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LAÍS DE CARVALHO MARONI
C
INÉTICA DO COMPROMETIMENTO
DO SISTEMA CITOCROMO P-450
MICROSSOMAL HEPÁTICO NA
ESQUISTOSSOMOSE MANSÔNICA
MURINA
B
ELO HORIZONTE
2006
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LAÍS DE CARVALHO MARONI
C
INÉTICA DO COMPROMETIMENTO
DO SISTEMA CITOCROMO P-450
MICROSSOMAL HEPÁTICO NA
ESQUISTOSSOMOSE MANSÔNICA
MURINA
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de Minas Gerais como requisito parcial
para obtenção do título
de Mestre em Patologia.
Área de concentração: Patologia Geral
O
rientador: Prof. José Renan da Cunha Melo
Universidade Federal de Minas Gerais
C
o-orientadora: Dra. Iramaya Rodrigues Caldas
Fundação Oswaldo Cruz - Centro de Pesquisas René Rachou
BELO HORIZONTE
2006
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Maroni, Laís de Carvalho
M354c Cinética do comprometimento do sistema citocromo P-450
microssomal hepático na esquistossomose mansônica murina/Laís de
Carvalho Maroni. Belo Horizonte, 2006.
98f. il.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas
Gerais.Faculdade Medicina.
Área de concentração: Patologia Geral
Orientador: José Renan da Cunha Melo
Co-orientadora: Iramaya Rodrigues Caldas
1.Esquistossomose mansoni/fisiopatologia 2.Sistema enzimático
do citocromo P-450/farmacocinética 3.Redutases do citocromo/
farmacocinética 4.Fígado/parasitologia 5.Western blotting 6.
Imunohistoquímica 7.Camundongos I.Título
NLM: WC 810
CDU: 616.995.122
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Aos meus pais e irmãs - Letícia e Ludmila - pela amizade e confiança;
por serem a minha principal fonte de inspiração e
os principais responsáveis por todos os meus objetivos até hoje alcançados.
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Ao Professor José Renan da Cunha Melo,
pela oportunidade de aprendizagem dentro do seu laboratório.
Por todos os ensinamentos fundamentais na formação de um pesquisador.
Pela amizade, confiança e por ter aberto portas que jamais serão esquecidas.
À Iramaya Rodrigues Caldas,
pela amizade e pelo exemplo de pesquisadora organizada e perseverante.
Pela dedicação e correção cuidadosa deste trabalho.
Por ser um exemplo de mulher, dedicada à profissão e batalhadora.
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À Capes e CNPq – pelas bolsas concedidas aos alunos envolvidos neste
projeto.
À Profa. Helenice Gobbi pela grande ajuda dos reagentes a serem
utilizados na imuno-histoquímica.
Ao Prof. Alfredo Barbosa, pelas ajudas constantes durante a realização
da imuno-histoquímica e pela agradável convivência durante todo este tempo.
À Biogen por ceder quantidades suficientes dos reagentes para que
fossem realizados os testes de imuno-histoquímica.
Ao Prof. Marcus Vinícius Melo de Andrade pelos ensinamentos durante
os experimentos.
Ao Prof. Paulo Marcos Zech Coelho, por ter infectado e disponibilizado
os animais utilizados no trabalho.
A Profa. Lúcia Porto, por ter permitido e ajudado na realização das
fotografias e no esclarecimento de algumas dúvidas relacionadas à Patologia.
A Anna Carolina Lustosa pela grande ajuda e disponibilidade na
realização das análises estatísticas.
Ao Jamil, do laboratório de Bioquímica do ICB, UFMG, por ter sido tão
prestativo na utilização da ultra-centrífuga.
A toda equipe do laboratório de Cirurgia Experimental - em especial,
Isabela, Klaus, Guilherme, Fabiana, Helen, André, Rodolfo, Roberta, Vinícius,
Júlia, Humberto e Felipe Lisboa - pelas constantes ajudas, por todo incentivo
durante o trabalho e principalmente pela amizade.
Àqueles que ajudaram das mais diversas formas: Lourdinha, pela
realização das reativações antigênicas; Thaís Ferreira, pela disponibilidade em
ajudar com as tentativas dos western blot; Marina Amaral, pelos ensinamentos e
pela boa vontade com relação à análise morfométrica do trabalho.
À minha família, pelo amor, incentivo e apoio constantes. Especialmente
aos meus pais, irmãs e cunhado, pelo exemplo de união e pelos incentivos.
Ao Felipe, por estar sempre ao meu lado; pelo incentivo e por se orgulhar
de todo o meu esforço.
Aos meus amigos, por estarem sempre torcendo e enviando energias
positivas; pela amizade e por tornarem a minha vida mais alegre – especialmente
Ana Karine, Ana Luísa, Bruna, Eliane, Flávia, Gena, Marina, Natália, Pollanah,
Sílvia, Marina Oliveira, Rodrigo Carvalho, Priscila Torrent, Kellyson e Juliana
Cristina.
Aos colegas do mestrado, especialmente às amigas Letícia Figueiredo,
Ana Paula Barbosa e Christiane Cartelle, pelo companheirismo durante o curso.
A todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para a realização
deste trabalho... Muito obrigada
!
Quando amamos e acreditamos, do fundo de nossa alma,
nos sentimos mais fortes que o mundo e somos tomados de uma serenidade
que vem da certeza de que nada poderá vencer a nossa fé.
Essa força estranha faz com que sempre tomemos
a decisão certa na hora exata, e quando atingimos nosso objetivo
ficamos surpresos com nossa própria capacidade.
Paulo Coelho
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RESUMO
Vários são os fatores que afetam o metabolismo hepático normal e o de alguns
medicamentos. Dentre eles, podem-se citar as doenças agudas ou crônicas que
atingem a arquitetura e/ou função hepáticas, como por exemplo, a esquistossomose.
Objetivo: Avaliar as alterações das enzimas citocromo P-450 das subfamílias 1A1,
2A6, 2B1, 2C11, 2E1, 3A2 e redutase, nas fases aguda, crônica e após tratamento
com oxamniquine e avaliar a cinética das alterações das enzimas citocromo P-450
das subfamílias 1A1, 2E1 e 3A4 nas fases aguda e crônica.
Métodos: A expressão das isoenzimas do sistema citocromo P-450 foi avaliada
através do western blot e a cinética das alterações das isoenzimas 1A1, 2E1 e 3A4
foi avaliada por imuno-histoquímica.
Resultados: Os achados revelaram que a maioria das isoenzimas do sistema
citocromo P-450 são alteradas durante a infecção por S. mansoni, vistos pelo
western blot e comprovados pela imuno-histoquímica. Algumas isoenzimas (e.g.
CYP1A1), porém, apresentam expressão homogênea durante o tempo de infecção
estudado. Outras apresentam expressão de forma oscilatória e outras (CYP3A4) são
alteradas de forma permanente, o que mostra que a infecção por S. mansoni
desregula o sistema microssomal hepático, com especificidade para as diferentes
isoformas da família P-450.
Conclusão: A infecção por S. mansoni altera a expressão de isoenzimas do sistema
citocromo P-450.
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ABSTRACT
Acute and chronic diseases, such as schistosomiasis, may affect the hepatic
architecture or function, impairing liver detoxication function and drug metabolism.
Objectives: To evaluate quantitative changes in enzymes of the cytochrome P-450
subfamilies 1A1, 2A6, 2B1, 2C11, 2E1, 3A2 and reductase, during the acute and
chronic phases of schistosomiaisis and after treatment with oxamniquine by western
blot. To evaluate the kinetics of these changes in the subfamilies 1A1, 2E1 and 3A4
during the acute and chronic phases, by immuhistochemistry.
Methods: Cytochrome P-450 isoenzymes expression was evaluated through western
blotting and the kinetics of the alterations of the isoenzymes 1A1, 2E1 and 3A4
through immunohistochemistry.
Results: The majority of cytochrome P-450 isoenzymes are altered during the
infection by S. mansoni. However, some of them (e.g. CYP1A1) showed no
modification of its levels of expression during the period studied and the expression
of other (e.g. CYP3A4) showed an oscillatory pattern (as seen by
immunohistochemistry), suggesting a specific modification in the microsomal hepatic
enzymatic system in the course of S. mansoni infection.
Conclusion: The infection by S. mansoni alters the hepatic microssomal expression
of several cytochrome P-450 isoenzymes.
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Ciclo catalítico do CYP-450 ......................................................
09
FIGURA 2 - Esquema de análise seqüencial das lâminas. A área
percorrida para captura dos campos e contagem da área marcada pelo
anticorpo seguiu o sentido das setas ...................................................
29
FIGURA 3 - Etapas para contagem da área marcada pelo anticorpo. (A)
Marcação imuno-histoquímica da enzima 2E1 de um animal com 50 dias
de infecção. A cor rosa representa a marcação do anticorpo. (B) Imagem
binária do corte histológico ilustrado em A. A coloração em branco
corresponde à marcação pelo anticorpo ......................................................
29
FIGURA 4 - Expressão dos níveis de CYP1A1 no sistema microssomal
hepático. Os valores representam a média ± DP nos grupos controle (CT),
fase aguda (FA), fase crônica (FC) e grupo tratado (TR) ............................
32
FIGURA 5 - Expressão dos níveis de CYP2E1 no sistema microssomal
hepático. Os valores representam a média ± DP nos grupos controle (CT),
fase aguda (FA), fase crônica (FC) e grupo tratado (TR) ............................
33
FIGURA 6 - Expressão dos níveis de CYP2A6 no sistema microssomal
hepático. Os valores representam a média ± DP nos grupos controle (CT),
fase aguda (FA), fase crônica (FC) e grupo tratado (TR) ............................
34
FIGURA 7 - Expressão dos níveis de redutase no sistema microssomal
hepático. Os valores representam a média ± DP nos grupos controle (CT),
fase aguda (FA), fase crônica (FC) e grupo tratado (TR) ............................
35
FIGURA 8 - Expressão dos níveis de CYP2C11 no sistema microssomal
hepático. Os valores representam a média ± DP nos grupos controle (CT),
fase aguda (FA), fase crônica (FC) e grupo tratado (TR) ............................
36
FIGURA 9 - Expressão dos níveis de CYP2B1 no sistema microssomal
hepático. Os valores representam a média ± DP nos grupos controle (CT),
fase aguda (FA), fase crônica (FC) e grupo tratado (TR) ............................
37
FIGURA 10 - Expressão dos níveis de CYP3A2 no sistema microssomal
hepático. Os valores representam a média ± DP nos grupos controle (CT),
fase aguda (FA), fase crônica (FC) e grupo tratado (TR) ............................
38
FIGURA 11 - Microscopia do fígado de animal com 30 dias de infecção ....
39
FIGURA 12 – Ovo e pigmento esquistossomótico em tecido hepático........
40
FIGURA 13 - Granulomas em fígado de camundongos infectados com 25
cercárias de S. mansoni em diferentes estágios evolutivos .........................
41
FIGURA 14 - Verme adulto de S. mansoni na luz de um vaso sanguíneo,
em animal representante da fase aguda, com 50 dias de infecção .............
42
FIGURA 15 - Marcação imuno-histoquímica da enzima CYP1A1 e
controle negativo. Controle negativo da reação (15A) e marcação da
isoenzima 1A1 (15B), em animal com 50 dias de infecção por S. mansoni
43
FIGURA 16 - Marcação imuno-histoquímica de CYP1A1 em parênquima
hepático. Animal não infectado, grupo controle (A), animal na fase aguda
(B) e animal na fase crônica da esquistossomose mansônica (C) ..............
44
FIGURA 17 - Expressão dos níveis de CYP1A1 no sistema microssomal
hepático. As barras transversais representam a média da área marcada
em diferentes dias da infecção por S. mansoni ...........................................
45
FIGURA 18 - Expressão dos níveis de CYP1A1 no sistema microssomal
hepático. As barras transversais representam a média da área marcada
em diferentes fases da infecção por S. mansoni ........................................
46
FIGURA 19 - Marcação imuno-histoquímica de CYP2E1 em parênquima
hepático. Animal não infectado, grupo controle (A), animal na fase aguda
(B) e animal na fase crônica da esquistossomose mansônica (C) ..............
47
FIGURA 20 - Expressão dos níveis de CYP2E1 no sistema microssomal
hepático. As barras transversais representam a média da área marcada
em diferentes dias da infecção por S. mansoni ..........................................
48
FIGURA 21 - Expressão dos níveis de CYP2E1 no sistema microssomal
hepático. As barras transversais representam a média da área marcada
em diferentes fases da infecção por S. mansoni ........................................
49
FIGURA 22 - Marcação imuno-histoquímica de CYP3A4 em parênquima
hepático. Animal não infectado, grupo controle (A), animal na fase aguda
(B) e animal na fase crônica da esquistossomose mansônica (C) ..............
50
FIGURA 23 - Expressão dos níveis de CYP3A4 no sistema microssomal
hepático. As barras transversais representam a média da área marcada
em diferentes dias da infecção por S. mansoni ..........................................
51
FIGURA 24 - Expressão dos níveis de CYP3A4 no sistema microssomal
hepático. As barras transversais representam a média da área marcada
em diferentes fases da infecção por S. mansoni ........................................
52
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LISTA DE TABELAS
1 - Cronograma de sacrifício dos animais para estudo por western blot .....
21
2 - Cronograma de sacrifício dos animais para estudo imuno-
histoquímico .................................................................................................
21
3 - Diluição dos anticorpos primários para western blot de fígado de
camundongos infectados com Schistosoma mansoni .................................
22
4 - Diluição dos anticorpos primários para imuno-histoquímica em fígado
de camundongos infectados com Schistosoma mansoni ............................
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AP – Fosfatase alcalina
BSA – Albumina bovina sérica
CT – Grupo controle
CYP – Citocromo P-450
FA – Grupo fase aguda
FC – Grupo fase crônica
FUNASA – Fundação Nacional de Saúde
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– Peróxido de hidrogênio (água oxigenada)
HE – Hematoxilina – eosina
ICB – Instituto de Ciências Biológicas
kg - quilogramas
µg - microgramas
µm - micrômetros
µm² - micrômetros quadrados
mg - miligramas
mL - mililitros
NI – Grupo não-infectado
PBS – Salina tamponada com fosfato
pH – Potencial hidrogeniônico
TBS – Salina tamponada com tris
TR – Grupo tratado
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SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................................
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ABSTRACT .............................................................………...................................................
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1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................
1
1.1 Esquistossomose mansônica ...............................................................................
1
1.1.1 A doença ......................................................................................................
1
1.1.2 Patogenia ......................................................................................................
2
1.1.3 Patologia .......................................................................................................
4
1.2 Sistema Citocromo P-450 ....................................................................................
6
1.2.1 Caracterização ..............................................................................................
6
1.2.2 Indução e inibição enzimática ...................................................................
9
1.2.3 Isoformas de P-450 ....................................................................................
11
1.3 Expressão do CYP-450 na Esquistossomose ...................................................
13
2. OBJETIVOS .......................................................................................................................
18
3. MATERIAIS E MÉTODOS ..........................................................................................
20
3.1 Animais ...................................................................................................................
20
3.1.1 Infecção dos camundongos .....................................................................
20
3.2 Western blot ..........................................................................................................
22
3.2.1 Separação dos microssomos .....................................................................
23
3.2.2 Protocolo do western blot .........................................................................
23
3.2.3 Análise da intensidade da banda ...............................................................
25
3.2.4 Análise estatística ........................................................................................
25
3.3 Histologia Convencional (HE) ...........................................................................
25
3.4 Imuno-histoquímica .............................................................................................
26
3.4.1 Protocolo de imuno-histoquímica ............................................................
27
3.4.2 Contagem das áreas marcadas pelos anticorpos ....................................
28
3.4.3 Análise estatística ........................................................................................
30
3.4.3.1 Avaliação da área marcada pelo anticorpo ................................
30
4. RESULTADOS ..................................................................................................................
32
4.1 Western blot ..........................................................................................................
32
4.2 Histologia Convencional (HE) ...........................................................................
39
4.3 Imuno-histoquímica .............................................................................................
43
4.3.1 CYP 1A1 .....................................................................................................
43
4.3.2 CYP 2E1 .....................................................................................................
47
4.3.3 CYP 3A4 .....................................................................................................
50
5.
DISCUSSÃO .......................................................................................................................
54
5.1 Metodologia ...........................................................................................................
54
5.2 Resultados ..............................................................................................................
57
5.3 Perspectivas Futuras .............................................................................................
61
6. CONCLUSÕES .................................................................................................................
64
7. REFERÊNCIAS ................................................................................................................
66
ANEXOS ..................................................................................................................................
73
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1.
INTRODUÇÃO
1.1 Esquistossomose mansônica
1.1.1 A doença
A esquistossomose mansônica decorre da contaminação do hospedeiro
humano pelo parasita Schistosoma mansoni (1) e tem a água como veículo de
transmissão. É uma doença que se caracteriza por uma fase aguda, que muitas
vezes não se manifesta clinicamente, e outra crônica, na qual podem ser
evidenciadas as formas graves, principalmente pela hipertensão porta ou pulmonar
(2).
Essa doença está distribuída de maneira endêmica em muitos países em
desenvolvimento, como em áreas tropicais e subtropicais na África, Ásia e América
do Sul. No mundo, estima-se a existência de duzentos milhões de pessoas
infectadas, estando seiscentos milhões de pessoas expostas ao risco da infecção. A
esquistossomose é considerada a segunda doença tropical em importância no
mundo e a terceira doença parasitária mais frequente (3). No Brasil, a área
endêmica para a esquistossomose abrange cerca de dezenove estados com
aproximadamente vinte e seis milhões de habitantes expostos ao risco da infecção.
Ocorre de forma endêmica e focal desde os estados do Maranhão até Minas Gerais
com certa penetração no Espírito Santo. Apresenta ainda, focos isolados nos
estados do Pará, Piauí, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina, Rio
Grande do Sul, Goiás e Tocantins.
1.1.2 Patogenia
A patogenia da esquistossomose e suas formas clínicas têm sido
relacionadas a vários fatores, tais como carga parasitária, idade, cepa e fatores
imunológicos do hospedeiro definitivo. Após conseguir a penetração da cabeça na
pele do hospedeiro definitivo, as cercárias perdem a cauda e transformam-se em
esquistossômulos. Ainda pelas ações lítica e mecânica, os esquistossômulos
migram pelo tecido subcutâneo, até atingir vasos linfáticos ou venosos, para
alcançar o coração e depois os pulmões. Os esquistossômulos então se dirigem
para o sistema porta, alimentando-se e desenvolvendo-se em machos e fêmeas
adultos, aproximadamente, 30 dias após a penetração. A partir daí, migram,
acasalados, para o sistema venoso portal, onde farão a oviposição. Os primeiros
ovos são vistos cerca de 35 a 40 dias após a infecção do hospedeiro.
Os ovos do Schistosoma mansoni e a reação inflamatória granulomatosa
que se forma ao redor deles são exemplos fundamentais de patogenia da
esquistossomose. Os granulomas apresentam, durante seu desenvolvimento, 3
estágios evolutivos que se sucedem: estágio necrótico-exsudativo, produtivo e de
cicatrização por fibrose (4, 5, 6).
No estágio necrótico-exsudativo, que é característico das fases iniciais da
infecção esquistossomótica, um ou mais ovos embrionados são circundados por
zona de necrose, onde comumente são encontrados imunocomplexos (7).
Externamente a essa área observa-se exsudato celular constituído por granulócitos
(neutrófilos e eosinófilos) e mais perifericamente, por linfócitos, plasmócitos e
macrófagos. No estágio produtivo o ovo habitualmente já se encontra fragmentado
ou deformado e o infiltrado celular é constituído por macrófagos, linfócitos e
plasmócitos. É comum o encontro de células gigantes multinucleadas e o granuloma
nessa fase é menor quando comparado com o do estágio anterior. Finalmente, no
estágio de cicatrização por fibrose, o granuloma é ainda menor e se resume a
fragmentos da casca do ovo circundado por escasso infiltrado inflamatório
mononuclear e, mais externamente, por zona de fibrose.
Variações do padrão evolutivo descrito acima são comuns, sendo raro o
encontro de ovos associados a reação inflamatória mínima ou ausente (4, 5, 6). A
reação inflamatória e o tamanho do granuloma variam com a intensidade e duração
da infecção esquistossomótica, com a fase do ciclo evolutivo de cada granuloma e,
até mesmo, entre os diversos órgãos comprometidos; entretanto, alguns autores
ressaltam que o principal fator determinante dessa variabilidade é a resposta imune
do hospedeiro (7).
