da enzima Nar I, os 27 primeiros

nucleotídeos do gene da proteína NS1, o DIII den-2, o sítio de restrição da enzima Nar I, a região

HA truncada do gene da proteína E de den-4 (sem os domínios H1 e CS) e os 27 primeiros

nucleotídeos do gene da proteína NS1, resultando em um produto final de PCR de 573 pares de

bases.

Tabela 4.1 – Seqüência dos oligonucleotídeos utilizados para a construção do cassete de

expressão DIII den-2 HA truncada den-4.

Oligonucleotídeo (polaridade) Seqüência (5’J3’)

RG 392 (+)

GGA GTT GGC GCC GAT CAA GGA TGC

GCC ATC AAC TTT GGC AAA GGG ATG

TCA TAC TCC ATG TGC

RG 393 (-)

CCT GGT GCA CAG CCT TTC CCA ATG

ATG TGG AAC TTC CTT TCT TGA ACC

AGT CC

RG 380 (-)

GCC AAA GTT GAT GGC GCA TCC TTG

ATC GGC GCC AAC TGT GAA GCC C

RG 394 (+)

GGA CTG GTT CAA GAA AGG TTC CAC

ATC ATT GGG AAA GGC TGT GCA CCA GG

Haste âncora Den-4Domínio III Den-2

N-term HA den-4 +

C-term DIII den -2

RG 392

RG 393

RG 394

RG 380

RG 392

RG 380

PCR

RT-PCR

PCR de Fusão

C-term HA FA +

N-term NS1 FA +

N-term DIII den-2

C-term DIII den -2 +

N-term HA den-4

N-term NS1 +

C-term HA den-4

Figura 4.1 - Obtenção do cassete de expressão inserido na região intergênica E/NS1 do genoma de

FA 17DD (Fonte: Laboratório de Biologia Molecular de Flavivírus - Fiocruz).

4.6.7 Clonagem do Cassete de Expressão do Domínio III den-2 no Vetor PCR-Blunt II-

TOPO

Após análise do cassete de expressão em gel de agarose, este foi purificado por meio do

sistema “QIAquick Gel Extraction” (Qiagen), cujo protocolo já foi descrito anteriormente (seção

4.6.5). O fragmento purificado do cassete de expressão do domínio III da proteína E do vírus

den-2 foi clonado no plasmídeo PCR-Blunt II-TOPO pelo sistema “Zero Blunt

TOPO

PCR

Cloning” (Invitrogen), de acordo com instruções do fabricante. Para a reação de clonagem, em

um tubo de 1,5 mL foram adicionados 100 ng (4 µL) do produto de PCR, 1 µL da solução de sal

(NaCl 1,2 M; MgCl

0,06 M) e 1 µL do vetor PCR-Blunt II-TOPO, totalizando um volume final

de 6 µL. Como controle positivo desta reação foi utilizado o plasmídeo pUC19, também oriundo

deste sistema comercial. Essas reações foram incubadas em gelo por 5 min e, em seguida,

iniciou-se a etapa de transformação em bactérias Escherichia coli linhagem DH5

quimiocompetentes comerciais (Tabela 4.2), provenientes do sistema de clonagem (Invitrogen).

Esta etapa de transformação bacteriana possibilita a introdução de um DNA circular exógeno, ou

plasmídeo, em uma bactéria (Sambrook et al., 1989).

Tabela 4.2 - Características genotípicas da cepa bacteriana usada durante o processo de

transformação com o Kit de clonagem Zero Blunt TOPO.

Cepa (E. coli) Genótipo

DH5-T1

ø80lacZ M15 (lacZYA-argF)U169 deoR

recA1 endA1 hsdR17 (r

) phoA supE44

thi-1 gyrA96 relA1 tonA (resistente ao fago

T1)

Em tubos de 15 mL, para cada volume de 50 µL de bactérias competentes foram

adicionados 2 µL da reação de clonagem e essa mistura foi incubada em gelo por 30 min. Após

este período, as células bacterianas sofreram choque térmico de 42ºC/30 s. Imediatamente, as

células foram transferidas para banho de gelo, e a esta suspensão, foram adicionados 250 µL de

meio SOC (“Super Optimal Catabolite”, Invitrogen) e mantido sob nova incubação (37ºC/1

h/200 rpm). Após este intervalo, foi feito o plaqueamento de 50 e 150 µL desta cultura, em

placas de Petri, contendo 40 mL de meio LB com 1,5 % ágar (Difco) acrescido do antibiótico

canamicina (50 µg/mL) para a seleção de clones recombinantes. As placas de Petri foram

incubadas (37ºC/18 h) e após este período, 10 colônias de cada placa foram removidas e cada

uma foi cultivada individualmente em frascos de 15 mL com 5 mL de meio LB acrescido de

canamicina (50 µg/mL) (37ºC/18 h/200 rpm).

Figura 4.2 - Mapa do vetor PCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen), parte do sistema comercial de

clonagem Zero Blunt TOPO, indicando os genes de resistência aos antibióticos canamicina e

zeocina. Este esquema também mostra os possíveis sítios de corte de diferentes enzimas de restrição

presentes no plasmídeo, além da região onde é realizada a clonagem (“Blunt PCR Product”). As áreas

marcadas com retângulos indicam os possíveis oligonucleotídeos a serem empregados no

seqüenciamento nucleotídico a fim de confirmação da clonagem. Extraído de Invitrogen

(2006 -

http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals /zeroblunttopo_man.pdf).

4.6.8 Extração em Pequena Escala dos Plasmídeos PCR-Blunt II-TOPO Recombinantes

As culturas bacterianas crescidas foram submetidas à extração de DNA plasmidial em

pequena escala para confirmação da clonagem do cassete de expressão do domínio III den-2.

Para tal, foi utilizado o sistema comercial, que emprega colunas com sílica, QIAprep Miniprep

(Qiagen,http://www1.qiagen.com/literature/Default.aspx?Term=QIAprep+Miniprep&Language=

EN&LiteratureType=4%3b8%3b9%3b10&ProductCategory=0).

As culturas de bactérias foram transferidas para tubos de 1,5 mL e centrifugadas (12.000

g/1 min), por duas vezes, sendo o sobrenadante descartado a cada centrifugação, para a formação

de precipitado bacteriano. Primeiramente, este precipitado foi ressuspendido em 250 µL do

tampão P1 e, em seguida, foram adicionados aos tubos 250 µL do tampão P2. Estas soluções,

juntamente com o precipitado bacteriano, foram misturadas de 4 a 6 vezes por inversão, para que

ocorresse a lise das células bacterianas. Após estes procedimentos, foram adicionados 350 µL do

tampão N3 e esta solução foi misturada da mesma forma que na etapa anterior. Os tubos foram

centrifugados (12.000 g/10 min). Todo o sobrenadante formado a partir desta última

centrifugação foi aplicado na coluna de sílica encaixada previamente em um tubo de 1,5 mL,

seguido de centrifugação (12.000 g/1 min). O sobrenadante foi descartado e a coluna foi lavada

com 500 µL de tampão PB por meio de centrifugação (12.000g/1 min). O sobrenadante foi

novamente descartado e a coluna então lavada com 750 µL de tampão PE e submetida ao mesmo

processo de centrifugação. Após descartar o sobrenadante, a coluna foi submetida a mesmo ciclo

de centrifugação, a fim de retirar todo o resíduo de tampão de lavagem. Por fim, a coluna foi

transferida para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL e o DNA, até então ligado à

coluna, foi eluído em 50 µL de tampão EB.

As preparações resultantes foram analisadas por eletroforese em gel de agarose. O perfil

de migração foi comparado ao perfil de amostras do plasmídeo vetor, com o objetivo de se

verificar quais culturas expressavam o DNA com tamanho pretendido, ou seja, maior que o

vetor. Estas amostras foram selecionadas para posterior análise de confirmação da inserção

clonada.

4.6.9 Digestão das Minipreparações Plasmidiais com Eco RI

A fim de avaliar a existência de bactérias recombinantes, as amostras de DNA plasmidial

foram submetidas à digestão com a enzima Eco RI, cujo sítio de corte flanqueia o inserto

clonado no vetor PCR-Blunt II-TOPO (Figura 4.2). Para cada reação de 10 µL, foram utilizados

60 ng de cada preparação plasmidial, que foram incubadas com 3 U da enzima Eco RI

(Promega), de acordo com as condições do fabricante. As reações foram incubadas (37ºC/1 h), e

as amostras digeridas foram analisadas por eletroforese em gel de agarose (seção 4.6.10).

4.6.10 Análise por Eletroforese de Ácidos Nucléicos em Gel de Agarose

A análise e a quantificação de DNA e RNA foram realizadas por eletroforese em gel

agarose em concentrações variáveis (0,8 ou 1%) em tampão TAE 1X. Foi aplicada uma corrente

elétrica média de 80 mA, permitindo a separação de ácidos nucléicos de acordo com o seu

tamanho e tipo de enovelamento.

Para cálculo de peso molecular, foram utilizados os marcadores comerciais Low DNA

Mass (Invitrogen), DNA/Hind III (Invitrogen) e DNA/Hind III Eco RI (Invitrogen).

Às amostras de ácido nucléico, foram adicionadas uma solução corante contendo xileno

cianol e azul de bromofenol ou tampão de amostra comercial Blue/Orange 6X Loading Dye

(Promega), para o acompanhamento do perfil de migração durante a corrida eletroforética. As

bandas de ácidos nucléicos foram detectadas por coloração do gel com brometo de etídeo 0,5

µg/mL (Biorad), a visualização das bandas de ácidos nucléicos foi feita sob luz ultravioleta 365

nm em transiluminador (Pharmacia LKB MacroVue) e as imagens dos géis foram obtidas pelo

sistema “Electroforesis Documentation and Analysis System 120 - Kodak”, câmera digital

(Kodak DC 120, programa Kodak 1D Image Analysis).

4.6.11 Preparação de Estoque Bacteriano

Os clones bacterianos recombinantes, após checagem realizada com enzimas de restrição

em gel de agarose, foram estocados em glicerol 16%. Para isto, 800 µL de cultura foram

adicionados a 200 µL de glicerol 80%. Os estoques foram armazenados a -20ºC.

4.6.12 Seqüenciamento Nucleotídico

Para a confirmação da integridade da seqüência nucleotídica do cassete de expressão

clonado, foi utilizada a técnica de terminação de cadeia por dideoxiribonucleotídeos (ddNTPs;

Sanger et al., 1977). Nas reações de seqüenciamento de amostras plasmidiais foram utilizados

entre 150 e 500 ng de DNA e 5 pmoles de cada oligonucleotídeo M13 F (+) e M13 R (-) (Figura

4.2 e Tabela 4.3). A mistura de DNA e oligonucleotídeo foi incubada (95ºC/5 min) e em seguida,

foram adicionados os reagentes do sistema comercial “BigDye Terminator v3.1 Cycle

Sequencing” (Applied Biosystems), com o uso de 2,0 µL de BigDye em volume final de 10 µL.

As reações foram incubadas em termociclador por 30 ciclos de 96ºC/10 s, 45ºC/5 s, 60ºC/4 min.

Após esta etapa, as reações de seqüenciamento foram precipitadas de acordo com o

seguinte protocolo: adicionou-se isopropanol (Merck) 60% às amostras que foram mantidas em

TA por no mínimo 15 min e, centrifugadas (12.000 g/20 min). Os sobrenadantes foram

desprezados e as amostras foram submetidas a dois ciclos de lavagens com etanol 60%. Após a

última centrifugação, as amostras foram aquecidas (65ºC/5 min) para que ficassem

completamente secas. Para finalizar o processo de precipitação, foram adicionados 10 µL de

formamida (Applied Biosystems) a cada amostra e estas, submetidas a seqüenciamento

nucleotídico.

O seqüenciamento nucleotídico foi realizado com o suporte da plataforma de

seqüenciamento PDTIS que conta com o seqüenciador automático ABI PRISM 3730 (Applied

Biosystems). Os cromatogramas correspondentes às seqüências nucleotídicas foram analisadas

com auxílio dos softwares Chromas version 3.0 (Technelysium Pty Ltd) e SeqMan II; este último

é proveniente do pacote de programas Lasergene, versão 5.07 (DNAStar Inc.).

Tabela 4.3 - Seqüência dos oligonucleotídeos utilizados para o seqüenciamento do cassete de

expressão DIII den-2 HA den-4 clonado no vetor comercial PCR-Blunt II-TOPO.

Oligonucleotídeo (polaridade) Seqüencia (5’J 3’)

M13F (+)

CAG GAA ACA GCT ATG AC

M13R (-)

GTA AAA CGA CGG GCC AG

4.7 Preparação do Molde de cDNA Viral

Para a obtenção do molde de cDNA viral recombinante foi utilizada a tecnologia do clone

infeccioso descrita por Rice e colaboradores (1989). Foi empregado o sistema de dois plamídeos,

que albergam, juntos, o genoma do vírus vacinal FA 17D sob a forma de cDNA. Neste presente

trabalho, foram utilizados o pT3 - derivado do pYFM5.2 (Rice et al., 1989) – contendo ou não a

inserção do gene correspondente ao cassete de expressão do domínio III da proteína E do vírus

den-2, e pG1.2 - derivado do pYF5’3’IV (Rice et al., 1989). Esses dois plasmídeos foram

construídos por Jabor (2001) e ambos podem ser propagados e amplificados de maneira estável,

fato que não acontece com plasmídeos individuais que carregam o genoma completo do vírus da

FA. Os plasmídeos utilizados nesta dissertação foram modificados a fim de seu genoma

assemelhar-se, fenotipicamente, ao genoma do víus vacinal 17DD, sendo, portanto, “17DD-

like”.

4.7.1 Subclonagem do Cassete de Expressão DIII den-2 no Plasmídeo pT3

4.7.1.2 Digestão de pT3 com Nar I

Dos clones bacterianos recombinantes que tiveram sua seqüência confirmada por

seqüenciamento nucleotídico, foi escolhido um exemplar para que fosse realizada a subclonagem

no plasmídeo pT3 (9.939 pb), o qual alberga, sob a forma de cDNA, a região central do genoma

do vírus FA17DD, que inclui parte do gene E, genes NS1, NS2A/B, NS3, NS4A/B e parte de

NS5 (Jabor, 2001) (Figura 4.3).

Primeiramente, o pT3 foi digerido com a enzima Nar I (Promega): para cada 50 ng de

plasmídeo foram utilizados 30 U de Nar I, de acordo com as recomendações do fabricante e água

deionizada para volume final de 250 µL. As reações foram incubadas (2 h/37ºC) e as amostras

digeridas foram analisadas em gel de agarose (seção 4.6.10).

Genoma central FA (9428 - 1373)

pT3/DIII den-2

(10473 pb)

Genoma central FA (1373 - 10473)

pT3

(9939 bp)

Figura 4.3 - Mapas dos plasmídeos pT3 íntegro e pT3 recombinante, contendo a inserção do

domínio III de dengue-2. O plasmídeo pT3 íntegro contém a região central do genoma do vírus FA

“17DD-like”. Estão indicados os sítios de restrição das endonucleases, a origem de replicação do

plasmídeo (ori) e o gene de resistência para beta-lactamase (bla) (“Gene Construction Kit” - GCK;

Textco, Inc., versão 2.5).

4.7.1.3 Precipitação de Ácidos Nucléicos

A fim de aumentarmos a concentração do material e otimizar as consecutivas etapas do

protocolo, as amostras digeridas com Nar I (Promega) foram precipitadas pelo método Acetato

de amônio/etanol (Sambrook et al., 1989). Adicionou-se às amostras 0,5 V de acetato de amônio

7,5 M e 3 V de etanol absoluto, seguido de centrifugação (12.000 g/10 min). O sobrenadante foi

desprezado e as amostras foram lavadas com 3 V de etanol 80%, seguindo o mesmo ciclo de

centrifugação. Novamente o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi seco à temperatura

ambiente e ressuspenso em 20 µL de TE.

4.7.1.4 Desfosforilação do Plasmídeo pT3/Nar I com SAP

A fim de minimizar a recirculação do vetor durante a etapa de transformação bacteriana,

o plasmídeo pT3 já digerido com Nar I foi submetido ao processo de desfosforilação com a

enzima SAP (Promega). Para cada 100 ng de DNA foram utilizados 0,2 U de SAP, segundo as

especificações do fabricante em volume final de 30 µL. A reação de desfosforilação foi incubada

(37ºC/15 min) e novamente incubada (65ºC/15 min) para inativação da enzima.

4.7.1.5 Digestão das Amostras Plasmidiais Recombinantes com Nar I

Dando prosseguimento à montagem do molde de cDNA do vírus recombinante, as

bactérias recombinantes para o cassete de expressão DIII den-2/HA trunc den-4 também foram

submetidas à digestão com a enzima Nar I para que fosse realizada a clonagem no sítio desta

enzima no plasmídeo pT3. Para cada 1 µg das alíquotas provenientes da preparação plasmidial

em pequena escala, foram adicionados 30 U de Nar I (Promega) nas condições fornecidas pelo

fabricante para volume final de 100 µL. As reações foram incubadas (37ºC/3 h) e o produto desta

reação foi analisado por eletroforese em gel de agarose (seção 4.6.10). A banda correspondente

ao cassete de expressão do domínio III foi então extraída por meio do sistema comercial

QIAquick Gel Extraction (Qiagen), de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante e já

descrito anteriormente (seção 4.6.5).

4.7.1.6 Ligação do Cassete de Expressão em pT3

Após as etapas de digestões e desfosforilação, o cassete de expressão DIII den-2/HA

trunc den-4 foi ligado ao plasmídeo pT3, utilizando-se o cálculo da relação equimolar entre o

vetor e o inserto, de modo a empregarmos duas diferentes proporções – 1 molécula do vetor (100

ng) : 5 moléculas do inserto (30 ng) e 1 molécula do vetor (100 ng) : 10 moléculas do inserto (60

ng). Para a reação de ligação foi empregada 1 U da enzima T4 DNA ligase (Invitrogen), no

tampão fornecido pelo fabricante (Invitrogen), em volume final de 10 µL. As amostras foram

incubadas a 4ºC por um período mínimo de 12 h.

4.7.1.7 Subclonagem do Cassete de Expressão DIII den-2/HA trunc den-4 no Plasmídeo

pT3

Esta subclonagem teve como objetivo obter grande quantidade de DNA correspondente

ao cassete de expressão, e a certificação da obtenção de extremidades coesivas criadas pela

digestão dos plasmídeos com a enzima de restrição Nar I. Cepas de E. coli SURE (Stop

Unwanted Rearrangement Events) quimiocompetentes (Tabela 4.4) foram preparadas em nosso

laboratório pela técnica Adriana Duarte. Nessa preparação foi usado o método do cloreto de

cálcio descrito por Sambrook et al. (1989), com modificações. As células foram transformadas

com os produtos de ligação como descrito no item 4.6.7.

Tabela 4.4 - Características genotípicas da cepa bacteriana usada durante o processo de

subclonagem do cassete de expressão no vetor pT3.

Cepa (E. coli) Genótipo

SURE

(Stop Unwanted Rearrangement Events)

e14-(McrA-) (mcrCB-hsdSMR-mrr)171

endA1 gyrA96 thi-1 supE44 relA1 lac recB

recJ sbcC umuC::Tn5 (Kan

) uvrC [F´ proAB

lacIqZM15 Tn10 (Tet

)].

Foi realizada a extração de plasmídeos em pequena escala de cada colônia, para avaliar a

presença de células bacterianas recombinantes. O sistema empregado foi o comercial QIAprep

Miniprep (Qiagen), cujos procedimentos já foram descritos anteriormente. Essas preparações

foram submetidas à digestão com a enzima Pst I para confirmação da clonagem do cassete de

DNA. Para cada reação foram utilizados 60 ng de plasmídeos, em tampão H fornecido pelo

fabricante (Promega), 3 U de enzima Pst I (Promega) e água estéril para volume final de 10 µL.

As reações foram incubadas (37ºC/2 h) e as amostras digeridas foram analisadas por eletroforese

em gel de agarose (seção 4.6.10). A verificação do sentido correto da inserção foi realizada por

seqüenciamento nucleotídico, por tratar-se de uma clonagem bidirecional. Foram utilizados os

oligonucleotídeos RG 174 (+) e RG 19 (-) os quais flanqueiam a região do genoma da FA onde o

cassete foi inserido – entre as proteínas E e NS1 (Tabela 4.5). Os procedimentos realizados para

a reação de seqüenciamento estão descritos no item 4.6.12. Os clones recombinantes

confirmados por seqüenciamento foram estocados em glicerol 80%, conforme descrito em

4.6.11.

