( PDF ) Comparação entre a toxicidade pulmonar de partículas de origem urbana e de queima de cana-de-açucar

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FLAVIA MAZZOLI DA ROCHA

COMPARAÇÃO ENTRE A TOXICIDADE PULMONAR

DE PARTÍCULAS DE ORIGEM URBANA E DE

QUEIMA DE CANA-DE-AÇÚCAR

Dissertação submetida à Pós-graduação do Instituto de Biofísica Carlos

Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro visando à

obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas (Fisiologia).

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

2008

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COMPARAÇÃO ENTRE A TOXICIDADE PULMONAR DE

PARTÍCULAS DE ORIGEM URBANA E DE QUEIMA DE CANA-DE-

AÇÚCAR

FLAVIA MAZZOLI DA ROCHA

ORIENTADORA: DÉBORA SOUZA FAFFE

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências

Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade

Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção

do título de Mestre.

APROVADA POR:

________________________________________________________________

Prof. Walter Araújo Zin

Prof. Titular UFRJ

_________________________________________________________________

Prof

. Regina Coeli dos Santos Goldenberg

Prof

. Adjunta UFRJ

_________________________________________________________________

Prof

. Claudia dos Santos Mermelstein

Prof

. Adjunta UFRJ

_________________________________________________________________

Prof

. Vânia Maria Correa da Costa – Revisora e Suplente Interna

Prof

. Adjunta UFRJ

_________________________________________________________________

Prof. Robson Coutinho Silva – Suplente Externo

Prof. Adjunto UFRJ

Rio de Janeiro

Março de 2008

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Rocha, Flavia Mazzoli da

Comparação entre a toxicidade pulmonar de partículas de origem urbana

e de queima de cana-de-açúcar / Flavia Mazzoli da Rocha. – Rio de Janeiro:

UFRJ / IBCCF, 2008.

xix, 149 f. : il. ; 31 cm.

Orientadora: Débora Souza Faffe

Dissertação (mestrado) – UFRJ/IBCCF, Programa de Pós -

Graduação em Ciências Biológicas, Fisiologia, 2008.

Referências bibliográficas: f. 93-110

1. Poluição do ar. 2. Mecânica respiratória - fisiologia. 3 Biomassa. 4.

Material particulado - toxicidade. 5. Saccharum. 6. Camundongos. 7.

Fisiologia – tese. i. Faffe, Débora Souza. ii. Universidade Federal do Rio de

Janeiro, IBCCF, Programa de Pós-Graduação Ciências Biológicas, Fisiologia.

iii. Comparação entre a toxicidade pulmonar de partículas de origem urbana

e de queima de cana-de-açúcar.

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia da Respiração do

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro

na vigência de auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP),

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro

(FAPERJ), Conselho de Ensino para Graduados e Pesquisa da UFRJ (CEPG-

UFRJ), Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX), e Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Aos meus pais e à minha querida irmã, pelo

amor, paciência, imensa dedicação e apoio em

todos os momentos de minha vida.

AGRADECIMENTOS

Nesta importante fase da minha vida, não poderia deixar de agradecer a

todas as pessoas que, de alguma forma, me ajudaram no decorrer deste trabalho.

À Profª. Débora Souza Faffe, por todos os momentos que se dedicou a mim,

sempre me auxiliando e compartilhando sua sabedoria em todas as etapas deste

trabalho, pela oportunidade de estar realizando este desejo, pela confiança, pela

compreensão nos momentos difíceis, pela atenção a qualquer momento que

precisasse, sempre ouvindo as minhas dúvidas, por sempre me incentivar e com isto

aumentar ainda mais minha vontade de aprender, pelo exemplo profissional que

tanto admiro e, sobretudo, pela pessoa maravilhosa que me recebe sempre com boa

vontade. Muito obrigada pela oportunidade e confiança depositada em mim.

Ao Prof. Walter Araújo Zin, por seus ensinamentos, conselhos e auxílios, por

sua disponibilidade em ajudar e pela oportunidade de poder estar aqui.

Ao Prof. Paulo Hilário do Nascimento Saldiva, pela imensa ajuda neste

trabalho, desde a obtenção das partículas utilizadas até a interpretação de dados,

além da essencial ajuda na fase de elaboração do artigo.

Ao Prof. Olaf Malm, pela análise das partículas e paciência em resolver

minhas dúvidas.

À colaboradora do Laboratório de Poluição Aérea Experimental, Regiani

Carvalho de Oliveira, pela análise do tamanho das partículas.

Ao colaborador, Marcos Abdo Arbex, pelas amostras das partículas e

informações sobre características da coleta.

À colaboradora do Laboratório de Fisiologia da Respiração, Clarissa Bichara

Magalhães, pela análise das lâminas e por sua fiel amizade.

Às alunas Mariana Alonso e Tatiana Mesquita, pela presença sempre alegre e

dedicada durante os experimentos, onde tanto me ajudaram.

Aos colaboradores do Laboratório de Radioisótopos Eduardo Penna Franca,

Rodrigo Meire e José Ricardo Tomás, pela análise da composição das partículas e

pela ajuda na compreensão das mesmas.

Aos queridos colegas do Laboratório de Fisiologia da Respiração, pela

preocupação, compreensão, paciência, carinho e, também, pelos momentos de

descontração. Com certeza, nesses poucos dois anos e meio de convivência no

laboratório, foram criados laços de amizade que perdurarão para o resto da vida.

Que a vida lhes retorne em dobro todas as coisas boas que fizeram por mim.

Aos funcionários do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, em especial

aos técnicos de laboratório Sr. Antônio Carlos de Souza Quaresma e ao Sr. João

Luiz Coelho Rosas Alves, sempre dispostos a ajudar.

Aos meus queridos e maravilhosos pais, Luiz Carlos e Fátima, pelo amor,

educação e criação, amizade e tamanha ajuda, sem a qual eu não estaria aqui. Amo

vocês.

À minha querida irmã, Fernanda, pela amizade, carinho, compreensão e

paciência. Amo você demais.

Aos meus avós, Manoel e Lídia, que tanto amo, pela preocupação, ajuda e

carinho ao longo de minha vida.

Ao meu namorado, José Sigiliano Gomes Neto, pelo amor, ajuda nos

momentos difíceis, carinho, amizade, respeito e compreensão. Agradeço a você pela

enorme contribuição neste trabalho, por me fortalecer internamente e por tanto me

incentivar desde a seleção para o mestrado e até quando Deus quiser.

E, finalmente, a Deus, pela excelente família e amigos que tenho, por me

proporcionar saúde e, finalmente, por tudo que sou.

RESUMO

COMPARAÇÃO ENTRE A TOXICIDADE PULMONAR DE PARTÍCULAS DE

ORIGEM URBANA E DE QUEIMA DE CANA-DE-AÇÚCAR

Introdução: A queima de biomassa é uma fonte importante e crescente de material

particulado, principal componente urbano da poluição do ar ambiente. Nós

avaliamos a toxicidade das partículas produzidas pela queima de cana-de-açúcar e

comparamos os resultados com massa equivalente de partículas provenientes de

poluição urbana.

Métodos: Camundongos BALB/c fêmeas receberam instilação intranasal (i.n.) única

de 15 µL de água destilada (C, n=9) ou 15 µg de partículas totais suspensas (PTS)

da cidade de São Paulo, origem urbana (SP, n=9) ou de queima de cana-de-açúcar

(Bio, n=11), em 15 µL de água destilada. Vinte e quatro horas após a instilação, a

mecânica pulmonar (elastância estática, componente elástico da viscoelasticidade e

as variações de pressão resistiva, viscoelástica e total) foi determinada pelo método

de oclusão ao final da inspiração. Os pulmões foram fixados para análise histológica

(HE), sendo determinada fração de área de colapso alveolar, bem como celularidade

total e diferencial. As concentrações de metais e hidrocarbonetos policíclicos

aromáticos (HPA) foram determinadas no material particulado de ambas as origens.

Resultados: Todos os parâmetros da mecânica pulmonar aumentaram de forma

semelhante nos dois grupos poluição quando comparados com o controle, exceto a

pressão resistiva das vias aéreas, que aumentou significativamente apenas em Bio.

Ambos os grupos de poluição apresentaram significativo aumento da fração de área

de colapso e influxo de células polimorfonucleares no parênquima pulmonar em

relação ao C. A análise da composição das partículas mostrou maiores

concentrações de HPA nas partículas originadas de tráfego e maiores níveis de

metais nas de queima de biomassa.

Conclusão: Nosso estudo demonstrou que uma única e baixa dose de partículas

ambientais, produzidas por tráfego ou por queima de biomassa, induziu significativa

alteração na mecânica e histologia pulmonares em camundongos. As alterações do

parênquima foram semelhantes nos dois grupos poluição, enquanto que a mecânica

das vias aéreas foi mais afetada por partículas de biomassa. Nossos resultados

indicam que as partículas de queima de biomassa são, no mínimo, tão tóxicas

quanto as de origem urbana.

Palavras-chave: Queima de Cana-de-açúcar, Material Particulado, Poluição Aérea,

Mecânica Pulmonar.

Rio de Janeiro

Março, 2008

ABSTRACT

COMPARATIVE RESPIRATORY TOXICITY OF PARTICLES PRODUCED BY

TRAFFIC AND SUGAR CANE BURNING

Introduction: Biomass burning is an important and increasing source of particulate

matter, a major component of air pollution. We explored the toxicity of particles

produced by sugar cane burning and compared these effects with equivalent mass of

traffic-derived particles.

Methods: Female BALB/c mice received a single intranasal instillation (i.n.) of either

15 µL distilled water (C, n=9) or total suspended particles (TSP) from the city of São

Paulo, an urban area (SP, n=9) or biomass burning-derived TSP (Bio, n=11) at 15 µg

in 15 µL distilled water. Lung mechanical parameters (static elastance, elastic

component of viscoelasticity, and total, resistive and viscoelastic pressures) and

histology (HE) were analyzed 24 hours after instillation. Fraction area of alveolar

collapse and cellularity were determined in lung parenchyma. Metal concentration

and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) metabolites of the two TSP sources

were determined.

Results: All mechanical parameters increased similarly in both pollution groups

compared with control, except airway resistive pressure, which increased only in Bio.

Both TSP groups showed significantly higher fraction area of alveolar collapse, and

influx of polymorphonuclear cells in lung parenchyma than C. TSP composition

analysis showed higher concentrations of PAH in traffic derived TSP and higher trace

metals in biomass TSP.

Conclusion: We demonstrated that a single low dose of ambient particles, produced

by traffic and biomass burning, induces significant alterations in lung mechanics and

histology in mice. Parenchymal changes were similar after both particle sources

exposure, whereas airway mechanics was more affected by biomass-derived

particles. Our results indicate that biomass particles were at least as toxic as those

produced by traffic.

Key-words: Sugar cane burning; Particulate matter; Air pollution; Lung mechanics.

Rio de Janeiro

March, 2008

ÍNDICE

FICHA CATALOGRÁFICA ............................................................................................. iii

AGÊNCIAS FINANCIADORAS ...................................................................................... iv

AGRADECIMENTOS ..................................................................................................... vi

RESUMO ....................................................................................................................... ix

ABSTRACT ..................................................................................................................... x

ÍNDICE ........................................................................................................................... xi

ÍNDICE DE FIGURAS ..................................................................................................... xiv

ÍNDICE DE TABELAS .................................................................................................... xvi

ABREVIATURAS ............................................................................................................ xvii

1 INTRODUÇÃO .........................................................................................................

1.1 POLUIÇÃO ATMOSFÉRICA ............................................................................. 02

1.1.1 Aspectos gerais ...................................................................................... 02

1.1.2 Material particulado ................................................................................ 09

1.1.3 Toxicidade do material particulado ...................................................... 15

1.1.4 Queima de biomassa .............................................................................. 19

1.2 MECÂNICA RESPIRATÓRIA ............................................................................ 23

1.2.1 Noções básicas ...................................................................................... 23

1.2.2 Estudo da mecânica respiratória .......................................................... 27

2 JUSTIFICATIVA ......................................................................................................

3 OBJETIVOS ............................................................................................................ 38

3.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................ 39

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................. 39

4 MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................

4.1 ANIMAIS UTILIZADOS ........................................................................................ 41

4.2 CARACTERIZAÇÃO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS ................................... 41

4.3 AMOSTRA DAS PARTÍCULAS ......................................................................... 43

4.4 MECÂNICA RESPIRATÓRIA ................................................................................ 44

4.4.1 Método de oclusão ao final da inspiração ............................................... 48

4.5 ESTUDO HISTOLÓGICO E MORFOMÉTRICO .................................................. 51

4.5.1 Fixação e preparo das lâminas para microscopia óptica .................... 51

4.5.2 Análise histológica e morfométrica ........................................................ 52

4.6 ANÁLISE DAS PARTÍCULAS .............................................................................. 53

4.6.1 Análise de metais ................................................................................. 53

4.6.1.1 Filtração ........................................................................................... 54

4.6.1.2 Extração total ................................................................................... 54

4.6.2 Análise de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos .......................... 55

4.6.2.1 Extração ............................................................................................ 56

4.6.2.2 Purificação ........................................................................................ 56

4.6.2.3 Fracionamento .................................................................................. 57

4.6.2.4 Condições cromatográficas .............................................................. 58

4.6.2.5 Quantificação ....................................................................................

4.6.3 Análise da distribuição de freqüência do diâmetro das partículas .......

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ...................................................................................... 59

5 RESULTADOS ...........................................................................................................

5.1 MECÂNICA RESPIRATÓRIA ............................................................................

5.2 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E MORFOMÉTRICA ........................................

5.2.1 Análise qualitativa .................................................................................... 65

5.2.2 Análise quantitativa ................................................................................... 67

5.3 ANÁLISE DAS PARTÍCULAS ............................................................................. 71

5.3.1 Freqüência de distribuição do diâmetro das partículas ...................... 74

6 DISCUSSÃO ...........................................................................................................

7 CONCLUSÕES .......................................................................................................

8 PERSPECTIVAS FUTURAS ...................................................................................

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..........................................................................

ANEXOS .................................................................................................................... 111

Anexo I Parâmetros da mecânica pulmonar em cada animal .................................... 112

Anexo II Percentual de áreas normais e colapsadas em cada animal ....................... 114

Anexo III Celularidade total e diferencial em cada animal ......................................... 115

Anexo IV Concentração de metais nas partículas ..................................................... 116

Anexo V Concentração de HPA nas partículas ......................................................... 117

Anexo VI Manuscrito da Environmental Research (Status: em revisão) ...................

117

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Classificação do material particulado de acordo com diâmetro

aerodinâmico ......................................................................................................

Figura 2. Relação entre tamanho e massa das partículas ............................

Figura 3. Deposição de partículas durante respiração nasal ...........................

Figura 4. Deposição de partículas durante respiração oral ...........................

Figura 5. Modelo linear unicompartimental ......................................................

Figura 6. Modelo do método de oclusão ao final da inspiração .......................

Figura 7. Modelo de molas e amortecedores para interpretação da mecânica

do sistema respiratório .....................................................................................

Figura 8. Montagem experimental da mecânica in vivo ...................................

Figura 9. Método de oclusão ao final da inspiração ..........................................

Figura 10. Retículo para quantificação dos parâmetros morfométricos ............

Figura 11. Esquema da metodologia utilizada na análise dos HPA ....................

Figura 12. Variações de pressão necessárias para vencer os componentes

resistivo, viscoelásticos/inomogêneos pulmonares e pressão total exercida

contra os componentes viscosos e viscoelásticos do pulmão............................

Figura 13. Elastância estática e componente elástico da viscoelasticidade do

pulmão

......................................................................................................................

Figura 14. Fotomicrografias do parênquima pulmonar .....................................

Figura 15. Fração de área de alvéolos normais e colapsados no parênquima

pulmonar ..........................................................................................................

Figura 16 Percentual de células polimorfonucleares e mononucleares e

celularidade total ..............................................................................................

Figura 17. Correlação entre parâmetros funcionais e histológicos ..................

Figura 18. Distribuição de metais contidos nas partículas ...............................

Figura 19. Distribuição de HPA contidos nas partículas ..................................

Figura 20. Freqüência de distribuição do diâmetro das partículas ..................

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Padrões de qualidade do ar para os principais poluentes ...................

Tabela 2. Padrões nacional e internacional de qualidade do ar .........................

Tabela 3. Característica física das partículas e sua concentração em massa ....

Tabela 4. Fluxo e volume dos animais utilizados nos grupos experimentais .........

ABREVIATURAS

∆E – componente elástico da viscoelasticidade

∆P – variação de pressão

∆P1 – variação de pressão relativa ao componente viscoso pulmonar

∆P2 – variação de pressão relativa ao componente viscoelástico e/ou inomogêneo

pulmonar

∆Ptot – variação de pressão total pulmonar

∆V – variação de volume gasoso mobilizado

ANTR – antraceno

B[a]A – benzo[a]antraceno

B[a]P – benzo[a]pireno

B[b]F – benzo[b]fluoranteno

B[k]F – benzo[k]fluoranteno

BALF – fluido do lavado broncoalveolar

CETESB – Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental

CRF – capacidade residual funcional

Crs – complacência do sistema respiratório

CVF – capacidade vital forçada

DPOC – doença pulmonar obstrutiva crônica

E – elastância

Edyn – elastância dinâmica do pulmão

EPA – Environmental Protection Agency

Est – elastância estática do pulmão

Est,L – componente elástico do pulmão

Est,w – componente elástico da parede torácica

FEF

25-75%

- fluxo expiratório forçado entre 25 e 75% da CVF

FLUO – fluoranteno

HE – hematoxilina e eosina

HPA – hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

i.n. – intranasal

i.p. – intraperitoneal

IARC – International Agency for Research on Cancer

MN – células mononucleares

NAAQS – National Ambient Air Quality Standards

NAF – naftaleno

P – pressão

PEEP – pressão positiva ao final da expiração

PEF – pico de fluxo expiratório

Pel – pressão de retração elástica do pulmão

Pi – pressão pulmonar no ponto de inflexão

PIR – pireno

PL – pressão transpulmonar

PM – material particulado

– material particulado de diâmetro aerodinâmico entre 2,5-10 µm

2,5

– material particulado de diâmetro aerodinâmico entre 0,1-2,5 µm

Pmáx – pressão máxima ou de pico inspiratório

PMN – células polimorfonucleares

ppm – partículas por milhão

Pres – pressão resistiva

Ptr – pressão traqueal

PTS – partículas totais suspensas

R – resistência do sistema respiratório

Raw – resistência de vias aéreas

Req – resistência do equipamento

Rinit,L – resistência intrínseca do pulmão

Rinit,w – resistência intrínseca da parede torácica

Rinit,rs – resistência intrínseca do sistema respiratório

ROS – espécies reativas de oxigênio

rpm – rotações por minuto

Rtis – resistência tecidual

Rtot – resistência pulmonar total

Rrs – resistência do sistema respiratório

– tempo inspiratório

V’ – fluxo aéreo

VEF

– volume expiratório forçado no primeiro segundo

– volume corrente

WHO – World Health Organization

INTRODUÇÃO

1 INTRODUÇÃO

1.1 POLUIÇÃO ATMOSFÉRICA

1.1.2 Aspectos gerais

Estudos epidemiológicos e experimentais demonstram associação entre

poluição do ar atmosférico e aumento da morbi-mortalidade por doenças

respiratórias (SCHWARTZ & DOCKERY, 1992; BRAGA et al., 2000; SCHWARTZ et

al., 2001), com piora da função pulmonar e aumento do número de internações

hospitalares por sintomas respiratórios (LIN et al., 1999; FUSCO et al., 2001), bem

como exacerbação de doenças pulmonares como asma (ETZEL et al., 2003; KO et

al., 2007b), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) (MAYER & NEWMAN,

2001; KO et al., 2007a), infecção pulmonar (LIN, M et al., 2005; MEDINA-RAMÓN et

al., 2006) e câncer de pulmão (POPE III et al., 2002; LADEN et al., 2007).

O primeiro episódio de poluição atmosférica diretamente relacionado a danos

à saúde humana ocorreu em Londres, Inglaterra, em 1952. Nesse período, uma

inversão de temperatura levou a significativo acúmulo de poluentes atmosféricos

emitidos pela queima de combustíveis fósseis. Esse fenômeno foi associado a um

abrupto aumento na taxa de mortalidade, resultando em aproximadamente 4000

óbitos além do esperado para o período (LOGAN, 1953). Cerca de 50% do aumento

na mortalidade foi principalmente atribuído a casos de bronquite e pneumonia.

Depois do estudo de Logan (1953), outros episódios de pico de poluição do ar

também foram correlacionados com efeitos adversos à saúde. Em 1930, no Vale de

Meuse, parte da Bélgica permaneceu coberta por fumaça durante cerca de cinco

dias. A partir do terceiro dia, milhares de pessoas evoluíram com sintomas

respiratórios, como tosse, dispnéia e edema pulmonar. Os mais afetados foram

idosos, asmáticos e cardiopatas, sendo registrados mais de 60 óbitos (NEMERY et

al., 2001). Outro episódio de inversão térmica ocorreu em 1948 em Donora, pequena

cidade industrializada da Pensilvânia, quando uma fumaça, carregada de

particulados e outros compostos industriais, alterou a visibilidade local e afetou a

saúde da população. Cerca de 6000 dos 14000 habitantes evoluíram com sintomas

respiratórios, 400 necessitaram de hospitalização e 20 óbitos foram registrados

(HELFAND et al., 2001).

A fumaça de Londres, cujo nível de material particulado (PM) e dióxido de

enxofre (SO

) excederam 1000 µg/m

(STERN et al., 1984), se tornou um marco

histórico no que diz respeito à associação de doenças respiratórias e poluição

atmosférica, estimulando pesquisas para melhor entender os efeitos da poluição

sobre a saúde humana, bem como para o estabelecimento de medidas e índices de

controle de qualidade do ar. Em 1956 foi aprovado o The Air Pollution Control Act of

London, com o objetivo de reduzir a liberação de poluentes e melhorar a qualidade

do ar em Londres (LIOY & ZHANG, 1999). Outros países e cidades fizeram o

mesmo. Em 1970, a Environmental Protection Agency (EPA) e o Clean Air Act

Amendments of the United States introduziram o National Ambient Air Quality

Standards (NAAQS), estabelecendo padrões de qualidade do ar para os principais

poluentes (Clean Air Act, 1971) (Tabela 1).

