( PDF ) Comparação de metodologias alternativas para detecção de Salmonella sp e Listeria monocytogenes em carnes e produtos cárneos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

PROGRAMA DE DOUTORADO EM CIÊNCIA DOS ALIMENTOS

COMPARAÇÃO DE METODOLOGIAS ALTERNATIVAS PARA

DETECÇÃO DE SALMONELLA SP E LISTERIA

MONOCYTOGENES EM CARNES E PRODUTOS CÁRNEOS.

DOUTORANDO

Paulo Rogério Franchin

ORIENTADORA

Prof.ª Cleide Rosana Vieira Batista, PhD

FLORIANÓPOLIS-SC

2008

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PAULO ROGÉRIO FRANCHIN

COMPARAÇÃO DE METODOLOGIAS ALTERNATIVAS PARA

DETECÇÃO DE SALMONELLA SP E LISTERIA

MONOCYTOGENES EM CARNES E PRODUTOS CÁRNEOS.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Ciência dos Alimentos do Centro de Ciências

Agrárias, Universidade Federal de Santa Catarina,

como requisito para obtenção do título de Doutor em

Ciência dos Alimentos.

Orientadora: Prof.ªCleide Rosana Vieira Batista, PhD

FLORIANÓPOLIS-SC

2008

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Excluído: Página com dados

da banca

Quebra de seção (próxima página)

Agradecimentos

A minha esposa Adriana, sempre presente e disposta, lutadora e

incentivadora;

Aos meus filhos Paula, Lucas e Daniela, a quem devo desculpas por várias

ausências;

Meu pai Pedro e mãe Tereza sempre me aconselhando e dando forças .

Aos amigos do laboratório (Giovana Lemos, Ivair Gonçalves, Cristiane

Moraes, Patrícia Dávila Moises, Vilmar Toffoli, Graziela Strider), excelentes

profissionais, pela colaboração incondicional.

Registro o estímulo me dado pela Empresa Perdigão S/A, na pessoa do Sr.

Joaquim G. Nunes, que tornou este projeto possível.

A minha orientadora, Dra. Cleide Rosana Vieira Batista que com paciência me

levou até o fim, para um novo começo.

Ao Professor Dr. Paulo J. Ogliari pela dedicação e paciência interminável.

Aos funcionários e professores do Centro de Ciências Agrárias que nunca me

faltaram.

Franchin, P. R. Comparação de metodologias alternativas para detecção de

Salmonella sp e Listeria monocytogenes em carnes e produtos cárneos. Tese

(Doutorado em Ciência dos Alimentos), Programa de Pós-graduação em

Ciência dos Alimentos, Universidade Federal de Santa Catarina.

RESUMO

Com o objetivo de validar metodologias analíticas alternativas para detecção

de Salmonella spp e Listeria monocytogenes em amostras de carcaças de frango,

carnes suínas cruas e, derivados cárneos processados naturalmente

contaminados, foram analisadas 503 amostras para detecção de Salmonella spp

e 334 amostras para detecção de L. monocytogenes.

Na análise de Salmonela spp em amostras de carnes suínas e carcaças de

frango, o método AOAC 993-07 (MSRV Acumedia), apresentou maior

sensibilidade, seguido do método PCR BAX System

, do Método AOAC 993-07

(MSRV Oxoid) e, do método de referência ISO 6579. Segundo o teste não

paramétrico de McNemar, há diferença significativa na comparação do método

AOAC 993-07 (MRSV Acumedia) e o método ISO 6579, entre o método ISO 6579

e o método BAX System

, entre o método AOAC 993-07(MRSV Oxoid) e o BAX

System

e entre os métodos AOAC 993-07 entre si. Não houve diferença

significativa entre os métodos Bax System

e AOAC 993-07 (MRSV Acumedia), e

ISO 6579 versus o método 993-07 (MRSV Oxoid).

Para a análise de L. monocytogenes em amostras de carnes cruas e produtos

processados o método BAX System

apresentou maior sensibilidade, seguido

pelo método ISO 11290-1/A1, USDA/FSIS modificado e ISO modificado. Há

diferença significativa entre os métodos ISO 11290-1/A1 e o BAX System

, ISO

modificado e o método BAX System

e entre o método USDA/FSIS modificado e o

BAX System

; Não há diferença significativa entre os métodos ISO 11290-1/A1 e

o método USDA/FSIS modificado, entre o método ISO 11290-1/A1 e o método

ISO 11290-1/A1 modificado, e, finalmente, entre os métodos ISO 11290-1/A1

modificado e USDA/FSIS modificado.

Avaliou-se também a aplicação do Teste de McNemar para a comparação de

proporções em amostras dependentes para verificar a conveniência da

substituição de um método convencional por um novo, na identificação da

presença de Salmonella spp. Resultado deste estudo mostrou que

o Teste de

McNemar nem sempre é suficiente para a tomada de decisão final do pesquisador

em amostras naturalmente contaminadas e que funções apropriadas das

proporções necessitam ser estimadas. Neste sentido, o Poder de Teste de

McNemar (1 - erro tipo II) foi aqui também estudado no capitulo 4.

.Palavras chaves: Métodos ISO, AOAC, USDA/FSIS, BAX System

, Salmonella ,

Listeria monocytogens, carnes e produtos cárneos

ABSTRACT

In order to evaluate alternative analytical methodology for Salmonella spp

and Listeria monocytogenes detection in samples from chicken carcasses, raw

pork meat and processed meat derivates naturally contaminated, 503 samples

were analyzed for Salmonella spp detection and other 334 samples for L.

monocytogenes detection.

In analysis for Salmonella spp in samples from pork meat and chicken

carcasses, the AOAC 993-07 (MSRV Acumedia) method presented higher

sensitivity, followed by the PCR BAX System

method, the AOAC 993-07 (MSRV

Oxoid) method and the reference method ISO 6579. According to the non

parametric test from Mcnemar, there is a significant difference when compared to

the AOAC 993-07 (MRSV Acumedia) and ISO 6579 methods, between ISO 6579

and BAX System

methods, between the AOAC 993-07(MRSV Oxoid) and the

BAX System

and, between AOAC 993-07 methods amongst themselves. There

isn´t a significant difference when compared the Bax System

and AOAC 993-07

(MSRV Acumedia) and between ISO 6579 and the 993-07 method (MSRV Oxoid).

For the L. monocytogenes analysis in raw meat and processed products

samples the Bax System

method presented higher sensibility, followed by the

ISO 11290-1/A1, USDA/FSIS modified and the ISO modified. There is a significant

difference between the ISO 10290-1/A1 method and the BAX System

, modified

ISO and the BAX System

and between the modified USDA/FSIS and the BAX

System

; There is no significant difference between the ISO 11290-1/A1 and the

USDA/FSIS modified methods, between the ISO 11290-1/A1 method and the

modified ISO 11290-1/A1 method, and finally between the modified ISO methods

and the modified USADA/FSIS.

The McNemar test application was also evaluated for the dependent samples

proportions comparison in order to verify the convenience of the substitution for a

conventional method for a new one, for the identification of Salmonella spp

presence. Results from this study showed that the McNemar Test is not always

sufficient for a final decision making from the researcher in naturally contaminated

samples and that appropriated functions from the proportions needed to be

estimated. This way, the McNemar test Power (1 - error type II) was here studied

in chapter 4.

Keywords: Métodos ISO, AOAC, USDA/FSIS, BAX System

, Salmonella ,

Listeria monocytogens meat and meat products, broiller carcasses

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO....................................................................................................... 1

1 OBJETIVO GERAL............................................................................................. 4

1.1 Objetivos Específicos ....................................................................................... 4

CAPÍTULO 1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................ 6

1 SALMONELLA ................................................................................................... 7

1.1 Métodos e meios para isolamento de Salmonella spp ..................................... 9

2 LISTERIA MONOCYTOGENES ....................................................................... 18

2.1. Métodos para Isolamento de Listeria monocytogenes .................................. 22

2.1.1 Reação em Cadeia da Polimerase....................................................... 25

3. TESTE DE HIPÓTESES SOBRE PROPORÇÕES EM AMOSTRAS

DEPENDENTES .................................................................................................. 28

4. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 29

CAPÍTULO 2 COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS ISO 6579, AOAC 993-

07/995-07 E O BAX SYSTEM

(DUPONT-QUALICOM) NA DETECÇÃO DE

SALMONELLA SPP EM AMOSTRAS DE CARCAÇAS DE FRANGO E CARNES

SUÍNAS, NATURALMENTE CONTAMINADAS.................................................. 39

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................. 40

2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 41

2.1 Amostras .................................................................................................... 41

2.2 Pré-enriquecimento das amostras para análise de Salmonella spp............... 42

2.3 Detecção de Salmonella spp pelo método da AOAC 993-07/995-07 (MSRV-

Semi-Sólido Rappaport-Vassiliadis Modificado – Oxoid e Acumedia).................. 42

2.4 Detecção de Salmonella spp. pelo método ISO 6579.................................... 43

2.5 Detecção de Salmonella spp pelo BAX System



. .......................................... 43

2.6 Análise estatística .......................................................................................... 44

3 RESULTADOS.................................................................................................. 48

4 DISCUSSÃO..................................................................................................... 52

5 CONCLUSÕES ................................................................................................. 57

6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 58

CAPÍTULO 3 Comparação do sistema BAX



com o método MSRV para

detecção de Salmonella spp em carcaça de frango e carnes suínas............ 61

“Comparison of the BAX System

with the MSRV method for the detection of

Salmonella in chicken carcasses and pork meat”. ......................................... 61

CAPÍTULO 4 METODOLOGIA ESTATÍSTICA PARA DETECÇÃO DE

PATÓGENOS. ..................................................................................................... 68

“STATISTICAL METHODOLOGY FOR PATHOGEN DETECTION”.................. 68

CAPÍTULO 5 COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS ISO 11290-1/A1, ISO

11290-1/A1 MODIFICADO, USDA/FSIS MODIFICADO E O BAX SYSTEM

Excluído: 1

Excluído: 4

Excluído: 6

Excluído: 7

Excluído: 9

Excluído: 18

Excluído: 22

Excluído: 25

Excluído: 28

Excluído: 29

Excluído: 39

Excluído: 40

Excluído: 41

Excluído: 42

Excluído: 43

Excluído: 44

Excluído: 48

Excluído: 52

Excluído: 57

Excluído: 58

Excluído: 61

Excluído: 68

(DUPONT-QUALICOM) NA DETECÇÃO DE LISTERIA MONOCYTOGENES EM

CARNES E PRODUTOS CÁRNEOS NATURALMENTE CONTAMINADAS...... 73

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................. 74

2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 75

2.1 Amostras ........................................................................................................ 75

2.2 Método ISO 11290-1/A1................................................................................. 75

2.3 Método ISO11290-1/A1 modificado (1) .......................................................... 76

2.4 Método PCR BAX System

segundo protocolo do fabricante........................ 77

2.5 Método USDA/FSIS modificado ..................................................................... 78

2.6 Análise estatística .......................................................................................... 78

3 RESULTADOS.................................................................................................. 85

4 DISCUSSÃO..................................................................................................... 93

4 CONCLUSÕES ................................................................................................. 98

6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................100

7 CONCLUSÕES ................................................................................................102

8 TRABALHOS FUTUROS.................................................................................104

Excluído: 73

Excluído: 74

Excluído: 75

Excluído: 76

Excluído: 77

Excluído: 78

Excluído: 85

Excluído: 93

Excluído: 98

Excluído: 100

Excluído: 102

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 2 COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS ISO 6579, AOAC 993-

07/995-07 E O BAX SYSTEM

(DUPONT-QUALICOM) NA DETECÇÃO DE

SALMONELLA SP EM AMOSTRAS DE CARCAÇAS DE FRANGO E CARNES

SUÍNAS, NATURALMENTE CONTAMINADAS.................................................. 39

Figura 1: Fluxograma para a detecção de Salmonella spp pelos métodos

ISO 6579, AOAC 993-07/995-07 e BAX System

(DuPont-Qualicom)... 46

CAPÍTULO 5 COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS ISO 11290-1/A1, ISO

11290-1/A1 MODIFICADO, USDA/FSIS MODIFICADO E O BAX SYSTEM

(DUPONT-QUALICOM) NA DETECÇÃO DE LISTERIA MONOCYTOGENES EM

CARNES E PRODUTOS CÁRNEOS NATURALMENTE CONTAMINADAS...... 73

Figura 1. Detecção de Listeria monocytogenes pelo método ISO 11290-

1/A1........................................................................................................ 80

Figura 2. Detecção de Listeria monocytogenes pelo método ISO 11290-

1/A1 Modificado. .................................................................................... 81

Figura 3. Detecção de Listeria monocytogenes pelo BAX System

....... 82

Figura 4. Detecção de Listeria monocytogenes pelo método USDA/FSIS

Modificado.............................................................................................. 83

Excluído: 39

Excluído: 46

Excluído: 73

Excluído: 80

Excluído: 81

Excluído: 82

Excluído: 83

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 2 COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS ISO 6579, AOAC 993-07/995-07

E O BAX SYSTEM

(DUPONT-QUALICOM) NA DETECÇÃO DE SALMONELLA SPP

EM AMOSTRAS DE CARCAÇAS DE FRANGO E CARNES SUÍNAS, NATURALMENTE

CONTAMINADAS. ............................................................................................................39

Tabela 1: Cálculo da concordância relativa, sensibilidade relativa e

especificidade relativa na detecção de Salmonella spp. ...................................47

Tabela 2: Detecção de Salmonella sp em carcaças de frango e carnes suinas

pelas metodologias ISO 6579, AOAC 993-07 (Oxoid) e AOAC 993-07

(Acumedia) e Bax System

................................................................................51

Tabela 3: Resultados estatísticos da detecção de Salmonella spp em amostras

de carcaças de frango e carnes suínas pelas metodologias ISO 6579, AOAC

993-07 (Oxoid), AOAC 993-07 (Acumedia) e Bax System

. .............................51

CAPÍTULO 3 Comparação do sistema BAX



com o método MSRV para detecção de

Salmonella sp em carcaça de frango e carnes suínas.................................................61

“Comparison of the BAX System

with the MSRV method for the detection of

Salmonella in chicken carcasses and pork meat”. ......................................................61

Tabela 1: Results for Salmonella sp in naturally contaminated chicken

carcasses and pork meat determined with the BAX

System

and MSRV

method”………………………………………………………………………………..64

Tabela 2: “Concordance, sensitivity, specificity, false positive rate and false

negative rate for Salmonella sp in naturally contaminated chicken carcasses

and pork meat determined with the BAX

System

and MSRV

method”…………………………………………………………………………….….64

CAPÍTULO 4 METODOLOGIA ESTATÍSTICA PARA DETECÇÃO DE PATÓGENOS. .68

“STATISTICAL METHODOLOGY FOR PATHOGEN DETECTION” ..............................68

Tabela 1 “Number (proportions) of the presence of Salmonella indicated by the

two methods in 200 samples of contaminated chicken-derived products”…….70

CAPÍTULO 5 COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS ISO 11290-1/A1, ISO 11290-1/A1

MODIFICADO, USDA/FSIS MODIFICADO E O BAX SYSTEM

(DUPONT-QUALICOM)

NA DETECÇÃO DE LISTERIA MONOCYTOGENES EM CARNES E PRODUTOS

CÁRNEOS NATURALMENTE CONTAMINADAS ...........................................................73

Tabela 1: Cálculo da concordância relativa, sensibilidade relativa e

especificidade relativa na detecção de Listeria monocytogenes. ......................84

Tabela 2: Detecção de Listeria monocytogenes pelas metodologias ISO

11290-1/A1, ISO 11290-1/A1 Modificado, USDA Modificado e BAX System

..90

Tabela 3. Resultados estatísticos da detecção de Listeria monocytogenes em

amostras de salsichas resfriadas, bacon, carcaças de frango resfriado e carnes

suínas cruas pelas metodologias ISO 11290-1/A1, ISO 11290-1/A1 Modificado,

USDA Modificado e BAX System

.....................................................................91

Tabela 4. Detecção de L. monocytogenes em amostras de salsichas resfriadas,

bacon, carcaças de frango resfriado e carnes suínas cruas pela combinação

Excluído: 39

Excluído: 47

Excluído: 51

Excluído: 61

Excluído: 68

Excluído: 73

Excluído: 84

Excluído: 90

Excluído: 91

das metodologias ISO 11290-1/A1, ISO 11290-1/A1 Modificado, USDA

Modificado e BAX System

................................................................................91

Tabela 5. Identificação de Listeria spp a partir da reação de esculina de

isolados obtidos pela metodologia ISO 11290-1/A1 e USDA/FSIS modificado.92

Excluído: 91

Excluído: 92

INTRODUÇÃO

Os consumidores esperam que os alimentos estejam livres de qualquer agente

contaminante que lhes possam causar danos a saúde, seja este contaminante

físico, químico ou biológico.

A produção e a industrialização de alimentos isentos de bactérias patogênicas

se tornam difíceis na prática, mesmo com a aplicação das Boas Práticas de

Manufatura e dos Procedimentos Padrão de Higiene Operacional nas indústrias

de alimentos, que são as bases essenciais da segurança da qualidade para

programas como APPCC (Análise dos Perigos e Pontos Críticos de Controle)

(SALLES, et al., 2002).

Também, restrições tecnológicas, mesmo em processos conduzidos dentro

das normas de higiene, possibilitam a sobrevivência de patógenos naturalmente

presentes no alimento e no ambiente. Embora nestes casos o número destes

patógenos seja pequeno, eles podem ser detectados em meios de cultivos

adequados.

Dentre os principais patógenos encontrados em diversos tipos de alimentos,

destacam-se Salmonella spp e Listeria monocytogenes, reconhecidamente

causadores de enfermidades transmitidas por alimentos.

Salmonella sp é um microrganismo amplamente difundido na natureza, sendo

o homem e animais seus principais reservatórios naturais (JAY; 2005). A

salmonelose é uma infecção de caráter agudo ou crônico, apresentando-se como

uma gastrenterite, febre entérica e septicemia (ICMSF; 1996) e muitas vezes

relacionada ao consumo de carnes cruas, principalmente de aves, ovos e

produtos derivados.

