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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DE SUL
FACULDADE DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO
COMPATIBILIDADE SIMBIÓTICA E CARACTERIZAÇÃO DE RIZÓBIOS DE
Lotus spp., ISOLADOS DE SOLOS DO RIO GRANDE DO SUL.
Brenda Cristye Tonon
Dissertação
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DE SUL
FACULDADE DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO
COMPATIBILIDADE SIMBIÓTICA E CARACTERIZAÇÃO DE RIZÓBIOS DE
Lotus spp., ISOLADOS DE SOLOS DO RIO GRANDE DO SUL.
Brenda Cristye Tonon
Engenheiro-Agrônomo (UEL)
Dissertação apresentada como
um dos requisitos à obtenção do
Grau de Mestre em Ciência do solo
Porto Alegre (RS) Brasil
Junho de 2008
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ii
Aos meus pais, Oriverto e Audinir,
e a minha irmã Bárbara
Ofereço.
Ao Henrique, meu noivo
amor da minha vida
Dedico
iii
AGRADECIMENTOS
À Deus, por ter me concedido vida, saúde e disposição. Sem Ele
nada seria possível.
À minha família, sempre presente com suas orações. Aos meus pais,
Oriverto e Audinir Tonon, e minha irmã Bárbara que sempre me deram amor,
exemplo de vida e por todo o amor dado a mim nesse período, e por
compreender a minha ausência.
Ao meu orientador Prof. Enilson L. Saccol de Sá, não só pela
amizade, mas também pelos conhecimentos transmitidos e pela compreensão
diante das minhas dificuldades e limitações, por ter confiado em mim, mas
também por ser um exemplo de dedicação profissional, competência e
entusiasmo pelo que faz. Nunca esqueceu que estudante de pós-graduação é,
antes de mais nada, colega de profissão, tratando a todos com respeito.
A UFRGS e ao Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo,
pela oportunidade de cursar o mestrado. Aos professores que colaboraram
para a minha formação.
Ao CNPq, pela bolsa de estudos ao Projeto LOTASSA por
possibilitar a realização desse trabalho.
Ao amor da minha vida, Henrique Debiasi. Você é o que tenho de
mais precioso nessa vida. Só sua presença já seria uma grande ajuda para a
elaboração dessa dissertação. Mas você foi mais longe... Obrigado pelo amor,
apoio e compreensão mesmo nos momentos mais difíceis dessa caminhada,
pela força, pelas orações e por compreender a minha ausência.
A todos os colegas e amigos do PPGCS, principalmente àqueles
com quem convivi mais diretamente: Benjamim Osório Filho, Andressa Silveira,
Christina Venzke, Andréa Scaramal, Edicarlos Damacena, Adriana Giongo,
Marcos Stroschein, Andréia Binz, Alano, Mariel Bizarro, Ricardo Fontoura,
iv
Márcio Frizzo, Jackson Brilhante, Andressa e Marcelo.
Aos meus amigos Anorival Jr. e Andressa pela amizade
incondicional, pelo carinho, apoio, pela ajuda nos momentos difíceis, e também
pelas longas conversas e desabafos.
Ao funcionário e amigo Márcio Silveira pela grande ajuda nas
analises de laboratório e principalmente pela amizade. E aos funcionários Adão
(Laboratório de Química), e Antônio (Laboratório de Biogeoquímica Ambiental),
pela grande ajuda nas análises e determinações laboratoriais. Também ao
secretário do PPGCS, Jader Amaro, pela competência e dedicação e o Sr.
José (Zé) pela ajuda no experimento de casa de vegetação.
Ao pesquisador da FEPAGRO Luciano Kayser Vargas, pela
colaboração na execução do trabalho.
Ao professor Miguel Dall’ Agnol, do Departamento de Plantas
Forrageiras, pela concessão das sementes e pelo auxílio.
Quero agradecer aos meus velhos amigos, que de longe ou perto
nunca abandonaram meus pensamentos: Julia Tufino, Eduardo Guerzoni,
Deoclécio Garbuglio, Caroline Menara, Cristiane Pierolli, Flávia Narduci, Kalícia
Dessunti e Dáfila Santos.
A todos aqueles que, de maneira direta ou indireta, contribuíram
para a realização deste trabalho.
Muito obrigado
v
COMPATIBILIDADE SIMBIÓTICA E CARACTERIZAÇÃO DE RIZÓBIOS DE
Lotus spp., ISOLADOS DE SOLOS DO RIO GRANDE DO SUL.
1/
Autor: Brenda Cristye Tonon
Orientador: Prof. Dr. Enilson L. Saccol de Sá
RESUMO
Espécies do gênero Lotus têm sido utilizadas como plantas
forrageiras no Estado do Rio Grande do Sul (RS). No entanto, tem sido
observada certa especificidade hospedeira na simbiose rizóbio-Lotus quando
se utiliza L. corniculatus em substituição a L. subbiflorus, na implantação de
pastagens com essas leguminosas, e vice versa. Sendo assim, a hipótese
deste trabalho é que, nos solos do estado, existem rizóbios nativos que formam
diferentes grupos de compatibilidade simbiótica com espécies de Lotus. Para
avaliação da compatibilidade simbiótica entre rizóbios nativos, isolados de
solos do RS, e plantas de L. corniculatus, L. uliginosus, L. subbiflorus e L.
glaber, foram realizadas a avaliação da inoculação cruzada em tubos de
ensaio, em lampadário, e em vasos tipo “Leonard”, em casa de vegetação.
Também se avaliou a compatibilidade simbiótica, em tubos de ensaio, de 159
rizóbios obtidos de L. corniculatus, L. uliginosus, L. glaber e L. subbiflorus que
foram inoculados em plantas das quatro espécies de Lotus, avaliando-se a
nodulação e a fixação de nitrogênio (N
2
). No experimento em casa de
vegetação, com vasos “Leonard”, avaliaram-se quatro isolados de rizóbios
nativos quanto à eficiência na fixação simbiótica de N
2
em plantas das quatro
espécies de Lotus. Estes rizóbios também foram caracterizados geneticamente
por comparação do perfil eletroforético dos produtos de amplificação do DNA
genômico, pela reação em cadeia da polimerase com os oligonucleotídeos
iniciadores BOX e ERIC. Os isolados de rizóbios nativos UFRGS Lg5, Lg109 e
Lg111, obtidos de L. glaber, foram ineficientes na simbiose com plantas de L.
subbiflorus e L. uliginosus sendo eficientes apenas em plantas de L.
corniculatus e L. glaber. No entanto, as estirpes EEL698, U512 e o isolado
Lc340 foram capazes de induzir a formação de nódulos e de fixar N
2
em
simbiose com todas as espécies de Lotus estudadas. Isto evidencia a
existência, nas amostras de solo das localidades estudadas no RS, de rizóbios
nativos eficientes em plantas de ambos os grupos de compatibilidade
simbiótica, com potencial para serem usados em inoculantes funcionais para
espécies de Lotus. Observou-se também que existem rizóbios potencialmente
parasitas tanto para plantas das espécies L. corniculatus e L. glaber como para
L.uliginosus.
1/
Dissertação de mestrado em Ciência do Solo. Programa de Pós-Graduação em
Ciência do Solo, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do
Sul. (66p.). Junho, 2008. Trabalho realizado com apoio financeiro do CNPq e Projeto
LOTASSA.
vi
SYMBIOTIC COMPATIBILITY AND CHARACTERIZATION OF NATIVE
RHIZOBIA FOR Lotus spp., ISOLATED FROM SOILS OF RIO GRANDE DO
SUL
Author: Brenda Cristye Tonon
Adviser: Enilson L. Saccol de Sá
ABSTRACT
Lotus sp. species have great potential to be cultivated as forage
plants in Rio Grande do Sul State (RS), Brazil. However, some symbiotic
specificity has been observed in the Rhizobia-Lotus symbiosis when L.
corniculatus is replaced by L. subbiflorus and vice versa. So, this work’s
hypothesis is that in the soils of RS there are native Rhizobia that form different
groups with Lotus species. To evaluate the symbiotic compatibility among
native Rhizobia, isolated from RS soils, and plants of L. corniculatus, L.
uliginosus, L. subbiflorus and L. glaber, were made the evaluation of the cross-
inoculation in tubes, under laboratory conditions, as well as in Leonard Jars
under greenhouse conditions. In tubes, the symbiotic compatibility of 159
rhizobia, obtained from of L. corniculatus, L. uliginosus, L. glaber and L.
subbiflorus plants, that were inoculated on plants of these four Lotus species
and evaluated on their capacity to form nodules and fixing N
2
. In the green
house experiments, whit Leonard jars, four native rhizobia isolates were
evaluated regarding to the efficiency of symbiotic nitrogen fixation in association
with plants of the four Lotus species studied. Those rhizobia also were
genetically characterized by PCR fingerprinting of genomic DNA using primers
BOX and ERIC. Native Rhizobia isolates obtained from L. glaber (UFRGS Lg5,
Lg109 e Lg111) didn’t establish an effective symbiosis with L. subbiflorus and L.
uliginosus, being efficient only when inoculated on L. corniculatus and L. glaber
plants. However, the strains EEL 698 and U512 as well as the isolate Lc 340
were able to induce nodulation and fixing N
2
in symbiosis with all the studied
Lotus species. This find points to the existence, in the state’s soil samples, of
native Rhizobia efficient in plants of both symbiotic compatibility groups, whit
potential to be used as inoculant for those Lotus species. It was observed that
there are some native Rhizobia potentially parasitic with L. corniculatus and L.
glaber and also L. uliginosus.
1/
M. Sc. dissertation in Soil Science. Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo,
Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. (66 p.). June
2008. Financial support by CNPq and LOTASSA Project.
ii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..........................................................................3
2.1 Características das espécies de Lotus .................................................3
2.2 Compatibilidade simbiótica entre rizóbio e Lotus spp...........................6
2.3 Caracterização genética dos rizóbios de Lotus ....................................8
3 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................10
3.1 Autenticação dos isolados..................................................................11
3.2 Determinação dos grupos de compatibilidade simbiótica...................11
3.2.1 Avaliação da compatibilidade simbiótica dos isolados de
rizóbios nativos inoculados em plantas de Lotus em tubos em
laboratório ................................................................................................12
3.2.2 Avaliação da compatibilidade simbiótica dos isolados de
rizóbios nativos inoculados em plantas de Lotus em casa de
vegetação.................................................................................................12
3.3 Caracterização genética dos isolados de rizóbios..............................14
3.3.1 Extração do DNA genômico dos isolados de Lotus.........................15
3.3.2 Amplificação do DNA genômico por oligonucleotídeos
iniciadores ................................................................................................16
3.3.3 Análise dos produtos da amplificação .............................................17
iii
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................19
4.1 Autenticações dos rizóbios isolados de solos do RS para
espécies de Lotus.....................................................................................19
4.2 Determinação dos grupos de compatibilidade simbiótica...................20
4.2.1 Avaliação da compatibilidade simbiótica em plantas de L.
uliginosus dos isolados de rizóbios obtidos de plantas de L.
corniculatus ..............................................................................................20
4.2.2 Avaliação da compatibilidade simbiótica, em plantas de L.
uliginosus, dos isolados de rizóbios obtidos de plantas de L. glaber........23
4.2.3 Avaliação da compatibilidade simbiótica, em plantas de L.
uliginosus, dos isolados de rizóbios obtidos de plantas de L.
subbiflorus ................................................................................................25
4.2.4 Avaliação da compatibilidade simbiótica, em plantas de L.
uliginosus, L. subbiflorus, L. corniculatus e L. glaber, dos rizóbios de
L. uliginosus .............................................................................................26
4.2.5 Avaliação da compatibilidade simbiótica, em plantas de L.
uliginosus, L. subbiflorus, L. corniculatus e L. glaber, dos rizóbios
obtidos de L. subbiflorus e L. glaber.........................................................29
4.3 Avaliação da compatibilidade simbiótica dos isolados de rizóbios
nativos inoculados em plantas de Lotus em casa de vegetação..............31
4.3.1 Avaliação da compatibilidade simbiótica dos isolados de
rizóbios nativos inoculados em plantas de L. corniculatus em casa de
vegetação.................................................................................................32
4.3.2 Avaliação da compatibilidade simbiótica dos isolados de
rizóbios nativos inoculados em plantas de L. glaber em casa de
vegetação.................................................................................................35
iv
4.3.3 Avaliação da compatibilidade simbiótica dos isolados de
rizóbios nativos inoculados em plantas de L. subbiflorus em casa de
vegetação.................................................................................................38
4.3.4 Avaliação da compatibilidade simbiótica dos isolados de
rizóbios nativos inoculados em plantas de L. uliginosus em casa de
vegetação.................................................................................................41
4.3.5 Comparação da compatibilidade simbiótica dos isolados de
rizóbios nativos com plantas das espécies de L. corniculatus, L.
glaber, L. subbiflorus e L. uliginosus em casa de vegetação ...................45
4.4 Caracterização genotípica dos rizóbios isolados obtidos de
plantas de Lotus .......................................................................................48
5. CONCLUSÕES.............................................................................................53
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................54
7 APÊNDICES.................................................................................................61
v
RELAÇÃO DE TABELAS
1. Análise das características químicas das amostras de solo das
localidades estudadas .................................................................................10
2. Estirpes de bactérias fixadoras de N recomendadas para produção de
inoculante para Lotus com respectiva planta hospedeira, origem e
outras designações ......................................................................................13
3. Composição das misturas para as reações de PCR para cada
oligonucleotídeo iniciador ............................................................................17
4. Programa dos ciclos utilizados na amplificação do DNA genômico para
cada oligonucleotídeo iniciador.....................................................................17
5. Autenticação em experimento em tubos, em lampadário, dos isolados
de rizóbios obtidos de plantas de L. uliginosus e origem da amostra de
solo...............................................................................................................20
6. Número de isolados de rizóbios nativos dos solos do Rio Grande do
Sul, obtidos de Lotus corniculatus, L. glaber e L. subbiflorus, capazes
de induzir a nodulação e fixar nitrogênio em plantas de L. uliginosus..........21
7. Rizóbios obtidos de nódulos de plantas de L. corniculatus capazes de
induzir a nodulação e fixar nitrogênio em simbiose com plantas de L.
corniculatus e L. uliginosus sob condições de crescimento em tubos de
ensaio em lampadário. .................................................................................22
8. Rizóbios obtidos de nódulos de plantas de L. glaber capazes de induzir
a nodulação e fixar nitrogênio em simbiose com plantas de L. glaber e
L. uliginosus sob condições de crescimento em tubos de ensaio em
lampadário....................................................................................................24
9. Rizóbios obtidos de nódulos de plantas de L. subbiflorus capazes de
induzir a nodulação e fixar nitrogênio em simbiose com plantas de L.
subbiflorus e L. uliginosus sob condições de crescimento em tubos de
ensaio em lampadário ..................................................................................26
10. Isolados de rizóbios obtidos de raízes de L. uliginosus capazes de
induzir a nodulação e fixar nitrogênio em simbiose com plantas de L.
uliginosus, L. subbiflorus, L. corniculatus e L. glaber sob condições de
crescimento em tubos de ensaio em lampadário .......................................27
11. Isolados de rizóbios obtidos de raízes de L. subbiflorus e L. glaber
capazes de induzir a nodulação e fixar nitrogênio em simbiose com
vi
plantas de L. subbiflorus, L. corniculatus e L. glaber sob condições de
crescimento em tubos de ensaio em lampadário.......................................29
12. Número e massa seca de nódulos e massa seca e quantidade de
nitrogênio acumulado na parte aérea de plantas de Lotus
corniculatus, inoculadas com isolados de rizóbios e estirpes, em
experimento conduzido em casa de vegetação.........................................33
13. Número e massa seca de nódulos, massa seca e quantidade de
nitrogênio acumulado na parte aérea de plantas de Lotus glaber
inoculadas com isolados e estirpes de rizóbios, em experimento
conduzido em casa de vegetação.............................................................36
14. Número e massa seca de nódulos, massa seca e quantidade de
nitrogênio acumulado na parte aérea de plantas de L. subbiflorus
inoculadas com isolados e estirpes de rizóbios em experimento
conduzido em casa de vegetação .............................................................39
15. Número e massa seca de nódulos, massa seca e quantidade de
nitrogênio acumulado na parte aérea de plantas de Lotus uliginosus
inoculadas com isolados e estirpes de rizóbios em experimento
conduzido em casa de vegetação.............................................................42
16. Número de nódulos e quantidade de nitrogênio total (mg planta
-1
)
obtido nas plantas das espécies de L. corniculatus, L. glaber, L.
