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i
Erro!
JOSÉ ALEXANDRE DE ANDRADE
COMPARAÇÃO ENTRE TESTE BANA E CHECKERBOARD
DNA-DNA HYBRIDIZATION NO DIAGNÓSTICO
PERIODONTAL INICIAL E NO MONITORAMENTO
TERAPÊUTICO
Dissertação apresentada à Universidade
Guarulhos para obtenção do título de
Mestre em Odontologia, Área de
Concentração Periodontia.
1° Orientador: Profa.Dra. Sheila Cavalca Cortelli
2° Orientador: Profa.Dra. Magda Feres
Guarulhos
2005
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ii
iii
Dedico esse trabalho a Deus, pois
somente por meio Dele tive
a oportunidade de superar os
obstáculos, e sempre sair vencedor.
“Não fiquem com medo,
pois estou com vocês;
não se apavorem, pois eu sou o seu Deus.
Eu lhes dou forças e os ajudo;
Eu os protejo com minha forte mão.
Todos os seus inimigos
Serão derrotados e humilhados;
Todos os que lutam contra vocês
Serão destruídos e morrerão.
Se vocês procurarem os seus inimigos,
Não os acharão, pois todos eles terão desaparecido.
Eu sou o Eterno, o Deus de vocês;
Eu os seguro pela mão e lhes digo:
Não fiquem com medo, pois eu os ajudo “.
Isaías 41: 10 -13
iv
AGRADECIMENTOS
Um agradecimento especial a minha esposa, Adriana, que abdicou do seu
tempo para que eu pudesse realizar este trabalho.
Aos meus pais e irmão pela confiança que sempre depositaram em meu
trabalho.
v
À Professora Dra. Sheila Cavalca Cortelli, pela dedicação, orientação do
caminho a ser tomado, onde muito mais que minha orientadora, tornou-se uma
amiga.
À Professora Dra. Magda Feres, por sempre saber discernir os momentos de
cobrança, não medindo esforços para o meu crescimento.
Ao Prof. Dr. Marcelo W. Barata Araujo, pela sinceridade, gentileza de seus
atos.
À Professora Dra. Luciene Cristina de Figueiredo, pela contribuição em meu
crescimento.
vi
Aos professores do Mestrado, pela paciência em transmitir os seus
conhecimentos.
Ao Professor Dr. Camillo Anauate Neto, pela dedicação durante minha
trajetória acadêmica e, hoje, como amigo.
À Izilvânia Malory Quinderé Barreto, pela colaboração laboratorial.
À Fernanda Roberta Rapucci, pelo pronto auxílio, sempre.
Aos colegas de mestrado, em especial ao Ricardo Atuí, por sempre levantar o
ânimo nas viagens pela rodovia Presidente Dutra.
A todos os indivíduos que aceitaram participar deste estudo.
i
RESUMO
Este estudo teve como objetivo comparar os resultados do Teste BANA em
relação a presença e a concentração de microrganismos do “complexo vermelho”,
estabelecida pelo Checkerboard DNA-DNA hybridization, no diagnóstico inicial e no
monitoramento terapêutico de indivíduos com periodontite. Foram selecionados 54
indivíduos com periodontite crônica e no mínimo 15 dentes. As amostras
subgengivais foram coletadas com curetas Gracey de 6 sítios periodontais/indivíduo
com profundidade de sondagem entre 5-7mm e nível clínico de inserção entre 5-
10mm, em quatro tempos experimentais: diagnóstico inicial (T0), imediatamente
(T1), 45 (T2) e 60 (T3) dias após o término da raspagem e alisamento radicular. A
identificação de Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythensis e/ou Treponema
denticola foi determinada pelo Teste BANA e pelo Checkerboard DNA-DNA
hybridization. Para ambos os testes em T0 as maiores freqüências foram de
resultados positivos, e em T3 de resultados negativos (Wilcoxon, p<0,05). Nos
quatro tempos experimentais, a atividade enzimática acentuada (escore 2) foi
acompanhada por proporções elevadas (≥10
5
células) de P. gingivalis e T.
forsythensis (Wilcoxon, p<0,05). Para o “complexo vermelho” os resultados das 2
técnicas microbiológicas mostraram associação apenas no exame inicial (χ
2
=10,79 e
p=0,001). A sensibilidade do Teste BANA para a identificação do “complexo
vermelho” foi de 84,13% (T0), 42,54% (T1), 40,76% (T2) e 28,57% (T3); e a
especificidade foi de 39,53% (T0), 67,93% (T1), 68,66% (T2) e 80,42% (T3). O Teste
BANA mostrou ser um método sensível para a detecção dos patógenos periodontais
do “complexo vermelho” no diagnóstico inicial. A presença e os níveis subgengivais
de P. gingivalis, T. denticola e T. forsythensis não mostraram uma relação direta com
os diferentes níveis de atividade enzimática.
Palavras-Chaves: diagnóstico; periodontite; bactérias; hibridização de ácido
nucléico; enzimas.
ii
ABSTRACT
The aim of this study was tom compare the results of the BANA with the
presence of the “red complex” microorganisms established by the Checkerboard
DNA-DNA hybridization in the initial diagnosis and in the therapeutic maintenance of
subjects with periodontitis. 54 subjects with chronic periodontitis with at least 15 teeth
were selected. Subgingival plaque samples were collected with Gracey curettes from
6 periodontal sites per subject with periodontal probing depths between 5-7mm and
clinical attachment level between 5-10mm, in four experimental times: initial
diagnosis (T0), immediately (T1), 45 (T2) and 60 (T3) days after scaling and root
planing. The identification of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythensis
and/or Treponema denticola was determined by the BANA Test and by
Checkerboard DNA-DNA hybridization. For both tests in T0 the highest frequencies
were of positive results, and in T3 of negative results (Wilcoxon, p <0,05). In the four
experimental times, a strong enzymatic activity (score 2) was accompanied by high
proportions (≥10
5
cels) of P. gingivalis and T. forsythensis (Wilcoxon, p <0,05). There
was an association between the BANA Test and the Checkerboard DNA-DNA
hybridization for the "red complex", only in the initial exam (X
2
=10,79 and p=0,001).
The sensitivity of the BANA Test for the identification of the "red complex" was as
follows 84,13% (T0), 42,54% (T1), 40,76% (T2) and 28,57% (T3); and the specificity
was 39,53% (T0), 67,93% (T1), 68,66% (T2) and 80,42% (T3). The BANA Test
showed to be a sensitive method for the detection of the periodontal pathogens of the
"red complex" in the initial diagnosis. The presence and subgingival levels of P.
gingivalis, T. denticola and T. forsythensis did not show a direct association with the
different levels of the enzymatic activity.
Key-words: diagnosis; periodontitis; bacteria; nucleic acid hybridization; enzymes.
iii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.E JUSTIFICATIVA ................................................................ 01
1.1 BANA .....................................................................................................
1.2 Checkerboard DNA-DNA hybridization..................................................
2. PROPOSIÇÃO ...............................................................................................
02
05
10
3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 11
3.1. População alvo e procedimentos periodontais .............................……... 11
3.2. Análise microbiológica............................................................................. 12
3.2.1. BANA ............................................................................................ 12
3.2.2. Checkerboard DNA-DNA hybridization ……………………………. 15
3.2.2.1. Condições de crescimento, isolamento do DNA e
preparo das sondas genômicas
15
3.2.2.2. Hibridização DNA – DNA 16
3.2.2.3. Detecção das espécies bacterianas 18
3.3. Análise estatística .................................................................................. 19
4. RESULTADOS...............................................................................................
4.1. População Estudada.............................................................................
4.2. Resultados microbiológicos ...................................................................
21
21
21
5. DISCUSSÃO .................................................................................................. 32
6. CONCLUSÕES............................................................................................... 39
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 40
ANEXOS.............................................................................................................
.
50
1
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
A saúde periodontal pode ser considerada um equilíbrio entre a população
microbiana e o hospedeiro. Quando da ocorrência de determinadas alterações, quer
seja no biofilme, quer seja na resposta imunológica do hospedeiro, este equilíbrio
pode ser rompido, podendo resultar na destruição do periodonto de proteção e/ou
sustentação. Assim, na dependência direta de eventos histopatológicos,
clinicamente podem se tornar evidentes características como sangramento, além
das alterações de cor, forma e textura superficial do tecido gengival (Schmit et al.
1988).
Em Periodontia, tem-se como meta, identificar indivíduos com risco elevado
para o desenvolvimento ou recorrência de doença. Atualmente, existem vários
métodos disponíveis, os quais, em geral, são empregados de forma conjunta com o
intuito de se estabelecer a condição periodontal. O diagnóstico periodontal,
estabelecido por métodos convencionais, baseia-se em dados provenientes da
sondagem periodontal, associado ou não a técnicas radiográficas. Todavia, este tipo
de exame, que avalia clinicamente o nível de inserção periodontal, profundidade de
sondagem e reabsorção óssea alveolar, não é capaz de prever uma futura
destruição periodontal. Os métodos convencionais só revelam resultados de eventos
biológicos anteriores, mesmo que em um passado recente (Jeffcoat et al. 1995;
Armitage 1996; Grisi et al. 2001).
Antigamente, acreditava-se que todas as bactérias eram igualmente
patogênicas para os tecidos periodontais (Löe, 1965). Entretanto, as descobertas
científicas das últimas décadas, relacionadas à etiologia e composição do biofilme
têm determinado novos conceitos no que se refere a métodos diagnósticos e terapia
periodontal. Com o estabelecimento da “hipótese da placa específica” ficou
evidenciado que certos microrganismos apresentam relação com quadros
característicos de doença periodontal (Loesche et al. 1976). E posteriormente, foi
sugerido que estes microrganismos não atuam isoladamente, sendo importante que
haja um equilíbrio entre espécies bacterianas patogênicas e espécies bacterianas
benéficas (Socransky et al. 1998). Mais recentemente foi aceito que este depósito
bacteriano ocorre na forma de biofilme, o qual consiste de uma ou mais
comunidades de microrganismos, aderidos a uma superfície sólida, em um ambiente
2
físico-químico apropriado, possibilitando, assim, em determinadas áreas a completa
redução de oxigênio (Socransky & Haffajee, 2002).
Além dos métodos tradicionais de diagnóstico, a caracterização da microbiota
periodontopatogênica permite a realização de intervenções preventivas, evitando-se
a ocorrência de perda de inserção clínica. Inúmeras técnicas podem e são utilizadas
com este objetivo, destacando-se a cultura bacteriana, ensaios imunológicos e
enzimáticos, além de técnicas que analisam o DNA bacteriano (Cortelli et al., 2000).
Especificamente, a caracterização da microbiota periodontal pode ser indicada como
auxiliar no diagnóstico inicial e plano de tratamento, monitoramento da eficácia do
tratamento, seleção de intervalos apropriados entre as consultas de manutenção,
determinação da atividade da doença e definição de indivíduos de risco (Zambon &
Haraszthy, 1995).
