ads:
THIAGO FERNANDES
“CITOGENÉTICA EM ESPÉCIES DE CESTRUM
(SOLANACEAE): MAPEAMENTO FÍSICO E
PROTEÍNAS CROMOSSÔMICAS”
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós - Graduação, em Genética e
Biologia Molecular, da Universidade
Estadual de Londrina, como requisito
parcial para a obtenção do título de
Mestre.
Orientador: Prof
o
. Dr. André Luis Laforga Vanzela
Londrina
2007
Instituto Agronômico do Paraná
Ela Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Universidade Estadual de Londrina
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
THIAGO FERNANDES
“CITOGENÉTICA EM ESPÉCIES DE CESTRUM
(SOLANACEAE): MAPEAMENTO FÍSICO E
PROTEÍNAS CROMOSSÔMICAS”
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós - Graduação, em Genética e
Biologia Molecular, da Universidade
Estadual de Londrina, como requisito
parcial para a obtenção do título de
Mestre.
Orientador: Prof
o
. Dr. André Luis Laforga Vanzela
Londrina
2007
ads:
THIAGO FERNANDES
“CITOGENÉTICA EM ESPÉCIES DE CESTRUM
(SOLANACEAE): MAPEAMENTO FÍSICO E
PROTEÍNAS CROMOSSÔMICAS”
Dissertação apresentada ao Programa de Pós -
Graduação, em Genética e Biologia
Molecular, da Universidade Estadual de
Londrina, como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. André Luis Laforga Vanzela
Universidade Estadual de Londrina
Profa. Dra. Maria Ap
a.
Marin Morales
Universidade Estadual Paulista
Rio Claro
Profa. Dra. Lúcia Giuliano-Caetano
Universidade Estadual de Londrina
Londrina, 28 de Fevereiro de 2007
À minha mãe Márcia Maria Stringheta e familiares dedico.
AGRADECIMENTOS
Sempre é difícil encontrar palavras que possam expressar com clareza sentimentos de
agradecimento. Mas, uma vez finalizada essa dissertação de mestrado, não posso evitar de
agradecer aqueles que me ajudaram, mesmo que de longe, a concluir esse trabalho da melhor
maneira possível.
Meus agradecimentos são dirigidos primeiramente à minha mãe, Márcia Maria
Stringheta, sem a qual não poderia ter começado esse trabalho. A educação que me
proporcionou, cuidados e atenção, apoio e sacrifício econômico são a base de tudo o que sou
agora. Estes agradecimentos se estendem a todos os membros de minha família,
especialmente meus irmãos Raphael e Carolina.
É claro que essa dissertação não poderia ser terminada sem a ajuda e orientação do
Prof. Dr. André Luis Laforga Vanzela, que não apenas tem sido um ótimo referencial em
nível científico e profissional, fonte de idéias, planos e informações, como também um amigo
além do ambiente de trabalho.
Meus mais sinceros agradecimentos às minhas companheiras de Laboratório: Priscila,
Mariana e Letícia e ao companheiro Marcos Letaif Gaeta, pela amizade, paciência, disposição
e pelo bom ambiente de trabalho que me proporcionaram.
Os conselhos e orientações do Prof. Dr. José Marcelo e da bióloga Alba Lúcia
Cavalheiro os quais me foram de valiosa ajuda durante todo esse período.
Ao Prof. Dr. Rogério pelo interesse demonstrado com o encaminhamento da minha
tese, como também, pelos inúmeros bate-papos científico-culturais no laboratório.
Agradeço também aos funcionários do LABRE pelas contribuições, instruções e boas
conversas, em especial aos funcionários Ed, Odair e “Seu” João.
A Suely pela longa e estimada paciência durante todas as minhas idas e vindas à
secretaria do mestrado.
Não poderia deixar de agradecer à melhor “metáfase” encontrada durante esse
mestrado: a minha namorada Esther do Lago e Pretti. Seu apoio, companheirismo, carinho e
motivação foram, e são, os pilares para cada realização por mim alcançada.
Finalmente agradeço à Universidade Estadual de Londrina e ao Mestrado em Genética
e Biologia Molecular que me permitiram a realização desta dissertação.
FERNANDES, Thiago. Citogenética de espécies de Cestrum (Solanaceae): Mapeamento
físico e proteínas cromossômicas. 2007. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia
Molecular) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina.
RESUMO
Os representantes do gênero Cestrum são, em sua maioria, arbustos e pequenas árvores
distribuídos nas regiões tropical e subtropical das Américas. Nesse trabalho, estudamos três
espécies coletadas no Brasil (C. capsulare, C. corymbosum e C. megalophylum) e uma na
Argentina (C. laevigatum) utilizando as seguintes ferramentas citogenéticas: i) coloração
convencional, ii) bandamento C-CMA
3
/DAPI e iii) hibridação in situ com as sondas de DNAr
45S e 5S. As quatro espécies apresentaram cariótipos com 2n = 2x = 16 e uma predominância
de cromossomos metacêntricos e submetacêntricos, exceto pelo menor par sempre
acrocêntrico. Nossos resultados reforçam a idéia desse perfil cariotípico ser uma característica
preservada dentro do gênero. O bandamento cromossômico e a hibridação in situ fluorescente
(FISH) mostraram que a maioria dos segmentos de DNAs repetitivos parece seguir um
modelo de dispersão eqüilocal/eqüidistante. Isso foi evidenciado principalmente para os
blocos C-CMA
3
+
e para os cistrons de DNAr 45S que apareceram preferencialmente nas
regiões terminais dos cromossomos, os blocos C-DAPI
0
/CMA
3
0
e dots C-DAPI
+
em regiões
intercalares/subterminais e sítios para DNAr 5S sempre na região pericentromérica dos
cromossomos. As diferenças encontradas no padrão de bandas entre as espécies aqui
estudadas e as outras nove reportadas na literatura sugerem que os segmentos
heterocromáticos encontrados em Cestrum apresentam uma dispersão por
amplificação/contaminação eqüilocal entre heterólogos ou têm origem a partir de sítios
iniciais de amplificação, ou seja, por amplificação não eqüilocal. Alem do mais, o
mapeamento físico dos diferentes segmentos heterocromáticos, aliado a outros mapas físicos
realizados para Cestrum, sugere que as diferenças cariotípicas dentro do gênero ocorreram por
mudanças nos diferentes classes de DNAs repetitivos, sem alterações significativas na
composição geral dos cariótipos (tamanho e forma). Além do mapeamento físico, outro ponto
estudado nesse trabalho foi o comportamento meiótico dos cromossomos Bs encontrados em
alguns indivíduos de Cestrum strigilatum por coloração convencional e imunodetecção com
anticorpos anti-H3 fosforilada. Esses cromossomos parecem ser eliminados durante a
microsporogênese dessa espécie, principalmente durante a transição da meiose I para meiose
II, ou, durante a formação da tétrade. O motivo de tal comportamento não pôde ser explicado
totalmente através do padrão de fosforilação das histonas H3, contudo, evidenciou que tanto
os Bs quanto os cromossomos do complemento A possuem um comportamento diferencial
dos citados na literatura. Nossos dados reforçam as suposições sobre um possível papel
secundário dessas proteínas nas divisões celulares, atuando provavelmente como sinalizadores
para a cinética dos cromossomos. Em um estudo complementar, nós verificamos que a
presença dos Bs não interfere na viabilidade dos grãos de pólen quando comparados
indivíduos portadores e não portadores de Bs.
Palavras-chave: Cestrum, bandamento cromossômico, C-CMA
3
/DAPI, DNAr 45S e 5S,
evolução cariotípica, cromossomos B, histonas H3, meiose e fosforilação.
ABSTRACT
The representants of Cestrum are, in most part small arboreous and shrubs species, distributed
in American tropical and subtropical areas. In this paper, three species collected in Brazil (C.
capsulare, C. corymbosum e C. megalophylum) and one in Argentina (C. laevigatum) have
been studied using the following cytogenetical tools: i) conventional staining, ii) C-
CMA
3
/DAPI banding and iii) in situ hybridization with 45S and 5S rDNA. Their karyotypes
are constituted by 2n=2x=16 organized mainly in meta and submetacentric chromosomes,
except for the last pair, always acrocentric. Our results strengths the idea that this karyotypic
profile is a conserved characteristic in this genus. The chromosomic banding and the
fluorescent FISH in situ hibridazation showed that most of the repetitive DNA segments
follow a model of equidistant distribution. This has been seen mainly in C-CMA
3
+
blocks and
45S rDNA cistrons located mainly in terminal chromosomal regions, in C-DAPI
0
/CMA
3
0
and
C-DAPI
+
dots in sub terminal chromosomal regions and pericentromeric positions 5s rDNA
sites. The differences found in the banding pattern among the species studied, and nine others
reported in literature suggests that the heterocromatic segments found in Cestrum are
dispersed by equilocal amplification/contamination among heterologous or are originated on
initial sites of amplification, meaning, by equilocal amplification. Also, the physic mapping of
the different heterocromatic segments, allied to other Cestrum physic maps , suggests that the
karyotypic differences in the genus have occurred because of changes in the repetitive DNA
classes, without significant changes in general composition of the karyotypes (size and
shape). Beyond physical mapping, this study aimed to investigate the meiotic behavior of B
chromosomes, found in some Cestrum strigilatum individuals, by conventional staining and
imuno detection with fosforilated anti-H3 antibodies. Those chromosomes seem to be
eliminated during microsporegenesis in this species, mainly during transition from meiosis I
to meiosis II, or during formation of the tetrade. The reason for this behavior could not be
totally explained by the fosforilation pattern of H3, though it has shown that both B
chromosomes and A complement chromosomes have different behavior than those found in
literature. Our data strengths the hypothesis of a potential secondary role of those proteins in
cellular division, acting probably as signals for chromosome cinetics. In a complementary
study, we have verified that Bs presence does not interfere in viability of pollen grains when
compared with individuals that don’t have them.
Key-words: Cestrum, bandamento cromossômico, C-CMA
3
/DAPI, DNAr 45S e 5S, evolução
cariotípica, cromossomos B, histonas H3, meiose e fosforilação.
LISTA DE FIGURAS
1. Capítulo 1: Mapeamento Físico com DNAs repetitivos espécies de Cestrum
(Solanaceae).
FIGURA 1: Coloração convencional (Giemsa) em Cestrum .................................................43
FIGURA 2: Bandamento C-DAPI em Cestrum......................................................................44
FIGURA 3: FISH com as sondas de DNAr 45S e 5S em Cestrum ........................................45
FIGURA 4: Idiogramas e mapeamento físico dos cromossomos de Cestrum .......................46
2. Capítulo 2: Transmissão, comportamento meiótico e fosforilação das histonas H3 do
cromossomo B de Cestrum strigilatum (Solanaceae)
FIGURA 1: Comparação entre pólen viável e inviável .........................................................64
FIGURA 2: Fases da meiose de Cestrum strigilatum com cromossomo B
.................................................................................................................................................66
FIGURA 3: Imunodetecção de H3 fosforilada na meiose de Cestrum ..................................67
FIGURA 4: Imunodetecção de H3 fosforilada em diferentes bivalentes de Cestrum ...........68
SUMÁRIO
1 REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................. 10
1.1 A família Solanaceae e o gênero Cestrum. .................................................................... 10
1.2 Aspectos citogenéticos de Solanaceae e do gênero Cestrum.......................................... 13
1.2.1 Bandamento Cromossômico em Solanaceae ................................................................ 15
1.3 Cromossomos B e proteínas cromossômicas................................................................. 21
2 JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS ...................................................................... 26
3 CAPÍTULO 1: MAPEAMENTO FÍSICO COM DNAS REPETITIVOS ESPÉCIES
DE CESTRUM (SOLANACEAE) ..................................................................................... 29
3.1 Resumo:......................................................................................................................... 29
3.2 Introdução...................................................................................................................... 30
3.3 Materiais e Métodos....................................................................................................... 32
3.4 Resultados...................................................................................................................... 34
3.5 Discussão....................................................................................................................... 37
Agradecimentos................................................................................................................... 41
Referências .......................................................................................................................... 47
4 CAPÍTULO 2: TRANSMISSÃO, COMPORTAMENTO MEIÓTICO E
FOSFORILAÇÃO DAS HISTONAS H3 DE CROMOSSOMOS B EM CESTRUM
STRIGILATUM (SOLANACEAE):. .................. ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
4.1 Resumo.......................................................................................................................... 51
4.2 Introdução...................................................................................................................... 52
4.3 Materiais e Métodos....................................................................................................... 54
4.3.1Coleta das amostras...................................................................................................... 54
4.3.2 Análise meiótica.......................................................................................................... 55
4.3.3 Análise da freqüência de Bs nas progênies (F1)........................................................... 55
4.3.4 Viabilidade dos grãos de pólen.................................................................................... 56
4.3.5 Imunodetecção das histonas H3 fosforiladas................................................................ 56
4.4 Resultados...................................................................................................................... 58
4.5 Discussão....................................................................................................................... 59
Agradecimentos................................................................................................................... 63
Referências .......................................................................................................................... 69
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................. 73
10
1 REVISÃO DA LITERATURA
1.1 A família Solanaceae e o gênero Cestrum.
Das ervilhas de Mendel ao tabaco de Alfred Hershey e Marta Chase,
espécies vegetais têm participação direta e indireta em diversas descobertas científicas.
Algumas espécies foram extremamente úteis para o entendimento de vários mecanismos
biológicos, como por exemplo, a Arabidopsis thaliana (Brassicaceae). Contudo, muito antes
de serem importantes para o desenvolvimento científico, os vegetais são essenciais para o
estabelecimento e a continuidade da vida no Planeta. As plantas constituem a base de
sustentação de diversos ecossistemas e permitem a manutenção da vida de uma grande
quantidade de organismos. Além disso, diversas espécies vegetais são importantes como fonte
nutricional e para a extração de diversos compostos secundários de interesse ao homem.
A família Solanaceae Juss., como muitas outras, insere-se perfeitamente
nesse contexto. Entre as mais de 3.000 espécies dessa família, algumas são usadas na
agricultura, como é o caso da batata (Solanum tuberosum L.), da berinjela (Solanum melogena
L), do tomate (Lycopersicum esculentum Mill.) e de vários tipos de pimenta (gênero
Capsicum L.). Na medicina, a espécie Atropa belladona L. é utilizada para a produção do
alcalóide antropina, empregado em tratamentos oftalmológicos (HAWKES et al., 1991), e
algumas espécies do gênero Solanum são utilizadas para a extração de alguns lipídeos,
empregados como agentes anti-tumorais (RODDICK, 1991). Além da utilização medicinal,
compostos extraídos de algumas solanáceas podem ser utilizados na agricultura como
bioinseticidas ou no controle de microrganismos fitopatogênicos (HARBONE, 1991).
Representantes da família Solanaceae podem ser encontrados nos mais
diversos ambientes e em todos os continentes, exceto no Antártico. No entanto, apesar da
11
ampla distribuição, as espécies desta família ocorrem preferencialmente em regiões tropicais e
subtropicais. A América do Sul é o centro de maior diversidade taxonômica, com cerca de 50
gêneros endêmicos e aproximadamente 400 espécies (D' ARCY, 1991). As espécies de
Solanaceae variam desde ervas efêmeras (gêneros Leptoglossis e Schizantus) encontradas no
deserto Chileno, às grandes árvores do gênero Duckeodron que habitam a úmida floresta
Amazônica. A ocupação de diferentes nichos resultou em uma grande variação morfológica
dentro da família, sobretudo no que diz respeito aos tipos de flores e frutos. Com relação à
morfologia floral, esta pode ser altamente ou levemente zigomórfica, como as encontradas em
Schizantus pinnatus e Hyoscyamus niger, tubulares (gênero Cestrum) ou levemente
actinomorfas, como as encontradas no gênero Solanum (KNAPP et al., 2002). Os tipos de
frutos podem ser, cápsulas, drupas, bagas, e alguns poucos frutos deiscentes não-capsulares
podem ser encontrados nos mais de 90 gêneros da família. (KNAPP, 2002).
