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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Sylvia Martins de Marsillac
Classificação de Variantes Missense
de BRCA1 Baseada na Atividade
Bioquímica de sua Região
C-Terminal.
Rio de Janeiro
2006
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Sylvia Martins de Marsillac
Classificação de Variantes Missense de BRCA1
Baseada na Atividade Bioquímica de sua
Região C-Terminal.
Dissertação de mestrado submetida ao curso de Pós-Graduação
em Ciências Biológicas (Biofísica) do Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em
Ciências Biológicas (Biofísica).
Orientador: Prof. Dr.Turán Péter Ürméyi
Co-orientador: Prof. Dr.Álvaro N. A. Monteiro
Rio de Janeiro
2006
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Marsillac, Sylvia Martins de
Classificação de Variantes Missense de BRCA1 Baseada na Atividade
Bioquímica de sua Região C-Terminal./ Sylvia Martins de Marsillac. Rio de
Janeiro: UFRJ/ IBCCF, 2006.
80f.
Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas- Biofísica)- Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2006.
Orientador: Prof.Dr. Turán Péter Ürményi.
1. BRCA1. 2. Análise funcional. 3. Gene Supressor de Tumor. I. Ürményi,
Turán Péter. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica
Carlos Chagas Filho.Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas-
Biofísica. III. Classificação de Variantes Missense de BRCA1 Baseada na
Atividade Bioquímica de sua Região C-Terminal.
Este trabalho foi realizado no
Laboratório de Metabolismo Macromolecular
Firmino Torres de Castro do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da
Universidade Federal do Rio de Janeiro e no
Laboratory of Cancer Genetics do
H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute
em Tampa, Florida.
Apoio financeiro: FAPERJ e CNPq.
Agradecimentos
- Ao meu orientador, Turán, pela amizade, paciência e serenidade. Eu sou a prova
de que ele não "prega no deserto". Muito obrigada!
- Ao meu orientador internacional, Álvaro, pelas oportunidades de trabalho, pela
presteza com que sempre me atendeu (a distância nunca foi um problema) e a
acolhida em "terras estranhas". Obrigada por tudo!
- Ao chefe do nosso laboratório, Edson. Pelo apoio, incentivo, compreensão e
respeito. Sem dúvida alguma, é por causa dele que nos chamamos de "família". É
uma honra poder conviver com você!
- À Rosane, para sempre mommy, pelo otimismo e empolgação inesgotáveis. Muito
obrigada.
- Ao meu querido amigo, César. Pessoalmente, pelas caronas, conversas, almoços,
gargalhadas e birutices e profissionalmente, pelos seqüenciamentos e pela
seriedade e honestidade com que você cuida do LMM. Sucesso e força neste novo
passo que você está dando. Coragem você já tem! Ah! E você ainda vai me aturar
por muito tempo...
- Ao seu Claudinho, nosso querido Bill. O que se pode falar dessa criatura que
trabalha pra caramba e ainda encontra tempo pra ajudar os outros? Obrigada vai ser
sempre pouco pra agradecer, você é um exemplo!
- Aos meus grandes amigos Giselle e Elielton... Por dividirem a vida comigo!
- A todos os membros (e ex-membros) da família LeMeMê: Fabi, Marcelo F., Deivid,
Juliene, Jorge, Roberta, Carol, Luísa, Ernesto, Léo, Beatriz, Luciana, Zé. Pela
amizade e harmonia da família.
- Aos membros do laboratório no MOFFITT: Carol, Virna, Ani, Alyson, Jonathan e
Marcelo, por toda a ajuda. Muito obrigada!
- À minha queridíssima e grande amiga, Nathaly. Companheira de todas as horas,
certeza nas horas de incerteza, habitante do mesmo planeta... Obrigada, amiga, por
tudo. Agradeço a Deus por tê-la colocado em minha vida.
- À minha família: Pai, Mãe, Marcelo (meu querido irmão) e Tia Narcisa. Pelo apoio,
incentivo, carinho, ajuda, respeito às minhas escolhas e individualidades e pelo
direito ao exercício da minha liberdade, desde sempre. MUITO OBRIGADA!
- A Deus, por todas as pessoas e acontecimentos da minha vida.
Resumo
MARSILLAC, Sylvia Martins de. Classificação de Variantes Missense de BRCA1
Baseada na Atividade Bioquímica de sua Porção C-Terminal. Rio de Janeiro, 2006.
Dissertação (Mestrado em Ciência Biológicas- Biofísica)- Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro, 2006.
BRCA1, o primeiro gene de predisposição a câncer de mama e ovário familiar
descoberto, contribui quando alterado para a maioria dos casos hereditários de
câncer de mama. A inativação de ambos os alelos parece ser necessária para a
progressão neoplásica em mama e ovário, sugerindo que BRCA1 atue como um
gene supressor de tumor. Embora a função primária de BRCA1 ainda tenha que ser
descoberta, existem várias evidências de que esta proteína está envolvida na
transcrição, recombinação e no reparo de DNA. Várias mutações têm sido descritas
para o gene BRCA1 e algumas predispõem a câncer de mama e ovário. Entre as
mutações no domínio BRCT, a região C-terminal da proteína, foi encontrada uma
correlação entre predisposição a câncer e a falta da atividade transcricional dos
mutantes em ensaios in vitro. Para verificarmos esta correlação, a técnica de
mutagênese sítio-dirigida através de PCR por sobreposição e extensão foi utilizada
para gerar mutações missense in vitro na região C-terminal de BRCA1 (aa 1396-
aa1863), que foram usadas em ensaios de ativação transcricional tanto em
leveduras quanto em células de mamíferos. Duas das variantes testadas neste
trabalho apresentaram capacidade de ativação transcricional maior do que 60% em
relação à atividade do controle selvagem e uma das variantes, apresentou
capacidade de ativaçao transcricional menor do que 50% em relação à atividade do
controle selvagem. Estes resultados nos permitem classificar estas variantes quanto
ao risco de desenvolvimento de câncer de mama e ovário como neutras/ baixo risco
e deletéria/ alto risco, respectivamente, tendo o potencial de auxiliar no prognóstico
da doença e, portanto, na conduta clínica a ser adotada.
Abstract
MARSILLAC, Sylvia Martins de. Classificação de Variantes Missense de BRCA1
Baseada na Atividade Bioquímica de sua Porção C-Terminal. Rio de Janeiro, 2006.
Dissertação (Mestrado em Ciência Biológicas- Biofísica)- Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro, 2006.
BRCA1, the first familial breast and ovary cancer gene discovered, accounts
when mutated for most of hereditary breast cancer cases. The inactivation of both
alleles appears to be necessary for neoplastic progression in the breast and ovary,
suggesting that BRCA1 acts as a tumor suppressor gene. Although the primary
function of BRCA1 remains to be determined, there is good evidence that this protein
is involved in DNA transcription, recombination and DNA repair. Several mutations
have been described for the BRCA1 gene, and some predispose to breast and
ovarian cancer. Among the mutations in the BRCT domain, the C-terminal region of
the protein, a correlation has been found between cancer predisposition and lack of
transcription activation activity of the mutants in in vitro assays. To verify this
correlation, we used site-directed mutagenesis by overlap extension PCR technique,
to generate in vitro missense mutations in the C-terminal region of BRCA1 (aa 1396-
aa1863), that were used in transcription activation assays in both yeast and
mammalian cells. Two of the variants tested in this work showed transcription
activation ability greater than 60% in relation to the wild type control activity and one
showed transcription activation ability lower than 50% in relation to the wild type
activity. These results allow us to classify these variants regarding the risk to develop
breast and ovarian cancer as neutral/ low risk and deleterious/ high risk, respectively,
potentially helping in the disease prognosis and therefore in the clinical conduct to be
adopted.
Lista de Ilustrações
Figura 1: Classes de mutações em BRCA1 e seus produtos protéicos esperados..17
Figura 2: Desenho esquemático da estrutura da proteína BRCA1 ..........................19
Figura 3: Estrutura tridimensional dos domínios BRCT............................................20
Figura 4: Rede de interações de BRCA1..................................................................22
Figura 5: Ativação Transcricional por BRCA1...........................................................31
Tabela 1: Seqüências dos iniciadores utilizados para amplificação da região
correspondente aos aminoácidos 1396-1863 de BRCA1..........................................38
Tabela 2: Seqüência dos iniciadores usados para inserir a mutação e amplificar a
porção 5’ da seqüência correspondente aos exons 13- 24........................................39
Tabela 3: Seqüência dos iniciadores usados para inserir a mutação e amplificar a
porção 3’ da seqüência correspondente aos exons 13- 24........................................39
Figura 6: Esquema de Mutagênese Sítio-dirigida por Extensão Sobreposta............40
Tabela 4: Plasmídeos utilizados................................................................................42
Tabela 5: Seqüência dos iniciadores utilizados para confirmação das construções de
DNA............................................................................................................................47
Figura 7: Amplificação por PCR das proções 5’ e 3’ da região C-terminal de
BRCA1........................................................................................................................56
Tabela 6: Tamanho esperado dos produtos de PCR da região C-terminal de
BRCA1........................................................................................................................57
Figura 8: Amplificação por PCR das proções 5’ e 3’ e do segmento completo da
região C-terminal de BRCA1......................................................................................58
Figura 9: Desenho esquemático da região C-terminal de BRCA1 fusionada ao
DBD............................................................................................................................59
Figura 10: Ensaio quantitativo de ativação transcricional de variantes da região C-
terminal de BRCA1 em levedura................................................................................60
Figura 11: Análise por western blotting da proteína de fusão LexA:BRCA1 em
leveduras transfectadas com diferentes variantes da região C-terminal de BRCA1..62
Figura 12: Ensaio quantitativo de ativação transcricional de variantes da região C-
Terminal de BRCA1 em células de mamíferos..........................................................64
Tabela 7: Comparação entre diferentes métodos de classificação...........................71
Lista de Abreviaturas e Siglas
µg – micrograma
µL – microlitro
µM - micromolar
aa- aminoácido
Abs - absorbância
ATM- Ataxia-telangiectasia mutated
ATR- ATM related
BACH1- Helicase C-terminal associada a BRCA1(BRCA1-associated C-terminal
Helicase 1)
BARD1- Proteína de domínio RING associada à BRCA1(BRCA1-associated RING
domain protein 1)
BASC- Complexo de Vigilância Associado a BRCA1 (BRCA1 Associated
Surveillance Complex)
BIC- Breast Cancer Information Core
cDNA – DNA complementar
DBD- Domínio de Ligação a DNA (DNA Binding Domain)
DMSO- dimetil sulfóxido
DNA – ácido desoxirribonucléico
dNTP – deoxirribonucleotídeos trifosfatados
DO- densidade óptica
DSB- Quebra de Dupla-fita (Double-Strand Break)
EDTA – ácido etilenodiaminotetracético
GADD45- Parada do crescimento e dano no DNA 45 (Growth Arrest and DNA
Damage 45)
HR- Recombinação Homóloga (Homologous Recombination)
kb - quilobase
kDa – quilodalton
M - molar
MDa- megadalton
mg – miligrama
mL – mililitro
mM – milimolar
mRNA – RNA mensageiro
ng - nanograma
ONPG- o-nitrofenil β-D galactopiranosideo
ºC – graus Celsius
ORF – Fase Aberta de Leitura (Open Reading Frame)
pb – pares de base
PBS – tampão salina-fosfato
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction)
pH – potencial hidrogeniônico
pol – polimerase
RNA – ácido ribonucléico
rpm – rotações por minuto
SDS – dodecil sulfato de sódio
TBE – tris-borato EDTA
TCA- ácido tricloro acético
TCR- Reparo Acoplado à Transcrição (Transcription Coupled Repair)
Tris – tris (hidroximetil) aminometano
UV- ultra-violeta
V – volt
Sumário
1 .Introdução .............................................................................................................12
1.1 O Câncer .........................................................................................................13
1.2 Estimativas de Câncer no Mundo e no Brasil ..................................................13
1.3 O Câncer de Mama .........................................................................................14
1.4 Os Genes BRCA..............................................................................................15
1.5 O BIC (Breast Cancer Information Core) .........................................................16
1.6 BRCA1.............................................................................................................17
1.6.1 Estrutura Gênica .......................................................................................17
1.7 A Proteína BRCA1...........................................................................................18
1.7.1 Estrutura e Características........................................................................18
1.7.2 O Domínio BRCT ......................................................................................19
1.7.3 Papel Biológico Desconhecido..................................................................21
1.8 Funções de BRCA1.........................................................................................22
1.8.1 O Reparo do DNA.....................................................................................22
1.8.2 Controle do Ciclo Celular ..........................................................................25
1.8.3 Regulação da Transcrição ........................................................................27
1.9 Domínio BRCT: Ativador Transcricional ..........................................................30
2. Objetivo .................................................................................................................34
2.1 Objetivo Geral..................................................................................................35
2.2 Objetivos Específicos ......................................................................................35
3. Materiais e Métodos..............................................................................................36
3.1 Construções de DNA.......................................................................................37
3.1.1 Seleção de Variantes................................................................................37
3.1.2 PCR por Sobreposição e Extensão...........................................................37
3.1.3 Digestão de Produtos de PCR e de Plasmídeos para Clonagem .............41
3.1.4 Tratamento dos Plasmídeos Digeridos com CIP.......................................42
3.1.5 Purificação de Plasmídeos e de Produtos de PCR ...................................42
3.1.6 Indução de competência em Escherichia coli ...........................................43
3.1.7 Clonagem dos Produtos de PCR em pLex9 e Transformação Bacteriana44
3.1.8 Subclonagem dos Produtos de PCR em pGBT9 ......................................46
3.1.9 Subclonagem dos Produtos de PCR em pCDNA3....................................46
3.1.10 Confirmação das Mutações por Seqüenciamento...................................47
3.2 Ensaio de Ativação Transcricional em Leveduras ...........................................47
3.2.1 Indução de Competência em Leveduras...................................................48
3.2.2 Transformação de Leveduras ...................................................................48
3.2.3 Ensaios para Atividade de β-galactosidase ..............................................49
3.2.4 Verificação da Presença da Proteína de Fusão em Leveduras. ...............51
3.3 Ensaio de Ativação Transcricional em Células de Mamíferos .........................52
3.3.1 Transformação de Células de Mamíferos .................................................52
3.3.2 Ensaio de Luciferase.................................................................................53
3.3.3 Verificação da Presença da Proteína de Fusão em Células de Mamífero.53
4. Resultados ............................................................................................................55
4.1 Geração de Mutantes de BRCA1 ....................................................................56
4.2 Análise Funcional das Variantes Missense .....................................................58
4.3 Ativação Transcricional em Leveduras............................................................60
4.4 Ativação Transcricional em Células de Mamíferos..........................................63
5. Discussão e Conclusões.......................................................................................65
12
1 .Introdução
13
1.1 O Câncer
O câncer é uma doença genética (VOLGELSTEIN & KINZLER, 1998) e este
termo se refere à proliferação celular descontrolada e não programada, nos
organismos multicelulares. É uma doença complexa e hoje se sabe que a formação
de um tumor é um processo constituído de várias etapas, que começa com
mutações somáticas e/ou herdadas, podendo culminar no espalhamento destas
células por todo o corpo (INCA, 2004).
