( PDF ) Citogenética comparativa de peixes ciclídeos por meio de hibridização in situ genômica (Gish) com ênfase em Oreochromis niloticus

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS

CÂMPUS DE BOTUCATU

CITOGENÉTICA COMPARATIVA DE PEIXES CICLÍDEOS POR

MEIO DE HIBRIDIZAÇÃO in situ GENÔMICA (GISH) COM

ÊNFASE EM Oreochromis niloticus

GUILHERME TARGINO VALENTE

Orientador: Prof. Dr. Cesar Martins

BOTUCATU – SP

2009

Dissertação apresentada ao Instituto de

Biociências, Câmpus de Botucatu,

UNESP, para obtenção do título de

Mestre no Programa de PG em

Biologia/AC:genética

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Livros Grátis

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Agradecimentos

Seria injusto se o primeiro agradecimento não fosse para minha família!

Aos meus pais, por tudo que me deram, ensinaram e por serem minha principal

inspiração. Apesar de tudo que passamos conseguir chegar até aqui é algo

quase inacreditável, mas acreditem: isso só ocorreu porque vocês existem.

Obrigado por tudo que sou e por me amarem. Amo vocês! Ao meu querido

irmão, por ser o meu melhor e mais fiel amigo. É também o meu único vínculo

com o passado e aquele que, no futuro, provavelmente nunca me deixará na

mão (Sunscrean). Te amo!

A Tatiana de Campos Melo, que sempre me apoiou e me afagou enquanto eu pensava

que nada daria certo. Meu pessimismo é sempre ofuscado pela calmaria de suas

palavras. Te amo minha princesinha!

Aos meus tios Edmir e Margarete, por serem pessoas que sempre me ajudaram e me

deram a mão nos momentos em que precisei e que sempre desejam muitas

coisas boas para mim. Muito obrigado!

Ao meu orientador, amigo e mentor Dr. Cesar Martins, primeiramente por me dar

oportunidade e o prazer de trabalhar com ele, por garantir o meu

desenvolvimento profissional e pessoal, por confiar à mim seriedade de uma

pesquisa, depositando assim uma inegável confiança. Agradeço também os

elogios, “broncas”, ensinamentos, por ser acessível, confiável, honesto,

verdadeiro e além de tudo, companheiro.

Ao CNPq, pelo auxílio financeiro e concessão de bolsa de estudos.

A profª. Dra. Adriane Wasko, por ser uma pessoa extremamente divertida e agradável

além de, inconscientemente, ser uma pessoa que eleva a minha auto-estima.

Ao profº. Dr. Luis Grassi e sua esposa profª. Msc. Fátima (UEMS), por serem as

pessoas que mais me incentivaram a entrar em uma pós-graduação e por serem

grandes amigos.

Ao profº. Dr. Paulo Vênere (UFMT), pelo companheirismo, caronas, colaborações e

ensinamentos, que não foram poucos.

Aos professores doutores, Guaracy Tadeu Rocha (UNESP - Botucatu) e Marta

Svartman (UFMG), por aceitarem participar da banca de mestrado.

Aos colegas de laboratório Andréia Poletto, Danillo Pinhal (amigo de república

também), Diogo Mello (risos), Juliana Mazzuchelli, Irani Ferreira, Wellcy Teixeira,

Gilberto (Provisório), Marcela (Scargot), Jéssica, e Rubens, pelas “botecadas”,

brincadeiras, ensinamentos, cooperações, discussões científicas e pelo

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companheirismo eminente. Agradecimento especial ao Diogo e Danillo, por

conselhos e discussões durante a elaboração do trabalho.

Aos colegas de outras instituições, Carlos Schneider, Claudia Gross e Eliana Feldberg

do INPA (Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia) pela amizade, conselhos

e colaboração no trabalho.

As professoras Cristiane Kioko Shimabukuru-Dias e Maeli Dal Pai Silva, por

participarem da minha banca de qualificação.

Aos amigos e amigas do meu estado, que são inúmeros, mas destaque especial para

o Manolo Sanches (o índio menos índio do Brasil), Brunão (gordo e barbudo

sempre), Gago e Baxada. Saudades de vocês!

A Ligiane Baggio, amiga e companheira, além de ser a criadora da minha nova vida.

Te adoro!

Aos amigos de república, Renato (Kékú), Adriano (Xurupito), Ângelo (Roseana), Caiqui

(Xapeleta), Danillo (Jacú), Juan “(não vai a utilizar? Passa para mim!)”, Sérgio

(Parrudo), e moradores itinerantes como o Guilherme (Caruncho) e Fabrício pela

amizade e companheirismo

Aos companheiros da UNESP, Konrado, Dani, Kelly, Fio, Varvito, Alf, Marlon, Cristiane

Dias, Monge, Esponja, Robson, Edimárcia, Antônio Sérgio (obrigado pelos

ensinamentos), Japa da genética, Emanuel, Guiodai, Moçoila, Claudinha,

Caruncho, Ricardo Benini (obrigado pelos ensinamentos), Waldo (professor da

UNEMAT), Márcio, Menudo, Vanessa, Tati, Magrela, Jú Silvério, Japa, Heraldo,

pelo companheirismo desde que cheguei à Botucatu.

Aos amigos Sérgio e Márcia, que são pessoas que fazem com que eu me sinta muito

bem.

Ao todos os funcionários do departamento de Morfologia do Instituto de Biociências da

UNESP de Botucatu, em especial a dona Terezinha e Luciana, que fazem esse

departamento funcionar.

Aos técnicos de Laboratório e amigos, Zé Eduardo (os turbinados), Ricardo e Renato.

Agradecimento especial ao Zé, que foi uma das pessoas que mais me incentivou

a essa vida Botucatuense.

A quase todos os professores credenciados no departamento de genética, pelas

disciplinas e conversas.

Aos funcionários da secretaria da pós-graduação, por serem compreensíveis e ágeis

no seu trabalho.

Ganhar? Não sei. Desistir nem tão fácil.

Muito obrigado!

Resumo

A família Cichlidae é a família mais especiosa dentre os Perciformes. Os ciclídeos são

apreciados na aquariofilia, na pesca esportiva ou alimentação, sendo a espécie

Oreochromis niloticus mais cultivada em todo o mundo. Além disso, O. niloticus é

atualmente um dos ciclídeos mais utilizados nos estudos genéticos e isto tem elevado

esta espécie a um patamar de “modelo experimental”. As análises citogenéticas dos

ciclídeos são ainda incipientes, porém em O. niloticus, as análises de heterocromatina

por bandamento C, citogenética molecular e outras ferramentas moleculares,

revelaram que o maior par cromossômico e a região pericentromérica de todos os

cromossomos são ricas em heterocromatina e em seqüências repetitivas. Análises de

complexo sinaptonêmico e de citogenética molecular revelaram que o maior par

cromossômico pode ser o par sexual da espécie. No presente estudo, a comparação

entre o genoma de O. niloticus e de outros ciclídeos, tanto africanos como sul-

americanos, por meio de GISH (técnica de citogenética molecular que utiliza o DNA

genômico total como sonda), demonstrou que pelo menos alguns elementos contidos

na heterocromatina pericentromérica dessa espécie são espécie-específicos e que

grande parte do braço longo do maior par possui seqüências conservadas, ao menos

dentro da tribo Tilapiini (compostas pelos gêneros Oreochromis, Tilapia e

Sarotherodon). Foi observado também que o genoma de O. niloticus é mais

semelhante ao genoma de Hemichromis, pelo menos em relação aos elementos

repetitivos. O maior par cromossômico é rico em seqüências repetitivas por ser um

suposto cromossomo sexual ou por resultar de uma fusão entre cromossomos que

possuíam elementos repetitivos dispersos. A hipótese de que seja um cromossomo

sexual é bastante discutível, pois os marcadores ligados ao sexo estão presentes em

outro grupo de ligação nessa espécie. De qualquer forma, a região heterocromática do

braço longo desse cromossomo, por ser uma cromatina rica em seqüências repetitivas

com alta taxa evolutiva, parece ter se tornado específica da tribo Tilapiinae.

Palavras-chave: Ciclídeos, seqüências repetitivas, cromossomos, heterocromatina,

evolução.

Abstract

The Cichlidae family is the most species-rich group of Perciformes order. This group

captures the attention of aquarium hobbyists, sport fishing and feeding, being

Oreochromis niloticus the most important in aquaculture today. In addition, this species

is currently used in studies for different areas and it has been upped to a level of

‘experimental model’ for the family. Cytogenetic analyses of the cichlids species are

still incipient, although O. niloticus has been characterized using classical and

molecular cytogenetics techniques, with special attention to the heterochromatin.

These studies have revealed that the q arm from the first chromosomal pair and the

pericentromeric regions are rich in heterochromatin and repetitive sequences. The

observation of the sinaptonemal complex and through molecular cytogenetic tools have

shown that probably the first chromosome is the sex bivalent of the species. In this

study was realized a comparison between the genome of O. niloticus and other

cichlids, from South America and Africa, using GISH technique. The results have

shown that at least some elements, contained in peri-centromeric heterochromatin of

Nile tilapia are specie-specific, and a large part of the q arm of the biggest

chromosome pair, presents sequence conservation within the Tilapiini tribe (composed

of the genus Tilapia, Oreochromis and Sarotherodon). It was also observed that

probably the genome of O. niloticus, compared with non-tilapiines tribes, is more

similar to the genome of Hemichromis, regarding for repetitive elements. It has been

observed that the first chromosome pair is rich in repetitive sequences and because

this it has supposed to be the sex chromosome or this accumulation is resultant of a

chromosome fusion. The first hyposthesis is highly debatable, due the marker sex

linked are present in another linkage group. Anyway our observations have

demonstrated that the heterochromatic region of the 1q apparently became specific to

the tribe Tilapiinae.

Keywords: Cichlidae, repeated DNAs, chromosome, heterochromatin, evolution.

RESUMO

ABSTRACT

INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

.........................................

..............

1.1. Biologia geral dos peixes ciclídeos..........................................................

1.2. Citogenética e genética de peixes ciclídeos............................................ 15

1.3. Hibridação in situ genômica (GISH) e seu potencial nos estudos de

evolução do genoma................................................................................

OBJETIVOS..................................................................

...........................

MATERIAL E MÉTODOS

........................................................

...

...........

3.1. Material Biológico.....................................................................................

3.2. Obtenção dos cromossomos mitóticos através de preparações diretas.

3.3. Extração de DNA de tecidos sólidos........................................................

3.4. Análise qualitativa do DNA.......................................................................

3.5. Preparação do DNA de bloqueio..............................................................

3.6. Análise quantitativa do DNA.....................................................................

3.7. Marcação da sonda e inserção do DNA bloqueador................................

3.8. Hibridação in situ Fluorescente – FISH....................................................

3.8.1. Desnaturação dos cromossomos mitóticos..............................

3.8.2. Desnaturação da solução sonda/DNA bloqueador e

hibridação.................................................................................

3.8.3. Lavagem pós-hibridação, detecção e contra-coloração...........

3.9. Genomic in situ Hybridization (GISH)……………………………….………

3.9.1. Controle experimental..............................................................

3.10. Análise das hibridações e processamento das imagens...............

3.11. Análise dos sinais..........................................................................

3.12.

