( PDF ) Concentração sérica e imunomarcação do fator de crescimento do endotélio vascular no prognóstico dos linfomas caninos

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

CÂMPUS DE JABOTICABAL

CONCENTRAÇÃO SÉRICA E IMUNOMARCAÇÃO DO

FATOR DE CRESCIMENTO DO ENDOTÉLIO VASCULAR

NO PROGNÓSTICO DOS LINFOMAS CANINOS

Sabrina Marin Rodigheri

Médica Veterinária

Jaboticabal – São Paulo - Brasil

2008

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

CÂMPUS DE JABOTICABAL

CONCENTRAÇÃO SÉRICA E IMUNOMARCAÇÃO DO

FATOR DE CRESCIMENTO DO ENDOTÉLIO VASCULAR

NO PROGNÓSTICO DOS LINFOMAS CANINOS

Sabrina Marin Rodigheri

Orientador: Prof. Dr. Carlos Roberto Daleck

Co-orientadora: Profa. Dra. Renée Laufer Amorim

Dissertação apresentada à Faculdade de

Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade

Estadual Paulista, Câmpus de Jaboticabal, como

parte das exigências para a obtenção do título de

Mestre em Cirurgia Veterinária.

Jaboticabal – São Paulo - Brasil

Fevereiro de 2008

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iii

DADOS CURRICULARES DO AUTOR

SABRINA MARIN RODIGHERI – nascida em 19 de janeiro de 1978, na cidade de

Suzano/SP, ingressou no curso de graduação em Medicina Veterinária da

Universidade Federal do Paraná (UFPR), Curitiba/PR, em março de 1999,

concluindo-o em março de 2004. Em fevereiro de 2004, ingressou no Programa de

Residência em Clínica Médica e Cirúrgica de Animais de Companhia da Pontifícia

Universidade Católica do Paraná (PUC/PR), Curitiba/PR, concluindo-o em janeiro

de 2006. Iniciou no Programa de Pós-Graduação em Cirurgia Veterinária da

Faculdade de Ciências Agrárias, Universidade Estadual Paulista, Campus de

Jaboticabal, em março de 2006.

Dedico esse trabalho a minha mãe,

mestre no amor incondicional

e meu eterno porto seguro.

Ao meu pai:

“Feliz daquele que junto a ti teve a oportunidade

de assimilar o magnífico sentido de viver”

AGRADECIMENTOS

À minha família, mãe, irmãs, cunhados e sobrinhos, que apesar da

distância, mantiveram-se sempre presentes, incentivando e apoiando todas as

minhas decisões. Amores da minha vida, sem vocês nada disso seria possível !!!

Ao amigo Paulo Alves de Oliveira, que esteve por perto nos momentos mais

difíceis, com palavras de conforto, abraços apertados, votos de confiança e com

“aquela ajudinha” que me possibilitou seguir em frente.

Ao meu orientador, Professor Carlos Roberto Daleck, pela oportunidade,

confiança e compreensão. Agradeço também às críticas e aos elogios, ambos

extremamente importantes na vida de quem começa a trilhar um novo caminho.

Á minha co-orientadora, Professora Renée Laufer Amorim, por nos receber

de abraços abertos no Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ, em Botucatu.

Muito obrigada por nos proporcionar dias de trabalho cercados de bom humor e

extremo profissionalismo. Agradeço pelo seu carinho, confiança e imensa

colaboração nesse projeto.

Agradeço também ao Professor Júlio Lopes Sequeira, pelos ensinamentos,

atenção e inestimável ajuda nas avaliações histopatológicas. Aos residentes e

pós-graduandos do Serviço de Patologia Veterinária, FMVZ-UNESP/Campus de

Botucatu, muito obrigada pelo carinho e colaboração.

Aos queridos amigos do Serviço de Oncologia Veterinária, Jane, Andrigo,

João Humberto, Fábio e Milena, muito obrigada pelo companherismo e pelos

maravilhosos dias que passamos juntos. Sem dúvida, todos sempre terão um

lugar muito especial no meu coração.

Às minhas novas irmãs, Sabryna e Simone, grandes companheiras de risos

e choros, de muita conversa e de valiosos momentos de silêncio. Nesse período

chegamos até a perder a nossa identidade, Sabrina foi Simone e Simone Sabrina.

Minhas queridas amigas, eu simplesmente quero dizer: muito obrigada por tudo !!!!

Amo vocês !!!

vii

Ás amigas, Thais, Thais, Jana, Carol e Carol que souberam entender que

verdadeiras amizades apenas se fortalecem com a distância. Aos eternos

mestres, Marconi Farias e Felipe Wouk, muito obrigada pela amizade, carinho e

pelos constantes votos de confiança.

Daniel, Soraia, Kellen, Juliana, Malu, Durva, Viúva, Ricardo, Tati, Rosana,

Bozo, Carmem, entre outros novos amigos de Jaboticabal, muito obrigada pelos

ótimos momentos que passamos juntos. Márcio Brunetto, muito obrigada pela sua

amizade, carinho e dedicação com a estatística !!!

Aos funcionários do Laboratório de Patologia Clínica, pela paciência e ajuda

na realização dos exames laboratoriais.

Ao senhor Orandir, técnico do Laboratório de Histologia, pela simpatia e

inestimável colaboração durante o processamento das amostras.

Á Professora Rosângela Zacarias Machado e a pós-graduanda Cibele, do

Laboratório de Imunoparasitologia Veterinária, que se dispuseram prontamente a

colaborar na realização do teste de ELISA.

Aos residentes, pós-graduandos e funcionários do Hospital Veterinário, pelo

companheirismo e pela luta diária a favor de uma melhor qualidade de vida aos

nossos animais.

Aos proprietários e cães que participaram deste trabalho, pela colaboração,

parceria e compreensão. Ao querido Skol, que trouxe muito amor e alegria à

República Nutronco durante os inesquecíveis seis meses que esteve conosco.

Draco, Esponja, Cocada e Paçoca, sempre estarão no meu coração. Aos meus

gatos queridos, que mesmo com a distância mantiveram seu amor e fidelidade.

Á Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),

pela concessão da bolsa e do auxílio financeiro que possibilitaram a realização

dessa pesquisa.

viii

SUMÁRIO

Página

LISTA DE TABELAS ............................................................................................. x

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ xii

RESUMO .............................................................................................................. xii

ABSTRACT .......................................................................................................... xiii

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 1

2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................ 2

2.1 LINFOMA CANINO ...................................................................................... 2

2.2 ANGIOGÊNESE ........................................................................................... 7

2.3 A ANGIOGÊNESE NO LINFOMA ............................................................... 11

3. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 13

3.1 GRUPOS EXPERIMENTAIS ....................................................................... 13

3.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ........................................................... 13

3.2.1 Grupo I ................................................................................................ 13

3.2.2 Grupo II ................................................................................................. 14

3.3 COLHEITA DE MATERIAL .......................................................................... 15

3.3.1 Sangue ................................................................................................ 15

3.3.2 Amostra tecidual .................................................................................. 15

3.4 EXAMES LABORATORIAIS . ...................................................................... 16

3.4.1 Hemograma ......................................................................................... 16

3.4.2 Bioquímica sérica ................................................................................. 16

3.4.3 Ensaio imunoenzimático (ELISA) ....................................................... 16

3.4.4 Histopatológico .................................................................................... 16

3.4.5 Imunoistoquímica ................................................................................ 17

3.4.5.1 Imunofenótipo ......................................................................... 18

3.4.5.2 Expressão do VEGF ............................................................... 18

3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA .............................................................................. 19

4. RESULTADOS ................................................................................................. 21

4.1 Dados epidemiológicos ........................................................................... 21

4.2 Hemograma e bioquímica sérica ............................................................ 22

4.3 Estadiamento .......................................................................................... 25

4.4 Grau Histológico ..................................................................................... 27

4.5 Imunofenótipo ......................................................................................... 29

4.6 Concentração sérica do VEGF ............................................................... 31

4.7 Expressão do VEGF ............................................................................... 32

4.8 Sobrevida ................................................................................................ 33

5. DISCUSSÃO ..................................................................................................... 38

5.1 Dados clínicos ........................................................................................ 38

5.2 Classificação morfológica e imunofenotípica ......................................... 42

5.3 Fator de crescimento do endotélio vascular .......................................... 44

6. CONCLUSÕES ................................................................................................. 49

7. REFERÊNCIAS ................................................................................................ 50

Apêndices ............................................................................................................ 58

A – TÉCNICA DE ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA) .................................. 59

B – TÉCNICA DE IMUNOISTOQUÍMICA ............................................................. 62

C – SOLUÇÕES UTILIZADAS NA TÉCNICA DE IMUNOISTOQUÍMICA ............ 66

D - DADOS INDIVIDUAIS DE CÃES SADIOS E DE CÃES COM LINFOMA .......

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Classificação Anatômica dos Linfomas Caninos. Citada por

VANDERHAAR & MORRISON (2002) ...............................................3

Tabela 2. Estadiamento dos Linfomas Caninos proposto pela Organização

Mundial da Saúde (OMS). Citado por GREENLEE et al.

(1990)..................................................................................................3

Tabela 3. Sistema “Kiel” proposto para Classificação Histopatológica dos

Linfomas Caninos. Citado por GREENLEE et al.

(1990)..................................................................................................5

Tabela 4. Protocolo Quimioterápico da Universidade de Madison-Wisconsin (L-

VCA-UW/Short) estabelecido para os Linfomas Caninos. Citado por

VAIL & YOUNG (2007) ....................................................................14

Tabela 5. Relação dos anticorpos primários, clone, código, marca e diluição

utilizada na técnica de imunoistoquímica realizada em cortes de

linfonodos de cães sadios e de linfomas caninos (FCAV-UNESP/

Jaboticabal, SP, 2007).....................................................................17

Tabela 6. Pontuação atribuída ao percentual de células marcadas por campo,

em linfonodos de cães sadios e em linfomas caninos (FCAV-

UNESP/Jaboticabal, SP, 2007).........................................................19

Tabela 7. Pontuação atribuída à intensidade de coloração das células

marcadas por campo, em linfonodos de cães sadios e em linfomas

caninos (FCAV-UNESP/Jaboticabal, SP, 2007)..............................19

Tabela 8. Contagens de hemácias, concentração de hemoglobina, hematócrito

e contagens de plaquetas de cães sadios e de cães com linfoma

(FCAV-UNESP/ Jaboticabal, SP, 2007)............................................23

Tabela 9. Contagens (x10

/µL) de leucócitos, eosinófilos, neutrófilos

bastonetes e segmentados (NB e NS), linfócitos e monócitos de cães

sadios e de cães com linfoma (FCAV-UNESP/ Jaboticabal, SP,

2007).................................................................................................24

Tabela 10. Valores individuais das atividades séricas (UI/dL) de alanina

aminotransferase (ALT) e do teor de creatinina (mg/dL) no soro

sangüíneo de cães sadios e de cães com linfoma (FCAV-UNESP/

Jaboticabal, SP, 2007)......................................................................25

Tabela 1D. Dados individuais referentes a epidemiologia, estadiamento, grau

histológico, morfologia celular, imunofenótipo e a sobrevida de cães

com linfoma (FCAV-UNESP/ Jaboticabal, SP, 2007).......................67

Tabela 2D. Valores individuais referentes às concentrações séricas (pg/mL) e a

expressão do VEGF em cães sadios e cães com linfoma (FCAV-

UNESP/Jaboticabal, SP, 2007).........................................................68

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquema simplificado da maturação linfocitária. Adaptado de

PARODI et al. (1988)..........................................................................4

Figura 2. Desenho ilustrativo que evidencia a participação do VEGF-A e do

VEGF-C na angiogênese e linfangiogênese tumoral, bem como de

diferentes citocinas e mediadores inflamatórios presentes no

microambiente tumoral. Adaptado de RUEGG

(2007)................................................................................................10

Figura 3. Método de graduação para determinar o percentual de

imunomarcação para VEGF em linfonodos de cães sadios e em

linfomas caninos (FCAV-UNESP/Jaboticabal, SP, 2007).................18

Figura 4. Distribuição da localização anatômica dos linfomas caninos (FCAV-

UNESP/Jaboticabal, SP, 2007).........................................................21

Figura 5. Cão da raça Boxer, macho, quatro anos de idade, apresentando

linfoma multicêntrico caracterizado por linfadenomegalia

generalizada (FCAV-UNESP/Jaboticabal, SP, 2007........................22

Figura 6. Distribuição do estadiamento (1 – 5) e sub-estadiamento (a – b) dos

linfomas caninos (FCAV-UNESP/Jaboticabal, SP, 2007)................26

Figura 7. Grau histológico dos linfomas caninos (FCAV-UNESP/Jaboticabal,

SP, 2007)..........................................................................................27

Figura 8. Fotomicrografia de linfoma anaplásico de alto grau de malignidade.