A esquistossomose evolui em duas fases: aguda e crônica. Nos seres
humanos, a fase aguda aparece em torno do 50° dia e dura até cerca de 120 dias
após a penetração da cercária. Nesta fase, os pacientes apresentam sintomatologia
variada, sendo febre alta, mal-estar, emagrecimento, tosse, diarréia,
hepatoesplenomegalia e linfadenomegalia, além de alterações hematológicas como
leucocitose e eosinofilia as manifestações mais frequentes. Essa fase pode ser
grave e acompanhar-se de toxemia, caracterizando a forma toxêmica (8).
A fase crônica pode apresentar grandes variações do ponto de vista
clínico, o que irá determinar diferentes formas clínicas para a doença. A forma clínica
intestinal, a mais frequente, é caracterizada por episódios ocasionais de diarréia
muco-sanguinolenta com dor ou desconforto abdominal. A forma clínica
hepatointestinal, além dos sintomas intestinais, caracteriza-se também pela
presença de hepatomegalia. A forma hepatoesplênica, que se manifesta sob a forma
compensada é caracterizada por hepatoesplenomegalia com discreta hipertensão
portal. A forma hepatoesplênica descompensada é mais grave e pode manifestar-se
por sangramento de varizes do esôfago, por anemia, por desnutrição ou por quadro
de hiperesplenismo (9). Os animais usados no presente trabalho, na fase crônica,
apresentaram a forma hepatoesplênica, com hepatoesplenomegalia acentuada.
1.1.3 Patologia
Os granulomas periovulares são encontrados em vários órgãos,
principalmente nos intestinos e no fígado. São vistos focos intralobulares de necrose
e necrobiose no fígado, com destruição de hepatócitos, infiltração porta de
histiócitos, eosinófilos, linfócitos, hiperplasia e hipertrofia das células de Kupffer. No
baço há hiperplasia dos cordões de Billroth e eosinofilia intensa (8).
O decréscimo no tamanho do granuloma, observado entre as fases aguda
e crônica, foi chamado de modulação. A modulação é um processo extremamente
complexo que envolve células T, macrófagos, fatores solúveis, citocinas,
prostaglandinas, anticorpos, imunocomplexos, etc (10).
A arquitetura normal dos lóbulos hepáticos não sofre mudança na
esquistossomose (11). O fígado se torna maior, endurecido e o seu lobo esquerdo,
com freqüência, é maior do que o direito (2); sua textura apresenta-se firme e com
uma superfície granular, distinguindo-se do aspecto nodular da cirrose hepática (11).
A lesão básica está em torno do tecido conjuntivo que circunda os ramos intra-
hepáticos da veia porta (8). Nos espaços de Disse, há depósitos de material e
colágeno fibrilar na membrana basal subendotelial, com capilarização dos sinusóides
(12).
A fibrose hepática se desenvolve a partir deste acúmulo de colágeno
depositado no fígado (13), com a proliferação de células sintetizadoras de colágeno,
aumento na síntese de colágeno, ou até pela deficiência na degradação deste
componente (14). Foi demonstrado, em animais experimentais, que o conteúdo de
colágeno no fígado aumenta paralelamente com a formação de granulomas
circundando os ovos do parasita (15).
Tratos portais se tornam, de certa forma, bloqueados com granulomas e
desorganizados pela inflamação e pela fibrose (7). A estrutura lobular permanece
preservada, salvo em alguns casos, quando ocorrem áreas focais de necrose ou
nódulos regenerativos, na provável dependência de trombos intra-hepáticos ou de
isquemia após hemorragias digestivas maciças (16).
Na esquistossomose não há, portanto, cirrose e sim fibrose (17). O
aspecto típico se mostra quando os espaços porta, grandes e fibrosos, aparecem
como “manchas brancas” circundadas por parênquima hepático (18, 19). Essa lesão
é chamada fibrose de Symmers (20), sendo aceita como peculiar à
esquistossomose. A forma de Symmers consiste, do ponto de vista anatômico, em
inflamação crônica produtiva, causada pelos ovos que penetram no conjuntivo
periportal (peripileflebite) e pela propagação desta à parede dos ramos porta
(pileflebite). Não ocorre subversão da arquitetura lobular do fígado, mas ocorre
neoprodução conjuntivo-vascular intensa e sistematizada (21).
1.2 Sistema Citrocromo P-450
1.2.1 Caracterização
O citocromo P-450 foi identificado primeiramente em 1958 nomeado por
apresentar um pigmento (P) com o espectro de, no máximo, 450nm, quando
reduzido e ligado ao monóxido de carbono (22, 23). Este pigmento foi
posteriormente caracterizado como uma hemoproteína P450, em 1961.
A superfamília de citocromo P-450 (CYP) é uma família de enzimas que
catalisa numerosas reações, incluindo o metabolismo de ácidos graxos,
biotransformação xenobiótica, além da síntese e metabolismo de substratos
endógenos (24, 25, 26, 27). As várias isoformas de CYP envolvidas com
biotransformação xenobiótica e metabolismo de drogas estão agrupadas nas
subfamílias CYP1, CYP2 e CYP3 (28).
A superfamília de CYP-450 é subdividida e classificada segundo
recomendações de um comitê de nomenclatura, de acordo com a base do
aminoácido, critérios filogenéticos e organização do gene. No entanto, sabe-se que
a sequência de aminoácidos é extremamente diversa, apesar da forma estrutural ter
sido conservada durante a evolução (29).
Vários fatores contribuem para alterar os níveis e atividade das várias
isoformas, incluindo fatores genéticos, ambientais, fisiológicos (30), dieta, infecções
e estímulos inflamatórios (31). Além destes, substâncias xenobióticas podem induzir
ou inibir a atividade das isoformas (32), principalmente pelo fato dessas isoformas de
P-450 apresentarem pesos moleculares e especificidades pelos diferentes
substratos (33).
Algumas drogas também podem alterar a expressão das isoformas de P-
450, como por exemplo praziquantel (34), omeprazol e lansoprazol (35), interferon-α
recombinante (36), interferon β (37), tabaco (38), lindane (39, 40) e a oxamniquine
(41).
A LPS, também conhecida como endotoxina de bactérias gram-negativas,
diminui o metabolismo de droga por CYP em várias espécies de animais, incluindo
roedores (42) e humanos. No entanto, em outros casos, ela também pode ser capaz
de aumentar a atividade da subfamília CYP3A.
In vivo, a grande maioria das biotransformaçôes medicamentosas são
catalisadas por enzimas celulares específicas. Nas células, as enzimas do sistema
CYP-450 podem se localizar no retículo endoplasmático, na mitocôndria, no citosol,
nos lisossomas, ou mesmo no envelope nuclear da membrana plasmática (33) de
inúmeros tecidos (30).
Não existe uma regra para a distribuição tecidual das enzimas P450.
Como suas funções são extremamente diversas, elas podem ser encontradas em
todos os tipos de tecidos, em todos os tipos de organismos (29). As enzimas P-450
foram primeiramente descritas em fígado de mamíferos, onde eram especialmente
abundantes e apresentavam função essencial no metabolismo de drogas (22, 43).
Os avanços da Biologia Molecular e o estudo do genoma permitiram a
caracterização bioquímica individual de enzimas P-450, assim como a sua função.
Até o presente momento, existem mais de 270 famílias de CYP diferentes, com 18
famílias registradas em mamíferos (44).
As várias enzimas de CYP-450 podem metabolizar vários componentes
exógenos, incluindo drogas, químicos ambientais e poluentes, além de produtos
naturais de plantas. Em geral, as enzimas P-450, particularmente aquelas
encontradas no fígado, são responsáveis em converter substâncias hidrofóbicas em
um número maior de derivados hidrofílicos, facilitando a depuração do organismo
(44).
Várias enzimas do sistema CYP-450 estão localizadas nas membranas
lipofílicas dos retículos endoplasmáticos hepático e de outros tecidos, onde ocorre
processo de oxidação-redução (figura 1). Neste, participam duas enzimas
microssomais: a flavoproteína NADPH citocromo P450-redutase e a hemoproteína
CYP-450 (33), que se interagem pela camada de lipídios (30).
FIGURA 1 – Ciclo catalítico do CYP-450. O P-450, que
contém ferro na forma férrica (Fe
3+
), combina-se com uma
molécula de droga (DH), recebe um elétron da NADPH-P450
redutase, que reduz o ferro a Fe
2+
, combina-se com o oxigênio
molecular, um próton e um segundo elétron (da NADPH-P450
redutase ou do citocromo b
5
) para formar um complexo
Fe
2+
OOH·DH. Esse complexo combina-se com outro próton,
produzindo água e um complexo oxeno férrico (FeO)
3+
·DH. O
(FeO)
3+
extrai um átomo de hidrogênio da DH, com formação
de um par de radicais livres de vida curta, liberação da droga
oxidada (DOH) do complexo e regeneração da enzima P-450
(45).
1.2.2 Indução e inibição enzimática
Alguns substratos medicamentosos quimicamente diferentes, quando
administrados repetidamente, são capazes de “induzir” a CYP-450, através do
aumento da taxa de síntese da isoforma e/ou da redução de sua taxa de degradação
(33).
A indução resulta em aceleração do metabolismo (30) e, habitualmente,
em diminuição da ação farmacológica do indutor, bem como dos medicamentos
concomitantemente administrados (33). Além disso, a indução pode associar-se ao
aumento da toxicidade no caso dos fármacos que são metabolizados em formas
reacionais (33).
As duas isoformas mais extensivamente estudadas são: CYP-450 2B1,
induzida pelo tratamento com o fenobarbital e CYP-450 1A1, pelo hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos. Além destas, já foi comprovada a ação dos glicocorticóides,
antibióticos macrolídios, anticonvulsivantes e alguns esteróides sobre uma forma
específica denominada CYP-450 3A1 (33) e também sobre o CYP-450 3A4 (30). A
isoniazida, a acetona ou a administração crônica do etanol induzem uma isoforma
diferente, CYP-450 2E1, responsável pela ativação das nitrosaminas carcinogênicas
(33, 30).
Os poluentes ambientais também são capazes de induzir o CYP-450. A
exposição ao benzopireno, presente na fumaça do tabaco e carne de churrasco,
induz reconhecidamente a CYP-450 1A1 e altera a taxa do metabolismo
medicamentoso hepático e extra-hepático (30), tanto em animais experimentais,
como em seres humanos (33). Outros agentes químicos ambientais que
reconhecidamente induzem os citocromos P-450 específicos incluem os bifenis
policlorados (PCBs), que são amplamente utilizados na indústria sob a forma de
materiais isolantes e plásticos (33).
Outros substratos medicamentosos podem inibir a atividade das enzimas
P-450. O proadifeno é um dos mais conhecidos. Este composto liga-se à molécula
do citocromo e, a partir daí, é capaz de inibir competitivamente o metabolismo de
potenciais substratos (33).
Os medicamentos que contêm o imidazol também podem inibir por
competição, ligando-se firmemente ao heme-ferro do CYP-450 e reduzindo de forma
eficaz o metabolismo dos substratos endógenos (testosterona) ou de outros
medicamentos administrados simultaneamente (33).
A inibição de enzimas do CYP que participam na biotransformação
medicamentosa resulta em elevadas concentrações do fármaco original, por
aumento da biodisponibilidade e maior incidência de toxicidade da droga (30).
1.2.3 Isoformas de P-450
Foram identificadas 12 famílias de genes do CYP-450 nos seres
humanos. Uma determinada família de CYP-450 divide-se em subfamílias e as
sequências protéicas dentro da mesma família têm semelhança superior a 55%.
Várias enzimas do CYP-450 podem coexistir em uma única célula (30).
As famílias 1, 2 e 3 de CYP-450 (CYP1, CYP2 e CYP3) codificam as
enzimas que participam na maioria das biotransformações de fármacos, enquanto as
famílias restantes são importantes no metabolismo de compostos endógenos como
esteróides e ácidos graxos (30).
CYP1 – a expressão da família de gene CYP1 é induzida pelo receptor
hidrocarbono aril, um fator transcricional que é ativado pela ligação de
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, onde as isoformas 1A1 e 1B1 parecem agir
de forma mais eficaz. Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos são encontrados
nos produtos de incineração industrial, fumaça do cigarro, e comidas grelhadas no
carvão (44). CYP1A1 e CYP1A2 são enzimas expressas em quantidades variadas,
em diferentes tecidos (44). A isoforma 1A1 apresenta grande correlação com a
carcinogênese no pulmão (28).
CYP2 – esta compreende a maior família de CYP-450 dos mamíferos.
CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, e CYP2C19 juntos, metabolizam mais da metade das
drogas prescritas frequentemente, além do ácido araquidônico e de alguns
esteróides (44). No entanto, CYP2E1, CYP2F1 e CYP2J2, também são citadas
como isoformas auxiliares no metabolismo de algumas drogas (44).
Apesar da família CYP2 ser bastante conhecida, algumas isoformas de
CYP-450 apresentam funções ainda obscuras (44). Camundongos knockout ou
deficientes no gene Cyp2e1 parecem ser normais, mas são muito resistentes aos
efeitos tóxicos do benzeno (46), indicando, portanto, uma função no metabolismo
xenobiótico para esta subfamília (44).
As hepatites C e B são doenças virais que levam ao aumento da
expressão da isoforma de CYP2A6 (47). Já a hepatite A está relacionada ao
aumento na expressão dessa mesma isoforma (48). A isoforma 2B1 metaboliza
várias drogas lipofílicas e esteróides, de forma bastante eficiente. A isoforma 2C11
está envolvida na oxidação de vários xenobióticos e é regulada por hormônios
gonadais. A isoforma 2E1 é responsável pela ativação de nitrosaminas
carcinogênicas, apresentando habilidade em converter o dioxigênio em radicais
livres, que levam à carcinogênese (28).
CYP3 – a família CYP3 apresenta quatro membros, sendo CYP3A4 e
CYP3A5 as enzimas P450 de maior expressão no fígado humano e no trato
gastrointestinal. As enzimas dessa família são também conhecidas por
metabolizarem mais de 120 drogas prescritas e substratos endógenos, tais como
esteróides e ácidos biliares (44).
Evidências sugerem que drogas diversas podem induzir membros da
família CYP3A4, e que a capacidade de um componente particular de induzir as
enzimas CYP3A varia entre espécies (44). A isoforma 3A2 metaboliza esteróides e é
expressa somente em machos (28).
1.3 Expressão do CYP-450 na Esquistossomose
Poucos são os trabalhos que relacionam a expressão de isoformas CYP
450 na esquistossomose. Alguns estudos, relacionando as alterações do
metabolismo de drogas e doenças hepáticas, tais como a hepatite (49) e cirrose
(50), concluíram que o grupo no qual havia maiores alterações hepáticas,
apresentou diminuição do conteúdo de CYP-450. Várias doenças parasitárias
causam alterações no metabolismo de drogas, como amebíase, ancilostomíase e
tripanossomíase (51).
São vários os fatores que afetam o metabolismo hepático normal e de
alguns medicamentos. Dentre eles, podem-se citar as doenças agudas ou crônicas
que atingem a arquitetura ou função hepáticas (33), tais como a esquistossomose
(52). Tais doenças podem levar tanto à indução de algumas isoformas de CYP-450
como à inibição de outras (31).
O conteúdo de CYP-450 foi reduzido consideravelmente na
esquistossomose experimental. O conteúdo de CYP-450 reduziu 30% com 8
semanas de infecção, voltando ao nível normal em 14 semanas de infecção (53).
O efeito da duração da infecção pelo S. mansoni na expressão das
isoformas de CYP-450 foi investigado. Houve inibição de algumas isoformas (1A1,
2B1 e 2B2) a partir do 45° de infecção (54).
O número infectante de cercárias de S. mansoni pode alterar a
intensidade e as ações farmacológicas de várias drogas. O conteúdo de CYP-450 foi
aumentado em até 72% na infecção com 180 cercárias de S. mansoni (55). A
influência do número de cercária na infecção por S. mansoni sobre o sistema P-450
também foi investigada, utilizando até 600 cercárias po animal (56).
O fenobarbital pode induzir algumas enzimas hepáticas, repondo o
conteúdo CYP-450 (57). A administração de lindane aumenta a atividade de
demetilases (DMN) (39) e de hidroxilases (AH) (40).
O praziquantel aumenta a atividade enzimática de aniline 4-hidroxilase,
em animais infectados com S. mansoni e tratados quando comparados com animais
com 9-13 semanas de infecção, sem tratamento (34).
A diminuição do conteúdo de enzimas CYP hepáticas, em camundongos
infectados com S. mansoni, levou a uma redução da taxa de metabolismo
xenobiótico. O declínio das atividades de CYP na esquistossomose murina tem sido
associado a uma resposta inflamatória ao redor dos ovos do parasita localizada no
parênquima hepático porque não houve mudança nas atividades de CYP ou no
metabolismo xenobiótico em camundongos atímicos (58).
Por este motivo foram também estudadas possíveis alterações no
conteúdo de CYP-450 em camundongos infectados com S. mansoni, com somente
15 a 30 dias de infecção, fase pré-postural. Não houve alteração de CYPs hepáticas
após 2 semanas de infecção, mas houve uma leve alteração após 1 mês. Segundo
os autores, essa mudança parece depender da isoforma de CYP e também do sexo
do animal estudado (59).
Não somente as atividades das enzimas são diferentemente moduladas,
mas também, a magnitude, a direção (se aumenta ou diminui a expressão) e o
tempo dos efeitos parecem depender do tipo de agente infeccioso e inflamatório
(59).
Embora existam publicações eventuais sobre alterações no sistema de
citocromo P-450 na vigência da infecção por esquistossomose, o estudo da cinética
das alterações funcionais hepáticas no sistema microssomal ao longo da infecção
esquistossomótica não foi ainda descrita na literatura, o que justifica a proposição
deste trabalho.
O
O
B
B
J
J
E
E
T
T
I
I
V
V
O
O
S
S
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito da infecção pelo S. mansoni na expressão de enzimas do
sistema citocromo P-450 no parênquima hepático, pelas técnicas de western blot e
imuno-histoquímica.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliar a expressão das subfamílias 1A1, 2A6, 2B1, 2C11, 2E1, 3A2 e
redutase de enzimas citocromo P-450, nas fases aguda, crônica da
esquistossomose mansônica murina e após tratamento com oxamniquine, por
western blot.
2. Avaliar a cinética das alterações das subfamílias 1A1, 2E1 e 3A4 de enzimas
citocromo P-450 nas fases aguda e crônica da esquistossomose mansônica murina,
pela técnica de imuno-histoquímica.
M
M
A
A
T
T
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R
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A
A
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I
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S
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O
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D
O
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S
S
3.
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais
Os experimentos foram realizados em duas etapas utilizando
camundongos swiss machos (1ª etapa), ou fêmeas (2ª etapa). Os animais foram
infectados com 25 cercárias de Schistosoma mansoni da cepa LE, por via cutânea,
no laboratório GIDE do Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais. Transferidos para o biotério da
Faculdade de Medicina da UFMG, os animais foram mantidos em temperatura
ambiente, com dieta alimentar e água ad libitum, até serem sacrificados de acordo
com o cronograma abaixo.
3.1.1 Infecção dos camundongos
Na primeira etapa do trabalho os animais foram divididos em quatro
grupos de pelo menos 10 animais cada: controle (animais não infectados), fase
aguda (animais com 70 dias de infecção), fase crônica (animais com 154 dias de
infecção) e grupo de animais tratados com oxamniquine, administrado em dose
única de 400mg/kg, por via gástrica, aos 140 dias de infecção e sacrificados 60 dias
após.
Tabela 1 – Cronograma de sacrifício dos animais para estudo por western blot.
Grupo Sacrifício N° Animais
Controle
-
10
Fase Aguda
70 dias 10
Fase Crônica
154 dias 10
Tratados 60 dias após tratamento 10
Os dias do sacrifício foram contados a partir do dia de infecção,
exceto nos animais tratados, que receberam oxamniquine
(400mg/kg) no 140° dia de infecção e foram sacrificados 60 dias
após.