Tabela 4.5 - Seqüência dos oligonucleotídeos utilizados para o seqüenciamento do cassete de

expressão DIII Den-2 HA Den-4 subclonado em pT3

Oligonucleotídeo

(polaridade)

Posição ocupada no

genoma FA

Seqüência (5’J 3’)

RG 174 (+) 1.640 – proteína E

CGG GGT GTG GAG AGA

GAT GCA

RG 19 (-) 2.638 – proteína NS1

GGG AGT CAA CTG AAT

TTA GGC

4.7.1.8 Extração de Plasmídeos em Grande Escala

As construções contendo os cassetes de expressão íntegros e com orientação correta

foram submetidos a preparações plasmidiais em grande escala com a finalidade de obter maior

massa de plasmídeos para ser utilizada nas próximas etapas de obtenção do molde de cDNA

viral. O sistema comercial empregado foi “HiSpeed

Plasmid Purification Kit” (Qiagen),

conforme recomendações do fabricante. Um primeiro pré-inóculo de 5 mL em meio LB, 50

µg/mL de ampicilina e 15 µL da cultura estocada em glicerol foi incubado (37ºC/200 rpm/8 h).

A partir deste inóculo, a cultura sofreu diluição de 1/500 e foi adicionada a 150 mL de meio LB

e 50 µg/mL de ampicilina, sofrendo nova incubação (37ºC/200 rpm/12 h). A cultura bacteriana

foi então centrifugada (6.000 g/15 min/4ºC) e o precipitado resultante foi ressuspenso com

auxílio de vortex, em 10 mL de tampão P1. Em seguida foi adicionado mesmo volume de

tampão P2, responsável pela lise das células, que foi misturado por inversão à suspensão

bacteriana e incubado (5 min/TA). Após este período, foi adicionado 10 mL de tampão P3 para a

neutralização, misturado da mesma forma que na etapa anterior. O lisado bacteriano foi aplicado

na coluna de sílica deste sistema comercial permanecendo por 10 min/TA, para garantir uma

correta filtração do precipitado quando este fosse aplicado a uma segunda coluna, de maior

escala, previamente equilibrada por ação da gravidade, com 10 mL do tampão QBT. Também

por ação gravitacional, o lisado bacteriano foi purificado ao passar por esta coluna e o DNA

plasmidial ligado por afinidade à resina de sílica. Em seguida, esta coluna sofreu uma lavagem

com 60 mL de tampão QC e o DNA plasmidial foi eluído em 15 mL de tampão QF. Por fim, o

DNA foi precipitado com isopropanol e etanol 70%, com auxílio de seringas e filtros

constituintes do sistema comercial e, por fim eluído em 1 mL de tampão TE.

4.7.1.9 Montagem do Molde de cDNA Viral

Para a obtenção do molde de cDNA viral foi empregado o sistema de dois plasmídeos. O

plasmídeo pT3 contém a parte central do genoma FA, parental ou recombinante para o cassete de

expressão da seqüência codante do domínio III; e o plasmídeo G1.2 (6.905 pb), contendo o

cDNA correspondente às extremidades genômicas virais 5´ (UTR não traduzida, genes C,

prM/M e parte do gene E) e 3´ (parte de NS5) do vírus FA “17DD-like” (Jabor, 2001) (Figura

4.4).

4.7.1.10 Digestão dos Plasmídeos com Nsi I e Sal I e Ligação dos Fragmentos

Cerca de 2 µg dos plasmídeos pT3 parental e recombinante e pG1.2 foram digeridos com

as endonucleases Nsi I e Sal I. Foi utilizada em cada reação 30 U Nsi I (Promega) e 30 U Sal I

(Promega) nas condições fornecidas pelo fabricante em volume final de 200 µL. As reações

foram incubadas (37ºC/2 h) e submetidas à análise por eletroforese em gel de agarose (seção

4.6.10).

As amostras foram purificadas pelo sistema comercial QIaquick PCR Purification

(Qiagen) para retirar as enzimas de restrição e o tampão de clivagem. Neste procedimento, foi

adicionado a cada volume do produto de ligação, 5 volumes do tampão PB. Essa mistura foi

aplicada em coluna de sílica para que o DNA se ligasse a ela por afinidade e submetida à

centrifugação (12.000 g/1 min). O sobrenadante foi desprezado e a mesma coluna foi lavada com

750 µL de tampão PE e submetida ao mesmo ciclo de centrifugação. O sobrenadante foi

descartado e o DNA foi eluído em 50 µL de tampão EB.

Após purificação, as amostras foram analisadas por eletroforese gel de agarose (seção

4.6.10). A reação de ligação dos fragmentos de DNA foi executada com 300 ng do pT3

recombinante e 200 ng de G1.2 na presença de 1 U da enzima T4 DNA ligase (Invitrogen) em

tampão comercial apropriado em volume final de 30 µL. As amostras foram incubadas

(4ºC/mínimo de 12 h). A visualização da ligação foi realizada por eletroforese em gel de agarose

(seção 4.6.10). Após a reação, a enzima T4 DNA ligase foi inativada (65ºC/20 min).

Figura 4.4 - Mapa do plasmídeo pG1.2. Este plasmídeo contém as regiões 3’ e 5’ do genoma do

vírus FA “17DD-like”. Estão indicados os sítios de restrição das endonucleases, a origem de replicação

do plasmídeo (ori), o gene de resistência para beta-lactamase (bla) e o promotor para a polimerase SP6.

As extremidades 5’ e 3’do genoma do vírus FA estão indicadas em vermelho e verde, respectivamente.

Fonte: Rice et al. 1989 (“Gene Construction Kit” - GCK; Textco, Inc., versão 2.5).

4.7.1.11 Digestão da Preparação de DNA Ligado com Xho I

A ligação foi em seguida submetida à digestão com a enzima Xho I, cujo sítio delimita a

extremidade 3´ do molde de cDNA genômico viral. Foram empregadas na reação 20 U de Xho I

(Promega) em tampão comercial apropriado em volume final de 90 µL. As amostras foram

incubadas (3 h/37ºC) e após esta etapa, o material foi precipitado pelo método acetato de

amônio/etanol (Sambrook et al., 1989) conforme descrito na seção 4.7.1.3. As amostras foram

ressuspensas em 10 µL de TE e 1 µL desta preparação foi analisada por eletroforese em gel de

agarose (seção 4.6.10).

4.7.1.12 Síntese in vitro do RNA Viral

A transcrição in vitro dos moldes de cDNA permitiu a produção in vitro do RNA

infeccioso (clone infeccioso) utilizado para obtenção de partículas virais em cultura de células

Vero. A transcrição in vitro do molde de cDNA, pelo uso do promotor SP6 RNA polimerase,

localizado na extremidade 5’ deste molde, permite a produção de RNAs virais infecciosos que

serão transfectados utilizando o método do lipídeo catiônico (Lipofectamine 2000, Invitrogen).

Para o preparo de grandes quantidades do transcrito visando a transfecção foi utilizado o

sistema de transcrição “AmpliScrib SP6 High Yield Transcription Kit” (Epicentre), em

condições de esterilidade, livre de nucleases e segundo recomendações do fabricante.

Os moldes de cDNA linearizados (50-100 ng) foram transcritos na presença de 1 U de

SP6 RNA polimerase, 3 mM do análogo de CAP, rNTPs 7,5 mM (de cada, sendo que GTP está a

0,75 mM), 10 mM DTT e 20 U de RNasin, em tampão apropriado por 2 h/37ºC. A integridade e

o perfil dos RNAs transcritos foram verificados por eletroforese em gel de agarose 1,0 % em

tampão TAE, livres de nucleases.

4.8 Transfecção do RNA Viral em Cultura de Células Vero

Foi utilizado aproximadamente 1 µg de RNA total resultante da transcrição in vitro. O

método escolhido foi o do lipídeo catiônico Lipofectamine 2000 (Invitrogen) em concentração

final de 20 µg/mL em 1 mL de meio Opti-MEM I 1X (Reduced Serum Medium Modification of

MEM - Gibco). O RNA foi complexado ao lipídio catiônico em meio Opti-MEM 1X por 10 min

em banho de gelo. Passado este intervalo, o complexo foi adicionado à monocamada de células

Vero, preparada com 24 h de antecedência (30.000 células/cm

). Foi retirado o meio de cultura

da monocamada e sobre ela, aplicada a solução contendo RNA-Lipofectamina, durante

incubação de 20 min/TA, movimentando-as a cada 2 min. Após este tempo, o sobrenadante foi

retirado das garrafas e a monocamada foi lavada com 5 mL de PBS livre de RNase e coberta

com 12 mL meio 199/Earle completo com 0,22% de NaHCO

. As culturas transfectadas foram

mantidas em incubadora com atmosfera de 5% de CO

a 37ºC e visualizadas diariamente em

microscópio invertido para verificação de efeito citopático. Os frascos de 25 cm

infectados com

os vírus recombinantes foram tripsinizados e, para isto, o sobrenadante celular foi descartado e a

monocamada de células foi lavada por duas vezes com uma solução de 50 mL de verseno e 500

µL de tripsina. Os frascos foram incubados (37

C/5% de CO

/3 min) para que a monocamada se

desprendesse da parede da garrafa e, em seguida, esta foi neutralizada com 2 mL de meio Earle

suplementado com 5% de Soro Fetal Bovino e 0,22% de NaHCO

Essa suspensão celular, na

proporção 1:4 ou 1:8, foi transferida para novos frascos de 25 cm

que já continham 12 mL de

meio 199/Earle 0,22% de NaHCO

. Os frascos foram incubados (37

C/5% de CO

) até

visualização de CPE e o sobrenadante das culturas foi coletado com adição de sorbitol a

concentração final de 8%. Este sobrenadante foi aliquotado e identificado como de primeira

passagem (1P), isto é, pós-tranfecção, e armazenado em freezer – 70°C.

Uma alíquota deste estoque foi submetida à extração do RNA viral (seção 4.5) e ao

procedimento de RT-PCR na presença de 20 pmoles dos oligonucleotídeos sintéticos RG 19 (-) e

RG 174 (+) (Tabela 4.5), por meio da técnica de RT-PCR (seção 4.6.2) para confirmação da

presença e integridade da inserção heteróloga.

Os fragmentos de DNA dupla fita antes de serem submetidos à reação de seqüenciamento

foram purificados por meio do “QIaquick PCR Purification” (Qiagen) (seção 4.7.1.10), a fim de

remover os dNTPs e os oligonucleotídeos restantes da reação de seqüenciamento.

Para a reação de seqüenciamento foi utilizada uma concentração desses fragmentos

purificados que variou de 20 ng a 80 ng e os oligonucleotídeos RG 174 (+), RG 175 (+) e RG 19

(-) na concentração de 5 pmoles. As seqüências dos oligonucleotídeos RG 174 (+) e RG 19 (-) já

se encontram descritas na tabela 4.5, enquanto que a descrição do oligonucleotídeo RG 175 (+)

está na tabela 4.6. As etapas em termociclador Mastercycle ep (Eppendorf), precipitação das

amostras e análise das seqüências já foram descritas na seção 4.6.12.

Tabela 4.6 - Oligonucleotídeo sintético utilizado no seqüenciamento nucleotídico do cassete de

expressão do domínio III den-2, clonado na região intergênica E/NS1 de FA 17D

Oligonucleotídeo

(polaridade)

Posição ocupada no

genoma FA

Seqüência (5’J 3’)

RG 175 (+)

1900- proteína E

CCC AAC TGA CAC TGG

CCA TGG

4.9 Produção dos Estoques Virais

Os estoques virais foram preparados em garrafas de 175 cm

, sistema fechado, cultivadas

com células Vero a uma densidade de 62.500 células/cm

. As culturas foram infectadas com

m.o.i (multiplicidade de infecção) desconhecida utilizando 3 mL de sobrenadante de transfecção

completado com 2 mL de meio 199/Earle com 0,22% de NaHCO

para que ocorresse a adsorção

viral. Essas culturas permaneceram em estufa (37

C/ 5% de CO

/1 h) e após este período, foram

adicionados 75 mL de meio 199/Earle com 0,11% NaHCO

e a garrafa foi incubada novamente

(37

C/5% de CO

) até visualização de CPE, quando então o sobrenadante viral foi recolhido e

suplementado com sorbitol a uma concentração final de 8%. As suspensões foram separadas em

alíquotas de 0,5 ou 1,0 mL e armazenadas em freezer a –70ºC. Esta preparação foi utilizada ao

longo de todo este trabalho de dissertação.

4.10 Caracterização dos Vírus FA Recombinantes

4.10.1 Titulação dos Vírus FA Recombinantes

Foi realizado por meio do teste de plaqueamento descrito por De Madrid e Porterfield

(1969), com algumas adaptações, por ser o método padrão empregado na titulação de vírus FA.

Monocamadas confluentes de células Vero cultivadas em placas de 24 cavidades (2 cm

cavidade) (Nunc, Naperville, EUA), numa densidade de 50.000 células/cm

foram semeadas com

24 h de antecedência em meio 199/Earle com 0,22% de NaHCO

. Os vírus vacinal FA17DD,

vírus G1.2/T3 (controles positivos) e os recombinantes foram diluídos seriadamente da diluição

-1

até 10

-6

, em meio 199/Earle 0,22% de NaHCO

. As placas contendo células Vero tinham o

meio de cultivo 199/Earle retirado de cada cavidade, por aspiração, com o auxílio de uma bomba

de vácuo, tomando-se o cuidado de não tocar na monocamada. Em seguida foram depositados,

em duplicata, 100 µL das suspensões virais diluídas. As placas foram, então, incubadas (1

h/37

C/5% de CO

), agitando-se gentilmente as mesmas de 15 em 15 min para que ocorresse

igual adsorção viral em toda a monocamada. Após este período, os inóculos virais foram

retirados, também por aspiração, e cada cavidade recebeu 1 mL de CMC (Carboximetilcelulose,

Sigma) a 3,5% em meio 199/Earle, suplementado com 5% de soro fetal bovino e 0,22% de

NaHCO

. As placas foram incubadas por 10 dias em estufa (5% de CO

/37

C) e, após este

período, para a detecção e contagem das placas de lise, efetuou-se a fixação das monocamadas

com formaldeído 10% por cerca de 1 h. Após este intervalo, as placas foram lavadas em água

corrente e coradas com solução de cristal violeta a 0,04% por 30 min e novamente lavadas em

água corrente para retirada do excesso de corante. Foram realizadas três titulações independentes

para todos os vírus e o cálculo do título viral expresso em unidades formadoras de placa (pfu)

por mL foi determinado mediante a utilização da seguinte fórmula:

T = log

M + log

ID + log

FC, onde:

T é o título expresso em log

pfu/mL;

log

M é o logaritmo na base 10 da média do número de placas de lise contadas numa

determinada diluição;

log

ID é o logaritmo na base 10 do inverso da diluição onde as placas de lise foram

contadas.

log

FC é o fator de correção em log

do inóculo para mL, ou seja, é o logaritmo na base

10 da fração de 1 mL inoculada. Como o inóculo corresponde a 100 µL, que é a décima parte

(1000/10 = 100) de 1 mL, FC=1 (log 10 = 1).

As amostras obtidas a partir do estoque viral foram submetidas a seqüenciamento

nucleotídico da região entre as proteínas estrutural E e a não-estrutural NS1, onde o inserto foi

clonado, a fim de verificarmos a integridade da mesma.

4.10.2 Cinética de Replicação Viral em Monocamadas de Células Vero

Os experimentos de cinética de propagação viral foram realizados em triplicata, em

cultura de células Vero com densidade de 62.500 células/cm

, semeadas 24 h antes da execução

do experimento. As células foram cultivadas em frascos de 25 cm

(sistema aberto) contendo 12

mL de meio Earle/199 com 0,22% de NaHCO

As garrafas tinham o meio de cultura retirado e

foram infectadas com os vírus recombinantes ou com o vírus controle FA 17DD e o parental FA

17D/G1.2-T3. A m.o.i escolhida para infecção foi de 0,02; valor considerado baixo como forma

de garantir que os vírus em replicação realmente tinham infectado as células. Passada uma hora

da adsorção dos vírus, adicionou-se 11 mL de meio Earle/199 com 0,22% de NaHCO

sobrenadante foi coletado em duas alíquotas de 250 µL nos seguintes intervalos de tempo: 24 h,

48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 h pós-infecção. As amostras coletadas foram estocadas a –70ºC e

uma das alíquotas coletadas de cada intervalo de tempo foi utilizada para posterior titulação, em

duplicata, em monocamadas de células Vero (50.000 células/cm

), de acordo com protocolo já

descrito. Esta titulação teve por objetivo avaliar o perfil de replicação dos vírus recombinantes

em relação aos controles, além de descobrir em qual intervalo de tempo ocorreria o pico de

replicação viral. Os gráficos correspondentes à curva de replicação viral ao longo do tempo (pós-

infecção) foram montados pelo programa Excel (Microsoft, 2003) e são resultado de uma média

dos 3 experimentos independentes, realizados sob as mesmas condições. O desvio padrão

também foi verificado e foi tido como insignificante quando mantido abaixo de 5%.

Para a análise estatística foi utilizado o programa GraphPad Prism versão 3.02

(GraphPad, Inc.). O teste ANOVA one-way com pós teste Tukey foi utilizado para a comparação

do título de cada vírus ao longo do tempo, e o teste ANOVA one-way com pós teste Bonferroni

foi empregado para comparar os títulos dos vírus estudados em cada período de infecção.

4.10.3 Estabilidade Genética Viral

Os dois vírus recombinantes FA 17D/DIII den-2 VGA e FA 17D/DIII den-2 IGA foram

submetidos a 10 passagens seriadas realizadas em duplicata (passagem 1 – P1 e passagem 2 –

P2), em monocamadas de células Vero, com o intuito de se determinar a estabilidade genética

das modificações inseridas no genoma do vírus parental, no caso, o vírus FA 17D/G1.2-T3, além

de possíveis modificações que pudessem ocorrer na região do inserto. As passagens seriadas

foram realizadas em garrafas com 25 cm

contendo 62.500 células/cm

e infectadas com o

volume de suspensão viral correspondente a uma m.o.i. de 0,02, a fim de garantir que um maior

número de ciclos replicativos virais ocorressem. A cada passagem, o sobrenadante recolhido das

culturas sofreu titulação de acordo com o descrito na seção 4.10.1 para que fosse realizado o

controle da m.o.i. utilizada na infecção daquela passagem já realizada. Caso ocorresse variação

da m.o.i., esta foi recalculada para o valor de 0,02 ao infectar-se a passagem consecutiva.

As passagens seriadas 5P1, 5P2, 10P1 e 10P2 foram submetidas à extração de RNA viral

(Método Trizol-LS), RT-PCR e seqüenciamento nucleotídico a fim de se averiguar a presença e

integridade do cassete de expressão. Estes procedimentos já foram descritos nas seções 4.5 e

4.6.2, respectivamente.

4.10.4 Imunofluorescência e Microscopia Confocal

Câmaras de 8 poços (Lab-Tek Chamber Slides, Nunc) foram semeadas com células Vero

em duas densidades: 20.000 e 30.000 células por poço. As câmaras foram infectadas com o vírus

controle FA 17DD, o vírus parental FA 17D/G1.2-T3 ou com os recombinantes FA 17D/DIII

den-2 VGA e FA 17D/DIII den-2 IGA, numa m.o.i. de 0,02 em 100 µL. As câmaras foram

incubadas (37

C/5% de CO

/72 h) e foi removido o sobrenadante celular de cada poço que foram

lavados por duas vezes com PBS 7,4 e, em seguida foi realizada a fixação das células com

paraformaldeído 4% em tampão fosfato. Após 10 min de incubação à TA, os poços foram

novamente lavados por duas vezes com PBS e foi iniciada a permeabilização das células com

0,5% de Triton X-100 em PBS. Passados 10 min de incubação à TA, a solução foi retirada e os

poços lavados com solução bloqueio composta por PBS 1% BSA seguida de outra incubação (20

min/TA). Após este intervalo, os anticorpos primários líquido ascítico murino anti dengue-2

(Gentry et al., 1982; Hiramatsu et al., 1996; 3H5-1-21 - Lote 077LAM001 - Data:16/07/07 –

cedido pelo LATAM/Bio-Manguinhos) e monoclonal anti-E de FA (Monath e Nystrom, 1984;

YF 17D 2D12 – Lote 0505001 – Data 10/05/2005 - cedido pelo LATAM/Bio-Manguinhos) eram

aplicados nos poços, na diluição 1:80 respectivamente. Em seguida, realizou-se uma incubação

de 1 h à TA e, após este intervalo, a preparação dos anticorpos foi removida e as câmaras lavadas

por três vezes com a solução de bloqueio. Para a marcação com o anticorpo secundário, foram

empregados os anti IgG de camundongo conjugados a Alexa Fluor 546 (Molecular Probes), nas

diluições 1:400, seguido de nova incubação por 1 h a TA. Passado este intervalo, os anticorpos

foram removidos e os poços lavados por três vezes com solução bloqueio. As lâminas foram

montadas com “SlowFade Gold antifade reagent with DAPI” (Molecular Probes) a fim de

minimizar a perda de fluorescência emitida pelos anticorpos secundários. As lâminas foram

visualizadas em microscópio invertido Olympus (IX51) para uma primeira avaliação da

qualidade e especificidade de marcação e após esta primeira análise as lâminas foram

visualizadas em microscópio confocal (laser scanning) (LSM 510 META, Carl Zeiss). A imagem

capturada foi arquivada com auxílio do programa “LSM Image Browse 3.5”, com suporte da

“Plataforma multi-usuário de microscopia confocal – PDTIS-FIOCRUZ”.

