( PDF ) Características in vitro do espermatozóide canino criopreservado em água de coco

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

Faculdade de Veterinária

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias

Rita de Cássia Soares Cardoso

CARACTERÍSTICAS IN VITRO DO

ESPERMATOZÓIDE CANINO CRIOPRESERVADO

EM ÁGUA DE COCO

Fortaleza - Ceará

Dezembro, 2005

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

Faculdade de Veterinária

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias

Rita de Cássia Soares Cardoso

CARACTERÍSTICAS IN VITRO DO

ESPERMATOZÓIDE CANINO CRIOPRESERVADO

EM ÁGUA DE COCO

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias -

Faculdade de Veterinária da Universidade

Estadual do Ceará, como requisito parcial

para a obtenção do grau de Doutor em

Ciências Veterinárias.

Área: Reprodução e Sanidade Animal

Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Daniel

Machado da Silva

Fortaleza – Ceará

Dezembro, 2005

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Universidade Estadual do Ceará

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias

Título do trabalho: Características in vitro do espermatozóide canino criopreservado

em água de coco

Autor(a): Rita de Cássia Soares Cardoso

Defesa em: 15/12/2005 Conceito obtido: Satisfatório

Nota obtida: 10,0

Banca Examinadora

__________________________________

Prof. Dr. Marcos Antônio Lemos de

Oliveira

Examinador

_____________________________

Prof. Dr. José Fereira Nunes

Examinador

___________________________

Prof. Dra. Maria Denise Lopes

Co-orientadora

___________________________

Profa. Dr. Fabiana Ferreira de

Souza

Examinadora

__________________________________

Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da

Silva

Orientadora

DEDICATÓRIA

Dedico a Deus por tudo o que

representa em minha vida. Por ser a

verdadeira força e abrigo nos

momentos de aflição.

AGRADECIMENTOS

A DEUS por permitir que eu chegasse até aqui, sendo a minha maior fonte

de força nos momentos difíceis. Por ser aquele a me fazer acreditar que tudo o que

acontece na vida tem uma explicação mesmo que eu não a compreenda.

A meus pais por me proporcionarem uma boa educação. Em especial à

minha mãe por sempre pensar em mim em primeiro lugar e na minha felicidade acima

de tudo. Agradeço também por ensinar os valores de uma vida honesta e de ajuda ao

próximo.

À minha orientadora, Profa. Lúcia Daniel Machado da Silva, em primeiro

lugar por ser uma amiga e repassar os seus valores de honestidade, humildade e, ainda

a simplicidade da vida. Agradeço ainda pelos ensinamentos profissionais, preparando-

me inicialmente para ser uma Médica Veterinária e, posteriormente, para orientar

futuros profissionais. E ainda por estar sempre disposta a ajudar e sempre

compreendendo todos os problemas sejam pessoais ou profissionais.

À Profa. Dra. Maria Denise Lopes que proporcionou a realização de parte

do experimento na UNESP-Botucatu, estando sempre disposta a superar qualquer

obstáculo. E ainda, por ser extremamente acolhedora, preocupando-se com nosso bem

estar e fazendo-nos sentir protegidos mesmo estando longe de casa.

À Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza pela valiosíssima colaboração no

experimento, estando sempre disponível não somente para a realização do trabalho,

mas também pelo acolhimento em sua cidade.

À Universidade Estadual do Ceará, em especial ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias nas pessoas dos professores, funcionários e

alunos.

Aos Laboratórios de Fisiologia e Controle da Reprodução, Tecnologia do

Sêmen Caprino e Ovino e MOIFOPA pela concessão no uso de equipamentos para a

realização deste experimento.

À ACP Biotecnologia na pessoa da Dra. Cristiane Clemente de Mello

Salgueiro e do Dr. João Monteiro Gondim pelo fornecimento do diluente ACP

106,

objeto de estudo deste trabalho.

Ao Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia da UNESP-Botucatu, onde agradeço à Direção e professores

pelo uso das instalações, e ainda, aos funcionários pela hospitalidade.

Aos funcionários do Laboratório de Microscopia Eletrônica (Instituto de

Biologia da UNESP-Botucatu) pelo preparo do material e fotodocumentação da

análise ultra-estrutural espermática.

A todos do REPAS (Laboratório de Reprodução de Pequenos Animais e

Silvestres), em especial à doutoranda Viviane Helena Chirinéa, pela valiosa ajuda e

amizade. Agradeço ainda à Profa. Dra. Maria Isabel Melo Martins pela acolhida em

sua residência. À M.Sc. Lilian Rigato Martins pelo auxílio na fotodocumentação dos

resultados do teste de interação espermatozóide-oócito.

À INTERVET pelo fornecimento de água ultra-pura para o preparo dos

diluentes.

À Associação Pró-Carnívoros pela concessão no uso do Dry shipper.

A CAPES, pela concessão da bolsa e ao CNPq pelo apoio finaceiro.

Ao Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo por me levar para o “mundo” da

pesquisa, “mundo” este que eu não quero deixar.

Aos colegas do PPGCV pelo ótimo convívio durante disciplinas e pelos

bons momentos como Marcos Renato Franzosi Mattos, Lucilene Simões Mattos,

Regiane Rodrigues e Ana Carolina Melo.

Aos animais experimentais, que mesmo sem saber, contribuíram de forma

valiosa, e ainda, aos proprietários dos mesmos.

Aos meus cães, Kaue e Tchutchuca, que do modo deles, sabem demonstrar

a sua fidelidade, parecendo entender quando precisamos de um carinho.

Aos companheiros do Laboratório de Reprodução de Carnívoros (LRC):

Janaína de Fátima Saraiva Cardoso, Ana Kelen Felipe Lima, Raimundo Diones

Carneiro, Iran Áquila Maciel, Camila Louise Ackerman, Cristina Vidal, Belarmino

Eugênio Lopes Neto, Daniel Falcão Menezes Brilhante, Áurea Helena Rocha Lima,

Henna Roberta Quintino e Thiago da Silva pelos diversos momentos de alegria e

ajuda. Ao amigo Carlos Gabriel de Almeida Dias, que apesar do pequeno convívio,

percebe-se que é uma pessoa muito especial, que te faz sempre se sentir bem e cuja

amizade vale a pena ser cultivada. Àqueles que fizeram parte do LRC e contribuíram

para a realização deste trabalho como o acadêmico Leonardo Tavernezzi.

Àqueles companheiros de LRC que são também amigos como a doutoranda

Ticiana Franco Pereira da Silva que além de ser uma verdadeira amiga, estando

sempre disposta a ajudar, é uma pessoa com quem se tem prazer de conviver e

trabalhar.

Ao amigo Daniel Couto Uchoa, que além de contribuir na realização do

experimento, é uma pessoa com quem sempre se pode contar.

Ao amigo Alexandre por também contribuir para que eu concluisse mais

esta etapa em minha vida, dividindo não só os bons momentos, mas também os

difíceis. Por estar presente em todas as etapas do experimento e com quem o trabalho

se tornava mais fácil.

À minha amiga Christiane Barreto por todos os momentos de alegria,

recebendo-me em sua casa e fazendo eu me sentir menos sozinha. Por ser uma

verdadeira amiga, pelas conversas, conselhos, risadas, mostrando que a vida deve ser

vivida intensamente.

Ao meu noivo Edilson Soares Lopes Júnior pelo companheirismo,

orientação e ajuda para enfrentar qualquer problema em minha vida. Agradeço ainda

pelo carinho, paciência, dedicação, por me fazer rir quando estou triste e por me

mostrar que não há problema sem solução e, quando não há solução, enfrentá-los e ver

o lado bom. E ainda por seu caráter, mostrando que estamos aqui para ajudar aos

outros, sendo sempre humilde, honesto e verdadeiro com os sentimentos.

RESUMO

A avaliação do sêmen geralmente inclui a análise da motilidade, vigor e

morfologia espermática. Porém para conhecer a extensão dos danos causados à célula

espermática e aperfeiçoar os métodos de criopreservação, é de grande importância a

análise de outros parâmetros. Desta forma, o objetivo geral desta tese foi avaliar in

vitro a eficácia de um diluente à base de água de coco em pó (ACP-106

) na

manutenção da qualidade do sêmen canino pós-descongelação. Por isso, o estudo foi

dividido em quatro etapas. Na primeira etapa, foi realizada uma comparação entre o

método de diluição fixa do sêmen com o de concentração fixa utilizando os diluentes à

base de água de coco in natura (ACIN) e ACP-106

. Na segunda etapa, foi observado

o efeito do armazenamento a -10°C sobre a eficiência do ACP-106

e o efeito da

diluição pós-descongelação. Na terceira e quarta etapas, o sêmen congelado foi

avaliado pelo teste de interação espermatozóide-oócito, análise computadorizada da

motilidade, integridade de membrana e avaliação morfológica pela microscopia

eletrônica de transmissão. O ACP-106

mostrou-se eficiente em comparação com o

ACIN, podendo ser utilizada a diluição 1:1 ou a uma concentração espermática de 200

x 10

espermatozóides/mL. Não houve influência do armazenamento a -10°C sobre a

eficiência do ACP-106

e a diluição pós-descongelação sobre a longevidade

espermática pós-descongelação. O procedimento de congelação-descongelação

utilizando ACP-106

foi eficiente na manutenção do potencial fertilizante do

espermatozóide canino in vitro, mantendo não somente a sua capacidade de de se ligar,

mas também de penetrar na zona pelúcida.

SUMÁRIO

Pág.

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

...................................................

LISTA DE FIGURAS...................................................................................... 15

LISTA DE TABELAS..........................................................................

..............

1. INTRODUÇÃO............................................................................................

REVISÃO DE LITERATURA.......................................................................

3. JUSTIFICATIVA......................................................................................... 49

4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS.......................................................................... 52

OBJETIVOS..................................................................................................

6. CAPÍTULO 1................................................................................................

7. CAPÍTULO 2......................

..........................................................................

8. CAPÍTULO 3................................................................................................

108

9. CAPÍTULO 4.................................................................................................

130

10. DISCUSSÃO GERAL.................................................................................

145

11. CONCLUSÕES.............................................................................

................

160

12. PERSPECTIVAS .................

........................................................................

161

13. REFERÊNCI

AS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................

162

14. ANEXOS ....................................................................................................

188

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

Abreviatura Significado

% Porcentagem

A Acrossoma

ACIN Água de coco in natura

ACP

Água de coco em pó

ACP-106

Diluente para sêmen de carnívoros à base de água

de coco em pó

ALH Amplitude lateral head

BCF Beat cross frequency

BSA Bovine serum albumine (Albumina sérica bovina )

º C Graus Celsius

C1 Concentração inicial

C2 Concentração final

CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de

Nível Superior

CASA Computer Aidded Semen Analysis

CBRA Colégio Brasileiro de Reprodução Animal

C-FDA Diacetato de carboxi-fluoresceína

CLONE Cryogenics Laboratory of New England

cm Centímetros

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico

e Tecnológico

Cool Cooled semen

CTC Clortetraciclina

DMSO Dimetil-sulfóxido

DVM Doctor em Veterinary Medicine

E Equatorial region

Ext Extended semen

FAVET Faculdade de Veterinária

FIG Figura

FMVZ Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

Fr Fresh semen

G Gravidade

GLM General Linear Model

Glyc Glycerolizated semen

HOST Hypoosmotic swelling test (teste hipo-osmótico)

HTR Hamilton Thorne Researcher

IA Inseminação artificial

IAA Ácido 3-indol acético

Km Kilometer

L Litro

Lin Linearity

LRC Laboratório de Reprodução de Carnívoros

LVV Low VAP cutoff

MVV Medium VAP cutoff

min Minutos

mL Mililitros

M.Sc. Master of Science

mOsm Miliosmol

MP Midpiece

NCW In natura coconut water

N Nucleus

OM Outer acrosome membrane

P Probabilidade

PBS Phosphate buffer saline

pH Potencial hidrogeniônico

PI Iodeto de propídio

PCW Powder coconut water

PM Plasma membrane

PNA Peanut Agglutinin

PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências

Veterinárias

PSA Pisum Sativum Agglutinin

r Coeficiente de relação

RA Reação acrossômica

REPAS Laboratório de Reprodução de Pequenos Animais e

Silvestres

ROS Reactive oxigen species (espécies oxigênio

reativas)

s Segundos

SAS Statistical Analysis System

SD Standard deviation

SDS Duodecil sulfato de sódio

SOD

Superoxide dismutase

SQA Semen quality analyzer

STR Straightness

SEM Scanning Electronic Microscopy

SOIA Sperm-oocyte interaction assay

TAB Tabela

TEM Transmission Electronic Microscopy

Thaw Frozen/thawed semen

THOS Teste hiposmótico

TTR Teste de termorresistência

UECE Universidade Estadual do Ceará

UNESP Universidade Estadual Paulista

USA United States of America

V/V Volume / Volume

VV Volume:Volume

V1 Volume inicial

V2 Volume final

VAP Velocity average pathway

VCL Velocity curvilinear

VSL Velocity straight line

µm Micrômetros

ZP Zona pelúcida

LISTA DE FIGURAS

Pág.

CAPÍTULO 1

ARTIGO: Efeito da diluição espermática na congelação de sêmen canino

utilizando-se a água de coco em pó como diluidor (ACP-106

)

FIGURA 1 Percentual de alterações morfológicas do sêmen canino congelado

em ACP-106

a uma concentração de 200 x 10

espermatozóides/mL (ACP CONCENTRAÇÃO) e a uma diluição

constante de 1:1 (ACP DILUIÇÃO). Letras diferentes implicam

em diferença significativa (P< 0,05) entre os métodos de diluição.

FIGURA 2 Percentual de alterações morfológicas primárias e secundárias do

do sêmen canino congelado em ACP-106

a uma concentração de

200 x 10

espermatozóides/mL (ACP CONCENTRAÇÃO) e a

uma diluição constante de 1:1 (ACP DILUIÇÃO). Letras

diferentes implicam em diferença significativa (P< 0,05) entre os

métodos de diluição.

ARTIGO: Use of the powder coconut water (ACP-106

) as an alternative extender

for canine semen freezing

FIGURA 1 Sperm motility of fresh (Fr), extended (Ext), cooled (Cool),

glycerol-supplemented (Glyc) and frozen/thawed (Thaw) semen

extended with fresh/in natura (NCW) or powder coconut water

(ACP-106

- P > 0.05; Student’s t test).

FIGURA 2 Sperm vigor of fresh (Fr), extended (Ext), cooled (Cool), glycerol-

supplemented (Glyc) and frozen/thawed (thaw) semen extended

with fresh/in natura (NCW) or powder coconut water (ACP-106

P > 0.05; Mann-Whitney test).

CAPÍTULO 3

FIGURA 1 Percentage of oocytes bound, penetrated and interacted (bound

and/or penetrated) by canine spermatozoa after freezing/thawing

using ACP-106

(10 replicates).

127

FIGURA 2 Number of canine spermatozoa per oocyte bound, penetrated and

interacted (bound and/or penetrated) to the zona pellucida after

freezing/thawing using ACP-106

(10 replicates).

128

CAPÍTULO 4

FIGURA 1 Transmission electron micrographs of fresh dog spermatozoa. N:

nucleus; A: acrosoma. (a) Fresh spermatozoa presenting an intact

acrosome and a plasmalemma in close apposition with the

acrosome (arrow). Magnification 1950X. (b) Spermatozoon

presenting a swollen plasmalemma but with an intact acrosoma.

Magnification 8400X.

142

FIGURA 2 Transmission electron micrograph of dog spermatozoa after

cryopreservation with ACP-106

. A: acrosoma; N: nucleus; E:

equatorial region. (a) Spermatozoon with a swollen intact plasma

membrane with plicae (arrows). The acrosoma is swollen with an

undulated contour (white arrow head) and vesiculation (black

arrow head). The equatorial region is swollen. Magnification

8400X. (b) Vesiculated plasma membrane (arrows) and releasing

143

of acrosomal contents (arrow heads). Magnification 11500X. (c)

Swollen plasma membrane (black arrow) with areas of

vesiculation (white arrow). Outer acrosoma membrane presents

areas of vesiculation (arrow heads). Equatorial region is intact.

Magnification 8400X.

FIGURA 3 Transmission electron micrograph of dog spermatozoa after

cryopreservation with ACP-106

. A: acrosoma; N: nucleus; E:

equatorial region; PM: plasma membrane; OM: outer acrosome

membrane, MP: midpiece. (a) Swollen and intact plasma

membrane (arrow). The acrosome is disrupted and the contents

are released (arrow heads). Mid-piece presents a plasmalemma

swelling and damages in mitochondrial sheath like content

disorganization. Magnification 6300X. (b) Plasma membrane,

outer (arrow) and inner (arrow heads) acrosome membrane are

swollen and with plicae. Equatorial region is intact.

Magnification 8400X.

144

LISTA DE TABELAS

Pág.

TABELA 1 Classificação morfológica do espermatozóide canino 34

CAPÍTULO 1

ARTIGO: Comparison of two dilution rates on canine semen quality after

cryopreservation in a coconut water extender

TABELA 1 Characteristics of fresh semen collected from six stud dogs

(n=12 ejaculates)

TABELA 2 Sperm motility and vigor during steps of freezing and after

thawing using coconut water extender with two different

dilution rates

TABELA 3 Post-thaw morphology using coconut water extender with two

different dilution rates

ARTIGO Efeito da diluição espermática na congelação de sêmen canino

utilizando-se a água de coco em pó (ACP-106

) como

diluidor

TABELA 1 Média e desvio padrão das características físicas e

morfológicas da fração espermática dos ejaculados caninos

(n=12)

TABELA 2 Média e desvio padrão da motilidade e vigor do sêmen canino

congelado com um diluidor à base de água de coco em pó

(ACP-106

) em dois métodos diferentes de diluição.

ARTIGO Use of the powder coconut water (ACP-106

) as an

alternative extender for canine semen freezing

TABELA 1

Sperm morphology observed in canine fresh and frozen-thawed

semen submitted to extension with fresh/in natura coconut water

(NCW) or powder coconut water (ACP-106

)

CAPÍTULO 2

ARTIGO Effect of storage at –10 °C of the ACP-106

extender and

post-thaw dilution on the quality of frozen canine semen

TABELA 1 Sperm motility (%) of non-stored and frozen-thawed canine

semen using non-stored or stored ACP-106

during

incubation at 37 °C for 120 minutes

105

TABELA 2 Sperm morphology (%) of fresh and frozen-thawed canine

semen using non-stored or stored ACP-106

during

incubation at 37 °C for 60 minutes

106

TABELA 3 Acrosomal status (%) of frozen-thawed canine semen using

non-stored or frozen-rewarmed ACP-106

, under dilution of

one part semen to four parts extender (1:4)

107

CAPÍTULO 3

TABELA 1 Mean ± SD for the sperm quality parameters determined after

freezing/thawing using ACP-106

126

TABELA 2 Relationships between (Simple regression model) data for

sperm-oocyte interaction assay and results from different

sperm parameters (independent variables)

129

1. INTRODUÇÃO

O aumento do interesse por parte dos criadores em incrementar a eficiência

reprodutiva de seus animais tem levado a um maior desenvolvimento na criação de cães.

Neste sentido, a preservação de gametas masculinos é uma valiosa ferramenta, uma vez que a

biotécnica de criopreservação oferece a possibilidade de transportar o sêmen para vários

países, bem como de armazená-lo por um tempo prolongado (Ström, 1999).

O conceito de preservação de sêmen implica na manutenção de sua capacidade

funcional, isto é, na habilidade para produzir ninhadas, o que, necessariamente, envolve a

manutenção da integridade celular espermática, a habilidade em penetrar o oócito e a

competência para suportar o desenvolvimento embrionário (Harrison et al., 1996). Para obter

tal sucesso, é essencial um protocolo de criopreservação que seja eficiente, devendo-se

considerar aspectos relacionados à taxa de resfriamento, método de congelação (vapor de

nitrogênio ou congeladores programáveis), método de estocagem (palhetas ou pellets), taxa de

descongelação bem como diluentes e agentes crioprotetores.

Pela avaliação do sêmen criopreservado tenta-se aperfeiçoar os métodos a fim de

torná-los mais práticos, bem como obter melhores resultados. Foi objetivando não somente

tornar a metodologia mais prática como também criar um produto para ser comercializado,

que foi criada a água de coco em pó, denominada de ACP

. O diluente padrão à base de água

de coco in natura já se mostrou eficiente para a diluição do sêmen de diversas espécies como

caprinos (Nunes e Salgueiro, 1999), suínos (Toniolli e Mesquita, 1990) e caninos (Cardoso et

al., 2003b). No entanto, esta solução não poderia ser armazenada por um longo período.

Para a comercialização de tal diluente, é preciso a comprovação de sua eficiência

para a conservação do sêmen. Infelizmente, não há um único teste in vitro que seja capaz de

mensurar todas essas funções numa amostra de sêmen. Contudo, uma quantificação fidedigna

do total de espermatozóides que possuem estas características, separadamente, pode ser um

importante indicador da capacidade funcional espermática (Amann & Hammerstedt, 1993).

A avaliação padrão do sêmen é, primariamente, baseada em parâmetros físicos.

Contudo, há evidências de que tais parâmetros sozinhos não são suficientes para determinar

um padrão de fertilidade de um ejaculado (Jeyendran et al., 1984). Este tipo de avaliação

também não é suficiente para uma análise do espermatozóide congelado-descongelado, visto

que, os mesmos apresentam uma série de danos que não podem ser detectados nesta análise

convencional. O processo de fertilização envolve uma complexidade de eventos físicos e

bioquímicos que não são mensurados pelos indicadores físicos usados, rotineiramente, nas

avaliações do sêmen (Jeyendran et al., 1984). Neste sentido, uma avaliação mais completa in

vitro e associada com o teste in vivo é de grande importância para se evidenciar o efeito da

criopreservação sobre a qualidade espermática.

2. REVISÃO DE LITERATURA

Histórico da tecnologia da reprodução assistida na espécie canina

A tecnologia da reprodução assistida em cães teve início no século XVIII.

Spallanzani, em 1776 (Watson, 1979), foi o primeiro a registrar que uma diminuição

na temperatura proporcionava uma redução, de forma reversível, na atividade

metabólica do espermatozóide, permitindo assim o seu armazenamento. A primeira

inseminação artificial (IA), cientificamente registrada, foi realizada na espécie canina e

descrita por Spallanzani em 1780 (Seager, 1969).

Foi a partir da descoberta da ação crioprotetora do glicerol por Polge et al.

(1949) que houve um impacto significativo na metodologia de criopreservação de

sêmen. Entretanto, as pesquisas direcionadas para a espécie canina eram raras até bem

pouco tempo, situação esta que vem sendo revertida devido a um interesse cada vez

maior sobre os animais de companhia, com as pesquisas voltadas para os mesmos

aumentando significativamente nos últimos anos (Farstad, 1984; Linde-Forsberg &

Forsberg, 1989).

O primeiro êxito na congelação de sêmen canino foi citado por Rowson

(1954), enquanto Seager (1969) relatou a primeira prenhez resultante de IA com a

utilização de sêmen canino congelado. Desde essa época, diversos foram os estudos

que se investigaram métodos de preservação de espermatozóides caninos pela

congelação, sendo, um dos mais comuns, o descrito por Andersen em 1972. No

entanto, os resultados obtidos após IA com sêmen canino congelado ainda são bastante

heterogêneos (Linde-Forsberg & Forsberg, 1989; England, 1993).

No Brasil, a primeira notificação de sucesso em inseminação artificial (IA)

com sêmen canino congelado foi realizada há pouco mais de 20 anos (Vaske et al.,

1981). Uma segunda gestação oriunda de IA com sêmen canino congelado foi

confirmada por ultra-sonografia em 2000 em um trabalho realizado pelo LRC – UECE

(Silva et al., 2001a), mas os resultados obtidos não foram satisfatórios, uma vez que a

cadela abortou, sendo constatada infecção por Erlichia canis e Leishmania chagasi.

O diluente e seus componentes

Para o sucesso da criopreservação, o diluente é de fundamental importância

a fim de minimizar os danos espermáticos que impliquem na redução da qualidade do

sêmen. Um bom diluente deve proteger os espermatozóides de todos os efeitos críticos

do processo de refrigeração, congelação e descongelação. Este deve conter nutrientes

para o metabolismo espermático, servir como tampão, ajustando as alterações de pH,

promover pressão osmótica compatível com o plasma seminal e conter eletrólitos

dentro dos padrões fisiológicos, além de prevenir o crescimento de bactérias

(Concannon & Battista, 1989).

Existem diferenças na composição lipídica da membrana plasmática do

espermatozóide entre as espécies, raças e ainda entre indivíduos da mesma espécie, o

que pode explicar o maior ou menor efeito protetor de um diluente aos

espermatozóides de um determinado indivíduo (Holt, 2000a).

A composição do diluente é de vital importância para criopreservação do

sêmen e deve ser específica para cada espécie. Foote (1964) foi um dos primeiros

pesquisadores a investigar, sistematicamente, a combinação e a quantidade de vários

componentes dos diluentes para a preservação do sêmen de cão. Diversas substâncias

podem ser adicionadas ao meio diluente a fim de garantir uma maior eficiência. As

mesmas serão descritas a seguir.