Para a segunda etapa do experimento, os animais foram infectados com
25 cercárias e foram sacrificados 5 animais por vez aos 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 85
e 140 dias de infecção além de animais do grupo controle, de acordo com a tabela
abaixo.
Tabela 2 – Cronograma de sacrifício dos animais para estudo imuno-histoquímico.
Grupo Sacrifício N° Animais
Controle - 10
Fase pré-postural 30 dias 5
Fase Aguda 35 dias 5
Fase Aguda 40 dias 5
Fase Aguda 45 dias 5
Fase Aguda 50 dias 5
Fase Aguda 60 dias 5
Fase Aguda 70 dias 5
Transição FA / FC 85 dias 5
Fase Crônica 140 dias 5
Os dias do sacrifício foram contados a partir do dia de infecção.
FA = fase aguda e FC = fase crônica.
Após o sacrifício dos animais, o abdômen foi aberto e segmentos de
fígado foram retirados e identificados. O fígado dos animais da 1ª etapa foi retirado,
colocado em nitrogênio líquido e transferido para armazenamento em um freezer a –
80°C até serem realizados ensaios de western blot. O fígado dos animais da 2ª
etapa foi retirado e fixado em formol tamponado a 10%, para posterior
processamento histológico.
3.2 Western blot
Os anticorpos primários utilizados para realização do western blot foram
anti-CYP1A1, anti-CYP2A6, anti-CYP2B1, anti-CYP2C11, anti-CYP2E1, anti-
CYP3A4 e anti-CYP c redutase (Calbiochem). O anticorpo secundário utilizado era
conjugado à peroxidase, diluído a 1:10000 (Dako).
As diluições dos anticorpos primários estão ilustradas na tabela 3.
Tabela 3 - Diluição dos anticorpos primários para western blot de fígado de
camundongos infectados com Schistosoma mansoni.
Anticorpo primário Diluição
anti-CYP1A1 1:1000
anti-CYP2A6 1:1000
anti-CYP2B1 1:5000
anti-CYP2C11 1:5000
anti-CYP2E1 1:5000
anti-CYP3A2 1:5000
anti-Redutase 1:5000
CYP = sistema citocromo P-450.
3.2.1 Separação dos microssomos
A fração microssomal hepática foi preparada (60), como descrito em
seguida: o fragmento de tecido separado para a técnica de western blot foi pesado,
cortado em pedaços pequenos e adicionado tampão de homogeneização (3 vezes o
peso do tecido – w/v) e o inibidor de protease (Boehringer Mannheim),
homogeneizador (Fisher Scientific) para terminar a maceração do tecido, num total
de 8 vezes.
O homogeneizado foi centrifugado durante 20 minutos, a 10.000 x g. O
sobrenadante foi então coletado e o pellet, descartado. Posteriormente, o
sobrenadante foi centrifugado durante 90 minutos, a 105.000 x g e novamente
coletado e armazenado (citosol). O pellet foi ressuspenso com tampão de
homogeneização com volume igual ao volume inicial utilizado (3x w/v) e centrifugada
por 90 minutos, a 105.000 x g.
O sobrenadante foi descartado e o pellet (microssomos) foi ressuspenso
em tampão de ressuspensão como descrito. As amostras foram imersas
rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas em freezer a -80°C. Foi
armazenada uma pequena alíquota das amostras para posterior determinação da
concentração de proteínas (61).
3.2.2 Protocolo do western blot
As canaletas do gel de poliacrilamida preparado no laboratório, a uma
concentração de 10% foram preenchidas com a solução de microssomos contendo
20µg de proteína/canaleta. A voltagem aplicada na cuba de eletroforese foi de 50
volts por 1h e em seguida aumentada para 100 volts, durante 2h. Foram colocados
200mL do tampão de transferência em uma cuba e os materiais para montagem do
blot foram mergulhados neste tampão.
O gel foi transferido para uma cuba contendo tampão de transferência
(0,302% tris, 1,44% glicina, 20% metanol). Após montado, o “sanduíche” foi levado
para a cuba preenchida com o tampão de transferência a 4º C a 80 volts, por 16h.
Terminada a transferência, a membrana de nitrocelulose foi colocada em
uma cuba contendo solução de ponceau red (0.1%, w/v em 5% de ácido acético)
sob agitação durante 15-30 segundos para avaliar a adequação do processo de
transferência. A membrana foi bloqueada com TBS Tween 20 a 0,05% e leite
desnatado 5%, por 1h na temperatura ambiente.
Os anticorpos primários foram diluídos em TBS/BSA 5% e incubados com
a membrana de nitrocelulose, a 4°C, sob agitação, p or 16h. Em seguida, a
membrana foi lavada com solução de Tween 20 0,05% em TBS, duas vezes por 10
minutos e incubada com o anticorpo secundário, por 2h, a 4°C, sob agitação,
seguida de lavagem da membrana por 3 vezes por 15 minutos, com TBS Tween 20,
0,05%.
3.2.3 Análise da intensidade da banda
Para a análise da intensidade da banda marcada no western blot, foi
utilizado o aparelho Kodak Image Station 2000 RT. O software Kodak Molecular
Imaging Software v.4.0.1 foi utilizado e os valores foram armazenados para posterior
análise estatística.
3.2.4 Análise Estatística
A análise estatística foi realizada utilizando o programa Prism 4.0. Foi
utilizado o teste não-paramétrico Kruskal-Wallis, seguido do teste Dunn para
múltiplas comparações. As diferenças foram consideradas significativas para valores
de p < 0,05.
3.3 Histologia convencional (HE)
Todos os fragmentos de fígados fixados em formaldeído 10% foram
incluídos em blocos de parafina após processo de desidratação (álcool 70%, álcool
80%, álcool 90%, álcool absoluto I e álcool absoluto II), diafanização (xilol I e xilol II)
e impregnação (parafina I e parafina II). Após a inclusão dos blocos, o material foi
cortado em micrótomo, na espessura de 5µm e corado com hematoxilina/eosina
(HE). A histologia convencional foi utilizada para analisar morfologicamente a
evolução da infecção nos fígados em estudo.
3.4 Imuno-histoquímica
Os fragmentos de fígado, fixados em formaldeído 10%, foram
processados como descrito, cortados em micrótomo, a uma espessura de 3µm e
processados para detecção das enzimas nos tecidos conforme descrito abaixo,
utilizando os anticorpos primários descritos na tabela 4.
As lâminas de vidro foram tratadas com uma solução de lisina (Sigma-
Aldrich), diluída a 1:10, para evitar que os cortes se desgarrassem no momento de
exposição a alta temperatura, no processo de reativação antigênica. Foram
colocados dois cortes em série, de um mesmo espécimen de fígado, em uma
mesma lâmina: um foi utilizado como controle negativo da reação imuno-
histoquímica (sem incubação com o anticorpo primário) e o outro como teste.
Os seguintes anticorpos foram utilizados no estudo imuno-histoquímico:
anti-CYP1A1, anti-CYP2E1 e anti-CYP3A4 (Calbiochem).
Tabela 4 - Diluição dos anticorpos primários para imuno-histoquímica em fígado de
camundongos infectados com Schistosoma mansoni. A diluição foi feita com diluente
de anticorpo (DakoCytomation).
Anticorpo primário Diluição
anti-CYP1A1 1:250
anti-CYP2E1 1:1000
anti-CYP3A4 1:750
CYP = sistema citocromo P-450.
3.4.1 Protocolo de imuno-histoquímica
Os cortes foram desparafinados e desidratados. A recuperação antigênica
foi feita através da transferência das lâminas para a cuba com tampão citrato pH 6,0,
pré-aquecido a 60°C. Observou-se a saturação do vap or e a partir deste momento,
as cubas foram transferidas com as lâminas para a câmara a vapor (steammer) por
25 minutos. O resfriamento das lâminas foi feito à temperatura ambiente, por
aproximadamente 20 minutos. Em seguida as lâminas foram lavadas com PBS, por
5 minutos e feito o bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio.
As lâminas foram colocadas em solução de 3.5% de H
2
O
2
a 30 volumes em PBS
(3,5mL de H
2
O
2
e 96,5mL de PBS), por 30 minutos.
Após o bloqueio, as lâminas foram novamente lavadas em PBS, por 5
minutos e secadas ao redor dos cortes, lâmina por lâmina. A um dos cortes foi
adicionado PBS (controle) e ao outro o anticorpo primário. As lâminas foram
colocadas em câmara úmida a 4°C, por 16h. As diluiç ões dos anticorpos estão
especificadas na tabela 4.
As lâminas foram lavadas novamente em PBS, utilizando garrafa de
esguichos e imersas em banho de tampão PBS por 5 minutos, por duas vezes. O
excesso de tampão foi enxugado, lâmina por lâmina e adicionado o complexo
EnVision AP (DakoCytomation) em cada um dos cortes. O complexo EnVision AP,
denominado multi-link, atua como anticorpo secundário, já que é um complexo que
se liga a qualquer anticorpo primário. As lâminas foram incubadas em câmara úmida
por 30 min, a temperatura ambiente. Em seguida as lâminas foram lavadas em PBS,
utilizando garrafa de esguichos e imersas em 2 banhos também de tampão PBS
durante 5 min cada.
Para a revelação, foram transferidos 3mL de substrato tampão para um
tubo e adicionado 1 tablete de Permanent Red (DakoCytomation). O tablete foi
dissolvido e misturado. A área em torno dos cortes foi secada e a solução de
cromógeno, acima descrita, foi adicionada sobre os cortes. Toda a reação do
cromógeno no tecido foi acompanhada, sendo que as lâminas permaneceram em
contato com a solução por 5 a 30 segundos. Após reação do tecido com o
cromógeno, as lâminas foram imersas em água destilada para interromper a reação,
lavadas em água corrente durante 2 minutos e contra-coradas com Hematoxilina de
Harris diluída a 1:10 durante 2 minutos. O excesso de hematoxilina foi removido por
meio de lavagem em água corrente durante 5 minutos. Os cortes foram desidratados
e as lâminas montadas com lamínula, para exame.
3.4.2 Contagem das áreas marcadas pelos anticorpos
Para a contagem da área marcada pelos anticorpos, foi utilizado o
software KS400, usado para contagem e análises morfométricas. Foi determinada a
área marcada pelo anticorpo, em µm
2
, em 30 campos de cada lâmina. O resultado
das contagens está demonstrado nos anexos 1, 2 e 3. Os campos foram capturados
seguindo o esquema abaixo:
FIGURA 2 – Esquema de análise
seqüencial das lâminas. A área
percorrida para captura dos
campos e contagem da área
marcada pelo anticorpo seguiu o
sentido das setas.
A área marcada dos 30 campos capturados de cada lâmina foi calculada
através da chamada imagem binária e anotada para posterior análise estatística (fig.
3).
FIGURA 3 – Etapas para contagem da área marcada pelo anticorpo.
(A) Marcação imuno-histoquímica da enzima 2E1 de um animal com 50 dias de
infecção. A cor rosa representa a marcação do anticorpo.
(B) Imagem binária do corte histológico ilustrado em A. A coloração em branco
corresponde à marcação pelo anticorpo.
3.4.3 Análise Estatística
3.4.3.1 Avaliação da área marcada pelo anticorpo
A análise estatística foi realizada utilizando o programa Prism 4.0. Foram
utilizados dois testes diferentes: para análise da enzima CYP1A1, foi usado o teste
não-paramétrico Kruskal-Wallis, seguido do teste Dunn para múltiplas comparações.
Para a análise das enzimas CYP2E1 e CYP3A4 foi usado o teste paramétrico
ANOVA, seguido do teste de Tukey. As diferenças foram consideradas significativas
para valores de p < 0,05.
Foram utilizados dois testes estatísticos distintos porque os valores da
área marcada pelos anticorpos anti-CYP2E1 e anti-CYP3A4 apresentaram
distribuição normal, diferindo daqueles obtidos pela marcação do anticorpo anti-
CYP1A1, que apresentaram irregularidade no teste de normalidade.
R
R
E
E
S
S
U
U
L
L
T
T
A
A
D
D
O
O
S
S
2.
RESULTADOS
4.1 Western blot
A figura 4 ilustra a expressão da isoenzima CYP1A1 na fração
microssomal hepática. Conforme pode ser notado, essa isoforma não se alterou ao
longo da infecção pelo S. mansoni, pois não houve diferença significativa na sua
expressão nas fases aguda e crônica, nem após o tratamento com oxamniquine, em
relação ao grupo controle.
1A1
CT FA FC TR
0
250
500
750
1000
Grupo
Intensidade da Banda
Controle
Fase Aguda
Fase Crônica
Grupo tratado
1A1
CT FA FC TR
0
250
500
750
1000
Grupo
Intensidade da Banda
Controle
Fase Aguda
Fase Crônica
Grupo tratado
FIGURA 4 - Expressão dos níveis de CYP1A1 no sistema
microssomal hepático. Os valores representam a média ± DP
nos grupos controle (CT), fase aguda (FA), fase crônica (FC) e
grupo tratado (TR).
Não existe diferença entre os grupos (p = 0,8798).
A isoenzima CYP2E1 manteve o mesmo padrão de expressão nos grupos
controle, fase aguda e fase crônica (fig. 5). Entretanto, no grupo tratado com
oxamniquine, observa-se um aumento significativo da expressão desta isoenzima
quando comparamos com os outros três grupos: controle, agudo e crônico (c = TR
vs CT: p < 0.001; e = TR vs FA: p < 0.05; f = TR vs FC: p < 0.05).
FIGURA 5 - Expressão dos níveis de CYP2E1 no sistema
microssomal hepático. Os valores representam a média ±
DP nos grupos controle (CT), fase aguda (FA), fase crônica
(FC) e grupo tratado (TR).
c = CT vs TR (p < 0.001); e = FA vs TR (p < 0.05); f = FC vs TR (p < 0.05).
2E1
CT
FA FC TR
0
500
1000
1500
Grupo
Intensidade da Banda
Controle
Fase Aguda
Fase Crônica
Grupo Tratado
c, e, f
2E1
CT
FA FC TR
0
500
1000
1500
Grupo
Intensidade da Banda
Controle
Fase Aguda
Fase Crônica
Grupo Tratado
c, e, f
O resultado da expressão da isoenzima CYP2A6 está resumido na
figura 6. A comparação entre os grupos controle e tratado demonstrou que o
tratamento aumentou a expressão da enzima (p < 0.05), enquanto nos das fases
aguda e crônica da doença os valores não se alteraram.
FIGURA 6 - Expressão dos níveis de CYP2A6 no sistema
microssomal hepático. Os valores representam a média ± DP
nos grupos controle (CT), fase aguda (FA), fase crônica (FC) e
grupo tratado (TR).
c = CT ≠ TR (p < 0.05).
2A6
CT FA FC TR
0
500
1000
1500
2000
Grupo
Intensidade da Banda
Controle
Fase Aguda
Fase Crônica
Grupo Tratado
c
2A6
CT FA FC TR
0
500
1000
1500
2000
Grupo
Intensidade da Banda
Controle
Fase Aguda
Fase Crônica
Grupo Tratado
c
A enzima citocromo P-450 redutase apresentou nível de expressão
aumentado nos camundongos infectados; após o tratamento houve uma redução
da expressão desta enzima em relação ao grupo da fase aguda da infecção (p <
0.05) (fig. 7).
FIGURA 7 - Expressão dos níveis de redutase no sistema
microssomal hepático. Os valores representam a média ± DP nos
grupos controle (CT), fase aguda (FA), fase crônica (FC) e grupo
tratado (TR).
e = FA ≠ TR (p < 0.05).
Redutase
CT FA FC TR
0
250
500
750
1000
1250
Grupo
Intensidade da Banda
Controle
Fase Aguda
Fase Crônica
Grupo Tratado
e
Redutase
CT FA FC TR
0
250
500
750
1000
1250
Grupo
Intensidade da Banda
Controle
Fase Aguda
Fase Crônica
Grupo Tratado
e
O nível de expressão da isoenzima CYP2C11 está representado na fig. 8.
O grupo da fase aguda apresentou menor nível de expressão desta isoenzima,
diferindo significativamente dos grupos controle (p < 0.001), e da fase crônica
(p < 0.001). Durante a fase crônica, o nível de expressão da isoenzima CYP2C11 se
tornou semelhante aos níveis do grupo controle. O grupo tratado apresentou níveis
significativamente menores de expressão quando comparado com os grupos
controle (p < 0.05) e da fase crônica (p < 0.05).
FIGURA 8 - Expressão dos níveis de 2C11 no sistema microssomal
hepático. Os valores representam a média ± DP nos grupos controle
(CT), fase aguda (FA), fase crônica (FC) e grupo tratado (TR).
a = CT vs FA (p < 0.001); c = CT vs TR (p < 0.05); d = FA vs FC (p < 0.001); f = FC vs TR
(p < 0.05).
2C11
CT FA FC TR
0
500
1000
1500
2000
2500
Grupo
Intensidade da Banda
Controle
Fase Aguda
Fase Crônica
Grupo Tratado
a, d c, f
2C11
CT FA FC TR
0
500
1000
1500
2000
2500
Grupo
Intensidade da Banda
Controle
Fase Aguda
Fase Crônica
Grupo Tratado
a, d c, f
A expressão da isoenzima CYP2B1 está ilustrada na figura 9. O gráfico
mostra que a infecção pelo S. mansoni induz a alterações diferentes durante o curso
da infecção. Observa-se uma queda significativa nos níveis desta isoenzima durante
a fase aguda da doença em relação aos outros grupos (p < 0,05). Os níveis de
expressão dessa enzima na fase crônica e após tratamento não foram significativos
em relação ao grupo controle.
FIGURA 9 - Expressão dos níveis de 2B1 no sistema
microssomal hepático. Os valores representam a média ± DP nos
grupos controle (CT), fase aguda (FA), fase crônica (FC) e grupo
tratado (TR).
a = CT vs FA (p < 0.01); d = FA vs FC (p < 0.001); e = FA vs TR (p < 0.05).
2B1
CT FA FC TR
0
500
1000
1500
2000
2500
Grupo
Intensidade da Banda
Controle
Fase Aguda
Fase Crônica
Grupo Tratado
a, d, e
2B1
CT FA FC TR
0
500
1000
1500
2000
2500
Grupo
Intensidade da Banda
Controle
Fase Aguda
Fase Crônica
Grupo Tratado
a, d, e
A isoforma CYP3A2 apresentou maior nível de expressão durante a fase
crônica da infecção quando comparada com os níveis dos grupos controle (p < 0.01)
e da fase aguda (p < 0.05). Não houve diferença significativa entre o grupo tratado e
os outros grupos estudados (fig. 10).
FIGURA 10 - Expressão dos níveis de 3A2 no sistema
microssomal hepático. Os valores representam a média ± DP nos
grupos controle (CT), fase aguda (FA), fase crônica (FC) e grupo
tratado (TR).
b = CT vs FC (p < 0.01); d = FA vs FC (p < 0.05).
3A2
CT FA FC TR
0
500
1000
1500
2000
2500
Grupo
Intensidade da Banda
Controle
Fase Aguda
Fase Crônica
Grupo Tratado
3A2
CT FA FC TR
0
500
1000
1500
2000
2500
Grupo
Intensidade da Banda
Controle
Fase Aguda
Fase Crônica
Grupo Tratado
b, d
4.2 Histologia convencional (HE)
A histologia do fígado do animal infectado por S. mansoni, com 30 dias de
infecção (figura 11) apresentou-se bastante semelhante à histologia normal do
fígado, vista em animais não infectados pelo parasito. A integridade do parênquima
hepático está preservada sem indícios de aglomerado de células inflamatórias e de
formação de granuloma esquistossomótico.
FIGURA 11 – Microscopia do fígado de animais com 30 dias de
infecção. Notar a não ausência de aglomerado de células inflamatórias
e de granulomas esquistossomóticos. Aumento: 400x. Coloração:
hematoxilina-eosina (HE).
A figura 12 demonstra a histologia do fígado de um animal com 35 dias de
infecção por S. mansoni. O corte permite visualizar o ovo do parasito (fig. 12A),
demonstrando postura aos 35 dias de infecção. É também evidente a presença de
grânulos castanho-escuros ou negros nas células de Kupffer, originados no tubo
digestivo do Schistosoma a partir do sangue do hospedeiro e regurgitado pelo verme
adulto (fig. 12B).