Algumas características da célula cancerosa são a evasão da apoptose, a
capacidade de invasão tecidual e a angiogênese, além da não observância dos
sinais de interrupção da proliferação e dos sinais de diferenciação celular, e a
capacidade de sustentação de sua proliferação (INCA, 2004).
1.2 Estimativas de Câncer no Mundo e no Brasil
De acordo com dados do Ministério da Saúde (2003), 10 milhões de casos
novos de câncer ocorrem todos os anos no mundo e mais de 6 milhões de pessoas
morrem por essa causa, o que corresponde a 12% do total de mortes por doença.
No mundo, o câncer de pulmão é o tipo mais comum da doença, com mais de 1,2
milhão de novos casos por ano, seguido do câncer de mama feminina, com
aproximadamente 1 milhão de casos novos por ano (PARKIN et al, 2001). No Brasil,
o câncer é a segunda maior causa de morte por doença (INCA, 2004).
14
1.3 O Câncer de Mama
Também de acordo com dados do Ministério da Saúde (2003), o câncer de
mama é o tipo mais freqüente da doença em mulheres no mundo e o segundo tipo
mais freqüente no Brasil. Apesar de ser considerado como tendo um relativo bom
prognóstico se diagnosticado precocemente, as taxas de mortalidade por câncer de
mama continuam elevadas no Brasil, muito provavelmente porque a doença ainda é
diagnosticada em estágios avançados. A maior contribuição para a formação do
câncer de mama feminina vem da idade e, em muitos casos, o envelhecimento é o
único fator de risco reconhecido. O câncer de mama é causado por uma variedade
de predisposições genéticas e por fatores ambientais, tornando a compreensão da
etiologia da doença muito difícil (KOONING et al 1996; INCA, 2004).
Acredita-se que o câncer de mama sempre existiu, nas mesmas proporções. O
que aconteceu foi o aumento da expectativa de vida, aumento da informação e do
acesso das pessoas à saúde. O câncer é uma doença do avanço da idade e estudos
mostram que toda mulher que chegar aos cem anos, desenvolverá câncer de mama
(ANTONIOU et al, 2003).
A maior parte dos casos de câncer de mama é esporádica, ou seja, não-
hereditária. Estima-se que de 5 a 10% do total de casos estejam relacionados à
predisposição hereditária, ou seja, herança de genes de susceptibilidade a câncer,
altamente penetrantes (CLAUS, RISCH & THOMPSON,1991; NEWMAN et al, 1988).
Observa-se um risco aumentado de desenvolver câncer de mama em mulheres
com casos da doença em familiares próximos (mãe, irmã ou filha). Este risco é
especialmente elevado quando o familiar tem câncer antes dos 50 anos de idade e
em ambas as mamas (MINISTER OF PUBLIC WORKS AND GOVERNMENT
SERVICES, 2002).
15
1.4 Os Genes BRCA
Em 1990, Hall e colaboradores mapearam o primeiro gene determinante de
susceptibilidade ao câncer de mama, BRCA1 (breast and ovarian cancer
susceptibility gene 1) e quatro anos mais tarde, um segundo gene foi mapeado,
BRCA2 (WOOSTER et al, 1994). Especula-se sobre a existência de um terceiro
gene de predisposição ao câncer de mama, mas apesar de todos dos estudos ainda
não foi possível encontrar outros genes com uma relação de penetrância alta com a
doença, como no caso de BRCA1 e BRCA2. Tanto um gene quanto o outro, são
supressores de tumor, ou seja, sua atividade impede a tumorigênese (TRIKKONEN
et al, 1997). Na população em geral, mutações em BRCA1 e BRCA2 são muito
freqüentes, mas apesar disso contribuem para menos de 2% do total de casos de
câncer de mama e ovário. O risco para desenvolvimento de câncer de mama e
ovário para mulheres que carregam certas mutações em BRCA1 e BRCA2 é
significativamente mais elevado do que para a população geral (SMITH et al, 1992).
Os alelos de BRCA1 encontram-se mutados em cerca de 45% das famílias com
casos hereditários de câncer de mama e em 80% das famílias com casos de câncer
hereditário de mama e ovários (EASTON et al,1993). As mulheres com
predisposição hereditária associada a mutações em BRCA1 têm um risco estimado
de até 80% para o desenvolvimento do câncer de mama e de até 60% para câncer
de ovário (EASTON, FORD & BISHOP, 1995; SZABO & KING, 1995).
16
1.5 O BIC (Breast Cancer Information Core)
Devido ao alto grau de polimorfismo observado nos genes BRCA, foi criado o
Breast Cancer Information Core (BIC), um banco de dados público, feito para que se
armazenasse todas as informações obtidas sobre os genes de susceptibilidade ao
câncer de mama e ovário, além de registrar todas as variantes encontradas destes
genes (NAROD & FOULKES, 2004). No site existem informações sobre a
distribuição das mutações nos genes, quem depositou tais informações, qual o tipo
de mutação encontrado, a posição na seqüência gênica, entre outras. Os
depositantes são em sua maioria pesquisadores e empresas que realizam testes
para identificação de mutações.
Já foram encontrados todos os tipos de variantes nos genes BRCA: nonsense
(a troca de um nucleotídeo resulta em um códon de terminação prematuro),
missense (a troca de um nucleotideo resulta na troca de um aminoácido), silenciosas
(a troca de um nucleotídeo não altera o aminoácido codificado), inserções e
deleções (figura 1). BRCA1 já tem mais de mil variantes catalogadas. As mutações
do tipo missense, por exemplo, já passam de 300. As variantes encontradas no BIC
se originam do resultado de testes feitos em indivíduos doentes ou pessoas que se
submeteram à busca por possuírem em sua família um histórico de câncer de mama
e ovário.
A associação com a doença já foi descrita e estabelecida para inúmeras
mutações em BRCA1. Estas mutações estão distribuídas por todo o gene e
freqüentemente resultam em término prematuro da tradução. Fora algumas
mutações claramente ligadas à doença ou algumas muito suspeitas de estarem
associadas à mesma, em sua maioria, as substituições de aminoácidos relatadas até
agora, não podem ser prontamente distinguidas como associadas à doença ou como
17
polimorfismos benignos e são classificadas como variantes de significado incerto
(BIC), o que é um problema de extrema importância em se tratando de
aconselhamento genético (VALLON-CHRISTERSSON et al, 2001).
1.6 BRCA1
1.6.1 Estrutura Gênica
BRCA1 foi descrito pela primeira vez em 1990, por um grupo de pesquisadores
japoneses que buscavam um gene de predisposição ao câncer de mama, doença de
crescente incidência entre mulheres (HALL et al, 1990).
Figura 1: Classes de mutações em BRCA1 e seus produtos protéicos
esperados.
Estrutura do gene BRCA1 humano e exemplos de diferentes tipos de mutações em várias
regiões do gene. No topo, desenho esquemático do locus do gene BRCA1. Retângulos azuis
correspondem aos exons. Abaixo, produtos protéicos previstos para as diferentes mutações
após análise por western blotting de células derivadas de tecido normal (Wt) ou tumoral (Mt) de
um indivíduo que carrega uma mutação na linhagem germinativa. Nos tecidos normais, as
bandas representam os produtos de ambos os alelos. Nos tecidos tumorais o alelo do tipo
selvagem é invariavelmente perdido (Retirado de Szabo, Worley & Monteiro, 2004).
18
BRCA1 foi mapeado no braço longo do cromossomo 17, em 1990 (HALL et al
1990), e mais tarde, através de experimentos de clonagem posicional (MIKI et al,
1994), foi finalmente identificado e caracterizado. O gene é composto por 24 exons,
dos quais 22 são codificantes, e que estão distribuídos por aproximadamente 100
kb. É expresso na maioria dos tecidos, sendo expresso mais abundantemente nos
testículos e no timo (MIKI et al, 1994). Estudos feitos com camundongos, mostraram
que esse gene é essencial durante a embriogênese, já que embriões nocauteados
para BRCA1, não se desenvolvem além da gastrulação (GOWEN et al, 1996;
HAKEM et al , 1996).
1.7 A Proteína BRCA1
1.7.1 Estrutura e Características
BRCA1 codifica uma proteína nuclear de mesmo nome, constituída por 1.863
aminoácidos, de 220 kDa (CHEN et al, 1995; SCULLY et al,1996; THOMAS et al,
1996; RUFFNER & VERMA, 1997). BRCA1 é uma fosfoproteína nuclear e, como
pode ser visto na figura 2, é constituída predominantemente por domínios
globulares. Possui um domínio RING-finger, um tipo especial de ZINC-finger que
participa de interações proteína-proteína, na região N-terminal (MIKI et al, 1994),
além de dois sinais de localização nuclear correspondentes aos aa 500-508 e aa
609-615 (CHEN et al, 1996; THAKUR et al, 1997) e uma região C-terminal que
contém dois domínios BRCT (BRCA1 C-terminal) idênticos em tandem, aa 1653-
1736 e aa 1756-1855 (KOONIN, ALTSCHUL & BORK, 1996; BORK et al, 1997;
CALLEBAUT & MORNON, 1997; MIKI et al 1994).
19
BRCA1 é expressa em vários tecidos, de modo dependente do ciclo celular.
Seus níveis são mais altos durante a fase S, o que sugere que esta proteína
funcione durante a replicação do DNA. Nas células somáticas, BRCA1 encontra-se
no núcleo, em foci subnucleares característicos que se redistribuem em resposta a
danos no DNA (CHEN et al, 1998).
1.7.2 O Domínio BRCT
BRCT significa BRCA1 C-terminal, e leva este nome devido a este domínio ter
sido inicialmente descrito na proteína BRCA1. O BRCT é um domínio globular que
caracteriza uma superfamília de proteínas envolvidas em pontos de checagem do
ciclo celular que respondem a danos no DNA (KOONIN et al, 1996; BORK et al,
1997). Os domínios BRCT possuem de 85-95 aminoácidos que constituem vários
grupos distintos de aminoácidos hidrofóbicos que formam o centro do BRCT. Podem
ser encontrados em módulos únicos ou em múltiplas repetições em tandem,
Figura 2: Desenho esquemático da estrutura da proteína BRCA1.
RING= domínio Ring-Finger , NLS= sinal de localização nuclear, BRCT=domínio BRCT
(Retirado de MONTEIRO, 1996).
20
formadas por dois domínios e ambos podem ocorrer em diferentes arranjos dentro
das proteínas (KOONIN et al, 1996; BORK et al, 1997).
Em BRCA1 existem dois domínios BRCT em tandem, como pode ser visto nas
figuras 2 e 3. A cristalografia de um domínio BRCT da proteína de reparo de
DNA XRCC1 (ZHANG et al, 1998b) revelou uma folha β de 4 fitas, rodeada por três
α-hélices. Muitas interações entre diferentes proteínas estabelecidas via domínios
BRCT já foram descritas, indicando que uma das funções deste domínio é mediar
interações proteína-proteína (HUYTON et al, 2000). Para mutações associadas a
câncer em BRCA1, a previsão é de que ocorram problemas no dobramento ou na
estabilidade dos domínios BRCT ou a alteração de uma provável interface de
Figura 3: Estrutura tridimensional dos domínios BRCT.
BRCT-N
aa 1653-1736 BRCT-C
aa 1760-1855
Modelo em fita da região C-terminal de BRCA1. Em amarelo, alfa-hélices; em verde, lâminas
beta; em azul, alfa-hélice que conecta os dois domínios BRCT.
