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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
COMPROMETIMENTO FISIOLÓGICO E SEMINAL DE
CÃES MACHOS INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE
POR Leptospira interrogans SOROVAR CANICOLA
Halim Atique Netto
Médico Veterinário
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL
Novembro de 2008
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A872c
Atique Netto, Halim
Comprometimento fisiológico e seminal de cães machos
infectados experimentalmente por leptospira interrogans sorovar
Canicola / Halim Atique Netto. – – Jaboticabal, 2008
xxi, 85 f. ; 28 cm
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias, 2008
Orientador: Raul José Silva Gírio
Banca examinadora: Vicente Borelli, Silvio Arruda Vasconcellos,
Luís Antônio Mathias, Samir Issa Samara
Bibliografia
1. Leptospira. 2. Cães. 3. Reprodução. 4 Sêmen. 5 Urina. 6 PCR.
I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 619:616.986.7:636.7
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da
Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de
Jaboticabal.
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
COMPROMETIMENTO FISIOLÓGICO E SEMINAL DE
CÃES MACHOS INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE
POR Leptospira interrogans SOROVAR CANICOLA
Orientado: Halim Atique Netto
Orientador: Prof. Dr. Raul Jose Silva Girio
Tese apresentada à Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de
Jaboticabal, como parte das exigências para a
obtenção de Título de Doutor em Medicina
Veterinária (Medicina Veterinária Preventiva).
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL
Novembro de 2008
v
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
Halim Atique Netto – nascido em 28 de janeiro de 1978, em São José do
Rio Preto, São Paulo, filho de Andraci Lucas Veltroni Atique e Halim Atique
Júnior; é graduado na primeira turma do Curso de Medicina Veterinária da
UNIRP - Centro Universitario de Rio Preto em dezembro de 2000 e está
inscrito no CRMV-SP - Conselho Regional de Medicina Veterinária do Estado
de São Paulo desde o mesmo ano. Ingressou no curso de Mestrado em
medicina veterinária, área de concentração reprodução animal na FCAV -
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da UNESP - Universidade
Estadual Paulista, campus de Jaboticabal em março de 2001, e o concluiu
em maio de 2003. Iniciou a docência em agosto de 2001, nas disciplinas de
reprodução animal e obstetrícia veterinária no Curso de Medicina Veterinária
da UNIRP, até os dias atuais. É veterinário credenciado para os exames de
brucelose e tuberculose e responsável técnico do laboratório de anemia
infecciosa eqüina pelo MAPA – Ministério da Agricultura Pecuária e
Abastecimento, no Hospital Veterinário da UNIRP desde 2004, onde também
é diretor a partir do mesmo ano até então. Matriculo-se no curso de
Doutorado em medicina veterinária, área de concentração medicina
veterinária preventiva na FCAV / UNESP – Jaboticabal em março de 2005
até sua conclusão em novembro de 2008.
vi
“O Senhor Deus te porá por cabeça, e não por cauda;
e só estarás em cima, e não debaixo, se seguires os
Seus mandamentos”.
Deuteronômio, 28:13
vii
Dedico
DedicoDedico
Dedico
À minha esposa, Tábata, e à minha filhinha Najla,
que me ajudaram e entenderam nos momentos de trabalho
e de estudo, nas quais eu renovava sempre minhas forças.
O céu e o sol de todos os meus dias!
Amo Vocês demais!!!
viii
Ofereço
OfereçoOfereço
Ofereço
A todos os animais que contribuíram para que este
trabalho se realizasse, possibilitando o avanço da ciência,
em benefício deles próprio e de nós, seus irmãos maiores.
ix
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Doutor Raul José Silva Girio, que com brilhantismo me orientou
neste trabalho como aluno, como pessoa, sendo um mentor, mostrando-me todas
as faces de um verdadeiro educador. Muito obrigado por tudo!
Ao Professor Doutor Vicente Borelli, que mais uma vez esteve presente nesta
etapa da minha formação, sempre como mestre e amigo.
À Doutora Fernanda Senter Magajevski, uma super-amiga e auxiliadora, que
sempre pôde me estender a mão, principalmente para o que eu não dominava,
com paciência e dedicação de uma mestra pra mim.
À Professora Tábata Salum Calille Atique, que comandou o Hospital Veterinário da
UNIRP em minhas ausências, sempre com competência e doçura, me
surpreendendo sempre!
Ao Professor Doutor Alan Perez Ferras de Melo, pelo companheirismo e pela
amizade, que me permitiram terminar outrora a monografia, posteriormente a
dissertação e esta tese, sendo meu professor de graduação, meu coordenador e
meu irmão. Muito obrigado!
Ao Professor Rodolfo Bilachi Prado, que com muita dedicação e empenho esteve
á frente do laboratório FertVitro - UNIRP, atento a tudo e a todos, se desdobrando
comercialmente e tecnicamente, exemplo que o dicípulo supera o mestre. Valeu!
Ao Professor Doutor Leonardo José Richtzenhain, do laboratório de biologia
molecular e sorologia aplicada da FMVZ/USP, pelo apoio e auxilio na execução
dos exames de DNA de nosso trabalho.
Ao Professor Doutor Sílvio Arruda Vasconcellos, do departamento de Medicina
Veterinária Preventiva e Saúde Animal da FMVZ-USP pelo fornecimento das
cepas de leptospiras utilizadas nos exames de sorologia do laboratório de
leptospirose e brucelose da FCAV-UNESP, os quais compuseram nosso trabalho.
x
Aos Professores Rodrigo Storti, Camila Ruiz, Tatiana Cruvinel; e às técnicas
Cleide Momesso e Edna Marthins, do laboratório de análises clínicas e infecciosas
do Hospital Veterinário da UNIRP, por me auxiliarem na execução dos exames
clínicos do experimento, e me mostrarem que sempre podemos contar com gente
competente e dedicada.
À Professora Carla Dan De Nardo, ao enfermeiro Daniel De Nardo e ao biólogo
Fabiano, do Biotério do Hospital Veterinário da UNIRP, que me ajudaram a
promover a colheita das amostras dos cães do experimento, sempre com alegria,
descontração e destreza, por mais que a situação fosse triste.
Aos Professores Doutor Daniel Bártoli de Sousa e Maurício Barros Fernandes,
que, com companheirismo e amizade, foram pacientes e complacentes comigo,
assumindo as aulas de reprodução e obstetrícia em várias ocasiões em que eu
estava no curso de doutorado. Muito obrigado!
A todo o corpo funcional da biblioteca da UNESP de Jaboticabal, que sempre
esteve pronto a solucionar as buscas por referência e conhecimento desse
período, em especial a bibliotecária Tieko, que na reta final do trabalho me
mostrou que formatação e normas técnicas são ciência!
À tia Fauzia Atique e aos primos Márcia, Mirian, Marta, Fernando, Evandro,
Eduardo e Samuel, pela recepção calorosa e sincera, e por dividirem comigo não
só uma casa, mas uma família, durante o mestrado e agora o doutorado,
relevando meus abusos e contratempos. Muito Obrigado!
Aos meus pais, Halim Atique Júnior e Andraci Lucas Veltro Atique, por acreditarem
mais uma vez em mim e proporcionarem mais esta qualificação profissional, e
meus irmão Henry, Andraci Maria e Haline, que sempre vibraram com as minhas
conquistas, e agora estão “babando” na sobrinha Najla!
À minha avó Yolanda Lucas Veltroni, que, com ternura e ”açúcar” próprios de vó,
sempre se alegrando comigo, demonstrou um amor, que eu só vejo maior com a
bisneta; e aos saudosos Avós Olinto Veltro, Halim e Yvette Atique, e às tias Alice e
Violete, que, mesmo por pouco tempo, marcaram minha vida. Sinto Saudades.
Aos tios Anete, Ronei, Ariádine, Alexandre, Adi, Ruty, Maria Lúcia, Edmo, Neide e
Wilma; por serem a estrutura e a base que todo mundo precisa ter, FAMÍLIA!
xi
Aos amigos de pós-graduação Lucas e Michele, que dividiram comigo os afazeres
do curso e do projeto, possibilitando a realização deste trabalho a várias mãos,
não havendo possibilidade de estarmos separados. Muito obrigado!
Aos professores, técnicos, funcionários e amigos do departamento de Medicina
Veterinária Preventiva da FCAV-UNESP, por serem pessoas boníssimas e
agradáveis, além de competentes e sinceras, em especial, Prof. Samir e Prof.
Mathias, que também contribuíram para esta tese; Prof. Adjair, Prof. Nader, Profa.
Ângela, Profa. Adolorata, Profa. Glorinha, Prof. Amaral; e Assis, Diba, Marisa,
Andréa, José Tebaldi, Hermes e Lila. Obrigado por tudo!
Aos professores, funcionários, técnicos e amigos do Hospital Veterinário da
UNIRP, por se empenharem em levar nosso hospital sempre avante e com muita
qualidade, mesmo que de vez em quando sem timoneiro, muito obrigado!
Aos meus queridos alunos de reprodução animal e obstetrícia veterinária, que,
sempre compreenderam as minhas falhas e contratempos, e lidaram com a minha
pouca atenção neste período de busca do conhecimento, sabendo que era por
uma causa nobre, a própria docência. Minhas sinceras desculpas e meus
agradecimentos.
Ao Professor Doutor Antonio Carlos Alessi, e as técnicas Maria Inês e Francisca,
do laboratório de histologia do departamento de patologia veterinária da FCAV-
UNESP, pelo auxilio na confecção das lâminas de levaditi e histologia do nosso
estudo.
Ao Professor Doutor Áureo Evangelista Santana e seu técnico Eugênio, do
laboratório de análises clínicas do departamento de clínica e cirurgia veterinária da
FCAV-UNESP, pela ajuda na confecção das fotos das lâminas de Levaditi e
Histologia de nosso trabalho.
xii
O agradecimento maior a DEUS, por nunca me deixar e
sempre existir na minha vida, no meu coração e em tudo
que eu faço, permitindo que eu corra a carreira e me
ajudando a guardar a fé. Graças a ELE, por tudo que
sou! Louvado seja o nome do SENHOR!!!
xiii
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS......................................................................................... xv
LISTA DE FIGURAS......................................................................................... xix
RESUMO........................................................................................................... xx
SUMMARY........................................................................................................ xxi
1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA.......................................... 01
2. JUSTIFICATIVAS.......................................................................................... 11
3. OBJETIVOS.................................................................................................. 11
4. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................. 12
4.1 - Instalação e manejo dos cães................................................................ 12
4.2. Seleção dos animais............................................................................... 12
4.3 – Inoculação............................................................................................. 13
4.4. Colheita de amostras.............................................................................. 14
4.4.1. Sangue.............................................................................................. 14
4.4.2. Sêmen............................................................................................... 14
4.4.3. Urina.................................................................................................. 14
4.5 – Eutanásia dos animais.......................................................................... 14
4.6– Pesquisa de anticorpos.......................................................................... 15
4.6.1– Preparo dos antígenos de leptospira............................................... 15
4.6.2 – Técnica de soroaglutinação microscópica ..................................... 15
4.7 – Reação em cadeia pela polimerase (PCR)......................................... 17
4.7.1 – Extração de DNA............................................................................. 17
4.7.2 – Oligonucleotídeos iniciadores (primers).......................................... 19
4.7.3 - Amplificação do DNA bacteriano...................................................... 20
4.7.4 – Ciclo de amplificação....................................................................... 20
4.7.5 – Análise do produto amplificado....................................................... 21
4.7.6 – Amostra de sêmen canino para contaminação experimental.......... 21
4.7.7 – Determinação do limiar de detecção da técnica de PCR na
amostra de sêmen canino experimentalmente contaminado com Leptospira
interrogans sorovar Canicola.............................................................................
22
4.8 – Análises dos ejaculados........................................................................ 22
4.8.1. Análises macroscópicas.................................................................... 22
4.8.1.1. Volume....................................................................................... 22
4.8.1.2. Coloração................................................................................... 23
4.8.2. Análises microscópicas..................................................................... 23
4.8.2.1. Motilidade espermática............................................................... 23
4.8.2.2. Vigor........................................................................................... 23
4.8.2.3. Concentração espermática........................................................ 23
4.8.2.4. Turbilhonamento......................................................................... 24
4.8.2.5. Análise das morfopatologias espermáticas............................... 24
4.9 – Técnica de Levaditi................................................................................
25
4.10 – Histopatológico.................................................................................... 26
4.11 – Hemograma, análise bioquímica do sangue e análise físico-química
da urina.............................................................................................................
26
xiv
4.12 – Análise estatística................................................................................ 26
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................... 27
7. CONCLUSÕES............................................................................................. 60
7. REFERÊNCIAS............................................ ................................................ 62
ANEXO 1........................................................................................................... 76
ANEXO 2...........................................................................................................
78
xv
LISTA DE TABELAS
1. Títulos de anticorpos aglutinantes antileptospira sorovar Canicola de cinco
cães infectados experimentalmente com a cepa LO4 de Leptospira
interrogans sorovar Canicola durante quatro avaliações num período de
sete dias, representando o Grupo G1 do presente experimento.
Jaboticabal, São Paulo,
2007......................................................................................................
28
2. Títulos de anticorpos aglutinantes antileptospira sorovar Canicola de cinco
cães infectados experimentalmente com a cepa LO4 de Leptospira
interrogans sorovar Canicola durante seis avaliações num período de 15
dias, representando o Grupo G2 do presente experimento. Jaboticabal,
São
Paulo,2007.....................................................................................................
29
3. Títulos de anticorpos aglutinantes antileptospira sorovar Canicola de cinco
cães infectados experimentalmente com a cepa LO4 de Leptospira
interrogans sorovar Canicola durante nove avaliações num período de 30
dias, representando o Grupo G3 do presente experimento. Jaboticabal, São
Paulo, 2007......................................................................................................
30
4. Títulos de anticorpos aglutinantes antileptospira sorovar Canicola de cinco
cães infectados experimentalmente com a cepa LO4 de Leptospira
interrogans sorovar Canicola durante doze avaliações num período de 45
dias, representando o Grupo G4 do presente experimento. Jaboticabal, São
Paulo, 2007......................................................................................................
30
5. Média aritmética e erro padrão (EP) do volume (mL), do turbilhonamento,
da motilidade (%), do vigor (0 a 5) e da concentração (x10
6
espermatozóides/mL) espermáticas de cinco cães infectados (CI) e três
cães controle (CC) durante quatro avaliações num período de 7 dias,
representando o Grupo G1 do presente experimento. Jaboticabal, São
Paulo, 2007......................................................................................................
32
6. Média aritmética e erro padrão (EP) do volume
(mL), do turbilhonamento, da
motilidade (%), do vigor (0 a 5) e da concentração (x10
6
espermatozóides/mL) espermáticas de cinco cães infectados (CI) e três
cães controle (CC) durante seis avaliações num período de 15 dias,
representando o Grupo G2 do pres
ente experimento. Jaboticabal, São
Paulo, 2007.....................................................................................................
33
xvi
7. Média aritmética e erro padrão (EP) do volume (mL), do turbilhonamento,
da motilidade (%), do vigor (0 a 5) e da concentração (x10
6
espermatozóides/mL) espermáticas de cinco cães infectados (CI) e três
cães controle (CC) durante nove avaliações num período de 30 dias,
representando o Grupo G3 do presente experimento. Jaboticabal, São
Paulo, 2007......................................................................................................
34
8. Média aritmética e erro padrão (EP) do volume (mL), do turbilhonamento,
da motilidade (%), do vigor (0 a 5) e da concentração (x10
6
espermatozóides/mL) espermáticas de cinco cães infectados (CI) e três
cães controle (CC) durante doze avaliações num período de 45 dias,
representando o Grupo G4 do presente experimento. Jaboticabal, São
Paulo, 2007...................................................................................................
35
9. Média aritmética, expressa em porcentagem, dos defeitos maiores,
menores, totais e de cabeça isolada de cinco cães infectados (CI) e três
cães controle (CC) durante quatro avaliações num período de sete dias,
representando o grupo experimental um (G1). Jaboticabal, São Paulo,
2007...............................................................................................................
37
10. Média aritmética dos defeitos maiores, menores, totais e de cabeça
isolada de cinco cães infectados (CI) e três cães controle (CC) durante
seis avaliações num período de 15 dias, representando o grupo
experimental dois (G2). Jaboticabal, São Paulo,
2007..............................................................................................................
38
11. Média aritmética dos defeitos maiores, menores, totais e de cabeça
isolada de cinco cães infectados (CI) e três cães controle (CC) durante
nove avaliações num período de 30 dias, representando o grupo
experimental três (G3). Jaboticabal, São Paulo,
2007...............................................................................................................
39
12. Média aritmética dos defeitos maiores, menores, totais e de cabeça
isolada de cinco cães infectados (CI) e três cães controle (CC) durante
doze avaliações num período de 45 dias, representando o grupo
experimental quatro (G4). Jaboticabal, São Paulo, 2007..............................
40
xvii
13. Resultado da PCR para amostras de sêmen e urina de cinco cães
infectados experimentalmente com a cepa LO4 de Leptospira interrogans
sorovar Canicola durante quatro avaliações num período de sete dias,
representando o Grupo G1 do presente experimento. Jaboticabal, São
Paulo, 2007....................................................................................................
42
14. Resultado da PCR para amostras de sêmen e urina de cinco cães
infectados experimentalmente com a cepa LO4 de Leptospira interrogans
sorovar Canicola durante seis avaliações num período de 15 dias,
representando o Grupo G2 do presente experimento. Jaboticabal, São
Paulo, 2007....................................................................................................
42
15. Resultado da PCR para amostras de sêmen e urina de cinco cães
infectados experimentalmente com a cepa LO4 de Leptospira interrogans
sorovar Canicola durante nove avaliações num período de 30 dias,
representando o Grupo G3 do presente experimento. Jaboticabal, São
Paulo, 2007...................................................................................................