FIGURA 12 – Ovo e pigmento esquistossomótico em parênquima hepático. Animal
com 35 dias de infecção por S. mansoni, demonstrando a postura dos ovos neste
período de infecção (12A) e a presença de pigmentos esquistossomóticos nas
células de Kupffer (12B). (Aumento: 1000x). Coloração: hematoxilina-eosina (HE).
A anatomia microscópica do fígado durante a fase crônica da infecção por
S. mansoni caracteriza-se principalmente pelo granuloma esquistossomótico, com
células inflamatórias presentes ao redor dos ovos do parasito (figura 13). Essa figura
representa cortes histológicos de fígado de animais, apresentando granulomas em
diferentes estágios evolutivos.
FIGURA 13 – Granulomas em fígado de camundongos infectados com 25
cercárias de S. mansoni em diferentes estágios evolutivos. Necrótico-exsudativo
(A), exsudativo 1 (B), exsudativo 2, em processo de cicatrização por fibrose (D).
A parte central corresponde ao ovo em torno do qual desenvolveu-se o
granuloma. (Aumento: 400x). Coloração: hematoxilina-eosina (HE).
Observa-se na figura 14, em fígado de animal com 50 dias de infecção, a
presença de um verme adulto do parasito localizado na luz de um vaso sanguíneo.
FIGURA 14 – Verme adulto de S. mansoni na luz de um vaso sanguíneo, em animal
representante da fase aguda, com 50 dias de infecção. A reação inflamatória em
torno do verme é bem mais discreta do que a desenvolvida em torno do ovo (A,
aumento: 100x; B, aumento: 400x). Coloração: hematoxilina-eosina (HE).
4.3 Imuno-histoquímica
4.3.1 CYP1A1
As figuras 15 e 16 demonstram a marcação imuno-histoquímica da
enzima CYP1A1 através da coloração rosa / vermelha no fígado de animais não
infectados (controle), com 50 dias de infecção (fase aguda) e com 140 dias de
infecção (fase crônica). Esta coloração se dá a partir da precipitação do cromógeno
utilizado e permite quantificar a expressão da enzima estudada.
FIGURA 15 – Marcação imuno-histoquímica da enzima CYP1A1 e controle negativo.
Controle negativo da reação (15A) e marcação da isoenzima 1A1 (15B), em animal
com 50 dias de infecção por S. mansoni (A e B: aumento 100x).
A coloração rosa se dá pela precipitação do cromógeno permanent red. A foto ilustra um dos 30 campos analisados.
FIGURA 16 – Marcação imuno-histoquímica de CYP1A1 em parênquima
hepático. Animal não infectado, grupo controle (A), animal na fase aguda
(B) e animal na fase crônica da esquistossomose mansônica (C) (A, B e C,
aumento: 400x).
As figuras acima não mostram o resultado final da estatística.
CYP1A1: sem diferença significativa entre as fases (p = 0,5253).
Na figura 17 estão apresentados os resultados das médias da área
marcada pelo anticorpo anti-CYP1A1, nos diferentes dias de infecção por S.
mansoni. Observa-se que a infecção não alterou a expressão da enzima CYP1A1 (p
= 0,8520).
FIGURA 17 – Expressão dos níveis de CYP1A1 no sistema microssomal
hepático. As barras transversais representam a média da área marcada em
diferentes dias de infecção por S. mansoni.
Os valores não diferem entre si (p = 0,8520). Os valores numéricos foram determinados a partir da média das áreas
marcadas pelo anticorpo específico, informadas pela análise binária dos cortes histológicos.
Azul: grupo controle; rosa: 30 dias de infecção (pré-postural); verde: 35 a 70 dias de infecção (fase aguda);
vermelho: 85 dias de infecção (intermediário); laranja: 140 dias de infecção (fase crônica).
1A1
0 30 35 40 45 50 60 70 85 140
0
5000
10000
15000
20000
25000
Tempo de Infecção (dias)
Área (
µ
µ
µ
µ
m²)
A comparação da expressão da enzima CYP1A1 entre os 5 diferentes
grupos: grupo não infectado (controle), 30 dias de infecção (pré-postural), fase
aguda (35 a 70 dias de infecção), 85 dias de infecção (transição entre as fases
aguda e crônica) e fase crônica (140 dias de infecção) encontra-se na figura 18. Não
houve diferença significativa da expressão da enzima CYP1A1 entre os 5 grupos
estudados (p = 0,5253).
FIGURA 18 – Expressão dos níveis de CYP1A1 no sistema microssomal
hepático. As barras transversais representam a média da área marcada em
fases diferentes de infecção por S. mansoni.
NI: grupo controle, não infectado; Pré-postural: 30 dias de infecção; Fase aguda: 35 a 70 dias de infecção;
Intermediário: 85 dias de infecção; Fase crônica: 140 dias de infecção. Não houve diferença estatísitica entre os
grupos (p = 0,5253).
1A1
NI Pré-postural Aguda Intermediário Crônica
0
5
10
15
20
25
Grupo
Área (
µ
µ
µ
µ
m²)
4.3.2 CYP2E1
A figura 19 ilustra a marcação imuno-histoquímica da enzima CYP2E1
através da coloração rosa / vermelha. Esta coloração se dá a partir da precipitação
do cromógeno utilizado e nos permite quantificar a expressão da enzima estudada.
FIGURA 19 – Marcação imuno-histoquímica de CYP2E1 em parênquima
hepático. Animal não infectado, grupo controle (A), animal na fase aguda (B)
e animal na fase crônica da esquistossomose mansônica (C) (A, B e C,
aumento: 400x).
As figuras acima não mostram o resultado final da estatística.
CYP2E1: fase pré-postural ≠ grupo controle (p = 0,0271).
Na figura 20 estão resumidos os resultados da área marcada (µm²) pelo
anticorpo anti-CYP2E1, nos diferentes dias de infecção por S. mansoni. Nota-se que
não houve diferença significativa entre os valores encontrados.
FIGURA 20 – Expressão dos níveis de CYP2E1 no sistema microssomal
hepático. As barras transversais representam a média da área marcada em
diferentes dias de infecção por S. mansoni.
Os valores comparados foram semelhantes (p = 0,1308). Os valores numéricos foram determinados a partir da média
das áreas marcadas pelo anticorpo específico, informadas pela análise binária dos cortes histológicos.
Azul: grupo controle; rosa: 30 dias de infecção (pré-postural); verde: 35 a 70 dias de infecção (fase aguda);
vermelho: 85 dias de infecção (intermediário); laranja: 140 dias de infecção (fase crônica).
2E1
0 30 35 40 45 50 60 70 85 140
0
10000
20000
30000
Tempo de Infecção (dias)
Área (
µ
µ
µ
µ
m²)
Na figura 21 encontra-se a comparação da expressão da enzima
CYP2E1 nas 4 diferentes fases da infecção por S. mansoni. Nota-se que após a
infecção por S. mansoni, houve uma diminuição significativa na expressão desta
enzima quando comparados os grupos controle e fase aguda (p = 0,0271).
FIGURA 21 – Expressão dos níveis de CYP2E1 no sistema microssomal
hepático. As barras transversais representam a média da área marcada em
fases diferentes de infecção por S. mansoni.
a = significativamente diferente do grupo controle (p = 0,0271).
NI: grupo controle, não infectado; Pré-postural: 30 dias de infecção; Fase aguda: 35 a 70 dias de infecção;
Intermediário: 85 dias de infecção; Fase crônica: 140 dias de infecção.
2E1
NI Pré-postural Aguda Intermediário Crônica
0
10000
20000
30000
a
Grupo
Área (
µ
µ
µ
µ
m²)
4.3.3 CYP3A4
A marcação imuno-histoquímica da enzima CYP3A4 através da
coloração rosa / vermelha, em fígado de animal infectado pelo S. mansoni está
ilustrada na figura 22.
FIGURA 22 – Marcação imuno-histoquímica de CYP3A4 em parênquima
hepático. Animal não infectado, grupo controle (A), animal na fase aguda (B) e
animal na fase crônica da esquistossomose mansônica (C) (A, B e C, aumento:
400x).
As figuras acima não mostram o resultado final da estatística.
CYP3A4: fase pré-postural ≠ grupo intermediário (p = 0,0301).
Na figura 23 estão resumidos os resultados da área marcada (µm²) pelo
anticorpo anti-CYP3A4, nos diferentes dias de infecção por S. mansoni. Os valores
não se apresentaram diferentes significativamente.
FIGURA 23 – Expressão dos níveis de CYP3A4 no sistema microssomal
hepático. As barras transversais representam a média da área marcada em
diferentes dias de infecção por S. mansoni.
Os valores comparados apresentaram valor de p = 0,2116. Os valores numéricos foram determinados a partir da média
das áreas marcadas pelo anticorpo específico, informadas pela análise binária dos cortes histológicos.
Azul: grupo controle; rosa: 30 dias de infecção (pré-postural); verde: 35 a 70 dias de infecção (fase aguda); vermelho:
85 dias de infecção (intermediário); laranja: 140 dias de infecção (fase crônica).
3A4
0 30 35 40 45 50 60 70 85 140
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
Tempo de Infecção (dias)
Área (
µ
µ
µ
µ
m²)
A comparação da expressão da enzima CYP3A4 entre as 4 diferentes
fases da infecção por S. mansoni está representada na figura 24. Os valores foram
significativamente diferentes entre os grupos de 30 dias e 85 dias de infecção
(p = 0,0301).
FIGURA 24 – Expressão dos níveis de CYP3A4 no sistema microssomal
hepático. As barras transversais representam a média da área marcada em
fases diferentes de infecção por S. mansoni.
g = significativamente diferente do grupo intermediário (p = 0,0301).
NI: grupo controle, não infectado; Pré-postural: 30 dias de infecção; Fase aguda: 35 a 70 dias de infecção;
Intermediário: 85 dias de infecção; Fase crônica: 140 dias de infecção.
3A4
NI Pré-postural Aguda Intermediário Crônica
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
g
Grupo
Área (
µ
µ
µ
µ
m²)
D
D
I
I
S
S
C
C
U
U
S
S
S
S
Ã
Ã
O
O
5. DISCUSSÃO
O acometimento hepático na esquistossomose faz supor que possa
ocorrer alteração das enzimas do sistema microssomal, incluindo as do sistema de
citocromo P-450. Os experimentos preliminares sugeriram que várias dessas
enzimas estão alteradas durante as fases aguda e crônica da infecção e que o
tratamento da doença pode reverter, pelo menos em parte, esse quadro.
Vários estudos têm demonstrado que infecções por vírus, bactérias ou
outros parasitas, bem como respostas inflamatórias, podem modificar os níveis e
atividades de CYP em tecidos de mamíferos. Sabe-se que são vários os fatores que
alteram a expressão de enzimas CYP, tais como a gravidade e o tempo da infecção,
tipo de agente infeccioso ou inflamatório, sexo e a resposta do sistema por meio de
indução ou inibição das enzimas (31, 62).
5.1 Metodologia
Alguns autores têm estudado alterações causadas pela esquistossomose
mansônica, dependente da carga parasitária e de formas clínicas da infecção
(aguda, crônica, intestinal, hepatoesplênica). O número de cercárias inoculadas
utilizada no presente experimento foi de 25 cercárias/animal. Os estudos de
expressão das enzimas CYP-450 em animais infectados com Schistosoma, em sua
maioria, utilizam para infecção um número muito maior de cercárias (60, 120, 180,
300 e até mesmo 600 cercárias) (55, 56). Considerando que um camundongo pesa
em média 25 gramas, a infecção com 25 cercárias corresponde, aproximadamente,
a 1 cercária por grama de animal. Esse dado extrapolado, para um humano adulto
de 70 kg, corresponderia a 70.000 cercárias, que constitui um número dificilmente
encontrado na prática clínica. Por esse motivo, baseados na mortalidade decorrente
da infecção e nos aspectos macro e microscópico do fígado dos animais infectados
e no interesse do estudo da fase crônica da doença, preferiu-se não aumentar o
número de cercárias inoculadas. Além disso, a ênfase deste trabalho foi o estudo
das alterações causadas por S. mansoni no curso da doença, comparado ao grupo
controle não-infectado e ao grupo tratado com oxamniquine e da cinética das
possíveis alterações ocorridas ao longo do tempo. Esse enfoque o diferencia de
outros trabalhos da literatura, nos quais as alterações enzimáticas em animais
infectados com S. mansoni foram estudadas em fases mais avançadas da infecção
sem a preocupação de verificar a evolução temporal das alterações (52, 53, 54, 59).
Para alguns autores, a fase aguda aparece em torno do 50° dia e dura até
cerca de 120 dias após a penetração da cercária. No presente trabalho, a fase
aguda foi considerada no período de 35 a 70 dias após a infecção e a fase crônica a
partir do 140° dia de infecção. O período entre ess as duas fases foi denominado
fase de transição e foi caracterizado pelo estudo dos animais com 85 dias de
infecção. O 30° dia de infecção foi retirado do gru po de fase aguda pelo fato de
ainda não haver postura dos ovos nesta época, como demonstrado pela histologia
convencional, embora não se possa ter certeza se alterações produzidas no
organismo do hospedeiro pela presença dos vermes no sistema porta, possam já
estar em curso.
Para a marcação imuno-histoquímica foi utilizado um kit, comercialmente
disponível, no qual o anticorpo secundário se liga à enzima fosfatase alcalina e o
cromógeno é o permanent red. Este kit apresenta a vantagem de evitar o
background causado pela peroxidase e biotina endógenas, presentes em quantidade
apreciável no tecido hepático, o que poderia comprometer a resolução dos achados
microscópicos, dificultando a contagem da marcação imuno-histoquímica.
A metodologia utilizada na análise morfométrica, para contagem da área
marcada pelos anticorpos, tem sido descrita em pesquisas relacionadas com imuno-
histoquímica (63) e colorações de tricrômico de Gomori (64).
A técnica adotada no presente trabalho utilizou cortes de tecido,
expressando a molécula alvo como controle negativo na ausência do anticorpo
específico com a finalidade de controlar a reação imuno-histoquímica positiva nos
cortes de fígado (65).
Ainda existem controvérsias em relação ao melhor marcador para cada
enzima. Por exemplo, em ratos, as reações de PROD (pentoxiresorufina-O-
despentilase) e BROD (benziloxiresorufina-O-desbenzilase) são catalisadas
preferencialmente por isoformas CYP 2B1/2 em microssomos hepáticos induzidos
por fenobarbital (66).
Em camundongos, entretanto, ainda não é totalmente claro que
isoenzimas metabolizariam preferencialmente a pentoxiresorufina (PROD) e a
benziloxiresorufina (BROD). BROD seria um marcador melhor do que PROD para a
atividade de isoformas da subfamília 2B em camundongos (67) que incluiria as
isoenzimas CYP 2B9 e CYP 2B10. Mesmo com 83% de homologia entre si, tais
isoformas apresentam grandes diferenças em sua regulação (68).
Várias reações têm sido utilizadas como marcadoras da isoenzima CYP
2E1, entre as quais a N-nitrosodimetilamina N-desmetilação (69), a anilina 4-
hidroxilação (70) e a hidroxilação do p-nitrofenol (71). Esta última, além de ser de
fácil execução, tem a vantagem de não envolver a manipulação de substância
altamente genotóxica / carcinogênica (e.g. N-nitroso-dimetilamina) e não exigir
grande quantidade de fração microssomal. Talvez por estas razões a hidroxilação do
p-nitrofenol seja amplamente utilizada como marcadora da enzima CYP 2E1 (72).
5.2 Resultados
Tem sido descrito que, tanto em seres humanos como em animais de
laboratório, infecções virais, bacterianas e parasitárias, e processos inflamatórios e
vários tipos, alteram o metabolismo de fármacos e as atividades e níveis de
expressão de várias isoformas de CYP no fígado, no rim e no cérebro (31, 73).
A isoenzima CYP 1A1 apresentou expressão muito semelhante nos dias
de infecção estudados tanto em machos utilizados nos experimentos de western blot
quanto em fêmeas, naqueles de imuno-histoquímica. A expressão de 1A1 foi
reduzida em fêmeas, após um mês de infecção por S. mansoni, mas não nos
animais machos (59). A alteração observada por esses autores não tem uma
explicação lógica se se considera que as alterações do sistema citocromo P-450 se
devem à resposta inflamatória induzida pelo ovo presente no tecido hepático, o que
só ocorre a partir do 35° dia de infecção (58). A a usência de alteração da isoforma
1A1, tanto em machos como em fêmeas no presente trabalho, parece indicar que
essa enzima não é afetada pela infecção pelo S. mansoni, o que confirma apenas
em parte os resultados de outros autores (59) e divergem dos constatados em outro
trabalho (54) que, em camundongos machos, encontraram expressão inalterada da
enzima 1A1 no 30° dia de infecção e a partir daí, c om diminuição gradual, à medida
que aumentava o tempo de infecção por S. mansoni. Essa diferença pode estar
relacionada com a intensidade da infecção por S. mansoni, pois, estes autores
infectaram os animais de estudo com 200 cercárias de S. mansoni e nos
experimentos do presente trabalho o número de cercárias/camundongo foi de
apenas 25, número 8 vezes menor do que o utilizado no trabalho referido.
A expressão da isoenzima CYP 2A6 demonstrou-se aumentada
significativamente apenas no grupo tratado com oxamniquine. Porém, alguns
autores têm visto que a expressão desta enzima foi aumentada na fase crônica da
infecção esquistossomótica (59), o que não foi confirmado pelos nossos resultados.
A isoenzima 2B1 apresentou menor nível de expressão em animais da
fase aguda da infecção e maior nível em animais da fase crônica e do grupo tratado.
As diferenças observadas em relação a outros autores que estudaram a expressão
dessa isoforma em camundongos com esquistossomose podem ser explicadas pela
dificuldade técnica na marcação da enzima pelo anticorpo. Por exemplo, no mesmo
grupo de animais, a marcação por BROD (benzyloxy) demonstrou um aumento
significativo em fêmeas com 30 dias de infecção, diferindo da marcação por PROD
(pentoxy), onde a expressão nos animais infectados foi semelhante à expressão do
grupo controle (não-infectado) (59).
A expressão desta isoenzima aumentou em animais com 6 dias de
infecção, seguida de redução de expressão aos 45 dias de infecção (54). Este
resultado está de acordo com os dados do presente trabalho, pois verificou-se
diminuição da expressão na fase aguda da doença. Fica difícil a análise em tempos
inferiores a 30 dias de infecção, porquanto os animais só começaram a ser
sacrificados após 30 dias de infecção. Além disso as dificuldades metodológicas
acima apontadas podem ter contribuído para alguma divergência de dados quando
confrontados com os da literatura.
A isoenzima CYP 2E1, nos machos, apresentou expressão semelhante
nas fases aguda e crônica quando comparadas entre si e ao grupo controle.
Contudo nos animais tratados com oxamniquine notou-se um aumento significativo
dessa enzima (p < 0,05). Este resultado corresponde ao constatado por alguns
autores, que demonstraram o aumento do conteúdo de CYP-450 causado pela
administração de oxamniquine (41). É possível que o tratamento induza uma
remodelação da fibrose observada nos animais infectados e esse fenômeno possa
alterar a expressão daas enzimas CYP-450.
Em fêmeas, a expressão da isoenzima 2E1 não foi alterada em dias
diferentes de infecção. Este resultado está de acordo com a literatura, onde foi
também encontrada semelhança na expressão dessa isoenzima, em animais fêmeas
infectadas com 15 e 30 dias (59). Ao se agruparem os dados de acordo com as
fases da infecção, a isoenzima 2E1 mostrou redução da expressão da enzima na
fase aguda em relação ao grupo controle (p = 0,0271). Na fase crônica, antes e após
o tratamento, os níveis dessa enzima voltaram aos valores controle.
A expressão de isoenzima 3A2, em machos, pelo western blot apresentou
um aumento significativo na fase crônica da infecção, quando comparada com os
grupos controle e fase aguda. Pela imuno-histoquímica a isoenzima 3A4, quando
estudada em animais agrupados de acordo com as fases da infecção, em fêmeas,
apresentou diferença entre a fase pré-postural no 30° dia após infecção e a fase de
transição no 85° dia. Estes achados estão de acord o com resultados descritos por
alguns autores, que demonstraram a diminuição na expressão da subfamília 3A,
com o decorrer do tempo de infecção (53).
