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LUCIA TERESA HINOJOSA SCHÄFFER
A CORRELAÇÃO DA EXPRESSÃO DO GENE p53 NO CARCINOMA INVASOR
DE COLO UTERINO COM FATORES CLÍNICOS E PROGNÓSTICO
BOTUCATU - SP
2009
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LUCIA TERESA HINOJOSA SCHÄFFER
A CORRELAÇÃO DA EXPRESSÃO DO GENE p53 NO CARCINOMA INVASOR
DE COLO UTERINO COM FATORES CLÍNICOS E PROGNÓSTICO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ginecologia,
Obstetrícia e Mastologia - área de
Ginecologia, Faculdade de Medicina de
Botucatu - UNESP, para obtenção do
Título de Mestre.
Orientador: Professor Paulo Traiman.
BOTUCATU – SP
2009
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Schäffer, Lucia Teresa Hinojosa
A correlação da expressão do gene p53 no carcinoma
invasor de colo uterino com fatores clínicos e prognóstico. /
Lucia Teresa Hinojosa Schäffer. - 2009
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Medicina de Botucatu, 2009.
Orientador: Paulo Traiman.
Assunto CAPES:
1. Colo uterino - Câncer
CDD
Palavras-chave: p53. Gene Supressor de Tumor. Câncer
Cervical.
Aos meus filhos, Diogo, Maysa e Átila por
existirem e me motivarem a não desistir
dos meus projetos e das minhas
conquistas.
Ao meu pai Humberto e minha mãe
Teresa (in memorian) exemplo de fé,
determinação e otimismo diante da vida e
minhas irmãs e irmãos pelo
encorajamento e credibilidade.
AGRADECIMENTO
Agradeço e louvo ao meu Deus e Pai, Autor e Consumador da minha fé por me fazer
perseverar até aqui.
Ao Prof. Helio Nunes pela orientação e colaboração nos estudos estatísticos e por
em esclarecer todas as dúvidas com competência e atenção.
À Profª Eliane S. Abreu pela análise do estudo imunohistoquímico realizado no
Departamento de Patologia da FMB, UNESP.
Aos docentes e funcionários da Pós-Graduação em Ginecologia, Obstetrícia e
Mastologia que de alguma forma colaboraram para este trabalho, meus sinceros
agradecimentos.
À Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, instituição de ensino que me
abraçou como profissional e docente do curso de medicina, a oportunidade de
lecionar em um curso pioneiro na nossa região, desafio contínuo para todos os
docentes e funcionários envolvidos, aos colegas do Departamento de Ciências
Naturais que colaboraram de certa forma para que concluísse este trabalho.
Às professoras Claudia Leal Macêdo e Maria Domingues pela atenção e cuidado na
seleção das imagens deste trabalho.
À profª Sandra, amiga e irmã pelo apoio e colaboração.
Ao Prof. Paulo Traiman,
Experiente professor e pesquisador
conceituado por suas grandes publicações por
ter me concedido a oportunidade de ser sua
orientanda.
Obrigada pelo seu apoio e esclarecimentos
prestados com muita eficiência diante das
dúvidas e incertezas, pelo exemplo de
simplicidade e praticidade durante a execução
deste estudo.
“E é por intermédio de Cristo que temos tal
confiança em DEUS; não que por nós mesmos,
sejamos capazes de pensar alguma coisa, como
se partisse de nós; pelo contrário, a nossa
suficiência vem de DEUS“ 2Co 3:4,5.
ÍNDICE
LISTAS DE TABELAS
LISTAS DE FIGURAS
LISTAS DE GRÁFICOS
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 16
1.1 Proteína p53 ........................................................................................................ 18
1.2 Neoplasia de colo uterino e fatores clínicos e prognóstico .................................. 27
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 32
2.1 Objetivo geral ...................................................................................................... 32
2.2 Objetivos específicos .......................................................................................... 32
3 CASUÍSTICA E MÉTODOS ................................................................................... 33
3.1 Casuística ............................................................................................................ 33
3.1.1 Dados clínicos .................................................................................................. 33
3.1.2 Seguimento clínico ........................................................................................... 34
3.1.3 Dados anátomo-patológicos ............................................................................. 34
3.2 Material e métodos .............................................................................................. 35
3.2.1 Expressão da oncoproteína p53 ....................................................................... 35
3.2.1.1 Detecção imunohistoquímica da p53 ............................................................ 35
3.2.1.2 Interpretação das reações de imunohistoquimica ......................................... 39
3.3 Análise estatística ............................................................................................... 40
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 41
4.1 Idade ................................................................................................................... 41
4.2 Etnia .................................................................................................................... 41
4.3 Paridade .............................................................................................................. 42
4.4 Coitarca ............................................................................................................... 42
4.5 Tabagismo ........................................................................................................... 43
4.6 Anticoncepcional oral .......................................................................................... 43
4.7 Citologia .............................................................................................................. 43
4.8 Histologia ............................................................................................................. 44
4. 9 Estadiamento ..................................................................................................... 44
4.10 Tratamento ........................................................................................................ 45
4.11 Seguimento ....................................................................................................... 46
4.12 Expressão do p53 ............................................................................................. 46
4.13 Graduação do p53 ............................................................................................. 47
4.14 Associação entre p53 e idade ........................................................................... 48
4.15 Associação entre a graduação do p53 e idade ................................................. 49
4.16 Associação entre p53 e cor ............................................................................... 50
4.17 Associação da graduação de p53 e cor ............................................................ 51
4.18 Associação do p53 e tabagismo ........................................................................ 52
4.19 Associação da graduação do p53 e tabagismo ................................................. 53
4.20 Associação entre a expressão do p53 e paridade ............................................. 53
4.21 Associação entre graduação do p53 e paridade ............................................... 54
4.22 Associação entre a expressão p53 e idade da coitarca .................................... 55
4.23 Associação entre a graduação do p53 e idade da coitarca ............................... 56
4.24 Associação entre a expressão do p53 e seguimento ........................................ 57
4.25 Associação do p53 e uso de anticocepcional oral ............................................ 58
4.26 Associação entre p53 e estadio ........................................................................ 59
4.27 Associação entre p53 e histologia ..................................................................... 60
5 ANÁLISE DOS RESULTADOS .............................................................................. 62
5.1 Associação p53 e idade ...................................................................................... 62
5.2 Associação p53 e etnia ....................................................................................... 62
5.3 Associação p53 e tabagismo ............................................................................... 62
5.4 Associação p53 e paridade ................................................................................. 63
5.5 Associação entre p53 e idade da coitarca ........................................................... 63
5.6 Associação p53 e seguimento ............................................................................. 63
5.7 Associação p53 e uso de anticoncepcional oral .................................................. 63
5.8 Associação p53 e estadio .................................................................................... 64
5.9 Associação p53 e a diferenciação histológica ..................................................... 64
6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 66
7 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 70
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 71
ANEXOS ................................................................................................................... 74
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo idade. ........................................................................................... 41
Tabela 2 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a cor. ............................................................................................ 41
Tabela 3 - Distribuições de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a paridade. ................................................................................... 42
Tabela 4 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a idade a coitarca. ........................................................................ 42
Tabela 5 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo o uso do tabaco. .......................................................................... 43
Tabela 6 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo o uso de ACO. ............................................................................. 43
Tabela 7 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a citologia cérvico-vaginal, segundo a classificação de
Papanicolau. ............................................................................................... 44
Tabela 8 - Distribuição de freqüências das pacientes segundo o grau de
diferenciação do tumor. .............................................................................. 44
Tabela 9 - Distribuição de freqüências das pacientes segundo o estadio. ................ 45
Tabela 10 - Distribuição de freqüências das pacientes segundo o tratamento. ........ 45
Tabela 11 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo o seguimento. .............................................................................. 46
Tabela 12 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo o p53. ........................................................................................... 46
Tabela 13 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas segundo a
graduação do p53. ...................................................................................... 47
Tabela 14 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo p53 e idade. ................................................................................. 48
Tabela 15 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a graduação do p53 e a idade ..................................................... 49
Tabela 16 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo p53 e cor. ..................................................................................... 50
Tabela 17 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo graduação da p53 e cor. .............................................................. 51
Tabela 18 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo graduação da p53 e o uso de tabaco........................................... 52
Tabela 19 – Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a graduação da p53 e tabagismo................................................. 53
Tabela 20 - Distribuições de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo p53 e paridade. ............................................................................ 54
Tabela 21- Distribuições de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a graduação da p53 e paridade. .................................................. 55
Tabela 22 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a p53 e a idade da coitarca. ......................................................... 56
Tabela 23 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a graduação da p53 e a idade da coitarca. .................................. 57
Tabela 24 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo p53 e seguimento ........................................................................ 58
Tabela 25 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo p53 e o uso de anticoncepcional oral........................................... 59
Tabela 26 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo p53 e o estadio. ........................................................................... 60
Tabela 27 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo p53 e a diferenciação histológica. ................................................ 61
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1 - Carcinoma de célula escamosa a) pouco diferenciado; b) muito
diferenciado. ............................................................................................. 34
Figura 2 - Representação esquemática do princípio da imunohistoquímica pelo
método da avidina-biotina-peroxidase. Observa-se o efeito
amplificador da avidina (A) que se liga à biotina (B) do anticorpo
secundário e a outras três moléculas de biotina. A peroxidase (P)
reage com a 3-3’ – diaminobenzidina (DAB) corando os sítios
antigênicos.(1ª) ......................................................................................... 36
Figura 3 - Fluxograma do protocolo básico de imunohistoquímica pelo método
da avidina-biotina-peroxidase (ABC) para detecção da expressão da
proteína p53. (1ª) ...................................................................................... 38
Figura 4 - Demonstração de p53 em lâmina. ............................................................ 39
LISTAS DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Distribuição quanto à distribuição de freqüências do p53. ....................... 47
Gráfico 2 - Distribuição quanto à distribuição de graduação do p53. ........................ 48
Gráfico 3 - Distribuição quanto à relação do p53 e a idade. ...................................... 49
Gráfica 4 - Distribuição quanto à relação da graduação do p53 e idade. .................. 50
Gráfico 5 - Distribuição quanto à relação do p53 e cor. ............................................ 51
Gráfico 6 - Distribuição quanto à relação graduação da p53 e etnia. ........................ 52
Gráfico 7 - Distribuição quanto à relação graduação da p53 e tabagismo. ............... 53
Gráfico 8 - Distribuição quanto à relação do p53 e paridade..................................... 54
Gráfico 9 - Distribuição quanto à relação graduação p53 e paridade. ....................... 55
Gráfico 10 - Distribuição quanto à relação do p53 e a Idade da coitarca. ................. 56
Gráfico 11 - Distribuição quanto à relação graduação do p53 e idade da
coitarca. .................................................................................................... 57
Gráfico 12 - Distribuição quanto à relação do p53 e seguimento. ............................. 58
Gráfico 13 - Distribuição quanto à associação do p53 e o uso do
anticoncepcional oral. ............................................................................... 59
Gráfico 14 - Distribuição quanto à relação do p53 e estadio. .................................... 60
Gráfico 15 - Distribuição quanto à associação do p53 e grau histológico. ................ 61
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ABC Avidina-biotina-peroxidase
ACO
Anticoncepcional oral
Arg
Arginina
ASCUS Alterações de células escamosas de significado indeterminado
CDKs Quinases dependentes de ciclina
cm Centímetro
DAB Tetrahidrocloreto de diaminabenzidina
DNA Ácido desoxirribonucléico
FIGO Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia
GADD-45 Growth Arrest DNA Damage
H
2
O
2
Peróxido de hidrogênio
HPV Papiloma Vírus Humano
HTA
Histerectomia Abdominal Total
IH Imunohistoquimica
mdm-2 Mouse double minute 2
ml Milímetro
NIC Neoplasia intraepitelial cervical
PCR Reação em cadeia pela polimerase
pH Potencial hidrogeniônico ou potencial hidrogênio iônico
Pro Prolina
Qt
Quimioterapia
RNA Ácido ribonucléico
Rt
Radioterapia
SIL Lesão intra-epitelial escamosa
SOB
Salpingo-ooforectomia bilateral
SSCP Polimorfismo conformacional
SST Solução salina tamponada
UNESP Universidade Estadual Paulista
WM
Werteim-Meigs
RESUMO
Durante décadas o estudo dos genes supressores de tumor têm alcançado
relevância quanto a sua participação nos tumores de modo geral. A etiopatogenia do
câncer cervical destaca o papel do p53, gene supressor de tumor, no
desenvolvimento da doença. Considerados sítios vulneráveis de lesões críticas do
DNA por funcionarem como barreiras fisiológicas contra a expansão clonal ou
mutabilidade genômica, são capazes de suspender o crescimento desordenado.