21
dimerização, resultados que condizem com os efeitos de perda de função da
proteína (ZHANG et al, 1998b).
1.7.3 Papel Biológico Desconhecido
Mais recentemente, diversos trabalhos têm elucidado a relação estrutura-
função de BRCA1 (NAROD & FOULKES, 2004; YOSHIDA & MIKI, 2004). Esta
proteína interage com outras inúmeras proteínas, mas seu papel biológico preciso
na célula ainda não foi elucidado. Apesar disso, sabe-se que BRCA1 está envolvida
em processos celulares importantes como o reparo de DNA, a regulação de pontos
de checagem do ciclo celular e a regulação da transcrição, como pode ser visto na
figura 4. Ainda não está claro se BRCA1 é uma proteína multifuncional com funções
de reparo e regulação transcricional ou se a proteína funciona na ativação da
transcrição seu papel no reparo é mediado através da ativação da transcrição.
Qualquer que seja o caso, essas funções não são mutuamente exclusivas,
obrigatoriamente (HAYES et al, 2000). A carência de conhecimento quanto à função
bioquímica exata de BRCA1 é uma grande barreira para a criação de um teste
funcional que forneça avaliação pré-sintomática confiável do risco para
desenvolvimento de câncer de mama e ovário (HAYES et al, 2000).
22
1.8 Funções de BRCA1
1.8.1 O Reparo do DNA
As primeiras evidências de que BRCA1 estaria envolvida no reparo de DNA
vieram da observação de que esta proteína era hiperfosforilada em resposta a danos
no DNA e recolocada em pontos de forquilhas de replicação (SCULLY et al, 1997b).
Figura 4: Rede de interações de BRCA1.
BRCA1 é um componente importante das vias que regulam o reparo de DNA, a progressão do
ciclo celular, ubiquitinaçao e regulação transcricional. Acredita-se que o dano no DNA seja um
dos gatilhos chave para a ativação de BRCA1. Através da figura e possível visualizar as
inúmeras proteínas com as quais BRCA1 interage e as funções das quais participa (Retirado
de NAROD & FOULKES, 2004).
23
BRCA1 é fosforilada por diferentes quinases, em diferentes resíduos de serina,
dependendo do tipo de agente causador de dano no DNA. A radiação ionizante
acarreta a fosforilação de BRCA1 pelas quinases ATM, Ataxia-telangiectasia
mutated (CORTEZ et al 1999; GATEI et al, 2000), e CHK2, quinase de controle de
G2/M (CHATURDEVI et al, 1999; BELL et al, 1999). A radiação ultravioleta provoca
fosforilação de BRCA1 através da quinase ATR (ATM related) (GATEI et al, 2001).
É provável que BRCA1 seja fosforilada em múltiplos resíduos de serina, por
diferentes quinases ao mesmo tempo, em resposta a danos no DNA, no entanto,
não se sabe como cada fosforilação afeta a função da proteína (CORTEZ et al,
1999; GATEI et al, 2000).
Outros estudos demonstraram que BRCA1 está envolvida com complexos
protéicos que ativam o reparo de quebra de dupla-fita de DNA (Double Strand
Break) por recombinação homóloga (Homologous Recombination) (SCULLY et al,
1997a). BRCA1 co-localiza com as proteínas Rad51 e BRCA2 in vivo, para formar
complexos. A proteína Rad51 eucariótica é homóloga a proteína bacteriana RecA,
que é recrutada para recombinação durante a mitose e a meiose, assim como para
recombinação homóloga de quebras de dupla-fita (SCULLY et al, 1997a, CHEN et
al, 1998). A co-localização das proteínas BRCA com Rad51 em sítios de
recombinação e em foci induzidos por danos no DNA sugere que os genes BRCA
têm um papel tanto na detecção quanto no reparo de quebra de dupla-fita (SCULLY
et al, 1997a). Células que expressam BRCA1 mutado são hipersensíveis à radiação
ionizante e apresentam reparo propenso a erro. Nessas células, a formação dos foci
de Rad51 é reduzida após tratamento com agentes causadores de danos no DNA e
deficiente durante o reparo de quebra de dupla-fita por recombinação homóloga
(SCULLY et al, 1999; MOYNAHAN,CUI & JASIN, 2001).
24
A idéia de que BRCA1 tem uma participação importante na manutenção da
integridade do genoma é reforçada pelo fato de que tumores de pacientes com uma
história familiar de câncer de mama exibem anomalias no genoma
excepcionalmente grandes quando comparadas a tumores esporádicos (GLEBOV et
al, 1994). BRCA1 atua como uma proteína supressora de tumor, uma vez que sua
superexpressão leva ao retardo no crescimento de células tumorais em
camundongos nude (THOMAS et al, 1996).
BRCA1 também está envolvido no reparo por excisão de nucleotídeo, que
envolve dois mecanismos diferentes: o reparo acoplado à transcrição (Transcription
Coupled Repair), também chamado de reparo preferencial da fita transcrita e o
reparo do genoma global, que não apresenta tendência para nenhuma das fitas.
BRCA1 pode ter um papel nestes dois tipos reparo (LE PAGE et al, 2000;
HARTMAN & FORD, 2002).
No reparo de DNA já foi descrito que BRCA1 interage com o complexo protéico
MRE11, Rad50/Nbs1 que participa no reparo da quebra de dupla-fita. Também
interage com SW1 e SNF, que são proteínas remodeladoras de cromatina, com o
complexo proteico BASC (BRCA1 Associated Surveillance Complex), que interagem
diretamente BRCA1 (BOCHAR et al, 2000), e ainda com DNA helicases, como a
proteína BACH1 (BRCA1-associated C-terninal Helicase 1) que interage diretamente
com os domínios BRCT (BERTWISTLE & ASHWORTH, 1998, CANTOR et al, 2001).
A importância de BRCA1 no reparo de DNA também é ressaltada pelo fato da
proteína funcionar como uma desacetilase de histona (YARDEN & BRODY, 1999).
O remodelamento da cromatina ocorre nas proximidades da quebra de dupla-
fita e acredita-se que este processo facilite o raparo do DNA. A ativação de outros
25
genes que estão implicados na resposta a dano no DNA, resulta dessa interação
(VERSTEEGE et al, 1998).
1.8.2 Controle do Ciclo Celular
Os pontos de checagem do ciclo celular são sistemas de vigilância que mantém
a integridade do genoma depois de danos no DNA ou em outras macromoléculas
celulares e que tem dois papéis importantes: assegurar que eventos essenciais do
ciclo celular sejam terminados antes que o ciclo continue e dar mais tempo para que
o reparo de danos no DNA seja feito, antes de sua replicação e da mitose
(KUFMANN & PAULES, 1996). Estes pontos de checagem tanto podem culminar em
morte celular programada (apoptose), para eliminar as células defeituosas, como na
parada do ciclo celular para prevenir que o DNA lesionado se replique (LI et al,
2000).
Quinases como ATM, por exemplo, interagem com BRCA1 e uma vez
fosforilada, BRCA1 participa da checagem da progressão do ciclo celular. ATM
pertence a uma família de proteínas que participam da regulação de pontos de
checagem do ciclo celular e que também estão envolvidas no reparo do DNA.
Provavelmente, BRCA1 está envolvida em diferentes vias de sinalização para
retardo do ciclo celular, que são dependentes do tipo de lesão sofrida pelo DNA
(KASTAN & LIM, 2000).
Como já foi mencionado anteriormente, os domínios BRCT também são
encontrados em proteínas dos pontos de checagem do ciclo celular, como p53BP1
(p53 binding protein 1), a proteína de pontos de checagem da replicação por fissão
em leveduras Rad4, a proteína de reparo de DNA, XRCC1 e as proteínas da família
26
retinoblastoma (BORK et al, 1997) entre outras, o que reforça a idéia de que BRCA1
participe deste tipo de evento.
Em cultura de células, a expressão induzida de BRCA1 acarretou morte celular
programada e revelou que um dos principais genes alvo de BRCA1 é o gene
responsivo a dano no DNA , GADD45 (HARKIN et al, 1999). GADD45 (Growth Arrest
and DNA Damage 45 ) deflagra apoptose dependente de JNK/SAPK (TAKEKAWA &
SAITO, 1998). Em outro tipo de experimento, com infecção por BRCA1 mediada por
adenovírus, foi mostrada a indução de genes do controle do ciclo celular como p21
(também conhecido como WAF ou CiP1), por exemplo, e também de genes de
resposta a danos no DNA, como o próprio GADD45, mas não foi demonstrada a
indução da apoptose, sugerindo que este resultado poderia ser um efeito específico
do tipo de célula utilizada (MACLACHLAN et al, 2000).
BRCA1 também já foi descrito como sendo um dos componentes de BASC
(WANG et al, 2000). Em células de cultura primária deficientes em BRCA2, o ponto
de checagem é preservado (PATEL et al, 1998), o que nao acontece em células
deficientes em BRCA1. Camundongos BRCA1
-/-
e BRCA2
-/-
, entretanto, morrem
durante estágios iniciais da embriogênese (XU et al, 1999; HAKEM et al, 1996). A
perda de p53 ou p21, retarda a letalidade embrionária em alguns dias (HAKEM et al,
1997), indicando que a falta do controle do ponto de checagem pode ser um evento
importante para a formação de tumor. A maioria das células que não expressam
BRCA1 nem BRCA2, sofrem apoptose devido ao controle do ponto de checagem
não estar preservado, mas células nas quais ambas as proteínas estão alteradas,
sobrevivem na presença de instabilidade genômica (TIRKKONEN et al, 1997; W
et al, 2002; GRETARSDOLTIR et al, 1998). Embora já tenha sido observado que na
maioria dos tumores de mulheres com mutações em BRCA1 e BRCA2, existe perda
27
do alelo selvagem, alguns cânceres parecem surgir na presença de um alelo
selvagem intacto. Para os dois casos, foi proposto que o segundo evento na
formação do tumor envolva a inativação de um gene de ponto de checagem, além
da perda do segundo alelo de BRCA1 ou BRCA2 (BERTWISTLE & ASHWORTH,
1998; VENKITARAMAN, 2002).
Proteínas são marcadas para degradação no proteassoma, por um processo
chamado ubiqüitinação. O proteassoma, por sua vez, quebra as proteínas marcadas
para degradação que possuem essa "etiqueta" de ubiqüitina. A falta da regulação
desta degradação conduz à perda do controle do ciclo celular e também parece ser
um passo importante na tumorigênese. O domínio RING-finger é um motivo
freqüentemente encontrado em proteínas com função de ubiqüitinação. BRCA1 e
BARD1 (BRCA1-associated RING domain protein 1) têm um motivo RING-finger em
sua porção mais N-terminal e foi demonstrado que o complexo BRCA1-BARD1
funciona no processo de ubiqüitinação. São raras as mutações em BARD1, ligadas
ao desenvolvimento de câncer, em tumores que não apresentam alterações em
BRCA1 e BRCA2 (HASHIZUME et al, 2001, GHIMENTI et al, 2002, ISHILOBI et al,
2003). Recentemente foi demonstrado que a ubiqüitinação mediada por BRCA1
ocorre em resposta a estresse na replicação (MORRIS & SOLOMON, 2004), ligando
esta função à resposta a danos no DNA.
1.8.3 Regulação da Transcrição
BRCA1 já foi envolvida na regulação transcricional de uma série de genes que
atuam no reparo do DNA. A proposta de um papel para BRCA1 na transcrição deve-
se a três razões principais: (i) a porção C-terminal de BRCA1 possui um excesso de
28
resíduos de aminoácidos carregados negativamente, podendo ativar a transcrição
de um gene quando fusionado a um domínio de ligação a DNA (DBD) in vivo
(CHAPMAN & VERMA,1996; MONTEIRO, AUGUST & HANAFUSA, 1996) e in vitro
(HAILE & PARVIN, 1999), (ii) a porção C-terminal de BRCA1 se associa com uma
forma da holoenzima RNA polimerase II (SCULLY et al, 1997a) e (iii) BRCA1 modula
a atividade de certos ativadores transcricionais (SOMASUNDARAM et al, 1997;
OUCHI et al, 1998, 2000; WANG et al, 1998).
A perda dos domínios BRCT de BRCA1 está ligada ao risco de
desenvolvimento de câncer. Mas um fato interessante é que a capacidade de ativar
a transcrição não parece ser uma característica geral dos domínios BRCT, uma vez
que os mesmos, isolados de outras proteínas, não possuem tal atividade (MIYAKE
et al, 2000).
Já foi demonstrado que a RNA polimerase II (pol II) de mamíferos existe em
dois complexos protéicos diferentes: um cerne, composto por 12 unidades da RNA
polimerase II (~500kDa) e a holoenzima (>1MDa), contendo o cerne mais o
complexo SRB-Med, fatores gerais de transcrição e fatores envolvidos no
remodelamento de cromatina. A idéia de que BRCA1 estaria envolvida na regulação
da transcrição (ANDERSON et al, 1998), ocorreu devido a resultados mostrando que
BRCA1 era co-purificada com a holoenzima RNA pol II, mas o mesmo não acontecia
com fatores de transcrição purificados nas mesmas condições (SCULLY et al,
1997a). BRCA1 é um componente da holoenzima RNA pol II, e se complexa com ela
através da RNA helicase A, outro componente da holoenzima (PAO et al, 2000).
