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CASSIANA SEVERIANO DE SOUSA
CONSTRUÇÃO DE CASSETES DE EXPRESSÃO PARA
SILENCIAMENTO DE GENES DA BIOSSÍNTESE DE ÁCIDOS
GRAXOS EM SOJA VIA RNA DE INTERFERÊNCIA
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das exigências
do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Agrícola, para obtenção do título de Magister
Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2007
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Milhares de livros grátis para download.
Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e
Classificação da Biblioteca Central da UFV
T
Sousa, Cassiana Severiano de, 1980-
S725c Construção de cassetes de expressão para silenciamento
2007 de genes da biossíntese de ácidos graxos em soja via RNA
de interferência / Cassiana Severiano de Sousa. – Viçosa,
MG , 2007.
ix, 48f. : il. (algumas col.) ; 29cm.
Orientador: Maurilio Alves Moreira.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de
Viçosa.
Referências bibliográficas: f. 44-48.
1. Silenciamento gênico. 2. Engenharia genética vegetal.
3. Regulação da expressão gênica. 4. Soja - Melhoramento
genético. 5. Soja - Composição. 6. Clonagem molecular.
I. Universidade Federal de Viçosa. II.Título.
CDD 22.ed. 660.65
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CASSIANA SEVERIANO DE SOUSA
CONSTRUÇÃO DE CASSETES DE EXPRESSÃO PARA
SILENCIAMENTO DE GENES DA BIOSSÍNTESE DE ÁCIDOS
GRAXOS EM SOJA VIA RNA DE INTERFERÊNCIA
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das exigências
do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Agrícola, para obtenção do título de Magister
Scientiae.
APROVADA: 28 de fevereiro de 2007.
_________________________________ _________________________________
Prof. Everaldo Gonçalves de Barros Prof. Luiz Orlando de Oliveira
(Co-Orientador) (Co-Orientador)
__________________________________ _________________________________
Prof
a
. Andréa de Oliveira Barros Ribon Prof
a
. Andréia Barcelos Passos Lima
________________________________________
Prof. Maurilio Alves Moreira
(Orientador)
Aos meus pais, Maurílio e Maria das Graças.
Às minhas irmãs Maria e Júlia.
À minha avó Elvira.
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus, por iluminar meu caminho e por ter me dado força para superar todas
as dificuldades e alcançar mais este objetivo.
À Universidade Federal de Viçosa, pela oportunidade de realização do curso.
Ao Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO), pela
oportunidade da realização deste trabalho.
Ao Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, pela oportunidade.
Aos professores do Departamento, pelos ensinamentos que foram fundamentais para
minha formação intelectual. Ao secretário Eduardo, pela amizade e por ser o “anjo
guarda” dos alunos da Bioquímica Agrícola, sempre disposto a nos ajudar,
informando datas importantes, resolvendo problemas e deixando as questões
burocráticas menos complicadas.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG),
pela concessão da bolsa de estudo.
Aos meus pais, Maurílio e Maria das Graças, pelo amor e pelos esforços sem
medida para que eu realizasse os meus sonhos. Eles foram e sempre serão minha base
e meu exemplo. Sempre estiveram ao meu lado, me apoiaram e compreenderam a
minha ausência. À minha avó, Elvira, pela presença sempre importante e pelos
momentos maravilhosos da minha infância. Às minhas irmãs, Maria e Júlia, pelo
amor, carinho, apoio e confiança. Elas me incentivaram e torceram pelo meu sucesso.
Muitas vezes foram elas que me impulsionaram, me fazendo acreditar em mais essa
conquista.
Ao professor Maurilio Alves Moreira, pela orientação, confiança e pelo
exemplo de competência.
Ao Professor Everaldo Gonçalves de Barros pela co-orientação, apoio,
incentivo e pela ajuda nos momentos difíceis. Ao professor Luiz Orlando de Oliveira,
pela co-orientação e pelas sugestões dadas a este trabalho.
Ao Professor Vagner Tebaldi de Queiroz, por todos os ensinamentos durante
a Iniciação Científica, que foram extremamente importantes para a execução dos
experimentos.
À Professora Andréia Barcelos Passos Lima, por todo apoio no início no
projeto, na época em que essa área ainda era uma novidade para mim, por ter me
iii
direcionado durante a execução de grande parte dos experimentos e pela ajuda em
todos os momentos.
Aos colegas do Laboratório de Clonagem e Sequenciamento de DNA
(SeqDNA) e dos Laboratórios de Genética Molecular de Plantas I e II (Biomol e
Proteína) pela convivência agradável e pela ajuda em todas as ocasiões. Às amigas
Polyana e Beatriz, por toda ajuda e colaboração, pelos momentos agradáveis dentro e
fora do laboratório e pelas risadas.
Às amigas da república, que se tornaram a minha família em Viçosa desde
2001, pelo total companheirismo e pela força. Um agradecimento especial à Ana
Paula, Vanessa e Rejane que me acompanharam até o alcance de mais essa conquista.
Muitas vezes rimos e choramos juntas.
Aos funcionários, Aloísio, Gláucia e João Paulo, pela atenção e presteza.
Enfim, a todos os amigos e familiares, que de alguma forma, contribuíram
para o meu crescimento profissional e humano.
iv
BIOGRAFIA
CASSIANA SEVERIANO DE SOUSA, filha de Maurílio Ferreira de Sousa e
Maria das Graças Severiano de Sousa, nasceu no dia vinte e sete de outubro de 1980,
em Cataguases, MG.
Em março de 2001, ingressou no curso de Bioquímica da Universidade
Federal de Viçosa, MG, graduando-se como Bacharel em Bioquímica em janeiro de
2005.
Em março de 2005, ingressou no Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Agrícola, em nível de mestrado, na mesma instituição, submetendo-se à defesa da
tese em fevereiro de 2007.
v
SUMÁRIO
RESUMO........................................................................................... viii
ABSTRACT....................................................................................... ix
1. INTRODUÇÃO................................................................................. 1
2. REVISÃO DE LITERATURA.......................................................... 3
2.1. Ácido-graxo dessaturases................................................................... 4
2.2. 1,2–diacilglicerol colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina
aciltransferase..................................................................................... 7
2.3. Silenciamento gênico......................................................................... 7
2.4. Silenciamento gênico por RNA de interferência................................ 9
3. OBJETIVOS....................................................................................... 12
3.1. Objetivo geral..................................................................................... 12
3.2. Objetivos específicos.......................................................................... 12
4. MATERIAL E MÉTODOS............................................................... 13
4.1. Material vegetal.................................................................................. 13
4.2. Extração de RNA total de sementes de soja....................................... 13
4.3. Síntese de cDNA por RT-PCR........................................................... 14
4.4. Análise das seqüências gênicas para escolha dos sítios de restrição
e desenho dos primers........................................................................ 15
4.5. Teste dos primers para estabelecimento das condições de
amplificação....................................................................................... 16
4.6. Isolamento dos fragmentos gênicos e clonagem em vetor pGEM T-
Easy.................................................................................................... 17
4.7. Transformação de Escherichia coli por choque térmico e
diagnóstico de colônias...................................................................... 18
4.8. Seqüenciamento do DNA................................................................... 19
4.9. Subclonagem dos fragmentos específicos em vetores
pKANNIBAL..................................................................................... 19
4.10. Nomenclatura dos clones com os fragmentos sense e antisense em
vetores pKANNIBAL........................................................................ 21
4.11. Transferência das construções dos vetores pKANNIBAL para os
vetores pCAMBIA 3301.................................................................... 21
4.12. Nomenclatura dos clones com as construções em vetores
pCAMBIA 3301................................................................................. 23
4.13. Substituição do promotor 35SCaMV pelo promotor semente-
específico do gene da subunidade α da β-conglicinina em vetores
pKANNIBAL..................................................................................... 23
4.14. Nomenclatura dos clones contendo as construções dirigidas pelo
promotor do gene da subunidade α da β-conglicinina em vetores
pKANNIBAL..................................................................................... 24
vi
4.15. Transferência dos cassetes com o promotor do gene da subunidade
α da β-conglicinina dos vetores pKANNIBAL para os vetores
pCAMBIA 3301................................................................................. 24
4.16. Nomenclatura dos clones com as construções dirigidas pelo
promotor da subunidade α da β-conglicinina em vetores pCAMBIA
3301.................................................................................................... 25
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................... 26
5.1. Amplificação de cDNA e escolha da temperatura de anelamento..... 26
5.2. PCR para diagnóstico das colônias transformadas com o vetor
pGEM T-Easy.................................................................................... 28
5.3. Confirmação das clonagens em vetores pGEM T-Easy..................... 28
5.4. Análise das seqüências e comparação com banco de dados.............. 29
5.5. Confirmação das subclonagens em vetores pKANNIBAL ............... 33
5.6. Confirmação das clonagens em vetores binários pCAMBIA 3301... 34
5.7. Confirmação da substituição do promotor 35SCaMV em vetores
pKANNIBAL..................................................................................... 36
5.8. Confirmação da transferência da construção dirigida pelo promotor
do gene da subunidade α da β-conglicinina para os vetores
pCAMBIA 3301................................................................................. 38
5.9. Representação esquemática dos clones obtidos................................. 39
6. CONCLUSÕES.................................................................................. 42
7. PERSPECTIVAS............................................................................... 43
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................... 44
vii
RESUMO
SOUSA, Cassiana Severiano de, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, Fevereiro
de 2007. Construção de cassetes de expressão para silenciamento de genes da
biossíntese de ácidos graxos em soja via RNA de interferência. Orientador:
Maurilio Alves Moreira. Co-Orientadores: Everaldo Gonçalves de Barros e Luiz
Orlando de Oliveira.
O óleo de soja é composto em sua maior parte por gordura insaturada, sendo
que os ácidos graxos polinsaturados (ácidos linoléico e linolênico), monoinsaturado
(ácido oléico) e saturados (ácido palmítico e esteárico) correspondem, em média, a
61%, 25% e 15%, respectivamente. Alterações nas proporções relativas destes ácidos
graxos na fração óleo, podem ser obtidas pela modificação genética da expressão de
enzimas-chave da biossíntese de ácidos graxos polinsaturados, através de
transformação genética de plantas via silenciamento gênico. Dentre essas enzimas,
destacam-se as dessaturases, as fosfotransferases e as aciltransferases. Através da
modificação da expressão dessas enzimas, é possível a obtenção de linhagens de soja
com óleos com menor conteúdo de ácido linolênico, maior conteúdo de ácido oléico
e, conseqüentemente, maior estabilidade oxidativa. Os objetivos deste trabalho foram
isolar os fragmentos dos genes da oleoil dessaturase, 1,2-diacilglicerol
colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina aciltransferase e construir cassetes de
expressão para o silenciamento, via RNA de interferência, para esses três genes em
sementes de soja. Foi possível isolar os fragmentos dos três genes, subclonar os
fragmentos sense e antisense no vetor pKANNIBAL e transferir as construções para
o vetor binário pCAMBIA 3301. Foram obtidos quatro cassetes de expressão para
silenciamento gênico. Destes, dois foram para o gene da oleoil dessaturase, um para o
gene da 1,2-diacilglicerol colinafosfotransferase e o outro para o gene da
lisofosfatidilcolina aciltransferase. Para os três genes foram obtidos cassetes de
silenciamento dirigidos pelo promotor 35SCaMV, sendo que para a dessaturase
também foi obtido o cassete com o promotor do gene da subunidade α da proteína de
reserva de soja β-conglicinina.
viii
ABSTRACT
SOUSA, Cassiana Severiano de, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, February,
2007. Construction of cassettes for silencing fatty acid genes expression in
soybean by RNA interference. Adviser: Maurilio Alves Moreira. Co-Advisers:
Everaldo Gonçalves de Barros e Luiz Orlando de Oliveira.