Tabela 1: Padrões de qualidade do ar para os principais poluentes.

Poluente Tempo de Exposição Padrão EPA Primário

(µg/m

)

Ozônio 8 horas 157 (0,08 ppm)

Monóxido de Carbono 1 hora

8 horas

40.000 (35 ppm)

10.000 (9 ppm)

Dióxido de Nitrogênio Anual 100 (0,05 ppm)

Dióxido de Enxofre 24 horas

Anual

365 (0,14 ppm)

80 (0,03 ppm)

Chumbo Trimestral

1,5

Partículas Inaláveis

(PM

)

24 horas

Anual

150

Partículas Finas ou

Respiráveis (PM

2,5

)

24 horas

Anual

Partículas totais

suspensas (PTS)

24 horas

Anual

260

EPA: Environmental Protection Agency; ppm: partícula por milhão.

Fonte: Clean Air Act (CAA), 1971.

Estratégias para atingir os padrões determinados levaram a significativo

aumento de métodos e técnicas para controle de poluição e medidas visando à

redução de emissão de poluentes no ar, com conseqüente diminuição dos

problemas relacionados à poluição. No entanto, o sucesso obtido no controle de

poluentes emitidos por fontes de combustão e outras com conhecido padrão de

acumulação, como o CO, não foi acompanhado por redução de emissão de ozônio e

material particulado fino (NATIONAL AIR QUALITY AND EMISSIONS TRENDS

REPORT, 1993). Adicionalmente, o aparecimento de novos componentes, a

poluição fotoquímica, produção de óxido de nitrogênio por crescente número de

veículos motorizados, bem como alteração de composição e distribuição de

partículas aéreas contribuíram para que a poluição do ar re-emergisse como tema

central para a saúde pública (BRUNEKREEF & HOLGATE, 2002).

Estudos mostraram que, mesmo em valores abaixo dos níveis até então

estabelecidos pelos órgãos responsáveis, a poluição continuava afetando de forma

significativa a vida dos seres vivos, sendo estes saudáveis ou portadores de

doenças respiratórias prévias (POPE III et al., 1995; LIN et al., 1999; POPE III, 2000;

BRUNEKREEF & HOLGATE, 2002). Pope III (2000) descreveu aumento de

mortalidade em situações de ausência de episódios agudos de poluição, com níveis

de material particulado abaixo de 150 µg/m³, em diversas partes do mundo. A partir

dessas observações, novos padrões foram instituídos pelos órgãos responsáveis,

incluindo EPA (US EPA, 2004) e World Health Organization (WHO AIR QUALITY

GUIDELINES, 2005), estabelecendo novos e inferiores limites de qualidade do ar na

tentativa de minimizar estes efeitos. No Brasil, a Companhia de Tecnologia de

Saneamento Ambiental (CETESB, 1997), agência de controle de meio ambiente,

estabeleceu padrões nacionais de qualidade do ar (Tabela 2).

Tabela 2: Padrões nacional e internacional de qualidade do ar.

Poluente Tempo de

Exposição

Padrão CETESB

(µg/m

)

Padrão EPA

(µg/m

)

Padrão WHO

(µg/m

)

Partículas Totais

em Suspensão

24 horas

MGA

150

Partículas

Inaláveis (PM

)

24 horas

MAA

150

Partículas Finas

(PM

2,5

)

24 horas

MAA

Fumaça 24 horas

MGA

100

Dióxido de

Enxofre

3 horas

24 horas

MGA

100

365 (0,14 ppm)

80 (0,03 ppm)

Dióxido de

Nitrogênio

1 hora

MGA

190

100

100 (0,05 ppm)

200

Monóxido de

Carbono

1 hora

8 horas

40.000 (35 ppm)

10.000 (9 ppm)

40.000 (35 ppm)

10.000 (9 ppm)

Ozônio 1 hora

8 horas

160

157 (0,08 ppm)

100

CETESB: Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental; EPA: Environmental

Protection Agency; MAA: Média aritmética anual; MGA: Média geométrica anual; ppm:

partículas por milhão; WHO: World Health Organization.

Fonte: CETESB, 1997; US EPA, 2004; WHO Air Quality Guidelines, 2005.

A industrialização urbana contribuiu muito para a piora da qualidade do ar

desde o seu surgimento. Em relação ao Brasil, São Paulo, centro mais

industrializado da América Latina, apresenta cerca de 3.000.000 de automóveis. A

CETESB calcula que os veículos automotivos sejam as principais fontes de poluição

atmosférica na cidade (CETESB, 1989), associados à presença de poucas áreas

verdes e existência de uma barreira de edifícios altos. Estes poluentes, resultantes

de combustão e utilizados para gerar energia e transporte, são divididos em quatro

categorias (KAMPA & CASTANAS, 2007): metais pesados; gases poluentes (como

, NO

, CO, ozônio e compostos orgânicos voláteis, incluindo os benzenos);

poluentes orgânicos persistentes (como dioxinas); e materiais particulados, que

parecem ser os principais responsáveis pelos efeitos adversos à saúde (NATIONAL

AIR QUALITY AND EMISSIONS TRENDS REPORT, 1993; BRUNEKREEF &

HOLGATE, 2002).

Em diferentes partes do mundo, estudos epidemiológicos conduzidos em

áreas com predomínio de poluição de origem industrial e automotiva demonstram

associação entre poluição e mortalidade em um período de 24 h por todas as causas

e por causas cardiopulmonares (SCHWARTZ & MARCUS, 1990; SCHWARTZ &

DOCKERY, 1992; SALDIVA et al., 1995; KELSALL et al., 1997; POPE III, 2000;

DOMINICI et al., 2007). Essa associação, inicialmente observada no início dos anos

90, recebeu críticas quanto à presença de fatores de interferência, como estação do

ano, temperatura e umidade relativa. No entanto, novos estudos controlados para

efeitos temporais, clima e poluentes associados, bem como por métodos estatísticos

mais refinados e análises combinadas de diferentes cidades (multicity studies)

confirmaram os achados iniciais (BRAGA et al., 2000; POPE III, 2000).

A relação entre poluição e mortalidade em um período de 24 h, quando

analisada separadamente para concentração total de partículas suspensas (PTS),

dióxido de enxofre (SO

), dióxido de nitrogênio (NO

) e monóxido de carbono (CO),

mostrou-se principalmente associada aos níveis de material particulado, sugerindo

ser este o principal preditor de risco (SCHWARTZ & MARCUS, 1990; SALDIVA et

al., 1995; SCHWARTZ et al., 1996; KELSALL et al., 1997; SCHWARTZ et al., 2001).

Diferentes autores demonstraram, ainda, que o material particulado representa fator

de risco para mortalidade cardiopulmonar mesmo em concentrações relativamente

baixas, abaixo dos limites de padrão de qualidade do ar determinados pelas

agências reguladoras (POPE III, 2000; SCHWARTZ et al., 2001). Esses achados

motivaram o interesse na forma da relação resposta-exposição, gerando inúmeros

estudos com diferentes estratégias de modelagem estatística, conduzidos tanto em

uma única cidade como em múltiplas cidades (POPE III, 2000). Os resultados

convergem para uma relação resposta-exposição quase linear, sem evidência de um

limiar para observação do efeito causado pelo material particulado sobre a

mortalidade em um período de 24 h (DANIELS et al., 2000; SCHWARTZ &

ZANOBETTI, 2000; SCHWARTZ et al., 2001, 2002).

O material particulado (PM) representa também importante fator contribuinte

para doenças respiratórias. Os efeitos observados incluem aumento de sintomas

respiratórios (PETERS et al., 1997; LIN et al., 1999); diminuição da função pulmonar

(KAN et al., 2007); aumento do número de admissões em unidades de emergência e

internações hospitalares por doenças respiratórias (FUSCO et al., 2001; FARHAT et

al., 2005), como pneumonia (MEDINA-RAMÓN et al., 2006), asma (LEE et al., 2006;

KO et al., 2007b) e DPOC (SCHIKOWSKI et al., 2005; KO et al., 2007a); aumento da

morbidade respiratória caracterizada por absenteísmo do trabalho ou escola ou

outras restrições de atividade, e aumento de mortalidade de origem cardiopulmonar

(POPE III et al., 1995). Esses efeitos adversos têm sido observados com níveis de

particulados presentes em várias cidades, incluindo algumas com níveis abaixo dos

padrões estabelecidos pelas agências de controle da qualidade do ar (POPE III et

al., 1995; MARTINS et al., 2002; DOMINICI et al., 2007).

O aumento na concentração de partículas no ar ambiente tem sido

relacionado à redução de capacidade vital forçada (CVF), volume expiratório forçado

no primeiro segundo (VEF

) e pico de fluxo expiratório (PEF) (PETERS et al., 1997;

KAN et al., 2007; MCCREANOR et al., 2007), sendo descrito queda de 3,4% na CVF

e 1,6% de VEF

para um aumento de 10 µg/m

de PM (ACKERMANN-LIEBRICH et

al., 1997). Enquanto que Frye et al. reportaram aumento de 4,7% na CVF em

associação a uma redução de 50 µg/m

nos níveis de PM (FRYE et al., 2003).

Crianças e idosos constituem população particularmente sensível aos efeitos

respiratórios associados à poluição (PEEL et al., 2005, 2007; LEE et al., 2006;

BATESON & SCHWARTZ, 2008; OFTEDAL et al., 2008). Evidências também

sugerem maior susceptibilidade de indivíduos com doenças prévias, como

hipertensão, DPOC e asma (SHEPPARD et al., 1999; ZANOBETTI et al., 2000;

ETZEL et al., 2003; MCCREANOR et al., 2007; PEEL et al., 2007).

1.1.2 Material particulado

Desde 1970, quando o material particulado (PM) foi apontado como um dos

principais poluentes a ser controlado pelo Clean Air Act, a concentração de PM nos

EUA tem sido monitorada (OSTRO & CHESTNUT, 1998). O PM é uma mistura de

partículas líquidas e gasosas de diferentes origens e tamanhos em suspensão no ar,

sendo o principal componente urbano da poluição aérea. As partículas são

classificadas de acordo com seu diâmetro aerodinâmico em grossas, finas e

ultrafinas. As partículas grossas são aquelas com diâmetro aerodinâmico entre 2,5 e

10 µm (PM

), as finas apresentam diâmetro entre 0,1 e 2,5 µm (PM

2,5

) e as

ultrafinas ≤ 0,1 µm (DONALDSON et al., 2001; TAO et al., 2003). Um quarto grupo,

denominado nanopartículas, é constituído por partículas com diâmetro aerodinâmico

de 0,010 µm a 0,056 µm (SHI et al., 2001; KITTELSON et al., 2004; LIN, C et al.,

2005; DUFFIN et al., 2007) (Figura 1). O termo partículas totais suspensas (PTS) se

refere a todas as partículas coletadas numa amostra de ar, sendo compostas tanto

por partículas grossas, finas e ultrafinas, como por nanopartículas e seus

componentes.

Figura 1. Classificação do material particulado de acordo com seu diâmetro aerodinâmico

(DONALDSON et al., 2001).

Em geral, as partículas de maior diâmetro aerodinâmico, também

denominadas partículas inaláveis, são geradas por processos mecânicos. Essas

partículas se depositam predominantemente na nasofaringe e orofaringe, podendo

penetrar nos pulmões, onde são, então, removidas pelo clearance mucociliar e

deglutidas, ou ainda, eliminadas por processos mecânicos como tosse e espirro. Em

Ultrafina

Fina

Grossa

0,01

0,1 1 2,5 10 µm

10 100 1000 2500 10000 nm

contrapartida, as partículas finas e ultrafinas, conhecidas como partículas

respiráveis, são geradas por combustão, condensação ou reações químicas, sendo

encontradas na fumaça de queima de madeiras, de carvão e de petróleo,

provenientes da exaustão de motores. Diferentemente das partículas grossas, as

partículas respiráveis apresentam tempo mais longo de suspensão na atmosfera

(dias e semanas) e dispersão mais uniforme em zonas urbanas, depositando-se nas

vias aéreas extratorácicas ou, dependendo do fluxo de ar e da difusão, penetrando

nas pequenas vias aéreas e alvéolos, onde persistem por semanas ou meses

(DUSSELDORP et al., 1995; PETERS et al., 1997; BROWN et al., 2002; TAO et al.,

2003). As partículas finas e ultrafinas podem ser eliminadas pelo sistema muco-ciliar,

funcionante desde a traquéia proximal até os bronquíolos terminais ou, então, ser

fagocitadas por macrófagos, quando depositadas nas regiões alveolares

(DONALDSON & STONE, 2003). Acredita-se que apenas as partículas ultrafinas

alcancem o parênquima pulmonar em número suficiente para causar danos ao

sistema respiratório (DONALDSON et al., 2001).

A maior capacidade de deposição alveolar das partículas ultrafinas é atribuída,

em parte, à sua maior concentração. A concentração das partículas se refere ao

número ou massa de partículas por unidade de volume (µg/m

). Para uma

determinada massa, as partículas ultrafinas possuem uma área de superfície de 10

a 10

vezes maior do que as partículas finas e, aproximadamente, 10

vezes maior

do que as grossas (HARRISON & YIN, 2000; DONALDSON & STONE, 2003)

(Tabela 3). Essa razão, massa por área de superfície, pode influenciar a toxicidade

das partículas no sistema respiratório, uma vez que uma grande área de superfície

por massa permitiria maior transporte de metais catalíticos e outros componentes

adsorvidos à sua superfície (HITCHINS et al., 2000; SHI et al., 2001), aumentando,

assim, a toxicidade pulmonar do PM.

Tabela 3: Características físicas de nuvem de partículas com concentração no ar de 10

µg/m

de massa, sendo composta por partículas de vários diâmetros. O número de

partículas por unidade de volume no ar aumenta consideravelmente com a área de

superfície por unidade de volume de ar, associado à redução do tamanho da partícula.

Concentração em

massa no ar (µg/m

)

Diâmetro da

partícula (µm)

Partículas /

mL de ar

Área de superfície da

partícula (µ

/mL de ar)

2 1,2

0,5 153 120

0,02 2400000 3016

Fonte: DONALDSON et al., 2001.

A figura abaixo ilustra a relação entre número de partículas, área de superfície

e grau de deposição em regiões de troca gasosa (KITTELSON et al., 2004) (Figura

2). Podemos observar que partículas finas e ultrafinas contribuem de forma

significativa, em número e em área de superfície, quando comparadas às partículas

grossas.

Figura 2. Relação entre tamanho e massa das partículas e suas respectivas deposições no

sistema respiratório (KITTELSON et al., 2004).

Além da influência exercida pelo diâmetro aerodinâmico na deposição

alveolar, a penetração das partículas também será alterada pelo padrão respiratório

utilizado, resultando em diferentes mecanismos de deposição como: (a) impactação,

predominante para partículas de maior diâmetro aerodinâmico na nasofaringe; (b)

sedimentação, deposição de partículas intermediárias em bronquíolos terminais e

respiratórios, como resultado da ação da gravidade ou (c) difusão, movimento

randômico, em zigzag, de partículas ≤ 0,1 µm de diâmetro, resultante da força

exercida por moléculas de gás até as pequenas vias aéreas e alvéolos. A

penetração de partículas nos pulmões, e a quantidade de deposição por

sedimentação e difusão, podem ser aumentadas durante respirações lentas e

profundas. O exercício provoca aumento de freqüência respiratória que, por sua vez,

aumenta a deposição por impactação (RAABE, 1999). Estudos relatam deposição de

0%, 15% e 25% de PM

, PM

2,5

e partículas ultrafinas, respectivamente, durante

respiração nasal, demonstrando a eficiência da filtração nasofaringea (Figura 3). Por

outro lado, em respirações orais ocorre grande deposição de partículas na região de

troca gasosa, inclusive aquelas ≥ 10 µm, como mostra a figura 4 (CHENG et al.,

1989, 1990).

Figura 3. Deposição de partículas durante uma respiração nasal com FR = 15 ciclos por

minuto e V

= 750 mL (CHENG et al., 1989; RAABE, 1999).

Figura 4. Deposição de partículas durante uma respiração oral com FR = 15 ciclos por

minuto e V

= 750 mL (CHENG et al., 1990; RAABE, 1999).

1.1.3 Toxicidade do material particulado

Além dos efeitos das partículas relacionados ao seu diâmetro aerodinâmico e

sua conseqüente capacidade de deposição alveolar, a composição específica do PM

também pode estar relacionada à sua toxicidade. Todo material particulado contém

material biológico, compostos orgânicos, hidrocarbonetos, íons, aerossóis ácidos,

gases reativos e metais adsorvidos ou ligados a um centro carbonáceo. O PM

constituído primariamente por material biológico, material da crosta e sal, enquanto

que o PM

2,5

consiste primariamente de metais, hidrocarbonetos e partículas

secundárias formadas por reações químicas com poluentes gasosos. A composição

específica do PM em determinado local depende da localização geográfica, clima,

estação do ano e fontes de poluição (TAO et al., 2003).

Morbidade e mortalidade têm sido associadas com todas as frações de PM

(POPE III et al., 2002; LADEN et al., 2000, 2006), embora associações específicas

apresentem resultados controversos. Estudos examinando tanto PM

quanto PM

2,5

demonstraram maior associação de morbi-mortalidade com níveis de PM

2,5

do que

(SCHWARTZ et al., 1996; CIFUENTES et al., 2000), outros identificaram

associação apenas com PM

2,5

mas não com PM

(ANDERSON et al., 2001; POPE

III et al., 2002), enquanto que alguns autores não demonstraram associação

individual com PM

ou PM

2,5

(LIPFERT et al., 2000). Acréscimos de 1,5% e 0,4% na

mortalidade são descritos para um aumento de 10 µg/m

na concentração de PM

2,5

(SCHWARTZ et al., 1996; LADEN et al., 2000, 2006) e de PM

(LADEN et al.,

2000), respectivamente. De forma semelhante, diminuição de 0,73% no risco de

mortalidade pode ser observada para cada 10 µg/m

de redução de PM

2,5

mostrando que estes efeitos são, em parte, reversíveis (LADEN et al., 2000, 2006).

Embora alguns investigadores tenham relacionado apenas PM

com mortalidade

(DOCKERY et al., 1992; OSTRO et al., 1999), a maior parte das evidências indica

que partículas finas e ultrafinas sejam as principais frações bioativas da poluição por

material particulado (PM) (TAO et al., 2003). De fato, frações finas e ultrafinas

correspondem a mais de 50% da composição do PM

(ANDERSON et al., 2001;

DONALDSON & STONE, 2003). O PM ultrafino seria potencialmente mais

patogênico, em virtude de sua grande capacidade de deposição nos alvéolos,

penetração no interstício pulmonar e grande área de superfície (PETERS et al.,

1997; CIFUENTES et al., 2000; DOMINICI et al., 2007).

Apesar de ser tema de intensa investigação, os mecanismos envolvidos na

associação entre material particulado e efeitos adversos à saúde permanecem

desconhecidos. Achados epidemiológicos de efeitos tóxicos e pró-inflamatórios

relacionados ao material particulado têm sido reproduzidos experimentalmente (NEL

et al., 2001). A inalação ou instilação de PM provoca resposta inflamatória em

modelos animais e em humanos (LI et al., 1997; KENNEDY et al., 1998; CLARKE et

al., 1999, 2000a,b; GHIO & DEVLIN, 2001; GHIO et al., 2001), caracterizada por

liberação de citocinas derivadas de macrófagos e pneumócitos, e concomitante

recrutamento de neutrófilos (FERIN et al., 1992; LI et al., 1996, 1997; KENNEDY et

al., 1998). A exposição a PM aumenta a expressão de genes relacionados à

ativação de NF-κB, incluindo TNF-α, TGF-β e IL-6 (SHUKLA et al., 2000; STONE et

al., 2000).

Radicais livres e estresse oxidativo têm sido extensamente implicados na

resposta inflamatória associada à exposição ao material particulado (DONALDSON

& STONE, 2003; DONALDSON et al., 2005; PEREIRA et al., 2007). Evidências

sugerem que (i) o material particulado apresenta propriedades oxidantes, (ii) provoca

alterações dependentes de oxidação in vitro em células críticas ao processo

inflamatório (e.g., macrófagos alveolares, células epiteliais e granulócitos

polimorfonucleares), (iii) bem como provoca efeito pró-inflamatório in vivo

dependente de oxidação. Muitos mediadores inflamatórios induzidos pela exposição

a PM são regulados por fatores de transcrição sensíveis a redox, como NF-κB, AP-1

e C/EBP, sugerindo um aumento da produção de espécies reativas de oxigênio

(ROS) após exposição a PM (JIMENEZ et al., 2000; LI et al., 2002; GONZALEZ-

FLECHA, 2004; DONALDSON et al., 2003; OHYAMA et al., 2007). A capacidade de

gerar ROS estaria relacionada à maior área de superfície da partícula,

independentemente de sua composição (BROWN et al., 2000). No entanto,

evidências sugerem que metais e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA),

principais constituintes do PM, possam atuar sinergicamente, produzindo ROS

(PARK et al., 2006; KAMPA & CASTANAS, 2007; OHYAMA et al., 2007).

Dentre os metais, os mais encontrados nos particulados são Cr, Co, Ni, Mn,

Zn, Cu, e, principalmente, Fe (GURGUEIRA et al., 2002). Este último se encontra

presente em maiores concentrações nas partículas de queima de combustíveis

fósseis, se comparado aos demais metais (PARK et al., 2006). Muitos trabalhos

epidemiológicos mostram influência da exposição ocupacional a metais sobre os

parâmetros espirométricos, com diminuição de VEF

, CVF ou PEF associados à

inalação crônica de Pb (BAGCI et al., 2004; HONG et al., 2007), Mn (BOOJAR &

GOODARZI, 2002; HONG et al., 2007), Zn (LAGORIO et al., 2006) e Fe

(DUSSELDORP et al., 1995; SEATON et al., 1995; ROEMER et al., 2000).