1.1 – BANA (Benzoyl-DL-Arginine-2-Naphthylamide)
Socransky et al. (1998) descreveram a ocorrência no biofilme dental de 5
complexos bacterianos principais. Dos 5 complexos, o denominado complexo
vermelho, é constituído por 3 espécies periodontopatogênicas, Porphyromonas
gingivalis, Tannerella forsythensis e Treponema denticola e mostra correlação com
indicadores clínicos de doença. Embora, a formação de um complexo específico
tenha sido descrita apenas em 1998, já havia sido identificada uma característica
comum entre estas espécies bacterianas. P. gingivalis, T. forsythensis e T. denticola
têm a capacidade de produzir arginina hidrolase, uma enzima semelhante à tripsina
que age na destruição das moléculas de colágeno (Bretz & Loesche; 1987, Loesche
et al., 1987). Com base neste perfil enzimático, foi idealizada uma reação
laboratorial (Loesche et al., 1990) denominada BANA, utilizando como substrato um
peptídeo sintético (Benzoyl-DL-Arginine-Naphthylamide) ligado a um cromóforo. No
primeiro ensaio laboratorial deste teste diagnóstico, a reação ocorria em meio
líquido.
O BANA sólido (cartão) foi desenvolvido posteriormente ao ensaio líquido, a
fim de oferecer um resultado rápido, obtido após 15 minutos de incubação a 55°C,
trazendo ainda a possibilidade de uso na clínica diária. Neste teste, a presença em
número elevado (10
4
células) de T. denticola, P. gingivalis e T. forsythensis resultam
numa coloração azul no cartão. Todavia esta reação independe da ocorrência
3
subgengival de apenas uma ou mais destas espécies bacterianas. Em casos de
doença periodontal, não são esperadas respostas negativas, mas, se eventualmente
elas forem encontradas provavelmente decorrem da ausência de bactérias em
número suficiente levando a não marcação do cartão (Hemmings et al.,1997;
Loesche et al.,1990; Watson et al., 1991).
Loesche et al. (1990) compararam o resultado do teste BANA líquido com o
resultado do cartão BANA. A sensibilidade e a especificidade com os dados clínicos
foram para o BANA líquido de 74 e 76%, respectivamente; no BANA cartão foi de 81
e 78%, respectivamente. Os resultados apresentaram alta sensibilidade e baixa
especificidade em relação aos parâmetros clínicos. Adicionalmente, ficou
estabelecido que, somente T. denticola, P. gingivalis e T. forsythensis geraram
reações positivas, enquanto outras 51 espécies bacterianas geraram, apenas,
resultados negativos. Os 2 métodos mostraram ser semelhantes e os autores
sugeriram a utilização do cartão, devido a maior facilidade.
Watson et al. (1991), compararam os resultados positivos do teste BANA e
reação ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) em 620 amostras de biofilme
dental obtidas de 157 indivíduos. Foram submetidas à reação ELISA as amostras de
biofilme subgengival já dispostas sobre a superfície do cartão BANA, com o objetivo
de se pesquisar isoladamente T. denticola e P. gingivalis. Dos indivíduos incluídos,
56% exibiram resultados positivos para o teste BANA, enquanto 86% dos indivíduos
apresentaram T. denticola ou P. gingivalis pela reação ELISA. Isoladamente, T.
denticola esteve presente em 79% dos indivíduos e P. gingivalis em 80% dos
indivíduos. O teste BANA teve uma especificidade de 92% e uma sensibilidade de
apenas 25% em relação ao teste ELISA. O teste BANA exibiu habilidade em detectar
bactérias patogênicas, todavia, a reação ELISA apresentou resultados superiores.
Bretz et al. (1993), determinaram a sensibilidade, especificidade e precisão
do teste BANA com a reação ELISA em 301 indivíduos dos quais foram analisados
1204 sítios periodontais. No total, o teste BANA teve 66% de sítios com resultados
positivos, enquanto pela reação ELISA foram detectados individualmente 52% de T.
denticola, 60% de P. gingivalis e 50% de T. forsythensis. A sensibilidade do BANA,
comparado com os resultados obtidos com o sistema ELISA, na presença de uma ou
mais das espécies bacterianas, variou entre 91% e 97%, a especificidade variou
entre 67% e 89% e a precisão ficou entre 80% e 90%. Ao relacionar o teste BANA
com a mensuração clínica observou-se sensibilidade entre 93% e 95%. A
4
especificidade do teste BANA de acordo com a condição clínica do indivíduo foi
baixa (47%), tendo sido sugerida a colonização bacteriana da superfície radicular,
sem evidência clínica de doença periodontal. A precisão do teste BANA com os
dados clínicos variou entre 61% e 62%. Entre si, o teste BANA e o sistema ELISA
apresentaram precisão de 90%, indicando que ambos detectaram a presença da
doença periodontal, podendo, deste modo, o teste BANA ser usado em estudos de
doença periodontal.
Hemmings et al. (1997), avaliaram a associação entre dois kits comerciais de
diagnóstico microbiológico com a condição periodontal. Foram utilizados no estudo o
Periocheck, que se baseia na atividade da enzima protease, e o BANA (Perioscan).
Durante este estudo, os autores avaliaram 19 indivíduos com periodontite moderada
e, de cada indivíduo, foram avaliados 5 sítios com doença periodontal e 2 sítios
saudáveis, totalizando 125 sítios. No exame inicial, o Periocheck teve sensibilidade
de 88% e especificidade de 61%, enquanto o BANA obteve uma sensibilidade de
99% e uma especificidade de 55% em relação aos dados clínicos. Após o
tratamento, foram calculadas as probabilidades de associação entre os resultados
do Periocheck e o exame clínico, e o valor encontrado foi 50,4%. Para o teste BANA,
a probabilidade de associação encontrada foi de 52%. Os dois métodos não
demonstraram refletir adequadamente a condição clínica periodontal.
Além de produzirem arginina hidrolase, T. denticola, P. gingivalis e T.
forsythensis, têm, ainda em comum, a capacidade de produzir e liberar sulfeto de
hidrogênio e metil mercaptana. Morita et al. (2001) avaliaram o nível sulcular de
sulfeto de hidrogênio e sua associação com a gravidade da doença periodontal e o
resultados do teste BANA. O trabalho demonstrou que o nível de sulfeto de
hidrogênio aumenta com a gravidade da doença periodontal, apresentando relação
com a profundidade de sondagem e o sangramento à sondagem. Os resultados do
teste BANA, também, exibiram associação com os níveis de sulfeto de hidrogênio
observados e, por conseqüência, com os parâmetros clínicos periodontais.
Figueiredo et al. (2002) pesquisaram a relação entre reação BANA, halitose e
a presença de doença periodontal estabelecida por diferentes critérios clínicos.
Foram incluídos 21 indivíduos apresentando bolsas periodontais acima de 3mm de
profundidade e 20 indivíduos controles saudáveis. A freqüência de sítios
periodontais com no mínimo 3mm, foi maior no grupo com resultados positivos para
o teste BANA. Houve correlação entre halitose e hidrólise do substrato BANA,
5
confirmando, assim, que as bactérias subgengivais contribuem para o mau odor
bucal.
Barbosa e Silva et al. (2003) verificaram a associação entre os níveis da
enzima aspartato aminotransferase no fluido gengival com parâmetros clínicos, bem
como com a hidrólise do substrato BANA em 22 indivíduos com bolsas periodontais.
Não foi observada associação entre as duas enzimas, nem entre o perfil enzimático
e os parâmetros clínicos.
Vergani et al. (2004) avaliaram diferentes modalidades terapêuticas,
utilizando parâmetros clínicos e, como parâmetro microbiológico, o teste BANA. Os
indivíduos incluídos no estudo tinham média de idade de 46 anos e receberam
diagnóstico de periodontite crônica. Considerando-se as diferentes terapias, os
resultados positivos iniciais do Teste BANA variaram entre 68,2% a 90,3%. No
período de 90 dias de observação, após o término da terapia periodontal o número
positivo de reações BANA, apresentou marcada redução e variou de 0,0 a 9,1%.
Figueiredo et al. (2005) investigaram a relação entre halitose, reações BANA
positivas e condição periodontal de 17 indivíduos com Síndrome de Down, 17
indivíduos com retardo mental e 17 controles mentalmente saudáveis. Não foram
observadas diferenças significativas para o número o positivo de reações BANA
entre os grupos experimentais, tanto para as amostras subgengivais como para o
dorso da língua. O grupo de indivíduos mentalmente saudáveis exibiu 10,8% de
amostras linguais positivas e 84,3% de amostras subgengivais positivas. Entre os 3
grupos o padrão microbiológico determinado pelo teste BANA foi similar.
1.2 Checkerboard DNA-DNA hybridization
Em 1994, Socransky et al. descreveram a técnica Checkerboard DNA-DNA
hybridization para detecção de microrganismos bucais em indivíduos saudáveis ou
com diferentes formas de doença periodontal. Esta técnica preconiza o uso de
sondas de DNA e permite a identificação e a quantificação simultânea de até 45
espécies bacterianas em um número máximo de 28 amostras clínicas. A hibridização
dá-se no formato de tabuleiro de xadrez, pois, após fixação do DNA na membrana
em linhas separadas, o dispositivo sofre rotação em 90° para posterior deposição
das sondas de DNA genômico.
6
Ali et al. (1997) avaliaram a microbiota de 42 indivíduos, 12 mulheres e 9
homens com saúde periodontal, e 12 mulheres e 9 homens com doença periodontal.
Utilizou-se para a análise microbiológica as técnicas de cultura bacteriana,
Checkerboard DNA-DNA hybridization e o Affirm DP teste (hibridização com sondas
de DNA). O teste comercial foi usado para detecção de T. forsythensis, P. gingivalis
(10
5
células) e Actinobacillus actinomycetemcomitans (10
6
células). O Checkerboard
DNA-DNA hybridization revelou presença mais acentuada de T. forsythensis, P.
gingivalis e T. denticola, em indivíduos com doença periodontal e presença de
Actinomyces naeslundii, Streptococcus mitis, Streptococcus sanguis, Streptococcus
oralis e Capnocytophaga ochracea mais acentuada em indivíduos saudáveis. O
Checkerboard DNA-DNA hybridization detectou T. forsythensis, P. gingivalis e
Actinobacillus actinomycetemcomitans em 52% dos indivíduos, enquanto o Affirm
DP não detectou T. forsythensis nas amostras. A técnica Checkerboard DNA-DNA
hybridization demonstrou resultados superiores à cultura bacteriana e ao kit
comercial.