Considerado “guardião do genoma”, o p53, previne o acúmulo de erros em células
lesadas nos seus DNAS, levando essas células a apoptose. Este gene pode
apresentar-se inativado ou mutado fazendo com que, a proteína p53 tenha sua meia
vida aumentada acumulando-se nas células tumorais. No presente estudo foram
avaliadas retrospectivamente, 120 pacientes com carcinoma epidermóide invasivo
de colo uterino, diagnosticadas, tratadas e acompanhadas no serviço de Oncologia
ginecológica do HC da Faculdade de Medicina de Botucatu. Através do
levantamento dos prontuários, foram estudados fatores clínicos relacionados como:
idade, raça, paridade, coitarca, tabagismo, uso de anticoncepcionais orais,
classificação de Papanicolau, estadio e expressão da proteína p53. A expressão da
p53 foi realizada através da técnica de imunohistoquimica em lâminas arquivadas
das pacientes com câncer invasor de colo uterino, a qual mostrou-se positiva. Foram
também avaliados os fatores clínicos correlacionados e prognóstico, analisadas as
freqüências de algumas variáveis e realizados teste de Fisher para verificar
associações entre p53 e as variáveis. Foram considerados estatisticamente
significativos os resultados cujos valores de p foram inferiores a 0,05. A análise dos
dados encontrados quanto à expressão positiva do p53 nas pacientes com câncer
epidermóide em relação a idade, nos mostrou que 89% das pacientes, com idade
menor ou igual a 69 anos apresentou positividade na expressão do p53. No grupo
de pacientes com idade acima de 70 anos, 5% a apresentaram positiva. A
expressão do p53 foi positiva em 71,7% das mulheres brancas. Na análise de
mulheres tabagistas e a expressão do p53, observou-se que esta expressão foi
positiva em 36,7% das mulheres tabagistas e 52,5% não tabagistas, demonstrando
não haver associação estatística significativa entre p53 e o uso do tabaco. Foi
observado também não haver e associação significativa entre a expressão positiva
do p53 e paridade, a idade da coitarca e o uso de anticoncepcional oral. A
superexpressão da proteína p53 em câncer de colo uterino neste estudo foi
encontrada numa freqüência de 15 a 50%. Concluímos que a inativação da p53 está
associada com o crescimento descontrolado das células e desenvolvimento do
câncer. A expressão positiva do p53 está associada com o mau prognóstico das
pacientes com câncer invasivo de colo do útero e os aspectos epidemiológicos, o
estadiamento, e as formas de tratamento não se evidenciaram como fatores
prognósticos quando relacionados com a expressão do p53.
Palavras-chave: p53. Gene Supressor de Tumor. Câncer Cervical.
ABSTRACT
For decades the study of tumor suppressor genes has gained relevance because of
its participation in tumors in general. The cervix cancer etiopathogeny highlights the
role of the tumor suppressor gene p53 in the disease development. It is the
vulnerable site of a DNA damage once it works as a physiological barrier inhibiting
clonal expansion or genomic mutation, thus being capable of stopping irregular
growth. The p53 gene is also considered the “guardian of the genome” for it prevents
the accumulation of mistakes in the cells with DNA damage, putting them into
apoptosis. The half-life of the p53 protein increases in the tumor cells given its
inactive or mutated appearance. This study retrospectively analyzed 120 patients
with invasive colon epidermoid carcinoma who were diagnosed, treated, and
observed at the Gynecologic Oncolgy Service, HC, Medical School of Botucatu,
Brazil. Reading the patients’ data, it was analyzed related clinical factors such as
age, race, parity, first sex intercourse, smoking habit, use of oral contraceptive,
papanicolau status, staging, and expression of p53. The p53 expression was found
through the immunohistochemistry in invasive colon cancer patients’ slides, which
happened to be positive. Prognostic and correlated clinical factors were also studied,
as well as the frequency of some variants. The Fisher’s test was used to test
associations between p53 and variants. The results were considered statistically
significant, with p values under 0.05. Regarding the positive expression of p53, the
data analysis has shown that 89% of the patients with epidermoid cancer and who
were 69 or less had positive p53 expression. This percentage fell to 5% on patients
over 70 years old. The p53 expression was positive in 71.7% of caucasians.
Regarding smoking habit, 36.7% of smoker and 52.5% of non-smokers presented
positive p53 expression. It showed no relation whatsoever between p53 and smoking
habit. It was also observed no important statistical association between positive p53
expression and parity, first sexual contact, and the use of oral contraceptive. In this
study, the superexpression of p53 in colon cancer was found in a frequency ranging
from 15 to 50%. We’ve concluded that p53 inactivity is associated with cell irregular
growth and cancer development. The positive expression of p53 is associated with
bad prognostic on invasive colon cancer patients and the epidemiologic aspects,
staging, and forms of treatment were not considered as prognostic factors when
related to p53 expression.
Keywords: p53. Tumor Suppressor Gene. Cervical Cancer.
16
1 INTRODUÇÃO
O câncer cervical é a segunda neoplasia maligna mais comum na mulher, a
cada ano registra-se cerca de 500.000 casos novos no mundo.
Esta neoplasia é responsável por cerca de 230.000 óbitos ao ano e para cada
caso novo de neoplasia cervical invasiva encontrada pelo rastreamento citológico,
aproximadamente 50 casos decorreram de esfregaços anormais como a lesão intra-
epitelial escamosa (SIL) de baixo grau e alto grau, também denominadas neoplasia
intraepitelial cervical (NIC).
Nas últimas três décadas a incidência do câncer de colo uterino tem
aumentado nas mulheres da raça negra e outras raças não brancas de acordo com
as pesquisas, porém a incidência e mortalidade por neoplasia de colo uterino têm
diminuído devido aos programas de rastreamento citológico.
(11)
Menos de 49% das mulheres afetadas por esta doença em países em
desenvolvimento têm uma sobrevida maior que 5 anos, enquanto que em países
desenvolvidos a sobrevida encontra-se em torno de 59 a 69% com média estimada
em 49%.
Afeta mulheres multíparas e na perimenopausa, porém sua incidência é
evidente na faixa etária de 20 a 29 anos com pico entre 45 e 49 anos.
(18)
A neoplasia cervical bem como as lesões precursoras é proveniente de dois
tipos de epitélio: escamoso e glandular, sendo mais freqüente no epitélio escamoso.
Dentre os fatores de risco para neoplasia de colo uterino destacamos o número de
parceiros sexuais, a idade da coitarca e doenças sexualmente transmissíveis como
infecções virais pelo Papiloma Vírus Humano (HPV).
(11)
17
Nas duas últimas décadas o HPV, vírus de transmissão sexual, tem sido
apontado como agente causal das neoplasias de colo uterino.
Através de técnicas de hibridização molecular estudos detectaram a presença
do HPV na cérvix uterina.
(27)
O desenvolvimento do câncer em humanos envolve uma complexa sucessão
de eventos regulada por padrões genéticos pré-estabelecidos.
(35)
As alterações genéticas presentes nas células malignas não são herdadas
por meio dos gametas, estas são decorrentes de mudanças no ácido
desoxirribonucléico (DNA) das células somáticas.
Em decorrência destas alterações, funções celulares que normalmente
estariam sob controle são exercidas desordenadamente, resultando na expressão
exagerada de proteínas responsáveis pela proliferação celular, como a p53 cuja
função é controlar o ciclo celular.
A etiologia e patogênese do câncer cervical têm enfatizado nas últimas
décadas o papel do p53, gene supressor de tumor, no desenvolvimento da
doença.
(5)
Este gene pode apresentar-se inativado ou mutado.
Os métodos utilizados para detectar mutações do p53 são a
imunohistoquimica (IH), o polimorfismo arranjado em filamento único, e métodos de
reação em cadeia pela polimerase (PCR). Cada método apresenta suas limitações
em termos de especificidade.
(23)
O p53 tem um papel de “guardião do genoma” em resposta a mutagenes
endógenos e exógenos.
(8, 16)
O p53 encontra-se mutado em vários tipos de tumores,
o tipo selvagem do p53 é mais frequentemente encontrado nos tumores iniciais de
colo uterino.
(26)
18
Do ponto de vista clínico, a imunohistoquimica do p53 parece ser o método
mais prático e útil de detecção de alterações do p53 em lesões pré-cancerosas e
carcinomas. Esta técnica permite precisar a localização e identificação de células
que inibem alterações do p53, contudo ela não pode detectar a perda completa da
p53 ou mutações pequenas.