Adicionalmente, a instilação intratraqueal de ferro, associado a partículas ultrafinas,

potencializa o recrutamento de células no lavado broncoalveolar, efeito não

observado após instilação isolada de Fe (WILSON et al., 2002). Alguns metais

também são conhecidos por induzir efeitos pró-oxidativos e pró-inflamatórios (PARK

et al., 2006). Gurgueira et al. (2002) observaram presença de estresse oxidativo em

estudo in vivo após inalação de partículas ultrafinas contendo metais como Mn, Fe,

Cu e Zn. A presença de Fe nas partículas parece exercer maior importância na

formação de ROS do que os demais metais (PARK et al., 2006; GHIO & COHEN,

2005).

Em relação aos compostos orgânicos, 16 HPA são considerados

particularmente importantes no monitoramento ambiental de poluentes orgânicos

prioritários: acenafteno, acenaftileno, antraceno, benzo[a]antraceno, benzo[a]pireno,

benzo[b]fluoranteno, benzo[ghi]perileno, benzo[k]fluoranteno, criseno,

dibenzo[a,h]antraceno, fenantreno, fluoranteno, fluoreno, indeno[1,2,3-c,d]pireno,

naftaleno e pireno (US EPA, 1987). Atenção especial tem sido dada aos HPA

portadores de atividade carcinogênica, incluindo benzo[a]antraceno,

benzo[b]fluoranteno, benzo[j]fluoranteno, benzo[k]fluoranteno, benzo[a]pireno,

dibenzo[k]antraceno e indeno[1,2,3-c,d]pireno (CASTAÑO-VINYALS et al., 2004).

Dentre esses, o benzo[a]pireno apresenta atividade carcinogênica 10-100 vezes

maior do que os demais HPA (SORENSEN et al., 2003).

A formação de HPA tem sua origem na combustão incompleta da matéria

orgânica, sendo influenciado principalmente por fatores como temperatura e

pressão. Deste modo, incêndios florestais e de campos, assim como a queima de

combustíveis fósseis, representam importantes fontes de HPA para o meio

ambiente. Porém, as maiores emissões de HPA provêm de processos industriais

ligados à produção de aço e alumínio, exaustão de incineradores, resíduos sólidos

industriais, e atividades petroquímicas (SISINNO et al., 2003). As concentrações de

HPA podem variar de dezenas de ng/m

, em áreas não poluídas ou pouco poluídas,

a centenas de ng/m

em regiões de maior poluição (KURE et al., 1997; CASTAÑO-

VINYALS et al., 2004). Compostos orgânicos, incluindo os benzenos, têm sido

associados à formação de ROS e peroxidação lipídica (SORENSEN et al., 2003),

induzindo estresse oxidativo em macrófagos alveolares (HIURA et al., 1999) e

células epiteliais, com conseqüente produção de IL-8 e indução de apoptose (LI et

al., 2002). Adicionalmente, os HPA se distribuem pelos tecidos, onde são

biotransformados em intermediários quimicamente ativos. Esses intermediários

podem se ligar ao DNA por ligação covalente (adutos de DNA), gerando mutação ou

iniciando processo tumoral. A formação de adutos de DNA é considerada essencial

para o potencial carcinogênico desses compostos (SORENSEN et al., 2003;

CASTAÑO-VINYALS et al., 2004).

1.1.4 Queima de biomassa

O planeta convive com outra fonte crescente de poluição, além da gerada por

queima de combustíveis fósseis, que atinge preferencialmente os países em

desenvolvimento: a queima de biomassa. A queima de biomassa se refere à queima

de qualquer matéria de origem vegetal ou animal (ARBEX et al., 2004), presente

tanto em ambientes internos como externos, e representa um contribuinte central

para o aumento de partículas em suspensão no ar.

A queima de biomassa em ambientes internos existe desde a pré-história,

permanecendo até os dias de hoje com a utilização de queima de carvão e madeira

no preparo de alimentos e aquecimento de residências. A exposição a essa fumaça

em ambientes fechados tem sido associada a infecções respiratórias agudas em

crianças e em portadores de DPOC, pneumoconioses, infecção respiratória aguda

das vias aéreas inferiores e efeitos adversos na gestação (JOHNSON & ADERELE,

1992; ARBEX et al., 2004). Esta prevalência é mais freqüente em países em

desenvolvimento, onde mulheres acompanhadas de seus filhos permanecem horas

do dia cozinhando em ambientes mal ventilados. Na Índia, 18 necropsias realizadas

em mulheres não fumantes expostas à queima de biomassa em ambientes internos

mostrou alta prevalência de enfisema pulmonar e bronquiectasia, e baixos índices de

bronquite crônica e tuberculose (PADMAVATI & JOSHI, 1964). Estudos mostram

redução da CVF (BEHERA et al., 1994) e da relação VEF

/CVF (REGALADO et al.,

2006) em mulheres que utilizam queima de biomassa se comparado com mulheres

que utilizam gás no preparo de alimentos. Adicionalmente, crianças expostas à

queima de biomassa no ambiente doméstico apresentam redução de CVF e VEF

semelhante àquelas expostas à fumaça de cigarro (RINNE et al., 2006).

A queima de biomassa em ambientes externos merece atenção ainda maior.

Em 1997, vários incêndios florestais ocorreram em diferentes regiões do sudoeste

asiático, levando a aumento do número de atendimentos hospitalares por asma

brônquica, bronquite crônica e infecção respiratória aguda, devido à elevada

concentração de material particulado suspenso (HELL & GOLDAMEER, 2001; KUNII

et al., 2002). No Brasil, além do desmatamento florestal e queima de campo para

cultivo, uma nova fonte de queima de biomassa em ambientes externos se iniciou

com a crise mundial de petróleo de 1970. A procura por combustíveis alternativos

levou ao desenvolvimento do uso do álcool, extraído da cana-de-açúcar. Desde

então, o cultivo da cana aumentou consideravelmente no Brasil. A monocultura da

cana-de-açúcar é hoje uma realidade em diversas regiões do nosso país. Duas

regiões do estado de São Paulo estão entre os maiores produtores de cana:

Araraquara e Piracicaba. Periodicamente, a palha da cana é queimada, espalhando

nuvens de fumaça composta de partículas de fuligem preta, “fuligem da cana” (SIH,

1997; ARBEX et al., 2004; JARDIM & NASCIMENTO, 2007). Atualmente, 70% da

cana-de-açúcar produzida no país é queimada antes da colheita manual, para a

produção de álcool (ARBEX et al., 2007). A queima dos canaviais, que ocorre nos

meses de maio a novembro, polui a atmosfera com a liberação de monóxido de

carbono, ozônio, óxidos de enxofre, óxidos de nitrogênio e toneladas de material

particulado (ARBEX et al., 2004; ZHANG & SMITH, 2007).

Com a crescente utilização do álcool como combustível em veículos

automotores, houve uma melhora na qualidade do ar nos grandes centros urbanos

(ARBEX et al., 2000). Porém, o inverso ocorreu com a qualidade do ar das regiões

produtoras de cana-de-açúcar (ARBEX et al., 2004), assim como em populações

vizinhas (SIH, 1997). Relatórios da CETESB, emitidos em 1986 e 1999, sobre a

qualidade do ar em Araraquara, mostraram um importante aumento da poeira total

em suspensão no período da safra da cana-de-açúcar, em comparação com o

período de entre-safra (ARBEX et al., 2004). Estudo prévio demonstrou ser a queima

de biomassa a principal fonte de partículas das áreas produtoras de cana durante os

períodos de queima (LARA et al., 2001). A maior fonte das partículas emitidas

durante a queima de biomassa se concentra na categoria de ultrafinas (< 0,1 µm)

(SCHWELA et al., 1999). Arbex et al. demonstraram recentemente (ARBEX et al.,

2007) que mesmo durante o período de queima, a concentração média de PTS em

Araraquara se mantém abaixo do padrão de qualidade do ar recomendado pelas

agências reguladoras. No entanto, nesses períodos o nível médio de PTS

representa o dobro do encontrado fora dos períodos de queima.

A Organização Mundial da Saúde sugere que incêndios florestais produzem

efeitos respiratórios adversos, incluindo aumento no número de admissões em

unidades de emergência e hospitalizações (SCHWELA et al., 1999). Na cidade de

Araraquara, com 192.000 habitantes, a queima de cana-de-açúcar já tem sido

associada com aumento de visitas a unidades de emergência para terapia inalatória

(ARBEX et al., 2000), aumento do número de internações hospitalares de crianças e

idosos por doenças respiratórias (CANÇADO et al., 2006), bem como, aumento de

admissão hospitalar por asma (ARBEX et al., 2007). Adicionalmente, estudo

epidemiológico no Estado de São Paulo, comparando 3000 crianças moradoras do

centro de São Paulo (expostas à poluição urbana), de Piracicaba (expostas à

poluição pela queima de cana-de-açúcar) e de Tupã e Batatais (zonas rurais livres

de poluição), verificou exacerbação de doenças respiratórias, como asma, bronquite

e pneumonia, nas zonas de poluição em comparação a Tupã e Batatais. Os

resultados dos estudos indicam que a poluição pela queima de biomassa atinge

níveis suficientemente altos para causar efeitos adversos à saúde da população

exposta, de forma semelhante à observada na zona urbana (SIH, 1997; ARBEX et

al., 2000; CANÇADO et al., 2006; ARBEX et al., 2007). Os efeitos respiratórios

adversos foram observados um dia após o aumento nas concentrações de PTS,

permanecendo praticamente inalterados até 5 dias após a exposição (ARBEX et al.,

2007). De forma semelhante ao descrito no material particulado de origem urbana

(DANIELS et al., 2000; SCHWARTZ & ZANOBETTI, 2000; SCHWARTZ et al., 2001,

2002), o risco relativo para admissões hospitalares por asma apresentam uma

relação dose-resposta com a poluição por queima de biomassa, sem a presença de

um limiar mínimo (ARBEX et al., 2007).

1.2 MECÂNICA RESPIRATÓRIA

1.2.1 Noções básicas

A respiração constitui um processo cíclico que envolve certo trabalho

mecânico por parte dos músculos respiratórios para a movimentação do sistema

respiratório. O sistema respiratório é formado por dois componentes: pulmão e

parede torácica. Como parede torácica subentende-se todas as estruturas que se

movem durante o ciclo respiratório à exceção dos pulmões. A pressão motriz,

gerada pela contração muscular durante a inspiração, precisa vencer forças de

oposição, tais como: a) forças elásticas dos tecidos pulmonares e parede torácica; b)

forças resistivas resultantes do fluxo de gás pelas vias aéreas e movimentação das

moléculas constituintes dos tecidos pulmonar e da parede torácica (D’ANGELO et

al., 1994); c) forças viscoelásticas dos tecidos pulmonares e da parede torácica; d)

forças plastoelásticas responsáveis pela histerese (HILDEBRANDT, 1970); e) forças

inerciais (dependentes da massa dos tecidos e dos gases) (MEAD, 1961); f) forças

gravitacionais (incluídas nas forças elásticas) (MILIC-EMILI, 1977); g) forças de

distorção da parede torácica. Contudo, durante a respiração basal, as forças

inerciais e de distorção da parede são consideradas desprezíveis (RODARTE &

REHDER, 1986).

A elasticidade constitui uma propriedade da matéria que permite ao corpo

retornar à sua forma original após ter sido deformado por uma força sobre ele

aplicada. Um corpo perfeitamente elástico, como uma mola, obedecerá à Lei de

Hooke, ou seja, a variação de comprimento é diretamente proporcional à força

aplicada até que seu limite elástico seja atingido. Em visão tridimensional, teríamos

volume proporcional à pressão.

O tecido pulmonar e a parede torácica possuem propriedades elásticas e

obedecem à Lei de Hooke, ampliada, de modo que quanto maior a pressão motriz,

maior o volume de gás inspirado. A inclinação da curva volume-pressão ou a relação

entre a variação de volume gasoso mobilizado (∆V) e a pressão motriz necessária

para manter o sistema respiratório insuflado é conhecida como complacência do

sistema respiratório (Crs). Logo, Crs = ∆V/Pel,rs, onde Pel,rs corresponde à pressão

de retração elástica do sistema respiratório.

Cabe ressaltar que, ao invés de complacência, é freqüentemente utilizada a

elastância. Esta corresponde ao inverso da complacência (Ers = 1/Crs), ou seja, é a

relação entre a variação de pressão e o volume mobilizado resultante. O cálculo da

elastância do sistema respiratório apresenta vantagens, já que as elastâncias do

pulmão (EL) e da parede torácica (Ew) são adicionadas diretamente: Ers = EL + Ew,

enquanto que se somam os inversos das complacências: 1/Crs = 1/CL + 1/Cw.

Dois fatores respondem pelo comportamento elástico do pulmão. Um deles

corresponde aos componentes elásticos do tecido pulmonar (fibras elásticas e

colágenas). Acredita-se que o comportamento elástico do pulmão não dependa do

simples alongamento das fibras de tecido conjuntivo, mas, principalmente, do seu

arranjo geométrico. Todas as estruturas pulmonares encontram-se interligadas pela

trama de tecido conjuntivo pulmonar, de forma que, quando há insuflação, todos

esses componentes se dilatam. Esse fenômeno é denominado “interdependência”,

que contribui para manter todos os espaços aéreos abertos.

Além das propriedades elásticas dos tecidos pulmonares, os pulmões ainda

apresentam um importante fator que contribui para as suas características elásticas:

a tensão superficial exercida pelas moléculas que recobrem a zona de troca gasosa.

A tensão superficial em uma interface ar-líquido aparece porque as moléculas do

líquido são atraídas com maior intensidade ao longo da superfície do próprio líquido

do que para a fase gasosa acima deste. A tensão superficial pode ser definida como

a força que age sobre uma linha imaginária de 1 cm de comprimento na superfície

de um líquido. Essa tensão surge, porque as forças de atuação entre as moléculas

do líquido são muito maiores do que aquelas entre líquido e gás, resultando em que

a área líquida torna-se a menor possível.

Em uma estrutura esférica como uma bolha de sabão, a tensão superficial

tem a propriedade importante de gerar pressão no interior da bolha. A relação entre

a tensão superficial na parede e a pressão desenvolvida dentro da bolha de sabão é

dada pela Lei de Laplace. Essa afirma que, para cada superfície de uma bolha, a

pressão (P) é igual ao dobro da tensão (T) dividida pelo raio (r), ou, para ambas as

superfícies, P = 4T/r. Entretanto, quando somente uma interface está envolvida,

como em um alvéolo esférico revestido por líquido na sua face interna, o numerador

tem o número 2 em lugar de 4. Considerando-se dois alvéolos de diferentes

tamanhos conectados através de uma via aérea comum, e com tensão superficial

semelhante, pode-se depreender, com base na Lei de Laplace, que a pressão no

alvéolo menor seria maior do que no alvéolo maior. Desta forma, os alvéolos

menores esvaziar-se-iam nos maiores, resultando em vários alvéolos colapsados e

outros hiperinsuflados. Contudo, isso não ocorre nos pulmões normais, pois a tensão

superficial do surfactante, líquido de composição protéica (≅ 10%) e, principalmente,

fosfolipídica (≅ 90%) secretado pelos pneumócitos tipo II, é consideravelmente

menor do que a da solução salina que recobre as mucosas pulmonares. Dessa

forma, há um equilíbrio entre os alvéolos maiores e menores, com uma mesma

pressão mantida em seus interiores.

Durante a movimentação do sistema respiratório, quando ocorre fluxo de gás,

um elemento adicional ao elástico precisa ser vencido pela pressão motriz: a

resistência. A resistência do sistema respiratório (Rrs) pode ser calculada dividindo-

se Pres,rs pelo fluxo aéreo. Pres,rs é a pressão resistiva do sistema respiratório, ou

seja, a pressão necessária para vencer seus componentes resistivos.

Semelhantemente à complacência, e pelas mesmas razões, a resistência do sistema

respiratório pode ser subdividida em seus componentes pulmonar e de parede.

A resistência pulmonar pode ser subdividida em dois subcomponentes: a

resistência das vias aéreas (Raw), que depende do fluxo de ar no interior dos

pulmões, e a resistência tecidual (Rtis), determinada pelas perdas energéticas

geradas pela viscosidade (isto é, atrito) pertinentes à movimentação do pulmão. A

resistência das vias aéreas pode ser influenciada pela geometria da árvore

traqueobrônquica, pelo volume pulmonar, pela complacência das vias aéreas, pela

viscosidade do gás inspirado e pela musculatura lisa dos brônquios. A resistência

tecidual depende da velocidade de deslocamento, tanto durante a inspiração como

na expiração. A resistência da parede torácica também é determinada pelas perdas

energéticas geradas pela viscosidade pertinente à movimentação das moléculas que

constituem os tecidos da parede torácica.

Além dos componentes elásticos e resistivos, o sistema respiratório

apresenta, também, propriedades viscoelásticas, que atuam no tecido pulmonar e na

parede torácica. A viscoelasticidade foi descrita, a partir do comportamento de fios

de seda, por Wilhelm Weber em 1835. Esse tipo de material obedece à lei da

proporcionalidade entre a força aplicada e o alongamento resultante (Lei de Hooke),

porém apenas por um curto período de tempo após a aplicação da força. Quando a

carga permanece por um tempo prolongado, o alongamento passa a aumentar

continuamente. O alongamento tempo-dependente representa uma propriedade

universal, presente em vários tecidos animais (DORRINGTON, 1980).

Substâncias viscoelásticas, quando mantidas sob deformação constante,

apresentam queda da tensão, chamada de relaxamento de tensão (stress

relaxation), ou simplesmente, relaxamento, quando o corpo é estirado. Por outro

lado, sob tensão constante, o corpo tende a se deformar continuamente com o

decorrer do tempo, fenômeno chamado creep. É importante notar que esta

deformação não é irreversível, mas sim reprodutível, podendo ser repetida, desde

que seja precedida por um período de tempo onde o material permaneça em

condições de repouso, a fim de apagar a memória do evento anterior. Do ponto de

vista morfofuncional, a viscoelasticidade ocorre ao nível do tecido pulmonar e da

parede torácica e permite o intercâmbio de energia (pressão) entre o componente

elástico e o resistivo. Por exemplo, durante uma pausa inspiratória, a energia

potencial (pressão) acumulada no componente elástico pode ser dissipada sob a

forma de calor pelo componente resistivo.

1.2.2 Estudo da mecânica respiratória

Na tentativa de compreender a complexidade do sistema respiratório e seus

componentes (pulmão e parede torácica), além dos diversos mecanismos envolvidos

durante a respiração foram utilizados modelos matemáticos relativamente simples,

que se aproximam ao máximo da realidade. Para isso, faz-se necessária a

interpretação fisiológica de variáveis mensuráveis como fluxo, volume e pressão na

abertura das vias aéreas.

O modelo mais simples é composto por 2 elementos, uma resistência

(representada por um tubo) e uma elastância (representada por um balão) (Figura

5). Esse modelo baseia-se na assertiva de que as propriedades mecânicas do

sistema respiratório independem do volume pulmonar e do fluxo, e que os fatores

inerciais são desprezíveis. Considerando-se o sistema respiratório normal, esse

modelo pode ser utilizado, e tornou-se tão popular que geralmente refere-se à

equação a ele associada como "equação de movimento do sistema respiratório".

Essa equação é dada por P(t) = E.V(t) + R.V’(t), onde, em qualquer instante t, E e R

são, respectivamente, a elastância e a resistência do sistema respiratório e P

representa a pressão motriz capaz de produzir volume (V) e fluxo aéreo (V’).

Entretanto, apesar do modelo de compartimento único continuar sendo amplamente

utilizado, não é possível empregá-lo com precisão para o estudo da mecânica em

presença de doenças pulmonares, sendo necessário um modelo de dois ou mais

compartimentos, que apresentem diferentes constantes de tempo para descrever o

comportamento mecânico do sistema respiratório. Além disso, essa equação de

movimento não explica o decaimento lento da pressão traqueal observado após

oclusão das vias aéreas ao final da inspiração (DON & ROBSON, 1965; BATES et

al., 1985a,b), a dependência de freqüência de R e E na faixa de 0-2 HZ (HANTOS et

al.,1986, 1987; BARNAS et al., 1987; BATES et al., 1989; BRUSASCO et al., 1989),

bem como a presença de histerese na curva volume-pressão quase-estática em

pulmões isolados (SIMILOWSKI & BATES, 1991).

Passa-se, então, ao estudo da mecânica respiratória utilizando-se modelos

bicompartimentais que consideram a heterogeneidade de distribuição de gás nos

pulmões (MEAD, 1961) e a viscoelasticidade dos tecidos (MOUNT, 1955).

Figura 5. Modelo linear unicompartimental. Representação anatômica (A), elétrica (B) e

reológica (corpo de Voigt, C). R, resistência do sistema respiratório; E, elastância do sistema

respiratório; V, variações de volume; P, pressão.

Na década de 60 foram descritos os primeiros modelos bicompartimentais

para estudo da mecânica respiratória, que associavam a natureza

multicompartimental do sistema respiratório à heterogeneidade da distribuição de

gás nos pulmões (OTIS et al., 1956; MEAD, 1969) ou à viscoelasticidade dos tecidos

(MOUNT, 1955).

Em 1985, Bates et al. representaram o modelo, originalmente proposto por

Mount, na forma de um modelo físico composto por elementos elásticos

representados por molas e por elementos resistivos expressos por amortecedores

(BATES et al., 1985b). Os autores realizaram uma análise teórica do comportamento

não homogêneo do sistema respiratório submetido à ventilação mecânica com fluxo

inspiratório constante, seguida por oclusão súbita das vias aéreas. Imediatamente

após a oclusão ocorre uma queda rápida da pressão traqueal (∆P1), indo do seu

valor máximo (Pmax) até um ponto de inflexão (Pi), seguida por uma queda lenta

(∆P2) até atingir um platô, que corresponde à pressão de retração elástica do

sistema respiratório (Pel), como mostrado na Figura 6.

VOLUME

(L)

FLUXO

(L/s)

PRESSÃO

TRAQUEAL

(cmH

INSP

OCLUSÃO

LIBERAÇÃO

Pel

Pmáx

Figura 6. Modelo do método de oclusão ao final da inspiração. Registros de volume, fluxo

aéreo e pressão traqueal em função do tempo. INSP, inspiração; V

, volume corrente;

Pmáx, pressão máxima ou de pico inspiratório; Pi, pressão pulmonar no ponto de inflexão;

Pel, pressão de retração elástica do pulmão.