Análise estatística..........................................................................

RESULTADOS E DISCUSSÃO

...............................................................

Comparative cytogenetics of cichlid fishes through genomic in situ

hybridization (GISH) with emphasis in Oreochromis niloticus…………...……

CONCLUSÃO

...........................................................................................

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

........................................................

1. Introdução e Justificativa

1.1. Biologia geral dos peixes ciclídeos

Mais da metade dos vertebrados ósseos viventes são animais conhecidos

como peixes (Helfmam et al., 1997; Venkatesh, 2003). É o grupo mais antigo,

diversificado e numeroso dentre os vertebrados, os quais acredita-se que incluam

mais da metade das espécies de vertebrados viventes conhecidas, sendo 25.000

espécies conhecidas e válidas para um total de 48.000 de espécies de vertebrados

conhecidas (Nelson, 2006). Além disso, a taxa de especiação mais rápida conhecida

em vertebrados é registrada entre os peixes. Como exemplo, aproximadamente 500

espécies de ciclídeos que vivem no lago Victória no leste africano surgiram por meio

de processos de especiação ocorridos nos últimos 100.000 anos a partir de poucos

ancestrais (Verheyen et al., 2003).

Os peixes com nadadeiras raiadas (Actinopterygii) compreendem

aproximadamente 23.700 espécies existentes (Nelson, 1994) e representam o grupo

mais diverso dentre os vertebrados, com vastas diferenças morfológicas e adaptativas.

Podem ser divididos em “teleósteos” (Teleostei) (grupo mais derivado) e “não

teleósteos” (Chondrostei e Holostei) (grupo mais basal). O grupo-irmão dos peixes de

nadadeiras raiadas são os peixes de nadadeiras lobadas, os quais incluem todos os

demais vertebrados ósseos (Sarcopterygii) (aproximadamente 23.600 espécies

viventes) (Venkatesh, 2003). As duas linhagens de vertebrados ósseos provavelmente

divergiram há aproximadamente 450 milhões de anos (Kumar e Hedges, 1998) (figura

1).

Os teleósteos são o maior grupo de vertebrados com aproximadamente 23.600

espécies (Maisey, 1996), compreendendo mais de 99% dos peixes viventes

(Venkatesh, 2003). Entretanto este número pode ser ainda maior, pois a cada ano

mais espécies são descritas. O mais antigo fóssil de teleósteo data de

aproximadamente 235 milhões de anos (Maisey, 1996) e evidências paleontológicas

sugerem que a radiação dos teleósteos ocorreu entre 150 a 250 milhões de anos

atrás. De qualquer forma, parece que os teleósteos têm passado por uma rápida

radiação, o qual é inigualável em relação a outros vertebrados (Venkatesh, 2003)

(Figura 1).

Figura 1

–

Evolução dos vertebrados ósseos. Os números nos nós indicam o tempo de

divergência em milhões de anos (Kumar e Hedges, 1998). O tempo de divergência dos

teleósteis está embasado no fóssil mais antigo do grupo, o qual se estima ter

aproximadamente 235 milhões de anos (Maisey et al., 1996) e diversos fósseis de

telelósteos são relatados como sendo do Jurássico e Cretáceo. A seta vermelha indica onde

provavelmente ocorreu uma duplicação total do genoma em algum teleósteo ancestral

(revisado por Venkatesh, 2003).

Acredita-se que a vasta morfologia e diversidade de espécies de teleósteos

pode estar relacionada a duplicações gênicas independentes em larga escala ou a

duplicações totais do genoma que teria ocorrido em um teleósteo ancestral (Amores et

al., 1998; Taylor et al., 2003; Meyer e Schartl, 1999). A duplicação total do genoma

gera milhares de duplicações gênicas as quais podem ser seletivamente silenciadas

em diferentes populações ou serem retidas com função parcial, levando ao isolamento

genético e especiação. A grande diversidade nas famílias de peixes tetraplóides, como

salmonídeos e catostomídeos (Allendorf e Thorgaard, 1984; Ferris, 1984) são

exemplos da radiação de espécies após duplicações genômicas (Taylor et al., 2001).

Porém, a carência de diversidade entre anfíbios poliplóides e répteis indica que a

duplicação do genoma por si só não é suficiente para a diversificação de espécies

(Venkatesh, 2003).

Mais de 9.300 espécies de teleósteos pertencem a Ordem Perciformes, que é

tida como a mais importante linhagem deste grupo e compreende 25% de todos os

vertebrados. Este grupo começou a divergir de outros grupos durante o Triássico e

desta forma tem um ancestral comum há aproximadamente 200 milhões de anos

(Kocher et al., 2003) (Figura 2).

Figura

–

Cladograma de Euteleostei, o maior grupo de teleósteos (Kocher

et al

2003)

A família de peixes Cichlidae é o grupo mais especioso dentre os Perciformes e

de todos os vertebrados, com aproximadamente 3.000 espécies com representantes

distribuídos por toda a África, América do Sul, Central e parte da América do Norte

(inclui Texas nos Estados Unidos), Madagascar, Índia, Sri Lanka, Cuba, ilha

Hispaniola, Síria, Israel e Irã, exibindo portanto uma distribuição gonduânica (Stiassny,

1991; Zardoya et al., 1996; Chakrabarty, 2004; Kocher, 2004; Sparks e Smith, 2004;

Nelson, 2006) (Figura 3). Além disso, os ciclídeos representam o maior clado de

Euteleostei de água doce (Nelson, 2006). Somente o continente africano apresenta

mais de 1.500 espécies e a maior diversidade dentro da família, as quais são

encontradas nos grandes lagos do leste africano (Victoria, Tanganyika e Malavi)

(Trevawas, 1983; Turner e Genner, 2005), onde se estima terem surgido cerca de

2.000 espécies somente nos últimos 10 milhões de anos de anos (Kocher, 2004). Em

outro exemplo, aproximadamente 500 espécies de Ciclídeos que colonizaram o Lago

Victoria no leste Africano surgiram a partir de apenas alguns ancestrais há 100.000

anos (Verheyen et al., 2003). O principal fator que promove este tipo de adaptação a

novos ambientes é o fato de que eles se adéquam facilmente a condições extremas de

habitats e nichos (Moyle e Cech Jr., 2000). A distribuição desta família sugere terem

se originado na Gonduana há aproximadamente 100 milhões de anos. A grande

radiação adaptativa dos ciclídeos tem atraído uma maior atenção por parte dos

pesquisadores para este grupo de peixes. Além dos aspectos evolutivos, estes peixes

também exibem propriedades fisiológicas que os tornam valiosos modelos para estudo

em diversas áreas da biologia. Além disso, algu

importância para a aqüicultura mundial (Trewavas, 1983; Stiassny

al., 1996; Kocher et al

., 200

Figura 3: Diversidade de espécies na família Cichlidae.

Smith et al

. (2008)

monofilético e,

corroborando Sparks e Smith (2004)

família é composta de

Ptychochrominae (ciclídeos de Madagascar)

Pseudocrenilabrinae (ciclídeos africanos) (

(Pseudocrenilabrinae) e os ciclídeos neotropicais (Cichlinae) são monofiléticos e

representam táxons irmãos (Smith

suportados por dados prévios (Sparks

em concordância com outros dados morfológicos e/ou moleculares combinados

(Farias et al

., 1999, 2000, 2001; Sparks, 2004; Sparks e Smith, 2004).

(1998) hav

ia incluído os Ptycochrominae como Cichlinae, mas agora os membros de

adagascar desta subfamília estão

africanos+ciclídeos neotropicais e

um grupo-irmão de

todas as outras subfamílias.

exceto os de Madagascar, representam um grupo monofilético (Smith

também exibem propriedades fisiológicas que os tornam valiosos modelos para estudo

em diversas áreas da biologia. Além disso, algu

mas espécies são de grande

importância para a aqüicultura mundial (Trewavas, 1983; Stiassny

1991; Zardoya

., 200

3; Kocher, 2004; Nelson, 2006).

Figura 3: Diversidade de espécies na família Cichlidae.

. (2008)

demonstraram

que a família Cichlidae é um grupo

corroborando Sparks e Smith (2004)

suportam a hipótese de que a

família é composta de

quatro

subfamílias: Etroplinae (ciclídeos indianos),

Ptychochrominae (ciclídeos de Madagascar)

, Cichlinae

(ciclídeos neotropicais) e

Pseudocrenilabrinae (ciclídeos africanos) (

Figura 4). Os ciclí

deos africanos

(Pseudocrenilabrinae) e os ciclídeos neotropicais (Cichlinae) são monofiléticos e

representam táxons irmãos (Smith

et al.,

2008). Estes resultados tamb

suportados por dados prévios (Sparks

e Smith, 2004) e o clado de

neotropicais estão

em concordância com outros dados morfológicos e/ou moleculares combinados

., 1999, 2000, 2001; Sparks, 2004; Sparks e Smith, 2004).

ia incluído os Ptycochrominae como Cichlinae, mas agora os membros de

adagascar desta subfamília estão

incluídos como grupo-irmão

do clado de ciclídeos

africanos+ciclídeos neotropicais e

além disso, a subfamília Etroplinae é considerada

todas as outras subfamílias.

odas as linhagens continentais,

exceto os de Madagascar, representam um grupo monofilético (Smith

et al

também exibem propriedades fisiológicas que os tornam valiosos modelos para estudo

mas espécies são de grande

1991; Zardoya

que a família Cichlidae é um grupo

suportam a hipótese de que a

subfamílias: Etroplinae (ciclídeos indianos),

(ciclídeos neotropicais) e

deos africanos

(Pseudocrenilabrinae) e os ciclídeos neotropicais (Cichlinae) são monofiléticos e

2008). Estes resultados tamb

ém são

neotropicais estão

em concordância com outros dados morfológicos e/ou moleculares combinados

., 1999, 2000, 2001; Sparks, 2004; Sparks e Smith, 2004).

Kullander

ia incluído os Ptycochrominae como Cichlinae, mas agora os membros de

do clado de ciclídeos

além disso, a subfamília Etroplinae é considerada

odas as linhagens continentais,

et al

., 2008).

Figura 4

Filogenia de Cichlidae combinando

nove

genes (

quatro

mitocondriais e

cinco

nucleares)

e noventa e um caracteres morfológicos, incluindo o fóssil Proterocara (Smith et al., 2008).

Apesar da grande importância evolutiva do grupo africano, as relações

filogenéticas ainda são confusas (Takahashi et al., 1998). Os ciclídeos africanos

podem ser divididos em três grandes grupos: Pelmatochromine, Haplochromine e

Tilapiine (Lowe-McConnell, 1999), porém estes grupos não são reconhecidos como

unidades taxonômicas válidas por muitos pesquisadores e a classificação correta das

espécies africanas ainda permanece indefinida (Liem et al., 1991).

Os Haplochromine do leste e centro da África, especialmente os dos lagos do

Rift Valley, passaram por um evento de radiação extraordinário e atualmente são

considerados como um exemplo clássico de radiação adaptativa (Liem et al., 1991).