Tampões

A atividade metabólica do espermatozóide resulta num acúmulo de íons de

hidrogênio, assim a utilização de um tampão no diluidor é necessária para neutralizar o

pH ácido do meio, evitando a diminuição da motilidade espermática progressiva. Além

disso, o contínuo metabolismo espermático, produzindo como resultado grandes

quantidades de catabólitos tóxicos, acarreta num aumento do ácido lático no meio

extracelular (Pérez & Pérez, 1994 apud Cunha, 2002; Farstad, 1996; Holt, 2000b). O

pH ótimo para o espermatozóide canino varia de 6,5 a 7,0 e a maioria dos diluentes

encontra-se na faixa de 6,9 a 7,1 (England, 1993).

Substâncias de poder tampão tais como o Tris (Tris-hidroximetil

aminometano) e o Tes (N-Tris (hidroximetil) metil 2-amonoetanosulfônico), citrato e

fosfato de sódio têm sido utilizadas na composição de diversos meios diluentes para a

criopreservação de sêmen canino (Silva e Verstegen, 1995; Santos, 1997; Rota et al.,

1998; Cardoso, 2001; Silva, 2001).

Agentes crioprotetores

Os crioprotetores devem ser adicionados ao meio para que haja uma

proteção do espermatozóide durante o equilíbrio, congelação e a descongelação

(Squires et. al., 1999), e esses elementos são importantes para evitar a formação de

grandes cristais de gelo intracelulares (Medeiros et al., 2002). Esses agentes pertencem

a dois grupos: aqueles que penetram nas células como o glicerol, o dimetil sulfóxido

(DMSO) e o metanol; e aqueles que permanecem no meio extracelular como as

proteínas, os açúcares e a polivinil pirrolidona (England, 1993).

O glicerol (CH

; propanotriol - (1, 2 ,3); a, ß, ?, Trioxipropano), um

álcool polihídrico, altamente permeável, é o crioprotetor mais empregado na

congelação do sêmen de diferentes espécies (Storey et al., 1996). A sua habilidade em

transpor a membrana celular permite a desidratação da célula pela saída de água por

osmose (Hammerstedt et al., 1990).

A concentração ótima de de qualquer agente crioprotetor depende de

diversos fatores como diluente, espécie animal e, ainda, a velocidade de congelação,

onde velocidades de congelação mais rápidas requerem baixas concentrações do

crioprotetor (England, 1993). Para a congelação do sêmen do cão, as concentrações

têm variado de 4 a 11% (v/v), dependendo da composição do diluente e do tampão

utilizado. A concentração ótima de glicerol deve permitir uma superioridade dos seus

efeitos protetores sobre os seus efeitos tóxicos (Watson, 1979). Terhaer (1993) afirma

que o espermatozóide canino é bastante tolerante ao glicerol (apud Rodrigues, 1997).

Contudo, altas concentrações podem afetar sua capacidade fertilizante (Neville et al.,

1970).

Gema de ovo

A adição de protetores de resfriamento é necessária para a preservação dos

espermatozóides durante o choque térmico, bem como durante a congelação e

descongelação (Farstad, 1996). A gema de ovo é o componente de origem biológica

mais, largamente, utilizado na composição de diluentes para o sêmen e tem sido

utilizada, rotineiramente, como protetor de resfriamento do espermatozóide canino

(Oliveira, 2003).

A interação entre os fosfolipídeos presentes no sêmen e os componentes

lipoprotéicos da gema possibilita a aderência das lipoproteínas à membrana plasmática

do espermatozóide, conferindo-lhe proteção durante a criopreservação. Além disso, a

gema de ovo previne a rotação da cauda do espermatozóide, favorecendo sua

motilidade (Holt, 2000b). A sua concentração requerida pode diferir de acordo com a

espécie, sendo empregada em concentrações que variam de 3 a 25% (v/v - Watson,

1979).

Açúcares

Os açúcares são incluídos nos diluentes seminais como substratos

energéticos exógenos, como componentes osmóticos e como agentes crioprotetores

(Watson, 1979). A maioria dos diluentes utilizados na criopreservação do sêmen

canino contém glicose e/ou frutose (Silva et al., 1996; Hay et al., 1997; Rota, 1998;

Chirinéa et al. 2003).

Investigações iniciais sobre o metabolismo energético do sêmen fresco de

cães incubados em glicose ou frutose, indicaram que a frutose é mais eficiente que a

glicose na obtenção de níveis energéticos (Rigau et al., 2000 apud Chirinéa, 2004 )

Aditivos

Atualmente, componentes aditivos como detergentes, antioxidantes e

aminoácidos, têm sido adicionados ao meio diluente (Oliveira, 2003). A adição de

diferentes compostos detergentes, como o Equex STM paste ou Orvus ES paste, em

diluentes de congelação parece ser benéfica para várias espécies, incluindo a canina

(Rota et al., 1997; 1999a; Holt 2000a; Peña & Linde-Forsberg, 2000a).

Espécies reativas ao oxigênio (H

; O

, - OH, ROOH) e os antioxidantes

têm demonstrado um importante papel na fertilidade e na infertilidade. Algumas

evidências diretas ou indiretas levam a crer que em vários momentos da

criopreservação do sêmen estas espécies são formadas. O controle do nível das

espécies reativas de oxigênio pela inclusão de antioxidantes ou pelo uso de condições

que reduzam a oxidação durante a congelação tem sido descrito (Bilodeau et al.,

2001). Vários aminoácidos, entre eles a glicina, têm sido incluídos na preservação do

sêmen (Bilodeau et al., 2001). De acordo com Papa et al. (1993 apud Cunha, 2002) a

ação da glicina ainda não está totalmente esclarecida, mas sabe-se, que esse

aminoácido participa na síntese de enzimas antioxidantes (Gluthation Peroxidase),

inibindo a formação de radicais livres e, conseqüentemente, protegendo a membrana

celular da oxidação.

Antibióticos

A contaminação bacteriana pode afetar negativamente a fertilidade, pela

própria presença das bactérias, pela produção de toxinas, por degradação dos

componentes do meio, ou ainda, pela utilização de substratos metabólicos. Essa

situação determina a necessidade de incorporar aos diluentes substâncias de efeito

antimicrobiano (Watson, 1990).

A maioria dos pesquisadores da atualidade emprega a benzilpenicilina

associada à diidroestreptomicina ou estreptomicina na composição dos diluentes do

sêmen canino (Rota et al., 1999a; Peña & Linde-Forsberg, 2000b; Iguer-Ouada &

Verstegen, 2001a). Entretanto, outros antibióticos já foram utilizados, com sucesso,

como a amicacina (Chirinéa, 2004).

Diluentes utilizados na criopreservação de sêmen canino

A adaptação dos diluentes na preservação de espermatozóides do cão

ocorreu de forma empírica, baseando-se naqueles empregados no resfriamento e

congelação do sêmen de outras espécies (Farstad, 1996). Pesquisas foram realizadas

utilizando leite desnatado (Santos, 1997), glicina-gema (Santos, 1997; Cunha & Lopes,

2001), lactose-gema (Olar et al., 1989) e o tampão TRIS (Ström et al., 1997; Silva et

al., 2003, Silva et al., 2006).

Além disso, outros diluentes têm sido desenvolvidos por empresas. Estão

disponíveis comercialmente: o Triladyl (Minitub, Tyefenbach, Alemanha) o qual foi

testado por Nothling et al.. (1995); Laiciphos 478 e Biociphos W482 (IMV, França),

testado por Silva & Verstegen (1995); e o CLONE (Cryogenic Laboratories of New

England, Inc), utilizado por Ström et al. (1997). No estado do Ceará, já foi testado um

diluente à base de água de coco para a congelação de sêmen canino, que foi

originariamente desenvolvido para a conservação de sêmen de caprinos (Salles &

Nunes, 1992) e se mostrou eficiente para a conservação de sêmen canino (Cardoso et

al., 2003b, 2005).

A água de coco

A água proveniente do fruto do coqueiro Cocos nucifera L. (membro da

família Palmae) é uma solução estéril, ligeiramente ácida, contendo proteínas, sais,

açúcares, vitaminas, fatores de crescimento (fitormônios) e muito pouco fosfolipídeo

(Laguna, 1996). O coco verde apresenta cerca de 400 mL de água que contém

propriedades nutritivas, sendo considerada como um repositor de sais e algumas de

suas aplicações terapêuticas, é a utilização, na forma de soro oral ou intravenoso, em

casos de cólera, problemas intestinais e estomacais (Jayalekshmy et al., 1984, Maciel

et al., 1992 - apud Magalhães et al., 2005).

A água de coco contém ainda outros compostos que mostram atividades

semelhantes àquelas das citocininas e que são derivados das purinas (difeniluréia),

possuindo atividades biológicas consideradas excelentes para as células (Nunes &

Salgueiro, 1999). O isolamento da citocinina na água de coco foi realizado por Letham

(1974 apud Nunes & Combarnous, 1995). Depois de várias pesquisas, verificou-se que

a auxina principal era o ácido 3-indol-acético (Letham, 1974 apud Nunes

&Combarnous, 1995). Nunes & Combarnous (1995) também isolaram essa substância

na água de coco, verificando que a mesma apresentava uma ação benéfica sobre a

motilidade do sêmen de caprinos e ovinos incubado a 37 ?C.

A água de coco sofre mudanças na sua composição durante o

desenvolvimento do fruto. Além do grau de maturação, outros fatores como variedade,

região e época do ano também têm influência sobre as suas características físico-

químicas (Jayalekshmy et al., 1984, Maciel et al., 1992 - apud Magalhães et al., 2005).

Os açúcares, no início da maturação, encontram-se sob a forma de redutores (glicose e

frutose), próximo ao 6° e 7° mês, alcançando níveis máximos de 5%. Com a

maturação do fruto, a concentração de açúcares redutores diminui em até 1%, porém

são formados os não redutores (sacarose), sendo, ao final da maturação, o teor de

açúcares totais de, aproximadamente, 2% (Campos et al., 1996, Jayalekshmy et al.,

1984 - apud Magalhães et al., 2005).

A água de coco in natura proveniente de frutos com idade de seis meses

(variedade verde da praia) apresenta uma osmolaridade em torno de 500 mOsmol/L e

um pH de 4,5 a 5,0 (Nunes & Combarnous, 1995). Para uma perfeita compatibilização

da água de coco in natura como diluente para o sêmen canino, deve ser feita uma

correção da osmolaridade para 300-310 mOsmol/L e do pH para 6,2 a 6,6 (Silva,

1999). Para tal correção, após filtrar a água de coco, adiciona-se água destilada e uma

solução de citrato de sódio a 5% (Nunes, 1995).

A solução citada anteriormente já foi utilizada com eficiência na congelação

de sêmen canino (Cardoso et al., 2003b). Testando-se alguns outros protocolos,

observaram-se melhores resultados (aproximadamente 50% de espermatozóides

móveis) utilizando a solução citada anteriormente contendo 20% de gema de ovo e 6%

de glicerol.

Apesar da água de coco ser um diluente eficiente na conservação do sêmen

de diversas espécies, era necessário preparar a solução para cada utilização. Foi

observado que acima de dois dias, havia um aumento de osmolaridade e diminuição do

pH (dados não publicados) no diluente à base de água de coco, o que prejudicava a sua

utilização para a congelação de sêmen canino, não estando dentro dos padrões

fisiológicos para a espécie.

Devido aos excelentes resultados obtidos com os primeiros estudos com a

água de coco in natura na conservação, principalmente, de células espermáticas

realizados pelo pesquisador José Ferreira Nunes durante as décadas de 80 e 90, levou

à elaboração de um produto genuinamente nordestino, o meio de conservação à base

de água de coco em pó (ACP

). Para a produção do ACP

, inicialmente, obtém-se o

fruto (coco) numa sequência de procedimentos iniciada pela rigorosa seleção e

higienização do produto, seguida de colheita do líquido endospérmico do coco (água

de coco) sob forma asséptica. Então dese ser realizada a filtração e o líquido é

bombeado sem intermitência e de forma contínua para o sistema de secagem. A

amostra seca é transformada em pó fino e uniforme, amorfo, destituído de água livre,

com alta solubilidade (Nunes et al., 2005). A uniformidade do produto, obtida

mediante rigoroso controle de processamento, em condições específicas, leva à

manutenção dos valores agregados do endosperma líquido do coco (Nunes et al.,

2005).

Tal produto foi registrado como ACP

(ACP Biotecnologia

, Fortaleza -

Ceará, Brasil). A água de coco em pó, após reconstituição, foi testada para a

refrigeração do sêmen de eqüinos (Sampaio-Neto et al., 2002), e diluição para

inseminação artificial em caprinos (Salgueiro et al., 2002). No entanto, outras

utilizações para o ACP

estão em fase experimental como: meio diluente para vacinas

virais animais, meio de conservação e criopreservação de órgãos para transplante,

meios de cultivo de microrganismos (fungos, bactérias, vírus), protozoários e insetos,

bebidas isotônicas, repositores energéticos, alimentos funcionais, produtos nutricionais

para pacientes hospitalares, dentre outros (Nunes et al., 2005).

Métodos de avaliação da qualidade espermática

Métodos in vitro mais utilizados

A alta taxa de fertilidade é o objetivo principal quando se trabalha com

criopreservação de sêmen. Contudo, testes de fertilidade, além de apresentarem um

alto custo, têm a desvantagem de mostrar baixa confiabilidade se poucos animais são

usados (Woelders, 1991; Rota et al., 1999a). As análises in vitro têm a vantagem de

mostrar quais aspectos da função espermática estão prejudicados ou intactos, sendo

isso de especial interesse ao se trabalhar com o aprimoramento de técnicas de

preservação de sêmen, bem como para a pesquisa fundamental. Várias técnicas in vitro

têm sido descritas para a avaliação de sêmen. A combinação de diferentes métodos de

avaliação fornece um resultado mais confiável do que um único teste quando se deseja

prever a fertilidade in vivo (Ström, 1999). Entretanto, rotineiramente, usa-se o método

de avaliação clássica que inclui basicamente a análise da motilidade, vigor e

morfologia espermáticos. A seguir, serão descritos alguns dos diversos métodos que

podem ser usados para se avaliar o sucesso da criopreservação de sêmen canino.

Motilidade espermática

Há muito tempo, o parâmetro mais, rotineiramente, utilizado para a

avaliação do sêmen é a motilidade espermática. A proporção de espermatozóides

exibindo uma motilidade progressiva é, geralmente, estimada subjetivamente em

microscópio óptico (Cardoso et al., 2003), de contraste de fase (Peña & Linde-

Forsberg, 2000a) ou, mais objetivamente, utilizando-se a análise computadorizada

(Iguer-Ouada & Verstegen, 2001). Este parâmetro é utilizado na avaliação do sêmen

congelado-descongelado, para a verificação da proporção de espermatozóides que

mantiveram a motilidade após o processo de criopreservação (Ström, 1999). Seager &

Fletcher (1972) ressaltam que a avaliação da motilidade espermática é a observação da

porcentagem de espermatozóides móveis da amostra, a qual deve ser avaliada

imediatamente após a colheita ou descongelação do sêmen. Em seguida, pode-se

avaliar o vigor espermático, que é a qualidade da motilidade exibida pelos

espermatozóides móveis. Para tanto, faz-se uso de uma escala compreendida numa

faixa de 0 a 5, cujas classificações variam de autor para autor (Platz & Seager, 1977;

Christiansen, 1988; Johnston et al., 2001)

A avaliação da motilidade pode ser prejudicada pela concentração

espermática, fato relatado por Cardoso et al. (2005) e Garner et al. (2001), onde estes

últimos autores descrevem a dificuldade na avaliação em amostras com baixas

concentrações espermáticas. Além disso, a viscosidade nos meios de criopreservação,

principalmente, devido à gema de ovo, também prejudica a motilidade (Hirai et al.,

1997), o que pode levar a subestimar este parâmetro.

Já foi demonstrado que tanto nos ejaculados a fresco (Casey et al., 1993),

como nos congelados (Januskauskas et al., 1996), há uma proporção de

espermatozóides que são viáveis mesmo estando imóveis, podendo adquirir motilidade

após estimulação com cafeína (Larsson et al., 1976). Portanto, a avaliação da

motilidade não pode ser usada como uma mensuração dos espermatozóides vivos e

mortos, mas fornece a informação de um fator que é necessário para a capacidade

fertilizante do espermatozóide, pois é a manifestação da sua competência estrutural e

funcional (Peña Martinez, 2004). Embora a motilidade esteja, geralmente,

correlacionada com integridade de membrana plasmática (Kumi-Diaka, 1993) e com a

morfologia (Ellington et al., 1993), relatos de correlações entre motilidade espermática

e fertilidade ainda são conflitantes (Kjaestad et al., 1993; Sanchez-Partida et al., 1999).

Morfologia espermática

A morfologia espermática é um parâmetro indispensável na avaliação

seminal, pois está intrínsecamente implicada a problemas na fertilidade tanto na

espécie canina como em outras espécies animais (Oettlé, 1993). No entanto, até o

momento, ainda não foi descrita a evidência de uma relação entre a morfologia

espermática e a fertilidade no cão. Os poucos trabalhos que evidenciam uma possível

relação ainda são conflitantes (Oettlé & Soley, 1985; Renton et al., 1986; Oettlé,

1993). Oettlé (1993) relata que à medida que se aumenta o percentual de

espermatozóides anormais, a fertilidade é reduzida, sendo que quando a proporção de

espermatozóides morfologicamente normais está abaixo de 60%, a fertilidade é

adversamente afetada.

Vários métodos têm sido desenvolvidos para avaliar a morfologia da célula

espermática. Esfregaços úmidos de sêmen podem ser examinados por microscopia de

contraste de fase após fixação com glutaraldeído ou tampão salina formolizada para

proteger a célula e realizar observação futura (CBRA, 1998). A morfologia também

pode ser avaliada, microscopicamente, após coloração com os corantes Wright, Rosa

de Bengala, Diff-Quik e Spermac

(Purswell et al., 1992; Oettlé & Soley, 1985),

Giemsa (Cardoso et al., 2003b), Hematoxilina-eosina (Silva et al., 2003) e eosina-

nigrosina (Peña, 2000). Após a coloração, as células espermáticas devem ser

examinadas, preferencialmente, a uma magnificação de 1000X, sob óleo de imersão e,

geralmente, um mínimo de 100 células é avaliado. Existem alguns métodos de

classificação das alterações morfológicas, nos quais um deles consiste na divisão em

alterações primárias e secundárias (Johnston et al., 2001). As alterações primárias

resultam da espermatogênese anormal, causando anormalidades na cabeça

(microcefalia, macrocefalia), peça intermediária (espessa, dupla, enrugada) e cauda

(dupla). As alterações secundárias podem resultar tanto de problemas na maturação

espermática ou no manuseio da amostra seminal (temperatura inadequada, esfregaço

mal confeccionado). Da mesma forma que para as primárias, as secundárias podem

estar presentes na cabeça (destacada), peça intermediária (quebrada) e cauda (enrolada,

quebrada) (Feldman & Nelson, 1996). As alterações secundárias podem representar

uma resposta transitória ao estresse e são consideradas menos prejudiciais à fertilidade

do que as primárias. Entretanto, uma alta proporção de espermatozóides apresentando

peça-intermediária reversa ou mesmo cauda enrolada ou quebrada, irá comprometer a

motilidade e a fertilidade (Peña Martinez, 2004). Existem outros métodos de

classificação das alterações, como por exemplo, a divisão em defeitos maiores e

menores e ainda a divisão quanto à região do espermatozóide em que está situada a

alteração, ou seja, cabeça, peça intermediária e cauda. Os defeitos maiores são àqueles

que podem ter um efeito negativo maior na fertilidade, diferentemente dos menores.

Oettlé (1993) descreve a união dessas duas últimas categorias, nas quais para cada

região da célula espermática, os defeitos são agrupados em maiores e menores como

mostrados na tabela 1.

Tabela 1. Classificação morfológica do espermatozóide canino *

CABEÇA PEÇA

INTERMEDIÁRIA

CAUDA ACROSSSOMA

MAIORES

Macrocefalia

Microcefalia

Piriforme

Cabeça dupla

Gota citoplasmática

Quebrada

Cauda dupla

Vacúolos

Distribuição

anormal

MENORES

Cabeça destacada

Descondensação

nuclear

Gota citoplasmática

distal

Enrolada

Quebrada

Reação

acrossômica

Edema

* Adaptado de Oettlé (1993)

Ao se desenvolver novos protocolos para a criopreservação, uma avaliação

ultraestrutural das células espermáticas deve ser realizada para assegurar que os

ejaculados com uma alta proporção de espermatozóides morfologicamente normais

seja usada. Contudo, certas alterações estruturais não são geralmente causadas pela

preservação (Watson, 1979); dessa forma, outras análises devem ser realizadas para se

avaliar o processo de criopreservação.

Capacitação

O espermatozóide necessita sofrer uma série de reações na membrana

plasmática durante a permanência no trato genital feminino, conhecida como

capacitação, para ser capaz de fertilizar o oócito (Petrunkina et al., 2003).

Em cães, algumas substâncias têm sido descritas para a avaliação do status

de capacitação como, por exemplo, a clortetraciclina (CTC), lectinas e ainda, a

mensuração das características de motilidade pela análise computadorizada, sendo

indicativo de capacitação ou hiperativação (Rota et al., 1999b).

Recentemente, o termo criocapacitação tem sido introduzido para explicar o

fato de que os procedimentos de criporeservação induzem alterações similares a da

capacitação no espermatozóide (Cormier & Bailey, 2003). Estas similaridades entre o

espermatozóide capacitado e o criopreservado consistem em alterações na

reorganização, fluidez e influxo de cálcio através da membrana plasmática (Green &

Watson, 2001). Esta criocapacitação é, em parte, responsável pela redução na

longevidade e fertilidade do espermatozóide congelado-descongelado (Peña Martínez,

2004).

Morfologia acrossomal

O acrossoma é uma vesícula contendo várias enzimas hidrolíticas incluindo

pró-acrosina, hialuronidase, esterases e hidrolases ácidas, envolvidas no processo de

fecundação (Garner & Hafez, 1995), desempenhando um papel crucial na função

espermática. Após o espermatozóide ter sofrido reação acrossômica (RA), que consiste

na fusão da membrana plasmática com a membrana acrossomal externa, ocorre a

vesiculação e liberação de enzimas acrossomais que auxiliam na penetração da zona

pelúcida (Eilts, 2005). As mudanças físicas da RA após criopreservação são

indicativas de que o espermatozóide não pode mais fertilizar, embora ainda possa estar

móvel (Eilts, 2005).

O acrossoma do espermatozóide congelado-descongelado, frequëntemente,

apresenta alterações morfológicas (Watson, 1990). Portanto, a análise acrossomal pode

ser considerada um parâmetro de grande utilidade ao se avaliar os métodos de

criopreservação.

A microscopia eletrônica de transmissão permite um exame detalhado do

acrossoma, mas é laboriosa e consome muito tempo. O acrossoma do espermatozóide

canino pode ser avaliado mais rapidamente e, facilmente, utilizando-se a microscopia

óptica em esfregaços corados com eosina nigrosina (Oettlé, 1986, Peña et al., 1998a),

Giemsa (Dahlbom et al., 1997) Rosa de bengala/Azul de Tripan/Marrom de Bismarck

(Talbot & Chacon, 1981) e Spermac

(Oéttle, 1993, Ström et al., 1997).

Recentemente, dois métodos têm sido desenvolvidos para avaliação

acrossomal utilizando-se microscopia de fluorescência (Peña, 1997, Hewitt &

England, 1998; Rota et al., 1999b). No primeiro método, detecta-se o material

intracelular associado ao acrossoma e, conseqüentemente, requer a permeabilização

das células antes de marcá-las. No segundo método, as células não precisam ser

permeabilizadas. Na primeira categoria, utiliza-se lectinas marcadoras, anticorpos

intracelulares, antígenos intracelulares e antígenos acrossomais. Na segunda, utiliza-se

as clortetraciclinas (CTC) e os anticorpos externos (Peña, 1997, Peña Martínez, 2004).

As lectinas mais utilizadas são: Pisum Sativum Agglutinin (PSA) e Peanut Agglutinin

(aglutinina do amendoim) (PNA), que se ligam ao conteúdo acrossomal (Rijsselaere et

al., 2005). Estas aglutininas podem ser usadas em associação com corantes

fluorescentes como Hoechst 33258 e carboxifluoresceína/iodeto de propídio

(Rijsselaere et al., 2005). A vantagem dos corantes fluorescentes consiste no fato de

não ser preciso a remoção do meio de criopreservação uma vez que não há a

interferência de glóbulos de gordura ou de outro material não corado (Peña et al.,

1998b).

Outro método já descrito para a avaliação acrossomal é a quantificação da

liberação de enzimas acrossomais, como por exemplo, a acrosina, para avaliar,

indiretamente, a integridade acrossomal do espermatozóide canino (Froman et al.,

1984). A imunoflorescência indireta usando anticorpos monoclonais e policlonais e

CTC também foi utilizada para a avaliação do status acrossomal (Brewis et al., 2001).

Citometria de fluxo

O uso do método de citometria de fluxo para avaliação da integridade da

membrana espermática e do acrossoma do espermatozóide canino pode facilitar o

aperfeiçoamento e desenvolvimento de novos protocolos de criopreservação e permitir

uma comparação precisa entre diferentes métodos de criopreservação, uma vez que a

citometria de fluxo permite uma análise mais acurada do que as convencionais (Peña,

2000).