subbiflorus e L. uliginosus inoculadas com isolados e estirpes de
rizóbios em experimento conduzido em casa de vegetação.....................46
vii
RELAÇÃO DE FIGURAS
1. Índice de eficiência relativa de fixação biológica de nitrogênio (%) em
comparação à estirpe U510, das estirpes e isolados de rizóbios
inoculados em plantas de Lotus corniculatus, em experimento
conduzido em casa de vegetação................................................................34
2. Índice de eficiência relativa de fixação biológica de nitrogênio (%) em
comparação à estirpe SEMIA 830, das estirpes e isolados de rizóbios
inoculados em plantas de L. glaber, em experimento conduzido em
casa de vegetação .......................................................................................37
3. Índice de eficiência relativa da fixação biológica do nitrogênio (%) em
comparação a estirpe SEMIA 850, dos isolados e estirpes de rizóbios
inoculados em plantas de L. subbiflorus, em experimento conduzido
em casa de vegetação .................................................................................41
4. Eficiência relativa da fixação simbiótica de nitrogênio (%) em
comparação a estirpe SEMIA 839 dos rizóbios de Lotus isolados dos
solos do RS inoculados em plantas de L. uliginosus, em experimento
conduzido em casa de vegetação ...............................................................44
5. Perfil de bandas obtidas com amplificação do DNA genômico com os
oligonucleotídeos iniciadores ERIC1-R e ERIC-2. Lambda= marcador
de peso molecular Lambda Eco RI + Hind III. A foto é apresentada em
negativo para melhor visualização das bandas............................................49
6. Perfil de bandas obtidas com amplificação do DNA genômico com o
oligonucleotídeo iniciador BOX A1. Lambda= marcador de peso
molecular Lambda Eco RI + Hind III. A foto é apresentada em negativo
para melhor visualização das bandas ..........................................................50
7. Dendrograma de genotipagem de estirpes e isolados de rizóbios para
L. corniculatus, L. glaber, L. subbiflorus e L. uliginosus. Agrupamento
obtido por UPGMA, utilizando-se o coeficiente de Jaccard, para perfil
de bandas obtido a partir da PCR com os oligonucleotídeos iniciadores
BOX A1-R + ERIC1-R e ERIC -2 .................................................................51
viii
RELAÇÃO DE APÊNDICES
1. Solução Nutritiva (Sarruge, 1975).................................................................62
2. Meio extrato de levedura-manitol - LM (Vincent, 1970). ...............................63
3. Rizóbios isolados de plantas de L. uliginosus e L. corniculatus
autenticados por Frizzo (2007) quanto a nodulação e fixação
simbiótica de nitrogênio em experimento em tubos mantidos sob
condições de lampadário.............................................................................64
4. Rizóbios isolados de plantas de L. subbiflorus e L. glaber autenticados
por Fontoura (2007) quanto à nodulação e fixação simbiótica de
nitrogênio em experimento em tubos mantidos sob condições de
lampadário....................................................................................................66
1 INTRODUÇÃO
O estudo da simbiose entre leguminosas forrageiras e bactérias
fixadoras de nitrogênio atmosférico (N
2
) é de grande importância para o
desenvolvimento de tecnologias que aumentem a produtividade, com o mínimo
risco de degradação do solo e do ambiente. Ao mesmo tempo, o emprego de
espécies de leguminosas forrageiras representa uma excelente fonte de
proteína para os animais, além da possibilidade de ser utilizada como cobertura
vegetal, na rotação com outras espécies, em sistema de semeadura direta.
As leguminosas forrageiras do gênero Lotus encontram-se
amplamente distribuídas no mundo. As espécies Lotus corniculatus L., L.
uliginosus Schkuhr, L. subbiflorus Lag. e L. glaber Mill (Syn. L. tenuis Waldst. &
Kit.) (Kirkbride, 2006) têm sido mais utilizadas devido a sua capacidade de
adaptação em regiões de clima temperado e subtropical, tolerância à acidez e
à baixa fertilidade do solo e pelo seu valor como planta forrageira. Além disso,
uma das principais justificativas para o uso de leguminosas em pastagens é a
sua capacidade de fixar o N
2
pela simbiose com rizóbios nativos do solo.
Posteriormente, uma maior quantidade desse nutriente poderá ser incorporado
no solo e ser transferido às gramíneas.
No Rio Grande do Sul, L. corniculatus (cv. São Gabriel) e L.
subbiflorus (cv. él Rincón) são as espécies de Lotus mais utilizadas como
plantas forrageiras em pastagens cultivadas. No entanto, dificuldades para a
implantação de L. subbiflorus em substituição a cultivares de L. corniculatus, e
vice-versa, têm sido observadas. Um dos fatores que podem explicar a
ocorrência desse problema é a existência de especificidade hospedeira na
simbiose Rhizobium-Lotus, representada pela habilidade de uma estirpe de
rizóbio em induzir a nodulação e/ou fixar nitrogênio atmosférico quando
2
associada às espécies do hospedeiro específico, sendo por isso uma
importante característica a ser considerada em programas de seleção de novas
estirpes. A especificidade hospedeira resulta na formação de grupos de
compatibilidade simbiótica, onde L. corniculatus e L. glaber formam um grupo
simbiótico efetivo com estirpes de crescimento intermediário, como
Mesorhizobium loti, enquanto que L. subbiflorus e L. uliginosus formam um
outro grupo simbiótico com estirpes de bactérias de crescimento lento do
gênero Bradyrhizobium sp. É importante destacar que bactérias de um grupo
simbiótico podem induzir a nodulação em plantas do outro grupo. Entretanto,
os nódulos formados podem ser inefetivos ou, de outro modo, a relação
estabelecida pode ser de parasitismo. Além disso, existe no Brasil um pequeno
número de estirpes disponíveis na coleção oficial, recomendadas para a
produção de inoculantes para Lotus: duas para L. corniculatus; uma para L.
uliginosus, três para L. subbiflorus e uma para L. glaber. Diante disso, estudos
que buscam o isolamento, caracterização e seleção destes microrganismos
são importantes para a manutenção desses recursos e desenvolvimento de
inoculantes mais eficientes para estas espécies.
Neste contexto, nos solos do estado, é possível a existência de
rizóbios nativos que realizem simbiose eficiente tanto em plantas da espécie L.
corniculatus, L. glaber, L. uliginosus como em L. subbiflorus, de modo que
encontrem rizóbios eficientes para as quatro espécies. Sendo assim, o objetivo
deste trabalho foi avaliar a compatibilidade simbiótica entre os isolados de
rizóbios nativos e as espécies de Lotus estudadas, e caracterizar
genotipicamente os isolados de rizóbios nativos do Rio Grande do Sul
eficientes na simbiose com estas espécies de Lotus.
3
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Características das espécies de Lotus
Espécies leguminosas com potencialidade forrageira vêm sendo
empregadas em diversas regiões pecuárias do Brasil, tanto em cultivo
monofítico como consorciadas com gramíneas (Jacob Jr. et al., 2004). Além do
alto valor nutritivo apresentado pelas leguminosas, uma das principais
justificativas para o uso das mesmas em pastagens é a sua capacidade de fixar
o nitrogênio atmosférico que, posteriormente, será transferido às gramíneas
(Scheffer-Basso et al., 2001), visando melhorar a qualidade da pastagem
(Brose, 1992a).
As espécies perenes do gênero Lotus [L. corniculatus L., Lotus
uliginosus Schkuhr (syn. L. pedunculatus Cav.), L. subbiflorus Lag. (syn. L.
hispidus Desf.) e L. glaber Mill. (syn. Lotus tenuis Waldst. Et Kit. Ex Wild.)] têm
sido mais difundidas devido à sua capacidade de adaptação em regiões de
clima temperado e subtropical e pelo seu valor como planta forrageira (Paim e
Riboldi, 1991). Essas leguminosas se destacam por sua capacidade de fixação
biológica de nitrogênio (FBN), tolerância à acidez e à baixa fertilidade do solo e
seu alto conteúdo de taninos, não provocando timpanismo nos animais
(Langer, 1990; Soster et al., 2004a). O excelente valor nutritivo destas espécies
deve-se principalmente aos seus elevados teores de proteína, podendo
alcançar até 24% de proteína bruta e 86% de digestibilidade (López et al.,
1966).
As espécies de Lotus foram introduzidas no sul do Brasil na década
de 1940 (Paim, 1991). O cornichão (L. corniculatus) é uma leguminosa
forrageira de grande importância em diversos países, especialmente no
Uruguai, onde é utilizado no melhoramento de extensas áreas de pastagens
4
naturais (Maroso & Scheffer-Basso, 2007). É uma espécie perene, hiberno -
primaveril, de origem européia e mediterrânea (Soster et al., 2004b), com
excelente adaptação no sul do Brasil, Uruguai, Argentina e Chile (Paim &
Riboldi, 1991). No Rio Grande do Sul, a cultivar de L. corniculatus, “São
Gabriel”, foi desenvolvido a partir de pesquisas entre 1955 e 1965 na Estação
Experimental do município de São Gabriel, RS (Paim, 1988). Esse cultivar é
caracterizado pelo rápido estabelecimento inicial, grande vigor vegetativo, boa
produtividade, elevada qualidade de forragem e boa ressemeadura natural,
mas apresenta problemas de persistência, devido ao hábito de crescimento
ereto, não suportando pastejo intenso (Paim & Riboldi, 1991). Esse é
provavelmente o principal fator responsável pela pouca expansão dessa
leguminosa no Sul do Brasil (Maroso & Scheffer-Basso, 2007).
Em comparação com outros sete cultivares testados no Rio Grande
do Sul, Paim e Riboldi (1991) observaram que o cultivar São Gabriel de Lotus
corniculatus foi o mais produtivo em todos os cortes ao longo do experimento
de 2 anos de duração, com produção de forragem no primeiro ano de 3. 262
Kg/ha de massa seca. Resultados semelhantes foram observados por Rocha et
al.(2007) na avaliação da produção de forragem de espécies e cultivares
forrageiros de inverno na Região da Depressão Central do RS, onde o cultivar
São Gabriel de L. corniculatus se destacou como maior produtor de massa
vegetal apresentando uma produção de MS de 6.627 Kg/ha.
L. uliginosus (cultivar tetraplóide Maku), denominado vulgarmente de
“cornichão dos banhados” e “cornichão dos campos úmidos” (Maroso &
Scheffer-Basso, 2007), é uma espécie leguminosa perene estival, rizomatosa,
originária do Mediterrâneo. É uma espécie que se caracteriza por apresentar
maior tolerância a solos ácidos e deficientes em fósforo em relação às outras
espécies de Lotus, com elevada capacidade de estabelecimento em áreas
úmidas (Paim & Riboldi, 1991; Brose, 1992b). Ao contrário de L. corniculatus,
as plantas de L. uliginosus são bastante tolerantes ao alagamento e se
adaptam bem em solos pobres e mal-drenados (Justin & Armstrong, 1987),
suportando também pastejos intensos (Ayala et al., 2003). Paim & Riboldi
(1991) relataram que, apesar dessa espécie apresentar boa qualidade da
forragem produzida e adaptação a solos pobres e mal drenados, os produtores
ainda fazem restrições ao uso desta devido ao lento estabelecimento, baixa
5
produção de sementes e difícil colheita das mesmas. Segundo Ayala et al.
(2003), os muitos anos de pesquisa e a crescente expansão em nível comercial
permitem afirmar que essa forrageira vem se constituindo, de maneira lenta,
mas segura, em um novo aporte para melhorar a base forrageira dos rebanhos
uruguaios.
Quanto à população de rizóbios no solo para L. uliginosus, nas
condições do Planalto de Santa Catarina, Brose (1992b) constatou que as
estirpes ocorrem com muito menos freqüência que em solos da Nova Zelândia
e menos distribuídas do que as de cornichão (L. corniculatus). De acordo com
o referido autor, isso pode estar relacionado ao fato de o uso de L. uliginosus
pelos produtores do Planalto de Santa Catarina ser menos freqüente do que na
Nova Zelândia.
Em relação à espécie L. subbiflorus, de acordo com Paim & Riboldi
(1991), não há relatos de quando foi introduzida no Rio Grande do Sul,
encontrando-se de forma espontânea em áreas de antigas coleções. É uma
leguminosa de inverno, de hábito ereto a decumbente. Pode se comportar
como planta bianual ou perene em áreas sem restrições hídricas. Demonstra
ser adaptada a solos ácidos, de baixa fertilidade e drenagem deficiente
(Lowther et al., 1987). Essa espécie possui um sistema radicular pouco
profundo, mas abundante. A cultivar el Rincón é de procedência uruguaia e
está em estudo na estação experimental La Estanzuela (Paim & Riboldi, 1991).
A espécie L. glaber é uma forrageira perene, de crescimento
prostado e que se ajusta bem em ambientes úmidos de clima temperado
(Beuselinck, 1999). Esta espécie cresce no outono e na primavera, mas tolera
baixas temperaturas e cobertura de gelo (Vigniolo et al., 1999). Também se
adapta a ambientes de muita salinidade. Mujica & Rumi (1999) constataram
boa resistência à salinidade na germinação de duas estirpes de L. glaber
oriundas da bacia do Rio Salado, Argentina, região também conhecida por
apresentarem solos com pH muito alto. Tem por distribuição primária o
noroeste europeu, bacia do mediterrâneo e sudoeste asiático e posteriormente
foi dispersa na Argentina e partes dos EUA (Blumenthal & McGraw, 1999),
além do Chile. Cresce em solos com pH 5,8 a 6,0. No Chile, esta espécie é
encontrada de forma espontânea nas áreas arrozeiras.
6
2.2 Compatibilidade simbiótica entre rizóbio e Lotus spp.
O processo de nodulação que ocorre durante a associação
simbiótica é controlado, em grande parte, pela troca de sinais entre os rizóbios
e a planta hospedeira (Hirsch et al., 2003). Devido à diversidade de compostos
e metabólitos secundários que compõem os exsudatos radiculares, plantas
podem enviar um número bem diverso de sinais. Nas interações entre
comunidades microbianas no solo e o sistema radicular das plantas, muitos dos
compostos fenólicos e flavonóides são liberados pelas plantas como moléculas
sinalizadoras para os simbiontes microbianos (Hirsch et al., 2003; Sullivan,
2004; Gage, 2004). Tais sinais são altamente específicos entre o hospedeiro e
o simbionte, pois diferem consideravelmente entre as leguminosas, e esta
especificidade possibilita que os rizóbios simbiontes identifiquem seus próprios
hospedeiros (Bais et al., 2004).
O fator Nod é essencial para que se estabeleça uma relação
simbiótica, e, na maioria dos casos, suficiente para induzir precocemente
respostas na planta hospedeira (Limpens & Bisseling, 2003), entretanto, não é
o único sinal bacteriano requerido para o sucesso da simbiose.
Exopolissacarídeos (EPSs) e lipopolissacarídeos (LPSs) são importantes para
a simbiose, tanto como componentes estruturais, quanto como moléculas
sinalizadoras, pois estão ligados ao desenvolvimento nodular (Mathis et al.,
2004). Além do reconhecimento entre o rizóbio e a planta hospedeira via troca
de sinais bioquímicos, o estabelecimento da simbiose depende também de
fatores abióticos (Lieven-Antoniou & Whittan, 1997), que podem influenciar
diretamente a população de rizóbio e diminuir sua eficiência, como
temperatura, umidade, fertilidade natural e acidez do solo (Hartwig, 1998;
Andrade et al., 2000; Moreira & Siqueira, 2005). Além disso, as estirpes
dependem, em parte, da capacidade de persistir no solo e competir com a
microflora nativa já estabelecida (Giongo, 2007). Os rizóbios nativos e
ineficientes podem competir com os rizóbios eficientes por sítios de infecção na
planta hospedeira, sendo este outro fator limitante para o estabelecimento da
simbiose (Moreira & Siqueira, 2005).
O estabelecimento da interação simbiótica exige o prévio e mútuo
reconhecimento entre a bactéria e a planta hospedeira, o que ocorre mediante
7
a troca de sinais bioquímicos específicos e geneticamente codificados. Diante
disso, Lieven-Antoniou & Whittan (1997) mencionam a compatibilidade
genética e a conseqüente especificidade hospedeira entre a planta e o
microsimbionte como um dos principais requisitos para o desenvolvimento da
relação simbiótica. No caso específico das leguminosas pertencentes ao
gênero Lotus, a simbiose pode ocorrer tanto com estirpes de bactérias de
crescimento intermediário (Mesorhizobium loti), quanto de crescimento lento
(Bradyrhizobium sp.) (Jarvis et al., 1997; Barrientos et al., 2002). No entanto,
parece existir certa especificidade hospedeira entre determinadas espécies de
Lotus e certos rizóbios. Nesse contexto, Hernández et al. (2005) supõem a
existência de dois grupos simbióticos na interação rizóbio-Lotus, caracterizados
pela compatibilidade simbiótica entre o hospedeiro e o microssimbionte. Um
deles seria constituído por L. corniculatus e L. glaber, simbioticamente
compatíveis com estirpes de rizóbio de crescimento rápido, como Rhizobium
loti, atualmente denominado Mesorhizobium loti (Jarvis et al., 1997). Já L.
subbiflorus e L. glaber formariam outro grupo simbiótico, relacionando-se
efetivamente com estirpes de bactérias de crescimento lento pertencentes ao
gênero Bradyrhizobium. Em outras palavras, as bactérias que produzem
nódulos nas espécies de L. corniculatus e L. glaber não seriam capazes de
induzir a nodulação em L. uliginosus e L. subbiflorus Lag., e vice-versa,
formando assim grupos de incompatibilidade simbiótica. No entanto, bactérias
de um grupo simbiótico podem induzir a nodulação em plantas do outro grupo,
porém sendo simbioticamente ineficiente, ou então estabelecendo uma relação
de parasitismo (Baraibar et al., 1999). Tal constatação é reforçada por
Hernández et al. (2005), que salientam que os rizóbios eficientes em um grupo
de especificidade comportam-se como parasitas no outro.