(7)
1.1 Proteína p53
Pesquisas na etiopatogenia do câncer têm relatado a idéia de que a perda de
controle do crescimento celular tem importante papel no desenvolvimento desta
doença. Um dos responsáveis pelo controle do crescimento celular é o gene p53
conhecido como um gene supressor do tumor.
(1)
O p53 foi descoberto em 1979 como uma proteína ligada a um oncogene
viral, o sv40, e a seqüência deste gene foi relatada por Cans e Crawford.
(1, 21, 42)
Ela
foi encontrada como uma fosfoproteina nuclear que pesava 53 KD que contém 393
aminoácidos, e assim nomeada p53.
(1)
O gene p53 está localizado no braço curto do cromossomo 17
(1, 4)
e está
presente em todas as espécies de vertebrados.
(1)
Uma das mais importantes propriedades bioquímicas deste oncogene é a sua
capacidade de se ligar a seqüências específicas do DNA.
(1, 4, 20)
Inibindo a replicação do DNA, atua como um fator de transcrição que controla
de forma positiva e negativa a expressão de diversos genes envolvidos em várias
vias celulares, regulando a transição da fase G1 para a fase S do ciclo celular e da
fase G para fase M. O objetivo de parada do ciclo celular em G1 é proporcionar à
19
célula um tempo de janela para reparar a lesão do DNA antes de entrar na fase S.
(20)
Desta forma é garantida a manutenção da integridade do genoma e controle da
proliferação celular, além de estar envolvido na determinação da morte celular por
apoptose.
(7)
O p53 está envolvido em vários processos celulares como transcrição do
gene, reparo do DNA, ciclo celular, estabilidade genômica, segregação
cromossômica, senescência e apoptose (morte celular programada).
(15, 16, 20)
Os genes supressores do tumor são sítios vulneráveis de lesões críticas do
DNA porque normalmente eles funcionam como barreiras fisiológicas contra a
expansão clonal ou mutabilidade genômica e são capazes de suspender o
crescimento desordenado.
(15)
Os genes que são inativados por perda alelica, distinguem-se pela alta
freqüência de mutações, a maioria destas mutações é do tipo missense (troca de um
nucleotídeo) e altera a função normal da p53. Assim, a proteína p53 tem sua meia
vida aumentada acumulando-se nas células tumorais.
Outro tipo de mutação pode ser do tipo nonsense decorrente de deleções
parciais do gene ou inserção de nucleotídeos. Este tipo de mutação pode levar a um
stop códon (parada da leitura do RNA mensageiro), alterando a proteína.
(20)
O p53 é uma proteína que produz um fator de transcrição nuclear que regula
a atividade de vários genes, incluindo o p21, o qual está diretamente envolvido no
controle do ciclo celular. A mutação do p53 é incapaz de ativar o gene p21, levando
à liberação do bloqueio do ciclo celular normal promovendo assim um crescimento
celular desordenado.
(7, 32)
Os genes supressores de tumor são genes que codificam proteínas capazes
20
de regular o crescimento celular. Quando mutados, apresentam como característica
a perda da função decorrente da deleção de um dos alelos, denominado perda de
heterozigose.
(19)
Quando uma célula sofre lesão do DNA, o p53 tem um papel crucial,
prevenindo que tais células se multipliquem, induzindo à apoptose. Porém, quando
este gene sofre mutação e não pode promovê-la, tais células lesadas são capazes
de continuar proliferando desordenadamente, resultando câncer.
(21, 32)
Como “guardião do genoma”, o p53, previne o acúmulo de erros em células
lesadas nos seus DNAS, levando essas células a apoptose, morte programada da
célula.
(8)
A atividade supressora do tumor pode também ser neutralizada pela
interação com outras proteínas ou com oncoproteínas virais.
(4, 15)
A mutação do p53 em câncer cervical é rara. Isto pode ser porque a
oncoproteína E6 e E7 do Papiloma Vírus Humano (HPV) de alto risco pode ligar-se à
proteína p53e inativá-la neste tipo de câncer.
(1, 4)
A inativação do p53 frequentemente ocorre como resultado de mutações
gênicas causadas pela exposição a mutagênicos químicos, ambientais, agentes
físicos como: radiações, raios gama ou infecções virais. Contudo, a inativação do
p53 pode também ocorrer esporadicamente através de processos endógenos, e em
raros casos, as mutações podem ser inerentes.
(32)
O controle da proliferação celular é essencial para o crescimento normal das
células do organismo, este é estimulado pelos protooncogenes, os quais podem
tornar-se oncogenes e resultar em crescimento tumoral. As mutações que inativam
os genes supressores de tumor, levam à tumorogênese.
(32)
Quando ocorre um dano no DNA, o gene TP53 selvagem inibe a mitose e
21
induz o reparo o qual se não for eficiente induz a apoptose, eliminando deste modo
as células instáveis com predisposição à malignidade. Quando ocorre uma mutação
no gene TP53, há uma alteração funcional da proteína, a qual sendo inativada leva a
uma instabilidade genética dando início à transformação maligna.
(29)
Como citado, no início do ciclo mitótico, o gene p53 ativa o gene p21,
induzindo a síntese da proteína p21, cuja função é inibir a ação das quinases
dependentes de ciclinas (CDKs), fazendo com que as células parem na fase G1 do
ciclo celular, até que se complete o reparo do DNA.
Para tanto, a proteína p53 ativa o gene Growth Arrest DNA Damage (GADD-
45), que atua corrigindo a lesão no DNA. Quando o reparo do DNA é finalizado, a
proteína p53 é degradada pela ação as proteína MDM-2, produto do gene mouse
double minute 2 (mdm-2). Não ocorrendo restauração do DNA, o gene p53 sinaliza
para outros genes reguladores, como bax, bcl-2e c-myc, e induz a apoptose,
eliminando, assim, a célula com a informação genética variada. O gene p53
promove, também um ponto de verificação de S para G2, que depende da
integridade do domínio C-terminal do gene.
(2, 28)
A mutação do TP53 leva ao acúmulo de proteína no núcleo celular, esta
alteração aumenta a meia vida desta proteína permitindo que esta seja detectada
por meio de imunohistoquímica.
(28)
Este gene pode ser alterado por várias mutações que ocorrem em vários
locais da sua extensão, tais mutações podem ocorrer por diversos agentes
mutagênicos. A mutação de um alelo do gene p53 muitas vezes é acompanhada de
deleção de outro alelo, resultando em produto protéico inativo.
(27)
A proteína p53
mutante inativa a proteína p53 normal ocasionando perda da função de supressão
22
tumoral permitindo assim a atividade oncogênica.
(27)
O uso da imunohistoquimica como determinante para o prognóstico da
neoplasia de colo uterino é controverso.
A perda de heterozigose do p53 está relacionada com a progressão de certos
tipos de tumores. No câncer cervical dois estudos mostraram esta relação. Um
estudo de coorte avaliou o polimorfismo no códon 72 do p53. Mutações do p53
foram encontradas em vários tumores humanos e estudos têm mostrado menos de
10% de prevalência da mutação do p53 em câncer cervical.
(23)
Por duas décadas as principais alterações do p53 foram encontradas no
câncer cervical e lesões precursoras, tais como a expressão do p53, mutações
perda de heterozigose e polimorfismo no p53.
Pacientes com carcinoma de células escamosas que foram tratadas com
radioterapia foram investigados quanto à infecção por HPV, status do p53, e outros
parâmetros clínicos, estes resultados foram variáveis. Observou-se que a mutação
do p53 tem uma significante correlação com recorrência local do tumor, porém sem
correlação com a infecção por HPV ou outro resultado clínico em pacientes com
câncer cervical. Tem sido relatada a presença do p53 mutante radioresistente em
diferentes tipos de tumores.
(19)
Surpreendentemente, o câncer cervical HPV positivo não tem mutações
freqüentes do p53.
(1)
O p53 é mais frequentemente mutado em tumores HPV
negativos do que em tumores HPV positivos, sugerindo que para a formação do
tumor, procede que o p53 deva ser inativado ou por interação de proteínas virais ou
por mutação. Uma pequena proporção de câncer cervical não contém HPV
detectável.
(36)
23
Vários estudos sugerem uma possível diferença molecular no caminho da
carcinogênese com p53 mutante encontrado em tumores HPV negativos.
(3, 4, 39)
Existe o polimorfismo no códon 72 do gene p53, que pode modificar uma
arginina (Arg) ou uma prolina (Pro), determinando três genótipos: Arg (ArgArgp53),
heterozigoto (Arg/Pro p53), os dois alelos não interferem na atividade da
proteína,porém estudos sugerem que pacientes Arg/Arg p53 têm risco maior de
desenvolver o câncer cervical associado ao HPV.
A p53 que possui uma Arg na posição 72 apresenta velocidade de
degradação maior do que uma Pro nesta posição e presença do HPV.
(20, 41)
Um modo de inativação do p53, mediada pelo HPV diminui a suscetibilidade
das células cancerígenas à apoptose e permite a sobrevivência destas após lesão
do DNA ou desenvolvimento de estabilidade genômica, acumulando mudanças
genéticas e maior progressão para malignidade.
(3, 38)
A interação entre E6 e p53 representa potencialmente um importante passo
para a progressão da maioria das malignidades cervicais.
(38)
Existe um sinergismo dos fatores de risco “clássicos” para câncer cervical
com a perda da função do gene supressor de tumor, p53.
(5)
Um dos métodos para detecção de mutações do gene p53 é por estudo dos
níveis de p53 em células tumorais.
(9)
O desenvolvimento de técnicas para detalhar o tumor biológico mais
claramente inclui o uso de imunohistoquimica (IH) e técnicas de biologia molecular
como PCR, tipagem de vírus, análise de ploidia e hibridização in situ.
(40)
A detecção das mutações do p53 é importante não somente por estabelecer
relação causa-efeito em exposição a doença, mas também para “screening” da
24
população exposta antes do início do câncer.
(32)
A imunohistoquímica é um método que depende da meia-vida das proteínas
do p53 mutantes. Geralmente a proteína p53 reside nos núcleos celulares, mas tem
uma meia-vida curta e está presente em tão pequena quantidade que não podem
ser detectadas pela IH de rotina.
(34)
As mutações frequentemente aumentam a meia-vida e quantidade da p53,
permitindo a sua detecção pela IH.
(1, 4, 13, 32)
As proteínas p53 mutantes acumuladas nos núcleos celulares levam a uma
relativa super expressão que pode ser detectada por IH em amostras teciduais
congeladas ou parafinada.
(4)
A detecção de anormalidades do p53 pode ter implicações diagnósticas,
prognósticas e terapêuticas.
(13)
Do ponto de vista clínico, a IH do p53 parece ser o método mais prático e útil
de detecção de alterações do p53 em lesões pré-cancerosas e carcinomas. Esta
técnica permite precisar a localização e identificação de células que inibem
alterações do p53, contudo ela não pode detectar a perda completa da p53 ou
mutações pequenas.