A citometria de fluxo é um método objetivo e acurado para a análise de

células espermáticas utilizando corantes fluorescentes e não utilizando fixadores. Esse

método permite uma avaliação de múltiplas características, simultaneamente, na

mesma amostra por um sistema de coloração dupla ou tripla. Além disso, dados de

milhares de células podem ser obtidos num curto espaço de tempo, no qual não

somente a morfologia geral do espermatozóide canino, bem como a integridade de

organelas específicas pode ser analisada (Peña et al., 1998b). Peña et al. (2001)

observaram uma correlação alta (90%) e significativa (P< 0,001) entre a análise por

fluxo citométrico e a microscopia de fluorescência para avaliar a integridade da

membrana. Além disso, o primeiro método mostrou-se superior em determinar o

percentual de espermatozóides com acrossoma danificado, provavelmente, por analisar

um número maior de células.

A base da citometria de fluxo depende da excitação e emissão de

fluorescência das células que foram coradas com corantes fluorescentes. As células

espermáticas são carreadas num fluxo de circulação rápida por meio de raios laser que

estimulam o corante (Garner et al., 1986). A luz emitida pelas células pode ser

refletida por espelhos e as cores vermelha e verde podem ser mensuradas,

individualmente, nas células (Garner et al., 1986).

A citometria de fluxo aplicada ao estudo do espermatozóide canino oferece

uma vantagem significativa para a pesquisa, já que fornece informações sobre a

viabilidade e outras características celulares de forma rápida para um grande número

de células. As técnicas microscópicas para repetidas avaliações são mais laboriosas e

consomem mais tempo e, geralmente, não mais do que 200 espermatozóides são

contados (Peña et al., 1998b).

Termorresistência (TTR)

A avaliação da longevidade dos espermatozóides in vitro pode ser realizada

pelo teste de termorresistência (TTR). A manutenção do sêmen à temperatura

semelhante à corporal mimetiza, parcialmente, a situação in vivo e, repetidas

observações da viabilidade e integridade acrossômica, durante a incubação, têm sido

realizadas para avaliar a longevidade espermática (Ström, 1999).

Uchoa et al. (2002) observaram que o sêmen canino a fresco apresenta uma

boa termorresistência, uma vez que o mesmo pode ser conservado por 180 minutos a

37?C após diluição em solução à base de água de coco. No entanto, Ström et al. (1997)

acreditam que a termorresistência pós-descongelação pode ser mais baixa para o

espermatozóide canino do que para outras espécies. Concannon e Battista (1989)

sugerem que o TTR deve ser usado mais, freqüentemente, para avaliar as técnicas de

congelação. Por outro lado, também tem sido questionado se ao avaliar-se a

capacidade fecundante do espermatozóide canino, a motilidade imediatamente após a

descongelação pode ser mais importante do que sua sobrevivência após incubação

(Olar, 1984).

Ström et al. (1997) observaram que o espermatozóide canino mesmo com

uma baixa termorresistência não tem, necessariamente, um baixo potencial fertilizante,

visto que o sêmen congelado com o método CLONE apresentou uma baixa

termorresistência e mostrou altos índices de fertilidade após inseminação vaginal

(59,3%) e intra-uterina (86,4%) (Govette et al., 1996). Portanto, devido aos resultados

divergentes a respeito de uma possível correlação entre o TTR e a fertilidade na

espécie canina, ainda não é possível sugerir a aplicação desse teste como um

parâmetro confiável na avaliação do sêmen canino.

Teste hiposmótico

O teste hiposmótico (THOS) avalia a integridade funcional da membrana

espermática (Spittaler & Tyler, 1985), sendo essa importante para o metabolismo

espermático. Essa análise é um teste de endosmose que determina as mudanças na

membrana espermática, onde o transporte através dessa é um processo bioquímico

importante para a viabilidade espermática e capacidade fertilizante (Jeyendran et al.,

1984).

No espermatozóide canino, o choque hiposmótico induz um progressivo

destacamento do acrossoma, cuja membrana é uma estrutura muito lábil que pode ser

alterada por processos como a congelação, descongelação, resfriamento e diluição para

inseminação artificial (Oettlé, 1986). England & Plummer (1993) verificaram existir

uma correlação negativa entre a osmolaridade e a porcentagem de espermatozóides

caninos edemaciados em soluções aquosas hiposmóticas à base de sacarose, frutose e

citrato de sódio. Além disso, esses pesquisadores demonstraram não existir correlação

entre a porcentagem de espermatozóides edemaciados e outros parâmetros seminais,

tais como a motilidade, morfologia e porcentagem entre vivos e mortos. Inamassu et

al. (1999) observaram existir no sêmen canino fresco uma correlação positiva entre a

turgidez espermática em resposta ao teste hiposmótico e a morfologia espermática. A

edemaciação em resposta ao HOST já foi positivamente correlacionada com a

motilidade espermática (Kumi-Diaka, 1993), com a motilidade e a viabilidade

(Rodríguez-Gil et al., 1994), mas não foi encontrada correlação alguma com

motilidade, morfologia e viabilidade por England e Plummer (1993). Uma relação

entre o HOST e a capacidade fertilizante do espermatozóide canino ainda não foi

observada.

Avaliação ultra-estrutural por microscopia eletrônica

Uma membrana plasmática intacta é um pré-requisito para a função

espermática normal, incluindo a fertilização (Ström, 1999). Durante o processo de

criopreservação, a membrana plasmática pode ser destruída pela transição de lipídios,

saída de água, estresse mecânico, soluções hipertônicas e, possivelmente, cristais de

gelo (Woelders, 1991). Entretanto, todos esses danos que o espermatozóide sofre ainda

não são bem descritos para os cães (Rodriguez-Martinez et al., 1993).

É muito difícil detectar os danos celulares associados com a criopreservação

(Hammerstedt et al., 1990). Microanálises pelo raio-X permitem a localização

quantitativa dos elementos celulares na microscopia eletrônica (Rodriguez-Martinez &

Ekwall, 1989). A integridade da membrana plasmática e acrossoma do espermatozóide

humano congelado, avaliado pela microscopia eletrônica, tem mostrado ser

positivamente correlacionada com a fertilidade, utilizando-se a inseminação artificial

(Mahadevan & Trounson, 1984).

Utilizando esse método, Rodriguez-Martinez et al. (1993) observaram que o

espermatozóide canino descongelado apresenta um alto grau de danos acrossômicos,

incluindo perda do conteúdo, rarefação e edemaciação do acrossoma, perda de

material acrossômico eletro-denso e vesiculação da membrana acrossomal. Porém,

verificaram que o plasmalema, aparentemente, permanecia intacto na maioria dos

casos. Esses autores sugeriram que tal fato poderia ser a razão para a baixa

porcentagem de anormalidades acrossômicas normalmente notificadas quando se

utilizava a microscopia de contraste de fase.

Análise espermática computadorizada (CASA)

A análise espermática computadorizada (CASA) tem sido desenvolvida e

está continuamente sendo aperfeiçoada desde que foi introduzida no início dos anos 80

(Amann & Hammerstedt, 1980). Günzel-Apel et al. (1993) foram os primeiros a

descrever a análise do sêmen canino com a CASA. Posteriormente, outros autores (Ohl

et al., 1994; Rawlings et al., 1994) relataram o uso de sistemas de CASA nesta espécie.

Atualmente, a análise computadorizada é largamente utilizada em humanos e seu uso

já está sendo proposto para as espécies animais (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b) na

prática clínica e em atividades de pesquisa.

A CASA permite uma avaliação objetiva e precisa não somente sobre a

proporção de células móveis em uma amostra de sêmen, mas também sobre a

qualidade do movimento das mesmas. As trajetórias do espermatozóide são

individualmente determinadas pela função flagelar, nos quais características como

velocidade, freqüência de batimento flagelar e amplitude irão, corretamente, refletir a

condição fisiológica de cada célula (Peña, 2000). Os dados obtidos através desse

método correspondem a centenas de mensurações espermáticas individuais,

fornecendo informações sobre a qualidade média da motilidade em uma amostra de

sêmen (Günzel-apel et al., 1993) e também sobre diferentes subpopulações

espermáticas coexistindo na amostra (Peña Martínez, 2004). Foi observado que

algumas características do movimento espermático avaliadas pela CASA podem

estimar a fertilidade in vivo e in vitro em humanos e touros (Tardif et al., 1998, Larsen

et al., 2000). Contudo, estudos similares objetivando estimar a fertilidade em cães não

foram realizados.

A CASA também foi descrita para a determinação da morfometria e tem

mostrado acurácia quando a técnica é padronizada (Rijsselaere et al., 2004). Contudo,

não há informação sobre a análise morfométrica do espermatozóide canino congelado-

descongelado (Eilts, 2005).

Utilizando o sistema de videomicrografia Cellsoft e analisador de

movimento celular Strömberg-Mika, Günzel-Apel et al. (1993) encontraram uma

significativa correlação entre os parâmetros mensurados subjetivamente e aqueles

obtidos com o uso da CASA. O Hamilton Thorne analyzer Ivos.10 (HTR-IVOS10) é

um recente sistema de análise computadorizada proposto para avaliação de sêmen

humano (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b) e também está sendo utilizado em algumas

espécies animais ao redor do mundo (Farrell et al., 1995; Abaigar et al., 1999). Na

espécie canina, o HTR foi utilizado para a descrição da motilidade em ejaculados de

cães da raça Beagle (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b), mostrando uma variabilidade

abaixo de 10%. O HTR, que já foi validado para a espécie canina, representa uma

importante ferramenta para futuros estudos andrológicos. Embora todos estes

equipamentos para análise computadorizada também já tenham sido validados para a

espécie canina, ainda estão muito longe de se tornar comum na prática veterinária

devido ao alto custo dos mesmos bem como a necessidade de padronização das

técnicas (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b). No entanto, há disponível um

equipamento com um preço mais acessível, é o Analisador de qualidade espermática

(SQA), que já foi validado para a avaliação do sêmen canino criopreservado (Iguer-

Ouada ¨& Verstegen, 2001b). Este equipamento registra variações na densidade

óptica, convertendo esta informação, por cálculos matemáticos, num índice de

motilidade espermática (SMI). Este equipamento mostrou uma boa repetibilidade de

resultados em amostras seminais de boa e ótima qualidade, observando altas

correlações entre vários parâmetros seminais (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b). No

entanto, ainda não foi determinada uma correlação entre o SMI e a fertilidade in vivo

(Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b).

Testes de interação espermatozóide-oócito

Além dos testes já mencionados para a avaliação de um único parâmetro da

função espermática, há aqueles testes que avaliam múltiplos parâmetros, tais como a

interação oócito-espermatozóide (ligação e penetração na zona pelúcida - ZP) e a

fertilização in vitro. A ligação do espermatozóide à ZP é um evento crítico na

interação gametogênica que culmina com a fertilização do oócito (Mayenco-Aguirre &

Pérez-Cortez, 1998). Essa ligação é mediada por receptores na membrana plasmática

espermática e uma ou mais glicoproteínas da ZP (Hoodbhoy & Dean, 2004) A

habilidade de um espermatozóide de interagir corretamente com o oócito é crucial e,

dependente de vários fatores, incluindo a motilidade espermática e a fluidez da

membrana.

As análises da interação oócito–espermatozóide avaliam indiretamente

danos moleculares, que são impossíveis de serem avaliados em análises convencionais.

(Ström, 1999). Portanto, a habilidade do espermatozóide em se ligar à ZP é um teste

potencialmente valioso ao se avaliar técnicas para resfriamento e congelação-

descongelação de sêmen. Testes avaliando essa habilidade têm sido desenvolvidos

para bovinos (Fazelli et al., 1993a), eqüinos (Fazelli et al., 1993b) e suínos (Fazelli et

al., 1995).

Os testes de ligação do espermatozóide canino com a ZP podem ser

realizados utilizando-se oócitos homólogos intactos (Ström Holst et al., 2001b) ou,

ainda, bisseccionados (hemi-zona) (Mayenco-Aguirre & Pérez-Cortez, 1998). Segundo

Olar (1984), a avaliação da capacidade fecundante do espermatozóide canino

imediatamente após a descongelação seria um parâmetro mais importante do que a

simples observação da manutenção da motilidade após um período de incubação. Em

um trabalho pioneiro, Froman et al. (1984) verificaram a capacidade fecundante in

vitro de espermatozóides caninos frescos e congelados e observaram que o processo de

congelação afeta bastante a taxa de penetração em oócitos de camundongas, sendo este

talvez o motivo para as baixas taxas de fertilidade in vivo obtidas com o sêmen

congelado.

A interação espermatozóide-ooócito pode ser avaliada pela fluorescência ou

pela microscopia óptica (aceto-orceína), onde se observa a presença de cabeças

espermáticas ligadas à ZP ou no espaço perivitelínico e ooplasma do oócito (Hewitt &

England, 1997).

Para a realização deste teste, Hay et al. (1997) relatam que podem ser

utilizados oócitos caninos colhidos de ovários após a ovariosalpingohisterectomia, os

quais podem ser utilizados, tanto imediatamente após a cirurgia, quanto após

congelação a -18 °C, para a avaliação do sêmen congelado de cães domésticos, lobos

cinzentos (Canis lupus) e lobos vermelhos (Canis rufus). Esses autores sugerem ainda

que as amostras de sêmen que retêm a motilidade após a descongelação também retêm

o movimento progressivo, indicando que se elas sobreviverem a congelação serão

capazes de progredir. Verificaram ainda que a baixa motilidade e aumento nos danos

acrossômicos nas células espermáticas caninas após a descongelação estão

correlacionados com penetração reduzida em oócitos homólogos.

Mayenco-Aguirre & Pérez-Cortez (1998) relataram que na espécie canina, a

ligação à zona pelúcida de oócitos homólogos é, significativamente, afetada pela

concentração espermática, sendo sugestivo o uso de concentrações superiores a 1 x 10

espermatozóides capacitados e móveis/mL. Segundo esses autores, a partir dessa

concentração espermática sugerida, foi obtida uma taxa de ligação de 86%. Em adição,

Ivanova et al. (1999) observaram que diferentes cães apresentam uma variação

individual quanto à possibilidade de terem seu sêmen congelado, com conseqüente

variação na porcentagem de espermatozóides ligados à zona pelúcida. Além disso,

Ström-Holst et al. (2000) mostraram que a adição da pasta Equex STM ao diluente tem

um efeito benéfico sobre a capacidade de espermatozóides caninos descongelados em

se ligarem à zona pelúcida de oócitos homólogos.

O teste de penetração oocitária consome menos tempo do que fertilização in

vitro, visto que, não há a necessidade de maturar o oócito e somente a penetração é

avaliada e não o seu desenvolvimento (Hewitt & England, 1997). A penetração do

espermatozóide na zona e/ou ooplasma mostrou-se intimamente associada à

motilidade espermática (Hay et al., 1997), mas não se correlacionou com o status

acrossomal (Rodrigues et al., 2004).

Outros métodos de avaliação in vitro

No cão, assim como em outras espécies, uma avaliação objetiva do

espermatozóide pode ser realizada em muitas situações clínicas ou atividades de

pesquisa. A avaliação da motilidade é, essencialmente, subjetiva, podendo causar uma

alta variabilidade entre laboratórios ou observadores. Para controlar esta variabilidade,

várias tentativas têm sido realizadas para padronizar a análise da motilidade

espermática (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b).

Várias técnicas têm sido propostas para superar essa subjetividade e fazer

com que a análise da motilidade seja mais confiável. A turbidimetria é uma técnica

baseada na avaliação espermática pelo “swim-up”, no qual a turbidez é registrada pela

espectroscopia (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b). A espectroscopia a laser consiste

na análise do movimento espermático induzido por variações no comprimento da

onda. Contudo, se esses métodos físicos são interessantes, eles somente dão a

informação sobre as características dos espermatozóides como um todo sem descrever

os parâmetros individuais. Além disso, esses testes são de difícil realização na prática

clínica, bem como necessitam de um equipamento de alto custo (Iguer-Ouada &

Verstegen, 2001b).

Para a avaliação espermática individual, bem como da velocidade, técnicas

envolvendo o filtro de acetato/nitrato (England & Allen, 1990) e progressão no muco

cervical (Mole & Fitzgerald, 1990) têm sido propostas. No entanto, tais técnicas

consomem muito tempo e os resultados são pouco confiáveis.

O armazenamento de espermatozóides em um reservatório é necessário para

que ele se mantenha funcional até o momento da fertilização (England e Pacey, 1998).

Vários estudos in vivo relataram que as principais reservas espermáticas do cão estão

localizadas nas criptas uterinas e na junção útero-tubárica (Rijsselaere et al., 2004).

Testes in vitro que investiguem a interação do espermatozóide com fragmentos do

oviduto podem fornecer informações não somente sobre a fisiologia e os mecanismos

dessa ligação como também comparar a capacidade de ligação dos ejaculados

(Petrunkina et al., 2004). Apesar de vários aspectos dessa ligação já terem sido

estudados como o efeito do estágio do ciclo estral e da região do oviduto, a capacidade

de ligação do espermatozóide com explants de oviduto ainda não foi correlacionado

com a fertilidade (Petrunkina et al., 2003, 2004).

Avaliação da função espermática in vivo

Apesar de inúmeros testes in vitro, a forma mais segura de avaliar-se o

sucesso da congelação de sêmen é pelos resultados obtidos após inseminação artificial

(IA) com o sêmen descongelado. Quando novos métodos para criopreservação de

sêmen são desenvolvidos, testes de fertilidade são necessários para confirmar os

resultados das avaliações in vitro. É importante ressaltar que a fertilidade de um

ejaculado é dependente da fertilidade da fêmea (Eilts, 2005). Amann (2005) relata que

a fertilidade de um garanhão pode ser tão alta quanto 95% se a fertilidade da fêmea é

de 90% e tão baixa quanto 24% se a fertilidade da fêmea é de 25%. Para o cão, mesmo

que sua fertilidade já houvesse sido testada num grande grupo de fêmeas férteis, a sua

fertilidade não poderia ser prevista ao se utilizar um outro grupo de cadelas que

tivessem uma fertilidade diferente (Eilts, 2005).

Há outros fatores que podem influenciar o resultado das inseminações

artificiais com sêmen congelado-descongelado, tais como diferenças na qualidade e

congelabilidade dos ejaculados de diferentes cães, o número de espermatozóides

inseminados, momento da inseminação e o local de deposição do sêmen. Portanto, é

necessário controlar esses fatores para poder avaliar os efeitos dos diferentes métodos

de criopreservação (Eilts, 2005).

As taxas de gestação obtidas com o sêmen canino congelado têm variado

consideravelmente e são, geralmente, mais altas quando o sêmen é depositado no

útero, comparado à deposição vaginal (Concannon & Battista, 1989; Olar et al., 1989).

Entretanto, Silva (1995) descreve resultados semelhantes para a IA intrauterina e a IA

intravaginal utilizando-se a sonda de Osíris com o sêmen congelado, o que implica que

a própria metodologia de inseminação pode influenciar os resultados.

Uma vez que muitos dos parâmetros avaliados in vitro não são

correlacionados com a fertilidade, a inseminação artificial de um grande número de

fêmeas é ainda o teste mais confiável ao se comparar os métodos de preservação de

sêmen (Amann & Hammerstedt, 1993). Em cães, testes de fertilidade são difíceis de

serem realizados devido ao número limitado de cadelas disponíveis e a longa duração

do seu ciclo estral. Eilts (2005) relata que para se ter uma significância estatística, na

qual a diferença na taxa de fertilidade entre dois grupos seja de 30%, são necessárias

37 cadelas por grupo.

3. JUSTIFICATIVA

O interesse pela IA com sêmen congelado de cães aumentou muitos anos

depois do uso dessa biotécnica na pecuária. Tradicionalmente, o interesse dos

proprietários de cães consistia mais em evitar a reprodução do que em incrementá-la.

Entretanto, nas duas últimas décadas, a situação tem, substancialmente, mudado e a IA

com sêmen congelado tem sido um assunto de interesse mundial. Esse interesse pode

ser explicado pelo crescente valor dos cães de raça pura, bem como pelo fato da

criação de cães ter se tornado um “hobby” bastante difundido (Peña, 2000).

Apesar do crescente interesse pelo uso da IA com sêmen congelado de cães,

tal biotécnica ainda não é tão usada no manejo reprodutivo da criação de cães no

Brasil. Uma razão para o ceticismo dos criadores são os resultados insatisfatórios de

fertilidade, bem como as ninhadas pequenas. Portanto, são necessárias investigações

objetivando a melhora do potencial fertilizante do espermatozóide canino congelado

(Peña, 2000).

O sêmen canino já foi criopreservado por diversos métodos e com diferentes

diluentes. Mais recentemente, o diluente à base de água de coco foi utilizado para a

criopreservação do sêmen desta espécie (Cardoso et al., 2000, 2003b, Cardoso, 2001).

A água de coco mostra toda uma riqueza de substâncias que participam inclusive no

metabolismo de espermatozóides; sendo desenvolvido, no Nordeste do Brasil, um

diluente à base de água de coco para a conservação de sêmen de caprinos (Salles &

Nunes, 1992) e que foi adaptado para a espécie canina (Cardoso et al., 2000). Apesar

de sua eficiência como diluente, era necessário preparar uma nova solução para cada

uso. A difusão do uso da água de coco está limitada, em primeiro lugar, a inexistência

da padronização de um insumo tão importante (Nunes et al., 2005). Uma série de

fatores como variedade, tipo de cultivar, idade, sanidade e fatores ambientais

influenciam, substancialmente, sua composição (Nunes et al., 2005). Sua labilidade

tem dificultado os esforços de inúmeros pesquisadores, muitos deles ligados à

industrialização, de obter na prateleira, a água de coco in natura, sob forma estável e

duradoura (Nunes et al., 2005). Portanto era preciso o desenvolvimento de um método

de armazenagem da água de coco que mantivesse as mesmas características

bioquímicas que a qualificam como um bom diluente. Objetivando ainda a

comercialização do referido diluente, pesquisadores do Ceará desenvolveram a água

de coco em pó que já foi testado em outras espécies (Salgueiro et al., 2002, Sampaio

Neto et al., 2002)), mas não ainda na espécie canina.

Embora o diluente à base de água de coco padrão (ACIN) já tivesse sido

eficaz para a congelação de sêmen canino, não se conhecia a eficiência da água de

coco em pó, na qual na espécie canina recebe o nome de ACP-106

. Para verificar a

eficiência deste diluente, é necessária uma avaliação mais precisa do espermatozóide,

podendo-se ter um maior conhecimento do tipo e da extensão dos danos causados à

célula espermática pelo processo de criopreservação com ACP-106

Um dos principais danos causados à célula espermática são as mudanças

semelhantes à capacitação resultantes da desestabilização de membrana, tendo sido

sugerido que a prevenção ou a diminuição dessas alterações podem aumentar as taxas

de concepção (Watson, 1995). Portanto diferentes testes in vitro podem fornecer

informações importantes a respeito dessas alterações, sendo útil para o

aperfeiçoamento ou mesmo o desenvolvimento de novos métodos de criopreservação

(Watson, 1995).

Mesmo com as inúmeras vantagens das avaliações in vitro, é pela taxa de

fertilidade que se pode avaliar, definitivamente, o sucesso da criopreservação. As

análises in vitro fornecem informações das características do espermatozóide

congelado e, consequëntemente, facilitam o aperfeiçoamento das técnicas existentes,

bem como o desenvolvimento de novas. Além disso, os resultados dessas análises

podem ser utilizados para as comparações e correlações entre características in vitro e

teste de fertilidade, determinando quais parâmetros das avaliações in vitro podem

melhor prever os resultados in vivo (Ström, 1999).

Dessa forma, uma avaliação detalhada dos danos que o espermatozóide

sofre com a criopreservação utilizando o ACP-106

poderá ajudar no aperfeiçoamento

dessa técnica, podendo a mesma ser utilizada em escala comercial, permitindo o

armazenamento e subseqüente difusão de material genético. Além disso, esse método

de preservação de sêmen poderá, futuramente, ser estudado em espécies canídeas

ameaçadas de extinção (Wildt et al., 1995) e o conhecimento dos fatores que

interferem no sucesso da congelação de sêmen canino com um diluente à base de água

de coco poderá acelerar a adaptação dessa biotécnica para as espécies selvagens.

É importante ressaltar que o mercado pet é um dos maiores setores

financeiros da atualidade, dando-se destaque para a criação comercial de cães. Além

disso, estudos da criopreservação do sêmen proporcionam o crescimento científico da

Medicina Veterinária, levando à formação de recursos humanos. E ainda, o

desenvolvimento de um novo produto, disponível comercialmente, promoverá uma

maior geração de empregos.

4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS

O diluente para sêmen de cães à base de água de coco em pó (ACP-106

) é

eficiente para a criopreservação de sêmen.

A concentração espermática influencia na qualidade seminal canina pós-

descongelação utilizando ACP-106

O armazenamento do ACP-106

a -10 °C não altera a sua eficiência como

diluente.

Utilizando diferentes análises in vitro, é possível estabelecer quais parâmetros

seminais serão mais correlacionados com os resultados das interações

espermatozóides-oócitos.