Acredita-se que existam 500 à 1.000 diferentes espécies adaptadas a nichos

específicos somente no Lago Malawi (Stiassny, 1991).

A tribo Tilapiine, cujas espécies são comumente denominadas de tilápias, inclui

os gêneros Sarotherodon, Oreochromis e Tilapia, e um quarto gênero, Danakilia, que

compreende uma única espécie (Kubitza, 2005). Os Haplocromineos diferem dos

Tilapiineos por diferenças na anatomia craniana e acredita-se que estas diferenças

tenham surgido num processo de divergência entre ambos há aproximadamente 10

milhões de anos (Trewavas, 1983).

Embora aproximadamente 70 espécies de ciclídeos recebam a denominação

de “tilápia”, somente Oreochromis niloticus, Oreochromis mossambicus e Oreochromis

aureus, e seus híbridos, têm grande importância na piscicultura mundial (Kubitza,

2005). Em cerca de 80 países em desenvolvimento as tilápias foram introduzidas com

o intuito de promover a subsistência de tais países e atualmente a sua produção

mundial ultrapassa 800.000 toneladas por ano (Lovshin, 1997; Boscolo et al., 2001).

As primeiras espécies a serem utilizadas para criação foram O. mossambicus e Tilapia

rendalli, mas a que apresentou características mais favoráveis à criação em cativeiro

foi Oreochromis niloticus (tilápia nilótica) (Popma e Masser, 1999). Mais recentemente,

a tilápia nilótica foi introduzida em vários países e atualmente é considerada a principal

espécie de tilápia cultivada no mundo, representando cerca de 75% da produção

pesqueira mundial (Stickney, 1996). Além disso, sua alta capacidade adaptativa a

ambientes de diferentes salinidades, permite atividades econômicas em águas

salobras e salgadas (Kubitza, 2005).

Além da importância social das espécies de ciclídeos, segundo Kocher et al.

(2003, 2004), os aspectos evolutivos são muito problemáticos na família e exibem

também propriedades fisiológicas que os tornam verdadeiros “ratos de laboratórios”.

Devido à notável robustez da espécie O. niloticus, por exemplo, é possível a

realização de diversas práticas experimentais, principalmente genéticas.

Todos esses fatores, fazem da tilápia nilótica um excelente modelo de estudos,

tornando-a um tipo de “organismo modelo” dentre os ciclídeos.

Os ciclídeos Neotropicais (Cichlinae) possuem 51 gêneros e aproximadamente

460 espécies (Kullander, 2003; Rican e Kullander, 2006; Chakrabarty e Sparks, 2007;

Schmitter-Soto, 2007). Além disso, o mais recente trabalho de filogenia no grupo,

designou que a subfamília Cichlinae possui sete tribos: Cichlini, Retroculini,

Astronotini, Chaetobranchini, Geophagini, Cichlasomatini and Heroini (Smith et al.,

2008) (figura 4). A região Neotropical possui também diversos fósseis importantes

(Casciotta e Arratia, 1993), como a espécie Proterocara, um fóssil do Eoceno

encontrado na Argentina (Malabarba et al., 2006) e que representa o fóssil mais antigo

de ciclídeos, atualmente incluído dentro da tribo Geophagini (Smith et al., 2008).

Na maior parte do século 20, a taxonomia dos ciclíneos seguiu Regan (1906).

O conhecimento da evolução dos ciclídeos alterou-se significantemente depois da

conclusão do trabalho de Cichocki (1976), avançando no conhecimento das relações

dos ciclídeos e ciclíneos. Posteriormente, ocorreram avanços no conhecimento das

inter-relações da família (Oliver, 1984; Stiassny, 1987, 1991). Porém, estes estudos

tiveram como ênfase as relações da família como um todo, proporcionando poucas

informações adicionais nas relações internas dos ciclíneos. Várias revisões e estudos

geográficos foram publicados, provendo um refinamento da taxonomia dos ciclídeos,

bem como a diagnose e descrição de diversos gêneros sul-americanos (Kullander,

1983, 1986, 1988; Kullander e Nijssen, 1989; Kullander e Staeck, 1990).

O conhecimento da filogenia dos ciclídeos sul-americanos aumentou com a

publicação de Kullander (1998), na qual foi proposta a primeira filogenia a nível de

gênero. Essa filogenia proposta foi baseada na análise de dados morfológicos que

avaliou e incorporou filogenias prévias e caracteres taxonômicos além de incluir

também novos caracteres nas análises.

Subseqüentemente, diversos estudos moleculares forneceram informações

sobre as relações entre os ciclíneos (Farias et al., 1999, 2000, 2001; Sparks, 2004;

Sparks e Smith, 2004). As combinações de estudos morfológicos e moleculares têm

demonstrado um monofiletismo para os “Chaetobranchini”, “Cichlasomatini”,

“Geophagini” (freqüentemente incluindo Crenicichla) e “Heroini” [incluindo todos os

membros da América Central (exceto poucos Cichlasomatini e Geophagini) e os

ciclídeos das Antilhas], mas as inter-relações desses clados (todos tratados como

tribos a partir de Smith et al., 2008) e a inter-relação e inclusão/exclusão dos gêneros

Acaronia, Astronotus, Cichla, Crenicichla e Retroculus permaneciam controversas

(revisado em Smith et al., 2008). A mais nova filogenia de ciclídeos (Smith et al., 2008)

foi baseada em cinco fragmentos de genes nucleares e quatro fragmentos de genes

mitocondriais, nos 91 caracteres morfológicos identificados por Kullander (1998), nos

dados morfológicos de Mazarunia (Kullander, 1990) e do fóssil Proterocara (Malabarba

et al., 2006). A subfamília Cichlinae foi recuperada como um grupo monofilético, mas

as relações dentro da subfamília diferiram de todas as hipóteses prévias. Atualmente

os ciclíneos incluem sete tribos, sendo que as grandes mudanças foram a alocação de

Chaetobranchini como tribo, a alocação de Crenicichla, Proterocara e Teleocichla

como Geophagini e a inclusão de Acaronia como Cichlasomatini. Houve uma falta de

resolução na topologia envolvendo rearranjos dos clados compostos por Crenicichla,

pelo fóssil Proterocara e por Teleocichla, devido à ausência de dados morfológicos

para Teleocichla e a ausência de dados moleculares para Proterocara (revisado por

Smith et al., 2008).

Kullander (1998) considera Cichla, Retroculus e Astronotus como os nomes

típicos para as subfamílias de ciclídeos e Sparks e Smith (2004) e Smith et al., (2008)

propuseram que Cichla, Retroculus and Astronotus devem ser tratados como tribos

monogenéricas dentro dos ciclídeos neotropicais (Cichlinae), sendo então

denominados de Cichlini, Retroculini e Astronotini, respectivamente. Smith et al.,

(2008) colocou os gêneros Astronotus, Cichla e Retroculus fora do clado composto de

Chaetobranchini, Cichlasomatini, Geophagini e Heroini (Figura 4).

Os Cichlini e Retroculini são grupos-irmão e formam um clado que é grupo-

irmão de todos os outros Cichlinae (Figura 4). A tribo Astronotini foi enquadrada como

grupo-irmão do clado composto pelas tribos Chaetobranchini, Cichlasomatini,

Geophagini e Heroini (Smith et al., 2008).

Kullander (1998) considera os Geophagini (denominação de tribo por Smith et

al., 2008) como a subfamília Geophaginae. Atualmente, essa tribo (Geophagini) é o

grupo-irmão de Chaetobranchini e juntos formam um clado que é grupo-irmão do clado

Cichlasomatini e Heroini (Smith et al., 2008) (Figura 4). Através de dados combinados

e análises combinadas, o gênero Crenicichla foi alocado dentro dos Geophagini

(Farias et al., 1999, 2000, 2001; Sparks, 2004; Sparks e Smith, 2004; Smith et al.,

2008), ao passo que Kullander (1998) alocou este gênero em Cichlinae (sensu stricto).

A tribo Cichlasomatini é grupo-irmão de Heroini (Smith et al., 2008) (Figura 4).

Entre os Heroini sul-americanos, a monofilia do gênero dentro do clado “deep-bodied”

(Heros, Mesonauta, Pterophyllum, Shymphysodon e Uaru) tem sido previamente

discutida (Kullander, 1986; Kullander e Silfvergrip, 1991; Bleher et al., 2007; revisado

por Smith et al., 2008).

Na primeira filogenia molecular em nível de família para os ciclídeos, Farias et

al. (1999) notaram que os ciclídeos neotropicais possuem níveis de variação genética

significantemente maiores do que o grupo-irmão Pseudocrenilabrini (grupo africano).

Argüiu-se que os Cichlinae têm passado por uma acelerada taxa de evolução

molecular e que uma taxa evolutiva particularmente alta foi encontrada dentro de

Geophagini. Em acordo com Farias et al. (2000, 2001), Smith et al. (2008)

demonstraram suporte para estas idéias pelo fato dos Geophagini possuírem ramos

comparativamente maiores. A respeito desses ramos encontrados dentro do

Geophagini (Farias et al., 1999), López-Fernández et al. (2005) sugeriram que o grupo

representou uma radiação adaptativa que foi caracterizada, em partes, por “curtos

ramos basais”. López-Fernández et al. (2005, p. 242) concluiram que foi “improvável

que a perda de resolução (do clado Geophagini) e suporte na base da árvore dos

Geophagini é devido a um dado insuficiente ou inadequado. Ao invés disso, os curtos

ramos na base da árvore sugerem que os diferentes gêneros de Geophagini podem

ter-se originado rapidamente e/ou sobre um curto período” de tempo.

Em termos econômicos, muitas espécies de ciclídeos sul-americanos

representam fontes importantes para aquariofilia, como as espécies dos gêneros

Symphysodon, Pterophyllum e Astronotus. Outras espécies, como aquelas

pertencentes ao gênero Cichla (tucunarés), são muito apreciadas para pesca esportiva

e consumo. No Brasil, os ciclídeos representam 6% da fauna dos peixes de água doce

(Feldberg, 2003), mas integram apenas 2% do total de peixes exportados e, além

disso, desempenham um papel muito importante, além da pesca, em atividades de

recreação, comércio e ecoturismo (Britski et al., 1986). Em suma, as espécies de

Ciclídeos existente na América do Sul apresentam um colorido fascinante, tornando as

espécies de pequeno porte as preferidas pelos aquariofilistas, enquanto as de grande

porte são muito utilizadas na alimentação e pesca esportiva (Axelrod, 1996).

1.2. Genética de peixes ciclídeos

Apesar das diversas filogenias descritas, poucos estudos genéticos foram

realizados sobre o ciclídeos Neotropicais, sendo a maioria deles relacionado a dados

citogenéticos (Feldberg et al., 2003; Mesquita et al., 2008; Mazzuchelli e Martins,

2008). Cerca de 135 espécies de ciclídeos já foram analisadas citogeneticamente, e

observou-se que o número diplóide varia de 38 a 60 cromossomos. O número diplóide

está intimamente relacionado à distribuição geográfica das espécies, uma vez que os

ciclídeos africanos apresentam 2n modal = 44 cromossomos enquanto que os da

região Neotropical possuem 2n modal = 48 cromossomos (Feldberg et al., 2003). Além

disso, não ocorre a presença de cromossomos sexuais, mas já foi relatada a

existência de cromossomos Bs (supernumerários) para algumas espécies como

Crenicichla reticulata, Cichla monoculos e Cichla sp. (Feldberg et al., 2004).