The soybean oil is composed in majority by unsaturated fatty acids. The
poliunsaturated fatty acids (linolenic and linoleic acids), monounsaturated (oleic
acid) and saturated (palmitic and estearic acids) correspond, on average, to 61%, 25%
e 15%, respectively. Alterations in the relative proportions of fatty acids may be
reached through genetic modification of the expression of key enzymes in the
polinunsaturated fatty acids biosynthesis, through genetic transformation of plants by
gene silencing. Among these enzymes are desaturases, phosphotransferases and
acyltransferases. Modificating the expression of these enzymes is possible to obtain
oils with lower content of linolenic acid, increased content of oleic acid and,
consequently, higher oxidative stability. The objectives of this work were to isolate
the fragments of the soybean oleoil desaturase gene, 1,2-diacylglycerol
cholinephosphostransferase gene and lisophasphatidilcholine acyltransferase gene
and to construct expression cassettes for silencing, by RNA interference, these three
genes in soybean seeds. Fragments of the three genes were isolated and subcloned in
sense and antisense in the vector pKANNIBAL and the constructions were
transferred to the binary vector pCAMBIA 3301. Four expression cassettes for gene
silencing were obtained. Two for the oleoil desaturase, one for the 1,2-diacylglycerol
cholinephosphotransferase and one for the lisofosfatidilcholine acyltransferase. There
were obtained three cassettes for gene silencing driven by the 35SCaMV promoter,
and one cassette for the desaturase gene with the gene promoter of the α subunit of
soybean storage protein β - conglycinine.
ix
1. INTRODUÇÃO
O cultivo da soja (Glycine max L. Merrill) ocupa a maior área plantada do
Brasil (45,2%), além de ser uma das mais importantes culturas do mundo. A área
cultivada com soja no país é de 20,6 milhões de hectares. O Brasil é o segundo maior
produtor mundial dessa leguminosa e a sua produção na safra 2005/2006 foi de
aproximadamente 53,4 milhões de toneladas. A estimativa para a produção de soja na
safra 2006/2007 é em torno de 53,9-55,2 milhões de toneladas, sendo que os
levantamentos realizados nos meses de janeiro e fevereiro de 2007, apontaram
produções de 54,8 e 56,3 milhões de toneladas, respectivamente
(www.conab.gov.br).
Tal leguminosa vem sendo geneticamente modificada em larga escala e a soja
transgênica está sendo utilizada em um número crescente de produtos. Dentre as
lavouras geneticamente modificadas mais comercializadas em escala mundial, a soja
é a que mais se destaca, apresentando 64% de uma área de 91 milhões de hectares.
Houve aumento expressivo com relação a área ocupada com lavouras de soja
transgênica ao longo de 11 anos, desde o início de sua comercialização, sendo que o
maior aumento no ano de 2006 ocorreu no Brasil, onde foram plantados 2 milhões de
hectares com soja transgênica (JAMES, 2006).
As técnicas de melhoramento tradicional podem ser auxiliadas pela
engenharia genética, visto que a manipulação genética permite que um ou mais genes
sejam transferidos de um organismo para outro, que passa a expressar uma nova
característica de especial interesse. Além disso, é possível controlar espacial e
temporalmente o padrão de expressão do gene de interesse (TANG & GALILI,
2004).
Os óleos com as características modificadas são de grande interesse para as
indústrias de óleo e gordura, uma vez que os mesmos podem apresentar
características nutricionais e/ou funcionais melhoradas em relação aos tipos
comercializados.
Uma das estratégias utilizadas para a obtenção de soja com modificação na
fração lipídica é a modificação genética da expressão de enzimas-chave da
biossíntese de ácidos graxos polinsaturados, através de transformação genética de
plantas via silenciamento gênico, transcricional ou pós-transcricional
(VENDRUSCOLO, 2003; TANG & GALILI, 2004).
1
A técnica de RNA interference (RNAi), mediada por inserção de um
transgene na forma de RNA dupla fita (dsRNA) complementar à seqüência do gene
alvo, tem mostrado bons resultados na modificação genética da composição de
ácidos graxos no óleo, apresentando vantagens em termos de sua eficiência e
estabilidade com relação às técnicas de silenciamento por co-supressão ou RNA
antisense (TANG & GALILI, 2004).
O Programa de Melhoramento da Soja, desenvolvido pela Universidade
Federal de Viçosa, visando à obtenção de linhagens especiais de soja para a
agroindústria, desenvolveu um valioso germoplasma que inclui, dentre outras,
linhagens com baixos teores de ácido linolênico. No que diz respeito á fração óleo, a
principal meta desse programa é aumentar a estabilidade oxidativa do óleo pela
redução do conteúdo de ácido linolênico e pelo aumento do conteúdo do ácido oléico
(MOREIRA, 1999).
2
2. REVISÃO DE LITERATURA
Os óleos vegetais possuem como seu principal componente lipídico os
triacilgliceróis. Estes são compostos de três ácidos graxos, cada um em ligação éster
com a molécula de glicerol. A maioria dos triacilgliceróis de ocorrência natural é
mista; eles contêm dois ou mais ácidos graxos diferentes. Os ácidos graxos
predominantes são os que possuem 16 e 18 carbonos: ácido palmítico (16:0), ácido
esteárico (18:0), ácido oléico (18:1, ∆
9
), ácido linoléico (18:2, ∆
9, 12
) e ácido
linolênico (18:3, ∆
9, 12,15
) (KINNEY, 1994).
A qualidade do óleo, o valor nutricional, o sabor e as propriedades físicas,
como estabilidade oxidativa e ponto de fusão, são determinados pela composição e
pela distribuição dos ácidos graxos na molécula de triacilglicerol. O teor de ácidos
graxos polinsaturados tem sido correlacionado com a redução da estabilidade
oxidativa e da qualidade (sabor e odor) do óleo de soja, gerando compostos voláteis,
que produzem “off-flavor”, rancidez e desempenho reduzido do óleo (YADAV,
1996; MURPHY, 1999).
Embora os óleos altamente insaturados tenham efeitos nutricionais benéficos,
a sua exposição a altas temperaturas por longos períodos de tempo leva à quebra
oxidativa de duplas ligações de carbono, resultando na formação de aldeídos de
cadeia curta, hidroperóxidos e ceto derivados. Isso causa sabor indesejável e reduzido
desempenho de fritura do óleo, por aumento da quantidade de compostos polares
(WARNER et al., 2001). Além disso, pode-se reduzir o teor de ácidos graxos
altamente insaturados a valores muito menores que os encontrados naturalmente, sem
que haja prejuízo com relação aos requerimentos nutricionais (ABBADI et al., 2004).
Uma alternativa para diminuir o teor de ácidos graxos polinsaturados é a
hidrogenação seletiva do óleo de soja, processo no qual as duplas-ligações de
carbono são reduzidas a ligações simples, por ação do hidrogênio na presença de um
catalisador (RAY & CARR, 1985). Tal processo reduz o conteúdo de ácidos graxos
polinsaturados, principalmente linoléico e linolênico e aumenta a abundância relativa
do ácido graxo monoinsaturado oléico.
No entanto, a hidrogenação parcial de óleos leva à produção de ácidos graxos
trans (YADAV, 1996). Esses isômeros trans podem constituir mais de 40% do total
de ácidos graxos do óleo de soja tratado quimicamente e têm sido relacionados,
3
juntamente com o ácido palmítico, com a elevação dos níveis de LDL-colesterol
sanguíneo e com a diminuição dos níveis de HLD-colesterol no plasma, aumentando
o risco de doenças cardiovasculares (MENSINK & KATAN, 1990).
Dessa forma, uma estratégia seria substituir os óleos hidrogenados na
indústria de alimentos por gorduras e óleos que sejam funcionais e nutricionalmente
benéficos (LIU et al.; 2002a; LIU et al.; 2002b). A modificação da composição dos
óleos vegetais pode ser realizada por meio de técnicas de melhoramento tradicional
ou com o auxílio de ferramentas da biotecnologia (KINNEY, 1996, WU et al., 2005).
A Engenharia Genética, associada às técnicas de melhoramento tradicional,
possibilita que genes de qualquer organismo sejam isolados em laboratório e
transferidos a outro organismo, quebrando a barreira intra-específica e levando ao
desenvolvimento de novas variedades (NODARI & GUERRA, 2001).
A possibilidade de produzir vegetais transgênicos favoreceu o progresso de
várias áreas da biologia celular vegetal, abrindo muitas possibilidades na agricultura.
Com essa tecnologia, é possível não só modificar a qualidade de lipídios, mas
também de amido e proteínas armazenadas em sementes, além de conferir a
determinados vegetais, resistência a fungos, vírus, insetos ou tolerância a herbicidas
(DUNWELL, 2000).
Um mecanismo que vem sendo empregado para a obtenção de soja com
características de interesse é a modificação genética de enzimas da biossíntese de
ácidos graxos por meio de transformação genética de plantas (TANG & GALILI,
2004).
A transformação genética de plantas via silenciamento gênico representa uma
ferramenta poderosa, permitindo que os melhoristas manipulem a composição de
produtos de plantas. Em sementes oleaginosas, isso estendeu significativamente a
capacidade para alcançar alterações principais nas proporções relativas dos ácidos
graxos presentes no óleo, com a finalidade de melhorar o seu valor nutricional sem
comprometer sua funcionalidade (PASSOS-LIMA, 2005).
2.1. Ácido-graxo dessaturases
Em soja, a biossíntese de ácidos graxos inicia-se com a formação dos ácidos
palmítico (C16:0), esteárico (C18:0) e oléico (C18:1) em uma seqüência de reações
catalisada pela ácido graxo sintase. Este complexo multienzimático tem como
4
função adicionar unidades de dois carbonos a cada ciclo até formar o palmitoil-ACP
(YADAV, 1996). Para a elongação do palmitoil-ACP a estearoil-ACP a enzima
requerida é a β-cetoacil sintase II e a para a conversão do estearoil-ACP em oleoil-
ACP a enzima necessária é a estearoil-ACP dessaturase ou ω-9 dessaturase
(SOMERVILLE & BROWSE, 1991). Uma vez sintetizados nos plastídios, eles
podem ser exportados para o citosol associados à proteína carreadora de grupos acil
(ACP) e serem utilizados na produção do óleo de reserva e lipídios estruturais de
membranas extracloroplastídicas (YADAV, 1996).
A biossíntese de ácidos graxos insaturados é catalisada por enzimas
denominadas ácido-graxo dessaturases. O principal substrato dessas dessaturases
microssomais é a fosfatidilcolina, sendo a via do retículo endoplasmático
predominante durante a biossíntese do óleo em sementes em desenvolvimento e em
outros tecidos não-fotossintetizantes (HEPPARD et al., 1996; YADAV, 1996).
Ácido-graxo dessaturases são enzimas que catalisam a introdução de duplas
ligações na porção hidrocarbônica dos ácidos graxos (KINNEY et al., 2002). As
ácido-graxo dessaturases estão diretamente relacionadas com a habilidade das células
5
Ácido
graxo
sintase
PLASTÍDIO
kas2 ω-9 dessat
16:0-ACP → 18:0-ACP → 18:1-ACP
16:0-GL → 16:1-GL → 16:2-GL → 16:3-GL
ω-9 dessat ω-6 dessat ω-3 dessat
DAG → 18:1-GL → 18:2-GL → 18:3-GL
RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
G3P
LPAAT
G3PAT
Pool de
Acil-CoA
TEs
LPCAT
TAG (óleo)
G3P
G3PAT
DAGAT
LPAAT PAP CPT ω-6 dessat ω-3 dessat
LPA → PA →DAG ↔ 18:1-PC → 18:2-PC → 18:3-PC
em modular as características físicas das membranas celulares, pois a introdução de
um número apropriado de insaturações em ácidos graxos de glicerolipídios de
membrana diminui a temperatura de fusão e provê membranas com a fluidez
necessária (HAZEL, 1995; MURATA et al., 1995).