44
16. Resultado da PCR para amostras de sêmen e urina de cinco cães
infectados experimentalmente com a cepa LO4 de Leptospira interrogans
sorovar Canicola durante doze avaliações num período de 45 dias,
representando o Grupo G4 do presente experimento. Jaboticabal, São
Paulo, 2007....................................................................................................
45
17. Média aritmética do número de hemácias, leucócitos, neutrófilos
segmentados, linfócitos, plaquetas e da concentração de uréia, fosfatase
alcalina, albumina e cálcio de cinco cães infectados (CI) e três cães
controle (CC) durante quatro avaliações num período de sete dias,
representando o grupo experimental um (G1). Jaboticabal, São Paulo,
2007..............................................................................................................
52
18. Média aritmética do número de hemácias, leucócitos, neutrófilos
segmentados, linfócitos, plaquetas e da concentração de uréia, fosfatase
alcalina, albumina e cálcio de cinco cães infectados (CI) e três cães
controle (CC) durante seis avaliações num período de 15 dias,
representando o grupo experimental dois (G2). Jaboticabal, São Paulo,
2007...............................................................................................................
53
xviii
19. Média aritmética do número de hemácias, leucócitos, neutrófilos
segmentados, linfócitos, plaquetas e da concentração de uréia, fosfatase
alcalina, albumina e cálcio de cinco cães infectados (CI) e três cães
controle (CC) durante nove avaliações num período de 30 dias,
representando o grupo experimental três (G3). Jaboticabal, São Paulo,
2007.........................................................................................................
55
20. Média aritmética do número de hemácias, leucócitos, neutrófilos
segmentados, linfócitos, plaquetas e da concentração de uréia, fosfatase
alcalina, albumina e cálcio de cinco cães infectados (CI) e três cães
controle (CC) durante doze avaliações num período de 45 dias,
representando o grupo experimental quatro (G4). Jaboticabal, São Paulo,
2007...............................................................................................................
56
21. Média aritmética da temperatura, freqüência cardíaca, freqüência
respiratória e massa (Kg) de cinco cães infectados (CI) e três cães
controle (CC) durante quatro avaliações num período de sete dias,
representando o grupo experimental um (G1). Jaboticabal, São Paulo,
2007...............................................................................................................
57
22. Média aritmética da temperatura, freqüência cardíaca, freqüência
respiratória e massa (Kg) de cinco cães infectados (CI) e três cães
controle (CC) durante seis avaliações num período de 15 dias,
representando o grupo experimental dois (G2). Jaboticabal, São Paulo,
2007...............................................................................................................
58
23. Média aritmética da temperatura, freqüência cardíaca, freqüência
respiratória e massa (Kg) de cinco cães infectados (CI) e três cães
controle (CC) durante nove avaliações num período de 30 dias,
representando o grupo experimental três (G3). Jaboticabal, São Paulo,
2007...............................................................................................................
58
24. Média aritmética da temperatura, freqüência cardíaca, freqüência
respiratória e massa (Kg) de cinco cães infectados (CI) e três cães
controle (CC) durante doze avaliações num período de 45 dias,
representando o grupo experimental quatro (G4). Jaboticabal, São Paulo,
2007...............................................................................................................
59
xix
LISTA DE FIGURAS
1. Resultado da PCR para amostra de sêmen do cão G1A2 (Grupo um animal
infectado dois). L) Padrão de peso molecular em escala ascendente
de 100 pb; 1) dia zero; 2) dia três; 3) dia cinco; 4) dia sete; N)
controle negativo do processo de extração do DNA; A) controle
negativo da PCR; CP (controle positivo). Jaboticabal, São Paulo,
2007.....................................................................................................
47
2. Resultado da PCR para amostra de sêmen do cão G4A2 (Grupo quatro
animal infectado dois). L) Padrão de peso molecular em escala
ascendente de 100 pb; 1) dia zero; 2) dia três; 3) dia cinco; 4) dia
sete; 5) dia dez; 6) dia quinze; 7) dia vinte; 8) dia vinte e cinco; 9) dia
trinta; 10) dia trinta e cinco; 11) dia quarenta; 12) dia quarenta e
cinco; N) controle negativo do processo de extração do DNA; A)
controle negativo da PCR; CP (controle positivo). Jaboticabal, São
Paulo, 2007..........................................................................................
47
3. Limiar de detecção de Leptospira interrogans sorovar Canicola por PCR, a
partir do DNA obtido pela técnica de extração com Isotiocianato de
Guanidina, de amostras de sêmen canino experimentalmente
contaminado. 1) Cultura pura com 10
8
leptospiras por mL; 2) Sêmen
com 10
7
leptospiras por mL; 3) Sêmen com 10
6
leptospiras por mL;
4) Sêmen com 10
5
leptospiras por mL; 5) Sêmen com 10
4
leptospiras por mL; 6) Sêmen com 10
3
leptospiras por mL; 7) Sêmen
com 10
2
leptospiras por mL; 8) Sêmen com 10
1
leptospiras por mL;
9) Sêmen com 10
0
leptospiras por mL; 10) controle negativo da
PCR. Jaboticabal, São Paulo, 2007.....................................................
48
4. Fotomicrografia de corte histológico da próstata do animal infectado G4A3,
utilizando a técnica de coloração Hematoxilina e Eosina, mostrando
a presença de prostatite, evidenciada através de células de
inflamação infiltrativas. Aumento de 100x............................................
49
5. Fotomicrografia de corte histológico do fígado de animal infectado
utilizando a técnica de coloração Levaditi, mostrando a presença de
leptospira. Aumentom de 400x............................................................
50
xx
COMPROMETIMENTO FISIOLÓGICO E SEMINAL DE CÃES MACHOS
INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE POR Leptospira interrogans
SOROVAR CANICOLA
Resumo
O trabalho presente objetivou pesquisar a presença de Leptospira
interrogans sorovar Canicola em 32 cães, dos quais 20 infectados e 12 controle,
em 4 grupos de estudo com 5 infectados e 3 de controle. No G1 os animais foram
eutanasiados 7 dias após a inoculação, no G2, 15 dias, no G3, 30 dias e no G4 45
dias. Colheu-se sêmen, urina e sangue nos dias 0, 3, 5, 7, 10 e após, a cada 5
dias, com realização de exames andrológicos do sêmen e bioquímicos da urina e
do sangue, e reação em cadeia da polimerase (PCR) dessas amostras. Avaliou-se
o estado clínico, e o soro sangüíneo foi submetido à soro-aglutinação
microscópica (SAM). Os títulos sorológicos dos infectados chegaram a 2.560. Na
PCR, detectou-se DNA de leptospiras primeiro no sêmen e depois na urina, e não
se detectou nos testículos, epidídimos, próstata, rins e fígado. Na Levaditi, foi
encontrada leptospira em um fígado, e no histopatológico, 5 animais com
prostatite, evidenciada também pelo aumento do número de espermatozóides com
a patologia cabeça isolada. O exame andrológico mostrou declínio na motilidade,
no vigor, na concentração espermática e defeitos maiores acima de 10%. No
hemograma, observou-se alterações a partir do dia 3 pós-infecção, e ao exame
bioquímico a partir do dia 30, indicando possíveis alterações hepáticas e renais.
Conclui-se que cães infectados com Leptospira interrogans sorovar Canicola
apresentam queda na qualidade espermática, sendo importantes fontes de
infecção para o homem e animais, podendo inclusive transmitir a leptospirose por
meio de sêmen nos primeiros dias pós-infecção, antes da transmissão urinária,
sendo detectada pela PCR anteriormente a SAM.
Palavras chave: Leptospira, cães, reprodução, sêmen, urina, PCR
xxi
PHYSIOLOGY AND SEMINAL COMMITMENT OF MALES DOGS
EXPERIMENTALLY INFECTED BY Leptospira Interrogans
SEROVAR CANIOLA
Summary
The present study aimed to investigate the presence of Leptospira interrogans
serovar Canicola. in 32 dogs, of which 20 are infected and 12 control, 4 study
groups with 5 infected and 3 of control. In G1 animals were euthanasing 7 days
after inoculation, the G2, 15 days, the G3, 30 days in the G4 and 45 days. It is
collected semen, urine and blood on days 0, 3, 5, 7, 10 and after, every 5 days,
with laboratory tests of semen andrological and biochemical of urine and blood,
and polymerase chain reaction (PCR ) Of these samples. Evaluated the clinical
status, and serum was submitted to serum-microscopic agglutination (SAM). The
serological evidence of infection arrived in 2560. In PCR, DNA was found in semen
of leptospires first and then in the urine, and is not detected in testis, epididymis,
prostate, kidney and liver. In Levaditi, was found leptospira in a liver, and the
histopathology, 5 animals with prostatitis, evidenced also by increasing the number
of sperm with the pathology head alone. The examination showed andrologic
decline in motility, in effect, defects in sperm concentration and higher above 10%.
In the blood, it was observed changes from day 3 post-infection, and the
biochemical examination on the day 30, indicating possible kidney and liver
abnormalities. It follows that dogs infected with Leptospira interrogans serovar
Canicola present decrease in sperm quality, and important sources of infection for
humans and animals, which may include forward to leptospirosis through semen
during the first day post-infection, before urinary transmission, and PCR detected
earlier by the SAM.
Key words: Leptospira, dogs, reproduction, semen, urine, PCR
1
1- INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
A leptospirose tem como principal mecanismo de contágio a exposição a
água ou solo contaminado, no entanto a transmissão venérea já foi amplamente
confirmada, tanto na monta natural como na inseminação artificial (ROBERTS,
1958; SLEIGHT e WILLIANS, 1961).
Esta importante zoonose de distribuição mundial (ACHA e SZYFRES, 1986)
não provoca sinais patognomônicos, e, portanto, seu diagnóstico clínico é difícil,
exigindo usualmente a confirmação laboratorial (STOENNER, 1972), que se
baseia no isolamento das leptospiras ou na presença de anticorpos específicos
induzidos pelo agente (VASCONCELLOS, 2000).
As leptospiroses apresentam forte significado sócio-econômico-cultural e
são exacerbadas por fatores como o crescimento desordenado de grandes
centros urbanos, as migrações, as deficiências nas condições de saneamento
básico e o acúmulo de lixo, que promovem a expansão de roedores
(MAGALHÃES et al., 2006).
As leptospiras são espiroquetas pertencentes à ordem Spirochaetales,
família Leptospiracae, gênero Leptospira (NOGUCHI, 1918). O gênero Leptospira
era anteriormente dividido em duas espécies: Leptospira interrogans,
apresentando uma variação antigênica caracterizada por 23 sorogrupos e 202
sorotipos (BARATON e POSTIC, 1989), que englobava um grande número de
variedades antigênicas, e Leptospira biflexa, variedades de comportamento
saprófita de vida livre presentes em água doce de superfície, distribuídas em 38
sorogrupos e 65 sorotipos (FAINE, 1994). Essa divisão baseava-se em critérios
estritamente relacionados a reações sorológicas relativamente específicas, que
forneciam os sorogrupos e sorovares de leptospiras patogênicas e saprófitas. A
identificação dos sorotipos só era possível pelo emprego da técnica de absorção
cruzada de aglutininas, executada por laboratórios de referência (CENTRO
PANAMERICANO DE ZOONOSIS, 1985). Em 1992, o Subcomitê de Taxonomia
da Leptospira propôs uma nova divisão para o gênero, o qual é formado
2
atualmente por oito genomoespécies patogênicas: L. borgptersenii, L. interrogans
sensu stricto, L. noguchii, L. santarosai, L. weilii, L. kirschneri, L. inadai e L. fainii
(KMETY e DIKKEN, 1993), distribuídas em 26 sorogrupos (ELLIS et al., 1986) e
250 sorovares (PERRY et al., 2000); e três genomoespécies saprófitas ou de vida
livre: L. biflexa, L. meyeri, L. wolbachii, com raros registros de infecções (KMETY e
DIKKEN, 1993).
Os diferentes sorovares de L. interrogans não apresentam especificidade
de hospedeiro, porém o que se observa é a existência de uma preferência de
certos sorovares por determinados vertebrados. Exemplos dessa condição
configuram-se nas associações estabelecidas entre o cão doméstico e o sorovar
Canicola, o suíno e o sorovar Pomona, o bovino e os sorovares Wolffi e ou Hardjo,
o eqüino e o sorovar Icterohaemorrhagiae (QUINN et al., 1994; FAINE, 1994).
A patogenia da leptospirose inclui a penetração do microrganismo através
das mucosas ou de lesões na pele, seguida de multiplicação no sangue e em
praticamente todos os órgãos e tecidos, o que caracteriza a fase denominada
leptospiremia, na qual há o comprometimento do fígado, dos rins, dos pulmões,
das adrenais, do cérebro, do útero, do ovário, das trompas e da glândula mamária.
Nas fêmeas em gestação, o abortamento e suas complicações tornam a
leptospirose uma importante doença da esfera reprodutiva (FAINE, 1982; FAINE,
1994; JORGE, 2008).
Durante o período de incubação, de sete a 14 dias, ocorre a septicemia,
surgindo a produção de anticorpos da classe IgM, que tem uma atividade de
poucos dias, e surgem mais tardiamente anticorpos da classe IgG. Apesar dos
anticorpos ajudarem no combate à bacteremia, não eliminam por si só a infecção
renal (REBHUN, 1995). Nos animais que conseguem sobreviver à fase aguda da
leptospirose, os microrganismos atingem a luz dos túbulos contornados renais e
passam a ser eliminados por meio da urina por períodos de tempo variados,
caracterizando a fase de leptospirúria; com isso os animais tornam-se uma fonte
de infecção importante, denominada portador renal (VASCONCELLOS, 1987;
SILVEIRA, 1996).
3
A transmissão da Leptospira spp pode ocorrer de forma indireta, pelo
contato com água e solos contaminados, e pelo modo direto, principalmente pela
via venérea (AMATREDJO et al., 1975). A transmissão transplacentária também é
comum entre os animais (BRASIL, 1995). Uma vez infectados, os animais podem
eliminar o agente na urina por um período de tempo variável, que pode chegar a
mais de um ano (HANSON, 1992; THIERMANN, 1984); segundo REBHUN (1995),
a leptospirúria em bovinos pode persistir entre dez dias e quatro meses, tendo
caráter intermitente. Nos carnívoros, devido ao elevado pH da urina, as leptospiras
não sobrevivem por um longo período, mas, com a utilização de rações
comerciais, a urina dos cães se torna uma importante via de transmissão (ACHA e
SZYFRES, 1986). Originalmente, os carnívoros não representavam uma fonte de
infecção muito séria para o homem, uma vez que, devido à sua alimentação à
base de carnes, o pH da urina é mais ácido, o que representa um ambiente
inóspito para as leptospiras, mas no caso dos cães domésticos, alimentados com
rações comerciais, o pH da urina torna-se apropriado para a manutenção e
sobrevivência dessas bactérias. Em cães, a leptospirose está normalmente
relacionada com nefrite intersticial, e como conseqüência dos danos renais
normalmente se observa proteinúria (ZARAGOZA et al., 2003). Em ambiente
urbano, devido ao contato muito próximo estabelecido entre cães e humanos, é
considerado que a principal fonte de infecção da leptospirose humana são os
cães. Esses animais vivem em contado direto com os seres humanos e podem
eliminar leptospiras vivas pela urina durante meses, mesmo sem apresentar
nenhum sinal clínico (FAINE et al., 1999). Nessa espécie animal, a leptospirose
pode ser causada por vários sorovares patogênicos, levando a uma enfermidade
com elevada letalidade (BIRNBAUM et al., 1998; PERRET et al., 2005). Os
roedores são um importante reservatório da doença e fonte de infecção para os
cães, o que torna difícil sua erradicação na população canina (DUTTA e
CHRISTOPHER, 2005; PERRET et al., 2005).
Um estudo publicado na revista The Canadian Veterinary Journal em 2002
mostra um aumento acentuado no número de casos de leptospirose canina a
4
partir do ano de 1998 no Hospital Escola da Faculdade de Veterinária de Ontário
(PRESCOTT et al., 2002).
Vários inquéritos sorológicos realizados em cães no Brasil retrataram a
variabilidade da distribuição de sorovares de Leptospira spp. predominantes nas
diferentes localidades. FURTADO et al. (1997) examinaram 260 cães em Pelotas,
RS, e encontraram prevalência de 28,9%, com destaque para os sororaves
Canicola e Icterohaemorrhagiae. ÁVILA et al. (1998) encontraram 34,8% de
reatores em 425 cães de Pelotas, RS, com predomínio dos sorovares Canicola,
Icterohaemorrhagiae e Copenhageni. JOUGLARD e BROD (2000), em Pelotas,
verificaram 2,7% de positividade em 489 cães, com destaque para os sororaves
Icterohaemorrhagiae, Australis, Copenhageni, Pyrogenes, Sentot e Canicola. Em
Santana de Parnaíba, SP, MASCOLLI et al. (2002) examinaram 410 amostras de
soro de cães e encontraram 15,0% de positividade, com destaque para os
sorovares Copenhageni, Canicola e Hardjo. BATISTA et al. (2005) examinaram
285 amostras de soro sangüíneo de cães colhidas durante a campanha de
vacinação anti-rábica animal, em Campina Grande, PB, e a prevalência de
leptospirose foi de 21,4%, com maior freqüência dos sorovares Autumnalis,
Copenhageni e Canicola. MAGALHÃES et al. (2006) colheram amostras de
sangue de 3.417 cães, em Belo Horizonte, MG, no período de setembro de 2001 a
setembro de 2002, encontrando 13,1% de positividade, sendo as sorovariedades
Canicola, Ballum, Pyrogenes e Icterohaemorrhagiae as mais prevalentes.