A expressão da P-450 redutase foi maior na fase aguda e menor no grupo
tratado com oxamniquine (p < 0,05). Esse fato é inesperado, pois o conteúdo da
enzima redutase é inversamente proporcional ao peso do fígado (52, 58) e este
tende a diminuir com o tratamento. Como a infecção pelo S. mansoni produz
hepatomegalia, o lógico seria encontrar níveis menores dessa enzima na fase aguda
(maior peso do fígado) do que após o tratamento.
Grande parte dos estudos da expressão de CYP-450 no sistema
microssomal hepático é feito de forma mais genérica. Ou os autores pesquisam tais
enzimas a partir dos seus substratos (54, 59) ou a partir do conteúdo total de
citocromo P-450, através de espectroscopia. (43). Esse fato dificulta a comparação
de resultados utilizando diferentes métodos. Nenhum dos trabalhos encontrados
usou a técnica de imuno-histoquímica e muito poucos a técnica de western blot.
A intensidade da imuno-marcação demonstrada nas fotografias (figuras
16, 19 e 22) não reflete, necessariamente, os resultados obtidos pela análise
estatística. Isso é explicado pelo fato de terem sido capturados e analisados 30
campos da lâmina de cada animal, sendo que cada grupo constava de pelo menos 5
animais estudados. As figuras são somente para ilustração da marcação imuno-
histoquímica dos anticorpos pesquisados e a análise subjetiva da intensidade de
coloração pode não refletir o padrão demonstrado pela leitura das cores através de
sensores do programa utilizado. Os valores numéricos das análises binárias
encontram-se nos anexos.
Os mecanismos subjacentes à depressão ou indução da expressão das
isoenzimas CYP-450, ainda não são bem conhecidos. A literatura sobre o assunto é
vasta, mas dispersa pelo uso de inúmeros agentes infecciosos ou inflamatórios, em
diferentes momentos de evolução da doença e pelo método de detecção variável
das isoformas.
5.3 Perspectivas Futuras
O presente trabalho abre possibilidades de estudos mais elaborados com
relação ao sistema citocromo P-450. Poder-se-á em uma próxima etapa, estudar a
cinética das alterações da expressão das enzimas estudadas neste trabalho, pela
técnica de western blot, para confirmar os dados obtidos pela imuno-histoquímica.
Uma outra abordagem a ser desenvolvida é a determinação da atividade enzimática
dessa família de enzima.
Em termos de aplicação clínica, podem ser conduzidos experimentos
utilizando a mesma abordagem metodológica em fígados de receptores de
transplantes hepáticos para caracterizar o comportamento do sistema CYP-450 nos
diferentes tipos de afecções que levam a insuficiência hepática grave naqueles
pacientes. Essas perspectivas ampliam a linha de investigação, com possibilidade
de avanço do conhecimento na área e inserção de novos projetos de pesquisa para
o seu desenvolvimento.
C
C
O
O
N
N
C
C
L
L
U
U
S
S
Õ
Õ
E
E
S
S
6. CONCLUSÕES
1) A esquistossomose mansônica é capaz de alterar a expressão das enzimas
do sistema citocromo P-450, em camundongos, no decorrer da infecção.
2) Animais na fase aguda da esquistossomose mansônica murina apresentaram
inibição e, na fase crônica, aumento da expressão das isoenzimas CYP2B1 e
CYP3A2, quando comparados com animais controle.
R
R
E
E
F
F
E
E
R
R
Ê
Ê
N
N
C
C
I
I
A
A
S
S
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A
A
N
N
E
E
X
X
O
O
S
S
ANEXO 1 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 1A1 (animais 1 a 27).
Continua...
Campo 01
Campo 02
Campo 03
Campo 04
Campo 05
Campo 06
Campo 07
Campo 08
Campo 09
Campo 10
Campo 11
Campo 12
Campo 13
F/01/30/F
14023,10
14876,80
8936,31 13655,60
13597,60
11439,80
10944,30
17347,70
10772,90
10267,10
4372,07 12439,80
12538,30
F/02/30/F
15518,50
3329,41 17065,10
9592,93 10195,70
8675,40 6860,81 21022,50
5755,45 28412,30
28476,20
8055,53 5159,29
F/03/30/F
13983,20
25651,80
13200,80
15332,70
13291,80
14928,40
12675,20
14452,60
17167,90
22542,60
16509,70
13038,30
8843,31
F/04/30/F
6044,14 5763,17 7826,46 8239,71 11420,00
11593,40
14469,10
16614,80
16407,00
16148,60
16391,00
15843,30
12155,00
F/05/30/F
4935,15 3537,72 6364,52 11522,40
14011,60
4896,83 4486,67 12404,60
19123,90
17896,70
13292,20
4323,11 10780,20
F/06/35/F
14291,80
17914,30
14779,30
20940,60
20888,90
22233,70
23128,00
21868,20
16451,90
20339,30
21599,70
18644,00
15182,90
F/07/35/F
3558,06 4316,52 6326,65 8307,88 9379,30 10764,60
12422,70
12294,80
13167,00
10201,00
12654,40
14673,50
14387,10
F/08/35/F
9581,71 6867,97 16425,10
12096,70
13523,60
18323,20
22246,60
18862,80
14751,70
12384,10
21495,50
8565,56 13181,30
F/09/35/F
6229,16 5381,34 4803,27 7938,26 12630,40
18016,40
19043,50
14530,30
10026,50
8847,94 11751,90
14190,40
15256,60
F/10/35/F
24382,70
27325,80
22675,30
21560,10
27096,90
27216,00
20975,50
21822,50
21864,70
11468,00
16485,00
20539,20
15920,80
F/11/40/F
2317,47 2433,34 3444,01 3970,18 4316,80 5611,67 5895,30 6882,69 6328,05 6112,03 8475,37 8332,71 8817,64
F/12/40/F
3318,19 4658,93 5665,11 6051,29 13489,00
13961,80
13387,40
6952,83 8080,50 12094,40
13462,70
11690,90
10725,90
F/13/40/F
9825,23 11657,20
11245,50
12165,80
13492,30
14784,30
13325,30
15339,30
15558,20
15089,60
13499,60
13803,30
12692,40
F/14/40/F
4074,97 15763,00
16512,40
14073,00
13366,70
14827,00
15573,20
12136,90
4305,02 6013,56 5967,55 5512,08 5006,25
F/15/40/F
15142,60
18231,30
18579,90
18163,10
19239,30
18535,00
20227,80
20098,30
19538,20
19489,10
21176,60
22180,20
22003,10
F/16/45/F
21383,00
16127,00
22577,00
20530,30
15438,70
14264,30
18257,10
18540,50
18119,50
14820,20
20429,80
19726,90
20844,30
F/17/45/F
8437,21 8679,33 9972,37 10226,00
10670,70
11528,70
11948,00
11746,30
14240,90
15653,90
14085,90
12342,30
11577,70
F/18/45/F
11085,90
14993,40
15918,90
16172,40
13286,60
12788,50
12009,70
12040,30
15022,40
11331,10
8915,41 8646,78 15930,10
F/19/45/F
7791,39 8769,80 13531,80
14596,10
15883,50
16108,40
14672,70
17016,00
15622,30
17469,20
17590,50
17860,70
19196,00
F/20/45/F
21770,80
18426,30
22123,80
21159,50
23565,10
24209,80
18869,40
18549,20
15278,00
15753,80
18397,90
19399,50
20635,20
F/21/50/F
8921,02 10404,60
10323,80
11175,80
17646,20
12423,80
11674,20
11379,50
7668,37 11710,80
17494,70
11785,60
20461,80
F/22/50/F
5122,25 6168,98 10448,20
9997,20 12605,20
9846,13 11172,70
12547,40
11924,40
11099,30
12696,10
13182,30
9757,47
F/23/50/F
13921,80
11220,30
13708,00
14721,10
17040,40
16275,50
16030,40
14073,40
18686,60
19096,10
20662,00
20902,40
23465,80
F/24/50/F
8751,71 12291,10
17122,40
18299,50
20792,30
21893,70
14522,30
15098,70
8697,70 26139,30
23940,20
21318,90
16367,20
F/25/50/F
19601,50
10866,60
15870,10
29311,40
27319,20
22052,10
28857,20
18064,10
19437,00
19021,60
26863,10
19443,10
18598,80
F/26/60/F
18380,70
14748,40
10213,90
18744,10
18193,70
17359,60
14774,00
15293,80
11631,40
15028,80
10757,10
10538,10
11854,20
F/27/60/F
16515,20
10920,80
20622,10
22582,70
16749,40
18561,20
20587,90
20307,20
22633,90
20636,00
7683,66 16256,00
20752,00
ANEXO 1 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 1A1 (animais 1 a 27).
Continua...
Campo 14
Campo 15
Campo 16
Campo 17
Campo 18
Campo 19
Campo 20
Campo 21
Campo 22
Campo 23
Campo 24
Campo 25
Campo 26
F/01/30/F
8211,51 9307,33 10895,70
9897,05 6970,65 12225,90
12463,40
10076,70
12484,80
14445,90
12210,00
9866,05 9439,19
F/02/30/F
4508,69 3662,28 9206,48 5774,39 5769,20 21925,70
11575,00
20242,60
20469,80
11844,20
17402,10
14189,40
5546,72
F/03/30/F
16757,00
17452,50
19575,50
20778,10
15788,00
18841,40
27106,60
27483,60
27915,70
25893,40
28050,20
28087,20
29378,60
F/04/30/F
11331,20
12717,80
9994,54 11629,60
12660,60
10926,70
12591,00
14344,90
13476,70
15360,30
16101,70
16181,60
16250,20
F/05/30/F
10091,50
11248,60
7757,16 13364,30
22788,10
20070,40
11061,30
8193,98 328,52 13262,80
8990,74 10471,50
12104,10
F/06/35/F
19724,10
22860,90
19340,20
15010,00
22179,60
22159,30
18141,20
15735,30
22698,10
21335,80
20316,10
23108,60
21305,00
F/07/35/F
13615,70
14086,90
12750,50
12542,90
13106,10
11049,00
10723,00
12471,10
13207,50
15309,00
14744,90
15099,00
14545,20
F/08/35/F
13221,80
15185,10
17150,10
20188,30
20137,90
16466,20
13701,80
10306,20
14459,90
14991,40
17878,40
9452,52 9030,85
F/09/35/F
18951,30
24167,60
20829,70
16847,50
13084,10
10906,20
10898,70
8641,90 8090,74 8848,22 11579,50
12387,50
19064,80
F/10/35/F
22549,60
22837,90
22403,10
11888,20
19939,30
18579,30
24214,60
17676,80
17186,40
23100,60
20919,10
15150,70
13461,00
F/11/40/F
9166,50 9447,61 11506,00
9843,18 10458,30
10245,80
11274,40
11748,00
11324,20
11535,20
13751,50
15239,10
13073,00
F/12/40/F
10799,20
7781,57 9391,92 7300,99 6137,70 4259,99 7059,16 7355,98 11506,30
9388,41 10334,60
9857,63 10161,50
F/13/40/F
12336,70
13113,80
13359,70
12818,10
12679,80
10965,10
11703,80
11450,00
10999,70
11407,40
10877,00
11953,90
11772,80
F/14/40/F
6154,11 13052,70
7593,46 7245,16 7143,46 6680,84 7149,08 7618,99 6219,76 6692,90 6747,05 6479,83 6918,75
F/15/40/F
21658,30
22890,40
22757,20
24677,00
23931,20
22208,80
24457,70
20870,10
22602,50
22693,40
22258,30
23890,40
23281,50
F/16/45/F
18266,20
16548,90
19129,20
19778,40
18583,90
20266,70
17070,20
14951,30
15383,00
15193,10
17265,90
16554,30
19468,10
F/17/45/F
12793,30
13061,40
12830,20
13001,30
12359,80
14317,20
12741,20
13447,70
13199,10
12004,40
13800,60
14564,80
14236,30
F/18/45/F
11716,80
16857,50
14208,70
15288,90
9191,75 13303,20
10639,80
12515,70
12883,90
15430,40
15124,20
14092,90
14555,80
F/19/45/F
18718,30
18821,90
18424,20
18661,70
18730,30
19806,00
20222,50
15887,50
17843,90
21055,60
20334,70
21894,40
21191,80
F/20/45/F
17568,50
19358,70
19122,90
18586,10
19073,60
21355,30
18351,00
22608,30
17270,70
15261,00
17522,40
17598,10
21036,10
F/21/50/F
18731,00
17552,50
10247,50
9511,29 12309,30
14304,50
7103,21 13494,20
13474,60
15270,70
13663,30
17845,00
18266,60
F/22/50/F
12747,40
12961,60
15046,00
15245,60
14424,10
13925,90
13377,00
11671,90
10705,40
13105,10
13841,00
14800,50
14275,80
F/23/50/F
23334,20
25547,20
23369,70
21847,70
21853,70
20814,00
16395,00
17533,00
24417,10
23549,10
22050,70
17967,90
24041,20
F/24/50/F
21271,50
19481,30
20859,30
19872,90
14585,90
13502,90
12793,00
17675,80
19478,80
16744,00
16264,90
21558,00
21051,80
F/25/50/F
18794,80
11480,90
18896,20
20402,00
22742,50
24852,70
26023,70
20461,40
24968,70
21809,60
19185,90
24652,60
21709,50
F/26/60/F
12493,90
12037,90
12444,60
11686,00
10205,10
14914,80
12184,60
18084,00
9996,36 13721,30
8796,32 13455,20
12391,00
F/27/60/F
23986,80
21556,50
12330,70
9465,42 25668,50
24077,60
22844,20
22026,30
18095,40
21536,30
25312,20
21240,70
20672,40
ANEXO 1 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 1A1 (animais 1 a 27).
Continua...
Campo 27
Campo 28
Campo 29
Campo 30
F/01/30/F
9659,28 9620,01 12160,10
13401,10
F/02/30/F
8675,40 12653,70
11518,20
12644,00
F/03/30/F
26095,50
24753,20
28427,60
25946,10
F/04/30/F
15851,70
14166,00
13035,00
21032,20
F/05/30/F
8990,74 13195,60
13517,70
11809,00
F/06/35/F
16977,50
18518,40
15988,00
17174,50
F/07/35/F
13460,60
11819,80
10735,00
14850,40
F/08/35/F
11804,60
20282,80
20036,30
20424,80
F/09/35/F
19848,40
11934,10
7613,66 12200,60
F/10/35/F
8713,55 18824,90
18535,00
21015,70
F/11/40/F
14509,00
14900,90
14512,80
13224,90
F/12/40/F
10780,20
11890,20
11744,50
11528,40
F/13/40/F
11243,40
11330,80
11855,00
11806,70
F/14/40/F
7576,63 6908,22 6633,71 7199,85
F/15/40/F
21268,80
20999,80
22847,30
22343,40
F/16/45/F
18446,80
15901,20
17537,10
17920,30
F/17/45/F
13763,40
13501,30
15603,50
16305,20
F/18/45/F
8130,85 10769,70
5862,90 12456,90
F/19/45/F
21896,90
21914,20
23004,80
18652,50
F/20/45/F
16521,10
18446,30
19055,00
18309,20
F/21/50/F
19719,70
12959,00
16413,90
18808,50
F/22/50/F
13463,80
12969,60
12795,70
12788,40
F/23/50/F
25217,10
26745,40
21922,80
24991,00
F/24/50/F
20591,80
18999,00
20491,10
22069,10
F/25/50/F
17092,40
23708,90
15063,60
23047,10
F/26/60/F
12359,70
12569,00
13476,10
11902,70
F/27/60/F
23626,50
19936,90
23398,90
23932,20
ANEXO 1 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 1A1 (animais 28 a 55).
Continua...
Campo 01
Campo 02
Campo 03
Campo 04
Campo 05
Campo 06
Campo 07
Campo 08
Campo 09
Campo 10
Campo 11
Campo 12
Campo 13
F/28/60/F
10151,50
9222,75 7956,21 7800,93 6390,61 4316,38 5891,10 6696,97 6800,35 9537,95 8562,06 9643,29 7298,89
F/29/60/F
13586,10
12761,60
18306,20
19926,40
20236,10
19178,40
15207,80
19155,30
9403,56 12785,60
14425,40
16552,80
16252,30
F/30/60/F
17108,80
18375,60
19828,30
19954,40
20440,10
19489,40
21091,10
21049,10
21320,60
18312,80
18900,00
20035,50
21906,10
F/31/70/F
6537,06 8348,14 12126,40
12662,00
16199,10
16336,10
15600,90
14978,20
17173,60
15215,30
14742,70
16448,10
18988,40
F/32/70/F
2348,89 12280,90
13752,30
10970,80
14034,90
12042,40
12359,40
22124,00
21752,90
16705,40
15342,90
17186,00
14072,90
F/33/70/F
8302,97 5730,06 10013,20
12165,30
4692,17 6208,40 8144,60 10534,70
6603,27 3877,74 6078,64 3936,23 5108,51
F/34/70/F
7809,35 17388,00
19685,80
18337,60
23277,20
21076,50
19247,00
15167,70
19538,50
18581,10
18469,10
20763,40
24768,20
F/35/70/F
5221,15 7060,98 8532,32 9885,97 12269,50
12150,80
17606,40
14011,70
16357,80
17293,70
18440,20
15808,10
16427,10
F/36/N/F 16526,80
17603,40
12090,20
11030,60
10379,90
7706,10 9405,39 10371,70
7684,78 8921,02 16157,90
16688,80
8331,87
F/37/N/F 3385,94 3725,68 4065,01 4390,72 6500,03 11027,40
11665,20
12124,20
11562,50
9551,27 11170,30
9977,14 9426,57
F/38/N/F 3775,90 4916,75 6215,41 7424,71 8805,29 10424,80
11528,90
11317,50
11260,40
13475,00
14961,80
13347,20
11940,40
F/39/N/F 22980,40
21769,40
20963,60
24353,60
24013,10
23354,50
21105,80
22219,60
22756,40
21823,00
24344,20
23852,60
23688,00
F/40/N/F 7790,69 8916,25 8422,91 13383,70
15534,80
13450,80
13465,90
14405,00
15687,00
15572,80
15789,40
16397,50
16540,90
F/41/N/F 3962,61 3698,05 3928,94 3827,24 5338,84 6118,76 7708,21 3632,54 3174,97 6906,82 5085,08 6951,29 11255,60
F/42/N/F 22182,50
20492,00
20385,10
20840,00
25199,80
25536,50
23155,50
21150,80
23767,60
25758,00
26037,30
16711,80
22406,40
F/43/N/F 7340,69 10941,80
6138,68 8861,12 9884,00 8369,88 10008,80
15571,10
12546,10
10587,90
12510,20
9795,63 9956,66
F/44/N/F 14481,60
15098,40
14187,50
13624,60
13364,20
13206,50
13325,60
13861,20
13989,10
14199,50
12791,70
14174,90
13504,20
F/45/N/F 5600,87 4681,65 4432,10 9377,61 9304,25 14036,10
6288,21 9139,85 14180,50
11848,50
14235,00
9351,80 12270,20
F/46/85/F
1972,54 2875,20 3969,34 2847,57 8057,07 9955,26 7400,31 7345,60 7390,91 7060,00 7550,54 12412,40
18585,50
F/47/85/F
26819,20
27872,90
23258,90
27424,90
24228,20
24107,80
23289,30
23344,20
24480,80
16118,10
23478,40
24375,30
22861,20
F/48/85/F
5812,96 9214,61 12323,80
6096,32 8361,47 12346,00
10392,50
8361,19 11159,70
8660,81 9412,68 15296,10
19177,20
F/49/85/F
8877,82 11873,40
12089,50
11219,70
10391,70
8455,31 20043,60
23407,40
25394,50
28013,90
14976,80
18925,20
20713,20
F/50/85/F
2920,51 4393,39 4213,00 7179,66 6552,07 5108,65 5536,62 6149,06 7400,59 10797,20
8100,56 10181,80
8293,01
F/51/140/F
13688,90
8113,18 7361,03 11029,20
12473,00
9340,58 12389,90
10656,50
8458,68 8182,48 14245,80
13915,10
12790,20
F/52/140/F
21538,80
19366,00
7722,38 22310,10
8078,95 11030,60
21049,70
17686,10
19082,80
24269,80
12510,90
26231,80
21535,50
F/53/140/F
16536,50
19284,10
13975,20
16223,80
16417,30
17600,80
18711,30
13906,50
14443,10
13950,30
17380,80
11894,00
15978,20
F/54/140/F
4169,23 4379,36 5023,08 4163,90 5377,55 6466,92 5621,21 5472,80 6481,51 5061,80 7267,33 7755,48 8374,93
F/55/140/F
9951,05 11505,20
7050,18 7119,76 10855,40
15833,70
12049,00
10997,90
11000,70
8476,35 11785,70
14217,80
19666,40
ANEXO 1 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 1A1 (animais 28 a 55).