Socransky et al. (1998) avaliaram a ocorrência no sulco gengival de grupos
bacterianos, processando pelo método Checkerboard DNA-DNA hybridization um
total de 13.321 amostras de biofilme dental, provenientes de 185 indivíduos com
periodontite crônica. Os resultados demonstraram a ocorrência de 5 complexos
bacterianos principais: verde, amarelo, roxo, laranja e vermelho (Figura 1). Os
autores observaram que as bactérias do “complexo vermelho” (T. denticola, T.
forsythensis e P. gingivalis) necessitam da presença do “complexo laranja”
(Fusobacterium nucleatum sp, Prevotella intermedia e Prevotella nigrescens,
Peptostreptococcus micros e Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus,
Campylobacter showae, Eubacterium nodatum e Streptococcus constellatus), para
colonizarem. As bactérias do “complexo vermelho” foram as mais relacionadas com
a presença de bolsas periodontais profundas e sangramento à sondagem. Neste
estudo, P. gingivalis não foi encontrada na ausência de T. forsythensis. As bactérias
do “complexo laranja” demonstraram ter relação com o “complexo vermelho”, não
apresentando esta mesma interação com os demais complexos. Já as bactérias do
“complexo verde”, o qual inclui Eikenella corrodens, Campnocytophaga sp.,
Campylobacter concisus e Actinobacillus actinomycetemcomitans sorotipo a;
“complexo amarelo” Streptococcus sanguis, S oralis, S. mitis, S. gordonii e S.
Intermedius e “complexo roxo” constituído de Veillonella parvula e Actinomyces
7
odontolyticus, estão relacionadas com a saúde periodontal. Posteriormente,
Socransky & Haffajee (2002) adicionaram um sexto grupo bacteriano, “complexo
azul”, também associado a saúde periodontal e composto por 5 espécies de
Actinomyces.
S. mitis
S. oralis
S.Sanguis
Streptococcus sp.
S. gordoni
S. intermedius
P.gingivalis
T. forsythensis
T. denticola
V. parvula
A. odontolyticus
P. intermedia
P. nigrescens
P. micros
F. nuc. vicentii
F. nuc. nucleatum
F. nuc. polymorphum
F. periodonticum
C. gracilis
C. rectus
C. showae
S. constellatus
E. nodatum
A
ctinomyces sp.
E. corrodens
C. gingivalis
C. sputigena
C. ochracea
C. concisus
A. actinomycetemcomitans a
Figura 1: Descrição dos complexos bacterianos encontrados no sulco gengival
humano. Adaptado de Socransky & Haffajee (2002).
Ximénez-Fyvie et al. (2000a), investigaram, pela técnica Checkerboard DNA-
DNA hybridization, o efeito do controle profissional do biofilme supragengival na
composição da microbiota supragengival e subgengival. Foram avaliados 18
indivíduos com periodontite crônica. Após o exame inicial, os indivíduos receberam
raspagem dental e alisamento radicular, e profilaxia semanal supragengival por 3
8
meses. Após o período de 3 meses, houve redução significativa no número de
bactérias, nas amostras de biofilme dental tanto supra como subgengival. Nas
amostras de biofilme supragengival, das 40 espécies analisadas, 22 foram
significativamente reduzidas; nas amostras de biofilme subgengival, das 40 espécies
bacterianas analisadas 34 tiveram uma redução significativa. O controle de biofilme
dental, realizado pelo profissional, teve um efeito surpreendente sobre a ocorrência
de espécies e de grupos bacterianos. O maior efeito da remoção de biofilme
supragengival foi a redução no número total de microrganismos no biofilme
supragengival e, também, uma redução no biofilme subgengival.
Ximénez-Fyvie et al. (2000b), compararam a composição da microbiota supra
e subgengival de 22 indivíduos com saúde periodontal e 23 indivíduos com
periodontite. As 1170 amostras de biofilme dental foram analisadas pelo
Checkerboard DNA-DNA hybridization. A diferença mais notável entre a saúde e a
doença periodontal foi observada na microbiota subgengival. As bactérias do
“complexo vermelho” tiveram uma proporção pequena em indivíduos com saúde
periodontal. Os níveis de T. denticola, P. gingivalis, T. forsythensis e Selenomonas
noxia foram elevados em indivíduos com periodontite, onde as bactérias patogênicas
também puderam ser detectadas na microbiota supragengival. As proporções de
espécies dos “complexos vermelho e laranja” estavam significativamente
aumentadas, tanto no ambiente supra como no subgengival, quando da presença de
bolsas periodontais profundas.
Haffajee et al. (2001), utilizaram Checkerboard DNA-DNA hybridization, para
verificar o efeito da escova manual e da escova elétrica na composição da
microbiota supra e subgengival. Foram incluídos 47 indivíduos, dos quais 25 usaram
escova manual e 22 usaram escova elétrica. Amostras do biofilme dental foram
coletadas inicialmente, no 3º e no 6° meses. Em cada exame foram avaliadas 1183
amostras de biofilme supragengival e 1183 amostras de biofilme subgengival.
Verificou-se que ambas as técnicas de escovação reduzem a contagem total de
bactérias, tanto para o biofilme supragengival como para o subgengival. O maior
achado deste trabalho foi, que a remoção do biofilme supragengival acarretou a
diminuição da principal fonte de colonização do biofilme subgengival.
Colombo et al. (2002), avaliaram a composição do biofilme subgengival de
indivíduos brasileiros com periodontite crônica não tratada, utilizando o
Checkerboard DNA-DNA hybridization. Foram incluídos 25 indivíduos com
9
periodontite crônica e 14 indivíduos saudáveis. As amostras foram coletadas de 4
sítios por dente, totalizando 4032 amostras. Verificou-se que as espécies que
apareceram com mais freqüência foram: P. gingivalis, T. forsythensis, Eubacterium
nodatum e Fusobacterium nucleatum ss vincentii. Os autores concluíram que
indivíduos brasileiros, com periodontite crônica não tratada, possuem as mesmas
espécies periodontopatogênicas observadas em outras populações.
Mager et al. (2003), examinaram amostras de saliva e 8 superfícies de tecido
mole intra-bucais e compararam com amostras de biofilme supra e subgengival.
Amostras de 225 indivíduos foram analisadas, sendo que destes, 45 foram
selecionados para a coleta das amostras supra e subgengivais. As amostras foram
analisadas com Checkerboard DNA-DNA hybridization. Verificou-se que na saliva e
na superfície lateral e dorsal da língua ocorreu uma maior proporção de Veillonella
parvula e Prevotella melaninogenica, enquanto que Streptococcus mitis e
Streptococcus oralis foram, proporcionalmente, menores na saliva e no dorso da
língua. Conclui-se que a proporção das espécies bacterianas foi diferente nas
superfícies intra-bucais. A microbiota dental diferiu daquela observada nos demais
tecidos moles intra-bucais.
Haffajee et al. (2004), estudaram a composição do biofilme subgengival de
300 indivíduos de 4 países (Brasil, Chile, Suécia e Estados Unidos da América). A
análise microbiológica estabelecida por Checkerboard DNA-DNA hybridization
demonstrou maiores proporções de P. gingivalis no Chile, enquanto T. denticola foi a
espécie mais prevalente no Brasil. T forsythensis não exibiu diferenças estatísticas
significativas nas diversas regiões geográficas. A composição microbiana
subgengival variou entre os indivíduos dos 4 países.
Haffajee et al. (2005), verificaram a ocorrência de diferença entre o biofilme
subgengival de indivíduos periodontalmente saudáveis da Suécia e dos Estados
Unidos da América. Do total de 158 indivíduos, 79 eram da Suécia e 79 dos Estados
Unidos da América. A análise microbiológica foi realizada utilizando-se a técnica
Checkerboard DNA-DNA hybridization. O perfil do biofilme subgengival dos
indivíduos dos 2 países foi diferente. Ocorreu uma maior heterogeneidade do
biofilme subgengival nos indivíduos americanos, sendo este fato atribuído pelos
autores à maior diversidade genética e microbiológica.
10
2. PROPOSIÇÃO
Comparar os resultados do Teste BANA, adotando-se como técnica padrão o
Checkerboard DNA-DNA hybridization, no diagnóstico inicial e no monitoramento
terapêutico de indivíduos com periodontite crônica moderada.
E, avaliar a ocorrência e as diferentes concentrações das bactérias do
“complexo vermelho”, relacionadas com cada nível de atividade enzimática.
11
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. População alvo e procedimentos periodontais
Foram selecionados 60 indivíduos com periodontite crônica moderada
(Armitage, 2002) que procuraram atendimento na clínica do Curso de Odontologia
da Universidade Guarulhos, atendendo aos seguintes critérios de inclusão: possuir
no mínimo 15 dentes, excluindo-se os terceiros molares; idade acima de 30 anos;
não ser fumante; não estar grávida ou amamentando; história negativa de
tratamento periodontal, antibioticoterapia ou uso de anti-sépticos bucais nos últimos
seis meses; história negativa de doença sistêmica, que comprometesse a resposta
do hospedeiro ou exigisse medicação profilática ao tratamento periodontal. Além
disso, possuíssem no mínimo 6 dentes com pelo menos 1 sítio interproximal,
apresentando profundidade de sondagem entre 5 e 7mm e nível clínico de inserção
entre 5 e 10mm. Estes 6 sítios deveriam estar dispostos em superfícies
interproximais não contíguas e distribuídos em quadrantes distintos. Os indivíduos,
que atenderam aos critérios de inclusão, participaram do estudo, mediante
assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, previamente avaliado e
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Instituição (ANEXO1).
A avaliação clínica inicial foi realizada por 2 examinadores calibrados (kappa
= 92%), utilizando-se sondas periodontais manuais (PC15-BR – HU-FRIEDY) e,
observando-se os seguintes parâmetros clínicos: Índice de placa Visível – IPV (0,1);
Índice de Sangramento Gengival – IG (0,1); Profundidade de Sondagem – PS (mm);
Nível Clínico de Inserção – NCI (mm), Sangramento à Sondagem – SS (0,1) e
Supuração – SUP (0,1). Os parâmetros clínicos foram avaliados em seis sítios por
dente (mesiovestibular, vestibular, distovestibular, mesiolingual, lingual, distolingual).
A terapia periodontal também foi realizada por 2 examinadores treinados,
utilizando-se como padrão de qualidade da raspagem dental e alisamento radicular
(RAR) a verificação realizada por um docente especialista. Os procedimentos de
raspagem e alisamento radicular foram realizados em 6 sessões de 1 hora cada, em
um período máximo de 21 dias. Para o autocontrole mecânico de biofilme foram
fornecidos escova dental multitufo e dentifrício. Escovas unitufo e interproximais
foram indicadas e fornecidas de acordo com as necessidades individuais.
12
3.2. Análise microbiológica
Os sítios avaliados microbiologicamente, em um total de 6 por indivíduo,
estavam localizados em faces dentárias interproximais não-contíguas, com
profundidade de sondagem entre 5-7mm e nível clínico de inserção entre 5-10mm.