(7)
A IH negativa pode indicar estado de p53 tipo selvagem (ou
seja, com função normal) ou gene p53 deletados.
Quando a IH é positiva, está geralmente, mas nem sempre, associada com
mutações da p53.
(43)
A IH, a qual identifica antígenos celulares específicos e outras técnicas
especializadas, podem fornecer fenótipos mais detalhados e algumas vezes
informações clínicas úteis. A correlação com fenótipos tais como grau histológico, ou
taxa de proliferação celular, com eventos moleculares precisos tais como alteração
25
do p53 ou outros genes, promete expandir nosso conhecimento do comportamento e
criar novos paradigmas de avaliação de risco, prevenção, detecção precoce,
determinação do prognóstico e terapias antineoplásicas.
(13)
A IH tem suas limitações, a ausência de marcação não significa ausência de
alteração da proteína (falso negativo). Inversamente o acúmulo de proteína não é
sinônimo de mutação. A Ausência de expressão pode decorrer de condições
adversas de fixação do tecido diminuindo a sensibilidade da técnica. Uma forte
positividade na maioria das células tumorais indica uma disfunção da proteína,
podendo corresponder a uma mutação ou estabilização por outro mecanismo. Entre
as técnicas utilizadas para investigação da inativação da p53 a IH é a mais
utilizada.
(20)
A relação de mutações da p53 com o grau do tumor e estadio têm sido
avaliados em muitos tipos de tumor. Esta tem sido observada em estadios
avançados de câncer de endométrio, cérvice e ovário, indicando que nesses
tumores as mutações da p53 podem ser eventos de contribuição tardia para a
progressão do tumor ao contrário da mama, por exemplo, no qual as mutações
ocorrem em estágios iniciais do tumor.
(13)
Embora a mutação do p53 possa ocorrer em estágios clínicos precoces do
processo neoplásico, em alguns tipos de câncer, a fração dos tumores com gene
p53 alterado é mais alto em estadios mais tardios do tumor.
(7)
Muitos estudos examinam o valor prognóstico de mutações do p53 e
variedade de câncer. Os dados concluem que pacientes com tumores que
apresentam mutação da p53 são piores do que naqueles pacientes com tumor sem
mutação.
26
O valor prognóstico da p53 em câncer cervical tem sido examinado com a
conclusão geral de que a p53 está associada com prognóstico desfavorável.
(9)
A resistência das células tumorais à radiação e quimioterapia permanece um
obstáculo significativo no tratamento do câncer.
(22)
Estudos descrevem que a terapia do câncer é menos efetiva em pacientes
que possuem tumor com mutações da p53. Embora existam exceções, o padrão e
freqüência de mutações da p53 em vários tipos de tumor correlaciona-se a uma
menor resposta do tumor à terapia.
(22)
Se a citotoxicidade de agentes antineoplásicos é determinada em parte pelo
mecanismo p53 dependente, as células que adquirem mutações da p53 são
predispostas a uma maior sobrevida a quimioterapia e a uma maior resistência do
tumor. A resistência à agentes antineoplásicos é uma conseqüência direta da
inativação da p53.
(20, 22)
A identificação de mutações da p53 em certos tipos de tumores pode tornar-
se um importante fator nas decisões de tratamento. Os agentes que restauram ou
mimetizam a função da p53 estão predispostos a ter uma potente atividade
antitumor.
(22)
Assim é possível designar drogas que bloqueiam a divisão celular por
mimetizar os efeitos inibitórios da proteína p53. A restauração da função normal do
gene p53 parece ser uma proposta promissora para terapia do câncer em geral. O
fenótipo tumorogênico poderia ser suprimido in vitro e em hospedeiros
imunocomprometidos pela restauração da função normal da p53 em células
neoplásicas.
(7)
Como o p53 é um componente integral do caminho programado de morte
27
celular (apoptose) induzida pela lesão do DNA, através de drogas quimioterápicas
(Qt) e radiações, a inativação da função normal do p53 poderia ter um aumento na
resistência à morte celular e redução na sensibilidade das células às drogas de
quimioterapia e radiações.
(1, 7, 43)
Essas observações levantam a possibilidade de que mutações na p53 podem
proporcionar uma base genética de resistência às drogas, e estudos com p53
podem ser utilizados para predizer a resposta dos cânceres a radioterapia e
quimioterapia no futuro. Não obstante, um benefício substancial poderá ser
conseguido por identificar os cânceres nos quais mutações da p53 não estão
presentes e as quais são, portanto possíveis de responder bem a quimioterapia com
drogas citostáticas tradicionais. Esses resultados também proporcionam alguns
alvos para novas estratégias no tratamento do câncer, isto é, conservação de terapia
com gene humano e radioterapia (Rt) e/ou quimioterapia (Qt).
(7)
Tentativas de colocar a p53 normal dentro de células cancerígenas, incluindo
células cancerígenas cervicais com adenovírus, medida por geneterapia, têm sido
relatadas com freqüência “in vivo” bem como “in vitro”, mas vários problemas
existem, principalmente o sistema de distribuição e modulação da expressão da
p53.
(1)
1.2 Neoplasia de colo uterino e fatores clínicos e prognóstico
Considerada problema de saúde pública mundial, a neoplasia de colo uterino
possui uma incidência elevada. Embora seja uma doença prevenível, estima-se que
19.000 casos novos de câncer de colo uterino devam ocorrer em 2008, no Brasil.
(6)
O câncer cervical pode ser diagnosticado através do estudo citológico da
28
cérvice uterina, técnica de Papanicolau, ou por visualização de lesões na cervix.
Uma amostra de biópsia deve ser extraída de qualquer lesão suspeita, porque o
exame de Papanicolau por vezes apresenta baixa sensibilidade no diagnóstico do
câncer.
(39)
Esta classificação foi realizada em 1940 dividindo os achados citológicos em
classes que variam de I a V, desde então outras classificações surgiram e
atualmente a mais utilizada e atual é classificação do Sistema BETHESDA,
Maryland, Estados Unidos. Esta classificação foi revista em 2001.
(18)
Segundo Papanicolau, a Classe I mostra achados normais, II apresenta
achados de atipias inflamatórias, ambas correspondem à classificação normal do
Bethesda; as classe III mostram atipias que correspondem a alterações de células
escamosas de significado indeterminado (ASCUS) sem a presença do HPV. Atipias
com a presença do HPV à lesões pré-neoplásicas, ou à lesão intraepitelial de baixo
grau (SIL de baixo grau). As classes III em outras classificações correspondem à
NIC I (SIL de Baixo grau), II e III (SIL de alto grau), IV a carcinoma in situ e V
corresponde ao câncer invasivo (Anexo A).
A associação com uso de anticoncepcionais orais mostra ser mais freqüente
no adenocarcinoma de colo uterino. O tabagismo é um conhecido fator de risco para
câncer cervical, alguns estudos demonstraram uma associação com as SIL de alto
grau devido á uma ação direta de metabólitos da nicotina no muco cervical.
(11)
Afeta mulheres multíparas e na perimenopausa, porém sua incidência é
evidente na faixa etária de 20 a 29 anos com pico entre 45 e 49 anos.
(18)
A associação desta neoplasia com o HPV de alto risco tem sido bem
documentada, e observou-se que as oncoproteínas E6 e E7 do HPV de alto risco
29
desregulam a proliferação celular. A Oncoproteína E6 liga-se à proteína p53, através
da proteína E6AP, formando o complexo p53-E6AP-E6 que é inativado por via
proteolítica dependente da ubiquitina; como não ocorre parada do ciclo celular para
o reparo do DNA, o ciclo prossegue com o genoma do vírus integrado ao do
hospedeiro.
(2)
O desenvolvimento do câncer no trato genital baixo está associado à infecção
por HPV em 95% dos casos de câncer de colo uterino.
(25, 37)
Dentre os subtipos de
HPV, os de alto risco são oncogênicos e produzem duas proteínas, E6 e E7, que
estimulam a transformação celular, como já citado. Essas proteínas se ligam ao p53
e Rb respectivamente.
(1, 25)
A classificação da neoplasia de colo uterino foi elaborada pela Federação
Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO) em 1994 e tem como parâmetros
o tamanho do tumor na cérvix e/ou sua extensão dentro da pelve. Os estágios IA1 e
IA2; o estagio IB em tumores IB1 (tumor <4 cm) e IB2 (tumor >4 cm).
Na América do Norte, quase 60% dos casos são diagnosticados no estagio I,
25% no estagio II, 10% no estagio III, e 5% no estagio IV. Em países menos
desenvolvidos, a maioria dos cânceres cervicais são diagnosticados no terceiro ou
quarto estagios. Para lesões menores (estagios IA e IB1), a classificação é feita com
a medida da profundidade da invasão tumoral (em biopsia cônica), o exame pélvico
para verificação clínica do tamanho do tumor, ou ambos. Para tumores mais
avançados, o exame pélvico é ocasionalmente necessário para a total verificação
dos tecidos parametriais adjacente a cervix e corpo uterino.
(39)
O tratamento para o carcinoma invasor do colo uterino, nos estadios IB e IIA
pela FIGO, pode ser cirúrgico, pela histerectomia radical com linfadenectomia
30
pélvica, pela radioterapia primária ou quimioirradiação, tais opções apresentam
taxas de sobrevida em cinco anos, variando de 87 a 92%. O exame histopatológico
da peça cirúrgica, é importante para estabelecimento do tipo histológico, estadio,
prognóstico e tratamento da doença.
(39)
O estadiamento cirúrgico de tumores maiores, inclui a avaliação
retroperitoneal dos nódulos linfáticos e pélvicos, para identificar metástases. O
estadiamento cirúrgico permite a comparação de resultados de tratamento por
diferentes métodos terapêuticos em diferentes países. Esta questão é importante
porque a maioria dos casos de câncer cervical ocorre em países menos
desenvolvidos, onde o acesso à terapia cirúrgica é restrito.
O estadio clínico é um indicador prognóstico confiável para pacientes com
carcinoma cervical. A expectativa de vida de 5 anos atinge 100% para pacientes
com tumores no estagio IA e fica entre 70-85% para aqueles no estagio IB1 e IIA
com lesões menores.
Nos tumores locais avançados (estagios IB2 a IV), a expectativa de vida é
variável e influenciada pelo volume do tumor, idade do paciente, e por complicações
e avanço da doença. No geral, a sobrevida de 5 anos livre de doença é de 50-70%
para os estágios IB2 e IIB, 30-50% para o estagio III, e 5-15% para o estagio IV.
