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UNIVERSIDADEESTADUALPAULISTA
INSTITUTODEBIOCIÊNCIAS
Luiz Ricardo de Souza Paiva
CITOGENÉTICADEPOPULAÇÕESDESerrapinnus
notomelas(CHARACIDAE:CHEIRODONTINAE)DA
BACIADORIOTIE
TÊ
MESTRADO
__________________________________________________________________
Botucatu-SP
2007
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UNIVERSIDADEESTADUALPAULISTA
INSTITUTODEBIOCIÊNCIAS
CITOGENÉTICADEPOPULAÇÕESDESerrapinnusnotomelas
(CHARACIDAE:CHEIRODONTINAE)DABACIADORIOTIETÊ
LuizRicardodeSouzaPaiva
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Instituto de Biociências da Universidade
Estadual Paulista,CampusdeBotucatu, como
partedosrequisitosparaObtençãodotítulode
Mestre Ciências Biológicas, Área de
ConcentraçãoZoologia.
OrientadorProf.Dr.FaustoForesti
__________________________________________________________________
Botucatu-SP
2007
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i
Dedico este trabalho as duas mulheres excepcionais em minha
vida, Abádia (minha mãe) e Greicy (minha esposa), sem deixar de
mencionar Paulo (meu pai) o grande incentivador e finaciador de
minha estada em Botucatu, e não menos importante Junior e
Alessandro (meus irmãos)!
ii
AGRADECIMENTOS
A mais umgrão de areia depositado na ampulheta que marca o tempo de
minha vida, gostaria de agradecer as inúmeras pessoas que tornaram possível a
minhaformaçãodecaráter,integridadeeconhecimento:
- Ao programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas A/C Zoologia do
IBB-Botucatu e ao Laboratório de Biologia e Genética de Peixes pela excelente
estruturaecondiçõesderealizaçãodestetrabalho.
- À Fapesp e ao CNPq, por possibilitar a aquisição de equipamentos e
materiais de consumo, para o bom andamento dos trabalhos desenvolvidos no
LaboratóriodeBiologiaeGenéticadePeixes;
-AomeuOrientadorProf.Dr.FaustoForesti,pelaconfiançaeoportunidade
concedida a mim,e questionamentose elucidações que possibilitaramumgrande
avançoemminhaformaçãoacadêmica,esperosinceramenteque:“apartirdeagora
elepossamedarasuabicicletinhaparaeutomarconta”;
- Ao Prof. Dr. Horácio Ferreira Júlio Júnior, por dar a oportunidade e base
citogenéticanecessáriaparaqueeupudessechegaratéaqui;
- Ao Prof. Dr. Cláudio Oliveira por ser também meu orientador (não
formalmente)epelaspiadasnocafé,corredor,laboratórios...;
- Ao Prof. Dr. César Martins pela válida contribuição durante o
desenvolvimentodemeutrabalhoe“pornãomedarumacanetada”;
-AProfa.Dr.AdrianePintoWascopelacolaboraçãoediscussãoduranteo
desenvolvimentodestetrabalho;
-AosProf.Dr.MariodePinnaeProf.Dr.RicardoBenninepelaidentificação
dosexemplarescoletados;
-AostécnicosRenatoDevidé,Ricardo,ZéEduardo,DonaTerezinhaeDona
Iolandaquetrabalhamduroparadeixartudoprontoearrumadonoslaboratóriose
departamentoparanóspós-graduandos;
- A Secretária dos departamentos de Morfologia e Histologia Luciana pela
prontaatençãoquandorequisitada;
-Obrigadoespecial àsamigasIraniAlvesFerreiraeTatianeMariguela,por
meensinaremFISH,ExtraçãodeDNA,Sequenciamento,......;
iii
-AsamigasdecoraçãoCíntiaKarenBulla(Cintiatusextressatus)eFernanda
Aparecida Cassemiro (Xakireatus hidrofobicus), por estarem comigo nos bons e
mausmomentos(Maringá);
-AoamigoAndersonLuisAlvespormemostraredirecionarocaminhoparao
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes e me indicar ao Prof. Dr. Fausto
Foresti;
- As recém amigas botucudas Patrícia Elda Sobrinho Escudeler e Lígia
Carolina Corazza Quessada Bassetto, obrigado pela imensa ajuda durante meu
período de adaptação a Botucatu, bem como auxiliar no desenvolvimento desta
dissertação;
-AosamigosqueficaramemMaringátorcendopormim:AnaPaula,Leandro,
Fernanda, Kátia, Edner, Gislaine, Gisele Fidelis, Gisele Lacanalo, Valéria e
Cléverson,AnaCristinaPetri;
-AomeuirmãodecoraçãoDr.EdsonFontes,obrigadopormeproporcionaro
gosto pela pesquisa, pelo método científico, pela investigação científica, com
princípioscalcadosnaéticaeresponsabilidade;
- Aos Professores Harumi I. Suzuki, Elaine Antoniasi, Erasmo Renesto,
Cláudio H. Zawadski, Élio Conti, Walter Della Rosa, Erivelto Goulart, Ismar
Mosqueta, Isabel Cristina Martins Santos, Ana Luiza Britto Portela Castro, Edmir
Carvalho, Silvia R. Rogatto, por estarem disponíveis e presentes quando me
surgiamdúvidasdasmaisdiversas;
-AosColegasdeLaboratóriodoIBB-UNESP:Heraldo,Kelly,Daniela,Karina,
Prof. Celso, Waldo, Conrado (vulgo Fernando), Kátia, Danillo, Emanuel, Adréia
Alves, Andréia Poletto, João Paulo, Marisa, Alex, Fernanda, Daniela, Cristiane,
Eleno,JoãoPaulo,Gisleine,Guilherme,Gleisy,Jefferson,Luiz,Marina,Juliana;
-Atodosaquelesqueporalgummomentoestiverampresenteemminhavida.
iv
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS........................................................................................................................................II
RESUMO GERA ..................................................................................................................................................1
1 INTRODUÇÃO GERAL..................................................................................................................................2
1.1
S
UBFAMÍLIA
C
HEIRODONTINAE
.......................................................................................................................2
1.2
-
O
G
ÊNERO
S
ERRAPINNUS
................................................................................................................................3
1.3
B
REVE
H
ISTÓRICODA
C
ITOGENÉTICADE
P
EIXES
..........................................................................................3
1.4
-
C
ITOGENÉTICADE
C
HEIRODONTINAE
...........................................................................................................4
1.5
-
R
EGIÕES
O
RGANIZADORASDE
N
UCLÉOLOE
DNA
R
45S..............................................................................5
2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS....................................................................................................................8
3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................................10
3.1
O
BTENÇÃODECROMOSSOMOSMITÓTICOS
...................................................................................................10
3.2
C
ARACTERIZAÇÃODASREGIÕESHETEROCROMÁTICASPOR
B
ANDAMENTO
C............................................13
3.3
D
ETECÇÃODASREGIÕESORGANIZADORASDENUCLÉOLOS
(RON
S
),
ATRAVÉSDEIMPREGNAÇÃOCOM
NITRATODE
P
RATA
...............................................................................................................................................13
3.4
O
BTENÇÃODASONDA
DNA
R
18S...................................................................................................................14
3.4.1Marcaçãodasonda......................................................................................................................................14
3.4.2Tratamentodaslâminas...............................................................................................................................15
3.4.3Soluçãodehibridação..................................................................................................................................15
3.4.4Hibridação....................................................................................................................................................16
3.4.5Lavagens.......................................................................................................................................................16
3.4.6Detecçãoeamplificaçãodosinaldasonda.................................................................................................16
3.5
P
ROCESSAMENTODASIMAGENS
.....................................................................................................................17
4 RESULTADOS ................................................................................................................................................18
CAPÍTULO I .......................................................................................................................................................20
R
ESUMO
.................................................................................................................................................................20
I
NTRODUÇÃO
.........................................................................................................................................................21
M
ATERIALE
M
ÉTODOS
........................................................................................................................................22
R
ESULTADOS
.........................................................................................................................................................24
S
ERRAPINNUSNOTOMELAS
-
POPULAÇÃODORIO
P
IRIQUITO
(
BACIADORIO
S
ÃO
J
OSÉDOS
D
OURADOS
) ...........24
S
ERRAPINNUSNOTOMELAS
-
POPULAÇÃODORIO
P
ARAITINGUINHA
(
BACIADO
R
IO
T
IETÊ
) ................................24
S
ERRAPINNUSNOTOMELAS
-
POPULAÇÃODO
R
ECANTODOS
C
AMBARÁS
(
BACIADORIO
P
ARANAPANEMA
)........25
D
ISCUSSÃO
............................................................................................................................................................31
R
EFERÊNCIAS
........................................................................................................................................................37
CAPÍTULO II......................................................................................................................................................42
R
ESUMO
.................................................................................................................................................................42
I
NTRODUÇÃO
.........................................................................................................................................................43
M
ATERIALE
M
ÉTODOS
..........................................................................................................................................44
R
ESULTADOS
.........................................................................................................................................................44
S
ERRAPINNUSNOTOMELAS
-
POPULAÇÃODORIO
T
IETÊ
(S
ALESÓPOLIS
-SP).........................................................44
S
ERRAPINNUSNOTOMELAS
-
POPULAÇÃODORIO
C
APIVARA
(B
OTUCATU
-SP)......................................................46
S
ERRAPINNUSNOTOMELAS
-
POPULAÇÃODOCÓRREGO
C
AMPO
N
OVO
(B
AURU
-SP)............................................46
D
ISCUSSÃO
............................................................................................................................................................53
R
EFERÊNCIAS
........................................................................................................................................................61
5 DISCUSSÃO E CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................................65
6 REFERÊNCIAS GERAIS ...............................................................................................................................67
Paiva, LRS Introdução
1
ResumoGeral
Os Cheirodontinaeformamum grupo monofilético de pequenospeixescom
duas tribos reconhecidas, Cheirodontini e Compsurini, sendo caracterizados pela
combinaçãodeumgrupodecaracteresqueenvolvemformadosdentes,cobertura
muscular sobre a região anterior à bexiga natatória e padrão de cores na região
umeral.Distribuem-seamplamentenaregiãoNeotropicalocorrendodesdeosuldo
México até a Argentina. No presente trabalho foram analisados exemplares de
Serrapinnus notomelas provenientesdeseis diferenteslocalidades da região leste
dabaciadoaltorioParaná,noEstadodeSãoPaulo,Brasil.Todososexemplares
capturados apresentaram número diplóide de 2n=52 cromossomos, com poucas
variações quanto à fórmula cariotípica, indicando uma tendência conservadora do
número diplóide da espécie. Porém, o mesmo não parece ocorrer em relação à
macro-estrutura cromossômica e à micro-estrutura cariotípica, sendo detectadas
diversas alterações com o uso da técnica de bandamento C, bem como quando
aplicada a técnica de impregnação pela Prata para identificação das regiões
organizadoras nucleolares, confirmada pelaaplicação da técnicade hibridação “in
situ”fluorescente(FISH)utilizandosondadeDNAr18S.Sãodiscutidososprováveis
eventosderearranjoscromossômicosenvolvidosnadiferenciaçãodestegrupo,bem
como as características citogenéticas limítrofes entre indivíduos destes ambientes
quepodemdarinícioaoestabelecimentodenovasespécies.
Paiva, LRS Introdução
2
1IntroduçãoGeral
1.1SubfamíliaCheirodontinae
AsubfamíliaCheirodontinaeéumcladopresentenosCharacidaeredescrito
recentemente por Malabarba (1998), sendo considerado monofilético e
compreendendo 23 gêneros, dos quais seis forram apresentados como gêneros
novos. Segundo este autor a monofilia do grupo é suportada pela presença
combinada de quatro caracteres, sendo que três destes são representados pela
forma dos dentes (pentacuspidado e pedicelado), um pela da cobertura muscular
anterioràbexiganatatória,queestáausenteformandoumpseudo-tímpanoeoutro
relacionadoaopadrãodecoresdaregiãoumeralquesãoexclusivosdestegrupo,
sendoquenenhumoutroCharacidaepossuitaiscombinações.