4.10.5 Microscopia em Contraste de Fase

Câmaras de 8 poços (Lab-Tek Chamber Slides, Nunc) foram semeadas com células Vero

na densidade 20.000 células por poço e infectadas com os vírus controle FA 17DD, parental FA

17D/G1.2-T3 ou com os recombinantes FA 17D/DIII den-2 VGA ou FA 17D/DIII den-2 IGA,

numa m.o.i. de 0,02. Como controle negativo, um poço de cada câmara não sofreu infecção

(Mock). As câmaras foram incubadas (37ºC/5% de CO

) e visualizadas em microscópio

invertido Olympus (IX51) nos aumentos de 200 e 400 X em intervalos de tempo de 24 h, 48 h,

72 h, 96 h, 120 h e 144 h pós-infecção. Imagens em contraste de fase foram adquiridas em

intervalos de tempo definidos de todos os poços infectados pelos vírus mencionados, inclusive o

Mock, a fim de comparar o efeito citopático entre os vírus controle, parental e os recombinantes.

5. RESULTADOS

5.1 Estudos Preliminares da Estrutura do Domínio III do Vírus Dengue-2: Análise por

Alinhamento Seqüencial e Modelagem Molecular

Antes que fosse realizada a clonagem do cassete de expressão do DIII den-2/HA truncada

den-4 na região intergência E/NS1, foi feito um estudo sobre a identidade das seqüências de DIII

entre os genótipos de den-2, entre os sorotipos de dengue, e das regiões que correspondem à

porção de HA de FA 17D e de den-4, a fim de se determinar o grau de conservação seqüencial

entre estes domínios de diferentes Flavivírus.

A seqüência de aminoácidos do DIII proveniente do clone infeccioso 17D/Den 2 P/S

(Caufour et al., 2001), utilizada para a construção do cassete de expressão, foi alinhada e

comparada com diferentes genótipos de den-2 escolhidas a partir de análises filogenéticas (Rico-

Hesse et al.,1998; Twiddy et al., 2002; dos Santos et al., 2002 e Rodriguez-Roche et al., 2005).

Foi utilizado pelo menos um representante de cada genótipo: NGC 44, Tailândia K008/93,

16681, Austrália TSV01/93, 16681, Jamaica 1409/83, BR64022/98, Peru IQT2913/96, além da

seqüência do genótipo candidato vacinal S1 Vaccine. A região que foi considerada como domínio

III neste trabalho é formada por 103 resíduos de aminoácidos, com início no resíduo 295 e fim no

397 da proteína E.

As estruturas secundárias (fitas 1-9) estão representadas em cores no alinhamento

(Figura 5.2) e foram nomeadas dessa forma seguindo a nomenclatura empregada por Volk et al.

(2007). Entretanto, caso seja seguida a nomenclatura utilizada por Rey e colaboradores (1995), as

fitas 1-9 equivalem a: A, B, Cx, C, D, Dx, E, F e G, respectivamente, observando-se algumas

alterações em relação às suas composições e/ou extensões. As fitas  se organizam numa

configuração de três folhas, sendo a primeira, cuja superfície superior encontra-se exposta na

superfície da partícula viral, é formado pelas fitas 1, 2, 5 e 7 (retângulo azul claro na figura

5.1); a segunda folha e a menor delas é formada pelas fitas 3 e 6 (retângulo amarelo na figura

5.1); e a terceira folha é formada pelas fitas 4, 8 e 9 (retângulo azul escuro na figura 5.1).

O alinhamento entre os resíduos de aminoácidos do DIII de diferentes genótipos de den-2

mostrou 7 diferenças, sendo que 2 representam substituições conservadas, 3 são semi-

conservadas e 2 não conservadas (Figura 5.1 e Tabela 5.1). A conservação entre os resíduos de

aminoácidos é ditada pelo programa escolhido para a realização dos alinhamentos: o Clustal W2

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Este programa agrupa os aminoácidos de

acordo com suas propriedades físico-químicas, a seguir: AVFPMILW são classificados como

hidrofóbicos de cadeia lateral pequena, DE são ácidos, RK básicos e STYHCNGQ polares que

tenham em suas cadeias laterais um radical hidroxil ou amina, com exceção da glicina que é

apolar. No alinhamento entre as seqüências de nucleotídeos foram identificadas 50 trocas

nucleotídicas num total de 309 nucleotídeos.

Comparando-se a seqüência de aminoácidos do DIII entre os quatro sorotipos do vírus

dengue foram encontradas poucas variações quanto à formação e extensão das fitas  que

compõem este domínio (Figura 5.2). Entre as variações observadas, 21 destas são conservadas,

11 são semi-conservadas e 26 não são conservadas, representando 43,7% de identidade entre as

cinco seqüências comparadas. Dentre as fitas, a 5 mostrou-se ser a mais variada entre as nove

que constituem a estrutura de DIII: em den-3 e den-4 ela é composta por apenas 2 aminoácidos,

enquanto que em den-2 ela apresenta mais 3 resíduos na sua porção N-terminal.

Em se tratando da identidade de nucleotídeos, a região de DIII mostrou-se bastante

diversificada entre os sorotipos de dengue. Foram observados apenas 128 nucleotídeos idênticos

num total de 310 possíveis que compõem o DIII (identidade seqüencial de 41,3%).

Tabela 5.1 - Alterações observadas na seqüência de aminoácidos de DIII após alinhamento múltiplo

entre diferentes genótipos do vírus dengue 2.

Mutação Posição na proteína E Localização em DIII

V ↔ I

308

1

I ↔ V ↔ T 335

Alça 3 e 4

H ↔ Y

346

Alça 4 e 5

V ↔ A 347

5

I ↔ T

352

Alça 5 e 6

V ↔A

382

Alça 8 e 9

D ↔ N ↔ S

390

9

Figura 5.1 - Alinhamento múltiplo das seqüências de aminoácidos de DIII de diferentes

genótipos do vírus dengue, sorotipo 2, com suas respectivas fitas β. Os genótipos escolhidos com

as suas respectivas seqüências depositadas no GenBank foram: NGC 44 (AF038403), Tailândia

K008/93 (AF100459), Austrália TSV01/93 (AY037116), Jamaica 1409/83 (M20558), BR64022/98

(AF489932), Peru IQT2913/96 (AF100468), 16681 (U87411) e S1 Vaccine (M19197). A primeira

posição do alinhamento é ocupada pela seqüência de DIII, proveniente do clone infeccioso 17D/Den 2

P/S (Caufour et al., 2001) utilizada para a construção do cassete de expressão. Os asteriscos (*)

representam os resíduos idênticos em todas as seqüências do alinhamento, os dois pontos (:) indicam

substituições conservadas e o ponto (.) faz referência a substituições semi-conservadas (ClustalW2,

versão 2.01, http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).

DIII den-2 cassete KGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEK 50

NGC 44 KGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEK 50

Tailândia K008/94 KGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKVPFEIMDLEK 50

Austrália TS V01/93 KGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEK 50

Jamaica 1409/93 KGMSYSMCTGKFKIVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEK 50

BR64022/98 KGMSYSMCTGKFKIVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEK 50

Peru IQT2913/96 KGMSYSMCTGKFKIVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEK 50

16681 KGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEK 50

S1 Vaccine KGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKTPFEIMDLEK 50

*************:************************** *********

DIII den-2 cassete RHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLDWFKK 100

NGC 44 RHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKK 100

Tailândia K008/94 RYVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKK 100

Austrália TS V01/93 RHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLSWFKK 100

Jamaica 1409/93 RHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKK 100

BR64022/98 RHALGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKK 100

Peru IQT2913/96 RHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGAEPGQLKLDWFKK 100

16681 RHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKK 100

S1 Vaccine RHVLGRLTTVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLDWFKK 100

*:.**** *****************************.*******.****

DIII den-2 cassete GSS 103

NGC 44 GSS 103

Tailândia K008/94 GSS 103

Austrália TS V01/93 GSS 103

Jamaica 1409/93 GSS 103

BR64022/98 GSS 103

Peru IQT2913/96 GSS 103

16681 GSS 103

S1 Vaccine GSS 103

***

β1

β2 β3

β5 β6 β7 β8 β9

β4

295

397

Cassete DIII den-2 KGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEK 50

NGC 44 KGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEK 50

Den 1 Hawaii KGMSYVMCTGSFKLEKEVAETQHGTVLVQVKYEGTDAPCKIPFSTQDEKG 50

Den 3 H87 KGMSYAMCLNTFVLKKEVSETQHGTILIKVEYKGEDAPCKIPFSTEDGQG 50

Den 4 H241 KGMSYTMCSGKFSIDKEMAETQHGTTVVKVKYEGAGAPCKVPIEIRDVNK 50

***** ** ..* : **::****** :::*:*:* .:***:*:. * :

Cassete DIII den-2 RHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLDWFKK 100

NGC 44 RHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKK 100

Den 1 Hawaii VTQNGRLITANPIVTDKEKPVNIEAEPPFGESYIVVGAGEKALKLSWFKK 100

Den 3 H87 KAHNGRLITANPVVTKKEEPVNIEAEPPFGESNIVIGIGDKALKINWYRK 100

Den 4 H241 EKVVGRIISSTPFAEYTNSVTNIELEPPFGDSYIVIGVGDSALTLHWFRK 100

**:*: .*.. .:. .*** *****:* *::* *.: *::*

Cassete DIII den-2 GSS 103

NGC 44 GSS 103

Den 1 Hawaii GSS 103

Den 3 H87 GSS 103

Den 4 H241 GSS 103

***

β1 β2

β3

β5

β6 β7 β8 β9

β4

Figura 5.2 - Alinhamento múltiplo das seqüências de aminoácidos de DIII entre os 4 sorotipos do

vírus dengue, incluindo o cassete de expressão. As fitas  estão representadas por uma linha

sublinhando os respectivos resíduos de aminoácidos. As seqüências utilizadas neste estudo estão

depositadas no GenBank: den-1 genótipo Hawaii (AF425619), den-2 NGC 44 (AF038403), den-3

genótipo H87 (L11423), den-4 genótipo H241 (AY947539) e os números de acesso depositados no

banco de dados do NCBI estão indicados entre parênteses. O sorotipo Den 1 genótipo Hawaii não tem

as fitas  do DIII identificadas, uma vez que este ainda não teve sua estrutura resolvida. Os asteriscos

(*) representam os resíduos idênticos em todas as seqüências do alinhamento, os dois pontos (:)

indicam substituições conservadas e o ponto (.) faz referência a substituições semi-conservadas

(ClustalW2, versão 2.01, http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).

Uma primeira análise realizada com o cassete de expressão DIII den-2/HA trunc den-4 foi

feita alinhando-se as regiões do DIII da proteína E dos vírus FA 17D e den-2. A seqüência

nucleotídica do DIII do plasmídeo pT3, o qual alberga o genoma central do vírus FA foi

conseguida na patente (Bonaldo, MC e Galler, R; Depósito 20050121605 realizado em

31/10/2005), enquanto que a seqüência de DIII den-2 foi obtida a partir

do clone infeccioso

17D/Den 2 P/S (Caufour et al., 2001). A identidade seqüencial entre os resíduos de nucleotídeos

e aminoácidos dessas porções destes dois Flavivírus (Figura 5.3 – A, Tabela 5.2) foi de 52,1% e

47,6%, respectivamente. Em seguida, foi realizado o alinhamento entre as regiões de HA

completa de FA 17D e HA completa e truncada do vírus den-4 (Figura 5.3 – B, Tabela 5.2). Esta

seqüência para o vírus FA 17D foi obtida da mesma forma que a descrita acima e, para o vírus

den-4, foi utilizada a seqüência do molde de cDNA completo construído para geração de um

vírus quimérico FA/Den-4 contendo os genes E e prM do genótipo Venezuela 88 (R. Galler, em

preparação). Os domínios funcionais haste (H1, CS e H2) e âncora (TM1 e TM2) foram

delimitados usando por base a determinação previamente feita para estas regiões da proteína E do

vírus FA (Bonaldo et al., 2007) (Figura 5.3 - B). A versão truncada da HA de den-4 fusionada à

proteína heteróloga foi formada por 66 aminoácidos e não continha os elementos H1 e CS, em

contraposição à versão completa da HA de FA 17D, composta por 96 resíduos de aminoácidos.

Os percentuais de identidade observados entre as porções HA completa FA 17D e HA completa

de den-4 foram de 58% para nucleotídeos e 47,9%, para aminoácidos, enquanto que para as

versões de HA truncadas destes dois Flavivírus os percentuais de identidade foram ligeiramente

menores, apresentando 57,1% e 45,5%, respectivamente (Tabela 5.2). O cassete de expressão

DIII den-2 HA truncada de den-4 formado por 178 resíduos de aminoácidos, clonado no genoma

de FA está representado na figura 5.3, com seus componentes delimitados.

Tabela 5.2 - Identidade das seqüências de DIII e Haste-âncora da proteína E utilizadas na

montagem do cassete de expressão. Estão indicados os percentuais de identidade entre as seqüências de

nucleotídeos (nt) e aminoácidos (aa) das regiões de DIII de FA 17D e den-2; HA FA 17D e HA completa

e truncada den-4 e DIII FA 17D HA completa FA com DIII den-2 HA truncada den-4.

Região comparada

% Identidade

Nucleotídeos Aminoácidos

DIII (FA 17D x cassete den-2) 52,1 47,6

HA (completa FA x completa den-4) 58,0 47,9

HA (truncada FA x truncada den-4) 57,1 45,4

DQGCAINFGKGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLDWFKKGSS

TSLGKAVHQVFGSVYTTMFGGVSWMIRILIGFLVLWIGTNSRNTSMAMTCIAVGGITLFLGFTVGA

N – term NS1

DIII den-2

TM2

1 -

-178

TM1

Figura 5.3 - Análise seqüencial dos componentes do cassete de expressão DIII den-2 HA trunc den-4. (A) Alinhamento da seqüência de aminoácidos que

compõem o domínio III de FA 17D com aquela do domínio III de dengue-2 NGC utilizado para a construção do cassete de expressão. (B) Alinhamento da

seqüência de aminoácidos que compõem a porção da HA completa de FA 17D e den-4 (completa e truncada). Os retângulos indicam os elementos

formadores desta região e os traços horizontais a ausência destes elementos na HA truncada, a escolhida para a construção do cassete de expressão. (C)

Cassete de expressão DIII den-2 HA trunc den-4 clonado no genoma FA e seus elementos constituintes. Os asteriscos (*) representam os resíduos idênticos

em todas as seqüências do alinhamento, os dois pontos (:) indicam substituições conservadas e o ponto (.) faz referência a substituições semi-conservadas

(ClustalW2, versão 2.01, http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).

(C)

5.1.2 Modelagem Molecular

A fim de comparar a estrutura tridimensional do DIII den-2 genótipo NGC, utilizada

para construção do cassete de expressão, com as demais estruturas já resolvidas do DIII de

outros sorotipos de dengue, bem como de outros Flavivírus, foi realizada a modelagem

molecular por homologia desta porção. Esta comparação teve como principais alvos:

identificar as regiões variáveis entre os genótipos de den-2 e mapear os possíveis resíduos que

representam escape de neutralização por anticorpos e apontar os resíduos que se ligariam a

receptores celulares, todos estes já descritos na literatura.

A busca de seqüências molde para o alinhamento destas com DIII den-2 NGC foi

realizada no programa BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ tendo como banco de

dados o PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Duas seqüências de DIII foram

eleitas para o alinhamento, empregando-se dois parâmetros: boa resolução quando resolvidas

(igual ou superior a 2 Å) e maior identidade seqüencial (igual ou superior a 25%). Assim, o

DIII den-2 foi alinhado com DIII do vírus den-3 (nº de acesso PDB = 1uzg, resolução = 3,5 Å,

identidade = 57 %; Modis et al., 2005) e com DIII do vírus do Oeste do Nilo (nº de acesso

PDB = 2i69, resolução = 3,11 Å, identidade = 44 %; Kanai et al., 2006). O alinhamento

destas seqüências, realizado no programa ClustalW2

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html; Figura 5.4) apresentou 34 resíduos idênticos,

20 alterações conservadas e 11 não conservadas.

Para a geração do modelo tridimensional do DIII den-2, utilizado para a composição

do cassete de expressão, foi empregado o programa Modeller (http://salilab.org/modeller/). O

modelo final é constituído por 9 fitas  desenhadas de acordo com os alinhamentos das

figuras 5.1 e o proposto pelo programa ClustalW2 (Figura 5.4), e a nomenclatura empregada

foi proposta por Volk et al. (2007). A constituição de cada fita , seus tamanhos e posições

estão descritos na figura 5.1. As nove fitas que compõem o modelo se organizam em três

folhas , numa conformação de -barril. A primeira folha é formada pelas fitas 1, 2, 5 e 7

(em azul claro na figura 5.5) e apresenta sua superfície superior exposta na partícula viral; a

segunda por 3 e 6 (em amarelo na figura 5.5) e a terceira delas, pelas fitas 4, 8 e 9 (em

azul escuro na figura 5.5). A fita 1 é a maior fita que compõe o modelo, totalizando 9

aminoácidos em sua constituição, enquanto que 3 e 6 são as menores, cada uma é formada

por 2 resíduos de aminoácidos.

Figura 5.4 - Alinhamento múltiplo das seqüências molde para a realização da modelagem do DIII den-2 utilizado para a geração do cassete de inserção.

A seqüência de DIII den-2 do cassete foi alinhada a seqüências obtidas no banco de dados PDB e estão representadas no alinhamento pelo seu código de acesso:

1uzg (DIII den-3, Modis et al., 2005) e 2i69 (DIII WNV, Kanai et al., 2006). O alinhamento foi realizado pelo programa ClustalW2 e os asteriscos (*)

representam os resíduos idênticos em todas as seqüências do alinhamento, os dois pontos (:) indicam substituições conservadas e o ponto (.) faz referência a

substituições semi-conservadas (ClustalW2, versão 2.01, http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).

Figura 5.5 - Modelo do domínio III da proteína E de dengue-2 utilizado para a construção do

vírus recombinante FA 17D/DIII den-2. (A) Visão da face voltada para o interior do dímero da

proteína E, em contato com o domínio I. (B) Visão da face voltada para a superfície lateral do dímero

da proteína E. N-term (N), C-term (C) e a face voltada para superfície (S).

Para a avaliação da qualidade do modelo gerado pelo programa Modeller, foram

utilizados os programas PROCHECK e Verify 3D. O PROCHEK (Laskowski et al., 1993)

avalia a qualidade estereoquímica do modelo obtido, em termos dos comprimentos de

ligações, dos ângulos planos e ângulos torcionais da cadeia principal, da qualidade do gráfico

de Ramachandran, dentre outros quesitos, sendo o programa mais utilizado para tal (Filho e

Alencastro, 2003). A partir desta avaliação, o modelo gerado apresentou 90,5% dos resíduos

localizados dentro da área correspondente às regiões ótimas no gráfico de Ramachandran,

7,1% dos resíduos posicionados nas regiões adicionais, 2,4% deles nas regiões generosas e

nenhum resíduo (0%) nas regiões não permitidas, sendo considerado, portanto, um bom

modelo (Figura 5.6).

β1β2

β3

β4

β5

β6

β7

β8

β9

β1

β2

β3

β4

β5

β6

β7

β8

β9

(A)

(B)

β1β2

β3

β4

β5

β6

β7

β8

β9

β1

β2

β3

β4

β5

β6

β7

β8

β9

(A)

(B)

Figura 5.6 – Plot de Ramachandran gerado pelo programa PROCHECK.

O programa Verify 3D (Lüthy et al., 1992) analisa se a seqüência modelada é

compatível com o enovelamento do modelo. Este programa verifica a vizinhança na qual as

cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos se encontram, baseando-se principalmente em

três propriedades: na área total não exposta da cadeia lateral, na fração da área coberta por

átomos polares (O e N) e na tendência desses resíduos de formarem estruturas secundárias

(Bowie et al., 1991 e Lüthy et al., 1992). Este programa faz a correlação entre a estrutura 3D

da proteína com valores para sua seqüência 1D, encontrados a partir de combinações entre os

parâmetros determinados acima, que colocam cada resíduo em uma de 18 possíveis regiões.

Para cada tipo de resíduo, há um escore que reflete sua compatibilidade com tal região

(definida previamente por análise estatística de proteína com estrutura conhecida). Cálculos

estatísticos e algoritmos tornam a estrutura da proteína mais maleável, podendo compará-la a

outras distantemente relacionadas, com a oportunidade de detectar relações estruturais que

não seriam vistas pela similaridade seqüencial (Bowie et al., 1991). O valor final esperado é

dado em relação ao número de resíduos que compõem a proteína em questão (Bowie et al.,

1991). Os valores determinados por este programa sinalizam que o modelo teórico para o DIII

está bastante satisfatório, apresentando como valor total 35,38; quando o ideal esperado seria

46,6 e um valor mínimo aceitável de 21, para o DIII, cujo número total de resíduos é 103.