Infiltrado de linfócitos grandes e indiferenciados. Hematoxilina-

xiii

Eosina, aumento de 400 vezes (FCAV-UNESP/Jaboticabal,

2007).................................................................................................28

Figura 9. Fotomicrografia de linfoma centrocítico de baixo grau de

malignidade. Infiltrado de linfócitos pequenos, com núcleo irregular e

citoplasma escasso. Hematoxilina-Eosina, aumento de 400 vezes

(FCAV-UNESP/Jaboticabal, 2007)...................................................28

Figura 10. Imunofenótipo dos linfomas caninos (FCAV-UNESP/Jaboticabal, SP,

2007).................................................................................................29

Figura 11. Fotomicrografia de linfoma de células T. Positividade para o

anticorpo primário anti-CD3. EnVision, DAB, Hematoxilina de Mayer.

Aumento de 400 vezes (FCAV-UNESP/Jaboticabal, 2007)..............30

Figura 12. Fotomicrografia de linfoma de células B. Positividade para o

anticorpo primário anti-CD79a. EnVision, DAB, Hematoxilina de

Mayer. Aumento de 400 vezes (FCAV-UNESP/Jaboticabal,

2007).................................................................................................30

Figura 13. Sobrevida dos cães com linfoma tratados com poliquimioterapia

sistêmica baseada no protocolo da Universidade de Madison-

Wisconsin. Nota-se uma elevada incidência de óbitos precoces

(FCAV-UNESP/ Jaboticabal, SP, 2007)............................................31

Figura 14. Distribuição das médias das concentrações séricas do VEGF em

cães sadios e cães com linfoma. Note que a média das

concentrações séricas de VEGF é superior em cães com linfoma

(FCAV-UNESP/Jaboticabal, SP, 2007).............................................32

xiv

Figura 15. Distribuição das médias dos escores de imunorreatividade do VEGF

em linfonodos de cães sadios e em linfomas caninos. Note que a

média de imunomarcação para VEGF é superior em cães com

linfoma (FCAV-UNESP/Jaboticabal, SP, 2007)...............................33

Figura 16. Linfonodo de cão sadio. Positividade para o anticorpo primário anti-

VEGF em menos de 25% dos linfócitos, caracterizando escore 1.

EnVision, DAB, Hematoxilina de Mayer. Aumento de 400 vezes

(FCAV-UNESP/Jaboticabal,2007)....................................................35

Figura 17. Linfonodo de cão sadio. Moderada imunomarcação para VEGF em

mais de 50% dos linfócitos, caracterizando escore 6. EnVision, DAB,

Hematoxilina de Mayer. Aumento de 400 vezes (FCAV-

UNESP/Jaboticabal, 2007)..............................................................35

Figura 18. Linfoma canino. Moderada imunomarcação para VEGF em mais de

75% dos linfócitos neoplásicos, caracterizando escore 8. EnVision,

DAB, Hematoxilina de Mayer. Aumento de 400 vezes (FCAV-

UNESP/Jaboticabal, 2007)..............................................................36

Figura 19. Linfoma canino. Forte imunomarcação para VEGF em mais de 75%

dos linfócitos neoplásicos, caracterizando escore 12. EnVision, DAB,

Hematoxilina de Mayer. Aumento de 400 vezes (FCAV-

UNESP/Jaboticabal, 2007)...............................................................36

Figura 20. Linfoma alimentar em cão da raça Pit Bull caracterizado por

linfadenomegalia mesentérica e presença de neoformação tumoral

em intestino delgado (A). Fotomicrografia de amostra intestinal

revelando infiltrado de linfócitos pequenos, com núcleo arredondado

e citoplasma escasso, caracterizando um linfoma linfoblástico de alto

grau de malignidade (HE, 400x) (B). Imunomarcação de linfócitos B

neoplásicos com o anticorpo primário anti-CD79a (IHQ, 100x) (C).

Forte imunomarcação para VEGF em mais de 75% dos linfócitos

neoplásicos (IHQ, 400x) (D)..............................................................37

xvi

CONCENTRAÇÃO SÉRICA E IMUNOMARCAÇÃO DO FATOR DE

CRESCIMENTO DO ENDOTÉLIO VASCULAR NO PROGNÓSTICO DOS

LINFOMAS CANINOS

RESUMO: A angiogênese tem importante participação na patogênese das

neoplasias malignas em seres humanos e animais de companhia. Estudos

envolvendo a influência dos fatores pró-angiogênicos no crescimento e

disseminação dos tumores sólidos têm sido amplamente realizados, porém os

relacionados às neoplasias hematopoiéticas são extremamente limitados. O

presente estudo objetivou investigar o fator de crescimento do endotélio vascular

(VEGF) nos linfomas caninos e sua relação com indicadores prognósticos da

neoplasia. Foram avaliados 25 cães, sendo 10 sadios e 15 com linfoma. Os

pacientes foram submetidos à coleta de sangue para mensuração da

concentração sérica do VEGF, mediante ensaio imunoenzimático (ELISA), e

biopsia de linfonodo ou de tecido neoplásico para avaliação da expressão do

VEGF, pela técnica de imunoistoquímica. Embora a média das concentrações

séricas do VEGF nos cães com linfoma (88,51±121,71) tenha sido superior à

média dos cães sadios (17,93±23,34), estes valores não foram considerados

significativos (p=0,10). A imunomarcação para VEGF foi maior (p<0,0001) em

cães com linfoma (9,07±2,34) em comparação com os cães sadios (2,70±2,35).

Não houve correlação significativa entre a concentração sérica e a marcação

imunoistoquímica do VEGF com a localização anatômica, estádio e sub-estádio

clínico, grau histológico, imunofenótipo e a sobrevida dos cães com linfoma. O

sub-estádio clínico influenciou negativamente na sobrevida dos cães com linfoma.

Os resultados obtidos permitem concluir que o VEGF possui grande importância

no comportamento biológico dos linfomas caninos, seja mediante estímulo da

angiogênese ou da linfangiogênese tumoral. São necessários estudos com maior

número de animais para determinar o valor prognóstico do estímulo à

angiogênese ou linfangiogênese nos linfomas caninos.

Palavras-chave: angiogênese, linfoma, cão, VEGF, ELISA, imunoistoquímica.

xvii

SERUM CONCENTRATIONS AND VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH

FACTOR LABELING IN PROGNOSIS OF CANINE LYMPHOMAS

ABSTRACT: Angiogenesis has a major role in the pathogenesis of malignancies in

human beings and companion animals. Studies involving the role of pro-angiogenic

factors in growing and dissemination of solid tumors are commonly performed, but

studies involving hematological malignancies are relatively limited. The present

report aims to investigate the role of the vascular endothelial growth factor (VEGF)

in canine lymphomas and its relation with prognostic factors. Twenty five dogs

were evaluated: ten healthy dogs and fifteen dogs with lymphoma. Patients were

submitted to blood sample collection to VEGF serum concentration measure, by

means of sandwich enzyme immunoassay. Lymph node or neoplastic tissue

biopsy was accomplished in order to evaluate VEGF expression, through

immunohistochemical technique. Although VEGF serum concentrations mean in

dogs with lymphoma (88,51±121,71) was found to be greater than VEGF serum

concentrations in healthy dogs (17,93±23,34), this values were not statistically

significant (p=0,10). VEGF expression was significantly higher (p=0,0001) in dogs

with lymphoma (9,07±2,34) than VEGF expression in healthy dogs (2,70±2,35). No

significant relationship was found between VEGF serum concentration or

expression and anatomical localization, clinical stage, histological grade,

immunophenotype or overall survival of lymphoma affected dogs. The clinical sub-

stage was the only negative prognostic factor in overall survival of dogs with

lymphoma. We conclude that VEGF has an important role in biological behavior of

canine lymphomas, once is involved in tumoral angiogenesis or

lymphangiogenesis stimuli. Larger series of animals are needed to determine the

prognostic value of angiogenesis and lymphangiogenesis in canine lymphomas.

Keywords: angiogenesis, lymphoma, dog, VEGF, ELISA, imunohistochemistry

xviii

1. INTRODUÇÃO

Linfomas são neoplasias comumente diagnosticadas no cão, sendo

responsáveis por elevados índices de morbidade e mortalidade na espécie. A

localização anatômica, o estadiamento clínico, o grau histológico e o

imunofenótipo dos linfomas caninos representam importantes fatores prognósticos

da neoplasia e são considerados parâmetros fundamentais para o

estabelecimento de terapias efetivas. Estima-se que o tempo médio de vida de um

cão portador de linfoma seja de 60 dias sem tratamento quimioterápico, e de 360

dias com a utilização de poliquimioterapia sistêmica. Terapias direcionadas a alvos

moleculares específicos, relacionados ao comportamento biológico da neoplasia,

são necessárias para aumentar os índices de sobrevida em seres humanos e

animais de companhia com linfoma.

Atualmente, a angiogênese representa um dos principais focos de pesquisa

relacionados à biologia tumoral na oncologia humana e veterinária, e isto se deve

a grande importância da neovascularização no crescimento e disseminação

tumoral. O fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) é o principal fator

pró-angiogênico. Pesquisas recentes evidenciam tempo de sobrevida mais curto e

baixos índices de resposta terapêutica em humanos portadores de tumores

sólidos ou neoplasias hematopoiéticas com maior expressão tecidual ou aumento

das concentrações séricas de VEGF. Em seres humanos, a utilização terapêutica

de anticorpos monoclonais direcionados contra o VEGF tem demonstrado

resultados promissores no tratamento de diferentes tipos de câncer.

Tendo em vista a relação do VEGF com a promoção e a progressão do

câncer, objetivou-se investigar a concentração sérica e a imunomarcação do

VEGF em cães sadios e com linfoma, correlacionando esses parâmetros com a

localização anatômica, estádio e sub-estádio clínico, grau histológico,

imunofenótipo e tempo de sobrevida após quimioterapia, dos animais afetados

pela neoplasia.

xix

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 LINFOMA CANINO

Os linfomas (linfossarcomas ou linfomas malignos) representam um variado

grupo de neoplasias decorrentes da expansão clonal de células linforreticulares

malignas. Órgãos linfóides primários, como timo e medula óssea, e órgãos

linfóides secundários, como baço e linfonodos, são os principais sítios da

transformação neoplásica (FAN, 2003; VAIL & YOUNG, 2007). Devido à contínua

migração das células linfóides, os linfomas podem se originar em praticamente

todos os tecidos do organismo (FAN, 2003).

Os linfomas são neoplasias comumente diagnosticadas no cão,

representando 83% dos tumores de origem hematopoiética (VAIL & YOUNG,

2007). Ocorrem mais freqüentemente em animais entre cinco e 11 anos, mas há

relatos da doença em cães com menos de um ano de idade (MOULTON &

HARVEY, 1990; VAIL & YOUNG, 2007). As raças mais acometidas são Boxer,

Rottweiler, Poodle, Beagle, Basset Hound, São Bernardo, Airdale terrier e Bulldog

inglês (VONDERHAAR & MORRISON, 2002; DHALIWAL et al., 2003).

A etiologia do linfoma é desconhecida nos cães, mas acredita-se que seja

multifatorial. A exposição crônica a campos eletromagnéticos ou a agentes

químicos (herbicidas, solventes orgânicos), aberrações cromossômicas e

imunossupressão crônica são consideradas causas prováveis (FAN, 2003;

DHALIWAL et al., 2003). Além disso, sabe-se que mutações gênicas herdadas ou

adquiridas podem levar a ativação de proto-oncogenes e/ou a inativação de genes

supressores de tumor, facilitando o desenvolvimento da neoplasia (VAIL &

YOUNG, 2007).

O linfoma é classificado quanto a sua localização anatômica em

multicêntrico, alimentar, mediastinal, cutâneo e extranodal, sendo a forma

multicêntrica a mais freqüente (Tabela 1). Os sinais clínicos associados à

neoplasia são variáveis e dependem da sua extensão e localização

(VONDERHAAR & MORRISON, 2002; DHALIWAL et al., 2003).

Tabela 1 – Classificação Anatômica dos Linfomas Caninos. Citada por VANDERHAAR &

MORRISON (2002).

FORMA LOCALIZAÇÃO

Multicêntrica Linfonodos periféricos, fígado, baço e/ou medula óssea

Alimentar Trato gastrintestinal, linfonodos mesentéricos, fígado

Mediastinal Timo e/ou linfonodos mediastinais

Cutânea Derme, epiderme e/ou junções mucocutâneas

Extranodal

Rins, olhos, cavidade nasal, sistema nervoso central, coração, ossos,

testículos e bexiga.

O estadiamento dos linfomas caninos obedece às regras estabelecidas pela

Organização Mundial de Saúde (OMS) e tem como principal objetivo avaliar a

extensão da doença (Tabela 2). É fundamentado em parâmetros clínicos

(anamnese e exame físico), laboratoriais (hemograma, urinálise, bioquímica sérica

e citologia), exames de diagnóstico por imagem (raio X e ultra-som) e avaliação

histopatológica. Em cães, os estádios III, IV e V são os mais freqüentes, em

decorrência da inabilidade dos proprietários em identificar os estádios iniciais da

doença (VAIL & YOUNG, 2007). Alguns estudos demonstram que os estádios IV e

V estão associados a sobrevida mais curta (DHALIWAL et al., 2003).