Continua...
Campo 14
Campo 15
Campo 16
Campo 17
Campo 18
Campo 19
Campo 20
Campo 21
Campo 22
Campo 23
Campo 24
Campo 25
Campo 26
F/28/60/F
4125,04 2188,14 5061,37 4769,32 7320,07 5893,62 7948,78 6356,95 5245,27 3635,63 5659,92 3839,59 6178,38
F/29/60/F
16079,80
18359,90
20775,90
19988,90
20682,20
18062,00
21131,70
20844,30
19959,80
21226,90
20717,40
19153,70
16629,20
F/30/60/F
22169,40
15112,00
20825,40
21311,60
14879,00
21175,90
24469,00
25077,10
22780,40
15005,10
21837,20
21246,20
21703,80
F/31/70/F
13818,40
17904,50
19641,30
15018,30
17633,90
19466,10
17091,30
18752,70
18361,10
18109,40
16808,60
19479,20
20262,20
F/32/70/F
15434,10
11470,90
14998,40
17461,50
15115,80
12483,10
13237,10
11209,70
11481,00
26851,40
22707,50
21294,20
13769,30
F/33/70/F
8217,97 11365,30
12921,20
4465,21 6983,69 10780,10
11253,20
5777,90 11281,40
8628,83 15666,50
16519,70
10712,00
F/34/70/F
24032,50
23761,00
20720,20
21257,00
14264,90
16869,20
21098,90
17655,20
20618,50
22924,00
24062,50
23804,70
23148,10
F/35/70/F
21729,00
19219,80
14788,30
18123,60
16893,20
14248,10
14845,50
15004,20
15372,20
18365,50
18807,00
20025,70
20327,00
F/36/N/F 8189,77 9104,22 9215,60 8134,92 7831,93 7063,65 7114,29 7974,87 8649,17 8140,95 7599,92 8809,50 8387,84
F/37/N/F 9578,91 8622,24 8463,30 7529,36 7240,96 8059,74 9753,97 11513,40
13896,80
12371,20
14389,90
14685,30
15. 797,4
F/38/N/F 12473,20
8982,18 7905,15 7070,38 5336,03 7346,44 8400,88 10221,60
10780,10
13096,00
18112,20
18470,70
19569,80
F/39/N/F 21970,90
20552,30
21187,40
21434,90
20458,90
20189,80
20212,70
23490,30
21407,10
21969,50
19749,80
21534,90
21072,00
F/40/N/F 16386,10
16098,10
16531,70
18084,00
17179,90
14663,40
18244,30
18181,20
17277,40
18634,20
17659,70
19724,50
19300,30
F/41/N/F 9184,59 6781,98 6266,05 6088,60 7044,01 10037,00
11190,40
8830,82 6120,87 7736,82 5686,30 3422,13 5315,27
F/42/N/F 19070,80
18347,70
18656,50
21063,70
25339,60
22086,00
14710,10
15953,70
17213,60
22319,60
25905,60
28450,40
27156,90
F/43/N/F 17055,00
16718,40
17714,00
17146,70
14981,80
15640,60
13203,70
13715,60
16301,50
16947,10
18790,20
20548,90
15817,30
F/44/N/F 14402,70
12622,00
14280,20
13304,00
14055,80
13545,90
12997,70
13003,60
10791,20
12392,20
12010,40
12040,40
11241,90
F/45/N/F 7602,72 4466,19 3201,48 11683,70
3094,17 10044,10
10532,20
14930,10
13747,40
9214,61 14545,70
14533,70
16518,60
F/46/85/F
10262,60
9463,46 9084,72 10022,20
11390,80
9517,33 11747,10
6835,84 7551,94 5244,85 5872,44 7418,12 6046,94
F/47/85/F
23175,80
23657,90
24509,60
23116,20
21498,70
22849,10
22809,90
19016,40
19612,60
20950,40
21340,10
18512,00
20500,70
F/48/85/F
12137,20
12661,30
15132,40
17919,20
10320,80
11216,30
12023,90
9881,76 13887,70
13316,90
7042,89 15118,30
11566,00
F/49/85/F
13168,10
23962,90
20846,60
23357,90
19137,10
19142,70
26483,40
18715,20
23459,70
20879,50
12783,80
18582,50
24686,30
F/50/85/F
5924,20 4384,27 6512,37 10504,60
10727,50
11244,10
10381,40
11277,80
11257,60
9559,27 9329,36 10306,50
9220,65
F/51/140/F
7130,14 14519,40
16148,50
14476,20
14076,90
9201,71 9872,50 15033,90
16580,00
13219,60
12310,50
12233,50
14111,70
F/52/140/F
22948,30
15308,50
23816,70
18777,40
22467,00
14559,80
23210,60
19319,50
23465,40
23800,60
22845,60
19758,70
18943,30
F/53/140/F
11868,00
17388,70
9469,07 12943,10
14597,10
14298,00
21256,30
24333,80
13321,00
17568,80
10915,40
14052,40
12354,70
F/54/140/F
11001,10
11290,10
11767,20
10959,90
9675,27 7617,17 9839,11 10449,70
9107,86 13895,00
16440,60
13269,20
16330,40
F/55/140/F
9198,48 19161,60
9004,76 19311,60
18799,60
20035,20
14049,90
21153,10
18987,40
25481,80
14209,10
18974,30
14199,00
ANEXO 1 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 1A1 (animais 28 a 55).
Continua...
Campo 27
Campo 28
Campo 29
Campo 30
F/28/60/F
6042,87 8728,14 6813,40 7309,55
F/29/60/F
16460,60
15713,80
19049,90
21517,60
F/30/60/F
19565,90
19574,80
19043,90
18801,20
F/31/70/F
14724,20
18760,00
21678,30
15056,80
F/32/70/F
7242,92 18110,80
19629,40
15698,50
F/33/70/F
8558,97 11131,00
7532,16 14430,60
F/34/70/F
22782,10
23005,10
23077,10
23241,20
F/35/70/F
18667,40
20072,50
18517,20
22815,20
F/36/N/F 7811,87 8537,23 8178,83 7247,97
F/37/N/F 16925,20
13094,60
13951,40
13721,30
F/38/N/F 17842,30
16538,90
13001,60
12545,70
F/39/N/F 22361,70
20015,30
21302,00
21788,10
F/40/N/F 19858,60
17970,80
18182,50
18282,50
F/41/N/F 8845,55 10149,00
8898,15 11681,50
F/42/N/F 24868,20
20367,00
19117,80
17880,90
F/43/N/F 12080,00
14715,70
16478,60
16688,80
F/44/N/F 14151,00
13531,00
13530,90
12339,50
F/45/N/F 14796,50
15983,70
12277,40
11599,10
F/46/85/F
8966,89 12624,00
12163,70
11969,30
F/47/85/F
22219,00
22108,30
24022,50
18886,40
F/48/85/F
12378,20
16570,30
15750,30
16278,70
F/49/85/F
25657,70
18962,50
25512,00
25541,30
F/50/85/F
6835,84 8901,38 8081,34 10792,10
F/51/140/F
13786,00
14365,90
16297,50
13825,40
F/52/140/F
27152,70
25068,50
15367,30
21190,00
F/53/140/F
11387,30
15844,40
24483,50
28464,00
F/54/140/F
15070,60
15619,50
15606,30
16064,10
F/55/140/F
19039,60
14355,10
22197,40
26175,30
ANEXO 2 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 2E1 (animais 1 a 27).
Continua...
Campo 01
Campo 02
Campo 03
Campo 04
Campo 05
Campo 06
Campo 07
Campo 08
Campo 09
Campo 10
Campo 11
Campo 12
Campo 13
F/01/30/F
10.644,00
25.855,60
22.834,50
15.723,30
26.780,90
18.097,60
15.579,60
18.261,00
23.386,40
22.107,50
22.731,90
19.012,60
18.338,90
F/02/30/F
9.459,81
10.363,50
13.827,30
10.923,90
1.496,73
11.697,70
20.610,60
19.851,00
16.767,30
12.767,60
17.651,30
15.231,30
13.691,50
F/03/30/F
10.291,20
23.788,80
20.331,30
21.931,70
25.122,10
22.572,40
21.383,50
22.043,30
16.753,40
23.001,00
21.421,80
22.240,10
20.411,00
F/04/30/F
11.541,10
19.120,40
10.692,70
14.105,30
10.582,00
17.951,50
19.757,20
8.558,55
10.946,90
13.794,00
9.281,38
14.526,10
18.191,60
F/05/30/F
10.856,90
13.110,70
11.513,70
17.329,30
22.566,30
6.317,39
10.848,20
17.814,80
23.315,30
15.774,00
14.903,60
13.394,40
21.301,20
F/06/35/F
26.358,20
15.949,70
21.234,20
16.079,50
18.520,70
26.246,30
22.913,90
16.689,50
11.615,40
2.567,58
21.269,10
19.125,10
23.363,20
F/07/35/F
23.087,00
19.870,80
25.683,50
26.894,60
25.424,40
19.740,10
23.384,60
24.923,60
24.707,30
24.656,10
25.522,80
23.890,80
22.436,90
F/08/35/F
27.886,00
25.915,00
22.064,40
23.161,70
20.572,80
26.725,70
19.437,80
22.620,20
17.242,20
20.049,10
22.035,00
20.131,30
17.357,50
F/09/35/F
7.370,01
10.808,70
8.950,20
10.436,40
10.710,40
12.029,90
11.294,70
13.037,90
13.948,90
13.679,00
10.761,80
13.331,00
19.389,80
F/10/35/F
17.871,80
24.709,70
22.737,90
15.613,80
22.717,60
18.540,90
16.830,00
18.734,50
21.025,80
18.255,10
21.317,60
24.893,80
23.096,90
F/11/40/F
19.467,10
11.679,90
8.359,64
8.178,41
11.216,70
7.322,17
21.486,40
23.180,50
23.594,00
17.556,40
22.478,10
24.946,50
14.004,10
F/12/40/F
17.300,70
15.252,20
22.651,90
22.810,80
22.161,50
16.744,50
23.244,30
23.551,90
17.346,30
15.057,60
18.902,20
24.469,90
15.251,00
F/13/40/F
16.470,00
19.897,60
20.773,20
22.009,60
22.379,50
22.801,40
20.636,70
19.170,40
18.888,90
20.763,70
19.642,20
22.746,20
15.376,90
F/14/40/F
29.439,80
30.319,70
29.012,90
28.670,20
27.383,60
26.910,60
24.910,90
24.716,30
26.459,50
26.790,70
28.786,80
28.058,60
23.824,60
F/15/40/F
16.552,80
16.962,20
18.453,60
19.596,00
18.106,30
21.410,90
20.191,40
19.556,50
19.016,10
21.048,40
19.180,50
22.408,50
21.139,20
F/16/45/F
13.557,20
3.446,96
18.298,10
24.150,70
19.506,80
19.350,80
24.359,60
18.499,20
16.173,90
15.111,20
7.950,74
22.566,80
20.017,00
F/17/45/F
13.113,70
14.083,40
16.224,00
18.046,40
11.560,70
8.103,64
15.319,20
12.943,80
19.092,60
15.762,30
16.278,50
19.067,80
15.821,10
F/18/45/F
16.661,40
16.637,50
17.586,60
17.858,60
20.230,60
19.319,00
18.515,10
17.011,30
20.577,90
20.662,00
19.465,60
17.388,80
21.363,10
F/19/45/F
24.309,40
20.391,10
20.412,60
23.182,30
21.880,50
22.604,50
19.951,50
19.613,00
15.862,30
21.105,50
22.397,60
19.294,20
20.532,60
F/20/45/F
8.217,54
11.123,90
8.534,70
9.980,93
14.243,40
13.365,90
14.387,80
15.791,70
11.062,00
12.424,50
10.111,00
9.503,30
12.780,10
F/21/50/F
9.055,82
15.309,20
6.762,48
7.088,62
3.724,70
9.356,57
7.313,90
3.193,62
9.316,03
12.552,40
12.503,80
11.997,90
10.830,60
F/22/50/F
9.659,14
10.155,30
8.875,29
7.256,10
8.114,58
9.446,21
8.482,94
6.181,60
7.521,50
7.426,26
5.860,10
6.866,42
6.207,56
F/23/50/F
20.504,30
7.018,20
6.325,53
20.168,20
22.480,60
18.791,10
11.387,50
14.166,70
22.944,80
28.493,30
25.480,00
27.996,80
23.270,10
F/24/50/F
16.639,60
18.832,50
24.309,40
20.436,40
15.504,10
19.428,00
20.051,60
23.863,30
12.145,90
17.097,70
21.893,90
21.054,30
10.864,90
F/25/50/F
16.294,00
17.733,20
16.944,00
13.956,00
14.978,60
15.951,30
15.626,80
17.808,70
14.675,10
16.787,20
20.090,60
18.648,60
20.554,80
F/26/60/F
8.907,83
14.349,60
15.830,60
14.458,30
14.044,70
8.459,66
17.493,90
17.892,70
12.631,70
17.495,00
16.362,80
15.238,50
17.403,10
F/27/60/F
27.841,30
25.593,20
31.671,70
25.963,60
29.510,20
28.116,70
28.386,00
25.292,10
23.783,80
22.956,00
24.987,50
32.183,50
29.145,10
ANEXO 2 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 2E1 (animais 1 a 27).
Continua...
Campo 14
Campo 15
Campo 16
Campo 17
Campo 18
Campo 19
Campo 20
Campo 21
Campo 22
Campo 23
Campo 24
Campo 25
Campo 26
F/01/30/F
22.123,60
23.877,80
18.322,30
21.521,30
27.234,10
23.629,80
19.648,10
24.566,90
20.850,80
22.779,60
25.154,50
25.536,60
26.151,00
F/02/30/F
20.733,70
7.820,15
15.985,50
17.839,10
16.255,00
14.782,70
20.498,30
14.310,10
17.101,50
14.871,30
14.897,70
11.424,90
7.055,51
F/03/30/F
22.530,00
18.514,40
24.025,60
23.777,30
20.673,30
24.482,90
24.185,20
20.527,20
24.403,50
23.915,50
23.772,00
25.480,30
14.645,30
F/04/30/F
18.597,00
10.102,10
20.595,20
12.792,30
21.993,30
22.163,00
20.196,30
21.099,30
24.600,30
21.045,10
20.727,60
22.594,50
11.636,40
F/05/30/F
12.307,40
8.380,26
9.093,42
12.346,00
23.838,50
25.039,80
19.493,80
27.072,10
24.332,00
15.424,40
9.708,80
24.600,70
6.137,28
F/06/35/F
21.892,50
25.494,00
24.080,70
12.203,90
15.628,80
24.099,70
22.472,50
4.678,71
9.167,06
6.756,87
19.165,40
8.255,42
18.318,00
F/07/35/F
27.494,20
23.583,70
24.648,60
22.100,30
22.689,20
24.424,40
25.113,90
23.427,60
24.188,60
22.761,20
15.920,60
15.327,30
20.364,00
F/08/35/F
17.093,30
21.503,20
22.597,60
24.054,50
23.671,70
22.439,50
21.724,00
16.806,70
20.420,10
25.758,70
23.396,20
21.439,10
17.443,90
F/09/35/F
13.605,60
10.404,40
10.206,80
11.592,00
10.343,70
13.197,70
14.400,10
22.103,90
12.370,40
18.622,90
18.529,40
11.373,60
12.443,60
F/10/35/F
20.028,10
13.195,00
21.126,60
14.176,50
13.832,40
23.786,30
19.811,60
22.674,80
22.321,10
24.794,00
24.752,90
23.369,80
23.568,00
F/11/40/F
12.829,80
18.140,80
14.863,70
20.321,40
15.647,40
20.728,90
19.403,70
19.562,20
16.274,60
20.275,20
11.823,30
18.484,10
20.647,70
F/12/40/F
17.698,00
19.258,20
19.464,60
18.908,80
17.552,40
23.398,30
23.848,70
20.779,50
18.093,00
19.782,00
18.312,80
13.257,30
23.087,30
F/13/40/F
22.148,60
20.962,90
20.770,70
20.988,70
20.774,80
18.509,30
20.588,30
17.026,20
17.545,50
11.950,10
20.085,70
19.149,50
15.783,70
F/14/40/F
29.391,20
26.157,90
26.235,30
24.643,50
24.637,20
27.021,60
24.621,60
26.751,10
26.785,10
7.052,15
11.525,40
10.453,70
10.225,90
F/15/40/F
17.570,90
20.800,30
20.306,20
17.264,10
19.802,70
18.050,90
20.987,40
20.379,20
17.154,70
15.785,50
17.710,30
17.104,60
17.389,70
F/16/45/F
24.521,50
27.704,20
24.017,10
21.109,30
20.990,40
23.336,20
16.376,60
11.354,50
7.180,22
15.130,40
670,37 3.541,08
16.475,30
F/17/45/F
14.270,70
12.910,10
16.088,60
16.823,60
16.861,00
10.398,00
14.685,00
18.820,50
12.904,10
18.533,30
12.789,40
17.688,90
11.548,60
F/18/45/F
20.314,20
21.185,30
20.800,30
12.204,60
14.907,90
13.954,90
19.272,70
16.778,50
21.508,20
20.908,70
20.354,90
16.823,40
24.225,50
F/19/45/F
20.011,20
22.035,80
16.935,20
21.043,00
20.194,60
21.713,50
17.962,40
17.947,40
14.742,10
20.285,10
20.563,60
20.583,00
18.841,40
F/20/45/F
15.151,90
13.600,70
12.859,50
10.515,20
11.571,20
9.833,08
11.350,60
11.548,60
8.422,48
11.403,30
11.039,30
10.917,80
11.849,80
F/21/50/F
3.830,33
9.734,05
9.422,36
11.636,20
15.959,00
13.003,00
17.530,10
6.591,77
6.369,57
13.617,70
18.115,20
13.595,00
14.001,10
F/22/50/F
6.058,16
7.841,61
4.733,13
6.735,97
5.726,13
6.328,05
3.855,30
7.061,97
4.698,20
5.078,21
5.185,10
5.839,34
4.254,94
F/23/50/F
23.279,30
23.926,00
29.634,60
25.064,90
20.808,00
26.299,60
25.713,70
24.773,10
10.321,90
19.675,40
27.390,40
25.142,20
22.795,10
F/24/50/F
16.278,70
19.017,50
15.463,10
21.206,70
24.845,50
22.745,90
19.919,90
22.374,00
19.677,90
12.421,70
19.471,60
16.690,00
23.361,40
F/25/50/F
21.089,00
19.244,60
20.201,60
18.246,00
19.761,30
19.926,00
20.467,30
17.693,30
20.540,10
20.269,30
17.769,50
17.982,90
19.506,40
F/26/60/F
15.436,80
16.737,00
9.614,54
14.851,00
14.445,90
17.473,10
8.433,43
15.765,10
8.053,42
13.552,90
16.123,00
16.704,70
15.865,90
F/27/60/F
16.672,00
28.118,00
32.507,10
22.400,40
25.752,50
33.245,70
26.838,00
28.335,40
28.280,40
24.391,90
28.567,80
20.585,10
32.563,00
ANEXO 2 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 2E1 (animais 1 a 27).
Continua...