A subfamíia Cheirodontinae é subdividida em duas tribos, Cheirodontini e
Compusurini, sendo o gênero Serrapinnus pertencente à tribo Cheirodontini, com
base principal em caracteres relacionados ao dimorfísmo sexual secundário
observadonosraiosprocorrentesventraisdanadadeiracaudaleraiosdanadadeira
anal dos machos (Malabarba et al, 1998). Malabarba (1998) descreve que
Cheirodontinaecomoumgrupodepeixesdepequenoporte,nãomigradoreseque
temcomomecanismoreprodutivoaoviparidadenoqualomachofecundaafêmea,
porém o desenvolvimento embrionário é externo. não são migradores e são de
pequeno porte. Vazzoler (1996) descreve que a este tipo de comportamento
(oviparidade) está relacionado às características particulares dos peixes não
migradores que apresentam cuidado parental e estratégia reprodutiva do tipo r.
Estas características dificultam o fluxo gênico entre as diferentes populações,
tornando os estudos citogenéticos populacionais importantes quando se trata de
estudar aspectos relacionados à conservação genética em peixes. A tribo
CheirodontiniincluiosgênerosCheirodon(comseisespécies),Spintherobolus(com
Paiva, LRS Introdução
3
quatro espécies), um characideo fóssil, † Megacheirodon unicus, Nanocheirodon
(uma espécie), Heterocheirodon (uma espécie), Serrapinnus (sete espécies) e um
novogênero.
1.2-OGêneroSerrapinnus
A denominação do gênero Serrapinnus (do Latim serra= disse e pinna=
nadadeira) é dadaemreferência àformapeculiardosraios da nadadeira anal do
machoquandomaduro,descritocomonovoparaasubfamíliaCheirodontinae,antes
abrangendo apenas os gêneros Cheirodon, Odontostilbe e Holoshesthes para os
RiosAmazonas,SãoFrancisco,Paraná-Paraguai-Uruguaiedrenagenscosteirasdo
Brasil (Malabarba, 1998). São peixes de pequeno porte entre 30mm e 60mm de
comprimentomáximo,habitamambientesvariáveisdelênticosasemi-lóticoseestão
aparentemente distribuídos geograficamente em localidades da América Central,
AméricadoSuleregiõescosteiras.
1.3BreveHistóricodaCitogenéticadePeixes
Os estudoscitogenéticos no grupo de peixes tiveram um grandeimpulso a
partirdadécadade60,principalmenteapósapublicaçãodotrabalhodeMcphaile
Jones (1966), formulando a técnica de suspensão celular para obtenção de
cromossomos mitóticos em peixes. Stewart e Lewis (1968) descreveram que a
aplicaçãodatécnicapropostaapresentavaalgumasdesvantagens,comreferênciaà
visualizaçãodoscromossomos(possívelsomentesobobservaçãoemcontraste-de-
fase) e à conservação do material, o qual deveria ser mantido em baixas
temperaturas. Dessa forma propuseram que o material deveria ser fixado em
etanol/ácidoacéticoecoradocomGiemsa.KligermaneBloom(1976)descreveram
outrométodoparaobtençãodecromossomosmitóticosquandosoluçãohipotônica
(KCl)foi empregandapela primeira vezcomeficiência,paramelhorar a dispersão
dos cromossomos. No Brasil Cestari (1973), Bertollo et al. (1978) e Foresti et al.
(1981;1993),descreverammetodologiasparaobtençãodecromossomosmitóticos,
Paiva, LRS Introdução
4
os quais foram adaptados para peixes e passaram a proporcionar excelentes
resultados,sendoempregadascomorotinaatéopresentemomento.Estesautores
impulsionaram a realização de muitos trabalhos de citotaxonomia dos peixes
neotropicais.Contudo,apesardodesenvolvimentodestaáreaousodastécnicasde
bandamentocromossômicoclássicoemcromossomosdepeixeséaindarestrito.
Vários autores relatam que são conhecidos os números diplóides e/ou
haplóidesde706espéciesdepeixesdistribuídasem207gênerose38famílias,o
querepresentaaproximadamente22%dasespéciesjáidentificadas,deocorrência
na região Neotropical (Almeida-Toledo et al, 2000, Oliveira et al, 2000). Segundo
Almeida-Toledoetal(2000)avariabilidadeempeixesneotropicaiséextraordinária
quantoaonúmeroefórmulacromossômica,sendoencontradosnúmerosdiplóides
que variam desde 2n=20 cromossomos em Pterolebias longipinnis a 2n=134
cromossomos em Corydoras aeneus. Outras características citogenéticas dos
representantes deste grupo são a presença de cromossomos supranumerários,
heteromorfismo ligado ao sexo, além de outros tipos de polimorfismo. Também é
comumaocorrênciadegruposcompoucavariaçãononúmerodiplóide,sendopor
isso denominados conservados, como os Parodontidae, Prochilodontidae,
Chilodontidade, além de outros Characidae que possuem o número diplóide de
2n=54 cromossomos na maioria das espécies já estudadas. Outras variações
envolvem a ocorrência de poliploidia (Corydoras cf. simulatus), a identificação de
híbridos naturais (Eigenmannia) e de polimorfismos das regiões organizadoras de
nucléolos.
1.4-CitogenéticadeCheirodontinae
OsdadoscitogenéticosdisponíveisparaosrepresentantesdeCheirodontinae
sãoescassos,efrequentementerepresentadosapenaspelaidentificaçãodonúmero
diplóide de alguns gêneros como Cheirodon, Paracheirodon, Odontostilbe e
Holoshestesdestegrupocom2n=52cromossomos(Oliveira,etal.1988,Nishiyama
e Santos, 1995 e Wasko et al, 2001). Nenhuma descrição das características
Paiva, LRS Introdução
5
cromossômicascom aplicaçãode técnicas de bandamentosfoi apresentadaatéo
presente.Waskoetal(2001)discutemaexistênciadeumpossívelmecanismode
determinação sexual do tipo ZZ/ZW nas espécies Odontostilbe paranensis e
Holoshestes heterodon, sendo a última reconhecida agora por Malabarba (1998)
como Serrapinnus heterodon. No presente trabalho, foram realizadas análises
citogenéticas em exemplares de S. notomelas capturados em seis diferentes
localidadesdasbaciashidrográficasdosprincipaisriosdoestadodeSãoPaulo(rio
Tietê, Rio Paraitinguinha, rio Capivara, córrego Campo Novo, rio Piriquito, rio
Paranapanema). Com o objetivo de caracterizar cromossômicamente a espécie
Serrapinus notomelas e verificar se oisolamentogeográficopoderia influenciar na
estrutura cariotípica de exemplares identificados como pertencentes à mesma
espécie,utilizou-secoloraçãoconvensionalcomGiemsa,técnicasdebandeamento
cromossômicoclássico(bandeamentoCedetecçãoderegiõesAg-NORpositivas)e
decitogenéticamolecular(FISH“hibridação‘insitu’fluorescente)comutilizaçãode
sondaDNAr18S.
1.5-RegiõesOrganizadorasdeNucléoloeDNAr45S
Emeucariotossuperiores,osgenesRNAribossômicos(RNAr)encontram-se
organizados como duas famílias multigênicas distintas, representadas pelo DNAr
45S e pelo DNAr 5S e compostas por unidades repetidas “em tandem”, com
centenasamilharesdecópias(Long&David1980;MartinseGaletti,2004).
O DNAr 45S consiste de unidades transcricionais que codificam os RNAs
ribossômicos 18S, 5.8S e 28S, separadas por espaçadores internos transcritos
(ITS1eITS2)eflanqueadasporespaçadoresexternostranscritos(ETS1eETS2)e
não-transcritos (NTS) (Long & David 1980). Múltiplas cópias destas unidades
correspondem às regiões organizadoras de nucléolos (RONs). Diversos trabalhos
têm demonstrado que várias espécies de peixes apresentam somente dois
cromossomosportadoresderegiõesorganizadorasdenucléolos(Galettietal.1984;
Venere & Galetti 1989; Pauls & Bertollo 1990; Martins & Galetti 1997), enquanto
Paiva, LRS Introdução
6
outras possuem múltiplos cromossomos portadores de RONs (Foresti et al. 1989;
Sola et al. 1990, 1992; Wasko & Galetti 1999, Paintner-Marques et al, 2002,
Gromichoetal,2005).
Como as regiões organizadoras de nucléolos podem constituir excelentes
marcadores citogenéticos em peixes (e.g. Galetti et al. 1984), estas têm sido
comumentedetectadasemváriasespéciesutilizandocoloraçãocomnitratodePrata
(Ag-NOR), mitramicina (MM) ou cromomicina A
3
(CMA
3
) (Amemiya & Gold 1986;
Phillipsetal.1989;Galetti&Rasch1993;Solaetal.1997).Acoloraçãocomnitratode
Prata tem sido a técnica mais utilizada em estudos de localização das regiões
organizadorasdenucléolos,emboraestadetectesomenteRONstranscricionalmente
ativas (Goodpasture & Bloom 1975; Hofgatner et al. 1979; Howell & Black 1980;
Rousseletal,1996;Zuritaetal,1998;Paintner-Marquesetal,2002;Gromichoetal,
2004). Os fluorocromos GC-específicos (MM, CMA
3
), ao contrário, podem detectar
tantoregiõesdeRONsativasquantoinativasempeixeseanfíbios(Mayretal.1986;
Schmid & Guttenbach 1988; Phillips & Hartley 1988), provavelmente como
conseqüênciadomaiorconteúdodebasesGCnoDNAr(Schmid&Guttenbach1988).
Contudo,investigaçãorealizadaporGromichoetal.(2005)revelaramquenemsempre
regiõesmarcadasporfluorocromoscorrespondemasegmentosdoDNAresponsáveis
pela transcrição de rRNA. Mais recentemente, a localização das regiões
organizadoras de nucléolos tem sido confirmada com precisão pela aplicação de
técnicadehibridação“insitu”fluorescente(FISH),utilizandosondasdeRNAroude
DNAr18Se28Semcromossomosfixadosdeváriosvertebrados,incluindoanfíbios,
mamíferos(Long&David1980)epeixes(Pendásetal.1993a,b;Castroetal.1996;
Viñasetal.1996;Abuínetal.1996;Martínezetal.1996;Gornungetal.1997,Martins
& Galetti 1998; Fischer et al. 2000; Mantovani et al. 2005; Gromicho et al. 2005;
Gromichoetal,2006),entreoutros.
Apesar da potencialidade da utilização dos DNAs ribossômicos como
marcadores em peixes, a maioria dos dados de localização cromossômica dos
genes RNA ribossômicos maiores (RNAr 45S) e menores (RNAr 5S), através de
Paiva, LRS Introdução
7
hibridação “in situ” fluorescente, refere-se principalmente a espécies de
Salmoniformes (Pendás et al.1993a,b; Almeida-Toledoet al, 2002;Morán et al.
1996;Abuínetal.1996;Fujiwaraetal.1998;Sajdaketal.1998)eacaracterização
da seqüência nucleotídica do DNAr 5S também restringe-se a poucas espécies
(Pendásetal.1995;Sajdaketal.1998;Martinsetal.2000;Almeida-Toledoetal,
2002).Assim,aampliação deestudosenvolvendoestesmarcadoresem espécies
de peixes neotropicais mostra-se de grande interesse, tanto para ampliar
conhecimentos sobre estes segmentos de DNA repetitivos, quanto pela sua
utilizaçãocomoelementosreveladoresdasalteraçõesestruturaisnoscromossomos
eseupapelnoprocessodediversificaçãodasespécies.
Paiva, LRS Justificativa e Objetivos
8
2JustificativaeObjetivos
SegundoMalabarba(1998),asubfamíliaCheirodontinaeésubdividida
em duas tribos, Cheirodontini e Compusurini, sendo o gênero Serrapinnus
pertencenteàtriboCheirodontini.EstatriboincluiaindaosgênerosCheirodon(com
seis espécies), Spintherobolus (com quatro espécies), um characideo fóssil, †
Megacheirodon unicus, Nanocheirodon (uma espécie), Heterocheirodon (uma
espécie),Serrapinnus(seteespécies)eumnovogênero.Sãodeampladistribuição
geográfica,ocorrendodesdeosuldoMéxicoatéoRioGrandedoSul.Osestudos
citogenéticos deste grupo são escassos quando comparados a peixes de grande
porte.Apósextensivarevisãobibliográfica,foramencontradosapenastrêstrabalhos
referentesaestudoscromossômicosparaasub-famíliaCheirodontinae,otrabalho
de Oliveira et al. (1988), Nishiyama e Santos (1995) e Wasko et al. (2001) onde
foramcariotipadosexemplaresdosgênerosCheirodon,OdontostilbeeHoloshestes.