Desta forma, a especificidade hospedeira observada dentro dos
grupos simbióticos se constitui, provavelmente, em uma das principais
justificativas para os problemas de estabelecimento e desenvolvimento das
plantas de L. subbiflorus e L. uliginosus quando as mesmas são implantadas
em solos anteriormente cultivados com L. corniculatus e L. glaber, ou vice-
versa, o que vêm sendo observado no Uruguai (Irisarri et al., 1996). Portanto, a
especificidade hospedeira é uma importante característica a ser considerada
em programas de seleção de novas estirpes (Peres et al., 1993; Carvalho,
8
2003), de forma a viabilizar a obtenção e seleção de isolados capazes de
induzir a nodulação e fixar nitrogênio atmosférico de maneira eficiente nas
quatro espécies de Lotus, sem que haja essa separação em dois grupos
simbióticos. Estudos conduzidos por Baraibar et al. (1999) evidenciaram que
esse objetivo pode ser alcançado. Estes autores, avaliando a efetividade
simbiótica de populações nativas de Mesorhizobium loti nos solos do Uruguai,
em três espécies de Lotus (L. corniculatus, L. uliginosus e L. subbiflorus),
relataram uma baixa especificidade hospedeira, pela análise do índice de
eficiência relativa (Brockwell et al., 1966).
2.3 Caracterização genética dos rizóbios de Lotus
Estudos de taxonomia e diversidade de rizóbio vêm tendo
consideráveis avanços através do emprego de técnicas de biologia molecular,
as quais permitem a identificação e classificação mais rápida e precisa de
grande número de indivíduos (Grange, 2001; Stralioto, 2005). Entre essas
técnicas, destaca-se a análise da reação em cadeia da polimerase (PCR -
Polymerase Chain Reaction), que permite a amplificação de seqüências
definidas da molécula de DNA (Laguerre et al., 1994; Chueire et al., 2000a).
Vários são os relatos sobre a utilização da tecnologia da reação da PCR nos
estudos de ecologia, genética e taxonomia de rizóbio (de Brujin, 1992; Judd et
al.,1993; Agius et al., 1997; Laguerre et al., 1997; Santos et al., 1999; Grange &
Hungria, 2004; Giongo et al., 2007; Stroschein, 2007), e tem sido utilizada para
determinar relações genéticas entre estirpes de Rhizobium (Laguerre et al.,
1994) e Bradyrhizobium (Vinuesa et al., 1998).
Nos estudos de diversidade genética de rizóbios, a reação em
cadeia da polimerase (PCR) com o uso de oligonucleotídeos iniciadores
específicos, como BOX (Enterobacterial Repetitive Sequences), ERIC
(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) e REP (Repetitive Extragenic
Palindromic Sequences), que amplificam seqüências repetidas do DNA
(Versalovic et al., 1994), permitem a diferenciação das estirpes estudadas (de
Brujin, 1992; Selenska-Pobell et al., 1995; Hungria et al., 1998; Santos et al.,
1999; Chueire et al., 2000b; Mostasso et al., 2002). A reação da PCR tem
apresentado bons resultados em estudos de diversidade e agrupamento por
9
similaridade. Grange (2001), avaliando a diversidade de rizóbio capaz de
nodular o feijoeiro (Phaseolus vulgaris), analisou rizóbios isolados de solos da
região nordeste e da região sul do Brasil empregando as técnicas de PCR com
o oligonucleotideo específico ERIC, PCR-RFLP da região do DNA que codifica
para o gene 16S rRNA com cinco enzimas de restrição e sequenciamento
parcial ou total da região 16S rRNA. Os resultados obtidos neste estudo
revelaram elevado grau de diversidade genética entre os isolados. Resultados
semelhantes também foram obtidos por Fernandes et al. (2003). Neste trabalho
foram analisados rizóbios isolados dos tabuleiros costeiros do Sergipe
empregando três técnicas: PCR com o oligonucleotídeo específico BOX; PCR-
RPFL da região do DNA que codifica para o gene 16S rRNA e da região
intergênica entre 16S e 23S rRNA, com cinco enzimas de restrição; e
seqüenciamento parcial da região 16S rRNA. E ainda, com base nestes
resultados, confirmam que a análise por BOX-PCR é eficiente para discriminá-
las, embora nem sempre tenha sido adequada nas avaliações filogenéticas,
como já relatado por outros autores (Laguerre et al., 1997; Chueire et al.,
2000b).
3 MATERIAL E MÉTODOS
Os rizóbios nativos estudados foram isolados por Frizzo (2007) e
Fontoura (2007) a partir de amostras de solo e plantas de L. corniculatus L., L.
uliginosus Schkuhr, L. subbiflorus lag. e L. glaber. Procurou-se realizar a coleta
em áreas com histórico de cultivo dessas espécies de oito localidades do
Estado do Rio Grande do Sul (Figura 1). Nas amostras de solo coletadas em
Arroio dos Ratos e Porto Alegre não foram realizadas as análises das
características químicas.
Tabela 1. Análise das características químicas das amostras de solo das
localidades estudadas
Argila
pH M.O.
Al Ca Mg P K
Localidades Solos
% H
2
O % --- cmol
c
dm
-3
---
- mg dm
-3
-
Bagé
Argissolos
14 5,0 4,0 0,2
5,5 2,6 7,6 66
Eldorado do
Sul
Argissolos
21 5,1 1,7 0,2
2,2 1,1 12,0
118
Hulha Negra
Vertissolos
13 5,0 3,1 0,6
5,0 1,8 4,0 73
Mostardas
Neossolos
9 5,6 1,8 0,0
3,3 0,9 67,0
159
Passo Fundo
Latossolos
22 6,5 8,0 0,0
12,4
11,3
23,0
347
Rio Pardo
Argissolos
13 5,4 2,6 0,1
3,4 1,6 31,0
83
Obs.: Análise realizada no laboratório de Análise de Solos da Faculdade de
Agronomia da UFRGS (Tedesco et al., 1995).
A caracterização genotípica dos rizóbios foram realizadas nos
Laboratórios de Microbiologia do Solo e de Biologia Molecular e os
experimentos com plantas de Lotus foram conduzidos em casa de vegetação
do Departamento de Solos da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
(UFRGS).
11
3.1 Autenticação dos isolados
Para a autenticação dos isolados de rizóbios obtidos, foram
utilizados tubos de ensaio de 25cm de comprimento e 2,4cm de diâmetro, com
solução nutritiva isenta de nitrogênio (Sarruge, 1975) (Apêndice 1), os quais
foram esterilizados em autoclave por 15 minutos. Após, colocou-se uma
semente pré-germinada, de cada espécie estudada (L. corniculatus, L. glaber,
L. subbiflorus e L. uliginosus). As sementes foram cedidas pelo Dr. Miguel
Dall`agnol, Departamento de Plantas Forrageiras – UFRGS. Estas sementes
foram previamente escarificadas com lixa n°120 por 2 minutos, e desinfestadas
por imersão sucessiva em álcool 70% por 30 segundos, hipoclorito de sódio
(5%) por 1 minuto e lavadas diversas vezes com água desionizada, esterilizada
em autoclave por 20 minutos. Após foram incubadas a 28°C por dois dias.
Após quatro dias da colocação das plântulas nos tubos, estes foram inoculados
com suspensão de células do cultivo de cada isolado de rizóbio, obtido de
nódulos de L. corniculatus, L. uliginosus, L. glaber e L. subbiflorus, crescidos
por 48 horas em meio levedura-manitol (Apêndice 2) líquido sob agitação a 120
rpm e a 28°C. Os tubos foram mantidos em lampadário com fotoperíodo de 12
horas diárias de luz. A avaliação visual da nodulação foi realizada aos 45 dias
após a inoculação, sendo descartados os isolados que não formaram nódulos e
considerados como rizóbios os que formaram nódulos. A fixação biológica de
nitrogênio atmosférico também foi avaliada visualmente, observando-se o
desenvolvimento e a coloração da parte aérea das plantas. A coloração
esverdeada acentuada observada na área foliar foi considerada como
indicativo da fixação simbiótica de nitrogênio.
3.2 Determinação dos grupos de compatibilidade simbiótica
Foram avaliados 159 rizóbios obtidos de plantas de L. corniculatus,
L. glaber, L. subbiflorus e L. uliginosus (Frizzo, 2007; Fontoura, 2007) para
determinação dos grupos de compatibilidade simbiótica desses isolados com
as plantas das espécies de Lotus em estudo.
12
3.2.1 Avaliação da compatibilidade simbiótica dos isolados de
rizóbios nativos inoculados em plantas de Lotus em tubos em laboratório
Os rizóbios isolados das espécies L. corniculatus, L. glaber, L.
subbiflorus e L. uliginosus, foram avaliados quanto à capacidade para produzir
nódulos e fixar nitrogênio em outras espécies de Lotus que não a de onde
foram isolados, indicando a compatibilidade simbiótica entre esses rizóbios e
essas espécies de Lotus. O experimento foi realizado utilizando-se tubos de
ensaio contendo gel formado com solução nutritiva (Sarruge, 1975), isenta de
nitrogênio, e 7,5 g L
-1
de ágar. Posteriormente esta metodologia foi simplificada
substituindo-se o gel por tira de 15 por 2 cm, de papel toalha, colocado no
interior do tubo para servir de suporte à planta. Foram utilizadas sementes das
quatro espécies de Lotus em estudo. As sementes foram escarificadas,
desinfestadas e pré-germinadas conforme descrito no item 3.1. Após quatro
dias do plantio das sementes pré-germinadas, realizou-se a inoculação do
caldo dos rizóbios crescidos em meio levedura-manitol por 48 horas a 28°C
com agitação a 120 rpm. Foram inoculadas alíquotas de 100 µL da suspensão
de células de cada isolado em plântulas das quatro espécies de Lotus
estudadas, separadamente e com duas repetições. Os tubos foram mantidos
em lampadário com 12 horas diárias de luz em condições de temperatura
ambiente por 50 dias.
Os experimentos foram conduzidos por 45 dias após o plantio e
avaliados visualmente quanto ao número de nódulos formados, coloração dos
nódulos e avaliação da fixação simbiótica de nitrogênio pela observação do
crescimento das plantas e coloração das folhas.
3.2.2 Avaliação da compatibilidade simbiótica dos isolados de
rizóbios nativos inoculados em plantas de Lotus em casa de vegetação
Foram escolhidos para este estudo os seguintes isolados de
rizóbios: um isolado de L. corniculatus, UFRGS Lc340, três isolados de L.
glaber, UFRGS Lg5, Lg109 e Lg111 (Frizzo, 2007; Fontoura, 2007). Também
foram escolhidas as estirpes EEL698, de L. subbiflorus, e EEL8084, de L.
uliginosus, cedidas pelo Dr. Elemar Brose, da coleção da Estação Experimental
de Lages – SC (EEL). Os rizóbios foram avaliados quanto à eficiência na
13
fixação simbiótica de nitrogênio em experimentos realizados em casa de
vegetação, em vasos de “Leonard” (Vincent, 1970). Os vasos continham uma
mistura de vermiculita e areia (proporção de 2:1), na parte superior e foram
esterilizados em autoclave por 90 minutos a 1 atm e a 120°C. No momento do
plantio, adicionou-se na parte inferior do vaso cerca de 400 mL de solução
nutritiva (Sarruge, 1975) isenta de nitrogênio, diluída a 25% e esterilizada. Em
cada vaso, foram plantados cinco sementes da mesma espécie de Lotus,
desinfestadas e pré-germinadas. Os rizóbios foram inoculados nas plantas de
L. corniculatus, L. glaber, L. subbiflorus e L. uliginosus, utilizando-se em cada
vaso, uma alíquota de 1 mL do caldo de cada isolado crescidos em meio
líquido LM, incubados por 48 horas a 28°C, sob agitação constante a 120 rpm,
aproximadamente 10
8
UFC mL
-1
. Após 15 dias, fez-se o desbaste deixando-se
duas plantas por vaso.
Foram utilizadas para comparação as estirpes SEMIA 839,
recomendada comercialmente como inoculante para L. uliginosus, SEMIA 830,
recomendada como inoculante para L. glaber, e a estirpe SEMIA 850,
recomendada para produção de inoculantes para L. subbiflorus no Brasil,
fornecidas pela Coleção de Culturas de Rizóbios da Fundação de Pesquisa
Agropecuária do Rio Grande do Sul (FEPAGRO) (Tabela 2).
Tabela 2. Estirpes de bactérias fixadoras de N recomendadas para produção
de inoculante para Lotus com respectiva planta hospedeira, origem e
outras designações
SEMIA Planta Hospedeira Origem Outras designações
830
L. glaber
Desconhecida --
839
L. uliginosus
USA NZP2021, CC829, TAL 925
850
L. subbiflorus
Uruguai U-531
As estirpes U510, recomendada para produção de inoculantes para
L. corniculatus, e U512, em estudos para a produção de inoculante no Uruguai,
foram cedidas pelo Dr. Carlos Labandera do Ministerio de Ganaderia,
Agricultura y Pesca do Uruguai (MGAP). Além dos tratamentos inoculados, foi
conduzido um tratamento controle para cada espécie, sem inoculação e sem
adição de nitrogênio. O experimento foi conduzido em casa de vegetação por
97 dias, com um delineamento inteiramente ao acaso com quatro repetições
14
por tratamento. Ao final do período, coletou-se a parte aérea das plantas que
foi acondicionada em sacos de papel e seca em estufa a 65°C, até apresentar
peso constante, e posteriormente pesado para determinação da massa seca
produzida. Os nódulos radiculares foram destacados, contados e colocados em
estufa a 65°C, durante três dias, para secagem. Também se determinou o teor
de nitrogênio total na parte aérea, segundo metodologia descrita por Tedesco
et al. (1995). Os dados referentes ao número e massa seca de nódulos, massa
seca e N-Total da parte aérea foram submetidos à análise de variância
(ANOVA) pelo programa estatístico SISVAR (2003), e as médias foram
comparadas pelo teste de Scot Knott ao nível de 5% de probabilidade. Foi
determinado o índice de eficiência relativa, que mede a acumulação de
nitrogênio fixado em relação aos tratamentos controles, segundo Brockwell et
al., (1966). Para o cálculo foi utilizado como parâmetro de comparação o Ntotal
da estirpe recomendada referente a cada espécie de Lotus. O índice de
eficiência relativa da fixação de nitrogênio em relação ao N fixado pela estirpe
foi calculado através da fórmula descrita abaixo.
IER = __Ntotal tratamento – Ntotal T-N_ x 100
Ntotal ER. – Ntotal T-N
onde:
Ntotal tratamento = nitrogênio total da planta do tratamento inoculado;
Ntotal T-N = nitrogênio total do controle não inoculado e sem nitrogênio;
Ntotal ER = nitrogênio total do controle inoculado com estirpe recomendada
3.3 Caracterização genética dos isolados de rizóbios
Os isolados de rizóbios testados quanto à eficiência na fixação
nitrogênio foram caracterizados geneticamente pelo método de amplificação do
DNA genômico utilizando-se a técnica de PCR (reação em cadeia da
polimerase), comparando-se os perfis eletroforéticos das estirpes estudadas
utilizando os oligonucleotidos iniciadores BOX A1 e ERIC.
15
3.3.1 Extração do DNA genômico dos isolados de Lotus
O DNA genômico dos isolados de rizóbios e das estirpes
recomendadas foi extraído pelo método de extração com sílica. A extração do
DNA foi realizada a partir de uma cultura de células multiplicadas em meio LM
e incubadas a 28°C durante 48 horas em agitação constante de 120 rpm. A
partir do caldo de cultura, foram transferidas alíquotas de 1,5 mL para tubos de
microcentrífuga esterilizados, para submetê-los a lavagens com soluções
salinas (NaCl 1%), para a retirada dos polissacarídeos e resíduos de meio de
cultura. Foram adicionados aos tubos 200 µL de solução EDTA salina (10 mM
de EDTA pH 8 e 150mM de NaCl em água ultrapura), invertendo-os várias
vezes para homogeneização. Foram adicionados aos tubos 100 µL de SDS
20% (Dodecil Sulfato de Sódio diluído em água ultrapura) homogeneizando-se
cuidadosamente. Em seguida, os tubos foram colocados em banho-maria a
60°C por quinze minutos, sendo periodicamente homogeneizados por inversão.