Em plantas, a reação catalisada pela oleoil dessaturase (ϖ-6 dessaturase) é a
rota primária para a produção de lipídios polinsaturados (HEPPARD et al., 1996). O
gene Fad2-2 que codifica a oleoil dessaturase é responsável pela produção de ácidos
graxos polinsaturados, incluindo os lipídios de membrana tanto em tecidos vegetais
quanto em sementes em desenvolvimento. O gene Fad2-1 semente-específico parece
ter um papel mais importante na conversão do ácido oléico em linolênico, incluindo
os lipídios de armazenamento, durante o desenvolvimento da semente (HEPPARD et
al., 1996).
Heppard et al. (1996) mostraram uma relação inversa entre o aumento no teor
de ácidos graxos polinsaturados de sementes de soja e a diminuição da temperatura,
embora a expressão dos genes Fad2-1 e Fad2-2 não tenha sido influenciada por
alteração da temperatura, demonstrando que as dessaturases são reguladas pós-
traducionalmente.
Cada ácido-graxo dessaturase introduz uma ligação insaturada numa posição
específica da cadeia carbônica do ácido graxo depois de sua incorporação à molécula
de lipídio. A primeira reação de dessaturação é catalisada pela estearoil-CoA
dessaturase plastidial para produzir o ácido oléico (18:1∆
9
). A partir deste, são
produzidos os ácidos graxos polinsaturados por meio de sucessivas dessaturações. A
primeira delas é catalisada pela oleoil-CoA dessaturase (ω-6 dessaturase) plastidial e
microssomal, que introduz uma insaturação no ácido oléico para produção do ácido
linoléico (18:1∆
9,12
). Um nova insaturação é introduzida pela linoleil-CoA
dessaturase (ω-3 dessaturase) plastidial e microssomal ao ácido linoléico para a
produção do ácido linolênico (18:3∆
9,12,15
) (HEPPARD et al., 1996).
Através da redução da expressão do gene Fad2-1 por co-supressão, RNA
antisense ou RNA interference foram obtidos óleos com elevados níveis de ácido
oléico (18:1), dentre eles, óleo de soja (KINNEY, 1996; BUHR et al., 2002;
KINNEY et al., 2002), canola (KINNEY et al., 2002; STOUTJESDIJK et al, 2002;
WU et al., 2005), algodão (LIU et al., 2000; LIU et al., 2002a) e milho (KINNEY et
al., 2002).
6
2.2. 1,2-diacilglicerol colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina aciltransferase
As enzimas 1,2-diacilglicerol colinafosfotransferase (CPT) e
lisofosfatidilcolina aciltransferase (LPCAT) também atuam na biossíntese de lipídios
no retículo endoplasmático. A CPT tem a função de converter reversivelmente
diacilglicerol (DAG) em fosfatidilcolina para a formação de lipídios de membrana e a
LPCAT tem a função de repor o estoque de ácidos graxos polinsaturados do pool de
acil-CoA no citoplasma (YADAV, 1996).
Em relação aos ácidos graxos polinsaturados, os níveis de C18:2 e de C18:3
no óleo dependem das taxas de biossíntese e de suas disponibilidades para a
biossíntese do óleo. Essa disponibilidade de ácidos graxos polinsaturados para a
incorporação em triacilgliceróis de reserva pode se dar por meio de dois mecanismos:
(1) reação reversível da CPT, a qual converte fosfatidilcolina contendo ácidos graxos
em DAG, que por sua vez, pode ser utilizado para a biossíntese de óleo via
diacilglicerol aciltransferase e (2) reação reversível da LPCAT levando ao
enriquecimento do pool de acil-CoA com ácidos graxos polinsaturados para uso na
biossíntese do óleo (YADAV, 1996).
A permuta de grupamentos acil entre grupamentos acil-CoA e fosfatidilcolina
representa o mecanismo predominante na regulação da qualidade de ácidos graxos
polinsaturados no pool de acil-CoA para a síntese do óleo, em sementes em
desenvolvimento (LANNA, 2002).
No caso do metabolismo de lipídios, o isolamento de um gene chave que
dirige a síntese de um ácido graxo particular, pode fornecer o meio para se alterar,
geneticamente, espécies oleaginosas de interesse econômico (PASSOS-LIMA, 2005).
2.3. Silenciamento gênico
O silenciamento gênico consiste na repressão da expressão de um gene alvo
(VAUCHERET et al., 2001), pela inibição da transcrição ou pela destruição do
transcrito (TANG & GALILI, 2004).
O silenciamento gênico é um mecanismo autômato, ou seja, pode ser
induzido localmente e pode se espalhar para distantes locais no organismo
(HAMILTON et al., 2002). Esse transporte sistêmico do sinal do silenciamento está
relacionado com um sinal móvel, não metabólico, não completamente identificado.
7
Esse sinal parece interagir com proteínas de membranas e vai movendo-se célula a
célula através do floema, semelhante ao padrão de infecção de vírus na planta
(MLOTSHWA et al., 2002).
O silenciamento gênico tem como função principal regular a expressão
gênica, controlando o número de cópias de determinado gene ou, ainda, ser um
mecanismo de defesa contra a superexpressão de transgenes (WASSENEGER,
2000). O silenciamento parece estar envolvido com a defesa a ácidos nucléicos
estranhos, com a proteção do genoma contra a inserção de elementos transponíveis,
contra vírus e com a regulação da expressão gênica de famílias multigênicas ou de
genes duplicados em plantas (VENDRUSCOLO, 2003; GROENENBOOM et al.,
2005).
O silenciamento gênico corresponde a uma interação entre seqüências
homólogas de DNA ou RNA. O RNA está envolvido nos seguintes tipos de
silenciamento gênico dependente de homologia (SGDH): (1) PTGS (silenciamento
gênico pós-transcricional), onde a degradação de RNAs homólogos no citoplasma
leva a não tradução do gene alvo e (2) TGS (silenciamento gênico transcricional),
que está relacionado com o bloqueio na transcrição do gene alvo promovido por
metilação na região promotora, a nível nuclear (FAGARD & VAUCHERET, 2000;
WASSENEGGER, 2000).
Uma grande vantagem do PTGS é a possibilidade de se evitar efeitos
indesejáveis do silenciamento total do gene-alvo, restringindo o silenciamento gênico
a um tecido ou a um órgão específico na planta, pela utilização de um promotor
tecido-específico para dirigir a construção gênica (KINNEY, 1996; BUHR et al.,
2002; TANG & GALILI, 2004).
Segundo Singh (2000), o PTGS tem sido utilizado na modificação da
composição lipídica das sementes oleaginosas de soja, canola e girassol. Ele pode ser
induzido pela utilização de RNA antisense, por co-supressão (sense) ou através de
construções que expressam um RNA hairpin autocomplementar (SINGH, 2000; LIU,
2002b).
Das metodologias de silenciamento gênico induzido por RNA dupla fita
(dsRNA), a técnica de RNA interference é a mais eficiente (SMITH, 2000).
8
2.4. Silenciamento gênico por RNA de interferência
A primeira evidência do silenciamento gênico por RNA interference remete a
estudos com o nematóide Caenorhabditis elegans e a utilização de RNA antisense
para diminuir a expressão do gene par-1, que é responsável por estabelecer a
polaridade e a divisão assimétrica de embriões de C. elegans, garantindo a
diversidade das células durante o desenvolvimento (GUO & KEMPHUES, 1995).
Em um estudo semelhante, Fire et al. (1998), utilizaram um dsRNA (fita
sense e antisense) também em C. elegans e verificaram que o silenciamento
demonstrou-se muito mais eficiente do que quando se utilizou cada fita isoladamente
e que poucas moléculas eram eficientes para silenciar completamente a expressão do
gene homólogo.
A técnica de RNA interference (RNAi) é um mecanismo de silenciamento de
genes ao nível pós-transcricional, capaz de diminuir a expressão de genes de
interesse em uma variedade de organismos (HAMMOND et al., 2001). Ela se
caracteriza pela clonagem do gene alvo como repetições invertidas, espaçadas por
uma seqüência não relacionada (íntron ou região UTR do próprio gene) e dirigida por
um promotor forte (SINGH, 2000, LIU et al., 2002b). Segundo Tang & Galili (2004),
essa técnica tem demonstrado bons resultados, além de apresentar vantagens em
termos de eficiência e estabilidade com relação às técnicas de silenciamento por co-
supressão ou RNA antisense.
O mecanismo de RNAi é ativado por uma molécula de dsRNA que leva à
degradação de genes homólogos, podendo ocorrer tanto em plantas quanto animais
(KUSABA, 2004; TANG & GALILI, 2004). Nas plantas, o silenciamento gênico por
RNAi funciona como um mecanismo de defesa, além de participar na regulação da
expressão de genes durante os processos de desenvolvimento (YU & KUMAR,
2003).
Em plantas, quando um dsRNA transgênico, contendo seqüências invertidas,
é gerado e assume a estrutura de grampo, ele é reconhecido por uma enzima
denominada DCL 2 (Dicer-like 2) (JONES-RHOADES et al., 2006) e clivado em
pequenos (21-22 nucleotídeos) e longos (24-26 nucleotídeos) siRNAs, que são os
pequenos RNAS de interferência (small interfering RNAs) (ZAMORE, 2004).
Dicer são enzimas altamente conservadas, compostas de dois domínios modulares de
RNAse III, um domínio de helicase, um domínio PAZ de provável transferência de
9
substrato, um domínio de função desconhecida (DUF283) e um motivo de ligação a
RNA fita-dupla (BERNSTEIN et al., 2001). A Dicer atua de forma dimérica
(HANNON, 2002), e processa dsRNAs em pequenos siRNAs de 21-23 nucleotídeos
de tamanho, dependendo da espécie. Após serem originados, os siRNAs são
metilados e transportados para o citosol, por meio de uma proteína transportadora
HASTY de maneira Ran-dependente (JONES-RHOADES et al., 2006). Esses
siRNAs são correspondentes às fitas sense e antisense do RNA alvo, se associam a
proteínas celulares formando o complexo de indução de silenciamento (RISC – RNA
Interference Specificity Complex) e induzem a clivagem e posterior degradação do
mRNA alvo (WATERHOUSE & HELLIWELL, 2002; YU & KUMAR, 2003;
TANG & GALILI, 2004; MEINS et al., 2005). RISCs são complexos
ribonucleoprotéicos que contêm membros da família das proteínas Argonautas (com
domínios PAZ-PIWI), siRNAs e mRNAs complementares; além de muitos outros
fatores importantes para a sua funcionalidade (HANNON, 2002). As proteínas da
família das Argonautas parecem garantir a especificidade do RISC e, juntamente com
outras proteínas e enzimas existentes no complexo, determinam a especificidade da
resposta a um siRNA particular.
É provável que o domínio PAZ das Argonautas esteja relacionado à ligação
aos miRNAs (microRNAs) ou siRNAs gerados ou liberados pela Dicer (SONG et
al., 2003). Os miRNAs são pequenos RNAs endógenos não codificados, derivados
de longos transcritos precursores (MALLORY & VAUCHERET, 2004). Eles adotam
uma estrutura de loop, apresentam característica de dupla fita e funcionam como
siRNAs marcando mRNAs específicos para a clivagem (TANG & GALILI, 2004). O
domínio PIWI das Argonautas parece interagir com e inibir os domínios de RNAse
III e de ligação a dsRNA da Dicer. Isto foi interpretado como uma interação de
transferência de substrato e, ainda é especulado, que as interações do domínio PIWI
com a Dicer estimularia a liberação dos siRNAs (TAHBAZ et al., 2004). Após sua
incorporação ao complexo RISC, o mRNA alvo é clivado em um único ponto e
liberado, ficando exposto ao ataque de endonucleases endógenas.