O modelo de Bates et al. é constituído por dois submodelos, pulmão e parede

torácica, apresentando um arranjo em paralelo, uma vez que são submetidos à

mesma variação de volume (Figura 7). A subunidade pulmonar consiste de um

amortecedor, representando a resistência das vias aéreas (Rinit,L) em paralelo com

um corpo de Kelvin, que consiste de uma mola representando a elastância estática

(Est,L) em paralelo com um corpo de Maxwell, caracterizado por uma mola,

componente elástico (E2,L), e um amortecedor, componente resistivo (R2,L),

dispostos em série. E2,L, R2,L e a constante de tempo correspondente

(τ2,L=R2,L/E2,L) estimam as propriedades viscoelásticas do pulmão. Já a

subunidade da parede torácica é representada por uma resistência (Rinit,w) e pelo

corpo de Kelvin, caracterizado pela elastância estática da parede torácica (Est,w) e

pelos parâmetros que correspondem a viscoelasticidade (E2,w, R2,w e τ2,w).

Quando esse modelo é alongado (afastamento das duas barras horizontais) a

uma velocidade constante (v), a carga da mola E2 aumenta com o tempo (Ti) e a

velocidade do amortecedor R2 se aproxima da velocidade de alongamento (v),

assim, a força exercida pela mola E2 aproxima-se de R2.v. Se uma manobra de

“interrupção de fluxo” for realizada, o movimento relativo das duas barras horizontais

cessa. Com isso, o comprimento da mola E2 diminui gradualmente até atingir seu

comprimento de equilíbrio. Logo, nesse modelo, o decaimento pressórico lento

(∆P2), observado após a interrupção do fluxo, é interpretado como equivalente ao

relaxamento da mola E2, resultando em dissipação calórica de energia no

amortecedor R2.

Baseado no modelo de Bates et al. (BATES et al., 1988), a queda de pressão

que ocorre imediatamente após a oclusão das vias aéreas, durante a insuflação

pulmonar com fluxo constante, fornece a variação de pressão do sistema respiratório

que seria obtida na ausência de desigualdades da constante de tempo e stress

relaxation, ou seja, o componente viscoso ou homogêneo do sistema respiratório. A

queda mais lenta da pressão, que ocorre subseqüentemente até ser atingindo o

platô, reflete a pressão dissipada em decorrência da viscoelasticidade e/ou

inomogeneidade do sistema, as quais são determinadas, respectivamente, pelo

stress relaxation e pendelluft (BATES et al., 1985a; 1988).

Figura 7. Modelo de molas e amortecedores para interpretação da mecânica do sistema

respiratório com a técnica de interrupção do fluxo, proposto por Bates et al. (Bates et al.,

1985). Pulmão e parede torácica apresentam um componente resistivo (Rinit,L e Rinit,w,

respectivamente) em paralelo com um corpo de Kelvin; este composto por componente

elástico (Est,L e Est,w, respectivamente), representando a elastância estática dos dois

compartimentos, em paralelo com um corpo de Maxwell, conjunto de amortecedor e mola

em série (R2,L – E2,L, e R2,w – E2,w, respectivamente), os quais representam o

comportamento viscoelástico. A distância entre as duas barras horizontais é análoga ao

volume pulmonar (V) e a tensão entre elas é análoga da pressão na abertura das vias

aéreas (P).

“Stress relaxation pulmonar” é a capacidade do pulmão de se adaptar a uma

insuflação mantida, apresentando redução da pressão em função do tempo. Quando

permanece sob um comprimento constante (volume), o pulmão pode alterar sua

tensão com o tempo, logo, o gradiente de pressão diminui progressivamente. O

stress relaxation ocorre após alterações súbitas do comprimento, strain. Nesse caso,

súbito significa que o tempo necessário para o estiramento é menor do que a

constante de tempo (

= R

). O stress relaxation depende do realinhamento da

matriz extracelular e de perdas de energia nos tecidos pulmonares e na interface ar-

líquido (HORIE & HILDEBRANDT, 1971). Já o pendelluft é a transferência de um

pequeno volume de gás dos compartimentos pulmonares de maior pressão para os

compartimentos de menor pressão, representando o reajuste estático das diferenças

regionais de volume pulmonar resultantes de desigualdades de constante de tempo

(OTIS et al., 1956; BATES et al., 1985a).

Vários fatores contribuem para o stress relaxation no pulmão, como o

fenômeno de abertura e fechamento das vias aéreas e espaços alveolares, e as

perdas de energia nos tecidos e na interface ar-líquido. As fibras de colágeno e

elastina, isoladamente, apresentam pouca adaptação ao estiramento, mas o arranjo

da matriz fibro-elástica apresenta contribuição significativa para este fenômeno

(HORIE & HILDEBRANDT, 1971). Alguns autores ressaltam o papel da interface ar-

líquido como o principal determinante do stress relaxation no pulmão (HORIE &

HILDEBRANDT, 1971).

O comportamento não homogêneo da parede torácica não está

completamente esclarecido. A parede torácica pode se comportar como um sistema

de dois compartimentos, um de baixa complacência, representado pela caixa

torácica e outro de complacência mais elevada, o abdômen (PESLIN et al., 1975).

Além disso, a pressão intrapleural não é uniforme em toda a cavidade torácica,

sendo afetada pela contração do diafragma e pela movimentação do abdômen

(D’ANGELO et al., 1974). As propriedades mecânicas do sistema respiratório podem

sofrer influência da parede abdominal, ajudando a explicar a queda não homogênea

da pressão pleural após a oclusão das vias aéreas (ZIN et al., 1989). A abertura

extensa da parede abdominal leva ao aumento da elastância e resistência,

provavelmente secundário à redistribuição de volumes gasosos no pulmão (ZIN et

al., 1989).

O primeiro estudo em animais realizado de acordo com o proposto por Bates

et al. (BATES et al., 1985b), com subdivisão do sistema em seus componentes

pulmonar e de parede, foi realizado por Saldiva et al. em 1987 (SALDIVA et al.,

1987). Posteriormente, outros trabalhos também demonstraram a contribuição

significativa da parede torácica para as desigualdades do sistema respiratório

(AULER et al., 1987; ZIN et al., 1989; D´ANGELO et al., 1994; MOREIRA et al.,

1997; MACEDO-NETTO et al., 1998; ROCCO et al., 1999), comprovando que elas

podem ser atribuídas aos componentes pulmonar e de parede.

O método de oclusão das vias aéreas após insuflação com fluxo constante

não é capaz de determinar a contribuição relativa do pendelluft (desigualdades de

constantes de tempo) e do stress relaxation (componente viscoelástico) para o

desenvolvimento da queda lenta observada na pressão traqueal (BATES et al.,

1985a; 1988; KOCHI et al., 1988b). No entanto, vários autores acreditam ser a maior

contribuição representada provavelmente pelo stress relaxation (BATES et al., 1988;

KOCHI et al., 1988a; SIMILOWSKI et al., 1991).

No final dos anos 80, foi demonstrada, através do método de oclusão ao final

da inspiração, a dependência das resistências pulmonares, de parede e do sistema

em relação ao fluxo e volume (KOCHI et al., 1988a,b). Em condições de isovolume,

as resistências intrínsecas pulmonares (Rinit,L), da parede (Rinit,w) e do sistema

respiratório (Rinit,rs) aumentam linearmente com o aumento do fluxo, enquanto que

a pressão necessária para vencer a viscoelasticidade e/ou inomogeneidade e o

pendelluft (∆P2,L ∆P2,w e ∆P2,rs) aumenta progressivamente, mas a variação deste

crescimento decai, chegando a zero (SIMILOWSKI et al., 1989). Em outras palavras,

se fosse possível calcular uma resistência utilizando-se esses valores de pressão e

fluxo no momento da oclusão, ela cairia com a elevação do fluxo. Na situação de

isofluxo, aumentando-se o volume, Rinit,L, Rinit,w e Rinit,rs decrescem, enquanto

que ∆P2,L ∆P2,w e ∆P2,rs aumentam de modo similar àquele obtido em situação de

isovolume (KOCHI et al., 1988a,b; D’ANGELO et al., 1989; SIMILOWSKI et al.,

1989).

Em 1988, o modelo de oclusão ao final da inspiração foi validado através de

estudos experimentais utilizando-se cápsulas posicionadas em pontos diferentes da

superfície pleural. Ao medir diretamente a pressão alveolar, comprovou-se ser esta

homogênea através dos pulmões, apresentando pico de pressão coincidente com o

ponto de inflexão (Pi) observado na curva de pressão traqueal. Logo, a pressão

alveolar mostra comportamento semelhante ao encontrado na segunda fase da

pressão traqueal, a de queda lenta. Tal observação indica que a variação de

pressão responsável pela queda lenta (∆P2) ocorre em conseqüência a um

fenômeno nas vias aéreas bem distais, alvéolo e tecido pulmonar. Logo, ∆P2 é uma

manifestação do comportamento tecidual de adaptação ao estresse (BATES et al.,

1988; SALDIVA et al., 1992).

Apesar de haver diversas técnicas para analisar a mecânica do sistema

respiratório, nos últimos anos o método de oclusão ao final da inspiração vem sendo

bastante utilizado, tanto em animais, quanto em seres humanos anestesiados

(BATES et al., 1985b; AULER et al., 1987; SALDIVA et al., 1987; D’ANGELO et al.,

1989, 1994; MACEDO-NETO et al., 1998; ROCCO et al., 1999; CORRÊA et al.,

2001). Este método foi empregado no presente trabalho, por fornecer informações

individualizadas sobre o componente pulmonar e permitir a análise de suas

propriedades elástica, viscosa e viscoelástica.

JUSTIFICATIVA

2 JUSTIFICATIVA

A relação entre poluição do ar ambiente e aumento da morbidade de doenças

respiratórias está bem estabelecida em áreas de poluição urbana, onde as principais

fontes poluentes são tráfego e indústrias. No entanto, pouco se sabe sobre os

efeitos da queima de biomassa, que se apresenta como fonte crescente de material

particulado, o componente central da poluição aérea. Esse problema é de particular

importância para o Brasil, uma vez que a procura por fontes alternativas de

combustível levou a significativo aumento do plantio de cana-de-açúcar e, hoje, 70%

dessa produção é queimada antes da colheita manual, para produção de álcool.

O potencial impacto dos efeitos adversos da queima de biomassa já começou

a ser observado em estudos epidemiológicos nas áreas de Piracicaba e Araraquara,

São Paulo, com aumento do número de admissões hospitalares por sintomas

respiratórios nos períodos de queima. Esses achados iniciais fortalecem a

necessidade de melhor entendimento dos efeitos e mecanismos envolvidos na

associação entre queima de biomassa e alterações respiratórias (ARBEX et al.,

2000; MARTINS et al., 2002; CANÇADO et al., 2006; REGALADO et al., 2006;

RINNE et al., 2006; ARBEX et al., 2007).

O presente trabalho estuda os efeitos da exposição aguda a partículas totais

suspensas (PTS) provenientes da queima de cana-de-açúcar sobre as propriedades

elásticas, resistivas e viscoelásticas e/ou inomogêneas pulmonares, bem como

sobre a histologia do pulmão em um modelo murino. Os efeitos respiratórios são

comparados com os provocados por exposição semelhante à PTS de origem

urbana, sendo também determinada a presença de metais e hidrocarbonetos

policíclicos aromáticos no PTS originado das duas fontes de poluição.

OBJETIVOS

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Verificar se a exposição à dose ambientalmente relevante de partículas

derivadas da queima de cana-de-açúcar provoca, agudamente, efeitos prejudiciais

ao sistema respiratório, e comparar esses efeitos com aqueles relacionados à

partículas de origem urbana.

Fornecer suporte experimental para observações epidemiológicas de

associação entre efeitos respiratórios e queima de cana-de-açúcar.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Através de uma única instilação intranasal de partículas totais suspensas de

duas fontes distintas de poluição, objetivamos:

a) avaliar, pelo método de oclusão ao final da inspiração, as propriedades

elásticas, resistivas e viscoelásticas e/ou inomogêneas do pulmão;

b) estudar as alterações morfométricas e a celularidade total e diferencial no

parênquima pulmonar e

c) avaliar a composição das partículas totais suspensas das duas fontes de

poluição (de origem urbana e de queima de cana-de-açúcar).

MATERIAIS E MÉTODOS

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 ANIMAIS UTILIZADOS

Vinte e nove camundongos BALB/c fêmeas adultas, 25-30 g, oriundas do

biotério do Laboratório de Fisiologia da Respiração do Instituto de Biofísica Carlos

Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro foram utilizados no estudo.

Os animais receberam cuidados conforme o guia preparado pelo Comitê de

Cuidados e Uso dos Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisas

dos Estados Unidos (U.S. Department of Health and Humane Services, 1985). O

protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de Avaliação do Uso de Animais

em Pesquisa (CAUAP) do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade

Federal do Rio de Janeiro.

4.2 CARACTERIZAÇÃO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS

Os camundongos foram divididos aleatoriamente em três grupos

experimentais:

a) Grupo controle (C, n=9): os animais receberam 15 µL de água destilada

instilados por via intranasal (i.n.);

b) Grupo SP (n=9): os animais receberam dose única (i.n.) de 15 µg (em 15

µL de água destilada) de partículas totais suspensas (PTS) provenientes

da cidade de São Paulo, cuja principal fonte de material particulado é o

tráfego, e

c) Grupo Bio (n=11): os animais receberam dose única (i.n.) de 15 µg (em 15

µL de água destilada) de partículas totais suspensas (PTS) provenientes

da cidade de Araraquara, coletadas durante período de queima de cana-

de-açúcar.

A seleção da dose de PTS administrada baseou-se na concentração média

de PTS observada nas áreas estudadas. Em Araraquara, os níveis de PTS atingem

cerca de 60 µg/m

durante a estação de queima (ARBEX et al., 2007), enquanto que

a média em 24 h de PTS na área urbana da cidade de São Paulo é de

aproximadamente 120 µg/m

(CETESB, 2006). Logo, a dose acumulada de PTS em

24 h inalada por um camundongo nessa concentração ambiental é cerca de 2 µg em

Araraquara e 4 µg em São Paulo, considerando que um camundongo inspira 0,03

de ar em 24 horas. Considerando que apenas uma fração do PTS administrado

por instilação nasal atinge a região alveolar, a dose utilizada é ambientalmente

relevante.

Para a instilação intranasal os animais foram anestesiados com sevofluorano

e se recuperaram rapidamente do procedimento.

Todos os animais foram analisados 24 horas após a instilação, sendo

submetidos à análise de mecânica respiratória e histologia.

Após a realização da medida de mecânica respiratória in vivo, os animais

foram sacrificados e tiveram seus pulmões removidos para análise da morfometria

pulmonar e quantificação da celularidade total e diferencial, realizada no Laboratório

da Fisiologia da Respiração.

A análise quantitativa da composição do material particulado das duas

diferentes origens foi realizada no Laboratório de Radioisópotos Eduardo Penna

Franca, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de

Janeiro, sendo determinadas as concentrações de alguns metais e de alguns

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA).

4.3 AMOSTRA DAS PARTÍCULAS

As partículas totais suspensas no ar foram coletadas em filtros de fibra de

vidro, utilizando um amostrador de médio volume, que operava em uma velocidade

de fluxo de 200 L/min (Handy-Vol, Energética, Rio de Janeiro, Brasil). As PTS de

origem urbana foram coletadas na cidade de São Paulo, Brasil, nos jardins da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, localizada na interseção de

duas movimentadas avenidas no centro da cidade. Neste local, 89% das partículas

finas são derivadas de tráfego (CETESB, 2006). As PTS provenientes da queima de

biomassa foram coletadas na área urbana da cidade de Araraquara, Brasil, nos dias

de queima de cana-de-açúcar. Em São Paulo, as partículas podem ser consideradas

de origem predominantemente de tráfego de veículos automotores. Por outro lado, a

queima de biomassa é a principal fonte de material particulado em Araraquara

durante os períodos de queima de cana-de-açúcar (LARA et al., 2001).

Os filtros foram pesados antes e após um período de 24 h de coleta das

partículas. A diferença de peso do filtro (g) corresponde à massa de PTS coletado

(ARBEX et al., 2007). Temperatura e umidade relativa foram respectivamente de

24,5

C e 71,22%, em São Paulo (7 fevereiro, 2006) e 24,6

C e 43% em Araraquara

(22 agosto, 2003) durante a coleta. As partículas foram, então, extraídas dos filtros

em água destilada via agitação em um sonicador ultrassônico por aproximadamente

oito horas. A proporção final partícula:volume foi 1:1 (1 µg:1 µL), sendo utilizados 15

µg de massa de PTS em 15 µL da solução final.

4.4 MECÂNICA RESPIRATÓRIA

Vinte e quatro horas após a instilação intranasal, os animais foram sedados

com diazepam (1 mg i.p.), pesados (balança Filizola, modelo BR, Indústrias Filizola

SA, SP, Brasil) e, então, anestesiados com pentobarbital sódico (20 mg/kg i.p.).

Depois de anestesiados, os animais foram colocados em uma pequena mesa

sob foco cirúrgico em decúbito dorsal, sendo seus membros fixados por

esparadrapo. Os membros superiores foram mantidos estendidos a 90 graus em

relação ao corpo e os membros inferiores estendidos em diagonal. Após o

posicionamento cirúrgico, foi realizada traqueotomia com introdução de jelco 20G

(com 32 mm de comprimento e 0,80 mm de diâmetro interno), sendo a cânula fixada

à traquéia por meio de fios de algodão. Os animais foram paralisados com injeção

intravenosa de brometo de pancurônio (0,4 mg/kg).

Os camundongos foram, então, acoplados a um ventilador de fluxo constante

(Samay VR15, Universidad de la Republica, Montevideu, Uruguai) com freqüência

de 100 incursões respiratórias por minuto e volume corrente (V

) de 0,2 mL.

Após a adaptação ao respirador, os animais foram submetidos à incisão

cirúrgica por tesoura na linha média do abdômen justo abaixo do apêndice xifóide. A

incisão foi estendida, superficialmente, ao longo da parede torácica sobre o esterno,

sendo, então, a pele do animal retirada por tração lateral. A seguir, a incisão

abdominal foi estendida lateralmente, para a esquerda e para a direita, seguindo o

bordo inferior das costelas até atingir a linha axilar anterior, bilateralmente. Com a

cavidade abdominal aberta, foi possível visualizar o diafragma, que foi perfurado e

secionado segundo a mesma orientação da abertura da parede abdominal. Antes da

perfuração do diafragma foi instalada pressão positiva ao final da expiração (PEEP)

de 2 cmH

O, a fim de evitar o desenvolvimento de colapso pulmonar e atelectasias

(POWERS et al., 1973; SALDIVA et al., 1992; RODRIGUES et al., 1993).

Após a retirada do diafragma, a parede torácica foi removida por incisões

longitudinais bilaterais ao nível da linha axilar anterior, em toda sua extensão, e

incisão superior, abaixo da clavícula.

O ventilador foi ajustado previamente para gerar uma pausa de 5 segundos

ao final da inspiração. Foram tomados cuidados especiais para a manutenção de

volume (V

= 0,2 mL) e fluxo (V’= 1 mL/s) constantes em todos os animais, a fim de

evitar os efeitos de diferentes fluxos, volumes e tempo inspiratório nas variáveis

medidas (KOCHI et al., 1988a,b; SIMILOWSKI et al., 1989).

O tubo traqueal foi conectado a um pneumotacógrafo para pequenos animais,

como descrito por Mortola e Noworaj (MORTOLA & NOWORAJ, 1983), para medida

de fluxo aéreo (V'), sendo o respirador acoplado à outra extremidade do

pneumotacógrafo. O pneumotacógrafo é constituído por uma cânula metálica com

duas saídas laterais conectadas a um transdutor diferencial de pressão, Validyne MP

45-2 (Engineering Corp, Northridge, CA, EUA), para medida de fluxo aéreo, sendo o

volume corrente obtido por integração do sinal de fluxo. Através de outra saída

lateral, a via aérea foi conectada a um transdutor diferencial de pressão Validyne

MP45-2 (Engineering Corp, Northridge, CA, EUA) para medida da pressão traqueal

(Ptr).

Uma vez que modificações abruptas no diâmetro não existiram no nosso

circuito, os erros de medida da resistência ao fluxo foram provavelmente evitados

(LORING et al., 1979; CHANG & MORTOLA, 1981). O espaço morto do

equipamento foi de 0,3 mL. Todos os sinais foram condicionados e amplificados em

um polígrafo Beckman tipo R (Beckman, Schiller Park, IL, EUA). Os sinais de

pressão e fluxo foram passados através de filtros Bessel passa-baixa de 8 pólos

(902LPF, Frequency Devices, Haverhill, MA, EUA), convertidos (DT-2801A, Data

Translation, Malboro, MA, EUA) de analógicos para digitais e armazenados em um

computador. Todos os dados foram coletados usando-se o software LABDAT (RHT-

InfoData Inc., Montreal, Quebec, Canadá) (Figura 8).

Durante os experimentos evitou-se ao máximo a manipulação da cânula

traqueal com aspirações e insuflações, para eliminar possíveis interferências sobre

os parâmetros medidos.

Os parâmetros da mecânica respiratória foram determinados 24 horas após a

instilação intranasal de água destilada (C), PTS de origem urbana (SP) ou PTS

derivado da queima de biomassa (Bio), sendo obtidos através do registro de 10

ciclos respiratórios pelo método da oclusão ao final da inspiração (descrito a seguir).

Figura 8. Montagem experimental consistindo de:

1 - Cilindro de ar comprimido.

2 - Válvula redutora de pressão.

3 - Ventilador de fluxo inspiratório constante composto por duas válvulas solenóides.

4 - Pneumotacógrafo.

5 - Peça em “T” para medida de pressão nas vias aéreas.

6 - Cânula traqueal.

7 - Mesa cirúrgica.

8 - Transdutor diferencial de pressão para medida de pressão nas vias aéreas.

9 - Transdutor diferencial de pressão para medida de fluxo.

10 - Polígrafo de oito canais para condicionamento e amplificação dos sinais de fluxo e

pressão.

11 - Filtros

passa-baixa Bessel de 8 pólos

12 - Conversor analógico-digital de 12 bits.

13 - Microcomputador.

4.4.1 Método de oclusão ao final da inspiração

A mecânica respiratória foi avaliada pelo método de oclusão ao final da

inspiração (BATES et al., 1985a), que permite analisar separadamente os

componentes elástico, resistivo e viscoelástico e/ou inomogêneo do sistema

respiratório.