A família Solanaceae está incluída na subclasse Asteridae, ordem Solanales,
sendo distinta das outras famílias que compõem esta ordem por possuir características como:
óvulos e semente numerosos, dois carpelos obliquamente orientados, ausência de látex,
cotilédones não plicados, estilete simples e estigma único, pouco ou nada lobado
(CRONQUIST, 1988). O último tratamento taxonômico completo para a família fora
realizado por Dunal (1852). Desde então, a organização filogenética da família sofreu grandes
modificações, com gêneros realocados dentro de outras famílias, como também, formando
suas próprias famílias. Recentemente, Hunziker (2001) realizou um tratamento completo para
os gêneros da família, incluindo um novo sistema de classificação. Segundo o autor, a família
pode ser dividida em seis subfamílias: Cestroidea, Juanulloideae, Solanoideae,
Salpiglossoideae, Schizanthoideae e Anthocercidoideae.
Cestrum, juntamente com os gêneros Sessea e Vestia formam a tribo
Cestreae G. Don (subfamília Cestroideae), a segunda maior tribo da família Solanaceae. Os
12
representantes dessa tribo são, em sua maioria, arbustos e pequenas árvores distribuídos nas
regiões tropical e subtropical das Américas (HUNZIKER, 1976), sendo Cestrum o maior
gênero da tribo, e o terceiro maior da família (JUDD et al., 1999). Smith e Downs (1966)
atribuíram como características morfológicas diagnósticas de Cestrum a corola tubular-
infundibuliforme; a presença de cinco estames inclusos e soldados ao tubo da corola; poucas
sementes comprimidas e embrião reto. Contudo, a relação entre Cestrum e Sessea vem sendo
muito discutida pelo fato das espécies destes dois gêneros apresentarem algumas semelhanças
morfológicas, diferindo, principalmente, pelo tipo de fruto: bacáceo em Cestrum e capsular
alado em Sessea. Com base nessas semelhanças, Carvalho e Schonoor (1993/1997)
transferiram a espécie Sessea regnelli Taub. para o gênero Cestrum, tratando-a como Cestrum
capsulare Carvalho & Schnoor. Porém, segundo Sá (2002), esta posição é bastante discutida e
talvez, no futuro, a espécie possa apresentar outro tratamento.
O Brasil concentra o maior número de espécies de Cestrum, cerca de 50
(HUNZIKER, 2001), das quais seis foram registradas na região da bacia do rio Tibagi,
Centro-Norte do Paraná. São elas: Cestrum amictum Schlecht., C. capsulare Carvalho &
Schnoor, C. corymbosum Schlecht., C. intermedium Sendtn., C. sendtnerianum Mart. Ex.
Sendtn. e C. strigilatum Ruiz & Pav (SÁ, 2002). No entanto, novos levantamentos florísticos
são necessários, principalmente em outras regiões do estado do Paraná, pois espécies como C.
laevigatum Schltdl, C. bracteatum Link & Otto e C. diurnum L. são encontradas no estado de
São Paulo, em áreas próximas ao estado do Paraná (http://herbario.iac.sp.gov.br).
Algumas espécies de Cestrum são de importância econômica, já que
fornecem a base para a extração de compostos ativos c 0 Td[( )-5.215(c)-2.80754écCã.4459(do)10.2.2(r)3.212 co
13
(LABRE), da Universidade Estadual de Londrina. Tais espécies são de estágio inicial de
sucessão florestal, além de possuírem frutos que servem como fonte de alimento para muitas
espécies de aves e morcegos. Essa característica é de suma importância em programas de
reflorestamento - já que mais de 60% do total das espécies arbóreas em florestas tropicais são
zoocóricas (VAN DER PIJL, 1982). Isso favorece a atração de animais de áreas
remanescentes vizinhas, possibilitando o fluxo gênico entre populações e a recolonização da
área restaurada por mais espécies vegetais (CAVALHEIRO et al., 2002).
1.2 Aspectos citogenéticos de Solanaceae e do gênero Cestrum.
Contagens cromossômicas realizadas por Moscone (1992), mostraram que a
família Solanaceae exibe números cromossômicos básicos variando de x=7 a x=13, sendo
x=12 o mais comum, já que ocorre em mais de 50% das espécies estudadas até o momento.
Contudo, essa amplitude cromossômica não é encontrada em todas as subfamílias de
Solanaceae. Um levantamento realizado por Hunziker (2001) mostrou que a subfamília
Cestroideae é a mais heterogênea do ponto de vista cariotípico, com uma amplitude de
números básicos variando de x=7 a x=13, seguida por Solanoideae (x=10, x=12, x=14, x=17).
Nesse mesmo levantamento, cariótipos com x=9 e x=10 foram reportados para
Anthocercidoideae, e x=11 e x=10 para as subfamílias Sapliglosssoideae e Schizanthoideae.
Informações sobre a subfamília Juanulloideae foram muito fragmentadas para permitir
generalizações.
Apesar da grande amplitude de números cromossômicos, a análise
cariotípica por coloração convencional de alguns gêneros da família revelou que,
independente do número cromossômico, cariótipos simétricos e com a prevalência de
cromossomos metacêntricos e submetacêntricos são comuns na família (BERNARDELLO e
ANDERSON, 1990; BERNARDELLO e HEISER, 1994; PILLEN et al., 1996; POZZOBON
14
et al., 2006). Além do mais, Bernardello e Anderson (1990) estudaram 18 das 22 espécies de
Solanum da seção Basarthrum, e detectaram que as espécies com menores comprimentos
cromossômicos tiveram maior simetria cariotípica, enquanto que as espécies com
comprimento maior foram mais assimétricas.
Estudos citogenéticos realizados em gêneros da tribo Cestreae, mostraram
uma constância de cariótipos com 2n=2x=16 (BERG e GREILHUBER, 1992, 1993a, b;
FREGONEZI et al., 2006; LAS PENAS et al., 2006), sendo a única alteração numérica
encontrada dentro da tribo devido à ocorrência de cromossomos Bs em algumas espécies de
Cestrum (SÝKOROVÁ et al., 2003b; FREGONEZI et al., 2004). Uma característica que
chama a atenção em Cestreae é que os representantes dessa tribo possuem os maiores
cromossomos da família, podendo medir até 14 µm (BERG e GREILHUBER, 1992, 1993a,
b; FREGONEZI et al., 2006; LAS PENAS et al., 2006). Em outros gêneros como Solanum e
Capsicum os cromossomos são menores, entre 1,2 - 2.4 µm e 3,5 - 4,0 µm, respectivamente
(BERNARDELLO e ANDERSON, 1990; MOSCONE et al., 1993; BERNARDELLO et al.,
1994).
Assim, como para os outros gêneros da família, uma predominância de
cromossomos meta e submetacêntricos também foram encontradas em Cestreae, porém o
menor par cromossômico é geralmente submetacêntrico ou subtelocêntrico (BERG e
GREILHUBER, 1992, 1993a, b; FREGONEZI et al., 2006; LAS PENAS et al., 2006). Desta
forma, cromossomos meta e submetacêntricos parecem ser comuns para a família
independente do gênero, do número cromossômico e do tamanho dos cromossomos, como
anteriormente citado.
Recentemente, Las Penas et al. (2006) estudaram diferentes espécies dos
três gêneros de Cestreae (C. bigibosum Pittier, C. buxifolium Kunth, Sessea corymbiflora
Goudot ex Taylor e Phillips e Vestia foetida Ruiz e Pav) quanto ao tamanho, o número
15
cromossômico e a simetria dos cariótipos. Com base nos dados obtidos, estes autores
sugeriram que na diversificação cariotípica em Cestreae pode ter ocorrido uma leve
assimetria acompanhada pelo aumento do tamanho do genoma. Estes autores ainda sugeriram
para Vestia foetida uma posição filogenética basal, já que foi a espécie que apresentou o
cariótipo menor e mais simétrico. Porém, estes autores não forneceram nenhuma explicação
para os possíveis eventos relacionados à manutenção desta simetria, tampouco relacionaram a
simetria e o tamanho dos cromossomos com eventos de amplificação e distribuição de DNAs
repetitivos.
1.2.1 Bandamento Cromossômico em Solanaceae
A diferenciação linear dos cromossomos por técnicas de bandamento
cromossômico tem possibilitado acessar caracteres adicionais e úteis na análise
citotaxonômica e no entendimento dos processos de acúmulo e dispersão de heterocromatina
em plantas (COSTA, 2002). Tais informações podem ainda indicar mudanças na simetria via
alterações nos DNAs repetitivos. A distribuição da heterocromatina no complemento
cromossômico é bem variável nas angiospermas, não havendo relação qualitativa e
quantitativa segura entre diferentes espécies. Além disso, a quantidade de heterocromatina em
uma espécie pode variar independentemente da quantidade de eucromatina e do conteúdo de
DNA, não havendo também uma relação direta com o tamanho dos cromossomos. Desta
forma, aparentemente, a heterocromatina não possui um significado funcional e evolutivo
comum para todas as espécies (GUERRA, 2000).
Dentre os estudos citogenéticos que abordaram a heterocromatina em
Solanaceae, o realizado por Moscone et al. (1993) em espécies de Capsicum (pimenta) foi
muito ilustrativo. Nesse estudo, esses autores realizaram bandamento C-Giemsa e
encontraram diferenças significativas em relação à quantidade e a distribuição de
16
heterocromatina entre as seis espécies de Capsicum, o que permitiu separar essas espécies em
dois grupos distintos. O primeiro grupo englobou espécies que apresentaram pequenas bandas
terminais e marcações intersticiais raras ou ausentes, formado por Capsicum chacoense, C.
parvifolium, C. annuum var annuum e C. baccatum var pendulum. Neste grupo, as proporções
de bandas C por complemento apresentaram valores mínimos em C. chacoense e máximos em
C. baccatum var pendulum, com 4 e 12% respectivamente. No segundo grupo, foram
colocadas C. pubescens e C. campylopodium já que mostraram 33% do complemento
composto por heterocromatina formando grandes blocos terminais e bandas intercalares.
Esses padrões de bandamento aliados a dados morfológicos, isoenzimáticos e fitogeográficos
permitiram aos autores sugerir que para o gênero Capsicum o aumento do conteúdo de
heterocromatina dentro do gênero representa uma característica apomórfica e possivelemente,
C. chacoense e C. parvifolium são espécies ancestrais na evolução do gênero.
Um grande enriquecimento no conhecimento sobre as regiões
heterocromáticas foi dado após a utilização concomitante de fluorocromos como o 4'- 6
diamidino - 2 fenilindol (DAPI) e a cromomicina A
3
(CMA
3
). Estes corantes fluorescentes
tornaram possível a determinação dos tipos de bases presentes em regiões heterocromáticas,
uma vez que o DAPI liga-se preferencialmente em regiões ricas em adenina e timina (AT),
enquanto que o CMA
3
liga-se preferencialmente em regiões ricas em citosina e guanina (GC)
(SHARMA e SEN, 2002).
Além da coloração diferencial por fluorocromos, uma característica peculiar
de alguns segmentos heterocromáticos tem se mostrado interessante para a obtenção de
marcas cromossômicas. Tais segmentos possuem um comportamento especial quando
meristemas são mantidos em baixas temperaturas, aparecendo com um aspecto
descondensado, ou fino, e pouco corado, seja com Giemsa, orceína ou outros corantes
inespecíficos. Esses segmentos foram primeiramente descritos por Darlington e LaCour
17
(1938) e, devido as suas propriedade, foram chamados de regiões sensíveis ao frio (cold
sensitive regions ou simplesmente CSRs). Em plantas, CSRs foram encontradas em cerca de
11 gêneros de monocotiledôneas e em apenas três de dicotiledôneas. Até o momento, quatro
classes de CSRs foram identificadas: C-Giemsa
+
/DAPI
+
(BERG e GREILHUBER, 1992,
1993, a, b; PUNINNA et al., 2001; FREGONEZI et al. 2006), C-Giemsa
+
/CMA
3
+
(BENKO-
ISEPPONN e MORAWETZ, 1993) C-Giemsa
+
/DAPI
0
/ e C-Giemsa
+
sem fluorescência
CMA
3
0
(FREGONEZI et al. 2006). Desta forma, a sensibilidade ao frio de alguns segmentos
heterocromáticos pode ser um fenômeno relacionado às quantidades de bases AT ou GC, mas
talvez da qualidade das proteínas associadas, ou de diferentes níveis de metilação entre os
segmentos heterocromáticos (FREGONEZI et al., 2006).
Até o momento, a identificação e o mapeamento físico de diferentes tipos de
segmentos heterocromáticos dentro da tribo Cestreae foram realizados apenas em poucas
espécies do gênero Cestrum. Berg e Greilhuber (1992, 1993a, b) estudaram o cariótipo de
cinco espécies de Cestrum (C. elegans (Brong.) Schldtl, C. fasciculatum Miers, C. parqui L’
Herit e C. strigilatum) e encontraram quatro tipos diferentes de heterocromatina: i) grandes
blocos não relacionados às regiões organizadoras de nucléolos (RONs); (ii) pequenos blocos
(dots) em regiões intercalares, proximais ou distais (iii) bandas CMA
3
positivas associadas às
regiões organizadoras de nucléolo (RON); e (iv) bandas DAPI positivas associadas às regiões
sensíveis ao frio. Mais recentemente, Fregonezi et al. (2006), encontraram esses mesmos tipos
heterocromáticos em C. amictum, C. intermedium, C. sendtnerianum e C.strigilatum, além de
outros três novos tipos: (i) bandas neutras C-CMA
3
0
/DAPI
0
, (ii) bandas CMA
3
positivas não
associadas às RONs, e (iii) bandas C-Giemsa/CSR/DAPI negativo. Assim, todas essas
informações indicam que, apesar da grande estabilidade cariotípica encontrada nas espécies
de Cestrum, quando analisadas por técnicas de coloração convencional, internamente os
cromossomos são organizados diferentemente quanto ao tipo e a distribuição dos diferentes
18
segmentos heterocromáticos. Estas informações vão de acordo com o fato da maior fração
genomas de eucariontes superiores ser formada por DNAs repetitivos, os quais podem estar
localizados em alguns sítios cromossômicos bem estabelecidos ou dispersos pelo genoma
(SCHIMIDT e HELSOP-HARRISON, 1998). Nos cromossomos, a composição, a estrutura, a
origem, o aumento e a diminuição dessas seqüências têm sido as principais ferramentas para
estudar a evolução dos cariótipos e, por conseqüência, a variabilidade genética (SHARMA E
SEN, 2002).
Avanços na área da Biologia Molecular, aliados ao número cada vez maior
de informações resultantes do seqüenciamento de DNA, propiciaram a identificação de
diversas classes de DNAs em genomas vegetais (HESLOP-HARRISON, 2000). Dentre a as
seqüências de DNAs repetitivos melhor estudadas podemos citar: i) seqüências teloméricas -
responsáveis pela manutenção de uma unidade linear de replicação e pela proteção das regiões
terminais do cromossomo, ii) unidades de DNA ribossomal (DNAr 45S e 5S) as quais
codificam RNAs ribossômicos que irão compor a subunidades dos ribossomos e iii)
elementos móveis, representados pelos retroelementos (os quais utilizam a transcriptase
reversa para produzir uma molécula de DNA complementar que será inserida no genoma,
resultando em seqüências dispersas ou agrupadas em regiões cromossômicas distintas) e
transposons, em que o efeito de transposição não acarreta no aumento do número de cópias
desse segmento no genoma (SCHIMIDT e HELSOP-HARRISON, 1998).
Todos os tipos de seqüências repetitivas, em blocos ou dispersas, podem ser
altamente variáveis, e a sua evolução normalmente rápida pode provocar mudanças tanto na
distribuição quanto na abundância dessas seqüências em diferentes genomas. Além disso, o
grande número de cópias e a tendência à formação de blocos fazem dos DNAs repetitivos
sondas ideais para experimentos de hibridação in situ, já que fornecem a localização física
19
desses DNAs no complemento cromossômico, o que não pode ser obtido por outras
metodologias (SCHWARZACHER, 2003).