Após, adicionou-se 50 µL de perclorato de sódio (5M), cuidadosamente, gota a
gota, seguido de inversão do tubo após a adição de cada gota. Adicionou-se
500 µL da mistura de clorofórmio e álcool isoamílico (24:1), homogeneizando
gentilmente por inversão até a formação de emulsão no tubo. Centrifugou-se
por 5 minutos a 10.000 rpm e, em seguida, coletou-se o sobrenadante com
cuidado, transferindo-o com auxilio de um micropipetador para um novo tubo
de microcentrifuga. Adicionou-se 250 µL de NaCl 4 M, correspondente ao
dobro do volume da amostra. Em seguida, adicionou-se 20 µL de dióxido de
sílica (0,5g de dióxido de sílica, lavado previamente em tampão fosfato salina
(PBS) em 45 mL de NaCl 4 M, mantida refrigerada e no escuro), previamente
suspendido no vórtex, para que ocorresse a precipitação do DNA. Os tubos
foram homogeneizados e deixados em banho-maria a 50°C por 5 minutos.
Após rápido pulso em microcentrífuga, descartou-se o sobrenadante e o
precipitado foi lavado duas vezes com 250 µL de solução G (NaCl 50 mM, Tris
pH 7,5 10 mM, EDTA 2,5 mM, em etanol 50%, mantida sob refrigeração). Em
cada lavagem, o tubo foi invertido 5 a 6 vezes, seguido de um rápido pulso em
microcentrífuga e descartado o sobrenadante. Logo após a lavagem, os tubos
contendo o precipitado foram colocados abertos para secar a temperatura
ambiente por 1 hora. O precipitado foi ressuspendido em 60 µL de água
ultrapura esterilizada, homogeneizando cuidadosamente com a ajuda de um
16
micropipetador, succionado com a ponteira 5 a 10 vezes, e colocando-se, em
seguida, em banho-maria a 40°C por 10 minutos. Após, os tubos foram
centrifugados a 10.000 rpm por 3 minutos, transferindo-se o sobrenadante,
contendo o DNA, para novos tubos de microcentrífuga esterilizados,
conservando-os congelados a -20°C.
3.3.2 Amplificação do DNA genômico por oligonucleotídeos
iniciadores
Os DNAs genômicos dos isolados de rizóbios e das estirpes
recomendadas foram caracterizados pela técnica de PCR, com a utilização de
seqüências repetidas ERIC e BOX. A reação de amplificação foi realizada
usando-se os seguintes nucleotídeos iniciadores:
1. ERIC - corresponde à seqüências repetitivas intergênicas de
enterobactérias (de Bruijn, 1992):
ERIC1-R - (5’ - ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C - 3')
ERIC-2 - (5' - AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G - 3').
2. BOX A1 - amplifica regiões conservadas e repetitivas do DNA
cromossômico (Versalovic et al., 1994).
BOX A1 - (5’ –CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3’).
A reação de amplificação do DNA genômico com o primer BOX foi
realizada de acordo com o protocolo de Versalovic et al. (1994) modificado
(Tabela 3), sendo a reação de amplificação utilizando o primer ERIC realizada
segundo protocolo descrito por de Bruijn (1992) modificado (Tabela 3). As
condições empregadas para a programação do termociclador são descritas na
Tabela 4.
Em todas as reações de amplificação do DNA genômico utilizou-se
como controle negativo uma reação contendo 20 µL de cada mistura e 5 µL de
água ultrapura esterilizada. A concentração de DNA genômico usada nas
17
amplificações foi verificada em gel de agarose (1%), utilizando-se o DNA de
fago lambda clivado com as enzimas de restrição Eco R-I e Hind III (Invitrogen)
como padrão.
Tabela 3. Composição das misturas para as reações de PCR para cada
oligonucleotídeo iniciador
Oligonucleotídeos iniciadores
Componentes BOX A 1-R ERIC1-R + ERIC-2
Tampão 10x * 1x 1x
MgCl
2
(50 mM) 1 mM 1,5 mM
dNTP (10mM) 200 µM 200 µM
Taq pol (5 U µL
-1
) 1 U 1 U
DMSO 1 µL 1 µL
Oligonucleotídeo iniciador
10 pM 10 pM
Água ultra pura **
(*) Tampão 10X (500 mM KCl, 15 mM MgCl
2
, 100 mM Tris-HCl, pH 9,0)
(**) Água ultrapura esterilizada em quantidade suficiente para completar o
volume de 25 µL por tubo.
Tabela 4. Programa dos ciclos utilizados na amplificação do DNA genômico
para cada oligonucleotídeo iniciador
oligonucleotídeos iniciadores
Ciclo n° de vezes BOX A 1-R ERIC1-R + ERIC-2
1 1 95 °C - 7 min 95 °C - 7 min
94 °C - 1 min 94 °C - 1 min
53 °C - 1 min 51 °C - 1 min
2 30
65 °C - 8 min 65 °C - 8 min
3 1 65 °C - 16 min 65 °C - 16 min
4
4 °C - ∞ 4 °C - ∞
3.3.3 Análise dos produtos da amplificação
Os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese em gel
de agarose 1,5% em cuba horizontal com tampão TBE 0,5X (Sambrook et al.,
2001) durante 90 minutos a 80 V. Como padrão de peso molecular foi utilizado
o DNA do fago lambda na primeira e última canaletas dos géis. Os géis foram
corados durante 10 minutos em solução de brometo de etídio (1 µg mL
-1
) e, em
seguida, imersos em água desionizada por 10 minutos. A visualização dos
18
fragmentos amplificados foi realizada com transluminador com luz ultravioleta e
documentada com equipamento de fotografia digital.
O perfil de bandas no gel foi transformado em uma matriz binária
bidimensional, utilizando-se o programa GelPro Analyser 3.1, onde 0 (zero)
indicava a ausência de banda e 1 (um) a presença. A
similaridade/dissimilaridade genética entre os isolados foi medida pelo
coeficiente de Jaccard (i, j) que não considera as similaridades negativas. As
matrizes foram analisadas em conjunto pelo programa PAST (Hammer et al.,
2007) e os dendrogramas obtidos pelo método de agrupamento UPGMA
(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Averages).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Autenticações dos rizóbios isolados de solos do RS para
espécies de Lotus
Entre os 159 isolados de rizóbios estudados, 15 foram autenticados
neste trabalho e estão relacionados na Tabela 5, sendo todos isolados de
plantas de L. uliginosus. No experimento para autenticação observou-se que
todos foram capazes de induzir a nodulação nas plantas de L. uliginosus,
espécie de onde foram isolados, sendo, por isso, autenticados como rizóbios.
No entanto, apenas os isolados UFRGS Lu14, Lu23, Lu35a, Lu35b, Lu36,
Lu49, e Lu55 foram capazes de fixar nitrogênio simbioticamente (Tabela 5).
Entre os demais isolados de rizóbios nativos estudados neste
trabalho, 92 foram autenticados por Frizzo (2007) e apresentavam capacidade
em induzir a nodulação, mas 80 fixavam nitrogênio simbioticamente (Apêndice
3). Os demais 52 isolados de rizóbios foram autenticados por Fontoura (2007)
sendo todos capazes de induzir a nodulação, mas 36 foram capazes de fixar
nitrogênio nas plantas de onde foram isolados (Apêndice 4).
Os resultados de autenticação de isolados de rizóbios obtidos neste
trabalho (Tabela 5) e os obtidos por outros autores (Frizzo, 2007; Fontoura,
2007) mostram que é comum o isolamento de rizóbios que, apesar de
induzirem a formação de nódulos na planta, não são capazes de fixar
nitrogênio simbioticamente.
20
Tabela 5. Autenticação em experimento em tubos, em lampadário, dos isolados
de rizóbios obtidos de plantas de L. uliginosus e origem da amostra
de solo
L.uliginosus
Isolados*
Nodulação Fixação N
Local
Lu14 + + Mostardas
Lu23 + + Mostardas
Lu35a + + Eldorado do Sul
Lu35b + + Eldorado do Sul
Lu36 + + Eldorado do Sul
Lu37 + - Eldorado do Sul
Lu45 + - Eldorado do Sul
Lu49 + + Eldorado do Sul
Lu53 + - Hulha Negra
Lu55 + + Hulha Negra
Lu58 + - Hulha Negra
Lu60 + - Hulha Negra
Lu61 + - Hulha Negra
Lu64 + - Hulha Negra
Lu65 + - Hulha Negra
* isolados da coleção da UFRGS. Legenda: += positiva; - =negativa
4.2 Determinação dos grupos de compatibilidade simbiótica
Nesses experimentos, avaliou-se a capacidade em formar nódulos e
fixar nitrogênio de 159 isolados de rizóbios, obtidos de plantas das espécies L.
corniculatus, L. glaber, L. subbiflorus e L. uliginosus, quando inoculados em
plantas de outras espécies de Lotus que não a de onde foram obtidos.
Observou-se a existência de grupos de rizóbios capazes de formar nódulos e
fixar nitrogênio simbioticamente tanto em plantas de L. corniculatus e L. glaber
como também em plantas de L. uliginosus.
4.2.1 Avaliação da compatibilidade simbiótica em plantas de L.
uliginosus dos isolados de rizóbios obtidos de plantas de L. corniculatus
Dos 59 isolados de rizóbios nativos obtidos de raízes de plantas de
L. corniculatus inoculados em plantas de L. uliginosus, apenas os isolados
UFRGS Lc336 e UFRGS Lc340 foram capazes de formar nódulos e fixar
nitrogênio em simbiose com plantas de L. uliginosus (Tabela 6 e 7), nas
condições do experimento em tubos de ensaio em lampadário. Os rizóbios
21
isolados de L. corniculatus UFRGS Lc336 e Lc340 são provenientes de
amostras de solo de Hulha Negra. Segundo Frizzo (2007), observou que,
conforme as características coloniais desses isolados, poderiam pertencer ao
gênero Mesorhizobium.
Tabela 6. Número de isolados de rizóbios nativos dos solos do Rio Grande do
Sul, obtidos de Lotus corniculatus, L. glaber e L. subbiflorus, capazes
de induzir a nodulação e fixar nitrogênio em plantas de L. uliginosus
L.uliginosus
Isolados de Nº de isolados
Nodulantes Fixação de N
L. corniculatus
59 30 2
L. glaber
30 28 4
L. subbiflorus
5 3 1
Dados observados visualmente em experimento em tubos realizado em
lampadário até 45 dias após a inoculação
Observa-se que 49% dos rizóbios isolados de L. corniculatus,
estudados nesse trabalho, não induziram a formação de nódulos nas plantas
de L. uliginosus. Observa-se que apenas 30 dentre 59 rizóbios obtidos de L.
corniculatus foram capazes de nodular as plantas de L. uliginosus (Tabela 6),
indicando compatibilidade nodular. Frizzo (2007), em seu trabalho de seleção e
caracterização de rizóbios nativos dos solos do RS para L. corniculatus e L.
uliginosus, encontrou rizóbios obtidos de L. corniculatus com colônias de 5 mm
de diâmetro e gomosas em oito dias de crescimento em placas com meio LMA.
Segundo o autor, essas características indicariam que os rizóbios obtidos de L.
corniculatus, poderiam pertencer ao gênero Mesorhizobium, bactérias de
crescimento intermediário. Esses rizóbios de L. corniculatus foram capazes de
induzir a nodulação em plantas de L. uliginosus, indicando que plantas dessa
espécie podem ser noduladas também por Mesorhizobium loti, além de
Bradyrhizobium sp. (Estrella, 1997). Como exemplo, pode-se citar a estirpe
NZP 2037 (Beltsville Rhizobium Culture Collection), caracterizada como
Mesorhizobium loti e que apresenta capacidade em formar nódulos em plantas
de L. uliginosus (Hotter & Scott, 1991). Por outro lado, existem autores que
constataram especificidade hospedeira entre bactérias do gênero
Bradyrhizobium e plantas de Lotus uliginosus (Brose, 1992b; Gault et al.,
1994). Isso evidencia que especificidade entre os rizóbios dessas espécies não
está bem definida nas plantas do gênero Lotus, fato já assinalado por Baraibar
(1999).
22
Tabela 7. Rizóbios obtidos de nódulos de plantas de L. corniculatus capazes de
induzir a nodulação e fixar nitrogênio em simbiose com plantas de L.
corniculatus e L. uliginosus sob condições de crescimento em tubos
de ensaio em lampadário.
Inoculação em plantas de
L. corniculatus L. uliginosus
Rizóbios de
L. corniculatus
Nod
+
Fix
+
Nod
+
Fix
+
Local
Lc 8 + + + - HN
Lc 11 + + - - HN
Lc 13 + + + - ES
Lc 14 + + - - ES
Lc 15 + + - - ES
Lc 18 + + + - ES
Lc 21 + + - - ES
Lc 22 + + - - ES
Lc 24 + + - - ES
Lc 25 + + + - ES
Lc 26 + + - - ES
Lc 27 + + - - ES
Lc 30 + + + - ES
Lc 32 + + - - ES
Lc 33 + + + - ES
Lc 34 + + + - ES
Lc 36 + + + - ES
Lc 38 + + - - ES
Lc 41 + + + - ES
Lc 44 + + + - ES
Lc 45 + + - - ES
Lc 46 + + - - ES
Lc 47 + + - - ES
Lc 48 + + + - ES
Lc 49 + + - - ES
Lc 50 + + + - ES
Lc 54 + + + - ES
Lc 55 + + - - ES
Lc 57 + + + - ES
Lc 58 + + - - ES
Lc 235 + + + - PA
Lc 240 + + - - PA
Lc 241 + + - - PA
Lc 242 + + - - PA
Lc 247 + + + - PA
Lc 250 + + + - PA
Legenda: Nod
+
= nodulação positiva; Fix
+
= fixação de N positiva; += positiva; -
=negativo; HN = Hulha Negra; ES = Eldorado do Sul; PA = Porto Alegre; AR
= Arroio dos Ratos - RS.
23
Tabela 7. Continuação...
Lc 252 + + - - PA
Lc 253 + + - - PA
Lc 254 + + + - PA
Lc 256 + + - - PA
Lc 270 + + - - PA
Lc 324 + + + - HN
Lc 327 + + - - HN
Lc 328 + + - - HN
Lc 331 + + + - HN
Lc 336 + + + + HN
Lc 338 + + - - HN
Lc 339 + + - - HN
Lc 340 + + + + HN
Lc 341 + + + - HN
Lc 343 + + + - HN
Lc 345 + + + - HN
Lc 346 + - - - HN
Lc 347 + + + - HN
Lc 348 + + + - HN
Lc 354 + + + - HN
Lc 386 + + + - AR
Lc 389 + + - - AR
Lc 392 + + + - AR
Legenda: Nod
+
= nodulação positiva; Fix
+
= fixação de N positiva; += positiva;
- =negativo; HN = Hulha Negra; ES = Eldorado do Sul; PA = Porto Alegre;
AR = Arroio dos Ratos/RS.
4.2.2 Avaliação da compatibilidade simbiótica, em plantas de L.
uliginosus, dos isolados de rizóbios obtidos de plantas de L. glaber
Entre os 30 isolados de rizóbios obtidos de plantas de L. glaber, 28
foram capazes de formar nódulos em plantas de L. uliginosus (Tabela 6) e
apenas dois isolados não induziram a nodulação (Tabela 6 e 8). Entre estes,
somente quatro isolados, UFRGS Lg5, Lg18, Lg109 e Lg111, foram capazes de
fixar nitrogênio em simbiose com plantas de L. uliginosus (Tabela 8). Os
resultados obtidos mostram que a maioria dos rizóbios isolados de L. glaber foi
capaz de formar nódulos em plantas de L. uliginosus (Tabela 6 e 8),
apresentando compatibilidade nodular, porém não foram capazes de fixar
nitrogênio simbioticamente, o que concorda com as observações realizadas em
estudo conduzido com rizóbios obtidos desta espécie (Estrella et al., 1997) e
que indicou a existência de um grupo simbiótico característico. Os resultados
obtidos neste trabalho indicam a existência de rizóbios potencialmente
24
parasitas para plantas da espécie L. uliginosus nas amostras de solos das
localidades estudadas no estado.