Assume-se que o número de espécies analisadas reflete poucos dados sobre a

família (Feldberg et al., 2004), visto que menos de 5% dos ciclídeos foram analisados

citogeneticamente e que a maioria dos estudos restrigem-se a trabalhos de

citogenética básica. Segundo Martins et al. (2004), as análises são principalmente

direcionadas para o conhecimento básico da estrutura cariotípica e poucos trabalhos

foram realizados visando o mapeamento cromossômico com a utilização de sondas de

DNA.

Em suma, a maioria dos trabalhos realizados visaram estabelecer o número

diplóide, organização da heterocromatina e localização das regiões de DNAr 18S.

Assim, avanços em relação à citogenética desta família de peixes são necessários e

mostram-se promissores para uma melhor compreensão dos mecanismos de rearranjo

cromossômico que estiveram envolvidos durante a diversificação dos ciclídeos. O

emprego de metodologias como a citogenética molecular, que visam estabelecer as

relações entre os genomas e sua organização cromossômica, é de extrema valia na

compreensão da história evolutiva desta família de peixes.

Os estudos genéticos e de citogenética molecular têm demonstrado que as

seqüências de DNA e genes podem ser muito úteis como ferramentas para definir a

estrutura e revelar a organização e evolução do genoma das espécies, além da

grande possibilidade de suas localizações nos cromossomos serem utilizadas como

marcadores entre diferentes espécies (Martins, 2007).

Diversos genomas de peixes encontram-se totalmente ou parcialmente

seqüenciados e à disposição da comunidade científica. Como exemplo pode-se

destacar os baiacús Fugu rubripes (Aparicio et al., 2002);

www.jgi.doe.gov/fugu/index.html) e Tetraodon fluviatalis (Crollius et al., 2002;

www.genoscope.cns.fr/extreme/tetraodon/), o paulistinha Danio rerio

(www.sanger.ac.uk/Projects/D_rerio/) e o medaka Oryzias latipes (Shima et al., 2003).

Apesar dos Perciformes compreenderem aproximadamente 25% de todos os

vertebrados, eles não têm sido o foco de qualquer projeto de seqüenciamento de

genoma (Kocher et al., 2003).

Dentre os ciclídeos estudados até o momento, a espécie O. niloticus, devido ao

seu valor econômico e sua facilidade adaptativa, tornou-se um excelente modelo

experimental para estudos em genética. Esta espécie apresenta n=22 cromossomos

(Kornfield et al., 1979) (Figura 5) e 1,2 picogramas de DNA por núcleo haplóide (cerca

de 10

pares de bases) (Hinegardner e Rosen, 1972). Existe um mapa genômico de

Tilapiinae baseado em microssatélites e AFLPs (Amplified Fragment Length

Polymorphisms) de O. aureus, O. mossambicus e Sarotherodon galilaeus (Agresti et

al., 2000), bibliotecas genômicas para as espécies O. niloticus (Katagiri et. al., 2001),

Haplochromis chilotes (Watanabe et. al., 2003), mapas de ligação a partir de

microssatélites e AFLPs para a espécie O. niloticus (Kocher et. al., 1998; Lee et al.,

2005), mapa físico cromossômico de sequências repetidas de DNA em O. niloticus

(Martins et. al., 2004) e mapa físico cromossômico de BACs (Bacterial Artificial

Chromosomes) contendo seqüências repetidas de DNA da tilápia do Nilo (Ferreira e

Martins, 2008).

Os trabalhos de mapeamento físico cromossômico têm utilizado a técnica de

hibridização in situ fluorescente (FISH) para a análise da distribuição genômica de

seqüências de cópia única e de seqüências repetidas de DNA. As seqüências

repetidas constituem uma classe importante de marcadores de grande valor para a

citogenética molecular. Estudos das seqüências repetitivas de DNA têm-se mostrado

úteis no esclarecimento de uma miríade de questões, incluindo estrutura centromérica

e telomérica, origem e evolução de cromossomos sexuais e cromossomos B e

evolução do genoma como um todo. Tais seqüências podem ser usadas também para

o mapeamento físico do genoma, contribuindo para o desenvolvimento de marcadores

genéticos importantes para a biologia básica e aplicada das espécies (Galetti e

Martins, 2004).

Quanto ao mapeamento cromossômico em O. niloticus, diferentes estudos têm

demonstrado a existência de grande quantidade de seqüências repetitivas no par

cromossômico de maior tamanho dessa espécie (Oliveira et al., 1999, 2003; Harvey et

al., 2003; Ferreira e Martins, 2008).

Fig. 5

–

Cariótipo da Tilápia do Nilo (

Oreochromis niloticus

). SM, cromossomo submetacêntrico,

ST/A,,

cromossomos subtelo- acrocêntricos.

O maior par cromossômico de O. niloticus apresenta um não pareamento

durante a meiose e foi identificado como possível par sexual de um sistema XX/XY

(Carrasco et al., 1999). Outras evidências apontam-no como par cromossômico

sexual: análises revelam que ele é rico em seqüências repetidas de DNA e apresenta

o braço longo rico em heterocromatina (Majundar e McAndrew, 1986; Oliveira et al.,

1999, 2003; Harvey et al., 2003; Ferreira e Martins, 2007).

Entre os tilapiíneos, foram identificados ao menos dois locos principais

envolvidos na determinação sexual. Por meio de análises de FISH, demonstrou-se que

esses locos estão separados em cromossomos não homólogos. A utilização de

diversos marcadores moleculares apontam que o grupo de ligação 3 (LG3) localiza-se

no maior cromossomo da tilápia do Nilo e o marcador LG1 em um cromossomo menor.

Esses dois locus também diferem no modo de ação sendo o loco do LG1 um

determinador dominante masculino (XY) enquanto o loco LG3 um marcador dominante

feminino (ZW). Analisando a herança dos alelos ligados a determinação sexual, foi

possível verificar que o sexo heterogamético é diferente entre as espécies de

tilapiíneos e que há dois diferentes locus e não alelos para um simples locus de

determinação sexual. Acredita-se que esses dois locus contribuam para a

determinação sexual em algumas espécies (Cnaani et al., 2008). Por causa da não

total explicação das diferenças entre as proporções das progênies de tilapiíneos,

sugere-se um modelo mais complexo de cromossomos sexuais argumentando-se que

locus autossômicos também participam da determinação sexual (Hammerman e

Avtalion, 1979).

Citogeneticamente, o cromossomos portados do LG3 possui as características

de um cromossomo sexual relativamente antigo em O. niloticus, com uma ampla

região com supressão de recombinação e um acúmulo de elementos repetidos

(Cnaani et al., 2008). Foi relatado também um retardo no pareamento meiótico

(Carrasco et al., 1999) e o acúmulo de elementos repetitivos como transposons e

retrotransposons (Oliveira et al., 1999; 2003; Harvey et al., 2003; revisado em Martins

et al., 2004; Ferreira e Martins, 2007), como já mencionado. Sugere-se que a

supressão de recombinação e o pareamento incompleto do cromossomo maior (LG3)

em espécies como O. niloticus, espécie no qual os loci de determinação sexual estão

localizado no LG1, pode refletir uma história evolutiva inicial do cromossomo maior

como um cromossomo sexual diferenciado (Cnaani et al., 2008).

Acredita-se que o estado ancestral do clado Oreochromis spp. foi um sistema

com uma fêmea heterogamética com o maior locus determinante de sexo localizado

no LG3, como visto hoje em Oreochromis aureus e Oreochromis karongae (Cnaani et

al., 2008). O locus LG1 pode possuir um gene secundário de determinação sexual o

qual permaneceu polimórfico durante a diversificação do gênero Oreochromis. Em

poucas linhagens este gene parece ter tomado controle da via de determinação

sexual, mudando o mecanismo da via de determinação sexual de fêmea para machos

heterogaméticos. Talvez uma nova mutação em um locus de determinação sexual

tenha mudado-o, mudando conseqüentemente o sexo heterogamético (Cnaani et al.,

2008), como observado em Drosophila melanogaster (Pomiankowski et al., 2004).

Embora avanços tenham sido obtidos em relação ao mapeamento genético de

loci relacionados a sexo nas tilápias, as análises não foram ainda extrapoladas para a

citogenética. Dessa forma, o mapeamento físico do cromossômico de marcadores

presentes nos grupo de ligação 1 e 3, assim como de marcadores contendo

seqüências repetidas de DNA, podem trazer grandes contribuições ao entendimento

da origem e evolução dos cromossomos sexuais nestes organismos.

1.3. Hibridação in situ genômica (GISH) e seu potencial nos estudos de

evolução do genoma

Desde a publicação da primeira detecção de seqüências de DNA em

cromossomos e células de Xenopus por hibridização in situ (ISH), utilizando-se uma

sonda de RNAr 18S e 28S (Pardue e Gall, 1969), uma série de variações têm sido

criadas para esta técnica como o uso de fluoróforos na detecção das sondas e dos

cromossomos, uso DNA genômico como sonda (Genomic in situ Hybridization), FISH

com duas ou mais sondas hibridizando simultaneamente e diferencialmente marcadas,

CGH (Comparative Genomic Hybridization), Pintura cromossômica [Whole

Chromosome Painting (WCP) ou Partial Chromosome Painting (PCP)], SKY (Spectral

Karyotyping), M-FISH (Multicolor FISH), MCB (Chromosome multicolor banding),

sondas gênicas, sondas de seqüências repetidas, sondas de miRNA (micro RNA) e

outros tipo de RNA. Além disso, algumas das variações podem ser aplicadas em

células interfásicas, fibras de cromatina, cromossomos mitóticos e meióticos, tecidos e

até em embriões (Pinkel et al., 1986; Raap et al., 1996; Schröck et al., 1996; Stace e

Bailey, 1999; Liehr et al., 2002; Tönnies, 2002; Guerra, 2004; Padilla-Nash et al., 2007;

Schröck et al., 2006; Palevitch et al., 2007; Wheeler et al., 2007). Embora a FISH

venha sendo usada nos mais diversos organismos, os avanços são mais notórios em

plantas e mamíferos.

A técnica de GISH foi originalmente desenvolvida para linhagens de células

hibridas animais (Pinkel et al., 1986), porém o termo foi cunhado em um trabalhado

realizado em planta (Schwarzacher et al., 1989). Esta técnica envolve a extração de

DNA total de um organismo, o qual é utilizado como sonda para hibridação in situ em

uma célula alvo de outro organismo (Stace e Bailey, 1999).

