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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
CONSEQUÊNCIAS DO ESTRESSE PSICOSSOCIAL NA
CINÉTICA DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL E NA
DEFESA ANTIOXIDANTE DE CAMUNDONGOS SUÍÇOS
LUCIANE DA SILVA GONÇALVES
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FLORIANÓPOLIS, DEZEMBRO DE 2007.
CONSEQUÊNCIAS DO ESTRESSE PSICOSSOCIAL NA
CINÉTICA DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL E NA
DEFESA ANTIOXIDANTE DE CAMUNDONGOS SUÍÇOS
Orientador: Prof. Odival Cezar Gasparotto
Co-Orientador: Profa. Sonia Gonçalves
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
FLORIANÓPOLIS, DEZEMBRO DE 2007.
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Santa Catarina como requisito
p
arcial para obtenção do título de Mestre
em Neurociências.
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Dedico esta Dissertação aos meus pais, Teodoro e Tânia, pessoas imprescindíveis na
minha vida, e que me incentivaram e ajudaram a obter tudo o que conquistei, e acima de
tudo, a ser quem me tornei.
i
AGRADECIMENTOS
A caminhada foi longa, nada fácil, porém com o “mínimo” de dedicação. Quantas
vezes saindo de madrugada do campus, dormindo tarde, e acordando cedo. Quantas alegrias
ao ver um sonho se concretizar, mas também quantas brigas e choros. Enfim, o tão
esperado término da Dissertação ocorreu, e só tenho a agradecer a quem participou comigo
de toda esta etapa da minha vida. Agradeço de coração............
Aos meus pais, Teodoro e Tânia, que fizeram o possível e o impossível para que eu
chegasse onde estou.
Aos meus padrinhos, Elias e Sônia, que me ajudaram e motivaram nessa caminhada.
Aos meus irmãos, Rafael e Laís, pela amizade e companheirismo de tantos anos.
Às amizades que fiz aqui, em SC, Fabiana, Liane, Virgínia, e em especial, ao meu
grande amigo, Valmiré, com quem sempre pude e posso contar, pra tudo.
Às minhas grandes amigas e “companheiras de casa”, Gláucia, Maura, Louise,
Fernanda e Cláudia, com as quais dividi muitas alegrias, tristezas e sonhos. Gurias, nessa
caminhada longe da minha família vocês constituíram a “própria”, para mim. Muito
obrigada, por tudo!
Aos meus colegas do Curso, Jéferson, Thais, Vinicius, Flávia, Juliana, Eduardo,
Heloisa, Ana Paula, Sérgio, Aline, Daniele, pela atenção e ajuda, sempre que solicitei.
À estagiária Cristiani, “meus braços direito e esquerdo” nos experimentos. Sem ela,
nada teria ido adiante. Valeu, Cris!
ii
Ao técnico de laboratório, Péricles, sempre paciente e disposto a ajudar, e que me
foi de grande valia nos experimentos. Sem ele muita coisa teria ficado para trás. Obrigada,
Péricles!
Ao pessoal do grupo de apoio do Departamento, Nivaldo, dona Vilma, Carlão, Nete,
pessoas simples e com uma “grande bagagem” a transmitir.
Ao “Nivaldinho”, sempre atencioso e solícito, e pronto para ouvir quaisquer elogios,
ou choros, ou reclamações de alunos, e sempre resolvendo coisas para tudo e todos. Muito
obrigadão, Nivaldo!
Ao pessoal dos Departamentos de Ciências Fisiológicas, Bioquímica, Química,
Microbiologia e Parasitologia, pelo empréstimo dos laboratórios e materiais necessários aos
experimentos.
Ao Biotério Central, pelos animais cedidos.
Aos professores, Adair, Carla, Marino, Cilene, Marcelo, pela ajuda e
esclarecimentos que solicitei, e fui sempre atendida.
Ao professor Alcir, pela amizade, colaboração e empréstimo do laboratório e
materiais, para a realização de uma complexa etapa dos experimentos.
À professora Sonia, pela dedicação, auxílio, colaboração e ensinamentos. Sem ela
grande parte da minha Dissertação não teria estado pronta.
E, finalmente, agradeço ao idealizador de todo o projeto da minha Dissertação, o
professor Odival Cezar Gasparotto, que apesar de ter me “puxado as orelhas” inúmeras
vezes, o fez com a melhor das intenções, e para que todo o trabalho de pesquisa “alçasse
vôo”. Obrigada pela dedicação, pelos elogios, pelas “chamadas de atenção”, e
principalmente por acreditar na minha capacidade profissional. Aprendi muito com o
senhor, e com todo esse projeto.
iii
SUMÁRIO
Resumo............................................................................................................................vii
Abstract..........................................................................................................................viii
Lista de Figuras...............................................................................................................ix
Lista de Abreviaturas.......................................................................................................xii
1. Introdução....................................................................................................................14
1.1. Breve histórico..............................................................................................14
1.2. Neurobiologia do estresse agudo e crônico..................................................16
1.3. Estresse psicossocial.....................................................................................18
1.4. Estresse psicossocial e resposta imune.........................................................19
1.5. Estresse oxidativo.........................................................................................20
1.5.1. Defesas não enzimáticas............................................................................22
1.5.2. Defesas enzimáticas...................................................................................23
1.6. Estresse oxidativo e a ativação imune..........................................................24
2. Objetivos......................................................................................................................26
2.1. Objetivo geral...............................................................................................26
2.2. Objetivos Específicos...................................................................................26
3. Materiais e métodos.....................................................................................................27
3.1. Animais.........................................................................................................27
3.2. Manutenção...................................................................................................27
3.3. Protocolo experimental.................................................................................28
3.4. Estresse de interação social..........................................................................31
iv
3.5. Estímulo imunogênico (estresse biológico)..................................................32
3.6. Coleta e preparação das amostras.................................................................33
3.6.1. Coleta de material biológico.......................................................33
3.6.2. Preparação das amostras de tecido cerebral e do sangue.............33
3.6.3. Ensaio de hemaglutinação............................................................33
3.7. Parâmetros pró-oxidantes.............................................................................34
3.7.1. Lipoperoxidação – método espectrofotométrico: TBARS -
MDA............................................................................................34
3.8. Parâmetros antioxidantes..............................................................................34
3.8.1. Avaliação da atividade de Glutationa Redutase (GR).................34
3.8.2. Avaliação da atividade de Glutationa S-transferase (GST).........35
3.8.3. Avaliação da atividade de Glutationa Peroxidase (GPx).............36
3.8.4. Avaliação da atividade de γ – Glutamil transpeptidase (GGT)...36
3.9. Dosagem de proteínas...................................................................................37
3.10. Análise estatística dos dados....................................................................37
4. Resultados..................................................................................................................38
4.1. Ativação da resposta imune humoral à HC........................................................38
4.2. Marcadores oxidativos de estresse.....................................................................39
4.2.1. TBARS.......................................................................................................39
4.2.2. GR..............................................................................................................41
4.2.3. GPX...........................................................................................................43
4.2.3. GST............................................................................................................45
4.2.4. GGT...........................................................................................................47
5. Discussão...................................................................................................................50
v
6. Conclusão..................................................................................................................61
7. Referências................................................................................................................62
vi
RESUMO
A exposição a diferentes tipos de estresse influencia a produção de espécies reativas
de oxigênio com risco potencial à integridade dos tecidos. O estresse psicossocial ou
biológico é responsável por alterações na imunidade, nos marcadores de estresse oxidativo
e no sistema de defesa antioxidante. Estudos prévios mostraram que os níveis de glutationa
(GSH) são aumentados no cerebelo de camundongos sujeitos ao estresse de restrição física.
Contudo, camundongos expostos à interação agonística recorrente (IAR) não apresentaram
alterações nos níveis de GSH. A proposta deste estudo foi analisar os efeitos do estresse de
interação social sobre a ativação da reposta imune humoral e sobre os parâmetros pró-
oxidantes (peroxidação lipídica -TBARS) e antioxidantes (glutationa redutase - GR,
glutationa peroxidase - GPX, glutationa S-transferase - GST, gama-glutamil transpeptidase
- GGT) no córtex cerebral de camundongos. Para tanto, camundongos Suíços, machos
foram submetidos ao estresse de interação social e/ou foram injetados com 10
9
hemácias de
carneiro (HC)/ml/ip, 4 horas, 3 dias, 5 dias, 7 dias, 9 dias, 11 dias, 13 dias, antes da coleta
de tecidos. Como controles, animais não submetidos ao estresse de interação social e/ou
injetados com solução veículo (V) foram usados. A resposta imune humoral analisada ao
longo do tempo nos grupos de animais estressados socialmente (E) e não estressados (C),
mostrou alterações significantes (KW= 80,65; p<0,001), contudo não foram observadas
diferenças estatisticamente significantes entre os grupos. Os ensaios de lipoperoxidação não
revelaram alterações estatisticamente significantes quando se avaliou o efeito do inóculo ou
do estresse social na média dos níveis de TBARS ao longo do tempo. Contudo, verificou-
se que a média da produção de TBARS alterou-se ao longo dos 13 dias de experimento.
Embora a análise ao longo do tempo não tenha demonstrado diferenças estatisticamente
significantes entre os inóculos empregados, os níveis de TBARS foram afetados pelo
estresse social [(6,215)= 5,81; p< 0,001]. Adicionalmente, uma interferência do estresse
social foi observada na média dos níveis de GR ao longo do experimento [F (1,216)=
13,73; p<0,001]. A média dos níveis de GPX no parênquima cortical mostrou uma
interação significante do inóculo e estresse social [F(1,215)= 33,90; p< 0,001]. A média dos
níveis de GST no parênquima cortical revelou um efeito significante do estresse social
[F(1,214)= 6,34; p<0,0126] nesta enzima, representado por um significativo aumento da
mesma (p<0,0115). A análise da média dos níveis de GGT mostrou um efeito significante
do estresse social [F(1,218)= 53,26; p<0,001], que por sua vez foi responsável por um
decréscimo desta enzima (p<0,001). Em conjunto, estes dados nos permitem sugerir uma
associação entre os mecanismos de adaptação ao estresse e a atividade imunológica, que
pode ser importante para a manutenção da homeostase e essencial para o bem-estar dos
organismos.
vii
ABSTRACT
Exposure to different kinds of stress influences the reactive oxygen species production with
potential risk to the integrity of tissues. Psychological or biological stress is responsible for
a significant increase in the oxidative stress markers and also for activation of the
antioxidant defense system. Previous studies showed that the glutathione levels (GSH) are
increased I the cerebellum of mice subjected to restraint stress. Nevertheless, mice exposed
to recurrent agonistic interaction (RAI) do not present significant alterations in the GSH
levels. The purpose of this study was to analyze the levels of antioxidant enzymes,
glutathione reductase (GR), glutathione peroxidase (GPX), glutathione S-transferase
(GST), gamma-glutamyl transpeptidase (GGT), and the lipid peroxidation (TBARS) in the
cerebral cortex of mice subjected to RAI and/or injected with 10
9
sheep red blood cells
(SRBC)/ml/ip, 4 hours, 3 days, 5 days, 7 days, 9 days, 11 days and 13 days before the
tissue collection. As controls, animals not subjected to RAI and/or injected with vehicle
solution (VS) were used. The humoral immune response analyzed longer the time on
socially stressed animals group (E) e no stressed (C), showed significant alterations (KW=
80,65; p<0,001), however weren´t observed differences statistically significant between
groups. The lipoperoxidation assays didn´t reveal alterations statistically significant when
the inoculants or social stress effect was availed TBARS medium levels longer the time.
However, was verified that medium of TBARS production was altered how long 13 days of
experiment. Although the analyze longer the time haven´t demonstred differences
statistically significant between inoculates employed, the TBARS levels were affected for
social stress [(6,215)= 5,81; p< 0,001]. Additionally, an interference of social stress was
observed at GR medium level over time on experiment [F (1,216)= 13,73; p<0,001]. The
GPX medium level in the cerebral cortex showed a significant interaction of inoculants and
social stress [F(1,215)= 33,90; p< 0,001]. The GST medium level in the cortical
parenquima showed a significant effect of social stress [F(1,214)= 6,34; p<0,0126] at that
enzyme, represented for a significative increase the same (p<0,0115). The GGT enzyme
showed a significante effect of social stress [F(1,218)= 53,26; p<0,001], that for your time
was responsible for a decrease at this enzyme (p<0,001). The present study proposes an
association between mechanisms of adaptation stress and an immunological activity that
can be important for the homeostasis maintenance and essential for the organisms comfort.