Tabela 8. Rizóbios obtidos de nódulos de plantas de L. glaber capazes de
induzir a nodulação e fixar nitrogênio em simbiose com plantas de L.
glaber e L. uliginosus sob condições de crescimento em tubos de
ensaio em lampadário
Inoculação em plantas de
L. glaber L. uliginosus
Rizóbios de
L. glaber
Nod
+
Fix
+
Nod
+
Fix
+
Local
Lg2 + + + - RP
Lg5 + + + + RP
Lg6 + + + - RP
Lg7 + + + - RP
Lg8 + + + - RP
Lg10 + + + - RP
Lg11 + + + - RP
Lg12 + + - - RP
Lg14 + + + - RP
Lg15 + + + - RP
Lg16 + + + - RP
Lg17 + + + - RP
Lg18 + + + + RP
Lg22 + + + - RP
Lg23 + + + - RP
Lg24 + + + - RP
Lg25 + + - - RP
Lg26 + + + - RP
Lg27 + + + - RP
Lg31 + + + - RP
Lg32 + + + - RP
Lg33 + + + - RP
Lg34 + + + - RP
Lg86 + - + - BG
Lg109 + + + + PA
Lg111 + + + + PA
Lg122 + + + - PA
Lg125 + + + - PA
Lg126 + + + - PA
Lg254 + - + - ES
Legenda: Nod
+
= nodulação positiva; Fix
+
= fixação de N positiva; += positiva;
- = negativo; RP = Rio Pardo; BG = Bagé; PA = Porto Alegre; ES = Eldorado do
Sul/RS
Observa-se que 90% dos rizóbios isolados de L. glaber induziram a
formação de nódulos em plantas de L. uliginosus crescidas em tubos de ensaio
em lampadário, indicando a existência de compatibilidade nodular entre os
rizóbios de L. glaber em plantas de L. uliginosus. Apenas os isolados UFRGS
25
Lg12 e Lg25 não foram capazes de nodular as plantas dessa espécie.
Observa-se que há a existência de compatibilidade simbiótica dos isolados de
L. glaber UFRGS Lg5, Lg18, Lg109 e Lg111 com as plantas de L. uliginosus.
Fontoura (2007), em seu trabalho de caracterização morfológica de isolados de
rizóbios isolados de plantas de L. glaber a partir de amostras de solo de
diversas regiões do Estado do Rio Grande do Sul, observou que, conforme as
características coloniais desses isolados, poderiam pertencer ao gênero
Mesorhizobium. De acordo com as observações feitas por Fontoura, pode-se
inferir que as plantas de L. uliginosus podem ser noduladas por esses rizóbios
isolados de L. glaber, pertencentes ao gênero Mesorhizobium. O que contraria
alguns autores (Baraibar et al., 1999), que relatam que plantas de L. uliginosus
são noduladas por rizóbios do gênero Bradyrhizobium.
4.2.3 Avaliação da compatibilidade simbiótica, em plantas de L.
uliginosus, dos isolados de rizóbios obtidos de plantas de L. subbiflorus
Entre os cinco isolados de rizóbios obtidos de plantas de L.
subbiflorus, três foram capazes de formar nódulos em plantas de L. uliginosus,
UFRGS Ls9, Ls51 e Ls59, mas somente o isolado UFRGS Ls9 foi capaz de
fixar nitrogênio simbioticamente tanto em L. subbiflorus como em L. uliginosus
(Tabela 6 e 9). Observa-se que os rizóbios Ls51, Ls52, Ls59 e Ls70, isolados
de amostras de Porto Alegre, não foram capazes de estabelecer simbiose
eficiente, pois não fixaram nitrogênio (Tabela 9). Fontoura (2007) salientou que
as amostras de solo provenientes de Eldorado do Sul, Passo Fundo e Porto
Alegre, correspondem a áreas experimentais onde têm sido cultivadas diversas
espécies de Lotus e outras leguminosas forrageiras. Desta forma, os isolados
de rizóbios capazes de induzir a nodulação em plantas de L. subbiflorus podem
não ser originados de população autóctone e sim de população de rizóbios
introduzida, adaptadas às condições de tais solos.
26
Tabela 9. Rizóbios obtidos de nódulos de plantas de L. subbiflorus capazes de
induzir a nodulação e fixar nitrogênio em simbiose com plantas de L.
subbiflorus e L. uliginosus sob condições de crescimento em tubos
de ensaio em lampadário
Inoculação em plantas de
L. subbiflorus
L. uliginosus
Rizóbios de
L. subbiflorus
Nod
+
Fix
+
Nod
+
Fix
+
Local
Ls9 + + + + MO
Ls51 + - + - PA
Ls52 + - - - PA
Ls59 + - + - PA
Ls70 + - - - PA
Legenda: Nod
+
= nodulação positiva; Fix
+
= fixação de N positiva; += positiva;
- = negativo; MO = Mostardas; PA = Porto Alegre/RS
4.2.4 Avaliação da compatibilidade simbiótica, em plantas de L.
uliginosus, L. subbiflorus, L. corniculatus e L. glaber, dos rizóbios de L.
uliginosus
Os 48 isolados de rizóbios nativos obtidos de plantas de L.
uliginosus foram avaliados quanto à capacidade de nodulação e fixação de
nitrogênio em L. uliginosus, espécie de onde foram isolados, bem como em
plantas de L. subbiflorus, L. corniculatus e L. glaber (Tabela 10). Embora todos
tenham induzido a formação de nódulos, 29 isolados (60%) foram capazes de
fixar nitrogênio em simbiose com plantas de L. uliginosus (Tabela 10).
Quando inoculados em plantas de L. subbiflorus, dos 47 isolados de
rizóbio estudados 37 apresentaram capacidade em induzir a formação de
nódulos e 10 (21% dos isolados) não foram capazes de formar nódulos nesta
espécie (Tabela 10).
Dentre os 47 isolados de L. uliginosus estudados em L. subbiflorus,
19 foram capazes de formar nódulos e fixar nitrogênio simbioticamente tanto
em plantas de L. uliginosus como em L. subbiflorus, sendo estes os isolados
Lu5, Lu8, Lu9, Lu11, Lu13, Lu14, Lu18, Lu19, Lu20, Lu22b, Lu23, Lu24, Lu25,
Lu30, Lu35a, Lu35b, Lu36, Lu39 e Lu40 (Tabela 10).
Quando inoculados em plantas de L. corniculatus, observou-se que
35 dos isolados de rizóbios obtidos de L. uliginosus foram capazes de induzir a
formação de nódulos (Tabela 10) e 12 destes, os isolados UFRGS Lu2, Lu13,
Lu20, Lu25, Lu32, Lu37, Lu45, Lu53, Lu54, Lu57, Lu61 e Lu65 fixaram N
simbioticamente nas condições do experimento.
27
Tabela 10. Isolados de rizóbios obtidos de raízes de L. uliginosus capazes de
induzir a nodulação e fixar nitrogênio em simbiose com plantas de L.
uliginosus, L. subbiflorus, L. corniculatus e L. glaber sob condições
de crescimento em tubos de ensaio em lampadário
Inoculação em plantas de
L.uliginosus L.subbiflorus
L.corniculatus L.glaber
Rizóbios
de Lotus
uliginosus
Nod
+
Fix
+
Nod
+
Fix
+
Nod
+
Fix
+
Nod
+
Fix
+
Local
Lu2 + - + - + + + - MO
Lu4 + + - - + - - - MO
Lu5 + + + + + - - - MO
Lu7 + - + + - - + - MO
Lu8 + + + + + - - - MO
Lu9 + + + + + - + - MO
Lu10 + - + + + - + - MO
Lu11 + + + + - - - - MO
Lu12 + - + + + - - - MO
Lu13 + + + + + + + - MO
Lu14 + + + + + - - - MO
Lu15 + + - - - - - - MO
Lu16 + + + - + - + - MO
Lu17 + - + + + - - - MO
Lu18 + + + + + - - - MO
Lu19 + + + + + - - - MO
Lu20 + + + + + + - - MO
Lu21 + - + + - - + - MO
Lu22b + + + + + - - - MO
Lu23 + + + + + - - - MO
Lu24 + + + + + - + - MO
Lu25 + + + + + + - - MO
Lu26 + + + - - - - - MO
Lu28 + - + - - - - - MO
Lu30 + + + + + - + - MO
Lu31 + + + + + - + - MO
Lu32 + + + - + + - - ES
Lu33 + + - - + - - - ES
Lu35a + + + + - - + + ES
Lu35b + + + + - - - - ES
Lu36 + + + + + - + - ES
Lu37 + - + + + + + - ES
Lu38 + + + - - - + + ES
Lu39 + + + + - - + - ES
Lu40 + + + + - - - - ES
Lu45 + - + - + + + - ES
Lu47 + - + - + - + - ES
Lu49 + + - - - - - - ES
Lu53 + - - - + + + - HN
Lu54 + - NA NA + + NA NA HN
Legenda: Nod
+
= nodulação positiva; Fix
+
= fixação de N positiva; += positiva;
-=negativo; NA= não avaliado; MO= Mostardas; ES= Eldorado do Sul;
HN= Hulha Negra – RS
28
Tabela 10. Continuação...
Lu55 + + - - + - + + HN
Lu57 + - - - + + + + HN
Lu58 + - + - + - + - HN
Lu60 + - - - + - + - HN
Lu61 + - - - + + + - HN
Lu62 + - - - + - + + HN
Lu64 + - + + - - + - HN
Lu65 + - + - + + + + HN
Legenda: Nod
+
= nodulação positiva; Fix
+
= fixação de N positiva; += positiva;
- = negativo; NA= não avaliado; MO= Mostardas; ES= Eldorado do Sul;
HN= Hulha Negra/RS.
Os isolados Lu13, Lu20 e Lu25 além de estabelecer simbiose
eficiente com as plantas de L. uliginosus, também foram eficientes nas plantas
de L. subbiflorus e L. corniculatus (Tabela 10), indicando compatibilidade
simbiótica desses isolados com estas espécies de Lotus. Observa-se que 27%
dos rizóbios isolados de L. uliginosus, estudados nesse trabalho, não induziram
a formação de nódulos em plantas de L. corniculatus (Tabela 10), mas
formaram nódulos e 19% fixaram nitrogênio em plantas de L. uliginosus. O fato
de rizóbios de L. uliginosus terem sido capazes de induzir a nodulação em
plantas de L. corniculatus indica que plantas dessa espécie podem ser
noduladas não só por Meshorhizobium, mas também por Bradyrhizobium.
Esses dados confirmam as observações realizadas por Jarvis et al. (1997), de
que plantas da espécie L. corniculatus são capazes de formar nódulos em
simbiose com Meshorhizobium e Bradyrhizobium. Os isolados de L. uliginosus,
utilizados neste estudo, foram caracterizados como de crescimento lento,
indicando ser pertencentes ao gênero Bradyrhizobium. (Frizzo, 2007).
Quando o estudo foi realizado com plantas de L. glaber, observou-se
que dentre os 47 rizóbios de L. uliginosus estudados, 25 (55%) apresentaram
capacidade em induzir nodulação (Tabela 10), mas apenas os isolados UFRGS
Lu35a, Lu38, Lu55, Lu57, Lu62 e Lu65 foram capazes de fixar nitrogênio em
simbiose com as plantas de L. glaber sob as mesmas condições do
experimento em lampadário. Observa-se também que 45% dos rizóbios
isolados de L. uliginosus, estudados nesse trabalho, não induziram a formação
de nódulos em plantas de L. glaber. Observações semelhantes foram relatadas
por Fulchieri et al. (2001), para rizóbios nativos isolados de L. glaber que foram
capazes de induzir a nodulação em plantas da espécie L. uliginosus. Esses
29
isolados também foram caracterizados como sendo de crescimento lento,
assim como os isolados de L. uliginosus caracterizados por Frizzo (2007) e
utilizado neste estudo. Barrientos et al. (2002), avaliando a eficiência simbiótica
de estirpes naturalizadas de Mesorhizobium loti e Bradyrhizobium sp. (Lotus),
provenientes de solos da região centro-sul do Chile, em plantas de três
espécies do gênero Lotus, também observou que dos 68 isolados inoculados
em plantas de L. glaber, apenas 11 induziram a formação de nódulos. Esses
isolados de rizóbios corresponderiam a Bradyrhizobium sp. e Mesorhizobium
loti, obtidos de plantas de L. uliginosus e L. glaber, respectivamente.
4.2.5 Avaliação da compatibilidade simbiótica, em plantas de L.
uliginosus, L. subbiflorus, L. corniculatus e L. glaber, dos rizóbios
obtidos de L. subbiflorus e L. glaber
Os 10 isolados de rizóbios nativos obtidos de raízes de L. subbiflorus
foram avaliados quanto à capacidade de nodulação e fixação de N em L.
subbiflorus, espécie de onde foram isolados, bem como em plantas de L.
glaber e L. corniculatus (Tabela 11).
Tabela 11. Isolados de rizóbios obtidos de raízes de L. subbiflorus e L. glaber
capazes de induzir a nodulação e fixar nitrogênio em simbiose com
plantas de L. subbiflorus, L. corniculatus e L. glaber sob condições
de crescimento em tubos de ensaio em lampadário
Inoculação em plantas de
L.subbiflorus L.corniculatus L. glaber Local
Rizóbios
Nod
+
Fix
+
Nod
+
Fix
+
Nod
+
Fix
+
L. subbiflorus
Ls1 + + + + - - MO
Ls22 + + + - - - MO
Ls23 + - + - - - MO
Ls29 + + + - + - MO
Ls36 + - + - + - MO
Ls50 + + + - - - PA
Ls54 + - + - - - PA
Ls57 + + + - + - PA
Ls62 + + + - + - PA
Ls65 + + + - + - PA
EEL698 + + + - - - LG
Isolados da coleção da UFRGS; estirpe da coleção da Estação Experimental
de Lages; Legenda: Nod
+
= nodulação positiva; Fix
+
= fixação de N positiva;
+= positiva; -=negativo; MO= Mostardas; PA= Porto Alegre; PF= Passo Fundo;
RP= Rio Pardo - RS; LG= Lages - SC.
30
Tabela 11. Continuação...
L. glaber
Lg4 - - + + + + RP
Lg13 - - + + + + RP
Lg29 + + + + + + RP
Lg108 - - + + + + PA
Lg121 - - + + + + PA
Lg149 - - + + + + PF
Lg156 - - + + + + PF
Isolados da coleção da UFRGS; estirpe da coleção da Estação Experimental
de Lages; Legenda: Nod
+
= nodulação positiva; Fix
+
= fixação de N positiva;
+= positiva; -=negativo; MO= Mostardas; PA= Porto Alegre; PF= Passo Fundo;
RP= Rio Pardo - RS; LG= Lages - SC.
Todos os isolados de rizóbios nativos obtidos de plantas de L.
subbiflorus UFRGS Ls1, Ls22, Ls23, Ls29, Ls36, Ls50, Ls54, Ls57, Ls62 e
Ls65, foram capazes de induzir a nodulação quando inoculados em plantas de
L. corniculatus (Tabela 11). E destes, somente o isolado UFRGS Ls1 fixou
nitrogênio em simbiose com plantas de L. corniculatus (Tabela 11). Fontoura
(2007) avaliou a eficiência relativa da fixação de N do isolado UFRGS Ls1, em
experimento com plantas de L. subbiflorus em casa de vegetação, e observou
índice de eficiência relativa acima de 70%, em comparação ao tratamento
controle sem inoculação com adição de nitrogênio mineral, sendo também
superior ao obtido nas plantas inoculadas com a estirpe SEMIA 849, que é
recomendada como inoculante comercial para essa espécie no Brasil, e que
apresentou índice de eficiência relativa de apenas 20%.
Quando esses mesmos 10 isolados foram inoculados em plantas de
L. glaber, verificou-se que apenas os isolados UFRGS Ls29, Ls36, Ls57, Ls62
e Ls65 apresentaram capacidade de induzir a formação de nódulos, mas não
de fixar N simbioticamente nessa espécie de Lotus (Tabela 11).
Os isolados de rizóbios nativos obtidos de plantas de L. glaber
UFRGS Lg4, Lg13, Lg29, Lg108, Lg121, Lg149 e Lg156 foram avaliados
quanto à capacidade de nodulação e fixação de nitrogênio em L. glaber,
espécie de onde foram isolados, bem como em L. corniculatus e L. subbiflorus
(Tabela 11). Todos esses sete isolados apresentaram capacidade em induzir a
nodulação e fixar N simbioticamente nas plantas de L. glaber, espécie de onde
foram isolados e em L. corniculatus. O isolado UFRGS Lg29 também foi capaz
31
de induzir a nodulação e fixar nitrogênio em simbiose também com plantas de
L. subbiflorus, indicando a compatibilidade simbiótica deste isolado com esta
espécie de Lotus.