A prova de soroaglutinação microscópica (SAM) é o teste sorológico mais
utilizado para o diagnóstico da leptospirose bovina (BOLIN et al., 1989) no Brasil e
em todo o mundo (OLIVEIRA, 1999). THIERMANN (1984) ressalta que, apesar da
padronização desse teste, há dificuldade de obter resultados concordantes entre
os diferentes laboratórios. É uma técnica laboriosa e exige o uso de leptospiras
vivas como antígenos (CHAPPEL et al., 1998).
O diagnóstico definitivo da infecção por Leptospira spp é usualmente dado
pelo isolamento e cultivo do agente, entretanto esse procedimento é oneroso,
5
necessita de amostras recém-colhidas, e pelo menos 30 dias são requeridos para
a obtenção de resultados conclusivos (BOLIN et al., 1989).
Nos últimos anos, a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR)
tornou-se importante na detecção de agentes patogênicos. O método é rápido e
extremamente sensível, podendo teoricamente detectar uma única molécula de
DNA em poucas horas. Outra grande vantagem da técnica de PCR decorre do fato
de não ser necessária a viabilidade dos patógenos para a realização do teste, o
que permite a inativação e o armazenamento das amostras, bem como a
aplicação da técnica em amostras mal conservadas (GILLESPIE, 1990;
GINGERAS et al., 1990; PAUL, 1990; MASRI et al., 1997). KEE et al. (1994)
puderam detectar L. interrogans no sangue de Sagüis (Merionis unguiculatus) dois
dias após a infecção experimental, enquanto anticorpos só foram detectados pela
SAM sete dias pós-infecção.
MÉRIEN et al. (1992) sintetizaram o par de oligonucleotídeos iniciadores
Lep 1 e Lep 2 a partir da seqüência do gene 16S rRNA de L. interrogans sorovar
Canicola determinada por FUKUNAGA et al. (1990). A técnica de PCR, quando
utilizada com esse par de oligonucleotídeos iniciadores, revelou ser específica
para Leptospira spp, não amplificando o DNA de outras bactérias como Borrelia
burgdorferi, Borrelia hermsii, Treponema denticola, Treponema pallidum, entre
outras.
Mais tarde, novos oligonucleotídeos iniciadores (primers) foram
desenvolvidos a partir de DNA de outros sorovares, como Icterohamorrhagiae e
Bim, estes capazes de detectar apenas leptospiras patogênicas (GRAVEKAMP et
al., 1993).
HEINEMANN (1995) demonstrou que os oligonucleotídeos iniciadores
sintetizados por MÉRIEN et al. (1992) foram capazes de amplificar um fragmento
de 330 pares de base (bp) a partir do DNA de todos os 30 sorovares de Leptospira
spp testados em seu trabalho, independentemente de serem das espécies L.
biflexa (apatogênica) ou L. interrogans (patogênica), devido provavelmente ao fato
de os genes de rRNA serem altamente conservados entre as bactérias.
6
Vários autores têm descrito bons limiares de detecção de leptospiras pela
técnica de PCR. HEINEMANN (1995) descreveu ter detectado 10 bactérias por mL
em sêmen de touros; no entanto HEINEMANN et al. (2000) observaram um limiar
de detecção de 100 bactérias por mL para o mesmo material. Em urina,
CETINKAYA et al. (2000) detectaram até cinco leptospiras por mL do material.
KIM et al. (2006), em contaminação experimental de sêmen canino com
Leptospira interrogans, conseguiram um limiar de detecção de 1.000 bactérias por
mL de sêmen por meio da técnica de PCR. No mesmo trabalho, os autores
aplicaram uma nested PCR ao mesmo material, na qual atingiram um limiar de
100 bactérias por mL de sêmen. VELOSO et al. (2000) atentaram para o fato de
que o procedimento de extração do DNA do material que se deseja avaliar e os
“primers” utilizados podem propiciar diferentes resultados.
MAGAJEVSKI et al. (2005), estudando amostras pareadas de sêmen e de
urina de 10 touros naturalmente infectados com Leptospira interrogans sorovar
Hardjo, detectaram DNA de leptospira em apenas uma amostra de urina e em
nenhuma das amostras de sêmen. No entanto amostras de urina de cinco touros
foram positivas no isolamento em meio de cultivo, alertando para o fato de que
diferentes técnicas de extração de DNA e os “primers” utilizados podem fornecer
diferentes resultados.
Muitos estudiosos têm utilizado a PCR no diagnóstico da leptospirose
canina a partir da urina desses animais.
CAI et al. (2002) utilizaram os “primers” G1/G2 e B64-I/B64-II para detectar
sorovares de leptospiras patogênicas em urina canina. Eles relataram que a prova
se mostrou específica e sensível, apresentando um limiar de detecção de 100
células de leptospira icterohaemorrhagiae por mililitro de urina.
Em um estudo com 123 cães com sintomas sugestivos de leptospirose e 13
animais clinicamente sadios, concluiu-se que a PCR para detecção de leptospira
na urina de cães teve 100% de sensibilidade e 88,3% de especificidade, sendo
considerada uma arma no diagnóstico precoce de leptospirose (HARKIN et al.,
2003a). No mesmo ano HARKIN et al., 2003b, publicaram outro trabalho
7
comparando PCR, cultura bacteriológica e teste sorológico na detecção de
leptospirúria, e afirmaram que, independentemente do estado de saúde, 8,2% dos
cães eliminavam leptospiras patogênicas na urina, representando um risco para
seus proprietários. Eles também concluíram que o teste sorológico é um indicativo
pobre, em termos de diagnóstico precoce, da eliminação de leptospiras pela urina
Uma das características da infecção por leptospiras que há muito tempo é
conhecida é a sua importância como enfermidade bovina que interfere na
qualidade reprodutiva desses animais. A presença de Leptospira spp em sêmen
de touros, natural e experimentalmente infectados, já foi demonstrada, indicando a
possibilidade de transmissão da leptospirose bovina pela monta natural ou pela
inseminação artificial (IA) (SLEIGHT e WILLIAMS, 1961; SLEIGHT et al., 1964;
SLEIGHT, 1965; RODINA, 1971; RODINA e BALASHOV, 1971).
SLEIGHT e WILLIAMS (1961) concluíram que a relação anatômica dos
aparelhos urinário e genital dos machos, em que a uretra é o ducto excretor
comum para urina e sêmen, favorece a contaminação do sêmen por leptospiras
enquanto o animal se apresenta em fase de leptospirúria.
Uma das primeiras comprovações sobre a importância do sêmen como
meio de transmissão da leptospirose foi verificada por KIKTENKO et al. (1976),
que isolaram leptospiras de quatro amostras de sêmen de um total de 56 touros
examinados. Alguns animais infectados apresentaram inibição dos reflexos
sexuais e perda na qualidade do sêmen, com queda na concentração e na
motilidade, diminuição do volume do ejaculado e necrospermia. A necropsia de
três machos revelou a presença de inflamação dos testículos e das glândulas
anexas.
MAGAJEVSKI et al. (2004) estudaram as possíveis alterações nos padrões
analisados em exames andrológicos de touros e constataram que os bovinos
podem ter uma queda na qualidade do ejaculado quando expostos a uma infecção
por leptospiras.
Apesar do crescente interesse na reprodução assistida em cães, existem
poucas informações científicas sobre a fisiologia da reprodução nesta espécie, em
8
comparação a outras. E ainda menos informações sobre as múltiplas causas de
infertilidade em cães machos, inclusive com informações sobre quais as possíveis
doenças que poderiam ser transmitidas durante a reprodução.
O aumento do número e da variedade de parâmetros anormais do sêmen
reflete condições de subfertilidade, indicando a necessidade de investigação mais
profunda. A análise do sêmen inclui avaliação de coloração, volume, motilidade,
vigor, concentração, defeitos e avaliação citológica (ROOT e JOHNSTON, 1994).
A coloração normal do sêmen de cães é branco-opalescente (JOHNSTON,
1991). O aspecto do sêmen varia conforme a concentração de espermatozóides e
a quantidade de líquido prostático presente no ejaculado (ROOT e JOHNSTON,
1994). O ejaculado dos cães é dividido em três distintas frações. O volume do
sêmen dos cães apresenta variações desde 1mL até mais de 80mL na somatória
das três frações. O volume também é dependente da quantidade de líquido
prostático (ROOT e JOHNSTON, 1994). A motilidade do sêmen deve ser superior
a 70% (JOHNSTON et al., 2001). O vigor corresponde à graduação de velocidade
na qual o espermatozóide se move (ROOT e JOHNSTON, 1994).
A concentração espermática é muito variável entre cães; normalmente os
cães maiores produzem mais espermatozóides que os menores (ROOT e
JOHNSTON, 1994).
Mamíferos com boa fertilidade normalmente possuem alta porcentagem de
espermatozóides normais e uniformes (OMBELET et al., 1995). Anormalidades do
sêmen associadas com infertilidade incluem oligospermia ou azospermia, volume
abaixo do normal, baixa motilidade, presença de hemospermia ou leucospermia e
grande quantidade de patologias espermáticas.
São parâmetros normais para o sêmen de cães: motilidade espermática
acima de 70%, concentração acima de 200 milhões de espermatozóides por
ejaculado e mais de 80% de espermatozóides morfologicamente normais
(MEYERS-WALLEN, 1991). Motilidade e morfologia espermática anormais, com
freqüência, são os primeiros indicadores de lesão gonadal, independentemente da
causa (JOHNSON, 1994). As etiologias incluem afecção testicular primária,
9
distúrbios endócrinos, agressões pelo meio ambiente, ejaculação incompleta e
causas iatrogênicas (JOHNSON, 1994).
Além dos métodos padrões utilizados no diagnóstico da leptospirose, como
a técnica de soroaglutinação microscópica, a leptospirose pode ser diagnosticada
pela visualização do agente em fragmentos de tecidos (ELLIS et al., 1983) por
várias técnicas, como imunofluorescência, imunoperoxidase, colorações com sais
de prata como a técnica de Levaditi.
Utilizando a técnica de Levaditi, KANEKO e OKUDA (1917) conseguiram
demonstrar a presença de leptospiras em mais de 50% dos tecidos hepáticos de
43 casos clínicos de leptospirose humana. Nos fragmentos de rins examinados,
verificaram a presença do agente; nos primeiros dias, as leptospiras estavam
localizadas no interstício, e mais tardiamente, no espaço intracelular.
ZAMORA (1995) encontrou, por meio das técnicas de Levaditi, observação
direta em campo escuro, imunofluorescência e imunoistoquímica, a presença de
leptospira em rins de 43% dos roedores silvestres examinados. A técnica que
apresentou o melhor desempenho foi a de Levaditi, em 67,5% dos rins.
CAMARGO et al. (1993) verificaram a presença de L. interrogans sorovar
Pomona pela reação de imunofluorescência direta e pela técnica de Levaditi em
fragmentos de ovários de hamsters experimentalmente infectados. As leptospiras
foram localizadas em diferentes estruturas dos ovários, como no interstício, nos
vasos sangüíneos e linfáticos, na altura da zona pelúcida e no interior dos óvulos.
CAMARGO (1996) verificou a presença do sorovar Pomona, a partir da
coloração de Levaditi, em ovários de hamsters infectados experimentalmente, que
foram induzidos à condição de portadores renais pela administração do estolato
de eritromicina.
BRANDESPIM et al. (2003), utilizando as técnicas de Levaditi e
imunoistoquímica, observaram a presença de L. interrogans sorovar Pomona no
testículo, no epidídimo, na vesícula seminal, no rim e no fígado de hamsters
experimentalmente infectados.
10
Nos últimos anos, vários pesquisadores têm se dedicado a estudar a
presença das leptospiras nos tecidos, com o objetivo de detectar a possível
existência desse microrganismo em estruturas do aparelho reprodutor tanto das
fêmeas como dos machos. A melhor compreensão da patogenia da leptospirose
poderia ajudar no desenvolvimento de métodos mais eficientes de controle
sanitário (MARPLETOFT, 1986).
11
2- JUSTIFICATIVAS
A realização deste trabalho é justificada pela inexistência de artigos
relatando o comprometimento do aparelho reprodutor de cães em infecções por
leptospiras aliada à crescente utilização de técnicas de reprodução assistida
nessa espécie.
3- OBJETIVOS
O presente projeto tem por objetivos:
• pesquisar a presença de leptospiras em sêmen e urina de cães
infectados por Leptospira interrogans sorovar Canicola;
• avaliar o perfil andrológico desses animais comparando-o ao de
animais não infectados;
• pesquisar a presença de leptospiras nos testículos, no epidídimo e
na próstata, bem como avaliar a extensão das lesões provocadas
por esses patógenos em animais experimentalmente infectados;
• comparar os achados com exames clínicos/laboratoriais
complementares.
12
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 - Instalação e manejo dos cães
Os cães foram mantidos em baias individuais apropriadas no Hospital
Veterinário “Dr. Halim Atique”, do Centro Universitário de Rio Preto - Unirp, com
temperatura ambiental não climatizada, recebendo água comum da rede pública e
ração comercial “ad libidum”.
4.2 - Seleção dos animais
Foram selecionados cães machos em idade reprodutiva (entre 1 e 4 anos),
sem raça definida, com massa corpórea variando de 10 a 15 kg, recolhidos ao
Centro de Controle de Zoonoses do Município de São José do Rio Preto, que não
apresentaram título de anticorpos séricos contra os sorovares de Leptospira spp
(Quadro 1), por meio da prova de soroaglutinação microscópica (SAM), em dois
testes realizados no intervalo de sete dias, e com a reação em cadeia da
polimerase (PCR) na urina negativa nessas duas ocasiões, descartando a
possibilidade dos animais serem portadores renais (FAINE, 1982).
Foram utilizados 32 animais, dos quais 20 foram inoculados com a cepa
patogênica de Leptospira interrogans sorovar Canicola (LO4) e 12 receberam
solução fisiológica, sendo considerados como grupo-controle e tratados da mesma
forma que o grupo infectado. Esses animais foram divididos em quatro grupos de
estudo, todos compostos de cinco cães infectados com a cepa patogênica LO4, e
três animais de controle; os animais do grupo 1 (G1) foram eutanasiados após
sete dias da inoculação, os animais do grupo 2 (G2) foram eutanasiados 15 dias
após a inoculação, os animais do grupo 3 (G3) eutanasiados após 30 dias de
incubação e os animais do grupo 4 (G4) foram eutanasiados após 45 dias da
inoculação da cepa patogênica.
13
Nos dias zero (dia da inoculação), três, cinco, sete, 10 e a partir daí de
cinco em cinco dias após a inoculação da cepa patogênica de Leptospira, foram
colhidas amostras de sangue, sêmen e urina. No sêmen foram realizados exames
andrológicos, no sangue, além da SAM (para traçar a curva de títulos) e de um
hemograma completo, foram verificados os níveis de uréia, creatinina, fosfatase
alcalina, transaminase, albumina, ALT, colesterol, glicose e cálcio. Na urina, foram
realizados os testes biofísicos e bioquímicos e observação quanto a proteinúria e
cilindros granulosos, inclusive no dia da eutanásia.
Nos dias de colheita dos materiais, foi realizada paralelamente uma
avaliação clínica dos cães, tanto os inoculados quanto os de controles,
observando-se principalmente se havia uremia, hemoglobinúria, icterícia, glossite
ou estomatite, temperatura dos animais, peso corporal, freqüência cardíaca e
freqüência respiratória. Foram colhidas na necropsia, amostras de rim, fígado,
epidídimo, testículo e próstata para realização de PCR, e das técnicas de
coloração de Levaditi e histopatológico.
4.3 - Inoculação
*
Foi utilizado um inóculo com a cepa virulenta do sorovar Canicola da estirpe
LO4 (FREITAS et al., 2004) na concentração de 10
9
leptospiras por mL. Para
obter essas concentrações de leptospiras, as mesmas foram contadas em lâminas
microscópicas 24 x 76 mm, (FAINE, 1982). Foram inoculados quatro mililitros do
inóculo por via subcutânea na região cervicodorsal.
*
Cepa LO4 - cepa patogênica de Leptospira interrogans sorovar Canicola, isolada de fígado de
suíno, pela equipe do Prof. Dr. Julio César de Freitas, em estudo realizado na Universidade
Estadual de Lo
ndrina (UEL) gentilmente cedida pelo Instituto Biológico de São Paulo.
14
4.4- Colheita das amostras
4.4.1 - Sangue
A colheita de sangue foi realizada por venopunção, parte do sangue foi
utilizada imediatamente na análise laboratorial com a adição de anti-coagulante, e
parte foi dessorada após retração do coágulo. O soro foi então identificado e
encaminhado para o exame sorológico, realizado pela técnica de SAM, a fim de
estabelecer uma curva de títulos nos animais.
4.4.2 - Sêmen
Para a colheita do sêmen foi aplicada a técnica de estimulação manual
peniana (JOHNSTON et al., 2001). Em parte das amostras da primeira e segunda
fração do ejaculado, foram realizados o espermiograma e a avaliação morfo-
patológica, e outra parte das amostras foi congelada à temperatura de -20º C até o
momento do exame de PCR.
4.4.3 - Urina
A colheita da urina foi realizada com a utilização de sonda. Parte das
amostras foi utilizada na análise físico-química e outra parte das amostras foi
congelada à temperatura de -20º C até o momento do exame de PCR.
4.5 – Eutanásia dos animais
Os animais foram inicialmente sedados com acepromazina na dose de
0,01mg/kg via intravenosa e em seguida, pela mesma via, receberam overdose de
tionembutal na dose de 25mg/kg (dose normal 12,5mg/kg) e brometo de
pancurônio na dose de 0,11mg/kg I.V. até total parada cardiorrespiratória.