5. OBJETIVOS

Geral

Avaliar a eficácia de um diluente à base de água de coco em pó (ACP-106

)

na criopreservação de sêmen canino.

Específicos

Comparar a eficiência dos diluentes à base de água de coco in natura (ACIN)

e em pó (ACP-106

) na criopreservação de sêmen canino;

Comparar dois métodos de diluição na criopreservação de sêmen canino

utilizando os diluentes ACIN e ACP-106

;

Verificar o efeito do armazenamento a – 10 °C sobre a eficiência do ACP-

106

;

Investigar a influência da diluição pós-descongelação na longevidade do

sêmen canino criopreservado com ACP-106

;

Verificar a eficiência do processo de criopreservação com o ACP-106

pela

análise computadorizada, integridade de membrana e interação oócito-espermatozóide;

Verificar a possibilidade de se estabelecer quais parâmetros seminais são os

melhores representantes dos resultados das interações espermatozóides-oócitos;

Caracterizar as alterações ultra-estruturais do espermatozóide canino

criopreservado em ACP-106

pela microscopia eletrônica de transmissão.

6. CAPÍTULO 1

COMPARAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE DOIS MÉTODOS DE

DILUIÇÃO NA CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN CANINO

UTILIZANDO OS DILUENTES À BASE DE ÁGUA DE COCO IN

NATURA (ACIN) OU EM PÓ (ACP-106

)

Comparison of two dilution rates on canine semen quality after

cryopreservation in a coconut water extender

Anmal Reproduction Science, artigo aceito para publicação (in press)

Efeito da diluição espermática na congelação de sêmen canino

utilizando-se a água de coco em pó (ACP-106

)

Ciência Animal, artigo submetido para publicação

Use of the powder coconut water (ACP-106

) as an alternative

extender for canine semen freezing

Animal Reproduction, artigo submetido para publicação

Efeito da diluição espermática na congelação de sêmen canino utilizando-se a água de coco

em pó (ACP-106

)

como diluidor

Effect of sperm dilution on canine semen freezing using powder coconut water (ACP-106

)

Rita de Cássia Soares Cardoso

, Alexandre Rodrigues Silva

, Lúcia Daniel Machado da

Silva

1. Doutorando (a) PPGCV/FAVET-UECE /Bolsista CAPES

2. Professor Adjunto FAVET-UECE/ Bolsista CNPq.

Laboratório de Reprodução de Carnívoros-FAVET/UECE

RESUMO

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da diluição seminal sobre a qualidade espermática

após a descongelação de sêmen canino usando a água de coco em pó (ACP

106). Foram

coletados doze ejaculados e o sêmen foi dividido em duas alíquotas, uma para diluição 1:1 e

outra para a concentração de 200x10

espermatozóides/mL. O sêmen foi inicialmente diluído

em ACP

106 contendo 20% de gema de ovo. Após a diluição, o sêmen foi submetido ao

resfriamento por 40 minutos em caixa térmica (15°C) e 30 minutos em refrigerador (4°C).

Posteriormente o ACP

acrescido de gema de ovo e glicerol (concentração final de 6%) foi

adicionado ao sêmen. Os ejaculados foram congelados em vapores de nitrogênio líquido e

armazenados a -196 °C. Após uma semana, o sêmen foi descongelado a 37 °C por 1 minuto e

os parâmetros microscópicos foram avaliados. Não houve efeito do método de diluição sobre

a motilidade e vigor. Após a descongelação as médias destes parâmetros foram 45,39 ±

13,91% e 3,08 ± 0,67 para o grupo diluído 1:1 e 55,0 ± 18,34% e 3,58 ± 0,47 para o grupo

diluído a uma concentração de 200x10

espermatozóides/mL, respectivamente. Também não

foi observado efeito dos métodos de diluição sobre a morfologia espermática (P>0,05)

enquanto os defeitos de cauda foram os mais observados (P<0,05). O percentual de alterações

morfológicas após a descongelação para os dois grupos foram 36,06% para a diluição 1:1 e

29,28% para a concentração fixa. Conclui-se que o ACP

106 é eficiente para a

criopreservação de sêmen canino utilizando-se uma concentração espermática de 200 x 10

espermatozóides/mL ou a uma diluição constante (1:1) com o método de congelação e

descongelação descrito neste trabalho.

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the effect of sperm dilution using powder coconut water

(ACP

106) extender on the post-thaw sperm quality. Twelve ejaculates were collected from

six dogs. Semen was divided into 2 aliquots, one for dilution 1:1 and another for

concentration of 200x10

spermatozoa/mL. Semen was initially extended with ACP

106

containing 20% egg yolk. After dilution, semen was submitted to cooling for 70 minutes.

After this step, extender added by egg yolk and glycerol at a final concentration of 6% was

added to semen. Ejaculates were frozen in nitrogen vapors and stored at -196?C. After one

week, straws were thawed at 37?C for 1 minute and the microscopic criteria were evaluated.

The method of sperm dilution had not a significant effect on post-thaw motility and vigor.

After thawing, motility and vigor values were 55.0 ± 18.34% and 3.58 ± 0.47 for semen

diluted 1:1 and 45.39 ± 13.91% and 3.08 ± 0.67 for semen diluted at 200 x 10

spermatozoa/mL. The method of sperm dilution didn’t affect sperm morphology either

(P>0.05) and tail defects were the most observed (P<0.05). The percentage of post-thaw

sperm abnormalities was 29.2 ± 9.04 % for dilution 1:1 36.06 ± 10.82% for dilution at

200x10

spermatozoa/mL. The ACP

106 is efficient for canine semen cryopreservation at a

constant dilution rate (1:1) or at 200x10

spermatozoa/mL using the freezing/thawing

processes described here.

Palavras-chave: ACP

, água de coco, sêmen, cão, congelação

Keywords: PCW, coconut water, sperm, dog, freezing

Introdução

Diversas pesquisas têm sido desenvolvidas objetivando aperfeiçoar os protocolos já existentes

para a congelação de sêmen canino através do uso de diferentes crioprotetores, processos de

congelação/descongelação e uma variedade de diluidores como o lactose, Pipes, Tes e Tris,

que é o mais utilizado para a conservação de sêmen canino (England, 1993).

Vários pesquisadores tentaram desenvolver um bom diluidor, ou seja, que apresente as

seguintes características: atoxicidade, isotonicidade, boa capacidade tamponante, bem como

praticidade, baixo custo e eficiência (Mies Filho, 1987; Fontbonne, 1993). Recentemente, foi

desenvolvida a água de coco em pó (ACP

) que já foi testada com sucesso em diferentes

espécies tais como eqüinos (Sampaio Neto et al., 2002), caprinos (Salgueiro et al., 2002) e

caninos (Cardoso et al., 2004). O ACP

foi desenvolvido devido à impossibilidade de

armazenamento da água de coco e ainda objetivando a padronização e comercialização do

referido diluidor, mesmo naquelas regiões onde o fruto não existe.

Embora a água de coco em pó já tenha sido testada com sucesso para a congelação de sêmen

canino, onde se obteve aproximadamente 60% de espermatozóides móveis após a

descongelação (Cardoso et al., 2004), ainda faz-se necessário o aperfeiçoamento deste

protocolo de congelação. Vale ressaltar que, para a espécie canina, o diluidor recebe a

denominação de ACP

106. Utilizando-se a solução à base de água de coco (50% água de

coco in natura + 25% água destilada + 25% citrato de sódio a 5%), o sêmen canino é

comumente congelado na proporção de uma parte de sêmen para uma parte de diluidor (1:1),

não se levando em conta a concentração espermática (Cardoso et al., 2003b, Cardoso et al.,

2004). Utilizando outros diluidores, o sêmen canino já foi congelado em diferentes

concentrações espermáticas como 40 (Olar et al., 1989), 44 (Dobrinski et al., 1993), 50 (Rota

et al., 1997a), 66 (Fontbonne e Badinand, 1993), 100 (Thomas et al., 1993, Wilson, 1993,

Ström et al., 1997), 150 (Farstad e Andersen-Berg, 1989) e 200 x 10

espermatozóides/mL

(Silva e Verstegen, 1995, Silva et al., 1996). Contudo ainda há pouca informação sobre o

efeito da concentração espermática sobre a qualidade do sêmen canino pós-descongelação.

Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do ACP

106, comparando-se um

método de diluição fixa (uma parte de sêmen:uma parte de diluidor ou 1:1) com um método

de concentração fixa (200 x10

espermatozóides/mL) na congelação de sêmen canino.

Material e Método

Animais experimentais

Foram utilizados seis cães: 1 American Sttafordshire Terrier, 2 Boxers, 1 Brazilian Mastiff, 1

Dobermann e 1 Rottweiler, com idade variando de 1 a 5 anos. Os animais pertenciam a canis

particulares e foram mantidos em boxes individuais. Os cães foram alimentados com ração

comercial e tinham livre acesso à água.

Coleta e avaliação de sêmen

Foram coletados dois ejaculados de cada cão através da técnica de manipulação digital

(Christiansen, 1986), utilizando-se tubos de vidro graduados acoplados a um funil e sendo

coletado o sêmen na sua forma fracionada. Os parâmetros macroscópicos (cor e volume)

foram avaliados no sêmen a fresco (fração espermática). A motilidade e o vigor (em escala de

0 a 5) foram avaliados no sêmen a fresco e após a diluição inicial, o resfriamento, a adição de

glicerol e a descongelação, utilizando-se um microscópio óptico (x100). A morfologia

espermática foi avaliada através da contagem de 200 células após coloração de um esfregaço

com eosina-nigrosina. As células foram classificadas como normal ou apresentando alterações

primárias ou secundárias. As alterações foram apresentadas de acordo com a sua localização

(cabeça, peça intermediária e cauda). Esta avaliação também foi realizada através da

microscopia óptica, em aumento de 1200x, no sêmen a fresco e congelado/descongelado. A

concentração espermática foi mensurada através de contagem em câmara de Neubauer

(Cardoso et al., 2003a).

Diluição do sêmen

Para a congelação do sêmen, foi utilizada a água de coco em pó (ACP

106, ACP

Biotecnologia

, Fortaleza-Ceará, Brasil), onde era composta por 1,2g de ACP

em 5,0 mL

de água ultra-pura autoclavada e 5,0 mL de solução de citrato de sódio a 1%. O diluidor

continha 20% de gema de ovo e 6% de glicerol (concentração final no diluidor).

Foram testadas duas taxas de diluição: uma parte de sêmen para uma parte de diluidor

(DILUIÇÃO) e outra a uma concentração de 200 x 10

espermatozóides/mL

(CONCENTRAÇÃO).

Após a mensuração da concentração espermática, o sêmen foi dividido em duas alíquotas. No

primeiro grupo, foi utilizada a diluição de uma parte de sêmen para uma parte de diluidor.

Para o segundo grupo, foi calculado o volume total de diluidor necessário para uma

concentração de 200 x 10

espermatozóides/mL . O volume total de diluidor para cada

protocolo foi dividido em duas partes (A e B). A parte “A” continha apenas o ACP

acrescido

de gema de ovo e a Parte “B”, similar a anterior, mas contendo 12% de glicerol. Após

diluição inicial e a adição de glicerol, a concentração final de glicerol no diluidor foi de 6%.

Processamento do sêmen

Após a divisão do sêmen em duas alíquotas, uma para cada protocolo a ser testado, a diluição

fixa (1:1) foi processada inicialmente na diluição de uma parte de sêmen para meia parte de

diluidor. Para o grupo com concentração espermática, o sêmen foi diluído inicialmente com

metade do volume de diluidor necessário para a concentração de 200 x 10

espermatozóides/mL. Nesta etapa, foi utilizada somente a parte A do diluidor. Após esta

diluição inicial com a parte A em temperatura ambiente (aproximadamente 27°C), as

amostras foram armazenadas em tubos de vidro e estes colocados em um recipiente com água

e acondicionados em caixa térmica com gelo reciclável (15?C) por 40 minutos. Após este

período, o sêmen foi transferido para um refrigerador até atingir 4°C (30 minutos) e a parte B

foi dividida em três partes iguais e adicionada ao sêmen em três etapas, com intervalos de

cinco minutos (Cardoso et al., 2003b).

O sêmen foi envasado em palhetas de 0,25mL, e depois dispostas horizontalmente em rampa

de congelação a uma altura de 5 cm do nível de nitrogênio líquido por cinco minutos e,

finalmente, armazenadas em nitrogênio líquido (-196 ?C). Após uma semana, as amostras

foram descongeladas em banho-maria (37?C) por um minuto e avaliadas microscopicamente

(Cardoso et al., 2003b). Foram obtidas vinte e quatro palhetas para cada método de diluição,

correspondendo a duas palhetas por réplica (n=12).

Análise estatística

Com exceção da cor, os demais parâmetros foram expressos na forma de média e desvio

padrão. Os dados de motilidade e alterações morfológicas foram transformados em arco seno.

Para avaliar o efeito da diluição espermática sobre estes parâmetros, utilizou-se o teste “t” de

Student e para o vigor, utilizou-se o teste de Mann-Whitnney. Estes mesmos testes foram

utilizados para avaliar o efeito das etapas do processo de congelação sobre os parâmetros

avaliados (P<0,05).

Resultados e Discussão

O sêmen a fresco (n=12) apresentou coloração branca opalescente. As características físicas

estão detalhadas na TAB. 1. Observa-se que as características físicas dos ejaculados frescos

estão de acordo com os valores considerados normais para a espécie canina (Jonhston et al.,

2001).

Foi observado um declínio significativo da motilidade e do vigor a partir do resfriamento

(TAB. 2) até a descongelação para os dois grupos, com exceção do vigor para o grupo que

utilizou a diluição 1:1, onde não se obsevou diferença entre as etapas de adição de glicerol e

descongelação. Cardoso et al. (2002) e Silva et al. (2001) também observaram este declínio

em ambos os parâmetros a partir do resfriamento e até a descongelação, utilizando diluidores

à base de água de coco e Tris, respectivamente. Além disso, não houve efeito do método de

diluição sobre a motilidade e vigor. Este resultado difere do encontrado por Peña e Linde-

Forsberg (2000) que, testando a diluição em concentrações espermáticas de 50, 100, 200 e

400 x 10

espermatozóides/mL, observou efeito da concentração espermática, encontrando

melhores resultados de motilidade progressiva imediatamente após a descongelação com 200x

espermatozóides/mL.

Neste trabalho somente foi testado uma diluição para uma concentração fixa de 200x 10

espermatozóides/mL e uma outra diluição a uma relação constante de 1:1 (sêmen:diluidor),

sem levar em conta a concentração espermática. Uma vez que a concentração espermática

média dos ejaculados foi de 1,6 x 10

espermatozóides/mL, para a diluição a uma

concentração de 200x 10

espermatozóides/mL foi necessário utilizar um grande volume de

diluidor. De acordo com Mann (1964), o espermatozóide dos mamíferos responde à diluição

excessiva exibindo perda de motilidade e aumento no número de espermatozóides mortos. Por

outro lado, a diluição a uma taxa constante, não leva em consideração a concentração

espermática, consequentemente havendo variação na quantidade de glicerol/célula. Como a

concentração espermática média foi de 1,6 x 10

espermatozóides/mL, após a diluição (1:1),

esta concentração foi de 800 x 10

espermatozóides/mL. Entretanto, é importante lembrar que

a concentração espermática variou de 530 a 2760 x 10

espermatozóides/mL. Então, após a

diluição, este parâmetro variou de 265 a 1370 x 10

espermatozóides/mL. Dessa forma, a

diluição a uma taxa constante pode levar a uma grande variação de resultados, mas esta

diluição foi escolhida, pois é comumente utilizada para a diluição não somente com a solução

à base de água de coco (Cardoso et al., 2003) como em outros diluidores (Silva et al., 1998;

2003) para a congelação de sêmen canino.

Colas (1975) relata que obteve melhores resultados de fertilidade com sêmen ovino, quando

este foi diluído a uma concentração constante de 900 x 10

espermatozóides/mL do que a uma

taxa constante de 1:4. Isto sugere que o nível ótimo de glicerol no sêmen diluído pode estar

relacionado à sua concentração final em relação ao espermatozóide (Colas, 1975).

Da mesma forma que para a motilidade e o vigor, não foi observado efeito do método de

diluição sobre a morfologia espermática (P>0,05), sendo os grupos similares quanto às

alterações de cabeça, peça intermediária e cauda e, ainda, quanto às alterações secundárias

(FIG. 1 e 2) e totais. Para os dois métodos de diluição, os defeitos de cauda (FIG. 1) foram os

mais observados (P<0,05). O percentual de alterações morfológicas após a descongelação

para os dois grupos (36,06% vs 29,28%) é similar aos encontrados por Cardoso et al. (2003) e

Silva et al. (2003) utilizando uma solução à base de água de coco e Tris, respectivamente.

Para a avaliação da morfologia espermática, foi realizada a coloração de eosina-nigrosina, que

não se mostrou tão eficiente. Embora ela seja classificada como uma coloração vital é difícil a

avaliação do percentual de células vivas após a descongelação, visto que se observa uma

população espermática que não se cora adequadamente, dificultando a interpretação, por isso

este parâmetro não foi mensurado. Este fato já foi observado por Peña (2004), relatando que

essa população de espermatozóides que não se cora adequadamente, poderia apresentar lesão

de membrana, mas talvez ainda fosse viável. Além disso, como não há fixação no processo de

coloração, observou-se que a vida útil da lâmina torna-se mais curta, podendo ocasionar

defeitos aos espermatozóides (principalmente de cauda) que não existiam no momento da

coloração. È importante ressaltar que só foi realizada a avaliação clássica da morfologia

espermática, sendo importante a realização de outras avaliações como, por exemplo, a do

status acrossomal.

Há ainda pouca informação a respeito do efeito da concentração espermática sobre a

congelação de sêmen canino. Estudos em outras espécies, especialmente a eqüina, sugerem

que este fator pode influenciar sobre a sobrevivência espermática pós-descongelação (Peña e

Linde-Forsberg, 2000). Palácios et al. (1992) relataram melhores resultados de motilidade

pós-descongelação quando o espermatozóide eqüino foi congelado a uma concentração de

800 x 10

espermatozóides/mL do que a 100 x10

espermatozóides/mL.

Usando o diluidor Tris para a congelação de sêmen canino a uma concentração de 50 x10

espermatozóides/mL, Rota et al. (1997b) obtiveram resultados similares de motilidade após a

descongelação (56,4%). Além disso, 56,5% dos espermatozóides mostraram uma membrana

intacta. Ström et al. (1997) obtiveram uma melhor motilidade após a descongelação utilizando

o diluidor Tris e o CLONE. Nesse experimento, o sêmen foi congelado a uma concentração

de 100x10

espermatozóides/mL e foi observado aproximadamente 70% de espermatozóides

móveis e 50% apresentando acrossoma normal. Silva et al (1996) utilizaram sêmen congelado

a uma concentração de 200 x 10

espermatozóides/mL e obtiveram 60% de cadelas prenhes

após inseminação intravaginal e intrauterina.

É relatado que para altas concentrações espermáticas (1000 x 10

espermatozoides/mL), a

motilidade pós-descongelação foi melhor quando uma rápida taxa de resfriamento foi

utilizada durante a congelação, ao passo que para baixas concentrações (200 x 10

espermatozóides/mL), a motilidade foi melhor quando se utilizou uma lenta taxa de

resfriamento (Parlevilet et al., 1992). Em nosso trabalho, foi utilizada uma taxa de

resfriamento moderada, explicando-se talvez o fato dela ter sido eficiente para as duas

diluições. Outros pesquisadores também utilizaram uma taxa similar a deste trabalho, mas em

concentrações espermáticas diferentes como 100 x 10

(Bueno et al., 2001), 200 x 10

(Eilts,

2003) e para uma diluição de 1:2 (Oliveira, 2003).

Conclusão

Com base nos resultados, conclui-se que o ACP

106

foi capaz de preservar a motilidade,

vigor e morfologia espermática pós-descongelação em índices aceitáveis para a realização de

inseminação artificial, sendo efeiciente para a criopreservação de sêmen canino diluído a uma

concentração espermática final de 200 x 10

espermatozóides/mL ou a uma diluição constante

(1:1).

Embora o método de diluição a uma taxa constante seja mais prático, a utilização de uma

concentração fixa tem como vantagens a simplificação do cálculo do número de

espermatozóides por palheta e o melhor aproveitamento do ejaculado.

É importante ressaltar que o resultado deste trabalho é o primeiro passo para a padronização

de um protocolo de congelação de sêmen canino com o diluidor ACP

106, facilitando a

futura comercialização deste diluidor para a referida espécie.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Laboratório de Tecnologia de Sêmen caprino, em nome dos

Doutores José Ferreira Nunes e Cristiane Clemente de Mello Salgueiro pela concessão da

água de coco em pó (ACP

106) e à Intervet pela água ultra-pura utilizada no preparo do

diluidor. Além disso, agradecemos ao Médico Veterinário M.Sc. Daniel Couto Uchoa (Canil

Grande Canafístula) pela utilização dos animais para a coleta de sêmen.

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Tabela 1. Média e desvio padrão das características físicas e morfológicas da fração

espermática dos ejaculados caninos (n=12)

Parâmetros Média ± desvio padrão

Motilidade (%)

95,25 ? 0,79

Vigor (0-5)

5,00 ? 0,00

Volume (mL) 1,18 ± 0,49

Concentração espermática

(x 10

espermatozóides/mL)

1607,50 ± 727,70

Alterações de cabeça (%) 14,56 ± 4,50

primárias 1,05 ± 1,24

secundárias 13,51 ± 4,82

Alterações de peça intermediária (%) 1,53 ± 0,94

primárias 0,40 ± 0,52

secundárias 1,13 ± 0,91

Alterações de cauda (%) 6,43± 2,95

primárias 0,10 ± 0,32

secundárias 6,33 ± 2,98

Alterações totais (%) 22,24 ± 8,54

Tabela 2. Média e desvio padrão da motilidade e vigor do sêmen canino congelado com um

diluidor á base de água de coco em pó (ACP 106

) em dois métodos diferentes de diluição.

Motilidade (%) Vigor (0-5)

ACP

DILUIÇÃO

ACP

CONCENT

ACP

DILUIÇÃO

ACP

CONCENT

Fresco 95,23 ± 3,63ª

95,23 ± 3,63ª

5,0 ± 0,0

Diluição inicial 95,67 ± 4,03ª

94,85 ± 3,91ª

4,96 ± 0,14ª

4,71 ± 0,40ª

Resfriamento 91,25 ± 4,33

89,62 ± 4,77

4,58 ± 0,36

4,29 ± 0,45

Adição de glicerol 79,17 ± 10,62

81,15± 8,70

4,0 ± 0,60

3,75 ± 0,45

Descongelação 55,0 ± 18,34

45,39± 13,91

3,58 ± 0,47

3,08 ± 0,67

ACP CONCENT = ACP CONCENTRAÇÃO (concentração de 200 x 10

espermatozóides/mL);

ACP DILUIÇÃO (diluição constante de uma parte de sêmen:uma parte de diluidor ).

a,b,c,d

Letras

minúsculas diferentes na mesma coluna implicam em diferença significativa (P<0,05). Letras

maiúsculas diferentes na mesma linha implicam em diferença significativa entre os tratamentos.

Percentual (%)

Cabeça Peça

intermediária

Cauda

Concentração

Diluição

Figura 1. Percentual de alterações morfológicas do sêmen canino congelado em

ACP-106

a uma concentração de 200 x 10

espermatozóides/mL (ACP

CONCENTRAÇÃO) e a uma diluição constante de 1:1 (ACP DILUIÇÃO). Letras

diferentes implicam em diferença significativa (P< 0,05) entre os métodos de

diluição.

Percentual (%)

Primárias Secundárias

Concentração

Diluição

a a

Figura 2. Percentual de alterações morfológicas primárias e secundárias do do

sêmen canino congelado em ACP-106

a uma concentração de 200 x 10

espermatozóides/mL (ACP CONCENTRAÇÃO) e a uma diluição constante de

1:1 (ACP DILUIÇÃO). Letras diferentes implicam em diferença significativa (P<

0,05) entre os métodos de diluição.

Use of the powder coconut water (ACP-106

) as an alternative extender for canine

semen freezing

R. C. S. Cardoso

; A. R. Silva

, L. D. M. Silva

Laboratory of Carnivore Reproduction – PPGCV/UECE, Paranjana 1700, Itaperi, Fortaleza-

Ceará, 60740-000, Brazil.

Corresponding author: R. C. S. Cardoso: Major Weyne 662 Jardim América, 60415-730,

Fortaleza – Ceará, Brazil. Phone: + 55 85 34940856, Fax: + 55 85 31019840; E-mail address:

[email protected]

Article type: Biotechnology

Running title: Use of ACP-106

for canine semen freezing

Abstract

This study aimed to test the efficiency of powdered coconut water (ACP

) as an alternative

extender for canine semen freezing. Ejaculates from six dogs were collected by manual

stimulation and evaluated grossly and microscopically. Semen was divided into two aliquots,

one for in natura coconut water (NCW) and another for powder coconut water (ACP-106

Semen was initially extended with A-fraction (room temperature/27°C) at a proportion of one

part semen:half part extender (1: ½). Extenders containing 20% egg yolk was used for this

initial dilution in both groups. After dilution, the semen was cooled for 40 minutes in a

thermal box (15°C) and for 30 minutes in a refrigerator (4°C). The other half of the extender

(B-fraction) containing egg yolk and glycerol (12%) was added to semen in both groups.