Em 1997, experimentos demonstraram que BRCA1 expressa ectopicamente,
causava parada do ciclo celular via transativação do inibidor de ciclo celular p21, de
modo dependente de p53, sugerindo uma base para a ação supressora de tumor de
29
BRCA1 (SOMASUNDARAM et al, 1997). BRCA1 interage fisicamente com p53 e
aumenta a ativação de genes responsivos ao mesmo, incluindo p21, sugerindo um
efeito mais direto de BRCA1 na transcrição (OUCHI et al, 1998; ZHANG et al,
1998a). BRCA1 também foi envolvida na diminuição da taxa de crescimento celular
estimulado por IFN-γ, provavelmente devido a sua ligação com STAT1 (Signal
Transducer and Activator of Transcription 1) ativado (OUCHI et al, 2000). Em células
estimuladas com IFN-γ, a diminuição do crescimento é mediada pela indução de p21
através de um elemento que responde a IFN-γ. Experimentos com HCC1937,
linhagem celular que carrega apenas uma cópia de uma versão truncada de BRCA1,
indicaram que BRCA1 é requerida para indução de p21 mediada por IFN-γ (OUCHI
et al, 2000). BRCA1 regula diferencialmente alguns genes alvos de IFN-γ, sugerindo
que a proteína apresenta seletividade a promotor.
BRCA1 é capaz não só de ativar, mas também de reprimir a transcrição. Em
um ensaio de dois-híbridos, mostrou-se que BRCA1 interage com o fator de
transcrição c-Myc (WANG et al, 1998). Em estudos de co-transfecção BRCA1
reprimiu a transcrição mediada por c-Myc e suprimiu o número de foci formados em
fibroblastos de embrião transformados com Ras ou c-Myc, sugerindo que BRCA1
pode regular negativamente a transcrição por c-Myc. O fato de BRCA1 possuir um
domínio de ativação transcricional pode parecer contraditório em relação à sua
função de repressão, mas a interação de BRCA1 com diferentes proteínas fornece
evidências indiretas do seu papel na transcrição e sugere que BRCA1 pode se
alternar entre um regulador positivo e um negativo, dependendo do contexto
(MONTEIRO, 2000; MACLACHLAN et al, 2000).
30
Finalmente, BRCA1 e BARD1, estão presentes em um complexo protéico que
contém o fator estimulante de clivagem CstF50, que ajuda a especificar o sítio de
processamento do mRNA, durante a poliadenilação (KLEIMAN & MANLEY, 1999).
1.9 Domínio BRCT: Ativador Transcricional
Monteiro e colaboradores, em 1996, demonstraram que a região C-terminal de
BRCA1 (aa 1760-1863) pode atuar como um ativador transcricional mediante sua
fusão a um domínio heterólogo de ligação ao DNA (figura 5). Ensaios posteriores
mostraram uma correlação entre a perda desta atividade transcricional e mutações
na região C-terminal da proteína que conferem predisposição hereditária ao câncer
de mama e ovário (MIKI et al, 1994; HAYES et al, 2000). Por outro lado,
polimorfismos benignos não mostraram relação com a perda da atividade
transcricional, o que é bastante consistente com a idéia de que BRCA1 é um gene
supressor de tumor (FRIEDMAN et al, 1994; DUROCHER et al, 1996) . O
estabelecimento dessa correlação permitiu o uso dessa estratégia como um ensaio
funcional para caracterização de variantes ainda não classificadas de BRCA1
(VALLON-CHRISTERSSON et al, 2001; PHELAN et al, 2005), possibilitando uma
análise de risco de desenvolvimento de câncer de mama e ovário mais precisa em
indivíduos que carregam mutações neste gene. Esta técnica gerou a possibilidade
de se desenvolver um ensaio através do qual é possível se ter uma idéia das
variantes que possivelmente contribuem ou não para o desenvolvimento do câncer
de mama e ovário.
31
Embora não exista um homólogo de BRCA1 em seu genoma, as leveduras tem
sido um sistema-modelo importante para o estudo de BRCA1, assim como para a
função de vários fatores de transcrição de mamíferos (KENNEDY, 2002). As
leveduras têm sido utilizadas para se analisar a estrutura-função de BRCA1 na
transcrição, como também para investigar seus mecanismos de ativação, fazendo-se
uma correlação com os dados clínicos (MONTEIRO, AUGUST & HANAFUSA, 1996,
1997; HAYES et al, 2000; VALLON-CHRISTERSSON et al, 2001; NADEAU et al,
2000). Além disso, a superexpressão de BRCA1 humana em leveduras gera um
fenótipo de colônias pequenas que foi proposto como um método para classificar
mutações em BRCA1 que ainda não haviam sido caracterizadas (MONTEIRO &
HUMPHREY, 1998; HUMPHREY et al, 1997).
A importância do estudo de mutações do tipo missense se deve a falta de
informação sobre qual tipo de problema a troca de um aminoácido poderá acarretar
Figura 5: Ativação transcricional por BRCA1.
DBD
repórter
Polimorfismo benigno
DBD
repórter
X
Variante missense associada a câncer
DBD
repórter
X
Variante nonsense associada a câncer
DBD
repórter
Tipo selvagem
Atividade transcricional da região C-terminal de BRCA1 selvagem e mutante fusionados com
um domínio heterólogo de ligação a DNA (DBD) (caixas laranjas). A introdução de mutações
associadas a câncer (mas não dos polimorfismos benignos) abole a ativação do gene repórter
(Retirado de Monteiro, 2000).
32
na função da proteína. Uma mutação que provoca a deleção de uma região da
proteína é facilmente reconhecida como causa da perda da função da mesma e
associada a uma evidente mudança estrutural. Já nas mutações onde ocorre apenas
a troca de um resíduo de aminoácido, não existe mudança física perceptível da
proteína, quando analisada por western blotting, por exemplo (SZABO, WORLEY &
MONTEIRO, 2004). A grande maioria das mutações já descritas para BRCA1,
invariavelmente, leva à truncagem da região C-terminal, região da proteína muito
conservada evolutivamente entre BRCA1 de camundongo a humano (aa 1636-1795)
(ABEL et al, 1995) e que compreende os domínios BRCT, ressaltando a importância
dessa região para sua função (MONTEIRO, 2000). As mutações missense relatadas,
localizam-se ou no domínio RING-finger ou na região C-terminal (Breast Cancer
Information Core).
Desta forma, Monteiro e colaboradores (1996) decidiram investigar se a região
contendo um grupo de mutações descritas adjacente à porção C-terminal de
BRCA1 (Breast Cancer Information Core), compreendendo os exons 16-24 (aa1560-
1863), estaria envolvida na ativação transcricional. Após a detecção e identificação
dos alelos mutantes de BRCA1 eram necessários dados adicionais para determinar
as conseqüências de uma dada alteração na saúde de um indivíduo. Os ensaios
funcionais poderiam medir o grau de inativação funcional de BRCA1 associado com
uma alteração de seqüência e poderiam ajudar na classificação de variantes
missense na linhagem germinativa como: um polimorfismo benigno (sem efeito na
função de BRCA1) ou como uma mutação que predispõe a câncer (com algum grau
de inativação funcional) (MONTEIRO & HUMPHREY, 1998).
Os estudos populacionais e de análise de ligação são os ensaios mais diretos
da função supressora de tumor atribuída a BRCA1. Alterações específicas de
33
seqüências da linhagem germinativa de muitos indivíduos são estudadas nestes
ensaios para a correlação com a presença de câncer de mama ou ovário. A
detecção de uma incidência alta de câncer entre indivíduos com uma dada mutação
missense confere um grau de certeza estatística, mas não absoluta, de que uma
certa mutação predispõe ao câncer. A análise de ligação tem demonstrado
claramente que as mudanças em seqüências na linhagem germinativa que resultam
em término prematuro da proteína BRCA1, predispõem indivíduos a câncer de
mama e ovário (MIKI et al, 1994).
34
2. Objetivo
35
2.1 Objetivo Geral
Este trabalho teve como objetivo a classificação de variantes missense de
BRCA1, quanto ao risco potencial de desenvolvimento de câncer de mama baseada
na capacidade da região C-terminal da proteína ativar a transcrição de um gene
repórter.
2.2 Objetivos Específicos
- Geração de variantes presentes no BIC através de mutagênese sítio-dirigida com
PCR por sobreposição e extensão;
- Realização de ensaio de ativação transcricional em leveduras;
- Realização de ensaio de ativação transcricional em células de mamíferos.
36
3. Materiais e Métodos
37
3.1 Construções de DNA
3.1.1 Seleção de Variantes
As variantes do gene BRCA1, utilizadas neste estudo, foram selecionadas no
BIC (Breast Cancer Information Core), segundo os seguintes critérios: (1) ser do tipo
missense, ou seja, aquelas nas quais a troca de um nucleotídeo na seqüência do
gene resulta na troca de um resíduo de aminoácido que compõe a proteína; (2) estar
contida entre os exons 13 e 24 do gene, uma vez que Phelan e colaboradores, em
2005, determinaram que esta porção do gene contribui para uma maior taxa de
ativação da transcrição; e (3) que ainda não tivessem sido estudadas pela mesma
abordagem proposta em nosso trabalho. De acordo com estes critérios, foram
selecionadas as variantes R1443G, R1495M, V1534M, D1546N, L1564P, P1614S,
T1700A, G1706E, V1736A e V1804D. As seis primeiras variantes encontram-se
antes dos domínios BRCT e as quatro últimas encontram-se dentro do domínio
BRCT.
3.1.2 PCR por Sobreposição e Extensão
Para a geração de mutações pontuais in vitro, correspondentes às variantes
selecionadas para o trabalho, foi utilizada a técnica de mutagênese sítio-dirigida
através de PCR (Polymerase Chain Reaction) por extensão sobreposta (overlap
extension PCR), como descrito em Sambrook & Russel (2001). Como molde foi
usado o plasmídeo p385-BRCA1 (gentilmente cedido pelo Dr. Michael Erdos,
National Human Genome Research Institute), que contém a seqüência codificante
completa de DNA de BRCA1 humana. A região amplificada, onde foram introduzidas
38
as mutações, correspondia aos aminoácidos 1396-1863, que era flanqueada pelos
iniciadores UX13 e 24ENDT (tabela 1). Cada um deles continha em sua extremidade
5’ sítios para as enzimas de restrição EcoRI e BamHI, respectivamente.
No primeiro conjunto de reações onde foram amplificadas as porções 5’ dos
fragmentos, foi utilizado o iniciador UX13 e um iniciador específico com a alteração
de interesse para cada uma das variantes, como é possível ver na tabela 2.
No segundo conjunto de reações foram amplificadas as porções 3’ dos
fragmentos, utilizando-se o iniciador 24ENDT e um iniciador específico contendo a
alteração de interesse, também para cada uma das variantes (tabela 3).
Na terceira reação foram utilizados os iniciadores UX13 e 24ENDT, a fim de
amplificar o fragmento 13-24 completo, e os produtos de PCR resultantes das
reações anteriores correspondentes às porções 3’ e 5’ de cada uma das variantes
(figura 6).
As concentrações finais dos reagentes nas reações de PCR foram: 200 µM de
cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) , 0,5 µM de cada um dos iniciadores, 100
ng DNA molde e 1 unidade da enzima Pfu em tampão de reação que acompanha a
enzima, para reações com volume final de 50 µL.
Tabela 1: Seqüências dos iniciadores utilizados para amplificação da região
correspondente aos aminoácidos 1396-1863 de BRCA1. Os sítios para enzimas de
restrição estão sublinhados.
Iniciador
Seqüência
Sítio de Clonagem
UX13
5’CGGAATT CCAGAGGGATACCATGCAA 3’
EcoRI
24ENDT
5’GCGGATCCTCAGTAGTGGCTGTGGGGGAT 3’
BamHI
39
Tabela 2: Seqüência dos iniciadores usados para inserir a mutação e amplificar a
porção 5’ da seqüência correspondente aos exons 13- 24.
Iniciador
Seqüência
R1443G R (g! c)
5’ TCT GGA TTT CCC AGG TCC TCA 3’
R1495M R (c-!a)
5’ AGG GGA TGA CAT TTC CAC TCC 3’
V1534M R (c! t)
5’ TGC TCC TCC ATA TCA ACA ACC 3’
D1546N R (c! t)
5’ TCC GTC AAA TTG TGT GGC CCA 3’
L1564P R (a! g)
5’ CT GAT TCC AGA TTC CGG GTA AGG GGT ACC CTC 3’
P1614S R (g!a)
5’ C AGC AGC TGA ACT CTG GGC AGA TTC TGC 3’
T1700A R (t! c)
5’ ATA TTT CAG TGC CCG TTC ACA CAC AAA C 3’
G1706E R (c! t)
5’ TCC CGC AAT TTC TAG AAA ATA 3’
V1736A R (a!g)
5’ ATC TCC TCT GGC TTC AAA ATC 3’
V1804D R (a!t)
5’ AAT TGG GTG GTC ACC TGT GCC 3’
Na nomenclatura das variantes, a primeira letra corresponde a ao aminoácido presente na proteína
selvagem, o número correspode à posição do aminoácido na proteína e a última letra, imediatamente
após o número, corresponde ao aminoácido alterado na variante. R oligonucleotídeo anti-senso.
Em negrito, os nucleotídeos alterados para a mutagênese sítio-dirigida.