Devido à grande distribuição geográfica e o poucos dados citogenéticos, foi
realizado o estudo citogenético da espécie Serrapinnus notomelas buscando
entender a macro-estrutura cariotípica dos exemplares coletados em diferentes
localidades,bemcomorelacioná-lasàdistribuiçãodaspopulaçõesanalisadas,com
afinalidadedecontribuircomasinformaçõesquepossamauxiliarnacompreensão
dos mecanismos envolvidos na diversificação cariotípica e nos processos de
especiaçãonestegrupodepeixes.
Com base na constatação da necessidade de informação sobre os
componentes deste grupo,foramrealizadasinvestigações sobreascaracterísticas
citogenéticasdeSerrapinnusnotomelas,tendoporobjetivoespecífico:
a) caracterizar cariotipicamente, diferentes populações de S. notomelas de três
diferentesbaciasquecompõeoladolestedabaciadoaltorioParaná(baciado
rio Tietê, com quatro localidades amostradas: rios Tietê e Paraitinguinha
Paiva, LRS Justificativa e Objetivos
9
(Salesópolis-SP);RioCapivara(Botucatu-SP);CórregoCampoNovo(Bauru-SP);
Rio Piriquito (bacia do rio São José dos Dourados – Poloni-SP); Recanto dos
Cambarás(baciadorioParanapanema–RioParanapanema).
b) identificaratravésdetécnicasdebandeamentoclássicoemolecular,marcadores
quepossamfornecerinformaçõescomparativasentreasdiferentespopulações;
c) compreender quais os mecanismoscromossômicos envolvidosno processode
especiação;
d)contribuircominformaçõescitogenéticasparaoestabelecimentodasrelaçõesas
diferentes amostras desta espécie de peixe e dos prováveis mecanismos de
especiação envolvidos no processo de sua diversificação.
Paiva, LRS Material e Métodos
10
3MaterialeMétodos
NopresentetrabalhoforamcapturadosexemplaresdaS.notomelas(Figura
1)relacionadosnaTabela1,emseislocalidadescorrespondentesa componentes
dasbaciashidrográficasdosriosTietê,SãoJosédosDouradoseParanapanema:
rio Tietê (Salesópolis-SP); rio Paraitinguinha (Salesópolis-SP); rio Capivara
(Botucatu-SP);córregoCampoNovo(Bauru-SP);rioPiriquito(BaciadorioSãoJosé
dosDourados–Poloni-SP);RecantodosCambarás(rioParanapanema–Itatinga)
(Figura2).Osanimaisforamtransportadosvivos paraoLaboratóriodeBiologiae
Genética de Peixes/IBB/UNESP e mantidos em aquários aerados até serem
sacrificadosparaobtençãodecromossomoseparacoletadeamostrasdetecidos,
paraaplicaçãodetécnicasdeestudosmoleculares.ParaextraçãodeDNA,foram
coletadasamostrasdefígadoedenadadeiracaudal,queforamfixadoseestocados
emetanol100%.
3.1Obtençãodecromossomosmitóticos
Para a obtenção de cromossomos mitóticos foi utilizada a técnica descrita por
Egozcue (1971) e por Cestari (1973), e posteriormente utilizada em peixes por
Forestietal.(1981,1993).Ametodologiaconsisteem:
a) injetarsoluçãoaquosadecolchicina0,025%(naproporçãode1ml/100gdepeso
do animal) intra-abdominalmente nos animais com uma seringa, entre as
nadadeiras peitorais e ventrais. Deixá-lo nadando livremente por 40 minutos.
Estetempofoipadronizadoparaasespéciesanalisadas;
b) sacrificaroanimalpararetiradadorim,(regiãoanterior),comoauxíliodetesoura
epinças;
c) colocarotecidoretiradoemplacadePetricontendo7mldesoluçãohipotônica
(KCL0,075M);
Paiva, LRS Material e Métodos
11
Figura1-ExemplardeSerrapinnusnotomelas.
d) dissociar o material, procurando obter uma suspensão de células. Para tal,
primeiro deve-se dissociar o material com pinças de ponta fina, depois,
homogeneizarcomoauxíliodeumapipetaPasteur;
e) transferirasoluçãoobtidaparaumtubodecentrífugaemanteremestufaa37ºC,
durante21minutos;
f) retirar a suspensão celular da estufa, colocar 7 gotas de solução fixadora
(metanol e ácido acéticona proporção de 3:1, respectivamente) gelada. Agitar
levementeamisturacomoauxíliodeumapipetaPasteur.Deixaremrepousopor
5minutosàtemperaturaambiente;
g) adicionarcercade6mldofixador,novamenteagitaramistura.Levaràcentrífuga
1000rpmpor10minutos;
h) retirarosobrenadanteeressupenderoprecipitadoem6mldefixador.Centrifugar
por7minutosa1000rpm;
i) repetiroitemhpor2ou3vezes;
j) pingaromaterialemlâminasesecá-lasaoarlivre.
Paiva, LRS Material e Métodos
12
OBS: os animais sacrificados, foram antes anestesiados em solução aquosa de
benzocaína (5% - solubilizada em 1ml de etanol e diluído então em 1L de água
destilada).
Figura2-Mapadasub-baciahidrográficadoRioParanáindicandoassub-bacias
amostradas na região leste do estado de São Paulo/SP (em verde). Os números
indicam os locais amostrados em 1) rio Piriquito/ bacia do rio São José Dos
Dourados;2)córregoCampoNovo/baciadorioTietê;3)rioCapivara/baciadorio
Tietê; 4) rio Paraitinguinha/ bacia do rio Tietê; 5) rio Tietê e 6) Recanto dos
Cambarás/baciadorioParanapanema.
Paiva, LRS Material e Métodos
13
3.2CaracterizaçãodasregiõesheterocromáticasporBandamentoC
Para obtenção de bandas C utilizou-se a técnica descrita originalmente por
Sumner(1972),queconsisteem:
a) hidrolisaraslâminaspor30minemHCl0,2Nàtemperaturaambienteelavarem
águadestilada;
b) passar poruma solução dehidróxido de bário (Ba(OH)2) por 1min elavar em
águadestilada;
c) lavarrapidamenteemHCl1Na60°Celavarnovamenteemáguadestilada;
d) incubarpor30minem2xSSC(pH=6,8),a60°C;
e) corarporaproximadamente30mincomGiemsanaproporçãode1:20emtampão
fosfato(pH=6,7).
3.3 Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RONs), através de
impregnaçãocomnitratodePrata
As RONs serão detectadas utilizando a técnica descrita por Howell & Black
(1980)queconsisteem:
a) pingarsobreumalâminapreparadaconformeatécnicaadotadaparaobtenção
de cromossomos mitóticos, 1 gota de solução aquosa de gelatina a 2%
(acrescidadeácidofórmiconaproporçãode1mlparacada100mldesolução),
mantida em frasco escuro e em geladeira. Pode-se utilizar gelatina comercial
semsaboreincolor.
b) adicionarsobrea gotadepositadaanteriormente, 1gota deáguadestilada e2
gotasdesoluçãoaquosadenitratodePrataa50%mantidaemfrascoescuroea
4
o
C.
c) misturarbemecobrircomumalamínula.Incubarapreparaçãoemestufaa60
o
C
sobreumsuportepor3minutos,realizandoummonitoramentodacoloraçãoda
Paiva, LRS Material e Métodos
14
d) lâminaedoscromossomosaomicroscópio.
e) após a preparação começar a apresentar coloração mais escura, quando os
cromossomos assumemuma tonalidade amareladae as RONs e os nucléolos
uma coloração pretaou marrom, lavarem água destilada, possibilitandoquea
lamínulasejaretiradapelaprópriaágua.Pode-secorarcomapreparaçãocom
Giemsaa5%diluídoemtampãofosfato(pH6.8),durante20a30segundosem
seguida,lavaremáguacorrenteedeixarsecaraoar.
3.4ObtençãodasondaDNAr18S
AsseqüênciasdeDNAr18Sutilizadasforamobtidasapartirdefragmentos
deDNAcomcercade1800paresdebasesobtidasdetilápia(Oreochromisniloticus)
e clonados em p-GEMT, sendo marcadas e realizada a sua localização nos
cromossomos,comseguinteprocessamento:
a) marcação por “nick translation” com biotina-14-dATP de acordo com as
instruçõesdofabricante(KitBionickTMLabelling-Invitrogen);
b) localização das seqüências de DNAr 18S nos cromossomos por Avidina-N-
fluorescenteIsotilcianato(FITC)conjugado;
c) amplificação do sinal utilizando Anti-avidina biotinilada, seguindo-se uma
segundavezdeaplicaçãocomAvidina-FITC;
d) utilização de Iodeto de Propídio (50 µg/ml) diluído em Antifade como contra-
coranteparaoscromossomos.
3.4.1Marcaçãodasonda
A sonda foi marcada pelo método de nick translation utilizando o Kit BioNickTM
LabelingSystem(Invitrogen):
a) prepararummixcontendo:1µL10xdNTPmix;1µLdoDNAsonda200ng/µL);
1µLdomixdeenzima;6µLdeáguaMilliQ.
Paiva, LRS Material e Métodos
15
b) misturarbem,centrifugarbrevementeeincubara16ºCporduashoras;
c) adicionar1µLdestopbuffer,1µLdeacetatodesódio3Me22µLdeetanol100%
gelado;
d) misturar,invertendootuboecentrifugarrapidamente,colocarentãonofreezer–
70ºCpor1hora;
e) centrifugarpor15minutosa15.000rpma4ºC;
f) descartarosobrenadanteeadicionar50µLdeetanol70%gelado;
g) centrifugarpor5minutosa15.000rpma4ºC;
h) descartarosobrenadantecomcuidadoedeixarsecar;
i) ressuspendere16µLdeáguaMilliQ.
3.4.2Tratamentodaslâminas
Aslâminascomaspreparaçõescromossômicaspodemserpreparadascom
umdiadeantecedênciaounomomentodouso.Paracadalâmina:
a) colocar 100µL de RNAse 40µg/mL (0,4µL de RNAse 10mg/mL e 99,6µL de
2xSSC) sobre a lamínula, aderir a lâmina sobre esta lamínula e deixar em
câmaraúmida(umidecidacom2xSSC)a37ºCpor1horae30minutos;
b) lavarduasvezesem2xSSCdurante10minutoscada;
c) desidratar em série alcoólica a 70%, 85% e 100% durante 10 minutos cada
passagem,utilizandosoluçõesgeladas;
d) mergulhar a lâmina em formamida 70% em 2xSSC por 4 minutos a 70º C
(soluçãodeformamidapodeserguardadaparaserreutilizadanodiaseguinte);
e) desidrataremsériealcoólica70%,85%e100%a–20ºCpor5minutoscada
(este passo é muito importante, pois as lâminas devem ser passadas
rapidamentedaformamidaparaoálcool).Deixarsecaraoar.
3.4.3Soluçãodehibridação
Paiva, LRS Material e Métodos
16
EmumtuboEppendorfcontendo16uldasondaadicionar40µLdeformamida
(concentraçãofinal50%),16µLdesulfatodedextrano50%(concentraçãofinal10%)
e8µLde20xSSC(concentraçãofinalde2xSSC).Desnaturarasondaa95ºCpor10
minutosepassarimediatamenteaogelo.
3.4.4Hibridação
Colocar80µLdesoluçãodehibridaçãosobrealamínulaeinverteralâmina
comapreparaçãosobrealamínula.
Manteraslâminascomomaterialvoltadoparabaixoemcâmaraúmida(2xSSC)a
37ºCovernight.
3.4.5Lavagens
a) lavaraspreparaçõesinicialmenteem2xSSCemtemperaturaambienteapenas
paratiraralamínulaeescorrerbemalâmina,semdeixarsecar.Destemomento
emdianteaslâminasnãopodemsecar:
b) lavaremformamida50%por15minutosa37ºC(utilizaramesmasoluçãododia
anterior–formamida70%etransformá-lapara50%);
c) lavarem2xSSCpor15minutosa37ºCporumavez;
d) lavarem2xSSCpor15minutosàtemperaturaambiente;
e) lavarem4xSSCàtemperaturaambiente(sóparaenxaguar).