Tabela 2 – Estadiamento do Linfoma Canino proposto pela Organização Mundial

da Saúde (OMS). Citado por GREENLEE et al. (1990).

ESTÁDIO CRITÉRIO

I Envolvimento limitado a um único linfonodo

II Envolvimento de vários linfonodos regionais

III Envolvimento generalizado dos linfonodos

IV Envolvimento do fígado e/ou baço, com ou sem envolvimento generalizado

dos linfonodos

V Envolvimento do sangue, medula óssea e/ou outros órgãos

Os estádios são divididos em sub-estádios: “a” (sem sinais sistêmicos) ou “b” (com sinais

sistêmicos).

xxi

Os linfomas são provenientes da expansão clonal de células linfóides com

características morfológicas e imunofenotípicas distintas (VAIL & YOUNG, 2007).

Como os linfomas caninos apresentam semelhanças com os linfomas não-

Hodgkin humanos, esquemas de classificação morfológica utilizados em medicina

humana têm sido aplicados com sucesso nos linfomas caninos (GREENLEE et

al.,1990; TESKE, 1994; PONCE et al., 2004).

O sistema “Kiel” baseia-se na persistência de analogias morfológicas entre

as células neoplásicas e os diferentes estágios de evolução das linhagens de

células T e B não neoplásicas, especialmente aquelas que ocorrem durante a

ativação imunológica (Figura 1).

Figura 1 – Esquema simplificado da maturação linfocitária. Adaptado de PARODI et al.

(1988).

xxii

A morfologia celular (linfocítico, linfoblástico, linfoplasmocítico, centrocítico,

centroblástico, imunoblástico), o imunofenótipo (T ou B) e o grau de malignidade

(alto ou baixo) são os principais parâmetros avaliados no sistema “Kiel” (PARODI

et al., 1988; GREENLEE et al.,1990; TESKE, 1994; KIUPEL et al., 1999; VAIL &

YOUNG, 2007) (Tabela 3).

Tabela 3 – Sistema “Kiel” proposto para a classificação histopatológica dos

linfomas caninos. Citado por GREENLEE et al. (1990).

CATEGORIA

BAIXO GRAU ALTO GRAU

Linfocítico Centroblástico

Linfoplasmocítico Linfoblástico T

Centrocítico Linfoblástico B

Centroblástico-Centrocítico Imunoblástico

Existem poucos estudos correlacionando a morfologia celular com o

prognóstico dos linfomas caninos, porém, sabe-se que o grau de malignidade

pode ser considerado um indicador prognóstico. Os linfomas de alto grau

geralmente apresentam maiores índices de remissão clínica que os de baixo grau.

Entretanto, cães com linfoma de baixo grau tendem a apresentar maior tempo de

sobrevida (TESKE , 1994; VONDERHAAR & MORRISON, 2002; VAIL & YOUNG,

2007). A maioria dos estudos relacionados ao grau histológico dos linfomas

caninos demonstra que apenas uma pequena porcentagem é de baixo grau (5,3 a

29%) (KIUPEL et al., 1999; VAIL & YOUNG, 2007).

Durante muito tempo a determinação do imunofenótipo dos linfomas

caninos foi dificultada pela falta de marcadores específicos (FERRER et al., 1992).

Entretanto, atualmente as técnicas imunoistoquímicas têm sido aplicadas com

sucesso em cortes histológicos de tecido incluído em parafina, utilizando o

anticorpo policlonal anti-CD3 para marcar linfomas de células T, e o anticorpo

xxiii

monoclonal anti-mb1 (CD79a) para os linfomas de células B (FOURNEL-FLEURY

et al., 1997; MOURA et al., 2001; FOURNEL-FLEURY et al., 2002).

A avaliação imunofenotípica é fundamental como indicador prognóstico,

uma vez que existem diferenças na apresentação clínica, comportamento e

resposta terapêutica entre os linfomas de células T e os de células B (KIUPEL et

al.,1999). Os linfomas de células T tendem a ser biologicamente mais agressivos,

resultando em remissões e tempos de sobrevida mais curtos (FAN, 2003).

Aproximadamente 30% dos linfomas caninos têm derivação imunofenotípica de

células T (FOURNEL-FLEURY et al., 2002).

O tratamento dos linfomas baseia-se principalmente em quimioterapia

antineoplásica (VONDERHAAR & MORRISON, 2002). A poliquimioterapia é a

modalidade terapêutica mais efetiva, sendo a administração de ciclofosfamida,

vincristina e prednisona um dos protocolos mais utilizados. Protocolos que incluem

fármacos como a doxorrubicina e a l-asparaginase tendem a promover tempo de

sobrevida mais longo (VAIL & YOUNG, 2007).

Cães com linfoma que não recebem tratamento quimioterápico apresentam

sobrevida média de 60 dias, já os tratados com poliquimioterapia sistêmica podem

apresentar até dois anos de sobrevida (MOULTON & HARVEY, 1990; VAIL &

YOUNG, 2007). Atualmente, sabe-se que o comportamento biológico dos linfomas

tem grande influência na evolução clínica da enfermidade e no tempo de

sobrevida do paciente. Desta forma, estudos relacionados à biologia tumoral são

fundamentais para o estabelecimento de fatores prognósticos precisos e terapias

específicas (VAIL & YOUNG, 2007).

2.2 ANGIOGÊNESE

A angiogênese representa a formação de novos vasos sangüíneos a partir

de um leito vascular pré-existente. É observada em processos fisiológicos, como

embriogênese, proliferação endometrial, cicatrização de feridas, e em processos

xxiv

patológicos, como artrite reumatóide, retinopatia diabética e neoplasias

(CLIFFORD et al., 2001; FERRARA, 2004).

Durante a carcinogênese há um acúmulo progressivo de mutações em

diferentes genes, que geram subpopulações celulares com características

biológicas específicas. Essa instabilidade genética é responsável pela ativação de

proto-oncogenes, inativação de genes supressores de tumor, proliferação celular

exacerbada, perda da habilidade celular em sofrer apoptose e produção de fatores

de crescimento que auxiliam na promoção e progressão tumoral (CASTRO-

JÚNIOR et al., 2006).

O crescimento das neoplasias malignas é condicionado a uma vasculatura

adequada. A sobrevivência das células tumorais é dependente de quantidades

suficientes de oxigênio e nutrientes, bem como da habilidade celular em eliminar

toxinas. Sem o recrutamento de sua própria rede vascular, um tumor não pode

exceder dois milímetros de diâmetro (CASTRO-JÚNIOR et al., 2006; CHUN &

THAM, 2007). A angiogênese constitui um pré-requisito não apenas para o

crescimento contínuo do tumor primário, mas também para a formação de

metástases (CHUN & THAM, 2007).

A regulação da angiogênese é um processo complexo resultante do

equilíbrio dinâmico entre fatores pró-angiogênicos e antiangiogênicos. Os

principais fatores pró-angiogênicos são o fator de crescimento do endotélio

vascular (VEGF), o fator de crescimento fibroblástico (FGF), a angiopoietina, a

angiogenina e o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF). A

angiostatina, as heparinases, a endostatina, os interferons e os retinóides são

considerados inibidores da angiogênese (GILES et al., 2004; PANDYA et al.,

2006). Em condições neoplásicas, os fatores pró-angiogênicos superam os anti-

angiogênicos, garantindo a angiogênese patológica (CHUM & THAMM, 2007). Os

mecanismos pelos quais as células neoplásicas estimulam a angiogênese

patológica mimetizam os utilizados pelas células normais na promoção da

angiogênese fisiológica. Entretanto, a microvasculatura originária de processos

neoplásicos tem sua estrutura, funcionamento e genética alterados, em

xxv

comparação a microvasculatura proveniente de condições fisiológicas (CASTRO-

JÚNIOR et al., 2006).

Uma cascata de eventos biológicos acompanha o processo de interação

entre as células neoplásicas e o microambiente local. Modificações homeostáticas

decorrentes de hipóxia e estresse oxidativo ou mecânico atuam como potentes

estimulantes da angiogênese tumoral, promovendo a expressão de múltiplos

fatores pró-angiogênicos (CASTRO-JÚNIOR et al., 2006). Esses fatores de

crescimento podem ser produzidos pelas células tumorais, pelo tecido adjacente

ao tumor ou por células inflamatórias presentes no microambiente tumoral,

principalmente macrófagos e linfócitos (PANDYA et al., 2006).

O processo de neovascularização tumoral segue as seguintes etapas:

produção de fatores de crescimento pró-angiogênicos, ativação das células

endoteliais, degradação da matriz extra-celular, migração e proliferação das

células endoteliais, adesão celular, reorganização da matriz extra-celular e início

do fluxo sangüíneo (CHUN & THAM, 2007).

O VEGF foi identificado em 1980 como o fator pró-angiogênico

predominante na maioria das neoplasias em seres humanos, sendo inicialmente

denominado fator de permeabilidade vascular (PODAK & ANDERSON, 2005).

Atualmente, é considerado um dos mais específicos reguladores da angiogênese

tumoral (PANDYA et al., 2006). É representado por uma família de fatores de

crescimento composta por seis glicoproteínas: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-

D, VEGF-E e fator de crescimento placentário (PIGF). O VEGF-A é o principal

fator de crescimento associado a angiogênese, sendo constituído por seis

isoformas distintas, classificadas de acordo com a quantidade de aminoácidos

presentes na cadeia protéica (121, 145, 165, 183, 189 ou 206). Estudos recentes

sugerem expressão tecidual específica dessas variantes do VEGF em

determinadas etapas da angiogênese (FERRARA & DAVIS-SMITH, 1997;

FERRARA, 2004).

Os efeitos angiogênicos do VEGF são mediados por suas ligações a

receptores celulares específicos presentes nas células endoteliais, incluindo o

xxvi

VEGFR-1, o VEGFR-2 e o VEGFR-3 (CASTRO-JÚNIOR et al., 2006). Algumas

vezes, o VEGF exerce um efeito autócrino mediante estimulação direta das

células tumorais (FERRARA, 2004; MILLANTA et al., 2006).

O VEGF é uma glicoproteína multifuncional, uma vez que estimula a

atividade mitogênica das células endoteliais, a permeabilidade vascular, a

sobrevivência celular e a produção de diferentes moléculas envolvidas no

processo de neovascularização. A atuação do VEGF é observada nas células

endoteliais de vasos sangüíneos e linfáticos (GILES et al., 2004).

Estudos recentes demonstram que a linfangiogênese é tão importante na

expansão tumoral quanto a angiogênese. NAGY et al. (2002) revelaram que o

VEGF-A participa da linfangiogênese bem como da angiogênese em diferentes

neoplasias, e que o VEGF-C e o VEGF-D influenciam na proliferação de vasos

linfáticos mediante ativação do VEGFR-3 expresso nas células endoteliais

linfáticas. A linfangiogênese tumoral foi associada a expressão do VEGF-C em

neoplasias mamárias, carcinomas de células escamosas, mesotelioma e

neoplasias pulmonares em seres humanos (KADOWAKI et al., 2005). HIRAKAWA

et al. (2007) sugeriram que o VEGF-C não promove o crescimento do tumor

primário, porém induz a expansão das redes linfáticas entre os linfonodos

sentinelas, favorecendo as metástases e a disseminação tumoral (Figura 2).

xxvii

Figura 2 – Desenho ilustrativo que evidencia a participação do

VEGF-A e do VEGF-C na angiogênese e linfangiogênese

tumoral, bem como de diferentes citocinas e mediadores

inflamatórios presentes no microambiente tumoral.

Adaptado de RUEGG (2007).

Pesquisas revelam que as concentrações séricas de VEGF são

significativamente maiores em seres humanos com diferentes tipos de câncer,

incluindo tumores sólidos (carcinomas mamários, prostáticos e colorretais) e

malignidades hematopoiéticas (mieloma múltiplo, leucemias e linfomas). Além

disso, demonstram que as concentrações séricas elevadas estão associadas a

baixos índices de resposta terapêutica e menor tempo de sobrevida (BERTOLINI

et al., 1999; FERRARA, 2004).

SCHEIDEGGER et al. (1999) evidenciaram que a estrutura molecular e a

função do VEGF humano e canino são idênticas em condições fisiológicas ou

patológicas, o que possibilita a utilização dos mesmos métodos diagnósticos e

terapêuticos em ambas as espécies.

xxviii

Em cães, estudos recentes revelam maior expressão do VEGF em

neoplasias mamárias malignas (RESTUCCI et al., 2002; MILLANTA et al., 2006),

carcinomas espinocelulares (MAIOLINO et al., 2000), seminomas pouco

diferenciados (RESTUCCI et al., 2003) e mastocitomas (REBUZZI et al., 2007),

sugerindo que a angiogênese pode estar associada ao aumento da proliferação

celular, invasão local e metástases. CLIFFORD et al. (2001) evidenciaram

elevadas concentrações circulantes de VEGF em cães com hemangiossarcoma.