5.1.1 Mapeamento dos Sítios Antigênicos no Modelo Tridimensional de DIII den-2

Com o modelo de DIII den-2 definido, foram mapeadas algumas regiões importantes

relacionadas à função desta porção, que já haviam sido descritas na literatura para os quatro

sorotipos do vírus dengue. As figuras a seguir com estas regiões identificadas orientam o DIII

em relação ao dímero da proteína E de tal forma que: as extremidades identificadas como N-

terminal (N) estão voltadas para o interior do DIII, ou seja, sinalizam a alça que se liga ao DI,

enquanto que a porção C-terminal (C) está na porção mais distal do dímero, sendo a porção

final da proteína E. As regiões que se encontram expostas na superfície viral foram

identificadas com (S).

Foram identificadas sete substituições entre os diferentes genótipos de den-2,

identificadas com esferas amarelas na figura 5.7: E308 (VI), E335 (IVT), E346

(HY), E347 (VA), E352 (IT), E382 (VA), E390 (DNS). Algumas destas

encontram-se dispersas ao longo da estrutura de DIII, enquanto que outras parecem estar

agrupadas preferencialmente em duas regiões deste domínio (Figura 5.7).

β1

β2

β3

β4

β5

β6

β7

β8

β9

390

308

346

352

347

382

335

308

390

β1

β7

β2

β3

β6

352

335

β9

β8

β4

β5

382

346

347

(A)

(B)

Figura 5.7 – Substituições de aminoácidos observadas entre os genótipos de den-2

(esferas amarelas). (A) Visão da face voltada para o interior do dímero da proteína E. (B)

Visão apical de (A).

Foram identificadas regiões do DIII que apresentaram um conjunto de resíduos de

escape de neutralização por anticorpos sorotipo específicos, os quais alteram a ligação ao

receptor celular (Modis et al., 2005). Estas regiões localizam-se principalmente nas fitas 1 e

9 deste presente modelo, representados pelos resíduos E303 (T), E304 (G), E305 (K), E306

(F), E307 (K), E308 (V), E309 (V), E383 (E), E384 (P) e E385 (G), identificados por esferas

cor de rosa na figura 5.8 – A.

Os resíduos E304 (G), E383 (E), E384 (P) e E385 (G), específicos para DIII den-2,

foram identificados como os sítios antigênicos de ligação do anticorpo monoclonal 3H5

utilizado neste trabalho nas etapas de microscopia confocal de fluorescência (Gentry et al.,

1982; Hiramatsu et al., 1996, Sukupolvi-Petty et al., 2007). Quando estes resíduos encontram-

se alterados, foi observada reduzida afinidade de ligação de 3H5 a este trecho (Gentry et al.,

1982; Hiramatsu et al., 1996, Sukupolvi-Petty et al., 2007). Todos estes resíduos estão

expostos na superfície viral por uma alça lateral de DIII (Figura 5.8 – B, esferas laranja).

Figura 5.8 - Epítopos mapeados no DIII den-2. (A) O conjunto de resíduos relacionados com escape

de neutralização por anticorpos específicos ao sorotipo den-2 são destacados em esferas cor de rosa

(Modis et al., 2005). (B) Resíduos de aminoácidos que afetam a ligação do anticorpo monoclonal 3H5

(esferas laranja). N-term (N), C-term (C) e a face voltada para superfície (S).

β1

β2

β3

β4

β5

β6

β7

β8

β9

T303

V309

P384

E383

G385

β1

β2

β3

β4

β5

β6

β7

β8

β9

E383

P384

G385

G304

(B)

303TGKFKVV309

(A)

β1

β2

β3

β4

β5

β6

β7

β8

β9

T303

V309

P384

E383

G385

β1

β2

β3

β4

β5

β6

β7

β8

β9

E383

P384

G385

G304

(B)

303TGKFKVV309

(A)

Outro resíduo importante em DIII consiste na posição E390 do sorotipo 2 do vírus

dengue. Esta posição não é conservada entre os sorotipos, e está exposta na superfície viral;

quando apresenta uma asparagina nesta posição parece causar maiores incidências de febre

hemorrágica por dengue (Leitmeyer et al., 1999; Modis et al., 2005). É representado por E390

(D) na figura 5.9.

Foram localizados também em nosso modelo resíduos responsáveis pela ligação do

vírus da dengue a receptores celulares. A porção de DIII promotora da ligação à célula C6/36

é mostrada na figura 5.10 – A (esferas vermelhas), sendo representada por 10 resíduos de

aminoácidos localizados numa alça lateral de DIII den-2; são eles: E380 (I), E381 (G), E382

(V), E383 (E), E384 (P), E385 (G), E386 (Q), E387 (L), E388 (K) e E389 (L) (Hung et al.,

2004). Outro domínio de ligação do DIII den-2 proposto por esses autores foi relacionado à

ligação a receptores celulares do tipo heparan sulfato (HS), contendo os seguintes resíduos,

todos lisinas: E295 (K), E305 (K), E307 (K), E310 (K), E393 (K) e E394 (K) (Figura 5.10 –

B, esferas verdes).

β1

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β9

D390

β1

β2

β3

β4

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β7

β8

β9

D390

Figura 5.9 - Modelo do DIII den-2 evidenciando o

resíduo D390 (esfera violeta). N-term (N), C-term (C) e a

face voltada para superfície (S).

Figura 5.10 - Modelo do DIII den-2: domínio de ligação a receptores celulares. (A) Ligação a

células de inseto C6/36 (esferas vermelhas), correspondente aos resíduos 380 a 389. (B) Os seis

resíduos de lisina conservados em todos os quatro sorotipos de dengue que podem estar relacionados à

ligação a receptores do tipo heparan sulfato (esferas verdes). N-term (N), C-term (C) e a face voltada

para superfície (S).

Foi realizada uma avaliação quanto à carga eletrostática da superfície de DIII den-2

(Figura 5.10). A porção do modelo de DIII voltada para o interior do dímero da proteína E é

caracterizada por uma distribuição pouco uniforme de cargas e algumas regiões com acúmulo

de cargas positivas; enquanto que essa mesma porção, em visão apical, mostrou uma maior

concentração de cargas negativas e neutras (Figura 5.11 – A, B, C e D). Observando o modelo

em sua porção final (C-term), pode-se detectar um predomínio de cargas negativas localizadas

na região não exposta na superfície viral, e a visão apical desta porção também apresentou em

sua maioria cargas negativas e neutras (Figura 5.11 - E, F, G e H).

β1

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I380

L389

β1

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β7

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β9

K295

K394

K393

K305

K307

K310

380IGVEPGQLKL389

(A) (B)

β1

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β5

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β9

I380

L389

β1

β2

β3

β4

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β6

β7

β8

β9

K295

K394

K393

K305

K307

K310

380IGVEPGQLKL389

(A) (B)

Figura 5.11 - Mapa da superfície eletrostática do DIII den-2. (A) Modelo em vista a partir da face voltada para o interior do dímero da proteína E, em

contato com o domínio I. (B) Superfície eletrostática de A. (C) Modelo em vista apical de A. (D) Superfície eletrostática de C. (E) Modelo em vista da face

voltada para a superfície lateral do dímero da proteína E. (F) Superfície eletrostática de E. (G) Modelo em vista apical de E. (H) Superfície eletrostática de G.

Azul indica cargas positivas, vermelho cargas negativas e branco, cargas neutras. N-term (N), C-term (C) e a face voltada para superfície (S).

5.2 Estratégia para Construção de Vírus FA 17D Recombinantes, Expressando

Domínio III de Dengue-2 na Região Intergênica E/NS1

A estratégia de clonagem do DIII den-2 na região intergênica E/NS1 do genoma do

vírus FA 17D foi desenhada de acordo com o descrito por Bonaldo e colaboradores (2007).

O cassete de expressão de DIII den-2 foi formado, no sentido 5´ para 3´ da fita codante:

pela porção N-terminal da proteína NS1 (27 nucleotídeos), por 309 nucleotídeos do gene DIII

e pela região gênica da haste e âncora (HA), que corresponde ao C-terminal da proteína E do

vírus den-4, obtido a partir do clone infeccioso completo do vírus quimérico Den4/FA (Figura

5.3 - C). No entanto, esta porção HA não foi empregada na sua versão completa, mas sim

truncada, com ausência dos elementos H1 e CS, constituintes da porção haste. Além destas

porções, após as amplificações por PCR e PCR de fusão, o cassete de expressão clonado no

vetor de expressão PCR-Blunt II-TOPO continha, em sua extremidade 5’, os 15 últimos

nucleotídeos da proteína E e, no extremo 3’ do cassete, a repetição dos 27 nucleotídeos da

porção N-terminal do gene NS1 (Figura 4.1). Esta estratégia foi adotada a fim de permitir que

o sítio Nar I flanqueasse o cassete de expressão, possibilitando sua inserção na região

intergênica E/NS1 do genoma de FA, uma vez que esta região também apresenta o sítio para

esta enzima de restrição.

A figura 5.12 mostra um esquema representativo da topologia de membrana da região

intergênica E/NS1 do vírus FA 17D onde foi realizada a clonagem do cassete de expressão, a

disposição e constituição deste na membrana do retículo endoplasmático.

(A)

(B)

Retículo endoplasmático

Sítio de clivagem da signalasecelular

Retículo endoplasmático

citoplasma

HA den-4

Figura 5.12 - Regiões da proteína E e NS1 do vírus Febre Amarela 17D usadas na montagem do

cassete de expressão do domínio III da proteína E dos vírus dengue 2. (A) é mostrada a topologia

da membrana do RE na região da poliproteína precursora onde foi inserido o cassete de expressão

(E/NS1), as possíveis clivagens proteolíticas realizadas pela peptidase sinal do RE (setas azuis) e todos

os elementos constituintes da região HA da proteína E. (B) é ilustrada a mesma região descrita acima

contendo o cassete de expressão DIII den-2 HA truncada den-4 (Fonte: Laboratório de Biologia

Molecular de Flavivírus – Fiocruz).

5.3 Obtenção do Molde de cDNA Genômico Contendo o Cassete de Expressão do DIII

den-2

Em uma primeira tentativa de obtenção do fragmento do domínio III do gene E do

vírus den-2, utilizou-se o RNA viral purificado do genótipo den-2 BR64022/98 para o

procedimento de RT-PCR, porém, não ocorria amplificação. Foram feitas algumas tentativas

nesse sentido, como a variação do método de extração de RNA empregado, a variação da

temperatura de ciclagem, entre outras. No entanto, estas não foram capazes de levar à síntese

do cassete de expressão.

Em vista dessas dificuldades para amplificação do domínio III de dengue-2 a partir de

preparações de RNA viral, foi utilizado o plasmídeo do clone infeccioso completo do vírus

quimérico YF 17D/DEN2 P/S, (Caufour et al., 2001). Esta quimera é composta pela proteína

C do capsídeo do vírus Febre Amarela 17D, por todos os genes não-estruturais de FA 17D e

pelas proteínas estruturais prM/M e E do vírus dengue-2 Nova Guinea C (NGC). Assim, foi

possível obter uma banda de 366 pb compatível com o tamanho esperado do produto de PCR

(Figura 5.13 – A, canal 1).

Para a amplificação do segundo produto de PCR correspondente à região HA truncada

do gene E, foi empregado o plasmídeo que abrange o clone infeccioso completo do vírus

quimérico Den4/FA (R. Galler, em preparação). A partir da reação de PCR, foi obtido um

produto com 250 pb que abrangia em sua seqüência: a porção N-terminal da NS1, a região C-

terminal do DIII den-2, a região da HA truncada de den-4, a seqüência correspondente ao sítio

Nar I, a região N-terminal da proteína não-estrutural NS1, a porção C-terminal da HA de den-

4 (Figura 5.13 – A, canal 2).

O cassete de expressão foi construído a partir da fusão desses dois fragmentos de PCR,

utilizando-se do pareamento dos oligonucleotídeos empregados para amplificação das pontas

dos dois fragmentos e pelo pareamento interno dos dois fragmentos na região complementar.

(Figura 4.1). Dessa forma, o cassete de expressão foi formado no sentido 5’  3’: a região 3’

do gene da proteína E de FA, o sítio de restrição para a enzima Nar I, os 27 primeiros

nucleotídeos do gene da proteína NS1, o DIII den-2, o sítio de restrição para a enzima Nar I, a

região HA truncada do gene da proteína E (sem os domínios H1 e CS) e os 27 primeiros

nucleotídeos do gene da proteína NS1, resultando em um produto final de PCR de 573 pares

de bases (Figura 5.13 – A, canal 3).

Este cassete de expressão foi clonado no vetor de expressão PCR-Blunt II-TOPO que

possui 3.519 pb (Figura 4.2). Após a clonagem e transformação dos produtos de ligação na

cepa DH5 de Escherichia coli, foram obtidas 56 colônias e 6 destas foram analisadas quanto

à presença de DNA plasmidial recombinante, cujo tamanho esperado seria de 4.092 pb

(Figuras 5.13 – B, canal 2 e 5.14). A análise consistiu na digestão destas amostras de DNA

plasmidial com a enzima de restrição Eco RI, uma vez que o cassete era ladeado por dois

sítios para esta enzima. Todas as preparações se mostraram positivas para o cassete de

expressão, detectado, após eletroforese em gel de agarose, como um fragmento de cerca de

590 pb (Figuras 4.2 e 5.13 – B, canal 3).

Entretanto, 5 dessas 6 amostras de DNA plasmidial apresentaram o cassete de

expressão íntegro confirmado por meio de seqüenciamento nucleotídico automático, e uma

destas foi escolhida para dar prosseguimento às etapas posteriores.

2,0

1,2

0,8

0,4

0,2

PM (kb)

2,0

1,2

0,8

0,4

0,2

PM (kb)

23,1

9,4

6,5

4,3

2,3

(B)

(A)

Figura 5.13 - Obtenção do cassete de expressão DIII den-2 HA truncada den-4. (A) Análise

eletroforética em gel de agarose 0,8% dos produtos de PCR correspondentes à amplificação: da

seqüência do DIII den-2 (canal 1); da região truncada da seqüência HA den-4 (canal 2); do cassete de

expressão DIII den-2 HA truncada den-4 (canal 3). (B) Análise eletroforética em gel de agarose 0,8%

do clone recombinante para o cassete de expressão DIII: controle do plasmídeo PCR-Blunt II-TOPO

não recombinante (canal 1); DNA plasmidial do plasmídeo PCR-Blunt II-TOPO recombinante

contendo o cassete de expressão (canal 2); DNA plasmidial recombinante digerido com a enzima Eco

RI (canal 3). Nos canais M

e M

, são indicados os pesos moleculares dos padrões DNA/Hind III e

“Low DNA Mass”, respectivamente.

PCR-BluntII TOPO

DIII den-2

(4092 pb)

Figura 5.14 - Mapa do plasmídeo PCR-Blunt II TOPO recombinante, contendo o cassete de

expressão do domínio III de dengue-2. Estão indicados os sítios de restrição das endonucleases Eco

RI e Nar I, a origem de replicação do plasmídeo (PUC ori), o gene de resistência para canamicina e o

promotor para SP6 da RNA polimerase (“Gene Construction Kit” - GCK; Textco, Inc., versão 2.5).

Uma vez obtido o plasmídeo PCR-Blunt II-TOPO /DIII den-2 HA truncada den-4, a

próxima etapa consistia na sub-clonagem do cassete no cDNA genômico viral. A metodologia

empregada foi semelhante à da tecnologia do clone infeccioso que emprega o uso de dois

plasmídeos, descrita por Rice e colaboradores (1989). Neste projeto, foram empregados os

plasmídeos bacterianos pT3 (Figura 4.4) e pG1.2 (Figura 4.5). O primeiro plasmídeo, pT3, é

derivado do plasmídeo pYFM 5.2 (Rice et al., 1989) e contém a região central do genoma do

vírus FA 17D: do nucleotídeo 1.372 ao 8.704. Já o pG1.2 é derivado do plasmídeo pYF5’3’IV

(Rice et al., 1989) e contém as extremidades do genoma viral de FA 17D - porções 5’ e 3’ -

nucleotídeos de 1 a 2.271 e de 8.274 a 10.862, respectivamente.

Primeiramente, o plasmídeo recombinante PCR-Blunt II-TOPO foi clivado com a

endonuclease Nar I. Em vista de o cassete de expressão possuir dois sítios de corte para a

enzima Nar I, ladeando as suas extremidades, e de o vetor PCR-Blunt II-TOPO também ter

dois sítios de corte para essa enzima nas posições 1.116 e 1.364 (Figura 5.14), ocorreu a

geração de 4 bandas distintas na análise por eletroforese em gel de agarose (Figura 5.15 - A).

Aquela que correspondia ao cassete de expressão apresentou 534 pb, a terceira banda

visualizada, a qual foi extraída do gel de agarose após eletroforese (Figura 5.15 - A e B). O

plasmídeo pT3 também foi digerido com a enzima Nar I (Figura 5.15 – C, canal 1) e para a

realização desta subclonagem, utilizaram-se duas diferentes relações molares, as proporções

5:1 e 10:1 (inserto:vetor) para clonagem do cassete de expressão no plasmídeo pT3 no sítio

Nar I, localizado na região intergênica E/NS1 (Figura 4.3). A transformação destas

preparações em E. coli SURE geraram aproximadamente 580 colônias na ligação 5:1 e 110

colônias na ligação 10:1 (Figura 5.15 - D).

A confirmação da clonagem do cassete, uma vez que a inserção exógena não altera o

tamanho do plasmídeo de forma significativa, foi feita pela clivagem do DNA plasmidial de

10 clones, provenientes de cada ligação, com a enzima Pst I (Figura 5.15 - E). Nesta etapa de

digestão poderia ter sido empregada a enzima Nar I que, após digestão e visualização dos

fragmentos em análise eletroforética, evidenciaria o próprio cassete de expressão clonado,

caso o plasmídeo fosse recombinante. Porém, devido à pouca disponibilidade, neste

momento, desta enzima em nosso laboratório foi empregada a Pst I, cujos sítios de restrição

no pT3 tem posições 597, 1.420 e 8.066 (Figura 4.3). Esta enzima é responsável por gerar

fragmentos de 823, 2.470 e 6.646 pares de base em clones não recombinantes (Figura 5.15 E,

canais 7, 8 e 9) e fragmentos de 1.357, 2.479 e 6.646 pares de base em clones recombinantes

(Figura 5.15 - E canais 2, 4, 6 e 11). Após visualização dos fragmentos de digestão por

eletroforese em gel de agarose, 2 colônias das 10 analisadas da proporção 5:1 eram

recombinantes, enquanto que da proporção 10:1, 5 colônias mostraram-se recombinantes para

o cassete de expressão.

Devido ao fato desta clonagem não ser direcional, dentre os clones bacterianos que

tiveram os perfis eletroforéticos avaliados e apresentaram tamanho condizente com o

esperado após o seqüenciamento nucleotídico, 1 clone da ligação “5:1” mostrou o cassete de

expressão clonado no sentido inverso, sendo que o outro clone desta mesma proporção e

todos os outros 5 da proporção 10:1 apresentaram deleções em sua seqüência. Por causa

desses fatores, mais 10 colônias de cada ligação foram analisadas e seqüenciadas até a

obtenção de um clone que mostrasse a construção íntegra e em fase correta de leitura. Após a

visualização da digestão com Pst I por análise eletroforética em gel de agarose, nenhum clone

da proporção 5:1 mostrou-se ser recombinante, mas 5 da proporção 10:1 apresentaram o perfil

de restrição compatível com o esperado. Esses 5 clones foram seqüenciados e 2 deles estavam

com a seqüência íntegra do cassete de expressão, enquanto os outros 3 apresentaram deleções,

mutações e a clonagem do cassete no sentido invertido.

Os dois clones de pT3 recombinantes foram escolhidos para a obtenção dos moldes de

cDNA viral, a serem montados juntamente com o plasmídeo pG1.2. Estes plasmídeos

contendo o cDNA genômico do vírus FA 17D foram clivados com as enzimas de restrição

Nsi I e Sal I (Figura 5.16 - A e B), produzindo bandas de 1.759 e 5.146 pb para pG1.2 e 8.298

pb e 2.175 pb para o recombinante de pT3. Os fragmentos de pT3 foram ligados aos de pG1.2

(Figura 5.16 - C) e submetidos à digestão com a endonuclease Xho I para a linearização do

molde de cDNA, definindo a extremidade 3´ do cDNA genômico viral (Figura 5.16 - D).

Foram gerados fragmentos que correspondem ao molde de cDNA viral recombinante

completo, além de outros fragmentos menores que correspondem a produtos de ligação

alternativos e fragmentos não ligados (Figura 5.16 - D).