Diante de valores idênticos de PS, selecionou-se o sítio mais comprometido, ou seja,
com maior perda de inserção clínica e com maiores escores dos índices periodontais
avaliados. As amostras de biofilme subgengival foram coletadas com curetas Gracey
mini-five 5/6, 11/12 e 13/14 (Hu-Friedy), previamente esterilizadas, da porção mais
apical da bolsa periodontal. Uma única amostra de biofilme subgengival, foi dividida
atendendo às necessidades de ambas as técnicas microbiológicas.
As análises microbiológicas foram realizadas em 4 tempos experimentais:
Tempo 0 - momento inicial, determinação do diagnóstico periodontal;
Tempo 1 - imediatamente após o término da RAR;
Tempo 2 - monitoramento terapêutico, 45 dias após o término da terapia
periodontal, que além de RAR incluiu o autocontrole mecânico de biofilme,
e
Tempo 3 - monitoramento terapêutico, 60 dias também após o término da
terapia periodontal.
3.2.1. BANA (Benzoyl-DL-Arginine-2-Naphthylamide)
O teste BANA foi realizado de acordo com a metodologia proposta por
Loesche et al. (1990). O conjunto é composto de uma incubadora e cartões
(Knowell™) (Figura 2), nos quais o nome de cada indivíduo e a data do exame foram
anotados na parte superior. A parte inferior do cartão contém o substrato N-Benzoil-
DL-Arginina-2-Naftilamida e corresponde à região onde foram depositadas as
amostras de biofilme subgengival. Desta forma, para cada indivíduo foram utilizados
dois cartões. Para a obtenção das amostras as curetas foram posicionadas na
porção mais apical da bolsa periodontal.
13
3
2
1
Figura 2: Foto ilustrativa dos componentes do teste BANA; 1-Incubadora; 2- cartão
reativo; 3-Frasco para armazenamento de cartões.
Após a coleta e deposição das amostras subgengivais na parte inferior do
cartão BANA, que contém o corante negro de Evans (Figura 3), a sua parte superior,
foi umedecida com água destilada, com auxílio de uma gaze estéril. O cartão foi
dobrado na marca da linha pontilhada e incubado por 15 minutos, sob temperatura
de 55°C (Amalfitano et al., 1993; Feitosa et al., 1993). Após a incubação, o cartão foi
cuidadosamente removido e a atividade enzimática observada:
Reação negativa (Escore 0): a coloração do cartão manteve-se inalterada
o que indicou ausência de atividade enzimática e, conseqüentemente,
concentrações bacterianas (< 10
4
células) abaixo do limite de detecção do
teste (Figura 4A).
Reação fracamente positiva (Escore 1): representada pela presença de
coloração azul pouco definida, a qual indicou atividade enzimática
moderada e, conseqüentemente, uma concentração bacteriana entre 10
4
-
10
5
células (Figura 4B).
14
Reação fortemente positiva (Escore 2): presença de coloração azul bem
definida, a qual indicou atividade enzimática acentuada e,
conseqüentemente, uma concentração bacteriana superior a 10
5
células
(Figura 4C).
Figura 3: Destaque para a parte superior do cartão BANA que contém o corante
negro de Evans.
A B C
Figura 4: Diferentes padrões de atividade enzimática associadas à reação BANA. A
= escore 0 (atividade enzimática ausente); B = escore 1 (atividade enzimática
moderada) e C = escore 2 (atividade enzimática acentuada).
A leitura dos resultados do Teste BANA foi feita por dois indivíduos calibrados
(Kappa= 91%), tendo sido os escores confirmados pelo examinador padrão.
15
3.2.2. Checkerboard DNA-DNA hybridization
Após a deposição no cartão BANA, o restante da amostra foi imediatamente
depositado em tubos plásticos individuais contendo 150μl de solução TE (pH 7,6), ao
qual foram adicionados 100μl de NaOH a 0,5 M para que o DNA bacteriano
permanecesse viável por longos períodos de tempo. Estes tubos foram então
identificados e armazenados até serem analisados por meio da técnica
Checkerboard DNA-DNA Hybridization para as 3 cepas bacterianas, no laboratório
de microbiologia da Universidade Guarulhos.
3.2.2.1. Condições de crescimento, isolamento do DNA bacteriano e preparo das
sondas genômicas
As cepas bacterianas do “complexo vermelho” (P. gingivalis*, T. denticola** e
T. forsythensis***)
1
foram adquiridas liofilizadas da ATCC (American Type Culture
Collection, Rockville, MD, USA). O conteúdo liofilizado de P. gingivalis e T.
forsythensis foi inicialmente re-hidratado em caldo para crescimento de Mycoplasma
(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) e posteriormente cultivado em meios de
cultura sólidos enriquecidos. O cultivo de T. forsythensis foi realizado em placas de
Petri contendo ágar triptose de soja com 5% de sangue de ovelha desfibrinado e 10
µg/ml de ácido N-acetil murâmico (NAM) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA);
enquanto P. gingivalis foi semeado em um meio similar, também suplementado com
5% de sangue de ovelha desfibrinado, e adicionado de 0,3µg/ml de menadiona
(Sigma) e 5µg/ml de hemina (Sigma). T. denticola foi cultivado em caldo para
crescimento de Mycoplasma (Difco) suplementado com 1mg/ml de glicose, 400µg/ml
de niaciamida, 150µg/ml espermina tetraidroclorídrica, 20µg/ml de isobutirato de Na,
1mg/ml de L-cisteína, 5µg/ml de tiamina pirofosfato e 0,5% de soro bovino. Os meios
de cultura foram incubados a 35
o
C sob condição de anaerobiose (80% N
2
, 10% CO
2
,
10%H
2
) por um período de 3 a 7 dias.
Após este período de incubação, as colônias foram raspadas, depositadas em
tubos de microcentrífuga contendo 1ml de solução-tampão TE (10 mM Tris-HCl,
0,1mM EDTA, pH 7,6) e lavadas 2 vezes por centrifugação em TE a 3.500 rpm por
10 minutos. Em seguida, as células destas cepas Gram-negativas foram novamente
1
* cepa ATCC 33277; ** cepa ATCC B1; *** cepa ATCC 43037
16
suspensas e lisadas com SDS (dodecilsulfato de sódio, C
12
H
25
NaO
4
S) a 10% e
proteinase K em uma concentração de 20mg/ml (Sigma). O DNA bacteriano foi
isolado e purificado como descrito por Smith et al. (1989). As sondas multi-
genômicas (whole-genomic) foram preparadas para cada uma das 3 espécies pela
marcação de 1µg do DNA bacteriano com digoxigenina, por meio do random primer
digoxigenin labeling kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA), de acordo
com o método descrito por Feinberg & Vogelstein (1983).
3.2.2.2. Hibridização DNA-DNA
As suspensões contidas nos tubos foram fervidas em banho-maria por 10
minutos e, em seguida, neutralizadas pela adição de 0,8 ml de acetato de amônia a
5 M. Cada suspensão de placa bacteriana contendo o DNA livre foi depositada em
uma das canaletas do Minislot (Immunetics, Cambridge, MA, USA) (Figura 5)
ficando, assim, concentrada em uma membrana de nylon (15 x 15cm) com carga
positiva (Boehringer Mannheim). As duas últimas canaletas do Minislot (Immunetics)
foram ocupadas por controles contendo uma mistura do DNA das espécies de
microrganismos investigadas pelas sondas, nas concentrações correspondentes a
10
5
e 10
6
células, ou seja, 1ng e 10ng de DNA de cada espécie, respectivamente
(Socransky et al., 1994; Haffajee et al., 1997a, b). A membrana foi então removida
do Minislot (Immunetics) e o DNA nela concentrado foi fixado por meio de
aquecimento em forno a 120º C por 20 minutos.
A membrana foi pré-hibridizada a 42º C, por 1 hora, em uma solução
contendo 50% de formamida, 1% de caseína (Sigma), 5 x standard saline citrate -
SSC (1 x SSC = 150mM NaCl, 15mM de citrato de sódio, pH 7,0), 25 mM de fosfato
de sódio (pH 6,5) e 0,5 mg/ml de RNA de levedura (Boehringer Mannheim).
Em seguida, a membrana foi posicionada no Miniblotter (Immunetics) (Figura
6) com as linhas de DNA perpendiculares às canaletas do aparato. Em cada
canaleta do Miniblotter (Immunetics) foi adicionada uma sonda de DNA (diluída a
aproximadamente 20ng/ml) em 130 μl de uma solução de hibridização composta de
45% de formamida, 5 X SSC, 20 mM de fosfato de sódio (pH 6,5), 0,2 mg/ml de RNA
de levedura (Boehringer Mannheim), 10% de sulfato de dextrano e 1% de caseína
(Sigma). A hibridização ocorreu por um período mínimo de 20 horas, a 42º C.
17
Membrana de
nylon
Filtro
Canaleta
aberta
Figura 5: Ilustração esquemática do aparato denominado MiniSlot 30™
Canaletas de
hibridização
Membrana
de nylon
Figura 6: Ilustração esquemática do Miniblotter 45™
18
3.2.2.3. Detecção das espécies bacterianas
Após o período de hibridização (Figura 7), a membrana foi removida do
Miniblotter (Immunetics) lavada por 40 minutos, a 65ºC numa solução adstringente
composta de 1% de SDS, 1mM de EDTA e 20mM de Na
2
HPO
4
, a fim de remover as
sondas que não hibridizaram completamente. Em seguida, a membrana foi imersa
por 1 hora em uma solução contendo 1% de ácido maleico (C
4
H
4
O
4
), 3 M de NaCl,
0,2 M de NaOH, 0,3% de Tween 20, 0,5% de caseína, pH 8,0, e, logo após, por 30
minutos, na mesma solução contendo o anticorpo anti-digoxigenina conjugado à
fosfatase alcalina em uma concentração de 1:10.000. A membrana foi depois lavada
2 vezes, por 20 minutos, em uma solução de 0,1 M de ácido maleico, 3 M de NaCl,
0,2 M de NaOH, 0,3% de Tween 20, pH 8,0, e 1 vez, por 5 minutos, em uma solução
de 0,1 M de Tris HCl, 0,1M de NaCl, 50 mM de MgCl
2
, pH 9,5.
Os próximos passos foram a incubação da membrana por 45 minutos a 37
o
C
em uma solução detectora à base de fosfatase alcalina, CDP-Star
TM
Detection
Reagent (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, England,UK). A
seguir, a membrana foi colocada em um cassete, Chassi Radiográfico 30x40cm
(Konex, Ind. Bras., SP, Brasil), sob um filme radiográfico de marca Kodak X-Omat K,
18x24cm (Kodak Brasileira Com. e Ind. Ltda, São José dos Campos, SP, BR) por 40
minutos. O filme foi posteriormente revelado (Haffajee et al. 2001) manualmente pelo
método convencional tempo-temperatura, de acordo com orientações do fabricante.