2.3 A ANGIOGÊNESE NO LINFOMA

Embora esteja bem estabelecido que o crescimento de tumores sólidos

requer neovascularização vigorosa, a influência da angiogênese no crescimento e

sobrevivência de células neoplásicas do sistema hematopoiético foi recentemente

reconhecida (BERTOLINI et al. 1999; KOSTER & RAEMAEKERS, 2005).

Em 1975, autores relataram um caso de linfoma sub-cutâneo mimetizando

um neoplasma vascular, devido a extensa telangiectasia desenvolvida ao redor do

tumor. Adicionalmente, observaram que fragmentos de linfoma inseridos em

camundongos induziam dramática neovascularização, sugerindo a existência de

um fator de crescimento produzido pelas células neoplásicas promovendo

angiogênese (ORPANA & SALVEN, 2002).

GILES et al. (2004) verificaram níveis séricos elevados de VEGF em

pacientes humanos com linfoma sem tratamento quimioterápico. Adicionalmente,

constataram que estes níveis eram inferiores durante a quimioterapia e que o

tempo de sobrevida foi significativamente maior em pacientes que apresentavam

concentração de VEGF abaixo da média, antes do tratamento quimioterápico.

Resultados semelhantes foram observados por SALVEN et al. (1997), SALVEN et

al. (2000) e NIITSU et al. (2002).

JORGENSEN (2005) avaliou a expressão imunoistoquímica do VEGF em

diferentes tipos histológicos de linfoma não-Hodgkin humano, evidenciando maior

imunorreatividade em tumores mais agressivos. Outros pesquisadores

xxix

constataram correlação entre a expressão do VEGF e alguns fatores prognósticos

dos linfomas não-Hodgkin humanos (HAZAR et al., 2003; KORKOLOPOULOU et

al., 2005). Esses autores concluíram que a expressão do VEGF pode ser um

método efetivo de avaliação do comportamento biológico desse tipo de neoplasia

(HAZAR et al., 2003; KORKOLOPOULOU et al., 2005; JORGENSEN, 2005).

Os linfomas cutâneos epiteliotrópicos são caracterizados por curso clínico

sub-agudo e baixa resposta terapêutica. MAZUR et al. (2004) verificaram

microdensidade vascular aumentada em linfomas epiteliotrópicos, referindo

influência da angiogênese no comportamento biológico desta neoplasia e a

importância do uso de medicações anti-angiogênicas no tratamento do linfoma

cutâneo em seres humanos.

GENTILINI et al. (2005) revelaram que a angiogênese é um importante fator

prognóstico em cães com linfoma comparando os valores da concentração sérica

de fatores angiogênicos de cães doentes com os valores de cães sadios.

O estudo da angiogênese tem recebido muita atenção na medicina, pois

representa um alvo terapêutico comum para a grande maioria das neoplasias

(LAMONTAGNE, 2005). Procedimentos experimentais baseados na administração

de anticorpos anti-VEGF em camundongos com diferentes tipos de câncer têm

demonstrado redução do crescimento neoplásico devido ao aumento da apoptose

e redução da vascularização e proliferação celular (FERRARA, 2004). Diferentes

trabalhos têm demonstrado efeito satisfatório das terapias anti-angiogênicas em

neoplasias linfoproliferativas de camundongos e seres humanos (ORPANA &

SALVEN, 2002).

xxx

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 GRUPOS EXPERIMENTAIS

Foram avaliados 25 animais da espécie canina, adultos, com ou sem raça

definida, entre machos e fêmeas, distribuídos da seguinte forma:

- Animais com linfoma (grupo I): 15 cães atendidos no Serviço de Oncologia do

Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel”, Faculdade de Ciências

Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita

Filho” (FCAV-UNESP/Jaboticabal), com diagnóstico de linfoma confirmado

mediante avaliação citológica e/ou histopatológica.

- Animais sadios (grupo II): 10 cães clinicamente saudáveis, provenientes do

Canil Municipal de Sertãozinho/SP.

3.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

3.2.1 Grupo I

Os cães do grupo I foram submetidos aos exames de rotina realizados pelo

Serviço de Oncologia Veterinária em pacientes com linfoma objetivando o

estadiamento da neoplasia, conforme protocolo proposto pela Organização

Mundial da Saúde. Estes exames incluíram hemograma, avaliação bioquímica

sérica, radiografia torácica (incidências látero-lateral e ventro-dorsal) e ultra-

sonografia abdominal. Citologia aspirativa da medula óssea foi realizada em cães

que apresentaram alterações hematológicas sugestivas de linfoma leucêmico.

Durante a avaliação clínica dos animais, além de coletados dados sobre

raça, sexo e idade, foi procedida a classificação do linfoma quanto a sua

localização anatômica (multicêntrico, alimentar, mediastinal, cutâneo ou extra-

nodal).

Adicionalmente, os 15 animais foram submetidos à coleta de sangue para

mensuração da concentração sérica de VEGF, como também à biópsia incisional

da neoplasia para determinação do grau histológico, do imunofenótipo e da

imunomarcação de VEGF.

xxxi

Após a realização dos exames e colheita das amostras, todos os animais

foram submetidos à quimioterapia antineoplásica baseada no protocolo de

Madison-Wisconsin (L-VCA-UW/Short) (Tabela 4) e monitorados quanto ao tempo

de sobrevida.

Tabela 4 – Protocolo Quimioterápico da Universidade de Madison - Wisconsin

(LVCA – UW / Short) estabelecido para os Linfomas Caninos. Citado

por VAIL & YOUNG (2007).

SEMANA QUIMIOTERÁPICO DOSE E VIA DE ADMINISTRAÇÃO

1 L-Asparaginase

Vincristina

Prednisona

400 UI/Kg – IM

0,7 mg/m

- IV

2 mg/kg - VO

2 Ciclofosfamida

Prednisona

250 mg/m

- VO

1,5 mg/kg - VO

3 Vincristina

Prednisona

0,7 mg/m

- IV

1 mg/kg - VO

4 Doxorrubicina

Prednisona

30 mg/m

- IV

0,5 mg/kg - VO

6 Vincristina 0,7 mg/m

- IV

7 Ciclofosfamida 250 mg/m

- VO

8 Vincristina 0,7 mg/m

- IV

9 Doxorrubicina 30 mg/m

- IV

11 Ciclofosfamida 0,7 mg/m

- IV

13 Vincristina 250 mg/m

- VO

15 Vincristina 0,7 mg/m

- IV

17 Doxorrubicina 30 mg/m

- IV

19 Vincristina 0,7 mg/m

- IV

21 Ciclofosfamida 250 mg/m

- VO

23 Vincristina 0,7 mg/m

- IV

25 Doxorrubicina 30 mg/m

- IV

O tratamento é interrompido após a 25ª semana se houver remissão completa da neoplasia

IM= intramuscular; IV= intravenosa; SC= subcutânea

3.2.2 Grupo II

xxxii

Os animais do grupo II foram submetidos a exame físico completo e coleta

de sangue para hemograma e avaliação bioquímica sérica objetivando a exclusão

de enfermidades sistêmicas. O soro de cada animal foi reservado para

mensuração da concentração sérica de VEGF. Adicionalmente, foi realizada

biopsia excisional do linfonodo inguinal de todos os cães para avaliar a

imunoexpressão de VEGF em tecido linfóide não neoplásico.

3.3 COLHEITA DE MATERIAL

3.3.1 Sangue

Foram obtidos 10mL de sangue/cão (grupo I e grupo II), mediante

venipunção jugular utilizando seringas e agulhas descartáveis. Foi adicionado

anticoagulante ácido etileno-diamino tetracético dissódico (EDTA) em 1mL de

cada amostra para a confecção do hemograma. A fração restante da amostra sem

anticoagulante foi mantida em tubos de ensaio, em repouso à temperatura

ambiente, até a coagulação e retração do coágulo, sendo posteriormente

centrifugada a 800G, durante 10 minutos, para obtenção do soro. Parte foi

utilizada para a avaliação bioquímica sérica e o restante foi congelado a -20ºC,

durante quatro a 10 meses, para mensuração da concentração sérica de VEGF.

3.3.2 Amostra tecidual

As amostras teciduais foram obtidas por biopsia incisional/excisional da

neoplasia (grupo I) ou de linfonodo inguinal (grupo II), sendo este procedimento

conduzido de forma asséptica e sob anestesia geral. Essas amostras foram

conservadas em formol 10%, por 24 horas, desidratadas em álcool 70%, por 48

horas, e posteriormente processadas para inclusão em parafina. Os blocos de

parafina foram encaminhados ao Laboratório de Patologia Veterinária, Faculdade

de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de

Mesquita Filho” (FMVZ-UNESP/Botucatu), para avaliação histopatológica e

imunoistoquímica.

xxxiii

3.4 EXAMES LABORATORIAIS

3.4.1 Hemograma

As contagens de hemácias, leucócitos e plaquetas, e a mensuração da

concentração de hemoglobina e do hematócrito, foram obtidos com auxílio de um

contador automático de células (Coulter ACT-8). As contagens diferenciais dos

leucócitos foram efetuadas em esfregaços sangüíneos corados com May

Grunwald – Giemsa. Os procedimentos laboratoriais foram realizados no

Laboratório de Patologia Clínica Veterinária “Prof. Dr. Joaquim Martins Ferreira

Neto”, do Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel”, FCAV – UNESP /

Jaboticabal.

3.4.2 Bioquímica Sérica

Foram determinados os teores de creatinina (método de Basques-Lustosa)

no soro sangüíneo dos animais dos grupos I e II, e as atividades séricas da

enzima alanina aminotransferase - ALT (método cinético UV). Os testes foram

realizados utilizando-se conjuntos de reagentes de uso comercial LABTEST

, e as

leituras das amostras efetuadas em espectrofotômetro LABQUEST

3.4.3 Ensaio imunoenzimático (ELISA)

A concentração sérica do VEGF foi mensurada com a utilização de um kit

comercial de ensaio imunoenzimático (ELISA) sanduíche (Human VEGF-C

Immunoassay, Quantikine

, R&D Systems, Minneapolis, USA), seguindo as

instruções do fabricante (Apêndice A). Todas as amostras foram avaliadas em

duplicata. A validação do teste de ELISA com anticorpo humano para a

mensuração do fator de crescimento do endotélio vascular canino foi previamente

confirmada por SCHEIDEGGER et al. (1999), CLIFFORD et al. (2001) e

GENTILLINI et al. (2005). O protocolo experimental foi conduzido no Laboratório

de Imunoparasitologia Veterinária, FCAV-UNESP/Câmpus de Jaboticabal.

3.4.4 Histopatológico

xxxiv

As amostras incluídas em parafina (animais do grupo I e II) foram

submetidas a cortes de cinco micrômetros e coradas com Hematoxilina e Eosina.

Após a confecção das lâminas, procedeu-se à avaliação histopatológica mediante

microscopia de luz objetivando a seleção dos linfonodos normais (grupo II) e a

determinação do grau histológico dos linfomas caninos (grupo I). Para esta

classificação foi utilizando o Sistema “Kiel” (Tabela 3), proposto para os linfomas

não-Hodgkin humanos (GREENLEE et al., 1990; TESKE, 1994).

3.4.5 Imunoistoquímica

Para a realização da técnica de imunoistoquímica, os espécimes incluídos

em parafina foram submetidos a cortes de três micrômetros e montados em

lâminas previamente preparadas com cola líquida a base de organosilano (A3648

– SIGMA). As reações de imunoistoquímica foram realizadas de acordo com

protocolos previamente estabelecidos pelo Laboratório de Imunoistoquímica do

Serviço de Patologia Veterinária, FMVZ-UNESP/Câmpus de Botucatu (Apêndices

B e C). Os anticorpos utilizados estão descritos na Tabela 5.

Tabela 5 - Relação dos anticorpos primários, clone, código, marca e diluição

utilizados na técnica de imunoistoquímica realizada em amostras de

linfonodos de cães sadios e linfomas caninos. FCAV-UNESP/

Jaboticabal, SP, 2007.

Anticorpo Clone Código Marca Diluição

Anti-CD3

Policlonal

A0452

DakoCytomation

1:100

Anti-CD79a

MB1

M7050

DakoCytomation

1:50

Anti-VEGF

(VEGF-A)

VG1

M7273

DakoCytomation

1:25

xxxv

Em todas as reações foram realizados controles negativos, nos quais se

substituiu o anticorpo primário por imunoglobulinas (Igs) da espécie em que o

anticorpo primário foi produzido (CD3–Igs de coelho; CD79a e VEGF–Igs de

camundongo).

A imunorreatividade dos anticorpos foi avaliada com o auxílio de um

equipamento analisador de imagens (QWin, versão 3.0). Esse equipamento

consta de um microscópio (Leica) acoplado a uma câmera digital (Leica–DF500)

que gera imagens em um programa computacional de análise morfométrica.