Subsequently, the final concentration of glycerol in the extender was 6%. Ejaculates were

frozen in 0.25 mL straws 5 cm above the surface of liquid nitrogen and stored at -196°C.

After one week, straws were thawed at 37 °C for 1 minute and the microscopic criteria were

evaluated. Both extenders were efficient in conserving sperm motility, vigor and morphology

after freezing/thawing processes. Results showed that ACP-106

can be used as a new option

for canine semen freezing. However, further in vivo studies must be conducted to test its

efficiency.

Keywords: canine, semen, freezing, coconut water, ACP

1. Introduction

The goal of using extenders when freezing semen is to minimize the damages resulting from

the process, maximizing the recovery of viable spermatozoa. For this reason, scientific

research has been carried out in an attempt to improve different protocols for this procedure

by using different cryoprotective agents, freezing/thawing processes, and a large number of

extenders, such as lactose, Pipes, Tes and Tris, which is the most extensively used extender

for canine semen conservation (England, 1993; Silva et al., 2002,2003).

Other authors have been trying to develop alternative non-toxic, isotonic, buffering, low cost,

practical and effective extenders. Recently, it has been shown that fresh coconut water (in

natura) is an effective extender for freezing canine semen (Cardoso et al., 2003). However,

the use of this extender presents some disadvantages such as the impossibility to store the

coconut water for long periods of time and limited availability of fruits around the world.

Furthermore, biochemical constitution of one coconut can be very different from another, and

this can directly affect the ability of the solution to preserve spermatozoa. Thus, studies were

conducted aiming at developing the powdered coconut water, registered under the brand name

ACP

, and that has already been tested for goat (Salgueiro et al., 2002), stallion (Sampaio

Neto et al., 2002) and canine semen (Cardoso et al., 2004).

After reconstitution, the biochemical characteristics of ACP

are very similar to those of fresh

coconut water. The product is easily stored before use, and the powder can be readily sent to

regions where fresh coconuts are not available. In addition, the composition of this extender is

standardized, since it is obtained from fruits of the same plantation. ACP

has been approved

for different animal species, and it is registered under the number ACP-106

for dogs.

This study was conducted to compare powdered coconut water (ACP

) with fresh coconut

water-based extender, known to be effective for freezing canine semen.

2. Materials and methods

2.1 Animals

Six proven stud dogs from private kennels were selected for this experiment: one Brazilian

Mastiff, one Doberman, one American Staffordshire Terrier, one Rottweiler and two Boxers,

aged 1 to 6 years. The animals were kept in individual boxes and fed with dry food once

daily, with free access to water.

2.2 Semen collection and evaluation

Each dog was submitted to two seminal collections by manual stimulation. Ejaculates were

collected into a sterile glass tube connected to a funnel and fractions were separated by color

modification (Johnston et al., 2001). The sperm-rich fraction was evaluated and later

individually frozen. Semen volume and color were grossly evaluated. Sperm motility

(percentage of mobile spermatozoa) and vigor (sperm motility status), scored on a scale from

0 (without movement) to 5 (fast progressive movement), were evaluated by light microscopy

(100x) (Johnston et al., 2001). Sperm morphology was evaluated by microscopic analysis

(1000x) of a slide stained with eosin-nigrosin, counting 200 cells per slide (Johnston et al.;

2001). Sperm concentration was determined by Neubauer counting chamber (Johnston et al.,

2001). Only samples that presented a volume > 0.6 mL, concentration > 200 x 10

spermatozoa/mL, sperm motility > 80% and vigor > 4 were used in the study.

2.3. Semen extension

Semen samples were submitted to a volume:volume extension based on a proportion of one

part semen to one part extender (1:1). Initially, samples were divided into two aliquots, which

were diluted in one of the two different media to be tested. The first one was a solution based

on in natura coconut water (NCW – Cardoso et al., 2003), constituted by 50% coconut water,

25% ultra-pure water and 25% anhydrous monosodium citrate solution (5%). The second one

was powder coconut water (ACP

Biotecnologia, Fortaleza-Ceará, Brazil) that was prepared

according to the manufacturer's recommendation. ACP

was obtained by an atomization

process in a Spray Dryer (Salgueiro et al., 2002).

2.4. Semen freezing

Semen was frozen by adding the A-fraction of the extender to the semen at room temperature

immediately after the initial analysis. The final dilution was, therefore, one part semen: one

part extender dilution, the A-fraction was added to semen at a one part semen to a half part

extender ratio (1:0.5). A cooling period was then allowed when the semen was stored in a

sealed tube and placed in a beaker of water in a thermal box (15 °C) for 40 minutes. The

semen was then transferred to a refrigerator for a further 30 min, where it reached 4 °C. At the

end of this time period, another half part of extender containing glycerol (B-fraction) was

divided into three equal parts and added to the sample three times at 5 minutes intervals. After

this dilution, the final glycerol concentration in the extender was 6%. Sperm was packaged in

0.25 mL plastic straws and frozen in nitrogen vapor (5 cm above surface of liquid nitrogen)

before being plunged into the liquid nitrogen (-196 °C). After one week, samples were thawed

in a water bath for 1 minute at 37 °C for microscopic evaluation. Twenty four straws were

obtained for each dilution method, that is, two straws for replicate (n = 12).

2.5 Statistical analysis

The results were expressed as means and standard deviations and were analyzed using the

Statview 5.0 software (SAS Institute Inc., Cary, NY, USA). Differences among the seminal

parameters of dogs were analyzed by the Kruskal-Wallis test. Sperm motility (%) and

morphology (%) were transformed to arcsine. The effects of extenders on sperm motility and

morphology, as well as the effects of the incubation period on motility were evaluated by the

Student t test (P<0.05). The same effects on vigor were analyzed by the Mann-Whitney test

(P<0.05).

3. Results

Fresh canine semen has a white milky appearance. The volume of the sperm-rich fraction was

1.20 ± 0.50mL, with a sperm concentration of 1.60 ± 0.7 x 10

spermatozoa/mL. Sperm

motility was 95.25 ± 0.85%, and vigor was 5.0 ± 0.6. Morphologically normal spermatozoa

rate was 77.48 ± 5.07 %. Statistical analysis demonstrated the population of dogs was

homogeneous, since no differences were detected among the samples (P > 0.05).

Fig. 1 and 2 show similar patterns of sperm motility and vigor for the use of NCW and ACP -

106

throughout each of the evaluation stages. After thawing, a reduction in the seminal

parameters was seen for both treatments, with significant differences at each evaluation stage

(P < 0.05), except for initial dilution. Table 1 shows the evaluation of sperm morphology prior

and after freezing/thawing. A significant reduction in the proportion of morphologically

normal spermatozoa was seen after thawing for both extenders (P<0.05), but there was no

difference between them. Tail defects were the most frequently observed (P<0.05).

4. Discussion

Several protocols have been developed for canine semen freezing and researchers are always

trying to develop more practical and less expensive methods. The fresh coconut water

extender (Nunes, 1995) was proven to be effective for freezing canine semen (Cardoso et al.,

2003), but the solution could not be stored for more than two days (data not published).

Therefore, a powdered form of coconut water (ACP

) was developed, and has already been

tested for goat (Salgueiro et al., 2002), and stallion semen (Sampaio Neto et al., 2002). Other

studies on cryopreservation of dog semen using ACP

(Cardoso et al., 2004, Silva et al.,

2004) have also been published.

A reduction in motility and vigor was seen in both groups from cooling up to thawing, except

for vigor (P>0.05), when it was compared glycerol addition and thawing stages. Silva et al.

(2001) and Cardoso et al. (2002) reported a similar reduction in seminal parameters during

freezing the stages. Our findings agree with those of Zalewski and Andersen Berg (1983),

who found that no damage occurred during dilution.

The post-thaw sperm motility and vigor observed for both extenders were within the optimum

range for insemination (Concannon & Battista, 1989), and were similar to those reported in

previous studies using coconut water extender (Cardoso et al., 2003) and Tris (Silva et al,

2002, 2003). In addition, the percentage of normal spermatozoa after thawing was different

from fresh semen for both extenders, but the frozen-thawed semen was considered as being of

good quality (Jonhston et al., 2001). The reduction in sperm motility and vigor observed with

all extenders after thawing may also be associated to a greater incidence of detached heads

and coiled tails, because the larger the number of sperm abnormalities, the lower the sperm

motility (Morton e Bruce, 1989). Oéttle (1993) reported that normal morphology values

below 60% adversely affect fertility rates.

Burgess et al. (2001) reported decreased numbers of live spermatozoa after freeze-thawing,

with more marked significant increases in acrosomal defects after freeze-thawing than after

cooling. This finding suggests that freeze-thawing either causes immediate damage or

exacerbates the damage already caused by cooling (Burgess et al., 2001). These findings are

in agreement with those of Rodrigues-Martinez et al. (1993) and Ström Holst et al. (1998),

who reported that freeze-thawing changed the morphology of sperm, including swelling of the

acrosome.

Although there was no difference between ejaculates, an effect of the dog was correlated to

post-thaw sperm motility, and there was an interaction between dog and extender. The

significant effect of the dog on post-thaw sperm motility confirms the suitability of using

ejaculates from different dogs in a repeated measurement experimental design (Steel e Torrie,

1980).

A spray drier was used to produce the powdered form of coconut water. After spray-drying,

coconut water retains its functional properties and can still be used as an extender. The

product was standardized for a pH 6.6 and 300-310 mOsmol/L, ideal for canine semen

(Johnston et al., 2001). However, ACP

has the disadvantage of not allowing complete

dissolution of egg yolk in the solution, resulting in higher content of debris that could possibly

affect sperm motility (Hirai et al., 1997).

In conclusion, ACP-106

can be successfully used for freezing canine semen as an alternative

extender in locations where coconuts are not readily available. ACP

106 is more practical to

be used for freezing canine semen when compared to NCW. In addition, further in vitro and

mainly in vivo studies are needed to prove the efficiency of ACP

106 for the canine species.

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5. Acknowledgements

The authors thank Dr. José Ferreira Nunes and Dr. Cristiane Clemente de Melo Salgueiro for

providing ACP-106

, DVM DC Uchoa for providing the animals and Intervet for providing

ultra-pure water for extenders prepare. This research was supported by CNPq (Research

Nacional Council/Conselho Nacional de Pesquisa). RCS Cardoso and AR Silva are supported

by grants from CAPES, and LDM Silva by grant from CNPq.

6. List of abbreviations

ACP

- powdered coconut water

NCW - in natura coconut water

Table 1: Sperm morphology observed in canine fresh and frozen-

thawed semen

submitted to extension with fresh/in natura coconut water (NCW) or powder coconu

water (ACP-106

)

Extenders Sperm morphology (%)

Fresh Semen NCW ACP

106

Normal sperm 77.5 ± 5.1

71.4 ± 6.4

70.7 ± 9.0

Head abnormalities 13.5 ± 5.3

10.7 ± 5.1

9.0 ± 5.5

Midpiece abnormalities 1.9 ± 1.4

2.8 ± 1.6

2.4 ± 1.9

Tail abnormalities 8.9 ± 4.7

15.2 ± 3.8

17.9 ± 5.7

Values in the same column followed by different superscripts are significantly different (P < 0.05;

Student’s t test)

Figure 1: Sperm motility of fresh (Fr), extended (Ext), cooled (Cool), glycerol-supplemented

(Glyc) and frozen/thawed (Thaw) semen extended with fresh/in natura (NCW) or powder

coconut water (ACP-106® - P > 0.05; Student’s t test).

Figure 2: Sperm vigor of fresh (Fr), extended (Ext), cooled (Cool), glycerol-supplemented

(Glyc) and frozen/thawed (thaw) semen extended with fresh/in natura (NCW) or powder

coconut water (ACP-106

- P > 0.05; Mann-Whitney test).

100

Fr Ext Cool Glyc Thaw

Evaluation stages

Sperm motility (%)

NCW

ACP 106®

3,5

4,5

Fr Ext Cool Glyc Thaw

Evaluation stages

Sperm vigor (0-5)

NCW

ACP 106®

7. CAPÍTULO 2

EFEITO DO ARMAZENAMENTO A -10 °C DO DILUIDOR ACP-

106

E DA DILUIÇÃO PÓS-DESCONGELAÇÃO SOBRE A

QUALIDADE DO SÊMEN CANINO CONGELADO

(Effect of storage at –10 °C of the ACP-106

extender and post-thaw

dilution on the quality of frozen canine semen)

Ciência Rural, submetido para publicação

Efeito do armazenamento a –10 °C do diluidor ACP

106 e da diluição pós-descongelação

sobre a qualidade do sêmen canino congelado

(Effect of storage at –10 °C of the ACP

106 extender and post-thaw dilution on quality of

frozen canine semen)

Rita de Cássia Soares Cardoso

, Alexandre Rodrigues Silva

and Lúcia Daniel Machado da

Silva

Resumo

O objetivo do presente estudo foi comparar a eficiência da água de coco na forma de pó (ACP

106) preparado no momento da congelação (grupo-não armazenado) e àquele armazenado

na forma congelada (grupo-armazenado). Além disso, objetivou-se avaliar o efeito da diluição

pós-descongelação (taxas de 1:0 e 1:4) sobre a longevidade espermática. Foram coletados dez

ejaculados oriundos de cinco animais através da manipulação digital. A fração espermática foi

inicialmente diluída à temperatura ambiente (27°C) utilizando as soluções fresca e congelada,

ambas contendo 20% de gema de ovo. Após a diluição, o sêmen foi submetido ao

resfriamento, diluído em ACP

106-gema de ovo-glicerol, congelado em vapores de

nitrogênio e armazenado em nitrogênio líquido (-196 °C). Após uma semana, as amostras

foram descongeladas e submetidas às avaliações de motilidade espermática progressiva,

morfologia, status acrossomal, integridade funcional de membrana (Teste hipoosmótico-

HOST) e termorresistência. Com relação à motilidadeespermática pós-descongelação, não foi

observada diferença entre os diluidores nem entre as taxas de diluição pós-descongelação,

exceto por uma maior motilidade aos 90 minutos no grupo usando ACP

106 armazenado e a

uma taxa de diluição 1:4. A taxa de espermatozóides e acrossomas normais (sêmen fresco e

congelado-descongelado) durante 60 minutos de incubação foi similar para os grupos não

1. Laboratory of Carnivore Reproduction, State University of Ceará, Fortaleza-Ceará, Brazil

Corresponding author: Major Weyne 662 Jardim América, 60415-730, Fortaleza – Ceará, Brazil.

armazenado e armazenado. Uma redução significativa (P < 0.05) na funcionalidade de

membrana espermática foi observada após a descongelação para o grupo com ACP

106 não

armazenado (53.6 ± 9.3%) e armazenado (53.1 ± 17.1%), mas não houve diferenças entre

eles. O armazenamento a -10 °C não diminuiu a eficiência do ACP

106 para a

criopreservação de sêmen canino. A diluição pós-descongelação não influencia a

sobrevivência espermática pós-descongelação, mas este procedimento melhora a avaliação da

motilidade por diminuir a viscosidade no diluidor.

Abstract

The aim of present study was to compare the efficiency of powder coconut water (ACP

106)

prepared at the moment of freezing (non stored group) and the one stored in a frozen form

(stored group). Moreover, this study aimed to evaluate the effect of post-thaw sperm dilution

(1:0 and 1:4 rates) on the sperm longevity. Ten ejaculates were collected from five dogs by

digital manipulation. The sperm-rich fraction was initially extended at room temperature

(27°C) using a non stored and stored solution containing 20% egg yolk. After dilution, the

semen was submitted to cooling, diluted in ACP

106-egg yolk-glycerol, frozen in nitrogen

vapor and stored in liquid nitrogen (-196 °C). After one week, samples were thawed and

submitted to evaluations of progressive sperm motility, morphology, acrosomal status,

functional integrity of membrane (hypoosmotic test-HOST) and thermoresistance tests.

Regarding post-thaw motility, there was no difference between extenders either post-thaw

dilution rates, except for group using stored ACP

106; where it was observed a higher

motility for 1:4 dilution rate at 90 minutes. Normal sperm and acrosome rates (fresh and

frozen-thawed semen) during 60 minutes incubation were similar for non-stored and stored

ACP

106. A significant reduction (P < 0.05) in sperm membrane functionality was found

after thawing for non-stored (53.6 ± 9.3%) and stored (53.1 ± 17.1%) ACP

106 but no

Tel. + 55 34940856; E-mail address: cardosorcs@yahoo.com.br

differences were observed between them. The storage at –10°C did not decrease the efficiency

of ACP

106 for canine semen cryopreservation. Post-thaw dilution did not influence the pos-

thaw survival, but this procedure improves the evaluation of sperm motility for decrease

viscosity in the extender.

Introduction

The cryopreservation of canine semen has been significantly increased since SEAGER

(1969) reported the first pregnancy using frozen dog semen. Since then, researchers tried to

develop new extenders and methods or more commonly improve the protocols used for other

species. Lactose, pipes and Tris had been used for other species and methods using this

extenders were efficient for canine semen freezing (ENGLAND, 1993; SILVA et al., 2002,

2003).

Coconut water extender had been developed for goat semen (NUNES, 1995) and it was

adapted for canine semen (CARDOSO et al., 2003, 2005). Recently, coconut water in a

powder form (ACP

) was developed since it was impossible to storage it for more than two

days (data not published). For canine semen, powder coconut water is named ACP

106 and

resulted in good values for post-thaw sperm motility (CARDOSO et al., 2004). However, it is

necessary to improve the protocol for ACP

106 in some aspects to provide a method more

practical. One of these features consists in the extender storage method since most of

extenders are stored in a frozen form. Tris, witch is one of the most used extender for canine

semen can be stored in a frozen form, being warmed at the moment of freezing (PEÑA et al

1998). Regarding ACP

, it is prepared a fresh solution to each freezing because it is not

known the effect of freezing on ACP

efficiency.

Moreover, it is important to check the effect of post-thaw dilution on canine semen. This

procedure can reduce the toxic effects of glycerol and egg yolk since the thaw medium

contains additional metabolizable substrate and buffering capacity (ROTA et al., 1997, 1998).

Moreover this is a lack of information about this effect on canine semen (PEÑA AND

LINDE-FORSBERG, 2000). These authors reported that the highest post-thaw dilution rate

evaluated (1:4) resulted in a higher sperm longevity.

The aim of the present work was to compare powder coconut water (ACP

106)

prepared at the moment of freezing and the one stored in a frozen form. Moreover, this study

aimed to evaluate the effect of post-thaw sperm dilution at two different rates (1:0, 1:4) on the

post-thaw sperm longevity.

Material and Methods

Animals

Five proven stud Boxer dogs, aged from one to six years, from a private kennel were

selected for this experiment. The animals were maintained in individual boxes and fed dry

food once daily, with free access to water.

Extenders

ACP

106 (ACP Biotecnologia

, Fortaleza-Ceará, Brazil) was prepared according to

the manufacturer's recommendation. This solution was stored at -10 °C. At the moment of

freezing, it was rewarmed and for the other group, a fresh solution was prepared for each

freezing process. For both groups, the ACP

106 solution was divided into two fractions. The

A-fraction extender consisted of stock solution containing 20% egg yolk. The B-fraction was

prepared from “A” but containing 12% glycerol (v/v). The pH and osmolarity of ACP

without egg yolk and glycerol was standardized for pH 6.6 and 300mOsm/L respectively.

Semen collection and processing

Each dog was submitted to two seminal collections by manual stimulation. Ejaculates

(N=10 replicates) were frozen at a 1:1 dilution rate. After the initial analysis, the A-fraction

was added to semen at one part semen to a half part extender ratio (1:0.5) at room temperature

(27°C). A cooling period was then allowed when the semen was stored in a sealed tube and

placed in a beaker of water in a thermal box (15° C) for 40 min. The semen was then

transferred to a refrigerator for a further 30 min, where it reached 4 °C. At the end of this time

period, another half part of extender containing glycerol (B-fraction) was divided into three

equal parts and added to the sample three times at 5 min intervals. After this dilution, the final

glycerol concentration in the extender was 6%. Sperm was packaged in 0.25 mL plastic

straws and frozen in nitrogen vapor (5 cm above surface of liquid nitrogen) before being

plunged into the liquid nitrogen (-196 °C). After 1 week, samples were thawed in a water bath

for 1 min at 37 °C. Twenty straws were obtained for each group, that is, two straws for

replicate (n= 10).

Sperm dilution

After collection, two aliquots of fresh semen were diluted in non-stored and stored

ACP

106 at a 1:4 dilution rate and kept at 37 °C in water bath for evaluation. Frozen-thawed

semen was diluted at a 1:0 and 1:4 dilution rate. For group using non-stored ACP

106, it was

prepared a new extender and for group using the one frozen stored, it was used a rewarmed

(37°C) solution for post-thaw dilution.

Semen evaluation

Sperm concentration

Sperm concentration was measured by counting in a Neubauer chamber.

Sperm motility

Sperm motility (%) was assessed using light microscopy (100x magnification).

Spermatozoal longevity (thermoresistance test) was verified in fresh and frozen-thawed

semen. Semen was kept at 37 °C in water bath and motility was evaluated at 0, 30, 60, 90 e

120 minutes after dilution.

Sperm morphology and acrosomal status

Sperm cell morphology and acrosomal status were evaluated by phase-contrast microscopy

(1000x) analyzing a slide stained with Bengal Rose (RODRIGUES, 1997), counting 200 cells

per slide. Acrosome was classified as normal, detached, lost or presenting cysts, swelling or

abnormal distribution (OETTLÉ, 1993). Normal sperm rate and acrosomal status were

evaluated immediately after collection and 60 minutes pos-dilution. In frozen thawed semen,

analysis was performed immediately after thaw and after 60 min only in 1:4 diluted samples.

Hypo-osmotic swelling test (HOST)

For the evaluation of sperm membrane function, a HOST (England and Plummer,

1993) was performed for fresh and frozen-thawed semen. A hypo-osmotic solution at 150

mOsm/L, constituted by 7.35g sodium citrate plus 13.51g fructose dissolved in 1000mL

distilled water was used. After collection and immediately after thawing, 0.01mL semen was

diluted in 0.09mL hypo-osmotic solution and kept in a water bath at 37ºC. After 45 min, 200

spermatozoa were counted and the ones presenting swollen coiled tails were considered as

presenting a functional sperm membrane (ENGLAND AND PLUMMER, 1993).

Statistical analysis

The data were expressed as mean and standard deviation and were analyzed by the

Statview 5.0 software (SAS Institute Inc., 1998). Percentage data were subjected to arcsine

transformation.

The effects of the extender storage on progressive sperm motility, morphology,

acrosome integrity and HOST as well as the effects of post thawing dilutions and incubation

period on sperm motility and morphology were evaluated by the Student’s t test (P < 0.05).

To evaluate dog effect and their interactions with effects of the storage and post thawing

dilutions on the variables considered in the study, data were subjected to analysis of variance

followed by Fisher’s PSLD test (P < 0.05).

Presence of correlations among post thaw sperm motility and morphologically normal

spermatozoa, normal acrosomes, HOST and sperm motility at 60 and 120 min were analyzed

by Spearman’s Correlation Test (P < 0.05) only for 1:4 diluted samples using non-stored and

stored ACP

106.

Results

During incubation at 37 °C, motility for fresh semen was similar for both extenders (Table 1).

After thawing, there was no difference between extenders either post-thaw dilution rates,

except for group using stored ACP

106; where it was observed a higher motility for 1:4

dilution rate at 90 minutes (Table 1). Moreover there was a significant decline on motility

after thawing (Table 1).

Normal sperm and acrosome rates (fresh and frozen-thawed semen) during 60 minutes

incubation were similar for non-stored and stored ACP

106 (Table 2 and 3). In both

extenders, there was not a significant decrease on these parameters immediately after thawing.

During post-thaw incubation at 37 °C , a significant reduction on normal sperm and acrosome

rates at 60 minutes was observed only in the group using stored ACP

106 (Table 2 and 3).

Moreover, there was no difference between post-thaw acrosome abnormalities rate, except for

a significant increase on absent acrosomes at 60 minutes using stored ACP

106 (Table 3).

Regarding HOST, 95.3 ± 2.8% sperm with functional membrane were observed in

fresh semen. A significant reduction (P < 0.05) in sperm membrane functionality was found

after thawing for both treatments, although no differences were observed between extenders.

Values of 53.6 ± 9.3% and 53.1 ± 17.1% normal functional spermatozoa were observed after

thawing for non-stored and stored ACP

106, respectively.

The effect of the dog was significant on post-thaw sperm normal rate but not on

normal acrosome rate. Moreover, this effect was observed on post-thaw sperm motility at 30

and 90 minutes during incubation at 37 °C. Regarding post-thaw sperm motility, there was an

interaction between dog and kind of extender (stored or non-stored) at 30 and 90 min

incubation and an interaction between the extender and dilution rate at 90 min.

Using non-stored ACP

106, there was a significant correlation (P<0.05) between

HOST after thawing and post-thaw normal sperm rate at 60 minutes incubation (r

=73.6%).

Furthermore, it was found a significant correlation between motility (post-thaw) at 60 min and

at 120 min for non-stored (r

=73.9%). and stored ACP

106 (r

=67.9%).