2,0

1,2

0,8

0,4

0,2

PM (kb)

23,1

6,5

4,3

2,3

9,4

2,0

1,2

0,8

0,4

0,2

PM (kb)

(A) (B)

(C)

PM (kb)

23,1

6,5

4,3

2,3

9,4

2,0

PM (kb)

23,1

6,5

4,3

2,3

9,4

2,0

(D) (E)

Figura 5.15 - Sub clonagem do cassete de expressão no vetor pT3 e transformação em E. coli SURE.

Análise eletroforética em gel de agarose 0,8%. (A) Digestão com a enzima Nar I do vetor PCR-Blunt II-

TOPO recombinante para o cassete de expressão do domínio III den-2 (canal 1). A seta indica a banda de

interesse extraída do gel. (B) Cassete de expressão do domínio III den-2 proveniente do plasmídeo PCR-

Blunt II-TOPO digerido com a enzima de restrição Nar I, e purificado a partir de gel de agarose (canais 1 e

2). (C): Vetor pT3 digerido com a enzima de restrição Nar I (canal 1) e o vetor controle pT3 não digerido

(canal 2). (D): Preparações plasmidiais em pequena escala do vetor pT3 em bactérias E. coli SURE

transformadas com a reação de ligação entre o cassete de expressão do domínio III den-2 e o vetor pT3

(canais 2 a 11). O canal 1 representa o vetor pT3 não recombinante. (E) Preparações plasmidiais em

pequena escala do vetor pT3 digeridas com a enzima Pst I (canais 2 a 11). O canal 1 exibe o vetor pT3

recombinante não digerido. Nos canais M

e M

são indicados os pesos moleculares dos padrões

DNA/Hind III e “Low DNA Mass”, respectivamente.

PM (kb)

23,1

6,5

4,3

2,3

9,4

2,0

(B)

PM (kb)

23,1

6,5

4,3

2,3

9,4

2,0

(A)

PM (kb)

6,5

4,3

2,3

(C)

23,1

9,4

2,0

PM (kb)

23,1

6,5

4,3

2,3

(D)

9,4

2,0

Figura 5.16 - Obtenção do molde de cDNA do vírus FA 17DD DIII den-2 HA truncada den-4.

Análise eletroforética em gel de agarose 0,8%. (A) Digestão do plasmídeo G1.2 com Nsi I e Sal I: No

canal 1, o plasmídeo G1.2 íntegro e no canal 2: o plasmídeo G1.2 digerido com Nsi I e Sal I. (B)

Digestão do plasmídeo pT3 com Nsi I e Sal I: No canal 1, o plasmídeo pT3 íntegro e no canal 2, o

plasmídeo pT3 recombinante digerido com Nsi I e Sal I. (C) Reação de ligação utilizando a enzima T4

DNA ligase. No canal 1, o pT3 digerido com Nsi I e Sal I; no canal 2, a reação de ligação entre os

plasmídeos G1.2 e pT3 não recombinante – controle positivo da reação, e no canal 3, a reação de

ligação dos plasmídeos G1.2 e pT3 recombinante. (D) Moldes de cDNA digeridos com a enzima de

restrição Xho I. No canal 1, molde de cDNA do vírus FA 17D/G1.2-T3 e no canal 2, molde de cDNA

do vírus FA 17D/DIII den-2. A seta indica o fragmento que corresponde ao molde de cDNA. Nos

canais M, são indicados os pesos moleculares do padrão DNA/Hind III.

Os moldes de cDNA linearizados foram submetidos à reação de transcrição in vitro

para a geração do RNA infeccioso do vírus FA 17D/DIII den-2, uma vez que na extremidade

5´do cDNA viral existe o promotor da RNA polimerase do fago SP6, que permite que o

molde seja transcrito in vitro na presença desta polimerase. O RNA foi visualizado por

eletroforese em gel de agarose, em condições não desnaturantes (Figura 5.17). As bandas de

tamanho inferior e em menor quantidade correspondem à transcrição de moldes de cDNA

viral incompletos que são formados juntamente com o íntegro.

23,1

6,5

4,3

2,3

PM (kb)

9,4

2,0

Figura 5.17 - Transcrição in vitro dos moldes de cDNA do vírus

FA 17DD DIII den-2 HA truncada den-4. Análise eletroforética em

gel de agarose 1,0%. No canal 1, RNA do vírus FA17D/G1.2-T3 e no

canal 2, RNA do vírus FA17D/DIII den-2. No canal M, são indicados

os pesos moleculares do padrão DNA/Hind III.

A figura 5.18 esquematiza todos os passos para a clonagem molecular de DIII den-2

no genoma do vírus FA 17D e a construção do molde de cDNA viral recombinante.

PCR-BluntII TOPO

DIII den-2

(4092 pb)

Genoma central FA (9428 - 1373)

pT3

(9939 bp)

pT3/DIII den-2

(10473 pb)

Genoma central FA (1373 - 10473)

Digestão Nar I

Digestão Nsi I e Sal I

Digestão Xho I

cDNA viral completo FA recombinante linearizado

Xho I

Sal I

SP6

Nsi I

3’ genoma FA

Genoma central FA

Cassete de

expressão

5’ genoma FA

Ori

G1.2

Genoma

Central FA

Amp R

G1.2

pG1.2

(6905 pb)

Extremidade 3’ genoma FA

(8215 - 10862)

Extremidade 5’ genoma

FA (1 - 2271)

Figura 5.18 - Clonagem e Sub-clonagem para obtenção do molde de cDNA completo viral recombinante.

5.4 Obtenção dos Vírus FA Recombinantes Expressando DIII den-2

Após a transfecção dos RNAs infecciosos do vírus recombinante em monocamadas de

células Vero, não foi possível observar efeito citopático (CPE) passados 5 dias deste

procedimento, apesar de a cultura infectada com o vírus controle FA17D/G1.2-T3 ter

apresentado CPE intensa até este tempo de incubação. A detecção do vírus recombinante por

CPE foi somente possível após submeter as monocamadas de células Vero infectadas, com o

vírus FA 17D/DIII den-2, ao tratamento com tripsina e cultivá-las em meio novo por três dias.

O sobrenadante desta cultura foi coletado e devidamente identificado como 1P, ou seja,

sobrenadante de 1ª passagem celular – pós-transfecção − pois esta foi a primeira vez que

houve propagação viral em um sistema celular.

O RNA viral obtido dos sobrenadantes de transfecção (1P) do vírus recombinante FA

17D DIII den-2 e do controle FA17D/G1.2-T3 foi submetido a RT-PCR na presença de

oligonucleotídeos específicos que flanqueavam a região de inserção do cassete (RG 19 e RG

174 – Tabela 4.5). A análise dos produtos desta reação revelou fragmentos de 1 kb para o

vírus controle FA17D/G1.2-T3, e fragmentos de 1.543 pb para o vírus recombinante FA 17D

DIII den-2, condizentes com os perfis esperados (Figura 5.20, canais 1 e 2). No entanto, o

seqüenciamento nucleotídico dos fragmentos de RT-PCR purificados do vírus recombinante

revelou uma mutação na região da HA truncada de den-4, na posição 526 do cassete de

expressão (GTTJATT), implicando na troca do aminoácido Valina por Isoleucina, na

posição 176 do cassete de expressão (Figura 5.19 - B). Nesta análise, foi possível detectar

uma mistura de populações virais, onde os dois códons estavam presentes. Isto pode ser

observado pela sobreposição dos picos do seqüenciamento nesta posição, indicados por seta

no cromatograma B da figura 5.19.

Mutações nesta região da TM2 não são detectadas entre Flavivírus, pois este motivo é

muito conservado no terminal carboxi da proteína E, uma vez que representa o sítio de

clivagem da enzima peptidase sinal do hospedeiro. Por este motivo, foi preparado um novo

molde de cDNA viral recombinante. Após transfecção do RNA viral sintetizado in vitro, mais

uma vez, não foi possível detectar CPE no intervalo de cinco dias pós-transfecção na cultura

transfectada com o vírus recombinante; apesar da condição controle, monocamada infectada

pelo vírus FA17D/G1.2-T3, ter apresentado um forte CPE neste tempo. Novamente, foi

realizada a tripsinização da monocamada de células Vero transfectadas com o vírus

recombinante e o CPE foi então detectado quatro dias após este procedimento. Após a

confirmação da inserção por meio de RT-PCR (Figura 5.20, canal 4) e seqüenciamento

nucleotídico da região correspondente à inserção heteróloga desta nova transfecção, não foi

observada nenhuma mutação, mantendo-se íntegra toda a região do inserto. Sendo assim,

foram obtidos dois vírus FA recombinantes para o cassete DIII den-2, denominados de FA

17D/DIII den-2 IGA (com mutação) e FA 17D/DIII den-2 VGA (sem mutação).

(A)

(B)

Figura 5.19 - Cromatogramas dos vírus recombinantes FA 17D/DIII den-2 VGA – sem

mutação (A) e FA 17D/DIII den-2 IGA – mutado (B). As setas indicam a posição 535 do cassete

de expressão onde houve mutação no códon GTT (A) para ATT (B), resultando na substituição do

aminoácido valina (A) por isoleucina (B).

5.5 Produção e Titulação de Estoques Virais

Foram preparados os estoques dos dois vírus recombinantes, a partir dos sobrenadantes de

transfecção (1P), a fim de se ter amostras homogêneas e em quantidade suficiente para todo o

processo de caracterização dos vírus FA recombinantes e também foram preparados estoques

dos vírus controles FA 17DD e do FA 17D G1.2/T3. Os títulos dos estoques virais

encontram-se listados na tabela 5.3.

Tabela 5. 3 - Títulos dos vírus FA 17D controles e recombinantes

Vírus

Título

(pfu/mL)

Título

(log10 pfu/mL)

FA17DD 3,21 x 10

7,51

FA 17D G1.2/T3 4,49 x 10

7,65

FA17D DIII den-2 IGA 1,90 x 10

6,28

FA17D DIII den-2 VGA 6,00 x 10

5,78

Para a confirmação da presença e integridade do cassete de expressão, amostras de

RNA dos estoques virais dos vírus recombinantes, FA 17D/DIII den-2 IGA e FA 17D/DIII

den-2 VGA, foram submetidas a RT-PCR (Figura 5.20, canais 3 e 5).

O vírus FA 17D/DIII den-2 IGA em sua primeira passagem celular (1P) mostrou um

perfil de amplificação homogêneo, exibindo uma banda de peso molecular compatível com o

esperado de 1.534 pb, equivalente à presença do cassete de expressão (Figura 5.20, canal 2).

Na passagem referente ao estoque viral, 2P, além do fragmento em torno de 1.500 pb,

também foi detectado um fragmento secundário de aproximadamente 1.200 pb, o qual poderia

estar indicando deleções parciais no cassete (Figura 5.20, canal 3). Porém, de acordo com

seqüenciamento nucleotídico, o cassete de expressão era inteiramente detectado, assim como

a mutação no códon GTT (V) J ATT (I), já detectada na 1P, evidenciando a mistura destes

códons nesta região genômica na população viral.

O vírus FA 17D/DIII den-2 VGA, também mostrou a banda de peso molecular

compatível com o esperado de cerca de 1.543 pb, para a presença do cassete de expressão, na

1P. Na 2P, esta banda, que confirma o cassete DIII den-2 clonado, foi visualizada, além de

uma segunda, mais fraca, de aproximadamente 1 kb (Figura 5.20, canal 5), tamanho

compatível com a banda visualizada no controle FA 17D/G1.2-T3, mostrando indícios de

perda do cassete de expressão. Após seqüenciamento nucleotídico, foi possível detectar o

cassete de expressão completo, sem nenhuma mutação pontual.

2,0

1,2

0,8

0,4

0,2

PM (kb)

Figura 5.20 - RT-PCR dos sobrenadantes de transfecção e infecção dos vírus recombinantes FA

17D/DIII den-2 IGA (mutado) e FA 17D/DIII den-2 VGA (sem mutação): No canal 1, estoque

viral – 2P – do vírus parental FA 17D/G1.2-T3. No canal 2, o sobrenadante de transfecção – 1P – do

vírus recombinante FA 17D/DIII den-2 IGA. No canal 3, estoque viral – 2P – do vírus recombinante

FA 17D/DIII den-2 IGA. No canal 4, o sobrenadante de transfecção – 1P – do vírus recombinante FA

17D/DIII den-2 VGA. No canal 5, estoque viral – 2P – do vírus recombinante FA 17D/DIII den-2

VGA. No canal M são indicados os pesos moleculares do padrão “Low DNA Mass”.

5.6 Análise da Replicação Viral em Células Vero

A caracterização por meio da cinética de propagação teve como objetivo avaliar a

capacidade proliferativa dos vírus FA recombinantes em relação aos vírus FA controles. Após

a infecção de monocamadas de células Vero com m.o.i. de 0,02 em três experimentos

independentes, a replicação viral foi acompanhada até 144 h. A figura 5.21 mostra o gráfico

das curvas cinéticas resultantes desses três ensaios independentes para os vírus FA 17DD

(controle) e FA17D/ G1.2-T3 (parental), FA 17D/DIII den-2 VGA e FA 17D/DIII den-2 IGA

(recombinantes) em células Vero. A tabela 5.4 mostra os valores da média e desvio padrão

para cada ponto da cinética de replicação viral referentes a cada uma das construções virais.

3,50

4,00

4,50

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

7,50

8,00

8,50

24h 48h 72h 96h 120h 144h

Tempo (horas pós-infecção)

Título log10 pfu/mL

FA 17DD FA 17D/G1.2-T3 FA 17D/DIII den-2 IGA FA 17D/DIII den-2 VGA

Figura 5.21 - Cinética de replicação dos vírus recombinantes FA 17D/DIII den-2 VGA e FA

17D/DIII den-2 IGA, e dos vírus controle FA 17DD e FA 17D/G1.2-T3 em monocamadas de

células Vero. Cada ponto do gráfico representa a média dos títulos obtidos a partir de experimentos

em triplicata, com os respectivos desvios padrões.

Tabela 5.4 - Cinética de Replicação Viral em Cultura de Células Vero. Os valores apresentados

referem-se à média e desvio padrão, em log

pfu/mL. As células destacadas em negrito indicam os

picos de produção viral.

24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h

FA 17DD

4,00

± 0,18

6,44

± 0,21

7,47

± 0,41

7,50

± 0,35

7,13

± 0,20

6,94

± 0,17

FA 17D/G1.2-T3

5,01

± 0,52

7,23

± 0,19

7,34

± 0,15

7,23

± 0,08

6,73

± 0,24

6,43

± 0,65

FA 17D/DIII den-

2 IGA

4,21

± 0,26

5,96

± 0,25

5,90

± 0,36

5,65

± 0,28

5,38

± 0,35

5,72

± 0,12

FA 17D/DIII den-

2 VGA

4,16

± 0,13

5,94

± 0,05

6,15

± 0,20

6,05

± 0,06

6,30

± 0,40

6,71

± 0,40

Pode-se observar um padrão diferenciado de replicação tanto entre os vírus controle e

parental, como entre os recombinantes. Os perfis obtidos entre os vírus controles são mais

semelhantes entre si do que os dos vírus recombinantes, que são bem próximos. No entanto,

para todos os quatro vírus foi observado um rápido aumento nos títulos virais nas primeiras

24 h pós-infecção (p.i.). O vírus vacinal FA 17DD apresentou pico de replicação viral em 72 h

p.i., apresentando valores de título médio e desvio padrão de 7,47 ± 0,41 log

pfu/mL (Tabela

5.4), que se manteve até 144 h p.i., porém, entre os intervalos de 96 h e 144 h p.i., foi

encontrada diferença significativa entre as médias (P < 0,05), indicando uma diminuição do

título viral nos últimos intervalos do experimento.

O vírus parental controle FA 17D/G1.2-T3 exibiu pico de replicação em 48 h p.i.,

registrando como média e desvio padrão os valores de 7,23 ± 0,19 log

pfu/mL (Tabela 5.4);

após este intervalo de tempo, até 144 h p.i., não foi detectada diferença significativa entre os

títulos virais (P > 0,05).

Já o recombinante FA 17D/DIII den-2 IGA mostrou pico de replicação em 48 h p.i. e

valores de título médio e desvio padrão de 5,96 ± 0,25 log

pfu/mL (Tabela 5.4). A partir de

72 h p.i., os valores de título atingem um platô, não havendo diferença significativa entre eles

(P > 0,05).

O vírus FA 17D/DIII den-2 VGA foi o mais divergente entre os vírus em questão. Num

primeiro momento, este vírus mostrou pico de replicação em 48 h p.i., com valores de título

médio e desvio padrão de 5,94 ± 0,05 log

pfu/mL (Tabela 5.4), apresentando um padrão

bastante próximo ao do vírus recombinante FA 17D/DIII den-2 IGA. Entretanto, entre 48 h e

96 h p.i foi detectada uma queda nos títulos virais e novo incremento replicativo em 144 h p.i.

(P > 0,05), atingindo valores de título médio e desvio padrão de 6,71 ± 0,40 log

pfu/mL.

Foi realizada outra análise a fim de identificar possíveis diferenças significativas entre

os vírus controles e recombinantes em cada intervalo de tempo. Foram observadas diferenças

significativas entre a capacidade replicativa do vírus parental FA 17D/G1.2-T3, mais

acentuado em relação ao vírus vacinal FA 17DD, em 24 h e 48 h p.i. (P < 0,05 e P < 0,001,

respectivamente). Não foram vistas outras diferenças ao longo da cinética, indicando que

ambos os controles se assemelham em seus padrões replicativos passadas 48 h da infecção.

Entre o vírus vacinal e os dois recombinantes, foram identificadas diferenças em 72 h

e 96 h p.i. (P < 0,01 e P < 0,001, respectivamente), indicando uma menor taxa replicativa dos

recombinantes quando comparados ao vírus vacinal. Decorridas 120 h da infecção, foi

detectada diferença entre as replicações de FA 17DD e o recombinante FA 17D/DIII den-2

IGA (P < 0,01), não sendo observada esta mesma diferença em relação ao recombinante FA

17D/DIII den-2 VGA, uma vez que este apresenta títulos virais maiores a partir de 96 h p.i.,

aproximando-se da curva exibida pelo controle vacinal.

Comparando-se o vírus parental FA 17D/G1.2-T3 com os recombinantes, foram

observadas diferenças em 48 h p.i. que se perpetuaram até 96 h p.i. (P < 0,01), indicando

novamente uma menor taxa replicativa dos recombinantes quando comparados ao controle

parental. Em 120 h p.i., a diferença detectada foi somente entre o parental e o recombinante

FA 17D/DIII den-2 IGA (P < 0,01), novamente não sendo identificada no outro vírus

recombinante devido ao seu diferenciado padrão replicativo. Também no ponto de 120 h p.i.,

foi encontrada diferença significativa na taxa replicativa de ambos os recombinantes (P <

0,05) e, dentro do intervalo de tempo de 144 h p.i., nenhuma diferença estatística significativa

foi observada para qualquer vírus.

Uma vez que o vírus controle FA 17D apresentou pico de expressão em 72 h p.i.; os

vírus FA 17D/G1.2-T3 e FA 17D/DIII den-2 IGA exibiram seus picos em 48 h p.i., sem que

fossem observadas diferenças significativas para os demais intervalos de tempo e, o FA

17D/DIII den-2 VGA, de perfil mais diferenciado entre os demais, exibindo dois diferentes

aumentos nos títulos virais, sendo que o primeiro registrado foi em 48 h p.i., foi determinado

que o tempo necessário para que todos estes vírus atingissem seu máximo de replicação viral

era de 72 h p.i., uma vez que neste intervalo todos os vírus encontravam-se num platô. Este

intervalo de tempo foi seguido para todas as demais etapas de caracterização dos vírus

recombinantes.

A fim de tentar explicar se as diferenças no padrão replicativo exibido pelos vírus em

questão se refletiam na velocidade de indução e intensidade de CPE observada, foi realizada

microscopia de contraste de fase na tentativa de comparar o efeito citopático entre os vírus

controle, parental e recombinantes. O vírus parental FA 17D/G1.2-T3, quando comparado ao

vacinal FA 17DD, exibe maior nível de CPE em todos os tempos analisados (Figura 5.22),

assim como a visualização dos focos iniciais de CPE parecem ser mais precoces, em 72 h

quando comparado ao vírus vacinal FA 17DD, em 96 h p.i.. A evolução de CPE para os vírus

recombinantes foi semelhante à observada para o vírus parental FA 17D/G1.2-T3 (Figura

5.22).

144h p.i.

24h p.i.

48h p.i.

72h p.i. 96h p.i. 120h p.i.

Mock

FA 17DD

FA17D/

G1.2-T3

FA17D/

DIII den-2

VGA

FA17D/

DIII den-2

IGA

Figura 5.22 - Fotomicrografias da cinética de replicação viral. Monocamadas de células Vero foram infectadas com os vírus controle (FA 17DD), parental

(FA 17D/G1.2-T3) e com os vírus recombinantes FA 17D/DIII den-2 VGA e FA 17D/DIII den-2 IGA, com m.o.i 0,02. As fotos foram feitas em intervalos de

24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas pós-infecção.