Observou-se que, em média, 65% dos rizóbios obtidos de plantas de
L. corniculatus e L. glaber foram capazes de induzir e fixar N em plantas de L.
uliginosus. No entanto, apenas 13% dos isolados de L. uliginosus e L.
subbiflorus foram capazes de induzir a nodulação em L. corniculatus e L.
glaber. Portanto, muitos dos rizóbios estudados são capazes de induzir a
nodulação em outras espécies de Lotus que não a de onde foram obtidos,
contrariando as observações de Hernández et al. (2005) da existência de
grupos simbióticos entre espécies de Lotus e algumas estirpes de rizóbios e de
que esses grupos não são compatíveis entre si. Os resultados deste trabalho
mostram que existem rizóbios capazes de realizar simbiose eficiente em
espécies diferentes de Lotus, sendo mais promíscuos e constituindo-se em
grupo promissor para futuros estudos, sendo os rizóbios UFRGS Lu13, Lu20,
Lu25, Lg29 os que apresentaram capacidade de estabelecer simbiose eficiente
em experimento em tubos em outras espécies de Lotus, conforme já discutido
anteriormente nos itens 4.2.4 e 4.2.5.
4.3 Avaliação da compatibilidade simbiótica dos isolados de
rizóbios nativos inoculados em plantas de Lotus em casa de vegetação
Para estes experimentos, foram escolhidos os isolados UFRGS
Lc340, obtido de L. corniculatus e estudado por Frizzo (2007) e Lg5, Lg109,
Lg111, obtidos de L. glaber e estudados por Fontoura (2007). Estes isolados
foram escolhidos para a avaliação por terem induzido a formação de nódulos
eficientes em plantas da espécie de onde foram obtidos, e em outras espécies
de Lotus quando avaliados em tubos (Tabelas 7 e 8). Além destes isolados,
também foram estudadas as estirpes SEMIA 830, para L. glaber, SEMIA 839,
para L. uliginosus, que são recomendadas para a produção de inoculantes no
Brasil, e SEMIA 850, recomendada para L. subbiflorus no Brasil, as estirpes
EEL698, para L. subbiflorus, EEL8084, para L. uliginosus, e as estirpes U510,
recomendada no Uruguai para cornichão (L. corniculatus), e U512 (em estudo
no Uruguai -MGAP).
32
Cabe destacar que para fins de comparações de eficiência
simbiótica, foram utilizados os resultados obtidos nos tratamentos inoculados
com as estirpes recomendadas para a espécie de Lotus estudada em cada
experimento.
4.3.1 Avaliação da compatibilidade simbiótica dos isolados de
rizóbios nativos inoculados em plantas de L. corniculatus em casa de
vegetação
Na Tabela 12, são mostrados os valores médios do número e massa
seca de nódulos, bem como da massa seca e quantidade de nitrogênio total da
parte aérea, produzidos nas plantas de L. corniculatus dos tratamentos
inoculados com as estirpes e com os isolados de rizóbios. O tratamento
inoculado com a estirpe U510, recomendada para produção de inoculantes
para L. corniculatus no Uruguai, foi utilizado para comparação com os
resultados obtidos nos demais tratamentos.
O número de nódulos por planta em L. corniculatus variou de 133 a
261 (Tabela 12). As plantas de todos os tratamentos inoculados apresentaram
nódulos radiculares não sendo observada nenhuma diferença no número de
nódulos por planta nem na massa seca de nódulos (Tabela 12). Estes
resultados mostram que, em termos de capacidade para nodulação, todos os
rizóbios estudados apresentaram elevada capacidade para induzir a formação
de nódulos em plantas de L. corniculatus, cultivar São Gabriel, apesar do fato
de esta não ser a espécie para a qual são recomendados.
Neste trabalho, as plantas de L. corniculatus inoculadas com rizóbios
obtidos de outras espécies e de L. corniculatus (isolado UFRGS Lc340)
apresentaram número médio de nódulos maior do que o observado por Frizzo
(2007), com rizóbios obtidos de L. corniculatus e inoculados nas plantas da
mesma espécie (em média, 81 nódulos por planta) e também superaram os
valores observados por Barrientos et al. (2002), em trabalho com estirpes
nativas dos solos chilenos, obtidos de L. glaber, que também foram capazes de
formar poucos nódulos em plantas de L. corniculatus, em média um nódulo por
planta.
33
Tabela 12. Número e massa seca de nódulos e massa seca e quantidade de
nitrogênio acumulado na parte aérea de plantas de Lotus
corniculatus, inoculadas com isolados de rizóbios e estirpes, em
experimento conduzido em casa de vegetação
Tratamento
N° de
nódulos
planta
-1
*
Massa seca
de nódulos
Massa seca
da parte
aérea
Quantidade
de
nitrogênio
--------------------mg planta
-1
--------------------
EEL698 169 a 99,7 a 1286,5 a
46,6 a
U510 179 a 87,5 a 1053,7 b
40,7 a
U512 133 a 81,2 a 955,7 c
39,8 a
UFRGS Lg111 168 a 74,2 a 928,5 c
38,1 a
UFRGS Lg109 172 a 94,0 a 870,7 c
34,9 a
EEL8084 261 a 94,5 a 961,5 c
31,4 b
UFRGS Lg5 195 a 83,5 a 659,5 d
26,7 b
UFRGS Lc340 229 a 90,5 a 751,0 d
25,7 b
T-N - - 28,0 e
0,2 c
CV (%) 23 16,9 16,6
17,2
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem significativamente
pelo teste de Scott-Knott a 5%. Médias de quatro repetições. *Dados
transformados por (x+1)
1/2
Analisando-se a produção de massa seca (Tabela 12) verifica-se
que a maior produção foi obtida nas plantas inoculadas com a estirpe EEL698,
para L. subbiflorus. A segunda maior produção de massa seca foi obtida nas
plantas inoculadas com a estirpe U510, para L. corniculatus, sendo superior à
obtida nas plantas dos demais tratamentos. Já em relação à quantidade de
nitrogênio total acumulado na parte aérea das plantas inoculadas, observa-se
que todos os rizóbios foram capazes de fornecer nitrogênio às plantas via
simbiose (Tabela 12). No entanto, as maiores quantidades de nitrogênio total
foram obtidos nas plantas inoculadas com as estirpes EEL698, U510 e U512 e
com os isolados UFRGS Lg111 e Lg 109. Destes rizóbios, apenas a estirpe
U510 é para L. corniculatus, porém os demais não diferiram na eficiência na
fixação de nitrogênio em relação a esta estirpe (Figura 1). Observa-se também
que entre os rizóbios mais eficientes na fixação de nitrogênio, exceto a estirpe
EEL698, os demais são rizóbios para L. glaber e que teriam compatibilidade
simbiótica com L. corniculatus. Resultados semelhantes foram obtidos por
Barrientos et al. (2002), que observaram que em L. corniculatus três dos oito
isolados obtidos de plantas de L. glaber foram capazes de induzir a nodulação
e que esses isolados corresponderiam a Mesorhizobium loti. Ao contrário do
34
que se observou no presente trabalho e também por Barrientos et al. (2002), a
compatibilidade simbiótica entre as espécies de L. glaber e L. corniculatus não
foi observada por Estrella et al. (1997), uma vez que a estirpe de L. glaber 1-
INTECH induziu a formação de nódulos em L. corniculatus, porém não foram
eficientes na fixação de nitrogênio.
No entanto, chama a atenção o fato de que a estirpe EEL698, para L.
subbiflorus, tenha tido eficiência relativa na fixação de nitrogênio similar à
observada para a estirpe U510, para L. corniculatus. Também a estirpe
EEL8084, para L. uliginosus, foi capaz de fixar nitrogênio em simbiose com
plantas de L. corniculatus, embora tenha apresentado apenas 77% de
eficiência em relação à estirpe U510 (Figura 1). Estes resultados indicam a
existência de rizóbios eficientes em plantas de outras espécies de Lotus, que
não a de onde foram isolados, indicando compatibilidade simbiótica e
mostrando potencial para serem usados em inoculantes funcionais para
espécies de Lotus.
U510
EEL698
U512
UFRGS Lg111
UFRGS Lg109
EEL8084
UFRGS Lg5
UFRGS Lc340
T-N
Eficiência relativa (%)
0
20
40
60
80
100
120
140
a
a
a
a
a
b
b
b
c
Figura 1. Índice de eficiência relativa de fixação biológica de nitrogênio (%) em
comparação à estirpe U510, das estirpes e isolados de rizóbios
inoculados em plantas de Lotus corniculatus, em experimento
conduzido em casa de vegetação
35
4.3.2 Avaliação da compatibilidade simbiótica dos isolados de
rizóbios nativos inoculados em plantas de L. glaber em casa de vegetação
Os valores médios de número e massa seca de nódulos e também
massa seca e quantidade de N acumulado na parte aérea das plantas de L.
glaber são mostrados na Tabela 13. Neste experimento, o número de nódulos
por planta em L. glaber variou de 46 a 233 (Tabela 13). Salienta-se que a
estirpe SEMIA 830 é atualmente recomendada para produção de inoculantes
para L. glaber (syn. L. tenuis) no Brasil. No entanto, pode-se observar na
Tabela 13 que esta estirpe produziu baixo número de nódulos e se mostrou
ineficiente na fixação simbiótica de nitrogênio nas plantas inoculadas. Observa-
se que a quantidade de nitrogênio total acumulado nas plantas inoculadas com
esta estirpe não diferiu do obtido nas plantas do tratamento controle não
inoculado e sem adição de nitrogênio (Tabela 13).
Os isolados de rizóbios nativos UFRGS Lg109 e Lg5, obtidos de L.
glaber, induziram a formação de maior número de nódulos radiculares do que
os demais (Tabela 13). As plantas inoculadas com as estirpes EEL 8084, para
L. uliginosus, e EEL698, para L. subbiflorus, apresentaram número de nódulos
intermediário, mas superior ao produzido nas plantas inoculadas pelos isolados
UFRGS Lg111, Lc340 e pelas estirpes U512 e a SEMIA 830, que produziu em
média 87 nódulos por planta. Resultados semelhantes foram encontrados por
Fontoura (2007), que observou que plantas de L. glaber inoculadas com a
estirpe SEMIA 830 produziram poucos nódulos (em média 98 nódulos por
planta) em relação às inoculadas com outros isolados obtidos de L. glaber, em
experimento em casa de vegetação.
Em relação à produção de massa seca de nódulos formados nas
plantas de L. glaber dos tratamentos inoculados com o isolado UFRGS Lg109 e
a estirpe EEL698 foram superiores aos demais tratamentos que não diferiram
da massa de nódulos formada nas plantas inoculadas com a estirpe SEMIA
830 (Tabela 13). Os isolados estudados neste trabalho apresentaram
capacidade em induzir maior número de nódulos em plantas de L. glaber,
principalmente dos rizóbios que não foram isolados dessa espécie, quando
comparados aos resultados obtidos por Barrientos et al. (2002) com rizóbios
36
isolados dos solos da região do Chile, onde a maior nodulação foi de 2 nódulos
por planta.
Tabela 13. Número e massa seca de nódulos, massa seca e quantidade de
nitrogênio acumulado na parte aérea de plantas de Lotus glaber
inoculadas com isolados e estirpes de rizóbios, em experimento
conduzido em casa de vegetação
Tratamento
N° de
nódulos
planta
-1
*
Massa seca
de nódulos
Massa seca
da parte
aérea
Quantidade
de
nitrogênio
--------------------mg planta
-1
--------------------
UFRGS Lg109 233 a 115,7 a 1249,7 a
44,3 a
EEL8084 118 b 61,5 b 802,2 b
27,4 b
U512 77 c 70,5 b 732,7 b
23,6 b
EEL698 138 b 86,7 a 716,5 b
23,6 b
UFRGS Lg111 79 c 68,0 b 659,0 b
21,3 b
UFRGS Lg5 181 a 60,2 b 575,2 b
17,6 b
UFRGS Lc340 46 c 52,2 b 354,2 c
9,1 c
SEMIA 830 87 c 32,0 b 218,7 c
8,2 c
T-N 0 0 31,2 c
0,4 c
CV (%) 18,61 31,21 41,4
40,7
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem significativamente
pelo teste de Scott-Knott a 5%. Médias de quatro repetições. *Dados
transformados por (x+1)
1/2
.
Avaliando-se a produção de massa seca da parte aérea (Tabela 13),
observa-se que as plantas de L. glaber inoculadas com o isolado UFRGS
Lg109 produziram maior massa e também de maior acúmulo de nitrogênio total
na parte aérea do que as inoculadas nos demais tratamentos. As plantas
inoculadas com os isolados UFRGS Lg111, Lg5 e com as estirpes EEL8084,
EEL698, e U512 apresentaram produção de massa seca da parte aérea
intermediária, sendo superiores aos tratamentos inoculados com o isolado
UFRGS Lc340, a estirpe SEMIA 830 e o controle não inoculado e sem adição
de N. Apesar destes isolados terem induzido a formação de poucos nódulos,
esses tratamentos apresentaram boa produção de massa seca da parte aérea,
indicando que esses rizóbios foram eficientes na fixação de nitrogênio, pois
foram capazes de suprir o nitrogênio requerido pela planta.
As plantas de L. glaber do tratamento inoculado com o isolado
UFRGS Lg109 acumularam os maiores teores de N fixado, sendo superiores
aos demais tratamentos e principalmente ao tratamento inoculado com a
37
estirpe SEMIA 830 (Tabela 13), atualmente recomendada para essa espécie no
Brasil. O isolado Lg109 apresentou índice de eficiência relativa na fixação de N
de 600% em relação à estirpe SEMIA 830 (Figura 2).
SEMIA 830
UFRGS Lg 109
UFRGS Lg 5
UFRGS Lg 111
U512
EEL Ls 698
EEL Lu 8084
UFRGS Lc 340
T-N
Eficiência relativa (%)
0
100
200
300
400
500
600
700
a
b
b
b
b
b
c
c
c
Figura 2. Índice de eficiência relativa de fixação biológica de nitrogênio (%) em
comparação à estirpe SEMIA 830, das estirpes e isolados de rizóbios
inoculados em plantas de L. glaber, em experimento conduzido em
casa de vegetação.
Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que a estirpe
SEMIA 830 apresenta problemas de eficiência na fixação simbiótica de N em
plantas de L. glaber (Tabela 13). Resultados semelhantes foram obtidos por
Fontoura (2007), que observou baixa eficiência relativa na fixação simbiótica de
nitrogênio dessa estirpe. Perdas de eficiência em estirpes de rizóbios já foram
observadas anteriormente. Brose (1992b), em um estudo de seleção de rizóbio
para L. pedunculatus (syn. L. uliginosus) em solo ácido, observou que duas
estirpes de Rhizobium EEL40 (de mesma origem da estirpe USDA 3469) e a
USDA 3470 (Beltsville Rhizobium Culture Colletion, Estados Unidos) que
apresentaram boa nodulação, no entanto, foram ineficientes na fixação
biológica do nitrogênio.
38
Já as plantas inoculadas com o isolado UFRGS Lc340, obtido de L.
corniculatus, apresentaram baixo acúmulo de nitrogênio fixado, em relação aos
demais isolados deste estudo, não diferindo das plantas inoculadas com a
estirpe SEMIA 830 e do tratamento controle não inoculado e sem adição de N
(Tabela 13). Observa-se que esse isolado, embora tenha sido obtido de L.
corniculatus, espécie do mesmo grupo de compatibilidade simbiótica de L.
glaber proposto por Hernández et al. (2005), foi ineficiente na fixação simbiótica
de nitrogênio, apesar de ter apresentado 100% na eficiência relativa na fixação
de N em relação à estirpe SEMIA 830 (Figura 2).
4.3.3 Avaliação da compatibilidade simbiótica dos isolados de
rizóbios nativos inoculados em plantas de L. subbiflorus em casa de
vegetação
Os valores médios de número e massa seca de nódulos bem como
a massa seca e a quantidade de N acumulado na parte aérea de plantas de L.
subbiflorus são mostrados na Tabela 14. O tratamento inoculado com a estirpe
SEMIA 850, recomendada para produção de inoculantes para L. subbiflorus no
Brasil, foi utilizado para comparação com os resultados obtidos nos demais
tratamentos.
Na Tabela 14, observa-se que as plantas inoculadas com o isolado
UFRGS Lc340 e as estirpes EEL698, SEMIA 850 e U512, apresentaram os
maiores números de nódulos formados. Embora o isolado UFRGS Lc340 e a
estirpe U510 sejam rizóbios para L. corniculatus, o número de nódulos
induzidos por estes não diferiu do produzido pelas plantas inoculadas com as
estirpes SEMIA 850 e EEL 698 que são para L. subbiflorus. Apesar de não
haver diferença estatística entre os resultados de número de nódulos nas
plantas inoculadas com estes rizóbios, pode-se observar que o isolado UFRGS
Lc340 induziu mais do que o dobro do número de nódulos radiculares da
estirpe U510 em plantas de L. subbiflorus (Tabela 14).