(39)
O tratamento para o câncer do útero nos estadios Ia2 e IIA dá-se através da
histerectomia radical, técnica que consiste na remoção do útero e do tecido
peritumoral (paramétrio, paracolpos e margens vaginais).
Entre 1907 e 1935, várias técnicas surgiram na tentativa de se aumentar a
sobrevida das pacientes, porém algumas delas apresentavam taxa de mortalidade
peri-operatória. Em 1974, foram descritas outra classes de técnica operatória em
31
histerectomia visando aumentar a sobrevida e diminuir as complicações das
portadoras de neoplasia de colo uterino.
(30)
O prognóstico da paciente com câncer de colo uterino depende de fatores
como: idade, estadiamento, tipo histológico do tumor e o seu grau de diferenciação.
32
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar A Correlação da expressão do gene p53 em pacientes com carcinoma
invasor de colo uterino com fatores clínicos e prognóstico.
2.2 Objetivos específicos
• Determinar a freqüência a alteração da proteína p53 no carcinoma epidermóide
de colo uterino.
• Correlação do comportamento biológico do câncer invasivo de colo uterino com
a alteração da proteína p53.
33
3 CASUÍSTICA E MÉTODOS
Trabalho retrospectivo realizado com pacientes com câncer de colo uterino
tratados no setor de Oncologia da disciplina de Ginecologia do Hospital das Clínicas
da Faculdade de Medicina – UNESP, Campus de Botucatu, durante o período de
1985 a 2000. As lâminas dos estudos anátomo-patológicos e imunohistoquímicos
foram fornecidas pelo Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu
– UNESP, tendo o estudo imunohistoquímico realizado pela Profª. Eliane S. de Abreu.
3.1 Casuística
Foram estudados, retrospectivamente, 120 pacientes com carcinoma
epidermóide invasivo de colo uterino, diagnosticadas, tratadas e acompanhadas no
serviço de Oncologia ginecológica do HC da Faculdade de Medicina de Botucatu.
Através do levantamento dos prontuários, foram estudados os seguintes
dados relativos às pacientes: idade, raça, paridade, coitarca, tabagismo, uso de
anticoncepcionais orais, classificação de Papanicolau, estadio e expressão da
proteína p53.
3.1.1 Dados clínicos
Idade, cor, paridade, uso de contraceptivos orais, tabagismo, coitarca,
citologia cérvico-vaginal, grau de diferenciação histológica do tumor, tratamento
realizado e follow-up (seguimento).
34
3.1.2 Seguimento clínico
Foram avaliados tempo de segmento de cada paciente e o tempo de
sobrevida não pôde ser pesquisado porque muitas pacientes abandonaram o
seguimento e/ou tiveram óbito em outras cidades.
3.1.3 Dados anátomo-patológicos
- Grau de diferenciação histológica do tumor:
- Pouco diferenciado
- Moderadamente diferenciado
- Muito diferenciado.
a b
c d
Figura 1 - Carcinoma de célula escamosa a e b) pouco diferenciado; c e d) bem
diferenciado.
35
3.2 Material e métodos
3.2.1 Expressão da oncoproteína p53
3.2.1.1 Detecção imunohistoquímica da p53
Também conhecida como Complexo Avidina-Biotina (ABC), a técnica da
Avidina-Biotina-Peroxidase é técnica imunohistoquimica utilizada na detecção da
p53.è fundamentada na grande afinidade da avidina (glicoproteína de alto peso
molecular) com a biotina (vitamina que pode ser conjugada a enzimas, anticorpos e
substancias fluorescentes). O tecido é incubado em um anticorpo primário (mono ou
policlonal) específico para a proteína em estudo. A seguir aplica-se um anticorpo
secundário previamente ligado a uma molécula de biotina, cada molécula de avidina
que se acopla à biotina do anticorpo secundário liga-se à outras três moléculas de
biotina conjugadas à peroxidase. A peroxidase atua sobre um corante e os sítios
antigênicos ficam corados de forma estável, geralmente em tonalidade castanha.
No presente estudo, utilizamos o complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC)
com modificações,
(17)
com o auxílio do método de recuperação antigênica pelo forno
de microondas, como descrito a seguir.
Os tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina foram cortados com 3
micra de espessura e montados em lâminas de vidro previamente preparadas com o
adesivo poli-l-lisina (Sigma Chemical Corporation, P-7886, Saint Louis, Missouri,
EUA) para evitar o descolamento dos cortes durante a imunocoloração. Em seguida,
os cortes foram desparafinizados em xilol por 5 minutos (3 banhos), hidratados em
álcool etílico absoluto (4 banhos) e lavados com solução salina tamponada (SST)
36
em pH7,4 por 5 minutos. Posteriormente, os cortes forma testados com peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) a 3% diluído em SST por 5 minutos para bloqueio da peroxidase
endógena.
DAB
P
B
DAB
P
B
A
B
P
DAB
B
Anticorpo secundário
Anticorpo primário
Antígeno
Figura 2 - Representação esquemática do princípio da imunohistoquímica pelo
método da avidina-biotina-peroxidase. Observa-se o efeito amplificador da
avidina (A) que se liga à biotina (B) do anticorpo secundário e a outras três
moléculas de biotina. A peroxidase (P) reage com a 3-3’ – diaminobenzidina
(DAB) corando os sítios antigênicos.
(33)
Utilizamos o método de recuperação de epítopos pelo calor (SST de citrato
com pH 6,4 por 15 minutos em forno de microondas caseiro SHARP, modelo
37
Interactive Touch On a 900 Watts para a pesquisa da proteína p53. Os cortes foram
incisados com anti corpo primário anti p53 na diluição 1:500 em média por 16 horas,
incluindo o período noturno. No dia seguinte, após lavagem em SST, os cortes foram
incubados com anticorpo secundário biotinilado anti camundongo, na diluição de
1:160 para o anticorpo (Vector Corp., Burlingame, USA). A seguir, realizou-se
incubação por 45 minutos com complexo ABC na proporção de 1 gota do reagente A
(Avidina) e uma do reagente B (biotina ligada a peroxidase) na diluição de 5 ml de
solução TRIS. Para visualização da reação, os cortes foram tratados com solução de
DAB (3-3) – tetrahidrocloreto de diaminabenzidina na concentração de 1 mg/ml de
solução tampão trizma e solução de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) por 5 minutos.
Os cortes foram então contracorados com hematoxilina de Harris por 20 segundos
desidratadas em gradientes sucessivos de álcool, com montagem final com
Permount e lamínula.
Todos os passos da reação imunohistoquimica foram realizados à
temperatura ambiente, com exceção da incubação no forno de microondas. Entre
cada passo da reação, as lâminas foram lavadas várias vezes com SST (pH=7,4).
A reação foi considerada positiva quando a imunorreatividade em padrão
nuclear esteve presente.
38
1. Desparafinizar e reidratar os cortes:
xilol 2 x 10 min
etanol 99%,
água destilada por 5 min
2. Inibir a peroxidase endógena:
H
2
O
2
a 3% por 5 min
lavar em SST por 10 min
3. Recuperação antigênica:
transferir as lâminas para cesto de vidro
cobrir com solução tampão de citrato, pH 6,4
forno de microondas por 15 min
4. Incu
bar com o anticorpo primário (anti
-
p53):
aplicar o suficiente para cobrir o corte
incubar em câmara úmida ovemight
lavar em solução salina tamponada (SST)
5. Incubar com o anticorpo secundário biotinilado:
incubar à temperatura ambiente por 60 min
lavar em SST
6. Aolicar o complexo avidina
-
biotina
-
peroxidase:
incubar à temperatura ambiente por 45 min
lavar em SST
7. Corar os sítios antigênicos com DAB:
diluir a solução de estoque em SST e acrescentar H
2
O
2
(0,1%)
cobrir os cortes e assegurar 2-5 min
lavar em água abundante
8. Contracoloração
P53: verde de metila
9. Montagem das lâminas:
desidratar em gradientes sucessivos de álcool
montar com Permount
TM
Figura 3 - Fluxograma do protocolo básico de imunohistoquímica pelo método
da avidina-biotina-peroxidase (ABC) para detecção da expressão da proteína
p53.
(33)
39
3.2.1.2 Interpretação das reações de imunohistoquimica
Avaliadas por microscópio óptico com 200 x de aumento, pelo examinador de
cortes histológicos de câncer de colo uterino invasor. Para todos os marcadores
pesquisados, foi feita análise semiquantitativa. Os resultados da expressão protéica
foram registrados como positiva ou negativas. Quando positiva, a expressão protéica
foi graduada 1+ a 4 +, o que corresponde aos graus de 1 a 4.
(33)
+/4+: expressão da proteína em menos de 10% das células.
++/4+: expressão da proteína em 11-25% das células.
+++/4+: expressão da proteína em 126-50% das células.
++++/4+: expressão da proteína em mais de 50% das células
A quantificação foi realizada pelo estudo de pelo menos 1000 células em 10
campos com aumento de 200 vezes de aumento (figura 4).
Figura 4 - Demonstração de p53 em lâmina.
40
3.3 Análise estatística
Foram apresentadas tabelas de freqüência de algumas variáveis e realizados
testes de Fisher para testar associações entre p53 e as variáveis.
Foram considerados estatisticamente significativos os resultados cujos
valores de p53 foram inferiores a 0,05.
(12, 24)
41
4 RESULTADOS
4.1 Idade
A mediana de idade do estudo foi de 46 anos e a média de 46 a 48 anos,
variação de 23 a 78 anos; estando a distribuição etária das pacientes representada
na tabela 1.
Tabela 1 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo idade.
Idade
Número
Per
centual
20-29 3 2,5 %
30-39 26 21,7 %
40-49 63 52,5 %
50-59 14 11,7 %
60-69 8 6,7 %
Acima de 70 6 5,0 %
TOTAL
120
100,0
%
4.2 Etnia
A tabela 2 representa a distribuição das pacientes segundo a etnia.
Tabela 2 - Distribuição por etnia.
Etnia
Núme
ro
Percentual
Branco 99 82,5 %
Mulato 13 10,8 %
Negro 8 6,7 %
TOTAL
120
100,0%
42
4.3 Paridade
A tabela 3 representa a distribuição das pacientes segundo a paridade.
Tabela 3 - Distribuições de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a paridade.
Paridade
Número
Percentua
l
Nulípara 0 0,0 %
Primípara 5 4,1 %
Secundípara 26 21,7 %
Tercípara 12 10,0 %
Multípara (P > 3) 77 64,2 %
TOTAL
120
100,0 %
4.4 Coitarca
A tabela 4 representa a distribuição das pacientes segundo a idade de
coitarca.
Tabela 4 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a idade a coitarca.