Um siRNA incorporado ao complexo RISC pode ser utilizado em novos
ciclos de reconhecimento e clivagem, o que protege esta molécula de uma rápida
degradação (HUTVAGNER et al., 2001); mas é improvável que os siRNAs sejam
reciclados após serem liberados do complexo RISC (NELSON et al., 2004).
10
Em plantas e C. elegans, uma amplificação do sinal de silenciamento e a sua
transferência célula-a-célula têm sido observadas e RNA polimerases dependentes de
RNA (RdRp) foram encontradas (BUSHMAN, 2003). Essa enzima é responsável
pela geração e amplificação de siRNAs em dsRNAs. Estes siRNAs são usados como
primers pela RdRp para a geração de novos dsRNAs que servem como novos alvos
para a Dicer para a produção de mais siRNAs. Graças a este sistema, nesses
organismos, um número específico de moléculas de dsRNAs pode inativar várias
cópias de transcritos endógenos (AHLQUIST, 2002). Além do sistema de
amplificação do sinal, existe também um sistema de transmissão de sinal célula-a-
célula conhecido como supressão sistêmica. Em plantas, o movimento do sinal
móvel, ainda desconhecido, pode ser realizado por meio dos plasmodesmos e/ou via
floema (HANNON, 2002).
11
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
O presente trabalho teve como objetivo geral isolar fragmentos de cDNA dos
genes que codificam três enzimas da biossíntese de ácidos graxos em soja, oleoil
dessaturase, 1,2-diacilglicerol colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina
aciltransferase, para a construção de cassetes de expressão, visando o silenciamento
via RNA de interferência.
3.2. Objetivos específicos
Os objetivos específicos deste trabalho foram:
Desenhar primers sense e antisense para os genes das enzimas oleoil
dessaturase, 1,2-diacilglicerol colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina
aciltransferase.
Isolar os fragmentos dos genes a partir de cDNA de sementes de soja.
Clonar os fragmentos gênicos na orientação sense e antisense no vetor
pKANNIBAL.
Substituir o promotor 35SCaMV do vetor pKANNIBAL pelo promotor do
gene da subunidade α da β-conglicinina.
Transformar células de Escherichia coli e analisar os clones transformantes.
Transferir os cassetes de expressão para o vetor binário pCAMBIA 3301.
12
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Material vegetal
Foram utilizadas sementes de soja da variedade comercial CAC-1 cultivada
em casa de vegetação sob aquecimento controlado e fotoperíodo de 14 horas de luz.
As sementes utilizadas para a extração do RNA total foram relativas ao
segundo estádio de desenvolvimento do grão. Os estádios foram determinados com
base no peso de matéria fresca da semente: 1º– 0 a 75 mg; 2º– 76 a 150 mg; 3º– 151 a
225 mg; 4º– 226 a 300 mg; 5º– 301 a 375 mg; 6º– 376 a 450 mg; 7º– 451 a 525 mg e
8º– representado por sementes maduras (LANNA, 2002) e compreenderam quase
todo período de enchimento do grão. As sementes foram coletadas, congeladas em
nitrogênio líquido e armazenadas a -80ºC.
4.2. Extração de RNA total de sementes de soja
A extração do RNA total das sementes foi realizada de acordo com
SAMBROOK et al. (1989), com algumas alterações ao protocolo original. Todas as
etapas foram conduzidas a 4ºC e em condições livres de RNases. Foram macerados
cerca de 4 g de sementes na presença de nitrogênio líquido e a cada amostra foram
adicionados 18 mL de tampão NTES (NaCl 0,1 M; Tris-HCl 0,01 M, pH 7,5; EDTA
1mM e SDS 1%), 6 mL de fenol e 6 mL de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). Os
tubos foram agitados vigorosamente em agitador vórtex por 15 min e centrifugados a
4
o
C por 10 min a 8.000 g. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e nele foi
adicionado 1/10 do volume de acetato de sódio 2M e 2 volumes de etanol 96% e, em
seguida, a mistura foi incubada por 1 h a –20ºC. Foi realizada uma nova
centrifugação a 8.000 g por 15 min e o precipitado resultante foi lavado com etanol
70% e ressuspendido em 2,5 mL de água DEPC (água deionizada tratada com dietil
pirocarbonato). Após uma centrifugação de 5 min a 5.000 g, o sobrenadante foi
transferido para novo tubo onde foram adicionados 2,5 mL de cloreto de lítio 4M. O
tubo foi incubado por cerca de 12 h a 4ºC para promover a precipitação do RNA. A
amostra foi então centrifugada a 8.000 g por 30 min e o precipitado foi ressuspendido
em 1,8 mL de água DEPC e acrescido de 0,2 mL de acetato de sódio 2M e 3,6 mL de
etanol 96%. Após precipitação por cerca de 6 h a -20
o
C, a solução foi centrifugada a
13
8.000 g por 10 min e em seguida, o precipitado foi lavado em etanol 70% e depois de
seco, ressuspendido em água DEPC.
As amostras de RNA total foram quantificadas a 260 nm e a sua integridade
foi avaliada por eletroforese em gel de agarose 1,5% em tampão de corrida TBE 1X
(Tris-Borato 90mM e EDTA 1mM, pH 8,0) contendo 0,2 μg/mL de brometo de
etídeo. O padrão de bandas do RNA foi visualizado sob luz ultravioleta e fotografado
com o sistema de fotodocumentação Eagle Eye II (STRATAGENE).
4.3. Síntese de cDNA por RT-PCR
Para as reações de RT-PCR, todas as amostras foram tratadas com RQ1
RNase-free DNase (PROMEGA), conforme as recomendações do fabricante. As
amostras foram incubadas em tampão da DNase 1X (Tris-HCl 40 mM, pH 8,0;
MgS0
4
10 mM e CaCl
2
1 mM) por 45 min a 37
o
C e extraídas com igual volume de
fenol e de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) após centrifugação a 11.000 g por 2
min a 4ºC. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e realizada uma outra
extração com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). A fase aquosa foi submetida à
precipitação com acetato de sódio 3M e etanol 96% por 1 h a -20ºC e depois
centrifugada a 12.000 g por 15 min. O precipitado foi lavado com etanol 70%, seco e
ressuspendido em água DEPC. As amostras foram novamente quantificadas em
espectrofotômetro.
A primeira fita de cDNA foi sintetizada usando o kit SuperScript™ First-
Strand Synthesis System (INVITROGEN) de acordo com as recomendações do
fabricante. As amostras de RNA total (5 μg) foram incubadas com 1 μL de oligo (dT)
12-18
a 70ºC por 10 min e em seguida, incubadas no gelo. Foram adicionados tampão
de PCR 1X (Tris-HCl 20 mM, pH 8,4 e KCl 50 mM), MgCl
2
5 mM, os quatro
desoxirribonucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 0,5 mM cada e DTT 5 mM, e
estas foram incubadas a 42ºC por 5 min. Em seguida, foram adicionadas 200 U da
enzima transcriptase reversa e as amostras foram incubadas a 42ºC por 50 min e a
70ºC por 15 min. Após a síntese da primeira fita de cDNA, o RNA foi degradado
pela adição de 2 U de RNAse H sob incubação a 37ºC por 20 min. Para cada amostra
foi feito um controle negativo que continha todos os reagentes exceto a transcriptase
reversa.
14
Inicialmente, as reações de síntese da segunda fita e amplificação por PCR
foram realizadas com um par de primers de actina de soja (F 5’ – CCC CTC AAC
CCA AAG GTC AAC AG – 3’ e R 5’ – GGA ATC TCT CTG CCC CAA TTG TG –
3’) com a finalidade de verificar possíveis contaminações com DNA genômico e
normalizar a quantidade de cDNA molde.
4.4. Análise das seqüências gênicas para escolha dos sítios de restrição e desenho
dos primers
A seqüência de nucleotídeos do cDNA total correspondente aos genes que
codificam as enzimas microssomais oleoil dessaturase e 1,2-diacilglicerol
colinafosfotransferase de Glycine max (números de acesso L43920 e U12735,
respectivamente), foram obtidas em um banco de dados público GenBank (National
Center for Biotechnology Information – NCBI). Como a seqüência de nucleotídeos
do cDNA total correspondente ao gene que codifica a enzima microssomal
lisofosfatidilcolina aciltransferase de Glycine max não se encontra depositada em
banco de dados, esta foi obtida através de um contig formado por ESTs (Expressed
Sequence Tags) de soja. A formação deste contig foi realizada pelo Dr. Eliseu
Binneck, pesquisador da Embrapa Soja (CNPSO) e gentilmente cedido por ele. As
seqüências foram analisadas pelo BLAST (www.worchbench.sdsc.edu).
Os primers específicos foram desenhados com o auxílio do programa
Primer3 Input Program (http://www.genome.wi.mit.edu//cgi-
bin/primer/primer3.cgi). Os sítios de restrição compatíveis para as clonagens foram
adicionados a extremidade 5’ de cada par antecedidos por uma cauda GGC. Para os
fragmentos sense foram utilizados os sítios de restrição das enzimas XhoI e KpnI e
para os fragmentos antisense, os sítio de BamHI e ClaI. A viabilidade dos primers foi
verificada por meio do programa QuickPrimer do pacote DNASTAR (DNASTAR
INC.). As seqüências dos primers estão mostradas a seguir:
15
Dessaturase sense:
F: 5’ – GGC CTC GAG CAC AAA GCC ACC ATT CAC TG – 3’
R: 5’ – GGC GGT ACC AGG GAA CCT GTG TTG GAG TG – 3’
Dessaturase antisense:
F: 5’ – GGC GGA TCC CAC AAA GCC ACC ATT CAC TG – 3’
R: 5’ – GGC ATC GAT AGG GAA CCT GTG TTG GAG TG – 3’
LPCAT sense:
F: 5’ – GGC CTC GAG TTG AAA ATT GAA GCG GGT TG – 3’
R: 5’ – GGC GGT ACC TTT TGG TGT TGA CCC TCC AG – 3’
LPCAT antisense:
F: 5’ – GGC GGA TCC TTG AAA ATT GAA GCG GGT TG – 3’
R: 5’ – GGC ATC GAT TTT TGG TGT TGA CCC TCC AG – 3’
CPT sense:
F: 5’ – GGC CTC GAG GTG CAA CCT GGG AGC ATT AT – 3’
R: 5’ – GGC GGT ACC GTG GCA TGC TTC CAT TCT TT – 3’
CPT antisense:
F: 5’ – GGC GGA TCC GTG CAA CCT GGG AGC ATT AT – 3’
R: 5’ – GGC ATC GAT GTG GCA TGC TTC CAT TCT TT – 3’
As letras destacas em negrito e sublinhadas nos primers forward e reverse
para a orientação sense indicam os sítios de restrição das enzimas XhoI, KpnI,
respectivamente, e as letras destacas em negrito e sublinhadas nos primers forward e
reverse para a orientação antisense indicam os sítios de restrição das enzimas BamHI
e ClaI, respectivamente. Os nomes dos genes foram abreviados para simplificar a
denominação dos primers.
4.5. Teste dos primers para estabelecimento das condições de amplificação
Os fragmentos dos três genes foram amplificados por meio de reações de
síntese da segunda fita de cDNA sintetizado a partir do RNA total. Cada reação de
16
amplificação continha 2μL da reação de síntese da primeira fita, Tris-HCl 10 mM
pH8.3, KCl 50 mM, MgCl
2
2,0 mM, os quatro dNTPs, 0,2 mM cada, 5,0 μM de
primers e 1 U de Taq DNA polimerase (PHONEUTRIA), apresentando um volume
total de 25 μL de reação.