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Diagrama esquemático dos procedimentos experimentais utilizados nos animais
para o estudo dos efeitos do estresse de interação social sobre a resposta imune humoral à
HC e sobre o estresse oxidativo no córtex cerebral
frontal...............................................................................................................................29
Figura 2. Protocolo de inoculação e coleta de material biológico (sangue e tecido cerebral)
nos animais do grupo controle. Ct - Grupos de animais não expostos ao estresse social e
que receberam injeção de HC ou de PBS; Dias - indica o dia em que foi feita a coleta do
material biológico; In - dia em que foi feita a injeção de HC ou de PBS; C - dia em que foi
feita a coleta de sangue e de tecido
cerebral............................................................................................................................30
Figura 3. Protocolo experimental e coleta de material biológico (sangue e tecido cerebral)
nos animais estressados socialmente. ES - Grupos de animais expostos ao estresse social e
que receberam injeção de HC ou de PBS; Dias - indica o dia em que foi feita a coleta do
material biológico; In - dia em que foi feita a injeção de HC ou de PBS; C - dia em que foi
feita a coleta de sangue e de tecido
cerebral...........................................................................................................................30
Fig 4. Grupos de animais alinhados por combinações de estresse social, inoculo, tempo de
exposição ao estresse (dias) e dados de coleta de sangue e córtex
cerebral............................................................................................................................31
Fig 5. Média geométrica e intervalo confidencial do título de anticorpos anti-HC na
resposta imune humoral. C= camundongos não estressados (controles); Dom=
camundongos dominantes e Sub= camundongos
submissos.........................................................................................................................38
Fig. 6. Média da produção de TBARS no parênquima cortical de camundongos de
diferentes hierarquias sociais injetados com HC ou
V......................................................................................................................................40
ix
Fig. 7 A. Níveis de TBARS medidos no parênquima cortical de camundongos injetados
com HC ao longo de 7 dias de
experimento.....................................................................................................................41
Fig. 7 B. Níveis de TBARS medidos no parênquima cortical de camundongos injetados
com solução veículo ao longo de 7 dias de
experimento.....................................................................................................................41
Fig. 8. Média dos níveis de GR no parênquima cortical de camundongos de diferentes
hierarquias sociais, injetados com HC ou
V......................................................................................................................................42
Fig. 9 A. Nível de GR medido no parênquima cortical de camundongos injetados com HC
ao longo de 7 dias de
experimento.....................................................................................................................43
Fig. 9 B. Nível de GR medido no parênquima cortical de camundongos injetados com
solução veículo ao longo de 7 dias de
experimento.....................................................................................................................43
Fig. 10. Média dos níveis de GPX no parênquima cortical de camundongos de diferentes
hierarquias sociais injetados com HC ou V. *** representa p <
0,001...............................................................................................................................44
Fig. 11 A. Níveis de GPX obtidos no parênquima cortical de camundongos de diferentes
posições hierárquicas, injetados com HC ao longo de 7 dias de experimento. *** denota
níveis mais baixos de GPX em camundongos controles injetados com HC comparados com
camundongos Dom e Sub injetados com
HC....................................................................................................................................44
Fig. 11 B. Níveis de GPX obtidos no parênquima cortical de camundongos de diferentes
posições hierárquicas, injetados com solução veículo ao longo de 7 dias de experimento.
+++ indica níveis mais baixos de GPX em camundongos Dom e Sub do que em
camundongos controles injetados com solução
veículo.............................................................................................................................45
Fig. 12. Níveis médios de GST em parênquima cortical de camundongos de diferentes
hierarquias sociais injetados com HC ou solução
veículo.............................................................................................................................46
x
Fig. 13 A. Níveis de GST obtidos ao longo do tempo no parênquima cortical de
camundongos de diferentes posições hierárquicas injetados com HC ao longo de 7 dias de
experimento................................................................................................................46
Fig. 13 B. Níveis de GST obtidos ao longo do tempo no parênquima cortical de
camundongos de diferentes posições hierárquicas injetados com solução veículo ao longo
de 7 dias de experimento. *** indica um nível mais baixo de GST em camundongos
controles em relação aos animais Dom tão bem como os camundongos Sub no quinto dia
de experimento.....................................................................................................................47
Fig. 14. Níveis médios de GGT em parênquima cortical de camundongos de diferentes
hierarquias sociais injetados com HC ou solução
veículo.............................................................................................................................48
Fig. 15 A. Níveis de GGT obtidos ao longo do tempo no parênquima cortical de
camundongos de diferentes posições hierárquicas injetados com HC ao longo de 7 dias de
experimento................................................................................................................48
Fig. 15 B. Níveis de GGT obtidos ao longo do tempo no parênquima cortical de
camundongos de diferentes posições hierárquicas injetados com solução veículo ao longo
de 7 dias de
experimento.....................................................................................................................49
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
ACTH: hormônio adrenocorticotrópico
anti-HeC: anticorpos anti-hemácias de carneiro
C: animais controles
CAT: catalase
CDNB: clorodinitrobenzeno
CEUA: comitê de ética para uso de animais
CRF: fator liberador de corticotropina
DMBA: 7,12-dimethylbenz (a) anthracene
DNA: ácido desoxirribonucléico
DOM: animais dominantes
ERO: espécies reativas de oxigênio
GCs: glicocorticóides
GGT ou γ-GT: γ – glutamil transpeptidase
GlyGly: glicina
GPx: glutationa peroxidase
GR: glutationa redutase
GSH: γ – glutamil – cisteinil – glicina ou glutationa
GSSG: glutationa dissulfeto
GST: glutationa S- transferase
H
2
O
2
: peróxido de hidrogênio/ água oxigenada
HeC: hemácias de carneiro
HEPES: ácido N – 2 – hidroxietilpiperazina – N’ – 2 - etanosulfônico
xii
HPA: eixo hipotalâmico – pituitária- adrenal
IA: interação agonística
IgG: imunoglobulina G
IgM: imunoglobulina M
IL-1: interleucina - 1
KPi: tampão fosfato
MeHg: metilmercúrio
mRNA: RNA mensageiro
MFOS: múltipla falha orgânica no sistema
NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NFκB: fator de transcrição nuclear kappa B
PAH: hidrocarboneto aromático policíclico
PBS: solução veículo
PM: Pluz-Maze ou Labirinto em Cruz Elevado
PVN: núcleo paraventricular hipotalâmico
RG: receptor de glucocotricóide
RM: receptor de mineralocorticóide
SDS: dodecilsulfato de sódio
SI: sistema imune
SNC: sistema nervosa central
SOD: superóxido dismutase
SUB: animais submissos
TBARS: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
t-BOOH: hidroperóxido de tert-butila
xiii
1. INTRODUÇÃO
1.1. Breve histórico
Durante a segunda metade do Século XIX, o fisiologista Claude Bernard referia-se aos
seres vivos como organismos capazes de manter a constância de seu equilíbrio interno,
mesmo quando submetidos a modificações do meio ambiente. Contudo, alertava este
cientista para as conseqüências decorrentes de uma perda nessa propriedade auto-
reguladora, que poderiam levar a manifestação de doenças ou até mesmo a morte.
Posteriormente, Walter Cannon (1932) denominou de homeostase (do grego homoios,
similar, stasis, posição) essa capacidade dos seres vivos manterem essa constância.
Paralelamente, Hans Selye descreveu que uma falha no equilíbrio interno de um organismo
poderia ser decorrente de um estresse biológico. Assim, o termo síndrome do estresse foi
primeiramente empregado por este cientista para explicar as reações do corpo a vários
agentes nocivos, cujas manifestações foram caracterizadas por três fases: reação de alarma
(1ª fase), fase de resistência (2ª fase) e fase de exaustão (3ª fase). De acordo com Hans
Selye, “na reação de alarma, as células do córtex das supra-renais descarregam seus
grânulos – microscopicamente visíveis - de secreção hormonal, na circulação. Durante a
fase de resistência, o córtex acumula uma reserva abundante de grânulos segregados. Após
uma exposição prolongada a quaisquer agentes nocivos, a adaptação adquirida durante a
segunda fase é perdida, e começa a fase de exaustão, cujos sintomas eram em muitos
pontos semelhantes ao da reação inicial de alarma”. Estes registros demandavam uma
designação geral para toda a síndrome e uma vez que estes estavam relacionados com
14
adaptação, o conjunto de respostas não-específicas foi denominado de síndrome de
adaptação geral (Selye, 1959).
Atualmente, o termo “estresse” tem sido empregado para definir uma ameaça, real ou
imaginária, à integridade fisiológica de um organismo e que requer respostas
compensatórias para a manutenção da homeostase (Leonard, 2005; Radley & Morrison,
2005). Em seres humanos e outros vertebrados, os estímulos estressores são responsáveis
por uma ampla variedade de alterações fisiológicas que constituem a “resposta ao estresse”.
Transcorridos alguns segundos após a exposição ao estresse, observa-se a liberação de
catecolaminas do sistema nervoso simpático (epinefrina e norepinefrina), que é seguida
minutos após da ativação do eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal (HPA) (Sapolsky et al.,
2000). Como sabido, a ativação deste eixo leva a produção do fator liberador de
corticotropina (CRF) pelos neurônios parvocelulares do núcleo paraventricular
hipotalâmico (PVN), que por sua vez age nas células corticotrófas do lobo anterior da
pituitária para induzir a síntese e secreção do hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) na
circulação sistêmica, responsável pela liberação de glicocorticóides esteroidais da adrenal
(GCs). Os níveis de GCs são passíveis de auto-regulação através de um mecanismo
retroativo negativo, que ocorre tanto no PVN quanto na glândula pituitária. As
catecolaminas e os GCs mobilizam reservas energéticas de células hepáticas e adiposas, de
modo a assegurar o suplemento energético necessário para o exercício muscular. Em
associação, os GCs são responsáveis por uma diminuição nas atividades essenciais como
alimentação, digestão, crescimento, reprodução e classicamente por inibir o sistema
imunológico (Bohus & Koolhaas, 1991, Sheridan et al., 1994, Kielcot-Glaser et al., 1996,
Vedhara et al., 1999, Stefanski, 2000). A habilidade dos estímulos estressantes, como dos
GCs em suprimir a resposta imune foi reconhecida logo após os relatos pioneiros dos
15
estudos sobre o estresse e sobre a funcionalidade dos GCs (Dhabhar & McEwen, 2001). Há
que se considerar nestas análises fisiológicas, a natureza, a duração, a intensidade dos
estímulos estressores, assim como o sujeito experimental (espécie, cepa, idade, sexo e a
exposição prévia dos organismos a estímulos potencialmente estressores) (Moynihan et al.,
1994). A regulação do mecanismo de retroalimentação do eixo HPA por GCs é mediada
através da ativação de dois subtipos distintos de receptores intracelulares referidos como
receptor mineralocorticóide (RM) e receptor glucocorticóide (RG). O RM tem uma alta
afinidade para corticosteróides endógenos e sugere-se que a sua atuação esteja relacionada
à regulação das flutuações circadianas nesses hormônios. Em contraste ao RM, o RG tem
uma baixa afinidade para corticosteróides endógenos; contudo, acredita-se que o RG seja o
mais importante receptor na regulação da resposta ao estresse, quando os níveis endógenos
de GCs encontram-se elevados (revisado por Raone et. al., 2007).
1.2. Neurobiologia do estresse agudo e crônico
O estresse agudo pode ser definido como uma resposta a uma ameaça imediata, tanto
física, emocional ou psicológica; porém, de curta duração. Esta ameaça pode ser real ou
imaginária. A percepção desta ameaça possibilita o desencadeamento de processos
fisiológicos por parte dos organismos, como a ativação do sistema nervoso autonômico,
aumento nos níveis de cortisol, epinefrina e outros hormônios que serão responsáveis por
um aumento na freqüência cardíaca e respiratória, como também na pressão sanguínea.
Estas alterações promovem o aporte de glicose e oxigênio para os músculos, preparando o
organismo para uma possível luta e/ou fuga. Observa-se uma rápida conversão da energia
16
armazenada em energia utilizável para a resposta de fuga, em associação a uma interrupção
temporária de processos reprodutivos, digestivos, imunológicos e de crescimento.
Em contrapartida, o estresse crônico é definido como um estado fisiológico que envolve
situações não passageiras, como problemas de relacionamento social, pressões no trabalho,
complicações de saúde e/ou financeiras. Contrariamente aos benefícios causados por uma
resposta rápida ao estresse, os estímulos estressores prolongados ou crônicos podem
ocasionar mudanças anormais na plasticidade cerebral e prejudicar a habilidade do cérebro
em regular apropriadamente a homeostasia e responder a estressores subseqüentes. Esses
efeitos podem ser causados pela ação de GCs. Os GCs interagem com seus receptores em
múltiplos tecidos-alvo, incluindo o eixo HPA, onde atuam através de um mecanismo
retroativo negativo, inibindo a secreção do ACTH pela pituitária. Um aumento na
susceptibilidade à depressão, ansiedade ou nos distúrbios do estresse pós-traumático se
verifica nos indivíduos cujas alterações fisiológicas são decorrentes de uma má adaptação à
exposição a estímulos estressores (Radley & Morrison, 2005).