Tabela 3: Seqüência dos iniciadores usados para inserir a mutação e amplificar a
porção 3’ da seqüência correspondente aos exons 13- 24.
Iniciador
Seqüência
R1443G F (c! g)
5’ TGA GGA CCT GGG AAA TCC AGA 3’
R1495M F (g-!t)
5’ GGA GTG GAA ATG TCA TCC CCT 3’
V1534M F (g!a)
5’ GGT TGT TGA TAT GGA GGA GCA 3’
D1546N F (g!a)
5’ TGG GCC ACA CAA TTT GAC GGA 3’
L1564P F (t! c)
5’ G GGT ACC CCT TAC CCG GAA TCT GGA ATC AG 3’
P1614S F (c! t)
5’ GCA GAA TCT GCC CAG AGT TCA GCT GCT G 3’
T1700A F (a!g)
5’ G TTT GTG TGT GAA CGG GCA CTG AAA TAT 3’
G1706E F (g!a)
5’ TAT TTT CTA GAA ATT GCG GGA 3’
V1736A F (t! c)
5’ GAT TTT GAA GCC AGA GGA GAT 3’
V1804D F (t! a)
5’ GGC ACA GGT GAC CAC CCA ATT 3’
Na nomenclatura das variantes, a primeira letra corresponde a ao aminoácido presente na proteína
selvagem, o número correspode à posição do aminoácido na proteína e a última letra, imediatamente
após o número, corresponde ao aminoácido alterado na variante. F oligonucleotídeo senso. Em
negrito, os nucleotídeos alterados para a mutagênese sítio-dirigida.
40
As amostras foram submetidas ao seguinte ciclo: desnaturação inicial de 94
o
C
por 5 minutos, 30 ciclos de desnaturação a 94
o
C por 1 minuto, anelamento a 60
o
C
por 1 minuto, extensão a 72
o
C por 2 minutos e extensão final a 72
o
C por 10 minutos.
Após cada reação os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese
em gel de agarose 1% (p/v) para confirmação dos tamanhos dos fragmentos e
posterior purificação. A terceira reação acontecia sob as mesmas condições das
reações anteriores, porém, não se utilizava DNA molde. Os iniciadores UX13 e
24ENDT eram usados nas mesmas concentrações descritas acima e os produtos
purificados correspondentes às porções 5’ e 3’ de uma mesma variante eram os
Figura 6: Esquema de Mutagênese Sítio-dirigida por Extensão Sobreposta.
Em rosa a porção 5’ do gene BRCA1. Em cinza, o plasmídeo, em marrom a região correspondente
aos exons 13-24 do gene BRCA1. Em azul escuro e azul claro, os oligonucleotídeos iniciadores que
amplificam a porção 3’ e 5’ do gene, respectivamente. Em amarelo o nucleotídeo alterado em
relação à seqüência selvagem. O desenho não está em escala.
41
moldes, sendo utilizados em massas aproximadamente iguais, estimadas através da
visualização do DNA em gel de agarose corado com brometo de etídeo 0,5 µg/mL,
por iluminação com luz UV. O produto final destas reações correspondia a um
fragmento de aproximadamente 1,4 kb (aminoácidos 1396-1863) e continha o
nucleotídeo de interesse alterado.
3.1.3 Digestão de Produtos de PCR e de Plasmídeos para Clonagem
Todos os produtos de PCR amplificados na última reação (fragmento 13-24
completo) foram digeridos com as enzimas EcoRI e BamHI (Amersham GE). Para
cada 20 µL de produto de PCR foram utilizadas 2 unidades de cada uma das
enzimas, diluídos em tampão que acompanhava a enzima. Para todas as reações
de digestão foi respeitada a relação 1:20 µL de enzima para volume total da reação.
Os plasmídeos pLex9, pGBT9 e pCDNA3 foram digeridos antes de utilizados
para as clonagens. Eram utilizadas 2 unidades de enzima para cada µg de vetor a
ser digerido, as demais condições eram as mesmas citadas anteriormente. Os
vetores pLex9 e pGBT9 foram digeridos com EcoRI e BamHI (Amersham GE) e
pCDNA3 foi digerido com as enzimas HindIII e BamHI (Amersham GE). Na tabela 4,
estão listados todos os plasmídeos utilizados em nosso trabalho.
42
3.1.4 Tratamento dos Plasmídeos Digeridos com CIP
Após digeridos, os vetores foram tratados com a enzima CIP- Calf Intestinal
Phosphatase - de acordo com as instruções do fabricante (New England BioLabs
Inc.). A CIP era importante para remoção dos grupos 5’ fosfato do DNA, evitando
que os vetores recircularizassem sem inserto após a digestão, facilitando a posterior
busca pelos clones mutados, diminuindo o número de falsos positivos.
3.1.5 Purificação de Plasmídeos e de Produtos de PCR
Os plasmídeos tratados com CIP e os produtos de PCR, foram submetidos à
eletroforese em gel de agarose 0,8-1,5% (p/v), para determinação do peso molecular
dos vetores e fragmentos amplificados a serem observados, utilizando-se,
Plasmídeo
Conteúdo
Utilização
p385-BRCA1
Seqüência codificante completa
de BRCA1 humano.
Molde para as reações de PCR para
mutagênese sítio-dirigida.
pLex9
Domínio de ligação a DNA de
LexA.
Expressão em leveduras.
pGBT9
Domínio de ligação a DNA de
GAL4.
Vetor intermediário de onde foi retirado
o domínio de ligação a DNA de LexA.
pCDNA3
-
Expressão em células de mamíferos.
pG5Luc
Gene repórter de luciferase de
vaga-lume.
Ensaio em células de mamíferos.
phGR-TK
Gene repórter de luciferase de
Renilla, de expressão
constitutiva.
Controle interno utilizado no ensaio em
células de mamíferos.
pRB1840
Plasmídeo repórter contendo o
gene LacZ.
Ensaio em leveduras.
Tabela 4: Plasmídeos utilizados.
43
respectivamente, um padrão de peso molecular de 1 kb ou de 100 pb (ambos
Invitrogen) com os quais os fragmentos eram comparados, após coloração com
brometo de etídeo 0,5 µg/mL e posterior visualização com luz UV. Confirmados os
tamanhos, o DNA era extraído de gel de agarose com o sistema QIAEX II- DNA
Extraction from Agarose Gel (Qiagen Inc.), de acordo com as instruções do
fabricante, e as amostras foram ressuspensas em Tris-HCl 10mM pH 8,5.
3.1.6 Indução de competência em Escherichia coli
Uma alíquota de 5 µL de um estoque da cepa de Escherichia coli DH5αF´IQ foi
inoculada em 5 mL de meio LB (triptona 10,0 g/L, extrato de levedura 5,0 g/L, NaCl
5,0 g/L) e cultivada por 16h a 37
o
C sob agitação constante de 250 rpm. Um mL
desta cultura foi então inoculado em 50 mL de LB e mantido sob agitação constante
de 250 rpm a 37
o
C até que chegasse à fase exponencial. Quando uma D.O.
600
de
aproximadamente 0,6 foi atingida, a cultura foi submetida à centrifugação de 1.000 g
por 10 minutos a 4
o
C. O sobrenadante foi descartado e as células ressuspensas em
25 mL de solução de CaCl
2
50 mM gelada. A suspensão foi mantida em gelo por 30
minutos e posteriormente centrifugada a 1.000 g por 10 minutos a 4
o
C. Novamente o
sobrenadante foi descartado e as células suspensas em 5 mL de solução de CaCl
2
50 mM gelada e mantidas em gelo por 1 hora. Após este período foi adicionado
glicerol em concentração final de 20% (v/v) e depois homogeneizado. Alíquotas de
200 µL de suspensão de células competentes foram distribuídas em tubos de 1,5 mL
e armazenadas a –70
o
C (protocolo adaptado de Sambrook & Russel, 2001).
44
3.1.7 Clonagem dos Produtos de PCR em pLex9 e Transformação
Bacteriana
Os fragmentos mutados foram clonados no vetor de expressão em leveduras
pLex9, na mesma fase de leitura de um domínio de ligação a DNA de LexA presente
no vetor. O vetor e os fragmentos mutados foram utilizados em uma proporção molar
de 1:3, respectivamente, em uma reação catalisada pela enzima T4 DNA Ligase
(Gibco, Fisher, Amersham GE) da qual se utilizava 3 unidades da enzima para 10 µL
de reação, utilizando-se o tampão fornecido juntamente com a enzima.
As ligações foram transfectadas na linhagem bacteriana DH5α de Escherichia
coli, por choque térmico a 42
o
C. Cerca de 20 ng de DNA foram adicionados em 200
µL de solução contendo bactérias competentes (mencionadas no item 1.5) e esta
mistura foi mantida em gelo por 15 minutos. Passado este período, a solução
permaneceu em banho-maria a 42
o
C por 90 segundos, para o choque-térmico, e
depois foi colocada em gelo por um período não inferior a 5 minutos. Posteriormente
foram adicionados 800 µL de LB ao tubo e o mesmo deixado em banho-maria a
37
o
C por pelo menos 30 minutos para recuperação das bactérias. Depois de
recuperadas as células eram espalhadas em placas de Petri que continham meio
sólido LB-ampicilina (50 µg/mL) e deixadas em estufa a 37
o
C, por aproximadamente
15h.
O vetor pLex9 contém um gene de resistência a ampicilina. As colônias
escolhidas foram inoculadas em 3 mL de meio LB líquido contendo ampicilina (50
µg/mL) durante a noite, sob agitação constante de 250 rpm e temperatura de 37
o
C.
Para confirmação dos clones positivos foi feita a extração do DNA plasmidial como
se segue: 1,5 ml de cultura foi submetido à centrifugação a 12.000 g em
microcentrífuga (Eppendorf) por 1 minuto. O sobrenadante foi descartado e as
45
células ressuspensas em 100 µL da solução GET (glicose 50 mM, EDTA pH 8,0 10
mM, Tris-HCl pH 8,0 25 mM). Posteriormente eram adicionados 200 µL de uma
solução contendo NaOH 0,2 N e SDS 1% e 150 µL de acetato de potássio 3M pH
4,8, após a adição de cada uma das soluções, a mistura foi feita por inversão. A
solução foi centrifugada a 12.000 g por 5 minutos e depois de recuperado o
sobrenadante, foi adicionado 1 volume de clorofórmio, misturado em vórtex, e a
solução, deixada incubando à temperatura ambiente por 2 minutos. A fase aquosa
foi recuperada em um tubo novo, onde adicionou-se 0,1 volume de acetato de sódio
3 M e 2 volumes de etanol absoluto. A solução foi misturada em vórtex e depois
incubada por pelo menos 20 minutos a –70
o
C. A solução foi centrifugada por 15
minutos a 12.000 g e o sedimento de DNA formado foi lavado com 300 µL de etanol
70%. Após outro passo de centrifugação nas mesmas condições por 5 minutos,
descartou-se o sobrenadante e o sedimento foi deixado em temperatura ambiente
para posterior ressuspensão com Tris-HCl 10 mM pH 8,5 (Protocolo adaptado de
Sambrook & Russel, 2001).
O DNA plasmidial extraído, foi digerido com as enzimas EcoRI e BamHI (como
citado no ítem 1.2) e através de eletroforese em gel de agarose 1% (p/v), verificou-
se a liberação do inserto de aproximadamente 1,4 kb.
Os clones positivos eram expandidos e o DNA extraído e purificado com o
sistema QIAGEN
Plasmid Purification (QIAGEN
), como recomendado pelo
fabricante. O DNA era quantificado em espectrofotômetro DU530 (Beckman) e as
mutações eram confirmadas por seqüenciamento automático em MegaBace 1000
Analysis System (Amersham Pharmacia Biotech Inc.), para o qual era utilizado o kit
MegaBace, DYEnamic
TM
ET dye terminator (Amersham Pharmacia Biotech Inc.).
46
3.1.8 Subclonagem dos Produtos de PCR em pGBT9
Para a subclonagem do insertos no vetor pGBT9 foram utilizados os insertos
liberados dos clones positivos em pLex9, digeridos com as enzimas EcoRI e BamHI.
A extração e purificação dos insertos de gel de agarose foram feitas como
mencionado no ítem 3.1.4. Uma vez liberados, os insertos foram clonados em
pGBT9 previamente digerido com as mesmas enzimas. A clonagem dos insertos foi
feita na mesma fase de leitura de GAL4 DBD, presente em pGBT9.
Os procedimentos e condições de reação foram realizados como descrito no
ítem 1.6. Os clones positivos foram expandidos, e os DNAs plasmidiais extraídos,
purificados e posteriormente digeridos com HindIII e BamHI, liberando insertos de
aproximadamente 2 kb, correspondentes ao fragmento contendo a mutação,
fusionado ao GAL4 DBD.
3.1.9 Subclonagem dos Produtos de PCR em pCDNA3
Os insertos liberados de pGBT9, digeridos com as enzimas HindIII e BamHI e
devidamente purificados, foram subclonados no vetor de expressão em células de
mamíferos pCDNA3 previamente digerido com as mesmas enzimas e sob as
condições descritas no ítem 1.6. Os clones positivos foram selecionados como
descrito acima e suas mutações foram confirmadas como descrito a seguir.