As soluções utilizadas foram da marca Kodak, sempre mantidas à temperatura de
20ºC. A leitura dos filmes radiográficos foi realizada por um único examinador
treinado, da seguinte forma: cada sinal produzido por uma determinada sonda na
amostra clínica foi comparado em intensidade ao sinal produzido pela mesma sonda
nos dois controles contendo 10
5
e 10
6
bactérias. Desta forma, o número 0 foi
registrado quando não houve detecção do sinal; 1 equivaleu a um sinal menos
intenso que o controle de 10
5
células; 2 equivaleu a aproximadamente 10
5
células; 3,
entre 10
5
e 10
6
células; 4 aproximadamente 10
6
células e 5, mais de 10
6
células. A
partir desta escala original os escores foram posteriormente reclassificados (Quadro
1).
A descrição completa das soluções e tampões utilizados se encontra no
Anexo 2.
19
Sondas de DNA
Identificação
positiva
(Sinal)
Amostras
de
Biofilme
Figura 7: Ilustração esquemática de detecção decorrente da hibridização das sondas
de DNA genômico com as amostras subgengivais
3.3. Análise estatística
Os valores dos erros intra e inter-examinadores relativos aos dados clínicos e
microbiológicos foram analisados, utilizando-se o teste estatístico Kappa.
No presente estudo, a partir dos escores originais do Checkerboard DNA - DNA
hybridization foram estabelecidas duas reclassificações (Quadro 1). A primeira foi
adotada para a interpretação da atividade enzimática (ausente, moderada ou
acentuada) pela concentração bacteriana, aplicando-se os testes Análise de
Variância – ANOVA e Wilcoxon. E, a segunda reclassificação foi utilizada para
análise pelo teste Qui-quadrado e cálculo dos valores de sensibilidade,
especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo.
Os valores de Sensibilidade, Especificidade, Valor Preditivo Positivo e Valor
Preditivo Negativo do Teste BANA, em relação ao Checkerboard DNA-DNA
Hybridization foram determinados nos 4 tempos experimentais tanto para o
“complexo vermelho” como para as 3 espécies bacterianas isoladamente. O teste
20
Qui-Quadrado foi utilizado, para associar os resultados do teste BANA com os do
Checkerboard DNA-DNA Hybridization.
O valor de p considerado foi de 0,05 para a existência de associação entre os
resultados obtidos. Os dados foram tabulados em planilhas Excel (Microsoft
®
) e
analisados estatisticamente, utilizando-se os softwares Bioestat
®
5.0 e SPSS
®
11.5.
Quadro 1: Reclassificação dos resultados do Checkerboard DNA - DNA hybridization
a partir dos escores originais.
Escores originais Escores: 1ª
reclassificação
Escores: 2ª
reclassificação
0: ≤ 10
4
bactérias
0: ≤ 10
4
bactérias
0: ≤ 10
4
bactérias
1: < 10
5
bactérias
2: 10
5
bactérias
1: 10
4
– 10
5
bactérias
3: 10
5
– 10
6
bactérias
4: 10
6
bactérias
5: > 10
6
bactérias
2: > 10
5
1: > 10
4
21
4. RESULTADOS
4.1. População estudada
Sessenta indivíduos atenderam aos critérios de inclusão e, inicialmente,
aceitaram participar do estudo. Dos 60 indivíduos selecionados, 53 (88,33%)
finalizaram o estudo. Assim, 7 indivíduos não completaram o tempo experimental de
60 dias. Destes, um indivíduo faleceu e 6 tiveram seus dados excluídos, 2 por terem
apresentado problemas na reação do teste BANA e 4 por terem exibido problemas
na leitura dos filmes radiográficos.
Os participantes que completaram o estudo tinham entre 30 e 61 (42 ± 7,58)
anos de idade, 34 eram do gênero feminino e 19 eram do gênero masculino. O
Quadro 2 caracteriza a população estudada de acordo com os parâmetros clínicos
avaliados. Os valores médios de PS e NCI foram compatíveis com a gravidade da
doença, enquanto a média das freqüências de SS, IG e IPV foram compatíveis com
o tipo de patologia periodontal.
Quadro 2: Valores médios das variáveis contínuas (PS e NCI, em mm) e a
freqüência das variáveis categóricas (SS, IPV, IG em porcentagem) observados no
exame inicial.
Parâmetro clínico
Valores mínimo e
máximo
Média e Desvio Padrão
Profundidade de sondagem
em mm – PS
1 - 15 3,66 ± 1,77
Nível clínico de inserção
em mm – NCI
0 - 15 4,15 ± 2,17
Sangramento à Sondagem
em % - SS
20 – 96 59,20 ± 19,80
Índice de Placa Visível em
% – IPV
44 – 100 82,30 ± 12,40
Índice de Sangramento
Gengival em % - IG
7 - 89 35,20 ± 19,40
22
4.2 Resultados microbiológicos
Foram obtidas amostras subgengivais de 6 sítios periodontais, para cada
indivíduo (n=53), de modo que foram analisados em cada tempo experimental o total
de 318 amostras microbiológicas, totalizando ao final do estudo 1.272 amostras
microbiológicas.
A distribuição das freqüências de escores do Teste BANA e Checkerboard
DNA-DNA Hybridization, após a primeira reclassificação, nos 4 tempos
experimentais, estão apresentados no Quadro 3. As figuras 8 e 9 exibem a
porcentagem dos escores para o teste BANA e Checkerboard DNA-DNA
Hybridization, respectivamente. Em relação às proporções observadas nos 4
tempos experimentais, para os diferentes escores, os padrões observados foram
similares para as duas técnicas microbiológicas. Exceto pelos resultados observados
aos 45 dias (T2), houve uma tendência de alteração dos escores de 2 para 0 ao
longo do período de observação.
Quadro 3: Freqüências de escores do teste BANA e Checkerboard DNA-DNA
hybridization, após recodificação, nos diferentes tempos experimentais
Escore 0 Escore 1 Escore 2
Freqüências
BANA Ck BANA Ck BANA Ck
T0 (Inicial) 18 49 44 40 256 229
T1 (Imediato) 152 186 74 84 92 48
T2 (45 dias) 126 134 75 90 117 94
T3 (60 dias) 163 128 77 100 78 90
Ck – Checkerboard DNA – DNA hybridization; BANA - Benzoyl-DL-Arginine-2-Naphthylamide
BANA escores: 0 = atividade enzimática ausente; escore 1 = atividade enzimática moderada; escore
2 = atividade enzimática acentuada
Ck Escores: 0 = < 10
4
células, 1 = 10
4
- 10
5
células, 2 = > 10
5
células
23
Figura 8: Porcentagem dos escores do Teste BANA nos 4 tempos experimentais
*
*
2,60%
13,20% 84,20%
43% 28,90% 28,10%
34,20% 21,90% 43,90%
52,60% 22% 25,40%
T0
T1
T2
T3
tempos experimentais
BANA teste
escore 0
escore 1
escore 2
*
*
*
*
BANA escores: 0 = atividade enzimática ausente; escore 1 = atividade enzimática moderada; escore
2 = atividade enzimática acentuada, * diferença estatisticamente significativa entre os diferentes
escores para cada tempo experimental(ANOVA e Wilcoxon p < 0,05); T0 – inicial, T1 – imediato, T2 –
45 dias, T3 – 60 dias
Figura 9: Porcentagem dos escores do Checkerboard DNA – DNA hybridization nos
4 tempos experimentais
5,70%
13,80% 80,50%
48% 23,20% 28,80%
39,60% 23,60% 36,80%
51,40% 24% 24,60%
T0
T1
T2
T3
tempos experimentais
Checkerboard DNA - DNA hybridization
escore 0
escore 1
escore 2
*
*
*
*
Checkerboard DNA – DNA hybridization escores: 0 = < 10
4
células, 1 = 10
4
- 10
5
células, 2 = > 10
5
células; * diferença estatisticamente significativa entre os diferentes escores para cada tempo
experimental (ANOVA e Wilcoxon p < 0,05); T0 – inicial, T1 – imediato, T2 – 45 dias, T3 – 60 dias
24
As possíveis combinações entre as três espécies bacterianas, que compõem
o “complexo vermelho”, relacionadas a cada um dos três possíveis padrões de
atividade enzimática estabelecida pelo teste BANA, estão apresentadas nos
Quadros 4 – 7 de acordo com os tempos experimentais. Nestes quadros, foi adotada
a primeira reclassificação de escores do Checkerboard DNA – DNA hybridization. No
exame inicial, a ausência de atividade enzimática não foi acompanhada de ausência
bacteriana (Quadro 4). Em T1, o escore 0 de T. denticola foi o resultado que mais
contribuiu para o escore 0 do BANA (Quadro 5). Os Quadros 6 e 7 mostram
respectivamente que tanto em T2 como em T3 para o escore 1 do BANA as maiores
freqüências foram dos escores 2 do Checkerboard DNA – DNA hybridization para P.
gingivalis e T. forsythensis. Freqüências mais elevadas de escore 2 (Checkerboard
DNA – DNA hybridization) para P. gingivalis e T. forsythensis, também, foram
observadas, quando da ocorrência de atividade enzimática acentuada em todos os
tempos experimentais.
Quadro 4: Interpretação dos resultados do teste BANA, de acordo com a freqüência
das diferentes concentrações bacterianas estabelecidas pelo Checkerboard DNA -
DNA hybridization, após reclassificação dos escores. Dados observados no exame
inicial (T0).
Checkerboard DNA-DNA hybridization
P. gingivalis T. denticola T. forsythensis
Escore
0
Escore
1
Escore
2
Escore
0
Escore
1
Escore
2
Escore
0
Escore
1
Escore
2
Escore
0
Atividade
enzimática
Ausente
04 03 11* 04 02 12* 02 01 15*
Escore
1
Atividade
enzimática
Moderada
07 07 30* 12 07 25 06 03 35*
B
A
N
A
Escore
2
Atividade
enzimática
Acentuada
13 10 233* 30 29 197 13 05 238*
Checkerboard DNA – DNA hybridization escores: 0 = < 10
4
células, 1 = 10
4
- 10
5
células, 2 = > 10
5
células; *diferença estatística significativa entre os escores 0, 1 e 2 do Checkerboard DNA – DNA
hybridization para cada microrganismo (ANOVA e Wilcoxon, p<0,05)
25
Quadro 5: Interpretação dos resultados do teste BANA, de acordo com a freqüência
das diferentes concentrações bacterianas estabelecidas pelo Checkerboard DNA -
DNA hybridization, após reclassificação dos escores. Dados observados
imediatamente após o término da raspagem e alisamento radicular (T1).