No animal com o tórax aberto, a Ptr é, na realidade, a pressão transpulmonar

(PL), logo todos os parâmetros medidos correspondem à mecânica pulmonar. Após

a oclusão das vias aéreas ao final da inspiração, sob fluxo constante, ocorre uma

queda súbita da PL até um ponto de inflexão (Pi), a partir do qual o decaimento da

pressão assume caráter mais lento, atingindo um platô em sua porção terminal. Esta

fase de platô corresponde à pressão de retração elástica do pulmão (Pel). A

diferença de pressão que caracteriza a queda rápida inicial (∆P1), representada pela

diferença entre a pressão máxima inicial (Pmax) e o ponto a partir do qual a queda

se torna mais lenta (Pi), corresponde ao componente viscoso pulmonar. A segunda

variação de pressão (∆P2), representada pela queda lenta, do Pi ao platô (Pel),

reflete a pressão dissipada para vencer os componentes viscoelástico (stress

relaxation) e/ou inomogêneo (pendelluft) do tecido pulmonar. A soma de ∆P1 e ∆P2

fornece a variação total de pressão no pulmão (∆Ptot) (Figura 9).

As elastâncias estática (Est) e dinâmica (Edyn) do pulmão foram obtidas

dividindo-se Pel e Pi, respectivamente, pelo volume corrente. O componente elástico

da viscoelasticidade (∆E) foi, então, obtido pela diferença entre Edyn e Est.

Para a realização da oclusão, o aparelho utiliza uma válvula com tempo de

fechamento definido (10 ms). Como este fechamento não é absolutamente

instantâneo, o volume nunca cai a zero imediatamente após a oclusão, propiciando,

assim, a existência de um pequeno fluxo. Este fluxo será responsável pelo aumento

do volume pulmonar e, conseqüentemente, de Pi e Pel. Por isso, foi feita correção

de acordo com Kochi et al. (1988a).

As seguintes fórmulas foram utilizadas na análise da mecânica pulmonar:

Onde:

∆P1 = variação de pressão utilizada para vencer o componente viscoso

∆P2 = variação de pressão relativa ao componente viscoelástico e/ou inomogêneo

∆Ptot = variação de pressão total Pmáx = pressão máxima atingida

Pi = pressão no ponto de inflexão Pel = pressão de retração elástica

Est = elastância estática Edyn = elastância dinâmica

∆E = componente elástico da viscoelasticidade

= volume corrente T

= tempo inspiratório

V’= fluxo inspiratório

∆

∆∆

∆

P1 = Pm

−

−−

−

∆

∆∆

∆

P2 = Pi

−

−−

−

Pel

∆

∆∆

∆

Ptot =

∆

∆∆

∆

∆∆

∆

Est = Pel/V

Edyn = Pi/V

∆

∆∆

∆

E = Edyn -

Est

= V

/V’

∆

∆∆

∆

∆∆

∆

1,2

1,0

0,5

PL (cmH

Pel

Pmax

A resistência total do equipamento (Req), incluindo a cânula traqueal, foi

previamente aferida através da aplicação de fluxos de ar ao sistema, com

concomitante registro das variações de pressão (∆P). Uma vez que Req = ∆P/V’, a

resistência do equipamento corresponde ao coeficiente angular da curva ∆PxV’. A

Req, constante até fluxos de 26 mL/s (bem acima da faixa de fluxos utilizada no

presente experimento), foi de 0,12 cmH

O.mL

-1

. A variação de pressão

determinada pelo equipamento (∆Peq = Req.V’) foi subtraída das pressões resistivas

do pulmão, de tal forma que os resultados representam suas propriedades

mecânicas intrínsecas.

Figura 9. Método de oclusão ao final da inspiração. Registros dos sinais de fluxo aéreo,

volume (V) e pressão transpulmonar (PL) em função do tempo. Os pulmões foram

ventilados com volume corrente de 0,2 mL e fluxo aéreo de 1 mL/s. O platô foi alcançado

após uma pausa inspiratória de 5 s. Após a oclusão das vias aéreas, há uma queda rápida

na PL (∆P1) que corresponde a Pmax – Pi, pressão dissipada para vencer o componente

viscoso do pulmão, seguida por uma queda lenta (∆P2), pressão dissipada para vencer os

componentes viscoelástico e/ou inomogêneo do pulmão, até um ponto de equilíbrio elástico,

representado pela pressão de retração elástica pulmonar (Pel). A linha de base do registro

de pressão corresponde à pressão positiva ao final da expiração (PEEP) de 2 cmH

O. Ins,

inspiração. V

, volume corrente.

4.5 ESTUDO HISTOLÓGICO E MORFOMÉTRICO

4.5.1 Fixação e preparo das lâminas para microscopia óptica

Após a determinação da mecânica pulmonar, os animais foram heparinizados

(veia cava inferior, 1000 IU) e tiveram a aorta abdominal e a veia cava seccionadas,

gerando uma hemorragia maciça, que rapidamente levou os animais ao óbito. A

traquéia foi ocluída com linha de algodão ao final da expiração. Os pulmões foram

perfundidos com solução salina (NaCl a 0,9%) e, posteriormente, com solução

Millonig modificada (100 mL de HCHO à 40%, 900 mL de água destilada, 18,6 g de

NaH

, e 4,2 g de NaOH, pH = 7,4) durante aproximadamente um minuto. Para

tal, um scalp (19G) foi introduzido no ventrículo direito e conectado ao frasco

contendo a solução de perfusão, a 50 cm de altura. A porção abdominal do esôfago

foi identificada e isolada, sendo presa por uma pinça hemostática. As estruturas do

pescoço foram dissecadas com liberação das vias aéreas. A pinça que prendia o

esôfago foi suavemente tracionada para cima, permitindo separá-lo das estruturas

aderidas à parede torácica posterior. Com todas as estruturas individualizadas, a

traquéia foi secionada acima do local ligado pelo fio e, posteriormente, o esôfago foi

separado do conjunto por leve tração. Os pulmões foram removidos en bloc e

fixados em solução Millonig modificada.

Depois da fixação, o material foi processado como de rotina para estudo

histológico e emblocado em parafina, obtendo-se, então, cortes histológicos com 3

µm de espessura.

As lâminas contendo os cortes pulmonares foram coradas com hematoxilina e

eosina (HE) e analisadas por microscopia óptica (Axioplan, Zeiss, Oberkochen,

Alemanha), segundo seus aspectos qualitativos e quantitativos.

4.5.2 Análise histológica e morfométrica

As lâminas com os cortes pulmonares montados foram analisadas por

microscopia óptica (microscópio Axioplan, Zeiss, Oberkochen, Alemanha) tanto

qualitativa quanto quantitativamente. Para a análise qualitativa, toda a superfície da

lâmina foi observada com todas as estruturas pulmonares representadas, em

aumento de 100x.

A análise quantitativa foi realizada através da técnica convencional de

contagem de pontos (point-couting) (GUNDERSEN et al., 1988), utilizando uma

ocular acoplada ao microscópio contendo um sistema de referência de 100 pontos e

50 linhas dispostos em paralelo (Figura 10).

Em um aumento de 200x foram avaliados de cinco a dez campos aleatórios e

não coincidentes por lâmina. Foi quantificada a fração de área ocupada por alvéolos

normais e colapsados (WEIBEL, 1990), onde o número de pontos que caíam em

área de alvéolo normal ou colapsado, respectivamente, foi dividido pelo total de

pontos contados em cada campo analisado e expresso sob a forma de percentual.

Em um aumento de 1000x foram avaliados de cinco a dez campos aleatórios

e não coincidentes por lâmina para quantificação da celularidade total e do número

de células polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN) no tecido pulmonar. O

número de PMN e MN foi computado como percentual de pontos totais que caíam

sobre o tecido pulmonar. Para tal, foi computado o número de pontos que caíam

sobre células PMN ou MN no septo alveolar de cada campo analisado. O total de

pontos sobre cada tipo celular foi, então, dividido pelo número total de pontos que

caíam sobre área de tecido pulmonar (descontando-se pontos sobre espaços

aéreos) e os valores expressos como percentual de PMN ou MN no tecido pulmonar

(PICANÇO et al., 2004; SANTOS et al., 2006).

Os valores finais foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM)

de 6 lâminas por grupo, sendo cada animal representado por apenas uma lâmina.

Figura 10. Retículo com 100 pontos e 50 linhas utilizado para análise histológica.

4.6 ANÁLISE DAS PARTÍCULAS

4.6.1 Análise de metais

Os experimentos de extração/solubilização dos metais pesados presentes no

particulado retido no filtro foram conduzidos sob o princípio básico de expor o

material em solução ácida, visando a obter um extrato com volume final aferido, no

qual os metais estejam solubilizados.

Todos os metais foram analisados em espectrofotômetro por absorção

atômica de chama (modelo AA 1475, Varian, Austrália), seguindo padrões de

recomendação (VARIAN, 1981) e estudos anteriores do Laboratório de

Radioisótopos na Universidade Federal do Rio de Janeiro (TRINDADE et al., 1981;

AZCUE et al., 1988). Todos os nossos resultados estiveram acima dos limites de

detecção (ng/mL) para os extratos: Cd (2,4), Cr (7,3), Cu (3), Fe (5), Mn (3), Ni (22) e

Zn (1,4), calculados de acordo com Slavin et al. (SLAVIN et al., 1972).

4.6.1.1 Filtração

Na filtração para a obtenção do particulado em suspensão (após a

determinação do volume inicial), as amostras de água refrigerada foram filtradas em

membrana Millipore (diâmetro do poro de 0,45 µm) com auxílio de uma bomba de

vácuo. Cada filtro, previamente pesado e seco em estufa (70

C) por 1 hora, foi

mantido em um dessecador até a filtração, realizada em bomba de vácuo. Após a

filtração, o material foi seco a 70

4.6.1.2 Extração total

Depois de determinada a massa filtrada, foi realizada a digestão do material

particulado. Para estimar o conteúdo total de metais pesados no particulado, as

amostras foram transferidas para cadinhos de teflon em banho de areia a quente,

digeridas com 5 mL de HNO

65% (P.A.), sendo, então, levadas à evaporação.

Adicionou-se então 5 mL de HCl 37% (P.A.), levando-se mais uma vez ao

ponto de secura da amostra e, finalmente, solubilizando o extrato com HCl 0,1 M. O

volume final aferido, com auxílio de uma proveta de vidro, foi de 15 mL deste último

ácido diluído. As amostras foram, então, armazenadas em frascos plásticos em

geladeira até o momento da análise no espectrofotômetro.

4.6.2 Análise de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

A análise de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos das partículas retidas

nos filtros se baseia em técnicas cromatográficas de separação, divididas em quatro

etapas principais: extração, purificação, fracionamento e determinação dos

poluentes por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE, do inglês HPLC)

(Figura 11). Para cada amostra, foi analisado um branco, que acompanhou todas as

etapas descritas abaixo.

Figura 11. Esquema da metodologia utilizada para análise de hidrocarbonetos policíclicos

aromáticos.

•

2 gramas de peso seco (p.s.) em ultra-som

(banho quente) com n-hexano/acetona (3 x

20 min)

•

Coluna cromatográfica aberta com agente

dessulfurizante (Al

/Na

/NaOH em 11%

de água)O)

•

Coluna cromatográfica aberta

contendo sílica gel

•

Modelo: RF-10 (Shimadzu AxL, Corp, Kyoto, Japão)

•

Bombas: LC-10AT e LC-10AS.

•

Coluna: CLC-ODS: 25 cm; 4,6 mm d.i.; 5 µm; 120 Å.

•

Fase móvel: acetonitrila/água (80:20 v/v)

•

Fluxo: 1,5 mL.min-1

Extração

Purificação

Fracionamento

CLAE_F

4.6.2.1 Extração

Matrizes, como particulado, apresentam uma gama de substâncias orgânicas

associadas, principalmente adsorvidas às partículas minerais. Para um melhor

desempenho na extração de poluentes orgânicos com polaridades distintas, se faz

necessário a utilização de solventes orgânicos com polaridades intermediárias.

Solventes como acetona, diclorometano, n-hexano e acetonitrila são amplamente

utilizados na extração desses contaminantes (PASTOR et al., 1997; TORRES et al.,

1999).

Neste estudo foram pesados dois gramas de peso seco (p.s.) de amostra de

partículas em tubos de vidro. Os tubos foram vedados com tampas de Teflon e

identificados. Cada amostra foi extraída, adicionando-se uma mistura de 12 mL de n-

hexano/acetona (3x 20 minutos) utilizando um aparelho de ultra-som em banho

quente (~90

C). Para cada extração, a proporção da mistura era alterada da

seguinte forma: 1) 1:4 v/v n-hexano/acetona; 2) 1:1 v/v n-hexano/acetona; 3) 4:1 v/v

n-hexano/acetona. Foi adicionado 1 mL de isooctano para cada etapa. Após cada

lavagem, as amostras foram centrifugadas a 1800 rpm por 15 minutos e

posteriormente transferidas para balões de vidro.

4.6.2.2 Purificação

O extrato adquirido das matrizes contém poluentes como hidrocarbonetos

policíclicos aromáticos, mas também outros compostos que podem aumentar o ruído

analítico, dificultando a quantificação cromatográfica futura. Japenga et al. (1987)

desenvolveram técnicas cromatográficas de purificação para poluentes orgânicos,

utilizando reagentes com ação dessulfurizante (adaptado por TORRES et al., 1999).

Este agente é composto de uma mistura de óxido de alumínio impregnado por uma

solução aquosa de sulfito de sódio e hidróxido de sódio, em uma quantidade mínima

de água (11%).

Para a etapa de purificação, os extratos foram previamente concentrados em

evaporador rotatório para 1 mL. Após concentrado, cada extrato foi transferido para

uma coluna cromatográfica aberta, empacotada com 7 g de agente dessulfurizante

(Al

/Na

/NaOH

em 11% de água). Primeiramente, a coluna foi ativada pela

eluição de 20 mL de n-hexano. O primeiro solvente eluído foi descartado. A coluna

foi eluída, posteriormente, com 20 mL de n-hexano. Por fim, o eluato purificado foi

recolhido e avolumado em balões volumétricos de 50 mL. As amostras foram

armazenadas em freezer (-10

C) para a etapa seguinte.

4.6.2.3 Fracionamento

O fracionamento é uma etapa de separação, que facilita a análise e posterior

quantificação das substâncias em estudo. A outra vantagem da técnica de

fracionamento é preservar o equipamento cromatográfico, principalmente a coluna

do aparelho (CLAE-FL), contra possíveis compostos mais reativos.

Para o fracionamento de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, foi retirada

uma alíquota de 20 mL de cada amostra. Consecutivamente, as amostras

purificadas foram concentradas em evaporador rotatório para 1 mL e transferidas

para uma coluna cromatográfica aberta, contendo 3 g de sílica gel. A sílica gel foi

previamente lavada com n-hexano em ultra-som por 20 min e seca em estufa (60

por 12 h. Duas eluições foram realizadas: a primeira, foi eluída com 7 mL de n-

hexano e posteriormente descartada, este procedimento tem o objetivo de retirar

qualquer outro contaminante orgânico que possa atrapalhar a identificação futura de

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, na segunda eluição foram usados 35 mL de

n-hexano/éter (3:1; v/v) para cada amostra. Ao fim da eluição, as amostras foram

concentradas em evaporador rotatório até a secura e solubilizadas em 0,5 mL de

acetonitrila.

4.6.2.4 Condições cromatográficas

As amostras foram analisadas em um cromatógrafo líquido de alta eficiência

(CLAE) acoplado a um detector de fluorescência, modelo RF-10 (Shimadzu AxL,

Corp, Kyoto, Japão) com duas bombas LC-10AT e LC-10AS, e coluna CLC-ODS: 25

cm; 4,6 mm d.i.; partícula com 5 µm e poro de 120 Å. A fase móvel é composta por

uma mistura de acetonitrila/água (80:20 v/v) com fluxo isocrático de 1,5 mL.min

-1

. O

detector foi programado em oito etapas de comprimento de onda para

excitação/emissão: 255/325; 253/350; 333/390; 287/462; 280/430; 294/404 300/500

e 300/421. Para análise de cada amostra, foi injetada uma alíquota de 20 µL. Foram

analisados 8 hidrocarbonetos policíclicos aromáticos neste estudo: naftaleno (NAF),

fluoreno (FLUO), antraceno (ANTR), pireno (PIR), benzo[a]antraceno (B[a]A),

benzo[b]fluoranteno (B[b]F), benzo[k]fluoranteno (B[k]F) e benzo[a]pireno (B[a]P).

4.6.2.5 Quantificação

Utilizou-se o software Borwin 1.2 para a integração dos cromatogramas e

cálculo de concentração dos compostos. Para a identificação dos compostos,

comparou-se o tempo de retenção de cada um com o cromatograma de uma

solução padrão. A quantificação dos HPA foi baseada na curva de calibração de

uma solução padrão.

4.6.3 Análise de distribuição de freqüência do diâmetro das partículas

Um segmento dos filtros de fibra de vidro foi utilizado para análise por

microscopia eletrônica de varredura. Dez campos não-coincidentes foram

fotografados e a distribuição de diâmetro de 1022 partículas amostradas em

Araraquara e 1746 partículas coletadas em São Paulo foi determinada por sistema

de análise de imagem (Image-Pro Plus 4.1; Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os valores finais foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM).

Inicialmente os dados foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov

(com correção de Lilliefors) para avaliar a normalidade de suas distribuições. A

seguir foi aplicado o teste da mediana de Levene para verificar a igualdade de

variâncias. Se ambas as condições fossem satisfatórias, era aplicada one-way

ANOVA, seguida do teste de Tukey para comparações múltiplas, quando

necessário. Em caso negativo, o teste não-paramétrico Kruskal Wallis ANOVA

seguido de teste de Dunn era empregado.

Os parâmetros de morfometria e celularidade foram submetidos à

transformada arcoseno, para posteriormente serem comparados.

Correlação entre os parâmetros funcionais e morfométricos foi determinada

pelo teste de Spearman.

Em todos os testes, o nível de significância considerado foi de 5%. As

análises estatísticas foram realizadas pelo programa Sigma Stat 3.11 (Systat

Software, Inc. San Jose, CA, USA).

RESULTADOS

5 RESULTADOS

5.1 MECÂNICA RESPIRATÓRIA

No intuito de avaliar os efeitos da exposição a diferentes tipos de poluição

sobre a função pulmonar em camundongos saudáveis, foram medidos os

parâmetros da mecânica pulmonar in vivo.

Os valores de volume e fluxo utilizados durante o experimento são mostrados

na tabela 4 e não variaram significativamente entre os grupos estudados.

As diferenças entre os parâmetros de mecânica pulmonar (Est, ∆E, ∆P1, ∆P2

e ∆Ptot) observadas entre os animais do grupo C e dos grupos SP e Bio estão

representadas nas figuras 12 e 13. Os valores de ∆P2 e ∆Ptot dos grupos poluição

aumentaram de forma semelhante, sendo significativamente maiores do que os do

grupo C. Entretanto, apenas o grupo Bio apresentou aumento do componente

resistivo (∆P1), quando comparado ao grupo C. Não foi observada diferença

significativa entre os grupos poluição (Figura 12).

A figura 13 mostra aumento de Est e ∆E nos animais que receberam

instilação de PTS de origem urbana e de queima de biomassa em relação ao

controle. Assim como o observado nos valores de pressões, não houve diferença

entre os grupos SP e Bio.

Os dados da mecânica pulmonar de cada animal separadamente são

apresentados no anexo I.

Tabela 4: Fluxo e volume nos animais dos grupos controle e poluição

Fluxo (mL/s) Volume (mL)

1,00 ± 0,01 0,19 ± 0,01

1,00 ± 0,00 0,20 ± 0,01

Bio

1,00 ± 0,01 0,20 ± 0,01

Os valores representam média ± EPM de 10 determinações por animal de 9-11 animais por

grupo. C, animais submetidos à instilação intranasal de 15 µL de água destilada; SP e Bio,

camundongos submetidos à instilação intranasal de 15 µg de PTS de origem urbana ou de

queima de biomassa, respectivamente. As medidas foram realizadas 24 horas após a

instilação.

Figura 12. Variações de pressão pulmonar necessárias para vencer os componentes

resistivo (∆P1) e viscoelástico/inomogêneo (

∆

P2) e pressão total exercida contra os

componentes viscosos e viscoelásticos do pulmão (

∆

Ptot) de 10 determinações por animal

de 9-11 animais por grupo. Os valores são expressos em mediana com os limites do

interquartil 25-75 e os valores máximo e mínimo de animais dos grupos C (n = 9), SP (n = 9)

e Bio (n = 11) analisados 24 h após instilação intranasal de 15 µL de água destilada (C) ou

15 µg de PTS de origem urbana (SP) ou de queima de biomassa (Bio), respectivamente.

*significativamente diferente de C (p<0,05).

Bio

∆

∆P (cmH

tot

Figura 13. Elastância estática (Est) e componente elástico da viscoelasticidade do pulmão

(

∆

E) de 10 determinações por animal de 9-11 animais por grupo. Os valores são expressos

em mediana com os limites do interquartil 25-75 e os valores máximo e mínimo de animais

dos grupos C (n = 9), SP (n = 9) e Bio (n = 11) analisados 24 h após instilação intranasal de

15 µL de água destilada (C) ou 15 µg de PTS de origem urbana (SP) ou de queima de

biomassa (Bio), respectivamente. *significativamente diferente de C (p<0,05).

Est (cmH

O/mL)

∆

∆E (cmH

O/mL)

Bio

5.2 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E MORFOMÉTRICA

Visando a fundamentar os achados funcionais e avaliar o comprometimento

tecidual seguido à administração intranasal das PTS de origem urbana e de queima

de biomassa foram realizadas análises qualitativas e quantitativas no tecido

pulmonar.

5.2.1 Análise qualitativa

A figura 14 apresenta fotomicrografias do parênquima pulmonar dos grupos

C, SP e Bio. Podemos notar que a administração de PTS provocou inflamação do

parênquima pulmonar, evidenciada pela presença de espessamento de septo

alveolar e aumento de celularidade, em ambos os grupos que receberam PTS. Além

disso, esses animais apresentaram áreas de colapso alveolar em comparação com o

grupo controle.