15
4.6 - Pesquisa de anticorpos
*
4.6.1 - Preparo dos antígenos de leptospira
Os sorovares de leptospira utilizados como antígenos foram provenientes
de matrizes repicadas semanalmente em meio de cultura EMJH (Ellighausen,
McCullough, Johson e Harris, Difco) enriquecido com soro sangüíneo de coelho,
na proporção de 10%, e mantidos em estufa bacteriológica (B.O.D.) a 28
o
C. Todos
os antígenos foram utilizados ao redor do sexto dia de incubação. A concentração
considerada ideal foi padronizada de forma a corresponder à metade da turvação
do tubo número 1 da escala de MacFarland (100 a 200 leptospiras por campo
microscópico), livre de contaminação e de auto-aglutinação, segundo as
orientações de SULZER e JONES (1980).
4.6.2 - Técnica de Soroaglutinação Microscópica
Os soros foram diluídos em solução tamponada de Sörensen, segundo
SANTA ROSA (1970), sendo a diluição inicial de 1/5. Dessa diluição foram
colocadas alíquotas de 50 µL e adicionada igual quantidade de antígeno,
resultando na diluição de 1/10. A mistura soro-antígeno foi levemente agitada e
incubada em estufa bacteriológica B.O.D. a 28
o
C por duas horas, procedendo-se
a seguir à leitura. O critério adotado para considerar um soro como reagente foi o
de 50% de aglutinação, ou seja, metade das leptospiras aglutinadas no campo
microscópico no aumento de 100 vezes. O título do soro foi considerado a
recíproca da sua maior diluição que apresentou 50% de aglutinação.
*
Realizado no Laboratório de Leptospirose e Brucelose da FCAV/UNESP sob a supervisão do Prof. Dr. Raul
José Silva Girio.
16
Quadro 1. Estirpes de Leptospira interrogans
*
empregadas como antígeno na
reação de soroaglutinação microscópica aplicada à leptospirose, segundo o
número de controle (código), o sorogrupo e a variante sorológica.
Código Sorogrupo Sorovar
1-A
Australis
Australis
1-B
Australis
Bratislava
2-A
Autumnalis
Autumnalis
2-B
Autumnalis
Butembo
3
Ballum
Castellonis
4
Bataviae
Bataviae
5
Canicola
Canicola
6
Celledoni
Whitcombi
7
Cynopteri
Cynopteri
8
Grippotyphosa
Grippotyphosa
9
Hebdomadis
Hebdomadis
10-A
Icterohaemorrhagiae
Copenhageni
10-B
Icterohaemorrhagiae
Icterohaemorrhagiae
11
Javanica
Javanica
12
Panama
Panama
13
Pomona
Pomona
14
Pyrogenes
Pyrogenes
15-A
Sejroe
Hardjo
15-B
Sejroe
Wolffi
16
Shermani
Shermani
17
Tarassovi
Tarassovi
18
Andamana
Andamana
20
Seramanga
Patoc
ST
Djasiman
Sentot
*
Cedidas gentilmente pelo Prof. Dr. Sílvio Arruda Vasconcellos do Departamento de Medicina Veterinária
Preventiva e Saúde Animal da FMVZ/USP.
17
4.7 – Reação em cadeia pela polimerase (PCR)
∗
∗∗
∗
4.7.1 - Extração de DNA
Para a extração de DNA das amostras clínicas de sêmen e de urina,
utilizou-se a técnica com isotiocianato de guanidina (adaptado de
CHOMCZYNSKI, 1993). A reação foi realizada em microtubos de 1.500µL, de
acordo com a seqüência de etapas que se seguem
• Adição de 600µL de isotiocianato de guanidina.
• Adição de 200µL de sêmen.
• Homogeneização por 10 segundos em agitador orbital (Vórtex).
• Incubação durante 5 minutos à temperatura ambiente.
• Centrifugação rápida.
• Adição de 100µL de clorofórmio gelado.
• Homogeneização por 10 segundos em agitador orbital (Vórtex).
• Incubação durante 3 minutos à temperatura ambiente.
• Centrifugação a 14.000 x g/5min.
• Transferência de 400µL da fase aquosa para novo tubo de 1.500µL,
tomando o cuidado de não aspirar a interface orgânica.
• Realização da precipitação acrescentando 600µL de propanol gelado,
homogeneizar por inversão.
• Estocagem da amostra por, no mínimo, 2 horas a -20˚C.
• Centrifugação a 14.000 x g/20min.
• Desprezo do sobrenadante por inversão.
• Adição de 500µL de etanol a 70%.
• Centrifugação a 14.000 x g/15min.
• Desprezo do sobrenadante por inversão.
∗
Realizado no Laboratório de Biologia Molecular e Sorologia Aplicada da FMVZ/USP sob supervisão do
Prof. Dr. Leonardo José Richtzenhain
18
• Banho-maria a 56˚C por 15 minutos.
• Suspensão do sedimento com 30µL de TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,
pH 8,0).
• Banho-maria a 56˚C por 30 minutos.
• Estocagem a -20º C, ou utilização imediata para amplificação.
Para a extração de DNA das amostras dos órgãos (rim, fígado, epidídimo,
testículo e próstata), foi utilizada a técnica com lise enzimática com proteinase K
(SAMBROOK et al., 1989). A reação foi realizada em microtubos de 1.500µL, de
acordo com a seqüência de etapas que se seguem
• Adição de 300µL da amostra clínica.
• Adição de 300µL de tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4 (TE). (somente
para as amostras de sêmen).
• Homogeneização por 10 segundos em agitador de tubos.
• Centrifugação em 13.000 x g/30 min.
• Ressuspenção do sedimento (pélete) em 300µL de tampão de lise.
• Adição de 150µL de tampão fenol.
• Homogeneização por 20 segundos em agitador de tubos
• Centrifugação da 13.000 x g/5min.
• Transferência de 200µL da fase aquosa para novo tubo de 1.500µL,
tomando o cuidado de não aspirar a interface orgânica.
• Adição de 100µL de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico, na proporção de
25/24/1.
• Homogeneização por 10 segundos em agitador de tubos.
• Centrifugação em13.000 x g/5min.
• Transferência de 100µL da fase aquosa para novo tubo de 1.500µL,
tomando o cuidado de não aspirar a interface orgânica.
• Adição de 20µL de acetato de sódio 2M.
• Adição de 240µL de etanol absoluto.
19
• Homogeneização por inversão.
• Manutenção em -20º C “overnight”.
• Centrifugação em 13.000 x g/15 min.
• Descarte do sobrenadante por inversão e lavagem do pélete com 500µL
de etanol 70%.
• Centrifugação da 13.000 g/15 min.
• Secagem do pélete de DNA.
• Ressuspenção do pélete em 30µL de TE com pH 7,4.
• Incubação em banho-maria a 56º C/15min.
• Estocagem a -20º C, ou utilizar imediatamente para amplificação.
4.7.2 - Oligonucleotídeos iniciadores (primers) empregados na
amplificação
Foram utilizados os primers descritos por MÉRIEM et al. (1992), gênero-
específicos, de 330 pb
Quadro 2 Seqüência dos pares de base dos dois primers utilizados no
experimento.
PRIMERS SEQÜÊNCIA
Lep 1 5’ GGCGGCGCGTCTTAAACATG 3’
Lep 2 3’ TTAGAACGAGTTACCCCCCTT 5’
20
4.7.3 - Amplificação do DNA bacteriano
A amplificação das amostras de DNA foi realizada em microtubos de 500µL,
com volume final de 25µL, de acordo com o protocolo de MÉRIEM et al. (1992),
descrito a seguir
• Adição de 16,1 µL de água ultrapura.
• Adição de 2,5 µL de tampão de reação 10x (500mM KCl; 15mM
MgCl
2
; 100mM tris-HCl, pH 9,0).
• Adição de 0,5 µL da mistura de dNTPs (200µM de cada nucleotídeo
[dCTP, dATP, dGTP, dTTP]).
• Adição de 0,75 µL de MgCl
2
(50mM).
• Adição de 1,25 µL de Lep 1(10 pmol/µL).
• Adição de 1,25 µL de Lep 2(10 pmol/µL).
• Adição de 0,15 µL de Taq DNA polimerase (5 unidades por µL).
• Adição de 2,5 µL da amostra de DNA extraído.
4.7.4 - Ciclo de amplificação
Foi utilizado o ciclo de amplificação preconizado por RICHTZENHAIN et al.
(2002). Inicialmente, foi realizada a desnaturação da fita, utilizando a temperatura
de 94º C por 5 minutos. Foram empregados 40 ciclos, divididos como descrito
abaixo:
• Desnaturação do DNA: 94º C/30seg
• Anelamento dos “primers”: 60º C/30seg
• Polimerização do DNA: 72º C/30seg
• Extensão final: 72º C/5min
21
4.7.5 - Análise do produto amplificado
A visualização do produto amplificado (330 pares de base) foi realizada por
eletroforese em gel de agarose a 2,0% (p/v), utilizando tampão de corrida TBE 0,5
X (0,04M tris-acetato e 0,001M EDTA, pH 8,0), segundo SAMBROOK et al.
(1989), como segue.
A cada uma das cavidades do gel foram adicionados 12µL de uma mistura
contendo 10µL de produto amplificado e 2µL de corante (azul de bromofenol
0,25%, glicerol 30%). O gel foi submetido a uma voltagem constante de 6-7 V por
centímetro de distância entre os eletrodos em cuba horizontal, contendo tampão
de corrida TBE 0,5%.
A revelação das bandas foi realizada por meio da imersão do gel em uma
solução de brometo de etídio a 5µg por mL durante 15 minutos e posterior
observação em transluminador ultravioleta. O gel foi fotografado pelo sistema
EDAS* (Electrophoresis Documentation and Analysis System - KODAK).
Como controle positivo foi utilizada uma cultura com o sorovar Canicola, e
como controle negativo foi utilizada água.
4.7.6 - Amostra de sêmen canino para contaminação
experimental
A amostra de sêmen canino submetida à contaminação experimental com
Leptospira interrogans sorovar Canicola foi obtida a partir de um animal utilizado
como controle negativo do experimento, que não apresentou título de anticorpos
séricos contra os sorovares de Leptospira spp. incluídos no Quadro 1, por meio da
prova de SAM (FAINE, 1982), e negativa para a técnica de PCR utilizada.
22
4.7.7 - Determinação do limiar de detecção da técnica de PCR na
amostra de sêmen canino experimentalmente contaminado com Leptospira
interrogans sorovar Canicola
Foi empregada uma suspensão bacteriana pura de Leptospira interrogans
sorovar Canicola, gentilmente cedida pelo Laboratório de Zoonoses Bacterianas
do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal da
FMVZ/USP. Por meio da metodologia de contagem em campo escuro descrita por
FAINE (1982), esta suspensão bacteriana revelou conter 3,6 x 10
8
bactérias/mL. A
fim de avaliar a menor concentração de DNA bacteriano que a técnica de PCR
pôde detectar em sêmen canino, o sêmen descrito no item 4.7.6 foi contaminado
experimentalmente com diferentes concentrações da suspensão bacteriana. Para
tanto, as bactérias foram diluídas diretamente na amostra de sêmen, de maneira a
obter as seguintes concentrações de bactérias/mL: 3,6 x 10
7
, 10
6
, 10
5
, 10
4
, 10
3
,
10
2
, 10
1
, 10
0
.
4.8 – Análises dos ejaculados
∗
∗∗
∗
Imediatamente após a colheita, o ejaculado foi mantido em temperatura
ambiente, sendo analisado macro e microscopicamente.
4.8.1 - Análises macroscópicas
4.8.1.1 - Volume
O volume da primeira e da segunda fração do ejaculado foi medido no
próprio tubo graduado no qual foi feita a coleta.
∗
Realizado no momento da colheita no Laboratório de Reprodução Animal do Hospital Veterinário da
UNIRP.
23
4.8.1.2 - Coloração
A coloração foi verificada pela simples inspeção visual, sendo considerada
normal para o ejaculado do cão, a cor de branco-opalescente a branco-leitosa
(ROOT e JOHNSTON, 1994).
4.8.2 - Análises microscópicas
4.8.2.1 - Motilidade espermática
Uma gota de sêmen fresco foi colocada entre lâmina e lamínula, pré-
aquecida a 37ºC e observada em microscópio de contraste de fase, com aumento
de 10X, sendo a avaliação registrada sob a forma de porcentagem de células em
movimento progressivo.
4.8.2.2 - Vigor
Utilizando-se das mesmas preparações microscópicas empregadas para a
avaliação da motilidade, avaliou-se a qualidade do movimento progressivo dos
espermatozóides, considerando-se escores de zero (nenhum movimento) a cinco
(movimento retilíneo).
4.8.2.3 - Concentração espermática
Para determinação da concentração de espermatozóides (sptz/mL), foi
utilizada diluição de 1/20, sendo 50µL do ejaculado em 950µL de água destilada.
A partir da referida diluição, preencheram-se as duas hemicâmaras de
“Neubauer”. Decorridos dois minutos, para sedimentação das células
espermáticas, as contagens foram realizadas em microscópio de contraste de
fase, com aumento de 40X, e o número de células contadas expresso em
espermatozóides por mL.
24
4.8.2.4 - Turbilhonamento
O turbilhonamento traduz o movimento de massa dos espermatozóides. Foi
colocada uma gota de sêmen sobre uma lâmina aquecida a 37ºC. A seguir, a
referida lâmina foi levada ao microscópio sobre uma placa aquecida, observada
com auxílio de uma objetiva de 100x, e o movimento foi classificado em uma
escala de zero a cinco.
4.8.2.5 - Análise das morfopatologias espermáticas
A morfologia dos espermatozóides foi avaliada por exame de amostras do
ejaculado em lâminas, no aumento de 100X (óleo de imersão), e foram contadas
200 células de cada amostra. A técnica utilizada para confecção das lâminas foi a
preconizada por JOHNSTON et al., 2001. Foi feito um esfregaço de uma gota de
sêmen, corado com Wright-Giensa. Os números e os tipos de anormalidades
foram anotados, e a porcentagem determinada. Quando um espermatozóide
apresentava mais de uma anormalidade, era anotada apenas a considerada mais
séria (SEAGER, 1986). As anormalidades foram consideradas como defeitos
maiores (cabeça: subdesenvolvida, isolada patológica, estreita na base, piriforme,
pequena anormal, contorno anormal, “pouch formation”, acrossomo, gota
citoplasmática proximal, forma teratológica; peça intermediária; cauda: dobrada ou
em gota, enroladas na cabeça e formas duplas) e defeitos menores (cabeça:
delgada, gigante-pequena-anormal, isolada anormal; cauda e implantação: retro-
abaxial-oblíquo, dobrada ou enrolada e com gota citoplasmática distal).
25
Foram consideradas como amostras de sêmen normais as que tiveram
menos que 10% de defeitos maiores, menos de 20% de defeitos menores e
defeitos totais entre 20 e 30% (JOHNSTON et al., 2001).
4.9 - Técnica de Levaditi
Essa técnica foi realizada conforme o procedimento descrito por Mc
MANUS e MOWRY (1965)
Os fragmentos de tecidos foram fixados em formol 10% por 24 horas à
temperatura ambiente.
Lavagem em água corrente por 1 hora.
Lavagem em álcool 96° por 24 horas.
Lavagem em álcool - 70° por 24 horas.
Retirada do álcool e imersão em água.
Revelação em solução de nitrato de prata (Nuclear 2850), por 72 horas à
temperatura de 37 °C, no escuro (Anexo 1).
Bloqueio da reação em solução redutora, por 24 a 72 horas à temperatura de
37°C, no escuro (Anexo 1).
Lavagem em água destilada.
Desidratação em série de álcoois em concentrações crescentes (70%, 95%,
absolutos I, II e III) e em xilol.
Diafanização, impregnação com parafina e inclusão em parafina.
Cortes em micrometro (4 a 5 µm) e montagem em resina sintética
“PERMOUNT”.
A leitura das lâminas foi realizada em microscópio de luz óptica (Carl Zeiss)
com ocular 10Χ e objetivas 40Χ e 100Χ (imersão), com condensador de campo
claro.
26
4.10 - Histopatológico
Fragmentos dos testículos, epidídimos, próstata, rim e fígado foram fixados
em solução neutra de formol a 10%, incluídos em parafina e cortados a cinco
micrômetros de espessura para então serem corados pela técnica de hematoxilina
e eosina (HE).
4.11 - Hemograma, análise bioquímica do sangue e análise físico-
química da urina
A metodologia utilizada para esta análise encontra-se no final deste
trabalho como anexo, uma vez que, para a maioria dos parâmetros, foram
utilizados Kits comerciais.
4.12 – Análise estatística
Os testes estatísticos foram realizados utilizando-se o programa
computacional Statististical Analysis System (SAS USER’S GUIDE: STATISTICS,
1985). Foram realizadas análises de variância individuais para cada parâmetro
estudado, dentro de um delineamento inteiramente casualizado. Para as variáveis
cujas médias foram consideradas significativas foi aplicado o teste t de Student
para detectar diferenças entre os tratamentos em cada dia. Neste caso,
consideram-se os níveis de significância de 1% e 5% para todas as condições.
27
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
De acordo com QUINN et al. (1994) e FAINE (1994), os diferentes
sorovares de L. interrogans não apresentam especificidade de hospedeiro, porém
existe a preferência de certos sorovares por determinados vertebrados. Exemplo
dessa condição é a associação estabelecida entre o cão doméstico e o sorovar
Canicola. Essa condição aliada aos vários inquéritos sorológicos que indicam esse
sorovar como um dos principais causadores da leptospirose canina (FURTADO et
al., 1997; ÁVILA et al., 1998; JOUGLARD e BROD, 2000; MASCOLLI et al., 2002;
BATISTA et al., 2005; MAGALHÃES et al., 2006) motivaram a utilização desse
sorovar no presente estudo.