3.4.6Detecçãoeamplificaçãodosinaldasonda
a) sobreumalamínula,colocar0,1µLdeavidina-FITC0,07%em70µLdetampãoC
(0,1Mdebicarbonatodesódio,pH8,5e0,15MdeNaCl);
b) inverteralâminacomapreparaçãosobreestalamínulaedeixarpor1horaem
câmaraúmidacom2xSSCa37ºC;
c) apósestetempo,lavaraslâminas3vezespor5minutoscada,comagitaçãoem
tampãodebloqueio(NaHCO31.26%/citratodesódio0,018%/Triton0,0386%
Paiva, LRS Material e Métodos
17
emáguadestiladapH8,0eleiteempódesnatado1%)recém-preparadoa42ºC.
escorreralâminaesecá-laporbaixo;
d) sobreumalamínuladepositar80µLdeanti-avidinabiotina-conjugada2,5%(2µL
de anti-avidina estoque em 78 µL de tampão de bloqueio), inverter a lâmina
sobre esta lamínula e deixar em câmara úmida com 2xSSC a 37º C por 30
minutos;
e) novamente lavar em tampão de bloqueioa42ºC três vezes durante5minutos
cadacomagitação;
f) repetirospassosde(a)até(e);
g) aplicarnovamenteoFITCefazeraslavagenscomodescritonopasso(e);
h) lavarem4xSSC/Triton2%duasvezespor3minutoscada,comagitação;
i) lavarem4xSSC/Triton0,2%duasvezespor3minutoscada,comagitação;
j) escorreraslâminasedeixarsecandoaoar;
k) secaralâminaemontarcomiodetodepropídionaproporçãode20µLdemeio
demontagemantifadingcom0,7µLdesoluçãodeiodetodepropídioa50µg/mL.
3.5Processamentodasimagens
Oscromossomosmetafásicosforamcapturadosutilizandomicroscópioóptico
OlympusBX-62,softwaredecapturaImage-ProMCv6.0eprocessadasemAdobe
Photoshop v 7.0. Os cariótipos foram obtidos a partir de medidas cromossômicas
propostasporLevanetal.(1964).
Paiva, LRS Resultados
18
4RESULTADOS
As análises efetuadas resultaram na elaboração de artigos científicos que
estão apresentados separadamente, na forma de capítulos. As citações
bibliográficasnãoforamlistadasnosmesmoseseencontramrelacionadasnoitem
ReferênciasBibliográficas.
CapítuloI:Evidências de rearranjos cromossômicos estruturais não
numéricos em Serrapinnus notomelas (Characidae: Cheirodontini)
de três diferentes localidades componentes da bacia do alto rio
Paraná
CapítuloII: Evidências de Especiação Cromossômica em Serrapinnus
notomelas (Characidae: Cheirodontinae) de Três Localidades do
RioTietê
Paiva, LRS Capítulo I
19
Capítulo I: Evidências de rearranjos cromossômicos estruturais não
numéricos em Serrapinnus notomelas (Characidae:
Cheirodontini) de três diferentes localidades componentes
da bacia do alto rio Paraná
Paiva, LRS Capítulo I
20
CapítuloI
Evidênciasderearranjoscromossômicosestruturaisnãonuméricosem
Serrapinnusnotomelas(Characidae:Cheirodontini)detrêsdiferentes
localidadescomponentesdabaciadoaltorioParaná
Resumo
O gênero Serrapinnus foi descrito como novo para a sub-família Cheirodontini, sendo
caracterizado principalmente pela presença de caracteres sexuais secundários. A espécie
Serrapinnusnotomelasdistribui-seportodaabaciadoRioParaná,éumpeixedepequeno
porte medindo cerca de 30mm a 60mm, sua importância comercial relacionada à área da
aquariofilia. Tem como importância ecológica a participação direta na cadeia trófica de
espéciespredadorasassociadasàmacrófitas.Osexemplaresforamcariotipadoseanalisados
pordiferentestratamentoscomobanda-C,NOReFISHutilizandocomosondaorDNA18S.
Todos os indivíduos analisados apresentaram número diplóide de 2n= 52 cromossomos (5
pares de cromossomos do tipo metacêntrico, 16 pares de submetacêntricos, 3 pares
subtelocêntricos e 2 de acrocêntricos).O padrão de regiões heterocromáticasricas em GC
demonstrou-sepoucoconservadoquantoaassociaçãocomasNORs,quandoempregadaa
técnicadebandeamentoC.AsNORsforamidentificadasatravésdaimpregnaçãopelaprata
demonstrando certa variação entre os cromossomos homólogos das populações do rio
ParaitinguinaeParanapanema.Asregiõesorganizadorasdenucléolosativasounão,foram
identificadasatravésdatécnicadeFISHcomsondadeDNAr18S,obtidasapartirdoDNA
extraído dos exemplares analisados, apresentando-se múltipla para os exemplares do rio
Paranapanemaesimplesnasdemaislocalidades.Foipossívelobservarque,emsetratando
da mesma espécie, há diferenças citogenéticas expressivas quando analisadas populações
queseencontramisoladasemdiferentesbaciashidrográficas.
Paiva, LRS Capítulo I
21
Introdução
OspeixesdogêneroSerrapinnussedistribuemportodaabaciadoRioParaná,
são facilmente encontrados em ambientes lênticos e semi-lênticos, associados à
macróficas, participando diretamente da cadeia trófica de predadores quando
associadosàmacrófitas(Lowe-McConnell,1999),tendoimportânciacomercialcomo
espécie utilizada na área de aquariofilia. Segundo Malabarba (1998), este gêneroé
caracterizado por um conjunto de caracteres morfológicos primários e secundários
como a presença de um pseudo-tímpano na parte mais anterior do corpo, raios
procorrentes da nadadeira caudal e últimos raios da anal, voltados para frente nos
machos e presença de mácula no pedúnculo caudal. Para Serrapinnus notomelas,
inclui-seaindapresençadeumamáculanopedúnculocaudal,atravessandodesdea
baseatéapartemaissuperiorepigmentaçãonoprimeiroraiodadorsal,desdesua
base até sua região mais extrema. Estudos citogenéticos em espécies do gênero
SerrapinnuseramdesconhecidosatéaredescriçãodeespéciesporMalabarba(1998),
sendo que o gêneroOdontostilbe, com númerodiplóidede2n=52 caracterizado por
Waskoetal,(2001),éagorareconhecidocomoSerrapinnus.OtrabalhodeWaskoet
al, (2001) descreve o número diplóide de 2n= 52 cromossomos (18 pares de
cromossomosdotipometa-submetacêntricos,6subtelocêricose2acrocêntricos)com
possível polimorfismo cromossômico ligado ao sexo, nos exemplares analisados, o
quenãofoiobservadonopresentetrabalho.
Estudos citogenéticos populacionais em peixes podem oferecer valiosas
informações sobre a história citogenética evolutiva de um determinado grupo ou
espécie,comenfoquenaestruturaecomposiçãodecromossomossupranumerários,
microemacro-cromossomosdocomplementoAepresençadecromossomossexuais,
alémdeauxiliarnaidentificaçãodenovasespécies(Koehleretal,1997;Maistroetal,
2000;Ferroetal,2003;Fontanaetal,2003;DinizeBertollo,2006;Fernandesetal,
2005;Fernandesetal,2006;Artonietal,2006).Estetrabalhotevecomopropostaa
avaliação da estrutura e composição cromossômica de exemplares de Serrapinnus
notomelasdeocorrênciaemtrêsdiferentesbaciashidrográficas(baciadorioSãoJosé
Paiva, LRS Capítulo I
22
dos Dourados, bacia do rio Tietê e bacia do rio Paranapanema),que compõeparte
dasprincipaisbaciasdoladolestedorioParaná,naregiãodoestadodeSãoPaulo.
MaterialeMétodos
Foramanalisados43exemplaresdeSerrapinnusnotomelasemtrêsdiferentes
baciasquecompõeabaciadoaltorioParaná:16exemplares(6fêmease10machos)
provenientes do córrego Piriquito (bacia do rio São José dos Dourados); 14
exemplares(10fêmease4machos)provenientesdorioParaitinguinha(baciadorio
Tietê);13exemplares(8fêmease5machos)provenientesdoRecantodosCambarás
(bacia do Rio Paranapanema) (Figura 1). As preparações cromossômicas foram
obtidas de acordo com Foresti (1993), o padrão de heterocromatina constitutiva
(Bandas-C)deacordo com Sumner(1972) easregiõesorganizadorasdenucléolos
(Ag-NOR)foramevidenciadasatravésdeimpregnaçãopelaprata(HowelandBlack,
1980). Foi realizada também a hibridação “in situ” fluorescente (FISH segundo a
técnicapropostaporPinkeletal.1986),commodificaçõesapresentadasporMartinse
Galetti(2001).AsseqüênciasdeDNAr18S,comcercade1800paresdebasesobtida
detilápia(Oreochromisniloticus)(Martinsetal.,2000)eclonadasemp-GEMTforam
marcadaspor“nicktranslation”combiotina-14-dATPdeacordocomasinstruçõesdo
fabricante (Bionick
TM
Labelling System – Invitrogen). As seqüências de DNAr 18S
foram localizadas nos cromossomos com o uso de Avidina-N-fluorescente
Isotilcianato (FITC) conjugado, sendo o sinal amplificado com nova conjugação por
Anti-avidina biotinilada seguida de novo tratamento com Avidina-FITC. Os
cromossomos foram contracorados com Iodeto de Propídio (50 µg/ml) diluído em
Antifade.Asimagensdaspreparaçõesforamcapturadasutilizandomicroscópioóptico
OlympusBX-62e softwaredecapturaImage-ProMCv 6.0, sendo processadas em
Adobe Photoshop v 7.0. Os cariótipos foram montados a partir de medidas
cromossômicas realizadas e os cromossomos classificados de acordo com a
nomenclaturapropostaporLevanetal.(1964).
Paiva, LRS Capítulo I
23
Figura1)Mapadasub-baciahidrográficadoRioParanáindicandoassub-baciasamostradasna
regiãolestedoestadodeSãoPaulo/SP(emverde).Osnúmerosindicamoslocaisamostrados,
1)rio Piriquito/bacia do rio São José Dos Dourados, em 5) rio Paraitinguinha/bacia do rio
Tietêeemazuleem6)RecantodosCambarás/baciadorioParanapanema.
Paiva, LRS Capítulo I
24
Resultados
Serrapinnus notomelas - população do rio Piriquito (bacia do rio São José dos
Dourados)
Os exemplares analisados apresentaram número diplóide de 2n= 52
cromossomos e númerofundamentalNF=100,sendo seu cariótipo compostopor5
paresdecromossomosmetacêntricos,16paresdecromossomossubmetacêntricos,3
pares de cromossomos subtelocêntricos e 2 pares de cromossomos acrocêntricos
(Figura 2a). O padrão de heterocromatina constitutiva por bandeamento C revelou
marcações nas regiões teloméricas, centroméricas, intersticiais e pericentroméricas,
para braço curto e braço longo. Foram caracterizados os seguintes pares
cromossômicos: pares 2, 12 e 14 (pericentromérica, braço longo) e pares 6 e 9
(intersticial,braçolongo)eumamarcaçãomaisevidenteparaumdoshomólogosdo
par26decromossomosacrocêntricos(braçocurto),sendoaindapossívelidentificar
marcaçõescentroméricasemtodososcromossomos(Figura3a).AAg-NORpositiva
foidetectadanobraçocurtodopar26decromossomosacrocêntricos(Figura4a).A
técnica de hibridação “in situ” fluorescente com a utilização de sonda DNAr 18S
possibilitou a evidenciação de duas regiões ribossomais responsáveis pela
organização nucleolar, as quais confirmaram com a marcação visualizada pela
impregnaçãocomnitratoPrata(regiãodobraçocurtodopar26)(Figura4b).