Figura 14. Fotomicrografias de parênquima pulmonar (200x) coradas com hematoxilina-

eosina. As fotos são representativas de animais do grupo controle (A) e de pulmões

retirados 24 horas após a instilação intranasal de 15 µg de PTS de origem urbana (B) ou de

queima de biomassa (C), respectivamente. Setas indicam áreas de colapso. Barras = 100

100 µm

5.2.2 Análise quantitativa

A figura 15 apresenta a análise morfométrica do parênquima pulmonar dos

animais dos grupos controle e poluição. Vinte e quatro horas após a instilação

intranasal de PTS, já se observou um aumento significativo de colapso alveolar nos

grupos SP e Bio comparado ao grupo C. O aumento das áreas de colapso foi

acompanhado por redução do percentual de áreas normais. Não houve diferença

entre os grupos SP e Bio. Os dados de cada animal separadamente são

apresentados no anexo II.

Visando a avaliar o efeito de partículas ambientais na resposta inflamatória,

quantificamos a celularidade total e diferencial no parênquima pulmonar (Figura 16).

Foi observado influxo de células PMN. O aumento de PMN foi semelhante nos

grupos SP e Bio, e significativamente maior do que o controle. Houve redução do

percentual de células MN nos grupos poluição, no entanto, a redução percentual de

MN foi secundária ao aumento relativo de PMN, uma vez que não houve queda do

número absoluto de MN por campo. Os dados de cada animal separadamente são

apresentados no anexo III.

O aumento da elastância estática pulmonar, observado nos grupos que

receberam instilação de PTS, se correlacionou com o aumento da área de colapso

alveolar (Figura 17).

Figura 15. Fração de área de alvéolos normais e colapsados no parênquima pulmonar de

camundongos analisados 24 h após instilação intranasal de 15 µL de água destilada (C) ou

15 µg de PTS de origem urbana (SP) ou de queima de biomassa (Bio). Os valores

correspondem à média + EPM de 5-10 campos por lâmina de 6 animais por grupo, em um

aumento de 200x. *significativamente diferente de C (p<0,05).

Normal

% área tecido

100

Colapso

Bio

Figura 16. Percentual de células polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN) e

celularidade total (Cel tot) em relação à área de tecido no pulmão de camundongos

analisados 24 h após instilação intranasal de 15 µL de água destilada (C) ou 15 µg de PTS

de origem urbana (SP) ou de queima de biomassa (Bio). Os valores correspondem à média

+ EPM de 5-10 campos por lâmina de 6 animais por grupo, em um aumento de 1000x.

*significativamente diferente de C (p<0,05).

Cel tot

% células / área tecido

PMN

Bio

Figura 17. Correlação (teste de Spearman) entre elastância estática pulmonar e fração de

área de colapso alveolar em camundongos que receberam instilação intranasal de 15 µL de

água destilada (C) ou 15 µg de PTS de origem urbana (SP) ou de queima de biomassa

(Bio). Cada ponto representa a média de 10 determinações de elastância e 5-10 campos

histológicos por animal, de 6 animais por grupo. r: coeficiente de correlação. p = 0,002.

% Colapso Alveolar

0 10 20 30

Est (cmH

O/mL)

Bio

p = 0,002

r = 0,670

5.3 ANÁLISE DAS PARTÍCULAS

A quantidade de metais nos particulados de diferentes origens está ilustrada

na figura 18. Observamos que tanto PTS de origem urbana como de queima de

biomassa apresentam grande quantidade de ferro, zinco, manganês e níquel, em

comparação com os outros metais. Entretanto, as partículas provenientes da queima

de biomassa, de forma geral, apresentaram maiores concentrações de metais do

que as de origem urbana. Os dados das amostras de PTS são apresentados no

anexo IV.

A figura 19 apresenta a distribuição de hidrocarbonetos policíclicos

aromáticos (HPA) nas duas amostras de PTS. O material particulado originado da

queima de biomassa apresentou quantidade total de HPA relativamente menor do

que o observado nas partículas de São Paulo, com pequenas concentrações de

pireno, benzo[b]fluoranteno e benzo[k]fluoranteno em relação ao PTS de origem

urbana. Além disso, concentrações de antraceno, benzo[a]antraceno e

benzo[a]pireno foram encontradas apenas nas PTS de origem urbana. É importante

lembrar que o benzo[a]pireno, encontrado em maior concentração entre todos os

HPA no PTS de origem urbana, e ausente no PTS derivado de biomassa, constitui o

benzeno de maior atividade carcinogênica. Os dados das amostras de PTS são

apresentados no anexo V.

Figura 18. Distribuição de metais contidos em partículas totais suspensas coletadas em

São Paulo (PTS-SP) e área de queima de biomassa (PTS-Bio). ppm, partícula por

milhão.

Metais

Ni Zn Mn Pb Fe Co Cd Cr Totais

PTS-SP

PTS-Bio

ppm (x10

)

Figura 19. Distribuição de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos contidos em partículas

totais suspensas coletadas em São Paulo (PTS-SP) e em área de queima de biomassa

(PTS-Bio). HPA: hidrocarbonetos policíclicos aromáticos; NAF: naftaleno; FLUO:

fluoranteno; ANTR: antraceno; PIR: pireno; B[a]A: benzo[a]antraceno; B[b]F:

benzo[b]fluoranteno; B[k]F: benzo[k]fluoranteno; B[a]P: benzo[a]pireno.

ng/g (x10

)

HPA

NAF FLUOANTR PIR B[a]A B[b]F B[k]F B[a]PTotais

PTS-SP

PTS-Bio

5.3.1 FREQÜÊNCIA DE DISTRIBUIÇÃO DO DIÂMETRO DAS PARTÍCULAS

A figura 20 ilustra a freqüência de distribuição do diâmetro dos dois tipos de

partículas utilizadas. Nas partículas de origem urbana e nas PTS de queima de

biomassa, a média do diâmetro foi de 5,54 µm (variando de 0,37 µm a 106,7 µm) e

3,21 µm (variando de 0,39 µm a 33,6 µm), respectivamente.

Figura 20. Freqüência de distribuição de diâmetro das partículas oriundas de Araraquara

(biomassa) e de São Paulo (tráfego) de mais de 1000 partículas de cada amostra.

DISCUSSÃO

6 DISCUSSÃO

O presente estudo mostra que a exposição aguda à baixa dose de partículas

totais suspensas (PTS) derivadas da queima de cana-de-açúcar provoca alterações

pulmonares funcionais e histológicas, caracterizadas por aumento dos componentes

elástico, resistivo e viscoelástico, acompanhado por inflamação pulmonar e colapso

alveolar. Com exceção do efeito sobre a mecânica de vias aéreas, o particulado

derivado da queima de biomassa induziu alterações semelhantes às observadas

com exposição à PTS urbano, apesar de apresentarem diferenças em suas

composições.

Uma parte importante da interpretação dos resultados de uma pesquisa

biológica é a cuidadosa seleção da espécie animal a ser utilizada. Existe uma

enorme variedade de espécies animais disponíveis e, como regra geral, a espécie

filogeneticamente mais próxima à humana possui a melhor correlação clínica. Os

modelos experimentais auxiliam na compreensão dos fenômenos naturais e

possibilitam o estudo de estruturas e órgãos de difícil acesso em seres humanos.

Ainda, a possibilidade de controlar as variáveis ambientais, sociais e patológicas em

animais de experimentação justificou, no nosso experimento, a escolha de pequenos

animais. Espécies de camundongo e rato têm sido utilizadas para avaliar os efeitos

cardiopulmonares da poluição ambiental (DYE et al., 2001; GURGUEIRA et al.,

2002; RIVERO et al., 2005; SAYES et al., 2007). Sendo assim, escolhemos

camundongos BALB/c fêmeas adultas, os quais são largamente utilizados para

estudos com poluição e não necessitam de um período muito longo de tempo para

se encontrarem em condições de uso após seu nascimento. Neste estudo, a

utilização de cerca de dez camundongos por grupo foi suficiente para detectar

diferenças significativas entre os mesmos.

Os efeitos respiratórios observados no presente trabalho foram induzidos por

dose única e baixa de partículas totais suspensas (PTS) de origens distintas. A dose

administrada foi baseada na concentração média de PTS na cidade de São Paulo

(120 µg/m

) correspondendo ao total de partículas inaladas em 24 h. Essa dose é

significativamente menor do que as doses geralmente utilizadas em estudos

experimentais com material particulado, apresentando, assim, maior relevância

ambiental, pois corresponde aos níveis de exposição regular da população das

áreas estudadas. Camundongos expostos a altas concentrações de partículas

ultrafinas de carbono (300-400 µg/m

) apresentam aumento de espécies reativas de

oxigênio (ROS), caracterizando quadro inflamatório (GURGUEIRA et al., 2002;

ANDRE et al., 2006). No entanto, as propriedades infamatórias de partículas

ultrafinas parecem ser mediadas por sua alta penetração no interstício pulmonar,

independentemente da sua composição química, fazendo com que um excesso de

partículas possa induzir, per se, uma reação inflamatória não-específica (BROWN et

al., 2000). Esse efeito foi evitado em nosso estudo. Adicionalmente, diferentes

autores relatam aumento de morbi-mortalidade associada à poluição, mesmo na

ausência de episódios agudos de poluição, com níveis de material particulado

abaixo de 150 µg/m

(POPE III, 2000; BRUNEKREEF & HOLGATE, 2002). A

descrição de uma relação dose-resposta quase linear entre poluição e efeitos

adversos à saúde, bem como, ausência de limiar, reforça a importância de estudos

utilizando baixas doses de poluentes (DANIELS et al., 2000; SCHWARTZ &

ZANOBETTI, 2000; SCHWARTZ et al., 2002). Em Araraquara, a concentração

média de PTS durante o período de queima permanece abaixo do padrão de

qualidade do ar, apesar de corresponder ao dobro das concentrações observadas

nos períodos de não-queima (ARBEX et al., 2007). Esse ponto ressalta a relevância

do uso de baixa dose de PTS no presente trabalho. Estudos prévios acerca de

efeitos de queima de biomassa, em sua maioria, avaliaram incêndios florestais, que

constituem eventos de curta duração com altas emissões de material particulado

(DUCLOS et al., 1990; ADITAMA, 2000; EMMANUEL, 2000; HELL & GOLDAMEER,

2001; KUNII et al., 2002; MOTT et al., 2005). Por outro lado, nas regiões produtoras

de cana-de-açúcar, os níveis de PTS duplicam no período de queima em

comparação ao período de não-queima, perdurando por seis meses a cada ano,

caracterizando, assim, episódios longos e regulares de exposição com baixas

concentrações de partículas (LONG et al., 1998; ARBEX et al., 2007).

Em nosso trabalho, foram administradas partículas totais suspensas, que

incluem particulados de diversos diâmetros. Estudos recentes têm dado maior

importância a partículas finas e ultrafinas ao invés de grossas ou PTS, em virtude de

sua maior capacidade de deposição alveolar. Trabalhos prévios mostram que 80-

95% das partículas emitidas durante a queima de biomassa se concentram na

categoria de finas e ultrafinas (WARD et al. 1997; SCHWELA et al., 1999;

EMMANUEL, 2000; LARA et al., 2001; US EPA, 2004), distribuição semelhante à

observada no presente estudo (Figura 20). Paralelamente, a queima de biomassa

representa a principal fonte de partículas nas áreas produtoras de cana-de-açúcar,

durante os períodos de queima (LARA et al., 2001; ZHANG & SMITH, 2007).

Portanto, é razoável assumir que variações diárias de PTS podem ser utilizadas

como meio de avaliar as variações diárias de partículas finas e ultrafinas,

caracterizadas por maior capacidade de deposição alveolar e indução de danos nas

vias aéreas (ETZEL et al., 2003; ARBEX et al., 2007).

Nossos resultados confirmam o conceito de que partículas ambientais

induzem inflamação pulmonar aguda, como caracterizado por alterações na

mecânica e histologia pulmonares (Figuras 12 a 16). Focalizamos nossas medidas

na resposta aguda produzida por exposição a partículas, permitindo 24 h para o

desenvolvimento da reação inflamatória. Estudos epidemiológicos (BRAGA et al.,

2001, 2002), incluindo aqueles com foco em material particulado derivado de queima

de cana-de-açúcar (CANÇADO et al., 2006; ARBEX et al., 2000, 2007), indicam um

período de 24 horas entre exposição e aparecimento de efeitos respiratórios

adversos.

Adicionalmente à baixa dose, nosso estudo utilizou instilação intranasal. Além

de mais fisiológica, a respiração nasal caracteriza-se por maior retenção de

partículas nas regiões extratorácicas (nasofaringe e traquéia). Mukae et al. (2001)

observaram resposta inflamatória difusa tanto nas pequenas vias aéreas como nos

alvéolos de coelhos saudáveis após instilação intratraqueal de PM

, duas vezes por

semana, durante três semanas. As partículas de PM

encontravam-se distribuídas

por todo o pulmão e estavam presentes nos macrófagos alveolares (< 5% do volume

citoplasmático). Os resultados obtidos foram comparados com uma análise prévia,

realizada com instilação intranasal (TERASHIMA et al., 1997). A concentração de

macrófagos alveolares foi cerca de três vezes maior quando realizada instilação

intratraqueal, confirmando uma maior deposição de partículas no epitélio alveolar.

Portanto, a escolha da instilação intranasal, além de ser mais representativa da

respiração utilizada por seres humanos expostos à poluição, evitou, potencialmente,

uma superestimativa dos resultados.

O material particulado de origem urbana, coletado na cidade de São Paulo,

pode ser considerado de origem predominantemente de tráfego de veículos

automotores, resultando da queima de combustíveis fósseis. Já as partículas

provenientes da queima de biomassa foram coletadas na área urbana da cidade de

Araraquara, em dias de queima de cana-de-açúcar. A queima de biomassa constitui

uma fonte crescente e regular de liberação de toneladas de material particulado em

Araraquara nos períodos de queima de cana-de-açúcar. No presente estudo, nós

mostramos que uma única instilação intranasal de baixa dose de partículas tanto de

origem urbana como de queima de biomassa gerou aumento dos parâmetros da

mecânica pulmonar, além de aumento significativo de colapso alveolar e influxo de

células PMN no parênquima pulmonar.

O aumento das pressões necessárias para vencer os componentes elásticos

(Est) e viscoelástico e/ou inomogêneos (∆P2) indica um enrijecimento pulmonar.

Embora não haja na literatura análises experimentais da mecânica pulmonar após

exposição à queima de cana-de-açúcar, estudos epidemiológicos observaram

alteração de parâmetros espirométricos após exposição a PM urbano e de queima

de biomassa (BEHERA et al., 1994; SAHA et al., 2005; REGALADO et al., 2006;

RINNE et al., 2006). Saha et al. (2005), ao avaliar o efeito da queima de madeira no

preparo de alimentos em residentes da Índia, observaram redução de VEF

, FEF

25-

75%

e PEF, principalmente em mulheres, em comparação àquelas que utilizavam

forno a gás. Resultado semelhante foi observado no México, em mulheres expostas

à queima de madeira, com redução de VEF

, VEF

/CVF, além de tosse e

expectoração. Todas as mulheres avaliadas apresentavam grau moderado de

obstrução de vias aéreas (REGALADO et al., 2006), situação também observada em

crianças, que permanecem junto às suas mães durante o preparo de alimentos

(RINNE et al., 2006). Entretanto, o aumento da pressão resistiva (∆P1) foi observado

apenas em camundongos instilados com PTS proveniente de queima de biomassa,

sugerindo maior comprometimento das vias aéreas (BATES et al., 1988b; SALDIVA

et al., 1992). Estudos epidemiológicos recentes observaram piora dos sintomas

respiratórios após exposição à queima de biomassa, principalmente em pessoas

portadoras de doenças obstrutivas das vias aéreas, como DPOC (LONG et al., 1998;

RAMÍREZ-VENEGAS et al., 2006; LIU et al., 2007) e asma (LONG et al., 1998;

ARBEX et al., 2007), com redução significativa de VEF

e da relação VEF

/CVF

(RAMÍREZ-VENEGAS et al., 2006), bem como aumento no número de admissões

hospitalares por asma (PARK et al., 2005; ARBEX et al., 2007).

Os achados funcionais descritos acima foram acompanhados por alterações

morfológicas do parênquima pulmonar evidenciadas na microscopia óptica, que se

estabeleceram de forma similar nos dois grupos poluição. No parênquima pulmonar,

houve recrutamento de células PMN em ambos os grupos de poluição (Figura 14).

Influxo de neutrófilos e aumento de células no fluido do lavado broncoalveolar foram

previamente relatados, 24 horas após instilação de 500 µg de PM

urbano em

voluntários saudáveis (GHIO & DEVLIN, 2001). Esse comportamento também se

assemelha ao descrito em outros estudos experimentais, com recrutamento de

neutrófilos polimorfonucleares e macrófagos alveolares 24 horas após instilação

intratraqueal de 500 µg (OBERDÖRSTER et al., 1992) e de 380 µg/m

(ANDRÉ et

al., 2006) de partículas ultrafinas, em ratos saudáveis. Vale ressaltar, no entanto,

que no presente estudo as alterações inflamatórias e de morfometria pulmonares

foram induzidas por dose significativamente menor de material particulado.

Apesar de uma correlação estatisticamente significativa só ter sido atingida

entre a presença de colapso e variação de Est (Figura 17), o colapso alveolar

(Figura 14 e 15), observado após administração de PTS de ambas as origens,

acarreta heterogeneidade do parênquima pulmonar, contribuindo potencialmente

para o aumento de ∆P2, ∆E e Est. Outros fatores também podem ter contribuído

para esse aumento, como distorção dos alvéolos patentes, o processo inflamatório

desencadeado e disfunção do surfactante pulmonar (LIU et al., 1996). Estudo

anatomopatológico realizado em habitantes de regiões montanhosas da Nova Guiné

expostos à queima de biomassa em ambiente interno, demonstrou enfisema

centrolobular, espessamento pleural e fibrose pulmonar (MASTER, 1974). Outros

autores também observaram espessamento de septo alveolar em ratos, após

exposição crônica a 1 ou 10 mg/m

de partículas de fumaça de madeira (TESFAIGZI

et al., 2002).

Poluentes aéreos que interagem com componentes do surfactante, como

proteínas e fosfolipídeos, podem prejudicar a secreção de surfactante pelos

pneumócitos tipo II ou modificar sua composição, gerando instabilidade e colapso

alveolar (SRIVASTAVA & MISRA, 1986; CHAUHAN & MISRA, 1991; MÜLLER et al.,

1998). Estudos experimentais reportaram previamente que a inalação de metais

(como Fe, Cd, Ni e Co) aumenta a secreção de fosfolipídeos, principalmente

dipalmitoilfosfatidilcolina, nos pulmões (JOHANSSON et al., 1983). Além disso, os

componentes do material particulado, em especial metais e HPA, estão envolvidos

na formação de estresse oxidativo (PARK et al., 2006; OHYAMA et al., 2007).

Um dos mecanismos pelo qual o material particulado lesa os pulmões pode

ser atribuído, em parte, ao seu conteúdo de metais (PRAHALAD et al., 2000, 2001;

ROEMER et al., 2000). Em nossos resultados, observamos que o PTS derivado da

queima de biomassa apresentou maior concentração total de metais do que o de

origem urbana (Figura 18). Além disso, o metal em maior concentração nos dois

tipos de poluição foi o Fe, sendo sua concentração ainda maior no PTS biomassa.

Estes resultados se assemelham aos de um recente estudo avaliando a toxicidade

de partículas ultrafinas provenientes de Dunquerque, cidade industrializada da

França (BILLET et al., 2007). Billet et al. observaram que o metal em maior

concentração também foi o Fe. Este último tem sido descrito como o principal metal

envolvido na formação de estresse oxidativo (PARK et al., 2006), por gerar ROS

(SMITH & AUST, 1997) e facilitar a conversão de ânion superóxido (O

) e peróxido

de hidrogênio (H

) em íons hidroxila (OH

) (STOHS & BAGCHI, 1995). Os efeitos

subseqüentes incluiriam disfunção do surfactante (CHAUHAN & MISRA, 1991), dano

epitelial, aumento da permeabilidade e resposta inflamatória, que podem resultar em

prejuízo da função pulmonar normal (ROEMER et al., 2000; SOUKUP et al., 2000;

BERGAMASCHI et al., 2001; DYE et al., 2001; LAGORIO et al. 2006; HONG et al.,

2007). Outros metais de transição como Cu, Ni, Co e Cr também são conhecidos por

gerar ROS, como H

, O

e OH

, iniciando processo inflamatório (STOHS &

BAGCHI, 1995). A fase inicial da resposta pulmonar à exposição a partículas parece

ser influenciada por metais individualizados, enquanto que a persistência da

resposta refletiria a complexidade da interação entre os diferentes metais (DREHER

et al., 1997; ANTONINI et al., 2004).