As manifestações associadas com Listeria monocytogenes incluem desde

sintomas semelhantes a um simples resfriado com febre baixa e mal estar, que

pode passar despercebido, ou evoluir para meningite, meningoencefalite,

septicemia, aborto ou parto prematuro. Idosos, recém-nascidos, gestantes e

indivíduos imunocomprometidos são mais susceptíveis a doenças causadas por

Listeria monocytogenes (McLAUCHLIN; 1997).

Listeria monocytogenes está distribuída amplamente no ambiente; se encontra

em solos, água, águas residuais e vegetação em decomposição. É comum no

intestino de humanos e animais domésticos, produtos agrícolas frescos e meio

ambiente da área de processamento na indústria (TOMPKIN et al., 2001). Esta

bactéria têm sido isoladas de diferentes alimentos, tais como leite cru e

pasteurizado, queijo, carne bovina, suína, de aves, peixes, embutidos, carne

moída de diferentes animais, produtos cárneos crus e termoprocessados, além de

produtos de origem vegetal, de origem marinha, e refeições preparadas. Estes

isolamentos têm sido realizados em vários países, incluindo o Brasil (FRANCO &

LANDGRAF; 2003).

Listeria é uma bactéria capaz de se desenvolver lentamente em temperaturas

de refrigeração, mas é sensível a baixos valores de pH de alimentos ácidos

(iogurte e algumas frutas) e ao calor, sendo facilmente destruída pelo cozimento

convencional. Pelo fato de se encontrar em qualquer ambiente frio e úmido, pisos

molhados e outras superfícies freqüentemente apresentam uma alta população de

espécies de Listeria spp. Devido ao seu alto poder de difusão, o microrganismo é

constantemente reintroduzido ao meio ambiente da área de processamento na

indústria. Os esforços excessivos para controlar Listeria monocytogenes podem

reduzir o nível de contaminação, mas não se pode, com as tecnologias atuais,

erradicar esse microrganismo da área de processamento na indústria, nem

eliminar completamente o potencial de contaminação dos produtos terminados

(TOMPKIN et al., 2001).

A necessidade dos produtores de alimentos em melhorar cada vez mais a

performance de qualidade e diminuir cada vez mais a ocorrência de patógenos

presentes em alimentos, faz com que também haja a necessidade paralela de

melhoria tecnológica quanto à detecção de patógenos em alimentos,

particularmente métodos automatizados e mais rápidos.

Atualmente, os métodos analíticos para análise de Salmonella spp (método

ISO - International Standards Organization - 6579) e Listeria monocytogenes

(ISO 11290-

1/A1 e Unit States Department of Agriculture/Food Safety and

Inspection Services (USDA/FSIS) 3º edição,1998) demandam tempo e trabalho

para chegar ao diagnóstico final da análise, devido aos vários passos de

transferência de inóculos, após incubação, necessários para a execução dos

métodos mencionados.

O tempo transcorrido entre o início e fim da análise microbiológica cria uma

necessidade de estocagem da produção (necessidades de frio, espaço físico,

estruturas mais inchadas de logística de distribuição, etc) até que se tenha o

resultado da análise para que se possa deliberar sobre o destino da produção

diária dos alimentos. Deriva deste fato custos adicionais de produção, que recaem

para o consumidor.

Quanto maior for o tempo da análise, maior será o tempo para a tomada de

ações corretivas e preventivas em casos de desvios de qualidade do processo,

quando monitorados por análises microbiológicas.

Por estas razões, a busca de novos métodos analíticos e adaptações

criteriosas dos métodos já existentes que possam reduzir o tempo para o

resultado final, desde que comprovada sua eficácia, levam a uma rápida resposta

para a solução de possíveis problemas de ordem microbiológica durante a

produção de alimentos no nível industrial, o quê, por consequência, leva a uma

garantia de qualidade maior para o consumidor, além da possibilidade de

diminuição de custos pela diminuição de estruturas físicas e outros recursos

necessários para estocagem da produção.

Necessário também é manter o controle da prevalência de determinados

patógenos, como Salmonella spp e Listeria monocytogenes, e na mudança de

um método mais produtivo que outro, este fator possa ser levado em

consideração não como um defeito de processo, mas sabidamente devido a

eficácia da metodologia usada na pesquisa. A Norma ISO 16140:2003(E)

preconiza que se façam 60 amostras por tipo de alimentos para validação de um

método alternativo usando o teste de McNemar para determinar significância ou

não entre os métodos testados. Introduzimos aqui o conceito do erro tipo II –

Poder do Teste de McNemar - para avaliação da validação de metodologias, pois

pode-se aceitar, por exemplo, que um teste novo seja aceito mesmo com

diferença significativa no teste de McNemar, desde que o percentual de

discordantes no teste não seja maior do que o estabelecido pelo pesquisador, o

que pode perfeitamente acontecer quando o número de amostras testadas é

“grande” (OGLIARI et al., 2007).

1 OBJETIVO GERAL

Comparar o desempenho entre os diferentes métodos analíticos, AOAC -

Association of Official Analytical Chemists - 993-07/995-07, ISO 6579 e BAX

System

(DuPont-Qualicom) na detecção de Salmonella spp e entre os métodos

ISO 11290-1/A1, ISO 11290-1/A1 modificado, USDA/FSIS modificado e o BAX

System

(DuPont-Qualicom) na detecção de Listeria monocytogenes em carnes e

produtos cárneos naturalmente contaminados.

1.1 Objetivos Específicos

1.1.1 Comparar o desempenho entre os métodos ISO 6579, AOAC 993-07/995-07

(avaliando-se o MSRV - Agar Semi-sólido Rappaport-Vassiliadis

Modificado da marca Oxoid e da marca Acumedia) e o BAX System

(DuPont-Qualicom), na detecção de Salmonella spp em amostras de

carcaças de frango e carnes suínas, naturalmente contaminadas, conforme

descrito abaixo:

a) Método ISO 6579 com o BAX System

;

b) Método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido Rappaport-Vassiliadis Modificado

- Oxoid) com o BAX System

;

c) Método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido Rappaport-Vassiliadis Modificado

- Acumedia) com o BAX System

;

d) Método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido Rappaport-Vassiliadis Modificado

- Acumedia) com o Método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido Rappaport-

Vassiliadis Modificado - Oxoid)

e) Método ISO 6579 e o método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido Rappaport-

Vassiliadis Modificado - Oxoid);

f) Método ISO 6579 com o método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido

Rappaport-Vassiliadis Modificado - Acumedia);

1.1.2 Comparar o desempenho entre os métodos ISO 11290-1/A1, ISO 11290-

1/A1 modificado (substituição do Caldo Fraser por Caldo MOPS-BLEB),

USDA/FSIS modificado (substituição do Ágar Oxford por Agar ALOA) e o

BAX System

(DuPont-Qualicom); na detecção de Listeria monocytogenes

em salsichas, bacon fatiado, carcaças de frango e cortes de carne suína

naturalmente contaminada, conforme descrito abaixo:

a) Método ISO 11290-1/A1 com o BAX System

;

b) Método ISO 11290-1/A1 modificado com o BAX System

;

c) Método ISO 11290-1/A1 com o método ISO 11290-1/A1 modificado;

d) Método USDA/FSIS modificado com o BAX System

;

e) Método USDA/FSIS modificado com o método ISO 11290-1/A1;

f) Método USDA/FSIS modificado com o método ISO 11290-1/A1

modificado.

g) Avaliar a concordância de amostras com reação de esculina positiva ou

negativa com o sucesso no isolamento de Listeria spp.

1.1.3 Avaliar a aplicação do Teste de McNemar para a comparação de

proporções em amostras dependentes para verificar a conveniência da

substituição de um método convencional por um novo, na identificação da

presença de Salmonella spp, introduzindo o cálculo do Poder do Teste de

McNemar segundo Ogliari et al., (2007) na avaliação do desempenho de novos

métodos analíticos.

CAPÍTULO 1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1 SALMONELLA

Salmonela é uma das principais bactérias envolvidas em surtos de doenças de

origem alimentar como febre tifóide, febre entérica e enterocolites, sendo

amplamente disseminada e apresentando grande impacto na saúde e economia

mundial, tendo o homem e animais como seu principal reservatório (JAY; 2005).

Este gênero pertence à família Enterobacteriaceae e é caracterizado por um

grupo de bacilos mesófilos, gram-negativos, não produtores de esporos,

anaeróbio facultativo e na sua grande maioria produtores de gás a partir da

glicose. São conhecidos 2.324 sorotipos de salmonela que são classificados de

acordo com sua composição antigênica: antígenos somáticos (O), flagelares (H) e

capsulares (Vi) (id, ibid). A classificação e a nomenclatura de salmonela sofreu

várias modificações nos últimos anos e, atualmente, estão colocadas em duas

espécies, S. enterica e S. bongori, com mais ou menos 2.000 sorotipos, sendo

divididos em 5 subespécies ou grupos, a maioria dos quais esta classificada na

chave da espécie tipo, S. enterica, que compreende as seguintes subespécies:

grupo II (S. enterica subsp. salamae); grupo IIIa (S. enterica subsp. arizonae);

grupo IIIb (S.enterica subsp. diarizonae); grupo IV (S. enterica subsp. houtenae);

e o grupo VI (S. enterica subsp. Indica)

( JAY; 2005). Os bacilos são normalmente

móveis através de flagelos peritríquios, ainda que se possam observar mutantes

imóveis, e o sorotipo Pullorum-Gallinarum é sempre imóvel (FRANCO &

LANDGRAF; 2003).

O principal habitat de salmonela é o trato intestinal de animais tais como, aves,

particularmente perus e galinhas, sendo muito comum também em suínos,

bovinos e eqüinos. Carnes cruas e mal cozidas, leite cru, ovos e seus respectivos

derivados, são veículos freqüentes do microrganismo, sendo freqüentes também

as contaminações cruzadas de matérias primas e alimentos processados, tanto

de origem animal como vegetal (GARRICK & SMITH; 1994).

Atualmente, Salmonella spp é um dos microrganismos mais freqüentemente

envolvidos em surtos de doença de origem alimentar em diversos países. A

preocupação com a ubiqüidade de Salmonella spp, e com os efeitos decorrentes

de sua veiculação pelos alimentos tem extensão internacional. As tentativas

visando o seu controle têm mobilizado os órgãos responsáveis pela saúde pública

com ponderáveis repercussões de ordem econômica, resultantes de medidas

acauteladoras impostas à indústria e ao comércio local e internacional (PARDI et

al., 1995). O crescente comércio internacional de animais e rações favorece a

distribuição da salmonelose (BARROS et al., 2002).

A maioria de surtos de salmonelose ocorre, tipicamente, em banquetes ou no

serviço de refeições coletivas. Nos Estados Unidos, foram registrados 11.834

casos de salmonelose no ano de 2008 (CDC, 2008), enquanto na Comunidade

Européia, um total de 170.497 casos de salmonelose humanas foi registrado em

2005 (The European Food Safety Autority - EFSA Journal, 2008).

O hábito de consumo de brotos de sementes, por pessoas que procuram

buscar energia e vitalidade pela alimentação saudável, transformou-se numa

indústria rentável, porém vem ocasionando surtos com bactérias patogenicas

como Salmonella spp. Foram relatados 1.917 casos confirmados de salmonelose,

associados ao consumo de brotos e sementes de alfafa e mostarda, e

identificação de vários sorovares em países como o Reino Unido, Estados

Unidos, Suécia, Irlanda, Canadá, entre os anos de 1988 e 1998 (BARROS et al.,

2002).

As principais causas que levam ao aumento da salmonelose veiculada por

alimentos são: aumento de elaboração de produtos em forma de massa, que

favorece a disseminação de Salmonella spp; os procedimentos inadequados de

armazenamento, que devido às atuais condições de vida são acumulados em

excesso; o costume cada vez mais freqüente de comer produtos crus ou

insuficientemente aquecidos; o aumento do comércio internacional; a diminuição

de resistência às infecções, devido ao aumento dos níveis de higiene pessoal

(JAY, 2005).

Jay (2005) cita ainda, a ocorrência de dois maiores surtos de salmonelose

registrados nos EUA, que aconteceram em circunstâncias incomuns. O maior

ocorreu em 1994 acometendo mais de 224.000 pessoas, devido à S. Enteritidis,

atingindo 41 estados. O veículo foi sorvete produzido de leite que fora

transportado em um caminhão-tanque, que anteriormente havia transportado ovo

líquido. O segundo grande surto ocorreu em 1.985 e envolveu cerca de 200.000

pessoas, devido à S. Typhimurium, proveniente de leite semidesnatado.

Inúmeros surtos de toxinfecção alimentar causado por Salmonella spp são

conhecidos, envolvendo os mais variados tipos de alimentos. Verifica-se, no

entanto, que a carne de aves e outros tipos de carne são mais freqüentemente

envolvidos. Salmonelose associada a lacticínios, é causada por leites crus ou

pasteurizado inadequadamente e também por queijo. Quanto a produtos

derivados de ovos, os mais freqüentemente envolvidos em surtos são as saladas

à base de ovos, sorvetes e outras sobremesas de fabricação caseira (FRANCO &

LANDGRAF; 2003).

Alves et al., (2001) relataram um surto ocorrido em São Luiz no Maranhão,

Brasil, onde algumas pessoas que participaram de um jantar, apresentaram

quadro clínico de diarréia, mal estar, cólicas e febre, sugestivos de salmonelose.

Após análise microbiológica, identificou-se o sorotipo de Salmonella Enteritidis.

1.1 Métodos e meios para isolamento de Salmonella spp

A detecção de Salmonella spp em alimetos é um trabalho que pode levar de 4

a 7 dias quando a análise é realizada pela metodologia tradicional ISO 6579,

sendo necessários 3 a 4 dias para obtenção de resultado negativo confirmatório

neste método (BENNETT et al., 1998). Para a indústria de alimentos, que retêm

seus produtos até a obtenção dos resultados analíticos frente a um patógeno

qualquer pesquisado , este tempo pode significar perdas econômicas, o que leva

o analista a buscar alternativas analíticas mais rápidas.

Em microbiologia de alimentos, a presença de um único organismo patogênico

é considerada significante,”considerando a dose infectante do agente”. Portanto,

métodos e meios devem ser sensíveis o suficiente para detectar um número

extremamente reduzido de células (TIEJEN & FUNG; 1995).

Procedimentos padrões para isolamento de Salmonella spp são especificados

por organismos internacionais, como ISO (International Standards Organization),

APHA (American Public Health Association), AOAC (Association of Official

Analytical Chemists), IDF (International Dairy Federation), BSI (British Standards )

geralmente após realização de estudos colaborativos. Contudo, não existe uma

única metodologia que possa ser aplicada para todos os tipos de alimentos (id,

ibid).

A técnica mais utilizada para detecção de Salmonella spp em alimentos é o

método recomendado pela APHA. É um método de cultura clássico dividido em

várias etapas de subcultura que, salvo algumas variações na seleção dos meios e

preparo das amostras, pode ser aplicado a qualquer tipo de alimento (SILVA &

EIROA; 1993).

Os métodos tradicionais de detecção de Salmonella spp em alimentos

envolvem cinco etapas seqüênciais: a) o pré-enriquecimento em caldo não

seletivo para restaurar células injuriadas a uma condição fisiológica estável; b)

enriquecimento seletivo, no qual a amostra é novamente colocada em caldo de

cultivo contendo reagentes inibitórios que permite a multiplicação de Salmonella

spp, enquanto restringe a proliferação da maioria das outras bactérias; c)

semeadura em meios sólidos seletivos que restringem a multiplicação de outras

bactérias que não Salmonellae; d) testes bioquímicos, que fornecem dados

fenotípicos da cultura isolada; e) sorotipagem para caracterização antigênica, que

é o passo definitivo e provê a identificação especifica da cultura isolada (BAILEY,

et al., 1991).

Vários métodos têm sido propostos nesses últimos anos, destacando-se os

imunoensaios enzimáticos (FLOWERS, et al., 1988; CURIALE, et al., 1990),

métodos de hibridização DNA-DNA (FITTS, et al., 1983; CHAN, et al., 1990), 1-2

teste de motilidade (OGGEL, et al., 1990) e os métodos de detecção por

motilidade em meios líquidos ou semi-sólidos (CHAU & HUANG; 1976; DE

SMEDT, et al., 1986; HOLBROOK, et al., 1989).

O Ágar semi-sólido Rappaport-Vassiliadis Modificado (MSRV) é derivado de

melhorias efetuadas ao longo do tempo no Caldo Rappaport. Segundo o Manual

Difco, (1998) o caldo de Rappaport segundo Rappaport, Konforti, Navon (1956),

incubado a 35

C, é baseado na habilidade de Salmonella spp em sobreviver em

um meio de cultura de pressão osmótica relativamente elevada, capacidade de

multiplicação em pH reduzido (5,2) e maior resistência ao verde malaquita, em

conjunto com uma menor demanda nutricional. Algumas modificações foram

introduzidas por Vassiliadis et al., (1976) no caldo Rappaport, como a redução na

concentração de verde malaquita, o aumento na temperatura de incubação de

C para 43

C e a sua utilização após uma etapa de pré-enriquecimento. Esta

modificação foi denominada meio de Rappaport-Vassiliadis que apresenta uma

maior atividade inibitória sobre a microbiota competidora do que a fórmula original

(XIROUCHAKI, et al., 1982; VASSILIADIS, 1983).

Em estudo realizado por Van Schothorst e Renaud (1983), o caldo Rappaport-

Vassiliadis (RV) permitiu o isolamento de salmonela em 42 amostras ambientais,

enquanto o caldo tetrationato verde brilhante e o caldo selenito-cistina detectaram

apenas 60% e 29% dessas cepas, respectivamente. Kalapothaki et al., (1983)

também relataram a superioridade do caldo Rappaport-Vassiliadis em relação ao

caldo tetrationato verde brilhante no isolamento de Salmonella spp a partir de

amostras de carnes.

O princípio dos meios semi-sólidos está na obtenção de uma maior

especificidade e facilidade de isolamento das cepas de Salmonella spp porque

estão combinados em um único meio de enriquecimento, o crescimento seletivo e

a capacidade de produzir flagelos, característica da maioria das cepas de

salmonela.

Busse, M. (1995), em uma revisão bibliográfica sobre meios de enriquecimento

seletivo, concentra sua pesquisa bibliográfica no caldo RV e na sua evolução na

forma do MSRV:

“Enriquecimento por motilidade é uma técnica antiga (CRAIGIE,

1931). Originalmente ele foi concebido em tubos em U, onde num lado

era inoculado e após incubação as bactérias móveis poderiam ser

isoladas no outro lado. Stuart e Pivnick em 1965 tentaram isolar

Salmonella de fezes usando esta técnica”.