Discussion

This work aimed to test the effect of storage at –10 °C on efficiency of ACP

106 for canine

semen freezing. There was no difference between stored and non-stored extender regarding

100

post-thaw motility and morphology. However it would be of great value to make a

biochemical analysis to evaluate the effect of freezing on biochemical constitution. Moreover,

it was observed that ACP

has the disadvantage to no permit a complete dissolution of egg

yolk in the solution, increasing the amount of debris which can affect the sperm motility

(HIRAI et al., 1997). Further studies are necessary to check the ideal concentration of egg

yolk in this extender. Nevertheless, post-thaw dilution improved the evaluation of sperm

motility.

Immediately after thaw, motility observed in this study was similar to that reported by Peña

and LINDE-FORSBERG (2000) using 1:0 and 1:4 post-thaw dilution rates but these authors

found a significant effect of this feature on progressive sperm motility immediately after

thaw. Like in the present work, these authors didn’t find differences between post-thaw

dilutions during 120 minutes incubation.

After 60 min incubation, motility in the present work was a little lower than the values

reported by ROTA et al., (1997) using a Tris-egg yolk extender. However, PEÑA AND

LINDE-FORSBERG (2000) and ROTA et al. (1997) using a Tris-egg yolk extender plus

Equex STM paste found a much better longevity post-thawing. Probably, these better results

can be influenced by use of Equex STM paste, where these authors reported that both viability

and longevity were enhanced by using this substance. The active compound in Equex STM

paste is thought to be the detergent SDS, which probably exerts its action through the

alteration of the egg yolk contained in the extender (PURSEL et al., 1978).

Post-thaw injury to spermatozoa and to other viable cells due to the abrupt removal of

glycerol is usually attributed to the occurrence of osmotic shock (FRIM AND MAZUR, 1983,

SCHNEIDER and MAZUR, 1984).This osmotic stress would be more pronounced when

thawed spermatozoa are further diluted in a glycerol-free medium because it induces an

abrupt removal of glycerol from the spermatozoa to reach the equilibrium on both sides of the

101

plasma membrane, and, therefore, cells have to accommodate new volumes changes in

addition to those suffered during the thawing. However, in this work, it was not observed a

significant effect of post-thaw dilution on sperm motility.

Although values for post-thaw motility were low after 60 minutes incubation, sperm

and acrosome normal rate were still high for stored and non-stored ACP

106 (Table 2 and 3).

PEÑA and LINDE-FORSBERG (2000) reported that the osmotic stress after thawing can

impair the straight movement of spermatozoa but maintaining intact sperm membranes.

Probably the high acrosoma normal rate could be, in part, caused by an inefficacy of Bengal

Rose stain to evaluate acrosomal damage.

The type of injury to frozen-thawed spermatozoa is characterized by swelling and

coiling of the distal end of the sperm tail. The osmotic shock phenomenon can be used as a

measurement of sperm behavior to osmotic conditions (CORREA and ZAVOS, 1995). Since

osmotic shock involves structural changes on the sperm membrane, its functional status must

be evaluated (CORREA and ZAVOS, 1995). For data pooled across extenders (stored and

non-stored ACP

106), the tail defects were the most observed.

In this experiment, it was evaluated the functional integrity of sperm membrane by

hypoosmotic test (HOST). During the HOS test, the biochemically active spermatozoa, when

exposed to hypoosmotic stress due to the influx of water, undergoes swelling and

subsequently increases in volume to establish an equilibrium between the fluid compartment

within the spermatozoon and the extracellular environment (JEYENDRAN et al., 1984). The

percentage of functional sperm membrane was approximately 53% for both extenders and

these values are close to values for motility immediately after thawing. Maybe, almost all of

mobile spermatozoa maintained a functional membrane after freezing-thawing process.

The present work found a correlation only between HOST after thawing and post-thaw

normal sperm rate at 60 minutes incubation using non-stored ACP

and motility (post-thaw)

102

at 60 min and at 120 min for non-stored and stored ACP

106. OETTLÉ (1986) observed

that motility of dog spermatozoa during cooling and after freezing does not correlate well

with acrosomal integrity.

The significant effects of dog upon the post-thaw sperm motility (30 and 90 min incubation)

and sperm normal rate confirm the suitability of using ejaculates from different dogs as

subjects in a repeated measurement experimental design (STEEL E TORRIE, 1980).

Conclusion

The storage at –10°C did not decrease the efficiency of ACP

106 for canine semen

cryopreservation. The ACP® 106 storage in a frozen form would provide a more practical

freezing protocol. Post-thaw dilution did not influence the pos-thaw survival during

incubation at 37 °C, but this procedure improves the evaluation of sperm motility for decrease

viscosity in the extender.

Acknowledgments

The authors thank Dr. José Ferreira Nunes and Dr. Cristiane Clemente de Melo Salgueiro for

providing ACP

106, DVM DC Uchoa for providing the animals and Intervet for providing

ultra-pure water for extenders prepare. This research was supported by CNPq (Research

Nacional Council/Conselho Nacional de Pesquisa). RCS Cardoso and AR Silva are supported

by grants from CAPES, and LDM Silva by grant from CNPq.

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105

Table 1. Sperm motility (%) of non-stored and frozen-thawed canine semen using non-stored or stored ACP

106 during incubation at 37 °C for

120 minutes

Fresh semen Frozen-thawed semen

Non-stored ACP

106 Stored ACP

106

Time Non-stored *

ACP

106

Stored *

ACP

106

1:0 1:4 1:0 1:4

0 94.2 ± 2.9

94.2 ± 2.9

59.0 ± 12.9

63.0 ± 11.6

58.0 ± 17,5

58.5 ± 17.3

30 84 ± 4.6

82.0 ± 10.1

37.0 ± 17.7

34.0 ± 14.3

37.0 ± 20,6

39.6 ± 21.7

60 62.0 ± 21.4

64.5 ± 25.9

Abc

15.0 ± 17.6

13.0 ± 10.3

8.7 ± 13.6

18.6 ± 17.5

90 30.8 ± 23.3

33.3 ± 23.4

Acd

6.0 ± 10.8

5.5 ± 12.6

0.1 ± 0.3

11.1 ± 15.2

ABc

120 40 ± 31.4

39.0 ± 30.4

1.0 ± 3.2

2.6 ± 6.3

0.0 ± 0.0

2.0 ± 3.5

* Diluted one part semen to four parts extender (1:4)

A,B

Values followed by different capital letters differ between columns (P < 0.05 - Student’s t test);

a,b,c,d

Values followed by different lower case letters differ between rows (P < 0.05 - Student’s t test);

106

Table 2. Sperm morphology (%) of fresh and frozen

thawed canine semen using non

stored or stored ACP

106 during incubation at 37

°C for 60

minutes

Fresh semen Frozen-thawed semen

Non-stored

ACP

106 *

Stored

ACP

106 *

Non-stored

ACP

106 *

Stored

ACP

106 *

0 ' 60 ' 0 ' 60 ' 0 ' 60 ' 0 ' 60 '

Normal sperm

95.0 ± 4.9 A 83.7 ± 19.4 AB

95.0 ± 4.9 A 92.1 ± 4.3 A 92.0 ± 2.9 AB 87.6 ± 6.5 B 93.7 ± 2.2 A 90.6 ± 3.4 B

Abnormalities

Head

3.0 ± 3.9 AB 2.4 ± 2.1 AB 3.0 ± 3.9 AB 3.4 ± 2.7 AB 2.0 ± 2.0 A 3.6 ± 2.2 AB 1.9 ± 1.4 A 2.4 ± 2.1 B

Midpiece

0.3 ± 0.4 A 0.6 ± 0.7 A 0.3 ± 0.4 A 0.5 ± 0.5 A 0.6 ± 0.6 A 0.2 ± 0.4 A 0.3 ± 0.3 A 0.4 ± 0.4 A

Tail

1.6 ± 1.1 A 13.0 ± 18.2 BC 1.6 ± 1.1 A 3.9 ± 2.2 B 4.9 ± 2.2 BC 8.1 ± 4.8 C 4.0 ± 2.8 B 4.5 ± 3.1BC

Total

5.0 ± 4.9 A 16.3 ± 19.4 AB

5.0 ± 4.9 A 7.9 ± 4.4 AB 8.0 ± 2.9 AB 12.4 ± 6.5 B 6.3 ± 2.2 A 9.4 ± 3.4 B

* Diluted one part semen to four parts extender (1:4)

A,B

Values followed by different capital letters differ between columns (P < 0.05 - Student’s t test).

107

Table 3. Acrosomal status (%) of frozen-thawed canine semen using non-stored or frozen-rewarmed ACP

106, under dilution of one part semen

to four parts extender (1:4).

Fresh semen Frozen-thawed semen

Non-stored *

ACP

106

Stored *

ACP

106

Non-stored ACP

106 Stored ACP

106

Acrosome

0 ' 60 ' 0 ' 60 ' 0 ' 60 ' 0 ' 60 '

Normal 99.7 ± 0.6 A 98.9 ± 1.8 A 99.7 ± 0.6 A 98.8 ± 1.8 A 98.77 ± 1.87A 97.50 ± 2.06AB 98.81 ± 1.09A 96.87 ± 2.28B

Absent 0.0 ± 0.0 A 0.0 ± 0.0 A 0.0 ± 0.0 A 0.1 ± 0.2 A 0.00 ± 0.00A 0.47 ± 1.31A 0.09 ± 0.18A 0.65 ± 0.54B

Swollen 0.1 ± 0.2A 0.4 ± 0.7AB 0.1 ± 0.2A 0.4 ± 0.7AB 0.20 ± 0.26AB

0.41 ± 0.32B 0.42 ± 0.59AB 0.52 ± 0.52AB

Breakaged 0.2 ± 0.6A 0.5 ± 0.9AB 0.2 ± 0.6A 0.7 ± 1.8AB

0.71 ± 1.75AB 1.19 ± 1.37B 0.54 ± 0.76AB 1.40 ± 1.68B

Cystic 0.0 ± 0.0A 0.2 ± 0.4AB 0.0 ± 0.0A 0.1 ± 0.3AB 0.33 ± 0.88AB 0.45 ± 0.79AB 0.15 ± 0.24AB 0.46 ± 0.59B

Abnormal 0.1 ± 0.3 A 0.2 ± 0.7AB 0.1 ± 0.3A 0.0 ± 0.0AB 0.00 ± 0.00AB 0.00 ± 0.00B 0.00 ± 0.00AB 0.10 ± 0.30AB

* Diluted one part semen to four parts extender (1:4)

A,B

Values followed by different capital letters differ between columns (P < 0.05 - Student’s t test);

108

8. CAPÍTULO 3

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL FERTILIZANTE DE

ESPERMATOZÓIDES CANINOS CONGELADOS-

DESCONGELADOS COM ACP-106

UTILIZANDO O TESTE IN

VITRO DE INTERAÇÃO ESPERMATOZÓIDE-OÓCITO

(Evaluation of in vitro fertilizing potential of frozen-thawed dog spermatozoa

diluted in ACP-106

using an in vitro sperm-oocyte interaction assay)

Reproduction in Domestic Animals, artigo submetido para publicação

109

Evaluation of fertilizing potential of frozen-thawed dog spermatozoa diluted in

ACP

106 using an in vitro sperm-oocyte interaction assay

Rita de Cássia S. Cardoso

, Alexandre R. Silva

, Lúcia D. M. Silva

, Viviane H. Chirinéa

Fabiana F. Sousa

, Maria D. Lopes

Laboratory of Carnivore Reproduction – FAVET, UECE, Paranjana 1700, Itaperi, 60740-

000, Fortaleza, Ceará, Brazil

Laboratory of Reproduction of Small and Wild Animals – Department of Animal

Reproduction and Veterinary Radiology, FMVZ, UNESP, Distrito de Rubião Júnior, 18618-

000, Botucatu, São Paulo, Brazil.

Laboratory of Animal Reproduction - UNIRP, Rod. BR 153, Km 69, São José do Rio Preto,

São Paulo, Brazil

Abridged title: Evaluation of frozen dog semen using a gametes interaction assay

110

Contents

The aim of present study was to evaluate frozen canine semen with ACP

106 using

an in vitro sperm-oocyte interaction assay (SOIA). Ten ejaculates from five stud dogs were

diluted in ACP

106 containing 20% egg yolk, submitted to cooling in a thermal box for 40

minutes and in a refrigerator for 30 minutes. After this period, a second dilution was

performed using ACP

106 containing 20% egg yolk and 12% glycerol. Samples were thawed

at 38 °C for 1 minute. Post-thaw motility was evaluated by light microscopy and by using a

computer aided semen analysis (CASA). Plasma membrane integrity and sperm

morphology/acrosomal status were evaluated by fluorescent probes (C-FDA/PI) and Bengal

Rose, respectively. Moreover, frozen-thawed semen was analyzed by a sperm-oocyte

interaction assay. Subjective post-thaw motility was 52.0 ± 14.8% and it was significant

higher than the total motility estimated by CASA (23.0 ± 14.8%) because this system

considered the egg yolk debris as immotile spermatozoa. Although normal sperm rate and

acrosomal integrity evaluated by Bengal Rose stain was 89.6 ± 3.1 and 94.3 ± 3.1%,

respectively, post-thaw percentage of intact plasma membrane was only 35.1 ± 14.3%.

Regarding SOIA, the percentage of interacted oocytes (bound, penetrated and bound and/or

penetrated) was 75.3%. Using regression analysis, it was found significant relations between

some CASA patterns and data for SOIA. In conclusion, the freezing-thawing procedure using

ACP

106 was efficient for maintain the in vitro fertility potential of dog spermatozoa.

111

Introduction

Despite the widespread use of conventional semen analysis under light microscopy in

which semen samples are analyzed for characteristics of motility, morphology and

concentration, the method is subjective and may be unreliable (Linford et al. 1976). The

ultimate functional test is the ability of the spermatozoon to fertilize the oocyte.

The oocyte penetration assay is a more rapid test of spermatozoal function than in

vitro fertilization since simply assesses the presence of decondensing spermatozoal heads

within the oocyte (Hewitt and England, 1997). Tests to determine the capacity of spermatozoa

to bind and penetrate intact zona pellucida or hemizonae have been applied in the canine

species (Hay et al. 1997; Mayenco-Aguirre and Pérez Cortés, 1998, Ström-Holst et al. 2001).

The results suggest that these tests are useful for evaluating canine sperm function (Ström-

Holst et al. 2001).

In vitro methods for the prediction of the fertilizing potential of a semen sample are

important both when developing new methods for cool storage or deep freezing of semen and

when evaluating the fertility of an individual male. Protocols for canine semen freezing had

been evaluated by sperm-oocyte interactions test (Ivanova et al. 1999, Ström Holst et al.

2000a).

Cryopreservation of canine semen using powder coconut water (ACP

106) extender

had only been evaluated by gross evaluation and the post-thaw values for these characteristics

were acceptable for artificial insemination (Cardoso et al. 2004). ACP

106 can be another

alternative for canine semen freezing as it presents good extender characteristics such as

atoxicity, isotonicity, buffering system and elements necessary for sperm metabolism.

However, other more accurate methods are necessary to check the efficiency of ACP

106,

112

since a combination of tests measuring different aspects of sperm function provides

information about several different sperm characteristics required for fertilization. The

commercialization of ACP

106 will take place earlier if its efficiency is confirmed.

The aim of present study was to evaluate the functional status of cryopreserved dog

spermatozoa that had been frozen in ACP

106 extender by means of sperm-oocyte

interaction assay.

Material and Methods

Semen collection and evaluation of ejaculates

Semen was collected by manual stimulation twice from five dogs of different breeds (one

Brazilian Mastiff and four Boxers), aged one to six years, from a private kennel. Each dog

selected for experiment presented sperm motility of = 80%, = 20% of sperm defects, as

estimated subjectively using light microscopy (100x). Sperm concentration was measured

using a Neubauer counting chamber and should be > 200 x 10

spermatozoa/mL.

Sperm freezing

ACP

106 (ACP Produtos Biotecnológicos

, Fortaleza-Ceará, Brazil) was prepared

according to the manufacturer's recommendation. This solution was stored at -10 °C and at

the moment of freezing, it was rewarmed. The ACP

106 solution was divided into two

fractions. The A-fraction extender consisted of stock solution containing 20% egg yolk. The

B-fraction was prepared from “A” but containing 12% glycerol (v/v). The pH and osmolarity

of ACP

without egg yolk and glycerol was standardized for pH 6.6 and 300mOsm/L

respectively.

113

After the initial analysis, semen was initially extended in ACP

106 (A-fraction) at

room temperature (27ºC). A cooling period was then allowed when the semen was stored in a

sealed tube and placed in a beaker full of water in a thermal box (15° C) for 40 min. The

semen was then transferred to a refrigerator for a further 30 min, where it reached 4 °C. At the

end of this time period, another part of extender containing glycerol (B-fraction) was divided

into three equal parts and added to the sample three times at 5 min intervals. After this

dilution, the final glycerol concentration in the extender was 6% and the final dilution

provided a sperm concentration of 200 x 10

spermatozoa/mL. Sperm was packaged in 0.25

mL plastic straws and frozen in nitrogen vapor (5 cm above surface of liquid nitrogen) before

being plunged into the liquid nitrogen (-196 °C). After 15 days, samples were transferred to a

dry-shipper and transported to another laboratory for further analyses. Immediately before

evaluations, samples were thawed in a water bath at 38 ºC for 1 minute.

Computer aided semen analysis (CASA)

The Hamilton-Thorne computer-aided semen analyzer, version 10 Ivos (HTR

analyzer, Hamilton-Thorne Research, Beverly, MA, USA), validated for dog semen analysis

(Iguer-Ouada and Verstegen, 2001), was used to objectively assess motility parameters. After

thawing, semen samples (10µL) were mounted on a Makler chamber and allowed to settle 1

min before the analysis at 38ºC by a phase-contrast microcopy system with stroboscopic

illumination, which was a compound of the HTR analyzer. Three different, non-consecutive,

randomly selected microscopic fields were scanned by the Ivos 10. The data were

computerized and mean ± SD values generated.

The following parameters were measured for each sample: the number of counted

cells; the percentage of total motile spermatozoa; the percentage of progressive motile

spermatozoa; velocity average pathway (VAP) - the average velocity of smoothed cell path in

114

µm/sec; the velocity straight line (VSL) - the average velocity measured in a straight line from

the beginning to the end of track in µm/sec; the curvilinear velocity (VCL) – the average

velocity measured over the actual point-to-point track followed by the cell in µm/sec; the

amplitude lateral head (ALH) – amplitude of lateral head displacement in µm; the beat cross

frequency (BCF) – frequency of sperm head crossing the sperm average path in Hertz; the

straightness (STR) – the average value of the ratio VSL/VAP in percentage (straightness

estimates the proximity of the cell path to a straight line, with 100% corresponding to the

optimal straightness); and the linearity (LIN) – the average value of the ratio VSL/VCL in

percentage (linearity estimates the proximity of the cell track to a straight line). According to

low VAP cut-off (LVV) and medium VAP cut-off (MVV), the overall sperm population was

subdivided in 4 categories: Rapid, with VAP > MVV; Medium, with (LVV < VAP < MVV);

Slow, with VAP < LVV; and Static, constituted by the fraction of all cells which are not

moving during the analysis.

Plasma membrane integrity

Sperm membrane integrity was assessed using 6-carboxy-fluorescein diacetate (C-

FDA) and propidium iodide (PI), as described by Rota et al. (1997). Thawed semen (10µL)

was diluted with staining medium (40 µL) and incubated for ten minutes. A 5 µL of stained

suspension was placed on a slide and covered with a coverslip and the fields were observed

with epifluorescence microscopy (LEICA – Episcopic Fluorescent Attachment “EFA”

Halogen Lamp Set, Sweden). For each sample stained with C-FDA/PI, 200 sperm cells were

counted and classified as having (stained in green with C-FDA and unstained with PI ) or not

(stained partial or totally in red with PI) an intact plasmalemma.

Sperm morphology

115

Sperm morphology was evaluated by phase-contrast microscopy (1000x) analyzing a

slide stained with Bengal Rose, counting 200 cells per slide. Sperm morphologic

abnormalities were classified as primary and secondary (Silva et al. in press).

Sperm-oocyte interaction assay (SOIA)

Oocyte preparation

Ovaries were obtained from 22 bitches of unknown age or cycle stage and collected

after ovariohysterectomies and transported to the laboratory in warm saline (38°C) within 2 h

of surgery. Ovaries (n=44) were dissected from the tracts in sterile saline plus gentamicine,

washed and placed in sterile 35mm gridded dishes with 10 ml Phosphate Buffer Saline (PBS)

containing 0.4% w/v bovine serum albumin (BSA). Oocytes were recovered from the ovarian

cortex by slicing finely the ovary with a scapel (#22 blade). After removal of debris, the dish

was analyzed under a stereomicroscope and Cumulus-oocyte complexes with a uniformly

dark ooplasm, an intact zona pellucida and a multilayered cumulus cell mass (Grade 1) were

selected for experiment. Selected oocytes were washed five times in PBS and transferred to

95µL droplets (10ova/droplet) of TALP containing 0.3% w/v BSA. Droplets (n=3) were

overlaid with mineral oil equilibrated with sterile saline and maintained at 38 °C for 30

minutes under humidified atmosphere containing 5% CO2 before co-incubation with sperm

(Hay et al. 1997).

Sperm preparation

Semen samples were thawed (38 °C) and evaluated for sperm motility. Spermatozoa

were washed at room temperature, suspended in TALP (1:1) and centrifuged at 700G/5min.

The supernatant was discarded and sperm pellet was adjusted at 40 x 10

motile cells/ml by

dilution in Sperm-TALP.

116

Sperm–oocyte binding and penetration assay

Sperm suspension (5µL) was added to the oocytes in each droplet of TALP to create a

final volume of 100µL, resulting in a final concentration of 2 x 10

motile sperm/ml. A

minimum of 30 oocytes (3 droplets) was used per replicate. The droplets with spermatozoa

and oocytes were incubated for 18h at 38ºC under humidified atmosphere containing 5%CO2

and 95% air. After incubation, the oocytes were washed in PBS plus BSA and transferred to

1% sodium citrate solution for 10 min at room temperature to expand cumulus cell and then

vortexed for 3 min to detach cumulus cells, aiming to facilitate the observation of

spermatozoa that had firmly bound to the zona pellucida or had penetrate the ooplasm. For

staining both bound and penetrated sperm heads, oocytes were transferred to Hoechst 33258

in 2.3% Na-citrate (100µL/mL) for 20 minutes. Stained oocytes were placed on a clean slide

and sandwiched with a coverslip supported by silicon to prevent damage to the oocytes (Hay

et al. 1997). The counts were made under fluorescent examination (LEIKA – Episcopic

Fluorescent Attachment “EFA” Halogen Lamp Set /400x, Sweden) to identify the percentage

of oocyte with spermatozoa bound to the zona pelucida, oocyte penetrated by spermatozoa

into the perivitelline space or ooplasm, and the number of spermatozoa bound plus penetrated

to the oocytes. From these data, it was calculated the percentage of oocytes bound or

penetrated by spermatozoa and the percentage of oocytes interacted to spermatozoa (bound

and/or penetrated).

Statistical analysis

Ten replicates were used in this study. Sperm cell characteristics and data for zona

pellucida binding assay were reported as means ± SD and analyzed by the Statview 5.0

software (SAS Institute Inc., Cary, 1998). A simple linear regression model was applied to

identify the correlations between sperm-oocyte interactions and sperm parameters, which

117

were considered as independent variables. A Spearman correlation test was applied to verify

correlations among results of sperm motility evaluated by light microscopy and CASA.

Probabilities < 0.05 were considered significant.

Percentage data were Arcsine transformed. Differences regarding sperm populations

and plasma membrane integrity were verified by Student’s t test (P<0.05). The existence of a

dog effect on all the parameters studied was verified by analysis of variance followed by

Fisher’s PLSD test (P<0.05).

Results

The overall characteristics of fresh semen were: 1030.3 ± 600.2 x 10

spermatozoa/mL

concentration, percentage of sperm motility ranged from 90 to 100% (97.5 ± 3.5) and the

proportion of morphologically normal spermatozoa was 92.5 ± 3.4%. There was no difference

among dogs in sperm characteristics before freezing.

Post-thaw sperm quality patterns are shown in Table 1. Sperm motility patterns were

subjectively evaluated by light microscopy (400x) and by CASA (Hamilton Thorne Analyzer

IVOS 10). Unfortunately, CASA was not so accurate for the analysis of frozen-thawed canine

semen using ACP

106. Although the subjective motility was correlated with total motility

determined by CASA, the latter was significant lower than the first (Student’s t test, P< 0.05).

Moreover, a significant higher percentage of static sperm population was observed and this

had not observed on subjective evaluation. It was sometimes necessary to dilute the sample

with saline (1:1) because viscosity was too high and the CASA could not perform the

analysis.

Regarding plasma membrane integrity (Table 1), the percentage of non-intact

spermatozoa was significant higher than the intact ones (P = 0.01). The group of non-intact

spermatozoa included those with a damaged plasmalemma but intact acrosoma, when the

118

acrosome stained green with C-FDA but the post-acrosomal region stained red with PI, and

those that had both a damaged plasmalemma and a damaged acrosomal membrane, when the

cells remained unstained with C-FDA but stained red with PI (Rota et al. 1997). Sperm

abnormalities were represented mainly by secondary defects (damaged acrosomes and coiled

tails).