Ainda em relação à composição dos particulados, as concentrações de HPA,

particularmente benzo[a]antraceno, benzo[b]fluoranteno, benzo[j]fluoranteno,

benzo[k]fluoranteno, benzo[a]pireno, dibenzo[k]antraceno e indeno[1,2,3-c,d]pireno,

são consideradas de potencial risco carcinogênico de acordo com IARC (CASTAÑO-

VINYALS et al., 2004). No presente estudo, somente benzo[b]fluoranteno e

benzo[k]fluoranteno foram detectados em ambas as amostras de PTS, enquanto que

os demais estiveram presentes apenas no PTS de origem urbana. Concentrações de

benzo[a]pireno (B[a]P) (benzeno de maior atividade carcinogênica) foram

encontradas apenas na amostra de PTS oriunda de São Paulo, assim como

benzo[a]antraceno, confirmando os altos níveis de HPA nos grandes centros

urbanos. Diferentemente de nossos achados, Godoi et al. observaram altas

concentrações de HPA, inclusive de B[a]P, em seu estudo também realizado em

Araraquara (GODOI et al., 2004). De acordo com Caricchia et al. (1999), pode

ocorrer perda de HPA de partículas coletadas em filtros quando analisados 24 h ou

mais após a coleta. Os filtros utilizados neste trabalho ultrapassaram este tempo

desde a sua coleta na cidade de Araraquara ou São Paulo até sua análise realizada

no Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. Dessa forma, níveis de HPA em ambas

as amostras podem ter sido subestimados. A presença de HPA em particulados tem

sido associada à indução de inflamação, formação de ROS, produção de

interleucinas e apoptose celular (LI et al., 2002; SORENSEN et al., 2003), tanto em

macrófagos alveolares (HIURA et al., 1999) quanto em células epiteliais (LI et al.,

2002). Estudos sobre a retenção pulmonar de HPA em solução após instilação

intratraqueal em ratas indicaram que eles são rapidamente absorvidos pelo trato

respiratório (WOLFF et al., 1989). Todavia, HPA inalados são predominantemente

absorvidos sob a forma de partículas de fuligem, estando adsorvidos principalmente

em partículas ultrafinas, penetrando nas células do epitélio brônquico, onde são

metabolizados, ativados e biotransformados (SORENSEN et al., 2003; CASTAÑO-

VINYALS et al., 2004). Acredita-se que a elevada produção de adutos de DNA

(seqüências de DNA alteradas) nas células implique em efeito mutagênico (AKCHA

et al., 2000). Um desses indícios está na mutação da proteína p53, responsável pelo

controle da proliferação celular em mamíferos, quando exposta ao B[a]P (BINKOVÁ

et al., 2000). Binková et al. observaram indução de adutos de DNA, seguido de

indução de proteína p53, em fibroblastos pulmonares após exposição a

benzo[a]pireno e dibenzo[a]pireno.

Ao avaliar a toxicidade relativa de partículas coletadas em áreas com

diferentes fontes de poluição – tráfego ou queima de cana-de-açúcar – visamos a

abordar os riscos potenciais da queima de biomassa e, também, avaliar um ponto

crítico na pesquisa de material particulado: o papel da composição da partícula na

determinação de sua toxicidade. A identificação da toxicidade relativa de

constituintes das partículas é crucial para o melhor entendimento da patogênese da

lesão induzida por material particulado. Como demonstrado nas figuras 18 e 19, as

partículas oriundas de São Paulo e Araraquara apresentam composição distinta.

Como regra geral, partículas produzidas por tráfego apresentaram maior conteúdo

de HPA do que as geradas por queima de biomassa, enquanto que a última mostrou

conteúdo de metal relativamente maior do que as derivadas de tráfego. É importante

ressaltar que as duas amostras testadas no presente estudo foram coletadas do ar

ambiente. Logo, não é possível excluir a contribuição de outras fontes sobre a

composição do particulado.

Os parâmetros de mecânica respiratória foram medidos pelo método de

oclusão ao final da inspiração. Esse método permite a identificação dos

componentes elástico, resistivo e viscoelático e/ou inomogêneo da mecânica

pulmonar (BATES et al., 1985b, 1988). A pressão viscoelástica e a elastância

estática aumentaram de forma semelhante nos grupos SP e Bio (Figuras 12 e 13).

No entanto, apenas em Bio houve aumento da pressão resistiva (que reflete

resistência de vias aéreas) em comparação com o grupo controle (Figura 13).

Nossos resultados indicam que os dois tipos de partículas induzem respostas

biológicas diferentes em termos de mecânica de vias aéreas. Essa observação

provavelmente não se relaciona à diferença de distribuição ao longo do trato

respiratório, uma vez que ambas as partículas apresentaram distribuição de

freqüência de diâmetro semelhante (Figura 20), além disso, a via de administração

foi similar nos dois casos. Dessa forma, teoricamente, diferenças na composição do

material particulado podem ter contribuído para as alterações na resposta das vias

aéreas. Por outro lado, os parâmetros relacionados ao parênquima pulmonar distal,

como propriedades elásticas e viscoelásticas, não apresentaram diferenças entre a

exposição a partículas de tráfego ou biomassa. Coerentemente, ambos os tipos de

partículas induziram a mesma magnitude de recrutamento de células

polimorfonucleares no septo alveolar (Figuras 14 e 16). Embora a simples análise

química das partículas, como empregado no presente trabalho, não permita o

estabelecimento de correlação direta entre composição e efeito, vale ressaltar que a

preponderância de metais (biomassa) ou de HPA (tráfego) na composição das

partículas pode induzir alterações semelhantes nos componentes elástico e

viscoelástico pulmonares, enquanto que a resistência de vias aéreas centrais foi

alterada apenas em animais expostos à biomassa. O efeito mais amplo das

partículas de biomassa reforça o potencial papel dos metais na determinação da

toxicidade do material particulado (SOUKUP et al., 2000; DYE et al., 2001;

MOLINELLI et al., 2002).

Até o presente, não há estudos experimentais avaliando a mecânica pulmonar

após exposição à queima de cana-de-açúcar. As semelhanças observadas no

presente trabalho entre a toxicidade respiratória aguda das partículas de origem

urbana e das provenientes da queima de biomassa suportam os achados obtidos em

um recente estudo epidemiológico (CANÇADO et al., 2006). No trabalho de Cançado

et al., aumentos de 10 µg/m

de PM

2,5

e 43 µg/m

de PM

, durante o período de

queima de cana-de-açúcar, foram associados a acréscimo de 21% e 31% nas

admissões hospitalares por sintomas respiratórios em crianças e idosos,

respectivamente. Esses efeitos foram significativamente maiores do que os

observados nos períodos de não-queima e semelhantes aos obtidos em áreas de

poluição urbana.

O presente estudo foi pioneiro em avaliar a função pulmonar em um modelo

de poluição atmosférica induzida por partículas provenientes da queima de cana-de-

açúcar.

CONCLUSÕES

7 CONCLUSÕES

- Uma única instilação intranasal de baixa dose de partículas ambientais, de origem

urbana ou de queima de cana-de-açúcar, induz alterações significativas da

mecânica pulmonar in vivo, acompanhadas por inflamação pulmonar e colapso

alveolar em camundongos saudáveis.

- Apesar de apresentarem composições diferentes, caracterizadas por maior

concentração de metais no PTS derivado de biomassa e maior concentração de

HPA no PTS de origem urbana, os dois particulados induziram grau semelhante de

inflamação e efeito funcional similar sobre o parênquima pulmonar. No entanto, a

mecânica das vias aéreas foi mais afetada pelo PTS derivado de queima de

biomassa.

- Nossos resultados fornecem suporte experimental para observações

epidemiológicas de associação entre efeitos respiratórios e queima de cana-de-

açúcar, mesmo em concentrações abaixo dos padrões de qualidade do ar e em

curto espaço de tempo após a exposição.

- Nosso estudo mostra que as partículas provenientes da queima de cana-de-açúcar

são, no mínimo, tão tóxicas quanto às de origem urbana.

PERSPECTIVAS

FUTURAS

8 PERSPECTIVAS FUTURAS

Esse foi um estudo inicial sobre os efeitos respiratórios da queima de

biomassa, que mostrou ser pelo menos tão tóxica quanto à poluição urbana. Os

efeitos observados corroboram e ampliam achados epidemiológicos prévios. No

entanto, vários outros pontos ainda necessitam ser melhor estudados, como:

a) efeitos respiratórios associados à exposição sub-crônica e crônica a

partículas de biomassa;

b) associação entre exposição à queima de biomassa e doenças prévias, como

asma e DPOC;

c) mecanismos de lesão envolvidos, incluindo ativação de NF-κB e análise de

apoptose celular, e

d) análises mais detalhadas da composição do material particulado, bem como

modelos experimentais capazes de avaliar a participação de diferentes

componentes na toxicidade do material particulado.

REFERÊNCIAS

BIBLIOGRÁFICAS

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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inhalation exposures to 1-nitropyrene, benzo[a]pyrene, Ga

, particles, and SO

alone and combinations on particle clearance, bronchoaveolar lavage fluid

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ANEXOS

ANEXO I: PARÂMETROS DA MECÂNICA PULMONAR EM CADA ANIMAL DOS

GRUPOS C, SP E BIO.

Fluxo Volume

1,00 0,20

C2 1,00 0,20

C3 1,01 0,20

C4 1,00 0,19

C5 1,00 0,18

C6 1,00 0,19

C7 1,00 0,21

C8 0,99 0,18

1,00 0,19

Média

1,00 0,19

0,01 0,01

EPM

0,00 0,00

9,00 9,00

DP/Média

0,53 4,11

Fluxo Volume

SP1 1,01 0,21

SP2 1,00 0,20

SP3 1,00 0,19

SP4 1,00 0,20

SP5 1,00 0,19

SP6 1,00 0,20

SP7 1,00 0,19

SP8 1,00 0,19

SP9 1,00 0,21

Média

1,00 0,20

0,00 0,01

EPM

0,00 0,00

9,00 9,00

DP/Média

0,39 2,80

Bio

Fluxo Volume

Bio1 1,01 0,20

Bio2 1,00 0,21

Bio3 1,00 0,19

Bio4 0,99 0,18

Bio5 1,01 0,19

Bio6 1,00 0,20

Bio7 1,00 0,20

Bio8 1,00 0,19

Bio9 1,00 0,20

Bio10 0,99 0,19

Bio11 1,00 0,19

Média

1,00 0,20

0,01 0,01

EPM

0,00 0,00

11,00 11,00

DP/Média

0,52 3,07

Est ∆E ∆P1 ∆P2 ∆Ptot

23,34 6,12 0,33 1,21 1,55

C2 21,20 4,75 0,52 0,95 1,48

C3 20,62 5,86 0,47 1,16 1,64

C4 19,10 4,91 0,32 0,95 1,27

C5 20,81 7,04 0,44 1,30 1,73

C6 22,48 5,14 0,31 1,00 1,31

C7 21,29 5,49 0,43 1,15 1,59

C8 24,68 6,28 0,31 1,16 1,47

18,14

5,21 0,44 0,98 1,41

Mediana

21,20 5,49 0,43 1,16 1,48

25%

20,24 5,08 0,32 0,97 1,39

75%

22,70 6,16 0,45 1,18 1,60

9,00 9,00 9,00 9,00 9,00

Est ∆E ∆P1 ∆P2 ∆Ptot

SP1 33,98 6,41 0,57 1,32 1,88

SP2 34,80 11,17 1,06 2,24 3,30

SP3 26,48 6,69 0,38 1,29 1,67

SP4 30,03 9,25 0,48 1,81 2,29

SP5 18,68 10,02 0,46 1,93 2,39

SP6 30,59 5,90 0,68 1,17 1,85

SP7 24,94 5,28 0,50 1,01 1,52

SP8 50,11 10,60 0,71 2,01 2,73

SP9 24,58 5,34 0,58 1,10 1,68

Mediana

30,03 6,69 0,57 1,32 1,88

25%

24,85 5,76 0,48 1,15 1,68

75%

34,18 10,17 0,69 1,95 2,47

9,00 9,00 9,00 9,00 9,00

Bio

Est ∆E ∆P1 ∆P2 ∆Ptot

Bio1 30,45 6,14 0,66 1,22 1,87

Bio2 28,33 6,43 0,64 1,33 1,97

Bio3 26,55 6,42 0,75 1,24 1,99

Bio4 43,50 9,17 1,27 1,69 2,95

Bio5 38,14 9,83 0,39 1,86 2,56

Bio6 33,32 6,88 0,60 1,35 1,95

Bio7 43,24 8,88 0,67 1,77 2,44

Bio8 33,23 7,08 0,94 1,35 2,30

Bio9 28,36 6,44 0,70 1,30 2,00

Bio10 47,56 10,54 0,76 2,01 2,80

Bio11 37,53 7,95 0,74 1,51 2,25

Mediana

33,32 7,08 0,70 1,36 2,25

25%

28,88 6,43 0,64 1,31 1,97

75%

41,97 9,08 0,75 1,75 2,40

11,00 11,00 11,00 11,00 11,00

ANEXO II: PERCENTUAL DE ÁREAS NORMAIS E COLAPSADAS EM CADA

ANIMAL DOS GRUPOS C, SP E BIO.

%NORM.

%COLAP.

91,30 8,70

C2 95,12 4,88

C3 86,70 10,07

C4 98,08 1,92

C5 93,37 6,63

C6 96,11 3,89

Média

93,45 6,01

3,69 2,79

EPM

1,50 1,14

6 6

DP/Média

3,94 46,34

%NORM.

%COLAP.

SP1

79,20 19,21

SP2

84,96 15,04

SP3

89,51 8,75

SP4 88,26 11,74

SP5 88,20 11,80

SP6 76,57 23,43

Média

84,45 14,99

4,90 4,98

EPM

2,00 2,03

6 6

DP/Média

5,80 33,21

Bio

%NORM.

%COLAP.

Bio1 76,89 21,73

Bio2 83,66 16,34

Bio3 83,78 15,38

Bio4 84,47 15,53

Bio5 87,10 11,58

Bio6 76,57 23,43

Média

82,08 17,33

3,95 4,03

EPM

1,61 1,65

6 6

DP/Média

4,81 23,28

ANEXO III: CELULARIDADE TOTAL E DIFERENCIAL EM CADA ANIMAL DOS

GRUPOS C, SP E BIO.

PMN MN TECIDO

%PMN

%MN TOTAL%

C1 2,13 12,63 28,25 5,01 29,14 34,14

C2 1,00 10,00 21,75 3,07 30,69 33,76

C3 1,63 12,13 25,00 4,27 31,48 35,75

C4 1,00 17,00 28,25 2,06 36,76 38,81

C5 1,13 15,63 22,88 2,77 39,44 42,21

C6 2,50 15,38 26,50 5,52 34,59 40,10

Média 1,56 13,80 25,44 3,78 33,68 37,46

DP 0,58 2,40 2,49 1,24 3,60 3,14

EPM 0,24 0,98 1,02 0,51 1,47 1,28

n 6 6 6 6 6 6

DP/Média 37,17

17,43 9,80 32,81 10,70 8,37

PMN MN TECIDO

%PMN

%MN TOTAL%

SP1 5,63 12,00 24,63 13,30 28,55 41,85

SP2 5,50 11,50 30,63 11,45 24,16 35,61

SP3 5,00 13,63 28,75 10,54 28,72 39,26

SP4 4,50 16,63 28,13 9,68 29,44 39,12

SP5 4,00 10,38 26,38 9,80 25,45 35,25

SP6 4,25 12,00 24,38 10,32 29,60 39,91

Média 4,81 12,19 27,15 10,85 27,65 38,50

DP 0,61 1,15 2,25 1,24 2,08 2,35

EPM 0,25 0,47 0,92 0,51 0,85 0,96

n 6 6 6 6 6 6

DP/Média 12,70

9,45 8,27 11,43 7,53 6,10

Bio

PMN MN TECIDO

%PMN

%MN TOTAL%

Bio1 5,88 11,38 30,00 12,35 24,07 36,42

Bio2 5,25 11,75 30,38 11,09 24,90 35,99

Bio3 6,50 13,00 30,38 13,03 25,91 38,94

Bio4 4,50 12,88 27,38 10,11 28,59 38,71

Bio5 3,75 14,25 28,25 8,14 30,96 39,10

Bio6 3,75 13,75 27,75 8,25 30,40 38,65

Média 4,94 12,83 29,02 10,50 27,47 37,97

DP 1,04 1,02 1,26 1,87 2,67 1,26

EPM 0,42 0,41 0,52 0,76 1,09 0,52

n 6 6 6 6 6 6

DP/Média 20,97

7,91 4,35 17,79 9,70 3,32

ANEXO IV: CONCENTRAÇÃO DE METAIS NAS PARTÍCULAS DE ORIGEM

URBANA (PTS-SP) E DE QUEIMA DE BIOMASSA (PTS-BIO).

Metais PTS-SP (ppm)

PTS-Bio (ppm)

Níquel 1119,17 2410,71

Zinco 4663,21 8571,43

Ferro 93264,25 135267,86

Manganês 3108,81 5142,86

Chumbo 310,88 428,57

Cobre 93,26 160,71

Metais Totais 10,273 15,229

ANEXO V: CONCENTRAÇÃO DE HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS

AROMÁTICOS (HPA) NAS PARTÍCULAS DE ORIGEM URBANA (PTS-SP) E DE

QUEIMA DE BIOMASSA (PTS-BIO).

HPA PTS-SP (ng/g) PTS-Bio (ng/g)

Naftaleno - -

Fluoreno - -

Antraceno 414,5 -

Pireno 829,0 357,1

Benzo[a]Antraceno 621,8 -

Benzo[b]Fluoranteno 829,0 357,1

Benzo[k]Fluoranteno 621,8 357,1

Benzo[a]Pireno 1450,8 -

HPA Totais 4766,8 1071,4

ANEXO VI: MANUSCRITO DA ENVIRONMENTAL RESEARCH (Manuscrito ID: ER-

07-234R1; Status: em revisão).

Comparative respiratory toxicity of particles produced by

traffic and sugar cane burning

Flavia Mazzoli-Rocha

, Clarissa Bichara Magalhães

, Olaf Malm

, Paulo Hilário

Nascimento Saldiva

, Walter Araujo Zin

, Débora Souza Faffe

Laboratory of Respiration Physiology,

Laboratory of Radioisotopes, Carlos Chagas Filho

Institute of Biophysics, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro;

Laboratory of

Experimental Air Pollution, Department of Pathology, School of Medicine, University of São

Paulo, São Paulo, Brazil.

Correspondence address: Débora Souza Faffe

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – C.C.S.

Av. Carlos Chagas Filho s/n

Ilha do Fundão

21941-902 – Rio de Janeiro – RJ

Brazil

e-mail: [email protected]

tel: (+5521) 2562-6557

fax: (+5521) 2280-8193

Abstract

The impact of particle emissions by biomass burning is increasing throughout the

world. We explored the toxicity of particulate matter produced by sugar cane burning and

compared these effects with equivalent mass of traffic-derived particles. For this purpose,

BALB/c mice received a single intranasal instillation of either distilled water (C) or total

suspended particles (15 µg) from an urban area (SP group) or biomass burning-derived

particles (Bio group). Lung mechanical parameters (total, resistive and viscoelastic pressures,

static elastance, and elastic component of viscoelasticity) and histology were analyzed 24

hours after instillation. Trace elements and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)

metabolites of the two sources of particles were determined. All mechanical parameters

increased similarly in both pollution groups compared with control, except airway resistive

pressure, which increased only in Bio. Both exposed groups showed significantly higher

fraction area of alveolar collapse, and influx of polimorphonuclear cells in lung parenchyma

than C. The composition analysis of total suspended particles showed higher concentrations of

PAHs and lower concentration of metals in traffic than in biomass burning-derived particles.

In conclusion, we demonstrated that a single low dose of ambient particles, produced by

traffic and sugar cane burning, induced significant alterations in pulmonary mechanics and

lung histology in mice. Parenchymal changes were similar after exposure to both particle

sources, whereas airway mechanics was more affected by biomass-derived particles. Our

results indicate that biomass particles were at least as toxic as those produced by traffic.

Keywords: Sugar cane burning; Particulate matter; Air pollution; Lung mechanics

This study was supported by: The Centers of Excellence Program (PRONEX-

MCT/FAPERJ), The Brazilian Council for Scientific and Technological Development

(MCT/CNPq), The Carlos Chagas Filho Rio de Janeiro State Research Supporting Foundation

(FAPERJ), Ministerio de Ciencia y Tecnologia (SAF 2005-0110) and Ministerio de Sanidad y

Consumo (CibeRes, ISCiii CB06/12).

This study was approved by the Ethics Committee of the Carlos Chagas Filho Institute

of Biophysics, Health Sciences Center, Federal University of Rio de Janeiro. All animals

received humane care in compliance with the “Principles of Laboratory Animal Care”

formulated by the National Society for Medical Research and the “Guide for the Care and Use

of Laboratory Animals” prepared by the National Academy of Sciences, USA.

1. Introduction

The adverse effects of ambient particles on human health have been documented in

different parts of the world (Schwartz and Dockery, 1992; Hoek and Brunekreef, 1994;

Saldiva et al., 1994; Pope et al., 1995; Hoek et al., 1997; Lin et al., 1999; Laden et al., 2000;

Braga et al., 2001; Schwartz et al., 2001) by studies conducted in areas where automotive and

industrial sources are dominant. On the other hand, studies on the effects of ambient particles

produced by biomass burning, such as forest fires or during rudimentary harvesting processes,

are much less frequent (Long et al., 1998; Phonboon et al., 1999; Arbex et al., 2000).

Biomass burning is a major contributor to toxic gases and the build-up of total

suspended particles (TSP) throughout the world, leading to high levels of air pollution in

developing countries (Schwela et al., 1999). Although there are few epidemiological studies

on this subject, a relationship between biomass burning and increased emergency room visits

has been reported in different cities (Schwartz et al., 1993; Lipsett et al., 1997; Long et al.,

1998; Arbex et al., 2007). In Brazil, 70% of the country’s sugar cane plantation is burnt

before manual harvesting for biofuel production. It has been reported that burning is the major

source of fine and ultrafine particles in sugar cane producing areas during the burning seasons

(Lara et al., 2001). In the city of Araraquara, São Paulo State, Brazil, sugar cane burning has

been associated with increased emergency room visits for inhalatory therapy (Arbex et al.,

2000; Arbex et al., 2007) as well as with hospital admissions due to respiratory diseases in

children and in the elderly (Cançado et al., 2006). Air quality in the cities located in the sugar

cane area of the State of São Paulo deteriorates dramatically during the burning season, the

levels of ambient particles more than doubling during harvesting (Cançado et al., 2006; Arbex

et al., 2007). In contrast to forest fires accidents, usually brief events with extremely high

concentrations of particulate matter, populations in areas surrounded by sugar cane

plantations are exposed to particles generated by continuous biomass burning for at least 6

months a year (Arbex et al., 2007).

Further works on the consequences of biomass-derived particles are necessary.

Annually, 7,500–8,600 Tg of dry material is emitted to the atmosphere around the world by

the process of burning (Cançado et al., 2006) and this problem is expected to worsen even

further, either because of fires facilitated by ongoing climate changes or due to the increasing

interest in biofuel production in areas, like Brazil, that still burn sugar cane plantations before

harvesting (Arbex et al., 2000). In this study, we aimed to further explore in an animal model

the toxicity of particles produced by sugar cane burning. Low doses of particles (total

suspended particles, TSP) collected during periods of sugar cane burning were administered

by a single nasal instillation to mice, and acute changes in lung mechanics and histology were

evaluated. The findings were compared with equivalent mass of traffic-derived particles. Our

results indicate that biomass derived particles were at least as toxic as those produced by

traffic.