Cabe destacar as diferenciações observadas nas atividades do eixo HPA frente à
exposição ao estresse agudo ou crônico. O estresse agudo, se ambiental ou psicológico,
resulta na liberação de CRF, de ACTH pela glândula pituitária anterior e de
glicocorticóides do córtex da adrenal. A ativação do eixo HPA por estresse agudo produz
um aumento transitório nos níveis de GCs no plasma e uma resistência parcial ao
mecanismo retroativo negativo da liberação de GCs. Estas observações persistem durante e
pouco tempo após a exposição ao estímulo estressor agudo e envolvem uma rápida
desensitização de receptores de GCs no cérebro (Leonard, 2005).
17
Exposições recorrentes a estímulos estressores, assim como o tratamento prolongado
com GCs induzem a regulação tanto no número quanto na expressão do RNAm dos RGs
em diferentes áreas cerebrais (revisado por Raone et. al., 2007).
A exposição crônica ao estresse acarreta efeitos em várias funções celulares como o
prejuízo de defesas antioxidantes, causando dano oxidativo e até doenças como câncer
(revisado por Muqbil & Banu, 2006).
1.3. Estresse psicossocial
O corrente entendimento dos mecanismos psicológicos implícitos nas desordens
relacionadas ao estresse baseia-se em estudos neuroendócrinos e farmacológicos realizados
em seres humanos e principalmente em investigações conduzidas em uma ampla variedade
de espécies animais. De acordo com Koolhaas et. al. (1997), os estímulos estressores de
natureza social e física podem contribuir para o desenvolvimento de doenças, sendo
considerados fenômenos biológicos que ocorrem com freqüência em animais e seres
humanos. Segundo estes autores, os modelos experimentais utilizados em laboratório para o
estudo do estresse, que simulam os desafios a que os animais normalmente enfrentam no
seu habitat, possibilitam uma análise mais precisa dos mecanismos comportamentais e
fisiológicos envolvidos nesta condição. Neste sentido, as investigações que fazem uso de
modelos experimentais para indução de estresse em laboratório, que envolve comumente
estímulos estressores não-naturais, como exposição ao frio, choque nas patas, contenção
física, nado forçado, podem resultar em respostas significativamente distintas daquelas
observadas na exposição aos estímulos estressores de natureza social ou psicológica
(Tamashiro et. al., 2005).
18
Os modelos experimentais baseados em respostas não condicionadas a um perigo
potencial, como a interação social, defesa anti-predador, exploração claro-escuro e
separação induzida por vocalização ultrasônica são procedimentos que reproduzem
fielmente as situações do habitat natural de roedores (Rodgers & Cole, 1993), o que implica
na reação natural do animal, propiciando uma resposta não forçada e baseada somente no
estresse que essas situações causam. Os modelos de conflito social, por representarem uma
situação normal, a que animais poderiam sofrer no seu habitat natural, podem ser usados
para estudar alterações fisiológicas decorrentes de desordens psiquiátricas, incluindo
depressão maior, ansiedade generalizada, desordem de estresse pós-traumático, abuso de
drogas, psicopatologias agressivas, esquizofrenia e distúrbios de alimentação (Huhman,
2006).
O modelo de estresse social utilizando camundongos machos conspecíficos é baseado
na definição da hierarquia, a qual é originada pela necessidade imposta ao animal de
dominar o território. Sendo assim, os animais são classificados em dominantes ou
submissos, de acordo com o comportamento exibido, ofensivo ou defensivo (Tamashiro et.
al., 2005).
1.4. Estresse psicossocial e resposta imune
A interação social exerce efeitos distintos sobre a resposta imune de animais que
assumem posições hierárquicas sociais distintas. Estudos prévios realizados em
camundongos machos Swiss expostos à interação agonística (IA) por um período
equivalente a quatorze dias, com duração de cinco minutos/dia e que posteriormente foram
injetados com hemácias de carneiro (HC), mostraram uma redução nos títulos de anticorpos
19
anti-hemácias de carneiro (anti-HC); sobretudo, quando estes valores foram comparados
àqueles observados nos animais controles (C), não estressados. Embora esta redução nos
títulos de anticorpos anti-HC tenha sido verificada no grupo de animais expostos ao
estresse de IA, foram os animais submissos (SuB) que apresentaram os títulos de anticorpos
significativamente mais baixos. Estes dados levaram os autores a sugerirem que o impacto
do estresse de interação social sobre a resposta imune humoral foi maior nos animais que
assumiram a postura de submissão (Gasparotto et. al., 2002).
O sistema imune (SI) tem sido definido como o sexto sentido de um organismo, com a
função de detectar e transmitir o estímulo de um agente invasor ao SNC. Neste conceito,
alerta e ansiedade representam as manifestações de um animal que utiliza sons ou sinais
químicos de alarme para informar ou comunicar uma situação estressante aversiva como a
presença de conspecíficos na colônia (Fernandes, 2000).
A resposta imune tem sido definida como uma resposta ao estresse não cognitiva. Essa
resposta ativa o eixo HPA através de um aumento do RNAm do hormônio CRF no PVN,
que é mediado pela ação de interleucina – 1 (IL-1), uma das citocinas mais potentes na
ativação do eixo HPA. Dependendo do tipo, da intensidade e da duração do estímulo
estressor, este pode aumentar ou até mesmo, diminuir a resposta imune humoral. Esse
efeito duplo é mediado pelo CRF, que pode levar a uma imunossupressão ou a estimulação
da atividade imunológica, dependendo da valência emocional do estressor agudo
(Fernandes, 2000). Sendo assim, o desafio imune é considerado um estressor muito mais
complexo que um estímulo puramente físico, devido aos componentes comportamentais
envolvidos nos mecanismos de defesa animal que são importantes para a sobrevivência
animal (Fernandes, 2000).
20
1.5. Estresse oxidativo
O metabolismo do oxigênio origina subprodutos altamente reativos que danificam
macromoléculas importantes para a manutenção da célula, como proteínas, lipídios e DNA
(Serafini et. al., 2001). Ao longo da evolução, as células desenvolveram mecanismos para
proteger seus componentes da toxicidade causada pela reatividade do oxigênio. As
moléculas que possuem um elétron desemparelhado no último orbital são chamadas de
Espécies Reativas de Oxigênio (ERO), as quais podem perturbar a fisiologia celular devido
ao desbalanço na homeostasia antioxidante que pode ser decorrente do excesso dessas
moléculas no ambiente intracelular. A formação das ERO leva a célula a desencadear
processos de correção para o dano oxidativo, tais como defesas enzimáticas, mediadas por
antioxidantes enzimáticos, ou não-enzimáticas, como os antioxidantes de baixo peso
molecular, tipo vitaminas C e E, carotenóides, o tripeptídio Glutationa (GSH) e ácido úrico,
dentre outros. O aumento das ERO e/ou a diminuição da capacidade antioxidante celular
acarreta uma modificação estrutural e/ou funcional da célula, característicos de um estresse
oxidativo (Serafini et. al., 2001).
Os danos causados pelo estresse oxidativo incluem, principalmente, clivagem do DNA
pela hidroxilação da guanina e metilação da citosina (Lee et. al., 2002), lise mitocondrial,
influxo de cálcio, oxidação de proteínas e geração dos derivados de carbonil e nitrotirosina
(Adams et. al., 2001), e peroxidação de lipídios da membrana celular (Marks et. al., 1996).
Os organismos aeróbicos desenvolveram, portanto, diferentes mecanismos de defesa
antioxidante, enzimáticos e não-enzimáticos, que podem prevenir a formação das ERO,
reagir com estes intermediários reativos, bem como reparar os danos causados pelos
mesmos (Sies, 1993).
21
O estresse oxidativo pode ser desencadeado por doenças neurodegerativas como mal de
Parkinson e Alzheimer, as quais afetam as células do sistema nervoso ocasionando dano
neurotóxico. Compostos neurotóxicos ambientais, a exemplo do metilmercúrio (MeHg),
causam prejuízos à saúde de humanos e animais (Clarkson et. al., 2003). Segundo Franco
et. al. (2006), a administração de MeHg na água de camundongos fêmeas lactantes causa
significantes prejuízos na performance motora da prole, o que pode estar relacionado a
alterações no estado tiol cerebelar, demonstrando a imaturidade das células do sistema
nervoso central em utilizar uma resposta compensatória ao dano oxidativo causado pela
ingestão de MeHg, através do leite materno.
O cérebro é particularmente sensível aos danos causados por radicais livres e ERO
devido à sua alta taxa metabólica e sua capacidade relativamente reduzida de regeneração
celular comparada com outros órgãos (Andersen, 2004).
Além disso, os tecidos cerebrais contêm grandes quantidades de ácidos graxos
poliinsaturados que podem ser oxidados por radicais livres. Finalmente, o cérebro contém
altos níveis de ferro, o qual tem sido referido como importante elemento associado à
produção de radicais livres e injúria neural (Herbert et. al., 1994).
1.5.1. Defesas não enzimáticas
A GSH é um composto sulfidrílico não protéico presente em todos os organismos e que
está envolvida na regulação da síntese protéica e organização enzimática, na formação de
deoxirribonucleotídeos, precursores de DNA, na manutenção de grupos sulfidrílicos de
proteínas intracelulares e na proteção de células contra radicais livres e ERO (revisado por
Erat et. al., 2006). A forma reduzida de GSH é um antioxidante biológico presente em altas
22
quantidades, especialmente no fígado, e sua presença é pré-requisito para a proteção contra
o dano oxidativo (Muqbil & Banu, 2006). Em estudos anteriores, este grupo de pesquisa
mostrou que o estresse de restrição resultou na geração de estresse oxidativo por diminuir o
conteúdo total de GSH e as atividades da superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e
Glutationa s-transferase (GST) no fígado e outros tecidos de ratos. Estudos realizados com
7,12-dimetilbenzeno (a) antraceno (DMBA) demonstraram a depleção de GSH com
concomitante aumento nos níveis de TBARS, nos ratos submetidos ao estresse de
contenção física e nos animais tratados com DMBA, e um decréscimo nas atividades das
enzimas antioxidantes SOD, GST, CAT e Glutationa Redutase (GR). A GSH é utilizada
por defesas enzimáticas como GR, Glutationa Peroxidase (GPx) e GST.
1.5.2. Defesas enzimáticas
A GR é essencial para a manutenção da GSH celular em sua forma reduzida, que é
altamente nucleofílica por muitos eletrófilos reativos. É um membro do nucleotídeo
piridina dissulfeto oxiredutase da família das flavoenzimas, que catalisa a redução da
glutationa dissulfeto (GSSG) à forma reduzida (GSH) na presença de NADPH. A GSH está
envolvida também como um substrato no ciclo redox de GSH citosólico, ou está apta a
inativar radicais livres e ERO, que são conhecidas por serem efetivos agentes estressores
(revisado por Erat et. al., 2006).
O acúmulo de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) na célula não é benéfico. Para detoxificar
essa ERO, duas atividades enzimáticas podem ser requeridas: a da CAT e a da GPx. Ambas
atuam transformando H
2
O
2
em H
2
O e O
2
. A CAT utiliza somente H
2
O
2
como substrato,
porém a GPx usa outros substratos além de H
2
O
2
. Portanto, a atividade da GPx representa a
23
primeira resposta protetora a pequenos ajustes nas concentrações de H
2
O
2
. Além disso,
além de H
2
O
2
, as GPxs podem também metabolizar moléculas orgânicas peroxidadas,
completando as ações seqüestradoras dela na reciclagem de algumas das moléculas que têm
sido atacadas seguido do vazamento de H
2
O
2
e, consequentemente, a produção de radical
hidroxil (Drevet, 2006).
A célula também possui a GST, que é uma defesa enzimática envolvida na conjugação
e detoxificação de uma larga quantidade de xenobióticos, incluindo carcinógenos
ambientais e agentes quimioterapêuticos (Ye & Song, 2005).
Outra defesa enzimática é a γ-Glutamil transpeptidase (GGT), que é uma enzima
glicoproteica ligada à superfície da membrana celular que catalisa a transferência do grupo
γ-glutamil para outros aminoácidos aceptores, peptídeos ou água (revisado por Borowski,
2006).
1.6. Estresse oxidativo e a ativação imune
O SI participa de diversas funções no organismo. Do ponto de vista funcional, os
leucócitos são fortemente influenciados pelo balanço antioxidante/oxidante (revisado por
Alvarado et. al., 2006). Uma situação que exemplifica a ação do sistema imune no
desencadeamento de uma série de eventos que podem ocasionar danos oxidativos nas
células é a sepse. A sepse é um complexo estado patofisiológico que está associado a um
alto grau de mortalidade. Os sintomas iniciais da sepse são associados com inflamação
aguda, incluindo febre ou hipotermia, taquipnéia, taquicardia, alta quantidade de células
sangüíneas brancas e edema pulmonar, e finalmente originando uma múltipla falha
orgânica no sistema (MFOS) (Victor et. al., 2004). Na sepse há várias fontes potenciais de
24
ERO, incluindo a cadeia transportadora de elétrons mitocondrial, a ativação da xantina
oxidase, como resultado da isquemia e reperfusão, a interrupção na cadeia respiratória
associada com a ativação celular imune, o metabolismo do ácido araquidônico e a NADPH
oxidase (Victor et. al., 2004).