Por outro lado, os isolados de rizóbio UFRGS Lg111 e Lg109,
obtidos de plantas de L. glaber, e a estirpe EEL8084, para L. uliginosus, não
foram capazes de estabelecer simbiose com plantas de L. subbiflorus em
condições de casa de vegetação (Tabela 14). Observou-se a formação de
39
baixo número de nódulos nas raízes das plantas inoculadas com o isolado
UFRGS Lg109 e a com estirpe EEL8084, e nódulos muito pequenos e
ineficientes (primórdios nodulares) naquelas inoculadas com o isolado UFRGS
Lg111. Fenômeno semelhante foi relatado por Baraibar et al. (1999), em um
estudo com 50 isolados de rizóbios, provenientes de dez solos do Uruguai,
onde a formação de nódulos pequenos e ineficientes foi observada quando
esses isolados foram inoculados em plantas de L. subbiflorus e L. uliginosus.
Esses resultados podem indicar a existência de incompatibilidade simbiótica
entre alguns rizóbios como os isolados UFRGS LG109 e Lg111, para L. glaber,
e estirpes como a EEL8084, para L. uliginosus, e plantas da espécie L.
subbiflorus.
Tabela 14 Número e massa seca de nódulos, massa seca e quantidade de
nitrogênio acumulado na parte aérea de plantas de L. subbiflorus
inoculadas com isolados e estirpes de rizóbios em experimento
conduzido em casa de vegetação
Tratamento
N° de
nódulos
planta
-1
*
Massa seca
de nódulos
Massa seca
da parte
aérea
Quantidade de
nitrogênio
--------------------mg planta
-1
--------------------
UFRGS Lc340 212 a 69,0 a
1462,2 a 53,6 a
SEMIA 850 149 a 72,7 a
1423,0 a 50,5 a
EEL698 141 a 61,7 a
615,5 b 18,8 b
U512 94 a 30,0 b
389,7 b 12,7 b
EEL8084 8 b 1,0 c
68,7 c 0,5 c
UFRGS Lg109 8 b 2,5 c
56,0 c 0,5 c
UFRGS Lg111 0 0
57,7 c 0,3 c
T-N 0 0
57,5 c 0,3 c
CV (%) 24,4 38,2 30,9 34,1
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem significativamente
pelo teste de Scott-Knott a 5%. Médias de quatro repetições. *Dados
transformados por (x+1)
1/2
A massa seca dos nódulos formados nas plantas de L. subbiflorus
dos tratamentos inoculados com o isolado UFRGS Lc340, e com as estirpes
EEL698 e SEMIA 850, recomendada para inoculante comercial para L.
subbiflorus no Brasil, foi superior aos demais tratamentos (Tabela 14).
Já os isolados UFRGS Lg109, Lg111, para L. glaber, e a estirpe
EEL8084, para L. uliginosus, não foram capazes de estabelecer simbiose
40
eficiente com plantas de L. subbiflorus, que não diferiram em relação à massa
seca da parte aérea e teor de N fixado das plantas do tratamento controle sem
inoculação e sem adição de N. Estes resultados demonstram a existência de
incompatibilidade simbiótica destes rizóbios com plantas de L. subbiflorus. A
incompatibilidade simbiótica de rizóbios de L. glaber em plantas de L.
subbiflorus já foi observada por outros autores (Baraibar et al., 1999),
sugerindo, desta forma, a existência de grupos de compatibilidade (Hernández
et al., 2005), onde as espécies L. glaber e L. subbiflorus são pertencentes a
grupos distintos. No entanto, observou-se que, no experimento realizado em
tubos, o isolado Lg 29, obtido de L. glaber, induziu a formação de nódulos e a
fixação de N em plantas de L. subbiflorus (Tabela 11), o que contradiz a
existência de grupos de compatibilidade simbiótica, proposta por Hernández et
al. (2005).
A produção de massa seca da parte aérea das plantas de L.
subbiflorus inoculadas com as estirpes EEL698, para L. subbiflorus e U512
foram inferiores àquela produzida nas plantas inoculadas com a estirpe SEMIA
850 e com o isolado UFRGS Lc340, embora não tenham diferido quanto ao
número de nódulos formados (Tabela 14).
Quanto à quantidade de nitrogênio fixado na parte aérea das plantas
inoculadas com o isolado UFRGS Lc340 e com a estirpe SEMIA 850, observa-
se que foram semelhantes entre si e superiores aos demais tratamentos
(Tabela 14). Também se pode observar que os isolados UFRGS Lg109, Lg111
e a estirpe EEL 8084 não foram capazes de formar simbiose eficiente nas
plantas de L. subbiflorus que não diferiram das plantas do tratamento controle
sem inoculação e sem adição de nitrogênio.
O isolado UFRGS Lc340, obtido de L. corniculatus, apresentou um
índice de eficiência relativa na fixação simbiótica do nitrogênio de 109%, em
relação ao tratamento inoculado com a estirpe SEMIA 850 (Figura 3),
mostrando compatibilidade simbiótica com plantas de L. subbiflorus. Já as
estirpes EEL698 e U512 apresentaram um índice de eficiência relativa na
fixação de nitrogênio abaixo de 40%, em relação ao tratamento inoculado com
a estirpe SEMIA 850, sendo consideradas ineficientes.
41
SEMIA 850
UFRGS Lc340
EEL698
U512
EEL8084
UFRGS Lg109
UFRGS Lg111
T-N
Eficiência relativa (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
a
b
a
b
c c
c c
Figura 3. Índice de eficiência relativa da fixação biológica do nitrogênio (%) em
comparação a estirpe SEMIA 850, dos isolados e estirpes de rizóbios
inoculados em plantas de L. subbiflorus, em experimento conduzido
em casa de vegetação.
Os demais tratamentos inoculados com os isolados UFRGS Lg109 e
Lg111 e com a estirpe EEL8084 apresentaram índice de eficiência relativa na
fixação de N inferior a 1% em relação à estirpe SEMIA 850, indicando que não
ocorreu simbiose eficiente com as plantas de L. subbiflorus (Figura 3).
4.3.4 Avaliação da compatibilidade simbiótica dos isolados de
rizóbios nativos inoculados em plantas de L. uliginosus em casa de
vegetação
Na Tabela 15, são mostrados os valores médios de número e massa
seca de nódulos, bem como a massa seca e quantidade de N acumulado na
parte aérea das plantas de L. uliginosus. O tratamento inoculado com a estirpe
SEMIA 839, recomendada para produção de inoculantes para L. uliginosus no
Brasil, foi utilizado para comparação com os resultados obtidos nos demais
tratamentos. As plantas do tratamento inoculado com a estirpe EEL8084, para
L. uliginosus, foram perdidas devido ao ataque de pragas no início do
42
experimento. Desta forma, não são apresentados resultados deste tratamento
na Tabela 15.
Tabela 15. Número e massa seca de nódulos, massa seca e quantidade de
nitrogênio acumulado na parte aérea de plantas de Lotus uliginosus
inoculadas com isolados e estirpes de rizóbios em experimento
conduzido em casa de vegetação
Tratamento
N° de
nódulos
planta
-1
*
Massa seca
de nódulos
Massa seca
da parte
aérea
Quantidade
de
nitrogênio
--------------------mg planta
-1
--------------------
SEMIA 839 235 a 118,7 a 1442,7 a 55,1 a
UFRGS Lc340 115 c 96,5 a 1213,0 a 40,2 b
EEL698 170 b 122,0 a 714,7 b 18,7 c
U512 128 c 105,0 a 516,5 c 17,4 c
UFRGS Lg111 29 d 32,7 b 408,7 c 10,8 c
UFRGS Lg5 9 e 9,5 b 73,7 d 1,4 d
UFRGS Lg109 0 0 55,0 d 0,3 d
EEL8084 - - - -
T-N 0 0 46,0 d 0,2 d
CV (%) 14,3 25,9 29,5 27,2
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem significativamente
pelo teste de Scott-Knott a 5%. Médias de quatro repetições. * Dados
transformados por (x+1)
1/2
As plantas do tratamento inoculado com a estirpe SEMIA 839
apresentaram maior número de nódulos do que as dos demais tratamentos
inoculados (Tabela 15), seguidas pelo número de nódulos das plantas dos
tratamentos inoculados com a estirpe EEL698, para L. subbiflorus, e com o
isolado UFRGS Lc340, obtido de L. corniculatus, e com a estirpe U512. Estes
resultados indicam a existência de compatibilidade simbiótica da estirpe
EEL698, de L. subbiflorus, e do isolado UFRGS Lc340, de L. corniculatus, com
as plantas de L. uliginosus. Observações semelhantes foram relatadas por
Frizzo (2007), que observou que o isolado UFRGS Ls54, obtido de plantas de
L. subbiflorus, apresentou capacidade em formar nódulos e eficiência na
fixação simbiótica de nitrogênio em plantas de L. uliginosus em experimento
conduzido em casa de vegetação.
A massa seca dos nódulos formados nas plantas inoculadas com as
estirpes SEMIA 839, EEL698, U512 e com o isolado UFRGS Lc340, foi
43
superior à formada nas plantas inoculadas dos demais tratamentos (Tabela
15).
Observa-se que o isolado UFRGS Lg109, obtido de plantas de L.
glaber, não foi capaz de estabelecer simbiose eficiente com plantas de L.
uliginosus, nas condições do experimento em casa de vegetação, pois não
induziram a formação de nódulos (Tabela 15), verificando-se apenas a
presença de primórdios nodulares.
A produção de matéria seca da parte aérea das plantas de L.
uliginosus inoculadas com a estirpe SEMIA 839 e com o isolado UFRGS Lc340
foi semelhante nestes tratamentos e superior aos demais (Tabela 15).
Observa-se também que a massa seca da parte aérea das plantas de L.
uliginosus inoculadas com os isolados UFRGS Lg5, que induziu a formação de
poucos nódulos, e com o isolado UFRGS Lg109, que não formou nódulos,
ambos obtidos de L. glaber não diferiu da produzida pelas plantas do
tratamento controle sem inoculação e sem adição de N.
A quantidade de nitrogênio acumulada na parte aérea das plantas de
L. uliginosus (Tabela 15) inoculadas com a estirpe SEMIA 839 foi superior ao
obtido nos demais tratamentos inoculados, seguido pela quantidade de
nitrogênio acumulada nas plantas inoculadas com o isolado UFRGS Lc340,
obtido de L. corniculatus.
Na avaliação do índice de eficiência relativa na fixação simbiótica de
N, em comparação ao tratamento inoculado com a estirpe SEMIA 839 (Figura
4), observa-se que este comportamento se repete, sendo o isolado UFRGS
Lc340 mais eficiente que os demais, porém sem se equiparar ao índice de
eficiência obtido pela estirpe SEMIA 839, nas condições de realização do
experimento.
44
SEMIA 839
UFRGS Lc340
EEL698
U512
UFRGS Lg111
UFRGS Lg5
UFRGS Lg109
T-N
Eficiência relativa (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
a
b
c
c
d
e
e
e
Figura 4. Eficiência relativa da fixação simbiótica de nitrogênio (%) em
comparação a estirpe SEMIA 839 dos rizóbios de Lotus isolados dos
solos do RS inoculados em plantas de L. uliginosus, em experimento
conduzido em casa de vegetação
Já as estirpes EEL698, para L. subbiflorus, e U512, juntamente com
o isolado UFRGS Lg111, obtido de L. glaber, formaram um grupo intermediário
com índice de eficiência relativa na fixação de N inferior a 40% (Figura 4),
indicando que, embora capazes de formar simbiose efetiva, esta foi ineficiente.
Observa-se ainda, que os isolados UFRGS Lg5 e Lg109, obtidos de L. glaber,
mostraram índice de eficiência relativa na fixação de N próximo à zero,
indicando a existência de incompatibilidade desses rizóbios com as plantas de
L. uliginosus. (Figura 4). A incompatibilidade simbiótica entre um rizóbio de L.
glaber e plantas de L. uliginosus também foi observada por Estrella et al.
(1997), que concluíram que o isolado de L. glaber 1-INTECH (Instituto
Tecnológico de Chascomús-Argentina) não foi capaz de formar nódulos
eficientes, produzindo apenas pseudonódulos, o que indica parasitismo.
45
4.3.5 Comparação da compatibilidade simbiótica dos isolados
de rizóbios nativos com plantas das espécies de L. corniculatus, L.
glaber, L. subbiflorus e L. uliginosus em casa de vegetação.
Na Tabela 16, para fins de comparação e identificação de grupos de
compatibilidade simbiótica, são apresentados os valores referentes ao número
de nódulos formados e ao teor de nitrogênio total acumulado na parte aérea de
plantas de L. corniculatus, L. glaber, L. subbiflorus e L. uliginosus inoculadas
com isolados e estirpes de rizóbios em experimento conduzido em casa de
vegetação. Deve-se salientar que nem todas as estirpes estudadas foram
inoculadas em todas as espécies de Lotus utilizadas no experimento.
Avaliando-se os resultados produzidos pelas estirpes que foram
inoculadas nas plantas das quatro espécies estudadas, estirpe EEL698 e U512
(Tabela 16), observa-se que estas foram capazes de induzir a formação de
grande quantidade de nódulos e de fixar nitrogênio em simbiose com todas as
espécies de Lotus estudadas. Observa-se também que a estirpe EEL 698 é de
L. subbiflorus, mas formou simbiose efetiva tanto em plantas desta espécie
como em L. corniculatus, L. glaber e L. uliginosus, embora tenha sido mais
eficiente em L. corniculatus. Da mesma forma, a estirpe U512 foi eficiente na
fixação de nitrogênio tanto em plantas de L. corniculatus como de L. glaber,
mas foi pouco eficiente em plantas de L. subbiflorus e L. uliginosus (Tabela 16).
Em relação aos resultados produzidos pela estirpe EEL8084, obtida
de L. uliginosus, observa-se que esta estirpe foi capaz de formar nódulos e
fixar nitrogênio em simbiose com plantas de L. corniculatus e L. glaber. Já com
plantas de L. subbiflorus esta estirpe não foi capaz de formar simbiose efetiva,
produzindo apenas 8 nódulos e não fixando nitrogênio (Tabela 16).
Avaliando-se os resultados produzidos pelos isolados de rizóbios
nativos que foram inoculados nas plantas das quatro espécies estudadas,
isolados UFRGS Lg5, Lg109, Lg111 e Lc340 (Tabela 16), observa-se que estas
apresentaram comportamento simbiótico diferente.
O isolado UFRGS Lc340, obtido de L. corniculatus, demonstrou
capacidade de induzir nodulação e fixar nitrogênio em simbiose com plantas
das quatro espécies estudadas. No entanto, observou-se também que este
isolado formou simbiose eficiente na fixação de nitrogênio em plantas de L.
46
subbiflorus, sendo superior que as demais espécies (Tabela 14, 16 e Figura 3),
pouco eficiente em plantas de L. corniculatus (Tabela 12, 16 e Figura 1) e
ineficiente em plantas de L. glaber (Tabela 13 e 16).
Tabela 16. Número de nódulos e quantidade de nitrogênio total (mg planta
-1
)
obtido nas plantas das espécies de L. corniculatus, L. glaber, L.
subbiflorus e L. uliginosus inoculadas com isolados e estirpes de
rizóbios em experimento conduzido em casa de vegetação
Espécies de Lotus
Rizóbio
L. corniculatus L. glaber L. subbiflorus L. uliginosus
Nº. Nod
N tot.
(mg)
Nº.
Nod
N tot.
(mg)
Nº.
Nod
N tot.
(mg)
Nº.
Nod
N tot.
(mg)
SEMIA
830
NA NA 87 c 8,2 c NA NA NA NA
SEMIA
839
NA NA NA NA NA NA 235 a 55,1 a
SEMIA
850
NA NA NA NA 149 a 50,5 a NA NA
EEL698 169 aA 46,6aA 138 bA
23,6bB
141 aA
18,8bB
170 bA
18,7cB
EEL8084
261 aA 31,4bA 118 bB
27,4bA
8 bC 0,5 cB - -
U510 179 a 40,7 a NA NA NA NA NA NA
U512 133 aA 39,8aA 77 cA 23,6bB
94 aA 12,7bB
128 cA
17,4 cB
Lg5 195 aA 26,7bA 181 aA
17,6bB
- - 9 eB 1,4 dC
Lg109 172 aA 34,9aB 233 aA
44,3aA
8 bB 0,5 cC 0 0,3 dC
Lg111 168 aA 38,1aA 79 cB 21,3bB
0 0,3 cC 29 dC
10,8cC
Lc340 229 aA 25,7bC
46 cC 9,1 cD 212 aA
53,6aA
115 cB
40,2bB
T-N 0 0,2 c 0 0,4 c 0 0,3 c 0 0,2 d
CV (%) 23 17,2 18,61 40,7 24,4 34,1 14,3 27,2
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha
não diferem significativamente pelo teste de Scott-Knott a 5%. Médias de
quatro repetições. *Dados transformados por (x+1)
1/2
Legenda: NA = não avaliado; - = tratamento perdido; T-N = Tratamento controle
negativo, sem inoculação e sem adição de N
Os resultados obtidos com as estirpes EEL 698, EEL 8084 e U512 e
com o isolado UFRGS Lc340 contradizem a idéia proposta por Hernández et al.