3.4.5.1 Imunofenótipo

O imunofenótipo dos linfomas caninos foi determinado pela marcação

positiva dos linfócitos neoplásicos presentes nas amostras teciduais. A

positividade ao anticorpo anti-CD3 confirmou o imunofenótipo T, e a positividade

ao anticorpo anti-CD79a, o imunofenótipo B.

3.4.5.2 Expressão do VEGF

Para determinar a expressão do VEGF nos espécimes dos animais do

grupo I e II foram avaliados cinco campos de cada amostra analisada. Em cada

campo foi mensurado o percentual de células marcadas (Figura 3 e Tabela 6) e a

intensidade de coloração (Tabela 7), conforme preconizado por DE NARDI (2007).

Foi estabelecida uma média dos valores determinados em cada campo.

Figura 3 - Método de gradação para determinar o percentual de imunomarcação

para VEGF, em linfonodos de cães sadios e em linfomas caninos.

FCAV-UNESP/Jaboticabal, SP, 2007.

xxxvi

Tabela 6 - Pontuação atribuída ao percentual de células marcadas por campo, em

linfonodos de cães sadios e em linfomas caninos. FCAV – UNESP /

Jaboticabal, SP, 2007.

Percentual de células marcadas Pontuação

< 5% 0

5 – 25 % 1

26 – 50% 2

51 – 75% 3

> 75% 4

Tabela 7 - Pontuação atribuída à intensidade de coloração das células marcadas

por campo, em linfonodos de cães sadios e em linfomas caninos.

FCAV-UNESP/Jaboticabal, SP, 2007.

Intensidade de coloração Pontuação

Fraca 1

Moderada 2

Forte 3

Ao final, estabeleceu-se um escore de 0 a 12 pontos obtido a partir do

produto da pontuação do percentual de células marcadas pela pontuação da

intensidade de coloração.

3.5 Análise Estatística

Para determinar se a concentração sérica e a expressão do VEGF

diferiram entre os cães sadios e com linfoma, as médias foram comparadas pelo

teste de Mann Withney, considerando um nível de significância de 5%. Foi

realizada análise de correlação de Spearman entre as variáveis concentração

sérica e expressão do VEGF, localização anatômica, estádio e sub-estádio clínico,

imunofenótipo, grau histológico e sobrevida dos pacientes com linfoma,

xxxvii

considerando a significância de 5%. Análise descritiva dos dados foi empregada

para o restante dos resultados. Utilizou-se o programa estatístico SAS (Statistical

Analysis System, versão 8.2 – Institute Inc., Cary, NC, USA) para a realização

destas análises.

xxxviii

4. RESULTADOS

4.1 Dados epidemiológicos dos cães com linfoma

Dos 15 animais com linfoma, oito (53%) eram machos e sete (47%) fêmeas.

A idade dos pacientes variou entre três e 15 anos, porém observou-se maior

prevalência da neoplasia em cães com idade entre seis e 10 anos (53,3%). Em

relação à distribuição racial, quatro (26,6%) cães não apresentavam raça definida,

três (20%) eram da raça Poodle, dois (13,4%) da raça Rottweiler e dois (13,4%) da

raça Pit bull. Os outros quatro animais pertenciam às raças Boxer, Bull terrier,

Bulldog inglês e Basset hound. A localização anatômica mais freqüente foi a

multicêntrica (53,3%). A forma extra-nodal ocorreu na região peri-aórtica (Figuras

4 e 5 ).

Número de

animais

Multicêntrico Cutâneo Alimentar Extra-nodal

Localização anatômica

6,65% 6,65%

33,4%

53,3%

Figura 4 – Distribuição da localização anatômica dos linfomas caninos.

FCAV-UNESP/Jaboticabal, SP, 2007.

xxxix

Figura 5 – Cão da raça Boxer, macho, quatro anos de idade, apresentando

linfoma multicêntrico caracterizado por linfadenomegalia

generalizada. FCAV-UNESP/Jaboticabal, SP, 2007.

4.2 Hemograma e bioquímica sérica

Os valores individuais obtidos no hemograma e na avaliação bioquímica

sérica dos cães sadios e dos cães com linfoma estão apresentados nas Tabelas 8,

9 e 10.

Tabela 8 - Contagens de hemácias, concentração de hemoglobina, hematócrito e contagens de plaquetas de

cães sadios e de cães com linfoma (FCAV-UNESP/Jaboticabal, SP, 2007).

Eritrograma

Hemácias

(x10

)

Hemoglobina

(g/dL)

Hematócrito

(%)

Plaquetas

(x10

/µL)

Valores de

referência

5,50 a 8,50 12 a 18 37 a 55 200 a 500

Animais

Sadios

n=10

Linfoma

n=15

Sadios

n=10

Linfoma

n=15

Sadios

n=10

Linfoma

n=15

Sadios

n=10

Linfoma

n=15

1 5,56 3,07 12,6 6,50 37 20,40 250 168

2 6,62 1,92 15,6 4,30 47 13,00 255 47

3 6,50 7,65 14,8 11,50 45 33,80 300 297

4 5,50 7,10 16,9 14,90 37 55,00 335 244

5 6,35 5,50 15,3 9,51 39 39,00 260 99

6 6,98 6,40 14,1 14,10 46 42,00 265 240

7 7,85 3,26 16,5 9,10 47 27,10 280 236

8 6,80 5,16 12,9 12,00 42 36,70 369 909

9 6,95 4,89 14,7 11,80 49 35,60 390 75

10 6,58 7,85 12,6 14,62 45 47,00 385 197

11 3,78 8,60 22,50 56

12 1,29 3,60 10,30 582

13 2,93 6,90 21,20 34

14 6,26 12,10 39,70 113

15 6,91 15,50 47,20 233

Valores de referência: GARCIA-NAVARRO & PACHALY, 1994.

Tabela 9 - Contagens (x10

/µL) de leucócitos, eosinófilos, neutrófilos bastonetes e segmentados (NB e NS),

linfócitos e monócitos de cães sadios e de cães com linfoma (FCAV-UNESP/Jaboticabal, SP, 2007).

Leucograma

Leucócitos

Eosinófilos

Linfócitos Monócitos

Valores de

referência

6,0 a 17,0 0,1 a 1,2 0,0 a 0,5 3,0 a 11,0 1,0 a 5,0 0,1 a 1,3

Animais

Sadios

n=10

Linfoma

n=15

Sadios

n=10

Linfoma

n=15

Sadios

n=10

Linfoma

n=15

Sadios

n=10

Linfoma

n=15

Sadios

n=10

Linfoma

n=15

Sadios

n=10

Linfoma

n=15

1 11,95 16,20 0,25

0,16 0,38

1,63 8,19 12,96 2,75 1,29 0,38 0,16

2 13,64 15,80 0,47

0,00 0,47

0,00 10,45 14,23 1,78 1,42 0,47 0,15

3 12,96 6,90 0,26

0,21 0,39

0,21 9,29 5,10 2,63 1,18 0,39 0,20

4 13,94 13,10 0,58

0,52 0,29

0,27 10,15 9,17 2,48 2,88 0,44 0,26

5 15,04 34,85 0,36

1,05 0,55

1,39 11,83 20,91 1,75 11,15 0,55 0,35

6 15,24 9,80 1,07

0,78 0,46

0,29 10,56 7,05 2,69 1,57 0,46 0,09

7 11,42 15,50 0,25

0,31 0,38

0,62 8,75 12,40 1,66 1,39 0,38 0,77

8 14,24 5,30 0,64

0,05 0,32

0,00 11,20 4,50 1,44 0,37 0,64 0,37

9 11,27 54,60 0,27

1,64 0,41

2,18 8,57 34,40 1,48 14,19 0,54 0,18

10 12,96 21,30 0,42

0,00 0,42

0,21 9,10 16,83 2,60 4,05 0,42 0,21

11 7,60

0,21

0,37 5,70 1,12 0,30

12 32,10

0,00

0,86 27,50 1,28 2,46

13 49,50

0,00

0,99 44,55 2,47 1,49

14 7,00

0,00

0,00 5,67 1,12 0,21

15 11,60

0,00

1,04 7,43 2,90 0,23

Contagens de basófilos iguais a zero em todas as amostras

Valores de referência: GARCIA-NAVARRO & PACHALY, 1994.

Tabela 10 - Valores individuais das atividades séricas (UI/dL) de alanina

aminotransferase (ALT) e do teor de creatinina (mg/dL) no soro

sangüíneo de cães sadios e de cães com linfoma (FCAV-UNESP/

Jaboticabal, SP, 2007).

Bioquímica

sérica

ALT Creatinina

Valores de

referência

10,0 a 88,0 0,5 a 1,5

Animais

Sadios

n=10

Linfoma

n=15

Sadios

n=10

Linfoma

n=15

1 36,62 812,40 0,91 0,98

2 52,23 47,17 1,35 0,74

3 41,25 39,50 1,08 1,02

4 39,27 70,00 1,14 1,20

5 48,64 115,20 1,27 1,02

6 46,87 40,00 0,86 1,70

7 54,25 73,30 1,18 0,68

8 38,47 125,70 0,91 0,68

9 42,54 33,77 1,29 0,90

10 49,28 67,54 1,41 1,31

11 33,77 1,10

12 85,00 4,65

13 70,00 2,35

14 15,00 0,59

15 20,95 1,50

Valores de referência: MEYER et al., 1995.

Na avaliação hematológica dos cães com linfoma verificou-se anemia em

sete (47%) cães e trombocitopenia em oito (53%), no diagnóstico da neoplasia. No

leucograma observou-se leucocitose por neutrofilia em cinco (33%) animais e

leucopenia em um (6,6%). Constatou-se linfocitose associada a presença de

linfócitos atípicos circulantes em apenas um (13,3%) cão, sendo confirmada a

ocorrência de linfoma leucêmico mediante avaliação citológica da medula óssea. À

avaliação bioquímica sérica, evidenciou-se elevação das atividades séricas da

alanina aminotransferase em três (20%) cães com linfoma, e elevação do teor de

creatinina no soro sangüíneo de outros três (20%) animais.

Notou-se maior freqüência de cães no estádio 5 e no sub-estádio “b”.

Nenhum dos pacientes foi classificado nos estádios 1, 2 ou 3 (Figura 6).

Número de

cães

12345 ab

Estadiamento

60%

40%

73,3%

26,7%

Figura 6 – Distribuição do estadiamento (1 – 5) e sub-estadiameto (a – b) dos

linfomas caninos. FCAV-UNESP/Jaboticabal, SP, 2007.

Pode-se constatar que dos 11 animais diagnosticados no estágio 5, seis

(40%) encontravam-se no sub-estádio “b”. Observou-se também que 71% dos

cães com anemia, 62% com trombocitopenia e 83% com alterações na avaliação

bioquímica sérica encontravam-se no estádio 5.

4.4 Grau Histológico

Constatou-se que os linfomas de baixo grau de malignidade acometeram

dois cães, sendo observado predomínio dos linfomas de alto grau de malignidade,

que totalizaram 13 dos 15 casos avaliados (Figuras 7, 8 e 9).

Número de

animais

Linfoma T Linfoma B

Imunofenótipo

Número de

animais

Linfoma T Linfoma B

Imunofenótipo

86,7%

13,3%

Figura 7 -

Imunofenótipo dos linfomas caninos. Note a prevalência do

linfomas de células B. FCAV-U

Grau histológico dos linfomas caninos. FCAV-

UNESP/Jaboticabal, SP, 2007.

NESP/Jaboticabal, SP, 2007.

Quanto a morfologia celular, os linfomas de baixo grau foram classificados

em centrocítico (1) e centroblástico-centrocítico (1). Os linfomas de alto grau foram

classificados como centroblástico (5), imunoblástico (4), linfoblástico (2) e

anaplásico (2). Os linfomas de alto grau acometeram 100% dos linfomas cutâneos

e 75% dos multicêntricos.

Figura 8 -

Fotomicrografia de linfoma anaplásico de alto grau de malignidade.

Infiltrado de linfócitos grandes e indiferenciados. Hematoxilina-

Eosina, aumento de 400 vezes. FCAV-UNESP/Jaboticabal, 2007.

Figura 9 -

Fotomicrografia de linfoma centrocítico de baixo grau de

malignidade. Infiltrado de linfócitos com núcleo irregular e citoplasma

escasso. Hematoxilina-Eosina, aumento de 400 vezes. FCAV-

UNESP/Jaboticabal, 2007.

4.5 Imunofenótipo

Na avaliação imunofenotípica observou-se prevalência dos linfomas de

células B (Figuras 10, 11 e 12).

Figura 10 -

Número de

animais

Linfoma T Linfoma B

Imunofenótipo

67%

33%

Imunofenótipo dos linfomas caninos. FCAV-UNESP/Jaboticabal,

SP, 2007.

Os linfomas de células B representaram 85% dos linfomas multicêntricos e

os de células T, 67% dos linfomas cutâneos. De acordo com a classificação de

“Kiel”, 100% dos linfomas de células T foram considerados de alto grau de

malignidade, assim como 80% dos linfomas de células B.