Sob condições fisiológicas normais, a maioria das ERO é formada durante a respiração
celular e pela ativação de células fagocíticas, incluindo neutrófilos, envolvido em resposta
inflamatória. Os neutrófilos produzem o fator de transcrição nuclear, NF-κB, que tem sua
atividade induzida pela resposta a vários estressores fisiológicos, como isquemia,
reperfusão, regeneração do fígado, choque hemorrágico e agentes quimioterapêuticos
(revisado por Victor et. al., 2004).
Fatima et al. (2007) analisaram o efeito combinado de vários inseticidas (atrazine,
diuron e isoproturon) sobre a imunidade humoral anti-hemácia de carneiro e a indução de
estresse oxidativo em peixes. Para tanto, uma concentração acumulada (50µg/l) destes
inseticidas foram adicionados na água por 12 semanas e a produção de anticorpos anti-HC,
assim como a indução de estresse oxidativo em células de fígado, rim e baço foram
analisadas em peixes imunizados com HC. Os resultados mostraram que a exposição
combinada destes inseticidas causa imunossupressão em peixes.
A bidirecionalidade existente entre o Sistema Nervoso Central e o Sistema Imune foi
claramente demonstrada em modelos experimentais que analisam os efeitos do estresse de
natureza psicossocial e/ou biológica em diferentes espécies animais. As implicações
decorrentes desta interconexão entre estes sistemas e a exposição a estímulos estressores
estão sendo analisadas sob o ponto de vista de indução de dano oxidativo às células.
Embora alguns mecanismos responsáveis por estes danos teciduais sejam conhecidos,
muito pouco se sabe sobre o comprometimento tecidual decorrente da exposição a um
25
estímulo de natureza psicossocial, seguido da exposição a um estímulo de natureza
imunogênica. O presente trabalho tem por objetivo geral elucidar a questão acima indicada,
assim como realizar uma análise cinética (temporal) que vise à compreensão dos possíveis
mecanismos envolvidos na deflagração destes processos.
26
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Avaliar a influência da exposição de camundongos albinos Swiss ao estresse de
natureza psicossocial e/ou biológica na ativação de uma resposta imune humoral e na
indução de estresse oxidativo.
2.2. Objetivos específicos
Estabelecer a dinâmica temporal da resposta imune humoral de animais injetados com
hemácias de carneiro (estresse biológico).
Avaliar a cinética da resposta imune humoral de animais submetidos à interação
agonística e injetados com hemácias de carneiro, considerando a posição hierárquica
assumida pelos animais durante as interações.
Avaliar a produção de TBARS como indicativo de agressão em membrana lipídica e
ativação de enzimas com ação antioxidante em diferentes intervalos do período de
exposição ao estresse psicossocial e ao estresse biológico com HC.
Analisar a possível interação entre os efeitos moduladores dos estímulos estressores
utilizados e o metabolismo oxidativo.
Avaliar a influência da posição hierárquica dos animais submetidos à interação
agonística sobre o metabolismo oxidativo.
27
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
Foram utilizados 247 camundongos albinos suíços machos, com 60 dias de idade,
provenientes do Biotério Central da UFSC. Após o desmame dos animais, ocorrido cerca
de vinte e um dias após o nascimento, estes animais foram transferidos para o Laboratório
de Neurobiologia do Estresse. Todos os experimentos realizados no presente estudo foram
aprovados pelo Comitê de Ética para Uso de Animais (CEUA/UFSC) e estão de acordo
com as Diretrizes de Cuidados com Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de
Saúde dos Estados Unidos da América.
3.2. Manutenção
Após o recebimento dos animais pelo Laboratório de Neurobiologia do Estresse, estes
foram mantidos inicialmente em grupos de irmãos, em gaiolas de polipropileno medindo 13
x 19 x 30 cm, fechadas com tampa de malha de aço e forradas com serragem de madeira
(pinheiro) esterilizada com o objetivo de aclimatá-los às condições do ambiente
laboratorial. As salas de manutenção dos animais dispuseram de iluminação artificial, com
ciclo claro-escuro de doze horas (12:12 horas), com as luzes acendendo às 4 horas e
desligando às 16:00 de cada dia. A temperatura ambiente foi mantida entre 21 ± 2°C. A
alimentação fornecida aos animais foi constituída de ração convencional para roedores
(BIO-TEC) e as mamadeiras contendo água clorada foram oferecidas livremente aos
28
animais. Ao completar 60 dias de idade, todos os animais receberam o vermífugo
Ivermectina (Ivomec) por gavagem, obedecendo a concentração de 0,1 mg/ Kg de peso, em
solução contendo 0,05 mL/10 gramas. Após o procedimento de desinfecção parasitária,
cada um dos animais foi transferido para uma gaiola de polipropileno opaca (13 x 19 x 30
cm). Estes animais permaneceram isolados durante todo o período de experimentação,
exceto no tempo em que estes animais foram submetidos à interação social.
3.3. Protocolo experimental
Como protocolo experimental básico, analisou-se os efeitos da exposição ao estresse de
interação social sobre a ativação de uma resposta imune humoral e sobre o estresse
oxidativo no córtex cerebral frontal. Para tal, os animais foram aleatoriamente distribuídos
em grupos experimentais e expostos ao estresse de interação social por diferentes períodos
de tempo que variaram de 0 (zero) até 13 (treze) dias. O estresse de interação social foi
induzido mediante a transferência de dois animais de suas respectivas gaiolas de
manutenção para uma arena neutra com maravalha nova. A interação foi analisada
diariamente, na segunda metade do ciclo claro, por um período de dez minutos. Durante
este período, os comportamentos exibidos pelos animais foram observados e catalogados
por um observador presente na sala, para posterior determinação dos comportamentos de
dominância e submissão. Após a interação social, os animais retornavam às suas
respectivas caixas de manutenção.
Como estímulo imunogênico utilizou-se HC (estresse biológico) para a ativação de uma
resposta imune humoral, cujo procedimento de preparo encontra-se descrito no item 3.6. A
29
injeção de HC foi realizada após o final da primeira sessão de indução de estresse de
interação social (Figura 1)
Como controle destes experimentos utilizamos animais não expostos ao estresse de
interação social, como também, animais que receberam 0,1 mL de uma solução salina
tamponada com fosfato, 0,01 M, pH 7,2 (PBS).
A análise dos efeitos sobre a ativação de uma resposta imune humoral à HC e a
avaliação do estresse oxidativo no córtex cerebral frontal foi realizada 4 horas, 3, 5, 7, 9, 11
ou 13 dias após a injeção de hemácias de carneiro ou da solução veículo (PBS), conforme
detalhado nas Figura 2 e 3. A tabela 1 mostra os grupos de animais alinhados por
combinações de estresse social, inoculo, tempo de exposição ao estresse (dias) e dados de
coleta de sangue e córtex cerebral.
Figura 1 – Diagrama esquemático dos procedimentos experimentais utilizados nos animais
para o estudo dos efeitos do estresse de interação social sobre a resposta imune humoral à
HC e sobre o estresse oxidativo no córtex cerebral frontal.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Injeção de
Hemácia
▼
Coleta de
Material
Biológico
(sangue e
tecido
cerebral)
▼
Estresse
Oxidativo
0
4h 3 5 7 9 11 13
30
Dias 0 3 5 7 9 11 13
Grupo
Ct In !C
Ct In
Ct In C
Ct In C
Ct In C
Ct In C
Ct In C
Ct In C
Figura 2. Protocolo de inoculação e coleta de material biológico (sangue e tecido
cerebral) nos animais do grupo controle. Ct - Grupos de animais não expostos ao estresse
social e que receberam injeção de HC ou de PBS; Dias - indica o dia em que foi feita a
coleta do material biológico; In - dia em que foi feita a injeção de HC ou de PBS; C - dia
em que foi feita a coleta de sangue e de tecido cerebral.
Dias
0 3 5 7 9 11 13
Grupos
Es Es! In !
C
Es Es ! In
Es Es ! In C
Es Es ! In Es C
Es Es ! In Es Es C
Es Es ! In Es Es Es C
Es Es ! In Es Es Es Es C
Es Es ! In Es Es Es Es Es C
Figura 3. Protocolo experimental e coleta de material biológico (sangue e tecido cerebral)
nos animais estressados socialmente. ES - Grupos de animais expostos ao estresse social
e que receberam injeção de HC ou de PBS; Dias - indica o dia em que foi feita a coleta do
material biológico; In - dia em que foi feita a injeção de HC ou de PBS; C - dia em que
foi feita a coleta de sangue e de tecido cerebral.
31
Figura 4
Grupos de animais alinhados por combinações de estresse social, inóculo, tempo
de exposição ao estresse (dias) e dados de coleta de sangue e córtex cerebral
Animais Grupos/Tempo de
exposição ao
estresse
Inóculo Anti-HC/O/AO
E E4
h
, E3, E5, E7,
E9, E11, E13
HC 4
h
,3,5,7,9,11,13
E E4
h
, E3, E5, E7,
E9, E11, E13
V 4
h
,3,5,7,9,11,13
C C4
h
, C3, C5, C7,
C9, C11, C13
HC 4
h
,3,5,7,9,11,13
C C4
h
, C3, C5, C7,
C9, C11, C13
V 4
h
,3,5,7,9,11,13
E = grupo de animais estressados socialmente
C = grupo de animais não estressados socialmente (controles)
HC = hemácias de carneiro
V = solução veículo
Anti-HC = anticorpos Anti-HC
O = mecanismos oxidantes
AO = mecanismos anti-oxidantes
3.4. Estresse de interação social
Animais com 75 dias foram escolhidos de acordo com a massa corporal para comporem
as duplas permanentes de interação social. As duplas foram formadas por animais de
diferentes ninhadas.
Nos dias de interação social, os animais de cada dupla eram transferidos de suas gaiolas
de manutenção para arenas neutras, no horário entre 12h e 13h (8h do ciclo claro). Os
comportamentos de interação social foram observados por um período de 10 minutos. Os
animais que exibiram os comportamentos: cheirar, perseguir e atacar o oponente foram
considerados animais Dominantes (Dom), e àqueles que assumiram uma postura de fuga, às
vezes vocalizando ou mesmo posicionando-se de forma defensiva ao oponente, levantando
32
as patas dianteiras ou apresentando congelamento (freezing) foram considerados como
Submissos (Sub).
Nos embates muito violentos, as duplas eram separadas antes da finalização do período
de interação social. Em contrapartida, nos casos em que não foram observadas interações
sociais entre as duplas no período estipulado, cinco minutos adicionais foram computados
para verificar a possibilidade do estabelecimento da interação entre as mesmas. Nos casos
em que não houve embates nas duplas de animais, ou nas situações em que os
comportamentos exibidos pelas duplas alternavam-se diariamente, estipulou-se a não
dominância entre os oponentes.
3.5. Estímulo imunogênico (estresse biológico)
Como estímulo imunogênico utilizou-se uma suspensão de hemácias de carneiro
obtidas através da punção da veia jugular do carneiro. Para o preparo desta suspensão, as
hemácias foram lavadas três vezes em PBS, durante um período equivalente a cinco
minutos, mediante centrifugação a 150 g. Na última etapa de centrifugação, o sobrenadante
foi eliminado e o sedimento de hemácias obtido foi ressuspenso em solução PBS. A
concentração desta suspensão foi acertada de modo a obter 10
9
hemácias/mL. Após a
obtenção da suspensão de hemácias de carneiro, os animais receberam uma injeção
contendo 10
8
hemácias em um volume de 0,1 mL, por via intraperitoneal.
A injeção de hemácias de carneiro ou de PBS nos animais expostos ao estresse social
foi feita após a primeira sessão de IA.
33
3.7. Coleta e preparação de amostras
3.7.1. Coleta de material biológico
As amostras de sangue foram retiradas por punção cardíaca com os animais
anestesiados com éter etílico. O sangue obtido (800 µL de sangue) foi depositado em tubos
Eppendorf para posterior obtenção do soro. Em seguida, os animais foram decapitados para
a retirada de tecido cerebral (córtex frontal) bilateralmente.
3.6.2. Preparação das amostras de tecido cerebral e do sangue
Terminadas as coletas, o tecido cerebral foi armazenado em freezer à temperatura de -
80ºC. O sangue depositado em tubos Eppendorf foi centrifugado a 150 g, por um período
equivalente a dez minutos. O soro obtido foi inativado a 56°C e em seguida armazenado
em freezer a -20°C para posterior avaliação da presença de anticorpos anti-HC.
34
3.6.3. Ensaio de hemaglutinação
Para avaliar a produção de anticorpos anti-HC, amostras de 50 µL de soro inativado
puro ou diluído foram depositadas nos poços das placas de microhemaglutinação. Na
seqüência, 50 µL de uma suspensão de HC, diluída a 2% em PBS foi adicionada em cada
poço da placa. As placas foram mantidas em repouso e incubadas por um período de 24
horas, a uma temperatura de 4°C. A produção de anticorpos foi analisada mediante a
observação de uma reação de aglutinação, cuja leitura foi feita em microscópio
estereoscópio (Olympus). O título de anticorpos anti-HC foi determinado e expresso pela
maior diluição do soro que apresentou o padrão característico de uma reação de
aglutinação.