Serrapinnusnotomelas-populaçãodorioParaitinguinha(baciadoRioTietê)
Os exemplares analisados apresentaram número diplóide de 2n= 52 com
número fundamental NF= 100 cromossomos, sendo seu cariótipo composto por 5
paresdecromossomosmetacêntricos,16paresdecromossomossubmetacêntricos,3
pares de cromossomos subtelocêntricos e 2 pares de cromossomos acrocêntricos
(figura 2b). O bandeamento C possibilitou a investigação das regiões ricas em
heterocromatinaconstitutiva,auxiliandonadescriçãoediferenciaçãodestapopulação
comasdemaisanalisadasnopresentetrabalho.Assimcomoapopulaçãoanalisada
Paiva, LRS Capítulo I
25
anteriormente, apresentaram marcações em posições teloméricas, centroméricas e
pericentroméricas,sendomaisevidentesasmarcaçõesobservadasnoscromossomos
dos seguintes pares: 6 (pericentromérica, braço longo), 7 e 20 (pericentromérica,
braço curto) e12(intersticial, braço longo)eumamarcação mais evidente para um
dos homólogos do par 26 (p) de cromossomos acrocêntricos (Figura 3b). As
marcações Ag-NORs foram detectadas ao longo do braço curto em ambos os
cromossomosacrocêntricosdopar26(Figura5a).Emcercade37,5%(210/560)das
metáfasesanalisadas,foiidentificadaamarcaçãoemapenasumdoscromossomos
homólogos desse par. Nestes casos, ambos os braços apresentaram marcação,
sendoquenobraçolongoocorreuemposiçãotelomérica(Figura5b).Ahibridação“in
situ”fluorescentecomsondaDNAr18S,confirmouasmarcaçõesobtidaspelatécnica
deAg-NORspositivasparaopar26epresentesaolongodobraçocurto(Figura5c).
NoscasosemqueasmarcaçõespelaPrataestiverampresentesemapenasumdos
cromossomoshomólogosdestepar,aaplicaçãodatécnicaFISHcomousodesonda
DNAr 18S, foram identificadas marcações em ambos os cromossomos do par 26e
tambémumafracamarcaçãoteloméricanobraçolongodeumdoshomólogos(Figura
5ced).
Serrapinnus notomelas - população do Recanto dos Cambarás (bacia do rio
Paranapanema).
Assim como as demais populações analisadas no presente trabalho, os
exemplares de S.notomelas coletados no Recanto dos Cambarás, apresentaram
número diplóide de 2n=52 cromossomos e número fundamental NF= 100, sendo o
cariótipo representado por 5 pares de cromossomos metacêntricos, 16 pares de
cromossomossubmetacêntricos,3paresdecromossomossubtelocêntricose2pares
de cromossomos acrocêntricos (Figura 2c). Os exemplares desta população
apresentaram um padrão mais rico em regiões de heterocromatina constitutiva por
bandeamentoC.Commarcaçõesmaisevidentesidentificadasnospares1,12,15e
16(intersticial,braçolongo),2(pericentromérica,braçocurto)10(braçocurto)euma
Paiva, LRS Capítulo I
26
marcação mais conspícua em um dos homólogos do par 26 (braço curto) de
cromossomosacrocêntricos(Figura3c).AsregiõesAg-NORspositivasevidenciaram
marcações ao longo do braço curto do par 26 (Figura 6a). Em cerca de 25%
(130/1040) das metáfases, foi possível observar marcação intersticial em um dos
cromossomosdestepareparaoseuhomólogoamarcaçãoocorreuaolongodobraço
curto(Figura6b).ComaaplicaçãodatécnicadeFISH,utiizandoasondaDNAr18S,
foivisualizadamarcaçãoaolongodobraçocurtodeambososhomólogosdopar26,
não acorrendo marcação na região pericentromérica, detectada pela técnica de
impregnaçãopelaPrata(Figura6c).
Paiva, LRS Capítulo I
27
Figura 2
- Cariótipos de Serrapinnus notomelas de exermplares capturados em
localidadesdetrêsbaciashidrográficasquecompõeabaciadoAltorioParaná.a)rio
Piriquito (bacia do rio São José dos Dourados; b) rio Paraitinguinha(bacia do rio
Tietê);d)RecantodosCambarás(rioParanapanema)
a
b
c
Paiva, LRS Capítulo I
28
a
b
c
Figura 3
- Cariótipos de exemplares de três populações de Serrapinnus notomelas
submetidos à técnica de Bandeamento C. As amostras analisadas correspondem a
exemplarescapturadosnorioPiriquito(a);norioParaitinguinha(b)enorioParanapanema
(RecantodosCambarás)(c),componentesdabaciadoaltorioParaná.
Paiva, LRS Capítulo I
29
Figura4
-MetáfasesdeSerrapinusnotomelasdeexemplaresdorioPiriquito(baciadorio
SãoJosédosDourados): a-preparaçãoobtidacomatécnicaAg-NOR;b-preparação com
aplicaçãodeFISH;assetasindicamamarcaçãocomasondadeDNAr18S.
Figura5
-MetáfasesdeSerrapinnus notomelasexemplaresdorioParaitiguinha(baciado
rio Tietê: a) setas indicam cromossomos portadores de NORs simples; b) seta indica
cromossomoportadoresdeNORsemambososbraços;c)setasindicammarcaçãocomsonda
DNAr 18S; d) setas indicam marcações em ambos os braços de um dos cromossomos
homólogosdopar26deacrocêntricos;
c
d
a b
a b
c
d
c d
Paiva, LRS Capítulo I
30
Figura 6
- Metáfases de Serrapinnus notomelas de exemplares Recanto dos
Cambarás(baciadorioParanapanema.a)assetasindicamcromossomosportadores
de NORs simples; b) a seta indica cromossomo portador de NOR,marcando todo o
braçoeacabeçadesetaindicacromossomohomólogocommarcaçãointersticial;ce
d)setasindicamasregiõesmarcadaspelapresençadesondaDNAr18S.
a
b
c
Paiva, LRS Capítulo I
31
Discussão
Os exemplares de Serrapinnus notomelas das três bacias hidrográficas
amostradas, Paranapanema (Recanto dos Cambarás), São José dos Dourados
(RibeirãoPiriquito)eTietê(RioParaitinguinha),apresentaramumaaltaconservação
cariotípicacomrelaçãoaonúmerodiplóideenúmerofundamental(2n=52eNF=100)
dos cromossomos (Tabela 1). Essa característica cariotípica sugere que eventos
determinantes de rearranjos cromossômicos numéricos como fusão e fissão não
devam ter ocorrido nesta espécie (Nirchio e Oliveira, 2006), pelo menos em nível
detectávelpelametodologiautilizada.
OsexemplaresdeS.notomelasdabaciadoParanapanemaapresentaramuma
bandaintersticialnobraçolongodoprimeiropardecromossomosmetacêntricosedo
par 15 de submetacêntricos, não sendo esta característica observada nos
cromossomosdasdemaispopulações(Figura4c,Tabela2).Paraosespécimesda
bacia do rio São José dos Douradosfoi possível observar marcação intersticial nos
cromossomosdospares6e9submetacêntricosemarcaçãopericentroméricanopar
14 submetacêntrico, o que não ocorreu nas demais populações (Figura 4a). Os
exemplares estudados provenientes da bacia do rio Tietê apresentaram como
marcador o par 20 formado por cromossomossubmetacêntricos,commarcação em
todoobraçocurto(Figura5,b).
Swarçaetal.(2005)demonstramaocorrênciadediversificaçãocariotípicaentre
populações de Pseudoplatystoma corruscans, quando analisaram os padrões de
regiões ricas em GC por CMA
3
e DNAr 5S. Encontraram também diferenciação
cariotípicanuméricaemorfológicaentreosindivíduosdaspopulaçõesanalisadas.No
presentetrabalhofoievidenciadaamesmatendênciaparaaformaçãoderearranjos
estruturais,porémnãonuméricosoumorfológicos.Atravésdatécnicadebandamento
C foi revelado marcações centroméricas, teloméricas, periteloméricas e intersticiais
com divergências entre as populações amostradas (Tabala 2). As divergências
encontradas para S. notomelas das três populações são consideradas aqui como
marcadores populacionais, possibilitando identificar as diferentes
32
Localidade 2n NF metacêntrico
submetacêntrico
subtelocêntrico
acrocêntrico
Ag-NOR
Piriquito
52 100 10 32 06 04 Par26
Paraitinga
52 100 10 32 06 04 Par26
Paranapanema
52 100 10 32 06 04 Par26
Tabela1- Representaçãodas localidadesamostradaspara Serrapinnus notomelas,com númerodiplóide (2n),número fundamental
(NF),morfologiacromossômica(meta-submeta-subtelo-eacrocêntrico)eparesportadoresdeAg-NOR.
33
BandamentoCLocal
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
Piriquito cen cen,
t
cen cen cen cen
in
q
cen cen
in
cen pc
q
cen pc
q
cen cen cen cen
tq
cen cen cen tq cen
tq
cen cen hp
Paraitin-
guinha
cen cen cen cen cen cen pc,p pc,q cen cen cen in,
q
cen cen cen cen cen cen pc,
p
p cen cen cen cen hp
Paraná-
panema
cen,
inq
cen
pc,p
pc,p cen cen cen cen cen cen cen,
tq
cen inq cen cen cen cen cen cen cen cen cen pc
p
cen cen
t
hp
Tabela2-RepresentaçãodasmarcaçõesporbandeamentoCdoscromossomosdeSerrapinnusnotomelas,capturadosemtrêslocalidades(riosPiriquito,
Paraitinguinha e Paranapanema). cen= centromérica; pc= pericentromérica; in= intersticial; t= telomérica; te= peritelomérica; p= braço curto do
cromossomo;q=braçolongodocromossomo;h=apenasumdoshomólogos.De1a26representaçãodosparescromossômicos.
Paiva, LRS Capítulo I
34
populações de S. notomelas analisadas no presente trabalho. A conservação
cariotípicaemdiferentespopulaçõesconsideradasdomesmogêneroe/ouespécie
foi também observadaemoutros trabalhos citogenéticoscomparativos empeixes,
conforme relatado por Feldberg et al. (1985) em Crenicichla e Geophagus, por
Nakayama,(2006)emSerrasalmus,porAlmeida-Toledoetal.(1987)emColossoma
macropomum e C. mitrei, por Pauls e Bertollo (1990) e Oliveira et al.(2003) para
exemplares da família Prochilodontidae, por Pansonato-Alves, (2006) em
Characidiumzebra.
A marcação Ag-NOR intersticial em um dos cromossomos homólogos dos
espécimesprovenientesdoRecantodosCambarás(Figura6b),sugerequepossa
ter ocorrido rearranjo cromossômico do tipo inversão paracêntrica, conforme
sugeridonoIdeograma7.ParaespécimesdorioParaitinguinhaanalisados,adupla
marcação em um dos cromossomos homólogos do par 26 de cromossomos
acrocêntricos sugere possível ocorrência de inversão pericêntrica da região
ribossomal (DNAr 45S) deste cromossomo, translocando do braço curto para a
posiçãomaisdistalnobraçolongo(Ideograma7a,beFigura6b).Quandoanalisada
asmetáfasesdeS.notomelasdorioParaitinguinhaporimpregnaçãoporNitratode
Prata,37,5%dasmetáfases(210/560metáfases)apresentarammarcaçãonosdois
braços de um dos homólogos portadores das RONs, enquanto nas análises das
preparaçoes dos exemplares do Recanto dos Cambarás, a proporção foi de 25%
(130/1040) com a RON localizada em um dos homólogos portador da possível
inversãoparacêntrica.
AregiãodeheterocromatinaricaemGCassociadaàsNORséconsiderada
comumparaospeixes(SchmideGuttenbach,1988;Solaetal,1992;Maistro,2000;
MolinaeGaletti,2006;Vicarietal,2006)emboranemtodasaregiõesevidenciadas
pelatécnicadeCMA
3
sejamdeterminantesdapresençadasRONs(Gromichoetal.,
2005).Contudo,paraastrêspopulaçõesanalisadashouveumaintensamarcação
apenasemumdoshomólogos(Figura3)ocorrendotambémparaasmarcaçõesAg-
NORspositivas.MackenzieeLubs(1973)sugeremqueobandamentoCpodeser
Paiva, LRS Capítulo I
35
Figura 7 - Idiograma representando possíveis eventos por rearranjo cromossômico
envolvendoasregiõesdeAg-NORs;a)ocorrênciadeinversãoparacêntricaenvolvendoum
dos cromossômos homólogos do par 26 de acrocêntricos, observado em espécimes de S.
notomelasdoRecantodosCambarás(rioParanapanema);b)inversãopericêntricaenvolvendo
a porção mais distal do braço curto de um dos cromossômos do par 26 de acrocêntricos,
observadoemespécimesdeS.notomelasdorioParaitinguinha(rioTietê).
influenciadopelaquantidadedeproteínasassociadasaestaregião,deformaquea
fixação do materialpeloácido acético possibilitaria a retirada de tais proteínasda
estruturadomaterialgenéticodestaregião.Estahipóteseparecesersuportadapelo
fatodequenãofoiencontradaacondiçãohomozigotaparaocaráteremquestão.