Como esperado, nenhum animal do grupo-controle apresentou aglutinação
frente à reação de soroaglutinação microscópica (SAM) para os 24 sorovares de
Leptospira spp. utilizados (Quadro 1), a partir da diluição 1/10; e os demais
animais só apresentaram reação ao sorovar Canicola após a infecção
experimental, o que comprova a qualidade das medidas adotadas no ambiente em
relação às instalações e ao manejo sanitário.
A confirmação da indução da leptospirose nos cães experimentalmente
infectados ficou caracterizada pelos títulos de anticorpos obtidos na prova de
SAM, caracterizando a “performance” da virulência da cepa utilizada e
assegurando o primeiro parâmetro assentado no delineamento da investigação,
que foi o de estabelecer uma população que tivesse um contato efetivo com a
leptospira.
Podem-se observar na Tabela 1 os títulos de anticorpos antileptospira dos
cães que constituíram o grupo 1 (G1) do experimento e que permaneceram
infectados durante sete dias. Dos cinco cães, apenas um (G1A1) não apresentou
título no período analisado, o que pode ser explicado pelos dados obtidos por
REBHUN (1995), que relata que o período de incubação da leptospirose pode ser
de até quatorze dias, período em que ocorre septicemia e o início da produção de
28
anticorpos. Os títulos apresentados pelos animais desse grupo variaram de 20 a
1.280.
Na Tabela 2, estão apresentados os títulos dos cães que permaneceram
infectados durante quinze dias e que constituíram o grupo 2 do protocolo
experimental (G2). Nesse grupo, todos os animais apresentaram títulos
detectáveis na prova de SAM durante o período de estudo, os quais variaram de
10 a 1.280.
Tabela 1. Títulos de anticorpos aglutinantes antileptospira sorovar Canicola de
cinco cães infectados experimentalmente com a cepa LO4 de Leptospira
interrogans sorovar Canicola durante quatro avaliações num período de
sete dias, representando o Grupo G1 do presente experimento.
Jaboticabal, São Paulo, 2007.
Dias de coleta de materiais em relação ao dia da
inoculação
ANIMAIS
0 03 05 07
G1A1 - - - -
G1A2 - - 160 1.280
G1A3 - 20 160 320
G1A4 - - 320 1.280
G1A5 - 20 80 640
G1: grupo 1, A: animal infectado -: ausência de reação
29
Tabela 2. Títulos de anticorpos aglutinantes antileptospira sorovar Canicola de
cinco cães infectados experimentalmente com a cepa LO4 de Leptospira
interrogans sorovar Canicola durante seis avaliações num período de 15
dias, representando o Grupo G2 do presente experimento. Jaboticabal,
São Paulo, 2007.
Dias de coleta de materiais em relação ao dia da inoculação
ANIMAIS
0 03 05 07 10 15
G2A1 - 10 160 640 1.280 1.280
G2A2 - - 20 160 320 1.280
G2A3 - 40 80 160 320 320
G2A4 - 10 20 80 320 640
G2A5 - 20 20 160 160 640
G2: grupo 2, A: animal infectado -: ausência de reação
A Tabela 3 mostra os títulos sorológicos obtidos dos animais do grupo três
(G3), avaliados durante trinta dias. Os cinco cães infectados apresentaram títulos
que variaram de 160 a 1.280. Na Tabela 4, são verificados os títulos do grupo 4
(G4), no qual os cães infectados foram observados por quarenta e cinco dias. No
grupo 4 (G4), em todos os animais foi possível a detecção de anticorpos, com
títulos que variaram de 20 a 2.560, revelando que houve soroconversão em todos
os animais inoculados.
30
Tabela 3. Títulos de anticorpos aglutinantes antileptospira sorovar Canicola de
cinco cães infectados experimentalmente com a cepa LO4 de Leptospira
interrogans sorovar Canicola durante nove avaliações num período de
30 dias, representando o Grupo G3 do presente experimento.
Jaboticabal, São Paulo, 2007.
Dias de coleta de materiais em relação ao dia da inoculação
ANIMAIS
0 03 05 07 10 15 20 25 30
G3A1 - - 640 1.280 1.280 1.280 1.280 640 640
G3A2 - - 160 320 640 640 1.280 1.280 1.280
G3A3 - - 160 320 320 320 320 640 320
G3A4 - - 160 320 640 1.280 1.280 1.280 640
G3A5 - - 320 320 320 1.280 1.280 1.280 1.280
G3: grupo 3, A: animal infectado -: ausência de reação
Tabela 4. Títulos de anticorpos aglutinantes antileptospira sorovar Canicola de
cinco cães infectados experimentalmente com a cepa LO4 de Leptospira
interrogans sorovar Canicola durante doze avaliações num período de
45 dias, representando o Grupo G4 do presente experimento.
Jaboticabal, São Paulo, 2007.
Dias de coleta de materiais em relação ao dia da inoculação
ANIMAIS
0 03 05 07 10 15 20 25 30 35 40 45
G4A1 - - 160 320 320 1.280 320 640 640 640 320 640
G4A2 - 20 640 1.280 1.280 2.560 1.280 2.560 1.280 2.560 640 640
G4A3 - - 320 640 1.280 2.560 2.560 2.560 2.560 2.560 1.280 1.280
G4A4 - - - 80 160 1.280 1.280 2.560 2.560 2.560 2.560 1.280
G4A5 - - 640 1.280 2.560 2.560 2.560 2.560 2.560 2.560 2.560 2.560
G4: grupo 4, A: animal infectado -: ausência de reação
Uma das principais preocupações deste trabalho foi avaliar a qualidade do
sêmen dos cães experimentalmente infectados com L. interrogans sorovar
Canicola em relação àquela apresentada pelos animais utilizados como controle.
A coloração do ejaculado dos cães infectados e de controle nos quatro
grupos experimentais variou de branco-opalescente a branco-leitosa durante o
período de estudo, o que é considerada a coloração esperada para esse material.
O volume do ejaculado variou de 0,5 a 7 mL, valores normais e esperados de
31
acordo com o tamanho de cada animal. O aspecto de todos os ejaculados foi
seroso, ou seja, dentro do normal (ROOT e JOHNSTON, 1994).
Nas Tabelas 5 a 8 estão apresentados os resultados dos espermiogramas
dos quatro grupos experimentais, em que são comparados os valores das médias
para volume, turbilhonamento, motilidade, vigor e concentração, de cães
infectados (CI) e de controle (CC), de cada grupo, para verificar possível diferença
significativa entre esses valores, durante o período experimental.
No G1, (Tabela 5) nota-se a ausência de diferença significativa para os
parâmetros analisados durante os sete dias de infecção. Entretanto, para o G2
(Tabela 6), a variável espermática da motilidade foi significativamente maior nos
CC (p<0,01) aos quinze dias após a infecção. As médias de vigor para os CC
também foram superiores às dos CI nos dias três (p<0,05), cinco (p<0,05) e
quinze (p<0,01). As médias de concentração espermática dos CC foram
significativamente superiores nos dias três (p<0,01), cinco (p<0,01), sete (p<0,05),
dez (p<0,01) e quinze (p<0,05).
Na Tabela 7, observam-se os parâmetros seminais do G3, no qual somente
a concentração espermática revelou médias significativamente maiores para os
CC do que dos CI nos dias sete, dez (p<0,05) e quinze (p<0,01) do período
experimental. Já para o G4 (Tabela 8), no qual os animais permaneceram
infectados durante quarenta e cinco dias, observa-se que a média da motilidade
foi significativamente superior nos CC do que dos CI (p<0,05) no décimo quinto
dia de infecção.
32
Tabela 5. Média aritmética e erro padrão (EP) do volume (mL), do
turbilhonamento, da motilidade (%), do vigor (0 a 5) e da concentração
(x10
6
espermatozóides/mL) espermáticas de cinco cães infectados (CI) e
três cães de controle (CC) durante quatro avaliações num período de 7
dias, representando o Grupo G1 do presente experimento. Jaboticabal,
São Paulo, 2007.
Dias de coleta de materiais em relação ao dia da inoculação
Parâmetros
0 03 05 07
Média 4,2 10,7 2,5 2,3
Volume
CI
EP 1,6 7,3 0,7 0,3
CC
Média 2,5 3,6 4,1 2,8
EP 1 1,8 2,9 1,1
Média 4 3,6 3,4 3,8
Turbilhonamento
CI
EP 0,6 0,2 0,6 0,5
CC
Média 3 4 2 2,6
EP 0 1 1,1 0,3
Média 92,6 77 77 81,6
Motilidade
CI
EP 2,7 8 14,3 13,1
CC
Média 81,6 73,3 45 71,6
EP 10,9 21,6 27,5 10,9
Média 4,4 4,2 3,8 4,4
Vigor
CI
EP 0,4 0,3 0,7 0,6
CC
Média 3,3 4 2,3 3
EP 0,3 1 1,4 0,5
Média 543,8 317 340 307
Concentração
CI
EP 130,1 39,2 72,9 23,1
CC
Média 271,6 405 286,6 310
EP 18,5 45,3 154,5 25,6
33
Tabela 6. Média aritmética e erro padrão (EP) do volume (mL), do
turbilhonamento, da motilidade (%), do vigor (0 a 5) e da concentração
(x10
6
espermatozóides/mL) espermáticas de cinco cães infectados (CI) e
três cães de controle (CC) durante seis avaliações num período de 15
dias, representando o Grupo G2 do presente experimento. Jaboticabal,
São Paulo, 2007.
Dias de coleta de materiais em relação ao dia da inoculação
Parâmetros
0 03 05 07 10 15
Média 2,3 1,8 2,4 2,5 1,9 3
Volume
CI
EP 0,4 0,2 0,7 0,2 0,5 0,6
CC
Média 2 1,9 1,7 2 2,1 2,3
EP 0,2 0,06 0,2 0 0,1 0,3
Média 2,6 3 3,4 4,2 2,6 3,4
Turbilhonamento
CI
EP 0,6 0,3 0,2 0,3 0,6 0,2
CC
Média 3 3,6 3,6 3,3 3,6 4
EP 0 0,3 0,3 0,3 0,3 0,5
Média 68 61 83 80 60 63
Motilidade
CI
EP 16,3 13,1 3,7 5,7 15,7 4,8
CC
Média 91,6 90 91,6 83,3 90 90**
EP 1,6 0 1,6 6,6 0 0
Média 3,2 3,4 3,6 4,8 3,2 3,6
Vigor
CI
EP 0,6 0,5 0,2 0,2 0,9 0,2
CC
Média 3,6 5* 4,6* 4,6 4,6 5**
EP 0,3 0 0,3 0,3 0,3 0
Média 461 171 214 186 133 211
Concentração
CI
EP 187,1 48,2 51,5 44,4 59,8 74,6
CC
Média 441 521,6** 578,3** 426,6* 476,6** 553,3*
EP 70,8 32,1 88,5 63,5 14,5 63,5
* p < 0,05 ** p < 0,01
34
Tabela 7. Média aritmética e erro padrão (EP) do volume (mL), do
turbilhonamento, da motilidade (%), do vigor (0 a 5) e da concentração
(x10
6
espermatozóides/mL) espermáticas de cinco cães infectados (CI) e
três cães de controle (CC) durante nove avaliações num período de 30
dias, representando o Grupo G3 do presente experimento. Jaboticabal,
São Paulo, 2007.
Dias de coleta de materiais em relação ao dia da inoculação
Parâmetros
0 03 05 07 10 15 20 25 30
Média 2,8 2 2,1 1,8 2,3 1,9 2,2 1,9 1,7
Volume
CI
EP 0,2 0,2 0,2 0,2 0,4 0,3 0,4 0,3 0,2
CC
Média 2,3 2,3 2,1 2,3 2,3 2,1 2,1 2,1 2
EP 0,3 0,3 0,4 0,3 0,3 0,4 0,4 0,4 0,5
Média 4 4,2 4,2 4,2 4,2 4 4,4 4,2 4,2
Turb.
CI
EP 0,3 0,3 0,3 0,3 0,2 0,4 0,2 0,4 0,3
CC
Média 4,6 4,3 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 4,3 4,3
EP 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
Média 80 82 86 85 78 71 75 77 83
Motilidade
CI
EP 6,5 4 4,3 5,2 4,6 7,4 5 4,8 4,6
CC
Média 85 85 90 90 90 90 88,3 86,6 88,3
EP 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 1,6 1,6 1,6
Média 4,6 4,8 4,6 4,6 4,2 4,4 4,4 4,4 3,8
Vigor
CI
EP 0,2 0,2 0,4 0.4 0,3 0,4 0,2 0,4 0,2
CC
Média 5 5 5 5 4,3 5 5 5 4,6
EP 0 0 0 0 0,6 0 0 0 0,3
Média 335 394 326 247 320 262 458 457 523
Conc.
CI
EP 86,9 80,1 78,6 51,9 42,2 48,1 66 70,9 110,1
CC
Média 535 588.3 586,6 491,6* 546,6* 620** 661,6 693 556,6
EP 43,6 39,4 38,4 79,9 36,6 63,5 101,7 132,2 32,8
* p < 0,05 ** p < 0,01
35
Tabela 8. Média aritmética e erro padrão (EP) do volume (mL), do
turbilhonamento, da motilidade (%), do vigor (0 a 5) e da concentração
(x10
6
espermatozóides/mL) espermáticas de cinco cães infectados (CI) e
três cães de controle (CC) durante doze avaliações num período de 45
dias, representando o Grupo G4 do presente experimento. Jaboticabal,
São Paulo, 2007.
Dias de coleta de materiais em relação ao dia da inoculação
Parâmetros
0 03 05 07 10 15 20 25 30 35 40 45
Média 2,1 2,3 2,8 2,7 2,4 2,1 2,1 3,1 2,4 2,4 3 2,4
Vol.
CI
EP 0,1 0,2 0,4 0,3 0,2 0,1 0,2 0,2 0,1 0,1 0,6 0,2
CC
Média 2,1 2,6 3,6 2,2 3 1,7 3,2 3,2 2 1,7 1,7 2,2
EP 0,4 0,1 0,7 0,2 0,5 0,2 0,7 0,2 0,5 0,2 0,2 0,2
Média 3,8 3 4 4,4 3,6 3,4 3,8 3,8 3,6 4,2 4 3,4
Turb.
CI
EP 0,3 0 0,4 0,2 0,4 0,2 0,2 0,3 0,2 0,3 0,3 0,8
CC
Média 4 2,3 2,6 3,5 4 4 3,5 3 4 3 3 2
EP 0,5 1,2 1,3 0,5 0 0 0,5 0 0 1 1 2
Média 71,8 86 80,8 89,8 81 75 84 77 76 79 83 70
Mot.
CI
EP 8,4 2,9 6 3,3 5 4,4 6,2 4,6 9,1 4 3,7 12,7
CC
Média 81,6 50 60 77,5 90 90* 70 70 92 60 62 45
EP 6 25,1 30,1 7,5 0 0 20 5 2,5 15 17,5 35
Média 4,4 4,6 4,4 4,8 4,6 3,6 4,4 4,4 4 4,6 4,6 4,2
Vigor
CI
EP 0,2 0,2 0,4 0,2 0,2 0,2 0,2 0,4 0,3 0,2 0,2 0,5
CC
Média 4,3 2,3 3 4,5 5 4,5 4 3,5 4,5 4 4 2,5
EP 0,3 1,2 1,5 0,5 0 0,5 1 0,5 0,5 1 1 1,5
Média 285 377 197 202 248 353 518 426 302 329 297 280
Conc.
CI
EP 49,8 183 26,3 16,7 55,5 28,2 170 129 40 42,4 56 33,4
CC
Média 483 225 235 145 207 275 430 347 345 487 525 407
EP 122 148 118 20 12,5 10 350 47,5 35 127,5 75 12,5
* p < 0,05
36
Com relação aos parâmetros seminais de volume, turbilhonamento,
motilidade, vigor e concentração, as maiores diferenças foram observadas nos
grupos dois e três (Tabelas 6 e 7). No grupo dois, foi verificada uma queda
significativa nos valores do vigor e da concentração espermática, nos cães
infectados, durante grande parte do período de estudo. Já no grupo três, somente
a concentração foi significativamente inferior no grupo de animais infectados em
três dos nove dias de colheita de material. Esses dados concordam em parte com
os achados de KIKTENKO et al. (1976), que puderam observar que touros
infectados apresentaram inibição dos reflexos sexuais e perda na qualidade do
sêmen, com queda na concentração e na motilidade, diminuição do volume do
ejaculado e necrospermia. Porém no presente estudo não foi possível relacionar a
presença de infecção com diminuição do volume do ejaculado.
A análise das características morfopatológicas dos ejaculados dos animais
dos grupos experimentais G1, G2, G3 e G4 estão apresentadas, respectivamente,
nas Tabelas 9, 10, 11 e 12, em que foram comparados os valores das médias
para defeitos maiores, defeitos menores, defeitos totais e cabeças soltas normais,
de CI e CC, de cada grupo, para verificar possível diferença significativa entre
esses valores, durante o período experimental. A avaliação das cabeças soltas
normais foi incluída por representarem um indicativo de prostatite (JOHNSTON et
al., 2001), e essa alteração ter sido verificada nos exames macro (durante a
necropsia) e microscópicos (HE) dos animais e órgãos em questão.
Observa-se, na Tabela 9, que houve uma diferença significativa (p<0,05) no
número de cabeças isoladas entre o grupo infectado e o de controle no quinto dia
pós-inoculação. Porém, mesmo com essa diferença, as porcentagens totais de
defeitos maiores, menores e totais permaneceram dentro dos padrões
considerados normais (JOHNSTON et al., 2001).
37
Tabela 9. Média aritmética, expressa em porcentagem, dos defeitos maiores,
menores, totais e de cabeça isolada de cinco cães infectados (CI) e três
cães de controle (CC) durante quatro avaliações num período de sete
dias, representando o grupo experimental um (G1). Jaboticabal, São
Paulo, 2007.