3.8. Parâmetros pró-oxidantes
3.7.1. Lipoperoxidação – método espectrofotométrico: TBARS – MDA
Os homogenatos, constituídos de córtex homogeneizados em 400 µL de HEPES 20mM
pH 7,0, foram incubados em banho-Maria com 40 mL de ácido tricloroacético 30%, 40 mL
de ácido tiobarbitúrico e 20 mL SDS 8,1% por 60 minutos a 95 º C. Em seguida, a leitura
da reação foi feita em espectrofotômetro, no comprimento de onda de 535 nm.
35
3.8. Parâmetros antioxidantes
O córtex cerebral de cada animal foi homogeneizado em 300 µL de tampão HEPES
20mM pH 7,0. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 20.000 g, a 4º C. O
sobrenadante foi coletado para as dosagens das enzimas antioxidantes GR, GST, GGT.
3.8.1. Avaliação da atividade da Glutationa Redutase (GR)
O meio de reação foi composto de 20 mL de tampão fosfato (KPi) 0,25 M, 17 mL de
água destilada e 111 µL de NADPH (100 mM). Para a determinação do valor basal das
amostras no espectrofotômetro foi colocado 375 µL do meio de reação, 80 µL de água
destilada e 20 µL da amostra na cubeta. Uma vez determinado o valor basal, através da
utilização de um comprimento de onda de 340 nm, foi adicionado o substrato GSSG, para
possibilitar o consumo de NADPH na reação, por 2 minutos. Do decaimento por minuto
obtido, descontou-se o consumo inespecífico de NADPH. O valor obtido foi dividido pelo
coeficiente de extinção molar do NADPH (ε = 6.220 M
-1
cm
-1
) e multiplicado pelas
diluições. O valor foi expresso como mUnidades/mg de proteína. Uma unidade corresponde
a 1 µmol/mL/min.
3.8.2. Avaliação da atividade Glutationa s-Transferase (GST)
O meio de reação foi composto de 16 mL de água destilada, 20 mL de tampão fosfato
(KPi) 0,25 M e 0,25 mL GSH 100 mM. Foram feitas leituras independentes, realizadas por
2 minutos, com o objetivo de mensurar a velocidade da reação espontânea do substrato 1 –
36
cloro – 2,4 – dinitrobenzeno (CDNB) com GSH, neste caso, sem a presença da amostra.
Uma vez acrescentada à amostra e o segundo substrato (CDNB) ao meio de reação,
realizou-se a leitura por 2 minutos a 340 nm. Ao decaimento por minuto obtido com a
amostra, descontou-se a velocidade da reação espontânea. O valor obtido pelo coeficiente
de extinção molar do conjugado GSH/CDNB (ε = 9.600 M
-1
cm
-1
) foi multiplicado pelas
diluições. O valor foi expresso como mUnidades/mg de proteína. Uma unidade corresponde
a 1 µmol/mL/min.
3.8.3. Avaliação da atividade de Glutationa Peroxidase (GPx)
Foram utilizados 20 mL de (KPi) 0,25 M, 3,1 mL de GR (5 U/ml), 0,5 mL de GSH
(100mM), 14,5 mL de água destilada, 111 µL de NADPH (100 mM). Para todas as
amostras foi lido o basal, constituído de meio de reação, água e amostra, sem o substrato,
hidropéroxido de tert-butila (t-BOOH - 17 µL/10 mL KPi 0,1 M). Após a leitura de cada
valor basal, adicionou-se a amostra neste meio para mensurar o consumo inespecífico de
NADPH através de uma leitura por 2 minutos a 340 nm. Ao se adicionar o substrato t-
BOOH, a leitura foi realizada por mais 2 minutos. Ao decréscimo de absorbância por
minuto obtido, descontou-se o consumo inespecífico de NADPH. O valor obtido foi
dividido pelo coeficiente de extinção molar do NADPH (ε = 6.220 M
-1
cm
-1
) e
multiplicado pelas diluições. O valor foi expresso como mUnidades/mg de proteína. Uma
unidade corresponde a 1 µmol/mL/min.
37
3.8.4. Avaliação da Atividade de γ – Glutamil Transpeptidase (GGT)
A atividade da GGT foi analisada a partir dos sedimentos. Foram preparados dois meios
de reação. O meio um continha 11,5 mL de água destilada, 6 ml de Tris 0,5 M pH 8,0, 10
ml PNA e 10 mL de glicil glicina (GlyGly). O meio dois continha apenas 31,5 mL de água
destilada e 6 mL de Tris/HCl 0,5 M pH 8,0. Após adicionadas as amostras aos meios de
reação dentro dos Eppendorfs, estes foram deixados na bancada, por 30 minutos, a fim de
possibilitar a transferência da porção γ – Glutamil do substrato sintético γ – Glutamil p-
nitroanilide para glicil-glicina. Deste modo, um cromóforo é formado e lido em 410 nm.
3.9. Dosagem de proteínas
Para a análise da atividade das enzimas antioxidantes, o conteúdo de proteínas totais
dos córtices foi quantificado pelo método de Bradford (1976). A absorbância foi lida em
espectrofotômetro a 595 nm, usando a albumina de soro bovino como padrão.
3.10. Análise estatística dos dados
Os títulos de anticorpos foram expressos com base na média geométrica e o
intervalo confidencial, como sugerido em Gasparotto et. al. (2002). Estes dados foram
submetidos a uma análise não paramétrica ANOVA (teste de Kruskal-Wallis) seguido pelo
teste de Dunn para múltiplas comparações dos pares de dados. O TBARS e as enzimas
antioxidantes foram expressas com base na média e desvio padrão e foram introduzidas
numa análise de variância (3-via ANOVA) com o inóculo como fator único com dois níveis
38
(camundongos injetados com HC e veículo), hierarquia como dois fatores, com três níveis
(C, Dom, Sub), e o tempo como três fatores, com 7 níveis (4 horas, 3, 5, 7, 9, 11 e 13 dias
depois da injeção de inóculo e/ou exposição ao estresse social), seguido pelas comparações
dois a dois (teste HSD de Tukey). O valor estatístico de p, considerado do resultado obtido,
foi limitado na apresentação para 0,001 e o nível de significância adotado foi de 0,05.
Devido ao grande número de dados, somente o valor médio dos dados e a distribuição ao
longo do tempo em animais de diferentes posições sociais foram graficamente
representados, a despeito da significância da análise estatística nos efeitos dos fatores
específicos e a interação dos mesmos mencionados no texto.
39
4. RESULTADOS
4.1. Ativação da resposta imune humoral à HC
A resposta imune humoral observada nos grupos de animais estressados socialmente
(E) e não estressados (C) mostraram alterações significantes ao longo do tempo (KW=
80,65; p<0,001), contudo não foram observadas diferenças estatisticamente significantes
entre os grupos. A comparação entre os animais controles (C) e os animais submetidos ao
estresse social, separados de acordo com a hierarquia, ou seja, em animais submissos (Sub)
e dominantes (Dom) mostrou que há uma diferença temporal na ativação desta resposta
(KW= 65,52; p<0,001) sem, contudo revelar uma diferença entre os grupos. Títulos
elevados de anticorpos anti-HC foram observados no 5º e 11º dia após a injeção de HC
(Fig. 5).
035791113
0
250
500
750
1000
Dom
Sub
C
days
Título de Anticorpos
Fig 5. Média geométrica e intervalo confidencial dos títulos de anticorpos anti-HC obtidos ao
longo do tempo (dias). C= camundongos não estressados (controles); Dom= camundongos
dominantes e Sub= camundongos submissos.
Dias
40
4.2. Marcadores oxidativos do estresse
4.2. Marcadores Oxidativos de Estresse
As dosagens de TBARS como indicativo de dano na membrana, assim como as
atividades enzimáticas dos substratos envolvidos no metabolismo anti-oxidativo foram
expressos em nM/min/mL.
4.2.1. TBARS
A avaliação do efeito do inóculo ou do estresse social na média dos níveis de
TBARs no parênquima cortical não revelou alterações estatisticamente significantes.
Todavia, a análise mostrou que a produção de TBARS se alterou ao longo dos 13 dias de
experimento [F(6,215)= 26,40; p< 0,001]. Os níveis mais baixos de TBARs foram
observados cerca de 4 horas após o início do experimento. Em contraposição, os níveis
mais elevados de TBARs foram observados nos 5º e 13º dias. Embora a análise ao longo do
tempo não tenha demonstrado diferenças estatisticamente significantes entre os inóculos
empregados, os níveis de TBARS foram afetados pelo estresse social [F(6,215)= 5,81; p<
0,001]. A separação de camundongos estressados, de acordo com a posição hierárquica
assumida durante as interações, mostrou que ambos os grupos, Dom e Sub exibiram níveis
similares de TBARS (Fig. 6). Animais de diferentes hierarquias apresentaram diferentes
níveis de TBARS ao longo do tempo (Fig. 7 A e B) [F(12,193)= 3,93; p< 0,001]. No 5º dia
do experimento, os níveis de TBARS no parênquima cortical dos camundongos
pertencentes ao grupo controle (C) foram mais elevados do que os observados em
41
camundongos submetidos ao estresse (E) (p< 0,001). No décimo terceiro dia de
experimento, os camundongos C exibiram níveis mais baixos de TBARS do que os animais
Dom (0,043).
NS/SRBC
Do
m
/S
RB
C
S
u
b/
S
RB
C
N
S
/V
Do
m
/V
Sub/V
0
1
2
C/HC
Dom/HC
Sub/HC
C/V
Dom/V
Sub/V
TBARS-nM/min/ml
Fig. 6. Média da produção de TBARS no parênquima cortical de camundongos de
diferentes hierarquias sociais injetados com HC ou Veículo (V).
0
1
2
3
C/HC
Dom/HC
Sub/HC
0 3 5 7 9 11 13
days
TBARS-nM/min/ml
A)
42
C/V
Dom/V
Sub/V
0 3 5 7 9 11 13
days
TBARS-nM/min/ml
B)
Fig. 7 A e B. Média dos níveis de TBARS obtidos no parênquima cortical de camundongos
ao longo do tempo (dias). A) animais injetados com HC, B) animais injetados com V.
4.2.2 – GR
Uma interferência do estresse psicossocial foi observada na média dos níveis de GR
ao longo do experimento [F (1,216)= 13,73; p< 0,001], uma vez que este fator diminuiu
significativamente os níveis desta enzima (p< 0,001). Por outro lado, o inóculo não foi
capaz de induzir alterações nos níveis de GR. Desta maneira, a interação entre o inóculo e o
estresse social resultou num efeito marginalmente significante [F(1,216)= 3,82; p< 0,05]
nos níveis de GR.
Foi observado que o grupo de camundongos estressados e injetados com solução
veículo apresentou níveis mais baixos de GR do que o grupo de camundongos controle,
injetados com veículo (p< 0,001). A despeito da variação significante nos níveis de GR ao
43
longo do tempo (F(6,216)= 2,98; p< 0,001), nenhum efeito do estresse social ou inóculo foi
observado no 7º dia das análises. A classificação dos grupos de animais estressados em
animais Dom e Sub resultou numa interação não significante deste fator com o inóculo na
média dos níveis de GR (Fig. 8), assim como na análise ao longo do tempo (Figs. 9 A e B).
NS/S
R
BC
Do
m
/S
RB
C
S
u
b/
S
RB
C
N
S
/V
Do
m
/V
Su
b
/V
0
25
50
75
C/HC
Dom/HC
Sub/HC
C/V
Dom/V
Sub/V
GR-nM/mim/ml
Fig. 8. Média dos níveis de GR no parênquima cortical de camundongos de diferentes
hierarquias sociais, injetados com HC ou V.
A)
0
25
50
75
C/HC
Dom/HC
Sub/HC
days
0 3 5 7 9 11 13
GR-nmmin/ml
44
B)
0
25
50
75
100
C/V
Dom/V
Sub/V
0 3 5 7 9 11 13
days
GR-nm/min/ml
Fig. 9 A e B. Média dos níveis de GR obtidos no parênquima cortical de camundongos ao
longo do tempo (dias). A) animais injetados com HC, B) animais injetados com V.
4.2.3. GPX
A média dos níveis de GPx no parênquima cortical mostrou uma interação
significante do inóculo e estresse social [F(1,215)= 33,90; p< 0,001]. Neste estudo, os
níveis mais baixos de GPx foram observados em camundongos controle e injetados com
hemácia (p< 0,001).
A separação do grupo de animais estressados em Sub e Dom permitiu demonstrar
uma interação significante entre o inóculo e o estresse social [F (2,193)= 16,27; p< 0,001].