Figura 11 -

Fotomicrografia de linfoma de células T. Positividade para o

anticorpo primário anti-CD3. EnVision, DAB, Hematoxilina de

Mayer, aumento de 100 vezes. FCAV-UNESP/Jaboticabal, 2007.

Figura 12 -

Fotomicrografia de linfoma de células B. Positividade para o

anticorpo primário anti-CD79a. EnVision, DAB, Hematoxilina de

Mayer, aumento de 400 vezes. FCAV-UNESP/Jaboticabal, 2007.

4.6 Concentração sérica de VEGF

No ELISA sanduíche, as concentrações séricas de VEGF variaram de 0 a

58,66pg/mL (17,93±23,34) nos cães sadios, e de 0 a 417,75pg/mL (88,51±121,71)

nos cães com linfoma. Apesar de a média das concentrações séricas de VEGF em

cães com linfoma ser superior à média de cães sadios, não houve diferença

estatística entre os dois grupos (p=0,10) (Figura 14). Os valores individuais da

concentração sérica de VEGF em cães sadios e cães com linfoma estão

demonstrados na Tabela 2, do Apêndice D.

Figura 14 –

100

VEGF sérico

(pg/mL)

Sadios Linfoma

Grupos experimentais

Médias das concentrações séricas de VEGF em cães sadios

e cães com linfoma. FCAV-UNESP/ Jaboticabal, SP, 2007.

Adicionalmente, não foi evidenciada correlação significativa entre as

variáveis concentração sérica de VEGF, localização anatômica (p=0,80), estádio

(p=0,44) e sub-estádio clínico (p=0,73), grau histológico (p=0,31) e imunofenótipo

(p=0,06) de cães com linfoma.

4.7 Expressão do VEGF

Na avaliação imunoistoquímica, o escore de imunomarcação para VEGF foi

significativamente maior (p<0,0001) em cães com linfoma (9,07±2,34) quando

comparado ao escore de imunomarcação para VEGF em linfonodos de cães

sadios (2,70±2,35) (Figura 15).

Escore

VEGF

Sadios Linfoma

Grupos experimentais

Figura 15 – Médias dos escores de imunomarcação para VEGF em

linfonodos de cães sadios e em linfomas caninos. FCAV –

UNESP / Jaboticabal, SP, 2007.

A expressão do VEGF caracterizou-se por marcação predominantemente

citoplasmática difusa, tanto em linfócitos de linfonodos normais como em linfócitos

neoplásicos. Nos linfonodos de cães sadios constatou-se imunomarcação para

VEGF em 90% dos casos, ocorrendo escores entre 0 e 6. Um caso (10%) foi

classificado no escore 0, três (30%) no escore 1, três (30%) no escore 2 e três

(30%) no escore seis (Figuras 16 e 17). Nos cães com linfoma, constatou-se

imunomarcação para VEGF em 100% dos casos, porém, nestes animais,

observou-se escores entre 6 e 12. Três casos (20%) foram classificados no escore

6, cinco (33,3%) no escore 8, dois (13,4%) no escore 9 e cinco (33,3%) no escore

12 (Figuras 18 e 19). Os escores individuais referentes a expressão do VEGF em

linfonodos de cães sadios e em linfomas caninos estão demonstrados na Tabela

2, do Apêndice D.

Adicionalmente, não foi evidenciada correlação significativa entre as

variáveis imunomarcação de VEGF, localização anatômica (p=0,60), estádio

(p=0,51) e sub-estádio clínico (p=0,24), grau histológico (p=0,16) e imunofenótipo

(p=0,67) de cães com linfoma (Figura 20).

Figura 16 -

Linfonodo de cão sadio. Positividade para o anticorpo primário anti-

VEGF em menos de 25% dos linfócitos, caraterizando escore 1.

EnVision, DAB, Hematoxilina de Mayer. Aumento de 400 vezes.

FCAV-UNESP/Jaboticabal, 2007.

Figura 17 -

Linfonodo de cão sadio. Moderada imunomarcação para VEGF em

mais de 50% dos linfócitos, caracterizando escore 6. EnVision, DAB,

Hematoxilina de Mayer. Aumento de 400 vezes. FCAV-

UNESP/Jaboticabal, 2007.

Figura 18 -

Linfoma canino. Moderada imunomarcação para VEGF em mais de

75% dos linfócitos neoplásicos, caracterizando escore 8. EnVision,

DAB, Hematoxilina de Mayer. Aumento de 400 vezes. FCAV-

UNESP/Jaboticabal, 2007.

Figura 19 -

Linfoma canino. Forte imunomarcação para VEGF em mais de 75%

dos linfócitos neoplásicos, caracterizando escore 12. EnVision, DAB,

Hematoxilina de Mayer. Aumento de 400 vezes. FCAV-

UNESP/Jaboticabal, 2007.

Figura 20 -

Linfoma alimentar em cão da raça Pit Bull, caracterizado por

linfadenomegalia mesentérica e presença de uma neoformação

tumoral em intestino delgado (A). Fotomicrografia de amostra intestinal

revelando infiltrado de linfócitos pequenos, com núcleo arredondado e

citoplasma escasso, caracterizando um linfoma linfoblástico de alto

grau de malignidade (HE, 400x) (B) Imunomarcação de linfócitos B

neoplásicos com o anticorpo primário anti-CD79a (IHQ, 100x) (C).

Forte imunomarcação para VEGF em mais de 75% dos linfócitos

neopláscios (IHQ, 400x) (D).

4.8 Sobrevida

O tempo de sobrevida dos cães com linfoma foi estabelecido pela contagem

dos dias do diagnóstico da neoplasia até o óbito do paciente. Dos 15 animais

avaliados, seis (40%) apresentaram sobrevida inferior a 10 dias, quatro (26,7%)

sobreviram de 11 a 60 dias, dois (13,3%) de 60 a 200 dias e três (20%)

apresentaram mais de 200 dias de sobrevida (Figura 13).

Número de

animais

< 10 11 a 60 61 a 200 > 201

Sobrevida após o diagnóstico da neoplasia (dias)

Figura 13 – Sobrevida dos cães com linfoma tratados com

poliquimioterapia sistêmica baseada no protocolo da

Universidade de Madison-Wisconsin. Nota-se uma elevada

incidência de óbitos precoces. FCAV-UNESP/Jaboticabal, SP,

2007.

Não houve correlação significativa entre a localização anatômica (p =0.35),

o estádio clínico (p =0,07), o grau histológico (p=0,80), a morfologia celular

(p=0.48), o imunofenótipo (p=0,11), a concentração sérica (p=0.67) e a expressão

(p=0.34) do VEGF com a sobrevida dos cães com linfoma. O sub-estádio clínico

(p<0.0001) foi considerado um fator prognóstico negativo quanto a sobrevida dos

cães com linfoma avaliados nessa pesquisa, independente do estádio clínico.

5. DISCUSSÃO

5.1 Dados Clínicos

Os linfomas podem afetar cães de diferentes raças (GREENLEE et al.,

1990), porém pesquisas revelam prevalência da neoplasia em animais das raças

Boxer, São Bernardo, Basset Hound, Bulldog Inglês, Beagle, Pastor Alemão e

Rottweiler (VONDERHAAR & MORRISON, 2002; DHALIWAL et al., 2003; VAIL &

YOUNG, 2007). Neste estudo, os linfomas foram diagnosticados em cães sem

raça definida e das raças Poodle, Rottweiler, Pit Bull, Boxer, Bull Terrier, Bulldog

Inglês e Basset Hound, sem prevalência significativa de nenhuma das raças. A

maior freqüência de cães sem raça definida pode ser explicada pela predomínio

desses animais na casuística do Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel”.

Existe grande discordância na literatura sobre a influência do sexo no

desenvolvimento dos linfomas. Entre os animais avaliados, houve maior

freqüência de machos (53%) em relação às fêmeas (47%), corroborando com os

resultados obtidos por MACEWEN et al.(1987), que identificaram 58% de machos

em uma população de 62 cães. JACOBS et al. (2002) afirmam não haver

predileção sexual no desenvolvimento dos linfomas caninos.

MACEWEN et al. (1987) sugeriram que a distinção entre machos e fêmeas

é um importante fator prognóstico nos linfomas caninos, visto que evidenciaram

que as fêmeas apresentam maiores índices de remissão clínica e tempo de

sobrevida, conforme também observado em seres humanos. No presente estudo

constatou-se que cinco (62%) machos apresentaram sobrevida inferior a 10 dias e

nenhum acima de 200 dias. Entre as fêmeas, constatou-se que apenas uma

apresentou sobrevida inferior a 10 dias e três (43%) sobreviveram mais de 200

dias. Segundo esses autores, as neoplasias linforreticulares desenvolvem-se na

ausência de imunorregulação apropriada, porém a influência dos hormônios

sexuais sobre o sistema imunológico é um mecanismo complexo e ainda pouco

conhecido.

De acordo com VAIL & YOUNG (2007), os linfomas prevalecem em animais

de meia idade, conforme observado nos cães avaliados. Segundo MACEWEN et

al. (1987), a idade não representa um importante fator prognóstico para os

linfomas caninos. Contudo, DHALIWAL et al. (2003) sugeriram que cães jovens

apresentam menor sobrevida que cães adultos ou idosos. Em contrapartida, no

presente estudo, 50% dos cães com menos de cinco anos de idade apresentaram

sobrevida superior a 200 dias e 67% dos cães com idade superior a cinco anos

sobreviveram menos de 30 dias.

A localização anatômica dos linfomas caninos é extremamente variável e

influencia significativamente nos sinais clínicos e no prognóstico da neoplasia

(FAN, 2003; DHALIWAL et al., 2003). Neste estudo, verificou-se que a forma

multicêntrica foi a mais freqüente (54%), manifestando-se principalmente por

linfadenomegalia regional ou generalizada, hepatomegalia, esplenomegalia e/ou

leucemia, sendo essas características também observadas por diferentes autores

(TESKE et al., 1994; VONDERHAAR & MORRISON, 2002; VAIL & YOUNG,

2007).

O linfoma cutâneo é uma neoplasia de ocorrência rara, representando de 3

a 8% de todos os linfomas caninos (TESKE, 1994; DHALIWAL et al., 2003).

Contrapondo com a literatura, no presente estudo, o linfoma cutâneo manifestou-

se em 33% dos animais. A elevada freqüência dos linfomas cutâneos na

população estudada pode ser explicada pela prévia seleção de determinadas

formas anatômicas para o presente estudo. Essa seleção foi realizada de acordo

com a possibilidade de realização da biopsia tecidual (necessária para as futuras

avaliações) sem ocorrência de risco de vida para o paciente. Dessa forma, não

foram incluídos neste estudo cães portadores de linfoma mediastinal, cardíaco e

renal. Além disso, a seleção dos animais dependeu da aceitação dos proprietários

em participar da pesquisa.

Segundo VONDERHAAR & MORRISON (2002), linfomas com envolvimento

cutâneo, renal ou do sistema nervoso central possuem prognóstico negativo

quanto a resposta terapêutica e o tempo de sobrevida. Corroborando com essas

observações, o maior tempo de sobrevida observado nos cães com linfoma

cutâneo, tratados com o protocolo quimioterápico de Madison-Wisconsin, foi de 90

dias.

O estabelecimento do estádio e sub-estádio clínico dos pacientes com

linfoma auxilia no prognóstico e no planejamento terapêutico da neoplasia (VAIL &

YOUNG, 2007). Neste trabalho, não foram diagnosticados pacientes nos estádios

iniciais da doença (1,2 ou 3), havendo prevalência de animais no estádio 5 (73%).

Esses resultados estão em concordância com GREENLEE et al. (1990), TESKE

(1994), VONDERHAAR & MORRISON (2002) e VAIL & YOUNG (2007), que

afirmam que o maior número de casos são diagnosticados nos estádios mais

avançados da doença. DHALIWAL et al. (2003) referiram menor duração do tempo

em remissão clínica em cães diagnosticados nos estádios 4 ou 5 da neoplasia.

Neste estudo, não foi observada correlação significativa entre o estádio clínico e a

sobrevida dos cães com linfoma, já que, pesquisas anteriores revelam não

existirem diferenças no tempo de sobrevida de pacientes diagnosticados nos

estádios 4 e 5 (MACEWEN et al.,1987).

VONDERHAAR & MORRISON (2002) consideraram a presença de sinais

sistêmicos no diagnóstico da neoplasia (sub-estádio “b”) um dos poucos fatores

prognósticos realmente consistentes em relação a sobrevida de cães com linfoma.

No presente estudo, o sub-estádio clínico foi o único fator prognóstico que

influenciou significativamente (p<0.0001) na sobrevida dos cães com linfoma.

Observou-se que cães diagnosticados no sub-estádio “b” apresentaram sobrevida

inferior aos cães diagnosticados no sub-estádio “a”.