Checkerboard DNA-DNA hybridization
P. gingivalis T. denticola T. forsythensis
Escore
0
Escore
1
Escore
2
Escore
0
Escore
1
Escore
2
Escore
0
Escore
1
Escore
2
Escore
0
Atividade
enzimática
Ausente
47 61 44 92* 38 22 75 31 46
Escore
1
Atividade
enzimática
Moderada
12 38* 24 37* 30* 07 24 20 30*
B
A
N
A
Escore
2
Atividade
enzimática
Acentuada
15 24 53* 37 28 27 20 24 48*
Checkerboard DNA – DNA hybridization escores: 0 = < 10
4
células, 1 = 10
4
- 10
5
células, 2 = > 10
5
células; *diferença estatística significativa entre os escores 0, 1 e 2 do Checkerboard DNA – DNA
hybridization para cada microrganismo (ANOVA e Wilcoxon, p<0,05)
Quadro 6: Interpretação dos resultados do teste BANA, de acordo com a freqüência
das diferentes concentrações bacterianas estabelecidas pelo Checkerboard DNA -
DNA hybridization, após reclassificação dos escores. Dados observados 45 dias
após o término da terapia periodontal (T2).
Checkerboard DNA-DNA hybridization
P. gingivalis T. denticola T. forsythensis
Escore
0
Escore
1
Escore
2
Escore
0
Escore
1
Escore
2
Escore
0
Escore
1
Escore
2
Escore
0
Atividade
enzimática
Ausente
35 50 41 58* 37 31 43 32 51
Escore
1
Atividade
enzimática
Moderada
19 20 36* 25 21 29 22 14 39*
B
A
N
A
Escore
2
Atividade
enzimática
Acentuada
09 39 69* 39 32 46 21 22 74*
Checkerboard DNA – DNA hybridization escores: 0 = < 10
4
células, 1 = 10
4
- 10
5
células, 2 = > 10
5
células; *diferença estatística significativa entre os escores 0, 1 e 2 do Checkerboard DNA – DNA
hybridization para cada microrganismo (ANOVA e Wilcoxon, p<0,05)
26
Quadro 7: Interpretação dos resultados do teste BANA, de acordo com a freqüência
das diferentes concentrações bacterianas estabelecidas pelo Checkerboard DNA -
DNA hybridization, após reclassificação dos escores. Dados observados 60 dias
após o término da terapia periodontal (T3).
Checkerboard DNA-DNA hybridization
P. gingivalis T. denticola T. forsythensis
Escore
0
Escore
1
Escore
2
Escore
0
Escore
1
Escore
2
Escore
0
Escore
1
Escore
2
Escore
0
Atividade
enzimática
Ausente
30 61 72* 65 49 49 39 39 85*
Escore
1
Atividade
enzimática
Moderada
11 26 40* 28 26 23 14 20 43*
B
A
N
A
Escore
2
Atividade
enzimática
Acentuada
02 23 53* 28 13 37 07 15 56*
Checkerboard DNA – DNA hybridization escores: 0 = < 10
4
células, 1 = 10
4
- 10
5
células, 2 = > 10
5
células; *diferença estatística significativa entre os escores 0, 1 e 2 do Checkerboard DNA – DNA
hybridization para cada microrganismo (ANOVA e Wilcoxon, p<0,05)
Os resultados da análise do Qui-quadrado (χ
2
) bem como os valores de
sensibilidade (S), especificidade (E), valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo
negativo (VPN), considerando-se de forma isolada as três espécies bacterianas, que
compõem o “complexo vermelho”, estão expressos nos quadros 8 a 11 de acordo
com os tempos experimentais. Para estas análises foram considerados os escores
decorrentes da segunda reclassificação.
Não foram observadas associações entre os resultados do teste BANA e
presença de T. denticola no exame inicial e 60 dias após o término da terapia
periodontal. Os resultados das duas técnicas microbiológicas, também, não exibiram
associação para T. forsythensis em T0.
No exame inicial, a sensibilidade do teste BANA foi alta para as 3 bactérias.
Nos demais exames não foi satisfatória. Os valores de especificidade mostraram-se
abaixo dos limites aceitáveis (80%).
27
Quadro 8: Associação entre os resultados das 2 técnicas microbiológicas, após
reclassificação dos escores, considerando-se isoladamente as 3 espécies
bacterianas. Dados observados no exame inicial (T0).
Checkerboard DNA-DNA hybridization
P. gingivalis T. denticola T. forsythensis
Escore 0 Escore 1
Escore 0 Escore 1
Escore 0 Escore 1
Escore
0
Atividade
enzimática
Ausente
04
14
04
14
02
16
B
A
N
A
Escore
1
Atividade
enzimática
presente
20
280
42
258
19
281
χ
2
e p
5,89 0,015 NS NS
S 95,24% 94,85% 94,61%
E 16,67% 8,7% 9,52%
VPP 93,33% 86% 93,67%
VPN 22,22% 22,22% 11,11%
Checkerboard DNA – DNA hybridization escores: 0 = < 10
5
células, 1 = > 10
5
células; NS = não-
significativo (p < 0,05); χ
2
= Qui-Quadrado; S= Sensibilidade; E= Especificidade; VPP= Valor Preditivo
Positivo; VPN= Valor Preditivo Negativo.
Quadro 9: Associação entre os resultados das 2 técnicas microbiológicas, após
reclassificação dos escores, considerando-se isoladamente as 3 espécies
bacterianas. Dados observados, imediatamente, após o término da raspagem e
alisamento radicular (T1).
Checkerboard DNA-DNA hybridization
P. gingivalis T. denticola T. forsythensis
Escore 0 Escore 1
Escore 0 Escore 1
Escore 0 Escore 1
Escore
0
Atividade
enzimática
Ausente
47
105
92
60
02
16
B
A
N
A
Escore
1
Atividade
enzimática
presente
27
139
74
92
19
281
χ
2
e p
9,55 e 0,002 8,09 e 0,004 17,67 e 0,000
S 56,97% 60,53% 61,31%
E 63,51% 55,42% 63,03%
VPP 83,73% 55,42% 73,49%
VPN 30,92% 60,53% 49,34%
Checkerboard DNA – DNA hybridization escores: 0 = < 10
5
células, 1 = > 10
5
células; NS = não-
significativo (p < 0,05); χ
2
= Qui-Quadrado; S= Sensibilidade; E= Especificidade; VPP= Valor Preditivo
Positivo; VPN= Valor Preditivo Negativo.
28
Quadro 10: Associação entre os resultados das 2 técnicas microbiológicas, após
reclassificação dos escores, considerando-se isoladamente as 3 espécies
bacterianas. Dados observados 45 dias após o término da terapia periodontal (T2).
Checkerboard DNA-DNA hybridization
P. gingivalis T. denticola T. forsythensis
Escore 0 Escore 1
Escore 0 Escore 1
Escore 0 Escore 1
Escore
0
Atividade
enzimática
Ausente
35 91 58 68 43 83
B
A
N
A
Escore
1
Atividade
enzimática
presente
28 164 64 128 43 149
χ
2
e p
8,337 e 0,004 5,188 e 0,023 5,306 e 0,021
S 64,31% 65,31% 64,22%
E 55,56% 47,54% 50%
VPP 85,42% 66,67% 77,60%
VPN 27,78% 46,03% 34,13%
Checkerboard DNA – DNA hybridization escores: 0 = < 10
5
células, 1 = > 10
5
células; NS = não-
significativo (p < 0,05); χ
2
= Qui-Quadrado; S= Sensibilidade; E= Especificidade; VPP= Valor Preditivo
Positivo; VPN= Valor Preditivo Negativo.
Quadro 11: Associação entre os resultados das 2 técnicas microbiológicas, após
reclassificação dos escores, considerando-se isoladamente as 3 espécies
bacterianas. Dados observados 60 dias após o término da terapia periodontal (T3).
Checkerboard DNA-DNA hybridization
P. gingivalis T. denticola T. forsythensis
Escore 0 Escore 1
Escore 0 Escore 1
Escore 0 Escore 1
Escore
0
Atividade
enzimática
Ausente
30 133 65 98 39 124
B
A
N
A
Escore
1
Atividade
enzimática
presente
13 142 56 99 21 134
χ
2
e p
6,819 e 0,009 NS 5,590 e 0,018
S 51,64% 50,25% 51,94%
E 69,77% 53,72% 65%
VPP 91,61% 63,87% 86,45%
VPN 18,40% 39,88% 23,93%
Checkerboard DNA – DNA hybridization escores: 0 = < 10
5
células, 1 = > 10
5
células; NS = não-
significativo (p < 0,05); χ
2
= Qui-Quadrado; S= Sensibilidade; E= Especificidade; VPP= Valor Preditivo
Positivo; VPN= Valor Preditivo Negativo.
29
Os quadros 12 a 15 apresentam os resultados referentes à análise do
“complexo vermelho”, ou seja, da presença ou ausência simultânea de P. gingivalis,
T. forsythensis e T. denticola. Os resultados do teste BANA demonstraram
associação com a identificação do “complexo vermelho”, apenas no exame inicial.
Para o “complexo vermelho”, os valores de sensibilidade também foram
adequados, apenas, no exame inicial. E, os valores de especificidade foram sempre
baixos (Figura 10).
Quadro 12: Associação entre os resultados das duas técnicas microbiológicas, após
reclassificação dos escores, considerando-se o “complexo vermelho”. Dados
observados no exame inicial (T0).
Checkerboard DNA – DNA
hybridization
complexo vermelho
Escore 0 Escore 1
Checkerboard DNA – DNA hybridization escores: 0 = ≤ 10
4
células, 1 = > 10
4
células; NS = não-
significativo (p < 0,05); S= Sensibilidade; E= Especificidade; VPP= Valor Preditivo Positivo; VPN=
Valor Preditivo Negativo; χ
2
= Qui-Quadrado.
Escore
0
Atividade enzimática
Ausente
17 43
B
A
N
A
Escore
1
Atividade enzimática
Presente
30 228
χ
2
e p
10,79 e 0,001
S 84,13%
E 39,53%
VPP 88,37%
VPN 28,33%
30
Quadro 13: Associação entre os resultados das duas técnicas microbiológicas, após
reclassificação dos escores, considerando-se o “complexo vermelho”. Dados
observados imediatamente após o término da raspagem e alisamento radicular (T1).
Checkerboard DNA – DNA
hybridization
complexo vermelho
Escore 1 Escore 0
125 77
Checkerboard DNA – DNA hybridization escores: 0 = ≤ 10
4
células, 1 = > 10
4
células; NS = não-
significativo (p < 0,05); S= Sensibilidade; E= Especificidade; VPP= Valor Preditivo Positivo; VPN=
Valor Preditivo Negativo; χ
2
= Qui-Quadrado.
Quadro 14: Associação entre os resultados das duas técnicas microbiológicas, após
reclassificação dos escores, considerando-se o “complexo vermelho”. Dados
observados 45 dias após o término da raspagem e alisamento radicular (T2).
Checkerboard DNA – DNA hybridization escores: 0 = ≤ 10
4
células, 1 = > 10
4
células; NS = não-
significativo (p < 0,05); S= Sensibilidade; E= Especificidade; VPP= Valor Preditivo Positivo; VPN=
Valor Preditivo Negativo; χ
2
= Qui-Quadrado.