47
3.1.10 Confirmação das Mutações por Seqüenciamento
Para a confirmação das mutações em pLex9 e pCDNA3, as construções foram
submetidas a seqüenciamento como mencionado no ítem 1.6. Para o
seqüenciamento das construções foi utilizado o iniciador 9503101, que se anela à
extremidade 5’ do exon 16, o iniciador LexA seq, que se anela à seqüência de Lex A
em pLex9, e o iniciador Gal4 DBD, que se liga à seqüência de GAL4 DBD, presente
nas construções feitas em pCDNA3 (tabela 5).
3.2 Ensaio de Ativação Transcricional em Leveduras
Para este ensaio foram utilizadas as células de Saccharomyces cerevisiae da
linhagem EGY48 [MATa, ura3, trp1, his3, 6 lexA operator-LEU2]. Todo o ensaio, da
indução de competência em leveduras até o ensaio de ativação transcricional
propriamente dito, foi realizado de acordo com as instruções do fabricante do
sistema MATCHMAKER Library (Clontech Laboratories Inc.).
Tabela 5: Seqüência dos iniciadores utilizados para confirmação das construções de
DNA.
Iniciador
Seqüência
Região de Hibridização
9503101
5’ CGG AAT TCG AGG GAA CCC CTT ACC TG 3’
Exon 16
LexA seq
5’ CGT CAG CAG AGC TTC ACC ATT 3’
Lex A
Gal 4 DBD
5’ TCA TCG GAA GAG AGT AG 3’
GAL4 BD
48
3.2.1 Indução de Competência em Leveduras
Algumas colônias de levedura, mantidas em placa de placa de Petri contendo
meio sólido YPD (peptona 20 g/L, extrato de levedura 10 g/L, glicose 20 g/l; Clontech
Laboratories Inc.), foram inoculadas em 1 mL de meio líquido YPD. A mistura foi
agitada vigorosamente para dispersão do aglomerado de células e posteriormente
transferida para um frasco contendo 50 mL de meio líquido YPD, que foi incubado a
30
o
C, de 16-18h sob agitação de 250 rpm até que a cultura atingisse a fase
estacionária (D.O.
600
> 1.5). Para um frasco contendo 300 mL de meio YPD líquido,
foi transferido volume de cultura suficiente para produzir uma D.O.
600
= 0,2-0,3 e
posteriormente incubadas a 30
o
C sob agitação constante de 230 rpm por 3 horas. As
células foram centrifugadas a 1.000 g por 5 minutos em temperatura ambiente e,
após o descarte do sobrenadante, foram ressuspensas em 30 mL de H
2
0. As
células foram novamente centrifugadas sob as mesmas condições, o sobrenadante
descartado e o sedimento foi ressuspenso em 1,5 mL de solução TE/LiAc 1X fresca
(TE: Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM). Todo o processo foi realizado em ambiente
estéril, com soluções estéreis.
3.2.2 Transformação de Leveduras
Para cada variante estudada, foi adicionado 500 ng de DNA de uma das
variantes clonada em pLex9, 200 ng do plasmídeo repórter pRB1840 e 100 µg de
DNA carreador (fornecido no kit), além de 100 µL de células de levedura
competentes e 600 µL PEG/ LiAc (PEG 4000 40%, TE 1X, Li Ac 1X; PEG: Polietileno
glicol), posteriormente misturados em vórtex. Esta mistura foi incubada a 30
o
C por
49
30 minutos sob agitação constante de 200 rpm e, posteriormente, foi adicionado
DMSO para 10%, misturado por inversão.
O choque térmico foi feito em banho-maria a 42
o
C por 15 minutos e em seguida
as células foram colocadas em gelo e posteriormente centrifugadas durante 5
segundos a 13.000 g. O sobrenadante foi descartado e as células ressuspensas em
0,5 mL de TE 1X. De 150 a 200 µL desta suspensão foram espalhados em placas
de Petri contendo meio SD/-TRP-URA sólido (YNB 6,7 g/L, Na
2
HPO
4
7,0 g/L,
NaH
2
PO
4
7,0 g/L, ágar 20 g/L 2% p/V de dextrose; na ausência de triptofano e
uracil), que foram deixadas incubando a 30
o
C até que as colônias aparecessem. O
YNB (yeast nitrogen base without aminoacids) utilizado no preparo do meio SD
(sodium dropout) é uma mistura contendo fontes de carbono, fontes de nitrogênio
(não-aminoácidas) e sulfato de amônio (Clontech Laboratories Inc.).
3.2.3 Ensaios para Atividade de β-galactosidase
Os ensaios para β-galactosidase foram realizados com 3 colônias
independentes de cada variante e cada uma das colônias foi ensaiada em triplicata.
Cada colônia foi inoculada em 5 mL de meio líquido SD/-TRP-URA e crescida
durante a noite sob agitação de 250 rpm a 30
o
C. À esta cultura foram adicionados 2
mL em 8 mL de meio líquido YPD, que foram crescidos a 30
o
C, de 3 a 5 horas sob
agitação de 240 rpm, até que a cultura alcançasse uma D.O. de 0,5-0,8,
correspondente a fase logarítmica média. Cada uma das culturas foi agitada em
vórtex durante 1 minuto e a D.O.
600
foi determinada. Posteriormente, 1,5 mL de
cada cultura foi colocado em tubos de 1,5 mL e e centrifugados a 13.000 g por 30
segundos. O sobrenadante foi retirado e o sedimento lavado e ressuspenso em 1.5
50
mL de tampão Z (16,1 g/L Na
2
HPO
4
⋅7H
2
O; 5,5 g/L NaH
2
PO
4
⋅H
2
O; 0,75 g/L KCl;
0,246 g/L MgSO
4
⋅7H
2
O, pH 7,0) por tubo. As células foram centrifugadas
novamente e ressuspensas em 300 µL de tampão Z (fator de concentração de 5 X).
O volume de 100 µL de cada uma das suspensões celulares foi colocado em
diferentes tubos que foram congelados em nitrogênio líquido e descongelados em
banho-maria a 37
o
C por no máximo 1 minuto. A etapa de congelamento e
descongelamento foi realizada duas vezes. Posteriormente, a cada um dos tubos, foi
adicionado 0,7 mL de tampão Z /β-mercaptoethanol (0,27 mL β-mercaptoethanol:
100 mL de tampão Z) e depois, 0,16 mL de ONPG (4 mg/mL, em tampão Z). As
amostras foram incubadas a 30
o
C até que a coloração amarela fosse revelada,
quando então se adicionou 0,4 mL de Na
2
CO
3
1 M para parar a reação. O tempo
entre a adição do ONPG e o surgimento da coloração amarela era registrado. Os
tubos contendo as reações foram submetidos à centrifugação por 10 minutos a
13.000 g para a retirada dos restos celulares e cada uma das amostras teve sua
D.O.
420
determinada.
Para o cálculo das unidades de β-galactosidase, para cada uma das amostras,
foi usada a seguinte fórmula (indicada no manual do fabricante):
1.000 X D.O.
420
/(t X V X D.O.
600
), onde;
t = tempo corrido de incubação, em minutos
V = 0,1 mL X fator de concentração (5)
D.O.
600
= A
600
de 1 mL de cultura
As D.O. foram medidas em espectrofotômetro Beckman DU530.
51
3.2.4 Verificação da Presença da Proteína de Fusão em Leveduras.
A avaliação da expressão das proteínas de fusão LexA DBD:BRCA1 das
variantes em células de levedura foi realizada por western blotting. Para isso, dos 10
mL de cultura de leveduras transformadas que estavam em meio líquido YPD (ítem
2.3) e foram utilizadas para os ensaios líquidos para atividade da β- galactosidase ,
foi separada uma alíquota de 6 ml para a retirada dos extratos protéicos totais. A
seguinte metodologia foi utilizada: 4 mL de cultura foram centrifugados a 3.000 rpm
de 5 a 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e as células ressuspensas em 1
mL de NaOH 0,25 M, β-mercaptoetanol 1%, transferidas para um tubo de 1,5 mL e
incubadas em gelo por 10 minutos. Foi adicionado 0,16 mL de TCA 50% (p/v) e
incubou-se novamente em gelo por 10 minutos. Após uma centrifugação a 14.000 g
a 4
o
C por 10 minutos em microcentrífuga (Eppendorf), o sedimento foi lavado com
acetona gelada e seco ao ar. O sedimento foi ressuspenso em 0,1- 0,2 mL de
tampão de amostra 1X (0,25% azul de bromofenol, 0,25% xileno cianol, 30% glicerol
em H
2
O) e caso ficasse amarelo, a cor azul era restaurada com a adição de 1-2 µL
de Tris pH 9,5. O extrato era estocado a –20
o
C. (EUKARYOTIC GENE
EXPRESSION COURSE MANUAL, 1998).
Os extratos protéicos foram analisados por western blotting, segundo
metodologia adaptada de Sambrook e Russel, 2001, resumidamente descrita a
seguir. As amostras foram resolvidas por eletroforese em gel de poliacrilamida 10%
(p/v) em condições desnaturantes (SDS-PAGE). Imediatamente após a eletroforese,
as amostras foram eletrotransferidas para filtro de PVDF (Immobilon-P - Millipore).
Para identificação das proteínas quiméricas, foi utilizado anticorpo monoclonal anti-
LexA (Clontech Laboratories Inc.) e anticorpo secundário policlonal anti-IgG de
camundongo conjugado com HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.) seguindo as
52
orientações dos fabricantes. A revelação era feita utilizando-se o ECL Plus Western
Blotting Detection Reagents e Hyperfilm ECL (ambos, Amershan Pharmacia Biotech
Inc.), seguindo orientações do fabricante. Para confirmação dos pesos moleculares
das proteínas, foi utilizado o padrão Rainbow Low Weight (BioRad).
3.3 Ensaio de Ativação Transcricional em Células de
Mamíferos
Para estes ensaios foram utilizadas células de mamíferos da linhagem de
epitélio renal humano 293T (ATCC – American Type Culture Collection), cultivadas
em meio DMEM suplementado com 5% (v/v) de soro de bezerro, penicilina 0,1
mg/mL e estreptomicina 0,1 mg/mL, a 37
o
C e 5% (v/v) de CO
2
em atmosfera úmida
(todos os reagentes, Invitrogen Life Technologies Inc.).
3.3.1 Transformação de Células de Mamíferos
As células 293T eram mantidas em placas de 24 poços (Fischer), que
continham 5 x 10
4
células em cada poço. As transfecções foram realizadas em
triplicata, cerca de 48 horas após o inóculo das células, quando estas atingiam 60%
de confluência, utilizando-se Fugene 6 Transfection Reagent (Roche) na razão 3:1
(Fugene:DNA), segundo metodologia de transfecção por formação de lipossomas
catiônicos, seguindo as instruções do fabricante. Para cada uma das variantes
testadas foram usados 0,5 µg das construções em pCDNA3 ou pCDNA3 vazio, 0,25
µg de pG5Luc (plasmídeo repórter) e 0,0025 µg de phGR-TK (controle interno).
53
3.3.2 Ensaio de Luciferase
As leituras foram feitas 24-36h pós-transfecção utilizando-se Dual–Luciferase
Reporter® Assay System (Promega), seguindo as orientações do fabricante,
descritas resumidamente a seguir. Removeu-se o meio de cultura das células que
em seguida foram lavadas com tampão fosfato (PBS; NaCl 8,0 g/L, KCl 0,2 g/L,
NaH
2
PO
4
1,2 g/L, KH
2
PO
4
0,2 g/L, pH 7,2). Posteriormente, preparou-se um extrato
celular com auxílio de um tampão de lise passiva (disponibilizado pelo fabricante).
Uma alíquota do extrato celular foi ensaiada na presença dos substratos adequados
(também disponibilizados pelo fabricante) para determinação da atividade
enzimática por quimioluminescência em luminômetro Sirius Luminometer (Berthold
Detection System).
3.3.3 Verificação da Presença da Proteína de Fusão em Células de
Mamífero.
As células da linhagem 293T foram cultivadas sob as mesmas condições
descritas para o ensaio de atividade de luciferase, porém, em placas de 6 poços
(Fischer) As células foram lavadas em solução salina balanceada (BSS; NaCl 8,0
g/L, KCl 0,4 g/L, CaCl
2
0,012 g/L, MgSO
4
.7H
2
O, NaH
2
PO
4
.12H
2
O, glicose 1,1 g/L,
vermelho de fenol 25 mg/L, pH 7,4) e recolhidas em tampão RIPA (TRITON X-100
1,0 % p/v, desoxicolato de sódio 0,1 % p/v, SDS 0,1 % p/v, NaCl 150 mM, EDTA 5
mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,2) que continha inibidores de protease (PMSF 100 µM,
aprotinina 2,2 µg/mL – ambos Sigma Chemical Co.) e inibidores de fosfatase
(ortovanadato de sódio 50 µM, fluoreto de sódio 500 µM e molibdato de sódio 50
µM).
54
Os extratos protéicos foram analisados para a presença das proteínas de fusão
GAL4 DBD:BRCA1 através de western blotting, segundo metodologia adaptada de
Sambrook e Russel, 2001. Para a resolução das amostras foram seguidos os
mesmos procedimentos adotados para os extratos protéicos de levedura. No caso
das céluas de mamíferos, as proteínas de fusão eram identificadas utilizando-se
anticorpo monoclonal anti-GAL4 DNA BD (Clontech Laboratories Inc.).