Dias de coleta de sêmen com relação ao dia da inoculação
Parâmetros
0 03 05 07
Defeitos Maiores
CI 4,6 7,8 8,0 11,3
CC 5,3 9,1 6,8 8,8
Defeitos Menores
CI 2,0 5,6 5,4 4,4
CC 4,1 4,6 3,3 4,8
Total
CI 6,6 13,4 13,4 15,7
CC 9,5 13,8 10,1 13,6
Cabeça Isolada
CI 0,7 1,5 1,5* 0,9
CC 0,5 0,5 0,1 1,0
* p < 0,05
Para o grupo 2 (Tabela 10), foi observado que as variáveis analisadas
foram significativamente superiores nos animais infectados a partir do quinto dia
pós-inoculação, sendo essas diferenças significativas a 1% nos dias cinco e dez e
a 5% no dia sete para a variável defeitos maiores, a 1% nos dias cinco e dez para
defeitos menores, a 1% nos dias cinco e dez e a 5% nos dias sete e quinze para a
variável defeitos totais e a 1% para a variável cabeça isolada normal no décimo
dia pós-inoculação da cepa patogênica. Observa-se também que, a partir do dia
cinco, a porcentagem de defeitos maiores ficou fora dos padrões aceitáveis.
38
Tabela 10. Média aritmética dos defeitos maiores, menores, totais e de cabeça
isolada de cinco cães infectados (CI) e três cães de controle (CC)
durante seis avaliações num período de 15 dias, representando o grupo
experimental 2 (G2). Jaboticabal, São Paulo, 2007.
Dias de coleta de sêmen com relação ao dia da inoculação
Parâmetros
0 03 05 07 10 15
Defeitos Maiores
CI 10,5 8,8 12,5** 11,8* 16,6** 12,0
CC 4,5 4,1 5,3 5,8 7,6 7,1
Defeitos Menores
CI 4,9 3,9 6,2** 4,9 8,0** 5,1
CC 3,1 3,5 2,3 3,3 3,1 2,6
Total
CI 15,4 12,7 18,7** 16,9* 24,6** 17,1*
CC 7,6 7,6 7,6 9,1 10,8 9,8
Cabeça Isolada
CI 1,4 0,9 1,4 0,6 3,5** 1,0
CC 0,8 1,0 1,3 0 1,3 0,8
* p < 0,05 ** p < 0,01
Houve uma diferença significativamente superior, com probabilidade de
acerto de 95%, no número de defeitos maiores entre os animais infectados e os de
controle do grupo três nos dias cinco, 20, 25 e 30, e com probabilidade de acerto
de 99% no dia sete. Para a variação defeitos menores, foram significativamente
superiores no nível de 1% para as médias dos dias 15 e 30, e a 5% para a média
do dia 25. Embora neste grupo a variável defeitos totais tenha sido
significativamente maior nos animais infectados a partir do dia cinco, a
porcentagem de defeitos permaneceu dentro dos padrões em todos os dias.
Observou-se também que houve um maior número de espermatozóides com
cabeça isolada nos animais do grupo infectado que nos do grupo de controle a
partir do décimo quinto dia do experimento (Tabela 11).
39
Tabela 11. Média aritmética dos defeitos maiores, menores, totais e de cabeça
isolada de cinco cães infectados (CI) e três cães de controle (CC)
durante nove avaliações num período de 30 dias, representando o grupo
experimental 3 (G3). Jaboticabal, São Paulo, 2007.
Dias de coleta de sêmen com relação ao dia da inoculação
Parâmetros
0 03 05 07 10 15 20 25 30
Defeitos Maiores
CI 12,0 7,3 9,0* 10,2** 6,3 7,5 8,9* 8,8* 9,1*
CC 6,0 5,1 5,6 6,1 5,5 6,5 5,5 6,0 5,6
Defeitos Menores
CI 4,7 3,3 4,3 4,7 3,3 7,8** 6,4 6,9* 7,5**
CC 1,8 2,3 2,6 3,3 4,5 3,8 4,0 3,1 3,3
Total
CI 16,7 10,6 13,3* 14,9** 9,6 15,3* 15,3** 15,7** 16,6**
CC 7,8 7,5 8,3 9,5 10,0 10,3 9,5 8,8 9,0
Cabeça Isolada
CI 1,1 0,8 0,8 1,2 0,4 2,8** 3,0* 3,4** 3,0*
CC 1,0 1,0 0,6 1,3 1,1 0,5 1,3 0,6 1,3
* p < 0,05 ** p < 0,01
No grupo de experimento 4 (Tabela 12), ocorreu uma inversão dos dados
que vinham sendo obtidos e esperados, e nos animais do grupo de controle houve
um maior número de defeitos, com porcentagens fora dos padrões nos animais de
controle, o que pode ter ocorrido pelo fato de os animais de controle neste grupo
terem apresentado problemas durante a coleta de sêmen. Porém observa-se que
o número de patologias desses animais volta a um padrão estável após o
trigésimo dia de experimento, ou após oito coletas. Essa volta aos padrões
normais mostra que as diferenças observadas não apresentavam relação com a
proposta do experimento, e esse fator inerente acabou por mascarrar e até
mesmo prejudicar a análise.
40
Tabela 12. Média aritmética dos defeitos maiores, menores, totais e de cabeça
isolada de cinco cães infectados (CI) e três cães de controle (CC)
durante doze avaliações num período de 45 dias, representando o grupo
experimental 4 (G4). Jaboticabal, São Paulo, 2007.
Dias de coleta de sêmen com relação ao dia da inoculação
Parâmetros
0 03 05 07 10 15 20 25 30 35 40 45
Defeitos
Maiores
CI 10,4 12,2 8,1 7,0 7,3 6,4 6,7 7,9 4,7 9,5 7,7 8,0
CC 17,6 13,3 9,8 11,6* 9,1 12,3** 10,8 12,3* 8,8 8,6 9,3 10,8
Defeitos
Menores
CI 4,5 9,8 5,8 7,2 6,6 6,6 6,0 7,6 6,8 10,6 9,0 9,6
CC 10,5 7,8 8,9 5,9 8,4 12,9** 18,9** 13,4* 7,6 9,4 9,6 8,9
Total
CI 14,9 22,0 13,9 14,2 13,9 13,0 12,7 15,5 11,5 20,1 16,7 17,6
CC 28,1 21,1 18,7 17,5 17,5 25,2** 29,7** 25,7** 16,5 18,0 19,0 19,7
Cabeça
Isolada
CI 2,4 4,9* 3,3 4,7 4,1 2,9 3,0 4,7 3,4 5,7 5,1 4,8
CC 2,8 2,1 2,8 2,8 5,1 6,8* 8,1** 6,8 2,6 4,8 4,1 3,6
* p < 0,05 ** p < 0,01
Não foram encontrados outros trabalhos que tratassem das alterações do
exame andrológico ou morfológico do sêmen de cães infectados (naturalmente ou
experimentalmente) com leptospiras para comparação com estes resultados,
porém, pelo exposto, mostra-se que há indícios de prejuízos na qualidade desse
material em cães expostos às leptospiras.
Devido às falhas da SAM e à dificuldade do cultivo de Leptospira spp. para
o isolamento a partir de diversos materiais (BOLIN et al., 1989), a PCR passa a
ser uma nova opção de diagnóstico, por ser considerada rápida e extremamente
sensível, podendo teoricamente detectar uma única molécula de DNA em poucas
horas (GILLESPIE, 1990).
No presente trabalho, utilizou-se a PCR na investigação de leptospiras em:
testículos, epidídimos, próstatas, rim, fígado, urina e sêmen de cães infectados
experimentalmente. Para tanto, preferiu-se utilizar os oligonucleotídeos iniciadores
Lep 1 e Lep 2, sintetizados por MÉRIEN et al. (1992) a partir da seqüência do
41
gene 16S rRNA de Leptospira interrogans sorovar Canicola determinada por
FUKUNAGA et al. (1990), devido ao fato de esses “primers” serem gênero-
específicos e permitirem a amplificação de vários sorovares de leptospiras
apatogênicas e patogênicas (HEINEMANN, 1995).
Pela técnica de PCR, não foi observado resultado positivo em nenhum dos
órgãos avaliados. No entanto, pela mesma técnica, foram obtidos resultados
promissores na análise de urina e sêmen. Nas Tabelas 13, 14, 15 e 16 estão
demonstrados, respectivamente, os resultados da PCR para as amostras de
sêmen e urina dos cães infectados com a cepa LO4 de Leptospira interrogans
sorovar Canicola, para os quatro grupos experimentais. A PCR foi negativa para
todos os animais utilizados como controle.
É possível observar, na Tabela 13, que nos cinco cães infectados e
sacrificados após sete dias (G1), foi detectado DNA de leptospiras no sêmen de
um animal (G1A2) no terceiro, quinto e sétimo dias após a inoculação da bactéria.
Entretanto não se detectou material genético de leptospira em nenhuma das
amostras de urina desses animais, resultado que aponta a possibilidade das
leptospiras estarem presentes no sêmen mesmo antes de sua eliminação pela
urina, confirmando a teoria de Kiktenko et al. (1976) de que o sêmen poderia ser
contaminado desde sua produção e não só durante a passagem pela uretra, ducto
excretor comum para urina e sêmen, como propuseram Sleight e Williams (1961).
42
Tabela 13. Resultado da PCR em amostras de sêmen e urina de cinco cães
infectados experimentalmente com a cepa LO4 de Leptospira
interrogans sorovar Canicola durante quatro avaliações num período de
sete dias, representando o Grupo G1 do presente experimento.
Jaboticabal, São Paulo, 2007.
Dias de coleta de materiais em relação ao dia da inoculação
0 03 05 07
ANIMAIS
S U S U S U S U
G1A1 N N N N N N N N
G1A2 N N P N P N P N
G1A3 N N N N N N N N
G1A4 N N N N N N N N
G1A5 N N N N N N N N
G1: grupo 1, A: animal infectado S: sêmen U: urina N: negativo P: positivo
Tabela 14. Resultado da PCR em amostras de sêmen e urina de cinco cães
infectados experimentalmente com a cepa LO4 de Leptospira
interrogans sorovar Canicola durante seis avaliações num período de 15
dias, representando o Grupo G2 do presente experimento. Jaboticabal,
São Paulo, 2007.
Dias de coleta de materiais em relação ao dia da inoculação
0 03 05 07 10 15
ANIMAIS
S U S U S U S U S U S U
G2A1 N N N N N N N N N N P N
G2A2 N N N N N N P N P P P P
G2A3 N N N N N N N N N N P P
G2A4 N N P N P N N N N N N N
G2A5
N N P N N N N N N N P P
G2: grupo 2, A: animal infectado S: sêmen U: urina N: negativo P: positivo
43
Para o G2 (Tabela 14), por intermédio da PCR detectou-se DNA bacteriano
no sêmen de todos os animais inoculados, sendo aos quinze dias após a
inoculação para o animal 1 (G2A1), nos dias sete, dez e quinze para o animal 2
(G2A2), no décimo quinto dia para o animal 3 (G2A3), nos dias três e cinco para o
animal 4 (G2A4) e nos dias três e quinze para o cão infectado de número 5
(G2A5). Na urina, pela mesma técnica, nos mesmos animais, só foi possível a
detecção de leptospiras em três animais (G2A2, A3 e A5) e ainda assim apenas a
partir do décimo dia em um animal (G2A2), que já apresentava leptospiras no
sêmen a partir do dia sete pós-inoculação, e no décimo quinto dia nos animais
G2A2, A3 e A5.
Os resultados da PCR dos animais do G3 (Tabela 15) explicitam que foi
possível detectar DNA nas amostras de sêmen e urina de todos os animais
infectados com leptospira. No animal 1 (G3A1), foi detectado DNA da bactéria no
sêmen nos dias cinco, sete e quinze e na urina nos dias sete e 15. No sêmen e na
urina do animal 2 (G3A2), havia leptospiras desde o sétimo até o vigésimo quinto
dia de coleta. Nos dias três, cinco e sete, no sêmen do animal 3 (G3A3), o qual
apresentou resultado positivo na urina apenas no dia três. No sêmen, ainda
obteve-se PCR positivo no terceiro, quinto, décimo, 25º e 30º dias no animal 4
(G3A4) e nos dias cinco e dez, após a inoculação bacteriana, no animal 5 (G3A5).
As amostras de urina do quarto animal do grupo 3 foram positivas na PCR nos
dias dez, vinte e cinco e trinta e apenas no dia dez para o quinto cão.
44
Tabela 15. Resultado da PCR em amostras de sêmen e urina de cinco cães
infectados experimentalmente com a cepa LO4 de Leptospira
interrogans sorovar Canicola durante nove avaliações num período de
30 dias, representando o Grupo G3 do presente experimento.
Jaboticabal, São Paulo, 2007.
Dias de coleta de materiais em relação ao dia da inoculação
0 03 05 07 10 15 20 25 30
ANIMAIS
S U S U S U S U S U S U S U S U S U
G3A1 N N N N P N P P N N P P N N N N N N
G3A2 N N N N N N P P P P P P P P P P N N
G3A3
N N P N P N P P N N N N N N N N N N
G3A4
N N P N P N N N P P N N N N P P P P
G3A5 N N N N P N N N P P N N N N N N N N
G3: grupo 3, A: animal infectado S: sêmen U: urina N: negativo P: positivo
Podem-se observar na Tabela 16 os resultados da PCR no sêmen e na
urina dos cinco animais infectados do G4. Foi possível detectar DNA de leptospira
nas amostras de todos os cães inoculados. Para o animal 1 (G4A1), os resultados
da PCR foram positivos nos dias sete, quinze, vinte, vinte e cinco e trinta de
coleta. Nos dias três e do sétimo ao 45º, todas as amostras de sêmen foram
positivas para o animal 2 (G4A2), na urina a partir do décimo dia. Nos dias dez,
quinze, vinte e quarenta, as amostras de sêmen e urina do animal 3 (G4A3) foram
positivas, e no dia três apenas a amostra de sêmen. Para o animal 4 (G4A4), as
amostras de urina foram positivas nos dias sete, dez, vinte, vinte e cinco, trinta e
cinco e quarenta de inoculação, e as de sêmen, além de positivas nesses dias,
foram também positivas nos dias três e cinco. Já o animal número 5 (G4A5)
apresentou amostras de sêmen e urina positivas à PCR nos dias sete e vinte e
cinco pós-infecção.
45
Tabela 16. Resultado da PCR em amostras de sêmen e urina de cinco cães
infectados experimentalmente com a cepa LO4 de Leptospira
interrogans sorovar Canicola durante doze avaliações num período de
45 dias, representando o Grupo G4 do presente experimento.
Jaboticabal, São Paulo, 2007.
Dias de coleta de materiais em relação ao dia da inoculação
0 03 05 07 10 15 20 25 30 35 40 45
ANIMAIS
S U S U S U S U S U S U S U S U S U S U S U S U
G4A1 N N N N N N P P N N P P P P P P P P N N N N N N
G4A2 N N P N N N P N P P P P P P P P P P P P P P P P
G4A3 N N P N N N N N P P P P P P N N N N N N P P N N
G4A4
N N P N P N P P P P N N P P P P N N P P P P N N
G4A5
N N N N N N P P N N N N N N P P N N N N N N N N
G4: grupo 4, A: animal infectado S: sêmen U: urina N: negativo P: positivo
Neste trabalho, foi possível detectar DNA de leptospira no sêmen de
dezesseis dos vinte cães inoculados com a cepa de L. interrogans sorovar
Canicola. Esse resultado concorda com os de vários outros autores que relatam
sucesso na detecção de Leptospira spp. pela PCR em sêmen de touros
(HEINEMANN, 1995; MASRI et al., 1997; HEINEMANN et al., 2000) e sêmen
canino experimentalmente infectado (KIM et al., 2006). Impressões contrárias
foram descitras por MAGAJEVSKI et al. (2005), que, estudando amostras
pareadas de sêmen e urina de 10 touros naturalmente infectados com L.
interrogans sorovar Hardjo, detectaram DNA de leptospira em apenas uma
amostra de urina e em nenhuma das amostras de sêmen.
KEE et al. (1994) puderam detectar L. interrogans no sangue de sagüi
(Merionis unguiculatus) dois dias após a infecção experimental, enquanto
anticorpos só foram detectados pela SAM sete dias pós-infecção. No presente
estudo, em oito dos dezesseis animais nos quais se detectou DNA de leptospira
por PCR no sêmen, a amostra mostrou-se positiva no terceiro dia pós-infecção, e
cinco dos oito cães não apresentavam títulos de anticorpos detectáveis na prova
46
de SAM nesse período. Esses resultados concordam com os achados de HARKIN
et al. (2003a), que consideram a PCR uma arma no diagnóstico precoce da
leptospirose.
O limiar de detecção de leptospiras pela técnica de PCR em sêmen canino
experimentalmente contaminado utilizada no presente estudo foi de 10 bactérias
por mL de sêmen. Resultados semelhantes foram obtidos por HEINEMANN et al.
(2000) e MÉRIEN et al. (1992) em sêmen bovino. Entretando KIM et al.(2006), em
contaminação experimental de sêmen canino com Leptospira interrogans,
conseguiram um limiar de detecção de 1.000 bactérias por mL de sêmen
utilizando a PCR convencional. Os mesmos autores, após submeter o material a
uma nested PCR, atingiram um limiar de detecção de 100 bactérias por mL de
sêmen.
VELOSO et al. (2000) relataram que o procedimento de extração do DNA
do material que se deseja avaliar e o “primer” utilizado podem propiciar diferentes
resultados na técnica de PCR.