Escore
0
Atividade enzimática
Ausente
B
A
N
A
Escore
1
Atividade enzimática
presente
59 57
χ
2
e p
NS
S 42,54%
E 67,93%
VPP 45,24%
VPN 61,88%
Checkerboard DNA – DNA
hybridization
complexo vermelho
Escore 0 Escore 1
Escore
0
Atividade enzimática
Ausente
92 109
B
A
N
A
Escore
42 75
Atividade enzimática
presente 1
χ
2
e p
NS
S 40,76%
E 68,66%
VPP 64,10%
VPN 45,77%
31
Quadro 15: Associação entre os resultados das duas técnicas microbiológicas, após
reclassificação dos escores, considerando-se o “complexo vermelho”. Dados
observados 60 dias após o término da raspagem e alisamento radicular (T3).
Checkerboard DNA – DNA
hybridization
complexo vermelho
Escore 1 Escore 0
115
Escore Atividade enzimática
Ausente 0
125
B
A
N
A
Escore
1
Atividade enzimática
presente
28 50
χ
2
e p
NS
S 28,57%
E 80,42%
VPP 64,10%
Checkerboard DNA – DNA hybridization escores: 0 = ≤ 10
4
células, 1 = > 10
4
células; NS = não-
significativo (p < 0,05); S= Sensibilidade; E= Especificidade; VPP= Valor Preditivo Positivo; VPN=
Valor Preditivo Negativo; χ
2
= Qui-Quadrado.
VPN 47,92%
Análise conjunto - "complexo vermelho"
Sensibilidade Especificidade
28,57
40,76
42,54
84,13
80,42
68,66
39,53
67,93
T0 T1 T2 T3
Tempos experimentais
BANA teste
Figura 10: Valores de sensibilidade e especificidade, para a detecção do “complexo
vermelho”, pelo teste BANA, nos 4 tempos experimentais, utilizando-se o
Checkerboard DNA – DNA hybridization como técnica padrão.
32
5. DISCUSSÃO
Métodos como o Checkerboard DNA-DNA hybridization e o N-Benzoil-DL-
Arginina-2-Naftilamida (BANA) têm a capacidade de revelar direta ou indiretamente,
a presença de bactérias, envolvidas na etiologia da doença periodontal. O teste
BANA pode ser utilizado como indicador de doença periodontal (Grisi et al., 2001), já
que algumas bactérias periodontopatogênicas, P. gingivalis, T. forsythensis e/ou T.
denticola têm a capacidade de produzir arginina hidrolase, uma enzima semelhante
à tripsina, que age na destruição das moléculas de colágeno. Assim, na presença
dessas bactérias e, após, incubação adequada, a hidrólise do substrato BANA gera,
em poucos minutos, uma reação colorimétrica de fácil visualização (Tanner et
al.,1998; Feitosa et al., 1993; Loesche et al., 1990). Por sua vez, o Checkerboard
DNA-DNA hybridization, desenvolvido por Socransky et al. (1994), possibilita a
análise de 28 amostras de biofilme, pesquisando simultaneamente uma grande
variedade de espécies bacterianas. A hibridização das amostras do biofilme com
sondas de DNA genômico, marcadas com digoxigenina, permite a detecção de
múltiplas reações em uma única membrana, com economia de tempo e identificação
de espécies de difícil cultivo em laboratório.
O Checkerboard DNA-DNA hybridization, como descrito anteriormente, tem
sido aplicado em vários estudos clínicos com diferentes propósitos (Ximenez-Fyvie
et al., 2000c; Feres et al., 2001; Colombo et al. 2002; Mager et al., 2003; Socransky
et al., 2004; Haffajee et al., 2005). O seu limite de detecção, provavelmente, atribui a
esta técnica molecular uma associação estreita com sinais clínicos de doença, em
especial, quando se considera a pesquisa do “complexo vermelho” (Haffajee et al.,
1997). Por isso, esta técnica pode ser utilizada para verificar os padrões
microbiológicos resultantes da terapia periodontal (Haffajee et al., 2005).
Desse modo, o objetivo do presente estudo foi comparar duas técnicas
microbiológicas, com características bem distintas, a fim de tentar validar os
resultados do teste BANA, adotando-se como padrão o Checkerboard DNA-DNA
hybridization, que, por sua vez, possibilita a identificação isolada das espécies que
compõem o “complexo vermelho”. Além disso, tentar elucidar o exato
comportamento microbiológico que acarreta ausência, ou presença em níveis
variados de atividade enzimática.
33
A associação entre o teste BANA com indicadores clínicos de doença
periodontal parece estar bem estabelecida (Loesche et al., 1990; Wilson et al., 1993;
Bretz et al., 1993; Pomes et al., 2000; Grisi et al., 2001). Embora exiba relação com
bolsas periodontais profundas (Takaishi et al., 2003; Yucekal-Tuncer et al., 2003),
sangramento gengival (Schmidt et al., 1988; Greenstein, 1984) e sangramento à
sondagem (Greenstein, 1984; Armitage 1996), é difícil indicar o teste BANA como
substituto de parâmetros clínicos, podendo este teste, oferecer informações
complementares dentro da caracterização periodontal.
Poucos autores, como Amalfitano et al. (1993) relataram, que, embora o
resultado positivo do teste BANA possa refletir a colonização bacteriana, raramente,
apresenta associação com evidência clínica de doença periodontal. Como a maior
parte dos autores (Bretz et al., 1993; Loesche et al., 1990; Hemmings et al., 1997),
Figueiredo et al. (2000) apontaram baixa especificidade do teste BANA em relação
aos parâmetros clínicos, isto é, mesmo na presença de doença, o teste exibiu
resultados negativos. Devido a este fato, sua utilização como indicador de doença
pode originar resultados contraditórios, principalmente, na terapia de manutenção,
onde as evidências clínicas tendem a ser mais discretas. Hemmings et al. (1997),
Loesche et al. (1990) e Watson et al. (1991) já haviam relatado, que, mesmo em
casos de doença periodontal, pode haver uma eventual resposta negativa, a qual
decorre da ausência de bactérias em número suficiente para gerar marcação no
cartão.
Devido à relação definida com parâmetros clínicos periodontais, para o
presente estudo foram selecionados apenas indivíduos previamente, diagnosticados
como portadores de periodontite crônica moderada (Armitage, 2002). Para obtenção
do diagnóstico periodontal foi necessário o exame completo de toda a cavidade
bucal, avaliando-se 6 sítios/dente. Os valores médios de PS e NCI foram
compatíveis com a gravidade da doença, isto é, periodontite moderada; enquanto as
freqüências elevadas de SS, IG e IPV foram compatíveis com o tipo de patologia
periodontal, isto é, periodontite crônica (Armitage, 2002). A inclusão de indivíduos
com doença periodontal bem caracterizada, teve por objetivo, aumentar a tendência
de ocorrência de reações BANA positivas e, por conseqüência, estabelecer, de
forma mais precisa, o comportamento das três espécies bacterianas associado à
positividade ou negatividade da reação BANA.
34
No presente estudo, no exame inicial (T0) a freqüência de reações BANA
positivas foi 94,33%, considerando-se ambos os perfis de atividade enzimática,
moderado e acentuado. Vergani et al. (2004) avaliaram diferentes modalidades
terapêuticas, utilizando como parâmetro microbiológico o teste BANA. Os resultados
positivos iniciais do referido teste variaram entre 68,2% a 90,3%. No período de 90
dias de observação, após o término da terapia periodontal o número de reações
BANA positivas apresentou marcada redução variando de 0,0 a 9,1%.
Adicionalmente, no presente estudo 60 dias após a terapia de raspagem e
alisamento radicular (T3) o número de reações BANA positivas passou para 155
(47,16%), também, considerando os escores 1 e 2.
Embora haja um número elevado de estudos, que compararam os resultados
do Teste BANA com parâmetros clínicos, a comparação entre o teste BANA com
outras técnicas microbiológicas é bastante escassa.
Em relação às proporções observadas, nos 4 tempos experimentais, para os
diferentes escores, os padrões encontrados foram similares para as duas técnicas
microbiológicas. Exceto pelos resultados observados aos 45 dias (T2) onde houve
uma tendência de alteração dos escores de 2 para 0 no teste BANA. Em termos
gerais, inicialmente (T0), foram observadas atividade enzimática acentuada e
presença bacteriana em proporções elevadas para os 2 testes (Figuras 8 e 9). No
teste BANA, a reversão do quadro alcançada em T1 não foi mantida em T2, onde se
observou níveis estatisticamente maiores de escore 2. Os resultados do
Checkerboard DNA-DNA hybridization também mostraram um ligeiro aumento do
escore 2 no tempo T2. Este fato pode sugerir uma recolonização bacteriana
(determinada pelo Checkerboard DNA – DNA hybridization) e atividade metabólica
do biofilme mais acentuada (determina pelo teste BANA) neste tempo. Mas, é
interessante salientar, que aos 60 dias (T3) os escores 0 de ambas as técnicas
voltaram a predominar, por isso essas alterações foram apenas transitórias. De
acordo com Petersilka (2002), devido à seqüência de colonização bacteriana, que
ocorre após o debridamento mecânico, patógenos periodontais como T. denticola e
P. gingivalis podem se manter em proporções reduzidas por inúmeros meses. E,
segundo Ramberg et al. (2003) procedimentos mecânicos de higiene bucal,
instituída pelos participantes e pelos profissionais, estabelecem níveis de biofilme
dental próximos a zero. Estes autores, em quatro dias de observação, praticamente,
não detectaram espécies do “complexo vermelho”, empregando-se Checkerboard
35
DNA – DNA hybridization. Querido et al. (2004), em indivíduos com periodontite
crônica, observaram 33,4% dos sítios periodontais positivos para P. gingivalis e
26,0% para T. forsythensis, 30 dias após o término da terapia periodontal mecânica.
Beikler et al. (2004), utilizando a técnica de PCR, avaliaram inicialmente, em 6
semanas, 3 e 6 meses as alterações microbiológicas associadas à terapia
periodontal mecânica. Ao longo do período experimental P. gingivalis exibiu redução
transitória e T. forsythensis aumento transitório, enquanto T. denticola manteve-se
praticamente inalterado, na área subgengival. Adicionalmente, Quirynen et al. (2005)
concluíram que, mesmo o ambiente supragengival sendo a única fonte de
colonização microbiana, uma complexa microbiota subgengival pode estar
reestabelecida em 1 semana.
Por esta análise preliminar, o teste BANA pareceu acompanhar os dados do
Checkerboard DNA – DNA hybridization, apresentando apenas oscilações
compatíveis com as variações microbiológicas. Mas, a análise isolada das três
espécies bacterianas, bem como a análise do próprio “complexo vermelho”, parece
não confirmar esta suposta concordância de resultados.