Coitarca (idade)
Número
Percentual
Antes dos 15 14 11,7 %
15-20 82 68,3 %
Após os 20 24 20,0 %
TOTAL
120
100
,0
%
43
4.5 Tabagismo
A distribuição das pacientes quanto ao uso do tabaco encontra-se expressa
na tabela 5.
Tabela 5 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo o uso do tabaco.
Tabagismo
Número
Percentual
Sim 47 39,2 %
Não 73 60,8 %
TOTAL
120
100,0 %
4.6 Anticoncepcional oral
A distribuição das pacientes quanto ao uso de anticoncepcional oral (ACO)
encontra-se expressa na tabela 6.
Tabela 6 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo o uso de ACO.
Aco
Número
Percentual
Sim 49 40,8 %
Não 71 59,2 %
TOTAL
120
100
,0
%
4.7 Citologia
A tabela 7 representa a distribuição de freqüências das pacientes segundo a
citologia cérvico-vaginal (Anexo A).
44
Tabela 7 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a citologia cérvico-vaginal, segundo a classificação de Papanicolau.
Citologia
Numero
Percentual
III 4 3,3 %
IV 10 8,3 %
V 106 88,4 %
TOTAL
120
100,0 %
4.8 Histologia
A distribuição de freqüências das pacientes segundo o grau de diferenciação
histológico de neoplasia de colo uterino encontra-se representada na tabela 8.
Tabela 8 - Distribuição de freqüências das pacientes segundo o grau de
diferenciação do tumor.
Histologia
Número
Percentual
Bem Diferenciado 30 25,0 %
Moderadamente Diferenciado 59 49,2 %
Pouco Diferenciado 31 25,8 %
TOTAL
120
100,0
%
4. 9 Estadiamento
A tabela 9 representa a distribuição de freqüências das pacientes segundo o
estágio da classificação da FIGO, 1994 (Anexo B).
45
Tabela 9 - Distribuição de freqüências das pacientes segundo o estadio.
Esta
dio
Número
Percentual
I 41 34,2 %
II 53 44,2 %
III 19 15,8 %
IV 7 5,8 %
TOTAL
120
100,0 %
4.10 Tratamento
A tabela 10 representa a distribuição de freqüências das pacientes segundo o
tratamento realizado. Sendo observado um percentual de 2,5 para o Histerectomia
Abdominal Total HTA), Salpingo-ooforectomia bilateral (SOB), Werteim-Meigs (WM),
Radioterapia (Rt) e Quimioterapia (Qt). anticoncepcional oral (ACO)
Tabela 10 - Distribuição de freqüências das pacientes segundo o tratamento.
Tratamento
Número
Percentual
HTA 3 2,5 %
HTA + SOB 1 0,8 %
HTA + SOB+ +Rt 6 5,0 %
WM 29 24,2 %
WM+ Rt 10 8,3¨%
WM + Qt 1 0,8 %
WM+ Rt + Qt 1 0,8 %
Rt 63 52,5 %
Rt+Qt 4 3,3 %
Qt 2 1,7 %
TOTAL
120
100,0 %
46
4.11 Seguimento
A distribuição de freqüências das pacientes segundo o seu seguimento está
representada na tabela 11.
Tabela 11 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo o seguimento.
Seg
ui
mento (anos)
Número
Percentual%
0-5 14 11,7 %
5-10 17 14,2 %
+10 89 74,3 %
TOTAL
120
100,0 %
Quando correlacionamos as variáveis com a presença do p53, vemos os
dados abaixo relacionados.
4.12 Expressão do p53
A distribuição de freqüências das pacientes quanto à expressão do p53
encontra-se representadas na tabela 12 e gráfico 1.
Tabela 12 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo o p53.
p
53
Número
Percentual
%
Positivo 107 89,2 %
Negativo 13 10,8 %
TOTAL
120
100,
0 %
47
107
13
0
20
40
60
80
100
120
Positivo Negativo
Gráfico 1 – Distribuição quanto às freqüências do p53.
4.13 Graduação do p53
A distribuição de freqüências das pacientes segundo a graduação do p53,
encontra-se representada na tabela 13.
Tabela 13 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas segundo a
graduação do p53.
GRADUAÇÃO
NÚMERO
PERCENTUAL
+ / 4+ 48 45,3 %
++ / 4+ 28 26,4 %
+++/ 4+ 26 24,5 %
4+ 4 3,8 %
TOTAL
106
100,0 %
OBS.: Uma das lâminas não foi possível graduar devido ao material exíguo.
48
48
28
26
4
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
+/4+ ++ /4+ +++ /4+ 4+
Gráfico 2 - Distribuição quanto à graduação do p53.
4.14 Associação entre p53 e idade
A distribuição de freqüências das pacientes correlacionando p53 e idade,
encontra-se representada na tabela 14.
Tabela 14 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo p53 e idade.
Idade
p53
Positivo Negativo
20-29 1 (0,8%) 2 (1,7%)
30-39 24 (20,0%) 2 (1,7%)
40-49 56 (46,7%) 7 (5,8%)
50-59 13 (10,8%) 1 (0,8%)
60-69 7 (5,8%) 1 (0,8%)
70 ou mais 6 (5,0%) 0 (0,0%)
TOTAL
107
13
p=0,161 pelo teste exato de Fisher. Não houve associação.
49
1
2
24
2
56
7
13
1
7
1
6
0
0
10
20
30
40
50
60
Positivo Negativo
20-29
30-39
40-49
50-59
60-69
70 ou mais
Gráfico 3 - Distribuição quanto à relação do p53 e a idade.
4.15 Associação entre a graduação do p53 e idade
A distribuição de freqüências das pacientes correlacionando graduação do
p53 e a idade, encontra-se representada na tabela 15.
Tabela 15 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a graduação do p53 e a idade
Idade
p53
Total
+/4+
++/4+
+++4/+
4+
20-29 1(0,9%)
0 (0,0%)
0(0,0%)
0 (0,0%)
1
30-39 15(14,2%)
5 (4,7%)
4 (3,8%)
0 (0,0%)
24
40-49 21(19,8%)
15(14,2%)
18(17,0%)
2 (1,9%)
56
50-59 5 (4,7%)
5 (4,7%)
2 (1,9%)
1 (0,9%)
13
60-69 3 (2,8%)
3 (2,8%)
1 (0,9%)
0 (0,0%)
7
70 ou mais 3 (2,8%)
0 (0,0%)
1 (0,9%)
1 (0,9%)
5
TOTAL
48
28
26
4
106
p=0,404 pelo teste exato de Fisher. Portanto, não houve associação entre graduação do
p53 e a idade.
50
0
5
10
15
20
25
+/4+ ++/4+ +++/4+ 4+
20-29
30-39
40-49
50-59
60-69
70 ou mais
Gráfica 4 - Distribuição quanto à relação da graduação do p53 e idade.
4.16 Associação entre p53 e cor
A relação de freqüências das pacientes correlacionando p53 e cor, encontra-
se na tabela 16.
Tabela 16 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo p53 e cor.
p
53
Cor
Branca
Mulata
Negra
Total
POSITIVO 86 (71,7%)
13 (10,8%)
8 (6,7%)
107 (89,2%)
NEGATIVO 13 (10,8%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
13 (10,8%)
TOTAL
99
13
8
120 (100%)
p=0,405 pelo teste exato de Fisher. Não houve associação entre p53 e cor.
51
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Branca Mulata Negra
Positiva
Negativa
Gráfico 5 - Distribuição quanto à relação do p53 e cor.
4.17 Associação da graduação de p53 e cor
A distribuição de freqüências das pacientes correlacionando a graduação da
p53 e etnia, encontra-se representada na tabela 17.
Tabela 17 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo graduação da p53 e etnia.
COR
p53
+/4+
++/4+
+++/4+
4+
TOTAL
Branca 38 (35,9%)
21(19,8%)
22 (20,8%)
4 (3,4%)
85
Mulata 7 (6,6%)
5 (4,7%)
1(0,9%)
0 (0,0%)
13
Negra 3 (2,8%)
2 (1,9%)
3 (2,8)
0 (0,0%)
8
TOTAL
48
28
26
4
106
p=0,689 pelo teste exato de Fisher. Não houve associação entre graduação da p53 e etnia.
52
0
5
10
15
20
25
30
35
40
+/4+ ++/4+ +++/4+ 4+
Branca
Mulata
Negra
Gráfico 6 - Distribuição quanto à relação graduação da p53 e etnia.
4.18 Associação do p53 e tabagismo
A distribuição de freqüências das pacientes correlacionando a graduação da
p53 e o uso do tabaco, encontra-se representada na tabela 18
Tabela 18 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo graduação da p53 e o uso de tabaco.
p53
TABAGISMO
SIM
NÃO
TOTAL
POSITIVO 44 (36,7%)
63 (52,5%)
107
NEGATIVO 3 (2,5%)
10 (8,3%)
13
TOTAL
47
73
120
p=0,244 pelo teste exato de Fisher. Não houve associação entre a expressão do p53 e uso
de tabaco.
53
4.19 Associação da graduação do p53 e tabagismo
A tabela 19 representa a graduação da p53 em relação o uso do tabaco.
Tabela 19 – Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a graduação da p53 e tabagismo.
TABAGISMO
p
53
+/4+
++/4+
+++/4+
4+
TOTAL
SIM
23 (21,7%)
13 (12,3%)
7 (6,6%)
1 (0,9%)
44
NÃO
25 (23,6%)
15 (14,2%)
19 (17,9%)
3 (2,8%)
62
TOTAL
48
28
26
4
106
p=0,287 teste exato de Fisher. Não houve associação entre a graduação da expressão do
p53 e tabagismo.
0
5
10
15
20
25
+/4+ ++/4+ +++/4+ 4+
SIM
NÃO
Gráfico 7 - Distribuição quanto à relação graduação da p53 e tabagismo.
4.20 Associação entre a expressão do p53 e paridade
A distribuição de freqüências das pacientes correlacionando a expressão do
p53 e paridade encontra-se representada na tabela 20.
54
Tabela 20 - Distribuições de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo p53 e paridade.
p53
PARIDADE
Nulíp
ara
Primípara
Secundípara
Tercípara
Multípara
TOTAL
POSITIVO 0 (0,0%)
5 (4,2%)
23 (19,2%)
11(9,2%)
68(56,7%)
107
NEGATIVO 0 (0,0%)
0 (0,0%)
3 (2,5%)
1 (0,8%)
9 (7,5%)
13
TOTAL
0
5
26
12
77
120
p=1,0 pelo teste exato de Fisher. Não houve associação entre p53 e paridade.