Dentre os segmentos de DNA repetitivos empregados em estudos
citogenéticos, os mais usados são aqueles que codificam os RNAs ribossomais. Em plantas,
os RNAs ribossômicos podem ser classificados de acordo com o seu coeficiente de Svedberg
em 5S, 5,8S, 18S e 25S. Os RNAs ribossomais 5,8S, 18S e 25S são originados após o splicing
de um transcrito primário codificado por um cistron chamado de DNAr 45S, o qual ocorre em
grandes blocos de repetições em tandem (aproximadamente 10-20 kb) em um ou mais sítios
cromossômicos (NEVES et al., 2005). O gene responsável pala transcrição do RNAr 5S
(DNAr 5S) também ocorre em repetições em tandem e em um ou mais sítios cromossômicos ,
porém , na maioria das vezes, separados dos DNAr 45S. Tanto as seqüências de DNAr 45S
como o 5S são altamente conservadas, permitindo que sondas originalmente isoladas de trigo
(GERLACH E BEDBROOK, 1979) possam ser utilizadas na localização desses genes em
diferentes espécies de eucariontes. Dessa forma, a característica conservada dessas seqüências
e a sua presença em ou mais sítios cromossômicos fizeram do DNAr 45S e 5S importantes
marcas cromossômicas para estudos citogenéticos (HELSOP-HARRISON, 2000)
Em Cestrum, o primeiro trabalho envolvendo a localização de DNAs
repetitivos por FISH foi realizado em um refinado experimento desenvolvido por Sýkorová et
al. (2003a). Nesse trabalho, os autores realizaram hibridização in situ, PCR, slot-blot e
Southern blot, e encontraram que Cestrum, Vestia e Sesseae possuem seqüências teloméricas
diferentes daquelas presentes em Aradabidopsis, comuns para a maioria dos vegetais. Esse foi
o primeiro relato da ausência de repetições teloméricas do tipo (TTTAGGG)
n
em
dicotiledôneas, e sustentam ainda mais a proposição da tribo como sendo composta somente
por Cestrum, Vestia e Sessea.
20
A ausência de seqüências teloméricas do tipo Aradabidopsis nos gêneros de
Cestreae levou esses autores a realizar um segundo trabalho no qual propuseram a
substituição da seqüência telomérica padrão pela seqüência 5’-T
(4-5)
AGCAG-3’, a qual teria
assumido a mesma função nos telômeros em um possível ancestral a estes gêneros
(SÝKOROVÁ et al., 2003b). Nesse mesmo trabalho, seqüências de DNA repetitivos, entre
elas uma família de minissatélites ricas em A/T, foram localizadas por FISH aparecendo
dispersas e geralmente associadas com regiões “teloméricas intersticiais” em algumas
espécies de Cestrum. Para os autores, essas seqüências ricas em A/T podem estar associadas a
processos de recombinação e fusão cromossômica, os quais resultaram no aumento do
genoma em Cestrum. Além disso, esses autores encontraram uma colocalização incomum de
segmentos de DNAr 45S e 5S no cromossomo B de C. parqui. Vale lembrar que a ocorrência
de DNAs ribossomais em cromossomos B é pouco comum, sobretudo colocalizados em uma
mesma região cromossômica. Além disso, tais características não foram observadas até o
momento em nenhuma outra espécie de Solanaceae.
Fregonezi et al. (2006) também realizaram hibridação in situ com sondas de
DNAr 45S e 5S nas espécies Cestrum amictum, C. intermedium. C. sendterianum e C.
strigilatum. Nesse estudo, os autores reportaram a presença de sítios de DNAr 45S sempre em
posições terminais ou subterminais, com variações no número de sítios e no par
21
subterminais), o sítio de DNAr 5S sempre ocupando a região pericentromérica do par 8 e a
prevalência de segmentos heterocromáticos ricos em AT e pequenos dots (inconstantes) em
regiões intercalares de todas as espécies estudadas. Porém, o pequeno número de espécies
estudadas citogeneticamente (apenas 9) e a escassez de informações filogenéticas dentro da
tribo, não permitem dizer se durante a evolução cariotípica de Cestrum houve uma tendência
ao acúmulo ou à eliminação de segmentos heterocromáticos. Para tal, novas espécies de
Cestrum, Sesseae e Vestia necessitam ser citogeneticamente estudadas.
1.3 Cromossomos B e proteínas cromossômicas
Além dos segmentos repetitivos encontrados nos genomas eucarióticos
(cromossomos A), existem também elementos genéticos que não obedecem às leis
Mendelianas de herança. Esses elementos, conhecidos como cromossomos B, ou
extranumerários, são reconhecidos porque variam em tamanho, forma e composição do DNA
com relação ao complemento normal, e, sobretudo, por não formarem sinapse com os
cromossomos do complemento A. Os Bs podem estar presentes ou ausentes em determinados
tecidos, indivíduos ou populações, e provavelmente têm sua origem a partir do complemento
A através de diferentes mecanismos (CAMACHO et al., 2000). A importância biológica e o
significado adaptativo destes cromossomos em populações naturais ainda são incertos. No
entanto, é importante ressaltar que tais cromossomos já foram encontrados em dezenas de
espécies de angiospermas, gimnospermas, pteridófitas, briófitas e fungos (JONES e
HOUBEN, 2003).
Até o momento relatos abordando os efeitos fenotípicos atribuídos à
presença de cromossomos Bs são raros. Os principais exemplos encontrados na literatura
mostram a alteração de cor em aquênios em Haplopappus glacine (JACKSON e
NEWMARK, 1960), a resistência a antibióticos no fungo Nectri haematococca (MIAO et al.,
22
1991) e a formação de folhas listradas em milho (STAUB, 1987). Contudo, na maioria dos
casos, esses cromossomos exercem efeitos negativos sobre caracteres como o vigor, a
fertilidade e a fecundidade do organismo hospedeiro, principalmente em indivíduos com um
elevado número de Bs (JONES e REES, 1982; GONZÁLES-SÁNCHEZ et al., 2004). Estes
distintos efeitos fenotípicos causados pelos cromossomos Bs deram origem a dois modelos
para explicar como esses cromossomos são mantidos em populações naturais. No primeiro
modelo, chamado de heterótico, um baixo número de Bs em um indivíduo poderia conferir
vantagens adaptativas, e assim aumentar em freqüência em algumas populações (WHITE,
1973). Em contraposição ao modelo heterótico, alguns pesquisadores classificam os Bs como
cromossomos parasitas (ÖSTERGREN, 1945), ou como um tipo DNA egoísta que se mantêm
nas populações naturais por mecanismos próprios (JONES, 1985). Contudo, nenhum desses
modelos é completamente explicado.
Se até o momento os motivos pelo quais os Bs são mantidos em populações
naturais permanecem pouco compreendidos, os mecanismos de transmissão e acúmulo desses
cromossomos parecem estar um pouco mais claros. Tais mecanismos estão relacionados à
não-disjunções ocorridas durante a gametogênese, como também, por fecundação preferencial
por gametas carregando Bs (BEUKEBOOM, 1994). Mecanismos gênicos controlando a taxa
de transmissão de Bs já foram identificados em arroz (PUERTAS et al., 1998) e milho
(GONZÁLES-SÁNCHES et al., 2003). Em arroz o controle da taxa de transmissão é
realizado pelo próprio B, já em milho, o mecanismo é muito mais complexo, sendo realizado
por genes autossômicos. Em ambas as espécies, linhagens com alta e baixa transmissão de Bs
já foram identificadas (ver Jones e Houben, 2003).
Cromossomos B foram encontrados em Cestrum parqui, no híbrido entre C.
parqui × C. aurantiacum (SÝKOROVÁ et al., 2003b), e em Cestrum strigilatum e C.
intermedium (FREGONEZI et al., 2004). Segundo estes autores, os Bs destas quatro espécies
23
são similares em tamanho e forma, quando observados por coloração convencional. Porém,
são compostos por diferentes famílias de DNA repetitivo, dentre as quais se destacam os
segmentos de DNAr 5S e 45S e um segmento de 405 pb contendo a família de minissatélite
BR23 (5’-A
4–5
CTGCT-3’) em C. parqui (SÝKOROVÁ et al., 2003b) e bandas C-Giemsa,
bandas CMA
3
0
/DAPI
0
e uma família do retroelemento Ty3-gypsy em C. strigilatum e C.
intermedium (FREGONEZI et al., 2004). Todavia pouco se conhece a respeito da distribuição
e da transmissão desses cromossomos nessas espécies, exceto por variações intra e inter-
individuais no número de Bs decorrente da sua eliminação em tecidos somáticos
(FREGONEZI et al., 2004).
Independente da espécie hospedeira, e da organização interna dos Bs, parece
que as variações observadas na freqüência desses cromossomos devido a uma segregação
irregular na meiose e na mitose (CAMACHO et al., 2000). Dessa forma, o comportamento
anormal desses cromossomos durante as divisões celulares pode estar relacionado a alterações
em eventos cruciais das divisões como: os processos de iniciação, a condensação e a cinética
dos cromossomos (SCHWARZACHER, 2003). Alguns processos citológicos das divisões
celulares são influenciados e sinalizados por modificações pós-traducionais de proteínas
cromossômicas, como por exemplo, as histonas. Trabalhos recentes têm demonstrado que
durante as divisões celulares, a condensação e a segregação dos cromossomos e cromátides
são influenciadas por fosforilação, acetilação e metilação das proteínas cromossômicas, como
as fosforilações nas histonas H3 reportado por Hendzel et al. (1997) e Manzanero et al.
(2000). Essas modificações pós-traducionais são reversíveis e podem ocorrer em diferentes
resíduos da cauda N-terminal das histonas (NOWAK e CORSES, 2004) e, geralmente, a
modificação em um resíduo leva a modificações no resíduo vizinho (veja PRIGENT e
DIMITROV, 2003). Com relação à histona H3, a fosforilação na serina 10 tem sido
relacionada à compactação cromossômica durante a mitose de organismos totalmente
24
divergentes como Tetrahymena thermophila (protozoário), Aspergillus nídulans (fungo),
Caenorhabditis elegans (nematóide), plantas e vertebrados (ver HANS e DIMITROV, 2001).
No entanto, essa relação parece não ser universal, pois mutantes de Sacharomices cerevisae
com ausência de fosforilação na serina 10 da histona H3 (H3/ser10) apresentaram ciclo
celular idêntico às linhagens selvagens (HSU et al., 2000). Em Xenopus, a fosforilação da
H3/ser10 está relacionada com a descondensação cromossômica (PRIGENT e DIMITROV,
2003).
Diferenças no padrão de fosforilação da H3/ser10 foram encontradas na
mitose e a meiose de animais e plantas. Na mitose animal, a fosforilação inicia-se na região
pericentromérica dos cromossomos no final do período G2 e, durante a prófase, os
cromossomos apresentam-se inteiramente fosforilados, sendo mantidos assim até a anáfase,
quando começam a desfosforilar (HENDZEL et al., 1997). Esse mesmo padrão de
fosforilação também foi encontrado na meiose animal (WEI et al., 1999; COBB et al., 1999).
Por outro lado, em plantas, a fosforilação tem início na prófase, também nas regiões
pericentroméricas dos cromossomos, porém, este padrão persiste até a metáfase, ou seja, os
cromossomos não são inteiramente fosforilados (HOUBEN et al., 1999).
Surpreendentemente, durante a meiose I (MI) os cromossomos de algumas espécies vegetais
aparecem inteiramente marcados e na meiose II (MII) repete-se o padrão observado durante a
mitose (marcações apenas nas regiões pericentroméricas). Do mesmo modo que ocorre em
animais, em plantas, a desfosforilação dos cromossomos tem início na transição
anáfase/telófase. Contudo, na meiose vegetal a fosforilação da H3/ser10 parece não estar
diretamente relacionada com a condensação cromossômica, mas sim com o pareamento e a
estabilidade dos bivalentes (KASZÁS e CANDE, 2000; MANZANERO et al., 2000).
Embora ainda não exista uma função bem definida para a fosforilação da
H3/ser10 durante as divisões celulares em vegetais, a sua ausência já foi relatada para alguns
25
comportamentos cromossômicos anormais. Brasileiro-Vidal et al. (2005) não encontraram
sinais de fosforilação em cromossomos formando pontes anafásicas, em cromátides
retardatárias e em fragmentos cromossômicos em um híbrido entre Triticum aestivum e
Thinopyrum ponticum. Além disso, Manzanero et al. (2000) demonstraram que quando
cromossomos univalentes de trigo e cromossomos Bs de arroz dividem-se equacionalmente
em MI (anfitelia) originam cromátides que não fosforilam em MII. Tais informações levaram
Manzanero et al. (2000) a proporem que a fosforilação da H3/ser10 não esteja relacionada
com a cinética dos cromossomos durante a MII, mas sim com separação das cromátides
irmãs, já que cromátides originadas por anfitelia ligaram-se normalmente as fibras do fuso.
Até o momento muitas perguntas sobre o efeito da fosforilação das
H3/ser10 nas divisões celulares em vegetais necessitam de respostas. As informações até
agora obtidas mostram que a imunofluorescência com anticorpos antiproteínas
cromossômicas pode ser uma ferramenta útil para a compreensão desses eventos relacionados
com as divisões celulares, sobretudo no que diz respeito ao pareamento cromossômico e a
separação dos cromossomos homólogos e das cromátides irmãs. Adicionalmente, tais
ferramentas parecem ser mais úteis ainda quando se trata dos cromossomos Bs, já que são
incompreendidos por alguns e desacreditados por outros. É possível que o uso de anticorpos
anti-proteínas cromossômicas forneçam muitas respostas no que diz respeito à segregação não
mendeliana e à transmissão materna ou paterna dos cromossomos Bs.
26
2 JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS
Até o momento, trabalhos citogenéticos em espécies de Cestrum reportaram
uma constância cariotípica quando observados convencionalmente, Porém, tais cariótipos
exibem uma riqueza qualitativa e quantitativa em famílias de DNA repetitivos distribuídos
(dispersos ou em blocos) ao longo de seus cromossomos, sobretudo as famílias
heterocromáticas. Apenas nove espécies de Cestrum foram estudadas quanto à distribuição
desses segmentos e este número reduzido de estudos não permite sugerir modelos de
organização e diferenciação cariotípica para o grupo. Desse modo, o mapeamento físico de
DNAs repetitivos em novas espécies de Cestrum pode trazer uma contribuição extremamente
útil para verificar os processos envolvidos na dinâmica dos DNAs repetitivos e sua influência
no processo de diferenciação cariotípica no gênero. Tais informações podem também ser de
fundamental importância para estudos taxonômicos e evolutivos, já que Cestrum é um grupo
considerado derivado na família Solanaceae.
Outra característica citológica interessante encontrada em Cestrum é a
presença de cromossomos Bs em algumas espécies, como por exemplo, em Cestrum
strigilatum. Variações observadas na freqüência de Bs acontecem porque estes cromossomos
não segregam regularmente na meiose e na mitose Para entender esta dinâmica, são
necessários estudos sobre fatores que regulam e interferem na segregação dos Bs, bem como
os possíveis efeitos desses cromossomos sobre as características reprodutivas das espécies
hospedeiras. O fato dos cromossomos Bs não parearem com outros cromossomos e não
apresentarem um comportamento tipicamente mendeliano, sugerem que outros fatores podem
interferir na cinética destes cromossomos nas divisões celulares, principalmente por
modificações pós-tradução de proteínas cromossômicas, como por exemplo, a fosforilação
diferencial das histonas H3. Sendo assim, os seguintes objetivos foram traçados para este
trabalho:
27
1) Caracterizar os cariótipos de quatro espécies do gênero Cestrum: C. capsulare
Carvalho & Schoonor, C. corymbosum Schlecht, C. laevigatum Schltdl. e C. megalophylum
Dunal, utilizando as seguintes ferramentas citogenéticas: i) coloração convencional, ii)
bandamento C-CMA
3
/DAPI e iii) hibridação in situ com as sondas de DNAr 45S e 5S.