Os camundongos Sub e Dom apresentaram níveis estáveis de GPx e os camundongos C
injetados com HC apresentaram baixos níveis de GPx (p< 0,001) (Fig. 10). Uma análise ao
longo do tempo mostrou uma interação do estresse social e o inóculo [F(6,215)= 3,01; p<
0,001], com diferenças entre grupos somente no 13º dia. Neste período, os camundongos C
45
injetados com HC apresentaram níveis de GPx mais baixos do que os camundongos E
injetados com HC (p< 0,001) e os camundongos C injetados com veículo (p< 0,005) (Fig.
11 A e B).
NS/SRBC
Dom/SR
B
C
Sub
/S
R
B
C
N
S
/V
Dom/V
Sub/V
0
5
10
15
C/HC
Dom/HC
Sub/HC
C/V
Dom/V
Sub/V
***
***
***
***
GPX-nM/min/ml
Fig. 10. Média dos níveis de GPX no parênquima cortical de camundongos de diferentes
hierarquias sociais injetados com HC ou V. *** representa p < 0,001.
46
0
10
20
C/HC
Dom/HC
Sub/HC
0 3 5 7 9 11 13
days
***
GPx-nm/min/ml
B)
0
10
20
C/V
Dom/V
Sub/V
days
0 3 5 7 9 11 13
+++
GPX-nM/min/ml
Fig. 11 A e B. Média dos níveis de GPX obtidos no parênquima cortical de camundongos
de diferentes posições hierárquicas ao longo do tempo (dias). A) animais injetados com HC
(*** denota níveis mais baixos de GPX em camundongos controles injetados com HC
comparados com camundongos Dom e Sub injetados com HC), B) animais injetados com
V (+++ indica níveis mais baixos de GPX em camundongos Dom e Sub do que em
camundongos controles injetados com V).
A)
47
4.2.3. GST
A análise da média dos níveis de GST no parênquima cortical mostrou um efeito
significante do estresse social [F(1,214)= 6,34; p< 0,0126] nesta enzima, representado por
um significativo aumento da mesma (p< 0,0115). O inóculo não afetou os níveis de GST,
até mesmo quando se analisou a interação deste fator com o estresse social. Na análise ao
longo do tempo, o estresse social afetou os níveis de GST [F(6,214)= 5,35; p< 0,001), cujo
aumento foi observado no 5º dia do experimento (p<0,001). Com a separação dos grupos de
camundongos estressados em Sub e Dom, o efeito do estresse social permaneceu
significante [F(2,192)= 3,30; p< 0,0391]. Os camundongos Sub apresentaram níveis mais
elevados de GST do que os grupos de animais C (p<0,0296), sem contudo considerar a
interação com o inóculo (Fig. 12). Numa análise ao longo do tempo (Fig. 13 A e B), o
efeito do estresse social foi mantido [F(12,192)= 2,82; p< 0,0014). No 5º dia do
experimento ambos camundongos Dom e Sub apresentaram níveis mais elevados de GST
(p< 0,001 e p< 0,0144, respectivamente) do que os camundongos C.
48
NS/SRBC
Do
m
/S
RB
C
S
u
b/
S
RB
C
N
S
/V
Do
m
/V
Sub/V
0
100
200
300
C/HC
Dom/HC
Sub/HC
C/V
Dom/V
Sub/V
GST-nM/min/ml
Fig. 12. Média dos níveis de GST no parênquima cortical de camundongos de diferentes
hierarquias sociais injetados com HC ou V.
A)
0
100
200
300
C/HC
Dom/HC
Sub/HC
days
0 3 5 7 9 11 13
GST-nM/min/ml
49
B)
0
100
200
300
C/V
Dom/V
Sub/V
days
0 3 5 7 9 11 13
***
GST-nM/min/ml
Fig. 13 A e B. Média dos níveis de GST obtidos no parênquima cortical de camundongos
de diferentes posições hierárquicas ao longo do tempo (dias). A) animais injetados com
HC, B) animais injetados com V. *** indica um nível mais baixo de GST em camundongos
controles em relação aos animais Dom e aos camundongos Sub no quinto dia de
experimento.
4.2.4. GGT
A análise da média dos níveis de GGT no parênquima cortical mostrou um efeito
significante do estresse social [F(1,218)= 53,26; p< 0,001], que por sua vez foi responsável
por um decréscimo desta enzima (p<0,001). O efeito do inóculo foi observado na análise ao
longo do tempo [F(6,218)= 7,69; p<0,001). Níveis elevados de GGT foram observados em
camundongos injetados com HC no 13º dia do experimento (p<0,001). A análise dos níveis
de GGT ao longo do tempo (Fig. 15 A e B) também mostrou um proeminente efeito do
estresse social [F(6,218)= 8,66; p< 0,001), representado por um decréscimo desta enzima
nos dias: 3 (p< 0,0035), 7 (p< 0,001), 9 (p<0,001) e 11 (p<0,0185). Com a discriminação
da hierarquia social dos camundongos, a análise da média dos níveis de GGT no
parênquima cortical (Fig. 14), mostrou um efeito significante do estresse social [F(2,196)=
50
25,02; p< 0,001]. Observou-se um decréscimo desta enzima em ambos os camundongos
Dom e Sub (p<0,001), quando cada grupo foi comparado aos camundongos C. Os inóculos
foram marginalmente efetivos em alterar o nível médio de GGT [F(1,196)= 3,76; p<
0,054]. Camundongos injetados HC apresentaram níveis mais elevados de GGT do que os
camundongos injetados com veículo (p< 0,05). Numa análise ao longo do tempo
[F(6,196)= 6,39; p<0,001], o efeito do inóculo foi observado no 13º dia (p< 0,001).
NS/SRBC
Do
m
/S
RB
C
S
u
b/
S
RB
C
N
S
/V
Do
m
/V
Sub/V
0
1
2
3
4
5
C/HC
Dom/HC
Sub/HC
C/V
Dom/V
Sub/V
GGT-nM/min/ml
Fig. 14. Níveis médios de GGT em parênquima cortical de camundongos de diferentes
hierarquias sociais injetados com HC ou V.
51
A)
0.0
2.5
5.0
7.5
C/HC
Dom/HC
Sub/HC
days
0 3 5 7 9 11 13
+++
GGT-nM/min/ml
B)
0.0
2.5
5.0
7.5
C/V
Dom/V
Sub/V
days
0 3 5 7 9 11 13
***
GGT-nM/min/ml
Fig. 15 A e B. Média dos níveis de GGT obtidos no parênquima cortical de camundongos
de diferentes posições hierárquicas ao longo do tempo (dias). A) animais injetados com
HC, B) animais injetados com V.
52
5. DISCUSSÃO
No presente estudo, a análise temporal da ativação de uma resposta imune humoral
e a indução de estresse oxidativo no córtex cerebral de camundongos expostos a um
estímulo estressor de natureza psicossocial, seguido da exposição a um estímulo
imunogênico (estressor biológico) mostraram alterações biológicas relevantes que
discutiremos a seguir.
Evidências da literatura mostram que a dinâmica temporal da ativação de uma
resposta imune humoral a antígenos proteicos envolve a estimulação de linfócitos B e a sua
diferenciação em células plasmáticas secretoras de anticorpos, assim como a produção de
células B de memória. Esta estimulação requer a participação de células T antígeno-
específicas, usualmente células T auxiliares CD4 do tipo T
H
2; contudo, um subgrupo de
células T
H
1 também pode auxiliar na ativação de células B. Sabe-se que o primeiro sinal
para a ativação de uma resposta imune humoral é a ligação do antígeno a um receptor
antigênico presente na superfície das células B (imunoglobulinas de superfície). Este evento
faz com que este receptor transmita sinais diretamente para o interior da célula. Deste
modo, o antígeno ligado aos receptores antigênicos das células B é enviado aos sítios
intracelulares, onde é degradado e devolvido para a superfície da célula B, como peptídeo
ligado a moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) de Classe II. O
segundo sinal se observa quando o complexo peptídeo: MHC II é reconhecido por células T
auxiliares antígeno-específicas, que por sua vez são responsáveis pelo envio de sinais
ativadores para a célula B. Nesta etapa, a interação entre o ligante CD40 (CD40L) na célula
T e a molécula CD40 na célula B é essencial, uma vez que possibilita a estimulação da
célula B em repouso a retomar o ciclo celular. Adicionalmente, as citocinas IL-4, IL-5 e IL-
53
6 constituem os sinais ativadores enviados pelas células T auxiliares antígeno-específicas,
cuja principal função é orientar a proliferação e a diferenciação das células B. É importante
ressaltar o papel das células apresentadoras de antígeno que atuam de forma altamente
especializada, promovendo a internalização e a apresentação de antígenos. As células
dendríticas, os macrófagos e as células B são populações celulares envolvidas na
apresentação de antígenos; contudo, as células dendríticas são consideradas as células mais
potentes estimuladoras de resposta de células T virgens. A ativação das células T por uma
célula apresentadora de antígeno leva à sua proliferação e à diferenciação de sua progênie
em células T antígeno-específicas. Durante este processo, várias citocinas (pequenas
proteínas de aproximadamente 25kDa) são liberadas pelas células apresentadoras de
antígeno em resposta a um estímulo ativador e induzem respostas por meio da ligação a
receptores específicos e entre elas destacam-se: a Interleucina -1β (IL-1β), Interleucina – 6
(IL-6), Interleucina - 12 (IL-12), o Fator de Necrose Tumoral – alfa (TNF) e a quimiocina
IL-8 (Janeway et. al, 2007). Os mecanismos e os sinais imunoestimulatórios envolvidos na
ativação de uma resposta imune humoral descritos acima são passíveis de serem afetados
pela exposição a diferentes estímulos estressores.
Neste trabalho, a dinâmica temporal da ativação da resposta imune humoral nos
animais não expostos ao estresse psicossocial (grupo C), mostrou que elevados títulos de
anticorpos anti-hemácias de carneiro foram observados no 5° e 11° dia após a injeção de
HC. O padrão da resposta imune humoral observado nestes animais está em concordância
com dados amplamente conhecidos na literatura e que são indicativos da produção de
moléculas de anticorpos da classe IgM e IgG, respectivamente neste período. Embora, os
testes estatísticos utilizados para analisar a dinâmica temporal da resposta imune humoral
54
dos animais não tenham revelado alterações significativas entre os diferentes grupos
testados; consideramos pertinente a discussão sobre os dados biológicos encontrados nos
animais submetidos ao estresse psicossocial e que receberam hemácias de carneiro. A razão
para esta atenção aos dados obtidos se justifica pela homogeneidade dos resultados obtidos
em estudos prévios que se pautaram no uso de protocolos experimentais semelhantes
(Gasparotto et al., 2002, Ghizoni et. al., 2006, Zreik et al., 2005, Kowalski et al., 2005).
Nesta discussão, há que se considerar um fator adicional importante, ou seja, a posição
hierárquica assumida pelos animais (dominância ou submissão) durante a exposição ao
estresse de interação social, visto que o perfil psicológico dos animais e o tempo de
exposição às interações sociais são importantes moduladores da resposta imune humoral.
Estudos desenvolvidos por Gasparotto et al. (2002) mostraram que a resposta imune
humoral primária e secundária analisada, após um longo período de estresse social, potente
e incontrolável, contribuíram para uma supressão da resposta imune humoral em animais
submissos. No presente estudo, um diminuição da imunidade humoral foi constatado no 5°
dia após a injeção de hemácias de carneiro nos animais que apresentaram um
comportamento de submissão durante as interações sociais. Estes animais apresentaram
baixos títulos de anticorpos anti-HC, comparado aos animais controles (não estressados
socialmente) e aos animais dominantes. A cinética da resposta imune humoral analisada no
grupo de animais submissos mostrou uma elevação dos títulos de anticorpos anti-HC,
apenas no 11° dia após a injeção de HC. Estes dados nos permitem concluir que a dinâmica
temporal da ativação de uma resposta imune humoral à hemácia de carneiro nos animais
submissos foi alterada pela exposição ao estresse social. Estudos realizados por Stefanski &
Engler (1999) sugeriram que somente os animais submissos apresentaram uma ativação
persistente do sistema adrenocortical e adrenomedular quando expostos ao estresse social
55
crônico. Nos animais dominantes, esta ativação ocorre no início da exposição ao estresse,
mas não se mantém cronicamente. Deste modo, o aumento persistente nos níveis de
corticosterona poderia explicar as diferenças imunológicas observadas nos animais
submissos. Posteriormente, Stefanski (2000) mostrou que ambos os grupos de animais
submissos e dominantes apresentavam níveis semelhantes de corticosterona total, todavia a
percentagem de corticosterona e de norepinefrina livre foi maior nos animais submissos.
Nesta análise, os autores consideraram a ausência de homogeneidade das estratégias
comportamentais no grupo dos animais submissos, o que os levou a separá-los em animais
submissos (efetivos) e subdominantes (animais submissos, porém reativos) (Stefanski,
1998). Segundo este autor, a diferença constatada na ativação do sistema imune entre
animais submissos e subdominantes poderia ser explicada pelo elevado nível de atividade
adrenocortical comparado com a atividade adremomedular observada em animais
submissos em relação aos animais subdominantes. No presente trabalho, os animais que
foram expostos ao estresse de interação social e que exibiram um comportamento de
submissão não foram separados, de acordo com as suas estratégias comportamentais
apresentadas durante a interação, ou seja, em submissos e subdominantes. Isto pode
explicar, em parte, a ausência de dados estatisticamente não significativos quando
comparamos os diferentes grupos testados.