As reações de amplificação foram realizadas em um gradiente de temperatura,
com as temperaturas de anelamento variando de 55 a 66ºC, em um aparelho
termociclador do tipo Robocycler Gradient 96 (STRATAGENE). Os ciclos de
amplificação foram constituídos por uma etapa inicial de desnaturação a 94°C por 2
min, seguida de 35 ciclos constituídos por: uma etapa de desnaturação a 94ºC por 30
s, uma etapa de anelamento dos primers ao cDNA molde que variou de 55 a 66°C
por 30 s e uma etapa de extensão a 72°C por 45 s. Posteriormente, foi realizada uma
última etapa de extensão a 72°C por 4 min.
Os produtos de amplificação foram analisados por eletroforese em gel de
agarose 0,8%, em tampão TBE 1X contendo 0,2 μg/mL de brometo de etídeo. O
padrão de bandas do DNA foi visualizado sob luz ultravioleta, por meio do sistema
Eagle Eye II (STRATAGENE) e fotodocumentado.
4.6. Isolamento dos fragmentos gênicos e clonagem em vetor pGEM T-Easy
Os fragmentos sense e antisense dos três genes específicos foram isolados
através de reações de síntese da segunda fita da cDNA sintetizado a partir do RNA
total, seguindo as mesmas condições descritas anteriormente.
Para as reações de amplificação foi utilizado aparelho termociclador Perkin-
Elmer, modelo 9600 (APPLIED BIOSYSTEMS). Os ciclos de amplificação foram
constituídos por uma etapa inicial de desnaturação a 94°C por 2 min, seguida de 35
ciclos constituídos por: uma etapa de desnaturação a 94ºC por 30 s, uma etapa de
anelamento dos primers a 64°C por 30 s e uma etapa de extensão a 72°C por 45 s.
Posteriormente, foi realizada uma última etapa de extensão a 72°C por 4 min.
Após a amplificação, os seis produtos foram analisados por eletroforese em
gel de agarose 0,8%, em tampão TBE 1X contendo 0,2 μg/mL de brometo de etídeo.
O padrão de bandas do DNA foi visualizado sob luz ultravioleta, por meio do sistema
Eagle Eye II (STRATAGENE) e fotodocumentado.
17
Os produtos de PCR, após a confirmação da amplificação, foram purificados
por meio do kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN), para posterior clonagem em
vetor pGEM T-Easy (PROMEGA), de acordo com as recomendações do fabricante.
4.7. Transformação de Escherichia coli por choque térmico e diagnóstico de
colônias
As células de E. coli DH5α foram transformadas por choque térmico de
acordo com SAMBROOK et al. (1989). Foram adicionados 5 μL da reação de
ligação a 200 μL de células ultracompetentes em um microtubo e este foi incubado
por 30 min no gelo. Após o choque térmico a 42ºC por 45 s, as células foram
mantidas no gelo por 2 min e, em seguida, foram adicionados 800 μL de meio SOC
(extrato de levedura 0,5%, triptona 2%, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl
2
10 mM,
MgSO
4
10 mM e glicerol 10%). Após a incubação a 37ºC por 1 h a 150 rpm, as
células foram concentradas por centrifugação a 1500 g por 10 min em centrífuga
5415D (EPPENDORF), ressuspendidas em 200 μL de meio SOC, dos quais 100 μL
foram plaqueados em meio LB (10% de Bactotriptona, 5% de extrato de levedura,
10% de NaCl) contendo ampicilina 50 μg/μL, 1 mg de X-Gal e 10 mM de IPTG. As
placas foram incubadas por cerca de 14 h a 37ºC.
Para cada uma das seis transformações foi feita a seleção de 10 colônias
aleatoriamente e o diagnóstico para a confirmação da transformação foi feito por
meio de PCR seguindo as mesmas condições descritas anteriormente.
Em seguida, foi realizada corrida eletroforética em gel de agarose 0,8%, em
TBE 1X, com brometo de etídio 0,2 µg/mL. Após a eletroforese, foi utilizado o
sistema Eagle Eye II (STRATAGENE) para a visualização e fotodocumentação do
gel.
Os clones positivos foram selecionados e transferidos para tubos contendo
meio LB e ampicilina 50 μg/μL e incubados a 37ºC e 180 rpm por cerca de 14 h.
Decorrido este intervalo, foi retirada uma alíquota das culturas bacterianas e
armazenadas a -80ºC, em glicerol 40%. O restante foi utilizado para a extração do
DNA plasmidial, através do kit comercial (Kit Wizard Plus SV Minipreps DNA
Purification System - PROMEGA), de acordo com as recomendações do fabricante,
que foi utilizado para os procedimentos subseqüentes.
18
4.8. Seqüenciamento do DNA
O seqüenciamento dos clones positivos foi realizado em seqüenciador
automático ABI PRISM 377 Genetic Analyzer (PE APPLIED BIOSYSTEMS),
utilizando o kit ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction.
As reações basearam-se na técnica de terminação de cadeia por dideoxinucleotídeos
(ddNTPs), descrita por SANGER et al. (1977).
As reações foram conduzidas por meio de amplificação linear por PCR,
utilizando os primers específicos forward e reverse de cada gene.
As seqüências obtidas foram comparadas com seqüências disponíveis no
GenBank e o alinhamento foi feito usando o BLAST (ALTSCHUL et al., 1997).
4.9. Subclonagem dos fragmentos específicos em vetores pKANNIBAL
Após o seqüenciamento e a confirmação dos fragmentos clonados, estes
foram excisados do vetor pGEM T-Easy para serem clonados no vetor pKANNIBAL
(WESLEY et al., 2001) de 6.063 pb, gentilemente cedido pelo Dr. Francisco Aragão
(EMBRAPA/CENARGEN). Este vetor contém, além do promotor 35SCaMV, a
região de clonagem para a seqüência sense, o íntron do gene que codifica a piruvato
desidrogenase quinase (PDK), a região de clonagem da seqüência antisense e o
terminador do gene que codifica a octopina sintase (OCS). A marca de seleção deste
plasmídeo é o gene npt, cujo produto confere resistência à canamicina.
19
Not I (5819)
Not I (2859)
Xba I
Bam HI
Hind I
Cla I
Kpn I
Eco RI
Xho I
Gene de
resist cia �
canamicina�
Promotor
35SCaMV
�tron PDK
Terminador OCS
779 pb
793 pb
1365 pb
pKANNIBAL
6.063 pb
Para as reações de restrição enzimática foram utilizadas as enzimas XhoI e
KpnI para a clivagem dos fragmentos sense e BamHI e ClaI para a clivagem dos
fragmentos antisense.
Os vetores pKANNIBAL foram clivados com as mesmas enzimas de restrição
utilizadas para clivar os fragmentos, para que ficassem com os mesmos sítios de
clonagem e fosse possível realizar as reações de ligação.
A subclonagem dos fragmentos ocorreu em duas etapas. Primeiro foram
subclonados os fragmentos antisense e, após a confirmação destes por PCR e
restrição enzimática, foram subclonados os fragmentos sense.
A clivagem dos vetores pGEM T-Easy que continham os fragmentos
antisense e do vetor pKANNIBAL fechado foi realizada com 5 U da enzima ClaI,
aproximadamente 500 ng de DNA e tampão de clivagem 1X (Tris-HCl 50 mM, pH
8,0; MgCl
2
10 mM) a 37ºC por 1 h. Para a realização da segunda reação de clivagem,
foi adicionado um volume de NaCl 0,5 M para que a concentração desse sal no
tampão fosse de 100 mM e em seguida, 5 U da enzima BamHI. A reação foi mantida
a 37ºC por 1 h.
As reações de clivagem foram analisadas em gel de agarose 0,8%, em TBE
1X, com brometo de etídio 0,2 µg/mL, os fragmentos clivados foram purificados do
gel com o kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) e utilizados para a subclonagem
nos vetores pKANNIBAL aberto para construção dos cassetes.
As reações de ligação foram feitas para um volume final de 10 μL, utilizando
a relação de 5:1 de DNA (50 ng) e vetor (10 ng), tampão de reação (Tris-HCl pH 7,6,
MgCl
2
10 mM, ATP 1 mM, DTT 1 mM e 25% de polietileno glicol-8000) e 1 U de
T4 DNA ligase (INVITROGEN). As reações foram mantidas a 4ºC por 14 h.
Em seguida, foi realizada transformação de E. coli por choque térmico,
diagnóstico das colônias e extração do DNA plasmidial, conforme descrito no item
3.7, com exceção da etapa final da transformação, na qual as células foram
plaqueadas em meio LB sólido contendo canamicina 50 μg/μL.
Para a subclonagem dos fragmentos sense, foi feita a clivagem dos vetores
pGEM T-Easy que continham os fragmentos antisense e dos vetores pKANNIBAL
com os braços sense fechado. Essa etapa foi realizada com 5 U da enzima XhoI,
aproximadamente 500 ng de PCR e tampão de clivagem 1X (Tris-HCl 50 mM, pH
8,0; MgCl
2
10 mM e NaCl 50 mM) a 37ºC por 1 h. Em seguida, foi feita a
20
precipitação por cerca de 1 h a -80ºC com 10% de acetato de sódio 3M e 1 volume de
etanol 96% gelado. Seguiu-se com centrifugação a 13.000g por 15 min e o DNA
precipitado foi lavado com etanol 70% e centrifugado por mais 5 min, sob mesma
rotação. O DNA precipitado foi seco à temperatura ambiente e ressuspendido em
água. Em seguida, foi realizada a segunda reação de restrição, com 5 U da enzima
KpnI e tampão de clivagem 1X (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4; MgCl
2
5,0 mM) a 37ºC
por 1 h.
As reações de clivagem, purificação, ligação, transformação de E. coli e
diagnóstico das colônias foram realizadas seguindo as mesmas condições descritas
para a subclonagem dos fragmentos antisense. A confirmação da clonagem foi
realizada por meio de reações de restrição enzimática e por PCR.
4.10. Nomenclatura dos clones com os fragmentos sense e antisense em vetores
pKANNIBAL
Os clones que continham os fragmentos sense e antisense foram denominados
de acordo com o promotor utilizado (35SCaMV) e o gene de interesse para o
silenciamento. Dessa forma, a nomenclatura utilizada foi a seguinte: p35S
Dessaturase RNAi, p35S CPT RNAi e p35S LPCAT RNAi, para os genes referentes
à oleoil dessaturase, 1,2-diacilglicerol colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina
aciltransferase.
4.11. Transferência das construções dos vetores pKANNIBAL para os vetores
pCAMBIA 3301
Após a confirmação da clonagem dos fragmentos sense e antisense, as
construções (promotor 35SCaMV+ fragmento sense + íntron PDK+ fragmento
antisense + terminador OCS) foram excisadas do vetor pKANNIBAL e,
posteriormente, clonadas no vetor binário pCAMBIA 3301. Esse vetor possui
11.307pb, contém uma região de T-DNA (5.077 pb) e apresenta o promotor
35SCaMV dirigindo a expressão do gene gus (que codifica a β-glucuronidase), o
terminador do gene que codifica a nopalina sintase (NOS), além do gene bar para a
seleção em plantas. Esse gene codifica a enzima fosfonitricina acetiltransferase, que
21
confere resistência a herbicidas que contenham glufosinato de amônio como
composto ativo.
A clivagem para a liberação das construções e abertura do vetor pCAMBIA
3301 foi realizada com 5 U da enzima PstI, aproximadamente 500 ng de DNA e
tampão de clivagem 1X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; MgCl
2
10 mM e NaCl 50 mM) a
37ºC por 1 h. Em seguida, foi feita a precipitação por cerca de 1 h a -80ºC com 10%
de acetato de sódio 3 M e 1 volume de etanol 96% gelado. Seguiu-se com
centrifugação a 13.000g por 15 min e o DNA precipitado foi lavado com etanol 70%
e centrifugado por mais 5 min, sob mesma rotação. O DNA precipitado foi seco à
temperatura ambiente e ressuspendido em água. Em seguida, foi realizada a segunda
reação de restrição, com 5 U da enzima SacI e tampão de clivagem 1X (Tris-HCl 20
mM, pH 7,4; MgCl
2
5,0 Mm) a 37ºC por 1 h.