2) Utilizar os resultados obtidos pela caracterização cariotípica das quatro espécies
para gerar mapas físicos e compará-los com os mapas gerados para as outras nove espécies
estudadas anteriormente e com isto contribuir para a elaboração de um modelo de evolução
cariotípica para o gênero.
3) Verificar e compreender: (i) o comportamento, a transmissão e a distribuição dos
cromossomos B em Cestrum strigilatum, utilizando informações sobre a freqüência de células
com B na meiose, a freqüência de Bs nas progênies e o comportamento dos cromossomos As
e Bs frente ao padrão de fosforilação das histonas H3 e (ii) verificar o efeito da presença dos
cromossomos B sobre a viabilidade dos grãos de pólen em plantas portadoras, em comparação
com as não portadoras de Bs.
28
CAPÍTULO 1
29
Mapeamento Físico com DNAs repetitivos espécies de Cestrum (Solanaceae)
Resumo:
Cestrum (Solanaceae) é um gênero com representantes arbóreo-arbustivos, distribuídos pelas
Américas tropical e subtropical. Estudos prévios mostraram um número cromossômico
2n=2x=16, com predominância de tipos meta e submetacêntricos, e diversas classes de
heterocromatina. Neste estudo, algumas espécies e populações brasileiras do gênero foram
caracterizadas citogeneticamente pela primeira vez, através de coloração convencional, com
bandamentos C-CMA
3
/DAPI e FISH com as sondas de DNA 45S e 5S. Todas as espécies
mostraram 2n=2x=16, com a predominância de cromossomos meta e submetacêntricos, com
exceção do menor par cromossômico, o qual foi acrocêntrico. Vários tipos heterocromáticos
foram identificados e variaram em tamanho, número, posição e composição dentro e entre as
espécies. Blocos C-CMA
3
+
e cistrons de DNAr 45S apareceram preferencialmente nas regiões
terminais dos cromossomos e os blocos C-DAPI
0
/CMA
3
0
e dots C-DAPI
+
em regiões
intercalares/subterminais dos cromossomos. Pela primeira vez, sítios para DNAr 5S foram
descritos em uma região não correspondente ao último par, embora, como também em outras
espécies, foi encontrado na região pericentromérica de um par cromossômico de C. capsulare.
As diferenças encontradas no padrão de bandas entre as espécies aqui estudadas, e as outras
nove reportadas na literatura, sugerem que os segmentos heterocromáticos encontrados em
Cestrum apresentam uma dispersão por amplificação/contaminação eqüilocal entre
heterólogos ou a partir de sítios iniciais de amplificação (amplificação não eqüilocal), porém,
sem alterações significativas na composição geral dos cariótipos (tamanho e forma).
Palavras-chave: Cestrum, bandamento cromossômico, C-CMA
3
/DAPI, DNAr 45S e 5S,
evolução cariotípica.
30
Introdução
A tribo Cestreae G. Don, a segunda maior da família Solanaceae, é formada pelos
gêneros Cestrum, Sessea e Vestia. Seus representantes são, na maioria, arbustos e pequenas
árvores distribuídos nas regiões tropical e subtropical das Américas (Hunziker 1976). Cestrum
é o maior gênero da tribo, e o terceiro maior da família (Judd et al. 1999), e o Brasil é o país
com a maior concentração de espécies deste gênero, com cerca de 50 (Hunziker 2001).
Estudos citogenéticos realizados em Cestreae foram feitos em algumas poucas
espécies, as quais abordaram contagens cromossômicas, bandamento, localização física de
sítios de DNAr, bem como o isolamento de uma família de microsatélite e outra de
retroelemento. O número cromossômico 2n = 2x = 16 é constante para a tribo, e os cariótipos
são simétricos com a predominância de cromossomos metacêntricos e submetacêntricos. A
tribo também é conhecida por apresentar os maiores cromossomos da família, podendo medir
até 14 µm (Berg e Greilhuber 1992, 1993a; b; Fregonezi et al. 2006; Las Penas et al. 2006).
Em outros gêneros, como Solanum e Capsicum, os cromossomos são bem menores, medindo
entre 1,2 a 2.4 µm e 3,5 a- 4,0 µm, respectivamente (Bernardello e Anderson 1990; Moscone
1993; Bernarderllo et al. 1994).
A aplicação de técnicas de bandamento cromossômico em Cestrum tem mostrado
que a estabilidade cariotípica observada por coloração convencional quanto ao tamanho e à
forma dos cromossomos, não é refletida na sua estrutura interna. A literatura traz um registro
de pelo menos sete diferentes famílias de DNA repetitivos em nove espécies Cestrum, as
quais variam qualitativa e quantitativamente entre as espécies. Nos estudos desenvolvidos por
Berg e Greilhuber (1993a; b) e Fregonezi et al. (2006), foram : (1) bandas G-Giemsa
relacionadas às regiões organizadoras de nucléolos; (2) bandas G-Giemsa diminutas formando
dots intercalares, proximais ou distais (3) bandas CMA
3
positivas associadas às regiões
31
organizadoras de nucléolo (RON), (4) bandas DAPI positivas associadas às regiões sensíveis
ao frio (CSRs), (5) bandas neutras C-CMA3
0
/DAPI
0
, (6) bandas CMA
3
positivas não
associadas às RONs e (7) bandas C-Giemsa/CSR/DAPI negativo.
Além dos segmentos heterocromáticos, outros DNAs repetitivos também foram
reportados em Cestrum. Sýkorová et al. (2003a) detectou que as seqüências teloméricas
(TTTAGGG)
n
, conhecidas como “telômeros do tipo Arabidopsis” (Brassicaceae), comumente
encontrada em plantas, são ausentes em Cestrum e nos dois outros gêneros da tribo Cestrae
(Vestia e Sessea). Logo em seguida, Sýkorová et al. (2003b) conseguiram isolar e mapear
uma família de minissatélite rica em A/T, chamada de BR23, que apareceram dispersas pelos
cromossomos inclusive nas regiões terminais dos cromossomos. Segundo estes autores, essas
seqüências de DNAs repetitivos poderiam estar associadas aos processos de recombinação e
fusão cromossômica, resultando no aumento do genoma em Cestrum. Além deste segmento
repetitivo, esses autores encontraram uma colocalização incomum de segmentos de DNAr
45S e 5S nos cromossomos Bs de C. parqui, até então não observadas em nenhuma espécie de
Solanaceae. Posteriormente, Fregonezi et al. (2006) utilizaram hibridação in situ com
fluorocromos (FISH) com as sondas de DNAr 45S e 5S em quatro espécies de Cestrum e
encontraram que o DNAr 5S apareceu sempre na região pericentromérica do braço longo do
par menor par cromossômico, enquanto que o DNAr 45S foi mais variável tanto em número
quanto em localização, porém aparecendo mais comumente nas regiões terminais dos braços
curtos dos cromossomos. Adicionalmente, Fregonezi et al. (2007) isolaram um segmento de
retrotransposon da família Ty3-gypsy que foi localizado disperso pelos cromossomos e
também associado às RONs. O acúmulo de DNAs repetitivos encontrado em algumas
espécies de Cestrum parece concordar com a proposta de Las Penas et al. (2006), que
sugeriram que a diversificação na assimetria cariotípica encontrada em várias espécies da
tribo Cestreae (C. bigibosum Pittier, C. buxifolium Kunth, Sessea corymbiflora Goudot ex
32
Taylor e Phillips e Vestia foetida Ruiz e Pav) pode ter ocorrido pelo aumento do tamanho do
genoma.
Com o objetivo de aumentar as informações sobre a ocorrência e a localização física
dos segmentos repetitivos de DNA em Cestrum, neste trabalho estudamos pela primeira vez o
cariótipo convencional, a ocorrência e a distribuição de diferentes famílias de heterocromatina
e a localização dos sítios de DNAr 45s e 5S em quatro espécies desse gênero. Tais
informações trazem uma nova contribuição para os estudos evolutivos do grupo, sobretudo
por que mostram diferenças na localização física de diferentes segmentos de DNA, os quais
sustentam novas possibilidades e processos envolvidos na diferenciação cariotípica do gênero
Cestrum.
Materiais e Métodos
Plântulas de quatro diferentes espécies de Cestrum (Tabela 1) foram obtidas, por
semeadura direta e/ou estaquia, e cultivadas no viveiro de mudas do Laboratório de
Biodiversidade e Restauração de Ecossistemas (LABRE, CCB, UEL, Londrina, Paraná). Para
as preparações citogenéticas, pontas de raízes foram pré-tratadas com colchicina 0,05% por
quatro horas à temperatura ambiente e fixadas em etanol/ácido acético (3:1, v:v) por até 24
horas à temperatura ambiente. Em seguida, as raízes foram diretamente utilizadas no preparo
das lâminas ou mantidas a –20 graus até o uso.
Para a coloração convencional as raízes pré-tratadas e fixadas foram digeridas em
uma solução composta de 4% de celulase e 40% de pectinase por uma hora a 37
o
C. Em
seguida, foram hidrolisadas em HCl 1M por oito minutos a 60
o
C, dissecadas em uma gota de
ácido acético 45% e as lamínulas retiradas após congelamento em nitrogênio líquido. A
coloração das lâminas foi feita em Giemsa 2% e as lâminas permanentes montadas com
Entellan. As cinco melhores metáfases de cada espécie foram utilizadas para medições,
33
utilizando o programa Micro Measure 3.3 (http://www.biology.colostate.edu/MicroMeasure/).
Os cromossomos foram classificados conforme a nomenclatura proposta por Guerra (1986).
O bandamento cromossômico seguiu o protocolo descrito por Schwarzacher et al.
(1980), com modificações. Para isto, raízes foram digeridas em solução de celulase/pectinase,
como descrito anteriormente, dissecadas em uma gota de ácido acético 45% e, após a retirada
das lamínulas, as lâminas foram envelhecidas por três dias. Após o envelhecimento, as
lâminas foram incubadas em ácido acético 45%, a 60
o
C durante 10 minutos, hidróxido de
bário 5% à temperatura ambiente (TA) por 10 minutos e 2xSSC, a 60
o
C por 80 minutos. As
lâminas foram coradas com Giemsa a 2% e montadas permanentes em Entellan, ou então,
com CMA
3
(0,5 µg/µL) por 90 minutos e, logo em seguida, com DAPI (2 µg/µL) por meia
hora. Por fim, as lâminas foram montadas em glicerol/ tampão McIIvaine 1:1 pH 7,0 com 2,5
mM MgCl
2
.
A FISH foi realizada de acordo com os procedimentos descritos por Heslop-Harrison
et al. (1991) e Cuadrado e Jouve (1994), com modificações. Foram utilizadas as sondas de
trigo pTa71, contendo a seqüência de DNAr 45S (Gerlach e Bedbrook, 1979) e pTa794
contendo a seqüência de DNAr 5S (Gerlach e Dyer, 1980). As sondas foram marcadas com
biotina-14d-TP ou digoxigenina-11-dUTP por nick translation. As lâminas foram preparadas
como descrito anteriormente para o bandamento, porém, sem o envelhecimento. Antes da
hibridação as lâminas foram tratadas com 50 µL de RNAse 1% por 1 hora e lavadas em
2xSSC por 10 min (TA), pós-fixadas em paraformaldeído 4% por 10 min (TA), lavadas
novamente em 2xSSC por 10 min (TA) e desidratadas nos álcoois 70% (5 min sob agitação
leve) e 100% (5 min sem agitação). Sobre cada lâmina foi aplicado 30 µL de uma mistura de
hibridação contendo 100 a 200 ng de sonda marcada (4 µL), formamida a 100% (15 µL),
polietilenoglicol a 50% (6 µL), 3 µL de 20xSSC (pH 7,0), 1 µL de DNA de timo de bezerro
fragmentado (100 ng) e SDS a 10% (1 µL). A mistura de hibridação foi desnaturada a 70
o
C
34
por 10 min e imediatamente colocada no gelo. Os cromossomos e a sonda foram desnaturados
simultaneamente em um termociclador a 90
o
C por 10 min, 50
o
C por 10min e 38
o
C por 5min.
Em seguida, as lâminas foram colocadas em uma câmara úmida a 37
o
C por pelo menos 12
horas. As lavagens pós-hibridação foram feitas em 2xSSC a 42
o
C por 5 min, formamida 20%
(20 mL de formamida e 80 mL de 0,1xSSC) a 42
o
C por 10 min, 0,1xSSC a 42
o
C por 5 min,
2xSSC a 42
o
C por 5 min, 4xSSC/Tween 20 0,2% a 42
o
C por 5 min e 4xSSC/Tween 20 0,2%
à temperatura ambiente 5 min, todos feitos sob agitação. As sondas foram detectadas com
uma solução de avidina/FITC (verde) 1:100 (em BSA 5%) ou anti-digoxigenina/rodamina
(vermelho) 1:100 (em BSA 5%), seguidas por duas lavagens pós-detecção com
4xSSC/Tween20 2%, por 10 min à temperatura ambiente. Por fim, as lâminas foram contra-
coradas e montadas simultaneamente com antifade: 23 µL de antifade (1,4-diaza-
bicyclo(2.2.2)-octane (2,3%), Tris HCl 20 mM, pH 8.0 (2%) e Glicerol (90%), em água
destilada), 1 µL de DAPI (2 µg/mL) e 1 µL de MgCl
2
(50mM).
Todas as imagens foram adquiridas em um microscópio de epifluorescência Leica
DM 4500 B, equipado com uma câmera DFC 300FX e com o programa IM50 4.0, também da
Leica. O idiograma foi construído com o auxílio do programa Corel Draw 12, a partir de
cinco medidas cromossômicas (comprimentos absoluto e relativo) obtidas de metáfases
coradas convencionalmente e tratadas para o bandamento e FISH.
Resultados
A análise citogenética por coloração convencional mostrou que número
cromossômico 2n = 2x = 16 foi constante para as quatro espécies de Cestrum estudas (Figuras
1A, B, C e D). Além da estabilidade cromossômica numérica, todas as espécies apresentaram
predominância de cromossomos metacêntricos e submetacêntricos, sendo o menor par sempre
acrocêntrico. Do mesmo modo que os números cromossômicos, os núcleos interfásicos
35
também foram constantes, sendo do tipo reticular (Figura 1A). Diferenças foram encontradas
na fórmula cariotípica, bem como no tamanho dos cromossomos e do complemento haplóide
(Tabela 1).
Cestrum capsulare e C. megalophylum apresentaram os cariótipos mais discrepantes
quando comparados às outras duas espécies. Cestrum megalophylum exibiu os maiores
cromossomos e, conseqüentemente, o maior complemento haplóide (38,1µm), enquanto que
em C. capsulare os cromossomos foram menores, com o complemento do lote haplóide
também menor, 24µm (Tabela 1). Cestrum corymbosum e C. laevigatum apresentaram
tamanhos cromossômicos e dos lotes haplóides intermediários e semelhantes entre si (Tabela
1). A fórmula cariotípica das quatro espécies apresentou variações, exceto pelo menor par
cromossômico (par 8), o qual foi sempre acrocêntrico (Tabela 1, Figuras 1A-D e Figura 4). As
variações mais marcantes foram encontradas em C. megalophylum e entre C. corymbosum e
C. laevigatum. Na primeira espécie foi detectado um par heteromórfico formado por um
cromossomo metacêntrico pequeno (7,55µm) e um submetacêntrico grande (10,32µm)
compondo uma fórmula cariotípica atípica, com 5m + 1sm + 1a + um par heteromórfico:
m+sm (Tabela 1 e Figuras 4 D). No segundo caso, apesar de ambas as espécies possuírem 6m
+ 1sm + 1a, a posição do par submetacêntrico variou entre as amostras, já que este foi o
terceiro par em C. corymbosum e o antepenúltimo em C. laevigatum (Tabela 1, Figuras 4B e
C).