55
4. Resultados
56
4.1 Geração de Mutantes de BRCA1
A geração das variantes através de mutagênese sítio-dirigida por PCR com
extensão sobreposta (overlap extension PCR) é um processo composto por três
PCRs independentes. Duas delas são realizadas para que sejam amplificadas,
separadamente, as porções 5’ e 3’ do fragmento de interesse, que, em nosso caso,
é a seqüência correspondente aos exons 13- 24 do gene BRCA1. Na terceira
reação, são utilizados os produtos de PCR resultantes das duas reações anteriores,
para que seja amplificado o fragmento completo.
Para amplificarmos as porções 5’ dos fragmentos contendo as mutações, foram
usados os oligonucleotídeos R, citados em Materiais e Métodos, em conjunto com o
oligonucleotídeo UX13 que se anela à borda do exon 13 (Figura 7B). Para
amplificarmos as porções 3’ dos fragmentos contendo as mutações, foram usados
os oligonucleotídeos F, também citados em Materiais e Métodos, em conjunto com o
Figura 7: Amplificação por PCR das porções 5’ e 3’ da região C-terminal de
BRCA1.
Em A, produtos de amplificação da região 5’ de algumas das variantes testadas,
correspondentes aos éxons 13-24 de BRCA1. Em B, os produtos de amplificação da
região 3’. As amostras foram separadas por eletroforese em gel de agarose 1% e
coradas com brometo de etídeo. À direita, as variantes correspondentes a cada uma das
colunas. À esquerda, tamanho do fragmento mais abundante no padrão de peso
molecular de 100 pares de bases.
B)
800pb→
1- 100pb
2- R1495M
3- D1546N
4- G1706E
5- V1736A
1 2 3 4 5
A)
800pb→
1- 100pb
2- D1546N
3- V1534M
4- V1736A
5- R1443G
6- R1495M
7- V1804D
1 2 3 4 5 6 7
57
oligonucleotídeo 24ENDT que se anela ao final do exon 24 (figura 7A). Na tabela 5,
são mostrados os tamanhos esperados para os fragmentos correspondentes às
regiões 5’ e 3’ das variantes.
Para a construção do fragmento 13-24 completo contendo a mutação foi
necessária uma terceira PCR, onde foram utilizados os oligonucleotídeos UX13 e
24ENDT, além dos produtos das reações anteriores. No primeiro ciclo desta última
reação, as porções 5’ e 3’ funcionam como molde e iniciadores da reação, já que
suas extremidades são sobrepostas sendo então polimerizados os primeiros
fragmentos completos. Do segundo ciclo em diante ocorre a amplificação dos
fragmentos 13-24 completos (figura 8), sendo que os oligonucleotídeos da reação
foram UX13 e 24ENDT. Neste caso, para todas as variantes, são esperados
fragmentos de aproximadamente 1,4kb.
Na nomenclatura das variantes, a primeira letra corresponde ao aminoácido codificado pelo
gene selvagem, o número corresponde à posição do aminoácido na proteína e a última letra
corresponde ao aminoácido pelo qual o aminoácido selvagem foi substituído devido à
mutação no gene.
Tabela 6: Tamanho esperado dos produtos de PCR da região C-terminal de
BRCA1.
199
V1804D
1243
V1804D
403
V1736A
1039
V1736A
493
G1706E
949
G1706E
518
T1700A
941
T1700A
778
P1614S
671
P1614S
921
L1564P
528
L1564P
974
D1546N
468
D1546N
1010
V1534M
432
V1534M
1126
R1495M
316
R1495M
1283
R1443G
159
R1443G
Tamanho (pb)
Variante
Tamanho (pb)
Variante
Fragmentos 3'
Fragmentos 5'
58
4.2 Análise Funcional das Variantes Missense
A localização das dez variantes missense estudadas, assim como os controles
negativos e positivos utilizados para os ensaios de ativação transcricional,
encontram-se indicados por setas na figura 9. Quatro das variantes estão nos
domínios BRCT e as outras seis encontram-se na região a montante dos mesmos.
Foram utilizadas como controles negativos, isto é, de perda de função, as
variantes M1775R e Y1853X, que ocorrem dentro da região dos domínios BRCT e
são conhecidas por serem deletérias/de alto risco. A variante Y1853X resulta em
uma proteína truncada, com 11 aminoácidos a menos do que a proteína normal no
final da molécula devido a um stop códon prematuro. Ambas as variantes já foram
descritas como relacionadas ao desenvolvimento de câncer de mama e ovário em
análises de ligação em famílias com casos da doença (FUTREAL et al, 1994;
FRIEDMAN et al,1994).
Figura 8: Amplificação por PCR das porções 5’ e 3’ e do segmento completo
da região C-terminal de BRCA1.
1- 100pb
2- V1736A 3’(1039pb)
3- V1736A 5’(403pb)
4- V1736A comp (1422pb)
5- G1706E 5’(949pb)
6- G1706E 3’(493pb)
7- G1706E comp (1422pb)
1 2 3 4 5 6 7
800pb→
400pb→
1000pb→
1400pb→
Produtos de amplificação das regiões 3’, 5’ e do fragmento 13-24 completo correspondente às
variantes G1706E e V1736A. As amostras foram separadas por eletroforese em gel de agarose
1% e coradas com brometo de etídeo. À direita, variantes correspondentes a cada coluna e
entre parênteses os tamanhos esperados. À esquerda, tamanho dos fragmentos amplificados.
59
Como controles positivos foram usados BRCA1 13-24 selvagem ou WT, visto
nas figuras 10 e 12, correspondente à seqüência humana de cDNA de BRCA1
depositada no Genbank (número de acesso U14680), aminoácido 1396 ao 1863, e
S1613G, um polimorfismo neutro comum que possui a mesma seqüência citada
anteriormente com exceção da troca de uma serina por uma glicina na posição 1613
da proteína. Esta variante já foi descrita como não relacionada ao desenvolvimento
de câncer de mama (DUNNIG et al, 1997).
A classificação das variantes é feita da seguinte maneira: aquelas que
apresentam atividade muito baixa (atividade <50% da atividade do gene selvagem)
ou nula, são classificadas como deletérias/alto risco de predisposição a câncer de
mama e ovário; as de atividade média, entre 50% e 60% da atividade do gene
selvagem, são ditas intermediárias/risco indeterminado ou moderado (em uma
avaliação menos conservadora) de predisposição à doença; e aquelas que
apresentam atividade alta (>60% da atividade do gene selvagem) ou comparável ao
Figura 9: Desenho esquemático da região C-terminal de BRCA1 fusionada ao
DBD.
DBD
1396
1863
BRCT-N
BRCT-C
G1706E
V1736A
Y1853X
V1534M
R1443G
T1700A
S1613G
M1775R
L1564P
V1804D
R1495M
D1546N
P1614S
As variantes analisadas estão indicadas em azul. Os controles negativos e positivos
estão em vermelho e verde, respectivamente. Nas caixas cinzas, os domínios BRCT;
DBD (Domínio heterólogo de ligação a DNA); na caixa azul o provável domínio coiled-
coil.
60
selvagem são ditas neutras/baixa importância clínica, portanto, de baixo risco de
desenvolvimento da doença.
Os parâmetros adotados foram baseados nos valores das atividades dos
controles positivos, selvagem e S1613G, e negativos, M1775R e Y1853X.
4.3 Ativação Transcricional em Leveduras
Para o ensaio em células de levedura, foram testadas as variantes R1443G,
R1495M, V1534M, D1546N, L1564P, P1614S, T1700A, G1706E, V1736A, V1804D,
como pode ser visto na figura 9.
Figura 10: Ensaio quantitativo de ativação transcricional de variantes da região
C-terminal de BRCA1 em levedura.
+ + - -
Controles
0
25
50
75
10 0
12 5
15 0
17 5
20 0
22 5
25 0
27 5
WT
S1613G
M1775R
Y1853X
R1443G
R1495M
V1534M
D1546N
L 1564P
P1614S
T1700A
G1706E
V1736A
V1804D
Atividade de B-galactosidase (%).
As capacidades de ativação transcricional das variantes estão representadas em unidades de
β-galactosidase e transformadas em valores percentuais em relação à atividade de BRCA1
selvagem (WT). As barras de erro representam o desvio padrão. A linha horizontal indica o
limite de 50% de atividade relativa abaixo do qual a variante é considerada deletéria/alto risco.
As variantes analisadas estão indicadas abaixo. (+), controles positivos; (-), controles
negativos. No canto superior direito, esquema das construções utilizadas para este ensaio.
LacZ
1 Op LexA
BRCA1
1863
1396
LexA DBD
61
As variantes R1443G, R1495M, V1534M, P1614S e V1804D, apresentaram
valores de atividade maiores que 100%, o nível de atividade do tipo selvagem, e
L1564P apresentou atividade de 89% em relação ao mesmo. Assim sendo, todas
receberam a mesma classificação: neutras/baixo risco de desenvolvimento de
câncer de mama. As variantes T1700A e G1706E tiveram valores de atividade
menor que 50% da atividade do tipo selvagem, 16% e 17% respectivamente. Sendo
consideradas variantes de baixa atividade, foram classificadas como deletérias/alto
risco de desenvolvimento de câncer de mama. As variantes D1546N e V1736A
apresentaram níveis intermediários de atividade em relação ao tipo selvagem, 57% e
61%, respectivamente e foram consideradas indeterminadas. Em uma avaliação
menos conservadora, estas variantes poderiam ser consideradas de risco moderado
para o desenvolvimento da doença.
Para confirmarmos que a variação dos valores de ativação transcricional era
um reflexo da capacidade de cada uma das variantes da porção equivalente aos
éxons 13-24 da proteína BRCA1 ativar a transcrição, e não fruto de diferenças nas
quantidades da proteína sintetizadas dentro das células, foram realizados
experimentos controle de western blotting. O tamanho da proteína de fusão LexA
DBD:BRCA1 13-24 é de aproximadamente 100 kDa. Como pode ser visto na figura
10, todas as variantes se apresentam em quantidades muito semelhantes nas
células transfectadas, o que significa que as atividades resultantes do ensaio de
ativação transcricional não eram devidas a diferenças nos níveis de proteína na
célula. Para exemplificar, a variante V1804D (figura 11, raia 14) apresentou níveis de
proteína muito semelhantes ao cotrole negativo Y1853X (figura 11, raia 2, fotografia
inferior). No entanto, V1804D mostrou atividade >100%, enquanto Y1853X
apresentou um nível de atividade bem menor que 50%. Concluímos que as
62
atividades detectadas são um reflexo das respectivas capacidades de ativação
transcricional das variantes.
Não fomos capazes de descobrir o motivo da alteração do peso molecular da
proteína correspondente à variante T1700A.
Figura 11: Análise por western blotting da proteína de fusão LexA
DBD:BRCA1 em leveduras transfectadas com diferentes variantes da região C-
terminal de BRCA1.
Anticorpo primário: LexA DNA BD (1: 4000)
Anticorpo secundário: Goat anti-mouse IgG (1: 3000)
Exposição: 5 min
150 ug Ex. total/poço
À direita, as variantes correspondentes a cada uma das colunas. À esquerda, os tamanhos de
três fragmentos do padrão de peso molecular de proteínas. As concentrações dos anticorpos
primário e secundário, assim como o tempo de exposição e a massa de extrato total protéico
utilizada encontram-se na parte inferior da figura.
150 kDa →
100 kDa →
75 kDa →
1 2 9 10 11 12 13 14
1- WT
2- Y1853X
9- L1564P
10- P1614S
11- T1700A
12- G1706E
13- V1736A
14- V1804D
1- WT
2- Y1853X
3- M1775R
4- S1613G
5- R1443G
6- R1495M
7- V1534M
8- D1546N
1 2 3 4 5 6 7 8
150 kDa
100 kDa
75 kDa
63
4.4 Ativação Transcricional em Células de Mamíferos
A realização do ensaio de ativação transcricional em células de mamíferos é
importante, uma vez que BRCA1 é uma proteína humana. O ensaio nas células
293T tem sensibilidade muito maior do que o ensaio em células de leveduras. Nos
ensaios de detecção da presença da proteína de fusão nas células de mamíferos e
de diferenciação de sua quantidade nas mesmas, muitas vezes essa quantidade de
proteína é mais do que suficiente para ser detectada no ensaio de ativação
transcricional através da leitura em luminômetro, mas pode ser insuficiente para ser
revelada em western blotting, o que também justifica a utilização do ensaio em
leveduras.
Para o ensaio de ativação transcricional em células de mamíferos, foram
testadas as variantes R1443G, R1495M, D1546N, P1614S, T1700A e V1736A.
Neste ensaio, como pode ser observado na figura 12, as variantes R1495M, D1546N
e P1614S apresentaram atividade de 81%, 74% e 86%, respectivamente, em
relação à atividade do tipo selvagem, sendo, portanto, classificadas como variantes
neutras/ baixo risco de desenvolvimento de câncer de mama e ovário. As variantes
R1443G, T1700A e V1736A apresentaram níveis muito baixos de atividade em
relação à proteína selvagem: 39%, 27% e 4%, respectivamente, e foram
classificadas como deletérias/ alto risco de desenvolvimento de câncer de mama e
ovário.