A técnica de bloqueio pode também ser usada, por meio do qual a sonda é

misturada com um excesso de DNA não marcado de um genoma não alvo

(bloqueador), o que permitirá que hibridem apenas as seqüencias específicas do

genoma alvo (especialmente as porções contendo elementos repetidos dispersos,

como elementos transponíveis). A quantidade de bloqueador pode ser um fator crítico

para o experimento. Se o genoma alvo for muito divergente do genoma utilizado como

sonda, nenhum bloqueador necessita ser utilizado. No entanto, alguns trabalhos

utilizam até uma relação de 1:100 de sonda/bloqueador (revisado em Stace e Bailey,

1999; revisado em Kato et al., 2005).

A GISH pode ser utilizada também em células em qualquer estágio da divisão,

tanto em meiose quanto em mitose e, em alguns casos, os resultados são

semelhantes à FISH utilizando-se sondas de elementos repetidos dispersos por todo o

genoma (Lapitan et al., 1986; revisado em Stace e Bailey, 1999).

A GISH tem sido aplicada a quatro linhas principais de investigação:

1- Disposição dos cromossomos – A GISH essencialmente relaciona-se à

células híbridas somáticos ou sexuais, bem como poliplóides, em que dois ou mais

genomas diferentes ocorrem juntos na célula. Nesse caso, esta técnica pode ajudar a

identificar domínios cromossômicos ou genômicos (revisado em Stace e Bailey, 1999);

2- Identificação de genomas – A GISH pode ser usada para identificar

diferentes genomas em poliplóides naturais (Benabdelmouna et al., 2001; Guimarães

et al., 2008), artificiais (revisado em Stace e Bailey, 1999), híbridos somáticos (Zhao et

al., 2008), anfidiplóides (Chen e Wu, 2008) e anfiplóides parciais (Sepsi et al., 2008).

Nestes casos, os diferentes genomas podem ser distinguidos utilizando-se

simultaneamente sondas dos supostos genomas ancestrais. O uso de diferentes

fluoróforos em cada suposto genoma ancestral produz várias cores nos cromossomos

alvos (revisado em Stace e Bailey, 1999);

3- Reconhecimento de partes do genoma – A GISH é igualmente efetiva

na detecção de cromossomos sem um par ou segmentos de cromossomos em células

de outro organismo. Como exemplo pode-se identificar cromatina alien em um

organismo (Wetzel e Rayburn, 2000), o qual pode ser parte de cromossomos ou até

um cromossomo inteiro, através do uso de DNA genômico proveniente da espécie de

outra natureza em híbridos interespecíficos (revisado em Stace e Bailey, 1999; Zhou et

al., 2008). Recombinações e translocações intergenômicas (Bi e Bogart, 2006; Bi et

al., 2007) ou recombinações intergenômicas em células híbridas ou anfidiplóides

contendo dois ou mais genomas podem também ser demonstrados por GISH

(revisado em Stace e Bailey, 1999);

4- Cromossomos B – A GISH parece ideal para a investigação da origem

dos cromossomos B. Têm-se demonstrado que o cromossomo B pode ser

parcialmente ou completamente marcado com uma sonda genômica da mesma

espécie, porém sem B (revisado em Stace e Bailey, 1999; Endo et al., 2008).

Além dos usos descritos acima, esta técnica foi também usada para investigar

a conservação genômica de um grupo e detectar regiões espécie-especifica entre os

genomas de Didelphidae (marsupiais da América) (Svartman e Vianna-Morgante,

1999).

No presente trabalho utilizou-se a técnica de GISH com o objetivo de detectar

regiões espécie-específica no genoma do ciclídeo Oreochromis niloticus, em

comparação com o genoma de ciclídeos africanos e sul-americanos, os quais foram

utilizados como DNA bloqueador das regiões em comum com o DNA genômico total

da tilápia nilótica (utilizada como sonda).

2. Objetivo

Rastrear regiões espécie-específicas da espécie de Ciclídeo Africano

Oreochromis niloticus com o uso de uma variação da técnica de citogenética

molecular, a Genomic in situ Hybridization, e investigar o grau de conservação do

genoma de O. niloticus em relação a outras espécies de ciclídeos.

3. Material e métodos

3.1. Material Biológico

Foram utilizadas no presente trabalho as espécies apresentadas na tabela 1.

Tabela 1- Espécies analisadas no presente trabalho.

Espécies

Utilização

Grupo

Oreochromis niloticus

Sonda, alvo e DNA bloqueador

ciclídeos africanos

Oreochromis karongae

DNA bloqueador

Oreochromis aureus

DNA bloqueador

Sarotherodon galilaeus

DNA bloqueador

Haplochromis obliquidens

DNA bloqueador

Hemichromis bimaculatus

DNA bloqueador

Astronotus ocellatus

DNA bloqueador

ciclídeos sul-americanos

Geophagus brasiliensis

DNA bloqueador

Crenicichla sp.

DNA bloqueador

Aequidens tetramerus

DNA bloqueador

Os espécimes foram mantidos em aquário aerado até o momento das

preparações cromossômicas e coleta de tecido para extração de DNA. A partir do

material coletado foram preparadas suspensões celulares para análises de

cromossomos mitóticos sendo também retiradas amostras de tecido (fígado ou

músculo) fixadas e estocadas em álcool 100% a -20° C para posterior extração de

DNA. Os exemplares foram fixados em formol 4% e conservados em álcool 70% para

armazenamento.

3.2. Obtenção dos cromossomos mitóticos através de preparações diretas

Os cromossomos mitóticos foram obtidos de acordo com a metodologia

adaptada para peixes por Bertollo et al. (1978). A espécie utilizada para as

preparações cromossômicas foi o ciclídeo africano Oreochromis niloticus (tilápia do

Nilo)

1. Injetar intraperitonealmente colchicina 0,0025% na proporção de 0,1 ml para

cada 100 g de peso do animal;

2. Deixar o peixe em aquário bem aerado por 40 minutos. Em seguida sacrificá-

lo e retirar a porção anterior do rim transferindo-o para uma solução hipotônica de KCl

0,075 M (6-8 ml);

3. Misturar bem o tecido com o auxílio de uma seringa de vidro. Retirar o

sobrenadante (suspensão celular) com o auxílio de uma pipeta Pasteur e colocar em

tubo de centrífuga;

4. Incubar a suspensão celular obtida em estufa a 37 °C por 23 minutos;

5. Pré-fixar com 6 gotas de metanol:ácido acético (3:1) e ressuspender o

material pipetando bem devagar por 100 vezes;

6. Deixar descansar por 5 minutos, adicionar fixador até encher o tubo e

posteriormente realizar a ressuspensão;

7. Centrifugar a 800 rpm por 10 minutos. Descartar o sobrenadante e completar

para 6ml com fixador pipetando por mais 100 vezes;

8. Centrifugar a 1.000 rpm por 10 minutos, descartar o sobrenadante e

completar novamente para 6ml de fixador, repetindo essa lavagem por mais duas

vezes;

9. Após a última lavagem, ressuspender o material em fixador até que tome um

aspecto um pouco turvo;

10. 24 horas antes da GISH, pingar 200 µl da preparação em uma lâmina pré-

aquecida em água destilada a 60°C 24 horas antes da GISH. Acondicionar o material

em uma estufa a 37 °C.

3.3. Extração de DNA de tecidos sólidos

A extração de DNA foi realizada segundo Sambrook e Russel (2001) com

pequenas modificações.

1. Secar o tecido (fígado ou músculo) em papel toalha a fim de retirar o

excesso de etanol;

2. Macerar em um cadinho contendo nitrogênio líquido aproximadamente

0,045g de tecido. A grande quantidade de DNA exigido justifica a grande

quantidade de tecido a ser utilizada na extração;

3. Acrescentar 10 ml da solução de digestão (NaCl 0,4 M; EDTA 0,1 M pH 8,0;

Proteinase K 100µg/ ml; SDS 0,1%) e homogeneizar com a ajuda de um

macerador;

4. Transferir o material para dois tubos Falcon de 15 ml, incubar em banho-

maria a 50 °C até dissolver todo o tecido restante. Homogeneizar o material

periodicamente;

5. Dobrar o volume com uma solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico

(50:48:2) e agitar suavemente por 15 minutos;

6. Centrifugar a 5.000 rpm por 5 minutos e transferir a fase superior para

novos tubos;

7. Repetir o passo 5 e posteriormente adicionar 1/20 de NaCl 1 M, dois

volumes de etanol 100% gelado e agitar suavemente até homogeneizar a

mistura;

8. Centrifugar a 5.000 rpm por 15 minutos e descartar o sobrenadante;

9. Secar em estufa e 37°C e eluir em 100-500 µl de água MilliQ estéril;

10. Unir as duas extrações para cada amostra em um único tubo eppendorf;

11. Adicionar 1 µl de RNAse 10mg/ml:50 µl de amostra;

12. Incubar a 37°C por 1h;

13. Incubar a 65°C por 10 minutos .

3.4. Análise qualitativa do DNA

1. Misturar 3 µl de cada amostra com 1 µl de Blue Green Loading Dye I (LGC

Biotecnologia) e aplicar em um gel de agarose 0,8% em TAE 1x;

2. Realizar a eletroforese por aproximadamente 40 minutos à 100 W;

3. Visualizar em transluminador UV com epi-iluminação de 250-300 nm.

As extrações devem demonstrar um alto peso molecular, pouca degradação e

nenhum excesso de RNA.

3.5. Preparação do DNA de bloqueio

Todas as espécies serviram como DNA bloqueador nos experimentos (tab 1).

Os DNAs bloqueadores devem possuir de 200-500 pb, a fim de facilitar o

bloqueio das seqüências em comum com a sonda.

1. Deixar a tampa do eppendorf semi-aberta e fixá-la com uma fita;

2. Inserir os eppendorfs em um Becker com papel toalha a fim de deixá-los em

posição vertical;

3. Autoclavar as amostras a 1Kgf/cm

por 12 minutos ;

4. Verificar a fragmentação do DNA em gel de agarose 1% em TAE1x;

5. Repetir o passo 3 até que todos os bloqueadores atinjam de 200-500 pb.

3.6. Análise quantitativa do DNA

1. Analisar 1 µl de todas as amostras (tab. 1) em um espectofotômetro Thermo

Scientific NanoDropTM 1000.

A quantificação pode ser realizada em outros espectofotômetros, porém uma

boa quantificação é primordial para o sucesso desses experimentos, visto que

pequenos erros na quantificação podem ser desastrosos no final, devido à relação

DNA bloqueador/sonda ser alta.

3.7. Marcação da sonda e inserção do DNA bloqueador

A espécie Oreochromis niloticus fora utilizada com sonda em todos os

experimentos e seu DNA foi marcado pelo procedimento de nick translation.

1. Adicionar 1000 ng de DNA genômico total em tubo Eppendorf;

2. Adicionar 5,0 µl de dNTPs Mix (0,2 mM dCTP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM

dTTP, 0,4 mM dATP e 0,4 mM dATP biotinilado [Biotin-14-dATP(Invitrogen)]

0,5 µl de DNA polimerase tipo I [DNA Polymerase I 5U/ µl (Roche)] , 0,5 µl

de DNase I [DNase I 4 kU 0,001x (GE Healthcare)] e água Mili-Q

autoclavada em quantidade suficiente para 25 µl. Misturar e centrifugar

rapidamente para recolher o líquido no fundo do tubo.