A título de ilustração dos resultados de PCR, foram incluídas as figuras 1, 2
e 3, que mostram respectivamente: o resultado da PCR da amostra de sêmen do
cão G1A2 (Figura 1). Nela percebe-se que foi possível detectar DNA de leptospira
nas amostras de sêmen coletadas nos dias três, cinco e sete do referido animal; a
Figura 2 ilustra o resultado da PCR na amostra de sêmen do cão G4A2 (Grupo 4,
animal infectado 2), em que se observa que somente as amostras coletadas nos
dias zero e cinco do período experimental foram negativas; e o limiar de detecção
de Leptospira interrogans sorovar Canicola, por PCR, a partir do DNA extraído
com isotiocianato de guanidina, da amostra de sêmen pura (sem diluição) e
experimentalmente contaminada, está apresentado na Figura 3.
47
Figura 1. Resultado da PCR em amostra de sêmen do cão G1A2 (Grupo 1, animal
infectado dois). L) Padrão de peso molecular em escala ascendente de
100 pb; 1) dia zero; 2) dia três; 3) dia cinco; 4) dia sete; N) controle
negativo do processo de extração do DNA; A) controle negativo da PCR;
CP (controle positivo). Jaboticabal, São Paulo, 2007.
Figura 2. Resultado da PCR em amostra de sêmen do cão G4A2 (Grupo 4, animal
infectado dois). L) Padrão de peso molecular em escala ascendente de
100 pb; 1) dia zero; 2) dia três; 3) dia cinco; 4) dia sete; 5) dia dez; 6) dia
quinze; 7) dia vinte; 8) dia vinte e cinco; 9) dia trinta; 10) dia trinta e
cinco; 11) dia quarenta; 12) dia quarenta e cinco; N) controle negativo do
processo de extração do DNA; A) controle negativo da PCR; CP
(controle positivo). Jaboticabal, São Paulo, 2007.
48
Figura 3. Limiar de detecção de Leptospira interrogans sorovar Canicola por PCR,
a partir do DNA obtido pela técnica de extração com isotiocianato de
guanidina, de amostras de sêmen canino experimentalmente
contaminado. 1) Cultura pura com 10
8
leptospiras por mL; 2) Sêmen com
10
7
leptospiras por mL; 3) Sêmen com 10
6
leptospiras por mL; 4) Sêmen
com 10
5
leptospiras por mL; 5) Sêmen com 10
4
leptospiras por mL; 6)
Sêmen com 10
3
leptospiras por mL; 7) Sêmen com 10
2
leptospiras por
mL; 8) Sêmen com 10
1
leptospiras por mL; 9) Sêmen com 10
0
leptospiras por mL; 10) controle negativo da PCR. Jaboticabal, São
Paulo, 2007.
Na avaliação histopatológica dos órgãos estudados (rim, fígado, próstata,
epidídimo e testículo), foram observadas alterações apenas nas próstatas dos
cinco animais infectados do grupo 4 com forte indício de prostatite (Figura 4). Pela
técnica de Levaditi, apenas em um corte histológico do fígado do animal G3A5 do
grupo 3, ou seja, sacrificado 30 dias após a inoculação da cepa patogênica de
Leptospira interrogans sorovar Canicola, foi encontrada leptospira (Figura 5).
49
Figura 4: Fotomicrografia de corte histológico da próstata do animal
infectado G4A3, utilizando a técnica de coloração Hematoxilina e
Eosina, mostrando a presença de prostatite, evidenciada através
de células de inflamação infiltrativas. Aumento de 100x.
A eficácia da técnica de Levaditi em revelar a presença das leptospiras em
órgãos como fígado e rins já foi mencionada por autores como FAINE (1982) e
ZAMORA (1995), os quais verificaram que a coloração pelos sais de prata
possibilita uma melhor visualização das leptospiras na estrutura dos órgãos.
Embora diversos autores (BRANDESPIM et al., 2003; CAMARGO et al.,
1993; CAMARGO, 1996) considerem a técnica de Levaditi eficaz no diagnóstico
de leptospirose. em órgãos do aparelho reprodutor de machos e fêmeas, no
presente estudo não foi possível detectar leptospiras nos fragmentos de testículos,
50
próstata e epidídimo dos cães experimentalmente infectados por Leptospira
interrogans sorovar Canicola pelo período de 45 dias.
Figura 5. Fotomicrografia de corte histológico do fígado de animal infectado
utilizando a técnica de coloração Levaditi, mostrando a presença
de leptospiras. Aumento de 400x.
A análise comparativa dos valores das médias referentes ao hemograma e
aos parâmetros bioquímicos do sangue dos cães infectados (CI) e de controle
(CC), de cada grupo, para verificar possíveis diferenças significativas entre esses
valores, durante o período experimental está demonstrada nas tabelas 18 a 20.
Em nenhum dos animais foi observada a presença de hemoparasitas. Embora
tenham sido analisados 13 parâmetros do hemograma (hemácias, leucócitos,
51
hematócrito, hemoglobina, basófilos, eosinófilos, neutrófilos segmentados,
neutrófilos bastonetes, linfócitos, monócitos, plaquetas, VCM e CHCM) e oito da
série bioquímica do sangue (uréia, creatinina, fosfatase alcalina, ALT, colesterol,
albumina, glicose, cálcio), apenas foram observadas alterações significativas, ou
seja, valores fora dos padrões normais, nos valores de hemácias, leucócitos,
neutrófilos segmentados, linfócitos, plaquetas, uréia, fosfatase alcalina e cálcio,
sendo as médias dos valores desses parâmetros apresentadas nas tabelas a
seguir.
Observa-se, na tabela 18, que houve diferença significativa (<0,01) maior
para os animais infectados apenas na média de neutrófilos segmentados no quinto
dia pós-infecção no G1. Embora o aumento de neutrófilos segmentados seja uma
alteração esperada em animais com leptospirose, esse valor ainda estava dentro
dos padrões (SILVEIRA, 1996). Para o G2 do experimento, a única variável a
apresentar uma alteração significativamente (p<0,05) maior para os animais
infectados foi o cálcio, no décimo dia de experimento (Tabela 19).
52
Tabela 17. Média aritmética do número de hemácias, leucócitos, neutrófilos
segmentados, linfócitos, plaquetas e da concentração de uréia, fosfatase
alcalina, albumina e cálcio de cinco cães infectados (CI) e três cães de
controle (CC) durante quatro avaliações num período de sete dias,
representando o grupo experimental 1 (G1). Jaboticabal, São Paulo,
2007.
Dias de coleta de sangue com relação ao dia da inoculação
Parâmetros
0 03 05 07
CI 6152 6194 5876 6014
Hemácias (10³/mm³)
CC 6566 6376 6013 6446*
CI 11060 9080 8500 9020
Leucócitos (/mm³)
CC 12300 11200 101200 8966
CI 71 67
75**
70
Neutrófilos segmentados
(%)
CC 68 66 58 61
CI 17 23 16 19
Linfócitos (%)
CC 19 19 27* 25
CI 179 239 201 229
Plaquetas (10³/mm³)
CC 179 258 178 233
CI 50 27 29 32
Uréia (mg/dL)
CC 45 24 33 35
CI 82 177 106 107
Fosfatase alcalina
(u/L)
CC 112 150 142 136
CI 3 2,6 2,7 2,8
Albumina (g/dL)
CC 2,3 2,4 2,8 2,7
CI 8,9 16,7 11,3 14,1
Cálcio (mg/dL)
CC 9,2 13,5 12,6 13,4
* p < 0,05 ** p < 0,01
53
Tabela 18. Média aritmética do número de hemácias, leucócitos, neutrófilos
segmentados, linfócitos, plaquetas e da concentração de uréia, fosfatase
alcalina, albumina e cálcio de cinco cães infectados (CI) e três cães de
controle (CC) durante seis avaliações num período de 15 dias,
representando o grupo experimental 2 (G2). Jaboticabal, São Paulo,
2007.
Dias de coleta de sêmen com relação ao dia da inoculação
Parâmetros
0 03 05 07 10 15
CI 6464 6960 6906 6526 6612 6936
Hemácias (10³/mm³)
CC 7106 7026 7053 6783 6830 6863
CI 9240 9300 14000 9900 10040 12440
Leucócitos (/mm³)
CC 9466 9666 9833 9500 9500 9866
CI 67 65 75 62 61 70
Neutrófilos segmentados
(%)
CC 70 68 71 71 72 68
CI 14 22 14 20 21 17
Linfócitos (%)
CC 21 24 21* 20 20 21
CI 147 158 164 169 211 237
Plaquetas (10³/mm³)
CC 210 268 209 212 211 222
CI 28 31 26 27 22 40
Uréia (mg/dL)
CC 34 38 39 35 28 38
CI 139 40 130 114 121 94
Fosfatase alcalina
(u/L)
CC 100 108 101 96 91 93
CI 2,5 2,6 2,5 2,4 2,2 2,8
Albumina (g/dL)
CC 2,9 2,6 2,9 2,8 2,7 2,7
CI 6,6 10,3 11,6 11,6 14,1* 13,6
Cálcio (mg/dL)
CC 10,3 9,4 11,3 9,9 10,1 11,5
* p < 0,05
54
Já no G3, observaram-se algumas alterações mais relevantes, como uma
diferença significativamente maior (p<0,01) na média do número de hemácias nos
cães de controle a partir do dia três até o dia do sacrifício dos animais desse
grupo, ou seja, dia 30. Também houve uma diferença significativamente maior
(p<0,01) na média do número de leucócitos nos animais infectados em relação
aos controles nos dias três a dez e com p<0,05 no dia quinze, a média de
linfócitos também foi significativamente maior nos animais controles nos dias 20 a
30, as plaquetas nos dias sete e dez. Esses resultados eram os esperados para
os cães com leptospirose (SILVEIRA, 1996). Para a fosfatase alcalina, as médias
dos dias três ao vinte foram significativamente maiores nos animais infectados que
nos de controle. Esse aumento de fosfatase alcalina pode estar indicando uma
alteração hepática do tipo obstrução biliar (JORGE, 2008) (Tabela 20).
No G4, não houve diferença significativa para a variável hemácia, mas
observou-se que em vários dias os números de leucócitos, neutrófilos
segmentados e plaquetas estavam significativamente maiores nos animais
infectados em relação aos de controle, e o número de linfócitos estava
significativamente maior nos animais de controle. No 45º dia pós-inoculação, a
média dos valores de uréia estava significativamente maior (p<0,01) nos animais
infectados, e no dia três a média dos valores da fosfatase alcalina estava
significativamente maior (p<0,01) nos animais infectados (Tabela 21).
55
Tabela 19. Média aritmética do número de hemácias, leucócitos, neutrófilos
segmentados, linfócitos, plaquetas e da concentração de uréia, fosfatase
alcalina, albumina e cálcio de cinco cães infectados (CI) e três cães de
controle (CC) durante nove avaliações num período de 30 dias,
representando o grupo experimental 3 (G3). Jaboticabal, São Paulo,
2007.
Dias de coleta de sêmen com relação ao dia da inoculação
Parâmetros
0 03 05 07 10 15 20 25 30
CI 7378 7052 6566 6732 6736 6940 6900 6986 7092
Hemácias
(10³/mm³)
CC 8163 8063** 7926** 7943** 7923** 7930** 8050** 7773** 7980**
CI 20220 34800** 20660** 17340** 17740** 16240* 14300 13500 13640
Leucócitos
(/mm³)
CC 11600 11500 12166 11233 11733 11000 10966 12066 11266
CI 62 79 64 64 68 66 55 52 55
Neutrófilos
segmentados
(%)
CC 68 70 68 71 69 68 69 65 69
CI 22 10 18 16 19 22 25* 27** 27**
Linfócitos
(%)
CC 17 16 17 16 16 18 17 17 15
CI 285 248 255 300** 269** 245 237 228 265
Plaquetas
(10³/mm³)
CC 227 231 223 226 231 222 228 223 230
CI 56 19 20 32 24 16 13 29 42
Uréia
(mg/dL)
CC 55 54 44 48 45 46 39 44 47
CI 122 194** 154** 143** 135* 153** 140* 116 126
Fosfatase
alcalina
(u/L)
CC 84 87 82 83 86 81 85 80 88
CI 3,3 3,0 3,3 2,7 2,7 3,1 2,8 2,0 3,0
Albumina
(g/dL)
CC 3,1 3,2 3,2 3,0 2,7 3,1 3,0 3,0 3,0
CI 11,7 13,1 8,8 11,0 6,7 10,1 9,7 10,1 10,0
Cálcio
(mg/dL)
CC 10,4 11,6 10,6 12,5 10,1 10,8 10,4 10,7 10,5
* p < 0,05 ** p < 0,01
56
Tabela 20. Média aritmética do número de hemácias, leucócitos, neutrófilos
segmentados, linfócitos, plaquetas e da concentração de uréia, fosfatase
alcalina, albumina e cálcio de cinco cães infectados (CI) e três cães de
controle (CC) durante doze avaliações num período de 45 dias,
representando o grupo experimental 4 (G4). Jaboticabal, São Paulo,
2007.
Dias de coleta de sangue com relação ao dia da inoculação
Parâmetros
0 03 05 07 10 15 20 25 30 35 40 45
CI 6418 6306 6256 5768 5742 6132 6194 6168 6088 6098 6042 6030
Hemácias
(10³/mm³)
CC 6483 6336 6650 6175 5990 6165 6395 6360 6420 6132 6005 6185
CI 10680
14440
**
10420
10880
*
12140
*
12360
**
10300
9820
*
10020 9380
9940
*
9080
Leucócitos
(/mm³)
CC 6166 5700 6700 5922 5772 5872 5672 4722 5672 5872 4872 5372
CI 70 75 68 72 76 76* 75* 70* 64 66 67 61
Neutrófilos
segmentados
(%)
CC 65 71 62 68 70 62 61 55 63 66 62 66
CI 13 9 14 16 12 12 10 16 17 19 17 21
Linfócitos
(%)
CC 24 13 24* 20 17 22* 26** 27* 19 18 22 21
CI 322 284** 292** 370** 356** 358** 353** 312** 292** 266* 252* 240*
Plaquetas
(10³/mm³)
CC 88 81 90 88 83 124 123 124 119 147 144 118
CI 35 34 33 34 25 39 52 43 42 51 35 51**
Uréia
(mg/dL)
CC 35 34 34 23 29 38 43 32 40 40 35 27
CI 57 152** 111 121 101 44 15 29 49 25 38 21
Fosfatase
alcalina
(u/L)
CC 35 73 98 75 80 54 28 25 64 37 55 36
CI 2,7 2,1 2,7 2,6 2,8 4,8 3,6 4,1 5,7 2,9 3,0 2,5
Albumina
(g/dL)
CC 2,5 1,8 2,4 2,9 3,1 4,8 3,5 3,6 5,8 3,2 3,2 2,3
CI 9,9 9,8 12,0 14,9 11,7 12,0 9,6 11,1 12,0 10,0 9,2 9,9
Cálcio
(mg/dL)
CC 10,3 10,1 12,8 17,4 11,5 10,7 9,1 10,2 11,2 10,0 8,9 8,6
* p < 0,05 ** p < 0,01
57
Em relação aos parâmetros físicos, bioquímicos e sedimentares da urina
dos animais de controle e infectados, não foram observadas alterações quanto ao
padrão normal para a espécie.
Quanto às características clínicas e aos parâmetros fisiológicos dos animais
estudados, observou-se que nenhum animal apresentou alterações na coloração
das mucosas, apatia, hemoglobinúria, uremia, glossite ou estomatite. Embora no
grupo 2 tenha sido observada uma alteração significativamente maior na
freqüência respiratória dos animais infectados em relação aos de controle, essa
diferença pode ser atribuída a uma variação individual de um dos animais do
grupo (Tabela 23). A comparação da média aritmética dos parâmetros físicos
temperatura, freqüência cardíaca, freqüência respiratória e massa corpórea entre
os animais infectados e os de controle está representada nas Tabelas 22 a 25.
Tabela 21. Média aritmética da temperatura, freqüência cardíaca, freqüência
respiratória e massa (Kg) de cinco cães infectados (CI) e três cães de
controle (CC) durante quatro avaliações num período de sete dias,
representando o grupo experimental 1 (G1). Jaboticabal, São Paulo,
2007
Dias de coleta de sangue com relação ao dia da inoculação
Parâmetros
0 03 05 07
CI 39,0 38,6 38,7 38,8
Temperatura (ºC)
CC 38,5 38,6 38,9 39,4
CI 147 119 106 97
Freqüência cardíaca
(/minuto)
CC 115 92 88 88
CI 48 47 38 40
Freqüência respiratória
(/minuto)
CC 41 41 41 41
CI 11,3 11,1 10,9 11,3
Massa (Kg)
CC 10,7 10,6 10,5 10,7
58
Tabela 22. Média aritmética da temperatura, freqüência cardíaca, freqüência
respiratória e massa (Kg) de cinco cães infectados (CI) e três cães de
controle (CC) durante seis avaliações num período de 15 dias,
representando o grupo experimental 2 (G2). Jaboticabal, São Paulo,
2007.
Dias de coleta de sêmen com relação ao dia da inoculação
Parâmetros
0 03 05 07 10 15
CI 38,9 38,8 39,0 39,0 39,1 39,3
Temperatura (ºC)
CC 38,4 38,8 38,9 39,5 39,5 39,1
CI 100 96 92 86 88 90
Freqüência cardíaca
(/minuto)
CC 101 99 85 84 91 88
CI 63 63** 59** 55 52* 59*
Freqüência respiratória
(/minuto)
CC 42 44 39 46 40 47
CI 17,4 17,0 17,1 17,2 17,4 17,4
Massa (Kg)
CC 8,9 8,7 8,6 8,9 8,9 8,9
* p < 0,05 ** p < 0,01
Tabela 23. Média aritmética da temperatura, freqüência cardíaca, freqüência
respiratória e massa (Kg) de cinco cães infectados (CI) e três cães de
controle (CC) durante nove avaliações num período de 30 dias,
representando o grupo experimental 3 (G3). Jaboticabal, São Paulo,
2007.