O bandamento cromossômico C-CMA
3
-DAPI mostrou uma grande variação
quantitativa e qualitativa entre as quatro espécies. Cestrum capsulare mostrou um grande
número de pequenas bandas (dots) DAPI+ localizadas preferencialmente nas regiões
intercalares a terminais, exceto nos pares 4 e 8, e grandes blocos subterminais nos pares 3, 4 e
7 (Figuras 2A e 4A). Bandas DAPI positivas também foram detectadas nas regiões proximais-
centroméricas dos pares 1 e 2. Cestrum corymbosum e C. laevigatum, apesar de terem os
36
cariótipos convencionais muito similares, mostraram uma grande variação no padrão de
bandas C-DAPI. Cestrum corymbosum mostrou bandas C-DAPI somente nas regiões
proximais-centroméricas, exceto no par 8 (Figuras 2C e 4B), enquanto que em C. laevigatum
apenas pequenos dots intercalares nos dois braços do par 1 foram encontrados, além de um
grande bloco DAPI
+
intercalar no braço curto do par 4. Bandas C-DAPI+ proximais-
centroméricas não foram observadas em C. laevigatum (Figuras 2E e 4C). Em C.
megalophylum foram encontradas bandas C-DAPI nas regiões proximais-centroméricas de
todos os cromossomos, exceto no par 8, além de dois grandes blocos nas regiões intercalares-
subterminais dos pares 3 e 7 (Figuras 2G e 4D). Bandas C-CMA
3
foram encontradas sempre
nas regiões terminais nas quatro espécies, exceto em C. capsulare que apresentou três bandas
intercalares. Nesta espécie foram encontrados blocos terminais nos pares 6 e 8, além de um
bloco intercalar/subterminal no par 3, um dot no braço longo (metacêntrico) do par 1 e um
bloco centromérico no par 8 (Figuras 2B e 4A). Cestrum corymbosum mostrou apenas dois
blocos terminais, nos pares 7 e 8 (Figuras 2D e 4B). Cestrum laevigatum mostrou também
dois blocos terminais, porém, nos pares 3 e 7 (Figuras 2F e 4C). Em C. megalophylum foram
encontradas bandas C-CMA
3
nos pares 4 e 7, e um heteromorfismo, com um grande bloco no
maior cromossomo do complemento (considerado como cromossomo 1) e a ausência no seu
par correspondente (Figuras 2H e 4D). Bandas neutras foram encontradas em C. capsulare
(região terminal do braço curto do par 2 e um dot intercalar no braço longo do par 1), em
Cestrum corymbosum (região terminal do braço curto do par 3) e Cestrum laevigatum (região
intercalar do braço curto do par 7), Figuras 2A-F e 4A-C.
A FISH com a sonda de DNAr 45S mostrou quatro sinais de hibridação localizados
sempre nas pontas dos braços curtos nas quatro espécies, exceto por um heteromorfismo em
C. megalophylum, onde apareceram cinco cromossomos marcados com a sonda de DNAr 45S
(Figuras 3 e 4). Em todas as amostras foram encontradas diferenças tanto no tamanho dos
37
sítios quanto nos pares de ocorrência. Em Cestrum capsulare, os sítios de DNAr 45S foram
encontrados nos pares 6 e 8 (Figura 3A, Figura 4A), em C. corymbosum nos pares 7 e 8
(Figura 3C, Figura 4B), em C. laevigatum nos pares 3 e 7 (Figuras 3E e 4C) e em C.
megalophylum nos pares 4 e 7 e no cromossomo heteromórfico número 1 (Figura 3F e 4D). A
FISH com a sonda de DNAr 5S mostrou sinais de hibridação sempre na região proximal do
braço longo do par 8, exceto em Cestrum capsulare, aonde os sinais foram detectados na
mesma região, porém no par 4 (Figuras 3B, D, E e G, Figura 4A-D).
Discussão
A análise citogenética, feita pela primeira vez nestas espécies, mostrou que o número
cromossômico 2n = 2x = 16 foi constante para as quatro espécies de Cestrum. Além dessa
estabilidade numérica, outras características citogenéticas também foram constantes, como a
predominância de cromossomos meta e submetacêntricos, a ocorrência de núcleos interfásicos
do tipo reticular, e a presença do par 8 acrocêntrico em todos os cariótipos estudados. Esses
resultados estão de acordo com os já descritos para o gênero Cestrum (Berg e Greilhuber,
1992, 1993, a, b; Fregonezi et al., 2006) e também para as outras espécies da tribo (Las Penas
et al., 2006). Vale lembrar que cariótipos com estabilidade cromossômica numérica e
morfológica foram também encontrados em outros gêneros da família Solanaceae como
Capsicum (Pozzobon et al., 2006), Solanum (Bernardello e Anderson, 1990) e Lycopersicum
(Pillen et al., 1996). No entanto, nossos resultados, somados aos obtidos por Berg e
Greilhuber (1992, 1993, a, b), Fregonezi et al. (2006) e Las Penas et al. (2006), indicam que,
apesar da estabilidade numérica e morfológica entre os cariótipos desses grupos, algumas
variações se destacam. Tais variações estão relacionadas à fórmula cariotípica, sobretudo no
que diz respeito ao número e à posição dos pares submetacêntricos, ao tamanho dos
cromossomos e do lote haplóide, e à simetria dos cariótipos. Las Penas et al. (2006) sugeriram
38
que o aumento do genoma acompanhado por uma leve assimetria cariotípica seja comum na
tribo Cestreae. Segundo estes autores, espécies com características morfológicas
plesiomórficas, como as do gênero Vestia, possuem cariótipos mais simétricos e
cromossomos menores, enquanto que nos gêneros Sessea e Cestrum, mais apomórficos, os
cariótipos são menos simétricos e têm cromossomos maiores. Nossos resultados corroboram,
em parte, com essa proposta, pois C. capsulare teve o cariótipo mais simétrico com os
menores cromossomos, ao contrário de C. megalophylum, que apresentou o cariótipo menos
simétrico e com os maiores cromossomos. Esta diferença encontrada entre o cariótipo de C.
capsulare e os cariótipos das demais espécies do gênero até poderia ser respaldada pela
taxonomia, já que C. capsulare pertencia ao gênero Sessea (S. regnelli), e foi transferida
recentemente para o gênero Cestrum (Carvalho e Schnoor, 1993/1997). Contudo, as análises
de bandamento cromossômico (discutidas a seguir) mostraram que esta espécie teve um
grande acúmulo de heterocromatina. Isto deveria ter gerado um cariótipo mais assimétrico, o
que não foi encontrado.
O bandamento cromossômico mostrou diferenças na abundância, no tamanho dos
blocos e na localização da heterocromatina, contudo, a distribuição da maioria das bandas
parece seguir o modelo de dispersão eqüilocal/eqüidistante proposto por Schweizer e Loidl
(1987). Isto fica bastante evidente quando comparamos a localização física dos blocos C-
CMA
3
+
, os quais aparecem preferencialmente nas pontas dos cromossomos. O mesmo é
encontrado para os blocos intercalares/subterminais C-DAPI
0
/CMA
3
0
e C-DAPI
+
, nas quatro
espécies, bem como para os dots C-DAPI
+
de C. capsulare e C. laevigatum e as bandas
centroméricas C-DAPI
+
de C. corymbosum e C. megalophylum, como destacado no
idiograma. Esse mesmo padrão de distribuição eqüilocal dos blocos heterocromáticos foi
encontrado nas espécies de Cestrum estudadas por Fregonezi et al. (2006). Contudo, o padrão
de bandas foi bastante diferente entre as espécies estudadas aqui e as outras nove reportadas
39
na literatura, de modo que cada espécie pode ser facilmente identificada seguindo esse perfil
de marcas cromossômicas. Se compararmos os mapas físicos gerados por a Berg e Greilhuber
(1992, 1993 a, b) e Fregonezi et al. (2006), ainda assim, algumas relações interespecíficas
podem ser estabelecidas entre estes cariótipos. Algumas bandas parecem ocupar
preferencialmente determinadas áreas cromossômicas, de modo não aleatório, como por
exemplo: (i) os dots heterocromáticos intercalares encontrados em C. capsulare e C.
laevigatum também foram descritos para as outras espécies, (ii) os grandes blocos C-DAPI
+
são encontrados preferencialmente nas regiões intercalares a subterminais, (iii) as RONs são
sempre terminais. De outro modo, outras bandas parecem ocupar determinadas regiões de
maneira aleatória, ou seja, sem nenhuma relação eqüilocal/eqüidistante. Assim, nossos dados
reforçam os de Fregonezi et al. (2006), os quais sugerem que alguns segmentos
heterocromáticos têm dispersão por amplificação/contaminação eqüilocal entre heterólogos e
outros a partir de sítios iniciais de amplificação, de modo não eqüilocal. Podemos propor,
desse modo, que os genomas das espécies de Cestrum podem diferir na qualidade, quantidade
e localização de ilhas de amplificação de heterocromatina. Adicionalmente a estes eventos de
amplificação, outros mecanismos também parecem ocorrer, como é o caso de C.
megalophylum. Nesta espécie foi encontrado um par heteromórfico para um segmento C-
CMA
3
+
/RON. Geralmente, heteromorfismos evolvendo estas regiões podem acontecer por
crossing-over desigual, translocações não recíprocas ou ainda deleções, contudo, nossos dados
ainda não permitem determinar o motivo já que estudos meióticos não foram realizados.
A hibridação in situ com a sonda de DNAr 45S em Cestrum revelou um padrão de
distribuição comum à maioria das espécies vegetais, ocorrendo sempre nas regiões terminais
dos cromossomos (Lima de Faria, 1976). Esse perfil foi também encontrado em Capsicum
(Moscone et al., 1995) e Nicotiana (Yoong Lim et al., 2000). As espécies aqui estudadas
apresentaram quatro sítios de DNAr 45S, exceto por um heteromorfismo em C.
40
megalophylum, que mostrou cinco sinais de hibridação. Neste caso, o sítio de DNAr 45S
heteromórfico está associado ao segmento C-CMA
3
+
, e provavelmente sofreu um dos três
eventos descritos anteriormente. Além do heteromorfismo numérico, diferenças nos tamanhos
dos sítios de DNAr 45S também foram observadas, provavelmente por uma diferença no
número de repetições por blocos. O fato mais interessante está relacionado à localização física
do segmento de DNAr 5S. Fregonezi et al. (2006) localizou este segmento por FISH na região
pericentromérica do braço longo do par 8 de quatro espécies de Cestrum, e sugeriu que esta
região poderia ser conservada no gênero. Nossos resultados mostraram que os sítios de
hibridação com a sonda de DNAr 5S também foram coincidentes com a região
pericentromérica do braço longo do par 8, exceto em Cestrum capsulare, onde a sonda
hibridou na região pericentromérica do braço longo do par 4. Como colocado anteriormente,
Cestrum capsulare pertencia a outro gênero (Sessea regnelli), e se o par 8 contendo o DNAr
5S for uma marca para o gênero, nossos dados estão na contramão do diagnóstico baseado na
morfologia do fruto que posicionou S. regnelli no gênero Cestrum (Carvalho e Schonoor,
1993/1997). No entanto, quando consideramos as demais características citogenéticas de C.
capsulare, o cariótipo não diferiu muito das outras espécies de Cestrum quanto à ampla
ocorrência de diferentes famílias de heterocromatina distribuídas equilocalmente, à
localização terminal dos sítios de DNAr 45S, ao tamanho e simetria dos cariótipos e mesmo a
localização pericentromérica do DNAr 5S.
Os mapeamento físico dos diferentes tipos de DNAs repetitivos gerados nesse
trabalho, quando comparados a outros mapas realizados para o gênero, reforçam a hipótese de
que em Cestrum as alterações cariotípicas ocorrem principalmente por mudanças nos padrões
de amplificação/dispersão de diferentes segmentos de DNAs repetitivos sem, no entanto,
provocar alterações significativas na composição geral dos cariótipos (tamanho e forma).
Nossos resultados reforçam a necessidade de um estudo citogenético mais abrangente em
41
Cestrum, tanto no que diz respeito ao número de espécies como nas ferramentas utilizadas
para identificação e localização de segmentos de DNAs repetitivos, uma vez que, das 250
espécies existentes desse gênero, apenas 11 foram citogeneticamente estudadas.
Agradecimentos
Os autores agradecem às agências SEMA-IAP, Fundação Araucária e CNPq pelo apoio
financeiro.
42
Tabela 1: Espécies de Cestrum com suas características citogenéticas encontradas e os locais de coleta das espécies.
FCH= fórmula cariotípica do complemento haplóide, VMB= valores médios da soma dos braços longos e curtos, TC= comprimento total dos
cromossomos maior e menor TLH= valor da soma de todos os cromossomos por complemento haplóide. Os símbolos * e ♣ referem-se aos
menores e maiores valores encontrados, respectivamente.
.
Espécie Localidade FCH VMB (µm) TC (µm) TLH (µm)
C. capsulare
Fazenda Califórnia, Curiúva–PR
Ventania Paraná
7m + 1a 27 e 21,10 6,66 e 4,83* 24*
C corymbosum Bandeirantes-PR 6m +1sm+1a 32,5 e 25,2 8,28 e 5,64 28,8
C.laevigatum Missiones-Argentina 6m +1sm+1a 31,89 e 25,48 8,28 e 5,73 28,68
C. megalophylum Salvador-Bahia (m+sm) + 5m + 1sm + 1a 42,4 e 38,8
10,32
♣
e 6,51 38,1
♣
43
Figura 1: Coloração convencional (Giemsa) em C. capsulare (A), C. corymbosum (B), C.
laevigatum (C) e C. megalophylum (D). As setas apontam para o par acrocêntrico. Barra
corresponde a 10 µm.
44
Figura 2. Bandamento C-DAPI em C. capsulare (A), C. corymbosum (C), C. laevigatum
(E) e C. megalophylum (G). As setas grandes apontam para as regiões C-DAPI
+
em alguns
cromossomos e as setas menores para as regiões CMA
0
/DAPI
0
. Bandamento C-CMA
3
em
C. capsulare C. capsulare (B), C. corymbosum (D), C. laevigatum (F) e C. megalophylum
(H). As setas maiores apontam as bandas terminais associadas ao DNA
r
45S. As setas
menores indicam as bandas C-CMA
0
/DAPI
0
. Barra corresponde a 10 µm.
45
Figura 3. FISH com a sonda de DNAr 45S e 5S em Cestrum. (A) Cestrum capsulare com
quatro sítios de DNAr 45S e em (B) as regiões hibridadas com DNAr 5S na mesma espécie
(as setas indicam a ausência desse sítio no par 8). (C) C. corymbosum mostrando quatro sítios
de DNAr 45S e em (D) FISH com DNAr 5S na mesma espécie. (E) Hibridação simultânea
(double FISH) com as sondas DNAr 45S marcada com digoxigenina-rodamina (vermelho) e a
sonda de DNAr 5S marcada com biotina-FITC (verde) na espécie C. laevigatum. Note que a
seta indica um cromossomo com o sítio para DNAr 45S sobre o núcleo interfásico (F) FISH
em C. megalophylum com a sonda de DNAr 45S (a seta indica o cromossomo pertencente ao
par heteromórfico). (G) mostra as regiões hibridadas com DNAr 5S na mesma espécie. Barra
corresponde a 10 µm.
46
Figura 4. Idiogramas e mapeamento físico dos cromossomos de Cestrum capsulare (A), C.
corymbosum (B), C. laevigatum (C) e C. megalophylum (D)
47
Referências
Berg C.; Greilhuber J. (1992) Cold-sensitive chromosome regions and their relation to
constitutive heterochromatin in Cestrum parqui (Solanaceae). Genome. 35: 921-930.
Berg C., Greilhuber J (1993a) Cold-sensitive chromosome regions and heterochromatin in
Cestrum (Solanaceae): C. strigilatum, C. fasciculatum, and C. elegans. Plant Systematic e
and Evolution. 185:133-151.