5.7 Estabilidade Genética dos Vírus FA 17D Recombinantes

A estabilidade do genoma dos vírus FA recombinantes FA17D/DIII den-2 IGA e

FA17D/DIII den-2 VGA foi aferida por meio de 10 passagens seriadas realizadas em

duplicata (passagem 1 – P1 e passagem 2 – P2), em células Vero. A cada passagem, o

sobrenadante das culturas foi recolhido por volta de 72 h p.i. e submetido à titulação para que

fosse realizado o controle da m.o.i. da passagem seguinte. Os valores de m.o.i eram

controlados de modo a ficarem ao redor de 0,02 e não ultrapassarem o valor de 0,1. Como

estes valores eram obtidos dez dias após a infecção da passagem correspondente, caso fosse

observada m.o.i. acima de 0,1 a passagem era refeita com a m.o.i. corrigida (Tabelas 5.5 e

5.6). A análise da estabilidade genética, para averiguação da presença e integridade do cassete

de expressão, foi realizada com as preparações de RNA viral das passagens 2P, 5P1, 5P2,

10P1 e 10P2 submetidas a RT-PCR (Figura 5.23) e seqüenciamento nucleotídico da região

que flanqueia a inserção. A seguir, os resultados estão apresentados por vírus recombinante.

Tabela 5.5 - Estabilidade Genética do vírus recombinante FA17D/DIII den-2 VGA. Número da

passagem viral em monocamada celular, título viral e m.o.i.

Passagem

Título

(pfu/mL)

Título

(log

pfu/mL)

m.o.i

(pfu/mL)

2P 6,00 x 10

5,78 0,02

3P1 7,90 x 10

5,9 0,02

3P2 8,60 x 10

5,93 0,02

4P1 4,72 x 10

6,67 0,02

4P2 4,10 x 10

6,61 0,02

5P1 4,72 x 10

6,67 0,1

5P2 5,32 x 10

6,73 0,1

6P1 1,36 x 10

7,13 0,1

6P2 1,16 x 10

7,06 0,1

7P1 1,60 x 10

7,2 0,05

7P2 2,32 x 10

7,37 0,04

8P1 1,06 x 10

7,03 0,06

8P2 1,60 x 10

7,2 0,08

9P1 2,10 x 10

7,32 0,09

9P2 1,85 x 10

7,27 0,05

10P1 1,26 x 10

7,1 0,08

10P2 9,62 x 10

6,98 0,06

Tabela 5.6 - Estabilidade Genética do vírus recombinante FA17D/DIII den-2 IGA. Número da

passagem viral em monocamada celular, título viral e m.o.i.

Passagem

Título

(pfu/mL)

Título

(log

pfu/mL)

m.o.i

(pfu/mL)

2P 1,90 x 10

6,28 0,02

3P1 3,82 x 10

5,58 0,02

3P2 5,20 x 10

5,72 0,02

4P1 3,72 x 10

6,57 0,04

4P2 2,85 x 10

6,45 0,05

5P1 5,82 x 10

6,76 0,03

5P2 7,12 x 10

6,85 0,02

6P1 8,25 x 10

6,92 0,06

6P2 3,50 x 10

6,54 0,07

7P1 6,30 x 10

6,8 0,08

7P2 6,65 x 10

6,82 0,03

8P1 6,90 x 10

6,84 0,06

8P2 7,62 x 10

6,88 0,06

9P1 6,95 x 10

6,84 0,07

9P2 6,87 x 10

6,84 0,08

10P1 2,95 x 10

6,47 0,07

10P2 4,30 x 10

6,63 0,07

5.7.1 Vírus FA 17D/DIII den-2 IGA

O vírus recombinante FA 17D/DIII den-2 IGA, já na passagem 2P, exibiu uma banda

secundária após visualização dos produtos de RT-PCR, de aproximadamente 1.200 pb,

sinalizando para algum tipo de deleção no cassete de expressão. O fragmento de 1.534 pb,

referente à manutenção da inserção, era claramente visualizado como a banda de maior

intensidade (Figura 5.23 - A, canal 3). Nas passagens 5P1 e 5P2, estes dois fragmentos ainda

foram detectados, e aquele que indicava algum tipo de deleção no cassete de expressão era o

majoritário dentre os dois (Figura 5.23 - A, canais 4 e 5, respectivamente). Após

seqüenciamento nucleotídico da região que flanqueava o inserto, foi detectada deleção de 303

pb no cassete de expressão, regiões tais que correspondem à: parte do DIII den-2 (a partir do

31º aminoácido até o 103, posição 127 a 345), toda região H2 (posição 346 a 402) e parte de

TM1 (seus 9 primeiros aminoácidos posição 403 a 429).

Além disto, a mutação na posição 534 do cassete de expressão observada na 2P, não

mais foi detectada, havendo reversão para o códon GTT (Valina), tanto em 5P1, como em 5P2

(Tabela 5.7). Na passagem 10P1, foi detectada somente a banda de aproximadamente 1.200

pb, referente à deleção mencionada acima (Figura 4.23, canal 6) e, após análise dos

cromatogramas, este fato foi confirmado (Tabela 5.7). A passagem 10P2 se mostrou

heterogênea e, dos dois fragmentos visualizados, nenhum deles apresentou tamanho esperado

para a detecção do cassete de expressão. Foi observada a banda de aproximadamente 1.200 pb

e uma outra, de 1 kb, cujo perfil é compatível com a perda total da inserção heteróloga (Figura

5.23 - A canal 7 e 1, respectivamente). Esta passagem, ao ser submetida a seqüenciamento

nucleotídico, mostrou ser uma população viral mista, a qual exibe muitas sobreposições de

picos, principalmente na região correspondente ao cassete de expressão.

5.7.2 Vírus FA 17D/DIII den-2 VGA

O vírus FA 17D/DIII den-2 VGA, na passagem 2P mostrava populações mistas, uma

vez que eram detectadas dois fragmentos, o primeiro de 1.534 pb, compatível com a presença

do cassete de expressão e, o segundo, de aproximadamente 1 kb, menos expressivo, cujo

tamanho era compatível com a perda total do cassete de expressão (Figura 5.23 - B canal 3).

Com o seqüenciamento nucleotídico, foi possível detectar o cassete de expressão íntegro. Na

passagem 5P1, este mesmo padrão de fragmentos visualizado na 2P foi mantido, o que foi

confirmado por seqüenciamento nucleotídico por exibir padrão misto de perfis nos picos dos

cromatogramas,confirmando a mistura de populações mostrada pelo RT-PCR (Figura 5.23 -

B, canal 4). A passagem 5P2 também exibiu este perfil, porém, com maior intensidade do

fragmento de 1 kb, que sinalizava para a perda do cassete de expressão (Figura 5.23 - B, canal

5). Após seqüenciamento nucleotídico, somente foram detectadas seqüências que apontavam

para a perda total do cassete de expressão, fato que pode estar relacionado a esta população

ser mais expressiva quando comparada à pequena parcela que ainda possui o inserto clonado.

Nas passagens 10P1 e 10P2, o padrão observado no RT-PCR (Figura 5.23 – B, canais 6 e 7) é

confirmado por seqüenciamento nucleotídico: a banda majoritária de 1 kb, tamanho

compatível com aquela observada no controle sem inserto, tem sua seqüência definida por

cromatogramas de picos claros, mostrando ser esta uma população homogênea que perdeu a

inserção referente ao DIII den-2. A tabela 5.8 lista os eventos ocorridos durante o estudo da

estabilidade genética do vírus FA 17D/DIII den-2 VGA.

(A) (B)

2,0

1,2

0,8

0,4

0,2

PM (kb)

475

2,0

1,2

0,8

0,4

0,2

PM (kb)

475

Figura 5.23 - Estabilidade genética dos vírus FA 17D recombinantes. Produtos de RT-PCR do

RNA viral extraído de diferentes passagens seriadas dos vírus FA 17D/DIII den-2 IGA (A) e FA

17D/DIII den-2 VGA (B). Análise eletroforética em gel de agarose 0,8%. (A): o canal (1) refere-se à

amostra derivada do sobrenadante de transfecção – 1P – do vírus parental FA 17D/G1.2-T3; e o

restante, amostras dos vírus FA 17D/DIII den-2 IGA correspondente a: (2) sobrenadante de

transfecção ou 1P; (3) passagem 2P; (4) passagem 5P1; (5) passagem 5P2; (6) passagem 10P1; (7)

passagem 10P2. (B): os canais se referem às amostras de produtos de RT-PCR: (1) sobrenadante de

transfecção – 1P – do vírus parental FA 17D/G1.2-T3; (2) sobrenadante de transfecção – 1P – do vírus

recombinante FA 17D/DIII den-2 VGA; (3) passagem 2P do vírus FA 17D/DIII den-2 VGA; (4)

passagem 5P1 do vírus FA 17D/DIII den-2 VGA; (5) passagem 5P2 do vírus FA 17D/DIII den-2

VGA; (6) passagem 10P1 do vírus FA 17D/DIII den-2 VGA. No canal 7, 10P2 FA 17D/DIII den-2

VGA. Nos canais M são indicados os pesos moleculares do padrão “Low DNA Mass”.

Tabela 5.7 – Mutações observadas no vírus recombinantes FA 17D/DIII den-2 IGA. São

indicadas as passagens em monocamadas celulares 1P, 2P, 5P1, 5P2, 10P1 e 10P2 além da mutação

detectada.

Passagem/Vírus Mutação detectada

1P/ FA 17D/DIII den-2 IGA

526 GTT (V) JATT (I)

2P/ FA 17D/DIII den-2 IGA

526 GTT (V) JATT (I)

5P1/ FA 17D/DIII den-2 IGA

526 ATT (I) J GTT (V)

 posição 118 a 421

73 aa C-terminal DIII + 19 aa H2 + 9 aa do

N-terminal de TM1

5P2/ FA 17D/DIII den-2 IGA

526 ATT (I) J GTT (V)

 posição 118 a 421

73 aa C-terminal DIII + 19 aa H2 + 9 aa do

N-terminal de TM1

10P1/ FA 17D/DIII den-2 IGA

526 ATT (I) J GTT (V)

 posição 118 a 421

73 aa C-terminal DIII + 19 aa H2 + 9 aa do

N-terminal de TM1

10P2/ FA 17D/DIII den-2 IGA

526 ATT (I) J GTT (V)

 posição 118 a 421

73 aa C-terminal DIII + 19 aa H2 + 9 aa do

N-terminal de TM1

FA 17D/DIII den-2 IGA

FA 17D/DIII den-2 VGA

Tabela 5.8 – Mutações observadas no vírus recombinantes FA 17D/DIII den-2 VGA. São

indicadas as passagens em monocamadas celulares 1P, 2P, 5P1, 5P2, 10P1 e 10P2 além da mutação

detectada.

Passagem/Vírus Mutação detectada

1P/ FA 17D/DIII den-2 VGA

______

2P/ FA 17D/DIII den-2 VGA

______

5P1/ FA 17D/DIII den-2 VGA

 cassete de expressão DIII den-2/ 543 pb

População viral mista recombinante e não

recombinante

5P2/ FA 17D/DIII den-2 VGA  cassete de expressão DIII den-2/ 543 pb

10P1/ FA 17D/DIII den-2 VGA  cassete de expressão DIII den-2/ 543pb

10P2/ FA 17D/DIII den-2 VGA  cassete de expressão DIII den-2/ 543 pb

5.8 Análise da Expressão do Cassete DIII den-2 pelos Vírus Recombinantes FA 17D

por Microscopia Confocal de Fluorescência

A detecção da expressão do DIII de den-2 foi possível por meio de infecção de células

Vero com os vírus controles FA 17DD e den-2 44/2 e os recombinantes FA 17D/DIII den-2

IGA e FA 17D/DIII den-2 VGA numa m.o.i de 0,02. A marcação com anticorpo anti-E FA foi

específica às preparações infectadas com vírus controle FA 17DD e não sendo detectada com

o vírus den-2 44/2 (Figura 5.24 - A e C). Do mesmo modo, a marcação com o anticorpo anti-

DIII den-2 foi específica para den-2 44/2 e não para FA 17DD, indicando assim a

especificidade de cada um dos anticorpos empregados (Figura 5.24 - B e D). Em ambos os

vírus recombinantes foi possível detectar a expressão do DIII den-2 por meio de marcação

desta região pelo anti-DIII den-2 (Figura 5.24 - F e H ). A detecção da proteína E de FA com

o anti-E de FA pode ser visualizada também nestas células infectadas com os vírus FA

recombinantes (Figura 5.24 - E e G). Esses resultados apontam para a dupla expressão de

antígenos da proteína E de FA e do DIII den-2 nos vírus recombinantes FA 17D/DIII den-2

IGA e FA 17D/DIII den-2 VGA.

Figura 5. 24 - Detecção da expressão do DIII de den-2. Monocamadas de células Vero foram infectadas com os vírus recombinantes FA 17D/DIII den-2 IGA e

FA 17D/DIII den-2 VGA, fixadas e marcadas contra os antígenos de FA com o anticorpo monoclonal 17D 2D12 anti-E FA (Monath e Nystrom, 1984) e den-2 com

o anticorpo monoclonal 3H5 (Gentry et al., 1982; Hiramatsu et al., 1996).

6. DISCUSSÃO

Esta dissertação propõe uma aplicação da nova metodologia que explora as boas

propriedades vacinais do vírus vacinal da Febre Amarela (FA) 17D, baseada na estratégia

empregada por Bonaldo et al. (2007), que utiliza este vírus como vetor de expressão de

antígenos heterólogos. De acordo com os resultados obtidos por estes autores, foi escolhida

uma região sabidamente imunogênica, o domínio III (DIII) da proteína de envelope (E) do

vírus dengue 2 (den-2), que participa da maioria dos eventos biológicos relevantes

relacionados à patologia do vírus (Chen et al., 1996), para ser clonado e expressado na região

intergênica E/NS1 do vírus da FA 17D. Foi descrito previamente que a expressão da proteína

fluorescente EGFP (“Enhanced Green Fluorescent Protein”), nesta região, provoca a sua

retenção e acúmulo no retículo endoplasmático (RE) celular (Bonaldo et al., 2007). Ainda, a

imunização de camundongos com o vírus FA expressando EGFP induz a formação de

anticorpos específicos dirigidos a esta proteína heteróloga (Bonaldo et al., 2007). Desse

modo, a expressão do DIII den-2 pelo vírus FA 17D na região intergênica E/NS1, poderia ser

utilizada como um modelo vacinal para a avaliação da produção de anticorpos neutralizantes

específicos anti-DIII.

Seguindo este método, para a construção do cassete de expressão do DIII den-2, a este

gene, foi fusionada a seqüência codificadora da porção haste âncora (HA) da proteína E do

vírus den-4 e os nove primeiros aminoácidos que compõe a proteína NS1. Este racional de

duplicação de seqüências flanqueadoras do DIII den-2 teve como objetivo manter preservados

os motivos para corretos endereçamento e processamento da poliproteína viral que ocorrem

em associação com o RE (Chambers et al., 1990; Allison et al., 1999). Dessa forma, o virion

recombinante é uma partícula do vírus FA 17D, que ao infectar uma célula, expressa em seu

interior, muito provavelmente no RE, o DIII de den-2. A expressão do DIII den-2, ou de

qualquer outro antígeno dos sorotipos de dengue, poderia se constituir em mais uma estratégia

para a busca de vacinas contra esta doença.

Nesta dissertação, é descrita a construção e a caracterização de um vetor com potencial

utilização para o desenvolvimento de vacina atenuada e combinada contra dengue e FA. Uma

formulação tetravalente, com quatro construções do vírus FA 17D expressando o DIII de cada

sorotipo de dengue na região intergênica E/NS1, seria constituída de partículas virais com

fenótipo do vírus vacinal FA 17DD. Os quatro diferentes vírus teriam potencialmente

tropismo celular e tissular equivalentes, uma vez que seriam virions FA 17D que

expressariam, intracelularmente, os diferentes DIII do vírus da dengue. Assim, esta

100

metodologia de expressão de antígenos do vírus dengue poderia proporcionar uma replicação

homogênea de todos os vírus FA recombinantes em formulação tetravalente, e promover uma

resposta imune equilibrada a todos os sorotipos do vírus dengue, sem que houvesse risco de

uma exacerbação da resposta imune devido ao ADE.

O domínio III de Flavivírus é formado por aproximadamente 100 aminoácidos (Rey et

al., 1995). A região delimitada neste estudo como DIII den-2 abrange os resíduos 295 a 397

da proteína E de den-2. Não existe um consenso sobre os limites deste domínio nos trabalhos

científicos que estudam o DIII de den-2 ou de outros sorotipos (Chu et al., 2005; Modis et al.,

2003; Gromowski et al., 2007; Sukupolvi-Petty et al., 2007; Volk et al., 2007). Foram

considerados dois principais critérios para a escolha dos resíduos limítrofes do DIII para este

trabalho: a manutenção de resíduos de aminoácidos com caráter não hidrofóbico e resíduos

que possuíssem cadeias laterais pequenas. A escolha do primeiro critério é justificada para

não alterar a solubilidade desta porção e assim, manter a expressão do DIII den-2 na sua

forma nativa, sem que fossem perdidas características que pudessem afetar seu

reconhecimento por anticorpos neutralizantes (Bhardwaj et al., 2001, Hung et al., 2004). A

porção C-terminal do DIII que se conecta à região de haste-âncora de E foi preservada, pois

esta é rica em resíduos pequenos e bastante conservados em Flavivírus, como serina e glicina

(GSS), aminoácidos que proporcionam maior flexibilidade à cadeia polipeptídica, o que

poderia ser relevante para que houvesse uma melhor acomodação de DIII den-2 em relação

aos domínios fusionados do cassete de expressão e ainda em relação à poliproteína viral.

Para a análise da seqüência do DIII de den-2 foram realizados alinhamentos múltiplos

entre diversos genótipos de den-2. Existem cinco principais grupos de genótipos circulantes

mundialmente e um genótipo de cada grupo foi escolhido para a realização deste alinhamento:

Grupo Americano (genótipo Peru IQT2913/96), Grupo Americano/Asiático (genótipos

BR64022/98 e Jamaica 1409/83), Grupo Asiático 1 (genótipos Tailândia K008/93 e 16681),

Grupo Asiático 2 (genótipo NGC 44) e Grupo Cosmopolita (genótipo Austrália TSV01/93)

(Rico-Hesse et al.,1998; Twiddy et al., 2002; dos Santos et al., 2002 e Rodriguez-Roche et

al., 2005). Foi também escolhido o genótipo candidato a vacina S1 Vaccine por esta já ter

sido bastante estudada em nosso laboratório. A seqüência gênica mostrou um grau alto de

conservação, cerca de 84%, apontando para uma maior variabilidade nucleotídica na terceira

posição dos códons em detrimento às outras.

A proporção de resíduos de aminoácidos idênticos da proteína E entre os Flavivírus é

de cerca de 40%, identidade esta que é refletida na conservação geral da estrutura

tridimensional desta proteína (Lisova et al., 2007). O modelo do DIII den-2 obtido por

modelagem molecular por homologia, utilizado para a construção do cassete de expressão,

101

mostrou-se bastante semelhante quando comparado a este domínio da proteína E de outros

Flavivírus (Rey et al., 1995; Modis et al., 2003; Wu et al., 2003; Modis et al., 2005; Kanai et

al., 2006; Nybakken et al., 2006; Volk et al., 2007). A proteína E de dengue assemelha-se

bastante à de TBE em sua estrutura dimérica, mas a principal diferença entre elas é um bolso

hidrofóbico localizado entre os domínios I e II da proteína E de dengue. Este bolso permite

uma maior flexibilidade entre esses domínios, facilitando mudanças conformacionais durante

os processos de maturação e fusão de membranas. A acessibilidade desta bolsa a ligantes

poderia ser uma alternativa para a inibição desses dois processos (Modis et al., 2003).

Apesar da semelhança tridimensional verificada entre os modelos de DIII de

Flavivírus, cada um deles possui cargas eletrostáticas de superfície únicas, as quais

contribuem para as diferentes afinidades de ligação apresentadas a uma série de receptores e

anticorpos (Volk et al., 2007). O modelo DIII den-2 mostrou-se condizente com o proposto

por Volk et al. (2007) quanto à disposição das cargas eletrostáticas de superfície.

A proteína E dos Flavivírus possui seis pontes dissulfeto altamente conservadas que

são importantes para a manutenção da correta estrutura terciária desta proteína (Winkler et al.,

1987). Uma destas pontes localiza-se no DIII e está representada no modelo DIII den-2 pelos

resíduos Cys 302 da alça Io 1 (conexão dos domínios I e III) e Cys 333 (fita 3). Devido aos

sinais de entrada ao RE e processamento pela peptidase sinal, a proteína heteróloga seria

translocada para esta organela, local onde ocorrem modificações pós-traducionais como a

formação de tais pontes. Assim, uma das conseqüências da localização de DIII no RE seria a

formação destas ligações entre os resíduos Cys 302 e Cys 333, reforçando a conformação

terciária mais favorável de DIII.