A avaliação hematológica, bioquímica sérica, citologia da medula óssea,

radiografia torácica e ultra-sonografia abdominal realizadas nos pacientes

objetivou estabelecer o estadiamento adequado dos linfomas caninos. Pode-se

constatar um grande percentual de alterações hematológicas e bioquímicas em

decorrência do número elevado de pacientes no estádio mais avançado da

neoplasia. TESKE (1994) referiu que anemia e trombocitopenia são alterações

hematológicas comuns em cães com linfoma, ocorrendo em 38 e 50% dos casos,

respectivamente. Resultados semelhantes foram obtidos nesta pesquisa, onde

constatou-se anemia em 47% dos cães e trombocitopenia em 53%. A anemia em

cães com linfoma decorre não somente do comprometimento da medula óssea,

mas também da presença de doença inflamatória crônica, anorexia ou distúrbios

imunomediados. A trombocitopenia pode ser explicada pelo comprometimento da

medula óssea, seqüestro esplênico ou distúrbios imunomediados (TESKE, 1994;

VAIL & YOUNG, 2007).

No presente estudo, constatou-se leucocitose por neutrofilia em 33% dos

cães com linfoma. Estes resultados eqüivalem aos observados por TESKE (1994),

que referiu ocorrência de leucocitose granulocítica em 26 a 38% dos cães com

linfoma em decorrência de infiltração medular por células neoplásicas, necrose

tecidual ou produção excessiva de fator estimulante de colônias granulocíticas.

A elevação das atividades séricas da alanina-aminotransferase ou do teor

de creatinina no soro sangüíneo de cães com linfoma pode estar relacionada ao

comprometimento do fígado ou rim pela neoplasia, ou por hepatopatia ou

nefropatia concomitante ou secundária à síndromes paraneoplásicas (VAIL &

YOUNG, 2007). No presente estudo constatou-se aumento da atividade sérica da

alanina-aminotransferase em três cães com linfoma, nos quais se observou sinais

sugestivos de comprometimento neoplásico do fígado mediante ultra-sonografia

abdominal. Além disso, verificou-se elevação dos teores de creatinina no sangue

de outros três animais, nos quais se diagnosticou nefropatia secundária a

hipercalcemia paraneoplásica. A freqüência de hipercalcemia paraneoplásica não

foi avaliada no presente estudo, porém VONDERHAAR & MORRISON (2002)

referem incidência em 10 a 15% dos cães com linfoma.

5.2 Classificação morfológica e imunofenotípica

Recentes avanços na imunologia, genética e biologia molecular ampliaram

o conhecimento do comportamento biológico dos linfomas caninos. Esses

avanços, associados a adequados sistemas de classificação morfológica, têm

proporcionado diagnósticos precisos e regimes terapêuticos mais efetivos

(GREENLEE et al., 1990).

No presente estudo, os 15 casos de linfoma foram classificados de acordo

com o esquema proposto por “Kiel”, o qual revelou supremacia dos linfomas de

alto grau de malignidade (86,7%), conforme também observado por diferentes

autores (GREENLEE, 1990; TESKE, 1994; FOURNEL-FLEURY et al., 1997;

PONCE et al., 2004). TESKE et al. (1994) enfatizam que, de acordo com a

classificação de “Kiel”, os linfomas de alto grau de malignidade estão associados a

elevados índices de remissão clínica, porém com curto tempo de sobrevida. Nesta

pesquisa não foi observada correlação significativa entre o grau histológico da

neoplasia e o tempo de sobrevida dos pacientes, principalmente em decorrência

do pequeno número de linfomas de baixo grau (2/15). Contudo, não há como

desconsiderar uma sobrevida média de apenas 80 dias em uma população de

cães com predomínio de linfomas de alto grau de malignidade.

Entre os linfomas de alto grau, os linfomas centroblásticos (38%) e

imunoblásticos (30%) foram os mais freqüentes em nossa casuística,

corroborando com os resultados de pesquisas realizadas por PARODI et al.

(1988), GREENLEE et al. (1990) e FOURNEL-FLEURY et al. (1997). PONCE et

al. (2004) referiram que os linfomas caninos ainda são considerados como uma

enfermidade única, e não uma neoplasia heterogênea com diferentes sub-tipos

morfológicos. Na medicina, os oncologistas definem a modalidade terapêutica dos

linfomas não-Hodgkin de acordo com a morfologia celular e o imunofenótipo, e

dessa forma, prevêem respostas terapêuticas e tempos de sobrevida (PONCE et

al., 2004). No presente estudo, não foi observada correlação significativa entre a

morfologia celular e a sobrevida dos cães com linfoma.

Atualmente, os marcadores imunológicos são imprescindíveis no

diagnóstico dos linfomas caninos, seja na diferenciação entre as neoplasias de

células redondas ou na determinação do imunofenótipo da neoplasia (FOURNEL-

FLEURY et al., 1997). No presente estudo, os linfomas de células B

representaram 67% dos linfomas caninos e os linfomas de células T, 60% dos

linfomas cutâneos. VAIL & YOUNG (2007) relataram que 60 a 80% dos casos de

linfoma são de células B. Além disso, referiram que os linfomas de células T estão

associados a menores índices de remissão clínica e tempo de sobrevida. Nesta

pesquisa, não foi observada correlação significativa entre o imunofenótipo e a

sobrevida dos cães com linfoma. Entretanto, todos os cães com sobrevida

superior a 90 dias apresentavam imunofenótipo B (5 /15).

5.3 Fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF)

Há mais de 35 anos, um cirurgião da Universidade de Harvard, conhecido

como Judah Folkman, sugeriu que o crescimento neoplásico era dependente da

neoformação vascular existente no leito tumoral. A partir desse momento,

inúmeras pesquisas começaram a ser desenvolvidas em relação à angiogênese,

objetivando a detecção de biomarcadores que auxiliem na detecção precoce, no

prognóstico e no tratamento de diferentes neoplasias (LAMONTAGNE, 2005).

O fator de crescimento do endotélio vascular representa o principal fator de

crescimento associado tanto à angiogênese quanto à linfangiogênese tumoral. A

imunomarcação do VEGF, bem como o aumento de suas concentrações séricas,

são considerados fatores prognósticos negativos em diferentes neoplasias sólidas

e hematopoiéticas (FERRARA & DAVIS-SMITH, 1997; HIRAKAWA et al., 2007).

As concentrações séricas do VEGF têm sido mensuradas em diferentes

pesquisas em seres humanos com linfoma não-Hodkin, mediante ensaio

imunoenzimático (SALVEN et al, 1997; BERTOLINI et al., 1999; NIITSU et al.,

2002). Entretanto, GENTILINI et al. (2005) foram os únicos pesquisadores que

avaliaram as concentrações séricas do VEGF em cães com linfoma, antecedendo

o presente estudo.

As concentrações séricas do VEGF foram mensuradas em kit comercial de

ELISA que utiliza o VEGF-C como anticorpo, ou seja, um dos componentes da

família VEGF referido como importante indutor da linfangiogênese tumoral. Os

resultados variaram de 0 a 58,66pg/mL nos cães sadios, e de 0 a 417,75pg/mL

nos cães com linfoma. GENTILINI et al (2005) constataram variações de 0 a

23,28pg/mL em cães sadios e de 0 a 189,84pg/mL em cães com linfoma.

Contrapondo com os resultados de GENTILINI et al (2005), verificou-se que,

embora a média das concentrações séricas do VEGF em cães com linfoma

(88,51pg/mL) tenha sido superior a média dos cães sadios (17,93pg/mL), a

diferença não foi considerada estatisticamente significativa em decorrência do

pequeno número de animais em ambos os grupos. Vale ressaltar que em 7 (47%)

cães com linfoma, as concentrações séricas do VEGF foram superiores a maior

concentração sérica detectada nos cães sadios (58,66pg/mL).

Recentes estudos demonstram que o VEGF circulante é encontrado nas

células sangüíneas, incluindo plaquetas e linfócitos, o que indica que o VEGF

detectado em amostras séricas é liberado das células sangüíneas durante o

processo de coagulação (SALVEN et al., 2000). Alguns autores sugerem que

pacientes com linfopenia ou trombocitopenia podem apresentar concentrações

séricas inferiores de VEGF, porém SALVEN et al. (2000) e RESTUCCI et al.

(2005) não evidenciaram correlações entre as concentrações de VEGF com as

contagens de plaquetas e linfócitos, de forma semelhante ao presente estudo.

O VEGF circulante encontrado em pacientes com câncer pode ser

originário das células neoplásicas, de células inflamatórias infiltradas no tumor ou

de células inflamatórias circulantes (FREEMAN et al., 1995). Portanto, sugere-se

que o VEGF presente no microambiente tumoral possa se mobilizar para a

circulação, acumulando-se em linfócitos e plaquetas (SALVEN et al., 1997). Dessa

forma, podem não existir correlações entre as concentrações séricas e a

expressão do VEGF em pacientes com câncer, conforme observamos no presente

estudo.

SALVEN et al. (2000) demonstraram que as concentrações séricas de

VEGF e bFGF são fatores prognósticos que influenciam negativamente na

sobrevida de pacientes humanos com linfoma de Hodgkin. Além disso, verificaram

maiores concentrações séricas de VEGF em linfomas de alto grau, especialmente

linfomas imunoblásticos. NIITSU et al. (2002) verificaram que elevadas

concentrações séricas de VEGF e interleucina-6 antes do tratamento

quimioterápico estão associadas a baixos índices de sobrevida em seres humanos

com linfoma não-Hodkin. GENTILINI et al. (2005) constataram correlação

significativa entre as concentrações séricas de VEGF com o sub-estádio “b” dos

linfomas caninos.

Na avaliação da concentração sérica em relação a localização anatômica, o

estádio e sub-estádio clínico, o grau histológico, o imunofenótipo e a sobrevida

dos linfomas caninos, não foi evidenciada nenhuma correlação estatisticamente

significativa (P>0,05). Entretanto, observou-se que em quatro (80%) dos cinco

cães com linfoma cutâneo as concentrações séricas do VEGF-C foram

indetectáveis, sugerindo que a linfangiogênese possa não ser significativa em

linfomas cutâneos. Quanto a morfologia celular, os linfomas imunoblásticos

revelaram a maior média de concentração sérica do VEGF (140,89pg/mL).

KADOWAKI et al. (2005) enfatizaram a importância da linfangiogênese nos

linfomas, uma vez que as células linfóides neoplásicas invadem linfonodos e

demais órgãos linfóides mediante vasos linfáticos. Em estudo realizado em 39

pacientes com linfoma, os resultados demonstrados por esses autores revelaram

diferença significativa da microdensidade linfática entre linfomas e linfonodos

normais. Além disso, evidenciaram expressão do VEGF-A em todas as amostras e

do VEGF-C em 36 espécimes, ocorrendo correlação positiva entre a

microdensidade linfática e a expressão do VEGF-A e do VEGF-C. Curiosamente,

não foram observadas correlações entre a microdensidade vascular e a expressão

das duas isoformas do VEGF.

A imunomarcação de VEGF tem sido avaliada em um grande número de

pesquisas relacionadas aos linfomas de Hodgkin’s ou não-Hodgkin humanos

(ORPANA & SALVEN, 2002; KORKOLOPOULOU et al., 2005), entretanto, além

desta pesquisa, apenas WOLFESBERGER et al. (2007), investigaram a

expressão do VEGF em linfomas caninos.

No presente estudo, 12 (80%) das 15 amostras de linfomas caninos

revelaram escores elevados (8, 9 ou 12) de imunomarcação para VEGF.

WOLFESBERGER et al. (2007) constataram 60% de amostras com alto nível de

expressão para VEGF, utilizando apenas o percentual de imunomarcação como

parâmetro de avaliação. HAZAR et al. (2003) referiram que a expressão do VEGF

foi detectada em 33,8% dos pacientes humanos com linfoma não-Hodgkin, sem

mencionar as características da imunomarcação.

À avaliação dos linfonodos normais, constatou-se ausência de

imunomarcação para VEGF em uma (10%) das amostras e presença de 6 (60%)

amostras revelando baixos escores de imunomarcação (1 e 2). Em três (30%)

espécimes evidenciou-se escore de imunomarcação moderado (6).

WOLFESBERGER et al. (2007) também observaram expressão do VEGF em

linfonodos normais, sugerindo que a expressão do VEGF possa ser necessária

para a manutenção da microcirculação fisiológica dos linfonodos.

Na técnica de imunoistoquímica empregada no presente estudo utilizou-se

o anticorpo monoclonal anti-VEGF-A, importante indutor da angiogênese e da

linfangiogênese tumoral. Pelos resultados fica evidente que o escore de

imunomarcação para VEGF-A foi significativamente maior (p<0.0001) nos linfomas

caninos em comparação aos linfonodos sadios, confirmando a importância do

VEGF no comportamento biológico dos linfomas caninos. Uma vez que, não foi

avaliada a mensuração da microdensidade vascular e linfática, não foi possível

definir se a forte imunomarcação do VEGF-A detectada nos linfomas caninos

garante a neovascularização sangüínea e/ou linfática.

Nos resultados obtidos neste estudo, evidencia-se que o anticorpo

monoclonal anti-VEGF-A é eficaz na detecção do fator de crescimento do

endotélio vascular em linfonodos sadios e linfomas caninos, mediante técnica

imunoistoquímica. Fato também constatado por WOLFESBERGER et al. (2007).

