16
SUMÁRIO
1. Introdução......................................................................................................................... 18
1.1 Histórico................................................................................................................. 18
1.2 Morfologia e Genética dos Hantavírus.................................................................. 19
1.3 Classificação dos Hantavírus................................................................................. 21
1.4 Transmissão............................................................................................................ 24
1.5 Reservatórios Naturais dos Hantavírus.................................................................. 25
1.6 Replicação dos Hantavírus..................................................................................... 27
1.7 Hantaviroses........................................................................................................... 29
1.7.1 Patogênese da SCPVH............................................................................... 29
1.7.2 Manifestações Clínicas............................................................................... 30
1.8 Imunologia das Hantaviroses ................................................................................ 31
1.9 Epidemiologia das Hantaviroses............................................................................ 32
1.10 Diagnóstico das Hantaviroses.............................................................................. 34
1.11 Produção de Antígenos Recombinantes para testes diagnósticos........................ 35
1.12 Proteínas Recombinantes..................................................................................... 37
1.13 Sistema de Expressão de Baculovírus.................................................................. 38
1.13.1 Baculovírus.............................................................................................. 38
1.13.2 Expressão Gênica nos Baculovírus.......................................................... 40
1.13.3 Utilização dos Baculovírus como Sistema de Expressão ........................ 40
2. Justificativa ...................................................................................................................... 43
3. Objetivo............................................................................................................................. 44
4. Método.............................................................................................................................. 45
4.1 Vetores, vírus e Linhagem Celular utilizada.......................................................... 45
4.1.1 Vetor de clonagem pET-N-Ara................................................................. 45
4.1.2 Vetor de Transferência pSynXIVVIX3..................................................... 45
4.1.3 Plasmídeo de clonagem pCRII................................................................... 47
4.1.4 Vírus vSyngalVI......................................................................................... 47
4.1.5 Linhagem celular utilizada......................................................................... 47
4.2 Desenho de oligonucleotídeos para síntese dos fragmentos utilizados no
preparo dos vetores de transferência ........................................................................... 47
4.2.1 Primers para o gene N com poliHistidina (6xHis)..................................... 48
4.2.2 Primers para o sinal de exportação do gene GP67..................................... 49
4.3 Síntese dos fragmentos e clonagem....................................................................... 50
4.3.1 Síntese da região do Gene N com poliHistidina (6xHis) para inserção
em plasmídeos..................................................................................................... 50
4.3.2 Síntese do sinal de exportação do gene da GP67....................................... 50
4.4 Construção dos vetores de transferência ............................................................... 50
4.4.1 Clonagem do gene Hist-N no vetor de transferência
pSynXIVVIX3.................................................................................................... 50
4.4.2 Clonagem da seqüência de exportação (Exp) no vetor de transferência
pSyn-Hist-N........................................................................................................ 51
4.5 Purificação dos vetores de transferência: pSyn-Hist-N e pSyn-Exp-Hist-
N................................................................................................................................... 51
4.6 Sequencimento dos vetores de transferência ......................................................... 52
4.6.1 Sequenciamento do pET-N-Ara................................................................. 52
4.6.2 Sequenciamento dos vetores de transferência recombinantes................... 53
4.7 Preparo do DNA do vSyngal VI-........................................................................... 56