3. Incubar

em termociclador a 16°C por 42 minutos ;

4. Adicionar rapidamente 5,0 µl de stop buffer (EDTA 0,5 M pH 8,0) a fim de

interromper a reação de marcação. Adicionar o DNA de bloqueio na

proporção desejada

, 1/10 de Acetato de Sódio 3 M, dobrar com etanol

100% e homogeneizar suavemente;

5. Precipitar a -20°C por 2h;

6. Centrifugar 15.000 rpm por 15 minutos a 4°C, d escartar o sobrenadante e

secar em uma estufa a 37°C;

7. Adicionar 6 µl de água Mili-Q autoclavada, agitar e deixar eluir durante 14

horas a 4°C.

No final desse procedimento, haverá aproximadamente 1.000 ng de sonda

marcada com biotina e aproximadamente 45x de DNA bloqueador, uma relação de

1:45.

A marcação também pode ser realizada através de kits disponíveis

comercialmente, seguindo as especificações do fabricante.

3.8. Hibridação in situ Fluorescente – FISH

3.8.1. Desnaturação dos cromossomos mitóticos

1. Desidratar a lâmina, preparada com 24 h de antecedência, em etanol 70%,

85% e 100%, gelados, por 5 minutos cada. Secar a temperatura ambiente (TA);

2. Desnaturar as lâminas por 42 segundos em uma solução contendo

formamida 70% e 2x SSC (solução salina de citrato de sódio) pH 7,0 a 67°C;

3. Transferir a lâmina rapidamente para etanol 70%, 85% e 100% gelados, por

2 minutos cada. Secar a TA;

1- A sonda deve possuir de 200-500 pb e para estipular o tempo necessário de incubação para

a amostra, realizar o procedimento descrito e aplicar posteriormente 3 µl em um gel de agarose

1% em TAE1X. Tal procedimento é dispensável após estipular o tempo ideal de incubação.

2- No caso, a quantidade de DNA bloqueador foi de 45.000 ng, ou seja, 45x a quantidade de

sonda.

4. Verificar a desnaturação em microscópio ótico com o condensador baixo.

Caso necessário, realizar novamente os passos 2 e 3, até que a desnaturação seja

completada;

3.8.2. Desnaturação da solução sonda/DNA bloqueador e hibridação

1. Adicionar no tubo contendo sonda/DNA bloqueador 15 µl de formamida

100% (concentração final de 50%), 6 µl de sulfato de dextrano 50% (concentração

final 10%) e 3 µl de 20x SSC (concentração final de 2x SSC). Homogeneizar e

centrifugar 10 segundos;

2. Desnaturar no termociclador a 95°C por 5 minutos ;

3. Transferir imediatamente ao gelo;

4. Aplicar todo o conteúdo em uma lamínula 24X40 limpa e inverter

vagarosamente a lâmina sobre a lamínula a fim de não formar bolhas;

5. Manter a lâmina com o material voltado para baixo em uma câmara

umedecida com 2xSSC e incubar em uma estufa a 37°C overnight.

3.8.3. Lavagem pós-hibridação, detecção e contra-coloração

1. Remover a lamínula cuidadosamente e lavar a lâmina em 2x SSC, pH 7,0, a

72°C por 5 minutos . Aquecer o SSC previamente e lavar sem agitação;

2. Transferir a lâmina em uma solução 1x PBD

a 45°C por 2 minutos;

3. Adicionar em um tubo 26 µl de Tampão C (0,1 M bicarbonato de sódio, pH

8,5 e 0,15 M de NaCl), 4 µl de Avidina-FITC (0,01mg/ml), homogeneizar, centrifugar

rapidamente, adicionar todo o volume sobre uma lamínula 24x60, limpa, e inverter a

lâmina sobre a lamínula. Incubar em câmara úmida a 37°C por 30 minutos ;

4. Remover a lamínula cuidadosamente e lavar com agitação moderada 3

vezes em 1x PBD a 45°C por 2 minutos ;

5. Adicionar em um tubo 1 µl de Anti-avidina [Monoclonal Anti-Avidin Biotin

Conjugate (Sigma)], 19 µl de 1xPBD, misturar gentilmente, centrifugar rapidamente,

adicionar todo o volume sobre uma lamínula 24x40 limpa e inverter cuidadosamente a

lâmina sobre a lamínula. Incubar em câmara úmida a 37°C por 10 minutos ;

6. Repetir o passo 4;

7. Repetir o passo 3;

8. Repetir o passo 4;

9. Adicionar em um tubo 20 µl de meio de montagem (Vectashield) e 0,7 µl de

iodeto de propídio (50µg/ml). Misturar e adicionar sobre uma lamínula 25x60 limpa e

inverter a lâmina sobre a lamínula;

3- Para 100 ml de 1x PBD, utilizar 20 ml de 20xSSC, 1 ml Triton X100, 1 g leite em pó

desnatado e completar com água destilada. Como são feitas 10 lavagens e cada lavagem

utiliza 60 ml, preparar 600 ml para cada experimento.

10. Acondicionar a lâmina a 4°C por poucos dias ou a -20°C por um período

mais prolongado, até a análise em microscopia fluorescente.

3.9. Genomic in situ Hybridization (GISH)

O procedimento de GISH procedeu-se utilizando a metodologia descrita acima

(tópicos 3.5-3.8).

Os alvos e sondas sempre foram oriundos de uma mesma espécie, a O.

niloticus. Porém, se simplesmente esta sonda marcada fosse hibridizada sem o uso de

um DNA bloqueador, não seria possível rastrear nenhuma região espécie-específica.

Contudo, usamos todos os ciclídeos listados na tab. 1 como um DNA bloqueador e

sendo assim, pela dinâmica do DNA, as regiões em comum entre alvo e bloqueador

são renaturadas durante a hibridação e as seqüencias da sonda que não encontrarem

similaridade com o bloqueador ficam livres para encontrar o seu alvo. Isso possibilita

que o rastreamento de regiões espécie-específicas de O. niloticus, em comparação

com o bloqueador, torne-se possível.

3.9.1. Controle experimental

1. Experimentos de GISH para controle foram realizados de duas maneira: (i)

com sonda marcada de O. niloticus sobre uma preparação de cromossômica mitótica

de O. niloticus e sem o uso de um DNA bloqueador (controle positivo); (ii) com sonda

marcada de O. niloticus sob uma preparação de cromossômica mitótica de O. niloticus

com o uso de um DNA bloqueador oriundo da espécie O. niloticus (controle negativo).

3.10. Análise das hibridações e processamento das imagens

1. Analisar as hibridações em um microscópio de fluorescência com os filtros

para FITC e iodeto de propídio;

2. Processar as imagens no software Adobe Photoshop CS2;

3. As medidas cromossômicas são realizadas a partir do centrômero utilizando-

se o software Image Tool. Realizou-se ao menos duas medidas para cada braço e

subseqüente fora feito uma média para cada um dos mesmos. Quando possível, foi

realizada ao menos duas medições para cada cromátide e com subseqüente cálculo

de média para cada uma das cromátides e posteriormente cálculo de média para cada

um dos braços;

4. Os cromossomos foram arranjados em ordem decrescente de tamanho e

baseados em uma classificação segundo o índice centromérico (IC=braço

px100/tamanho total do cromossomo). A alocação correta de cada cromossomo foi

baseada em uma ordenação prévia de um cariograma corado com Giemsa 2% à 10

minutos. Isso garantiu que os cromossomos possuíssem as mesmas posições nos

diferentes cariogramas.

3.11. Análise dos sinais

As diferenças de sinais entre cromossomos e entre cariogramas foram feitas

por uma análise visual, através da identificação de sinais mais evidentes,

medianamente evidentes e menos evidentes.

3.12. Análise estatística

1. A extensão do sinal da hibridação foi realizada com o software Image Tool.

Foram realizadas medições em toda a extensão de cada sinal de hibridação com

subseqüente cálculo de média para cada um dos mesmos. Foi considerado um sinal

apenas as marcações evidentes e características de uma FISH;

2. Foi realizado cálculo de porcentagem de hibridação para cada um dos

cariogramas, onde:

∑

tamanho total do lote diplóide = tamanho total do genoma de O. niloticus

(100%) no cariograma

∑ cobertura total da hibridação do lote diplóide = tamanho total das região

exclusivas do genoma de O. niloticus em comparação com a espécie bloqueio em

questão (X%).

Esses “tamanhos” não remetem o tamanho do genoma em números de

nucleotídeos;

3. As diferenças entre cada espécie usada como DNA bloqueador e O. niloticus

foram feitas por meio da somatória do comprimento dos braços horizontais seguindo a

filogenia apresentada por Smith et al. (2008). Posteriormente, cada distância foi

convertida em número de transformações, sendo que dez transformações

correspondem a 3,49 mm [(barra de calibração apresentada em Smith et al. (2008), a

qual corresponde a combinação de dados genéticos e morfológicos].

4. Através do software Excel foram realizadas análises de dispersão em que no

eixo X foram dispostos os números de transformações e em Y as percentagens de

hibridação. Foram calculados ainda o coeficiente de correlação de Pearson (r), o

coeficiente de determinação (R

) e a relação entre as duas variáveis (X e Y) por meio

de regressão (y = a+bx). O melhor ajustamento da curva foi feito seguindo o método

de mínimos quadrados.

4. Resultados e discussão

Os resultados e discussão são apresentados a seguir no formato de manuscrito

a ser enviado a revista científica da área de genética e citogenética.

Comparative cytogenetics of cichlid fishes through genomic in situ

hybridization (GISH) with emphasis in Oreochromis niloticus

Guilherme T. Valente and Cesar Martins

Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual

Paulista - UNESP, Botucatu, SP, Brazil.

Keywords: Cichlidae, repeated DNAs, chromosome, heterochromatin,

evolution

Corresponding author and reprint request: Cesar Martins, UNESP -

Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Departamento de Morfologia,

CEP 18618-000, Botucatu, São Paulo, Brazil. Telephone/Fax: ++55(14)38116264

e-mail: [email protected]esp.br

Abstract

The Cichlidae family is the most species-rich group of Perciformes order. This group

captures the attention of aquarium hobbyists, sport fishing and feeding, being

Oreochromis niloticus the most important in aquaculture today. In addition, this species

is currently used in studies for different areas and it has been upped to a level of

‘experimental model’ for the family. Cytogenetic analyses of the cichlids species are

still incipient, although O. niloticus has been characterized using classical and

molecular cytogenetics techniques, with special attention to the heterochromatin.