Campo 27
Campo 28
Campo 29
Campo 30
F/01/30/F
21.850,80
24.565,80
22.537,70
23.278,80
F/02/30/F
15.282,60
10.956,40
14.260,80
4.572,24
F/03/30/F
21.886,00
26.271,70
19.464,20
21.876,00
F/04/30/F
12.090,00
18.315,60
12.680,50
15.245,10
F/05/30/F
6.045,40
11.432,10
7.408,72
11.188,80
F/06/35/F
18.160,60
9.411,70
6.657,13
22.762,00
F/07/35/F
17.995,10
17.813,40
21.643,80
19.020,90
F/08/35/F
25.685,20
24.434,60
19.270,50
26.488,00
F/09/35/F
17.246,00
21.493,10
20.935,40
14.159,40
F/10/35/F
23.987,90
19.480,00
13.717,80
23.334,60
F/11/40/F
23.383,70
24.666,10
22.853,10
18.563,90
F/12/40/F
19.738,50
15.851,30
15.291,60
19.559,70
F/13/40/F
18.138,00
17.273,40
22.804,20
18.873,90
F/14/40/F
9.488,43
9.226,54
8.508,19
9.830,42
F/15/40/F
19.185,40
17.451,50
19.390,70
21.197,50
F/16/45/F
13.216,90
4.179,47
6.353,16
7.510,42
F/17/45/F
12.757,10
12.098,80
17.618,40
12.465,30
F/18/45/F
19.744,00
15.075,10
18.867,00
17.427,80
F/19/45/F
17.534,80
21.918,00
21.162,60
18.512,10
F/20/45/F
10.855,50
12.528,30
11.623,50
11.986,70
F/21/50/F
12.283,40
17.796,60
17.379,70
13.043,50
F/22/50/F
5.680,97
5.572,39
5.257,06
6.523,87
F/23/50/F
29.782,50
20.852,50
21.766,50
24.134,90
F/24/50/F
23.186,10
22.017,40
21.740,80
18.551,10
F/25/50/F
21.225,00
22.104,30
17.107,30
20.539,50
F/26/60/F
10.003,80
8.636,26
10.714,10
4.141,04
F/27/60/F
26.467,90
26.544,20
30.191,50
26.099,70
ANEXO 2 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 2E1 (animais 28 a 55).
Continua...
Campo 01
Campo 02
Campo 03
Campo 04
Campo 05
Campo 06
Campo 07
Campo 08
Campo 09
Campo 10
Campo 11
Campo 12
Campo 13
F/28/60/F
10.910,10
8.364,83
9.646,94
18.342,40
17.095,60
10.656,10
19.210,00
22.302,90
8.346,46
9.691,83
15.117,40
18.790,90
23.145,50
F/29/60/F
23.694,00
21.069,00
26.267,90
21.608,40
26.769,10
24.185,80
14.647,70
21.957,50
20.702,70
12.054,90
18.279,80
22.026.,1
19.928,50
F/30/60/F
11.443,70
6.398,75
13.613,10
7.523,89
5.104,58
7.689,97
18.432,20
4.143,42
17.188,50
9.061,01
3.459,02
11.469,00
12.419,30
F/31/70/F
19.766,70
14.135,30
9.512,14
17.776,40
19.656,90
21.060,10
14.042,70
19.965,80
9.280,40
16.925,90
18.480,40
19.773,30
19.340,40
F/32/70/F
24.130,10
14.653,50
19.538,40
16.576,10
21.572,50
18.168,20
17.264,10
20.657,20
16.012,40
15.564,50
15.973,90
17.957,10
14.928,70
F/33/70/F
23.898,70
20.193,30
18.436,80
12.112,30
26.139,30
15.562,30
17.596,00
17.700,20
29.266,10
19.588,90
16.840,80
13.437,40
23.554,80
F/34/70/F
24.698,50
30.211,10
26.396,00
29.377,10
27.110,10
17.979,40
22.859,50
12.927,00
11.617,10
23.380,90
22.827,90
28.978,50
29.238,20
F/35/70/F
27.613,30
31.237,10
31.402,50
29.084,30
34.846,80
31.707,00
21.520,60
27.414,50
25.649,60
32.152,00
24.176,00
14.164,60
23.158,00
F/36/N/F 6.971,63
26.379,40
22.273,30
21.485,90
26.361,00
24.318,90
27.828,40
19.441,00
26.070,50
25.217,90
24.609,30
26.176,00
13.289,00
F/37/N/F 18.187,50
20.404,30
21.263,20
19.010,90
21.721,90
20.585,20
18.925,40
17.526,60
21.126,40
13.688,80
18.171,30
20.854,80
18.443,80
F/38/N/F 17.819,20
19.531,60
19.991,60
12.299,00
13.851,90
17.640,60
20.029,90
25.983,10
26.590,50
24.566,80
25.644,20
27.374,00
27.554,60
F/39/N/F 15.107,10
10.176,10
9.375,79
14.699,50
14.369,30
8.979,65
10.748,70
16.547,90
11.961,50
11.606,80
14.089,00
15.480,10
12.778,70
F/40/N/F 18.787,20
16.917,10
17.347,90
18.355,60
18.740,90
18.591,80
20.540,90
17.799,50
20.072,00
20.408,50
18.558,60
18.050,30
20.078,00
F/41/N/F 22.939,70
25.712,50
18.746,40
23.433,10
24.669,20
20.372,00
26.597,00
26.934,20
25.177,50
20.630,30
21.102,30
15.536,50
21.888,10
F/42/N/F 23.748,00
26.238,30
27.284,20
25.553,90
23.008,80
20.795,20
27.286,80
25.727,00
27.918,60
29.273,30
26.741,00
27.439,30
26.046,10
F/43/N/F 27.239,30
24.361,40
23.885,20
20.534,20
20.725,20
21.919,70
22.026,70
24.941,60
20.856,50
23.589,90
19.942,20
22.206,30
26.029,80
F/44/N/F 18.642,40
19.273,40
21.737,30
24.049,70
21.149,30
21.200,50
26.853,80
25.627,50
29.407,90
26.965,20
26.489,00
25.607,10
25.672,70
F/45/N/F 16.627,10
29.436,40
28.931,70
23.157,90
21.041,30
21.788,90
21.538,70
28.898,90
20.846,70
27.367,50
30.866,10
25.907,20
30.396,00
F/46/85/F
20.635,30
16.069,30
21.692,40
11.470,20
16.862,40
23.315,30
21.820,20
23.555,30
11.525,20
26.880,90
24.858,30
25.318,90
22.231,90
F/47/85/F
26.872,20
24.677,00
11.418,90
20.623,70
14.207,10
24.482,20
26.683,50
29.719,90
25.296,40
24.450,50
26.304,20
25.116,00
14.079,00
F/48/85/F
26.035,70
24.520,80
21.905,40
19.009,80
18.991,40
20.017,30
18.635,30
18.293,20
23.539,70
25.559,90
21.207,20
18.305,60
20.307,20
F/49/85/F
14.999,50
15.381,90
13.919,30
14.451,20
17.750,00
13.166,70
16.117,60
16.326,40
15.443,80
16.834,90
15.708,60
14.335,00
14.482,80
F/50/85/F
18.781,50
20.797,10
26.062,00
21.955,30
20.609,90
22.282,00
13.892,10
10.610,60
8.789,72
9.501,19
11.500,40
19.748,50
22.407,30
F/51/140/F
28.298,50
31.847,40
25.649,40
22.189,60
19.629,40
19.178,00
18.462,90
19.759,00
17.833,10
17.139,80
22.065,00
21.532,40
24.445,00
F/52/140/F
15.101,20
13.977,60
6.694,17
17.005,90
20.039,90
18.227,50
18.902,90
19.216,90
20.771,90
19.831,80
18.332,30
23.171,10
19.459,30
F/53/140/F
25.414,70
21.189,50
22.472,20
24.289,90
20.869,00
23.708,40
23.576,30
25.337,20
22.994,60
24.087,30
23.392,50
24.710,30
17.778,10
F/54/140/F
15.672,40
4.785,88
7.971,22
17.788,50
12.894,40
27.491,40
16.327,40
14.241,40
22.012,00
10.484,40
12.965,70
12.848,00
10.582,70
F/55/140/F
14.288,90
13.014,40
17.140,40
35.042,70
33.297,30
30.153,80
31.807,20
33.183,50
26.171,00
32.788,30
20.942,10
25.876,80
22.243,00
ANEXO 2 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 2E1 (animais 28 a 55).
Continua...
Campo 14
Campo 15
Campo 16
Campo 17
Campo 18
Campo 19
Campo 20
Campo 21
Campo 22
Campo 23
Campo 24
Campo 25
Campo 26
F/28/60/F
22.928,70
27.599,00
27.702,50
19.149,40
14.705,80
23.990,00
23.766,40
29.411,90
19.928,90
24.535,20
13.802,80
27.217,10
21.745,20
F/29/60/F
13.583,60
16.489,50
20.146,30
20.075,30
16.804,00
21.939,20
12.018,60
10.223,60
9.599,81
14.129,80
17.599,90
3.080,56
11.021,90
F/30/60/F
6.434,24
5.226,62
3.494,23
18.099,60
3.063,59
3.896,54
10.512,40
6.317,67
12.393,80
15.519,50
12.377,20
2.904,80
6.403,66
F/31/70/F
17.897,70
16.515,70
8.998,59
22.431,70
18.730,70
16.768,70
16.561,60
20.117,40
21.097,10
18.919,90
24.957,00
24.776,90
23.735,90
F/32/70/F
16.746,60
14.086,30
11.562,70
19.769,00
17.353,70
16.435,50
17.418,40
20.433,50
13.968,40
20.366,00
18.889,90
20.721,90
20.308,20
F/33/70/F
15.678,20
22.776,20
16.437,10
17.011,10
19.694,80
22.755,80
24.733,70
15.705,70
15.519,80
10.156,80
16.028,20
13.680,00
17.405,50
F/34/70/F
29.752,90
28.788,30
24.333,90
21.758,10
17.123,00
24.948,80
20.407,70
24.287,20
28.252,60
18.167,50
15.092,80
25.723,50
16.434,50
F/35/70/F
20.943,80
33.673,90
28.389,10
20.173,30
23.571,10
28.044,70
32.221,00
33.144,60
15.580,40
19.847,10
24.077,60
20.763,70
23.232,90
F/36/N/F 23.814,80
26.261,00
21.495,90
26.051,60
24.514,90
26.945,10
22.463,50
26.986,20
22.389,70
24.695,60
22.170,90
20.703,40
25.886,60
F/37/N/F 10.202,40
18.137,30
19.500,60
14.874,00
18.779,20
19.779,60
14.982,70
20.090,60
9.048,53
19.048,00
17.557,10
19.241,10
7.488,26
F/38/N/F 28.153,50
28.707,80
25.545,10
17.874,20
23.534,50
26.425,00
27.517,70
19.039,30
27.609,30
26.593,00
27.824,10
27.813,60
26.580,10
F/39/N/F 13.982,30
13.112,60
7.802,05
18.368,10
15.843,60
12.114,60
12.764,00
15.243,70
14.316,10
15.361,00
10.762,10
15.015,40
9.597,14
F/40/N/F 21.762,00
19.389,40
19.355,50
19.397,50
16.694,90
16.987,90
20.752,70
19.129,60
22.103,70
22.261,40
19.796,90
20.590,90
21.278,80
F/41/N/F 19.583,70
23.024,30
23.556,20
21.627,80
23.933,00
16.524,70
15.399,60
23.590,80
18.567,70
20.953,30
22.421,40
21.607,60
22.100,60
F/42/N/F 29.346,60
28.713,40
28.081,20
24.786,50
29.325,30
26.249,20
31.328,70
27.168,60
26.693,20
27.438,50
28.156,30
26.807,50
28.806,30
F/43/N/F 25.328,20
21.882,40
22.277,70
26.147,30
15.746,90
24.425,00
25.994,40
24.047,10
25.266,60
26.597,10
22.492,10
21.605,30
25.941,80
F/44/N/F 25.287,20
29.509,80
25.681,70
31.794,60
28.539,20
31.788,40
31.335,90
25.439,00
24.418,40
29.182,50
27.380,40
30.068,10
29.726,90
F/45/N/F 27.829,70
28.232,20
28.473,80
10.741,20
27.409,60
24.965,70
24.313,90
26.218,80
23.347,80
27.062,30
9.552,25
15.753,10
24.268,30
F/46/85/F
23.739,90
19.300,60
20.751,60
21.292,40
22.985,10
21.068,20
20.647,40
14.278,80
10.357,80
21.679,70
14.835,00
25.333,20
20.958,10
F/47/85/F
22.956,30
28.146,20
27.244,30
19.838,10
29.658,20
10.442,40
23.082,70
23.590,20
17.156,40
31.189,10
22.729,10
21.619,80
10.282,20
F/48/85/F
23.621,30
18.609,10
17.400,00
19.502,30
19.108,90
16.813,50
21.187,70
21.976,10
18.898,30
18.584,80
19.038,60
23.790,20
23.107,90
F/49/85/F
13.242,30
16.514,10
14.157,00
8.051,18
18.322,80
13.473,90
18.025,00
14.442,80
13.580,90
16.234,60
14.127,70
17.142,20
15.517,40
F/50/85/F
16.635,40
24.208,90
22.707,00
23.408,80
15.103,90
22.027,30
23.950,30
18.795,10
14.513,10
24.496,90
24.044,70
20.317,00
23.643,20
F/51/140/F
12.829,90
14.867,10
13.628,90
17.017,50
16.054,70
11.326,40
12.607,30
18.893,80
15.786,60
14.821,20
16.670,00
15.659,20
12.372,20
F/52/140/F
27.097,90
27.578,60
29.093,70
21.060,20
23.917,90
26.026,50
12.139,30
25.061,40
20.358,30
19.974,10
23.114,10
14.218,30
17.127,30
F/53/140/F
23.562,40
22.546,10
23.814,40
14.960,80
18.889,20
24.292,50
20.743,10
20.771,40
23.057,70
21.594,80
10.508,80
15.188,60
21.299,70
F/54/140/F
16.588,00
21.686,80
13.914,50
28.659,10
20.355,50
27.128,10
24.525,70
18.428,20
36.410,60
35.542,10
20.665,30
22.159,30
22.410,50
F/55/140/F
23.360,00
15.487,80
16.903,90
15.962,80
38.269,20
25.893,90
30.042,70
23.999,90
30.443,60
34.984,10
34.067,70
26.447,00
29.990,30
ANEXO 2 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 2E1 (animais 28 a 55).
Continua...
Campo 27
Campo 28
Campo 29
Campo 30
F/28/60/F
27.296,00
18.270,20
24.806,10
19.100,20
F/29/60/F
4.660,05
10.364,40
9.618,32
13.063,60
F/30/60/F
15.599,50
4.613,90
6.027,72
13.436,60
F/31/70/F
10.312,30
15.614,50
19.123,40
20.325,00
F/32/70/F
25.341,20
19.493,30
14.933,90
20.629,10
F/33/70/F
19.606,40
14.949,40
19.541,50
15.578,70
F/34/70/F
24.137,10
30.446,50
25.749,20
23.170,90
F/35/70/F
25.379,30
18.757,70
23.511,10
24.599,50
F/36/N/F 17.409,00
23.132,30
24.118,20
24.009,50
F/37/N/F 21.387,20
18.189,50
20.604,00
15.991,10
F/38/N/F 26.871,80
23.347,80
23.291,00
28.813,60
F/39/N/F 17.720,30
12.850,90
16.008,80
11.988,40
F/40/N/F 18.780,80
22.630,00
23.615,90
19.797,60
F/41/N/F 16.653,20
21.169,90
16.356,30
21.263,90
F/42/N/F 21.414,00
27.901,80
22.993,00
28.277,20
F/43/N/F 24.012,30
20.350,10
25.640,70
25.738,20
F/44/N/F 30.136,70
27.751,40
32.287,30
26.252,20
F/45/N/F 29.606,10
10.533,20
27.279,80
20.872,90
F/46/85/F
18.626,70
23.204,00
25.215,10
18.828,60
F/47/85/F
22.232,10
21.607,60
18.655,90
24.857,70
F/48/85/F
22.094,90
23.825,00
23.495,10
18.615,90
F/49/85/F
10.165,70
17.233,00
10.438,20
13.052,00
F/50/85/F
22.040,30
19.421,40
18.194,00
17.434,30
F/51/140/F
9.616,22
17.051,30
20.791,90
19.756,50
F/52/140/F
14.072,60
25.776,10
21.400,40
30.807,30
F/53/140/F
15.224,40
18.479,90
17.219,80
17.525,60
F/54/140/F
29.497,10
27.141,70
19.544,80
31.419,20
F/55/140/F
30.047,60
33.113,40
30.583,30
23.640,80
ANEXO 3 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 3A4 (animais 1 a 27).
Continua...
Campo 01
Campo 02
Campo 03
Campo 04
Campo 05
Campo 06
Campo 07
Campo 08
Campo 09
Campo 10
Campo 11
Campo 12
Campo 13
F/01/30/F
8948,51 12618,90
11450,90
19209,90
22219,40
19408,50
19959,50
22194,00
20744,90
11258,10
4738,46 11167,50
12883,60
F/02/30/F
26294,50
28743,70
23570,30
26663,50
26483,10
25411,80
23190,80
27552,70
24040,10
30024,30
29807,00
22543,50
27396,80
F/03/30/F
27378,00
28043,60
28163,00
26920,70
28668,50
28621,10
25330,70
20053,90
24617,10
12988,00
28877,00
28005,30
22692,40
F/04/30/F
15270,80
25717,00
24682,80
23514,20
26113,40
25024,50
28428,00
29066,90
23801,20
23573,10
26833,50
23778,50
28703,30
F/05/30/F
12993,50
26934,90
30535,00
33144,30
34291,70
34883,30
33555,70
33885,50
34193,90
24785,50
35024,60
31650,50
33403,90
F/06/35/F
16180,90
26898,70
27126,50
25724,60
25225,10
24577,00
22597,50
18143,80
18858,50
15487,50
19857,80
25412,20
26838,90
F/07/35/F
24878,50
24963,60
25435,80
27488,80
27520,70
26682,10
27275,30
28279,00
28311,70
26525,70
24921,80
26806,40
23416,00
F/08/35/F
24962,60
26350,40
26374,20
24003,60
24542,80
23929,20
20492,40
26748,60
27802,60
27272,50
25502,60
25160,10
25771,70
F/09/35/F
17828,90
17295,00
7716,63 10638,70
16094,50
9655,21 18984,00
17633,50
13485,80
6649,84 14611,10
15049,00
15323,10
F/10/35/F
11236,70
17984,30
20059,60
19539,40
17350,20
19359,70
16913,30
13146,20
11660,90
16530,50
20550,30
22392,80
19307,50
F/11/40/F
25843,00
28968,20
27722,70
25863,80
24763,40
25815,90
26787,20
23487,70
21724,50
21519,00
19308,90
24860,20
27973,30
F/12/40/F
17575,90
27955,00
28596,70
24832,20
24999,40
23491,70
24245,00
30484,10
30432,60
23587,70
24743,00
23260,00
29381,70
F/13/40/F
25285,00
26076,60
22813,80
33429,70
32509,80
29513,30
34308,30
35016,90
34713,40
34562,70
33107,40
32852,20
33044,50
F/14/40/F
18292,00
17559,70
19399,50
18429,50
18217,80
17691,00
17212,60
17098,00
16709,60
17630,40
16465,40
20206,40
18766,60
F/15/40/F
7163,52 5136,42 9441,30 10710,20
9326,13 8641,17 7576,49 6939,51 7651,96 11534,00
17988,90
11748,40
8987,93
F/16/45/F
21205,40
28006,30
27986,20
29310,70
28788,10
27931,00
26869,70
10215,60
27579,30
27112,30
17055,90
19533,50
26989,50
F/17/45/F
15292,10
16222,40
14197,00
12101,30
15328,30
15211,70
16344,90
14111,20
15349,50
14178,50
11913,30
16752,40
9168,46
F/18/45/F
17242,80
19649,90
19409,70
20256,40
20583,40
19729,60
15494,80
19125,80
17523,50
19106,20
15252,20
17818,10
15581,80
F/19/45/F
23175,40
18802,20
10620,00
16456,70
23946,20
24871,70
23186,50
19709,10
12279,00
22771,40
22108,90
23850,10
20377,10
F/20/45/F
9403,14 9662,79 10276,20
10136,60
9741,06 9114,32 13151,50
12285,40
11536,60
13741,50
13676,70
14018,90
15791,50
F/21/50/F
7145,29 8467,23 7013,43 5265,33 3970,74 2939,59 3491,85 3891,49 4471,52 2807,73 2208,76 2295,73 2865,10
F/22/50/F
22608,70
23960,50
19730,60
19815,00
18971,40
21742,10
22243,30
18182,30
19783,20
21036,80
17519,00
19184,50
13606,00
F/23/50/F
20131,30
25023,10
24997,60
2114,10 23933,30
25131,90
23803,40
22815,60
26961,80
22947,30
21703,90
25056,80
23771,10
F/24/50/F
23288,60
22310,20
26959,40
22901,00
20456,20
16907,10
24062,10
19582,30
21995,80
24202,90
12999,90
22266,00
22598,00
F/25/50/F
22608,70
23960,50
19730,60
19815,00
18971,40
21742,10
22243,30
18182,30
19783,20
21036,80
17519,00
19184,50
13606,00
F/26/60/F
20131,30
25023,10
24997,60
21114,10
23933,30
25131,90
23803,40
22815,60
26961,80
22947,30
21703,90
25056,80
23771,10
F/27/60/F
18793,50
13566,30
16848,60
14007,60
15635,00
15819,70
15526,10
16024,10
17238,40
11797,90
15247,90
16507,60
11944,10
ANEXO 3 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 3A4 (animais 1 a 27).