Os dois ensaios de ativação transcricional concordaram quanto à avaliação das
variantes R1495M e P1614S, classificadas como variantes neutras/ baixo risco de
desenvolvimento de câncer de mama e de T1700A, classificada como deletéria/ alto
risco de desenvolvimento da doença. E foram discordantes para a classificação das
variantes R1443G e V1736A. A primeira foi classificada como neutra no ensaio em
64
leveduras e como deletéria no ensaio em células de mamíiferos e a segunda doi
classificada como indeterminada de acordo com o ensaio em leveduras e deletéria
de acordo com o ensaio em células de mamíferos.
Figura 12: Ensaio quantitativo de ativação transcricional de variantes da
região C-Terminal de BRCA1 em células de mamíferos.
0
2 5
5 0
7 5
1 00
1 25
1 50
pCDNA3
WT
S1613G
M1775R
Y1853X
R1443G
R1495M
D1546N
P1614S
T1700A
V1736A
Unidades relativas de luciferase (%).
Controles
- + + - -
As capacidades de ativação transcricional das variantes estão representadas em unidades
relativas de luciferase, e transformadas em valores percentuais em relação à atividade de
BRCA1 selvagem (WT). As barras de erro representam o desvio padrão. A linha horizontal
indica o limite de 50% de atividade relativa abaixo do qual a variante é considerada
deletéria/alto risco. As variantes analisadas estão indicadas abaixo. (+), controles positivos; (-),
controles negativos. No canto superior direito, esquema das construções utilizadas para este
ensaio.
Luciferase
5 GAL4 BS
BRCA1
1863
1396
GAL4 DBD
65
5. Discussão e Conclusões
66
Uma avaliação de risco mais informativa para indivíduos que carregam
mutações em BRCA1 é uma arma valiosa para médicos e pesquisadores, quanto ao
risco de desenvolvimento de câncer de mama e ovário. No entanto, a importância
clínica das variantes do tipo missense tem sido particularmente árdua de se definir
por causa de sua baixa freqüência, o que torna difícil a condução de estudos
significativos baseados em dados populacionais. Diversas linhas experimentais
devem ser levadas em consideração para a classificação de uma variante de
BRCA1 em deletéria/alto risco ou neutra/baixa significância clínica (COUCH &
WEBER, 1996). A ocorrência da variante em indivíduos de alto risco (afetados por
câncer de mama ou ovário e com uma história familiar de câncer de mama e ovário)
comparada com os controles pode dar algumas pistas, como sua condição, mas as
freqüências das variantes diferem consideravelmente entre grupos étnicos
(DUROCHER, 1996). A segregação da variante em membros da família afetados
pela doença pode ser um forte indício de que uma variante é deletéria a não ser que
ela esteja em desequilíbrio de ligação com uma outra mutação, como observado em
alguns grupos étnicos (BONNEM, 2002). Abordagens adicionais têm se baseado em
comparações de seqüências (ABKEVICH et al, 2004; SZABO et al, 1996; SHARAN,
WIMS & BRADLEY, 1995; FLEMING, 2003) e testes funcionais que incluem ensaios
específicos, como ativação transcricional, ou características mais abrangentes como
a geração do fenótipo de colônia pequena de levedura ou indução da apoptose em
células em cultura (MONTEIRO & HUMPHREY, 1998; VALLON-CHRISTERSSON,
et al, 2001; THANGARAJU, KAUFMANN & COUCH, 2000; HUMPHREY, 1997).
O ensaio funcional de transcrição é um método de classificação de variantes de
BRCA1. Já havia sido mostrado previamente que alelos do gene contendo
polimorfismos neutros retinham a atividade do tipo selvagem na transcrição
67
(MONTEIRO, AUGUST & HANAFUSA, 1997). Outras linhas de estudo apontaram
para um papel fisiológico de BRCA1 na transcrição, embora a função bioquímica
exata da proteína permaneça desconhecida (SCULLY et al,1997a; OUCHI, 2000;
OUCHI et al, 1998; ANDERSON et al, 1998; KRUM et al, 2003b; SOMASUNDARAM
et al, 1997; TAKIMOTO et al, 2002). Porém, desconsiderando a atuação ou não de
BRCA1 como um ativador transcricional in vivo, um ensaio transcricional usando a
fusão de um domínio heterólogo de ligação a DNA e um gene repórter serve como
um monitor da integridade da região C-terminal de BRCA1 (PHELAN et al, 2005).
Uma vez que esta região é essencial para a função supressora de tumor de BRCA1,
o ensaio de ativação transcrição é capaz de gerar informação sobre o resultado das
alterações missense na molécula.
Até recentemente este ensaio de ativação transcricional só era aplicável às
variantes nos domínios BRCT (exons 16-24). Phelan e colaboradores, em 2005,
mostraram que regiões adjacentes aos domínios BRCT contribuem para a atividade
na transcrição, permitindo a extensão das análises, abrangendo então os exons 13 a
24. Como a região consenso de ligação a DNA de BRCA1 ainda não foi definida e
cada vez mais evidências sugerem que muitos processos celulares, incluindo a
transcrição, são conservados entre espécies eucarióticas, foi utilizado um sistema de
fusão ao domínio de ligação a DNA de LexA de levedura. Apesar de estarmos
testando a atividade de uma proteína humana que traz risco de doença para esse
organismo em uma espécie que não possui ortólogo de BRCA1, a realização dos
ensaios em leveduras é válida porque este ensaio foi desenvolvido primeiramente
neste organismo.
Baseados nestas novas descobertas, quatro variantes missense no domínio
BRCT e seis variantes adjacentes a este domínio foram testadas em nosso trabalho.
68
No ensaio de ativação transcricional em levedura, duas das dez variantes
testadas causaram uma perda dramática da função de ativação da transcrição,
T1700A e G1706E, semelhante às atividades das mutações controle de alto risco de
desenvolvimento de câncer de mama e ovário, sugerindo que podem ser variantes
deletérias/alto risco. Outras 6 variantes mostraram ativação transcricional próxima ou
maior que o tipo selvagem de BRCA1 (R1443G, R1495M, V1534M, L1564P,
P1614S e V1804D) sugerindo que são, provavelmente, variantes neutras/baixa
importância clínica. As duas variantes restantes, D1546N e V1736A tiveram
resultados intermediários.
No ensaio de ativação transcricional realizado com células de mamíferos, três
das variantes testadas resultaram em uma perda dramática da função de ativação
da transcrição (R1443G, T1700A e V1736A) semelhante às mutações controle de
alto risco, sugerindo que podem constituir variantes deletérias/alto risco. As três
variantes restantes, R1495M, D1546N e P1614S, mostraram ativação transcricional
próximas à apresentada pelo tipo selvagem de BRCA1, e muito parecidas com a
atividade apresentada pelo polimorfismo S1613G, muito comum na população geral,
sugerindo que provavelmente são variantes neutras/ baixa relevância clínica.
V1736A mostrou atividade reduzida em levedura (61%), mas uma atividade
extremamente reduzida (4%) em células de mamíferos. Como os valores das
atividades para esta variante obtidos nos ensaios de levedura resultaram em um
desvio padrão extenso, que variava da faixa considerada baixa atividade até aqueles
considerados como de alta atividade, esta variante, para este ensaio, foi
considerada de atividade intermediária, não sendo possível classificá-la com
segurança. Levando-se em consideração os ensaios feitos nos dois diferentes
69
organismos, a classificaríamos como uma variante deletéria/ alto risco de
desenvolvimento de câncer de mama e ovário.
A variante D1546N exibiu atividade de 74% em relação à do tipo selvagem,
sendo considerada neutra/ baixa relevância clínica, no ensaio em células de
mamíferos, mas sua atividade transcricional para o ensaio em leveduras foi de 57%
em relação à atividade do tipo selvagem, correspondendo à região de valores onde
não é possível fazer uma classificação segura. Levando-se também em
consideração os desvios padrões para os ensaios nos dois organismos, seria
recomendável assinalar a variante como não-classificada ou, numa atitude menos
conservadora, como de risco intermediário.
R1443G apresentou alta atividade em leveduras (próxima à do tipo selvagem) e
atividade muito reduzida em células de mamífero (39%), não permitindo sua
classificação.
Nossos resultados foram comparados com dados publicados anteriormente
sobre classificação de variantes missense. Das cinco variantes estudadas por nós,
para as quais o método baseado em variação interespecífica (Abkevich et al, 2004)
foi capaz de chegar a alguma conclusão, os dados confirmaram a classificação
baseada nos dois testes funcionais, no caso de T1700A (deletéria). Para leveduras,
a classificação de G1706E como deletéria e V1534M como neutra foi confirmada.
Para células de mamíferos, foram confirmadas as classificações de D1546N como
neutra e V1736A como deletéria.
Para fazermos uma validação cruzada dos dados provenientes de nossa
análise, os comparamos com resultados de dois métodos publicados para se
classificar variantes no domínio BRCT. Um deles baseia-se no fato de que variantes
que causam mudanças de conformação possuem mais chances de serem
70
propensas à degradação proteolítica (WILLIAMS et al, 2003). Apenas uma das
variantes estudadas em nosso trabalho, V1804D, foi avaliada por este método e o
resultado foi concordante com a resposta do ensaio em levedura de manutenção da
atividade de transcrição.
Nossos resultados também foram comparados com resultados derivados de um
método baseado em parâmetros de estrutura de proteínas para predizer o resultado
de diferentes variantes de BRCA1, ou seja, um algorítmo preditivo. (MIRKOVIC et al,
2004). Uma das três variantes estudadas por nós, para as quais existiam predições,
confirmava nossos resultados obtidos em levedura. G1706E resulta em perda de
atividade de transcrição. A mesma predição foi feita para a variante V1736A, que
está de acordo com o resultado obtido em células de mamíferos. Já para a variante
V1804D, que também foi predita resultar em perda da atividade de transcrição, o
resultado do ensaio em levedura foi discordante.
Em resumo, de acordo com os dados gerados pelos experimentos em
leveduras e células de mamíferos, classificamos uma variante do tipo missense,
T1700A, como uma variante provavelmente deletéria/alto risco de desenvolvimento
de câncer de mama e ovário e outras duas, R1495M e P1614S, como variantes
provavelmente neutras/baixa importância clinica. As seis variantes restantes foram
deixadas não-classificadas por terem gerado resultados discordantes ou não
conclusivos.
Embora alguns dos resultados apresentados em nosso trabalho não tenham
sido concordantes nos ensaios de ativação transcricional e não tenham sido
confirmados por outras abordagens, é preciso lembrar que os tipos de células
utilizados são de organismos diferentes, não representando um mesmo micro-
ambiente. Além disso, diferentes experimentos já descritos, feitos para testar a
71
relação das variantes com o desenvolvimento da doença, mostram resultados não
concordantes entre si para uma mesma variante, o que não significa que os métodos
utilizados não sejam válidos, mas sim, que em cada uma das diferentes abordagens,
são levadas em consideração diferentes características das variantes protéicas
testadas, como exposto na tabela 7.
Tabela 7: Comparação entre diferentes métodos de classificação.
A variação interespecífica (diferença na composição dos aminoácidos das
proteínas nas diferentes espécies para as quais a proteína já foi descrita), leva em
consideração a conservação da posição onde o aminoácido foi trocado. O ensaio de
sensibilidade à protease avalia se a região onde houve a troca do aminoácido passa
a ser sensível à ação de uma determinada enzima ou não, e o algorítmo preditivo
baseado em modelagem estrutural de proteínas, considera a conformação da
molécula, mas não sua interação com outras moléculas no ambiente celular. O que
Mutaçao
Resíduos
Permitidos
AT(L)
AT(M)
Variação
Interespecífica
SP*
EST**
BIC
R1433G
L, P, Q, R
○
●
10
R1495M
K, P, R
○
○
17
V1534M
H, L, M, Q, S, V
○
○
18
D1546N
D, E, N, R
●
○
○
25
L1564P
L, N, P
○
8
P1614S
A, N, T
○
○
9
T1700A
T
●
●
●
G1706E
G
●
●
●
6
V1736A
V
●
●
●
12
V1804D
A, S, T, V
○
●
○
○
10
AT Ativaçao transcricional, (L) levedura e (M) célula de mamífero; ○ neutro; ● Dúvida e
● deletéria; * Sensibilidade à protease (WILLIAMS et al, 2003); ** Predição baseada em
estrutura (MIRKOVIC et al, 2004).
72
significa dizer que todas as abordagens têm seus pontos fortes e fracos. Enquanto
métodos individuais de classificação de alelos de BRCA1 ainda apresentarem
limitações (e provavelmente as limitações sempre existirão), nenhum método
individual pode ser usado sozinho, com confiança, necessitando-se de uma
combinação de vários métodos como uma forma mais poderosa de se identificar
variantes diretamente ligadas a um alto risco de desenvolvimento de câncer de
mama e ovário (GOLDGAR et al, 2004). O modelo de estudo de ativação
transcricional isoladamente é muito útil para reavaliar o prognóstico de um paciente
que carrega determinada variante, servindo para que, dependendo do caso, certos
pacientes sejam acompanhados com maior cautela.
Sem dúvida alguma ainda há muito que se estudar sobre o câncer e suas
causas e para BRCA1, mais particularmente, o quadro não é diferente. Muitas
descobertas ainda terão que ser feitas até que se possa chegar a métodos que
confiram prognósticos confiáveis e exatos e a medicamentos específicos e eficientes
para cada caso. Não importando o tamanho da contribuição, esperamos que com
nosso trabalho e empenho, possamos ajudar a atingir este objetivo o quanto antes.
73
Referências
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