Berg C., Greilhuber J (1993b) Cold-sensitive regions and heterochromatin in Cestrum
aurantiacum (Solanaceae). Plant Systematic and Evolution. 185: 259-273.
Bernardello L. M.; Anderson G. J (1990) Karyotyp.31915( 6-740381)ar
48
Judd E. S. et al (1999) Plant Systematics: a phylogenetic approach. Massachusetts U.S.A:
Sinauer Associates.
Las Penas M. L., Chiarini F. E., Bernardello G., Benítez De Rojas C. (2006) Karyotypes of
some species of Cestrum, Sessea, and Vestia (tribe Cestreae, Solanaceae). Caryologia 59:
131-137.
Lima De Faria A. (1976) The chromosome field I. Prediction of the location of ribossomal
cistrons Hereditas. 83: 1-22.
Moscone E. A. (1993) Estudios cromosomicos en Capsicum (Solanaceae) II. Analisis
cariotipico de C. parvifolium y C. annuum var. annuum. Kurtziana.22: 9-18.
Moscone E. A., Lambrou M., Hunziker T., Ehrendorfer, F. (1995) Giemsa C-banded
karyotypes in Capsicum (Solanaceae) Plant Syst and Evol. 186: 213-229
Pillen K., Pineda O., Lewis C.B., Tanksley, S. D. (1996) Status of genome mapping tools in
the taxon Solanaceae. In Genome mapping in plants. A.H. Paterson. R.G. Landes (eds.)
Company, Austin, Texas: 281–308.
Pozzobon M. T., Schifino-Wittmann M. T., Bianchetti L. B. (2006) Chromosome numbers in
wild and semidomesticated Brazilian Capsicum L. (Solanaceae) species: do x=12 and x=13
represent two evolutionary lines? Bot Jou of the Lin Soc 151 (2): 259–269
Schwarzacher T. P., Ambros P., Schweizer D. (1980) Application of Giemsa banding to
orchid karyotype analysis. Plant Syst Evol 134: 293-297.
Schweizer D., Loidl J (1987). A model for heterochromatin dispersion and the evolution of C-
banded patterns. Chromo. Today 9: 61-74.
Sýkorová E., Lim Ky., Chase M. W., Knapp S, Leitch I. J, Leitch A. R, Fajkus J (2003a) The
absence of Arabidopsis-type telomeres in Cestrum and closely related genera Vestia and
Sessea (Solanaceae); first evidence from eudicots. Plant Journal, 34: 283–291.
Sýkorová E.; Yoong Lim., Fakijus J., Leitic A. R. (2003b) The signature of the Cestrum
genome suggests an evolutionary response to the loss of (TTTAGGG)
n
telomeres.
Chromosoma. 112: 164-172.
Yoong Lim K., Matyasek R., Lichtenstein C. P., Leitch A. R. (2000) Molecular cytogenetic
analyses and phylogenetic studies in the Nicotiana section Tomentosae. Chromosoma. 109:
245-258.
49
CAPÍTULO 2
Transmissão, comportamento meiótico e fosforilação das histonas H3 do cromossomo B de
Cestrum strigilatum (Solanaceae).
*Este artigo será enviado para publicação na revista Annals of Botany
51
Transmissão, comportamento meiótico e fosforilação das histonas H3 do cromossomo B
de Cestrum strigilatum (Solanaceae)
Resumo
Cromossomos B são reconhecidos por não formarem sinapse com os cromossomos do
complemento A, e por que possuem comportamento univalente e segregação não Mendeliana.
. Neste trabalho estudamos a freqüência e a distribuição de Bs nas primeira e segunda fase da
divisão meiótica masculina (MI e MII) de C. strigilatum, pela aplicação de técnica de
coloração convencional. Os Bs de C. strigilatum foram facilmente reconhecidos por
aparecerem como univalentes, e sempre distantes espacialmente dos cromossomos A. A
análise convencional mostrou que o número de células com B decresce ao longo da meiose,
pois a proporção de Bs foi maior em MI (0,89 em média) do que em MII (0,17 em média).
Além disso, a eliminação destes cromossomos foi observada no final da tétrade. A
imunodetecção com anti-H3-fosforilada realizada em diferentes fases da meiose mostrou que
mesmo não havendo uma relação entre a fosforilação das H3 e a eliminação do B, Cestrum
strigilatum possui um padrão de fosforilação para essa proteína diferente daquele encontrado
para os cromossomos do complemento A de outras espécies vegetais.
Palavras-chave: cromossomos B, Cestrum, histonas H3, meiose, fosforilação, Solanaceae
52
Introdução
Cromossomos acessórios, conhecidos também como cromossomos B, diferem
daqueles do complemento normal em tamanho, forma e composição do DNA e não possuem
segregação Mendeliana como os demais. Tais cromossomos são facilmente reconhecidos por
não formarem sinapse com os cromossomos do complemento A na meiose, apesar de
provavelmente serem originados a partir do complemento A, por diferentes mecanismos
(Camacho et al., 2000). A importância biológica e o significado adaptativo destes
cromossomos em populações naturais ainda são incertos. Contudo, é importante lembrar que
os Bs já foram encontrados em dezenas de espécies de angiospermas, gimnospermas,
pteridófitas, briófitas e fungos (Jones e Houben, 2003). Efeitos fenotípicos atribuídos à
presença de um ou poucos cromossomos Bs são raros. No entanto, parece que na maioria dos
casos, esses cromossomos exercem efeitos negativos sobre o organismo hospedeiro,
principalmente em indivíduos que possuem uma grande quantidade de Bs (veja Jones e Rees,
1982). Esse efeito negativo foi reportado por Gonzáles-Sánchez et al., (2004) em arroz, aonde
os autores mostraram que a fertilidade e a viabilidade dos grãos de pólen viáveis foram
afetadas em indivíduos com elevado número de Bs. Porém, esses autores sugeriram que o
efeito do B pode ser benéfico ao longo do tempo, pois indivíduos descendentes de plantas
mãe com quatro cromossomos B mostraram-se mais férteis do que os originados de plantas
mãe sem esses cromossomos.
Até o momento os motivos pelos quais os Bs são mantidos em populações naturais
permanecem pouco compreendidos, porém os mecanismos de transmissão e acúmulo desses
cromossomos já são um pouco mais conhecidos. Tais mecanismos estão relacionados à não-
disjunções ocorridas durante a gametogênese, como também, por fecundação preferencial por
gametas carregando Bs (Beukeboom, 1994). Mecanismos gênicos controlando a taxa de
53
transmissão de Bs já foram identificados em arroz (Puertas et al., 1998) e milho (Gonzáles-
Sánches et al., 2003). Em arroz o controle da taxa de transmissão é realizado pelo próprio B.
Já em milho, o mecanismo de transmissão parece ser um muito mais complexo, sendo
realizado por genes autossômicos. Em ambas as espécies, linhagens com alta e baixa
transmissão de Bs já foram identificadas (ver Jones e Houben, 2003).
Cromossomos B foram encontrados em Cestrum parqui, no híbrido C. parqui × C.
aurantiacum (Sýkorová et al., 2003), e em Cestrum strigilatum e C. intermedium (Fregonezi
et al., 2004). Apesar de ambos os estudos terem fornecido informações preciosas a respeito da
organização interna destes cromossomos, como a ocorrência de segmentos de DNAr 5S e 45S
e uma família de minissatélite em C. parqui (Sýkorová et al., 2003) e presença de bandas C-
Giemsa, bandas CMA
3
0
/DAPI
0
e uma família do retroelemento Ty3-gypsy em C. strigilatum e
C. intermedium (Fregonezi et al., 2007), pouco se conhece a respeito da distribuição e da
transmissão destes cromossomos nestas espécies, exceto por variações intra e inter-individuais
no número de Bs decorrente da eliminação desses cromossomos em tecido somático
(Fregonezi et al., 2004).
Independente da espécie hospedeira e da organização interna dos Bs, parece que as
variações observadas na freqüência desses cromossomos acontecem devido à segregação
irregular tanto na meiose quanto na mitose (Camacho et al., 2000). Para entender esta
dinâmica, são necessários estudos sobre os fatores que regulam e interferem na segregação
dos Bs, bem como os possíveis efeitos desses cromossomos sobre as características
reprodutivas das espécies hospedeiras. O fato dos cromossomos Bs não parearem com outros
cromossomos e não apresentarem um comportamento tipicamente mendeliano, sugerem que
outros fatores podem interferir na cinética destes cromossomos nas divisões celulares. Neste
contexto, modificações pós-traducionais em proteínas cromossômicas poderiam estar
associadas a estes eventos. Trabalhos recentes demonstraram que a fosforilação da histona H3
54
na serina 10 (H3/ser10) pode estar relacionada a eventos críticos das divisões celulares como:
a condensação cromossômica (Hendzel et al., 1997), a coesão entre as cromátides irmãs em
metáfase I (Kaszás e Cande, 2000) e a segregação das cromátides irmãs na segunda fase da
meiose (Manzanero et al., 2000). Com o objetivo de entender o comportamento, a transmissão
e a distribuição dos cromossomos B em C. strigilatum, foram estudadas neste trabalho a
freqüência do cromossomo B na primeira e na segunda divisão meiótica (MI e MII), a
freqüência e a distribuição desses cromossomos nas progênies, e o comportamento dos
cromossomos As e Bs frente ao padrão de fosforilação das H3/ser10, utilizando cinco
diferentes indivíduos de C. strigilatum portadores de B. Adicionalmente, uma comparação da
viabilidade de pólen em plantas portadoras e não portadoras desse cromossomo também foi
realizada.
Materiais e Métodos
Coleta das amostras
Sementes de dois indivíduos de Cestrum strigilatum contendo cromossomos B foram
coletadas no ano de 2002 em São Jerônimo da Serra, Paraná, Brasil. As exsicatas foram
depositadas no herbário FUEL, do Centro de Ciências Biológicas, da UEL. As sementes
foram submetidas à germinação e cultivadas no Laboratório de Biodiversidade e Restauração
55
polínica. Frutos desses indivíduos também foram utilizados para estimar a taxa de transmissão
dos Bs para a sua progênie.
Análise meiótica
Para a análise convencional, anteras jovens foram coletadas de flores de diferentes
ramos dos cinco arbustos de C. strigilatum contendo Bs, e diretamente fixadas em etanol:
ácido acético (3:1, v: v) por 12 horas e estocadas a –20°C. As anteras foram lavadas em água
destilada e hidrolisadas em HCl 1M a 60
o
C por 5 min. Em seguida, as amostras foram
dissecadas e esmagadas em uma gota de ácido acético 45%. Após o congelamento do
conjunto lâmina/lamínula em nitrogênio líquido, as lamínulas foram removidas e o material
corado com Giemsa 2%. As lâminas foram montadas em Entellan (Merck). Células foram
analisadas para a presença de Bs e agrupadas em: (i) meiócitos em MI sem Bs, (ii) meiócitos
em MI com Bs, (iii) meiócitos em MII sem Bs e (iv) meiócitos em MII com Bs. A análise
estatística foi feita pelo teste de Mann-Whitney U para valores em proporção (Tabela 1). O
cálculo das proporções de cromossomos B em MI foi feito pela divisão do total de células
com esse cromossomo nesta fase pelo número total de células em MI. O mesmo procedimento
foi adotado para o cálculo da proporção de Bs em MII
Análise da freqüência de Bs nas progênies (F1)
Frutos maduros foram coletados dos cinco indivíduos de C. strigilatum contendo Bs,
e as sementes retiradas e colocadas para germinar em câmera úmida à temperatura ambiente.
Raízes foram coletadas, pré-tratadas com colchicina 0,05% por 4 horas, fixadas em etanol:
ácido acético (3:1, v: v) por 12 horas e estocadas a -20°C. Para a confecção das lâminas, as
raízes foram hidrolisadas em HCl 1M a 60
o
C por 10 min, dissecadas e esmagadas em uma
56
gota de ácido acético 45%. As lamínulas foram removidas por congelamento em nitrogênio
líquido e o material corado com Giemsa 2%. As preparações foram feitas com apenas uma
raiz por lâmina, sendo cada raiz considerada como um indivíduo. Após a montagem das
lâminas permanentes, estas foram analisadas quanto à presença de cromossomos B e o
número de Bs por célula.
Viabilidade dos grãos de pólen
O estudo da viabilidade polínica foi feito de modo comparativo entre os cinco
indivíduos portadores e três não portadores de Bs. A viabilidade foi avaliada pela coloração
dos grão de pólen com corante Alexander (0,5M), o qual permite discriminar os polens
viáveis pela coloração púrpura do citoplasma, enquanto que nos polens inviáveis o citoplasma
é reduzido ou ausente, e apenas a ecsina aparece esverdeada (Figura 1). Para isto, cinco flores
de diferentes ramos de cada indivíduo foram coletadas em pré-antese (um a dois dias antes da
abertura da flor) e suas anteras abertas em uma gota de corante, para a liberação dos grãos de
pólen. As lâminas foram imediatamente cobertas com lamínula e montadas de modo semi-
permanente. A coleta das flores e o preparo das lâminas foram feitos em um único dia e no
mesmo período. O critério de análise respeitou a estrutura externa dos grãos de pólen, e a
coloração e o tamanho/volume do citoplasma. Ao final da contagem os dados foram
submetidos ao Test t utilizando o programa Statisca 6.0.
Imunodetecção das histonas H3 fosforiladas
A imunodetecção foi feita de acordo com Manzanero et al. (2000), com pequenas
modificações. Para isto, anteras jovens foram coletadas e diretamente fixadas em formaldeído
4% em tampão PBS 1X (pH 7,0) por 1 hora, lavadas por 20 minutos em tampão PBS 1X e
57
digeridas em uma mistura de celulase 2% (Onozuka), pectinase 2% (Sigma) e hemicelulase
2% (Carl Roth) em tampão PBS 1X, a 37
o
C por 3 h. Em seguida, as anteras foram lavadas por
20 min em PBS 1X, dissecadas em uma gota de PBS 1X gelado e esmagadas. Após o
congelamento do conjunto lâmina/lamínula em nitrogênio líquido, as lamínulas foram
removidas e as lâminas transferidas imediatamente para um frasco contendo PBS 1X gelado.
As lâminas foram tratadas com uma solução bloqueadora (BSA 3%, w/v; 0.1% Triton X-100)
in PBS 1X por 10 minutos a temperatura ambiente. As amostras foram tratadas com o
anticorpo primário anti-phospho-histone H3 (rabbit polyclonal IgG – Upstate Biotechnology,
USA), diluído 1:100 em BSA 3% preparado em PBS 1X (25µL/lâmina), por 12 horas a 4
o
C e
lavadas por 20 min PBS 1X. Em seguida, as lâminas foram incubadas com o anticorpo
secundário Goat anti-rabbit IgG FITC-conjugated (Sigma) diluído 1:100 em BSA 3%
preparado em PBS 1X (25µL/lâmina) por 3 horas a temperatura ambiente. As amostras foram
lavadas em por 10 min, contra-corados com DAPI (2 µg/mL) e as lâminas montadas em
antifade [1,4-diaza- bicyclo (2.2.2)-octane-(2.3%), Tris HCl 20 mM, pH 8.0 (2%) e Glicerol
(90%), em água destilada].
Todas as imagens foram adquiridas em um microscópio de epifluorescência Leica
DM 4500 B, equipado com uma câmera DFC 300FX e com o programa IM50 4.0, também da
Leica.
58
Resultados
A análise convencional mostrou que o cromossomo B de Cestrum strigilatum teve
um comportamento univalente durante a meiose e apareceu geralmente distante do
complemento A. Esse comportamento foi evidenciado desde os primeiros estágios da meiose
(paquíteno e diplóteno) como mostrado nas figuras 2A-B e estendeu-se até o final da meiose,
na formação da tétrade (Figuras 2D- I). Além do seu comportamento univalente, o B de C.
strigilatum não foi orientado e segregado eficazmente para os pólos opostos (Figuras 2F).