No Teste BANA, a presença de 10
4
células de T. denticola, P. gingivalis e/ou
T. forsythensis tende a resultar em atividade enzimática suficiente para gerar uma
coloração azul no cartão após 15 minutos de incubação a 55
o
C. Porém, por resultar
da ação da enzima arginina hidrolase, a reação BANA positiva independe da
ocorrência subgengival de apenas uma ou mais espécies bacterianas. Nos
resultados aqui obtidos, no exame inicial (T0), a ausência de atividade enzimática
não foi acompanhada de ausência bacteriana. Pelo contrário, o escore 0 do BANA
teve como valores mais freqüentemente associados (Wilcoxon, p< 0,05) os escores
2 do Checkerboard DNA-DNA hybridization, para as 3 bactérias (Quadro 4).
Adicionalmente, não está claro na literatura se P. gingivalis, T. denticola e T.
forsythensis contribuem, de modo mais, ou menos significativo, para a positividade
da reação BANA. Entretanto, sabe-se que há variação na expressão gênica,
relacionada à produção enzimática dentro de cada espécie bacteriana e, que esta
variação apresenta relação com a virulência bacteriana (Lamont & Jenkinson, 2000;
Fenno et al., 2001; Sela 2001; Ally et al., 2003; Lee & Fenno, 2004). Diferentes
genótipos de P. gingivalis, além de influenciar a atividade proteolítica, parecem,
também, influenciar a coexistência com outras espécies bacterianas incluindo T.
forsythensis (Miura et al., 2005). Além disso, a análise de seqüências ribossômicas
36
tem encontrado novas espécies bacterianas possivelmente associadas à
periodontite crônica (Kumar et al., 2003), cujo perfil enzimático ainda não foi
determinado. No presente estudo em T1, o escore 0 de T. denticola foi o resultado
de maior freqüência associado ao escore 0 do teste BANA (Quadro 5). Ao passo que
nos demais tempos experimentais, o escore 0 do BANA foi acompanhado por
presença bacteriana em proporções elevadas, (Checkerboard DNA – DNA
hybridization - escore 2), especialmente, de P. gingivalis e T. forsythensis. Smith et
al. (1995) não encontraram correlação entre níveis subgengivais elevados de P.
gingivalis e atividade enzimática (teste BANA). Os Quadros 6 e 7 mostram,
respectivamente, que tanto em T2 como em T3 para o escore 1 do BANA
contribuíram igualmente os escores 2 do Checkerboard DNA – DNA hybridization
para P. gingivalis e T. forsythensis. Freqüências mais elevadas de escore 2
(Checkerboard DNA – DNA hybridization), para P. gingivalis e T. forsythensis,
também foram observadas, quando da ocorrência de atividade enzimática
acentuada (BANA escore 2) em todos os tempos experimentais. Como escores 2
para P. gingivalis e T. forsythensis foram encontradas em associação com escores 0
e 2 do BANA, sugere-se uma maior investigação do perfil enzimático de T. denticola.
Este fato pode ganhar relevância ao lembrarmos que Haffajee et al., (2004) ao
compararem a composição do biofilme subgengival de 300 indivíduos de 4 paises
encontraram T. denticola como a espécie mais prevalente no Brasil
comparativamente ao Chile, Suécia e Estados Unidos da América.
A maior parte dos estudos na literatura parece comparar o teste BANA com a
reação ELISA. Utilizando esta técnica como padrão, o teste BANA parece ter
sensibilidade adequada e especificidade reduzida (Bretz et al. 1993). Contudo, no
estudo de Watson et al. (1991) o teste BANA originou resultados diferentes,
apresentando especificidade de 92% e sensibilidade de apenas 25% em relação ao
teste ELISA, no exame inicial. Já Wilson et al. (1993) demonstraram forte correlação
entre teste BANA e a reação ELISA em amostras subgengivais de indivíduos com
periodontite, o que não ocorreu nas amostras coletadas de indivíduos
periodontalmente saudáveis.
No presente estudo, no exame inicial a sensibilidade do teste BANA foi alta,
variando de 94,61% a 95,24% para as 3 bactérias. Nos demais exames, não foi
satisfatória, permanecendo sempre abaixo do limite de aceitação de 80%. Já os
37
valores de especificidade se mostraram abaixo dos limites aceitáveis, em todos os
tempos experimentais (Quadros 8 - 11).
Para as 3 espécies bacterianas, isoladamente, no estudo de Wetzel et al.
(1991) o teste BANA exibiu sensibilidade adequada apenas no grupo pré-tratamento
periodontal. Por outro lado, no estudo de Watson et al. (1991), a reação BANA foi
negativa quando T. denticola e/ou P. gingivalis não foram detectados pelos
reagentes imunológicos. Contudo, neste mesmo estudo, quando a reação ELISA
detectou T. denticola e/ou P. gingivalis, a reação BANA foi freqüentemente negativa.
Em 2003, Takaishi et al., comparam o Teste BANA com a técnica PCR e, a despeito
de resultados superiores da última, concluíram que ambos os métodos podem ser
úteis para detectar patógenos associados com a destruição tecidual.
Os resultados do teste BANA demonstraram associação (Qui-quadrado, p <
0,05) com a identificação do “complexo vermelho”, apenas no exame inicial (Quadro
12). Em T0, esta associação também foi observada para as 3 espécies bacterianas
isoladamente. Porém, nos demais tempos experimentais os resultados foram
discrepantes (Quadros 13 - 15). Assim, se a atividade enzimática difere da
identificação isolada das bactérias, os resultados do teste BANA parecem atuar
melhor como preditores da destruição tecidual (Luterbacher et al. 2000), pelo
potencial lítico da enzima arginina hidrolase, do que propriamente como indicadores
microbiológicos.
Para o “complexo vermelho”, houve uma tendência de declínio dos valores de
sensibilidade, ao longo do período experimental, estando estes, dentro dos limites
aceitáveis apenas no exame inicial. Já, os valores de especificidade não foram tão
baixos como os observados para as bactérias isoladas, mas, mesmo assim,
permaneceram abaixo dos limites aceitáveis. No estudo de Bretz et al., (1993), a
sensibilidade do Teste BANA em relação ao teste ELISA foi adequada,
considerando-se a presença conjunta das três espécies bacterianas, porém a
especificidade foi adequada apenas quando da análise isolada das bactérias.
A maior variabilidade dos resultados do teste BANA em relação ao
Checkerboard DNA – DNA hybridization pareceu ocorrer para resultados negativos.
Ou seja, nem sempre a ausência de atividade enzimática pode ser acompanhada de
ausência das bactérias, que produzem arginina hidrolase. Este fato pode explicar
sua baixa especificidade, isto é, reação BANA negativa na presença das bactérias.
38
Os resultados aqui observados sugerem que P. gingivalis, T. denticola e T.
forsythensis apresentam diferentes contribuições para o resultado da reação BANA.
Portanto, estudos futuros deverão ser conduzidos a fim de verificar se os resultados
obtidos em 60 dias de observação, mantém-se por períodos mais longos. E, se em
outros períodos experimentais pode haver maior concordância de resultados entre
estas duas técnicas microbiológicas.
39
6. CONCLUSÕES
O teste BANA mostrou ser uma técnica sensível para a detecção do
“complexo vermelho”, no diagnóstico inicial. Todavia, a presença e os níveis
subgengivais de P. gingivalis, T. denticola e T. forsythensis não mostraram uma
relação direta com os níveis de atividade enzimática.
40
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50
ANEXO 1 – Carta de aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UnG
51
ANEXO 2 - Protocolo dos Reagentes usados no Checkerboard DNA – DNA
hybridization
NaOH: 0,5M
Preparo: 1gr de NaOH em 50ml de água destilada
Acetato de amônio: 5M:
Preparo: 38,5gr em 100ml de água destilada
Solução de 2XSSC:
Preparo:
50ml da Solução 2XSSC diluir em 450ml de água destilada
OBS: Solução preparada a partir da solução de 20XSSC
Solução de 20XSSC:
87,67gr de NaCL
44,12gr de Citrato de Sódio
Diluir em 500ml de água destilada: pH 7,5
Autoclavar
Solução de Pré-Hibridização (Estoque)
88gr de NaCL
44gr de Citrato de sódio
6,9gr de Fosfato de sódio monobásico
Diluir em 500ml de água destilada: pH 6,5
Autoclavar
Solução de Hibridização (Estoque)
30,7gr de NaCL
16,1gr de Citrato de sódio
2,01gr de Fosfato de sódio monobásico
Diluir em 300ml de água destilada: pH 6,5
Autoclavar
Solução de Pré-Hibridização (Uso)
50ml de Formamida (Usar do estoque)
6ml de Rna de levedura (Usar do estoque)
35ml de Sol. De Pré-Hibridização
10ml de Caseína (Usar do estoque)
Solução de Hibridização (Uso) - Diluir as sondas
20ml de Formamida (Usar do estoque)
800ul de Rna de levedura (Usar do estoque)
Dissolver 4gr de Sulfato de Dextran em 17,2ml de Solução de Hibridização (Usar do
estoque)
4ml de caseína (Usar do estoque)
52
Formamida (Estoque)
500ml de Formamida
25gr de resina de deionização
Deixar meia hora homegeinizando
Filtrar com papel de filtro
Estocar no Freezer
Rna de Levedura (Estoque)
1gr de Rna de Levedura em 100ml de água destilada
Ferver para dissolver bem
Estocar no Freezer
Solução de TE
0,785gr de TrisHCL
0,186gr de EDTA
pH 7,6
Filtrar
Autoclavar
Tampões de Lavagem
Buffer de Fosfato (Primeira lavagem no Banho-maria com circulação 65°C)
30gr de SDS (Dodecil Sulfato de Sódio)
1,1gr de EDTA
8,4gr de Fosfato de sódio dibásico
Diluir em 3litros de água destilada
Autoclavar
Blocking Buffer (Segunda lavagem)
450ml de Maleic Buffer
50ml de caseína
OBS: Deste total 50ml para diluição do anticorpo
Anticorpo (Anti Digoxigenina)
5ul de anticorpo
50ml de Blocking Buffer
Maleic Buffer
(Terceira lavagem) – Lavagem para retirar o excesso de anticorpo
34,8gr de ácido maleico
26,3gr de NaCl
22gr de NaOH
Diluir em 3litros de água destilada: pH 7,5
Adicionar 9ml de de Tween 20
Autoclavar
53
Bu ffer 3
7,85gr de TrisHCL
8,75gr de NaCl
Diluir em 500ml de água destilada: pH 9,5
Autoclavar
Buffer 1 (Usado para preparar a Caseína)
29gr de ácido maleico
21,75gr de NaCL
18,75 de NaOH
Diluir em 2,5litros de água destilada: pH 7,5
Autoclavar
Caseína
80gr de caseína em 800ml de água destilada
Homenizar
Autoclavar
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