Continua...
Campo 14
Campo 15
Campo 16
Campo 17
Campo 18
Campo 19
Campo 20
Campo 21
Campo 22
Campo 23
Campo 24
Campo 25
Campo 26
F/01/30/F
15422,20
19619,30
21100,30
17555,20
19716,80
23402,10
24537,70
17421,20
9260,62 9372,70 18102,10
22206,50
16682,30
F/02/30/F
27419,00
25828,70
26329,20
27980,50
25575,50
29399,90
23882,50
25232,00
11518,90
29136,90
18881,50
22805,20
22951,40
F/03/30/F
27507,80
23835,40
23654,40
27539,50
27252,10
24131,00
25630,90
27800,50
25571,70
26782,60
24800,60
29569,70
28178,40
F/04/30/F
28830,30
24083,50
17989,00
24164,20
22960,40
29021,30
27485,60
24588,80
23992,60
29892,00
29577,40
30565,50
31182,40
F/05/30/F
34866,70
34175,60
32817,90
31726,70
31141,20
26735,30
31732,40
31345,10
25864,00
32668,50
32800,30
30483,70
34001,60
F/06/35/F
28645,30
19132,80
6259,18 17285,40
27119,80
26573,30
27221,50
25670,90
27762,80
25500,20
22441,60
18644,70
21602,70
F/07/35/F
26678,80
16314,70
27513,80
19843,80
23454,00
22186,30
25416,00
25416,00
23819,80
23975,10
26361,30
27309,30
27471,00
F/08/35/F
26919,50
22647,60
22773,50
24760,20
23585,40
23688,40
24268,10
26942,50
25825,60
25312,20
24431,80
24067,00
23624,60
F/09/35/F
18242,10
18452,90
20184,30
24338,40
21785,10
15710,40
16888,00
8838,26 5255,79 6516,58 9450,27 12636,70
12114,20
F/10/35/F
18482,70
22062,90
17640,60
11279,70
17375,80
12181,40
10027,10
15456,10
15341,20
21128,20
18245,20
21684,90
15034,20
F/11/40/F
28078,40
22876,60
19422,90
18499,90
15413,90
22169,90
13366,60
15194,10
19212,50
20462,10
20317,70
17158,80
13470,80
F/12/40/F
21864,50
30492,40
28823,00
32204,70
30538,30
29497,00
30604,70
27334,10
27685,10
26452,40
26515,10
25077,20
30883,50
F/13/40/F
29572,30
32590,20
32997,80
23863,70
32985,30
33434,80
34002,20
28759,40
32337,60
18953,00
26742,60
34339,10
31809,30
F/14/40/F
19074,80
19632,60
19989,90
20026,50
18029,70
19915,30
18842,90
18162,60
16031,80
16237,70
18328,70
19879,70
17858,70
F/15/40/F
9216,58 8913,16 9116,84 8564,58 9381,82 11384,10
10983,80
14761,50
13247,50
14658,90
14751,10
12103,60
8481,40
F/16/45/F
22151,10
30729,00
18992,70
23718,10
25777,90
26200,00
26544,80
25188,20
23440,10
23379,80
27182,10
24816,20
23308,10
F/17/45/F
17715,40
11479,50
14600,30
17405,20
11159,50
12503,90
16910,10
12552,20
17606,70
9846,13 11982,50
14097,80
12753,00
F/18/45/F
11185,30
17629,50
15349,40
19893,50
20254,20
21444,70
20923,40
23411,10
23294,80
21705,80
22272,90
20203,80
17973,10
F/19/45/F
17793,90
21946,00
24214,40
18679,10
22570,80
23235,20
24622,20
25610,80
22655,50
22849,10
23291,80
16718,20
23417,00
F/20/45/F
12743,20
13645,20
13785,20
12973,00
11796,50
16736,40
13424,70
15362,80
17191,60
18049,60
14581,60
16771,30
15561,20
F/21/50/F
4350,89 5289,74 3780,25 3728,91 10216,30
12359,40
5433,38 6856,18 6602,01 6855,06 5687,98 3058,54 2521,01
F/22/50/F
19316,60
18226,70
19174,60
19437,00
17223,90
17553,10
14469,70
14781,30
15140,50
17652,40
19008,30
15023,90
16898,60
F/23/50/F
21013,40
22954,30
20978,40
18379,70
19276,10
23534,90
18490,40
26295,20
23482,90
25855,30
20825,00
28732,50
23518,50
F/24/50/F
23484,10
22970,50
20508,10
24961,00
20880,00
24104,20
22162,80
20686,00
22490,70
22852,10
23244,80
23174,80
23665,00
F/25/50/F
19316,60
18226,70
19174,60
19437,00
17223,90
17553,10
14469,70
14781,30
15140,50
17652,40
19008,30
15023,90
16898,60
F/26/60/F
21013,40
22954,30
20978,40
18379,70
19276,10
23534,90
18490,40
26295,20
23482,90
25855,30
20825,00
28732,50
23518,50
F/27/60/F
15498,50
15719,40
12464,20
14034,20
14337,00
13387,50
15420,20
9542,86 13890,00
13296,60
12661,00
14146,20
14774,20
ANEXO 3 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 3A4 (animais 1 a 27).
Continua...
Campo 27
Campo 28
Campo 29
Campo 30
F/01/30/F
22040,20
22967,20
23059,40
20985,30
F/02/30/F
29887,50
21150,70
27695,60
30579,80
F/03/30/F
23274,30
24605,50
25550,10
23999,90
F/04/30/F
29955,10
27351,90
28319,10
27305,60
F/05/30/F
16918,30
28060,50
20617,60
33240,80
F/06/35/F
25441,00
26686,20
28965,20
27160,60
F/07/35/F
26970,10
29416,90
27230,90
27884,10
F/08/35/F
23477,60
23007,60
22358,00
21952,20
F/09/35/F
16444,80
16677,60
14997,80
5282,31
F/10/35/F
20602,10
20998,90
19133,40
18284,90
F/11/40/F
13881,40
14110,50
12450,20
14099,80
F/12/40/F
23711,40
27170,40
30089,00
29407,40
F/13/40/F
34361,60
33074,80
32496,20
30943,80
F/14/40/F
17453,50
17843,20
18037,00
17483,10
F/15/40/F
8014,43 12643,50
14033,50
11566,20
F/16/45/F
27930,10
27676,80
26424,90
28737,80
F/17/45/F
9876,29 13563,50
11545,60
14036,70
F/18/45/F
22216,60
21998,80
21012,90
21069,90
F/19/45/F
22748,00
21367,40
21551,00
24146,50
F/20/45/F
17678,20
17308,20
13820,20
9638,66
F/21/50/F
2421,41 2233,73 3288,45 3632,68
F/22/50/F
18880,90
17329,50
13018,70
16220,60
F/23/50/F
24553,30
25579,30
25651,70
26113,70
F/24/50/F
19504,10
22285,90
23344,70
22669,30
F/25/50/F
18880,90
17329,50
13018,70
16220,60
F/26/60/F
24553,30
25579,30
25651,70
26113,70
F/27/60/F
12152,50
15189,50
13634,10
13623,90
ANEXO 3 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 3A4 (animais 28 a 55).
Continua...
Campo 01
Campo 02
Campo 03
Campo 04
Campo 05
Campo 06
Campo 07
Campo 08
Campo 09
Campo 10
Campo 11
Campo 12
Campo 13
F/28/60/F
33450,50
33443,30
31149,70
34099,40
30286,00
31854,20
29196,80
31450,90
24666,00
32997,80
26917,10
32813,20
28584,20
F/29/60/F
20187,60
26246,80
30551,20
27534,30
21604,90
23550,40
25922,50
23747,30
23490,30
24815,50
25630,50
23514,70
25605,70
F/30/60/F
22088,80
25182,20
21716,60
19976,30
23211,60
27107,70
13497,90
17111,20
29881,40
26199,60
28608,10
30891,00
25745,90
F/31/70/F
29919,10
9878,95 17547,90
27431,50
27634,00
19061,60
28967,50
28119,90
17354,40
21878,90
24768,80
24708,60
17913,20
F/32/70/F
21982,10
23427,20
26897,20
25217,40
27647,60
21690,50
24987,30
23702,70
22457,20
16881,30
16107,40
23583,90
24073,70
F/33/70/F
21017,60
21148,70
27509,00
8590,53 29922,30
13307,80
17060,20
15195,30
28659,60
21048,30
23616,70
26620,40
21442,50
F/34/70/F
23473,10
23012,70
24363,50
29673,70
28576,00
25328,90
23938,90
18245,20
18623,40
26077,80
30370,90
27319,70
20315,50
F/35/70/F
12603,20
19545,90
18588,40
19044,20
23266,20
21896,40
20367,80
25819,40
25378,40
23637,90
13119,00
19748,20
26125,80
F/36/N/F 10195,70
19485,60
19463,60
28975,90
24304,20
25105,70
20780,50
28038,70
30383,10
33480,40
33825,20
34216,10
33199,70
F/37/N/F 11256,20
11317,70
11980,30
17358,50
20260,10
15861,60
15614,80
20258,40
13172,40
14295,90
19656,60
14053,00
21566,90
F/38/N/F 19830,10
22342,00
25631,20
22709,60
22403,50
27949,50
24913,70
25276,90
27610,90
22096,80
28781,70
29521,10
27396,80
F/39/N/F 29265,60
25944,00
29215,30
27067,70
25030,10
25791,00
28925,40
24377,10
27204,60
27276,90
22209,50
24272,10
25881,40
F/40/N/F 23127,60
24746,90
22629,70
26435,40
26548,60
26049,80
29187,70
26785,20
24407,60
20711,80
22346,20
17900,00
24263,10
F/41/N/F 10956,10
15890,80
11626,90
5013,96 10803,50
14662,20
9587,46 7136,45 11469,80
13939,80
11187,10
10584,50
14004,70
F/42/N/F 16109,80
19943,60
21687,70
21706,00
21711,80
19134,20
19961,40
20479,60
17632,70
20003,20
19625,60
19554,10
20638,30
F/43/N/F 23080,20
25783,50
20644,30
19742,90
25825,70
22432,10
27691,50
24301,40
24716,30
23851,90
22863,40
20639,70
21157,30
F/44/N/F 7424,29 8547,47 12000,70
12013,60
15221,30
11622,60
11743,90
12861,20
15643,90
13978,70
15403,50
13921,10
16568,10
F/45/N/F 10806,00
20551,70
15413,90
14415,40
23609,40
12537,10
6993,93 11628,60
15855,60
30690,20
27404,50
20854,40
23438,00
F/46/85/F
2358,71 3026,14 8026,21 12467,20
8101,40 13783,30
15486,30
11528,40
8577,91 10215,80
14050,00
14059,30
11862,70
F/47/85/F
23529,20
20811,60
25458,40
17244,10
6682,24 20246,10
20993,40
11837,60
27971,80
24916,90
19830,80
25476,00
18308,60
F/48/85/F
8480,42 5509,69 4617,83 6094,49 6801,90 7395,26 5202,49 6280,22 9184,03 12582,50
8304,94 10756,90
8930,42
F/49/85/F
6110,49 7442,67 7719,71 5631,59 7801,91 7652,10 6424,98 8591,94 10251,70
6147,27 8026,21 8776,68 5416,69
F/50/85/F
22765,40
24188,50
22934,10
13442,30
17940,20
17891,10
20229,60
19793,40
28345,80
20039,70
20314,40
20534,60
13334,90
F/51/140/F
24590,90
27197,90
22543,90
17115,30
24198,40
30823,90
19559,00
24940,20
20780,50
30087,70
32909,50
30955,40
30238,80
F/52/140/F
13472,80
10931,30
22521,30
13577,30
22933,00
15702,90
23650,40
14412,20
7184,85 11102,30
10605,40
20466,70
18768,70
F/53/140/F
14611,20
7932,51 5423,98 1110,41 2593,25 9201,15 11726,20
11778,80
8288,66 15655,70
13126,40
10901,60
4812,81
F/54/140/F
18322,90
18071,00
23145,90
26243,90
26027,90
26217,10
26279,80
27946,10
25667,80
22162,30
24668,50
17781,20
15405,10
F/55/140/F
30494,90
26464,70
29533,20
29162,70
29625,20
32589,90
34819,80
33237,10
32745,90
28633,20
29131,00
29340,00
29128,80
ANEXO 3 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 3A4 (animais 28 a 55).
Continua...
Campo 14
Campo 15
Campo 16
Campo 17
Campo 18
Campo 19
Campo 20
Campo 21
Campo 22
Campo 23
Campo 24
Campo 25
Campo 26
F/28/60/F
29550,00
34359,60
35780,40
31129,00
32711,10
31977,30
33602,40
31402,50
28950,50
30544,40
30207,10
29959,60
29334,10
F/29/60/F
12241,30
11891,20
11456,90
7147,11 27210,00
23677,20
24655,30
26224,10
25838,00
22684,30
24415,30
12612,30
19317,60
F/30/60/F
19429,00
15885,60
26046,80
27081,80
24914,20
28604,20
30142,40
28337,10
26413,80
29561,50
27722,00
24025,70
29709,50
F/31/70/F
22032,00
20012,40
14892,50
32043,50
30377,90
17176,40
22978,90
18827,60
23752,90
22956,70
28189,40
28757,80
24289,00
F/32/70/F
22704,10
15693,70
16264,70
21363,60
19897,50
25309,50
30945,50
25858,40
7012,31 17529,10
22834,10
25736,40
26969,70
F/33/70/F
16772,00
23118,70
24739,90
26370,20
29811,80
32038,80
32430,80
30786,50
30447,40
27584,40
26135,90
23789,90
28127,10
F/34/70/F
23695,70
18300,30
28666,90
24919,60
30866,60
31408,90
26739,90
29637,80
27850,20
29198,20
29499,10
30911,20
30445,00
F/35/70/F
27890,00
16273,50
23580,40
24234,90
18341,10
23053,10
20894,00
30300,90
24579,80
26982,90
28464,00
21638,10
26748,60
F/36/N/F 30741,10
26737,40
29016,30
19870,50
28152,80
32977,80
32774,80
31540,90
33648,00
29947,10
33772,60
35133,20
31074,20
F/37/N/F 17277,90
21775,20
24478,70
23212,20
21513,20
24162,90
19048,00
23525,00
16389,40
20595,20
11295,70
20422,20
14788,80
F/38/N/F 28434,60
28042,20
29142,50
30276,50
26628,70
24059,30
27236,90
29813,90
26640,70
27315,90
27842,90
30068,30
30686,70
F/39/N/F 25821,70
22940,40
26710,60
23735,20
25269,30
27450,50
20963,10
24667,50
22072,10
25415,30
29002,40
27285,20
29020,40
F/40/N/F 13221,10
29103,30
32083,20
28669,10
31262,20
29760,30
19616,50
27551,40
26408,00
29734,60
29547,90
30089,10
28954,10
F/41/N/F 9259,92 12979,40
10588,00
17092,80
17277,30
16178,00
18111,60
14242,50
12272,60
10996,70
3809,01 15779,20
14837,40
F/42/N/F 20925,10
22822,20
20056,70
22657,10
18527,30
21889,70
18711,90
21746,40
15267,70
12989,70
19324,30
18267,20
20478,80
F/43/N/F 16920,20
16464,40
21908,90
20077,90
22831,90
22554,80
19437,20
21190,20
17124,80
20260,40
23079,20
14695,70
18009,70
F/44/N/F 15448,30
17736,30
19611,70
17697,10
20398,10
22858,80
24035,00
21731,30
19236,90
19315,20
18565,20
20487,90
23561,30
F/45/N/F 21324,20
14319,20
13563,30
23861,80
19726,90
30571,80
21298,00
10232,00
11140,60
14867,10
26352,90
25941,50
31534,10
F/46/85/F
19676,50
16388,90
13747,30
11783,50
7000,24 7566,95 8372,27 9397,67 8380,82 4828,38 9653,53 12290,30
20619,60
F/47/85/F
24264,20
24669,60
26520,70
15350,30
20895,70
21310,70
16921,10
22289,60
21747,70
13273,40
21763,70
20619,90
27234,70
F/48/85/F
6950,87 8768,40 7185,27 8030,42 8556,17 9178,84 8581,98 6859,41 7528,38 10131,60
11583,00
10141,50
6840,33
F/49/85/F
9587,88 6996,74 6920,15 11017,70
7483,35 7535,11 8063,38 10118,70
8212,63 12123,60
11134,00
11124,30
13824,90
F/50/85/F
18740,80
25021,00
25183,00
26642,70
26582,70
29600,40
27333,10
30426,00
28484,90
23138,00
24709,20
18312,50
18596,30
F/51/140/F
27698,50
35537,10
33477,30
33105,40
29276,90
30547,20
27547,10
31191,80
32240,90
33696,10
31490,30
28391,90
29082,90
F/52/140/F
10780,20
21749,80
12226,60
17080,80
10301,00
5683,07 15125,90
15330,40
8926,63 5458,21 13847,50
8422,91 15751,40
F/53/140/F
3316,64 5198,70 6021,13 14413,60
21833,80
20899,70
5989,85 15155,20
20040,70
8210,39 11395,60
10727,20
9743,73
F/54/140/F
22867,90
26834,50
24056,90
25418,70
27819,20
27256,30
25658,80
26640,20
25599,30
26514,60
19160,30
19596,30
17933,20
F/55/140/F
22664,70
33371,80
31254,40
35335,50
29752,20
36877,80
34540,60
32339,80
30024,30
28544,30
29825,20
18781,60
27325,40
ANEXO 3 –
Contagem da área marcada pelo anticorpo 3A4 (animais 28 a 55).
Continua...
Campo 27
Campo 28
Campo 29
Campo 30
F/28/60/F
32963,00
28925,20
32951,80
33696,00
F/29/60/F
25323,10
14187,50
23332,70
23200,40
F/30/60/F
26283,60
29818,10
17622,90
29586,90
F/31/70/F
25532,90
27221,50
22212,30
24567,60
F/32/70/F
30602,40
27228,50
22707,60
27417,20
F/33/70/F
27380,30
27547,30
30422,80
20028,90
F/34/70/F
28991,00
30527,20
32476,30
27608,40
F/35/70/F
20303,20
25588,00
26098,90
18202,00
F/36/N/F 35443,50
35942,30
34052,10
31921,20
F/37/N/F 20469,50
20333,30
24367,50
19200,00
F/38/N/F 31185,10
30932,80
20977,40
14033,50
F/39/N/F 29544,70
24658,70
29335,40
27205,20
F/40/N/F 27570,80
26169,10
20826,80
29477,80
F/41/N/F 12211,00
11537,70
13750,00
13572,70
F/42/N/F 23036,50
20526,20
16068,00
22691,30
F/43/N/F 20305,50
18973,40
19625,10
22337,30
F/44/N/F 22061,60
22683,90
22361,30
20174,70
F/45/N/F 17935,90
23633,40
20526,70
24807,10
F/46/85/F
19695,80
12757,00
15498,90
12829,50
F/47/85/F
27083,40
13927,30
10627,70
24633,40
F/48/85/F
10809,10
11383,40
8964,64 8216,84
F/49/85/F
14234,70
13810,40
12851,90
14750,30
F/50/85/F
22221,30
23169,40
28809,50
28044,50
F/51/140/F
33108,50
29429,80
26779,00
31090,70
F/52/140/F
7359,63 11904,40
8948,23 12605,90
F/53/140/F
17287,70
10275,20
5532,42 16757,00
F/54/140/F
26874,70
29096,00
29701,10
28756,40
F/55/140/F
24191,30
29936,60
27787,10
30175,10
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