Stuart e Pivnick (1965) estudaram o caldo selenito com 1,2% de ágar, o caldo

Rappaport com 0,6% de ágar e o meio modificado de Rappaport adicionado de

verde brilhante substituindo o verde malaquita. Os melhores resultados foram

obtidos com o meio de Rappaport adicionado de verde brilhante e foi observado

que o uso deste meio seguido de isolamento em Ágar EMB (Ágar eosina Azul de

Metileno), geralmente, resultava em uma colônia pura de Salmonella spp.

Outros autores que usaram o procedimento do tubo em “U” foram Banwart

(1968), Harper & Shortrige (1969) e Fung & Kraft (1970). Chau & Huang (1974;

1976) que tentaram aperfeiçoar o método testando o efeito do pH, força iônica e a

ação do trifenilmetano na motilidade de enterobactérias. Em 1974, Chau & Huang

desenvolveram um meio de enriquecimento seletivo semi-sólido para tubo em ”U“,

para a pesquisa de Salmonella spp a partir de amostras fecais. Foi considerado

um meio de cultura eficaz e simples, mas sua seletividade não era alta, porque

permitia o desenvolvimento e migração de outras espécies bacterianas como

Citrobacter freundii e Enterobacter cloacae. Este efeito na seletividade foi

minimizado quando, em 1976, Chau e Huang introduziram na composição do

meio, verde malaquita, cloreto de magnésio e novobiocina (20µg/ml). Com o

material coletado na área de migração realizavam testes sorológicos para

antígenos “H“ (BUSSE, M., 1995).

Apesar dos meios semi-sólidos nos tubos em “U” permitirem o isolamento de

um grande número de cepas de salmonela, esses tubos apresentavam

desvantagens como a necessidade de manuseio adequado, maior espaço para

incubação e a limitação do seu uso devido ao formato peculiar (PERALES &

AUDICANA, 1989).

Uma modificação do método foi introduzida por Goossens et al., (1984) que

trocaram os tubos em “U” por placas de Petri. Eles usaram o meio de Rappaport

modificado (Modified Semisolid Rappaport - MSR) contendo 3,2 g de ágar, 65 mg

de verde malaquita oxalato e 17,25 g de MgCl

por litro. Os nutrientes foram

reduzidos para 60% da formulação do Rappaport. Em trabalhos comparativos, o

uso deste meio, incubado por 18 horas sob temperatura de 37

C, aumentou em

22,3% a sensibilidade (detecção de amostras positivas) comparada ao método

cultural tradicional (DE SMEDT et al., 1986).

Perales e Audicana (1989) avaliaram o efeito da temperatura de incubação na

eficiência do meio MSR para a detecção de salmonela a partir de 104 amostras

de produtos cárneos. O microrganismo estava presente em 41 amostras, das

quais o meio SR (Semi-sólido Rappaport) incubado a 35°C permitiu detectar

90,2%, o BGA (Brilliant Green Agar), 63,4%, o meio SR incubado a 43

C, 58,5% e

o BSA (Bismuth Sulfite Agar), 46,3%. O meio SR incubado a 43°C foi 100%

específico, seguido pelo SR a 35°C (72,6%), o BSA (36,6%) e o BGA (25,1%). O

meio SR incubado a 35°C forneceu a melhor combinação sensibilidade-

especificidade. Apesar da incubação do meio SR a 43°C ter aumentado a

especificidade do meio de 72,6% para 100%, houve uma perda considerável de

sua sensibilidade.

Um meio similar foi proposto por De Smedt et al., (1986) contendo 2,7 g de

ágar, 37 mg de verde malaquita oxalato e 23,3 g MgCl

. O conteúdo de nutrientes

também foi reduzido. Como uma modificação do RV, o ágar foi chamado MSRV

(modified semisolid Rappaport-Vassiliadis). O mais seletivo, MSR, é incubado a

35-37ºC, enquanto para o MSVR foi proposto 43ºC (reduzido para 42ºC, Baird et

al., 1989). Como toda a família Rappaport, este meio não contem açúcares.

Esta modificação de De Smedt (De Smedt et al., (1986) tornou o meio mais

hipertônico. Foi observado que concentrações mais elevadas de ágar resultavam

em zonas de migração muito reduzidas e concentrações menores, apesar de

proporcionar uma detecção mais rápida, tornava o meio instável e frágil durante o

manuseio das placas de Petri. A concentração de cloreto de magnésio de 2,33%

e incubação a 42ºC foram suficientes para a inibição de Enterobacter cloacae e

Citrobacter diversus. A redução da concentração de ágar de 0,29 % para 0,27%

aumentava a zona de migração, bem como o uso de 0,92% de triptose ao invés

de triptona, resultava na formação de zonas de migração maiores (BUSSE, M.,

1995). Estes fatores, combinados com uma temperatura de incubação de 42°C,

permitiram condições adequadas para a multiplicação e consequente migração

das cepas de salmonela (DE SMEDT et al., 1986). A adição de novobiocina

também é inibitória para Enterobacter cloacae e Citrobacter freundii (DE SMEDT

et al, 1986; CHAU & HUANG, 1976). Desta forma a eficiência desse meio é

decorrente da habilidade de Salmonella spp em migrar através do meio altamente

seletivo que é conferido pela presença de oxalato de verde malaquita, cloreto de

magnésio, novobiocina, temperatura de incubação a 42ºC (O’DONOGUE et al.,

1992) e pH reduzido, o que minimiza a migração da maioria das

Enterobacteriaceae móveis, exceto espécies de Salmonella spp.

De Smedt & Bolderdjik (1987) demonstraram que um pequeno número de

células (60 UFC/mL) podiam ser recuperadas, mesmo que o número de bactérias

competidoras estivessem na ordem de 10

. Segundo estes autores, o isolamento

pelo método tradicional, utilizando o caldo TBG (Tetrationato Verde Brilhante),

depende do número de competidores, enquanto que o isolamento no meio MSRV

independe do alto número de microrganismos competidores.

De Smedt & Bolderdjik (1990), em estudo colaborativo com amostras de cacau

em pó e chocolate, encontraram diferença significativa ao comparar o MSRV

versus o RV, mas o efeito foi devido à presença de 3 cepas de 11 que eram de

Salmonella spp lactose positiva. Quando as cepas lactose positiva foram

excluídas da análise estatística não foram observadas diferenças no estudo.

Quando cepas imóveis de Salmonella spp são esperadas, De Zutter et al., (1991)

recomendam que o crescimento nas placas de MSRV que não apresentarem

migração seja semeado em algum outro ágar seletivo.

Amostras contendo microrganismos que não são capazes de migrar a 42°C,

mas sim em temperaturas inferiores, podem resultar em falso-positivas devido à

temperaturas de incubação menores que 42ºC ou prolongada permanência a

temperatura ambiente após período de incubação. Deste modo, além do controle

da temperatura da incubadora, é importante a leitura das placas logo após a

retirada do meio da estufa incubadora (O’DONOGUE et al., 1992).

A superfície do meio MSRV é inoculada com 0,1 mL de cultura pré-enriquecida

(motilidade em enriquecimento direto) em 3 gotas eqüidistantes após 20 mais ou

menos 2 horas de incubação, podendo também ser inoculado a partir de outros

caldos seletivos (motilidade em enriquecimento indireto) após 8 mais ou menos

0,5 horas de incubação (BOLDERDJJK & MILAS., 1996).

Os métodos de detecção por motilidade são técnicas de cultura mais simples.

Os resultados negativos e presuntivamente positivos podem ser obtidos em 48

horas. Ele consiste em promover o pré-enriquecimento das amostras, nas

mesmas condições recomendadas pelo método clássico, passando-se em

seguida para uma etapa simultânea de enriquecimento seletivo e plaqueamento

diferencial em MSRV. O ágar semi-sólido permite a diferenciação de Salmonella

spp após 24 horas de incubação a 42ºC, em função da ativa motilidade neste

meio, em contraposição à incapacidade de migração dos competidores na

mesma velocidade (SILVA e EIROA; 1993).

As cepas de salmonela, se presentes na amostra, formam zonas de migração

circular na superfície do meio MSRV atingindo de 10 a 40 mm de raio em 24

horas de incubação a 42°C, enquanto os demais microrganismos (Enterobacter

cloacae, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis) são totalmente inibidos ou, quando

se desenvolvem , as zonas circulares de migração não ultrapassam raios de 4 a 6

mm (DE SMEDT et al.,1986). Esta migração é caracterizada por uma zona turva

esbranquiçada ao redor da gota de inoculação, que pode se espalhar por toda a

extensão da placa. Se o meio permanecer de coloração azul, sem formação de

zona turva, o teste é considerado negativo (ausência de Salmonella spp móvel). O

crescimento de microcolônias em volta da gota não é considerado como

migração. O resultado falso-negativo não deve ocorrer com o meio MSRV porque

Salmonella spp, ao se mover por quimiotaxia através do meio, forma os halos de

migração que facilitam a visualização de seu crescimento, o que não acontece

com os competidores (DE SMEDT et al., 1994).

Cepas não produtoras de H

S também são facilmente detectadas no meio

MSRV, uma vez que a caracterização da presença de Salmonella spp neste meio

não depende da habilidade da bactéria produzir H

S. Em combinação com

semeadura em BPLS (Agar Verde Brilhante Fenol Lactose Sacarose), a sorologia

com cultura pura a partir do BPLS é tão possível quanto a partir do MSRV (DE

SMEDT et al.,1994)

Devido à baixa incidência de sorotipos de salmonela imóveis (<0,1%) e ao

percentual de amostras negativas para salmonela (90%), os métodos de detecção

baseados na motilidade têm tido reconhecimento na rotina laboratorial, e entre

eles o MSRV, por apresentar um número reduzido de falsos-positivos resultando

em rapidez na análise, e, consequentemente, redução de custos de

armazenamento para a indústria de alimentos em geral (OGGEL et al.,1990).

Em janeiro de 1993, a Association of Official Analytical Chemists (AOAC)

adotou, preliminarmente, o método MSRV para a detecção de salmonela em

amostras de cacau e produtos achocolatados e, em 1995, para dried milk

products após a realização de estudos comparativos com o método tradicional

para estas classes de produtos (BOLDERDIJK & MILAS, 1996).

Estudos comparativos foram efetuados utilizando o método MSRV frente a

outros métodos de detecção de salmonela em amostras de alimentos, como

imunoenzimático Salmonella - tek, Bactometer, tradicional, (O’DONOGUE et al.,

1992), modified 1-2 test e tradicional (OGGEL et al., 1990), tradicional (DE

SMEDT & BOLDERDJIK, 1990; DE SMEDT et al., 1991; De ZUTTER et al., 1991;

DE SMEDT et al.,1994) não havendo diferença estatística nos resultados.

O teste Tecra

Unique

Salmonella, quando comparado ao meio MSRV por

Poppe e Duncan (1996), em carcaças de frango, cortes de frango e carne

mecanicamente separada (CMS) de perus, num total de 100 amostras

demonstraram diferença estatística significativa a favor do MSRV, segundo o

teste de McNemar (χ

= 21,04).

Fierens & Huyghebaert (1996) realizaram um trabalho comparativo entre o

método tradicional e cinco diferentes métodos para a pesquisa de Salmonella spp

em 217 amostras de rações naturalmente contaminadas. 21 amostras foram

positivas para Salmonella na combinação dos seis métodos. O método tradicional

(usando como enriquecimento seletivo somente o RV) detectou 17 amostras

positivas (81%), o MSRV 19 (90,5 %), Salmosyst-Rambach 8 (38,1%),

Salmonella-Tek 19 (90,5%) Dynabeads anti-Salmonella 7 (33,33%) e EIA FOSS

21 (100%).

2 LISTERIA MONOCYTOGENES

A bactéria hoje conhecida como Listeria monocytogenes foi descrita pela

primeira vez no ano de 1926 por Murray e colaboradores como a causa de

doenças entre cobaias de laboratório e coelhos, do Departamento de Patologia da

Universidade de Cambridge. Os autores propuseram o nome de Bacterium

monocytogenes para o “novo organismo” devido a elevação característica nos

valores sanguíneos de leucócitos mononucleares. Em 1925, Pirie isolou um

organismo muito similar de um gerbil selvagem. Ele o chamou de Listerella

hepatolytica pelo comprometimento hepático durante a infecção. A similaridade

dos organismos descritos pelos diferentes pesquisadores levou, em consenso, ao

nome de Listerella monocytogene. Subseqüentemente foi modificado para

Listeria, porque Listerella já era a denominação de um grupo de protozoa. É

interessante ressaltar que, tanto Murray quanto Pirie, atribuíram as infecções dos

animais ao consumo de alimentos contaminados (POST, 1994).

O gênero Listeria encontra-se, atualmente, constituído por cinco espécies (L.

monocytogenes, L. seeligeri, L. ivannovii, L. innocua e L. welshimeri), as antigas

espécies L. grayi e L. murrayi foram reclassificadas no novo gênero Murraya (M.

grayi subsp. grayi, M. grayi subsp. murrayi) e a espécie L. denitrificans foi

reclassificada no novo gênero Jonesia (J. Denitrificans) (SILVA et al., 2007).

Os membros do gênero Listeria são definidos como bastonetes regulares

Gram-positivos, medindo de 0,4 a 0,5 µm de diâmetro por 5 – 20 µm de

comprimento, com terminações arredondadas, ocorrendo aos pares, em cadeias

curtas ou isoladamente, não-esporogênicos, catalase positivos e não-produtores

de H

S. Desenvolvem-se em condições de aerobiose e microaerofilia, tendo

preferência à ambiente com 10% de dióxido de carbono bem como numa ampla

faixa de temperatura (3-45°C), com temperatura ótima entre 30-37°C, sendo

consideradas psicrotrófilas, em função da capacidade de multiplicar-se em

temperaturas de refrigeração. Apresentam motilidade característica a 20-25°C,

com movimentos rotatórios ou de tombamento, devido aos flagelos peritríquicos,

mas são imóveis a 37°C. Fermentam a glicose com produção de ácido lático, sem

produção de gás (SILVA et al., 2007).

L. monocytogenes multiplica-se em pH entre 5,0 e 9,0 com ótimo em pH 7,0 e

7,5. È termolábil, podendo ser destruída durante o cozimento. Temperaturas

como as utilizadas para pasteurização de leite a 71,7ºC por 15 segundos podem

inativar este microrganismo (MÜLLER & WEBER, 1996).

Doyle et al., (1985) observaram a sobrevivência de Listeria monocytogenes em

alimentos desidratados com aw inferior a 0,93, valor este, até então, considerado

mínimo para o desenvolvimento da bactéria, supondo que, pelo menos por um

certo período de tempo, Listeria monocytogenes seria capaz de tolerar condições

de baixa atividade de água. A atividade de água ótima para seu desenvolvimento

é próxima a 0,97. Contudo, essa bactéria tem a capacidade de multiplicar-se em

atividade de água considerada baixa para a multiplicação de patógenos – 0,92. Já

foi relatada a sobrevivência de Listeria monocytogenes a 4°C por, pelo menos,

132 dias em caldo tripticase soja contendo NaCl na concentração de 25,5%, com

Aw de aproximadamente 0,83 (FRANCO e LANDGRAF, 2003).

Listeria monocytogenes apresenta alta tolerância ao sal, podendo multiplicar-

se em meios com teores de 10% de NaCl e de sobreviver por um ano em meio

com 16% de NaCl quando o pH era mantido em 6.0. Shahamat et al., (1980),

apud Loguercio, et al., (2001), relataram a sobrevivência a 37°C por 15 dias em

10,5% de NaCl e de 5 dias em teores de 20 a 30% de NaCl. A bactéria foi capaz

de sobreviver mais de 100 dias em teores de 10,5 a 30% de NaCl quando a

temperatura era mantida em 4°C.

Doyle (1988) relatou que Listeria monocytogenes tolera concentrações de

nitrito de sódio de cerca de 156 ppm, valor máximo permitido para carnes curadas

nos Estados Unidos. A inibição do crescimento do patógeno, no entanto, é obtida

pela combinação de outros fatores como demonstrado por Shahamat et al.

(1980), apud Loguercio et al., 2001 que, ao associar 100 ppm de nitrito, 3% de

NaCI e pH próximo a 5,5 a uma temperatura de 5°C, observaram inativação da

bactéria.

A bactéria Listeria monocytogenes está distribuída amplamente no ambiente;

ela se encontra em solos, água, águas residuais e vegetação em decomposição.

Comum no intestino de humanos e animais domésticos (incluindo moscas),

produtos agrícolas frescos, meio ambientes da área de processamento na

indústria (TOMPKIN et al., 2001). Têm sido isoladas de diferentes alimentos, tais

como leite cru e pasteurizado, queijo, carne bovina, suína, de aves, peixes,

embutidos, carne moída de diferentes animais, produtos cárneos crus e

termoprocessados, além de produtos de origem vegetal, de origem marinha, e

refeições preparadas. Estes isolamentos têm sido realizados não só em outros

países como também no Brasil (FRANCO e LANDGRAF, 2003). De acordo com

Barreto (2001), no Brasil, trabalhos publicados recentemente indicam a presença

de Listeria monocytogenes em camarões (10% - região sul), filé de peixe (29,1% -

região sul), leite pasteurizado e ensacado (16,7% - região nordeste), produtos

cárneos refrigerados (10% - região sudeste), e mortadelas (8% - região sudeste).

Listeria é uma bactéria capaz de desenvolver-se lentamente em temperaturas

refrigeradas, mas é sensível a alimentos muito ácidos (iogurte e algumas frutas) e

ao calor, sendo facilmente destruída pelo cozimento convencional. De fato essa

bactéria se encontra em qualquer ambiente frio e úmido. Esta é uma das razões

pela qual o deságüe no piso é uma prática incoreta por aumentar o nível de

contaminação das superfícies com esta bactéria. Devido ao seu alto poder de

difusão, o microrganismo é constantemente reintroduzido ao meio ambiente da

área de processamento na indústria. Os esforços excessivos para controlar

Listeria monocytogenes podem reduzir o nível de contaminação, mas não se

pode, com as tecnologias atuais, erradicar Listeria monocytogenes da área de

processamento na indústria e nem eliminar completamente o potencial de

contaminação dos produtos prontos (TOMPKIN et al., 2001).