As reações de clivagem das construções foram analisadas em gel de agarose
0,8%, em TBE 1X, com brometo de etídio 0,2 µg/mL e os fragmentos
correspondentes às construções foram excisados do gel, purificados com o kit
22
pCAMBIA 3301
11.307 pb
Sítio múltiplo de clonagem
Promotor 35SCaMV
Gene de seleção em planta
35SCaMV poliA
Borda -T (esquerda)
Gene de seleção em bactéria
pBR322 ori
pBR322 bom
pVS1 rep
pVS1 sta
Borda –T (direita)
NOS poliA
BstEII (762)
PmII (752)
BstEII (729)
Cauda de histidina
Gene repórter (s)
SpeI (15)
NcoI (1)
BglII (8)
Promotor 35SCaMV
Lac Z alfa
QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) e utilizados para a as reações de ligação com o
vetor pCAMBIA 3301 aberto.
As reações de ligação foram feitas para um volume final de 10 μL, utilizando
a relação de 5:1 de DNA (50 ng) e vetor (10 ng), tampão de reação (Tris-HCl pH 7,6,
MgCl
2
10 mM, ATP 1 mM, DTT 1 mM e 25% de polietileno glicol-8000) e 1 U de
T4 DNA ligase (INVITROGEN). As reações foram mantidas a 4ºC por 14 h.
Em seguida, foi realizada transformação de E. coli por choque térmico,
diagnóstico das colônias e extração do DNA plasmidial, conforme descrito no item
3.7, com exceção da etapa final da transformação, na qual as células foram
plaqueadas em meio sólido contendo canamicina 50 μg/μL. A confirmação da
clonagem foi realizada por meio de reações de restrição enzimática e por PCR.
4.12. Nomenclatura dos clones com as construções em vetores pCAMBIA 3301
Os clones que continham as construções foram denominados de acordo com o
promotor utilizado (35SCaMV), o nome do vetor de forma abreviada (CB) e o gene
de interesse para o silenciamento. Dessa forma, a nomenclatura utilizada foi a
seguinte: p35SCB Dessaturase RNAi, p35SCB CPT RNAi e p35SCB LPCAT RNAi,
para os genes referentes à oleoil dessaturase, 1,2-diacilglicerol colinafosfotransferase
e lisofosfatidilcolina aciltransferase, respectivamente.
4.13. Substituição do promotor 35SCaMV pelo promotor semente-específico do
gene da subunidade α da β-conglicinina em vetores pKANNIBAL
Os clones p35S Dessaturase RNAi, p35S CPT RNAi e p35S LPCAT RNAi
tiveram o promotor 35SCaMV substituído pelo promotor semente-específico do gene
da subunidade α da β-conglicinina. Tal procedimento foi realizado por meio de
clivagem enzimática com as enzimas de restrição SacI e XhoI. O promotor,
previamente isolado em nosso laboratório (BARROS, 2006), também foi clivado
com as mesmas enzimas de restrição.
A clivagem para a liberação do promotor 35SCaMV foi realizada com 5 U da
enzima SacI, aproximadamente 500 ng de DNA e tampão de clivagem 1X (Tris-HCl
20 mM, pH 7,4 e MgCl
2
50 mM) a 37ºC por 1 h. Em seguida, foi feita a precipitação
por cerca de 1 h a -80ºC com 10% de acetato de sódio 3 M e 1 volume de etanol 96%
23
gelado. Seguiu-se com centrifugação a 13.000g por 15 min e o DNA precipitado foi
lavado com etanol 70% e centrifugado por mais 5 min, sob mesma rotação. O DNA
precipitado foi seco à temperatura ambiente e ressuspendido em água. Em seguida,
foi realizada a segunda reação de restrição, com 5 U da enzima XhoI e tampão de
clivagem 1X (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; MgCl
2
10 mM e NaCl 50 mM) a 37ºC por 1
h.
As reações de clivagem dos cassetes foram analisadas em gel de agarose
0,8%, em TBE 1X, com brometo de etídio 0,2 µg/mL e os fragmentos
correspondentes aos clones sem o promotor 35SCaMV foram excisados do gel,
purificados deste com o kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) e utilizados para a
as reações de ligação com o promotor do gene da subunidade α da β-conglicinina,
previamente clivado.
As reações de ligação, transformação de E. coli, diagnóstico das colônias e
extração do DNA plasmidial foram realizadas seguindo as mesmas condições
descritas anteriormente. A confirmação da clonagem foi realizada por meio de
reações de restrição enzimática e por PCR.
4.14. Nomenclatura dos clones contendo as construções dirigidas pelo promotor
do gene da subunidade α da β-conglicinina em vetores pKANNIBAL
Os clones que continham as construções dirigidas pelo promotor do gene da
subunidade α da β-conglicinina em vetores pKANNIBAL também foram
denominados de acordo com o nome do promotor de forma abreviada (β) e o gene de
interesse para o silenciamento. Dessa forma, a nomenclatura utilizada foi a seguinte:
pβ Dessaturase RNAi, pβ CPT RNAi e pβ LPCAT RNAi, para os genes referentes à
oleoil dessaturase, 1,2-diacilglicerol colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina
aciltransferase, respectivamente.
4.15. Transferência dos cassetes com o promotor do gene da subunidade α da β-
conglicinina dos vetores pKANNIBAL para os vetores pCAMBIA 3301
Após a confirmação da clonagem do promotor semente-específico, os
cassetes (promotor do gene da subunidade α da β-conglicinina + fragmento sense +
24
íntron PDK+ fragmento antisense + terminador OCS) foram excisados do vetor
pKANNIBAL e, posteriormente, clonados no vetor binário pCAMBIA 3301.
Os procedimentos de clivagem, purificação, reação de ligação, transformação
e confirmação da clonagem foram realizados conforme descrito para a transferência
das construções com o promotor 35SCaMV também do vetor pKANNIBAL para o
vetor pCAMBIA 3301 (item 3.11).
4.16. Nomenclatura dos clones com as construções dirigidas pelo promotor do
gene da subunidade α da β-conglicinina em vetores pCAMBIA 3301
Os clones que continham as construções dirigidas pelo promotor do gene da
subunidade α da β-conglicinina em vetores pCAMBIA3301 também foram
denominados de acordo com o nome do promotor de forma abreviada (β), o nome do
vetor de forma abreviada (CB) e o gene de interesse para o silenciamento. Dessa
forma, a nomenclatura utilizada foi a seguinte: pβCB Dessaturase RNAi, pβCB CPT
RNAi e pβCB LPCAT RNAi, para os genes referentes à oleoil dessaturase, 1,2-
diacilglicerol colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina aciltransferase,
respectivamente.
25
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Amplificação de cDNA e escolha da temperatura de anelamento
Para a construção dos cassetes de expressão, o cDNA foi sintetizado por RT-
PCR, a partir do RNA total de sementes de soja e os fragmentos foram obtidos por
PCR. Também foi realizado um gradiente para a temperatura de anelamento dos
primers que variou de 55 a 66ºC, para verificação da melhor temperatura de
anelamento a ser utilizada nos ensaios de PCR subseqüentes. Conforme observado
nas Figuras 1A, 1B e 1C, o tamanho dos fragmentos amplificados foi correspondente
ao tamanho esperado para o produto amplificado pelos primers sintetizados neste
trabalho. Estes foram de 372, 300 e 331 pb para os fragmentos sense e antisense
referentes à oleoil dessaturase, 1,2-diacilglicerol colinafosfotransferase e
lisofosfatidilcolina aciltransferase, respectivamente. O gradiente de temperatura
utilizado demonstrou que, apesar de ter havido amplificação dos fragmentos em
todas as temperaturas utilizadas, em temperaturas mais altas, a amplificação foi mais
eficiente e sem o aparecimento de fragmentos inespecíficos. Diante deste resultado,
foi escolhida a temperatura de 64ºC para o anelamento dos primers, para todos os
fragmentos, nas amplificações subseqüentes.
26
Figura 1 - Teste de gradiente de temperatura de anelamento para amplificação do
cDNA obtido por RT-PCR do RNA total de sementes de soja. O gradiente
variou de 55 a 66ºC. A letra M corresponde ao DNA de fago λ clivado
com as enzimas EcoRI, BamHI e HindIII, utilizado como marcador de
tamanho. As letras A, B e C, correspondem aos ensaios de PCR para a
amplificação dos fragmentos correspondentes à oleoil dessaturase, 1,2-
diacilglicerol colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina aciltransferase,
respectivamente. Os fragmentos sense estão à esquerda do marcador e os
antisense estão à direita.
27
A
55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 M 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 ºC
372 pb
B
55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 M 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 ºC
300 pb
C
55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 M 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 ºC
331 pb
5.2. PCR para diagnóstico das colônias transformadas com o vetor pGEM T-
Easy
Após a amplificação dos fragmentos sense e antisense dos genes de interesse,
estes foram clonados no vetor pGEM T-Easy e, posteriormente, células de E. coli
DH5α foram transformadas por choque térmico. Após a transformação, foram
selecionadas 10 colônias de cada transformação para a realização do PCR. Foram
utilizados os primers sense e antisense específicos para cada um dos fragmentos de
interesse. Foi selecionada uma colônia positiva de cada transformação para a
extração do DNA plasmidial, ensaios de restrição enzimática para confirmação da
presença dos fragmentos, sequenciamento e posteriores subclonagens.
5.3. Confirmação das clonagens em vetores pGEM T-Easy
Os fragmentos sense e antisense foram liberados do vetor pGEM T-Easy por
clivagem enzimática com as mesmas enzimas de restrição citadas anteriormente
(Figura 2). Os fragmentos sense e antisense da oleoil dessaturase, 1,2-diacilglicerol
colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina aciltransferase possuem 372, 300 e 331
pb, respectivamente. Os fragmentos liberados através da restrição enzimática
corresponderam ao tamanho esperado.
28
Figura 2 – Clivagem enzimática para liberação dos fragmentos gênicos clonados em
vetores pGEM T-Easy. A letra m representa o marcador de tamanho de
100 pb (INVITROGEN). Os números 1 e 2, 3 e 4, 5 e 6, indicam,
respectivamente, os fragmentos liberados referentes à oleoil dessaturase,
lisofosfatidilcolina aciltransferase e 1,2-diacilglicerol
colinafosfotransferase. Os números ímpares são referentes aos fragmentos
sense e os números pares aos fragmentos antisense.
As bandas referentes aos fragmentos de interesse foram excisadas, purificadas
do gel, seqüenciadas e, posteriormente, clonadas em vetores pKANNIBAL.
5.4. Análise das seqüências e comparação com banco de dados
As seqüências isoladas da oleoil dessaturase, 1,2-diacilglicerol
colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina aciltransferase foram alinhadas com o
auxílio do BLAST, o que confirmou a similaridade de cada fragmento com as
seqüências dos genes aos quais eles se referem (Figuras 3, 4 e 5). Para os genes da
oleoil dessaturase e 1,2-diacilglicerol colinafosfotransferase foram feitos
alinhamentos de nucleotídeos com as seqüências de cDNA depositadas no GenBank
e utilizadas para o desenho dos primers. Para o gene da lisofosfatidilcolina
aciltransferase foi feito o alinhamento de nucleotídeos com uma seqüência obtida
através do contig formado por ESTs (Expressed Sequence Tags) de soja e utilizado
para o desenho dos primers, pois a seqüência nucleotídica completa deste gene ainda
não foi seqüenciada. Foram obtidos 95%, 99% e 97% de identidade para os
alinhamentos realizados para a oleoil dessaturase, 1,2-diacilglicerol
colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina aciltransferase, respectivamente.