Muitos dos efeitos imunossupressivos do estresse social têm sido atribuído aos
glicocorticóides (GCs) (Dhabhar & McEwen, 1999). Recentemente, três modelos foram
propostos para explicar os mecanismos pelos quais os GCs podem regular a expressão de
uma ampla variedade de genes imunologicamente relacionados. O primeiro modelo
mostrou que os GCs podem transativar um inibidor da atividade do fator de transcrição
nuclear NF-kB. A hipótese é a de que os GCs induzem a transcrição de IkBα e seqüestram
56
o NF-kB no citoplasma, prevenindo-o da translocação para o núcleo e subseqüente
ativação de genes. Isto explicaria o amplo espectro da supressão de citocinas mediada pelos
GCs. Todavia, evidências posteriores mostraram que, em alguns tipos celulares, a síntese de
IkBα não foi necessária para a inibição do NF-kB pelos glicocorticóides. Um segundo
modelo propôs a existência de uma ligação cruzada entre NF-kB e o receptor de
glicocorticóide (GR) que poderia prevenir a expressão gênica. O receptor de GR ativado
tem a capacidade de ligar-se diretamente ao NF-kB e prevenir a sua transmigração para o
núcleo. Em adição, o receptor de GR ativado tem a capacidade de ligar-se diretamente ao
NF-kB, uma vez que este está ligado ao locus característico de ligação do DNA kB. O
terceiro modelo sugere que a repressão da atividade do NF-kB pelo glicocorticóide poderia
ser causada pela competição entre o GR e o NF-kB para alguns cofatores limitantes, tais
como a proteína ligante de AMPc (CBP) e coativador-1 do receptor esteróide (SRC-1).
Embora os dados sejam controversos, foi verificado que em alguns tipos celulares, a
repressão do NF-kB pelo GR poderia ser atenuada pelo excesso de cofatores. A despeito da
distinção entre os modelos, acredita-se que não sejam mutuamente exclusivos e que possam
contribuir com a imunomodulação de animais submetidos ao estresse de natureza
psicossocial (Padgett & Glaser, 2003).
Com relação aos animais que exibiram um perfil de dominância, a análise da
resposta imune humoral mostrou que a primeira fase (produção de IgM) foi semelhante
aquela observada nos animais controles (não estressados socialmente). Contudo, esta
semelhança não foi verificada na segunda fase da resposta (produção de IgG), uma vez que,
os títulos de anticorpos anti-HC foram menores comparados aos observados nos animais
controles. Estes resultados corroboram dados anteriormente obtidos por Gasparotto et al.
57
(2002) que sugerem o favorecimento da ação de órgãos linfóides periféricos e conseqüente
incremento na produção de anticorpos em animais dominantes, pelo fato destes animais
obterem sucesso no controle do estresse. Por fim, há que se considerar nesta discussão que
a ausência de diferenças estatísticas entre os diferentes grupos pode estar relacionada à
dificuldade no estabelecimento de uma hierarquia estável no início das interações. No
nosso protocolo experimental, usualmente a hierarquia social é estabelecida no início das
interações, mas em algumas duplas de camundongos foram necessários alguns dias para
esta definição. Este fato pode estar contribuindo com a dispersão do intervalo de confiança
observada nestes dados.
Os estudos sobre a indução de estresse oxidativo (análise de TBARS) mostraram
um incremento da lipoperoxidação no 5º dia de experimentação nos animais não
estressados socialmente e que foram injetados com hemácias de carneiro. Este período de
tempo é coincidente com o pico da produção de IgM, cuja ativação imunológica pode levar
a indução de estresse oxidativo. A potencialidade dos estímulos estressores de natureza
psicossocial como biológica (imunógenos) na produção de EROs é amplamente conhecida.
Estudos desenvolvidos por Miyashita et. al. (2006) mostraram que o estresse
psicológico foi capaz de induzir a produção de EROs. Embora, a indução de morte neuronal
decorrente da exposição a estímulos estressores seja conhecida e o estresse de imobilização
possa promover dano hipocampal, pouco se sabe sobre os efeitos do estresse no córtex
cerebral. Lee et al., (2006) relataram que a morte neuronal observada no córtex cerebral de
camundongos submetidos ao estresse de imobilização parece ser mediada por NADPH
oxidase, IL-1, COX-2, EROs e Fas.
58
Miyashita et. al. (2006) mostraram que o estresse por acondicionamento social foi
responsável pela elevação da concentração de corticosterona no soro e por um aumento no
dano oxidativo no DNA de células sangüíneas em camundongos.
Estudos que buscam compreender os mecanismos causadores de danos neuronais
induzidos por estresse têm demonstrado que a corticosterona liberada do córtex adrenal
durante a exposição a estímulos estressores induz a formação de ERO ou diminui a
atividade de enzimas antioxidantes, resultando em um aumento na neurotoxicidade em
culturas de córtex (Smith et. al., 1996; Lin et. al., 2004; Brooke et. al., 2002).
Dados da literatura mostram ainda, o envolvimento da catecolamina noradrenalina
(NA) na regulação do superaquecimento corporal. A NA, ao ser liberada da área pré-óptica
anterior do hipotálamo (PO/AH), se liga a receptores ß
3
- adrenérgicos no tecido adiposo,
ativando o hormônio sensível a lipase (HSL), o qual cliva triglicerídeos e libera ácidos
graxos para a mitocôndria, os quais são utilizados na produção de calor. Djordjevic et. al.
(2005) buscaram uma relação entre o estresse psicológico sofrido por ratos aglomerados
(12 animais por gaiola) em um ambiente estreito (58,3 cm
2
) e a atividade de algumas
enzimas antioxidantes como MnSOD e CuZnSOD, e a MAO, uma enzima envolvida na
deaminação de NA. As ações enzimáticas não foram alteradas, visto que o
superaquecimento dos corpos dos roedores foi capaz de manter os níveis basais de
liberação de NA dos neurônios terminais da PO/AH, uma vez que a atividade da MAO
hipotalâmica não se alterou sob influência da exposição a esse tipo de estressor agudo (3
horas de estresse por aglomeração).
A exposição ao estresse é ainda capaz de afetar a atividade dos neurônios centrais
dopaminérgicos e serotonérgicos (revisado por Sahin & Gümüslü, 2004). Relatos recentes
mostram que a produção de radicais livres no cérebro é resultante do processo metabólico
59
de catecolaminas como a dopamina e a noradrenalina, e que níveis elevados de
catecolaminas podem sofrer autooxidação, podendo produzir EROs. Para neutralizar as
EROs, as células utilizam enzimas antioxidantes, a exemplo de Cu, Zn-SOD, CAT e Se-
GSH-Px, e não antioxidantes (GSH) (revisado por Sahin & Gümüslü, 2004).
Sahin & Gümüslü (2004) verificaram um aumento nas atividades de Cu, Zn-SOD e
CAT no cérebro de ratos submetidos a diferentes modelos de estresse (estresse de
imobilização, estresse pelo frio e estresse de imobilização seguido de estresse pelo frio).
Esses achados são indicativos que o estresse pode elevar a taxa de formação de O
2
!
-
e H
2
O
2
no cérebro; e como conseqüência, o principal detoxificador de radicais livres, Cu, Zn-SOD,
CAT e Se-GSH-Px, podem atuar efetivamente para removê-los (Sahin & Gümüslü, 2004).
Nos experimentos de Sahin & Gümüslü (2004), a defesa antioxidante não
enzimática GSH apresentou níveis diminuídos em todos os grupos de estresse, confirmando
os relatos de que o estresse reduz os níveis de GSH e causam um aumento nos níveis de
EROs.
Ratos expostos ao estresse de restrição ou de contenção física por 3 horas/dia, por
um período de 10 dias apresentaram níveis de malonildialdeído (MDA) no fígado e no
plasma significativamente maiores do que os observados em animais controle (não
estressados) (Muqbil & Banu, 2006). Estes dados levaram os autores a concluírem que o
modelo de estresse empregado foi capaz de promover danos às membranas celulares, e,
portanto são considerados indicativos da ocorrência de dano oxidativo.
Os estudos de Fatima et. al. (2007) exemplificaram a influência do estresse
imunológico sobre o estresse oxidativo, visto que as mudanças patofisiológicas que são,
com freqüência, observadas seguido da exposição a xenobióticos podem também ser devido
60
à superativação de fagócitos, induzindo à produção excessiva de espécies reativas, com
concomitante redução na capacidade antioxidante de tecidos de peixes.
No presente trabalho e de forma muito intrigante foram observados altos níveis de
TBARS em animais não estressados socialmente e que receberam injeção de solução
veículo. A despeito do extremo rigor e cuidado com os animais e com o procedimento
experimental, não podemos descartar uma interferência biológica causada por algum
patógeno (vírus, bactéria e/ou parasita). Com relação aos animais submetidos ao estresse
social e que apresentaram um perfil de submissão e que foram injetados com solução
veículo foi verificado um aumento na produção de TBARS no 7º dia de experimentação.
Por outro lado, os animais que exibiram um comportamento de dominância, um aumento
substancial foi observado no 13º dia.
Um outro fator a considerar é o aumento observado na produção de TBARS em
camundongos não estressados e injetados com solução veículo que não está em fase com o
aumento observado nos animais submetidos ao estresse social. É impossível saber se os
níveis de TBARS de camundongos estressados socialmente e não estressados no 5º dia são
similares ou não, contudo os dados sugerem um retardo na produção de TBARS nos
animais estressados.
Com relação aos dados de TBARS observados em camundongos que foram
submetidos ao estresse social e que receberam hemácias de carneiro, devemos considerar a
possibilidade de uma ação inibitória dos glicocorticóides, decorrente da exposição ao
estresse, sobre as células imunologicamente competentes. Tal ação poderia resultar em uma
redução na ativação celular e conseqüente diminuição na produção de EROs.
61
A produção de EROs pode estar associada ainda a muitos mecanismos
neuroendócrinos envolvidos na resposta ao estresse. Os glicocorticóides, unicamente, não
induzem morte neuronal, contudo a prévia exposição a este hormônio seguido da exposição
a estressores oxidativos foram efetivos na promoção de morte neuronal (Ames et. al.,
1993). Este efeito potenciador do estresse oxidativo do glicocorticóide pode estar associado
com o decréscimo de algumas atividades de enzimas antioxidantes no cérebro de ratos
adultos, inclusive no parênquima cortical (Behl et. al., 1997). Adicionalmente, o
incremento típico nos níveis de catecolaminas em resposta a exposição ao estresse é capaz
de promover um aumento na susceptibilidade de neurônios a EROs tanto in vivo como in
vitro (Grima et. al. 2003; Burke et. al. 1998; Fu et. al. 1998). Trabalhos anteriores
conduzidos no nosso laboratório mostraram que níveis de glutationa (GSH) e a detecção de
dano oxidativo não se alteraram em camundongos não estressados ou submetidos ao
estresse psicológico (Ghizoni et. al., 2006). Contudo, o procedimento de exposição ao
estresse de restrição física (imobilização aguda) em ratos foi capaz de induzir um aumento
nos níveis de glutationa no cérebro na 4ª hora após a exposição a este tipo de estressor.
Neste estudo, o estresse social induziu uma diminuição na atividade das enzimas
antioxidantes, GR, GPX e GGT, exceto em GST, embora esta ação seja circunscrita no 5º
dia do experimento.
Analisando conjuntamente estes dados, podemos sugerir que a injeção de hemácias de
carneiro parece minimizar o efeito depressor do estresse social na atividade enzimática
antioxidante. Este processo pode ter um efeito protetor contra os efeitos deletérios do
estresse social e do estresse oxidativo na neurodegeneração, tendo em vista os baixos níveis
de TBARS em camundongos submetidos ao estresse social e injetados com HC. Como já
62
discutido anteriormente, o aumento não esperado de TBARS em camundongos injetados
com solução veículo no 5º dia aponta para a realização de experimentos complementares de
modo a possibilitar uma melhor compreensão destes dados. A despeito da obtenção deste
resultado neste grupo em particular, esta é a primeira evidência do efeito do estresse social
no metabolismo antioxidante no Sistema Nervoso Central e cumpre-nos ressaltar a
importância do protocolo experimental, que se baseou em um estudo cinético de resposta
que possibilitou a análise das alterações biológicas ao longo do tempo. Por fim, sugerimos
uma associação entre os mecanismos de adaptação ao estresse e a atividade imunológica,
que pode ser importante para a manutenção da homeostase e essencial para o bem-estar dos
organismos.
63
6. CONCLUSÃO
O estresse psicossocial foi efetivo em alterar a resposta imune humoral de camundongos,
bem como as atividades enzimáticas antioxidantes, ao longo de 13 dias, como proposto
no protocolo experimental.