Segundo Barreto (2001), o maior risco de contaminação com Listeria

monocytogenes provém da contaminação pós-processamento depois da cocção,

quando não observados os cuidados necessários, no que se refere à manipulação

de alimentos crus e mal cozidos, como é o caso de leite e produtos lácteos

(queijos brancos), ovos, sorvetes, hortaliças (adubadas com fezes de animais),

mariscos, mexilhões, carnes e produtos cárneos (fiambre, salsicha, embutidos de

carne de porco) e, ainda, dos próprios manipuladores de alimentos. Os magarefes

de matadouros têm sido reportados como portadores assintomáticos.

Devido à sua associação com animais e reconhecida patogenicidade, a

detecção de Listeria monocytogenes representa interesse à indústria cárnica, já

que seus produtos podem eventualmente veicular o microrganismo. Estima-se

que, na Europa, a contaminação de carnes por Listeria monocytogenes seja da

ordem de 6 a 12% para produtos tipo “delicatessen” crus e carnes processadas e

mais de 33% para embutidos secos (JENNIFER et al., 1988).

O primeiro surto de listeriose humana veiculada por alimentos data de 1979,

nos EUA, quando 20 pacientes internados apresentaram a doença, atribuída ao

consumo de saladas de alface, tomate e salsão (HO et al., 1986 apud

LOGUERCIO et al., 2001). Outro surto envolvendo 41 pessoas, foi relatado em

1981, no Canadá, estando relacionado ao consumo de salada de repolho, que se

encontrava contaminada pelo uso de adubo orgânico contendo esterco de ovinos

infectados pela bactéria. Também foi constatado que os repolhos haviam sido

mantidos sob refrigeração por tempo prolongado (SCHLECH III, W. F., LAVIGNE,

P. M., BORTULCCI, R. A., et al., 1983, apud LOGUERCIO et al., (2001).

A incidência de Listeria spp em carnes cruas pode ser considerada elevada.

Farber et al., (1989) encontraram 56% de positividade para Listeria

monocytogenes em 16 amostras de coxa de frango. Franco et al., (1995)

encontraram 96% de positividade para Listeria spp em 25 amostras de pele de

coxa de frango e 64% no músculo em abatedouro no nordeste da Espanha. Entre

janeiro de 1992 a dezembro de 1995, um estudo realizado na França e Bélgica,

foi encontrado Listeria monocytogenes em níveis considerados baixos, entre 1 e

100 UFC/cm

(UYTTENDAELE et al., 1997). Segundo Oyeniyi et al., (1996), as

principais causas da contaminação do frango e de seus produtos foram a limpeza

e a desinfecção inadequadas na linha de processamento e no ambiente do abate,

uma vez que a presença de Listeria sp em frangos é quase inevitável em função

da ampla distribuição deste microrganismo na natureza.

Korsak et al., (1998) encontraram na superfície de carcaças suínas 2% de

Listeria monocytogenes e 22% de Listeria spp, e na superfície de carcaça de

gado, 10% de Listeria monocytogenes e 54% de Listeria spp.

Em carne moída de suíno, Inoue et al., (2000), em análise quantitativa pela

técnica de Número Mais Provável (NMP), encontraram 28,6% de positividade em

amostras com resultado <0,3; 14,3 % de positividade para amostras com

resultado entre 0,3 e <1,1; 28,6% de positividade para amostras com resultado

entre 1,1 e <10 e 28,6% de resultados positivos com contagens entre 10 e <100

NMP/g.

Comi et al., (1992) encontraram 91,6% de positividade para Listeria spp em

carne de gado moída, com contagens menores que 100 UFC/g para Listeria

monocytogenes; 92,6% de positividade em carne suína também com contagens

menores que 100 UFC/g de Listeria monocytogenes.

Dentre as espécies de Listeria, Listeria monocytogenes é inquestionavelmente

patogênica para o homem e, ao contrário da maioria dos patógenos de origem

alimentar, que geralmente provocam sintomas gastrintestinais, as principais

manifestações clinicas de listeriose são, inicialmente, semelhantes a um resfriado,

com febre baixa e mal estar geral, podendo progredir para meningite,

meningoencefalite, septicemia, aborto ou parto prematuro. A taxa de mortalidade

encontra-se na faixa de 20-30% dos casos diagnosticados e os grupos

susceptíveis, considerados grupos de risco, são mulheres grávidas (e seus fetos)

crianças, idosas e indivíduos com o sistema imunológico comprometido (SILVA et

al., 2007).

2.1. Métodos para Isolamento de Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes não era considerada um importante patógeno em

alimentos até ocorrer alguns surtos de listeriose no início dos anos 1980; devido

ao consumo de alimento contaminado. Conseqüentemente, alguns meios

seletivos foram desenvolvidos para o isolamento de Listeria monocytogenes em

alimentos. McBride & Girard (1960) apud Vlaemynck et al., (2000) desenvolveram

um meio seletivo para o isolamento de L. monocytogenes de amostras clínicas,

mas foram encontrados problemas com a biota contaminante como

Streptococcus, Micrococcus, Enterobactérias e Pseudomonas.

Muitas modificações do meio foram subseqüentemente desenvolvidas como o

Modified McBride’s Ágar, porém a seletividade era insuficiente. Muitos

investigadores buscavam melhorar a seletividade propondo modificações de

fórmulas. O desenvolvimento do cloreto de litio feniletanol moxalactam Ágar LPM

por Lee e McClain (1986), apud Vlaemynck et al.,(2000), foi uma significante

melhoria para o isolamento de Listeria monocytogenes considerando a resistência

geral de Listeria sp frente ao cloreto de lítio e cefalosporinas, como moxalactam e

ceftazidina. Estes princípios são a base para outros meios seletivos. O caráter

indicativo neste meio ainda estava baseado no desenvolvimento de colônias

azulado-acinzentadas quando do uso da iluminação de Henry (VLAEMYNCK et

al., 2000).

A adição de esculina ao meio resultando na formação de colônias verde

acinzentadas puxando para preto e em alguns casos, o meio também modificava

sua cor para preto, tornava mais fácil à visualização e identificação das colônias.

Estes elementos foram explorados, posteriormente, na maioria dos meios usados

para o isolamento de Listeria spp, como Agar Oxford (CURTIS et al., 1989), Ágar

Oxford modificado (McCLAIN & LEE, 1988) e Ágar Palcam (VAN NETTEN et al.,

1989). Porém ainda havia necessidade de um meio que pudesse distinguir

Listeria monocytogenes e Listeria sp não patogênica. Além disso, sabe-se que

durante o enriquecimento em caldo seletivo, Listeria monocytogenes pode ser

inibida pelo rápido crescimento de Listeria innocua. O Ágar hemolítico ceftazidina

cloreto de lítio – HCLA, “enhanced haemolysis agar” – EHA e algumas

modificações deste, Listeria monocytogenes Ágar sangue - LMBA, recentemente

desenvolvido Rapid L’mono de Foret & Dorey (1997) e o meio ALOA (OTTAVIANI

et al.,1997) são exemplos de tais meios que possibilitam a diferenciação de

Listeria monocytogenes de Listeria spp (VLAEMYNCK et al., 2000).

O enriquecimento seletivo, realizado em duas etapas (a primeira em caldo

UVM (“University Vermont modified”), e a segunda em caldo Fraser), tem a

finalidade de inibir a microbiota acompanhante, permitindo a recuperação de

baixos números de células de Listeria spp. O efeito seletivo do caldo UVM é

exercido pela associação de ácido nalidíxico e acriflavina, e no caldo Fraser pelo

cloreto de lítio, ácido nalidíxico, acriflavina e citrato de ferro. O enegrecimento do

meio evidencia a presença de Listeria spp. Ápos 48 horas de incubação, as

culturas que não enegrecem, são consideradas negativas (DIFCO & BBL

MANUAL, 2003).

Na seleção e isolamento em ágar Palcam, observa-se a não fermentação do

manitol e a formação de esculetina pela hidrólise da esculina, reação revelada

pela presença de ferro trivalente. Palcam é meio sólido onde se encontram

presentes as substâncias sulfato de polimixina B, cloreto de lítio, ceftazidina e

cloridrato de acriflavina, com a finalidade da inibição da biota acompanhante.

Listeria monocytogenes hidrolisa a esculina, dando como resultado a formação de

um halo negro ao redor das colônias. Este agente não fermenta o manitol, o que o

diferencia de contaminantes como Enterococcus e Staphylococcus. A incubação

em condições microaerófilas inibe o desenvolvimento de aeróbios, como espécies

de Bacillus e Pseudomonas que podem desenvolver-se sobre o meio (DIFCO &

BBL MANUAL, 2003).

O meio ALOA, para seleção e isolamento, utiliza o princípio básico dos meios

existentes pela adição dos agentes seletivos inclusive cloreto de lítio, ceftazidina e

polimixina para reduzir o desenvolvimento de competidores. Esculina é

substituída por um substrato cromogênico e um substrato enzimático (lípase) que

resulta em um aparecimento de colônia azulada típica para todas as listerias e a

capacidade de diferenciar entre Listeria monocytogenes de outras Listerias sp,

pela produção de um halo opaco claro que cerca as colônias. A combinação

cromogênica X-glucoside é somada com o substrato para a detecção da β-

glucosidase, que é comum para toda a espécie de Listeria, resultando em

colônias de coloração azul. A diferenciação da Listeria monocytogenes da Listeria

sp é baseada na produção de fosfatidilinositol-especifico fosfolipase C em cepas

de Listeria monocytogenes que somado a um substrato purificado específico

resulta em um halo opaco claro ao redor das colônias de Listeria monocytogenes

(VLAEMYNCK et al., 2000).

A confirmação bioquímica e diferenciação das espécies são realizadas por

meio da verificação da produção de beta-hemólise em Ágar sangue de cobaia (L.

monocytogenes é positiva), prova de CAMP-test (Listeria monocytogenes produz

reação de CAMP positiva com Staphylococcus aureus ATCC 25923 e negativa

para Rhodococcus equi ATTC 6939), motilidade característica no Ágar motilidade

modificado (Listeria spp apresenta crescimento móvel característico em forma de

guarda-chuva), capacidade de fermentar ramnose e, α - metil D – manosídeo,

incapacidade de fermentar xilose e o manitol (Oxoid manual, 1998).

O teste de CAMP é considerado como definitivo para L. monocytogenes. Um

isolado que é considerado CAMP positivo para S. aureus e negativo para R. equi

deve ser considerado como um isolado positivo para L. monocytogenes , mas

não necessariamente um isolado virulento (McKELLAR, 1994).

2.1.1 Reação em Cadeia da Polimerase

A reação em cadeia da polimerase (PCR), baseia-se em duas propriedades de

DNA: 1) as cadeias integrantes da dupla hélice do DNA separam-se sob o

aumento de temperatura, processo este reversível; 2) a enzima de

DNApolimerase é capaz de replicar in vitro uma seqüência de DNA, desde que

haja uma fita de DNA para servir de molde ou alvo, um pequeno trecho de fita

capaz de iniciar o processo (“primer” ou oligonucleotídeos iniciadores

complementares ao DNA alvo) e nucleotídeos livres (formadores da molécula de

DNA), além de sais e tampões nas concentrações adequadas (MADUREIRA

JUNIOR S., 1992 apud PONTES, 1999).

A PCR é baseada na repetição cíclica de três reações: 1) desnaturação; 2)

anelamento; 3) extensão, com variações de temperaturas. A técnica difundiu-se

após a identificação da bactéria Thermus aquaticus thermophilus, que produz

uma polimerase termoestável resistente a altas temperaturas, chamada Taq DNA

Polimerase. O magnésio é um importante co-fator na PCR, pois a Taq DNA

Polimerase requer grandes concentrações de magnésio livre para ligar-se à

amostra de DNA alvo, além de “primers” e nucleotídeos livres (BICKLEY et al.,

1996 apud PONTES, 1999).

Após a separação das fitas duplas de DNA, ocorre hibridização de pequenos

oligonucleotídeos iniciadores, os “primers”, com o DNA alvo. A DNA polimerase

tem capacidade de, a partir do iniciador, sintetizar uma fita complementar de DNA,

adicionando nucleotídeos de forma seqüencial, com base na seqüência do DNA

molde. A temperatura inicial do processo é, em média de 94ºC, com a qual é

possível desnaturar o DNA, isto é, quebrar as pontes de hidrogênio que mantêm

as ligações entre as bases da cadeia e liberar cadeias únicas de DNA alvo que

não necessitam estarem puras ou em grandes quantidades para serem

amplificadas. Ao diminuir-se a temperatura de 94ªC para 40ºC a 60ºC, dá-se a

condição para que os pares de iniciadores reconheçam as seqüências

complementares do DNA alvo e ligue-se a estes (TAYLOR, 1991 apud PONTES,

1999).

O segmento de DNA amplificado é visualizado sob luz ultravioleta em gel

agarose corado com brometo de etídio, revelando produtos que são comparadas

com um marcador padrão e que devem corresponder ao tamanho esperado,

conforme o par de iniciadores utilizados.

O sistema de detecção de patógenos BAX System

é um método de triagem

utilizado para alimentos e amostras ambientais, que combina velocidade e

facilidade de uso com uma performance capaz de obter resultados exatos. Este

sistema utiliza a tecnologia da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) a qual

cria milhões de cópias do fragmento de DNA alvo, caso esteja presente. Em

seguida é possível obter resultados “positivo ou negativo”, diretamente do sistema

(Manual do usuário BAX System

O BAX System

fornece detecção qualitativa de seções de DNA que são

altamente especificas para Salmonella spp em uma grande variedade de

alimentos e amostras ambientais. Usa a PCR para amplificar um fragmento

especifico de DNA de bactérias e usa a detecção fluorescente para analisar o

produto da PCR. O BAX System

combina “primers”, polimerase e nucleotídeos

necessários para a PCR dentro de um único tablete. A especificidade de um

ensaio de PCR é determinada pela seqüência de DNA dos ”primers” empregados.

O produto da reação PCR é automaticamente analisado pela detecção da

fluorescência emitida. Cada tablete de PCR contém um corante fluorescente, o

qual se liga com a dupla fita de DNA e emite um sinal em resposta à luz emitida

(excitação). Durante a fase de detecção automatizada, a temperatura das

amostras é lentamente aumentada para desnaturar o DNA, o qual libera o corante

causando uma queda na emissão do sinal. A temperatura de desnaturação e a

magnitude da mudança do sinal fluorescente são medidas, da qual permite

emissão de resultados (AOAC, 2002).

A concentração celular pode ser incrementada mais rapidamente pelo uso de

ácido nucléico alternativo, e pelo uso da reação da polimerase em cadeia, a qual

amplifica exponencialmente uma seqüência de ácidos nucléicos de até 10

vezes

em 2-3 horas. A detecção amplificada do produto indica a presença do DNA

original e por sua vez, o organismo original (BENNETT et al., 1998).

O BAX System

detecta 100% de sorotipos de salmonela em todos os

alimentos, incluindo carne bovina, frango, frutas e produtos vegetais, produtos

lácteos, chocolates e produtos de panificadora, ração animal e massa após pré-

enriquecimento. A realização das análises requer 4 (quatro) passos:

enriquecimento da amostra, extração de DNA, amplificação de DNA e leitura de

resultados (Manual do usuário BAX System

Segundo Lou et al., (1997), é necessária a remoção de substâncias inibitórias

da PCR em materiais como sangue e fezes (FLUIT et al., 1993), a hemoglobina, a

bilirrubina (WIDJOJOAMODJO et al., 1992) e os sais biliares. A purificação do

DNA é essencial para a integridade da DNA polimerase (WERNARS et al., 1991).

3. TESTE DE HIPÓTESES SOBRE PROPORÇÕES EM AMOSTRAS

DEPENDENTES

Num estudo sobre comparação entre duas proporções populacionais,

pode-se definir como significante uma diferença mínima de 5 pontos percentuais

entre elas. A partir desta informação fornecida pelo pesquisador, pode-se, então,

definir o número de amostras necessárias a serem ensaidas de modo que se

tenha alta probabilidade de rejeitar a hipótese nula (igualdade das duas

proporções) quando a diferença mínima desejada ocorrer. É sabido que, por

menor que seja a diferença entre duas proporções, sempre haverá um tamanho

de amostra suficientemente grande que permitirá detectar esta diferença. Isto

ocorre com o teste de McNemar ao comparar duas proporções em amostras

dependentes, e a utiização do Poder do Teste de McNemar, é uma excelente

ferramenta para o pesquisador definir a capacidade do teste em detectar

diferanças significantes ao problema em estudo quando elas existirem (OGLIARI

et al., 2007).

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CAPÍTULO 2 COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS ISO

6579, AOAC 993-07/995-07 E O BAX SYSTEM

(DUPONT-

QUALICOM) NA DETECÇÃO DE SALMONELLA SP EM

AMOSTRAS DE CARCAÇAS DE FRANGO E CARNES

SUÍNAS, NATURALMENTE CONTAMINADAS.

CAPÍTULO 2 Comparação entre os métodos ISO 6579, AOAC 993-07/995-07

e o BAX System

(DuPont-Qualicom) na detecção de Salmonella sp em

amostras de carcaças de frango e carnes suínas, naturalmente

contaminadas.

1 INTRODUÇÃO

Este estudo tem como objetivo comparar o desempenho entre os métodos

ISO 6579, AOAC 993-07/995-07 (avaliando-se o MSRV - Ágar Semi-sólido

Rappaport-Vassiliadis Modificado da marca Oxoid e da marca Acumedia) e o BAX

System

(DuPont-Qualicom), na detecção de Salmonella spp em amostras de

carcaças de frango e carnes suínas, naturalmente contaminadas, conforme

descrito abaixo:

a) Método ISO 6579 com o BAX System

;

b) Método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido Rappaport-Vassiliadis Modificado

- Oxoid) com o BAX System

;

c) Método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido Rappaport-Vassiliadis Modificado

- Acumedia) com o BAX System

;

d) Método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido Rappaport-Vassiliadis Modificado

- Acumedia) com o Método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido Rappaport-

Vassiliadis Modificado - Oxoid)

e) Método ISO 6579 e o método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido Rappaport-

Vassiliadis Modificado - Oxoid);

f) Método ISO 6579 com o método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido

Rappaport-Vassiliadis Modificado – Acumedia).