29
372 pb
m 1 2 3 4 5 6
331 pb
300 pb
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
Dessaturase 1 CACAAAGCCACCATTCACTGTTGGCCAACTCAAGAAAGCCATTCCACCGCACTGCTTTCA
60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||| |||||||||||
L43920.1 176 CACAAAGCCACCATTCACTGTTGGCCAACTCAAGAAAGCAATTCCACCACACTGCTTTCA
235
Dessaturase 61 GCGTTCCCTCCTCACTTCATTGTCCTATGTTGTTTATGACCTTTCATTGGCTTTCATTTT
120
||| ||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| || ||||||||
L43920.1 236 GCGCTCCCTCCTCACTTCATTCTCCTATGTTGTTTATGACCTTTCATTTGCCTTCATTTT
295
Dessaturase 121 CTACATTGCCACCACCTACTTCCACCTCCTCCCTCACCCCTTTTCCCTCATTGCATGGCC
180
|||||||||||||||||||||||||||||| ||||| |||||||||||||||||||||||
L43920.1 296 CTACATTGCCACCACCTACTTCCACCTCCTTCCTCAACCCTTTTCCCTCATTGCATGGCC
355
Dessaturase 181 AATCTATTGGGTTCTCCAAGGTTGCATTCTTACTGGCGTGTGGGTGATTGCTCACGAGTG
240
||||||||||||||||||||||||| |||| ||||| |||||||||||||||||||||||
L43920.1 356 AATCTATTGGGTTCTCCAAGGTTGCCTTCTCACTGGTGTGTGGGTGATTGCTCACGAGTG
415
Dessaturase 241 TGGTCACCATGCCTTCAGCAAGTACCCATGGGTTGATGATGTTGTGGGTTTGACCGTTCA
300
|||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||| ||||
L43920.1 416 TGGTCACCATGCCTTCAGCAAGTACCAATGGGTTGATGATGTTGTGGGTTTGACCCTTCA
475
<<<<<<<<
Dessaturase 301 CTCAGCACTTTTAGTCCCTTATTTCTCATGGAAAATAAGCCATCGCCGCCACCACTCCAA
360
|||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||
L43920.1 476 CTCAACACTTTTAGTCCCTTATTTCTCATGGAAAATAAGCCATCGCCGCCATCACTCCAA
535
<<<<<<<<<<<<
Dessaturase 361 CACAGGTTCCCT 372
||||||||||||
L43920.1 536 CACAGGTTCCCT 547
Figura 3 – Alinhamento da seqüência isolada referente à oleoil dessaturase com a
seqüência obtida no banco de dados (L43920.1 - mRNA completo da
FAD2-1 oleoil dessaturase microssomal de Glycine max). As letras
destacadas em negrito correspondem aos primers sem os sítios de
restrição e as setas indicam os sítios de anelamento destes.
30
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
CPT 1 GTGGCATGCTTCCATTCTTTCCCTTCACAACCTTGTAAACATTACTAACATTGCATGTGA 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
U12735.1 921 GTGGCATGCTTCCATTCTTTCCCTTCACAACCTTGTAAACATTACTAACATTGCATGTGA 862
CPT 61 CTGTTGGTGTAACACCAAAAGCTATCATTAAACACAATATAGCTTTGAATGTCGGGATTC 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
U12735.1 861 CTGTTGGTGTAACACCAAAAGCTATCATTAAACACAATATAGCTTTGAATGTCGGGATTC 802
CPT 121 CCCCAAGATAAGGAAGCCAATTTAAGAATGGCAAAGACTTTCCAAATTGCTGAACCCACC 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
U12735.1 801 CCCCAAGATAAGGAAGCCAATTTAAGAATGGCAAAGACTTTCCAAATTGCTGAACCCACC 742
CPT 181 ACTCAGCACCCACGATAGCAGTGAAAAAGTGACAGATGTATATTATCATAAGACCCTCTG 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
U12735.1 741 ACTCAGCACCCACGATAGCAGTGAAAAAGTGACAGATGTATATTATCATAAGACCCTCTG 682
<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<
CPT 241 TAGGCCCATTTATAACAGGCAGTATAAGTGTATTGGTGAAATAATGCTCCCAGGTTGCAC 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
U12735.1 681 TAGGCCCATTTATAACAGGCAGTATAAGTGTATTGGTGAAATAATGCTCCCAGGTTGCAC 622
Figura 4 – Alinhamento da seqüência isolada referente a 1,2-diacilglicerol colina
fosfotransferase com a seqüência obtida no banco de dados (V12735.1 –
mRNA completo da aminoalcoholphosphotransferase (AAPT1) de
Glycine max). As letras destacadas em negrito correspondem aos
primers sem os sítios de restrição e as setas indicam os sítios de
anelamento destes.
31
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
LPCAT 1 TTGAAAATTGAAGCGGGTTGCAAGAGAAAGATATGCACAAGATAGACCTACATACAGTTT 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
contig 1 TTGAAAATTGAAGCGGGTTGCAAGAGAAAGATATGCACAAGATAGACCTACATACAGTTT 60
LPCAT 61 CAACCAAATGACAGAAAAAAATGTAAAATAAATAAACATGGCAGTAAAAGAAACTATCAC 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
contig 61 GAACCAAATGACAGAAAAAAAAGTAAAATAAGTAAACATGGCAGTAAAAGAAACTATCAC 120
LPCAT 121 CAAAAAAGAGAGTAGGCTCTTAAATCTAGAAATTTCATTTTCATTTAGTTGGTTAGGGAA 180
|| |||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||
contig 121 CATAAAAGAGACTAGGCTCTTAAATGTAGAAATTTCATTTTCATTTAGTTGGTTAGGGAA 180
LPCAT 181 ATGGCCTTGAATCTTGAAATCCGAAAGCAATTGGTCCTTGATCTGGAATGTGTCGATTAA 240
||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||
contig 181 ATGGCCTTGAATCTTGAAATCTGAAAGCAATTGGTCCTTTATCTGGAATGTGTCGATTAA 240
LPCAT 241 CCAAGAAGCAGCTTTGGTTTCAGAAGCTGGAATCTCCTCCACCGGAATACGCGGCACATG 300
||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| ||||||||| |||| ||
contig 241 CCAAGAAGCAGCTTTGGTTTCGGAAGCTGGAATCTCCTCCACAGGAATACGCCGCACGTG 300
<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<
LPCAT 301 CAGGTGCACTTCTGGAGGGTCAACACCAAAA
|||||||||||||||||||||||||||||||
contig 301 CAGGTGCACTTCTGGAGGGTCAACACCAAAA
Figura 5 – Alinhamento da seqüência isolada referente à lisofosfatidilcolina
aciltransferase com a seqüência obtida através do contig. As letras
destacadas em negrito correspondem aos primers sem os sítios de
restrição e as setas indicam os sítios de anelamento destes.
32
5.5. Confirmação das subclonagens em vetores pKANNIBAL
Para a subclonagem em vetores pKANNIBAL, os fragmentos antisense foram
liberados do vetor pGEM T-Easy por meio de clivagem com as enzimas ClaI e
BamHI, purificados e ligados aos vetores pKANNIBAL. Os clones positivos foram
denominados p35S Dessaturase antisense, p35S CPT antisense e p35S LPCAT
antisense, por possuírem somente os fragmentos antisense.
Para a subclonagem dos fragmentos sense, estes foram liberados do vetor
pGEM T-Easy usando as enzimas XhoI e KpnI e subclonados no vetor pKANNIBAL,
utilizando os clones p35S Dessaturase antisense, p35S CPT antisense e p35S
LPCAT antisense. Os clones positivos foram denominados p35S Dessaturase RNAi,
p35S CPT RNAi e p35S LPCAT RNAi e possuem 6.648, 6.504 e 6.566 pb,
respectivamente. As clonagens foram confirmadas por PCR e por reação enzimática.
A Figura 6 mostra que os fragmentos sense e antisense liberados corresponderam ao
tamanho esperado de 372, 300 e 331 pb para os genes da oleoil dessaturase, 1,2-
diacilglicerol colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina aciltransferase,
respectivamente.
33
Figura 6 – Clivagem enzimática e PCR para confirmação das clonagens em vetor
pKANNIBAL. A letra M corresponde ao DNA de fago λ clivado com as
enzimas EcoRI, BamHI e HindIII, utilizado como marcador de tamanho
e a letra m corresponde ao marcador de tamanho de 100 pb
(INVITROGEN). Os números são referentes às clivagens e as letras são
referentes aos PCRs. As canaletas 1, 4 e 7 indicam os clones 35S
Dessaturase RNAi, 35S CPT RNAi e 35S LPCAT RNAi fechados,
respectivamente. As canaletas 2 e 3, 5 e 6, 8 e 9 indicam as clivagens
para liberação dos fragmentos sense e antisense. As letras A e B, C e D,
E e F correspondem aos fragmentos sense e antisense amplificados dos
genes da oleoil dessaturase, 1,2-diacilglicerol colinafosfotransferase e
lisofosfatidilcolina aciltransferase, respectivamente.
5.6. Confirmação das clonagens em vetores binários pCAMBIA 3301
Os clones p35S Dessaturase RNAi, p35S CPT RNAi e p35S LPCAT RNAi
contêm o cassete para o silenciamento dos genes de interesse, mas não apresentam
uma marca para seleção em plantas. Além disso, como a transformação de plantas
será realizada por meio de Agrobacterium tumefaciens, uma estrutura de T-DNA
também se faz necessária. Assim, as três construções foram subclonadas no vetor
binário pCAMBIA 3301. Nessa etapa, as enzimas de restrição utilizadas foram SacI
e PstI, por serem enzimas que correspondiam aos sítios de clivagem tanto no vetor
pKANNIBAL quanto no vetor pCAMBIA 3301, sendo possível transferir a
construção completa com apenas uma etapa de restrição enzimática.
As construções completas (promotor 35SCaMV + fragmento sense + íntron
PDK + fragmento antisense + terminador OCS) para os genes da oleoil dessaturase,
1,2-diacilglicerol colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina aciltransferase possuem
3.681, 3.537 e 3.599 pb, respectivamente. Os clones positivos foram denominados
34
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 m A B C D E F
372 pb
300 pb
331 pb
331 pb
300 pb
372 pb
p35SCB Dessaturase RNAi, p35SCB CPT RNAi e p35SCB LPCAT RNAi e
possuem 14.988, 14.844 e 14.906 pb, respectivamente. Novamente, as clonagens
foram confirmadas por PCR e restrição enzimática do DNA plasmidial dos clones
isolados. As Figuras 7A, 7B e 8 confirmam a transferência dos cassetes do vetor
pKANNIBAL para o vetor pCAMBIA 3301. Os fragmentos sense e antisense que
foram liberados dos vetores apresentaram o tamanho esperado. Houve a liberação de
fragmentos de 372, 331 e 300 pb por meio da restrição enzimática e a amplificação
de fragmentos de tamanho correspondente através do PCR com os primers
específicos, ambos se referindo aos fragmentos sense e antisense dos três genes.
Figura 7 – Clivagem enzimática (A) e PCR (B) para confirmação das clonagens no
vetor binário pCAMBIA 3301. A letra M corresponde ao DNA de fago λ
clivado com as enzimas EcoRI, BamHI e HindIII, utilizado como
marcador de tamanho e a letra m corresponde ao marcador de tamanho
de 100 pb (INVITROGEN). As canaletas 1 e 5 indicam os clones
p35SCB Dessaturase RNAi e p35SCB LPCAT RNAi fechados,
respectivamente. As canaletas 2, 3 e 4, 6, 7 e 8 indicam as clivagens para
liberação dos fragmentos sense, antisense e da construção completa,
referentes aos clones p35SCB Dessaturase RNAi e p35SCB LPCAT
RNAi, respectivamente. As letras A e B, C e D correspondem aos
fragmentos sense e antisense amplificados dos genes da oleoil
dessaturase e lisofosfatidilcolina aciltransferase, respectivamente.