A maioria das substituições por troca de aminoácidos observadas no alinhamento entre

os genótipos de den-2 e a seqüência escolhida para compor o cassete de expressão deste

trabalho, ocorrem em alças fora de estruturas secundárias rígidas (fitas), que são importantes

para a formação da estrutura terciária de DIII. As regiões de alças são porções naturalmente

mais variáveis quando comparadas às fitas, pois constituem pontos de maior mobilidade do

modelo.

Algumas substituições encontram-se dispersas ao longo da estrutura de DIII. Este é o

caso da que ocorre entre resíduos alifáticos na posição E308 (VI) da fita exposta 1 e das

substituições não conservadas na posição E352 (IT) na alça 3 e 4, exposta na superfície

viral, e da E390 (DNS) na superfície lateral externa do dímero. No entanto, algumas

substituições se encontram agrupadas em regiões de DIII, como nas posições E346 (HY) e

E347 (VA) localizadas na alça 4 e 5 voltada para o domínio I e não exposta na superfície

viral; e nas E335 (IVT) e E382 (VA), localizadas na fita 5 não exposta e na alça

102

exposta 8 e 9, respectivamente. Os resíduos não expostos na superfície viral parecem não

ser relevantes em termos de interação com anticorpos. Nenhuma dessas substituições

verificadas entre os genótipos den-2 localiza-se nas alças mais acessíveis à superfície viral,

sendo possível uma associação entre a conservação dessas regiões às funções relevantes da

patogênese viral, como, por exemplo, à ligação a receptores celulares ou à manutenção da

estrutura tridimensional de DIII den-2.

Parte dos resíduos variáveis localizados na superfície de DIII, detectados pelo

alinhamento dos diferentes genótipos de den-2 analisados neste trabalho, está associada a

regiões que contêm epítopos neutralizantes. O primeiro resíduo variável E308 (VI) exposto

na superfície de DIII (fita 1) é constituinte do bolso hidrofóbico presente em den-2 e faz

parte de uma região associada à ligação de uma série de anticorpos neutralizantes específicos

ao subcomplexo dengue (Sukupolvi-Petty et al., 2007). Além disto, E308 (VI) é adjacente

ao resíduo E307 (K) que já teve sua função associada à ligação a receptores celulares do tipo

heparan-sulfato (HS). Outras lisinas também foram identificadas como participantes da

ligação à HS: E295, E305, E307, E310, E393 e E394, conservadas em todos os sorotipos de

dengue (Hung et al., 2004; Gromowski e Barret, 2007; Lisova et al., 2007). Entretanto, nem

todos esses resíduos encontram-se expostos na superfície viral (Modis et al., 2004),

contribuindo diretamente na ligação a HS, mas eles poderiam contribuir para um maior aporte

de cargas positivas que se ligariam a esse receptor, altamente negativo.

O resíduo variável E335 (IVT) encontra-se exposto na superfície viral (alça 3 e

4) e está adjacente a um grupo de resíduos relacionados com o escape de neutralização por

anticorpos sorotipo específicos (Roehrig et al., 1998; Kanai et al., 2006; Sukupolvi-Petty et

al., 2007).

O resíduo E382 (VA), exposto na superfície viral (alça 8 e 9), é adjacente aos

resíduos E383 (E), E384 (P) e E385(G), sítios de ligação ao anticorpo monoclonal 3H5

(Hiramatsu et al., 1996). Outros MAbs sorotipo-específicos também reconheceram a

seqüência E383 (E) e E384 (P), confirmando a importância deste epítopo para a neutralização

de Flavivírus (Sukupolvi-Petty et al. 2007; Gromowski e Barret, 2007). Além desses resíduos

indicados como sítio de ligação ao MAb 3H5, também foi identificado o E304 (G)

(Sukupolvi-Petty et al., 2007). Todos esses, E304 (G), E383 (E), E384 (P) e E385(G) são

conservados entre os genótipos de den-2, inclusive no escolhido para construção do cassete de

expressão desta dissertação, mas bastante variáveis entre os outros sorotipos (Sukupolvi-Petty

et al., 2007). Em posições correspondentes, o motivo RGD está localizado nos vírus FA,

MVE e WNV (Hiramatsu et al., 1996).

103

Os resíduos descontínuos conservados E304 (G), E383 (E), E384 (P) e E385(G) de

den-2 se sobrepõem a uma região análoga de WNV, onde foi identificado o sítio de ligação

para o MAb E16: E306 (S), E307 (K), E330 (T) e E332 (T) (Nybakken et al., 2005;

Sukupolvi-Petty et al., 2007). Assim como em den-2, esses resíduos são inteiramente

conservados em todas as seqüências disponíveis de WNV e bastantes variáveis entre os

Flavivírus, principalmente entre os sorotipos de dengue (Nybakken et al., 2005). Foram

identificados anticorpos neutralizantes flavivírus-específicos que se localizam em regiões

análogas a estas e, por isso, propõe-se que este epítopo tenha papel dominante na

neutralização de Flavivírus (Lin e Wu, 2003, Wu et al. 2003, Volk et al., 2004).

Hung et al. (2004) identificaram uma alça lateral responsável pela ligação do vírus

dengue a células de inseto C6/36, formada pelos resíduos 380 a 389 de DIII, localizada

lateralmente na supefície externa deste domínio, ao longo da alça que conecta 8 a 9 e na fita

9. Dessa forma, substituições no resíduo E382 poderiam levar a alterações na afinidade desta

ligação.

O resíduo E390 (DNS), localizado na superfície lateral do dímero, na fita exposta

9, mostra-se não conservado entre os sorotipos de dengue, e tem seu análogo na posição

E388 de den-3, identificado como sítio mutante de escape de neutralização por anticorpos

(Modis et al., 2005). Essa variação na posição E390 já foi associada a algumas características

biológicas virais (Lobigs et al., 1990; Sánchez e Ruiz 1996; Leitmeyer et al., 1999 e Pryor et

al., 2001). Nos genótipos americanos, caracterizados por serem menos virulentos, é comum

encontrar o resíduo Ácido aspártico nesta posição, enquanto que nos genótipos asiáticos,

associados a maiores números de casos de DHF/DSS, o resíduo Asparagina é mais

freqüentemente observado (Leitmeyer et al., 1999). Além deste evento, a substituição na

posição E390 foi relacionada com uma menor taxa replicativa para os genótipos americanos,

fato consistente com a proposta de que a falta de associação deste genótipo com doença grave

está relacionada com sua menor habilidade replicativa e Asp390 pode ser determinante para

este fato (Pryor et al., 2001). Também foi demonstrado que este resíduo tem influência na

replicação do vírus em cultura de células dendríticas (Cologna e Rico-Hesse, 2003). A

substituição E390 NH em den-2 foi relacionada com maior neurovirulência em

camundongos (Sánchez e Ruiz, 1996), enquanto que E390 GR em MVE está relacionada

com um fenótipo menos neuroinvasivo (Lobigs et al., 1990). Cabe ressaltar que essa posição

faz parte do motivo RGD (Arg-Gly-Asp) de ligação a receptores celulares do tipo integrina

(Pierschbacher e Ruoslahti, 1987).

A seqüência empregada na construção do cassete foi obtida do clone infeccioso FA

17D/Den 2 P/S (Caufour et al., 2001) e este plasmídeo foi construído a partir do genótipo

104

NGC neuroadaptado por meio de passagens seriadas em cultura de cérebro de camundongo.

Originalmente, esse genótipo é membro do grupo de genótipo Asiático 2 (Rodriguez-Roche et

al., 2005), sugerindo a presença de asparagina em E390. Porém, o resíduo encontrado foi um

ácido aspártico, fato que pode estar relacionado com sucessivas passagens seriadas que trazem

como conseqüência a atenuação viral.

O resíduo E390 ainda encontra-se no meio de um dos dois sítios putativos de ligação a

glicosaminoglicanas: E386 a E411 que é formado por múltiplas regiões enriquecidas em

aminoácidos básicos, podendo ainda interferir na ligação do vírus à célula hospedeira (Chen

et al., 1997).

Foi demonstrado que o anticorpo monoclonal (MAb) 4E11, que neutraliza todos os

sorotipos de dengue, mas não outros Flavivírus, interage com resíduos 389 e 391, entre outros

do DIII den-2, vizinhos ao E390 que, caso tenha suas características alteradas dada alguma

substituição nesta posição, pode impedir interações essenciais entre o vírus e componentes

celulares (Lisova et al., 2007).

Até o momento, o mapeamento de epítopos de anticorpos neutralizantes realizados no

DIII den-2 ou de outros Flavivírus indica que estes reconhecem trechos de resíduos do topo

da crista lateral deste domínio na superfície externa (alças Io 1/2 e 3/6 e 8/8 e 9)

(Nybakken et al., 2005; Modis et al., 2005; Gromowski et al., 2007; Sukupolvi-Petty et al.,

2007). Além destes, outros resíduos também são importantes para este reconhecimento e

situam-se em regiões adjacentes, em segmentos descontínuos, reponsáveis pela formação de

epítopos conformacionais em DIII (Hiramatsu et al., 1996; Modis et al., 2005; Gromowski et

al., 2007; Sukupolvi-Petty et al., 2007).

A conservação desses resíduos nestas posições superficiais do DIII entre os genótipos

de den-2 poderia ser uma vantagem no que diz respeito à resposta imune que se desenvolveria

no mesmo nível, contra esses genótipos. No entanto, foi demonstrado que houve diferenças na

neutralização por soro humano quando dois genótipos de den-3 diferiam entre si em apenas

quatro aminoácidos na região de DIII, sendo que três destes encontravam-se expostos na

superfície (Zuleta et al., 2006). Apesar de a variação entre genótipos do mesmo sorotipo ser

mínima, ela parece ter implicações importantes e afetar o reconhecimento de anticorpos

gerados pela imunização com outro genótipo do vírus dengue do mesmo sorotipo, conforme

descrito para den-3 (Zuleta et al., 2006).

A abordagem escolhida para clonagem e expressão do DIII den-2 foi alvo de depósito

de patente em outubro de 2005 (Bonaldo MC e Galler R; Depósito 20050121605 realizado em

31/10/2005) por ser uma metodologia inovadora de expressão de antígenos heterólogos na

região entre as proteínas E e NS1 do vírus FA 17D. Este local de inserção é uma região

105

natural de transição do genoma que delimita duas porções funcionais - os genes estruturais e

os não-estruturais dos Flavivírus, fato que proporciona a inserção de cassetes protéicos

maiores que 36 aminoácidos. Nesta metodologia, o cassete de expressão de DIII den-2 foi

construído de modo a expressar no seu N-terminal os noves aminoácidos do N-terminal da

proteína NS1, visto que a região DXGC é bastante conservada entre Flavivírus, além de

flanquear o motivo de clivagem da peptidase sinal entre E/NS1 (Bonaldo et al., 2007). À

porção C-terminal do cassete de expressão foi adicionada a região de HA truncada de den-4,

com seus elementos H2, TM1 e TM2. A região do elemento haste H2 tem sua função de

formar uma -hélice contínua com o elemento transmembranar TM1, que por sua vez é

responsável pelo ancoramento da proteína E na membrana do RE; já TM2, é responsável pela

estabilização da proteína heteróloga, além de conter a seqüência sinal para NS1 e o sítio de

clivagem da peptidase sinal (Allison et al., 1999, Zhang et al., 2003; Op De Beeck et al.,

2003).

Bonaldo et al. (2007) reportaram a geração de vírus viáveis que expressavam a proteína

EGFP fusionada à HA completa de FA, na região intergênica E/NS1. No entanto, apesar de

gerar vírus viável, foram identificados sinais de pareamentos inespecíficos após as análises de

estabilidade genética viral, levando à perda da inserção heteróloga. Este fato foi atribuído à

região repetitiva da HA de FA flanqueando o gene da EGFP, a qual apresenta identidade

seqüencial nucleotídica máxima com a região de HA da plataforma viral FA. Neste trabalho, a

fim de tentar aprimorar a plataforma de expressão, o cassete de inserção heteróloga contendo

o DIII den-2 apresentou uma modificação quanto à escolha da porção HA, optando-se pela

versão HA do vírus den-4. Esta substituição justifica-se pelo fato do vírus quimérico FA

17D/DEN4/Esa/6, que possuía duas HA, a de FA e a de den-4, ter se mostrado estável até a

20ª passagem seriada em monocamadas celulares, indicando que a redução da identidade

seqüencial destas regiões homólogas leva ao aumento da estabilidade do cassete de expressão,

apesar de esta quimera ter apresentado taxa de proliferação mais lenta e inferior aos controles

(Bonaldo et al., 2007).

Na construção do cassete de expressão DIII den-2, a HA den-4 foi empregada na sua

versão truncada, sem os elementos H1 e CS, pois queríamos evitar a inserção de uma

seqüência repetida de cerca de 600 nucleotídeos (DIII + HA completa), uma vez que já havia

sido comprovada a viabilidade de vírus FA recombinantes que expressavam EGFP fusionada

à versão truncada da HA de den-4 (Bonaldo MC, comunicação pessoal). Esses vírus

mostraram-se estáveis até a 15ª passagem seriada, sendo que esta construção viral apresentava

taxa de proliferação superior quando comparado à quimera FA 17D/DEN4/Esa/6 (Bonaldo

MC, comunicação pessoal). Estes fatos demonstraram que diminuindo a identidade seqüencial

106

entre essas porções foi possível aumentar a estabilidade genética dos vírus FA recombinantes

que expressavam proteínas heterólogas na região intergênica E/NS1, evitando a perda da

inserção por pareamento entre as HA complementares não alélicas durante a replicação do

vírus. A porção H1 da haste está envolvida na formação de homotrímeros da proteína E

quando submetida a tratamento de baixo pH e CS que, apesar de ter sua seqüência conservada

entre Flavivírus, ainda não teve definida nenhuma função a ele associada (Allison et al.,

1999).

A identidade nucleotídica seqüencial entre a porção HA truncada de FA e HA truncada

den-4 caiu para 57,1%. A identidade seqüencial da região do DIII de den-2 também foi

avaliada em comparação a esta mesma região de FA, mostrando 52,1% de nucleotídeos

idênticos e 47,6% de igualdade entre os aminoácidos.

Foram obtidos dois diferentes vírus FA recombinantes que continham a inserção

heteróloga correspondente ao DIII den-2 a partir desse sistema de clonagem e expressão, que

diferiam entre si na porção C-terminal do cassete de expressão, um apresentando o motivo

esperado VGA e o outro um motivo mutante IGA. Esta mutação foi observada nos vírus

recuperados após transfecção do RNA viral sintetizado in vitro e não no clone infeccioso,

indicando que esta ocorreu durante a replicação viral. No entanto, o vírus FA 17D/DIII den-2

IGA apresentava-se como uma mistura de populações virais contendo ambos os motivos

VGA e IGA. Estes motivos ficam no C-terminal do peptídeo sinal, responsável pela

translocação de NS1 ao lúmen do RE, e faz parte do sítio de clivagem da enzima peptidase

sinal celular. O motivo VXA é bastante conservado no extremo carboxi da proteína E dos

Flavivírus, fato que sugere sua crucial importância na maturação da poliproteína viral

(Chambers et al., 1990; Lobigs e Lee 2004).

O motivo de clivagem da enzima peptidase sinal, entre E/NS1, são os resíduos de

aminoácidos VXA, onde X pode ser representado por Q nos sorotipos de dengue; H em JEV,

KUN, MVE e WNV; e G em FA e TBE (Chambers et al., 1990). Devido ao fato de a mutação

encontrada ter ocorrido entre aminoácidos conservados e alifáticos (VJI), ela pode não ter

sido tão danosa ao correto processamento da poliproteína viral pela enzima signalase celular,

gerando vírus viáveis mesmo com mutação pontual em resíduo tão importante em Flavivírus.

O caráter deletéreo da mutação IGA pode ser confirmado pela fixação da população com o

motivo VGA na quinta passagem celular seriada, não sendo mais observada a mutação no

seqüenciamento de amostras provenientes desta passagem em diante.

A expressão do DIII den-2 nos dois vírus recombinantes pôde ser detectada juntamente

com os antígenos da proteína E de FA. Estes resultados confirmam que os vírus

recombinantes FA 17D/DIII den-2 IGA e FA 17D/DIII den-2 VGA foram capazes de

107

expressar a proteína heteróloga, mesmo em culturas celulares infectadas com multiplicidade

baixa de infecção (m.o.i. 0,02), evidenciando a habilidade de disseminação desses vírus para

células adjacentes. As imagens confocais de imunofluorescência sugerem uma localização

perinuclear do DIII den-2 ao mostrarem uma marcação mais intensa ao redor do núcleo. No

entanto, são necessários estudos de co-localização celular com emprego de traçadores de

organelas, a fim de confirmar a retenção do DIII den-2 no RE, além de ensaios de

imunoprecipitação com produtos de marcação metabólica para analisar a presença de DIII no

meio extracelular ou associado a compartimentos celulares. A expressão e localização da

proteína heteróloga por este sistema também foi observada nas construções que expressavam

a proteína EGFP desenvolvida com HA completa e truncada de FA ou den-4 (Mello, 2007;

Bonaldo et al., 2007 e Bonaldo MC comunicação pessoal) e a marcação metabólica com

metionina- [S

] de células Vero infectadas com o vírus FA recombinante que expressava

EGFP associada à HA completa de FA mostrou que esta proteína encontrava-se nos extratos

celulares. Estes autores puderam também demonstrar que esta proteína estava associada ao

RE das células infectadas, sugerindo que a ligação de EGFP pelo ancoramento de sua região

HA à membrana do RE fosse responsável por essa associação (Bonaldo et al., 2007). Além

disso, estudos de cinética de expressão do DIII ainda serão realizados com objetivo de

identificar se o pico de expressão da proteína heteróloga coincide com o pico de replicação

dos vírus recombinantes.

Os dois vírus recombinantes apresentaram características proliferativas menores que a

observada para os dois vírus controles. Assim, o cassete de expressão parece não causar

grande comprometimento da estrutura e função viral, dada à capacidade replicativa dos vírus

recombinantes. Porém, este fato tem relação com uma menor viabilidade dos vírus

recombinantes, já que estes exibem menores valores de multiplicação em certos pontos da

curva de cinética de proliferação viral. O pico de replicação dos vírus recombinantes ocorreu

em 48 h p.i., como observado para o parental, o que pode ser justificado pela mesma

plataforma genotípica replicativa compartilhada por eles, enquanto que o vírus vacinal

mostrou pico de replicação em 72 h p.i., indicando um menor vigor replicativo quando

comparado ao parental.

A semelhança replicativa entre os dois vírus recombinantes construídos nesta

dissertação foi notável, com rápido aumento no número de partículas virais até 48 h p.i.

Entretanto, a partir deste ponto, o recombinante FA 17D/DIII den-2 IGA apresentou rápida

queda no título viral que elevou-se novamente a partir de 120 h p.i. Um padrão semelhante foi

demonstrado por FA 17D/DIII den-2 VGA que exibiu um primeiro pico registrado em 48 h

p.i., atingindo um platô entre 72 e 96 h e, passadas 96 h de infecção até as próximas 144 h,

108

foi marcante o aumento do título viral, sendo registrado novo pico de replicação neste último

ponto da curva cinética. Provavelmente, a mutação observada no vírus recombinante FA

17D/DIII den-2 IGA afeta de alguma forma sua capacidade replicativa. Estudos

demonstraram que existe um controle e uma ordem exercidos pela peptidase sinal durante

suas múltiplas clivagens da poliproteína viral, que é crítico para a eficiente morfogênese viral.

Lobigs e Lee (2004) mostraram que uma mutação no sítio de clivagem da peptidase sinal

entre as proteínas C e prM favorecia a redução na incorporação do nucleocapsídeo por

membranas em brotamento, o que resultava em uma maior exocitose de vírus sem esta porção

(VLP, do inglês “Virus-Like Particles”), liberando, dessa forma, um menor número de

partículas virais infecciosas pelas células infectadas. Além disso, foi observado que o vírus

mutante exibia menor taxa replicativa em relação ao controle, em diferentes linhagens

celulares (Lobigs e Lee, 2004), assim como o recombinante FA 17D/DIII den-2 IGA,

podendo esta mutação, de alguma forma, estar interferindo na formação e/ou secreção de

partículas virais.

O estudo cinético de infecção de monocamadas de células Vero por microscopia em

contraste de fase dos vírus recombinantes permitiu observar que a indução de CPE ocorre em

nível semelhante e dentro do mesmo intervalo de tempo entre os recombinantes e o controle

parental. Este fato, mais uma vez pode ser justificado pela mesma constituição genética em

termos replicativos compartilhada pelos três.

A estabilidade genética de insertos no genoma viral é uma característica importante,

pois para que os vírus FA 17D recombinantes sejam utilizados no desenvolvimento de novas

vacinas virais atenuadas expressando antígenos de outros patógenos, eles necessitam ser

estáveis, ou seja, manterem a inserção heteróloga em seu genoma, ao longo das passagens

virais. A perda do cassete de expressão por parte da população viral poderia acarretar na

diminuição da imunogenicidade dirigida ao antígeno exógeno induzida pela vacinação com o

vírus recombinante.