AsondadeDNAr18Smapeadanobraçocurtodopar26decromossomos
acrocêntricos confirmou as marcações identificadas pela aplicação da técnica Ag-
NORparaastrêspopulações(Figuras4,5e6).
Contudo,acondiçãodelocalizaçãodamarcaçãoemregiãopericentromérica
identificadaparaosespécimesdoRecantodosCambarásnãofoiconfirmadapela
marcaçãocomasondadeDNAr18S,ocorrendoapenasfracamarcaçãodetodoo
braço curto dos cromossomos do par 26. Esta condição, segundo Dobigny et
al.(2002)eGromichoetal.(2005),poderiaserexplicadapelofatodequeproteínas
Paiva, LRS Capítulo I
36
associadas ao complexo transcricional poderem estar ativas ou não na interfase
precedente do ciclo celular, proporcionando marcações diferenciadas entre os
cromossomoshomólogos.ComautilizaçãodamarcaçãoporsondadeDNAr18S,
os exemplares do rio Paraitinguinha que apresentaram a RONs apenas no braço
curtodopar26 decromossomosacrocêntricos,apresentaramtambémmarcações
em ambos os cromossomos do par 26 na região do braço curto, sendo esta
condiçãocomumatodosindivíduosanalisados(Figura5ced).Quantoàmarcação
emapenasumdoshomólogosemambososbraçoscromossômicos,aaplicaçãoda
técnicaporFISHcomsondaDNAr18S,confirmoucomadescriçãofeitaatravésda
impregnação pelonitratodePrata, de marcaçãoemambosos braçosdeum dos
homólogosdopar26decromossomosacrocêntricos,alémdamarcaçãonormaldo
seuhomólogo(Figura7ced),comamarcaçãoidentificadasomenteaolongodo
braço curto. Tal observação parece indicar que a ativação das duas regiões
teloméricasdocromossomoemquestão,parecesersuficienteparaofuncionamento
dasatividadesorganizacionaisnucleolaresenvolvidascomestaregião,nãohavendo
necessidadedaativaçãodeseuhomólogo(Dobignyetal.,2002;Maisetal.2004).
Os dados obtidos no presente trabalho sugerem que a especiação
cromossômica pode iniciar-se sob aspectos de rearranjos estruturais não
determinantes das alterações numéricas ou morfológicas dos cariótipos, como
translocações balanceadas, duplicações, inversões e deleções, uma vez que a
espécie analisada presente em três diferentes bacias hidrográficas pode ser
diferenciadacomaaplicaçãodametodologiaclássicadecitogenética.
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Paiva, LRS Capítulo II
41
Capítulo II: Evidências de Especiação Cromossômica em Serrapinnus
notomelas (Characidae: Cheirodontinae) de Três
Localidades do Rio Tietê
Paiva, LRS Capítulo II
42
CapítuloII
EvidênciasdeEspeciaçãoCromossômicaemSerrapinnusnotomelas
(Characidae:Cheirodontinae)deTrêsLocalidadesdoRioTietê
Resumo
O gênero Serrapinnus é ainda pouco descrito citogeneticamente,
apresentandonúmerodiplóidede2n=52cromossomos.Nestaespécieaindanãohá
descrição de estudos cariotípicos aplicando técnicas de bandamentos
cromossômicosquepoderiamauxiliarnoentendimentodaestruturacromossômica
deste grupo. No presente trabalho foram investigadas três populações de
Serrapinnus notomelas pertencentes à bacia do rio Tietê e os exemplares
analisados apresentaram número diplóide de 2n= 52 cromossomos, com variação
morfológicaparaastrêslocalidades(rioTietê,rioCapivaraecórregoCampoNovo).
A técnica de bandamento C foi empregada com o objetivo de mapear regiões de
heterocromatinaconstitutivaricasemGC,possibilitandoumadiferenciaçãoentreas
populaçõesanalisadas.Atécnicadeimpregnaçãopelaprata,identificouasregiões
Ag-NORs ativas, que se apresentaram simplespara os exemplares do rioTietê e
múltiplas para os exemplares do rio Capivara e córrego Campo Novo. Quando
empregadaàtécnicadeFISH,buscandolocalizarsítiosdeDNAr18S,verificou-se
que os dadosforam congruentes com asAg-NORs do rio Tietê e córrego Campo
Novo. Os resultados do presente trabalham são indicadores de como poderia
ocorrer a diferenciação cromossômica em indivíduos da mesma espécie quando
isolados. Há uma tendência para a ocorrência primária de alterações estruturais
não-numéricas,indicandoqueeventoscomoinversões,deleçõeseduplicaçõesde
segmentos cromossômicos e translocações devam ser os primeiros eventos a
ocorrer,porémconservandoonúmerodiplóidedosindivíduos.
Paiva, LRS Capítulo II
43
Introdução
A subfamília Cheirodontinae compreende um grupo de peixes de ampla
distribuição na América do Sul. Está subdividida em duas tribos, Cheirodontini e
Compusurini,sendoqueogêneroSerrapinnus,pertencenteàtriboCheirodontini,foi
identificadocombaseemcaracteresrelacionadosaodimorfísmosexualsecundário
observadonosraiosprocorrentesventraisdanadadeiracaudaleraiosdanadadeira
anal dos machos (Malabarba et al, 1998). Esta tribo inclui os gêneros Cheirodon
com seis espécies, Spintherobolus com quatro espécies, Nanocheirodon uma
espécie,Heterocheirodonumaespécie,Serrapinnusseteespécies,umnovogênero
alémdeumcharacideofóssil,†Megacheirodonunicus.
Os dados citogenéticos para os representantes deste grupo são escassos,
sendocaracterizadosapenaspelonúmerodiplóidedeespécimesdestegrupocom
2n=52cromossomos(Oliveira,etal.1988,NishiyamaeSantos,1995eWaskoetal,
2001). Como as regiões organizadoras de nucléolos podem constituir excelentes
marcadores citogenéticos em peixes (e.g. Galetti et al. 1984), estas têm sido
comumentedetectadasemváriasespéciesutilizandocoloraçãocomnitratodePrata
(Ag-NOR), mitramicina (MM) ou cromomicina A
3
(CMA
3
) (Amemiya & Gold 1986;
Phillipsetal.1989;Galetti&Rasch1993;Solaetal.1997).Acoloraçãocomnitrato
de Prata tem sido atécnicamais utilizada em estudos de localização das regiões
organizadoras de nucléolos, embora esta detecte somente RONs
transcricionalmente ativas (Goodpasture and Bloom 1975; Hofgatner et al. 1979;
Howell&Black1980;Rousseletal,1996;Zuritaetal,1998;Paintner-Marquesetal,
2002; Gromicho et al, 2004). Com o objetivo de caracterizar citogeneticamente
espécimes da Tribo Cheirodontini, foram amostrados quatro pontos de coleta,
compreendendo localidades da região do Alto Tietê (Rio Tietê/ Salesópolis) e do
MédioTietê(Botucatu,RioCapivara/BotucatueCórregoCampoNovo/Bauru).
Paiva, LRS Capítulo II
44
MaterialeMétodos
Foramcoletados73exemplaresdeSerrapinnusnotomelasemtrêsdiferentes
localidades que compõe a bacia do alto rio Paraná, sendo 26 exemplares (14
fêmease12machos)provenientesdorioTietê(Salesópolis-SP),22exemplares(10
fêmease12machos)provenientesdorioCapivara(Botucatu-SP)e28exemplares
(17fêmease11machos)provenientesdocórregoCampoNovo(Bauru-SP)(Figura
01).AspreparaçõescromossômicasforamobtidasdeacordocomForesti(1993),o
padrãodeheterocromatinaconstitutivadeacordocomametodologiapropostapor
Sumner(1972)easregiõesorganizadorasdenucléolos,foramevidenciadasatravés
da impregnação pela prata Ag-NORs por Howel and Black (1980). A técnica de
hibridação “in situ” fluorescente (FISH) foi aplicada de acordo com Pinkel et al.
(1986),commodificaçõesapresentadasporMartinseGaletti(2001).Asseqüências
de DNAr 18S com cerca de 1800 pares de bases foram extraídas de tilápia
(Oreochromisniloticus)(Martinsetal.,2000)clonadasemp-GEMTemarcadaspor
“nicktranslation” combiotina-14-dATP, deacordo comas instruções dofabricante
(Kit Bionick
TM
Labelling System - Invitrogen). As seqüências de DNAr 18S foram
localizadas nos cromossomos por Avidina-N-fluorescente Isotilcianato (FITC)
conjugado, sendo o sinal foi amplificado com adição de Anti-avidina biotinilada,
seguindo-seumasegundadeAvidina-FITC.Oscromossomosforamcontracorados
com Iodeto de Propídio (50 µg/ml) diluído em Antifade. Os cromossomos
metafásicos foram capturados utilizando microscópio óptico Olympus BX-62,
softwaredecapturaImage-ProMCv6.0eprocessadasemAdobePhotoshopv7.0.
A classificação dos cromossomos foi obtida a partir de medida cromossômica
propostaporLevanetal.(1964).
Resultados
Serrapinnusnotomelas-populaçãodorioTietê(Salesópolis-SP)
Paiva, LRS Capítulo II
45
Os exemplares analisados apresentaram número diplóide de 2n=52
cromossomossendo7paresmetacêntricos,15paressubmetacêntricos,2pares
Figura 1 - Mapa da sub-bacia hidrográfica do Rio Paraná indicando os locais amostrados
pertencentesabaciadorioTietê,pertencenteaoestadodeSãoPaulo/SP.Osnúmerosindicam
os locais amostrados; em 2) córrego Campo Novo; em 3) rio Capivara; e em 4) Rio
Paraitinguinha.
Paiva, LRS Capítulo II
46
subtelocêntricos e 2 pares acrocêntricos, com número fundamental de NF= 100
(Figura 3a). O bandamento C evidenciou marcações centroméricas em todos os
cromossomos e uma marcaçãointersticial nos cromossomos submetacêntricos do
par17(Figura3b).AsmarcaçõesdasregiõesAg-NORsapresentaram-sedeforma
simples, sendo identificada no braçocurtodos cromossomosacrocêntricosdo par
26 (Figura 4a). A hibridação “in situ” fluorescente com sonda para o DNAr 18S
identificouasregiõesribossomaispresentesnopar26formadopordecromossomos
acrocêntricos(Figura4b).
Serrapinnusnotomelas-populaçãodorioCapivara(Botucatu-SP)
Os exemplares analisados apresentaram número diplóide de 2n=52
cromossomos 5 pares metacêntricos, 15 pares submetacêntricos, 4 pares
subtelocêntricose2paresacrocêntricos,comnúmerofundamentalNF=100(Figura
5a). O bandamento C evidenciou marcações centroméricas em todos os
cromossomos, marcações pericentroméricas no braço curto dos pares 7 e 19 de
cromossomos submetacêntricos, fracas marcações pericentroméricas no braço
longodospares8e9decromossomossubmetacêntricosemarcaçõesintersticiais
nobraçolongodospares14e16decromossomossubmetacêntricos(Figura5b).
As marcações das regiões Ag-NORs apresentaram-se de forma múltipla, sendo
marcado um dos homólogos dos pares 11 em posição peritelomérica no braço
longo,nobraçocurtodoscromossomosdospares23e26(Figura6a).Ahibridação
“in situ” fluorescente com a sonda DNAr 18S identificou regiões ribossomais
presentesapenasnobraçocurtodoscromossomosacrocêntricosdopar26(Figura
6b).