These studies have revealed that the long arm from the longest chromosome pair and

the pericentromeric regions are rich in heterochromatin and repetitive sequences. The

observation of the sinaptonemal complex and through molecular cytogenetic tools have

shown that probably the first chromosome is the sex bivalent of the species. In this

study was realized a comparison between the genome of O. niloticus and other

cichlids, from South America and Africa, using the GISH technique. The results have

shown that at least some elements, contained in the pericentromeric heterochromatin

of Nile tilapia are species-specific, and a large part of the long arm of the largest

chromosome pair presents sequence conservation within the Tilapiini tribe (composed

of the genus Tilapia, Oreochromis and Sarotherodon). It was also observed that the

genome of O. niloticus [compared with non-tilapiines tribes] is more similar to the

genome of Hemichromis, regarding for repetitive elements. It has been observed that

the largest chromosome pair is rich in repetitive sequences and because this it has

supposed to be the sex chromosome or this accumulation is resultant of a

chromosome fusion. Our observations have demonstrated that the heterochromatic

region of the 1q apparently became specific to the tribe Tilapiinae.

Keywords: Cichlidae, repeated DNAs, chromosome, heterochromatin, evolution.

Introduction

Cichlids represent the most species-rich group of Perciformes and in fact of all

vertebrates, and comprise more than 3,000 living species (Stiassny, 1991; Zardoya et

al., 1996; Chakrabarty, 2004; Kocher, 2004; Sparks and Smith, 2004; Nelson, 2006).

Only the African continent has more than 1,500 species and the greater diversity

among this family is found in the Great Lakes of East Africa (Victoria, Tanganyika and

Malawi (Trevawas, 1983; Turner and Genner, 2005). Almost 2,000 species of cichlids

have evolved in a short evolutionary time (approximately 10 million years) and they

have attracted the attention of researchers for various reasons (Kocher, 2004). For

instance, approximately 500 species of cichlids that colonized the Lake Victoria have

evolved from some few ancestrals in the last 100,000 years (Verheyen et al., 2003).

Thus, cichlid fishes have attracted an increasing scientific interest because of their

rapid adaptive radiation leading to an extensive ecological diversity and enormous

importance to tropical and subtropical aquaculture.

The family Cichlidae represents a monophyletic group and the limits and

interrelationships of all four subfamilies [Etroplinae (Indian), Ptychochrominae

(Malagasy), Cichlinae (Neotropicals) and Pseudocrenilabrinae (African)] were well

supported based on molecular and morphological data (Smith et al., 2008). The African

(Pseudocrenilabrinae) and Neotropical (Cichlinae) cichlids are both monophyletic and

represent sister groups (Smith et al., 2008). The African cichlids are often distributed in

the groups pelmatochromine, haplochromine and tilapiine (Lowe-McConnell, 1999), but

these groups are not recognized as valid taxonomic units. The Neotropical cichlids

(Cichlinae) are monophyletic and composed of 51 genera and 406 described species

(Kullander, 1998, 2003). The most recent proposed phylogeny of the group recognizes

the tribes Cichlini, Retroculini, Astronotini, Chaetobranchini, Geophagini,

Cichlasomatini and Heroini as part of the Cichlinae clade (Smith et al., 2008).

Most genetic/genomic information concerning cichlids are related to the Nile

tilapia Oreochromis niloticus and most species are poorly known. Despite the

morphological and ecological diversity of cichlid fishes, chromosome information in

known for 135 species and most cytogenetic data are only related to the determination

of haploid/diploid chromosome number. The African cichlids have a modal diploid

number of 44 chromosomes whereas the Neotropical cichlids 2n=48 chromosomes

(Feldberg et al., 2003). The mechanisms of chromosome evolution that have acted

during the karyotype diversification of cichlids are still uncertain and the application of

molecular cytogenetic techniques seems to be very promising in the clarification of the

chromosome evolution in the group.

Since the first publication of in situ detection of DNA sequences in the

chromosomes by hybridization (Pardue and Gall, 1969), a lot of variations of this

technique have been described. Genomic in situ hybridization (GISH) represents one

of these variations which consists in the use of whole genomic DNA of an organism

that is used as probe to hybridize to the target chromosomes of another organism.

GISH technique has been applied to the investigation of several topics in cytogenetics,

such as chromosome disposition in the genome, genomic identification, recognition of

part of genomes, B chromosomes, comparative cytogenetics and genomics (revised by

Stace and Bailey, 1999, Svartman and Vianna-Morgante, 1999).

In order to advance improve the knowledge of the organization of cichlid

genomes, we applied the GISH technique for purposes of comparative cytogenetics in

the group. Considering that some cichlid species are having their genomes completely

sequenced (The International Cichlid Genome Consortium, 2006), the economical

interest and the extraordinary evolution of this group, the cytogenetic information

provided here will be very useful in supplying genetic information at the chromosomal

level that can contribute expand the knowledge on cichlid biology.

Materials and methods

Biological samples, DNA extraction and chromosome preparation

The species used in the present study and their geographic origin are described

in Table 1. Oreochromis niloticus was the reference species used and its DNA was

used as probes against its own chromosomes. The DNA of the other cichlids were

used as blocking DNAs to block the hybridization of similar nucleotide sequences that

exists between O. niloticus and the other cichlids.

Table 1: Species analyzed and their origin.

Species

Application

Origin of specimens

African cichlids

Oreochromis niloticus

Probe, chromosome

preparation and

blocking DNA

Tietê River, Botucatu, SP, Brazil

Oreochromis karongae

Blocking DNA Institute of Aquaculture, University of

Stirling, Stirling, Scotland

Oreochromis aureus

Blocking DNA Institute of Aquaculture, University of

Stirling, Stirling, Scotland

Sarotherodon galilaeus

Blocking DNA Institute of Aquaculture, University of

Stirling, Stirling, Scotland

Haplochromis obliquidens

Blocking DNA Aquarium Shop, Botucatu, SP, Brazil

Hemichromis bimaculatus

Blocking DNA Aquarium Shop, Botucatu, SP, Brazil

South American cichlids

Astronotus ocellatus

Blocking DNA Tietê River, Botucatu, SP, Brazil

Geophagus brasiliensis

Blocking DNA Unknown

Crenicichla sp.

Blocking DNA Unknown

Aequidens tetramerus

Blocking DNA Unknown

Genomic DNAs of the species listed in Table 1 were extracted according to

standard phenol–chloroform procedures (Sambrook and Russel 2001). Mitotic

chromosomes of O. niloticus were prepared from anterior kidney cells with in vivo

colchicine treatment (Bertollo et al., 1978) and were submitted to GISH according to

the protocol described bellow.

Blocking DNAs and probe

DNA samples used for blocking were fragmented to 200-500 bp though

autoclavage of 1 Kgf/cm

for at least 12 minutes. The DNAs used as probe and for

blocking were quantified in the spectrophotometer Thermo Scientific NanoDropTM

1000.

Genomic in situ hybridization (GISH)

Oreochromis niloticus DNA was used as a probe in all experiments after nick

translation labeling with biotin 14-dATP (BioNick

Labeling System Invitrogen)

according to the specifications of the supplier. The chromosomal DNA was denatured

in 70% formamide/2x SSC pH 7,0 for 42 seconds at 67ºC pH 7. Hybridization mixtures

containing 1µg of biotin-labelled DNA probe, 45 µg of blocking DNA (1:45

probe/blocking DNA), 10 mg/ml dextran sulfate, 2xSSC, and 50% formamide in a total

volume of 30 µl were denatured for 5 minutes at 95ºC and dropped on chromosome

preparation. The hybridization was performed overnight at 37ºC in a 2xSSC moist

chamber and after was made one washing in 2xSSC at 5 minutes at 72ºC. Detection of

hybridized probes was carried out with 0.07% avidin-FITC conjugate (Sigma) in C

buffer (0.1 M NaHCO

pH 8.5, 0.15 M NaCl) for 30 min followed by a signal

ampliﬁcation using 5% anti-avidin biotin conjugate (Sigma) in blocking buffer (4xSSC,

0.5% triton and 1% nonfat dried milk) for 10 minutes, and then followed again by a

treatment with avidin-FITC for 10 minutes at 37ºC. Both treatments were conducted in

a 2xSSC moist chamber at 37 ºC and after each ampliﬁcation step, the slides were

washed three times for 2 minutes each in blocking buffer at 45ºC. Chromosomes were

counterstained with propidium iodide (PI) (0.2%) diluted in antifade (Vectashield).

GISH using the O. niloticus probe and target and no blocking DNA, and a GISH

using the same specie like probe, target and blocking DNA, were made like positive

control for probe and blocking DNA respectively of the GISH experiments.

Amount of blocking DNA

The amount of blocking DNAs used for GISH can vary from 1-100 times (revise

by Stac and Bailey, 1999) and in the present study the quantity of blocking DNA was

adjusted using the genome of G. brasiliensis. Different amounts of blocking DNAs

varying from 10-50 µg (10-50 times the amount of probe DNA) were used in GISH

experiments and 45 µg proved to be more efficient to block the similar nucleotide

sequences in the genome of O. niloticus generating species-specific signals in this

species.

GISH signal analysis

Hybridized chromosomes were analyzed under an Olympus BX 61 microscope

and the images captured with a digital camera Olympus DP70 with the software Image-

Pro MC 6.0. The images were processed with the program Adobe Photoshop CS2 and

the chromosome arms were measure twice with the software Image Tool.

Chromosomes were arranged in decreasing size of according to Ferreira and Martins

(2008).

Based on signal intensity three patterns of signals were considered strong,

medium and low.

Statistical analysis

The extension of the hybridized signals were estimated in relation to the whole

extension of the chromosomes with the software Image Tool: the whole extension of

the chromosomes of O. niloticus was defined as 100% and the extension of the

hybridized segments was defined as a percentage of the O. niloticus genome that

hybridizes after blocking with the DNA of other cichlid species.

The evolutionary divergence between each species used as blocking DNA and

O. niloticus was determined through the measure, obtained with a pachymeter, of the

horizontal branches of the phylogeny proposed by Smith et al. (2008). The branch

lengths were converted to number of transformations [(10 transformations = 3.49

millimeters in the bar of calibration as stated by Smith et al., 2008)]. These

transformations are related to the genetic and morphological data (Smith et al., 2008).

The number of transformations were plotted against the percentage of GISH

hybridization and the coefficient of correlation of Pearson (r), the coefficient of

determination (R

), and the relationship between the two variables were determined

though regression analysis (y=a+bx).

Results and discussion

The chromosomes of O. niloticus were used as reference in the present study

and were subjected to hybridization using blocking DNAs of the African cichlids O.

niloticus (blocking control), O. aureus, O. karongae, Sarotherodon galilaeus,

Hemichromis bimaculatus and Haplochromis obliquidens, and the South American

cichlids Astronotus ocellatus, Crenicichla sp., Geophagus brasiliensis and Aequidens

tetramerus. In general, labeling patterns after GISH were very similar to the results

observed for the distribution of DNA sequences and constitutive heterochromatin in the

genome of O. niloticus, here evidenced by hybridization of the BAC-probe enriched of

repeated sequences (Figure 1). The distribution of repeated elements was previously

described for O. niloticus with a preferential localization in the pericentromeric region,

in the whole extension of the largest chromosome pair (pair 1) and in a less intense

pattern in the subtelomeric regions (Ferreira and Martins, 2008). The correlation

between GISH results and distribution of repeated elements was also evidenced for

other organisms like plants (revised by Stace and Bailey, 1999). The positive control of

GISH probe reveled a labeling throughout the genome, which were strongly labeled in

the heterochromatic areas. Moreover, the positive control of blocking DNA reveled no

labeling.