2 MATERIAL E MÉTODOS

As análises de Salmonella spp foram realizadas utilizando-se,

simultaneamente, o método tradicional ISO 6579 (Skovgaard, N. 2002; ISO

6579:2002/amd. 1:2007(E)) e os métodos AOAC 993-07/995-07 (De Smedt et al.,

1994, AOAC, 2006) e Bolderdijk & Milas, 1996) (MSRV Oxoid e Acumedia) e BAX

System

, conforme mostrado na Figura 1, página 45.

Para cada partida de meio de cultura, diariamente, foi feito um controle positivo

com Salmonella Enteritidis.

2.1 Amostras

a) Um total de 247 amostras de carcaças de frango foi coletado durante o

abate, logo após o chuveiro existente no final da operação de depenagem, ou

imediatamente após a evisceração, antes do chuveiro de lavagem.

b) Foi analisado um total de 256 amostras de retalhos de carne suína crua

proveniente da desossa da cabeça do suíno recém abatido e recortes de

desossa.

Os pontos de coleta das amostras foram selecionados por haver maiores

probabilidades de se encontrar amostras positivas para Salmonella spp

(experiência do autor);

Todas as amostras foram coletadas na linha de processamento de um

frigorífico com SIF, localizado em Santa Catarina, Brasil.

Imediatamente após a coleta as amostras foram enviadas ao laboratório e,

num intervalo de no máximo 2 horas, foram submetidas à análise de Salmonella

spp.

2.2 Pré-enriquecimento das amostras para análise de Salmonella spp

Pesou-se 25 +/- 0,5g de amostra em saco Whirl-Pak estéril (Nasco) em

balança modelo Dilumat 3, (AES Laboratories – França), e adicionou-se 225 mL

de água peptonada tamponada (APT) (Oxoid CM: 509).

Homogeneizaram-se as amostras em homogeneizador peristáltico (MA-440

Marconi – Brasil) por 1 minuto e incubou-se à 36ºC +/- 1ºC por 20 – 24 h.

2.3 Detecção de Salmonella spp pelo método da AOAC 993-07/995-07

(MSRV-Semi-Sólido Rappaport-Vassiliadis Modificado – Oxoid e Acumedia).

Transferiu-se alíquotas de 0,1 mL da amostra pré-enriquecida para placas

contendo o meio seletivo MSRV (Acumedia 7511

) adicionado de 1 mL/L de

solução 2% de novobiocina (INLAB 5701 – Brasil) e para placas contendo o meio

MSRV (Oxoid CM 910) adicionado do suplemento SR 161E (Oxoid) conforme

recomendação do fabricante. Cada alíquota de 0,1 mL foi depositada em três

locais eqüidistantes em uma mesma placa. As placas inoculadas foram incubadas

a 42,0ºC +/- 0,5ºC por 24 horas. Após incubação observaram-se as placas que

apresentavam motilidade positiva (halo de migração visível pela diferença de

tonalidade de cor do meio) e procedeu-se como a seguir:

a) As culturas consideradas presuntivamente positivas (motilidade positiva)

foram transferidas, com auxílio de alça de platina, a partir da parte mais

externa do crescimento, para placas contendo os meios seletivos: Ágar

verde brilhante (VB) (Oxoid CM 329/263), Ágar Hektoen (Oxoid CM419)

e/ou Ágar Xilose Lisina Desoxycholato (XLD) (Oxoid CM469). Todos os

meios foram incubados por 24h à 37ºC. Unidades formadoras de colônias

típicas nos meios seletivos foram confirmadas pelas provas bioquímicas,

Ágar lisina ferro (LIA), (Merck 1.11640), Ágar tríplice açúcar ferro (TSI)

(Merck 1.03915) e caldo uréia (Merck 1.08483), e provas sorológicas - soro

polivalente somático, e soros grupo específicos B, C

, C

, D, E - (Probac do

Brasil). Quando necessário, o sistema API 20E (Biomerux Brasil S/A) foi

usado como complementar na identificação. As cepas consideradas

positivas foram enviadas para tipificação no Instituto Oswaldo Cruz – Rio

de Janeiro, Brasil, em tubos de ágar nutriente (Oxoid CM3).

2.4 Detecção de Salmonella spp pelo método ISO 6579.

Transferiu-se 0,1 mL da amostra pré-enriquecida para 10 mL de caldo

Rappaport–Vassiliadis Soya Peptone -RVS (Oxoid, CM 0866) e 1,0 mL para 10

mL de caldo tetrationato, segundo Muller Kauffmann- MKTT (Muller Kauffmann

Tethrationato) (Oxoid, CM 0343, Oxoid manual , 1998) adicionado de 19 mL/L de

uma solução de iodo (5 gramas de iodeto de potássio mais 4 gramas de iodo em

20 mL de água destilada); 9,5 mL/L de uma solução de verde brilhante 0,1%; e,

40mg/L de novobiocina. Novobiocina é adicionado para inibir o crescimento de

Proteus sp. O Caldo RVS foi incubado a 42ºC +/-0,5ºC por 22 a 24 horas e o

caldo MKTT foi incubado a 37ºC +/- 0,5ºC por 22 a 24 horas. Após incubação,

com auxílio de alça de platina de 5 µL, transferiu-se alíquotas das culturas em

caldo RVS e MKTT para placas contendo os meios seletivos: Xilose lisina

desoxicolato Ágar - XLD (Oxoid, CM 469), Ágar verde Brilhante (Oxoid CM 263)

adicionado de 1 mL/0,5 L de solução de novobiocina a 1%, Ágar Manitol Lisina

Cristal Violeta Verde Brilhante Ágar - MLCB (Oxoid, CM 783) e Ágar Hektoen - HE

(Oxoid, CM 419). Todos esses meios de cultura seletivos foram incubados a 37ºC

+/- 0,5ºC por 24/48 horas. Unidades formadoras de colônias típicas nos meios

seletivos foram confirmadas pelas provas bioquímicas e sorológicas conforme

descrito no item 2.3

2.5 Detecção de Salmonella spp pelo BAX System



Amostras pré-enriquecidas foram submetidas à análise por PCR, utilizando o

protocolo do fabricante do BAX System

(DuPont Qualicon- Wilmington – DE –

USA): Após o enriquecimento da amostra, ligou-se o termociclador/detector e o

computador; esperou-se um minuto e iniciou-se a utilização do BAX System

com

a digitalização dos dados da amostra conforme instrução do manual do usuário.

Adicionou-se 150 µL de protease para 12 mL de tampão lise e transferiu-se 200

µL do reagente de lise para cada tubo de reação lise. A este tubo de reagente lise

adicionou-se 5 µL da amostra pré-enriquecida em caldo APT utilizando ponteiras

descartáveis; fecharam-se os tubos e efetuou-se a reação de lise. Para salmonela

a reação efetuou-se a 37ºC por 20 minutos para ocorrer a lise celular e a digestão

de proteínas, e depois 95ºC por 10 minutos para inativação da protease. Estas

operações foram realizadas em blocos aquecedores para tubos de PCR

previamente aquecidos. Os tubos foram então colocados em bloco de

resfriamento previamente mantido em geladeira. Os tubos permaneceram neste

bloco por cerca de 5 minutos. Pipetou-se então 50 µl de amostra contidas nos

tubos de lise para tubos contendo tablete de PCR acondicionados no bloco de

resfriamento e fechou-se com tampas óticas com auxílio de ferramenta específica

fornecido pelo fabricante. Levou-se o bloco para o termociclador/detector e deu-se

inicio ao programa automatizado. Após amplificação, uma janela se abre e cada

poço aparece com uma cor diferente e um símbolo no centro de cada poço. Um

sinal de “menos” (-) indica que o teste é negativo para o organismo alvo. Um sinal

de “mais” (+) indica que o teste é positivo para o organismo alvo, neste caso

Salmonella spp. Outro sinal, como interrogação em cor amarela, leva a uma

consulta ao fabricante.

2.6 Análise estatística

A análise estatística foi feita conforme o teste não paramétrico de McNemar

(SIEGEL, S. 1956), (|ND – PD| - 1)

/(ND+PD) = χ

(χ

> 3,84 é significativo ao

nível de p = 0,05) e conforme ISO 16140, para amostras naturalmente

contaminadas, item 5 – Métodos Qualitativos – Protocolo técnico para suas

validações, onde são definidos:

a) Concordância relativa (RA): Grau de correspondência entre a resposta

obtida pelo método de referência e a resposta obtida pelo método

alternativo em amostras idênticas;

b) Desvio Positivo (PD): O método alternativo se torna um falso positivo

quando mostra um desvio positivo se ele indica um resultado positivo

quando o método de referência indica um resultado negativo;

c) Desvio Negativo (ND): O método alternativo indica um desvio negativo se

ele dá um resultado negativo quando o método de referência dá um

resultado positivo;

d) Sensibilidade relativa (RS): Capacidade do método alternativo para

detectar o alvo quando ele é detectado pelo método de referência;

e) Especificidade relativa (RE): Capacidade do método alternativo de não

detectar o alvo quando ele não é detectado pelo método de referência.

O cálculo da concordância relativa, sensibilidade relativa e especificidade

relativa para Salmonella spp é apresentado na Tabela 1.

Figura 1: Fluxograma para a detecção de Salmonella spp pelos métodos ISO

6579, AOAC 993-07/995-07 e BAX System

(DuPont-Qualicom).

Se característico

c/ halo

AOAC - MSRV

42ºC +

0,5 / 24 hs

Resultado: + p/ SS

25g amostra/225 mL APT

35ºC +

2 / 18-24hs

ISO 6579 - RV

42ºC +

0,5 / 22-24 hs

ISO 6579 - MKTT

37ºC +

0,5 / 22-24 hs

PCR BAX SYSTEM

XLD/HECTOEN/

TSI/LIA/Uréia/

Sorolo

XLD/HECTOEN/

VB/MLCB

TSI/LIA/Uréia/

Sorolo

Resultado: + p/ SS

Lise celular

37ºC / 20 min

95ºC / 10 min

8ºC / 5 min

Hidratar os tabletes do rack

PCR

Inserir o rack no

termobloco e iniciar a

corrida

Positivo para

organismo alvo

Negativo para

organismo alvo

Tabela 1: Cálculo da concordância relativa, sensibilidade relativa e especificidade relativa na detecção de Salmonella spp.

Métodos Sum

Concordância

Relativa RA (%)

N+

Sensibilidade

Relativa RS (%)

N-

Especificidade

Relativa RE (%)

100x(PA + NA) 100x PA 100x NA

Referencia Alternativo

(++)

(--)

(+-)

(-+)

PA + NA

PA + ND

N+

NA + PD

N-

ISO 6579 BAX 70 357 16 60 24,33 503 427 84,89 86 81,40 417 85,61

ISO 6579

AOAC

(Acumedia)

73 353 13 64 32,47 503 426 84,69 86 84,88 417 84,65

ISO 6579

AOAC

(Oxoid )

55 370 31 47 2,88 503 425 84,49 86 63,95 417 88,73

AOAC

(Acumedia)

BAX 115 351 22 15 0,97 503 466 92,64 137 83,94 367 95,90

AOAC

(Oxoid )

BAX 86 357 16 44 12,15 503 443 88,07 102 84,31 401 89,02

AOAC

(Oxoid)

AOAC

(Acumedia)

96 360 6 41 24,60 503 456 90,65 102 94,11 401 89,77

Legenda:

RE - Especificidade Relativa;

RS - Sensibilidade Relativa;

RA - Concordância Relativa;

PA - concordância de amostras com resultados positivos em ambos os métodos (+/+);

NA - concordância de amostras com resultados negativos em ambos os métodos (-/-);

PD - Desvio positivo: método de referência negativo e método alternativo positivo (R-/A+);

ND - Desvio negativo: método de referência positivo e método alternativo negativo (R+/A-);

3 RESULTADOS

Os métodos AOAC 993-07 (MRSV Acumedia e Oxoid), ISO 6579 e BAX

System

juntos detectaram como positivas para Salmonella spp 160 amostras

(31,81%).

Dezenove amostras foram detectadas somente por um dos métodos testados

acima, sendo: duas (2) com o AOAC (MSRV da Oxoid), cinco (5) com o AOAC

(MSRV da Acumedia), seis (6) com o método ISO e seis (6) com o BAX System

Os resultados desse estudo são apresentados na Tabela 2 e na Tabela 3, na

página 50.

a) Método ISO 6579 com o BAX System

O método ISO 6579 detectou 86 amostras positivas versus 130 do BAX

System

, sendo concordantes 70 e 357 amostras positivas e negativas,

respectivamente, em ambos os métodos. 60 amostras foram positivas para o BAX

System

e negativas no método ISO 6579 e 16 amostras foram positivas no

método ISO 6579 e negativas no BAX System

. O χ

= 24,23 (p=0,00001)

demonstra diferença estatística entre os métodos. A concordância relativa foi de

84,89%, a especificidade relativa foi de 85,61% e a sensibilidade relativa foi de

81,40%. O BAX System

apresentou uma taxa de Falso Negativo de 18,60% (100

– Sensibilidade Relativa) e a taxa de Falso Positivo foi de 14,39% (100 –

Especificidade Relativa)

b) Método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido Rappaport-Vassiliadis

Modificado - Oxoid) com o BAX System

;

O método AOAC 993-07 (Oxoid) detectou 102 amostras positivas versus

130 do método BAX System

, sendo concordantes 86 e 357 amostras positivas e

negativas, respectivamente, em ambos os métodos. 16 amostras foram positivas

para o método AOAC 993-07 (Oxoid) e negativas para o BAX System

e 44

amostras foram positivas para o BAX System

e negativas no método AOAC 993-

07 (Oxoid). O χ

= 12,15 (p=0,0001) demonstra diferença estatística entre os

métodos. A concordância relativa foi de 88,07%, a especificidade relativa foi de

89,02% e a sensibilidade relativa foi de 84,31%. O método BAX System

apresentou uma taxa de Falso Negativo de 15,69% (100 – Sensibilidade Relativa)

e a taxa de Falso Positivo foi de 10,98% (100 – Especificidade Relativa).

c) Método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido Rappaport-Vassiliadis

Modificado - Acumedia) com o BAX System

;

O método AOAC 993-07 (Acumedia) detectou 137 amostras positivas

versus 130 do método BAX System

, sendo concordantes 115 e 351 amostras

positivas e negativas, respectivamente, em ambos os métodos. 22 amostras

foram positivas para o método AOAC 993-07 (Acumedia) e negativas para o BAX

System

e 15 amostras foram positivas para o BAX System

e negativas no

método AOAC 993-07 (Acumedia). O χ

= 0,97 (p=0,324) não demonstra

diferença estatística entre os métodos. A concordância relativa foi de 92,64%, a

especificidade relativa foi de 95,90% e a sensibilidade relativa foi de 83,94%. O

método BAX System

apresentou uma taxa de Falso Negativo de 16,06% (100 –

Sensibilidade Relativa) e a taxa de Falso Positivo foi de 4,10% (100 –

Especificidade Relativa)

d) Método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido Rappaport-Vassiliadis

Modificado - Acumedia) com o Método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido

Rappaport-Vassiliadis Modificado - Oxoid)

O método AOAC 993-07 (Acumedia) detectou 137 amostras positivas

versus 102 do método AOAC 993-07 (Oxoid), sendo concordantes 96 e 360

amostras positivas e negativas, respectivamente, em ambos os métodos. 41

amostras foram positivas para o método AOAC 993-07 (Acumedia) e negativas

para o método AOAC 993-07 (Oxoid) e 6 amostras foram positivas para o método

AOAC 993-07 (Oxoid) e negativas no método AOAC 993-07 (Acumedia). O χ

24,60 (p=0,00001) demonstra diferença estatística entre os métodos. A

concordância relativa foi de 90,65%, a especificidade relativa foi de 89,77% e a

sensibilidade relativa foi de 94,11%. O método AOAC 993-07 (Oxoid) apresentou

uma taxa de Falso Negativo de 5,89% (100 – Sensibilidade Relativa) e a taxa de

Falso Positivo foi de 10,23% (100 – Especificidade Relativa).

e) Método ISO 6579 e o método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido

Rappaport-Vassiliadis Modificado - Oxoid);

O método ISO 6579 detectou 86 amostras positivas versus 102 do método

AOAC 993-07 (Oxoid), sendo concordantes 55 e 370 amostras positivas e

negativas, respectivamente, em ambos os métodos. 47 amostras foram positivas

para o método AOAC 993-07 (Oxoid) e negativas no método ISO 6579 e 31

amostras foram positivas no método ISO 6579 e negativas no método AOAC 993-

07 (Oxoid). O χ

= 2,88 (p=0,089) não demonstra diferença estatística entre os

métodos. A concordância relativa foi de 84,49%, a especificidade relativa foi de

88,73% e a sensibilidade relativa foi de 63,95%. O método AOAC 993-07 (Oxoid)

apresentou uma taxa de Falso Negativo de 36,05% (100 – Sensibilidade Relativa)

e a taxa de Falso Positivo foi de 11,27% (100 – Especificidade Relativa).

f) Método ISO 6579 com o método da AOAC (MSRV-Semi-Sólido

Rappaport-Vassiliadis Modificado - Acumedia);

O método ISO 6579 detectou 86 amostras positivas versus 137 do método

AOAC 993-07 (Acumedia), sendo concordantes 73 e 353 amostras positivas e

negativas, respectivamente, em ambos os métodos. 64 amostras foram positivas

para o método AOAC 993-07 (Acumedia) e negativas no método ISO 6579 e 13

amostras foram positivas no método ISO 6579 e negativas no método AOAC 993-

07 (Acumedia). O χ

= 32,47 (p=0,00001) demonstra diferença estatística entre os

métodos. A concordância relativa foi de 84,69%, a especificidade relativa foi de

84,65% e a sensibilidade relativa foi de 84,88%. O método AOAC 993-07

(Acumedia) apresentou uma taxa de Falso Negativo de 15,12% (100 –

Sensibilidade Relativa) e a taxa de Falso Positivo foi de 15,35% (100 –

Especificidade Relativa)

Tabela 2: Detecção de Salmonella spp em carcaças de frango e carnes suinas

pelas metodologias ISO 6579, AOAC 993-07 (Oxoid) e AOAC 993-07 (Acumedia)

e Bax System

ISO 6579 AOAC 993-07 Oxoid AOAC 993-07 Acumedia

BAX System

Positivo Negativo Total Positivo Negativo Total Positivo Negativo Total

Positivo 70 60 130 86 44 130 115 15 130

Negativo 16 357 373 16 357 373 22 351 373

Total 86 417 503 102 401 503 137 366 503

AOAC 993-07 Acumedia

Positivo 73 64 137 96 41 102 - - -

Negativo 13 353 366 6 360 401 - - -

Total 86 417 503 137 366 503 - - -

AOAC 993-07 Oxoid

Positivo 55 47 102 - - - - - -

Negativo 31 370 401 - - - - - -

Total 86 417 503 - - - - - -

(-) não se aplica

Tabela 3: Resultados estatísticos da detecção de Salmonella spp em amostras de

carcaças de frango e carnes suínas pelas metodologias ISO 6579, AOAC 993-07

(Oxoid), AOAC 993-07 (Acumedia) e Bax System

Métodos X

Valor p

ISO x BAX

24,33 0,0001 84,89 85,61 81,40 14,69 18,6

AOAC 993-07 Acumedia x BAX

0,97 0,324 92,64 95,90 83,94 4,10 16,06

AOAC 993-07 Oxoid x BAX

12,15 0,0001 88,07 89,02 84,31 10,98 15,69

ISO x AOAC 993-07 Acumedia

32,47 0,0001 84,69 84,65 84,88 15,35 15,12

ISO x AOAC 993-07 Oxoid

2,88 0,089 84,49 88,73 63,95 11,27 36,05

AOAC 993-07 Oxoid x Acumedia

24,60 0,0001 90,65 89,77 94,11 10,23 5,89

Legenda:

RE – Especificidade Relativa;

RS – Sensibilidade Relativa;

RA – Concordância Relativa;

FP – Falso Positive;

FN – Falso Negativo.