Dias de coleta de sêmen com relação ao dia da inoculação
Parâmetros
0 03 05 07 10 15 20 25 30
CI 38,9 38,9 38,6 39,1 38,8 39,0 38,9 39,0 39,1
Temperatura (ºC)
CC 38,2 39,0 39,1 39,4 39,7 39,3 38,6 38,9 38,9
CI 80 89 84 82 84 89 92 93 94
Freqüência cardíaca
(/minuto)
CC 94 99 85 99 99 103 101 96 96
CI 56 65 57 57 60 72 63 60 70
Freqüência respiratória
(/minuto)
CC 72 65 59 67 64 71 63 64 69
CI 9,6 9,4 9,3 9,2 9,2 9,3 9,4 9,6 9,5
Massa (Kg)
CC 12,7 12,6 12,6 12,8 12,9 13,1 13,0 12,8 12,9
59
Tabela 24. Média aritmética da temperatura, freqüência cardíaca, freqüência
respiratória e massa (Kg) de cinco cães infectados (CI) e três cães de
controle (CC) durante doze avaliações num período de 45 dias,
representando o grupo experimental 4 (G4). Jaboticabal, São Paulo,
2007.
Dias de coleta de sangue com relação ao dia da inoculação
Parâmetros
0 03 05 07 10 15 20 25 30 35 40 45
CI 38,4 38,8 38,5 39,1 38,9 39,0 38,8 39,1 38,8 38,8 38,8 38,7
Temperatura
(ºC)
CC 39,3 39,5 39,4 38,7 39,2 38,5 39,2 38,5 38,6 38,9 38,9 39,1
CI 101 91 87 88 90 93 94 88 93 89 92 95
Freqüência
cardíaca
(/minuto)
CC 98 92 96 92 90 88 93 87 89 89 91 91
CI 73 64 63 58 55 62 61 58 60 56 56 60
Freqüência
respiratória
(/minuto)
CC 76 70 72 70 73 70 72 71 70 74 75 74
CI 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 7,6 7,8 7,7 7,9 7,9 7,9 7,8
Massa (Kg)
CC 10,3 10,2 10,2 10,2 10,3 10,4 10,5 10,5 10,6 10,5 10,6 10,5
Nenhum dos cães infectados veio a óbito em decorrência da infecção por
leptospira, porém esses animais continuavam a eliminar bactérias para o meio
ambiente, o que demonstra a importância do cão doméstico na cadeia
epidemiológica da leptospirose urbana, assim como observado por
VASCONCELLOS (1987) e FAINE et al.(1999).
60
6. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos e analisados, a partir da infecção experimental com
Leptospira interrogans sorovar Canicola, nas condições em que o presente estudo
foi realizado e segundo a metodologia empregada, possibilitaram as seguintes
conclusões.
1. Foi possível detectar material genético de leptospiras, pela técnica de PCR,
em sêmen de cães experimentalmente infectados a partir do terceiro dia da
inoculação, quando os títulos sorológicos pela prova de SAM ainda eram
muito baixos ou mesmo inexistentes; e na urina iniciou-se a partir do sétimo
dia pós-inoculação, quando os títulos sorológicos pela SAM já estavam
sendo registrados e na sua maior parte acima de 100, sugerindo que a
eliminação de leptospiras no sêmen canino pode iniciar-se anteriormente à
leptospirúria.
2. Cães experimentalmente infectados com leptospiras mostram declínio da
motilidade, do vigor e da concentração espermática, podendo apresentar
um aumento na porcentagem de espermatozóides com defeitos, como
observado no grupo 2 deste experimento, em que, nos dias cinco, sete, dez
e quinze, a porcentagem de defeitos maiores encontrada estava acima de
10%, evidenciando um prejuízo na qualidade deste ejaculado.
3. Pela análise morfológica dos espermatozóides e pelos achados
macroscópicos (durante necropsia) e microscópicos (por meio de coloração
com HE de cortes de tecido das próstatas dos animais infectados), pode-se
associar a infecção por leptospiras em cães com a ocorrência de prostatite;
já pela técnica de coloração de Levaditi, não foi possível verificar a
61
presença de leptospiras nos testículos, nos epidídimos, na próstata ou nos
rins dos cães experimentalmente infectados e eutanasiados até o 45º dia
após a inoculação da cepa patogênica. Por meio dessa técnica, só foi
possível observar a presença de leptospira em um corte de fígado de um
animal do grupo 2.
4. O exame hematológico apontou para um aumento do número de linfócitos,
plaquetas e neutrófilos segmentados e uma diminuição do número de
hemácias a partir do terceiro dia pós-infecção, e o exame bioquímico do
sangue revelou um aumento de uréia no 45º dia e um aumento de fosfatase
alcalina a partir do 30º dia, indicando possíveis alterações nas funções
hepáticas e renais dos animais infectados; apesar disso, durante os 45 dias
de inoculação, não foi possível observar alterações na composição ou nas
características físicas das urinas dos animais examinados.
62
7. REFERÊNCIAS
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76
ANEXO 1
Solução, meios de cultura, diluidores e tampões utilizados no trabalho.
1 – SOLUÇÃO
Solução tamponada da Sörensen pH 7,5
• Fosfato di-sódico anidro...................................8,33g
• Fosfato monopotássico.....................................1,09g
• Água destilada..................................................1000mL
2 – MEIOS DE CULTURA
a) EMJH (Difco – 0987-01)
• Sódico fosfato dibásico.........................1g
• Potássio fosfato monobásico.................0,3g
• Cloreto de sódio....................................1g
• Cloreto de amônia.................................0,25g
• Tiamina.................................................0,005g
• Água destilada......................................900mL
• Enriquecimento com 10% de soro sanguíneo de coelho
b) Fletcher (Difco – 0987-01)
• Bacto-peptona......................................0,3g
• Bacto-extrato de carne.........................0,2g
• Cloreto de sódio...................................0,5g
• Bacto-ágar............................................1,5g
• Água destilada......................................900mL
• Enriquecimento com 10% de soro sanguíneo de coelho
3 – DILUIDORES
a) TE pH 7,4
• Tris HCl 10mM
• EDTA 1mM (Ethylenediaminetetracetic acid – sal)
b) Solução tampão de lise (proteinase K)
• Proteinase K a 20mg/mL......................15µL
• Dodecil sulfato de sódio (SDS) 10%....30µL
• TNE 5x..................................................60µL
• Água ultrapura......................................195µL
•
c) TNE 5x pH 8,0
77
• Tris 50mM
• NaCl 500mM
• EDTA 125mM
d) Solução tampão de reação 10x pH 9,0
• KCl....................................................500mM
• MgCl
2
................................................15mM
• Tris HCl.............................................100mM
4 – GEL DE AGAROSE 2,0%
• Tampão TBE (0,5 x).................................100mL
• Agarose.....................................................2,0g
5 – TAMPÃO DE CORRIDA TBE pH 8,0
• Tris acetato 0,004M
• EDTA 0,001M
6 – SOLUÇÃO DE NITRATO DE PRATA
Nitrato de prata 2,0g
Àgua deionizada q.s.p.100mL
7 – SOLUÇÃO REDUTORA
Ácido pirogálico 4,0g
Formol puro 5mL
Água deionizada q.s.p.100mL
78
ANEXO 2
HEMOGRAMA
Após homogeneização da amostra com EDTA, utilizou-se uma gota de
sangue para realização do esfregaço em lâmina identificada com o nome ou RG
do animal. O restante da amostra foi utilizada para a contagem dos glóbulos
vermelhos e brancos. Para tanto, utilizou-se um contador automático, como se
segue (TVEDTEN, 1994b).
Contador Automático ABC-VET (HORIBAABX, 2001).
Diluição (diluidor DA 500)
• Diluição para glóbulos brancos (posição WBC)
• Diluição para glóbulos vermelhos (posição RBC), utilizando como amostra o
béquer da diluição dos glóbulos brancos;
• Colocamos 2 gotas de hemolisante (Cellmlise II) no béquer da diluição de
glóbulos brancos e homogeneizar bem;
Operação (CELM CC 530) (HORIBAABX, 2001).
• Deixamos sempre um béquer com solução Isocellm II no transdutor;
ligamos o aparelho. Automaticamente o aparelho fez um ciclo de limpeza, e
o display indica 0 (zero).
Contagem de glóbulos vermelhos (THRALL, 2007d; TVEDTEN, 1994a).
• Seleção RBC com a tecla [RBC/WBC];
• Colocamos o béquer, com a amostra diluída, no transdutor;
• Contagem apertando [COUNT];
• Apareceu no display o valor de RBC.
79
Contagem de glóbulos brancos e dosagem de hemoglobina (TVEDTEN,
1994c; WEISER, 2007a; WEISER, 2007c; WEISER, 2007b).
• Preparação da diluição para WBC, homogeneização e colocação no
transdutor;
• Seleção WBC com a tecla [RBC/WBC];
• No caso de dosagem de hemoglobina, seleção HGB:
• Contagem de glóbulos brancos apertando [COUNT];
• Aparecendo no display o valor de WBC, e o led indicador HGB acendendo
intermitentemente (indicando que se for necessário repetir a contagem com
a tecla [REPEAT] o aparelho não fará uma nova dosagem de HGB);
• Ao final de cada contagem, desprezo do restante de cada amostra e
lavagem do béquer com água corrente, secagem e reutilização.
Hematócrito – volume globular (THRALL, 2007c; THRALL, 2007a).
• Homogeneização da amostra, em seguida enchimento de sangue
aproximadamente ¾ do tubo de micro-hematócrito;
• Fechamento de uma das extremidades com massa selante ou pelo fogo;
• Centrifugação por 5 minutos em centrífuga apropriada;
• Leitura no cartão especial.
Proteína Plasmática Total (FETTMAN & REBAR, 2007b; LASSEN, 2007a).
• Quebra do microtubo (utilizado no hematócrito) acima do nível dos
eritrócitos;
• Colocação de uma gota do plasma no refratômetro;
• Leitura na coluna da esquerda, resultado em g/ dL.
Contagem de Eritrócitos em Câmara de Neubauer (THRALL, 2007e; THRALL,
2007b).
• Sangue total com EDTA;
80
• Líquido de Hayem - bicloreto de mercúrio 0,5 g
- cloreto de sódio 1,0 g
- sulfato de sódio 5,0 g
- água destilada 100,0 mL
• Diluição 1: 200. O mais correto é a utilização da pipeta de diluição de
eritrócitos (pipeta de Thomas).
• Colocação da câmara em repouso, por 5 minutos, em câmara úmida;
• Realização da contagem em microscópio, no aumento 40 x, em 5 grupos de
16 quadradinhos no centro da câmara, multiplicando o número de eritrócitos
contados por 10.000.
Contagem de leucócitos em Câmara de Neubauer (WEISER, 2007b).
• Sangue total com EDTA;
• Pipeta para glóbulos brancos;
• Líquido de Türk - ácido acético glacial 1 mL
- violeta de genciana 1 mL
- água destilada 100 mL
• Diluição 1: 20, o mais correto é a utilização da pipeta de diluição de
leucócitos.
• Preenchimento da câmara;
• Usando a objetiva 10 x contagem dos leucócitos nos quatro conjuntos de 16
quadrados encontrados nos quatro extremos da câmara, somandos os
resultados e multiplicando por 50.
Contagem diferencial dos leucócitos (WEISER, 2007b).
• Coloração do esfregaço com o kit Instant Prov
®
• Examinada ao microscópio, objetiva de imersão 100x
81
Contagem de plaquetas (WEISER, 2007a).
• Contagem de plaquetas no mesmo esfregaço utilizado na contagem
diferencial de leucócitos;
• Contagem das plaquetas em 5 – 10 campos (dependendo da quantidade de
plaquetas), fazendo a média e multiplicando por 15.000.
• O resultado foi expresso em mm
3
.
BIOQUÍMICA SÉRICA
Tipos de amostra para realização de cada exame
(LASSEN e WEISER, 2007).
MÉTODO AMOSTRA
Creatinina Soro/ plasma (EDTA ou Heparina)
ALT (Alanina Amino Transferase) Soro/ plasma (EDTA ou Heparina)
AST (Aspartato Amino Transferase) Soro/ plasma (EDTA ou Heparina)
Fosfatase Alcalina Soro/ plasma (Heparina)
Albumina Soro
Uréia Soro/ plasma (EDTA ou Heparina)
Proteína Total Soro
CK-NAC (Creatino-fosfoquinase) Soro/ plasma (Heparina)
• O aparelho utilizado para a realização dos bioquímicos foi o Quick-Lab -
Drake.(DRAK ELETRÔNICA E COMÉRCIO, 2002).
• Seguimos os passos solicitados pelo aparelho (específicos para cada
técnica).
• Recomendou-se que a amostra só fosse colocada no reagente de trabalho
no momento em que o aparelho estivesse pronto para recebê-la. Após
colocação da amostra no reagente, homogeneização rápida, não
demorando mais que 10 segundos para inseri-la no aparelho. Para cada
teste existiu um procedimento diferente no preparo dos reagentes de
trabalho, que pôde ser encontrado na bula de cada método. Nesse caso
82
foram utilizados os kits da Katal. A seguir, encontra-se um resumo dos
procedimentos utilizados no preparo de pequenas quantidades de cada
reagente.
CREATININA
Soro / Plasma (EDTA ou Heparina)
KATAL
Reagente de
Trabalho
Quantidade
Reagente
Quantidade
Amostra
Branco Padrão Banho-maria
37
o
C
2,0 ml Tampão
0,5 ml Ácido
Pícrico
1 mL
1 mL
100 µL
-
-
-
-
100 µL
-
Fonte: FETTMAN e REBAR, 2007a).
URÉIA Soro / Plasma (EDTA ou Heparina)
KATAL
Reagente de
Trabalho
Quantidade
Reagente
Quantidade
Amostra
Branco Padrão Banho-maria
37
o
C
2,0 ml Tampão
20 µl Enzima
20 µl Coenzima
1 mL
1 mL
10 µL
-
-
-
-
10 µL -
Fonte: FETTMAN e REBAR, 2007a.
ALT - Alanina Amino Transferase
Soro / Plasma (EDTA ou Heparina)
KATAL
Reagente de
Trabalho
Quantidade
Reagente
Quantidade
Amostra
Branco Padrão Banho-maria
37
o
C
2,5 ml Tampão
25 µl Enzima
25 µl Coenzima
1 mL 100 µL - - -
Fonte: LASSEN, 2007b.
AST - Aspartato Amino Transferase
Soro / Plasma (EDTA ou Heparina)
KATAL
Reagente de
Trabalho
Quantidade
Reagente
Quantidade
Amostra
Branco Padrão Banho-maria
37
o
C
2,5 ml Tampão
25 µl Enzima
25 µl Coenzima
1 mL 100 µL - - -
Fonte: LASSEN, 2007b.
83
FOSFATASE ALCALINA
Soro / Plasma (Heparina)
KATAL
Reagente de
Trabalho
Quantidade
Reagente
Quantidade
Amostra
Branco Padrão Banho-maria
37
o
C
0,9 ml Tampão
0,1 ml Substrato
1 mL 20 µL - - -
Fonte: LASSEN, 2007b.
ALBUMINA
Soro
KATAL
Reagente de
Trabalho
Quantidade
Reagente
Quantidade
Amostra
Branco Padrão Banho-maria
37
o
C
50 ml Reagente
cor-estoque,
completar p/
500ml água
destilada/deioni
zada
(estável 6
meses 8
0
C)
2 mL
2 mL
2 mL
10 µL
-
-
-
-
-
-
-
10 µL
15 minutos
temperatura
ambiente
Fonte: BAKER, 2007.
PROTEÍNAS TOTAIS
Soro
KATAL
Reagente de
Trabalho
Quantidade
Reagente
Quantidade
Amostra
Branco Padrão Banho-maria
37
o
C
50 ml Biureto-
estoque,
completar p/
500ml
deionizada
(estável 6
meses
0
C
ambiente)
2,5 mL
2,5 mL
2,5 mL
50 µL
-
-
-
-
50 µL
água
-
-
50 µL
15 minutos
temperatura
ambiente
Fonte: FETTMAN e REBAR, 2007b.
84
URINÁLISE
• Ao chegar ao laboratório, as amostras foram transferidas para tubo cônico,
a partir do qual foi realizado o exame físico e, posteriormente, a
centrifugação para a realização da análise do sedimento (NAVARRO &
EUGENIO, 1996; LEES et al. 1994).
Exame físico da urina
• Cor: amarelo-ouro, amarelo-citrino, âmbar, avermelhada...
• Aspecto: límpido, turvo, ligeiramente turvo...
• Odor: característico/ sui generis, fétido...
• Densidade: colocação de uma gota no refratômetro e realização da leitura
na coluna da direita.
Exame químico da urina:
• Realizado com tiras de plástico (Combur Test UX 10 – Roche) que contêm
pedacinhos de papel de várias cores embebidos em reagentes químicos, os
quais mudam de cor quando em contato com determinadas substâncias
eventualmente presentes na urina.
Exame do sedimento urinário:
• O sedimento pôde ser visto à fresco ou corado, mas deve ser sempre feito
de amostra recente, porque a demora (mais de 2 horas) pode determinar a
fragmentação de certos elementos, principalmente nas urinas alcalinas.
• Para preparação do sedimento, centrifugação da amostra em tubo cônico
por 5 a 10 minutos (1.000 a 1.500 rpm); desprezando o sobrenadante,
colocação de uma gota de sedimento sobre uma lâmina cobrindo-a em
seguida com lamínula; observação com objetiva de 40 x, com pouca luz.
85
• Nos sedimentos podemos observar: hemácias, leucócitos, células epiteliais
prepuciais, células caudadas da pelve renal, células de transição, bactérias,
leveduras, cilindros e cristais.
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