The hybridization pattern observed after GISH analysis reveals a remarkable

conservation among cichlid genomes. The most distinct region of the genome of O.

niloticus is represented by the pericentromeric regions of most chromosomes and the

largest chromosome pair. However, there are small differences in the GISH signals

generated by the different blocking DNAs (Figures 1, 2). Pericentromeric DNAs

comprise the most rapidly evolving DNA sequences in eukaryotic genomes, differing

even between closely related species (Haaf and Willard, 1997; Csink and Henikoff,

1998; Murphy and Karpen, 1998). The pericentromeric regions are associated to a

rapid evolutionary rate caused by recombination suppression that leads to the

accumulation of repeat sequences (Charlesworth et al., 1994; Topp and Dawe, 2006).

Although GISH technique does not allow to predict which specific sequences are being

detected, it seems clear that the differential hybridization pattern obtained is represents

the presence of repeated DNA sequences such as satellite DNA and transposable

elements.

Our results indicates that the pericentromeric constitutive heterochromatin of O.

niloticus is species-specific at least some elements of this chromatin. The largest

chromosome pair seems to be conserved among O. niloticus, O. karongae, O. aureus

and S. galillaeus (Figures 1, 2). On the other hand, remarkable differences in the

chromosome 1 of O. niloticus chromosome 1 was observed in relation to the

hybridization pattern observed with blocking DNAs of non-tilapiines and South

American cichlids. These data indicate that the genomes of the three tilapiines (O.

karongae, O. aureus and S. galillaeus) used as blocking DNAs are more similar to O.

niloticus than the others cichlids, which is in agreement with the phylogeny proposed

for this family (Smith et al., 2008). Although O. karongae has a karyotype composed of

2n=38 chromosomes (Harvey et al., 2002) and the other tilapiines analyzed herein

posses 2n=44 (Majumdar and McAndrew 1986), the karyotype differences do not

seems to reflect remarkable genomic differences among these species. In fact, the

existence of hybrids between O. niloticus and O. karongae (Harvey et al., 2002)

indicates a close genetic relationship among them. Viable interspecific hybrids between

O. niloticus and O. aureus (Wohlfarth, 1994; Hulata et al., 1983, 1993), hybrids among

Sarotherodon, Tilapia and Oreochromis, have also been already supported (Heinrich,

1967; Bauer, 1968; Fishelson, 1988; Rana et al., 1996).

Genomic DNA of the African cichlids Hemichromis bimaculatus and

Haplochromis obliquidens did not block the DNA of O. niloticus pair 1 even though they

are quite related to the tilapiines (Smith et al., 2008). The tilapiines have a typical

karyotype pattern (represented here by O. niloticus) composed of one pair (the largest

one), of subtelocentric (st), few meta-submetacentric chromosomes (m/sm) and

several subtelo-acrocentric (st/a) chromosomes (Majumdar and McAndrew 1986). On

the other hand, the karyotypes of non-tilapiine African cichlids are composed by a

typical large m/sm, a large st/a, several small m/sm and several small st/a. Our results

indicate that the pair 1 of tilapiines has exclusive genomic sequences segments not

evidenced in the genome of other cichlids. In the same way, the hybridization pattern

observed with the use of blocking DNA of the non-tilapiine African cichlids H.

obliquidens was quite similar to the results observed when the South American species

were used for blocking. The GISH using blocking DNA of different South American

cichlid species revealed a similar hybridization pattern for all of them (Figures 1, 2). In

each case, all chromosomes of O. niloticus were blocked, except pair 1 and the

pericentromeric heterochromatin. This hybridization pattern is similar to the results

obtained with the use of H. obliquidens genomic DNA for blocking.

The most remarkable result obtained is related to the hybridization pattern of

the largest chromosome pair of O. niloticus. The genomic content for this chromosome

is similar in the tilapiines and diverges from the rest of the cichlids. The first

chromosome pair of O. niloticus is enriched in repeated DNA sequences (Harvey et al.,

2003; Ferreira and Martins, 2008) and is believed to be the sex chromosome of this

species, evidenced by unpaired segments in the terminal region of the long arm of

male heterogametic meiotic cells (Carrasco et al., 1999). The restriction of

recombination in the heterogametic genotype between the regions containing the sex-

determining genes is a general requirement in the process of sex chromosome

differentiation (Solari, 1994). Recombination is the primary force in the removal of

unnecessary DNA sequences and when suppressed, the accumulation of repeated

DNA sequences is exepcted (Topp and Dawe, 2006). Several classes of repeated

DNAs were identified in the largest chromosome of O. niloticus including LINES

(Oliveira et al., 1999), SINES (Oliveira et al., 2003), telomeric sequences (Chew et al.,

2002), non LTR transposons, Ron1 (mobile elemente), Tc1 transposon (Harvey et al.,

2003) and several non-classified transposon elements. FISH analysis using C

t-1 DNA

(DNA enriched for highly and moderately repetitive DNA sequences), confirms that this

chromosome is rich in repeated elements (Ferreira and Martins, 2008). Moreover, C-

banding technique detected the presence of heterochromatin in the complete extension

of long arm of largest pair (Majundar and McAndrew, 1986) (herein indicate as pair 1)

that is supposed to contain repeated DNAs. The accumulation of repeated DNAs in the

chromosome 1 of O. niloticus can be a consequence of restricted recombination that is

acting in early stages of sex chromosome differentiation or result of chromosome

fusions that were involved in the origin of this karyotype element (Oliveira et al., 1999).

Besides major differences related to the first chromosome pair and peri-

centromeric region, minor variations were observed after the use of blocking DNAs of

different cichlid species. The chromosomal signals generated by blocking the

hybridization with H. bimaculatus, O. karongae and O. aureus were less evident, while

blocking with S. galilaeus showed more evident signals (Figure 1, 2). The use of

blocking DNA of H. obliquidens evidenced stronger signals compared to the other

African cichlids. It is interesting because Oreochromis are more related to

Haplochromis than Hemichromis (Smith et al., 2008). The results revealed a

relationship between the karyogram results obtained with GISH and the phylogenetic

data for the tilapiine cichlids. Although Haplochromis is considered closely related to

tilapiines (Smith et al., 2008), our results reveals that the genome of O. niloticus is

more similar to Hemichromis than to Haplochromis. The comparative analyses of

GISH-signals using blocking DNAs of South American cichlids reveals a similar

patterns to the blocking with Haplochromis genomic DNA (Figure 1, 2). Haplochromis is

characterized as a high diversity group compared to other African cichlids (Kornifield et

al., 1979; Liem, 1991) We could speculate that the differential pattern of hybridization

observed for Haplochromis could be related to the high genetic diversity observed in

this genus.

The comparative analysis of transformations based in the phylogeny of Smith et

al. (2008) and the percentage of hybridization allowed the establishment of a clear

correlation between the divergence of Cichlidae groups and the level of GISH

hybridization (Table 1, Figure 3). Such data support the use of GISH for comparative

genomics. Cytogenetics haves been neglected as a tool to be applied in understanding

the genome structure and evolution. GISH can be helpfull to solve several genomic and

cytogenetic problems among fishes involving sex chromosomes, B chromosomes and

chromosome rearrangements. Cytogenetic data can be integrated to nucleotide

sequence and other genetic mapping data to establish a most parsimonious scenario

for the complex evolutionary history of fishes.

References

As referências citadas no tópico Resultados e Discussão encontram-se

reunidas no final deste volume no item Referências Bibliográficas.

Table

Table 1: Number of transformations according to Smith et al. (2008) and

percentage of GISH-hybridization between different cichlid species and O. niloticus.

Sarotherodon galilaeus was the only tilapiine considered in the phylogeny of Smith et

al. (2008).

Blocking species Number of transformations Percentage of hybridization

Sarotherodon 41,604 15,14%

Hemichromis 80,946 21,19%

Haplochromis 85,301 26,79%

Astronotus 204,112 24,36%

Crenicichla 261,304 26,63%

G. brasiliensis 266,576 32,34%

Aequidens 251,361 28,36%

Figures

Figure 1. In situ hybridization of Oreochromis niloticus chromosomes using the BAC

clone C4E09 as probe (a), and the FISH using blocking DNA of O. aureus (b), O.

karongae (c), Sarotherodon galilaeus (d), Hemichromis bimaculatus (e), Haplochromis

obliquidens (f), Astronotus ocellatus (g), Crenicichla sp. (h), Geophagus brasiliensis (i)

and Aequidens tetramerus (j).

Figure 2: Relationship between the chromosome signals generated by GISH experiments. The genome of the species in the cladogram

(Smith et al., 2008) were used as blocking DNA. The number in the top refers to each chromosome pair of Oreochromis niloticus,

including long chromosome arm (q) information for chromosomes 1 and 2. Green, strong signal; red, medium signal; yellow, week signal;

X, no signal. The African and South American cichlid clades are indicated by top left and bottom left, respectively.

Chromosomes pairs

Species

Figure 3 –

Correlation between the number of transfor

among cichlid species and the percentage of hybridization.

of determination.

41,604; 15,14%

Sarotherodon

85,301; 26,79%

Haplochromis

0,00%

5,00%

10,00%

15,00%

20,00%

25,00%

30,00%

35,00%

percentage of hybridization

Correlation between the number of transfor

mations (Smith

among cichlid species and the percentage of hybridization.

indicates the

41,604; 15,14%

Sarotherodon

80,946; 21,19%

Hemichromis

85,301; 26,79%

Haplochromis

204,112; 24,36%

Astronotus

261,304; 26,63%

Crenicichla

251,361; 28,36%

Aequidens

R² = 0,628

100 150 200

250

number of transformations

mations (Smith

et al., 2008)

indicates the

coefficient

261,304; 26,63%

Crenicichla

266,576; 32,34%

G. brasiliensis

250

300

5. Conclusão

No presente trabalho foi possível concluir que:

1 - os genomas de Oreochromis niloticus em comparação com o de outros

ciclídeos são bastante conservados, sendo que basicamente a heterocromatina

pericentromérica é espécie-específica desta espécie, ao menos alguns elementos de

sua cromatina;

2 - o braço longo do par 1 de O. niloticus é específico da tribo a qual está

alocada esta espécie;

3 – o genoma da espécie referência parece ser mais semelhante ao genoma

de Hemichromis do que ao genoma de Haplochromis, pelo menos em relação aos

elementos repetitivos.

É relevante afirmar que essa técnica tem um grande potencial para estudos de

comparação de genomas, mesmo havendo restrições como: ser somente possível

analisar o genoma apenas de modo amplo; as análises serem restritas a regiões ricas

em DNA repetitivos; não há possibilidades de se conhecer as seqüências específicas

da espécie referência ou as seqüências conservadas de um genoma. Acredita-se que

o trabalho pôde contribuir com o cenário evolutivo dos ciclídeos corroborando algumas

hipóteses e demonstrando que, apesar de haver grande conservação entre os

genomas, há regiões que estão evoluindo independentemente entre as tribos e dentro

da tribo Tilapiinae, com referência a espécie Oreochromis niloticus.

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