As análises por estabilidade genética de vírus recombinantes dotados de inserções

heterólogas são realizadas por meio de infecções seriadas em monocamadas celulares. É

padrão, em nosso laboratório, que essas infecções sejam executadas a uma m.o.i. de 0,02,

considerada como baixa, a fim de que os vírus recombinantes realizem um maior número de

replicações de seu genoma, propiciando a ocorrência de eventos de recombinação que

poderiam levar à perda da inserção heteróloga. Outra justificativa seria para atingir uma maior

proximidade da condição utilizada para a produção de lotes vacinais.

A partir da segunda passagem celular seriada do vírus recombinante FA 17D/DIII den-2

IGA, já foram detectados fragmentos secundários que sinalizavam para certa instabilidade

109

deste recombinante. Esses fragmentos correspondiam tanto a deleções parciais no cassete de

expressão, nas passagens 2P, 5P1, 5P2, 10P1 e 10P2, como a perda total da inserção na 10ª

passagem de uma das séries independentes. As regiões não deletadas do cassete de expressão,

ou seja, os 9 primeiros aminoácidos de NS1, os 30 primeiros aminoácidos de DIII den-2 e os

últimos 38 aminoácidos de TM2, de certa forma contribuíram para sua estabilização,

mantendo este fragmento de inserção heteróloga por até dez passagens seriadas.

Um fato curioso detectado a partir das passagens 5P1 e 5P2 do recombinante FA

17D/DIII den-2 IGA foi a reversão da mutação e restabelecimento do sítio de clivagem da

peptidase sinal para VGA. Este fato mostrou o caráter deletério e aleatório daquela mutação

pontual que surgiu em um evento replicativo da transcrição viral, e confirma a importância

deste motivo na clivagem de E/NS1 durante o processamento da poliproteína viral. Lobigs e

Lee (2004) analisaram alguns exemplares virais oriundos de plaques purificados do mutante

para o sítio de clivagem da peptidase sinal entre C e prM, e detectaram reversão da mutação, o

que significou em aumento na eficiência replicativa desses vírus, comparável ao exibido pelo

vírus controle, indicando a importância da conservação deste sítio de clivagem em Flavivírus.

O vírus recombinante FA 17D/DIII den-2 VGA também mostrou um mesmo padrão

heterogêneo de fragmentos amplificados a partir da 2P, culminando na perda total do cassete

de expressão nas passagens 10P1 e 10P2. Porém, diferentemente do exibido pelo FA

17D/DIII den-2 IGA, só foram detectados fragmentos de tamanhos compatíveis com a

presença ou ausência do cassete recombinante, sem fragmentos intermediários entre esses

dois, referentes a possíveis deleções no cassete. Este fato já era algo esperado por nosso

grupo, uma vez que a nossa experiência acumulada no estudo da estabilidade genética de

diferentes vírus FA recombinantes indica que deleções de seqüências exógenas inseridas no

genoma viral são rapidamente fixadas após algumas passagens contínuas em monocamadas de

células Vero. Isto ocorre devido à pressão seletiva exercida sobre as populações virais de cada

amostra (com e sem a inserção heteróloga), pois, uma vez que a taxa replicativa dos vírus que

têm seu fenótipo revertido para o tipo vacinal (não carreadores da inserção heteróloga) é mais

alta, estes terminam por superar a replicação exibida pela população viral recombinante,

selecionada negativamente ao longo deste processo (Bonaldo et al., 2007).

Esses fatos apontam para relativa instabilidade genética de ambos os recombinantes que

expressavam o DIII den-2 na região intergênica E/NS1, uma vez que desde o estoque viral

(segunda passagem em monocamada celular) já era detectada uma relativa perda da inserção

heteróloga, sugerindo que a inserção, de alguma forma, desestabiliza a replicação viral. No

entanto, o recombinante FA 17D/DIII den-2 VGA se mostrou mais estável quando comparado

ao FA 17D/DIII den-2 IGA, uma vez que este primeiro não apresentou deleções parciais no

110

inserto heterólogo. Outro fator que confirma a menor estabilidade do recombinante FA

17D/DIII den-2 IGA é o fato de detectarmos fracamente o cassete íntegro nas passagens 5P1 e

5P2, quando o vírus FA 17D/DIII den-2 VGA nestas passagens apresentavam este fragmento

majoritariamente. Como possíveis explicações para a menor estabilidade deste recombinante

são à deleção de 303 aminoácidos do cassete de expressão e a mutação no sítio de clivagem

da peptidase sinal do hospedeiro.

Quando o resultado da estabilidade genética desses recombinantes que expressavam

DIII den-2 é comparado aos obtidos para a primeira geração de vírus que expressavam a

proteína heteróloga EGFP associada à HA truncada de FA foi observado um padrão parecido

quanto à perda da inserção heteróloga. O cassete de expressão da EGFP começou a ser

perdido já na 2P, sendo fixada a deleção total na 10ª passagem seriada (Mello, 2007).

No entanto, quando os resultados de instabilidade dos vírus FA recombinantes que

expressavam DIII den-2 na região intergência E/NS1 são comparados ao vírus recombinante

que expressava a proteína EGFP associada à HA truncada de den-4 grandes diferenças são

observadas. Análises por RT-PCR e citometria de fluxo deste último recombinante,

mostraram que ele foi estável até a 10ª passagem seriada, com indícios de perda da inserção

na 15ª passagem seriada (Bonaldo MC, comunicação pessoal). Sendo assim, a instabilidade

do recombinante que expressava o DIII den-2 não parece estar associada à plataforma de

expressão em si. O sistema que expressava DIII den-2 pode ter se mostrado mais instável,

pois esta região poderia estar se pareando com a homóloga de FA, regiões que compartilham

identidade nucleotídica de 52,1% e, de certa forma, contribuindo para menor estabilidade

genética. Outra possível explicação seria o pareamento de DIII den-2 com os demais

domínios do outro monômero da proteína E, em pontos onde normalmente não ocorre o

contato entre essas porções, facilitando a formação de fragmentos inespecíficos que

culminariam na perda da inserção heteróloga (Bonaldo et al., 2006).

Outra hipótese poderia estar associada a um caráter tóxico exercido pelo DIII às células

infectadas pelos vírus recombinantes, que estaria se acumulando no RE da célula hospedeira,

contribuindo para indução de apoptose. Estudos mostraram que o RE responde ao estresse

causado pelo acúmulo de proteínas com enovelamento incorreto em seu lúmen ativando vias

transdutoras de sinais chamadas de “unfolding protein response” ou resposta à proteína com

enovelamento incorreto (Ron e Walter, 2007).

Lorenz et al. (2002) observaram que as proteínas virais se associam logo após sua

síntese para que a clivagem de prM, a partir da poliproteína viral, seja eficiente e para que

ocorra o correto dobramento da proteína E. Essa associação entre prM e E é vital para

formação de heterodímeros intracelulares, na proporção 1:1 dessas proteínas, a fim de garantir

111

a maturação dos virions. Dessa forma, um acúmulo de DIII den-2 no interior da célula poderia

perturbar esta interação e, conseqüentemente o processo de maturação viral, levando à

geração de recombinantes menos viáveis e mais instáveis.

Bredenbeek et al. (2006) também elegeram a região E/NS1 do vírus FA 17D como o

local para a inserção de antígenos heterólogos. No entanto, a estratégia adotada por este grupo

abrangia somente a duplicação da região gênica de TM2 de FA após o gene da glicoproteína

LASV GPC de Lassa vírus (arenavírus), para servir de seqüência sinal e garantir a correta

inserção da proteína NS1 no RE. Foram gerados vírus viáveis que expressavam a

glicoproteína de Lassa vírus e que conferiram proteção de 80% das cobaias após desafio.

Porém, neste trabalho, não foi demonstrado nenhum dado referente à cinética de replicação

dos vírus recombinantes em comparação com o parental, além de dados de estabilidade

genética desses vírus.

Diversos trabalhos reportaram o uso do vírus FA 17D como vetor de expressão de

antígenos heterólogos (McAllister et al., 2000; Bonaldo et al., 2005; Tao et al., 2005; Barba-

Spaeth et al., 2005). Entretanto, para o desenvolvimento de Flavivírus como vetores de

expressão de antígenos heterólogos, é necessário o desenho de criteriosas estratégias, evitando

o comprometimento da estrutura e replicação virais, de forma a assegurar que a construção

gere um vírus não-patogênico, mantendo a seqüência exógena integrada de forma estável no

genoma viral. Além destes, deve-se garantir que o vírus FA recombinante, além de atenuado,

mantenha suas propriedades imunológicas, expressando o antígeno heterólogo de modo que

este induza resposta imune apropriada. Também é importante a manutenção da capacidade de

proliferação em culturas de células certificadas para a produção de vacinas.

Por fim, a comparação de nossos resultados com dados disponíveis na literatura

científica até o momento indica que a estratégia utilizada neste trabalho é promissora e

inovadora. No presente trabalho, foi apresentada a construção de dois vírus FA 17D que

expressam o domínio III do vírus den-2 na região entre os gene E e NS1 de FA. A

particularidade entre eles era representada por uma mutação pontual no sítio de clivagem

entre E/NS1 da peptidase sinal do hospedeiro. Ambos os recombinantes mostraram-se

estáveis até a 5ª passagem seriada e a perda da inserção heteróloga em ambos os construtos

virais indicaria que a clonagem e expressão de DIII den-2/HA trunc den-4 exerce um efeito

deletério na viabilidade viral. No entanto, este fato não limita o uso destes vírus vetores como

modelos para imunização de camundongos e dosagem de anticorpos neutralizantes para FA e

DIII den-2 por ensaios de PRNT, além da dosagem de anticorpos produzidos contra a proteína

heteróloga por ELISA. Além disso, estudos de desafio intracerebral com vírus FA e den-2

neuroadaptado podem avaliar o grau de proteção desempenhado por estes vírus

112

recombinantes. A clonagem e expressão de outros epítopos de dengue ou qualquer outra

proteína de Flavivírus poderiam ser realizadas empregando-se esta mesma abordagem ou

pequenas variações dela, como por exemplo, a inserção de seqüências sinais com objetivo de

secretar a proteína heteróloga, a fim de comparar sua expressão e apresentação frente ao

sistema imune com o sistema de expressão anterior.

113

7. CONCLUSÕES

• A análise seqüencial nucleotídica e de aminoácidos, bem como a modelagem

molecular do DIII den-2, permitiram uma melhor caracterização desta região quanto à

sua estrutura, além de proporcionar a identificação de regiões conservadas e variáveis

entre os genótipos e sorotipos de den-2.

• A modelagem molecular por homologia do DIII den-2 proporcionou o mapeamento no

modelo tridimensional dos resíduos não conservados entre os genótipos de den-2, dos

resíduos envolvidos no escape de neutralização por anticorpos e dos resíduos

responsáveis pela ligação a receptores celulares;

• A estratégia de inserção do DIII den-2 entre o gene da proteína estrutural E e o gene

da proteína não-estrutural NS1 mostrou-se viável e promissora na obtenção de vírus

FA 17D recombinantes, não comprometendo consideravelmente a estrutura e função

virais;

• Os perfis replicativos das construções que expressavam o DIII den-2/HA truncada

den-4 foram diferenciados quando comparados aos controles vacinal e parental. No

entanto, esses padrões são compatíveis com procedimentos experimentais deste

trabalho;

• A perda da inserção heteróloga em ambas as construções virais sugere que a clonagem

e expressão de DIII den-2/HA truncada den-4 exerce um efeito deletério na

viabilidade viral. No entanto, este fato não limita a utilização destes vírus como

vetores vacinais, visto que são mantidas a integridade estrutural e funcional do cassete

heterólogo.

114

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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130

9. ANEXO

9.1. Meios de Cultura e Soluções

O meio 10X concentrado Earle 199 (GIBCO), PBS, tripsina solução estoque, Hepes

1 M, fungizona (500 mg/mL), Soro Fetal Bovino (SFB – Cutilab) não inativado foram

produzidos pela estrutura do Laboratório de Sarampo (LASA/Bio-Manguinhos), seguindo as

normas de controle de qualidade já estabelecidas pela instituição. No LATEV os reagentes de

cultura celular foram aliquotados e estocados, prontos para o uso.

Acetato de amônio 7,5 M

Acetato de amônio 28,87 g

Água tipo I q.s.p. 50 mL

Estocar a 4

Agarose 0,8%

Agarose

0,8 g

Água tipo I q.s.p. 100 mL

Aquecer em microondas para mistura. Armazenagem à TA.

Bicarbonato de sódio 4,4% gaseificado (NaHCO

)

NaHCO

44 g

Vermelho de fenol 1% 1 mL

Água tipo I q.s.p. 1.000 mL

Adição de gelo seco com agitação até a solução atingir pH 7,0 – 7,2; aliquotar em 20 mL e

esterilizar por autoclave 121°C 15 min.

BSA 40 mg/mL

Soro albumina bovina 400 mg

Água tipo I q.s.p. 10 mL

Preparar e estocar a 4ºC.

Carboximetilcelulose (CMC) 3%

CMC

3 g

Água tipo I q.s.p. 100 mL

Homogeneização por agitação vigorosa (liquidificador); esterilização por autoclave (121°C

por 20 min). Armazenagem à TA.

131

Cloreto de Cálcio 100 mM

CaCl

1,11 g

Água tipo I q.s.p. 100 mL

Após o preparo, autoclavar (121

C/20 min) e estocar a 4ºC.

Cristal Violeta

Solução Estoque (2%)

Cristal Violeta

10 g

Metanol 100 mL

Água tipo I q.s.p. 500 mL

Solução de Uso (0,04%)

Cristal Violeta estoque 20 mL

Água tipo I q.s.p. 1.000 mL

Preparar e estocar à TA.

DEPC - Solução de tratamento de material contra RNase : 0,01% em água bidestilada.

EDTA 0,5 M (pH 8,0)

EDTA

186,1 g

Água tipo I q.s.p. 1.000 mL

Ajustar pH até 8,0 com pastilhas de NaOH. Estocar a 4

Formaldeído 10%

Formaldeído 37% 1.000 mL

Água tipo I 2.700 mL

Preparar e estocar à TA.

Meio 199 com sais de Earle completo (199/Earle completo)

Meio 199 com sais de Earle 10X 10 mL

NaHCO

4,4% (pH 7,0) 2,5 mL ou 5 mL *

SFB inativado (Cutilab) 5 mL

Sulfato de gentamicina (4 mg/mL) 1 mL

Fungizona (500 mg/mL) 0,1 mL

Água tipo I q.s.p. 100 mL

Todo material estéril; preparo no momento do uso.

* Depende do tipo de sistema de cultura: 2,5 mL para sistema aberto ou sistema fechado.

132

Meio 199 com sais de Earle para inocular em camundongo

Meio 199 com sais de Earle 10X 10 mL

NaHCO

4,4% (pH 7,0) 2,5 mL

SFB inativado 5 mL

Água tipo I q.s.p. 100 mL

Todo material estéril; preparo no momento do uso.

Meio 199 com sais de Earle 2X concentrado (199/Earle 2X)

Meio 199 com sais de Earle 10X 20 mL

NaHCO

4,4% (pH 7,0) 10 mL

SFB inativado 10 mL

Sulfato de gentamicina (4 mg/mL) 2 mL

Fungizona (500 mg/mL) 0,2 mL

Água tipo I q.s.p. 100 mL

Todo material estéril; preparo no momento do uso.

Meio 199 com sais de Earle /CMC (199Earle/CMC)

Meio 199 com sais de Earle 10X 10 mL

NaHCO

4,4% (pH 7,0) 5 mL

SFB inativado 5 mL

Sulfato de gentamicina (4 mg/mL) 1 mL

Fungizona (500 mg/mL) 0,1 mL

CMC 3% (Sigma) q.s.p. 100 mL

Todo material estéril; preparo no momento do uso. Homogeneizar vigorosamente.

Meio 199 Earle / Hepes

Meio 199 com sais de Earle 10X 10 mL

NaHCO

4,4% (pH 7,0) 0,5 mL

SFB inativado 5 mL

Sulfato de gentamicina (4 mg/ml) 1 mL

Fungizona (500 mg/ml) 0,1 mL

Água tipo I q.s.p. 100 mL

Meio BHI (Brain Heart Infusion)

Meio BHI

37 g

Água tipo I q.s.p. 1.000 mL

Esterelizar por autoclavação por 15 min a 121ºC.

133

Meio LB (Luria-Bertani)

Bacto-triptona

10 g

Extrato de levedura 5 g

NaCl 10 g

Água tipo I q.s.p. 1.000 mL

Homogeneizar e ajustar pH 7,5 com solução de NaOH 1 N; esterilização por autoclave

(121°C por 20 min); armazenar a TA.

Obs.: Para meio LB sólido, acrescentar 1,5 g de agar bacteriológico para cada 100 mL de

meio LB.

Meio SOC (Super Optimal Catabolite) comercial

Bacto-triptona

20 g

Extrato de levedura 5 g

NaCl (10 mM) 0,58 g

KCl (2,5 mM) 0,186 g

MgCl

(1 M) 5 mL

MgSO

(1 M) 5 mL

Glicose (2 M) 10 mL

Água tipo I q.s.p. 1.000 mL

Adicionar os quatro primeiros ingredientes em um frasco de 2 L e verter água estéril q.s.p. 1

L. Homogeneizar e autoclavar por 30 min. Resfriar o frasco em TA, adicionar 10 mL da solução de

magnésio e misturar bem. Adicionar 10 mL de glicose e misturar bem.

Paraformaldeído 4%

Paraformaldeído

4,0 g

Água tipo I q.s.p. 50 mL

Tampão fosfato dibásico 2 mM 50 mL

Aquecer a água milli-Q até 70ºC. Adicionar, aos poucos, o Paraformaldeído. Clarificar a

solução com 1 ou 2 gotas de NaOH 1 N. Deixar esfriar e, em seguida, adicionar o tampão fosfato

dibásico.

PBS-1%BSA (Solução de bloqueio)

BSA 1%

5,0 g

PBS 1x q.s.p. 500 mL

134

PBS (salina tamponada com fosfato) – Livre de RNase – Para transfecção

NaCl 5 M

30 mL

Na2HPO 32 mL

NaH2PO 8 mL

Água tipo I q.s.p. 1.000 mL

Preparado com água tratada com DEPC (0,01%) e autoclavado (121°C por 20 min).

Sulfato de gentamicina (Garamicina)

5 ampolas de Garamicina (2 mL cada) para 90 mL de água bidestilada estéril.

Sulfato de Magnésio (MgSO4) 1 M

MgSO

12,03 g

Água tipo I q.s.p. 100 mL

Filtrar em millipore 0,22 µm. Estocar a 4

Soro Fetal Bovino/SFB (Cultlab)

Inativado a 56ºC por 30 minutos. Aliquotado (50 mL) e armazenado a 4ºC.

TAE (solução de estoque 50X)

Tris base

242 g

Ácido acético glacial 57,1 mL

EDTA 0,5 M (pH 8,0) 100 mL

Água tipo I q.s.p. 1.000 mL

Estocar à TA.

Tampão PBS 10x pH7,4

NaCl

80,0 g

KCl 20,0 g

HPO

O 14,4 g

Água tipo I q.s.p. 1.000 mL

Ajustar pH 7,4; esterilização por autoclavação a 121ºC por 15 min; armazenagem à TA.

(Sambrook et al., 1989).

TE pH 7,6

Tris 10 mM

10 mL Tris 1 M (pH 7,6)

EDTA 1 mM 2 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0)

Água tipo I q.s.p. 1.000 mL

Após o preparo autoclavar (121ºC/20 min) e estocar a 4

135

Tripsina/PBS

Tripsina estoque 0,5 mL

PBS 1 X 50 mL

Preparar imediatamente antes do uso.

Tripsina/verseno

Tripsina estoque 0,5 mL

Verseno 50 mL

Preparar imediatamente antes do uso.

Tris 1 M (pH 7,6)

Tris base

121,1 g

Água tipo I q.s.p. 1.000 mL

Ajustar pH até 7,6 com HCl 1 N. Estocar a 4ºC.

Verseno –

Solução estoque 5%

EDTA

50 g

Vermelho de fenol 1% 0,1 mL

Água tipo I q.s.p. 1.000 mL

Misturar e acertar o pH para 7,6 com NaOH 1 N. Estocar à TA.

Solução de trabalho

Solução estoque de verseno 20 mL

Vermelho de fenol 1% 0,1 mL

PBS pH 7,6 q.s.p. 1.000 mL

Homogeneizar, ajustar pH para 7,6 com NaOH 1 N. Aliquotar em frascos 50 mL, esterilizar

por autoclave 121°C por 20 min. Estocar à TA.

0,5% Triton X-100 em PBS

Triton X-100

1,0 g

PBS 1x q.s.p. 1000 mL

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