0
10
20
30
40
50
60
70
Nulipara Secundípara Multípara
Positivo
Negativo
Gráfico 8 - Distribuição quanto à relação do p53 e paridade.
4.21 Associação entre graduação do p53 e paridade
A distribuição de freqüências das pacientes correlacionando p53 com a
paridade encontra-se representada na tabela 21.
55
Tabela 21 - Distribuições de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a graduação da p53 e paridade.
PARIDADE
p
53
+/4+
++/4+
+++/4+
4+
TOTAL
Nulípara 0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)
0
Primípara 2 (1,9%)
2 (1,9%)
1 (0,9%)
0 (0,0%)
5
Secundípara 10 (9,4%)
5 (4,7%)
7 (6,6%)
1 (0,9%)
23
Tercípara 4 (3,8%)
3 (2,8%)
3 (2,8%)
1 (0,9%)
11
Multípara 32 (30,2%)
18 (17,0%)
15 (14,2%)
2 (1,9%)
67
TOTAL
48
28
26
4
106
p>0,942 pelo teste exato de Fisher. Não houve associação entre p53 e paridade.
0
5
10
15
20
25
30
35
+/4+ ++/4+ +++/4+ 4+
Nulípara
Primípara
Secundípara
Tercípara
Multípara
Gráfico 9 - Distribuição quanto à relação graduação p53 e paridade.
4.22 Associação entre a expressão p53 e idade da coitarca
A distribuição de freqüências das pacientes correlacionando a expressão
positiva ou negativa do p53 e a idade da coitarca encontra-se representada na
tabela 22.
56
Tabela 22 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a expressão do p53 e a idade da coitarca.
p
53
COITARCA (IDADES)
Antes dos 15
15
-
20
Após os 20
TOTAL
POSITIVO
12 (10,0%)
77 (64,2%)
18 (15,0%)
107
NEGATIVO
2 (1,7%)
5 (4,2%)
6 (5,0%)
13
TOTAL
14
82
24
120
p=0,024 pelo teste exato de Fisher. Há indício de associação entre a idade da coitarca e a
expressão do p53.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
antes dos 15 15-20 após os 20
Positivo
Negativo
Gráfico 10 - Distribuição quanto à relação do p53 e a Idade da coitarca.
4.23 Associação entre a graduação do p53 e idade da coitarca
A distribuição de freqüências das pacientes correlacionando a graduação do
p53 e a idade da coitarca encontra-se representada na tabela 23.
57
Tabela 23 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a graduação da p53 e a idade da coitarca.
COITARCA
p
53
+/4+
++/4+
+++/4+
4+
TOTAL
< 15 6 (5,7%)
3 (2,8%)
3 (2,8%)
0 (0,0%)
12
15-19 36 (34,0%)
20 (18,9%)
19 (17,9%)
2 (1,9%)
77
>20 6 (5,7%)
5 (4,7%)
4 (3,8%)
2 (1,9%)
17
TOTAL
48
28
26
4
106
p=0,716 pelo teste exato de Fisher. Não houve associação.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
+/4+ ++/4+ +++/4+ 4+
< 15 a
15-19 a
> 20 a
Gráfico 11 - Distribuição quanto à relação graduação do p53 e idade da
coitarca.
4.24 Associação entre a expressão do p53 e seguimento
A distribuição de freqüências das pacientes correlacionando a expressão do
p53 e seguimento da doença encontra-se representada na tabela 24.
58
Tabela 24 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo p53 e seguimento
p53
Seguimento
em a
nos
<1
1
-
5
5
-
10
>10
TOTAL
POSITIVO
12 (10,0%)
52 (43,3%)
17 (14,2%)
26 (21,7%)
107
NEGATIVO
2 (1,7)
7 (5,8%)
2 ( 1,7%)
2 (1,7%)
13
TOTAL
14
59
19
28
120
p=0,918 pelo teste exato de Fisher. Não houve associação.
0
10
20
30
40
50
60
<1 1-5 5-10 >10
Positivo
Negativo
Gráfico 12 - Distribuição quanto à relação do p53 e seguimento.
4.25 Associação do p53 e uso de anticoncepcional oral
A distribuição de freqüências das pacientes correlacionando a expressão
positiva ou negativa do p53 e o uso de pílulas encontra-se representada na tabela
25.
59
Tabela 25 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo a expressão do p53 e o uso de anticoncepcional oral.
p53
ANTICONCEPCIONAL ORAL
NÃO
SIM
TOTAL
NEGATIVO 7(5,8%)
6 (5,0%)
13
POSITIVO 64 (53,3%)
43 (35,8%)
107
TOTAL
71
49
120
p=0,768 pelo teste exato de Fisher. Não houve associação entre p53 e o uso de
anticoncepcional oral.
0
10
20
30
40
50
60
70
NÃO SIM
NEGATIVO
POSITIVO
Gráfico 13 - Distribuição quanto à associação do p53 e o uso do
anticoncepcional oral.
4.26 Associação entre p53 e estadio
A tabela 26 representa a expressão do p53 em relação ao estadiamento da
doença.
60
Tabela 26 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo p53 e o estadio.
p53
EST
A
DIO
I
II
III
IV
TOTAL
NEGATIVO
10 (8,3%)
1 (0,8%)
0 (0,0%)
2 (1,7%)
13
POSITIVO
31(25,8%)
52 (43,3%)
19 (15,8%)
5 (4,2%)
107
TOTAL
41
53
19
7
120
p=0,001 pelo teste de Fisher. Houve associação entre p53 e estadio.
0
10
20
30
40
50
60
I II III IV
NEGATIVO
POSITIVO
Gráfico 14 - Distribuição quanto à relação do p53 e estadio.
4.27 Associação entre p53 e histologia
A distribuição de freqüências das pacientes do p53 com o grau de
diferenciação histológica do tumor encontra-se representada na tabela 27.
61
Tabela 27 - Distribuição de freqüências absolutas e relativas das pacientes
segundo p53 e a diferenciação histológica.
DIFERENCIAÇÃO
HISTOLÓGICA
p
53
POSITIVO
NEGATIV
O
TOTAL
Bem Diferenciado 28 (23,3%)
2 (1,7%)
30
Moderadamente Diferenciado 52 (43,3%)
7 (5,8%)
59
Pouco Diferenciado 27 (22,5%)
4 (3,3%)
31
TOTAL
107
13
120
p=0,799 pelo teste exato de Fisher. Não houve associação entre p53 e diferenciação
histológica do tumor.
0
10
20
30
40
50
60
POSITIVO NEGATIVO
Bem diferienciado
Moderadamente
diferenciado
Pouco diferenciado
Gráfico 15 - Distribuição quanto à associação do p53 e grau histológico.
62
5 ANÁLISE DOS RESULTADOS
5.1 Associação p53 e idade
A análise dos dados encontrados quanto à expressão positiva do p53 nas
pacientes com câncer epidermóide em relação a idade, nos mostrou que 89% das
pacientes, com idade menor ou igual a 69 anos apresentou positividade na
expressão do p53. No grupo de pacientes com idade acima de 70 anos, 5% a
apresentaram positiva. Não houve associação significativa, do ponto de vista
estatístico, entre p53 e idade. A faixa etária em que a expressão do p53 foi mais
freqüente foi a de 40 a 49 anos.
5.2 Associação p53 e etnia
A expressão do p53 foi positiva em 71,7% das mulheres brancas; 10,8% das
mulatas e 6,7% das negras, a análise estatística demonstrou que não houve
associação estatística entre p53 e etnia.
5.3 Associação p53 e tabagismo
Na análise de mulheres tabagistas e a expressão do p 53, observou- se esta
expressão foi positiva em 36,7% das mulheres tabagistas e 52,5% não tabagistas.
Não houve associação estatística significativa entre p53 e o uso do tabaco.
63
5.4 Associação p53 e paridade
A análise dos dados mostrou que o p53 foi positivo em 56,7% das multíparas,
seguido das secundíparas em 19,2%, tercíparas em 9,2%, 4,2% em primíparas e 0%
em nulíparas. Demonstrou-se neste estudo não haver e associação estatística
significativa entre expressão positiva do p53 e paridade.
5.5 Associação entre p53 e idade da coitarca
A faixa etária mais freqüente da coitarca onde o p53 teve expressão positiva
foi entre 15 a 19 anos. Nesse estudo, houve associação estatística significativa entre
p53 e idade da coitarca.
5.6 Associação p53 e seguimento
O maior tempo de seguimento em pacientes com expressão p53 positivas foi
de 1 a 5 anos; correspondendo a 43,3% das pacientes. Não observamos assim
associação estatística significativa entre tempo de seguimento e positividade do p53.
5.7 Associação p53 e uso de anticoncepcional oral
Em pacientes usuárias de anticoncepcional oral, a expressão do p53 foi
positivo em 53,3% das mulheres que não utilizavam anticoncepcional e 35,8% das
64
mulheres que utilizavam o método. Não houve associação estatística significativa
entre p53 e uso de anticoncepcional oral.
5.8 Associação p53 e estadio
O percentual de pacientes em estadio I, II, III e IV, cujos tumores exibiam
positividade do p53 foram 25,8%, 43,3%, 15,8% e 4,2% respectivamente e essa
diferença foi estatisticamente significativa, sendo maior no estadio II.
5.9 Associação p53 e a diferenciação histológica
O percentual das pacientes com tumores com diferenciação histológica em
bem diferenciado, moderadamente e pouco diferenciados, com expressão positiva
do p53 foi respectivamente 23,3%; 43,3% e 22,5%. Porém, não houve diferença
estatisticamente significativa.
A necessidade de compreendermos melhor a etiopatogenia do câncer de colo
uterino e os seus fatores clínicos e prognósticos, tem levado a um crescente número
de pesquisas na biologia molecular, tanto para orientar tratamento adequado assim
como para entender sua evolução.
Existem vários fatores prognósticos, alguns com valores já estabelecidos e
seguros para serem utilizados na rotina clínica. Outros, entretanto, ainda constituem
motivo de controvérsias e estudos. Nos últimos anos têm-se verificado crescente
interesse em marcadores moleculares, mas ainda não se definiu, de forma clara, a
sua utilidade na prática clínica. A superexpressão da proteína p53 em câncer de colo
65
uterino neste estudo foi encontrada numa freqüência de 15 a 50,0%
6,10
, de acordo
com a maioria dos pesquisadores. No presente estudo, o valor encontrado foi
89,2%. Estas discrepâncias talvez possam ser explicadas pelo uso de anticorpos
variados, diferentes critérios leitura, particularidades da técnica e heterogeneidade
da população estudada e ao fato de ter sido considerados os casos possivelmente
HPV positivo.