For sperm-oocyte interaction assay, 5.71 ± 2.21 ovaries were used for each replicate.

The number of oocytes obtained from each ovary ranged from 0 to 103. A total of 1247

oocytes were evaluated, from those 710 of them were Grade 1 and 30 Grade 1 oocytes were

used for each frozen-thawed semen sample. The data for SOIA are shown in figures 1 and 2.

We found significant relationships between sperm parameters and SOIA data, as

shown in Table 2. Moreover, an effect of the individual dog was observed on VAP values

(P=0.04).

Discussion

Evaluation of frozen-thawed semen with ACP

106 by CASA presented some

problems. We believed that total and progressive motility were underestimated since we

observed a higher motility by subjective analysis. This fact can be explained in the following

way. It was observed that egg yolk is not totally dissolved when ACP

is used, increasing the

amount of debris that can be recognized by CASA as immotile spermatozoa. Hirai et al.

(1997) described the effect of the egg yolk percentage on the viscosity of extenders and

motility of spermatozoa evaluated by using a computer-assisted system. These authors

reported that any factor that changes the pattern of sperm motion could affect parameters like

the percentage of progressively motile spermatozoa. It is well established that the viscosity in

the medium surrounding the spermatozoa affects the pattern of sperm motion (Amman and

Hammerstedt, 1980). Hirai et al. (1997) demonstrated that the addition of egg yolk could alter

119

the movement pattern of spermatozoa, and increasing amounts of egg yolk in the extender

decrease the velocity of progressively motile spermatozoa in frozen-thawed bull semen.

Moreover, they reported that this increase in the amount of egg yolk did not improve the

accuracy of computer-detected false spermatozoa, which were actually egg yolk particles or

debris. Verstegen et al. (2002) suggested that the extender used to dilute semen must not

contain particles of a size similar to sperm cells’ heads (e.g., non-clarified egg yolk and whole

milk extenders), because they will not be differentiated from non-motile sperm. Others

authors, however, reported that this problem can be solved by a solved by a special software

feature that can make an identification of tail-structures in immotile spermatozoa, reducing

the number of false sperms (Hirai et al. 1997). Nevertheless, Hirai et al. (1997) used an

analysis system that is different from the one used in our study. Further studies are necessary

to determine the ideal concentration of egg yolk in ACP

106 extender or to test methods that

can reduce or minimize the amount of egg yolk debris in the extender.

Regarding other motion patterns evaluated by CASA, we observed a high mean ALH,

which could suggest that the motile spermatozoa exhibited a hyperactivation movement, as

reported by Peña and Linde-Forsberg (2000a). VAP, VCL and VSL values were lower than

the one reported by Peña and Linde-Forsberg (2000a), possibly due the low number of motile

cells that were counted.

Our results of plasma membrane integrity after thawing (35.1%) were lower than the

one reported by Ström et al. (1997), Rota et al. (1997) and Peña and Linde-Forsberg (2000b).

Using the same fluorescent probes (C-FDA and PI), these authors found approximately 74%,

56% and 64%, respectively, of intact plasma membranes immediately post-thawing. The

plasma membrane integrity reflects sperm viability and the cryopreservation process damages

this membrane (Cormier et al. 1996, Correa et al. 1996). Cryopreservation can causes

irreversible damages to the plasma membrane and lead to cell death (Holt, 2000) or to

120

changes similar to those seen during sperm capacitation in the surviving spermatozoa,

shortening their lifetime (Pérez et al. 1996, Watson, 2000). These changes are caused by a

process named cryocapacitation (Cormier and Baley, 2003). Similarities between capacitated

and cryopreserved spermatozoa have been demonstrated regarding plasma membrane

reorganization and fluidization and calcium influx (Green and Watson, 2001). Plasma

membrane integrity and function are essential for cell viability, as the selective permeability

of the plasma membrane maintains intracellular metabolic activities, pH and ionic

composition. In the sperm cell, a functional plasma membrane is also essential for the events

leading to fusion with the oocyte (Curry and Watson, 1996). It is important to determine the

possible causes for a low percentage of intact plasma membrane. We found a high ALH that

could indicate a hyperactivation movement and this is a sperm feature indicative of

capacitation (Peña, 2004). Evidence about the involvement of reactive oxygen species (ROS)

on sperm capacitation has accumulated (Medeiros et al. 2002). An increased generation of

ROS may be a component of capacitation-like alterations observed in cryopreserved semen

(Medeiros et al. 2002). There is a substance named indol-3-acetic acid (IAA) on coconut

water (Nunes, 1995). Although its toxic effects are unknown, reactive oxygen species can be

formed after peroxidation and produce citotoxic substances (Pires de Melo et al. 1997). The

effects of ROS are prevented or diminished by the detoxifying enzymes superoxide dismutase

(SOD), catalase, peroxidases (GPx and PHGPx), and by reducing agents, such as glutathione,

ascorbic acid, taurine and hypotaurine, present in the sperm cell and sperm environment

(Hinton et al. 1995, Lapoint et al. 2000).

Regarding sperm morphology, secondary defects were observed most often, and are

considered to be less harmful to fertility than primary defects, although they represent

transient response to stress. It is obvious that a large proportion of spermatozoa with reflexed

mid-piece or coiled and bent tails will compromise motility and fertility (Peña, 2004).

121

Although the percentage of sperm membrane integrity was low (35.1%), the normal sperm

rate evaluated by Rose Bengal stain was high (89.6%), meaning that this evaluation should

not be used alone. Conventional staining methods for light microscopy are not suitable for the

assessment of cryopreserved spermatozoa because glycerol and egg yolk, essential ingredients

in most cryopreservation media for dog spermatozoa, interfere with most fixatives used in

differential staining. The use of fluorescent dyes has overcome this problem, as fluorescent

stained sperm can be used in assessing functional and morphological aspects without

interference of the extracelullar media (Peña, 2004).

The zona pellucida binding assay has been used for dog sperm evaluation (Hay et al.

1997, Ström Holst et al. 2000a,b). We used a methodology similar to Hay et al. (1997), but

we found approximately 15% of penetrated oocytes while their values were approximately

70%. However, these authors considered penetrated oocytes when spermatozoa were bound to

zona pellucida and or entered the ooplasm. When we put together the two categories in what

we called “interacted”, our results were similar to them. Ström Holst et al. (2000a) obtained

84 and 89% for oocytes with spermatozoa bound to zona pellucida after gentle and tough

washing of the sperm–oocyte complexes, respectively.

We found some significant relationships between CASA patterns and data for SOIA.

However, it is important to emphasize that total and progressive motility was underestimated

by CASA as previous reported. Thus, the use of CASA patterns (total and progressive

motility) as a predictor of sperm-oocyte interactions using frozen-thawed semen with ACP

106 is not suitable. Nevertheless, we can consider the normal acrossome rate as a prognostic

value for the number of spermatozoa that penetrate the ZP in vitro.

Canine semen freezing using ACP

106 was previously evaluated using only

subjective motility and gross morphology (Cardoso et al. 2004). These analyses showed that

ACP

106 is efficient for canine semen freezing. However, damage to associated molecular

122

binding structures cannot be detected using routine morphological techniques (Ström Holst et

al. 2000a). Therefore, the ability of the spermatozoon to bind to the zona pellucida is a

potentially valuable test when evaluating techniques for chilling and freeze–thawing semen

(Ström Holst et al. 2000a). In spite of the low percentage of intact plasma membrane, good

results were obtained in the present work (75%) for sperm-oocyte interactions (oocytes

bound, penetrated and bound and/or penetrated by spermatozoa). It has been suggested that

both acrosome-intact and acrosome-reacted spermatozoa are capable of binding to the ZP in

the canine species (Kawakami et al. 1993).

In conclusion, the freezing-thawing procedure using ACP

106 was efficient in

maintaining the in vitro fertility potential of dog spermatozoa.

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126

Table 1. Mean ± SD for the sperm quality parameters determined after freezing/thawing using

ACP

106

Sperm quality patterns Mean ± SD Range

Subjective motility (%) 52.0 ± 14.8 30 - 70

CASA patterns

Number of counted cells (%) 1076.5 ± 442.6 516.0 – 1793.0

Total of motile sperm (%) 23.0 ± 14.8 1.0 – 43.0

Progressive motility 18.0 ± 12.2 1.0 – 37.0

VAP (µm/sec) 85.3 ± 13.1 70.1 – 107.8

VSL (µm/sec) 76.9 ± 13.6 62.3 – 100.6

VCL (µm/sec) 111.5 ± 18.5 92.6 ± 146.3

ALH (µm) 4.8 ± 0.6 3.5 – 5.7

BCF (Hertz) 20.5 ± 5.1 15.3 – 29.3

Straightness (%) 89.6 ± 2.5 86.0 – 93.0

Linearity (%) 69.8 ± 4.5 65 – 77

Fast (%) 19.3 ± 12.6 1.0 – 38.0

Medium (%) 3.7 ± 2.4 0.0 – 8.0

Slow (%) 24.3 ± 13.5 3.0 - 48.0

Static (%) 52.6 ± 27.0 11.0 – 96.0

Intact membrane rate (%) * 35.1 ± 14.3 13.0 - 60.0

Normal sperm rate (%) 89.6 ± 3.1 83.6 – 92.0

Acrosomal integrity (%) 94.3 ± 3.1 91.3 – 99.3

VAP: velocity average pathway; VSL: velocity straight line; VCL: curvilinear velocity; ALH:

amplitude lateral head; BCF: beat cross frequency; * Evaluation by epifluorescency

microscopy.

127

65.6

15.5

75.3

100

Bound Penetrated Interacted

Oocytes (%)

Figure 1. Percentage of oocytes bound, penetrated and interacted (bound and/or penetrated)

by canine spermatozoa after freezing/thawing using ACP 106

(10 replicates).

128

1.96

1.51

2.04

Bound Penetrated Interacted

Spermatozoa

per oocyte

Figure 2. Number of canine spermatozoa per oocyte bound, penetrated and interacted (bound

and/or penetrated) to the zona pellucida after freezing/thawing using ACP 106

(10

replicates).

129

Table 2. Relationships between (Simple regression model) data for sperm-oocyte interaction

assay and results from different sperm parameters (independent variables)

Relations P value R value

Percentage of bound oocyte vs VCL 0.040 0.638

Percentage of penetrated oocyte vs total motility (CASA) 0.040 0.649

Percentage of penetrated oocyte vs progressive motility

(CASA)

0.048 0.636

Percentage of penetrated oocyte vs percentage of rapid

(CASA)

0.047 0.639

Number of bound spermatozoa vs VAP 0.005 0.811

Number of bound spermatozoa vs VSL 0.001 0.863

Number of bound spermatozoa vs VCL 0.004 0.817

Number of bound spermatozoa vs normal sperm rate 0.029 0.857

Number of penetrated spermatozoa vs VAP <0.001 0.911

Number of penetrated spermatozoa vs VSL 0.002 0.882

Number of penetrated spermatozoa vs VCL 0.003 0.865

Number of penetrated spermatozoa vs normal acrosome

rate

0.004 0.976

Number of interacted spermatozoa vs VAP <0.001 0.865

Number of interacted spermatozoa vs VSL <0.001 0.917

Number of interacted spermatozoa vs VCL 0.027 0.834

130

9. CAPÍTULO 4

INTEGRIDADE E MUDANÇAS ULTRA-ESTRUTURAIS NO

ESPERMATOZÓIDE CANINO FRESCO E APÓS

CRIOPRESERVAÇÃO COM ÁGUA DE COCO EM PÓ (ACP-

106

)

(Integrity and ultrastructural changes in fresh dog spermatozoa and after

cryopreservation with powder coconut water – ACP-106

)

131

Integrity and ultrastructural changes in dog spermatozoa after cryopreservation with powder

coconut water (ACP

106)

Running title: Ultrastructural changes of frozen dog spermatozoa

Rita de Cássia Soares Cardoso

, Alexandre Rodrigues Silva

, Viviane Helena Chirinéa

Lúcia Daniel Machado da Silva

, Maria Denise Lopes

Laboratory of Carnivore Reproduction – FAVET-UECE, Paranjana 1700, Itaperi, 60740-

000, Fortaleza, Ceará, Brazil

Laboratory of Reproduction of Small and Wild Animals – Department of Animal

Reproduction and Veterinary Radiology, FMVZ, UNESP, Distrito de Rubião Júnior, 18618-

000, Botucatu, São Paulo, Brazil.

Corresponding author: Major Weyne 662 Jardim América, 60415-730, Fortaleza – Ceará, Brazil.

Tel. + 55 34940856; E-mail address: cardosorcs@yahoo.com.br

132

Abstract

The structural details of any sperm morphoanomaly or the extent of membrane damage are

best evaluated using the high resolution of transmission electron microscopy. Dog

spermatozoa has been cryopreserved with a new extender that is powder coconut water

(ACP

106) but the fine appearance of canine spermatozoa after freezing-thawing using this

method has not been described. So, this work was aimed to characterize the ultrastructural

changes in canine spermatozoa after freezing-thawing using ACP

106 extender. Semen from

three dogs was collected by digital manipulation. Samples were extended in ACP

106-egg

yolk-glycerol, frozen and stored in liquid nitrogen (-196 °C). After thawing (37 °C), semen

was submitted to evaluation of acrosomal status by Bengal Rose stain, plasma membrane

integrity by fluorescent probes (C-FDA/PI) and sperm fine-structural appearance by

transmission electronic microscopy (TEM). Evaluation of acrosomal status by light

microscopy showed 7.8 % of abnormalities and the fluorescent probes revealed 67.3 % of

spermatozoa presented a non-intact plasma membrane. Regarding TEM results, the most post-

thawing changes observed on plasmalemma were swelling with plicae formation. The

ultrastructural acrosoma changes were swelling, vesiculation and loss of contents. The post-

thawing ultrastructural changes in frozen-thawed dog spermatozoa using ACP

106 extender

were similar to previous reports where the methods presented a high fertility rate. We can

suggest that ACP

106 might be efficient for freezing of canine semen like other extenders.

Key words: spermatozoa, dog, freezing, electronic microscopy.

133

Introduction

Automated sperm morphometric evaluation has the potential to eliminate several drawbacks

inherent to the current methods of sperm morphology evaluation, and allows for the

identification of subtle sperm characteristics that cannot be detected by visual light

microscopic evaluation. Canine sperm morphology assessment has been previously attempted

by means of scanning (SEM) and transmission electron microscopic (TEM) images [1-4].

These studies evaluated mainly the membrane and acrosomal damage that occurred following

cryopreservation, elucidating major changes in the acrosomal region after freezing and

thawing. The structural details of any sperm morphological anomaly or the extent of

membrane damage are best evaluated using the high resolution of transmission electron

microscopy [5,2].

The cryopreservation procedures currently used are known to induce a series of osmotic,

chemical and mechanical stresses to the sperm cells [6], causing not only the death of some

spermatozoa but severe latent damages in the sperm population that survives

cryopreservation, compromising the life span and fertilizing capacity of frozen-thawed

spermatozoa [7].

Dog spermatozoa have been cryopreserved with a new extender that is powder coconut water

(ACP

106) and evaluated for motility, morphology, acrosomal status and oocyte-sperm

interaction assay (unpublished data). The protocol for this extender has been improved after

new tests were performed. Before improving the cryopreservation method, however, it is

important to understand the effects of cryoinjury on the reduction of sperm longevity after

thawing. [4].

This study was carried out in order to characterize the type and extent of ultrastructural

changes present in canine spermatozoa after freezing-thawing using ACP

106 extender.

134

Material and Methods

Animals

Three proven stud dogs of different breeds, one Brazilian Mastiff and three Boxers,

from a private kennel were selected for this experiment. The dogs were aged from one to six

years. The animals were maintained in individual boxes and fed dry food once daily, with free

access to water.

Semen collection and freezing

Each dog was submitted to one seminal collection by manual stimulation, and the

sperm-rich fraction was used for the experiment. For sperm freezing, it was used ACP

106

extender (ACP Biotecnologia

, Fortaleza-Ceará, Brazil) that was prepared according to the

manufacturer's recommendation. This solution was stored at -10 °C and at the moment of

freezing, it was rewarmed. The ACP

106 solution was divided into two fractions. The A-

fraction extender consisted of stock solution containing 20% egg yolk. The B-fraction was

prepared from “A” but containing 12% glycerol (v/v). The pH and osmolarity of ACP

without egg yolk and glycerol was standardized for pH 6.6 and 300mOsm/L respectively.

After the initial analysis, semen was initially extended in ACP

106 (A-fraction) at room

temperature (27ºC). A cooling period was then allowed when the semen was stored in a

sealed tube and placed in a beaker full of water in a thermal box (15° C) for 40 min. The

semen was then transferred to a refrigerator for a further 30 min, where it reached 4 °C. At the

end of this time period, another part of extender containing glycerol (B-fraction) was divided

into three equal parts and added to the sample three times at 5 min intervals. After this

dilution, the final glycerol concentration in the extender was 6% and the final dilution

provided a sperm concentration of 200 x 10

spermatozoa/mL.Sperm was packaged in 0.25

135

mL plastic straws and frozen in nitrogen vapor (5 cm above surface of liquid nitrogen) before

being plunged into the liquid nitrogen (-196 °C). After 15 days, samples were transferred to a

dry-shipper and transported to another laboratory for further analyses. Immediately before

evaluations, samples were thawed in a water bath at 37ºC/1 min.

Acrosomal status

Post-thawing acrosomal status was evaluated by phase-contrast microscopy (1000x) analyzing

a slide stained with Bengal Rose, counting 200 cells per slide. Acrosome was classified as

normal, detached, lost, presenting cysts, swelling or abnormal distribution [1].

Plasma membrane integrity

Sperm membrane integrity was assessed using 6-carboxy-fluorescein diacetate (C-FDA) and

propidium iodide (PI), as described by Rota et al.[8]. Thawed semen (10µL) was diluted with

staining medium (40 µL) and incubated for ten minutes at room temperature (23°C). A 5 µL

of stained suspension was placed on a slide and covered with a coverslip and the fields were

observed with epifluorescence microscopy (LEICA – Episcopic Fluorescent Attachment

“EFA” Halogen Lamp Set, Sweden). For each sample stained with C-FDA/PI, 200 sperm

cells were counted and classified as having (stained in green with C-FDA and unstained with

PI ) or not (stained partial or totally in red with PI) an intact plasmalemma.

Semen processing for transmission electron microscopy

Semen samples from three dogs (both fresh and frozen-thawed semen) were individually

centrifuged at 720G / 5 min. Pellets were extended with 3% glutaraldehyde in phosphate

buffer and kept at 5ºC prior to procedure. For transmission electron microscopy, fixed

samples were pooled individually for each category (fresh and frozen-thawed semen), post-

136

fixed in phosphate buffer plus osmium tetroxide (1%), in acetone solutions and embedded in

Araldite. Ultra fine sections (50nm) were obtained and stained with uranyl acetate and lead

citrate before examination by a transmission electronic microscope (Philips CM 100,

German). Spermatozoa were documented by micrographs and results were subjectively

described.

Results

In fresh samples, most spermatozoa presented a normal appearance (Fig. 1a) but the plasma

membrane was often ballooning and had plicae (Fig. 1b). The electron-microscopic

examination showed that the spermatozoa subjected to freezing-thawing with ACP

106

presented great changes in their morphology, when compared to fresh semen.

After freezing-thawing, the changes observed most often on plasmalemma were swelling with

plicae formation (Fig 2.a) and, in most cases, remained apparently intact. Other changes

observed were vesiculation (Fig. 2 b-c) and disruption. Regarding the morphological changes

in the acrosome, TEM showed swelling (Fig. 2a, 3b), vesiculation (Fig. 2a) and loss of

electron-dense acrosomal material (Fig. 3a-b). An acrosomal defect commonly observed was

undulated contour (Fig. 2c).

Regarding plasma membrane integrity, it was observed a high rate of non-intact sperm plasma

membrane (67.3 %). Evaluation by Bengal Rose stain revealed 7.8% of acrossomal

abnormalities.

Discussion

An intact plasma membrane (PM) is a prerequisite for normal sperm function

including fertilization [9]. During the cryopreservation process, sperm membranes are

137

considered as the principal sites of damage associated with temperature changes [6,7]. The

integrity of sperm plasma membrane can be evaluated by hyposmotic test [10], fluorescent

probes [11], and scanning and transmission electron microscopy [3]. Although the

transmission electron microscopy (TEM) is labor intensive and time consuming, it can also

allow detailed examination of the acrosomal status. Bacetti et al. [12] reported that the study

of spermatozoon alterations in cases of human infertility has demonstrated that electron

microscopy can be a valuable tool in understanding not only the presence but also the nature

of the defects.

With regards to the integrity of the plasma membrane, most spermatozoa appeared to

have an intact membrane in spite of the swelling. According to Hurtgen and Johnson [13],

undulating plasma membranes and undulant acrosomes were also a regular acrosomal pattern

in fertile stallions, suggesting that these deviations are more due to fixation procedures than to

freezing procedures. Chirinéa et al. [14] reported the occurrence of slightly swollen

plasmalemma above the acrosomal region observed in fresh canine spermatozoa, and

explained that this is a consequence of the semen sample being exposed to glutaraldehyde

during fixation procedure for TEM. Moreover, canine spermatozoa suffer several alterations

in head region after cryopreservation, but plasmalemma seems to be intact

The most important changes after freezing-thawing are related to acrosomal status.

Although this experiment did not quantify the abnormalities, the main acrosomal defects were

swelling, vesiculation and loss of acrosomal contents. These defects are called capacitation-

like changes [15] and could be a result of acrosome reaction [16]. In fact, Rodriguez-Martinez

et al. [2] suggested that the alterations found in the fine structural appearance of canine frozen

semen could be interpreted as a false acrosomal reaction. The physical change of the

acrosome reaction after cryopreservation is an indication that the cell cannot fertilize, even

though it may be motile [16]. Similarities between capacitated and cryopreserved

138

spermatozoa have been demonstrated regarding plasma membrane reorganization and

fluidization and calcium influx [17].

Physiologically, some features can induce acrosome reaction such as intracellular

calcium [18], pH [19], inositol triphosphate [20] and dyacilglycerol [21]. Thus, glycerol might

be an important feature of the cryopreservation procedures leading to changes in acrosome.

Such changes were previously reported for frozen dog spermatozoa [2, 3]. Ström Holst

et al. [3] found 89% of swollen acrosomes after freezing-thawing using the CLONE method.

Since insemination with spermatozoa that was cryopreserved by this method resulted in high

whelping rates, it was suggested that swelling of the acrosoma does not impair fertilization.

For frozen-thawed spermatozoa with ACP

106, we can suggest the same explanation since

the defects were similar. Moreover, evaluation of frozen-thawed spermatozoa with ACP

106

by oocyte-sperm interaction assay (unpublished data) showed 75% of oocyte-sperm

interactions (oocyte bound, penetrated and bound plus penetrated by spermatozoa These

acrosomal defects do not impair fertilization, at least in vitro. Since acrosomal swelling might

short the cells life span, it is important to detect the ideal moment to perform artificial

insemination [22].

Although most of frozen-thawed spermatozoa presented acrosomal defects, evaluation

by phase contrast microscopy showed only 7.8 % of acrosomal defects, which has been

discussed by Rodriguez-Martinez et al. [2]. The intact membrane might account for low

percentages of acrosomal abnormalities usually reported when using phase contrast

microscopy alone. Nevertheless, evaluation by fluorescent probes (C-FDA/PI) was more

efficient and showed 67.3 % of non-intact membranes.

In addition, changes in mid-piece were still observed, as plasmalemma swelling and

damages in mitochondrial sheath like content disorganization. Burgess et al. [4] reported a

139

slight but not significant increase in the number of spermatozoa with damaged mid-piece

membranes after 4 h post-thaw incubation.

As reported previously, TEM was a valuable tool in performing a deep analysis of

spermatozoa since evaluation by phase contrast was not efficient in making a reliable analysis

of the acrosoma. Other authors reported a series of changes after freezing-thawing procedures

using different extenders. It was not different for ACP

106 and the changes found were

similar to those reported in previous studies. Thus, we can suggest that ACP

106 might be

efficient for freezing canine semen like other extenders. However, further in vivo studies are

necessary to confirm this hypothesis. Since many spermatozoa presenting acrosomal defects

were found, investigations have to be carried out to further improve this protocol.

Acknowledgements

The authors thank Dr. José Ferreira Nunes and Dr. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro for

providing ACP

106, DVM DC Uchoa for providing the animals and Intervet for providing

ultra-pure water for extenders prepare. This research was supported by CNPq (Research

Nacional Council/Conselho Nacional de Pesquisa). RCS Cardoso and AR Silva are supported

by grants from CAPES, and LDM Silva by grant from CNPq.

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142

Figure 1. Transmission electron micrographs of fresh dog spermatozoa. N: nucleus; A:

acrosoma. (a) Fresh spermatozoa presenting an intact acrosome and a plasmalemma in close

apposition with the acrosome (arrow). Magnification 1950X. (b) Spermatozoon presenting a

swollen plasmalemma but with an intact acrosoma. Magnification 8400X.