4 DISCUSSÃO

O método AOAC detectou o maior número de amostras positivas para Salmonella

sp quando comparado ao BAX System

. Por outro lado, o método ISO 6579 que é

considerado como método oficial para Salmonella spp, detectou o menor número de

amostras positivas comparado aos outros métodos.

Em comparação com o método ISO, a taxa de isolamento nos métodos AOAC

e BAX System

para Salmonella spp do total de amostras positivas (160) foi de

apenas 54%, enquanto o método AOAC isolou 85,6% (Acumedia), 63,8% (Oxoid)

e o método BAX System

81,3 %.

Embora tanto o método AOAC 993-07 como o método ISO sejam métodos

culturais, o método AOAC permite a identificação de colônias suspeitas de serem

salmonela logo no início da análise, a partir da multiplicação de colônias móveis,

isoladas no Ágar MSRV. Por outro lado, isso não é possível quando se emprega o

método ISO, uma vez que o uso dos caldos seletivos não permite essa seleção

prévia.

Outro aspecto a ser levado em consideração quanto ao método AOAC 993-07,

é o fato de ser possível detectar salmonela não móvel, pela semeadura de

colônias não típicas em ágar MSRV para meios seletivos diferenciais e posterior

identificação.

Nesse estudo, o método AOAC 993-07 foi o que mais isolou Salmonella spp

nas amostras analisadas. Recentemente o método AOAC 993-07 foi considerado

como um método ISO Horizontal para alimentos, rações e amostras na produção

primária de animais de abate (ISO 6579:2002/Amd.1:2007(E).

De acordo com Bennett et al., (1998) o BAX System

foi sempre positivo

quando a concentração de células de salmonela na água peptonada tamponada

(APT) foi de 5 x 10

CFU/mL ou maior. De acordo com De Smedt & Bolderdijk

(1987), o método AOAC (semi-sólido MSRV) foi sempre positivo quando a

concentração celular no APT foi de pelo menos 60 células por mL, independente

do alto número de células contaminantes também presentes no caldo. Isto

significa que o método AOAC (semi-sólido MSRV) tem 83 vezes mais capacidade

numérica de detecção quando comparado ao BAX System

. Este cálculo

matemático pode explicar, teoricamente, as amostras negativas obtidas com o

BAX System

, mas não explica os resultados negativos no método AOAC (semi-

sólido MSRV). Esse método não detecta células não móveis e isto pode explicar a

diferença entre os dois métodos quando o BAX System

detectou Salmonella spp

e o método AOAC não detectou.

Outra explicação para a detecção de amostras positivas pelo BAX System

negativas pelo método AOAC, mas com poucas probabilidades, poderia ser

atribuída ao estado fisiológico das células, porque o DNA pode persistir em

células mortas e ser amplificado pela PCR (DUPRAY et al., 1997; HERMAN 1997;

KLEIN & JUNEJA 1997; MASSO & OLIVA 1997, SHERIDAN et al., 1998), e,

portanto, esta técnica não poderia ser usada para diferenciar células viáveis de

não viáveis, (McKILLIP et al., 1999), daí a necessidade de confirmação com

métodos culturais, onde se obtém células vivas para confirmação.

A probabilidade de existência de células mortas presentes na superfície da

pele é indiscutível, pois também existem células vivas que pretendemos

multiplicar para o teste de detecção em qualquer dos métodos existentes para

Salmonella spp. Não se sabe ainda, qual é a proporção de multiplicação de

células presentes no animal ou ave ainda viva e, qual proporção padece devido a

processos de abate, como durante a escaldagem, por exemplo, e, permanecendo

na derme como célula morta, possa ser detectado devido a amplificação de DNA

nas técnicas de PCR.

O método AOAC 993-07 (Acumedia) detectou mais amostras Salmonella sp

positiva do que o método AOAC 993-07 (Oxoid). A diferença encontrada entre os

dois fornecedores de MSRV (Oxoid e Acumedia) está no valor de pH de cada

meio. O meio fornecido pela Oxoid possui um pH de 5,2 +/- 0,2 e o fornecido pela

Acumedia possui pH de 5,4 +/-0,2. O pH menor do meio Oxoid, por ser mais

seletivo, poderia explicar a menor taxa de recuperação de salmonelas nas

amostras analisadas, comparadas ao meio da Acumedia.

De acordo com o Manual do fabricante do BAX System

, as vantagens deste

método combinam velocidade e facilidade de manuseio. Além disso, o método

também proporciona resultados em 30 +/- 1h. Esta diminuição reduz,

potencialmente, o problema de contaminação cruzada. Não requer interpretação

de um especialista, e permite processar até 96 amostras em uma única vez. Esta

prática é de alta valia para uso rotineiro de laboratório.

Para o método AOAC 993-07, a confirmação não é tão dependente da

experiência do operador. Isto se deve ao fato da leitura de motilidade ser simples

e visualmente sem evidência de dúvidas. A possibilidade de positividade é

decorrente da migração das células, que elimina praticamente toda a microbiota

acompanhante, produzindo colônias mais puras. O repique é realizado em Ágar

seletivo-diferencial a partir da área de migração mais externa destas colônias e,

consequentemente, quando se multiplicam nos mesmos são facilmente

diferenciadas e geralmente puras e típicas. Este fato é usado por vários autores

(DE SMEDT et al., 1986) e pelo método oficial da AOAC 993.07 (AOAC, 2006)

para realizar o ensaio sorológico das culturas que apresentam migração

diretamente do meio MSRV por considerá-las puras (MASSO & OLIVA, 1997).

Em contra partida, quando usamos o BAX System

, não é possível identificar

a cepa em estudos epidemiológicos, exceto quando as culturas são obtidas do

pré-enriquecimento ou enriquecimento seletivo para o isolamento de colônias, as

quais foram positivas. Um procedimento somente possível a partir de meios

culturais.

Após enriquecimento, o Ágar MSRV, apesar da facilidade de uso, requer 24

horas de incubação e a confirmação de amostras presuntivamente positivas ou

definitivamente negativas. Amostras presuntivamente positiva podem ser

confirmado por testes sorológicos diretamente da placa de MSRV e, também pelo

isolamento de colônias pela semeadura da área mais externa do halo de

migração em meios seletivos diferenciais como Agar XLD, BPLS (Brilliant-green

Phenol-red Lactose Sucrose Agar), HE ou outros meios a escolha do analista.

Colônias isoladas após 24 horas podem ser usadas para confirmação por testes

bioquímicos adicionais para confirmação definitiva e, inclusive, também por testes

genéticos. As cepas confirmadas podem ser usadas para estudos

epidemiológicos após definição do sorotipo.

O método AOAC (MSRV) permite a diferenciação de Salmonella sp após 24h

de incubação a 42ºC, baseado na ativa motilidade destes microrganismos no

meio, em contraste com a inabilidade dos competidores para migrar com a

mesma velocidade. As zonas de migração de Salmonella sp podem alcançar raios

de 10 a 40 mm. Nos casos de zonas de migração iguais ou superiores a 10 mm, a

presença de Salmonella sp pode ser esperada (DE SMEDT et al.,1986; SILVA &

EIROA, 1993).

O interesse da indústria de alimentos é encontrar e usar um método que

detecte o maior índice possível de amostras positivas com o objetivo de encontrar

a melhor resposta aos procedimentos de prevenção e monitoramento do

programa de redução de patógenos adotado pela companhia e com isso reduzir a

freqüência deste patógeno. Mais especificamente, o objetivo é estar seguro que o

novo método a ser utilizado é capaz de detectar maior número de amostras

positivas que o método anteriormente em uso na rotina de seu laboratório. A

possibilidade de maior freqüência no isolamento de Salmonella spp em amostras

naturalmente contaminadas pode ser atribuída a maior eficácia do novo método e

não poderá ser atribuída a possíveis falhas nos programas de qualidade

(Redução de Patógenos) adotados pela companhia.

A combinação de pelo menos dois métodos analíticos aqui comparados e com

maior rendimento na detecção de amostras positivas (AOAC-MSRV e BAX

System

) tem a vantagem de obtenção de reultado positivo ou negativo em 30

horas (BAX System

). O microrganismo deverá ser isolado pelo método cultural

(AOAC-MSRV), que poderá ser utilizado para fins epidemiológicos e ainda, a

critério do laboratório, eliminar a possibilidade de falso positivo gerado pelo PCR

(BAX System

) devido a possibilidade, mesmo que com pouca probabilidade, da

amplificação de DNA de células mortas de Salmonella spp presentes na amostra,

como conseqüência de processos industriais. Isto requer sim, um especialista

com conhecimento de processos industriais, microbiologia de alimentos e

métodos analíticos empregados para análise de amostras.

Os resultados deste estudo são concordantes com outros que, da mesma

forma, confirmaram a boa produtividade do MSRV na detecção de Salmonella sp

em carcaças de frango e carnes cruas (AFFLU & GYLES 1997; MASSO & OLIVA

1997; POPPE & DUNCAN 1996; SCHALCH & EISGRUBER 1997).

5 CONCLUSÕES

Resultados desse estudo demonstram que o método AOAC 993-07, com uso

de meio MSRV (Acumedia) com pH 5,4 e o BAX System

, não diferiram

significativamente para as amostras analisadas. O método por PCR – BAX

System

- pode ser considerado como método screening, e deve ter seus

resultados positivos confirmados por um método cultural, neste caso o MSRV. O

método AOAC 993-07 é mais eficiente quanto ao número absoluto de amostras

positivas encontradas; deveria ser, portanto, considerado como método de rotina,

e também pelo menos, como mais um método oficial para amostras de carnes

vermelhas e de aves, em detrimento do método ISO 6579, considerado hoje como

método padrão.

6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AFFLU, L., GYLES, C.L. A comparison of procedure involving Single Step

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detection of Salmonella in ground beef. International Journal of Food

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SCHALCH, B., EISGRUBER, H. Nachweis von Salmonellen mittels MSRV-

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Colet. ITAL, Campinas 23(1), p. 68-77, jan/jun.1993;

CAPÍTULO 3 Comparação do sistema BAX



com o

método MSRV para detecção de Salmonella sp em

carcaça de frango e carnes suínas.

“Comparison of the BAX System

with the MSRV method for the

detection of Salmonella in chicken carcasses and pork meat”.

CAPÍTULO 4 METODOLOGIA ESTATÍSTICA PARA

DETECÇÃO DE PATÓGENOS.

“STATISTICAL METHODOLOGY FOR PATHOGEN

DETECTION”

CAPÍTULO 5 COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS ISO

11290-1/A1, ISO 11290-1/A1 MODIFICADO, USDA/FSIS

MODIFICADO E O BAX SYSTEM

(DUPONT-QUALICOM)

NA DETECÇÃO DE LISTERIA MONOCYTOGENES EM

CARNES E PRODUTOS CÁRNEOS NATURALMENTE

CONTAMINADAS

CAPÍTULO 5 Comparação entre os métodos ISO 11290-1/A1, ISO 11290-1/A1

modificado, USDA/FSIS modificado e o BAX System

(DuPont-Qualicom) na

detecção de Listeria monocytogenes em carnes e produtos cárneos naturalmente

contaminadas

1 INTRODUÇÃO

Esse estudo tem como objetivo comparar o desempenho entre os métodos

ISO 11290-1/A1, ISO 11290-1/A1 modificado (substituição do Caldo Fraser por

Caldo MOPS-BLEB), USDA/FSIS modificado (substituição do Ágar Oxford por

Ágar ALOA) e o BAX System

(DuPont-Qualicom); na detecção de Listeria

monocytogenes em salsichas, bacon fatiado, carcaças de frango e cortes de

carne suína naturalmente contaminada, conforme descrito abaixo:

Método ISO 11290-1/A1 com o BAX System

Método ISO 11290-1/A1 modificado com o BAX System

;

Método USDA/FSIS modificado com o BAX System

Método USDA/FSIS modificado com o método ISO 11290-1/A1.

Método USDA/FSIS modificado com o método ISO 11290-1/A1 modificado.

Método ISO 11290-1/A1 com o método ISO 11290-1/A1 modificado

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Amostras

Nesse estudo foram analisados um total de 334 amostras constituídas de

salsichas resfriadas (89), bacon fatiado (116), carnes suínas cruas (52) e carcaça

de frango resfriado (77). As amostras foram coletadas na linha de processamento

em uma Indústria com SIF localizada no estado de Santa Catarina.

Amostras de carnes suínas cruas e frango resfriado foram analisadas com o

objetivo de avaliar amostras naturalmente contaminadas que apresentassem uma

carga microbiana maior e mais diversificada do que aquela presente em salsichas

e bacon fatiado, conforme experiência prévia do autor.

As amostras foram analisadas, simultaneamente, pela combinação dos

métodos ISO 11290-1/A1 (SKOVGAARD, 2002, ISO 11290-1/A1, 2004) ISO

11290-1/A1 modificado, USDA/FSIS (COOK, 1999) modificado e o método PCR

BAX System

Nesse estudo também se avaliou o uso do plaqueamento direto a partir do

caldo de pré-enriquecimento, bem como a combinação de isolados positivos com

a leitura de esculina no caldo Fraser. Avaliou-se, também, o uso de diferentes

meios de cultura para pré-enriquecimento e enriquecimento seletivo, como caldo

Demi-Fraser, caldo UVM (University of Vermont medium), caldo Fraser, caldo

MOPS-BLEB (3-(Morpholino) propanesulfonic acid - Listeria enrichment Broth),

com plaqueamento sempre em Ágar ALOA.

2.2 Método ISO 11290-1/A1

Um total de 70 gramas de amostra foi homogeneizado em 140 g de solução

fisiológica em homogeneizador peristáltico por 2 minutos, e deixada decantar por

+/- 3 minutos. Após decantação da amostra por +/- 3 minutos, um total de 30 mL

de amostra foi transferido para 70 mL de caldo Demi Fraser concentrado 1,285

vezes, e incubado por 24/26 horas a 30ºC. Após o pré-enriquecimento, do caldo

Demi Fraser, transferiu-se 0,1 mL para caldo Fraser (Oxoid CM 895) adicionado

de suplemento seletivo (Oxoid SR 156) (Citrato férrico amoniacal 0,5g/L, ácido

nalidíxico, 20mg/L e Cloreto de acriflavina 25g/L de meio base), incubou-se a

37ºC por 24/48 horas , bem como transferiu-se com alça de platina 5 µL para

Ágar ALOA (Biolife 4016052) adicionado de suplemento seletivo (Biolife –

423501) (ácido nalidixíco 10 mg/L, ceftazidine 10 mg/L, cycloheximide 50 mg/L,

polimixina B 38350 UI e L-α-fosfatidilinositol 1 g). Incubou-se o Ágar ALOA por

24/48 horas a 35ºC e o caldo Fraser 24/48 horas a 37ºC em estufa bacteriológica.

Do caldo Fraser após 24 e 48 horas de incubação a 37ºC, foi feita a leitura da

hidrólise de esculina e, sendo positiva ou negativa, transferiu-se com auxílio de

alça de platina 5µL para Ágar ALOA e incubou-se por 24/48 horas a 35ºC.

Transferiu-se as colônias características com halo de cor azul esverdeada,

para Ágar motilidade (BBL 211436) e incubou-se por 3 dias a 22ºC, bem como

efetuou-se o teste de catalase com peróxido de hidrogênio a 3%, teste de

motilidade por microscopia em contraste de fase, teste CAMP (Ágar base de

sangue de carneiro Newprov), utilizando cepa de Staphylococcus aureus 25923

(Oxoid) e cepa de Rodoccoccus equi ATCC 6939 (Oxoid), prova sorológica com

soro polivalente (Difco 2302-50-0), além do teste de fermentação de ramnose

(Phenol Red Broth base Difco 292100).

Foram consideradas como sendo L. monocytogenes as leituras com testes

positivos para: catalase, motilidade (em forma de guarda chuva), ramnose, CAMP

teste frente a S. aureus e, para aglutinação frente ao soro polivante (Figura 1).

2.3 Método ISO11290-1/A1 modificado (1)

Esse procedimento difere do item 2.2 pela substituição do caldo Fraser por

caldo MOPS-BLEB no enriquecimento seletivo (Figura 2).

2.4 Método PCR BAX System

segundo protocolo do fabricante

Um total de 70 gramas de amostra foi homogeneizado em 140 g de solução

fisiológica em homogeneizador peristáltico por 2 minutos, e deixada decantar por

+/- 3 minutos. Após decantação da amostra por +/- 3 minutos, 30 mL de amostra

foi transferido para 70 mL de caldo Demi Fraser concentrado 1,285 vezes, e

incubado por 24/26 horas a 30ºC e então transferido 0,1 mL para 10 mL de caldo

MOPS-BLEB (Tecra TLEMED 500), que incubou-se por 24 horas a 37°C.