35
M 1 2 3 4 5 6 7 8 m
m A B C D
A
B
372 pb
331 pb
331 pb
372 pb
Figura 8 – Clivagem enzimática e PCR para confirmação das clonagens em vetor
pCAMBIA3301. A letra M corresponde ao DNA de fago λ clivado com
as enzimas EcoRI, BamHI e HindIII, utilizado como marcador de
tamanho e a letra m corresponde ao marcador de tamanho de 100 pb
(INVITROGEN). Os números são referentes às clivagens e as letras são
referentes aos PCRs. A caneleta 1 indica o clone 35SCB CPT RNAi
fechado. As canaletas 2, 3 e 4 indicam as clivagens para liberação dos
fragmentos sense, antisense e da construção completa. As letras A e B
correspondem aos fragmentos sense e antisense amplificados do gene da
1,2-diacilglicerol colinafosfotransferase.
5.7. Confirmação da substituição do promotor 35SCaMV em vetores
pKANNIBAL
Os clones descritos anteriormente possuem o promotor 35SCaMV do
mosaico da couve-flor, que é expresso constitutivamente e em altos níveis. Tal
promotor vem sendo há bastante tempo utilizado na Engenharia Genética de Plantas
(ODELL et al., 1985).
Entretanto, uma estratégia seria a substituição de promotores constitutivos por
promotores tecido-específicos. No presente trabalho, foi utilizado um promotor
semente-específico de soja, do gene da subunidade α da β-conglicinina, de 634 pb,
previamente isolado em nosso laboratório.
A expressão semente-específica de transgenes é requerida para várias
aplicações na Engenharia Genética, entre elas a melhoria da qualidade nutricional de
grãos por engenharia metabólica. Dentre esses promotores, destacam-se os
promotores dos genes da β-conglicinina de soja, por estarem bem caracterizados e
serem bastante utilizados para construções em dicotiledôneas (BARROS, 2006).
36
300 pb
M 1 2 3 4 m A B
300 pb
Os clones p35S Dessaturase RNAi, p35S CPT RNAi e p35S LPCAT RNAi
foram clivados com as enzimas de restrição SacI e XhoI, para liberação do promotor
35SCaMV e, em seguida, ligados ao promotor do gene da subunidade α da β-
conglicinina, previamente clivado com as mesmas enzimas de restrição. Entretanto
só foi possível a obtenção de clone positivo para o gene da oleoil dessaturase e este
foi denominado pβ Dessaturase RNAi. A clonagem foi confirmada por PCR e
restrição enzimática do DNA plasmidial do clone isolado. De acordo com a Figura 9,
pode-se observar que o clone possui o promotor do gene da subunidade α da β-
conglicinina dirigindo a construção, pois houve a liberação de um fragmento de 634
pb correspondente ao promotor. A construção completa (promotor Beta + fragmento
sense + íntron PDK + fragmento antisense + terminador OCS) possui 2.950 pb. Os
fragmentos sense e antisense também apresentaram o tamanho esperado. Houve a
amplificação de fragmentos de 372 pb através do PCR com os primers específicos.
37
Figura 9 – Clivagem enzimática e PCR para confirmação da presença do promotor do
gene da subunidade α da β-conglicinina no vetor pKANNIBAL. A letra
M corresponde ao DNA de fago λ clivado com as enzimas EcoRI,
BamHI e HindIII, utilizado como marcador de tamanho e a letra m
corresponde ao marcador de tamanho de 100 pb (INVITROGEN). A
canaleta 1 indica o clone pβ Dessaturase RNAi fechado. As canaletas 2 e
3 representam as clivagens para liberação do promotor do gene da
subunidade α da β-conglicinina e da construção completa,
respectivamente. As letras A e B correspondem, respectivamente, aos
fragmentos sense e antisense amplificados do gene da oleoil dessaturase.
Não foram obtidos clones positivos para os genes da 1,2 diacilglicerol
colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina aciltransferase. Para estes genes, foram
realizados a troca do promotor, a transformação de E. coli e o PCR para diagnóstico
das colônias. No entanto, não houve crescimento das colônias em meio LB líquido
contendo canamicina, o que impossibilitou a extração do DNA plasmidial para a
confirmação das clonagens.
5.8. Confirmação da transferência da construção dirigida pelo promotor do
gene da subunidade α da β-conglicinina para os vetores pCAMBIA 3301
A etapa de transferência do cassete com o promotor do gene da subunidade α
da β-conglicinina foi realizada somente com o clone pβ Dessaturase RNAi.
Após a confirmação da substituição do promotor 35SCaMV pelo promotor do
gene da subunidade α da β-conglicinina no vetor pKANNIBAL, a construção foi
liberada do clone pβ Dessaturase RNAi e inserida no vetor binário pCAMBIA 3301.
As clonagens foram confirmadas por PCR e clivagem enzimática do DNA
plasmidial do clone isolado. O clone positivo foi denominado pβCB Dessaturase
RNAi. A Figura 10 demonstra que o clone possui o promotor do gene da subunidade
38
M 1 2 3 m A B
372 pb
634 pb
α da β-conglicinina dirigindo a construção. Por meio de restrição enzimática houve a
liberação de um fragmento de 634 pb correspondente ao promotor e de um fragmento
de 2.950 pb correspondente à construção completa (promotor Beta + fragmento sense
+ íntron PDK + fragmento antisense + terminador OCS). A presença dos fragmentos
sense e antisense foi confirmada através do PCR por amplificação de fragmentos de
372 pb utilizando os primers específicos.
Figura 10 – Clivagem enzimática e PCR para confirmação da clonagem no vetor
binário pCAMBIA 3301. A letra M corresponde ao DNA de fago λ
clivado com as enzimas EcoRI, BamHI e HindIII, utilizado como
marcador de tamanho e a letra m corresponde ao marcador tamanho de
100 pb (INVITROGEN). A canaleta 1 indica o clone pβCB Dessaturase
RNAi fechado. As canaletas 2 e 3 representam as clivagens para
liberação do promotor e da construção completa, respectivamente. As
letras A e B correspondem, respectivamente, aos fragmentos sense e
antisense amplificados do gene da oleoil dessaturase.
5.9. Representação esquemática dos clones obtidos
Os clones finais obtidos estão representados de maneira esquemática nas
Figuras 11 e 12. Eles correspondem às construções para silenciamento gênico, via
RNA de interferência, dos genes da oleoil dessaturase, 1,2-diacilglicerol
colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina aciltransferase, sob controle do promotor
35SCaMV ou do promotor do gene da subunidade α da β-conglicinina. Os cassetes
estão clonados no vetor binário pCAMBIA 3301, utilizado para a transformação
genética de plantas via Agrobacterium tumefaciens.
39
M 1 2 3 m A B
372 pb
634 pb
Figura 11 - Representação esquemática dos clones contendo as construções para silenciamento gênico, RNA interference, do gene da
oleoil dessaturase em soja. Os cassetes estão sob controle do promotor 35SCaMV (A) e do promotor do gene da subunidade
α da β-conglicinina (B).
1
pP34i
14896 pb
Sac I
Xho I
Kpn I
Kpn I
Xba I
Pst I
Xho I
Xho I
Cla I
GUS
Promotor CaMV 35S
Promotor
Lac Z alfa
Poli -A (NOS)
Cauda de Histidina
T-DNA (direito)
T-DNA
Kanamicina R
ori
bom
rep (pVS1)
ata (pVS1)
P34 sense
P34 antisense
Terminador OCS
CaMV 35S
Intron PDK
Promotor
CaMV 35S
bar
Poli A (CaMV 35S)
(esquerdo)
pBR322
pBR322
1
pBP34i
14177 pb
Kpn I
Kpn I
Sac I
Xho I
Cla I
Xba I
Xho I
Xho I
Pst I
GUS
Promotor CaMV 35S
Lac Z alfa
Poli -A (NOS)
Cauda de Histidina
T-DNA (direito)
T-DNA
Kanamicina R
ori
bom
rep (pVS1)
ata (pVS1)
P34 sense
P34 antisense
Terminador OCS
Intron PDK
Promotor
CaMV 35S
bar
Poli A (CaMV 35S)
(esquerdo)
pBR322
pBR322
Promotor
β
Conglicinina
B)
A)
Dessaturase sense
Dessaturase antisense
Bam HI
p35SCB Dessaturase RNAi
14.988 pb
pβCB Dessaturase RNAi
14.275 pb
Dessaturase sense
Dessaturase antisense
Bam HI
40
Figura 12 - Representação esquemática do clone contendo a construção para silenciamento gênico, RNA interference, dos gene da 1,2-
diacilglicerol colinafosfotransferase e da lisofosfatidilcolina aciltransferase em soja. Os cassetes estão sob controle do
promotor 35SCaMV.
1
pBBI-Ai
14646 pb
Sac I
Xho I
Kpn I
Kpn I
Cla I
Xba I
Xho I
Xho I
Pst I
GUS
Promotor CaMV 35S
Promotor
Lac Z alfa
Poli -A (NOS)
Cauda de Histidina
T-DNA (direito)
T-DNA
Kanamicina R
ori
bom
rep (pVS1)
ata (pVS1)
BBI-A sense
BBI-A antisense
Terminador OCS
CaMV 35S
Intron PDK
Promotor
CaMV 35S
bar
Poli A (CaMV 35S)
(esquerdo)
pBR322
pBR322
BamHI
Colina antisense
Colina sense
p35SCB CPT RNAi
14.844 pb
1
pBBI-Ai
14646 pb
Sac I
Xho I
Kpn I
Kpn I
Cla I
Xba I
Xho I
Xho I
Pst I
GUS
Promotor CaMV 35S
Promotor
Lac Z alfa
Poli -A (NOS)
Cauda de Histidina
T-DNA (direito)
T-DNA
Kanamicina R
ori
bom
rep (pVS1)
ata (pVS1)
BBI-A sense
BBI-A antisense
Terminador OCS
CaMV 35S
Intron PDK
Promotor
CaMV 35S
bar
Poli A (CaMV 35S)
(esquerdo)
pBR322
pBR322
BamHI
Colina antisense
Liso sense
p35SCBColinaRNAi
14.844 pb
p35SCB LPCAT RNAi
14.906 pb
Liso antisense
41
6. CONCLUSÕES
Foi possível isolar e subclonar os fragmentos sense e antisense de 372, 300 e
331 pb referentes aos genes da oleoil dessaturase, 1,2-diacilglicerol
colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina aciltransferase, respectivamente, em
vetores pKANNIBAL.
Foram obtidos quatro cassetes de expressão para silenciamento gênico, via
RNA de interferência. Dois destes foram para o gene da oleoil dessaturase, sendo um
deles dirigido pelo promotor 35SCaMV e o outro pelo promotor do gene da
subunidade α da β-conglicinina. Os cassetes obtidos para os genes da 1,2-
diacilglicerol colinafosfotransferase e da lisofosfatidilcolina aciltransferase estão sob
a direção do promotor 35SCaMV.
42
7. PERSPECTIVAS
Os experimentos continuam, visando obter os cassetes de expressão para
silenciamento gênico, via RNA de interferência, dirigidos pelo promotor do gene da
subunidade α da β-conglicinina, para os genes da 1,2-diacilglicerol
colinafosfotransferase e lisofosfatidilcolina aciltransferase.
Os cassetes serão utilizados para a transformação genética de nós
cotiledonares e/ou embriões somáticos de soja, via Agrobacterium tumefaciens.
As variedades, a serem obtidas, contendo reduzido conteúdo de ácido
linolênico e maior conteúdo de ácido oléico serão incorporadas no Programa de
Melhoramento da Soja do BIOAGRO/UFV.
43
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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