Suas cromátides irmãs apresentaram um comportamento similar ao encontrado no
complemento A, ou seja, separando-se somente na segunda divisão da meiose. (Figuras 2D-
G). Adicionalmente, uma tendência à eliminação do B foi vista nos estágios finais da
microsporogênese, telófase e tétrade (Figuras 2 G-I). Nos cinco indivíduos portadores de
cromossomos B, a proporção de células com B foi, em média, sempre maior na primeira
divisão meiótica (MI) do que na segunda (MII), como mostra a Tabela 1. Nas duas divisões
meióticas (MI e MII) meiócitos sem cromossomo B foram observados, como mostrado na
metáfase I na Figura 2C. A análise da freqüência dos Bs na progênie dos cinco indivíduos
revelou que 69% das sementes germinadas possuíam cromossomo B (Tabela 2) e apenas um
dos 42 indivíduos testados exibiu 2 cromossomos B.
Outro parâmetro analisado neste trabalho foi o comportamento dos cromossomos B e
do complemento A na meiose, diante das modificações pós-traducionais das histonas H3. A
imunodetecção com o anticorpo anti-H3-fosforilada na Ser 10, realizada em diferentes fases
da meiose mostrou que desde paquíteno (Figuras 3A, B e C) até as fases mais avançadas da
meiose I (Figuras 3D, E e F), os bivalentes do complemento A fosforilaram na região
proximal do bivalente. Diferentemente, o cromossomo B (univalente) foi quase totalmente
fosforilado, contudo os sinais de fosforilação foram mais intensos no braço curto e na região
pericentromérica do braço longo, e mais fracos na região terminal do braço longo (Figuras
59
3G, H e I e Figuras 4J, K e L). Na meiose II, os cromossomos As de C. strigilatum também
fosforilaram apenas nas regiões centromérica/pericentromérica. Porém, em todas as células
analisadas nenhum sinal de fosforilação foi encontrado nos cromossomos Bs durante a meiose
II (Figuras 3J, K e L). Adicionalmente, averiguamos neste estudo se a fosforilação das
histonas H3 estava associada a algum outro evento envolvendo os cromossomos bivalentes,
como a ocorrência de quiasmas e as constrições nucleolares. As Figuras 4A a I mostram que a
fosforilação ocorreu apenas nas regiões proximais dos bivalentes e não associada com os
quiasmas terminais (Figuras 4A, B e C), quiasmas intersticiais (Figuras 4G, H e I), nem com
as regiões organizadoras de nucléolos (Figuras 4D, E e F).
Para detectar se a presença dos cromossomos B estava afetando de, algum modo, a
eficiência reprodutiva dos indivíduos portadores destes cromossomos, foi feita uma
comparação da viabilidade polínica entre os indivíduos portadores e não portadores de Bs.
Nesta comparação foram contados 34.907 grãos de pólen de anteras de flores em pré-antese.
A análise estatística através do test T não permitiu traçar qualquer relação entre a viabilidade
dos grãos de pólen e a presença de cromossomos B na planta mãe, já que diferenças
significativas foram encontradas entre: (i) anteras de um mesmo indivíduo, contendo ou não
Bs, (ii) entre indivíduos com cromossomos B, (iii) entre indivíduos sem cromossomos B e (iv)
entre indivíduos com e sem Bs (Tabela 3).
Discussão
O cromossomo B de Cestrum strigilatum teve um comportamento univalente durante a
meiose e distante do complemento A desde os primeiros estágios da meiose, sendo facilmente
detectável por seu tamanho diminuto quando comparados aos demais cromossomos. Os dados
obtidos do comportamento meiótico por coloração convencional permitiram propor que, em
Cestrum strigilatum, há uma eliminação do cromossomo B durante a microsporogênese, uma
60
vez que a proporção de Bs foi sempre maior em MI do que em MII. No entanto, quando as
progênies oriundas das mesmas plantas utilizadas na análise meiótica foram avaliadas quanto
à presença do cromossomo B, uma alta taxa de indivíduos com B foi encontrada (69%). Este
fato levantou uma questão: se os cromossomos B de C. strigilatum são eliminados durante a
microsporogênese, como explicar a taxa de 69% de indivíduos portadores de Bs nas progênies
estudadas? Nossos resultados apontam para três possibilidades: (i) o fato de haver eliminação
61
realização de experimentos de cruzamentos controlados entre plantas com Bs e sem Bs
laboriosos em virtude dos processos de manipulação.
Apesar da análise meiótica ter mostrado a eliminação dos cromossomos B na
gametogênese masculina, não permitiu explicar porque os Bs não têm herança mendeliana.
Uma das saídas para responder esta questão foi analisar estes cromossomos por
imunodetecção de histonas H3 fosforiladas, já que a fosforilação destas proteínas pode estar
relacionada com a condensação, a coesão das cromátides irmãs e a segregação. Ao buscarmos
repostas sobre o comportamento dos Bs, nossos resultados mostraram diferenças
surpreendentes e significativas no padrão de fosforilação dos cromossomos A, bem como dos
Bs frente aos cromossomos do complemento A. Em Cestrum strigilatum, a fosforilação
aconteceu na região centromérica/pericentromérica de todos os cromossomos A na primeira
fase da divisão meótica, similar ao observado na mitose e na segunda fase da fase da divisão
meótica de vários organismos (Wei et al., 1999; Houben et al., 1999; Manzanero et al., 2000).
Este fato pode ser considerado incomum, já que trabalhos anteriores (Manzanero et al., 2000),
mostram que todos os cromossomos de arroz e trigo são inteiramente fosforilados na meiose
I, independente de serem Bs ou pertencentes ao complemento A. O padrão de fosforilação
encontrado em C. strigilatum trouxe mais dúvidas e não a resposta que estávamos esperando.
Se a fosforilação da H3/ser10 está envolvida com o pareamento dos cromossomos e com a
coesão das cromátides irmãs, porque então os cromossomos A são fosforilados apenas na
região proximal e os Bs em quase toda sua extensão? Nossos resultados indicam que a
fosforilação da H3/ser10 nos cromossomos do complemento A pode estar envolvida
preferencialmente com o bom funcionamento da região centromérica e não com a
condensação e a coesão das cromátides irmãs, diferentemente dos outros grupos vegetais.
Contudo, para os cromossomos B a fosforilação da H3/ser10 pode ter outro papel. As Figuras
2B-G mostram que as cromátides irmãs dos cromossomos B de C. strigilatum separam
62
somente na meiose II. Diante deste fato, se a fosforilação está associada com a coesão das
cromátides irmãs, porque o B de C. strigilatum fosforila apenas na primeira fase da meiose e
não na segunda? Uma das possibilidades é que a fosforilação quase que total dos
cromossomos B esteja relacionada com a manutenção das duas cromátides na estrutura
univalente. Isto poderia assegurar que suas cromátides sejam separadas somente na segunda
fase da meiose, como observado por coloração convencional.
Em um outro estudo Kaszás e Cande (2000), encontraram sinais de fosforilação da
H3/ser10 associados à RON e em um ponto de um bivalente de milho. Ao contrário do
observado por Kaszás e Cande (2000), em nosso estudo não encontramos nenhuma relação
entre a fosforilação da H3/ser10 com as regiões organizadoras de nucléolo ou pontos de
quiasma em C. strigilatum, como pode ser observado nas Figuras 4A-I. Esses dados vêm a
ressaltar as características singulares de C. strigilatum quanto ao padrão de fosforilação da
H3/ser10 em relaçã e seid e oosalta640381(gi)1ia-13892(o)10.138estudados.
63
assim com o processo comum encontrado por Wei et al. (1999), Houben et al. (1999) e
Manzanero et al. (2000).
Um outro parâmetro analisado foi se a presença de cromossomos B poderia causar
algum efeito sobre a viabilidade dos grãos de pólen. Para isto foi comparada a viabilidade
polínica entre os indivíduos portadores e não portadores de Bs. Após a contagem de 34.907
grãos de pólen, foi observado que havia diferenças significativas entre: (i) anteras de um
mesmo indivíduo, contendo ou não Bs, (ii) entre indivíduos com cromossomos B, (iii) entre
indivíduos sem cromossomos B e (iv) entre indivíduos com e sem Bs (veja a Tabela 3).
Nossos resultados indicam que a presença de cromossomos B nas plantas mãe não interferem
na viabilidade dos polens das suas flores. Um resultado oposto foi encontrados em arroz
(González-Sánchez et al.,2004). Estes autores reportaram que a viabilidade dos grãos de pólen
não está relacionada com a presença de Bs na planta mãe, mas sim com a presença e
quantidade desses cromossomos no grão de pólen. Concluindo, seria importante saber se os
Bs estão presentes em todos os grãos de pólen produzidos, bem como a relação entre a
ocorrência dos Bs e o número de polens viáveis e inviáveis. Para tal, seria importante localizar
os Bs por hibridação in situ em todas as fazes da meiose até o produto final (grãos de pólen).
Agradecimentos
Os autores agradecem às agências SEMA-IAP, Fundação Araucária e CNPq pelo apoio
financeiro.
64
Figura 1. Comparação entre pólen viável e inviável. Polens viáveis (cabeça de seta)
possuem um aspecto túrgido com citoplasma evidentemente corado, enquanto que os
polens inviáveis (seta) aparecem murchos e com o citoplasma reduzido e apenas levemente
corado ou ausente.
65
Tabela 1. Números de Bs e suas respectivas proporções em diferentes fases da meiose.
Contagens de Bs na meiose
Células Planta 1 Planta 2 Planta 3 Planta 4 Planta 5 Total
M I com Bs 364 378 454 306 153 1655
M I sem Bs 654 483 555 986 316 2994
M II com Bs 110 124 104 210 185 733
M II sem Bs 1067 611 376 1058 1488 4600
Total 2195 1596 1489 2560 2142 9982
PCB – MI 0,36 0,44 0,45 0,24 0,33 0,55
PCB – MII 0,09 0,17 0,22 0,17 0,11 0,15
1 - M I = meiose I;
2 – MII = meiose II
3 – PCB = proporção de células com cromossomo B
Tabela 2: Quantidade de indivíduos portadores de cromossomo B na progênie
Amostras Sem B Com B Total Proporção de Bs
Planta 1 4 8 12 0,67
Planta 2 5 3 8 0,38
Planta 3 0 11 11 1,00
Planta 4 4 7 11 0,64
Planta 5 0 0 0 0
Total 13 29 42 0,69
66
Figura 2. Microsporogênese de C. strigilatum com B. A) paquíteno, B) diplóteno, C)
metáfase I sem Bs, D) metáfase I, E) anáfase I, F) metáfase II, G e H) Telófase II, I)
Tétrade com eliminação de Bs. As setas apontam cromossomos B. Barra = 10 µm.
67
Figura 3. Imunodetecção de H3 fosforilada na meiose de C. strigilatum. Os cromossomos
corados com DAPI são mostrados em vermelho e a imunodetecção da H3/ser10 em verde.
A coluna da direita apresenta a sobreposição das duas primeiras colunas. A-C) paquíteno
com sinais proximais e não ao longo dos bivalentes. D-F) diplóteno sem cromossomo B. G-
I metáfase I com B parcialmente fosforilado e cromossomos A fosforilados apenas na
região proximal. J-L) metáfase II com B não fosforilado (seta) e cromossomos A
fosforilados na região proximal. Barra = 10 µm.
68
Figura 4. Imunodetecção de H3 fosforilada em diferentes bivalentes de C. strigilatum, com
fosforilação evidentemente na região proximal. Cromossomos corados com DAPI são
mostrados em vermelho e a imunodetecção da H3/ser10 em verde. As imagens na coluna
da direita representa a sobreposição das imagens das duas primeiras colunas. A-C)
bivalente metacêntrico com quiasmas terminais (setas). D-F) bivalente submetacêntrico
com a região do satélite não fosforilada (seta). G-I) bivalente submetacêntrico com
quiasma intersticial (seta). J-L) cromossomo B com braço curto fosforilado e o braço longo
parcialmente fosforilado.
69
Referências
BEUKEBOOM LW. 1994. Bewildering Bs: an impression of the 1st B-chromosome
conference. Heredity 73: 328-336.
CAMACHO JPM, SHARBEL TF, BEUKEBOOM LW. 2000. B-chromosome
evolution. Phil Trans R Soc Lond B 355:163–178.
FREGONEZI JN, ROCHA C, TOREZAN JMD, VANZELA ALL. 2004. The
occurrence of different Bs in Cestrum intermedium and Cestrum strigillatum (Solanaceae)
evidenced by chromosome banding. Cytogenetic and Genome Research 106: 184-188.
FREGONEZI JN, VILAS-BOAS LA; FUNGARO MHP, VANZELA ALL. 2007.
Distribution of Ty3/gypsy-like retroelements on the A and B chromosomes of Cestrum
strigilatum and C. intermedium (Solanaceae). Genetics and Molecular Biology. no prelo.
GONZALEZ-SANCHEZ M, GONZALEZ-GONZALEZ E, MOLINA F,
CHIAVARINO AM, ROSATO M, PUERTAS MJ. 2003 One gene determines maize B
chromosome accumulation by preferential fertilization; another gene(s) determines their
meiotic loss. Heredity 90: 122–12
GONZÁLEZ-SÁNCHEZ M, CHIAVARINO M, JIMÉNEZ G, MANZANERO S,
ROSATO M, PUERTAS MJ (2004): The parasitic effects of rye B chromosomes might
be beneficial in the long term. Cytogenetic and Genome Research 106:386-393
HENDZEL MJ, WEI Y, MANCINI MA., VAN HOOSER A, RANALLI T,
BRINKLEY BR, BAZETT-JONES DP, ALLIS C.D. 1997. Mitosis specific
phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin
during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome
condensation. Chromosoma 106: 348–360.
HOUBEN A, WAKO T, FURASHIMA-SHIMOGAWARA R, PRESTING G,
KUNZEL G, SCHUBERT I e FUKUI K. 1999. The cell cycle dependent phosphorylation
of histone H3 is correlated with the condensation of plant mitotic chromosomes. Plant
Journal 18: 675–679.
JONES N, HOUBEN A. 2003.B chromosomes in plants: escapes from de A chromosome
genome. Trends in Pant Science (8) 9: 417-421.
JONES RN, REES H. 1982. B chromosomes. New York: Academic Press.
KASZÁS E, CANDE WZ. 2000. Phosphorylation of histone H3 is correlated with changes
in the maintenance of sister chromatid cohesion during meiosis in maize, rather than the
condensation of the chromatin. Journal Cell Sci 113: 3217–3226.
MANZANERO S, ARANA P, PUERTAS MJ, HOUBEN A. 2000. The chromosomal
distribution of phosphorylated histone H3 differs between plants and animals at meiosis.
Chromosoma 109: 308_317.
PUERTAS MJ, GONZÁLEZ-SÁNCHEZ M, MANZANERO S, ROMERA F,
JIMÉNEZ MM. 1998.Genetic control of the rate of transmission of rye B chromosomes.
IV. Localization of the genes controlling B transmission rate. Heredity 80: 209–213.
70
SÝKOROVÁ E, YOONG LIM, FAKIJUS J, LEITIC AR. 2003. The signature of the
Cestrum genome suggests an evolutionary response to the loss of (TTTAGGG)
n
telomeres.
Chromosoma 112:164-172.
WEI Y, YU L, BOWEN J, GOROVSKY M.A, ALLIS C.D. 1999. Phosphorylation of
histone H3 is required for proper chromosome condensation and segregation. Cell 97: 99–
109.
71
CONCLUSÕES
1. A análise convencional reforçou que as espécies de Cestrum possuem estabilidade
cromossômica numérica com 2n=16 e núcleos interfásicos reticulados.
2. A análise por bandamento cromossômico, ao contrário, mostrou que os cariótipos
diferem consideravelmente quanto à ocorrência, distribuição e quantidade de bandas
entre as espécies aqui estudas, do mesmo modo como as descritas na literatura.