Serrapinnusnotomelas-populaçãodocórregoCampoNovo(Bauru-SP)
Os exemplares analisados apresentaram número diplóide de 2n=52
cromossomos, porém com três diferentes citótipos. No citótipo I foi possível
identificar; 12 cromossomos metacêntricos, 34 cromossomos submetacêntricos, 4
Paiva, LRS Capítulo II
47
cromossomos subtelocêntricos e 2 cromossomos acrocêntricos (Figura 7a) com
número fundamental NF= 102; o citótipo II apresentou 12 cromossomos
metacêntricos,33cromossomossubmetacêntricos,4cromossomossubtelocêntricos
e 3 cromossomos acrocêntricos (Figura 7b) e número fundamental NF= 101; o
citótipo III apresentou 12 cromossomos metacêntricos, 32 cromossomos
submetacêntricos,4cromossomossubtelocêntricose4cromossomosacrocêntricos
(Figura 7c) e número fundamental NF= 100. Para o citótipo I a técnica de
bandamento C revelou marcações centroméricas para todos os cromossomos,
marcações pericentroméricas para os pares 2, 3 e 19 localizados no braço curto,
além de marcações intersticiais para os pares 7, 10, 12, 14 e 17 localizadas no
braçolongoemarcaçõesperiteloméricas(Figura8a).AsmarcaçõesdasregiõesAg-
NORs apresentaram-se de forma múltipla para 26% dos indivíduos analisados e
simples para os 64% restantes. Quando múltipla, foi identificada em um dos
homólogos dos pares 2 (braço curto em posição peritolérica), 23 e 26 (no braço
longoemposiçãoperitelomérica),epresentetambémnospares7,22(braçocurto),
esta observada somentepara indivíduos dos citótipos II e III (Figura 9b). Quando
simples, a marcação pode ser observada apenas nos cromossomos do par 22
(braçocurto),paratodosos indivíduosdoscitótiposI(Figura9a).Ahibridação “in
situ” fluorescente com sonda para DNAr 18S, identificou as regiões ribossomais
simplesemúltiplascorrespondentes àsmarcaçõesAg-NORpositivas(Figura9ce
d).
Paiva, LRS Capítulo II
48
a
b
Figura 3 - a)Cariótipo de Serrapinnus notomelas, exemplares do rio Tietê, apresentando
2n=52 cromossomos com 7 pares metacêntricos, 15 pares submetacêntricos, 2 pares
subtelocêntricose2paresacrocêntricos;b)CariótipodeS.notomelas,comoscromossomos
submetidosà técnicadebandeamentoC.
Figura 4 - Cromossomos metafásicos de S. notomelas do rio Tietê a) setas indicam as
regiõesAg-NORspositivas;b)setasindicamcromossomosportadoresderegiõesDNAr18S,
obtidaspelatécnicadeFISH.
a
b
Figura 3 - a)Cariótipo de Serrapinnus notomelas, exemplares do rio Tietê, apresentando
2n=52 cromossomos com 7 pares metacêntricos, 15 pares submetacêntricos, 2 pares
subtelocêntricose2paresacrocêntricos;b)CariótipodeS.notomelas,comoscromossomos
submetidosà técnicadebandeamentoC.
a
b
a
b
Figura 3 - a)Cariótipo de Serrapinnus notomelas, exemplares do rio Tietê, apresentando
2n=52 cromossomos com 7 pares metacêntricos, 15 pares submetacêntricos, 2 pares
subtelocêntricose2paresacrocêntricos;b)CariótipodeS.notomelas,comoscromossomos
submetidosà técnicadebandeamentoC.
Figura 4 - Cromossomos metafásicos de S. notomelas do rio Tietê a) setas indicam as
regiõesAg-NORspositivas;b)setasindicamcromossomosportadoresderegiõesDNAr18S,
obtidaspelatécnicadeFISH.
Paiva, LRS Capítulo II
49
Figura 5 - Análise dos cromossomos de Serrapinnus notomelas do rio Capivara, 2n=52
cromossomos a) cariótipo utilizando coloração com giemsa; b) cariótipo com os
cromossomossubmetidosatécnicadebandeamentoC.
Figura6 - CromossomosmetafásicosdeexemplaresdeS.notomelas dorioCapivara.)As
setasindicamasregiõesAg-NORspositivasem(a)eoscromossomosportadoresderegiões
DNAr18S,identificadaspelatécnicadeFISHem(b).
a
b
a
b
Figura 5 - Análise dos cromossomos de Serrapinnus notomelas do rio Capivara, 2n=52
cromossomos a) cariótipo utilizando coloração com giemsa; b) cariótipo com os
cromossomossubmetidosatécnicadebandeamentoC.
Figura6 - CromossomosmetafásicosdeexemplaresdeS.notomelas dorioCapivara.)As
setasindicamasregiõesAg-NORspositivasem(a)eoscromossomosportadoresderegiões
DNAr18S,identificadaspelatécnicadeFISHem(b).
a
b
a
b
Paiva, LRS Capítulo II
50
Figura7 - CariótiposdeSerrapinnusnotomelas,exemplaresdocórregoCampoNovo.
a) citótipo I com 2n=52 cromossomos; b) citótipo II com 2n= 52 cromossomos; c)
citótipoIIIcom2n=52
a
b
c
Figura7 - CariótiposdeSerrapinnusnotomelas,exemplaresdocórregoCampoNovo.
a) citótipo I com 2n=52 cromossomos; b) citótipo II com 2n= 52 cromossomos; c)
citótipoIIIcom2n=52
a
b
c
a
b
c
Paiva, LRS Capítulo II
51
a
b
c
Figura 8 - Cariótipos de Serrapinnus notomelas de exemplares do córrego Campo
Novo,obtidosapóstratamentoporbandeamentoCparaidentificaçãodasregiõesde
heterocromatina constitutiva. a) citótipo I com 2n=52 cromossômos; b) citótipo II
com2n=52cromossômos;c)citótipoIIIcom2n=52cromossômos.
a
b
c
a
b
c
Figura 8 - Cariótipos de Serrapinnus notomelas de exemplares do córrego Campo
Novo,obtidosapóstratamentoporbandeamentoCparaidentificaçãodasregiõesde
heterocromatina constitutiva. a) citótipo I com 2n=52 cromossômos; b) citótipo II
com2n=52cromossômos;c)citótipoIIIcom2n=52cromossômos.
Paiva, LRS Capítulo II
52
Figura9 - MetáfasesdeSerrapinnusnotomelas,exemplaresdocórregoCampoNovoa)
citótipo I, setas indicam Ag-NOR simples presente no par 22; b) citótipos II e III,
asteriscosrepresentamcromossomosportadoresdeAg-NORs(azul=cromossomopar
02,verde=cromossomopar25,vermelho=cromossomospar07,preto=cromossomos
par 22); c) cromossomos submetidos a FISH por sonda DNAr 18s, cabeças de setas
indicam cromossomos portadores, par 22; d) cromossomos submetidos a FISH por
sondaDNAr18s,cabeçasdesetasindicamcromossomosportadores(cromossomos02e
25– pares07e22).
*
*
a
*
*
*
*
*
*
b
c
d
Figura9 - MetáfasesdeSerrapinnusnotomelas,exemplaresdocórregoCampoNovoa)
citótipo I, setas indicam Ag-NOR simples presente no par 22; b) citótipos II e III,
asteriscosrepresentamcromossomosportadoresdeAg-NORs(azul=cromossomopar
02,verde=cromossomopar25,vermelho=cromossomospar07,preto=cromossomos
par 22); c) cromossomos submetidos a FISH por sonda DNAr 18s, cabeças de setas
indicam cromossomos portadores, par 22; d) cromossomos submetidos a FISH por
sondaDNAr18s,cabeçasdesetasindicamcromossomosportadores(cromossomos02e
25– pares07e22).
*
*
a
*
*
*
*
*
*
b
c
d
*
*
a
*
*
a
*
*
*
*
*
*
b
*
*
*
*
*
*
b
cc
dd
Paiva, LRS Capítulo II
53
Discussão
Os exemplares de Serrapinnus notomelas das três localidades amostradas
componentesdocomplexodapartelestedabaciasuperiordorioParaná,noestado
de São Paulo, apresentaram uma grande divergência cariotípica quando foram
relacionadas às estruturas cariotípicas obtidas através de bandamentos
cromossômicos (Tabela 2). Apesar das três populações (Rios Tietê, Capivara e
Córrego Campo Novo) apresentarem o mesmo número diplóide de 2n=52
cromossomos, a morfologia dos cromossomos nos cariótipos, bem como as
variaçõesencontradascomrelaçãoaoonúmerofundamentalindicamqueeventos
derearranjoscromossômicosestruturaisdevamterocorrido(Tabela1).
Pelas análises citogenéticas realizadas nos indivíduos do citótipo destas
populaçõespode-sesuporqueeventoscomoinversõespericêntricas,translocações
entre pares cromossômicos não homólogos, deleções e duplicações podem estar
levando à alterações na forma dos cromossomos sem, contudo alterar o número
diplóide. Netas populações ocorreram alterações no número de cromossomos
metacêntricos, submetacêntricose subtelocêntricos,semalteraronúmero diplóide
(2n=52cromossomos)(Tabela1).Estahipóteseéaindareforçadapelofatodequeo
número de cromossomos acrocêntricos não foi alterado entre os exemplares dos
rios Tietê, Capivara e córrego Campo Novo, citótipo I (Figuras 3a, 5a e 7a),
mantendoassimonúmerofundamental(NF=100)(Tabela1).Osexemplaresdesta
localidadedemonstramtermaiorrelaçãocromossômicacomasdemaispopulações
analisadas do que os citótipos II e III. Eventos de rearranjos cromossômicos em
peixes também foram observados por Maistro et al. (2000) em Astyanax
scabrippinis;porMolinaeGaletti(2002)empeixesrecifaisdogêneroChromis,por
Bertollo et al. (2004) em Erythrinus erythrinus; por Fernandes e Martins-Santos
(2004) em Astyanax altiparanae e por Fernandes et al. (2005) em espécies do
gêneroGymnotus,demonstrandoqueesteseventossãodecertaformafreqüentes
ocorrendo em diferentes espécies e não restritos a um grupo.
54
Localidade
2n NF metacêntrico
submetacêntrico
subtelocêntrico
acrocêntrico
Ag-NOR
Tietê
52 100 14 30 04 04 Par26
Capivara
52 100 10 30 08 04 Par26
Campo Novo
Citótipo I
52 100 12 32 04 04 Par22
Citótipo II
52 101 12 33 04 03 Par22
Citótipo III
52 102 12 34 04 02 múltipla
Tabela1-RepresentaçãodaslocalidadesamostradasparaSerrapinnusnotomelas,comnúmerodiplóide(2n),númerofundamental
(NF),morfologiacromossômica(meta-submeta-subtelo-eacrocêntrico)eparesportadoresdeAg-NOR.
55
BandamentoC
Local
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
Tietê cen cen pc,
p
cen cen cen cen cen cen cen cen cen cen cen cen cen cen
,in,
p
cen cen cen - cen cen cen cen cen -
Capivara cen cen cen,
pc
cen - cen pc,p pc,q pc,
q
cen cen in,
q
cen cen cen cen
inq
cen cen pc,
p
cen cen cen
te,q
cen cen cen
te,q
p -
Campo
Novo
CitótipoI
cen,
te,p
pc,p pc,p cen - - cen,
in,q
cen cen,
te,q
cen,
in,q
cen
te,q
pc,
q
cen in,q cen cen cen
,pc,
q
- cen - x p cen cen cen cen cen
,te,
q
Tabela2-RepresentaçãodasmarcaçõesporbandeamentoCdoscromossomosdeSerrapinnusnotomelas,capturadosemtrêslocalidades(riosTietêe
CapivaraecórregoCampoNovo)cen=centromérica;pc=pericentromérica;in=intersticial;te=peritelomérica;p=braçocurtodocromossomo;q=
braçolongodocromossomo;h=apenasumdoshomólogos;x=pardecromossomosnãopresente.De1a27representaçãodosparescromossômicos.