2. Materials and methods

2.1. Animal preparation

Twenty-nine female BALB/c mice (25-30 g) were randomly divided into 3 groups. In

the control group (C), animals received a single intranasal instillation (i.n.) of 15 µL of sterile

distilled water. SP and Bio groups received 15 µg of particle mass in 15 µL of sterile distilled

water i.n. from either an urban area (traffic-derived source) or from sugar cane burning origin,

respectively. All animals were analyzed 24 hours after instillation. For intranasal instillation

mice were anesthetized with sevoflurane, and sterile distilled water or suspended particles

were gently instilled in their snouts with the aid of a precision pipette. The animals recovered

rapidly after instillation.

2.2. Particle sampling

Total suspended particles were sampled with fiber glass filters, using a medium

volume sampler, which operated at a flow rate of 200 liters/minute (Handy-Vol, Energética,

Rio de Janeiro, Brazil). Traffic-derived particles were collected in São Paulo, Brazil, at the

gardens of the São Paulo Medical School, which is located in downtown at the intersection of

two busy streets. In this location, receptor modeling has reported that 89% of fine particles are

emitted by traffic (Cetesb, 2006). Biomass-derived particles were sampled in the urban area of

Araraquara, Brazil, in days of sugar cane burning. In São Paulo, particles could be considered

as predominantly generated by traffic, whereas biomass burning is the major source of

particles in sugar cane producing areas during the crop-burning periods (Lara et al., 2001).

Filters were weighed before and after a 24 h period of sampling and the difference in

weight yielded particle mass. Temperature and relative humidity were 24.5

C and 71.22%,

respectively, in São Paulo (Feb 7, 2006) and 24.6

C and 43% in Araraquara (Aug 22, 2003)

during collection. Particles were extracted in distilled water by ultrasonication in a water bath

during approximately 8 h. A suspension of 15 µg of either biomass or traffic-derived particles

in 15 µL of distilled water was instilled in each animal.

2.3. Particle analysis

The atmospheric suspended particles were digested in a HNO

-HClO

mixture and

after dissolution were brought to a final volume of 15 mL of HCl 0.1M. The extract was

analyzed by flame atomic absorption spectroscopy (VARIAN AA1475, Varian, Inc., Palo

Alto, CA, USA) following recommended standard operating procedures (Varian, 1981) and

previous reports of our group (Trindade et al., 1981; Azcue et al., 1988). Cadmium (Cd),

Chromium (Cr), Cooper (Cu), Iron (Fe), Manganese (Mn), Nickel (Ni), Zinc (Zn) and Lead

(Pb) were measured and the results expressed as µg.g

-1

of particles. The results were far above

the detection limits (ng.mL

-1

) of the tests: Cd (2.4), Cr (7.3), Cu (3), Fe (5), Mn (3), Ni (22)

and Zn (1.4) calculated as previously reported (Slavin et al., 1972).

For polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) extraction, 2 g of particles were

extracted consecutively with 12 mL of an acetone/n-hexane mixture (4/1: 1/1 and 1/4; v/v)

using an ultrasonic bath set at 90

C for 20 minutes. One milliliter of isooctane was added

prior to each PAH extraction step. The extracts were filtered and combined in a glass flask.

The combined extracts were concentrated to 1 mL by vacuum rotatory evaporation. All

solvents used in these experiments were residue-analysis quality; reagents were supplied by

Tedia Co. (Fairfield, OH, USA). All glassware was rinsed three times with HPLC grade

acetone prior to analysis.

In order to avoid potential interferences such as humic materials and elemental

sulphur, the combined extracts were passed through a chromatography column filled with 7 g

of Al

/Na

deactivated with

11% of water (Japenga et al., 1987; Torres et al., 1999).

Twenty milliliters of n-hexane were used to elute PAHs from the cleanup column. The

cleaned extracts were concentrated to 1 mL by vacuum rotary evaporation and then eluted

through another chromatography column filled with silica gel 60 (70-230 mesh ASTM) with

35 mL of n-hexane/ethyl ether (3:1; v/v). The eluents were concentrated by vacuum rotary

evaporation until dry and then diluted with 0.5 mL of acetonitrile.

An aliquot of 20 µL of the acetonitrile extract was analyzed using a high performance

liquid chromatograph (LC-10AS, Shimadzu Co., Kyoto, Japan) equipped with a fluorescence

detector (RF-10 AxL, Shimadzu Co., Kyoto, Japan). The separation was performed on a

Shimadzu CLC-ODS II column (180.0 x 4.1 mm i.d.), with 5 µm of particle size and pores of

120 Å. The isocratic run was completed with a mobile phase composed of water:acetonitrile

mixture (20:80; v/v). The detector was programmed with eight Ex/Em wavelength steps:

255/325; 253/350; 333/390; 287/462; 280/430; 294/404 300/500 and 300/421. The following

PAHs were analyzed: naphthalene, fluorene, anthracene, pyrene, benz[a]anthracene,

benzo[b]fluoranthene, benzo[k]fluoranthene, benzo[a]pyrene (B[a]P). The PAHs detection

limits in particulate extracts were calculated as being three times the standard deviation of the

blank concentrations. The detection limits ranged from 0.01 ng.g

-1

and 0.47 ng.g

-1

for the

other PAH compounds.

The PAHs standard reference material was obtained from the National Institute of

Standards and Technology (NIST, Gaithersburg, MD, USA) (No. 1647c). PAHs recovery was

evaluated using reference material of marine sediment provided by the Institute for

Environmental Studies (IVM, Amsterdam, The Netherlands). The mean PAHs recovery

ranged from 65.3 to 87.2% and the coefficients of variation were below 15%.

A segment of the fiber glass filter was analyzed by scanning electron microscopy. Ten

non-coincident microscopic fields were photographed and the diameter distribution of 1022

particles sampled in Araraquara and 1746 particles collected in São Paulo was determined by

computer-aided image analysis.

2.4. Pulmonary mechanics

Twenty-four hours after distilled water or particle administration the animals were

sedated with diazepam (1 mg i.p.), anesthetized with pentobarbital sodium (20 mg.kg body

weight

-1

i.p.), tracheotomized, and a snugly fitting cannula (0.8 mm id) was introduced into

the trachea. The animals were then paralyzed with pancuronium bromide (0.4 mg/kg) and the

anterior chest wall was surgically removed. A pneumotachograph (1.5 mm ID, length = 4.2 cm,

distance between side ports = 2.1 cm) (Mortola and Novoraj, 1983) was connected to the tracheal

cannula for the measurements of airflow (V’). Lung volume (V

) was determined by flow signal

integration. The pressure gradient across the pneumotachograph was determined by means of a

Validyne MP45-2 differential pressure transducer (Engineering Corp, Northridge, CA, USA).

The flow resistance of the equipment (Req), tracheal cannula included, was constant up to flow

rates of 26 mL.s

-1

and amounted to 0.12 cmH

O.mL

-1

.s. Equipment resistive pressure (= Req.V’)

was subtracted from pulmonary resistive pressure so that the present results represent intrinsic

values. Transpulmonary pressure was measured with a Validyne MP-45 differential pressure

transducer (Engineering Corp, Northridge, CA, USA). All signals were conditioned and

amplified in a Beckman type R Dynograph (Schiller Park, IL, USA). Flow and pressure signals

were also passed through 8-pole Bessel filters (902LPF, Frequency Devices, Haverhill, MA,

USA) with the corner frequency set at 100 Hz, sampled at 200 Hz with a 12-bit analog-to-digital

converter (DT2801A, Data Translation, Marlboro, MA, USA), and stored on a microcomputer.

All data were collected using LABDAT software (RHT-InfoData Inc., Montreal, Quebec,

Canada).

Lung resistive (∆P1) and viscoelastic/inhomogeneous (∆P2) pressures, total pressure

drop (∆Ptot = ∆P1 + ∆P2), static elastance (Est), and elastic component of viscoelasticity (∆E)

were computed by the end-inflation occlusion method (Bates et al., 1985; Bates et al., 1988).

Briefly, after end-inspiratory occlusion, there is an initial fast drop in transpulmonary pressure

(∆P1) from the pre-occlusion value down to an inflection point (Pi) followed by a slow pressure

decay (∆P2), until a plateau is reached. This plateau corresponds to the elastic recoil pressure of

the lung (Pel). ∆P1 selectively reflects airway resistance in normal animals and humans and ∆P2

reflects stress relaxation, or viscoelastic properties of the lung, together with a small contribution

of time constant of alveoli (Bates et al., 1988; Saldiva et al., 1992). Lung static elastance (Est)

was calculated by dividing Pel by the tidal volume. ∆E was calculated as the difference between

static and dynamic elastances, and reflects the elastic component of viscoelasticity (Bates et al.,

1985; Bates et al., 1988).

2.5. Histological study

Heparin (1000 IU) was intravenously injected immediately after the determination of

pulmonary mechanics. The trachea was clamped at end-expiration, and the abdominal aorta

and vena cava were sectioned, yielding a massive hemorrhage that quickly killed the animals.

Hence, the lungs were fixed at end-expiratory lung volume by vascular perfusion with

buffered formaldehyde (10%) and removed en bloc. Then, lungs were embedded in paraffin,

and two 3-µm-thick longitudinal slides from the left lung were cut and stained with

hematoxylin-eosin.

Morphometric analysis was performed with an integrating eyepiece with a coherent

system made of a 100-point and 50 lines (known length) grid coupled to a conventional light

microscope (Axioplan, Zeiss, Oberkochen, Germany). The fraction areas of collapsed and

normal alveoli were determined by the point-counting technique at a magnification of x400

across ten random non-coincident microscopic fields per animal. Points falling on normal or

collapsed alveoli were expressed as percentage of total points of the grid (Gundersen et al.,

1988). Polymorpho (PMN) and mononuclear (MN) cells, and pulmonary tissue were

evaluated at x1000 magnification across 10 random non-coincident microscopic fields in each

animal. Points falling on PMN and MN cells were counted, and divided by the total number

of points falling on tissue area in each microscopic field (Gundersen et al., 1988).

2.6. Statistical Analysis

SigmaStat 9.0 statistical software package (SYSTAT, Point Richmond, CA, USA) was

used. The normality of the data (Kolmogorov-Smirnov test with Lilliefors’ correction) and the

homogeneity of variances (Levene median test) were tested. If both conditions were satisfied,

one-way ANOVA test followed by Tukey Test was used to assess differences among groups.

In the negative case, Kruskal-Wallis ANOVA was used followed by a Dunn’s Test.

Associations between mechanical and morphological parameters were tested by Spearman’s

correlation test. In all instances the significance level was set at 5% (p < 0.05).

3. Results

Metal composition of the analyzed particulate matters is presented in Table 1. Traffic-

derived particles showed a high concentration of Fe, followed by Zn. The same profile was

observed in biomass particles. However, the total concentration of metals was higher in the

latter particulate matter than in the traffic-generated ones.

Particulate PAH concentrations are shown in Table 2. In contrast with metal

composition, the average concentration for total PAH was lower in biomass-derived particles

than in traffic-derived ones. In the latter higher levels of pyrene, benzo[b]fluoranthene, and

especially, of benzo[a]pyrene were observed. In those produced by sugar cane burning the

concentrations of pyrene, benzo[b]fluoranthene, and benzo[k]fluoranthene were similar,

whereas benzo[a]pyrene was not detected. Figure 1 depicts the frequency distribution of

diameters of particles sampled in the two study locations. In São Paulo and Araraquara the

median particle diameters were 5.54 µm (range 0.37 to 106.7 µm), and 3.21µm (range 0.39 to

33.6 µm), respectively. We did not observe smaller particles, probably because they were

trapped deeper in the fiber glass fiber or, even, were not retained by this filtering media.

The survival rate was 100% in all groups during and after intranasal instillation.

All mechanical parameters (∆P2, ∆Ptot, ∆E and Est) increased similarly in SP and Bio

groups compared with control, excepting ∆P1, which increased only in Bio compared with C

(Figs. 2 and 3). Pulmonary mechanics did not differ between groups exposed to different

particulate matters.

Exposure to traffic- or biomass burning-derived particles increased similarly the

fraction area of alveolar collapse and polymorphonuclear (PMN) cell influx into the lung

parenchyma compared with C. On the other hand, a decrease in the mononuclear cell content

was observed in both SP and Bio groups in relation to control (Table 3 and Fig. 4).

Static elastance was positively correlated with the fraction area of alveolar collapse, all

groups included (Fig. 5). Spearman’s correlation coefficient equaled 0.670 and p = 0.002.

4. Discussion

In the present study we showed that a single intranasal instillation of a low dose of

total suspended particles from both urban and sugar cane burning areas elicited a significant

increase in alveolar collapse and influx of polymorphonuclear cells in lung parenchyma,

accompanied by an increase in mechanical parameters.

We administered a low dose of particles to our animals, aiming to avoid the effects of

particle overload, an event that, per se, may induce a non-specific inflammatory reaction. In

addition, low dosage reflects more precisely the adverse pulmonary consequences of ambient

particle concentrations. In Araraquara, average TSP levels increase to about 60 µg/m

during

the burning season (Arbex et al., 2007), while annual mean of TSP in São Paulo approximates

120 µg/m

(Cetesb, 2006). Thus, the accumulated 24-hour dose of TSP received by a mouse

at this ambient concentration is about 2 µg in Araraquara and 4 µg in São Paulo, considering

that a mouse inspires 0.03 m

of air in 24 hours. Knowing that only a fraction of the TSP

administered by nasal instillation reaches the alveolar region, we assumed that the dose used

in this study is environmentally relevant. Experimental studies on air pollution frequently use

high doses of particles, and, hence, a low dose allowed the observation of the pulmonary

effects induced by levels of particles usually observed in the real world.

Our results support the concept that ambient particles induce acute respiratory

inflammation, as characterized by changes in pulmonary mechanics and lung histology. We

focused our measurements on the acute response elicited by particle exposure, allowing 24

hours for the development of the inflammatory reaction. In addition, time series studies

(Braga et al., 2001; Braga et al., 2002), including those focusing on sugar cane derived

biomass (Cançado et al., 2006; Arbex et al., 2000 and 2007), indicate that a 24 hour lag

occurs between exposure and respiratory adverse effects.

By evaluating the relative toxicity of particles collected in areas with different sources

– traffic and sugar cane burning – we aimed to address the potential health risks of biomass

burning, as well as trying to address a critical issue of particle research: the role of particle

composition in determining their toxicity. The identification of the relative toxicity of particle

constituents is crucial for better understanding the pathogenesis of particle-induced injury, as

well as to establish emission control policies aiming to preserve public health. Indeed, as

depicted in Tables 1 and 2, particle composition differs in the two sampling sites. As a general

rule, particles produced by traffic presented a higher content of PAHs than those generated by

sugar cane burning, whereas the latter showed higher relative metal content than those

produced by traffic. It is important to note that the two samples tested in the present study

were collected from ambient air. Thus, it is not possible to exclude the contribution of other

sources to particle composition. Receptor models with chemical mass balance made on

particles collected at the same site of the present study indicate that approximately 89% of

fine particles are derived from traffic (Cetesb, 2006), while a previous study (Lara et al.,

2001) showed that burning is the major source of particles in sugar cane producing areas

during the crop-burning periods. The aforementioned data support the assumption that

particles collected in São Paulo and Araraquara (during the sugar cane harvesting) are

generated, predominantly, by traffic and biomass burning, respectively.

Respiratory mechanical parameters were measured by the end-inflation occlusion

method. This method allows the identification of elastic, resistive, and viscoelastic and/or

inhomogeneous lung mechanical components (Bates et al., 1985; Bates et al., 1988).

Viscoelastic pressure and static elastance increased similarly in SP and Bio groups (Figs. 2

and 3). However, only Bio increased resistive pressure (that reflects airway resistance) in

comparison with the control group (Fig. 3).

Our results indicate that the two types of particles induce different biological

responses in terms of airway mechanics. This observation is probably not related to

differences in distribution along the respiratory tract, since the diameter distribution of both

particles is similar (Fig. 1) and the administration route was the same in both cases. Thus,

theoretically, differences in particle composition may be an explanation for the changes in

airway response. On the other hand, parameters related to distal pulmonary parenchyma, such

as viscoelastic and elastic properties, did not disclose significant differences between traffic

and biomass particles. Coherently, both particle types promoted recruitment of PMN cells of

the same magnitude in the alveolar walls (Table 3, Fig. 4). Although the simple chemical

analyses of the particles, such as those employed in the present study, cannot lead to a direct

correlation between particle chemistry and effects, it is noteworthy that the preponderance of

either metals (biomass burning) or PAHs (traffic generated material) in particle composition

can induce similar elastic and viscoelastic pulmonary changes, while central airway resistance

was higher only in the animals exposed to biomass. The broader effect of biomass particles

reinforces the potential role of metals in determining particle toxicity (Soukup et al., 2000;

Dye et al., 2001; Molinelli et al., 2002).

According to Müller et al. (1998) surfactant secretion by type II pneumocytes is

impaired after inhalation of air pollutants. Additionally, exposure to fly ash has been reported

as modifying surfactant composition (Srivastava and Misra, 1986; Chauhan and Misra, 1991)

and rheology (Anseth et al., 2005). These effects could lead to alveolar instability and

collapse, as reported herein. Accordingly, we found a positive correlation (Spearman’s r =

0.670, p = 0.002) between lung elastance and the fraction area of alveolar collapse, as shown

in Fig.5.

The similarities in acute respiratory toxicity between traffic and biomass particles

are supported by a recent epidemiologic study conducted by our group (Cançado et al., 2006).

We found that respiratory morbidity associated with ambient levels of PM

2.5

during biomass

burning, was, at least, of the same magnitude of that observed for the same increment of

traffic or industrial sources. This finding indicates the necessity of conducting studies

focusing in greater detail on the toxicity of biomass produced particles.

In conclusion, we demonstrated that a single low dose of ambient particles produced

by traffic or sugar cane burning induced significant alterations in pulmonary mechanics and

lung histology in mice. Parenchymal changes were similar in both groups exposed to

particles, whereas airway mechanics was more affected by biomass particles. Thus, biomass

particles were at least as toxic as particles produced by traffic.

Acknowledgments

The authors are grateful to Regiani Carvalho de Oliveira for conducting particle size

measurements, Marcos Abdo Arbex, for providing the particle samples, and Joao Luiz Coelho

Rosas Alves and Antonio Carlos de Souza Quaresma for their skillful technical assistance.

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Missoula.

FIGURE LEGENDS

Fig 1. Frequency distribution of particle diameter in total suspended particles sampled in

Araraquara (biomass) and São Paulo (traffic).

Fig 2. Lung static elastance (Est) and elastic component of viscoelasticity (∆E) in mice

intranasally instilled with sterile distilled water (C) or 15 µg of traffic-derived total suspended

particles (SP) or biomass burning-derived particles (Bio). Measurements were performed 24

hours after exposure. Box plot of 9-11 animals in each group (10-15 determinations per

animal). Boxes show interquartile (25-75%) range, whiskers encompass range, and horizontal

lines represent median values. *Values significantly different from C (p<0.05).

Fig 3. Pressures spent against resistive components of lung mechanics in mice intranasally

instilled with sterile distilled water (C) or 15 µg of traffic-derived total suspended particles

(SP) or biomass burning-derived particles (Bio). ∆Ptot: total pressure variation, ∆P1 and ∆P2:

pressure spent to overcome resistive and viscoelastic/inhomogeneous mechanical

components, respectively. Measurements were performed 24 hours after exposure. Box plot

of 9-11 animals in each group (10-15 determinations per animal). Boxes show interquartile

(25-75%) range, whiskers encompass range, and horizontal lines represent median values.

*Values significantly different from C (p<0.05).

Fig 4. Photomicrografs of lung parenchyma from mice intranasally instilled with sterile

distilled water (C group, panel A) or 15 µg of traffic-derived total suspended particles (SP

group, panel B) or biomass burning-derived particles (Bio group, panel C). Samples were

obtained 24 h after instillation and stained with hematoxylin-eosin.

Fig 5. Correlation (Spearman´s) between lung static elastance (Est) and alveolar collapse in

mice intranasally instilled with sterile distilled water (C) or 15 µg of traffic-derived total

suspended particles (SP) or biomass burning-derived particles (Bio). Measurements were

performed 24 hours after exposure. r: Spearman’s correlation coefficient. p = 0.002

Table 1

Metals contained in total suspended particles collected from São Paulo (traffic source) and

Araraquara (biomass burning source).

Metals Traffic (ng.g

-1

) Biomass (ng.g

-1

)

Ni 1119 2411

Zn 4663 8571

Fe 93264 135268

Mn 3109 5143

Pb 311 429

Co 93 161

Cd 19 38

Cr 155 268

Table 2

Policyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) contained in total suspended particles collected

from São Paulo (traffic source) and Araraquara (biomass burning).

PAHs Traffic (ng.g

-1

) Biomass (ng.g

-1

)

Naphthalene - -

Fluorene - -

Anthracene 414.5 -

Pyrene 829.0 357.1

Benzo[a]anthracene 621.8 -

Benzo[b]fluoranthene 829.0 357.1

Benzo[k]fluoranthene 621.8 357.1

Benzo[a]pyrene 1450.8 -

Total PAHs 4766.8 1071.4

Table 3

Morphometrical parameters and cellularity in lung parenchyma

Groups Normal area (%) Alveolar collapse (%) PMN (%) MN (%)

93.45 ± 1.50 6.01 ± 1.14 3.78 ± 0.51 33.68 ± 1.47

84.45 ± 2.00* 14.99 ± 2.03* 10.85 ± 0.51 * 27.65 ± 0.85 *

Bio

82.08 ± 1.61* 17.33 ± 1.65* 10.50 ± 0.76 * 27.47 ± 1.09 *

Values are mean ± SEM of 6-9 animals in each group. Data were gathered from ten random,

non-coincident fields per mouse. In C group, sterile distilled water was intranasally instilled

(15 µL). In SP and Bio groups, mice received total suspended particles (TSP) from the city of

São Paulo and TSP from a biomass burning area, respectively (15 µg). PMN: fraction area of

polymorphonuclear cells, MN: fraction area of mononuclear cells. * Values significantly

different from C (p<0.05).

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