Esses resultados demonstram que o anticorpo monoclonal anti-VEGF-A pode ser

utilizado em tecido canino.

HAZAR et al. (2003) evidenciaram índices de remissão tumoral

significativamente maiores em pacientes com expressão negativa para VEGF.

Entretanto não constataram correlações entre a expressão do VEGF,

microdensidade vascular, sexo e idade do paciente, estadiamento clínico, grau

histológico da neoplasia e sobrevida dos pacientes.

Na avaliação da expressão do VEGF em relação a localização anatômica, o

estádio e sub-estádio clínico, o grau histológico, o imunofenótipo e a sobrevida

dos linfomas caninos, não foi evidenciada nenhuma correlação estatisticamente

significativa (P<0,05), de forma semelhante aos resultados obtidos por HAZAR et

al. (2003). Quanto a morfologia celular, os linfomas imunoblásticos e

centroblásticos foram os que revelaram maiores escores de imunomarcação para

VEGF.

É importante ressaltar que este trabalho não corresponde a um estudo

retrospectivo, o que promove uma dependência da casuística da enfermidade na

rotina hospitalar e da aceitação dos proprietários em participar da pesquisa.

Todavia, é importante salientar que entre os 15 animais avaliados,

observou-se prevalência significativa de animais diagnosticados no estádio 5,

portadores de linfomas de alto grau de malignidade e com elevada expressão do

VEGF, o que justifica a curta sobrevida dos pacientes, mesmo utilizando o

protocolo de Madison-Wisconsin, um dos protocolos quimioterápicos mais

recomendados pela literatura. Além disso, a presença de concentrações séricas

elevadas e imunomarcação significativa do VEGF nos linfomas caninos, sugere a

necessidade da utilização de terapias anti-angiogênicas associadas aos

protocolos quimioterápicos, visando melhorar a resposta terapêutica e o tempo de

sobrevida dos animais.

6. CONCLUSÕES

Nas condições em que foi realizado o presente estudo, foi possível concluir que:

- Cães com linfoma apresentam média das concentrações séricas de VEGF

superior a cães sadios.

- A média do escore de imunomarcação para VEGF é significativamente maior

nos linfomas caninos em comparação a linfonodos normais

- Não foi constatada correlação significativa entre a concentração sérica e a

expressão do VEGF com a localização anatômica, estádio e sub-estádio

clínico, grau histológico, imunofenótipo e a sobrevida dos cães com linfoma.

- O VEGF é um importante biomarcador dos linfomas caninos e deve ser

reavaliado em estudos posteriores com maior número de animais.

- O sub-estádio “b” apresenta correlações significativas com um menor tempo de

sobrevida em cães com linfoma.

7. REFERÊNCIAS (ABNT 6023, Ago/2002)

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APÊNDICES

A. TÉCNICA DE ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA):

As amostras de soro sangüíneo congeladas a –20ºC, durante quatro a 10

meses, foram utilizadas para a mensuração da concentração sérica do fator de

crescimento do endotélio vascular utilizando o método de ensaio imunoenzimático

em sanduíche, do kit comercial Quantikine – Human VEGF-C (R&D Systems).

O kit utilizado consta dos seguintes itens:

- Microplaca composta por 96 poços revestidos com o anticorpo monoclonal

anti-VEGF-C;

- Conjugado: 21mL de anticorpo policlonal anti-VEGF-C conjugado a moléculas

de peroxidase e agentes preservativos;

- Padrão: 70ng de VEGF-C recombinante humano em uma solução tampão

liofilizada com preservativos;

- Diluente RD1W: 11mL de solução tampão com base protéica e preservativos;

- Diluente calibrador concentrado RD6U: 21mL de soro animal com

preservativos;

- Concentrado tampão de lavagem: 21mL de solução concentrada de

surfactante tamponado com preservativos;

- Reagente colorido A: 12,5mL de peróxido de hidrogênio;

- Reagente colorido B: 12,5mL de cromógeno (tetrametilbenzidina);

- “Stop solution”: 6 mL de ácido sulfúrico (2N).

A técnica de ELISA em sanduíche utilizada (conforme as recomendações do

fabricante) está descrita na seqüência:

1. Preparar os reagentes, amostras e solução padrão conforme as

recomendações do fabricante:

- Deixar todos os reagentes em temperatura ambiente antes da sua utilização;

- Solução tampão: diluir 20mL da solução tampão concentrada em 480mL de

água destilada;

- Solução substrato: Misturar os reagentes coloridos A e B 15 minutos antes da

sua utilização. Proteger a solução final da luz;

- Diluente calibrador RD6U: diluir 10mL do diluente calibrador em 10mL de água

destilada;

- Diluir 40μL de cada amostra de soro descongelado com 160μL do diluente

calibrador RD6U previamente diluído;

- Amostras padrão: reconstituir o padrão com 1mL de água destilada, de forma a

produzir uma solução de estoque com 70,000pg/mL. Pipetar 900μL do diluente

calibrador juntamente com 100μL da solução de estoque, de forma a obter uma

solução com 7000pg/mL. Pipetar 500μL desta solução no próximo frasco e

realizar o mesmo procedimento nos frascos subsequentes de forma a produzir

soluções de 3500pg/mL, 1750pg/mL, 875pg/mL, 438pg/mL, 219pg/mL e

109pg/mL. O padrão de 7000pg/mL representa a concentração máxima e o

diluente calibrador a concentração mínima (0pg/mL).

2. Adicionar 10μL do diluente RD1W em cada poço da microplaca;

3. Adicionar 50μL do padrão e das amostras a cada poço e incubar em

temperatura ambiente, durante 2 horas, em um “shaker” horizontal para

microplacas (50rpm);

4. Aspirar o conteúdo de cada poço e lavar quatro vezes com a solução tampão.

Remover o excesso da solução tampão invertendo a microplaca contra um

papel toalha;

5. Adicionar 200μL do conjugado em cada poço e incubar em temperatura

ambiente, durante duas horas, em um “shaker” horizontal para microplacas

(50rpm);

6. Aspirar o conteúdo de cada poço e lavar quatro vezes com a solução tampão.

Remover o excesso da solução tampão invertendo a microplaca contra um

papel toalha;

7. Adicionar 200μL da solução substrato em cada poço e incubar em temperatura

ambiente, durante 30 minutos, sob proteção da luz;

8. Adicionar 50μL da “stop solution” em cada poço. A cor da solução presente em

cada poço deve mudar de azul para amarelo. Após 30 minutos, determinar a

densidade óptica em um leitor de microplacas com capacidade de mensurar

absorbância de 450nm.

9. A concentração sérica do VEGF deve ser determinada mediante análise de

regressão linear.

B. TÉCNICA DE IMUNOISTOQUÍMICA:

Cortes histológicos com três micrômetros de espessura foram depositados

em lâminas de vidro previamente preparadas com cola líquida a base de

organosilano (A3648 – SIGMA), objetivando reduzir os riscos de perda de material

durante a técnica de imunoistoquímica. As lâminas permaneceram em estufa a

60°C durante 24 horas e posteriormente foram submetidas aos processos

descritos na seqüência:

1- Desparafinização:

- Passagem em xilol I, durante 30 minutos, em temperatura ambiente;

- Passagem em xilol II, durante 20 minutos, em temperatura ambiente.

2- Hidratação:

- Passagem em álcool absoluto I / II / III, 3 minutos em cada etapa;

- Álcool a 95%, durante 3 minutos;

- Álcool a 85%, durante 3 minutos;

- Lavar em água destilada (10 vezes).

3- Recuperação antigênica:

- Passar as lâminas em água destilada levemente aquecida;

- Imergir as lâminas em solução de EDTA (pH 8,0), em banho-maria (95ºC),

durante 30 minutos (anticorpos primários CD3 e CD79a);

- Imergir as lâminas em solução de EDTA (pH 9,0), em banho-maria (95ºC),

durante 30 minutos (anticorpo primário VEGF-A);

- Deixar esfriar em temperatura ambiente durante 20 minutos;

- Lavar em água destilada (10 vezes).

4- Bloqueio da peroxidase endógena:

- Imergir as lâminas em água oxigenada 10 volumes, durante 20 minutos;

- Lavar em água destilada (10 vezes)

5- Lavar duas vezes em solução tampão de TRIS, durante 5 minutos.

6- Incubação com o Anticorpo primário:

- Diluir o anticorpo primário em solução diluidora de anticorpo (Dako) (Tabela 5

– página 17);

- Cobrir os cortes com o anticorpo

- Deixar as lâminas em câmara úmida durante 18hs a 4°C (geladeira);

- Lavar com solução tampão de TRIS;

- Remover o excesso de TRIS.

7- Incubação com anticorpo secundário conjugado a um polímero e moléculas de

peroxidase do kit EnVision Dual-link (Dako – K4063):

- Cobrir os cortes com o anticorpo secundário;

- Deixar as lâminas em temperatura ambiente, durante 30 minutos

(recomendação do fabricante);

- Lavar com solução tampão de TRIS. Tempo: 5 minutos.

8- Revelação com o substrato cromogênico diaminobenzidina (DAB, pronto para

uso – Dako - código K34466)

- Cobrir os cortes com o DAB;

- Tempo de DAB: 5 minutos, ao abrigo da luz

- Passar em solução tampão de TRIS;

- Lavar em água destilada (10 vezes).

9- Contra-coloração com Hematoxilina de Mayer:

- Imergir as lâminas no corante;

- Tempo: 3 minutos;

- Lavar em água corrente durante 10 minutos;

- Lavar em água destilada (uma vez).

10- Desidratação dos cortes e montagem das lâminas:

- Passagem em álcool 85° e 95°;

- Passagem em álcool absoluto I / II / III – 3 minutos em cada etapa;

- Passagem em xilol I e II – 3 minutos em cada etapa;

- Montar as lâminas com resina sintética e lamínulas.

C. SOLUÇÕES UTILIZADAS NA TÉCNICA DE IMUNOISTOQUÍMICA:

EDTA (Ácido etilenodiamino tetra-acético):

- 1000mL de água destilada

- 0,3722g de EDTA

- Acertar o pH em 8,0 ou 9,0 (de acordo com o anticorpo primário)

TRIS solução tampão:

- 1000mL de água destilada

- 6,0g Trizma base (Sigma – código T1503).

- 8,5g cloreto de sódio

- Acertar o pH em 7,4

D. DADOS INDIVIDUAIS DE CÃES SADIOS E DE CÃES COM LINFOMA

Tabela 1D. Dados individuais referentes a epidemiologia, estadiamento, grau histológico, morfologia celular,

imunofenótipo e a sobrevida de cães com linfoma (FCAV – UNESP / Jaboticabal, SP, 2007).

Animais

Sexo

Idade

(anos)

Localização

Anatômica

Estádio

clínico

Sub-estádio

Grau

Histológico

Morfologia

celular

Imunofenótipo

Sobrevida

(dias)

1 Macho 7 Multicêntrico 5 b Baixo Misto B 9

2 Macho 10 Extra-nodal 5 b Alto Imunoblástico B 0

3 Macho 10 Multicêntrico 5 b Alto Imunoblástico T 1

4 Fêmea 3 Multicêntrico 5 a Alto Imunoblástico B 240

5 Macho 4 Multicêntrico 5 b Alto Anaplásico T 4

6 Macho 9 Cutâneo 5 b Alto Centroblástico B 90

7 Fêmea 4 Alimentar 5 b Alto Linfoblástico B 0

8 Macho 7 Cutâneo 5 a Alto Anaplásico T 30

9 Fêmea 4 Multicêntrico 4 a Baixo Centrocítico B 330

10 Fêmea 4 Multicêntrico 4 b Alto Centroblástico B 30

11 Fêmea 5 Multicêntrico 4 a Alto Centroblástico B 330

12 Fêmea 15 Multicêntrico 4 b Alto Imunoblástico B 30

13 Macho 6 Cutâneo 5 b Alto Linfoblástico T 1

14 Fêmea 7 Cutâneo 5 a Alto Centroblástico T 30

15 Macho 6 Cutâneo 5 a Alto Centroblástico B 90

Tabela 2D. Valores individuais referentes às concentrações séricas (pg/mL) e a expressão do VEGF em cães sadios

e cães com linfoma (FCAV – UNESP / Jaboticabal, SP, 2007).

Concentração sérica de VEGF

(pg/mL)

Expressão do VEGF

Animais

Sadios

n=10

Linfoma

n=15

Sadios

n=10

Linfoma

n=15

1 30,16 0,00 6 6

2 58,66 161,26 1 8

3 7,36 0,00 2 8

4 0,00 149,86 1 12

5 0,00 13,06 6 8

6 0,00 7,36 1 12

7 52,96 417,75 2 12

8 0,00 0,00 2 9

9 30,16 35,86 6 8

10 0,00 58,66 0 8

11 172,66 6

12 252,46 12

13 58,66 6

14 0,00 12

15 0,00 12

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