Neste trabalho, utilizamos o anticorpo monoclonal específico e interpretamos
a expressão da proteína p53 quando mais que 10,0% das células neoplásicas
apresentaram núcleos corados, critérios que estão em concordância com parte dos
autores. Como já exposto, a p53 age como um efetivo supressor de tumor em
células.
A inativação da p53 está associada com o crescimento descontrolado das
células e desenvolvimento do câncer.
66
6 DISCUSSÃO
A detecção de anormalidades do p53 pode ter implicações diagnósticas,
prognosticas e terapêuticas.
Existe um sinergismo dos fatores de risco ditos como clássicos para câncer
cervical com a perda da função do gene supressor de tumor, p53.
A maior incidência de câncer cervical é encontrada no grupo de mulheres com
idade média de 52,2 anos, e a distribuição de casos é bimodial, com picos em 35-39
anos e 60 – 64 anos.
(32)
Em nosso estudo encontramos a média de idade de 46,5 anos, mostrando
uma idade mais precoce de diagnóstico da neoplasia. O p53 esteve positivo mais
frequentemente na faixa etária de 40 a 50 anos, porém sem correlação estatística
significativa.
Várias estatísticas mostram maior número de casos de câncer cervical uterino
nas populações negras e latino-americanas que vivem no território norte-
americano.
(14)
Nosso estudo mostrou uma maior incidência em pacientes brancas
(82,5%) em relação as mulatas (10,8%) e à negra (8,0%), talvez explicada pela
realidade sócio-econômica diferente nestes continentes. Não houve diferença
estatística significativa de positividade do p53 em relação à cor.
A paciente típica com câncer cervical é a mulher multípara.
(10)
Como relatado
na literatura, a multiparidade está associada com câncer de colo uterino, o que foi
confirmado no nosso estudo sendo 77,0% a freqüência de câncer em multíparas
(acima de 3 filhos). Em relação à positividade da expressão do p53, não
encontramos associação estatisticamente significativa.
67
Há evidencias indiretas de que os contraceptivos hormonais promovem
infecção pelo HPV e consequentemente câncer cervical. Dois estudos de caso-
controle da relação entre largo uso de anticoncepcional oral e câncer cervical,
mostraram aumento de 2,0% no risco da neoplasia.
(5)
Do ponto de vista estatístico,
não obtivemos correlação entre p53 e uso de anticoncepcional oral.
Quanto ao tabagismo, a nicotina tem sido encontrada no muco cervical de
mulheres fumantes em concentrações mais altas que no plasma. Esses metabólitos
não são carcinogênicos por si próprios, mas diminuem os mecanismos de defesa
imune locais tais como as células de Langerhans. Estudos de caso-controle
demonstraram aumento aproximado de 2,0% no risco de câncer cervical por
fumantes.
(8)
No nosso estudo não houve correlação significativa quanto a presença
do p53 positivo e tabagismo.
O sistema de estadiamento proposto pela FIGO espelha nitidamente a
evolução da doença e apresenta talvez o melhor fator prognóstico para o câncer
cervical.
(14)
Nosso estudo mostrou o percentual de 43,3% das mulheres em estagio II
da doença e podemos observar correlações estatisticamente significativas entre p53
positivo e estadiamento.
Além do estadiamento, outros fatores são apontados como importantes na
avaliação prognóstica. A graduação histológica tem significação controversa no
prognóstico.
A graduação histológica dos carcinomas epidermóides é barrado no sistema
de Broders que leva em conta a quantidade de ceratinização, pleomorfismo e
atividade mitótica e permite que sejam classificados em: bem diferenciados,
moderadamente diferenciados e pouco diferenciados.
68
Shidu e Cols mostraram maior freqüência de metástases em linfonodos
pélvicos e óbito em pacientes com tumores bem diferenciados, em comparação com
os poucos diferenciados. Por outro lado, Chung e Cols, mostraram que o índice de
metástase em linfonodos pélvicos aumenta com a diferenciação. Yopkin e Cols,
estudando 345 pacientes com carcinoma cervical estadio IB, encontraram sobrevida
de 5 anos em 95,0 % nos tumores bem diferenciados e 82,0% no pouco
diferenciado.
(14)
Quanto á histologia, neste estudo, e no mesmo estudo houve predomínio do
tipo moderadamente diferenciado (49,2%), porém não foi possível o estudo de
sobrevida porque muitas pacientes perderam o seguimento. De nosso estudo só foi
possível concluir que as pacientes em estágios de câncer mais avançados tiveram
um tempo de seguimento menor.
Não houve correlação estatística significativa entre p53 positivo e grau de
diferenciação do tumor.
Após o diagnóstico de câncer cervical invasivo ser estabelecido, a questão é
como melhor tratar a paciente. As medidas terapêuticas específicas são geralmente
dirigidas pela idade e estado geral da paciente, extensão do câncer e pela presença
e natureza de qualquer anormalidade que complique.
(10)
A radioterapia exclusiva no mesmo estudo, foi o tratamento mais utilizada
(52,5%) devido ao diagnóstico da doença em estágios mais avançados, seguindo
pela cirurgia de Wertheim Meigs (24,2%).
Não correlacionamos tais dados a presença do p53 positivo por não
acharmos a correlação de importância.
A expressão alterada do p53, em nosso estudo, foi demonstrada em 89,2%
69
das pacientes, utilizando o método de imunohistoquimica que segundo a literatura
detecta o p53 mutante devido a sua meia vida mais prolongada.
O p53 foi negativo em 10,8% dos casos segundo a literatura da
imunohistoquimica pode indicar estado de p53 tipo selvagem (ou seja, p53 com
função normal) ou p53 inativado resultando da ação de oncogenes virais.
Muitos estudos examinam o valor prognóstico de mutações do p53 em uma
variedade de câncer. Esses dados concluem que pacientes com tumores com
mutações do p53 são piores do que aqueles pacientes sem mutações do p53, em
termos de sobrevida total livre da doença.
Escrevemos esta discussão, reconhecendo que a casuística foi pequena.
Mesmo assim nos possibilitou.
a) aumentar nossos conhecimentos a respeito de alguns fatos prognósticos do
câncer de colo uterino.
b) Desenvolver nosso interesse pela investigação anátomo clínica relacionada à
patologia do colo do útero.
70
7 CONCLUSÕES
Apesar do pequeno número de pacientes estudadas, este trabalho permitiu-
nos as seguintes conclusões:
1- A expressão positiva do p53 está associada com o mau prognóstico das
pacientes com câncer invasivo de colo útero.
2- Os aspectos epidemiológicos, o estadiamento, e as formas de tratamento não se
evidenciaram como fatores prognósticos quando relacionados com a expressão
do p53.
71
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74
ANEXOS
75
Anexo A - Tabela Papanicolau. Comparação entre Sistema Bethesda,
Papanicolaou, Sistema NIC, e Displasia
CLASSES
Papanicolaou
DESCRIÇÃO GRADAÇÃO NIC
2
SISTEMA BETHESDA
1
I Normal Normal Normal
II Atipia reativa / inflamatória
Atipia Normal
II / III Atipia suspeita Atipia ASCUS
II / III Atipia com HPV
Atipia, atipia
condilomatosa ou
coilocitótica
SIL de baixo grau
(LSIL)
III Displasia leve NIC I
SIL de baixo grau
(LSIL)
III Displasia moderada NIC II
SIL de alto grau
(HSIL)
III Displasia acentuada NIC III
SIL de alto grau
(HSIL)
IV Carcinoma in situ NIC III
SIL de alto grau
(HSIL)
V Câncer invasivo Câncer invasivo Câncer invasivo
1
No sistema Bethesda, as lesões cervicais escamosas são divididas em 4 categorias:
Atipia em Células Escamosas de Significado Indeterminado (ASCUS)
Lesão Intraepitelial (SIL) de Baixo Grau (LSIL)
Lesão Intraepitelial (SIL) de Alto Grau (HSIL)
Carcinoma de Células Escamosas
1
No sistema Bethesda, as lesões glandulares são divididas em 6 categorias:
Células endometriais, citologicamente benignas, em mulheres pós menopausa
Atipia em Células Glandulares de Significado Indeterminado (AGUS)
Adenocarcinoma Endocervical
Adenocarcinoma Endometrial
Adenocarcinoma Extrauterino
Adenocarcinoma não especificado
2
No sistema Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC) a classificação é dada pela espessura proporcional do epitélio
cervical com alterações citológicas:
NIC I Crescimento anormal restrito ao terço inferior do epitélio (Displasia Leve)
NIC II Lesão envolvendo entre 1/3 a 2/3 do epitélio a partir da base (Displasia Moderada)
NIC III Lesão envolvendo mais de 2/3 do epitélio (Displasia Acentuada e Carcinoma In Situ)
76
Anexo B - Estadiamento de câncer cervical, FIGO, 1994.
Estagio Descrição
Estagio O Carcinoma-in-situ, carcinoma intraepitelial
Estagio I Carcinoma invasor estritamente confinado a cérvix
Estagio IA
Carcinoma invasor - Invasão estromal de no máximo 5 mm de
profundidade,e até 7 mm de extensão, identificado
microscopicamente (todas as lesões grosseiras, mesmo com
invasão superficial, devem ser colocadas no estagio IB)
Estagio IA1
Invasão estromal ≤ 3,0 mm em profundidade e até 7,0 mm de
extensão
Estagio IA2 Invasão medida do estroma entre 3,0 e 5,0 mm em profundidade e
não mais extensa do que 7,0 mm
Estagio IB Lesões pré-clínicas maiores do que estagio IA ou lesões clinicas
confinadas a cérvix
Estagio IB1 Lesões clinicas de 4,0 cm ou menos em tamanho
Estagio IB2 Lesões clinicas maiores do que 4,0 cm em tamanho
Estagio II Carcinoma extendendo alem da cérvix mas não a parede lateral
pélvica; carcinoma envolve a vagina mas não a terça parte inferior
Estagio IIA Envolvimento dos dois terços superiores da vagina, sem
envolvimento parametrial
Estagio IIB Envolvimento parametrial sem envolvimento da parede pélvica
Estagio III Envolvimento do terço inferior da vagina ou infiltração do
paramétrio até a parede pélvica. Todos os casos com hidronefrose
ou rim não-funcionante devem ser incluídos, a menos que haja
outra causa para tal comprometimento.
Estagio IIIA Envolvimento da terça parte inferior da vagina; sem extensão a
parede pélvica
Estagio IIIB Extensão a parede lateral pélvica e/ou hidronefrose ou não
funcionamento renal
Estagio IV Extensão além do trato genital clinicamente a mucosa da bexiga
ou do reto.
Estagio IVA Avanço de crescimento em órgãos adjacentes, bexiga, reto ou
ambos
Estagio IVB Metástase à distância
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