(2005) da existência de grupos de compatibilidade simbiótica definidos, sendo
um grupo formado entre plantas de L. corniculatus e L. glaber e seus rizóbios
simbiontes e outro formado entre plantas de L. subbiflorus e L. uliginosus e
47
seus rizóbios simbiontes. Sendo assim, as bactérias que produziriam nódulos
nas espécies de L. corniculatus e L. glaber não seriam capazes de induzir a
nodulação em L. uliginosus e L. subbiflorus, e vice-versa, formando grupos de
incompatibilidade simbiótica ou, segundo os autores, podem induzir a
nodulação em plantas do outro grupo, sendo simbioticamente ineficiente, ou
então estabelecer uma relação de parasitismo.
Estes resultados deste trabalho indicam que não existem os grupos
de compatibilidade simbiótica e que os rizóbios eficientes nas espécies de L.
corniculatus, L. glaber, L. subbiflorus e L. uliginosus apresentaram potencial
para serem usados em inoculantes funcionais para as demais espécies de
Lotus que foram utilizadas neste estudo.
No entanto, os resultados produzidos pelos isolados de rizóbios
nativos UFRGS Lg5, Lg109 e Lg111, obtidos de L. glaber, mostram que os
mesmos foram ineficientes na simbiose com plantas de L. subbiflorus e L.
uliginosus sendo eficientes apenas em plantas de L. corniculatus e L. glaber
(Tabela 16).
Também os resultados da avaliação da compatibilidade simbiótica
dos isolados de rizóbios nativos obtidos de L. corniculatus (Tabela 8) e de L.
glaber (Tabela 9) mostram que muitos não induziram a formação de nódulos ou
não fixaram nitrogênio em simbiose com plantas de L. uliginosus. De forma
semelhante, a avaliação dos rizóbios nativos obtidos de L. uliginosus (Tabela
10) mostra incompatibilidade simbiótica de muitos isolados com plantas de L.
corniculatus e L. glaber.
Também a observação de que muitos dos rizóbios estudados
induziram a formação de nódulos radiculares sem fixação simbiótica de
nitrogênio (Tabelas 7, 8, 9, 10 e 16) mostra que estes podem ser
potencialmente parasitas, concordando com as observações de Baraibar et al.
(1999), que salientam que os rizóbios eficientes em um grupo de especificidade
comportam-se como parasitas em outro.
Estes resultados indicam a existência de população de rizóbios
nativos que podem ser potenciais parasitas em plantas de espécies de Lotus
de grupos de compatibilidade simbiótica diferentes.
48
4.4 Caracterização genotípica dos rizóbios isolados obtidos de
plantas de Lotus
A caracterização genotípica dos isolados e estirpes de rizóbios, que
foram estudados quanto à compatibilidade hospedeira e eficiência simbiótica,
em condições de casa de vegetação, mostrou grandes diferenças entre estes
quanto ao perfil eletroforético de fragmentos de DNA oriundos da amplificação
do DNA genômico pela PCR com os oligonucleotídeos iniciadores BOXA1 e
ERIC (ERIC1-R e ERIC-2).
Na Figura 5 é apresentado o perfil eletroforético dos produtos de
amplificação com os oligonucleotídeos iniciadores ERIC1-R e ERIC-2 das
estirpes padrão SEMIA 816, SEMIA 830, SEMIA 839, SEMIA 850, U510, U512,
dos isolados de rizóbios UFRGS Lc340, Lg5, Lg109, Lg111, e das estirpes
EEL698 e EEL8084, avaliados quanto a eficiência da fixação simbiótica de N
em plantas de L. corniculatus, L. glaber, L. subbiflorus e L. uliginosus. Na
Figura 6 é apresentado o perfil eletroforético dos produtos da amplificação do
DNA genômico dos mesmos rizóbios com o oligonucleotídeo iniciador BOX A
1-R
A amplificação do DNA genômico com oligonucleotídeos iniciadores
ERIC1-R e ERIC-2, permitiu a obtenção de perfis eletroforéticos em gel de
agarose das estirpes e isolados utilizados (Figura 5). O tamanho dos
fragmentos de DNA analisados no perfil eletroforético dos produtos de
amplificação do oligonucleotideo ERIC variou de 3530 pares de bases (pb) até
564 pb (Figura 5), dependendo do isolado avaliado, diferindo dos dados
encontrados por Fontoura (2007), em que os tamanhos dos fragmentos
variaram de 4.268 pb a 564 pb e por Giongo (2007), em que a faixa observada
variava de 5.000 pb a 650 pb.
49
Figura 5. Perfil de bandas obtidas com amplificação do DNA genômico com os
oligonucleotídeos iniciadores ERIC1-R e ERIC-2. Lambda= marcador
de peso molecular Lambda Eco RI + Hind III. A foto é apresentada em
negativo para melhor visualização das bandas
Com a amplificação do DNA genômico com o oligonucleotídeo
iniciador BOX A1, submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5%, foi
possível a obtenção do perfil de bandas característico para as estirpes e
isolados de rizóbios utilizados (Figura 6). O tamanho dos fragmentos de DNA
analisados no perfil eletroforético dos produtos de amplificação do
oligonucleotideo BOX A1 variou de 3.530 pares de bases (pb) até 564 pb
(Figura 6).
50
Figura 6. Perfil de bandas obtidas com amplificação do DNA genômico com o
oligonucleotídeo iniciador BOX A1. Lambda= marcador de peso
molecular Lambda Eco RI + Hind III. A foto é apresentada em
negativo para melhor visualização das bandas
Os perfis eletroforéticos obtidos com a amplificação do DNA
genômico com o oligonucleotídeo iniciador ERIC (Figura 5) e BOX A1 (Figura
6) foram analisados em conjunto com objetivo de se obter uma análise de
agrupamento mais detalhada. Recentemente, essa metodologia vem sendo
utilizada por muitos autores (Hungria & Vargas, 2000; Sikora et al., 2002;
Frizzo, 2007; Fontoura, 2007; Giongo et al., 2008), com o intuito de elevar ao
máximo as diferenças genotípicas detectadas, de modo a fornecer resultados
mais coerentes (Rademaker et al., 2000). O dendrograma formado pelo
agrupamento dos perfis de bandas dos isolados e estirpes de rizóbios,
analisadas com o algoritmo UPGMA e o coeficiente de Jaccard, que considera
a presença ou ausência de bandas, é mostrado na Figura 7.
No dendrograma, observa-se a formação de dois grandes grupos
que apresentaram similaridade em torno de 15% entre si. No grupo I foram
agrupadas as estirpes SEMIA816, SEMIA 830, EEL698, EEL8084 e U512,
além do isolado UFRGS Lg5, proveniente de amostras de Porto Alegre.
51
Figura 7. Dendrograma de genotipagem de estirpes e isolados de rizóbios para
L. corniculatus, L. glaber, L. subbiflorus e L. uliginosus. Agrupamento
obtido por UPGMA, utilizando-se o coeficiente de Jaccard, para perfil
de bandas obtido a partir da PCR com os oligonucleotídeos
iniciadores BOX A1-R + ERIC1-R e ERIC -2
No grupo II foram agrupadas as estirpes SEMIA 839, SEMIA 850 e
U510 e o isolado UFRGS Lg109, também proveniente de amostras de Porto
Alegre.
Na Figura 7, observa-se que os isolados UFRGS Lg111, obtido de
plantas de L. glaber em amostra de solo de Porto Alegre, de uma área
I
II
52
experimental com histórico de inoculação com diferentes estirpes, e o isolado
UFRGS Lc340, de L. corniculatus em amostra de solo de Hulha Negra
destacam-se por apresentar menos de 10% de similaridade com os demais
rizóbios estudados. Do mesmo modo, pode-se observar que os isolados
estudados não mostraram grande similaridade com as estirpes SEMIA 816,
SEMIA 830, SEMIA 839, SEMIA 850 e também com as estirpes EEL698,
EEL8084, U510 e U512 (Figura 7) não sendo, portanto, re-isolamento de
nenhuma destas. Frizzo (2007), em um estudo de caracterização genotípica
dos isolados e estirpes para L. uliginosus, em análise conjunta dos produtos de
PCR dos oligonucleotídeos iniciadores ERIC e BOX, também observou que
nenhum dos isolados apresentou 100% de similaridade entre si. Esse autor
relata ainda que isolados também não mostraram grande similaridade com as
estirpes recomendadas comercialmente para L. uliginosus, indicando a
existência de um novo banco de rizóbios para a seleção de estirpes mais
eficientes para esta espécie.
5. CONCLUSÕES
a) Existem rizóbios potencialmente parasitas tanto para plantas da espécie L.
corniculatus, L. glaber, L. subbiflorus como para L.uliginosus nas amostras de
solos das localidades estudadas no Estado.
b) Existem rizóbios nativos eficientes em plantas das quatro espécies de Lotus
em estudo, como o isolado UFRGS Lc340, e a estirpe EEL698, com potencial
para serem usados em inoculantes funcionais para espécies de Lotus, nas
amostras de solos das localidades estudadas no Estado.
c) Existem rizóbios com especificidade hospedeira em uma ou mais espécies
de Lotus, e outros rizóbios com incompatibilidade simbiótica, contrariando a
hipótese dos grupos de compatibilidade simbiótica.
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7 APÊNDICES
62
APÊNDICE 1. Solução Nutritiva (Sarruge, 1975)
Macronutrientes Estoque
(g.L
-1
)
Solução dos vasos
(mL)
KH
2
PO
4
136,1 1
MGSO
4
.
7H
2
O 246,4 2
CaCl
2
111,1 5
KCl 74,6 5
NH
4
NO
3
80 1
Fe EDTA 1M 10
Micronutrientes
H
3
BO
3
2,86 1
ZnCl
2
0,10 1
CuSO
4
.
5H
2
O 0,04 1
Na
2
Mo
4
.
4H
2
O 0,02 1
Obs.: O nitrogênio é adicionado usando-se uma solução de 20 g de
NH
4
NO
3
por litro.
O componente CuCl
2
foi substituído por CuSO
4
.
5H
2
O, preservando-
se a proporção do elemento Cobre.
Retirou-se MnCl
2
.
4H
2
O, pois a areia utilizada nos vasos Leonard
contém manganês.
Componentes com Potássio devem ser adicionados por último, para
evitar precipitação.
O pH da solução foi ajustado em torno de 6,0.
Para elaboração de meio semi-sólido, acrescentar 7 g de ágar por
litro de meio.
63
APÊNDICE 2. Meio extrato de levedura-manitol - LM (Vincent, 1970).
Obs.: Para elaboração de meio sólido, acrescentar 15 g de ágar por
litro de meio. Ajustar pH para 6,8.
Para formular o meio extrato de levedura-manitol-vermelho congo
(LMV), adicionar 10 mL de vermelho congo (solução de 250 mg de vermelho
congo em 100 mL de água destilada) em 1 L de meio LM.
Manitol............................................................. 10,0 g
K
2
PO
4
.............................................................. 0,5 g
MgSO
4
.7H
2
O.................................................... 0,2 g
NaCl................................................................. 0,1 g
Extrato de levedura.......................................... 0,5 g
Água destilada................................................. 1000 mL
64
APÊNDICE 3. Rizóbios isolados de plantas de L. uliginosus e L. corniculatus
autenticados por Frizzo (2007) quanto a nodulação e fixação
simbiótica de nitrogênio em experimento em tubos mantidos sob
condições de lampadário
L. uliginosus L. corniculatus
Rizóbios Nod
+
Fix
+
Local Rizóbios Nod
+
Fix
+
Local
Lu 2 + - MO Lc 8 + + HN
Lu 4 + + MO Lc 11 + + HN
Lu 5 + + MO Lc 13 + + ES
Lu 7 + - MO Lc 14 + + ES
Lu 8 + + MO Lc 15 + + ES
Lu 9 + + MO Lc 18 + + ES
Lu 10 + - MO Lc 21 + + ES
Lu 11 + + MO Lc 22 + + ES
Lu 12 + - MO Lc 24 + + ES
Lu 13 + + MO Lc 25 + + ES
Lu 15 + + MO Lc 26 + + ES
Lu 16 + + MO Lc 27 + + ES
Lu 17 + - MO Lc 30 + + ES
Lu 18 + + MO Lc 32 + + ES
Lu 19 + + MO Lc 33 + + ES
Lu 20 + + MO Lc 34 + + ES
Lu 21 + - MO Lc 36 + + ES
Lu 22b + + MO Lc 38 + + ES
Lu 24 + + MO Lc 41 + + ES
Lu 25 + + MO Lc 44 + + ES
Lu 26 + + MO Lc 45 + + ES
Lu 28 + - MO Lc 46 + + ES
Lu 30 + + MO Lc 47 + + ES
Lu 31 + + MO Lc 48 + + ES
Lu 32 + + ES Lc 49 + + ES
Lu 33 + + ES Lc 50 + + ES
Lu 38 + + ES Lc 54 + + ES
Lu 39 + + ES Lc 55 + + ES
Lu 40 + + ES Lc 57 + + ES
Lu 47 + - ES Lc 58 + + ES
Lu 54 + - HN Lc 235 + + PA
Lu 57 + - HN Lc 240 + + PA
Lu 62 + - HN Lc 241 + + PA
Lc 242 + + PA
Lc 247 + + PA
Lc 250 + + PA
Lc 252 + + PA
Lc 253 + + PA
Lc 254 + + PA
Lc 256 + + PA
Lc 270 + + PA
Lc 324 + + HN
Isolados da coleção da UFRGS; Legenda: Nod+= nodulação positiva; Fix+=
fixação de N positiva; += positiva; - =negativo; AR =: Arroio dos Ratos; ES =
Eldorado do Sul; HN = Hulha Negra; MO = Mostardas; PA = Porto Alegre
65
APÊNDICE 3. Continuação.....
Lc 327 + + HN
Lc 328 + + HN
Lc 331 + + HN
Lc 336 + + HN
Lc 338 + + HN
Lc 339 + + HN
Lc 340 + + HN
Lc 341 + + HN
Lc 343 + + HN
Lc 345 + + HN
Lc 346 + - HN
Lc 347 + + HN
Lc 348 + + HN
Lc 354 + + HN
Lc 386 + + AR
Lc 389 + + AR
Lc 392 + + AR
Isolados da coleção da UFRGS; *Legenda: Nod+= nodulação positiva; Fix+=
fixação de N positiva; += positiva; - =negativo; AR =: Arroio dos Ratos; ES =
Eldorado do Sul; HN = Hulha Negra; MO = Mostardas; PA = Porto Alegre
66
APÊNDICE 4. Rizóbios isolados de plantas de L. subbiflorus e L. glaber
autenticados por Fontoura (2007) quanto à nodulação e
fixação simbiótica de nitrogênio em experimento em tubos
mantidos sob condições de lampadário
L. subbiflorus L. glaber
Rizóbios Nod
+
Fix
+
Local Rizóbios Nod
+
Fix
+
Local
Ls 1 + - MO Lg 2 + + RP
Ls 9 + + MO Lg 4 + + RP
Ls 22 + - MO Lg 5 + + RP
Ls 23 + - MO Lg 6 + + RP
Ls 29 + - MO Lg 7 + + RP
Ls 36 + - MO Lg 8 + + RP
Ls 50 + - PA Lg 10 + + RP
Ls 51 + - PA Lg 11 + + RP
Ls 52 + - PA Lg 12 + + RP
Ls 54 + - PA Lg 13 + + RP
Ls 57 + - PA Lg 14 + + RP
Ls 59 + - PA Lg 15 + + RP
Ls 62 + - PA Lg 16 + + RP
Ls 65 + - PA Lg 17 + + RP
Ls 70 + - PA Lg 18 + + RP
Lg 22 + + RP
Lg 23 + + RP
Lg 24 + + RP
Lg 25 + + RP
Lg 26 + + RP
Lg 27 + + RP
Lg 29 + + RP
Lg 31 + + RP
Lg 32 + + RP
Lg 33 + + RP
Lg 34 + + RP
Lg 86 + - BG
Lg 108 + + PA
Lg 109 + + PA
Lg 111 + + PA
Lg 121 + + PA
Lg 122 + + PA
Lg 125 + + PA
Lg 126 + + PA
Lg 149 + + PF
Lg 156 + + PF
Lg 254 + - ES
Isolados da coleção da UFRGS; Legenda: Nod+= nodulação positiva; Fix+=
fixação de N positiva; += positiva; - =negativo; BG = Bagé; ES = Eldorado do
Sul; HN = Hulha Negra; MO = Mostardas; PA = Porto Alegre; PF = Passo
Fundo; RP = Rio Pardo
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