Diante do exposto, sugerimos uma associação entre os mecanismos de adaptação ao
estresse e a atividade imunológica, que pode ser importante para a manutenção da
homeostase e essencial para o bem-estar dos organismos.
64
7. REFERÊNCIAS
1. Adams S, Green P, Claxton R, Simcox S, Williams MV, Walsh K, Leeuwenburgh
C. Reactive carbonyl formation by oxidative and non-oxidative pathways. Front.
Biosci. 2001; 6:A17-A24.
2. Alvarado C, Álvarez P, Puerto M, Gausserès N, Jiménez L, De la Fuente M. Dietary
supplementation with antioxidants improves functions and decreases oxidative
stress of leukocytes from prematurely aging mice. Nutrition 2006; 22:767-777.
3. Ames BN., Shigenaga MK, Hagen TM. Oxidants, antioxidants, and the
degenerative diseases of aging. Proc. Natl. Acad. Sci. 1993; 90:7915–7922.
4. Andersen JK. Oxidative stress in neurodegeneration: cause or consequence? Nat.
Med. 2004; 10, S18-S25.
5. Azpiroz A, Garmendia L, Fano E, Sanchez-Martin JR. Relations between
aggressive behavior, immune activity, and disease susceptibility
Aggression and Violent Behavior, 2003; 8:433-453.
6. Behl C, Lezoualc’h F, Trapp T, Widmann M, Skutella T, Holsboer F.
Glucocorticoids enhance oxidative stress-induced cell death in hippocampal neurons
in vitro. Endocrinology, 1997; 138:101–106.
7. Bohus B, Koolhaas JM. Psychoimmunology of social factors in rodents and other
subprimate vertebrates. Psychoneuroimmunology. New York: Academic Press,
1991, pp. 807-830.
8. Borowski CF. Papel do zinco no sistema nervoso central: defesas antioxidantes e
sinalização celular via PI3K/AKT. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-
Graduação em Neurociências e Comportamento, UFSC/SC. 2006. 99p.
9. Burke WJ, Kristal BS, Yu BP, Li SW, Lin TS. Norepinefrine transmitter metabolite
generates free radicals and activates mitochondrial permeability transition: a
mechanism for DOPEGAL-induced apoptosis. Brain Research 1998; 787: 328-32.
10. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem.
1976; 72:248-254.
11. Brooke SM, McLaughlin JR, Cortopassi KM, Sapolsky RM. Effect of GP120 on
glutathione peroxidase activity in cortical cultures and the interaction with steroid
hormones. J. Neurochem. 2002; 81:277-284.
65
12. Cannon W. The wisdom of the body. W.W. Norton, New York, 1932.
13. Carobrez SG, Gasparotto OC, Buwalda B, Bohus B. Long term consequences of
social stress on corticosterone and IL-1ß levels in endotoxin-challenged rats.
Physiol Behav 2002; 76: 99-105.
14. Clarkson TW, Magos L, Myers GJ. The toxicology of mercury-current exposures
and clinical manifestations. N. Engl. J. Med. 2003; 349:1731-1737.
15. Dhabhar FS, McEwen BS. Bidirectional effects of stress and glucocorticoid
hormones on immune function: possible explanations for paradoxical observations.
In: Ader, R., Felten, D.L., Cohen, N (Eds.) Psychoneuroimmunology 3rd ed.
Academic Press San Diego 2001 pp. 301– 338.
16. Djordjevic J, Cvijic G, Petrovic N, Davidovic V. Effect of the acute crowding stress
on the rat brown adipose tissue metabolic function. Comparative Biochemistry and
Physiology 2005; 142:433-438.
17. Drevet JR. The antioxidant glutathione peroxidase family and spermatozoa: A
complex story. Molecular and Cellular Endocrinology 2006; 250:70-79.
18. Erat M, Ciftci M, Gumustekin K, Gul M. Effects of nicotine and vitamin E on
glutathione reductase activity in some rat tissues in vivo and in vitro. European
Journal of Pharmacology. Article in Press. 2006.
19. Fatima M, Mandiki SNM, Douxfils J, Silvestre F, Coppe P, Kestemont P.
Combined effects of herbicides on biomarkers reflecting immune-endocrine
interactions in goldfish immune and antioxidant effects. Aquatic Toxicology 2007;
81:159-167.
20. Fernandes GA. Immunological stress in rats induces bodily alterations in saline-
treated conspecifics. Physiology & Behavior 2000; 69:221-230.
21. Franco JL, Teixeira A, Meotti FC, Ribas CM, Stringari J, Garcia Pomblum SC,
Moro AM, Bohrer D, Bairros AV, Dafre AL, Santos ARS, Farina M. Cerebellar
thiol status and motor déficit after lactational exposure to methylmercury.
Environmental Research 2006; 102:22-28.
22. Fu W, Luo H, Parthasarathy S, Mattson M P. Catecholamines Potentiate Amyloid
β-Peptide Neurotoxicity: Involvement of Oxidative Stress, Mitochondrial
Dysfunction and Perturbed Calcium Homeostasis. Neurobiology of Disease 1998; 5
(4):229-43.
66
23. Gasparotto OC, Ignácio ZM, Gonçalves S. The effect of different psychological
profiles and timings of stress exposure on humoral immune response. Physiol
Behav 2002; 76:321-326.
24. Ghizoni DM, Pavanati KCA, Arent AM, Machado C, Faria MS, Pinto CMH,
Gasparotto OC, Gonçalves S, Dafre AL. Alterations in glutathione levels of brain
structures caused by acute restraint stress and by nitric oxide synthase inhibition but
not by intraspecific agonistic interaction. Behavioural Brain Research, 2006;
166:71-77.
25. Grima G, Benz B, Parpura V, Cuénod M, Do KQ. Dopamine-induced oxidative
stress in neurons with glutathione deficit: implication for schizophrenia.
Schizophrenia Research, 2003; 62:213– 224.
26. Halliwell B. Role of free radicals in the neurodegenerative diseases. Drugs Aging
2001; 9:685-716.
27. Herbert V, Shaw S, Jayatilleke E, Stopler-Kasdan T. Most free radical injury is
iron-related: it is promoted by iron, hemin, holoferritin and Vitamin C, and inhibited
by desferoxamine and apoferritin. Stem Cells 1994; 12:289-303.
28. Ho YS, Magnenat JL, Gargano M, Cao J. The nature of antioxidant defense
mechanisms: a lesson from transgenic studies. Environ. Health Perspect. 1998; 106:
1219-1228.
29. Huhman KL. Social conflict models: Can they inform us about human
psychopathology? Hormones and Behavior 2006; 50:640-646.
30. Janeway C, Travers P, Walport M, Shlomchik MJ. Imunobiologia: O Sistema
Imune na saúde e na doença. 6ª Edição, Artmed Editora S.A, ISBN: 85-363-0741-
2,Porto Alegre, 2007, pp 824.
31. Kielcot-Glaser JK, Glaser R, Gr. Savenstein S, Malarkey WB, Sheridan J. Chronic
stress alters the immune response to influenza virus vaccine in older adults. Proc
Natl Acad Sci USA 1996; 93: 3043-3047.
32. Koolhaas JM, de Boer SF, de Ruiter AJH., Meerlo P, Sgoifo A. Social stress in rats
and mice. Acta Physiol Scand 1997; 161: 69–72.
33. Kowalski M, ZREIK M, Carobrez SG, Gasparotto OC. Effects of buspirone on
anxiety and humoral immune response of stressed Swiss mice.. In: 1st
Iberoamerican Congress on Neuroimmunomodulation, 2005, Rio de Janeiro. Annals
of the 1st Iberoamerican Congress on Neuroimmunomodulation, 2005.
67
34. Lee JM, Zipfel GJ, Park KH, He YY, Hsu CY, Choi DW. Zinc translocation
accelerates infarction after mild transient focal ischemia. Neuroscience 2002;
115:871-878.
35. Lee YJ, Choi B, Lee EH, Choi KS, Sohn S. Immobilization stress induces cell death
through production of reactive oxygen species in the mouse cerebral cortex.
Neuroscience Letters 2006; 392:27-31.
36. Leonard BE. The HPA and immune axes in stress: the involviment of the
serotonergic system. European Psychiatry 2005; 20:S302-S306.
37. Lin H, Decuypere E, Buyse J. Oxidative stress induced by corticosterone
administration in broiler chickens (Gallus gallus domesticus). 1: Chronic exposure.
Comp. Biochem. Physiol. B: Biochem. Mol. Biol. 2004; 139:737-744.
38. Marks DB, Marks AD, Smith CM. Oxygen metabolism and toxicity. In: Basic
Medical Biochemistry: A Clinical Approach. Baltimore: Williams and Wilkins
1996; 327-340.
39. Miyashita T, Yamaguchi T, Motoyama K, Unno K, Nakano Y, Shimoi K. Social
stress increases biopyrrins, oxidative metabolites of bilirubin, in mouse urine.
Biochemical and Biophysical Research Communications 2006; 349:775-780.
40. Muqbil I, Banu N. Enhancement of pro-oxidant effect of 7,12-dimethylbenz (a)
anthracene (DMBA) in rats by pre-exposure to restraint stress. Cancer Letters 2006;
240:213-220.
41. Oishi K, Yokoi M, Maekawa S, Sodeyama C, Shiraishi T, Kondo R, Kuriyama T,
Machida K. Oxidative stress and haematological changes in immobilized rats. Acta
Physiol. Scand. 1999; 165:65-69.
42. Padgett DA & Glaser R. How stress influences the immune response. Trends in
Immunology 2003; 24 (8): 444-48.
43. Radley JJ, Morrison JH. Repeated stress and structural plasticity in the brain.
Ageing Research Reviews 2005; 4:271-287.
44. Raone A, Cassanelli A, Scheggi S, Rauggi R, Danielli B, De Montis MG.
Hypothalamus-Pituitary-Adrenal modifications consequent to chronic stress
exposure in an experimental model of depression in rats. Neuroscience 2007;
146:1734-1742.
45. Rodgers RJ, Cole JC. Influence of social isolation, gender, strain, and prior novelty
on plus-maze behaviour in mice. Physiology & Behavior 1993; 54:729-736.
68
46. Sahin E, Gümüslü S. Altertions in brain antioxidant status, preotein oxidation and
lipid peroxidation in response to different stress models. Behavioural Brain
Research 2004; 155:241-248.
47. Sapolsky RM, Romero LM, Munck AU. How do glucocorticoids influence stress
responses? Integrating permissive, supressive, stimulatory, and preparative actions.
Endocr Rev 2000; 20: 55-89
48. Selye H. Stress – a tensão da vida. São Paulo: IBRASA. 1959.
49. Serafini LA, Barros NM, Azevedo JL. Biotecnologia na agricultura e na
agroindústria. Guaíba: Agropecuária. 2001. 463p.
50. Sheridan JF, Dobbs C, Brown D, Zwilling B. Psychoneuroimmunology: stress
effects on pathogenesis and immunity during infections. Clin Microbiol Rev 1994;
7: 200-212.
51. Sies H. Oxidative stress: oxidants and antioxidants. Exp. Phisiol. 1997; 82:291-295.
52. Sies H. Strategies of antioxidant defense. Eur. J. Biochem. 1993; 215(2):213-219.
53. Smith MA. Hippocampal vulnerability to stress and aging: possible role of
neurotrophic factors. Behav. Brain Res. 1996; 78:25-36.
54. Stefanski V, Engler H. Social stress, dominance and blood cellular immunity.
Journal of Neuroimmunology. 1999; 94:144–152.
55. Stefanski V. Social Stress in Loser Rats: Opposite Immunological Effects in
Submissive and Subdominant Males. Physiology & Behaviour, 1998; 63:605-613.
56. Stefanski V. Social stress in laboratory rats: hormonal responses and immune cell
distribution. Psychoneuroendocrinology 2000; 25: 389-406.
57. Tamashiro KLK, Nguyen MMN, Sakai RR. Social stress: from rodents to primates.
Frontiers in Neuroendocrinology 2005; 26:27-40.
58. Vedhara K, Cox NKM, Wilcock GK, Perks P, Hunt M, Anderson S, Lightman SL,
Shanks NM. Chronic stress in elderly carers of dementia patients and antibody
response to influenza vaccination. Lancet 1999; 353: 627-631.
59. Victor VM, Rocha M, De la Fuente M. Immune cells: free radicals and antioxidants
in sepsis. International Immunopharmacology 2004; 4: 327-347
60. Ye Z, Song H. Glutathione s-transferase polymorphisms (GSTM1, GSTP1 and
GSTT1) and the risk of acute leukaemia: A systematic review and meta-analysis.
European Journal of Cancer 2005; 41:980-989.
69
61. Zreik M, Kowalski M, Gasparotto OC, Carobrez, SG. Long-term effects of
buspirone on delayed-type hypersensitivity (DTH) response in socially stressed
mice. In: 1st Iberoamerican Congress on Neuroimmunomodulation, 2005, Rio de
Janeiro. Annals of the 1st Iberoamerican Congress on Neuroimmunomodulation,
2005.
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