Após o enriquecimento da amostra em caldo MOPS-BLEB, ligou-se o

termociclador/detector e o computador; esperou-se um minuto e iniciou-se a

utilização do BAX System

com a digitalização dos dados da amostra conforme

instrução do manual do usuário. Adicionou-se 150 µL de protease para 12 mL de

tampão lise e transferiu-se 200 µL do reagente de lise para cada tubo de reação

lise. A este tubo de reagente lise adicionou-se 5 µL da amostra proveniente do

caldo de enriquecimento seletivo (MOPS-BLEB, ou caldo Fraser, quando usado

método modificado de enriquecimento seletivo) utilizando ponteiras descartáveis;

fechou-se os tubos e efetuou-se a reação de lise. Para Listeria monocytogenes a

reação foi realizada a 55ºC por 60 minutos para ocorrer à lise celular e a digestão

de proteínas, e depois 95ºC por 10 minutos para inativação da protease. Estas

operações foram realizadas em blocos aquecedores para tubos de PCR

previamente aquecidos. Os tubos foram então resfriados em bloco de

resfriamento previamente mantidos em geladeira. Os tubos permanecem neste

bloco por cerca de 5 minutos. Pipetou-se então 50 µl de amostra contida nos

tubos de lise para tubos contendo tablete de PCR acondicionados no bloco de

resfriamento e fechou-se com tampas óticas com auxílio de ferramenta específica

fornecida pelo fabricante. Levou-se o bloco para o termociclador/detector e deu-se

inicio ao programa automatizado. Após amplificação, uma janela se abre e cada

poço aparece com uma cor diferente e um símbolo no centro de cada poço. Um

sinal de menos indica que o teste é negativo para o organismo alvo (Figura 3).

2.5 Método USDA/FSIS modificado

Esse procedimento foi modificado pela substituição do Ágar Oxford Modificado

por Ágar ALOA.

Um total de 70 gramas de amostra foi homogeneizado em 140 g de solução

fisiológica em homogeneizador peristáltico por 2 minutos, e deixada decantar por

+/- 3 minutos. Após decantação da amostra em 5.2.1, transferiu-se 30 mL de

amostra para saco Whirl-Pak estéril (Nasco) contendo 70 mL de caldo UVM

concentrado 1,285 vezes (Oxoid CM 863), adicionado de suplemento seletivo

(Oxoid SR 142E) (ácido nalidíxico 20 mg/L de meio base e acriflavina HCl 12

mg/L de meio base). Incubou-se o caldo UVM a 30°C por 24 horas e, após

incubação, transferiu-se 0,1 mL para 10 mL de caldo Fraser (Oxoid CM 895)

adicionado de suplemento seletivo (Oxoid SR 156) (Citrato férrico amoniacal

0,5g/L, ácido nalidíxico, 20mg/L e Cloreto de acriflavina 25g/L de meio base), que

incubou-se a 37ºC por 24/48 horas. Transferiu-se também 5 µL com auxílio de

alça de platina para Ágar ALOA que incubou-se por 24/48 horas a 35ºC. Do caldo

Fraser, depois de registrada a leitura de esculina, transferiu-se 5 µL, com auxílio

de alça de platina, para Ágar ALOA e incubou-se por 24/48h a 35ºC. Das

colônias características para Listeria monocytogenes procedeu-se às reações

bioquímicas e sorológicas citadas no item 2.2 (Figura 4).

2.6 Análise estatística

A análise estatística foi feita conforme o teste não paramétrico de McNemar

(SIEGEL, S. 1956), (|ND – PD| - 1)

/(ND+PD) = χ

(χ

> 3,84 é significativo ao

nível de p = 0,05) e conforme a norma ISO 16140, para amostras naturalmente

contaminadas , item 5 – Métodos Qualitativos – Protocolo técnico para suas

validações, onde são definidos:

f) Concordância relativa (RA): Grau de correspondência entre a resposta

obtida pelo método de referência e a resposta obtida pelo método

alternativo em amostras idênticas;

g) Desvio Positivo (PD): O método alternativo se torna um falso positivo

quando mostra um desvio positivo se ele indica um resultado positivo

quando o método de referência indica um resultado negativo;

h) Desvio Negativo (ND): O método alternativo indica um desvio negativo se

ele dá um resultado negativo quando o método de referência dá um

resultado positivo;

i) Sensibilidade relativa (RS): Capacidade do método alternativo para

detectar o alvo quando ele é detectado pelo método de referência;

Especificidade relativa (RE): Capacidade do método alternativo de não

detectar o alvo quando ele não é detectado pelo método de referência;

O cálculo da concordância relativa, sensibilidade relativa e especificidade

relativa para Listeria monocytogenes é apresentado na Tabela 1.

0,1mL 5

µL

Figura 1. Detecção de Listeria monocytogenes pelo método ISO 11290-1/A1.

FRASER

37ºC +

2 / 24-48hs

30mL amostra +70mL DF

30ºC / 24-26hs

ÁGAR ALOA

35ºC +

2 / 24-48hs

Colônias azuis esverdeadas c/

halo

Colônia azul esverdeada s/

halo

CAMP-TEST

35ºC +

2 / 24 hs

CALDO RHAMNOSE

35ºC +

2 / 24 hs

ÁGAR MOTILIDADE

21ºC / 3-5 dias

SOROLOGIA

CATALASE

ÁGAR MOTILIDADE

21ºC / 3-5 dias

ÁGAR ALOA

35ºC +

2 / 24-48hs

Colônias azuis esverdeadas c/

halo

Colônia azul esverdeada s/

halo

CAMP-TEST

35ºC +

2 / 24 hs

CALDO RHAMNOSE

35ºC +

2 / 24 hs

ÁGAR MOTILIDADE

21ºC / 3-5 dias

SOROLOGIA

CATALASE

ÁGAR MOTILIDADE

21ºC / 3-5 dias

0,1mL 5µL

5µL

Figura 2. Detecção de Listeria monocytogenes pelo método ISO 11290-1/A1

Modificado.

MOPS

1 / 24hs

30mL amostra + 70mL DF

C/24

26hs

ÁGAR ALOA

35ºC +

2 / 24-48hs

Colônias azuis esverdeadas c/

halo

Colônia azul esverdeada s/

halo

CAMP-TEST

35ºC +

2 / 24 hs

CALDO RHAMNOSE

35ºC +

2 / 24 hs

ÁGAR MOTILIDADE

21ºC / 3-5 dias

SOROLOGIA

CATALASE

ÁGAR MOTILIDADE

21ºC / 3-5 dias

ÁGAR ALOA

35ºC +

2 / 24-48hs

Colônias azuis esverdeadas c/

halo

Colônia azul esverdeada s/

halo

CAMP-TEST

35ºC +

2 / 24 hs

CALDO RHAMNOSE

35ºC +

2 / 24 hs

ÁGAR MOTILIDADE

21ºC / 3-5 dias

SOROLOGIA

CATALASE

ÁGAR MOTILIDADE

21ºC / 3-5 dias

0,1mL

5µL

50µL

Figura 3. Detecção de Listeria monocytogenes pelo BAX System

30mL amostra + 70mL DF

30ºC / 24-26hs

MOPS

37ºC +

1 / 22-26hs

Lise celular

55ºC / 1 hora

95ºC / 10 min

↓ 8ºC / 5 min

Hidratar os tabletes do rack

PCR

Inserir o rack no

termobloco e iniciar a

corrida

Positivo para

organismo alvo

Negativo para

organismo alvo

0,1mL 5µL

0,5µL

Figura 4. Detecção de Listeria monocytogenes pelo método USDA/FSIS

Modificado.

FRASER

1/24

48hs

30mL amostra + 70mL UVM

C/24

26hs

ÁGAR ALOA

35ºC +

2 / 24-48hs

Colônias azuis esverdeadas c/

halo

Colônia azul esverdeada s/

halo

CAMP-TEST

35ºC +

2 / 24 hs

CALDO RHAMNOSE

35ºC +

2 / 24 hs

ÁGAR MOTILIDADE

21ºC / 3-5 dias

SOROLOGIA

CATALASE

ÁGAR MOTILIDADE

21ºC / 3-5 dias

ÁGAR ALOA

35ºC +

2 / 24-48hs

Colônias azuis esverdeadas c/

halo

Colônia azul esverdeada s/

halo

CAMP-TEST

35ºC +

2 / 24 hs

CALDO RHAMNOSE

35ºC +

2 / 24 hs

ÁGAR MOTILIDADE

21ºC / 3-5 dias

SOROLOGIA

CATALASE

ÁGAR MOTILIDADE

21ºC / 3-5 dias

Tabela 1: Cálculo da concordância relativa, sensibilidade relativa e especificidade relativa na detecção de Listeria monocytogenes.

Métodos Sum

Concordância

Relativa RA (%)

N+

Sensibilidade

Relativa RS (%)

N-

Especificidade

Relativa RE (%)

100x(PA + NA) 100x PA 100x NA

Referencia Alternativo

(++)

(--)

(+-)

(-+)

PA + NA

PA + ND

N+

NA + PD

N-

ISO BAX 158 135 12 29 6,24

334

293 87,72 170 92,94 164 82,31

ISO Modificado BAX 158 144 3 29 19,53

334

302 90,42 161 98,13 173 83,23

ISO ISO modificado 157 160 13 4 3,76

334

317 94,91 170 92,35 164 97,56

USDA

Modificado

BAX 145 127 20 42 7,11

334

272 81,43 165 87,88 169 75,14

ISO

USDA

Modificado

139 138 31 26 0,28

334

277 82,93 170 81,76 164 84,14

USDA ISO modif. 130 138 35 31 0,13

334

268 80,23 165 78,78 169 81,65

Legenda:

RE - Especificidade Relativa;

RS - Sensibilidade Relativa;

RA - Concordância Relativa;

PA - concordância de amostras com resultados positivos em ambos os métodos (+/+);

NA - concordância de amostras com resultados negativos em ambos os métodos (-/-);

PD - Desvio positivo (método de referência negativo e método alternativo positivo (R-/A+);

ND - Desvio negativo (método de referência positivo e método alternativo negativo (R+/A-);

3 RESULTADOS

Os resultados desse estudo mostram que:

O método ISO 11290-1/A1 (DFA + DFFA) isolou 170 cepas de Listeria

monocytogenes versus 187 do BAX System

, sendo concordantes 158 e 135

amostras positivas e negativas, respectivamente, em ambos os métodos. 29

amostras foram positivas para o BAX System

e negativas para o método ISO e

12 amostras positivas no método ISO e negativas no BAX System

. O χ

igual a

6,24 (p=0,0125) demonstra diferença estatística entre os métodos. A

concordância relativa foi de 87,72 %, a especificidade relativa foi de 82,31 % e a

sensibilidade relativa foi de 92,94%. O BAX System

apresentou uma taxa de

falso negativo de 7,06 % e a taxa de falso positivo de 17,69 % (Tabela 2 e Tabela

O método ISO modificado (DFA + DFMA) isolou 161 cepas de L.

monocytogenes versus 187 do BAX System

, sendo concordantes 158 e 144

amostras positivas e negativas, respectivamente, em ambos os métodos. 29

amostras foram positivas para o BAX System

e negativas para o método cultural

e três amostras positivas no método cultural e negativo no BAX System

. O χ

igual a 19,53 (p=0,00001) demonstra diferença estatística entre os métodos. A

concordância relativa foi de 90,42 %, a especificidade relativa foi de 83,23% e a

sensibilidade relativa foi de 98,13%. O BAX System

apresentou uma taxa de

falso negativo de 1,87% e a taxa de falso positivo de 16,77% (Tabela 2 e Tabela

3).

O Método USDA/FSIS modificado (UVMA + UVMFA) isolou 165 cepas de

L. monocytogenes versus 187 do BAX System

, sendo concordantes 145 e 127

amostras positivas e negativas, respectivamente, em ambos os métodos. 42

amostras foram positivas para o BAX System

e negativas para o método

USDA/FSIS e 20 amostras positivas no método USDA/FSIS e negativas no BAX

System

. O χ

igual a 7,11 (p=0,0077) demonstra diferença estatística entre os

métodos. A concordância relativa foi de 81,43%, a especificidade relativa foi de

75,14 % e a sensibilidade relativa foi de 87,88%. O BAX System

apresentou uma

taxa de falso negativo de 12,12 % e a taxa de falso positivo de 24,86% (Tabela 2

e Tabela 3).

A combinação dos métodos de isolamento em Ágar ALOA a partir dos caldos

de pré-enriquecimento DF (ISO) e UVM (USDA/FSIS modificado) comparadas

ao BAX System

resultou em 164 amostras positivas e 130 amostras negativas,

respectivamente, para ambos os métodos. 17 amostras foram negativas no BAX

System

e positivas na combinação de caldos de pré enriquecimento e 23

amostras foram positivas no BAX System

e negativas na combinação de caldos

de pré-enriquecimento. Não há diferença estatística (χ

= 0,625; p=0,4292) entre

os métodos de isolamento a partir dos caldos de pré-enriquecimento comparadas

ao BAX System

(Tabela 4).

Comparando todos os meios culturais combinados (ISO 11290-1/A1, ISO

modificado e USDA/FSIS modificado) versus o BAX System

temos 176 e 126

amostras foram positivas e negativas para a combinação dos métodos

respectivamente. 21 amostras foram positivas em pelo menos um dos métodos

culturais e negativas no BAX System

e 11 amostras foram positivas no BAX

System

e negativas nos métodos culturais (χ

= 2,53; p=0,111). Das 11 amostras

positivas no BAX System

e negativas nos métodos culturais, oito foram

sorotipadas no Instituto Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro) como Listeria innocua e

três como Listeria innocua não tipável (Tabela 4).

O método ISO (DFA + DFFA) isolou 170 cepas de Listeria monocytogenes

versus 165 do método USDA/FSIS modificado, (UVMA + UVMFA), sendo

concordantes 139 e 138 amostras positivas e negativas, respectivamente, em

ambos os métodos. 26 amostras foram positivas para o método USDA/FSIS e

negativas para o método ISO e 31 amostras positivas no método ISO e negativas

para o método USDA/FSIS. O χ

igual a 0,280 (p=0,5962) não demonstra

diferença estatística entre os métodos. Juntos, isolaram 196 amostras positivas

para L. monocytogenes. A concordância relativa foi de 82,93 %, a especificidade

relativa foi de 84,14 % e a sensibilidade relativa foi de 81,76%. O método

USDA/FSIS modificado apresentou uma taxa de falso negativo de 18,24 % e a

taxa de falso positivo de 15,86 % (Tabela 2 e Tabela 3).

Considerando-se o plaqueamento direto para Ágar ALOA, das culturas

provenientes dos caldos de enriquecimento primário, ou seja, UVM (USDA/FSIS

modificado) e DF (ISO), observaram-se 99 amostras positivas e 153 amostras

negativas concordantes para ambos os métodos. 44 amostras foram positivas no

caldo DF e negativas no UVM, e 38 amostras foram positivas no UVM e negativas

no DF. Não há diferença estatística significativa entre os isolados a partir de

quaisquer dos caldos utilizados (χ

= 0,30; p=0.5808). Juntos isolaram 181

amostras positivas para Listeria monocytogenes (Tabela 2).

O isolamento a partir dos caldos de enriquecimento secundários (caldo Fraser)

oriundos dos caldos de pré enriquecimento Demi Fraser (ISO) e UVM

(USDA/FSIS modificado) houve menos isolamentos de L. monocytogenes no

total das amostras analisadas, com 178 isolados positivos, sendo 142 amostras

positivas quando oriundas do caldo UVM e 149 positivas quando oriundas do

caldo Demi Fraser. 113 amostras foram positivas para ambos os caldos e 156

negativas. A partir do caldo MOPS isolou-se somente 138 amostras positivas.

Quando se testou o método ISO 11290-1/A1 (DF + F + ALOA) de 289 isolados

Frazer esculina positiva, 241 confirmaram ser Listeria spp em Ágar ALOA, dos

quais 148 foram L. monocytogenes e 93 Listeria sp, porém 48 amostras esculina

positivo não confirmaram ser Listeria spp. Por outro lado, de 45 amostras Frazer

esculina negativas, duas confirmaram ser Listeria spp no Ágar ALOA, das quais

uma foi L. monocytogenes e a outra Listeria sp. A amostra que resultou positiva

para L. monocytogenes, também foi positiva, a partir do plaqueamento direto do

caldo UVM, para Ágar ALOA, no protocolo USDA/FSIS modificado. A amostra

dada como Listeria sp, foi positiva para esculina a partir do caldo UVM com 24

horas, mas negativa para Listeria sp após plaqueamento em Ágar ALOA,

conforme disposto na Tabela 5.

A Tabela 5 apresenta o método USDA/FSIS modificado (UVM + F+ ALOA),

de 279 isolados Frazer esculina positivos, 229 confirmaram ser Listeria spp em

Ágar ALOA, dos quais 142 foram L. monocytogenes e 87 Listeria sp. Porém, 50

isolados esculina positivos não confirmaram ser Listeria spp no Ágar ALOA. Esta

amostra foi positiva para esculina em caldo Fraser quando originada do caldo

Demi-Fraser e dada como Listeria sp nas demais condições do estudo. Este

último resultado confirma o encontrado quando se testou o método ISO 11290-

1/A1.

O método ISO modificado (DFA + DFMA) isolou 161 cepas de L.

monocytogenes versus 165 do USDA/FSIS modificado (UVMA + UVMFA), sendo

concordantes 130 e 138 amostras positivas e negativas, respectivamente, em

ambos os métodos. 31 amostras foram positivas para o método ISO modificado e

negativo para o método USDA/FSIS modificado e 35 amostras positivas no

método USDA/FSIS modificado e negativo para o método ISO modificado. O χ

igual a 0,1363 (p=0,7119) não demonstra diferença estatística entre os métodos.

Juntos, isolaram 196 amostras positivas para L. monocytogenes. A concordância

relativa foi de 80,23%, a especificidade relativa foi de 81,65% e a sensibilidade

relativa foi de 78,78%. O método ISO modificado apresentou uma taxa de falso

negativo de 21,22% e a taxa de falso positivo de 18,35% (Tabela 2 e Tabela 3).