56
BandamentoC
Córrego
Campo
Novo
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
CitótipoI cen,
te,p
pc,p pc,p cen - - cen,
in,q
cen cen,
te,q
cen,
in,q
cen
te,q
pc,
q
cen in,q cen cen
cen,
pc,q
- cen - x p cen cen cen cen
cen,
te,q
Citótipo
II
cen pc,p cen cen cen cen cen cen cen cen,
in,q
cen Cen
,
in,q
cen in,
q
cen
,
te,q
te,
q
cen - cen
,
in,q
cen h,p p cen cen cen
,
te,q
cen h,
cen
Citótipo
III
cen pc,p cen cen cen cen cen,
te,q
cen cen cen cen cen cen
in,q
in,q pc,
q
cen cen cen cen - - p - cen h,te
,q
- x
Tabela3-RepresentaçãodasmarcaçõesporbandeamentoCdoscromossomosdeSerrapinnusnotomelasportadoresdoscitótiposI,II
eIIIcapturadosdocórregoCampoNovo.cen=centromérica;pc=pericentromérica;in=intersticial;te=peritelomérica;p=braçocurtodo
cromossomo; q= braço longo do cromossomo; h= apenas um dos homólogos; x= par de cromossomos não presente. De 1 a 27
representaçãodosparescromossômicos.
57
AutilizaçãodatécnicadebandamentoCpermitiuobservarqueamarcação
intersticialidentificadanoscromossomosdopar17dapopulaçãoanalisadadorio
Tietê(Figura3b)ésemelhanteàdospares12dorioCapivara(Figura5b)e14do
córregoCampoNovo,citótipoI(Figura8a),indicandoumapossívelorigemcomum.
O mesmo ocorre para a marcação pericentromérica existente no par 3 das três
populaçõesanalisadas(Figuras3b,5be8a)etambémparaosparesportadoresde
Ag-NOR,par26nosexemplaresdosriosTietê(Figura4a)eCapivara(Figura6a)e
par 22 do córrego Campo Novo, citótipo I (Figura 09b). Estes eventos e outras
marcações independentes identificadas nos cromossomos do exemplares das
populações analisadas sugerem que possam ter ocorrido eventos de
heterocromatinização, inversões paracêntricas e translocações, que seriam então
iniciadores do processo de especiação (Tabela 02). A ocorrência de eventos
similaresfoidescritaporSwarçaetal.(2005)emPseudoplatystomacorruscanepor
Almeida-Toledoetal.(1987)emColossomamitreieColossomamacropomun.
Os cromossomos portadores de Ag-NOR demonstraram certa estabilidade
quandoforamcomparadosexemplaresprovenientesdaspopulaçõesdosriosTietê
eCapivara(Figuras4ae6a,respectivamente),mostrandomarcaçãoconsistenteno
par26.Porém,obandamentoCrevelouquearegiãoricaemGCassociadaàNOR
estava presentesomentenapopulação do rio Capivara, demonstrando a possível
ocorrênciadeeventodeheterocromatinizaçãodestaregião(Figura05b).Omesmo
ocorreu para os exemplares analisados do córrego Campo Novo, onde o
bandamentoCfoipositivoparaaposiçãodaNORidentificadonopar22(Figura8a).
Segundo Gromicho e Colares-Pereira (2004) as regiões Ag-NORs podem
estarenvolvidasemeventosdehibridaçãoentreespéciesdiferentes,originadouma
nova espécie. De modo similar, o presente trabalho demonstra que há eventos
simultâneosdedispersãoderegiõesribossomais45Sedeinversõespericêntricas,
quando analisados os citótipos encontrados na amostra da população do córrego
Campo Novo. Nesta localidade, os exemplares coletados apresentaram três
citótipos,indicandoquerearranjoscromossômicosestruturaisnão-númericosdevem
58
ter ocorrido (Figuras 7 a, b e c), uma vez que o número diplóide encontrado
permaneceu constante com 2n= 52 cromossomos; porém, o número fundamental
varioudeNF=100,101e102,paraoscitótipoI,IIeIII,respectivamente(Figuras7
a,b e c), sendo o citótipo I o mais freqüente. As regiões Ag-NORs estiveram
presentes no par 22 para os três citótipos (Figura 9a e b), sendo estas posições
confirmadaspelaaplicaçãodatécnicadeFISHcomsondaDNAr18S(Figura9ce
d).Alémdopar22,oscitótiposIIeIIIapresentaramtambémmarcaçõesemoutros
cromossomos,caracterizando-secomoNORsmúltiplas.
DeacordocomopadrãoderegiõesAg-NORsobtidasdaspopulaçõesdorio
TietêeCapivara,oparcromossômico27docitótipoIpodeterseoriginadoapartir
de umancestralcomuma estaspopulações.Assim,oeventomais provávelseria
translocação da região ribossomal 45S do segundo par de cromossomos
acrocêntricosdocitótipoI(reconhecidocomopar26paraaspopulaçõesdorioTietê
e Capivara), para o par 22 de cromossomos submetacêntricos, dando origem ao
citótipoIatual(Ideograma1).EstainstabilidadedasregiõesdeDNAr18Slevandoà
altavariabilidadedeposiçõesetamanhosdestessegmentoscromossômicos,pode
serexplicadapelofatodequeessaregiõespoderiamsegregarindependentemente
e randomicamente, proporcionando variabilidade intra- e interespecífica, segundo
Gromichoetal.(2006).
Ideograma1-Representaçãodopossíveleventoderearranjocromossômicoocorridoapartir
deumcitótipoancestralcomumaosexemplaresdabaciadorioTietê.Ocorrênciadeinversão
pericêntrica envolvendo as regiões Ag-NORs positivas par 27 e braço curto par 22,
originandoocitótipoI.
CitótipoAncestralCitótipoI
59
Considerando-secomoprimeirahipótese,pelaqualaorigemdocitótipoIIa
partirdocitótipoI,poderiaterocorridoapartirdepossívelinversãopericêntricaem
apenas um dos cromossomos do par 27 (Ideograma 2), deve-se imaginar a
necessidade de ocorrênciade interaçõesenvolvendo indivíduos portadores destes
dois citótipos de forma a originar mais tarde o citótipo III. O mesmo poderia ter
ocorridoentreindivíduosdocitótipoIeIII,deformaaoriginarmaistardeocitótipoII.
Porém, quando analisada a região portadora de DNA ribossomal, tanto por
impregnaçãopelaPrataquantoporFISHcomsondaDNAr18S(Figura9),pode-se
especular que a origem mais parcimoniosa seria através da combinação dos
citótipos I e III. Esta origem pode ter se dado por eventos de rearranjos
cromossômicosdotipoinversãopericêntrica,ocorrerianoparcromossômico27do
citótipo I, para formar o par 21 do citótipo III (Ideograma 2). Assim, exemplares
portadoresdocitótipoIIIpoderiaminteragircomindivíduosportadoresdocitótipoI,
originado os indivíduos portadores do citótipo II, já que este apresenta-se com
apenas um cromossomos dos pares 21 e27 etambém com múltiplas marcações
Ag-NORseDNArcomsonda18S(Figura8).
Ideograma 2 - Representação do possível evento de inversão pericêntrica, envolvendo os
cromossômosdopar27,originandooscromossomossubmetacêntricosdopar22.
AsregiõesGCricasidentificadaspelobandamentoCnaregiãodeDNAr18S
confirmaram a diferença estrutural entre os três citótipos (Figura 8 a, b e c). Os
60
resultadosobtidosporbandamentoCreforçamaidéiadesteevento,poisalgumas
marcações encontradas nos citótipos parentais I e III, podem ser observadas no
citótipoII(Tabela2).Marcaçõescomoasidentificadasnoscromossomos10,23e
26docitótipoI,foramreconhecidasnocitótipoII,porémnãoidentificadasnospara
exemplares pertencentes ao citótipo III. Da mesma forma ocorre para os
cromossomos 1, 3, 9 e 17 do citótipo III, onde as marcações estão presentes no
citótipoIIeausentesnocitótipoI(Tabela2).
Opresentetrabalhodemonstrouqueosestudoscitogenéticospopulacionais
sãofundamentaisparaacompreensãodoprocessodeevoluçãocromossômicadas
espécies de peixes, dos mecanismos que regem esta evolução, quais se
manifestamprimeiro.Sãoimportantestambémparaestabelecerquaisosníveisde
alteraçõessãosuficientesparabloquearofluxogênicoentreindivíduosidentificados
comopertencentesàmesmaespécieepresentesnamesmapopulação,deformaa
estabelecer se estes grupos constituem espécies diferentes ou não. Por fim os
dados citogenéticos sugerem que os exemplares analisados do córrego Campo
Novo, possuem polimorfísmo estrutural populacional, onde o citótipo II
provavelmentenãotenhafluxogênicoemrelaçãoaoscitótiposIeIII.Dessaforma,
indivíduos pertencentes aos citótipo II talvez sejam formados unicamente pela
hibridaçãodoscitótiposIeIII.
Paiva, LRS Referências
61
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Paiva, LRS Discussão e Considerações Finais
65
5DISCUSSÃOECONSIDERAÇÕESFINAIS
RecentementeMalabarba(1998)descreveuogêneroSerrapinnuscomonovo
paraospeixesdasub-famíliaCheirodontinae,propondosete espéciesaprincípio.
Comosdadosdopresentetrabalhopode-seobservaraaltaplasticidadecariotípica
para a espécie S. notomelas, demonstrando que a sistemática morfológica a
citogenéticapopulacional,bemcomooutrosinstrumentosdeestudospopulacionais
devem ter um limiar mais estreito para que se possa ampliar o entendimento da
distribuição,biologiaeevoluçãodestegrupodepeixes.
O presente trabalho demonstrou ainda que estudos citogenéticos
populacionaiscomoosapresentadosporAlmeida-Toledoetal.(1987)eSwarçaet
al. (2005), podem ser considerados ferramentas relevantes quando se analisa
diferentes grupos populacionais de peixes. Tais estudos possibilitam a
caracterização de grupos distintos a nível cromossômico presentes ou não na
mesma bacia hidrográfica, de tal forma a auxiliar na identificação de grupos que
possivelmente não mais possuam fluxo gênico, sem que, contudo devam ser
caracterizadoscomonovasespécies.EstesaspectosforamdiscutidosnoCapítuloI,
que descreve as modificações cromossômicas observadas nos exemplares
analisadosdasdiferentespopulaçõessemque,contudotivessesidoencontradoum
mecanismosuficientementefortedemodificaçãoestruturalquefossedeterminante
paraaidentificaçãodedistintaspopulaçõespresentesnomesmoambiente.
Contudo, o estudo de indivíduos de diferentes populações do rio Tietê
(Capítulo II) permitiu estabelecer diferenças entre os cariótipos, indicando a
possibilidade de início de um processo de diversificação mais acentuado, com o
aparecimento de três citótipos bem diferenciados nos exemplares coletados no
córrego Campo Novo. Na análise dos exemplares desta população, pode-se
observar a existência de polimorfísmo cromossômico populacional a partir das
regiões mapeadas por sonda de DNAr 18S, Ag-NORs e bandamento C, onde
aparentementeocorrehibridaçãoentreosexemplaresportadoresdoscitótiposIeIII,
Paiva, LRS Discussão e Considerações Finais
66
originandoexemplaresportadoresdocitótipoII.Contudo,exemplaresportadoresdo
citótipoIIaparentementenãointeragemcomexemplaresportadoresdoscitótiposIe
III,indicandotalvezquesetratemdeduasespécies(citótipoIecitótipoIII),jáque
nãoforamencontradosindivíduosportadoresdecitótiposhíbridosentreoscitótiposI
eIIIcomocitótipoII.
Umaconsideraçãoquetambém poderiaserdiscutidarefere-seaos eventos
cromossômicos necessários que levariam à formação de novas espécies. O
presente trabalhodemonstraquehá umatendênciaprimeira paraa ocorrênciade
alterações namacro-estrutura cromossômicadas diferentes populações de bacias
hidrográficas distintas (Capítulo I), mas sem ocorrência de alterações numéricas.
Porém,quandoanalisadososexemplarespertencentesàmesmabaciahidrográfica
(CapítuloII)observa-sequeaalteraçãoocorreutantonamacro-estruturacariotípica
quantonamicro-estruturadoscromossômos.Entende-sequeapressãoseletivanos
exemplares de diferentes bacias deve ter sido menor e diferenciada, pois as
alteraçõescariotípicasforammaissutisquandocomparadasàquelasocorridasnos
exemplaresdeumadamesmabaciahidrográfica.
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