3. Os blocos heterocromáticos, independente de suas composições (ricos em AT, GC
ou neutros) exibiram distribuição eqüilocal e eqüidistante, com sítios preferenciais
de ocorrência, como por exemplo os dots intercalares e grandes blocos
intercalares/subterminais).
4. A hibridação in situ mostrou que o DNAr 45S ocorre preferencialmente nas regiões
terminais dos braços curtos, com variações no número, tamanho dos blocos e
cromossomos de ocorrência.
5. A hibridação in situ mostrou que o DNAr 5S ocorre preferencialmente na regiões
pericentromérica do par 8, exceto em C. capsulare.
6. O cromossomo B de C. strigilatum não obedeceu aos padrões mendelianos de
herança, sofrendo eliminação durante a microsporogênese. Este fato, associado à
elevada incidência de Bs nas progênies subseqüentes, sugere que a transmissão pode
ser preferencialmente materna.
7. A análise da fosforilação das histonas H3 na microsporogênese não indicou que
este evento está associado à eliminação dos Bs na transição da meiose I para a
72
meiose II, contudo, evidenciou que tanto os Bs quanto os cromossomos do
complemento A possuem um comportamento diferencial dos citados na literatura,
mostrando um possível papel secundário como sinalizadores para a cinética dos
cromossomos.
8. A presença dos Bs não interferiu na viabilidade dos grãos de pólen quando
comparados os indivíduos portadores e não portadores de Bs.
73
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BENKO-ISEPPON, A. M; MORAWETZ, W. Cold-induced chromosome regions and
karyosystematics in Sambucus and Viburnum. Bot. Acta n.106, pp.183-192, 1993.
BERG, C.; GREILHUBER, J. Cold-sensitive chromosome regions and their relation to
constitutive heterochromatin in Cestrum parqui (Solanaceae). Genome n 35: pp 921-930.
1992.
BERG C e GREILHUBER J. Cold-sensitive chromosome regions and heterochromatin in
Cestrum (Solanaceae): C. strigilatum, C. fasciculatum, and C. elegans. Plant Systematic e
and Evolution, n 185, pp133-151, 1993a.
BERG, C e GREILHUBER, J Cold-sensitive regions and heterochromatin in Cestrum
aurantiacum (Solanaceae). Plant Systematic and Evolution, n 185, pp 259-273, 1993b.
BERNARDELLO, L. M; ANDERSON, G. J Karyotypic studies in Solanum section
Basarthrum (Solanaceae). American. Journal of Botany n 77, v 3, pp 420-431, 1990.
BERNARDELLO, L. M; HEISER, C. B; PIAZZANO, M. Karyotypic studies in Solanum
section Lasiocarpa (Solanaceae). American. Journal of Botany. n 81, v 1, pp 95-103, 1994.
BEUKEBOOM, L. W. Bewildering Bs: an impression of the 1st B-chromosome
conference. Heredity n73, pp 328-336, 1994.
BRASILEIRO-VIDAL, A. C; BRAMMER, S; PUERTAS, M. J; ZANNATA, A. C;
PRESTES, A; MORAES-FERNANDES, M. I. B e GUERRA, M. Mitotic instability in
wheat×Thinopyrum ponticum derivatives revealed by chromosome counting, nuclear DNA
content and histone H3 phosphorylation pattern. Plant Cell Reports. v 24 , n3, pp 172-178,
2005.
CAMACHO J. P. M; SHARBEL T. F; BEUKEBOOM L.W: B-chromosome evolution. Phil
Trans R Soc Lond B 355, pp 163–178. 2000.
CARVALHO, L. A. F; SCHNOOR A. Sessea Carvalho et Schnoor – nova seção para o
gênero Cestrum (Solanaceae). Rodriguésia, 71-75(45-49), pp 15-24. 1993/97.
CAVALHEIRO, A. L.; TOREZAN, J. M. D; FADELI, L. Recuperação de áreas
degradadas: procurando por diversidade e funcionamento de ecossistemas. In A bacia do
rio Tibagi (eds M.E Medri, E. Bianchini, ºA Shibata & J.A. Pimenta), pp 213-214, Edição
dos editores, Londrina, 2002.
COBB, J; MIYAIKE, M; KIKUCHI, A; HANDEL, M. A. Meiotic events at the
centromeric heterochromatin: histone H3 phosphorylation, topoisomerase IIα localization
and chromosome condensation. Chromosoma 108, pp 412–425. 1999.
COSTA, J. Y. Estudos cariotípicos na família Alismataceae Vent. no Estado de São Paulo.
Mestrado em Ciências Biológicas na Área de Biologia Vegetal. IB-USP, 2002.
CRONQUIST, A. The Evolution and Classification of Flowering Plants. The New York
Botanical Garden, New York, 555 pp. 1988.
D’ARCY, W. G. The Solanaceae since 1976, with a review of its biogeography. In: Hawkes
JG, Lester RN, Nee M.and Estrada N (eds) Solanaceae III – Taxonomy, chemistry,
74
evolution. The Royal Botanic Garden and The Linnean Society of London, Kew, p 75-137,
1991.
DARLINGTON, C. D; LACOUR, L. Differential reactivity of the chromosomes. Ann. Bot.
n. s. 2, pp 615-625, 1938.
DUNAL, M. F. Solanaceae. In: A. de Candole .Prodr. Paris, v 13, n (1), pp 1-741, 1852.
FREGONEZI, J. N; ROCHA, C; TOREZAN, J. M. D; VANZELA A. L. L— The
occurrence of different Bs in Cestrum intermedium and Cestrum strigillatum (Solanaceae)
evidenced by chromosome banding. Cytogenetic and Genome Research, 106, pp 184-188,
2004.
FREGONEZI, J. N; FERNANDES, T; TOREZAN, J. M. D; VIEIRA, A.O e VANZELA
A. L. L. Karyotype differentiation of four Cestrum species (Solanaceae) based on physical
mapping of repetitive DNA. Gen Mol Biol, n 29 (1), pp. 97-104, 2006.
GERLACH, W. L; BEDBROOK, J. R. Cloning and characterization of ribosomal RNA
genes from wheat and barley. Nucleic Acids Research (7), pp 1869-1885, 1979.
GONZÁLEZ-SÁNCHEZ, M; CHIAVARINO, M; JIMÉNEZ, G; MANZANERO, S;
ROSATO, M; PUERTAS, M. J. The parasitic effects of rye B chromosomes might be
beneficial in the long term. Cytogenetic and Genome, 106, pp 386-393, 2004.
GONZALEZ-SANCHEZ, M; GONZALEZ-GONZALEZ, E; MOLINA, F;
CHIAVARIJNO, A. M; ROSATO, M; PUERTAS, M. J. One gene determines maize B
chromosome accumulation by preferential fertilization; another gene(s) determines their
meiotic loss. Heredity 90, pp 122–129, 2003.
GUERRA M: Patterns of heterochromatin distribution in plant chromosomes. Gen Mol
Biology 23, pp 1029-1041, 2000.
HANS, F. e DIMITROV, S.. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene 20,
pp 3021-3027, 2001.
HARBONE, J, B. Systematic Significance of Variations in defense Chemistry in the
Solanaceae. IN: D’ARCY, W. Solanaceae Biology and Systematics, New York, , pp 328-
345. 1991.
HAWKES, J. G; LESTER, R. N; NEE, M; ESTRADA, N. Solanaceae III – Taxonomy,
chemistry, evolution. Kew: The Royal Botanic Gardens/ The Linnean Society of London,
1991.
HENDZEL MJ et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily
within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion
coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma 106, pp 348-360, 1997.
HESLOP-HARRISON, J. S. Comparative Genome Organization in Plants: From Sequence
and Markers to Chromatin and Chromosomes. The Plant Cell, v. 12, pp 617–635, may,
2000.
HOUBEN, A; WAKO, T; FURUSHIMA-SHIMOGAWARA, R; PRESTING, G;
KÜNZEL, G; SCHUBERT, I; FUKUI, K. The cell cycle dependent phosphorylation of
histone H3 is correlated with the condensation of plant mitotic chromosomes. Plant
Journal. 18, pp 675–679. 1999.
75
HSU, J. Y; SUN, Z. W; LI, X; REUBEN, M; TATCHELL, K; BISHOP, D. K;
GRUSHCOW, J. M; BRAME, C. J; CALDWELL, J. A; HUNT, D. F; LIN, R; SMITH, M.
M; ALLIS, C. D. Mitotic phosphorylation of histone H3 is governed by Ipl1/aurora kinase
and Glc7/PP1 phosphatase in buddingyeast and nematodes. Cell, 102, pp 279-291, 2000.
HUNZIKER, A. T. South American Solanaceae; a synoptic survey. In: Hawkes, R. N.
Lester and A. D. Skelding [eds.], The Biology and Taxonomy of the Solanaceae, 7ed
Linnean Society Symposium Series. Academic Press, N.Y, pp 49-85, 1976.
HUNZIKER, A. T. The Genera of Solanaceae. Alemanha:b A.R.G Kommanditgeselschaft,.
497 pp, 2001.
JACKSON, R. C. e NEWMARK, K. P. Effects of supernumerary chromosomes on
production of pigment in Haplopappus gracilis. Science 132, pp 1316-1317, 1960.
JONES, N; HOUBEN, A. B chromosomes in plants: escapes from de A chromosome
genome. Trends in Pant Science, vol 8, no 9, pp 417-421, 2003.
JONES, R. N. Are B chromosomes selfish? In: The evolution of genome size. ed. T.
Cavalier-Smith, pp. 397-425.London:Wiley, 1985.
JONES, R. N; REES, H. B chromosomes. New York: Academic Press. 1982.
JUDD, E.S. et al. Plant Systematics: a phylogenetic approach. Massachusetts U.S.A:
Sinauer Associates, 1999.
KANNAP, S. Tobacco to tomatoes: a phylogenetic perspective on fruit diversity in the
Solanaceae. Journal of Experimental Botany. V 53, n 337, pp 2001-2022, 2002.
KANNAP, S; BOHS, L; NEE, M; SPOONER, D. M. Solanaceae – a model for linking
genomics with biodiversity. Comparative and Functional Genomics. v 5, pp 285-291.
2002.
KASZÁS, E; CANDE, W. Z. Phosphorylation of histone H3 is correlated with changes in
the maintenance of sister chromatid cohesion during meiosis in maize, rather than the
condensation of the chromatin. J. Cell Sci. 113, pp 3217-3226, 2000.
LAS PENAS, M. L; CHIARINI, F. E; BERNARDELLO, G; BENÍTEZ DE ROJAS, C.
Karyotypes of some species of Cestrum, Sessea, and Vestia (tribe Cestreae, Solanaceae).
Caryologia 59, pp 131-137, 2006.
MANZANERO, S; ARANA, P; PUERTAS, MJ; HOUBEN, A. The chromosomal
distribution of phosphorylated histone H3 differs between plants and animals at meiosis.
Chromosoma 109, pp 308-317, 2000.
MIAO, V. P; COVERT, S. F; VANETTEN, H. D. A fungal gene for antibiotic resistance
on a dispensable B chromosome. Science 254, pp 1773-1776, 1991.
MOSCONE, E. A. Estudios de cromosomas meióticos en Solanaceae de Argentina
Darwiniana, 31: pp 261-297, 1992.
MOSCONE, E. A.; LAMBROU, M; HUNZIKER, T; EHRENDORFER, F. Giemsa C-
banded karyotypes in Capsicum (Solanaceae). Pl. Syst. Evol. n.186, pp 213-229, 1993.
76
NEVES, N; DELGADO, M; SILVA, M; CAPERTA, A; MORAIS-CECÍLIO, L;VIEGAS,
W. Ribosomal DNA heterochromatin in plants. Cytogenet Genome Res 109, pp 104–111.
2005.
NOWAK, S. J. e CORCES, V. G. Phosphorylation of histone H3 of Chromosomes in
Trillium, J. Genet., pp 19-40, 2000.
ÖSTERGREN, G.. Parasitic nature of extra fragment chromosomes. Bot. Notiser, 2, pp
157-163, 1945.
PILLEN, K; PINEDA, O; LEWIS, C.B; TANKSLEY, S. D. Status of genome mapping
tools in the taxon Solanaceae. In Genome mapping in plants. Edited by A.H. Paterson. R.G.
Landes Company, Austin, Texas, pp 281–308, 1996.
POZZOBON, M. T; SCHIFINO-WITTMANN, M. T; BIANCHETTI L. B Chromosome
numbers in wild and semidomesticated Brazilian Capsicum L. (Solanaceae) species: do
x=12 and x=13 represent two evolutionary lines? Botanical Journal of the Linnean Society
151 (2), pp 259–269, 2006.
PRIGENT, C.L e DIMITROV, S. Phosphorylation of serine 10 in histone H3, what for?
Journal of Cell Science 116, pp 3677-3685, 2003.
PUERTAS, M. J; GONZALEZ-SANCHEZ, M; MANZANERO, S; ROMERA, F;
JIMÉNEZ, M. M. Genetic control of the rate of transmission of rye B chromosomes. IV.
Localization of the genes controlling B transmission rate. Heredity 80, pp 209–213, 1998.
RODDICK, J.G. The Importance of the Solanaceae in Medicine and Drug Therapy. In:
Hawkes JG, Lester RN, Nee M. and Estrada N (eds) Solanaceae III – Taxonomy, chemistry,
evolution. The Royal Botanic Garden and The Linnean Society of London, Kew, pp 7-20,
1991.
SÁ, K. L. V. R. A família Solanaceae Juss. Espécies arbóreo/arbustivas na bacia do rio
Tibagi-Pr. Monografia de Bacharelado em Ciências Biológicas, UEL, 2002.
SCHIMIDT, T e HELSOP-HARRISON, J.S. Genomes, genes and junk: the large scale
organization of plant chromosomes. Trends in Plant Science, v3, n5, 1, pp. 195-199, 1998.
SCHULTES, R. e RAFFAUF, R. F. Phytochemical and Ethnopharmacological Notes on
the Solanaceae of the Northwest Amazon. In: Hawkes JG, Lester RN, Nee M.and Estrada
N (eds) Solanaceae III – Taxonomy, chemistry, evolution. The Royal Botanic Garden and
The Linnean Society of London, Kew, pp 25-49. 1991.
SCHWARZACHER, T. DNA, chromosomes, and in situ hybridization. Genome, v 46, pp
953-962, 2003.
SHARMA, A e SEN, S. Chromosome Botany Science. Calcutá, Índia, Science Publishers,
Inc, 115 pp., 2002
SMITH LB e DOWNS RJ. Solanáceas. In: Reitz PR (ed) Flora Ilustrada Catarinense.
Biblioteca Superior de Cultura, Itajaí, pp. 321. 1966
STAUB, R.W. Leaf striping correlated with the presence of B chromosomes in maize. J.
Hered. 78, pp 71-74. 1987.
77
SÝKOROVÁ E., LIM KY., CHASE M. W., KNAPP S, LEITCH I. J, LEITCH A. R,
FAJKUS J. The absence of Arabidopsis-type telomeres in Cestrum and closely related
genera Vestia and Sessea (Solanaceae); first evidence from eudicots. Plant Journal, v34: pp
283–291, 2003a
SÝKOROVÁ E.; YOONG LIM., FAKIJUS J., LEITIC A. R. The signature of the Cestrum
genome suggests an evolutionary response to the loss of (TTTAGGG)
n
telomeres.
Chromosoma. 112: 164-172, 2003b.
VAN DER PIJL, L. Principles of Dispersal in higher plants. 2 ed, Springer Verlag, Berlin,
pp 214, 1982.
WEI, Y., YU, L., BOWEN, J., GOROVSKY, M.A. e ALLIS, C.D.. Phosphorylation of
histone H3 is required for proper chromosome condensation and segregation. Cell 97, pp
99-109, 1999.
WHITE, M.J.D. Animal Cytology and Evolution. 3rd ed. Cambridge Univ. Press, London.
1973.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