O método ISO 11290-1/A1 (DFA + DFFA) isolou 170 cepas de L.

monocytogenes versus 161 do método ISO 11290-1/A1 modificado (DFA +

DFMA), sendo concordantes 157 e 160 amostras positivas e negativas,

respectivamente, em ambos os métodos. Quatro amostras foram positivas para o

método ISO modificado e, negativas para o método ISO 11290-1/A1 e 13

amostras positivas no método ISO 11290-1/A1 e negativas para o método ISO

modificado. O χ

igual a 3,76 (p=0,0524) não demonstra diferença estatística entre

os métodos. Juntos, isolaram 174 amostras positivas para L. monocytogenes. A

concordância relativa foi de 94,91%, a especificidade relativa foi de 97,56% e a

sensibilidade relativa foi de 92,35%. O método ISO modificado apresentou uma

taxa de falso negativo de 7,65% e a taxa de falso positivo de 2,44 % (Tabela 2 e

Tabela 3).

Tabela 2: Detecção de Listeria monocytogenes pelas metodologias ISO 11290-1/A1, ISO 11290-1/A1 Modificado,

USDA Modificado e BAX System

ISO11290-1/A1

(DF-F-A)

ISO 11290-1/A1 modif.

(DF-M-A)

USDA/FSIS modif.

(UVM-F-A)

ISO11290-1/A1

(DF-A)

BAX System

Positivo Negativo

Total Positivo Negativo

Total

Positivo Negativo

Total

Positivo Negativo

Total

Positivo 158 29

187

158 29

187

145 42

187 - - -

Negativo 12 135

147

3 144

147

20 127

147 - - -

Total 170 164 334 161 173 334 165 169 334 - - -

USDA/FSIS modif.

(UVM-F-A)

Positivo 139 26 165 130 35

165

- - - - - -

Negativo 31 138 169 31 138

169

- - - - - -

Total 170 164 334 161 173 334 - - - - - -

ISO 11289-1/A1 modif.

(DF-M-A)

Positivo 157 4

161

- - - - - -

- - -

Negativo 13 160

173

- - - - - -

- - -

Total 170 164 334 - - - - - - - -

USDA/FSIS modif.

(UVM-A)

Positivo - - - - - -

- - - 99 38 137

Negativo - - - - - -

- - - 44 153 197

Total

- - - - - - - - -

143 191 334

Legenda:

DF = Caldo Demi-Fraser

F = Caldo Fraser

A = Agar Aloa

M = Caldo MOPS

UVM = Caldo UVM

Tabela 3. Resultados estatísticos da detecção de Listeria monocytogenes em

amostras de salsichas resfriadas, bacon, carcaças de frango resfriado e carnes

suínas cruas pelas metodologias ISO 11290-1/A1, ISO 11290-1/A1 Modificado,

USDA Modificado e BAX System

Métodos X

Valor p

ISO x BAX 6,24 0,013 87,72 82,31 92,94 17,69 7,06

ISOm x BAX 19,53 0 90,42 83,23 98,13 16,77 1,87

USDA x BAX 7,11 0,007 81,43 75,14 87,88 24,86 12,12

ISO x USDA 0,28 0,59 82,93 84,14 81,76 15,86 18,24

ISO x ISOm 3,76 0,052 94,91 97,56 92,35 2,44 7,65

USDA x ISOm 0,13 0,71 80,23 81,65 78,78 18,35 21,22

Legenda:

RE – Especificidade Relativa;

RS – Sensibilidade Relativa;

RA – Concordância Relativa;

FP – Falso Positive;

FN – Falso Negativo.

Tabela 4. Detecção de L. monocytogenes em amostras de salsichas resfriadas,

bacon, carcaças de frango resfriado e carnes suínas cruas pela combinação das

metodologias ISO 11290-1/A1, ISO 11290-1/A1 Modificado, USDA Modificado e

BAX System

ISO11290-1/A1

USDA/FSIS modif.

ISO11290-1/A1

ISO 11290-1/A1 modif.

USDA/FSIS modif.

BAX

Positivo Negativo

Total

Positivo Negativo

Total

Positivo

164 23 187 176 11 187

Negativo

17 130 147 21 126 147

Total 181 153 334 197 137 334

Tabela 5. Identificação de Listeria spp a partir da reação de esculina de isolados

obtidos pela metodologia ISO 11290-1/A1 e USDA/FSIS modificado.

ISSO 11290-1/A1 USDA/FSIS modificado

Caldo Fraser

Esculina +

Caldo Fraser

Esculina -

Caldo Fraser

Esculina +

Caldo Fraser

Esculina -

Listeria

monocytogenes

148 1 142 0

Listeria sp

93 1 87 1

Não Listeria sp

48 43 50 54

ISO 11290-1/A1 ⇒ Demi-Fraser → Fraser → Agar ALOA

USDA/FSIS modificado ⇒ UVM → Fraser → Agar ALOA

4 DISCUSSÃO

Os resultados das comparações de protocolos analíticos para análise de

Listeria monocytogenes em carnes e produtos cárneos, com o método ISO

11290-1/A1 e USDA/FSIS modificado, tidos como método de referência neste

estudo, indicam que o uso de um único protocolo de isolamento pode resultar em

13 a 16% a menos de resultados positivos para L. monocytogenes. Apesar de

este índice parecer alto, não apresentou diferença estatística significativa quando

comparados entre si. Combinados os dois métodos, a taxa de isolamento de L.

monocytogenes subiu de 86,73 % para 99,49 %. Na comparação do método ISO

11290-1/A1 versus o método ISO modificado com utilização do caldo MOPS como

enriquecimento secundário, temos 2,30 a 7,47% de resultados positivos a menos,

dependendo da escolha de um método em detrimento de outro; juntos, eles

isolariam 88,32 %das amostras positivas.

A combinação do método USDA/FSIS modificado versus o método ISO

modificado com utilização do caldo MOPS como enriquecimento secundário,

temos novamente entre 16 a 18% de resultados positivos a menos, também sem

nenhuma diferença estatística entre eles. Combinando os dois métodos, a taxa de

isolamento de L. monocytogenes subiria de 84,18 % para 99,49 %. Resultados

similares foram obtidos por Pritchard e Donnelly (1999), onde o percentual de

Listeria sp isolada inicialmente por um só método de enriquecimento, passou de

82,5 % para 97,5 % quando realizada em combinação de dois métodos de pré

enriquecimento (UVM e LRBS). Segundo estes mesmos autores, outros

pesquisadores (FLANDERS et al., 1995, LUND et al., 1991, WARBURTON et al.,

1991, NOAH et al., 1991., e HAYES et al., 1992) obtiveram resultados similares

estudando recuperação de listerias a partir de mais de um caldo de

enriquecimento. Pritchard e Donnelly (1999), de acordo com seus estudos,

relatam que: “a verdadeira incidência de Listeria monocytogenes, possivelmente

presente em amostras, podem não estar sendo detectadas nos protocolos

analíticos existentes e serem por isto subestimada”. Evidência esta que também

podemos constatar em nossos dados.

Os resultados tanto do método ISO 11290-1/A1 e ISO 11290-1/A1

modificado, quanto do método USDA/FSIS modificado, demonstraram que na

maioria dos casos L. monocytogenes é isolada já a partir do pré-enriquecimento.

O enriquecimento secundário rendeu sempre algumas amostras positivas a mais.

Nossos resultados indicam também a necessidade do plaqueamento inicial

a partir do caldo de pré enriquecimento, por termos amostras que se mostram

positiva neste e negativas quando semeadas a partir do enriquecimento

secundário. 14,28% das amostras positivas de 161 analisadas deixariam de ser

isoladas, caso não fossem semeadas a partir do caldo de pré-enriquecimento no

método ISO modificado. 12,35% das amostras positivas de 170 analisadas

deixariam de ser isoladas, caso não fossem semeadas a partir do caldo de pré-

enriquecimento no método ISO 11290-1/A1 e, 13,94% das amostras positivas

deixariam de ser isoladas de um total de 165 amostras positivas analisadas no

método USDA/FSIS modificado. Possivelmente, a razão para que tenhamos

amostras positivas para L. monocytogenes não isoladas a partir do

enriquecimento em caldo Fraser ou caldo MOPS e positivas no pré-

enriquecimento – UVM ou Demi Fraser – pode estar relacionada a pouca

competitividade da Listeria monocytogenes quando em presença de Listeria

innocua nos caldos de ennriquecimento secundários, fato este já comprovado por

outros autores (SCOTTER, et al., 2001; PETRAN & SWANSON, 1993; CORNU,

et al., 2002).

Neste estudo, das 23 amostras negativas para L. monocytogenes oriundas

do caldo MOPS, 21 eram Listeria sp e 2 negativas para Listeria spp, e quando

oriundas do caldo Fraser, das 21 amostras, 20 foram Listeria sp e 1 negativa para

Listeria spp. Estas amostras foram positivas para L. monocytogenes no caldo

Primário (Demi Fraser). 23 amostras oriundas do caldo Fraser, já tidas como

Listeria monocytogenes a partir do caldo UVM, foram classificadas como Listeria

sp.

Na análise de validação do protocolo analítico do BAX System

observamos que este difere significativamente dos protocolos ISO, ISO

modificado e USDA/FSIS modificado (χ

- 6,24, 19,53 e 7,11 respectivamente).

Estes resultados comprovam a necessidade de confirmação dos resultados

positivos no BAX System

, podendo o mesmo ser considerado um método

screening e, portanto, somente válido como diagnóstico final para amostras com

resultado negativo.

As vantagens de rapidez na obtenção de resultados do BAX System

para

amostras negativas, podem ser discutidas pelo sistema de enriquecimento

secundário, onde o caldo MOPS sugerido pelo fabricante não leva indicador de

esculina. Todas as amostras devem prosseguir a análise utilizando o “kit” para

análise de PCR proposto pelo fabricante. Por sua vez, a leitura de esculina

negativa com 24 horas no caldo Fraser já pode nos levar a um indício de

negatividade para Listeria spp e, levando em consideração que o caldo MOPS é

incubado somente 24 horas, na comparação entre os dois caldos de

enriquecimento secundário não teríamos necessidade de continuar a análise no

BAX System

em culturas com leitura de esculina negativa. Neste caso, teríamos

que utilizar os dois caldos de enriquecimento secundário (MOPS e caldo Fraser),

caso optássemos pela adoção do protocolo analítico proposto para o BAX

System

Segundo a metodologia ISO, a leitura do caldo Fraser deve ser efetuada

também após 48 horas para dar um resultado negativo.

Os resultados de leitura de atividade esculinase nos caldos Fraser a partir

do caldo Demi Fraser mostraram, que 139 amostras foram positivas para L.

monocytogenes com leitura positiva em caldo Fraser com 24 horas e 9 amostras

foram positivas após 48 horas de incubação. O isolamento de L. monocytogenes

em Ágar ALOA a partir do caldo Demi Fraser, foi de 139 amostras

presuntivamente positivas (colônias características azuladas com halo opaco)

com leitura concordante de esculina positiva em 24 horas, e duas a partir do caldo

Fraser positivo com 48 horas. Considerando as amostras presuntivamente

positivas a partir do plaqueamento em Ágar ALOA e, adicionalmente, a leitura de

esculina no caldo Fraser oriundo do caldo de pré-enriquecimento, pelo menos 139

amostras não teriam necessidade de continuidade de análise pelo kit BAX

System

. Isto pode gerar uma economia em kits não usados do BAX System

, ou

ainda, poder-se-ia confirmar as colônias características isoladas no Ágar ALOA

utilizando o próprio Kit do BAX System

, como opção de método de identificação.

A opção de pré-enriquecimento pelo método USDA/FSIS, com 48 horas

temos pelo menos 137 amostras presuntivamente positivas para L.

monocytogenes, considerando a leitura de esculina positiva em caldo Fraser após

24 horas e colônia característica de L. monocytogenes em Ágar ALOA semeado a

partir do caldo UVM.

A validação de novas metodologias analíticas, bem como de diferentes

protocolos analíticos em laboratórios de controle de qualidade têm por objetivo,

hoje, a otimização dos trabalhos internos, baseados na procura do método que

renda o maior número possível de amostras positivas. Isto se deve à adequação

de novas tendências aos princípios de segurança alimentar sustentado pelas

empresas de alimentos mais preocupadas em servir com qualidade de excelência

seus clientes: os consumidores.

Neste estudo de validação de métodos analíticos para detecção de L.

monocytogenes, a mão de obra empregada para a atividade de pré-

enriquecimento é a mesma para os protocolos analisados. Uma atividade extra

nos protocolos USDA/ISO seria o plaqueamento direto em Ágar ALOA, mas que

poderia em 24 horas resultar em screening positivo, se colônias características

presentes, e a mesma atividade para a transferência de 0,1 mL para o caldo

Fraser ou para o caldo MOPS no caso do uso do protocolo BAX System

. A

vantagem do caldo Fraser sobre o caldo MOPS após 24 horas de incubação

seria a leitura de esculina com 24 horas em caldo Fraser. O escurecimento do

meio é considerado presuntivamente positivo para Listeria sp. necessitando de

confirmação, enquanto que, culturas sem alteração de cor do meio podem ser

consideradas negativas (International Journal of Food Microbiology, 9 (1989) 94-

96 FOOD 00M03). Já teríamos também uma leitura prévia do Ágar ALOA, que

mesmo com colônias pequenas, mas características após incubação a 37 C por

24 horas, já poderiam ser visualizadas, dependendo da experiência dos técnicos

de laboratório. Colônias sem halo e esculina positivas em caldo Fraser com 24

horas de incubação, poderiam ser consideradas como negativa, e, neste caso, o

custo benefício da análise com o KIT PCR deve ser avaliado.

Devemos considerar, também, que o número de amostras positivas no

BAX System

(187), se considerado isoladamente o protocolo de isolamento do

BAX System

como preconizado pelo fabricante, resultaria em 49 amostras falso

positivo, pois o número de isolados em Ágar ALOA a partir do caldo MOPS

somente rendeu 138 amostras positivas. Como um método screening os

resultados devem ser confirmados. Desta forma, o protocolo do BAX System

deveria considerar a semeadura em ágar seletivo diferencial também a partir do

pré-enriquecimento, o que certamente levaria a uma grande economia de

consumo do KIT da PCR, e mesmo neste caso, como opcão, poderia a PCR ser

usada como prova de confirmação genética de células viáveis a partir de colônias

isoladas em Ágar ALOA.

4 CONCLUSÕES

Os resultados deste estudo comprovam que a tecnologia de PCR para

detecção de L. monocytogenes é uma ferramenta valiosa para análise de rotina

em laboratórios de controle de qualidade de alimentos. Após 48 horas já é

possível trabalhar o KIT analítico do BAX System

e aproximadamente após 5

horas ter o diagnóstico final da análise se negativo e, na possibilidade de

combinação com métodos culturais semeados a partir do pré-enriquecimento em

Ágar diferencial como o Ágar ALOA, a partir de colônias característica para L.

monocytogenes também resultados finais positivos.

Os protocolos analíticos propostos pela ISO e USDA modificado com

semeadura em Ágar ALOA a partir dos caldos de pré-enriquecimento, podem

também gerar resultados positivos presuntivamente sem necessidade de custos e

mão de obra adicionais uma vez que a semeadura a partir dos caldos de pré

enriquecimento (UVM + DF) isolou um número maior L. monocytogenes que a

semeadura a partir do caldo Fraser e caldo MOPS como enriquecimento

secundário. Constata-se, novamente, que ainda não existe somente um caldo de

pré enriquecimento que nos possa levar a isolamentos de 100% de amostras

positivas. Pelos resultados apresentados, o uso dos dois caldos de pré-

enriquecimento (DF e UVM) teriam uma vantagem sobre o BAX System

, com o

mesmo tempo para obtenção de resultados negativos e presuntivamente

positivos, além do que estes métodos comparados não apresentaram diferença

estatística entre si e resultam em maior número de amostras positivas,

confirmadas pela provas bioquímicas.

Desta forma, podemos concluir que os caldos de enriquecimento também

necessários aos protocolos dos “chamados métodos rápidos”, se bem usados e

interpretados, podem ser utilizados também com o conceito de métodos rápidos

devido a leitura de certas propriedades bioquímicas que neles ocorrem devido as

reações metabólicas que ocorrem durante a multiplicação bacteriana; e, devido a

esta característica, podem abreviar o tempo de análise e serem rápidos nos

conceitos dos métodos rápidos utilizados nos dias de hoje como apelo de vendas

e, inclusive, serem mais econômicos.

6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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7 CONCLUSÕES

Podemos concluir após a finalização deste trabalho, que o método AOAC

993/07 (MSRV Acumedia) com pH 5,4 +/-0,2 é o método mais sensível para a

detecção de Salmonella sp em carcaças de frango e carnes suínas cruas, e

deveria ser também considerado para uso com este fim. O método BAX System

pode ser utilizado como método screening para análise de Salmonella spp, pois

pode adiantar o resultado definitivamente negativo após 24 horas, mas como

screening, deve em casos presuntivamente positivos ter a confirmação dos seus

resultados confirmados com um método cultural para o resultado definitivo da

análise.

O método ISO 6579, hoje tido como método de referência para todos os

tipos de alimentos, deveria ser repensado quanto a ser referência em detrimento

do método AOAC 993-07/ISO 6579: amd1(E), também para carnes e produtos

cárneos.

Para análise de Listeria monocytogenes, fica claro que não há um método

de pré enriquecimento que se possa dizer seja absoluto e, portanto, mais

pesquisas são necessárias para encontrar um meio que venha a ter excelente

rendimento para isolar o patogeno em carnes e produtos carneos prontos para

consumo.

Os métodos alternativos (como a PCR) também podem e devem ser

usados como análise de screening, pois nos dão a vantagem do rápido

diagnóstico de detectar amostras negativas e aliam-se a possibilidade de serem

usados como provas determinativas de confirmação a partir de colônias isoladas.

8 TRABALHOS FUTUROS

a) Avaliação das metodologias alternativas aqui apresentadas com

diluição1: 5 versus 1:10 para análises de Listeria monocytogenes,

utilizando o modelo de regresão logística multinomial;

b) Avaliacão da metodologia quantitativa por NMP de Salmonella sp

usando o meio MSRV;

c) Comparação de metodologia quantitativa por NMP de Salmonella sp

usando o meio MSRV versus a frequencia de isolados positivos:

d) Avaliação do caldo APT para enriquecimento de patogenos múltiplos

(Salmonella, Listeria monocytogenes e Campylobacter

termotolerantes em produtos carneos, e sua correlação com a

contagem destes patogenos).

e) Explorar os dados aqui apresentados e publicá-los utilizando a

ferramenta apresentada para análise estatística de métodos analíticos

conforme publicação de Ogliari et al., 2007.

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