(a)

(b)

143

Figure 2. Transmission electron micrograph of dog spermatozoa after cryopreservation with

ACP

106. A: acrosoma; N: nucleus; E: equatorial region. (a) Spermatozoon with a swollen

intact plasma membrane with plicae (arrows). The acrosoma is swollen with an undulated

contour (white arrow head) and vesiculation (black arrow head). The equatorial region is

swollen. Magnification 8400X. (b) Vesiculated plasma membrane (arrows) and releasing of

acrosomal contents (arrow heads). Magnification 11500X. (c) Swollen plasma membrane

(black arrow) with areas of vesiculation (white arrow). Outer acrosoma membrane presents

areas of vesiculation (arrow heads). Equatorial region is intact. Magnification 8400X.

(a) (b)

(c)

N N

144

Figure 3. Transmission electron micrograph of dog spermatozoa after cryopreservation with

ACP

106. A: acrosoma; N: nucleus; E: equatorial region; PM: plasma membrane; OM: outer

acrosome membrane, MP: midpiece. (a) Swollen and intact plasma membrane (arrow). The

acrosome is disrupted and the contents are released (arrow heads). Mid-piece presents a

plasmalemma swelling and damages in mitochondrial sheath like content disorganization.

Magnification 6300X. (b) Plasma membrane, outer (arrow) and inner (arrow heads) acrosome

membrane are swollen and with plicae. Equatorial region is intact. Magnification 8400X.

(a)

(b)

145

10. DISCUSSÃO GERAL

Capítulo I: Comparação da eficiência de dois métodos de diluição na

criopreservação do sêmen canino utilizando os diluentes à base de água de coco in

natura (ACIN) ou em pó (ACP-106

)

Vários protocolos têm sido desenvolvidos para a congelação de sêmen

canino e os pesquisadores estão sempre tentando desenvolver métodos mais práticos e

com um menor custo. Uma solução fresca à base de água de coco in natura foi eficaz

para a congelação de sêmen da referida espécie (Cardoso et al., 2003), mas esta

solução não pode ser armazenada por mais que dois dias (dados não publicados).

Portanto, a água de coco em pó (ACP

) foi desenvolvida e já foi testada para o sêmen

de caprinos (Salgueiro et al., 2002) e equinos (Sampaio Neto et al., 2002). Para a

espécie canina, nenhum trabalho desenvolvido.

Como a solução à base de água de coco in natura já era eficiente para a

congelação de sêmen canino (Cardoso et al., 2003), era preciso realizar uma

comparação entre esta e a água de coco em pó para poder ser, futuramente, usada para

a congelação do sêmen da referida espécie. Além disso, há carência de informações

sobre alguns aspectos na criopreservação de sêmen canino. Um destes é o efeito da

diluição espermática. Os grupos de pesquisa trabalham com o sêmen congelado em

diversas concentrações, não se levando em conta que possa haver um efeito da mesma.

Este efeito consiste, principalmente, no fato de não se observar a quantidade de

glicerol por célula criopreservada. Portanto,objetivou-se comparar uma concentração

fixa de 200 x 10

/espermatozóides/mL com uma fixa de uma parte de sêmen: uma

parte de diluente nos meios à base de água de coco in natura ou em pó (ACP-106

146

O método de diluição não afetou a motilidade e o vigor espermático pós-

descongelação em ambos os diluentes, mas foi observado que a concentração

espermática pode prejudicar a avaliação da motilidade. Foi observado em nosso

trabalho que na concentração fixa de 200 x 10

/espermatozóides/mL há uma tendência

em subestimar a motilidade. Este fato já foi relatado por Garner et al. (2001) que

encontraram que a maior parte da dificuldade em avaliar tal parâmetro foi devido a

uma considerável variabilidade quando concentrações espermáticas menores foram

examinadas.

Os resultados deste experimento diferem do encontrado por Peña e Linde-

Forsberg (2000b) que, testando a diluição em concentrações espermáticas de 50, 100,

200 e 400 x 10

espermatozóides/mL, observou efeito da concentração espermática,

encontrando melhores resultados de motilidade progressiva imediatamente após a

descongelação com 200x 10

espermatozóides/mL.

Em nosso trabalho, não testamos diferentes concentrações espermáticas e

sim uma concentração fixa de 200x 10

espermatozóides/mL e uma diluição a uma

taxa constante de 1:1 (sêmen:diluente), sem levar em conta a concentração

espermática. Uma vez que a concentração espermática média dos ejaculados foi de 1,6

x 10

espermatozóides/mL, para a diluição a uma concentração de 200x 10

espermatozóides/mL, foi necessário utilizar um grande volume de diluente. De acordo

com Mann (1964), o espermatozóide dos mamíferos responde à diluição excessiva

exibindo perda de motilidade e aumento no número de espermatozóides mortos. Por

outro lado, a diluição a uma taxa constante, não leva em consideração a concentração

espermática, consequentemente havendo variação na quantidade de glicerol/célula.

Como a concentração espermática média foi de 1,6 x 10

espermatozóides/mL, após a

diluição (1:1), esta concentração foi de 800 x 10

espermatozóides/mL. Entretanto, é

importante lembrar que a concentração espermática variou de 530 a 2760 x 10

espermatozóides/mL. Então, após a diluição, este parâmetro variou de 265 a 1370 x

espermatozóides/mL. Dessa forma, a diluição a uma taxa constante pode levar a

uma grande variedade de resultados, mas esta diluição foi escolhida, pois é comumente

147

utilizada para a diluição não somente com a solução à base de água de coco (Cardoso

et al., 2003b) como em outros diluentes (Silva et al., 2003) para a congelação de

sêmen canino.

O método de diluição também não afetou o percentual de espermatozóides

normais após a descongelação. É provável que uma diluição excessiva altere o

metabolismo e até afete a motilidade, mas estas não sejam suficientes para causar

tantas anormalidades morfológicas. É importante notar que, em ambos os grupos, o

sêmen era de boa qualidade, estando em uma faixa ideal para realização de

inseminação artificial (Concannon & Battista, 1989).

Ainda há uma carência de informações sobre o efeito da concentração sobre

a congelação de sêmen canino. Peña & Linde-Forsberg (2000b) avaliaram os efeitos e

interações na congelação de sêmen canino com Tris e utilizando quatro diferentes

concentrações espermáticas (50 x 10

, 100 x 10

, 200 x 10

e 400x 10

espermatozóides/mL). No experimento citado, a motilidade espermática variou de 49,7

a 65,0% e o percentual de espermatozóides vivos variou de 55,0 a 63,7%. Estes

autores sugerem que espermatozóides caninos congelados em concentrações de 200 x

espermatozóides/mL e diluídos imediatamente após a descongelação com tampão

Tris em taxas de 1:2 ou 1:4 tem uma melhor sobrevivência do que quando congelados

em concentrações maiores ou menores.

Estudos em outras espécies, especialmente eqüinos, sugerem que a diluição

pode ter influência na sobrevivência espermática (Peña & Linde-Forsberg, 2000b).

Palacios et al. (1992) relatam uma melhor motilidade pós-descongelação quando

espermatozóides eqüinos foram congelados a uma concentração de 800 x 10

espermatozóides/mL quando comparados com 100 x 10

espermatozóides/mL. Para o

sêmen ovino, uma melhor sobrevivência espermática foi observada quando o sêmen

foi diluído a uma concentração constante de 900 x 10

espermatozóides/mL, onde a

quantidade de glicerol permanece constante, do que a uma taxa constante (1:4) quando

a quantidade de glicerol poderia ser variável. Isto sugere que o nível ótimo de glicerol

148

no sêmen diluído é provavelmente associado a uma concentração final em relação ao

espermatozóide (Colas, 1975). No tocante ao sêmen bovino, Garner et al. (2001)

relataram que altas diluições são mais prejudiciais à função mitocondrial.

Não foi observado um efeito do cão, bem como ejaculado (em cada cão)

sobre a qualidade seminal após diluição inicial, resfriamento, adição de glicerol e

descongelação. Além disso, não houve uma interação cão x tratamento.

Da mesma forma que para a motilidade e o vigor, não foi observado efeito

do método de diluição sobre a morfologia espermática (P>0,05). Os grupos foram

similares quanto ao total de alterações de cabeça, peça intermediária e cauda e, ainda,

quanto ao total de alterações secundárias e totais, exceto por um maior percentual de

alterações totais de cauda no grupo ACP-106

(concentração fixa) quando comparado

ao grupo ACIN (diluição fixa ou 1:1).

Para a avaliação da morfologia espermática, foi realizada a coloração de

eosina-nigrosina, onde esta não se mostrou tão eficiente. Embora ela seja classificada

como uma coloração vital é difícil a avaliação do percentual de vivos após a

descongelação, visto que se observa uma população espermática que não se cora

adequadamente, dificultando a interpretação, por isso este parâmetro não foi

mensurado. Este fato já foi observado por Peña-Martinez (2004), relatando que esta

população de espermatozóides que não se cora adequadamente, poderia apresentar

lesão de membrana, mas talvez ainda fosse viável. Além disso, como não há fixação

no processo de coloração, a vida útil da lâmina torna-se mais curta, ocasionando

defeitos aos espermatozóides (principalmente de cauda) que não existiam no momento

da coloração. É importante ressaltar que só foi realizada a avaliação clássica da

morfologia espermática, sendo importante a realização de outras avaliações como, por

exemplo, a do status acrossomal.

Comparando-se todos os tratamentos, foi observada uma superioridade do

diluente ACIN (diluição 1:1) sobre o ACP-106

(concentração fixa). Essa

149

superioridade pode ser devido à dificuldade na avaliação quando uma concentração

mais baixa foi utilizada (ACP-106

/concentração de 200 x 10

espermatozóides/mL),

onde esse fato foi observado também no ACIN. Apesar dessa inferioridade, os

resultados com ACP-106

/concentração de 200 x 10

espermatozóides/mL foram bons

e estes não diferiram do método de diluição 1:1. Em outra fase do experimento, esse

protocolo foi usado e os resultados foram melhores. Estes resultados serão descritos

posteriormente.

Capítulo II: Efeito do armazenamento a – 10 °C do diluente ACP-106

e da

diluição pós-descongelação sobre a qualidade do sêmen canino congelado.

No primeiro capítulo foi observado que o ACP-106

foi eficiente para a

criopreservação de sêmen canino, podendo o mesmo ser congelado tanto a uma

concentração fixa como a uma diluição fixa. Nesta segunda fase do trabalho, o método

de diluição fixa (1:1) foi escolhido por conferir uma maior praticidade ao trabalho,

podendo-se determinar a concentração espermática posteriormente.

Os resultados com ACP-106

, descritos no capítulo anterior, foram

satisfatórios. No entanto, é necessário aperfeiçoar este protocolo para que o mesmo se

torne mais prático. Um ponto que precisa ser investigado é o armazenamento do

diluente visto que a maioria dos diluentes é armazenada na forma congelada e, para o

ACP-106

, é preparada uma nova solução para cada congelação por este efeito ainda

não ser conhecido. Um outro fator importante a ser estudado é o efeito da diluição pós-

descongelação. Tal procedimento reduz os efeitos tóxicos do glicerol e gema de ovo

visto que o meio de descongelação contém substratos metabolizáveis adicionais, bem

como, capacidade tamponante. Há pouca informação sobre este efeito no sêmen

canino. É de nosso conhecimento apenas o trabalho desenvolvido por Pena & Linde-

Forsberg (2000b) que observaram que a mais alta taxa de diluição avaliada (1:4)

resultou em maior longevidade espermática. Portanto, foi realizada uma comparação

150

com o ACP-106

preparado no momento da congelação com o armazenado na forma

congelada (-10°C). Além disso, foi investigado o efeito da diluição pós-descongelação.

Não foi observada diferença entre o diluente preparado no momento da

congelação e o armazenado na forma congelada quanto à motilidade, vigor,

morfologia espermática e acrossomal. No entanto, seria de grande valor investigar o

efeito da congelação sobre a composição bioquímica do ACP-106

Foi observado que não há uma completa dissolução da gema de ovo no

diluente, aumentando a quantidade de debris e isto pode afetar o movimento

espermático (Hirai et al., 1997). Além disso, os debris prejudicam na avaliação da

motilidade. Esta dissolução incompleta da gema de ovo leva a uma variação na

concentração deste protetor de resfriamento, o que pode levar a uma variação nos

resultados.

Com relação ao efeito da diluição pós-descongelação, não foi observada

influência deste fator nem imediatamente após a descongelação e nem durante a

incubação por 120 minutos. Esses resultados diferem, em parte, daqueles encontrados

por Peña e Linde-Forsberg (2000b) que observaram um efeito, imediatamente, após a

descongelação, mas não durante a incubação por 120 minutos. Estes autores

observaram ainda este efeito após 5 horas de incubação, onde amostras não diluídas

apresentaram menores valores de motilidade.

A motilidade no presente trabalho aos 60 minutos de incubação foi apenas

um pouco menor que a encontrada por Rota et al. (1997), usando um diluente à base de

Tris. No entanto, melhores resultados de longevidade foram encontrados por Peña &

Linde-Forsberg (2000b) e Rota et al. (1997) também usando Tris, mas adicionado de

Equex STM. Provavelmente, estes últimos resultados foram influenciados pelo Equex

STM, onde foi observado que a viabilidade e longevidade são melhoradas com a

adição dessa substância.

A injúria pós-descongelação sofrida pelo espermatozóide e outras células

viáveis ocasionada pela retirada brusca do glicerol é geralmente atribuída ao choque

151

osmótico (Frim & Mazur, 1983, Schneider & Mazur, 1984). Este choque deverá ser

mais pronunciado quando os espermatozóides são diluídos em meio livre de glicerol

porque isto induz a uma retirada abrupta do glicerol do espermatozóide com o objetivo

de alcançar um equilíbrio em ambos os lados da membrana. Dessa forma, as células

tentam se acomodar a novas mudanças de volume em adição àquelas mudanças já

sofridas durante a descongelação (Peña & Linde-Forsberg, 2000b).

Embora os valores de motilidade fossem baixos após 60 minutos de

incubação, a taxa de espermatozóides e acrossomas normais foram altas para o ACP-

106

fresco (87,6 ± 6,5%/97,50 ± 2,06%) e congelado (90,6 ± 3,4%/96,87 ± 2,28).

Peña & Linde-Forsberg (2000b) relatam que o estresse osmótico pós-descongelação

pode ser capaz de prejudicar o movimento espermático retilíneo, mas mantendo as

membranas espermáticas intactas. Essa alta taxa de acrossomas normais pode ser, em

parte, devido a ineficiência da coloração de Rosa de Bengala em avaliar danos

acrossomais.

A injúria do espermatozóide congelado-descongelado é caracterizada por

edemaciamento e enrolamento da parte final da cauda espermática (Correa & Zavos,

1995). Para os dados agrupados dos diluentes (fresco e congelado), os defeitos de

cauda foram os mais observados.

Foi realizada a avaliação da integridade funcional das células espermáticas

através do teste hipoosmótico (HOST). Durante o HOST, os espermatozóides

bioquimicamente ativos, quando expostos a um estresse osmótico devido ao influxo de

água, sofrem edemaciamento, aumentando em volume a fim de estabelecer um

equilíbrio entre o compartimento fluido (dentro do espermatozóide) e o meio

extracelular (Jeyendran et al., 1984). O percentual de membranas funcionais foi para

ambos diluentes aproximadamente 53%, sendo estes valores próximos aos resultados

de motilidade pós-descongelação. Talvez a maioria dos espermatozóides móveis tenha

mantido uma membrana funcional após o processo de congelação-descongelação.

152

Nesta segunda etapa do experimento, foi observado um efeito significativo

do cão sobre a motilidade espermática pós-descongelação (30 e 60 minutos de

incubação), bem como sobre a taxa de espermatozóides normais imediatamente após a

descongelação. Este efeito do cão confirma o fato de se considerar o uso de ejaculados

de diferentes cães no delineamento experimental (Steel & Torrie, 1980).

Capítulo III: Avaliação do potencial fertilizante de espermatozóides caninos

congelados-descongelados com ACP-106

utilizando o teste in vitro de interação

espermatozóide - oócito

Apesar do largo uso de análises convencionais através da microscopia

óptica em que o sêmen é avaliado quanto à motilidade, morfologia e concentração,

estes métodos são subjetivos e imprecisos (Linford et al., 1976).

Métodos in vitro para predição do potencial fertilizante de uma amostra de

sêmen são importantes tanto ao se desenvolver novos métodos de resfriamento e

congelação de sêmen ou avaliar a fertilidade de um reprodutor. Como a realização de

inseminações artificiais na espécie canina apresenta algumas dificuldades como:

disponibilidade de animais e infra-estrutura para mantê-los e, ainda o longo intervalo

interestral da cadela, os testes de interação entre oócito e espermatozóides têm se

tornado uma valiosa ferramenta na avaliação da função espermática canina (Ström-

Holst et al., 2001).

A criopreservação de sêmen canino utilizando ACP-106

foi avaliada

somente através de métodos convencionais como motilidade, morfologia e status

acrossomal e estes resultados foram bons (Cardoso et al., 2004, 2005-dados não

publicados). Dessa forma, outros métodos mais acurados são necessários a fim de

investigar a eficiência do referido diluente, uma vez que uma combinação de testes

pode fornecer informações sobre várias características espermáticas necessárias para a

153

fertilização. Portanto, resolveu-se avaliar a funcionalidade espermática através do teste

de interação espermatozóide-oócito. Durante este fase do experimento, mas antes do

referido teste, as amostras de sêmen foram avaliadas pela análise espermática

computadorizada (CASA) e quanto à integridade de membrana com provas

fluorescentes.

1. Avaliação através de sistema de análise computadorizada (CASA)

A avaliação do sêmen canino congelado-descongelado através da CASA

apresentou alguns problemas. Acreditamos que a motilidade total e progressiva foram

subestimadas uma vez que foi observada uma motilidade mais alta, na mesma amostra,

através da análise subjetiva. Este fato pode ser explicado da seguinte forma. Foi

observado em estudos prévios que o ACP-106

tem a desvantagem de não permitir a

completa dissolução da gema de ovo na solução, aumentando a quantidade de debris

que podem ser reconhecidos como espermatozóides imóveis. Hirai et al. (1997)

descreveu o efeito da percentagem de gema de ovo na viscosidade dos diluentes e na

motilidade espermática avaliada através de CASA. Estes autores relataram que

qualquer fator que altere o padrão de movimento espermático pode alterar a motilidade

progressiva e, já é bem estabelecido que a viscosidade no meio altera este padrão

(Amman & Hammerstedt, 1980). Hirai et al. (1997) também observaram que um

aumento na quantidade de gema de ovo prejudica o reconhecimento de falsos

espermatozóides bovinos, onde estes eram partículas de gema de ovo ou outros debris.

Verstegen et al. (2002) sugeriram que o diluente não deve conter partículas de

tamanho similar à cabeça espermática (gema de ovo e leite) porque elas não serão

diferenciadas de espermatozóides imóveis. No entanto, é relatado que este problema

pode ser resolvido através de softwares que identifiquem estruturas de cauda em

espermatozóides imóveis (Hirai et al., 1997). Estudos adicionais seriam necessários a

fim de investigar a concentração ideal de gema de ovo no diluente ACP-106

mesmo métodos que possam reduzir a quantidade de debris no diluente.

154

Com relação às outras características do movimento espermático avaliadas

pelo CASA, foi observado um valor alto de ALH (amplitude lateral de cabeça) o que

poderia sugerir que os espermatozóides exibiram um movimento de hiperativação.

Este fato já foi observado por Peña & Linde-Forsberg (2000a). A motilidade

hiperativada é essencial para a fertilização de oócitos in vitro e in vivo (Fahrig, 2003).

Já foi observada uma correlação entre ALH e fertilidade em ratos e no homem (Moore

& Akhondi, 1996, Peedicayil et al., 1997). Os valores de VAP, VCL e VSL foram

mais baixos que o relatado por Peña & Linde-Forsberg (2000b).

Há evidências do envolvimento de espécies oxigênio reativas na capacitação

(Medeiros et al., 2002). Um aumento na quantidade destes compostos pode ser um

fator envolvido nas alterações similares à capacitação que ocorrem no espermatozóide

criopreservado (Medeiros et al., 2002). Existe uma substância chamada ácido 3-indol

acético (IAA), presente na água de coco (Nunes, 1995). Embora seus efeitos tóxicos

não sejam conhecidos, espécies oxigênio reativas podem ser formadas após

peroxidação e com isso produzir substâncias tóxicas (Pires de Melo et al., 1997). O

efeito destas substâncias podem ser diminuídos através de peroxidases, catalases, bem

como agente redutores (glutationa, ácido ascórbico, taurina e hipotaurina) presente nas

células espermáticas e ambiente espermático (Hinton et al. 1995, Lapoint et al. 2000).

2. Avaliação pela microscopia de epifluorescência

Os resultados da integridade da membrana plasmática pós-descongelação

(35,1%) foram mais baixos que os de Ström et al. (1997), Rota et al. (1997) e Peña e

Linde-Forsberg (2000a), utilizando as mesmas provas fluorescentes, sendo observado

74%, 56% e 64% de membranas intactas. A integridade da membrana plasmática

reflete a viabilidade espermática e o processo de criopreservação danifica esta

membrana (Cormier et al., 1996, Correa et al., 1996). O processo de criopreservação

causa danos irreversíveis à membrana plasmática e conduz a morte celular (Holt,

155

2000b) ou, nos espermatozóides sobreviventes, causar alterações similares a dos

espermatozóides capacitados, encurtando a sua vida útil (Pérez et al., 1996, Watson,

2000). Apesar da percentagem de membranas espermáticas intactas ter sido baixa, a

taxa de espermatozóides normais avaliada pela coloração de Rosa de Bengala foi alta

(89,6%), significando que esta avaliação não pode ser usada sozinha. Os métodos

convencionais de coloração para uso em microscopia óptica não são desejáveis para a

avaliação do espermatozóide criopreservado, pois o glicerol e a gema de ovo,

ingredientes necessários na maioria dos meios de congelação de sêmen canino,

interferem com os fixadores utilizados nas colorações. O uso de provas fluorescentes

tem superado este problema, pois não há interferência do meio extracelular na

avaliação (Peña-Martinez, 2004).

3. Avaliação pelo teste de interação espermatozóide-oócito

Utilizamos uma metodologia para o teste de interação oócito-

espermatozóide similar à descrita por Hay et al. (1997) e a mesma mostrou-se fácil de

ser realizada apesar de minuciosa. No presente trabalho, foi encontrado,

aproximadamente, 15% de oócitos penetrados sendo diferente de Hay et al. (1997) que

encontraram uma taxa de 70%. No entanto, estes autores agruparam em uma única

categoria a taxa de oócitos que se ligaram à zona pelúcida ou penetraram no ooplasma,

chamando-a de penetrados. Quando agrupamos também as duas categorias (ligados e

penetrados) a qual chamamos de interagidos, nossos resultados foram similares aos

destes autores. Melhores resultados foram obtidos por Ström Holst et al. (2000) que

obtiveram 84 e 89% de oócitos que se ligaram à zona pelúcida após lavagem suave e

forte dos complexos oócito-espermatozóide, respectivamente.

Encontramos algumas correlações entre os dados do CASA e os do teste de

interação espermatozóide-oócito. Contudo, é importante lembrar que a motilidade total

e progressiva avaliada pelo CASA pode ter sido subestimada. Então, talvez não seja

156

confiável estabelecer um valor preditivo para o CASA, com relação a estes

parâmetros, sobre a fertilidade in vitro utilizando sêmen canino congelado-

descongelado com ACP-106

. Vale ressaltar que as correlações entre a motilidade

total e progressiva e o percentual de oócitos penetrados foram as mais baixas quando

comparadas a outras observadas neste trabalho. Por outro lado, as velocidades

espermáticas, avaliadas pelo CASA, como VCL (velocidade curvilínea), VAP

(velocidade média da trajetória) e VSL (velocidade progressiva) apresentaram uma

alta e positiva correlação com o número de espermatozóides ligados e penetrados no

oócito. Portanto podemos considerar tais parâmetros do CASA como preditivos para o

número de espermatozóides que interagem com o oócito, seja por ligação ou

penetração, ou ambos. Além disso, também podemos considerar a taxa de

espermatozóides e acrossomas normais avaliados através da coloração de Rosa de

bengala como um valor prognóstico para o número de espermatozóides que ligaram e

penetraram no oócito, respectivamente.

No presente trabalho, mesmo com um baixo percentual de espermatozóides

com membrana intacta, a taxa de oócitos interagidos (ligados, penetrados e ligados

mais penetrados) foi satisfatória. Na espécie canina, tem sido sugerido que

espermatozóides tanto com acrossoma intacto e acrossoma reagido são capazes de se

ligar à zona pelúcida (Kawakami et al. 1993). No entanto, Hoodbhoy & Dean (2004)

relatam que somente espermatozóides móveis e com acrossomas intactos podem

penetrar o cumulus oophorus e se ligar à zona pelúcida. Diversos aspectos do

mecanismo de interação do espermatozóide com o oócito precisam ser elucidados.

Acredita-se que a fusão do da célula espermática com o gameta feminino inicia-se na

região equatorial do espermatozóide (Kaji & Kudo, 2004) e esta região permanece

intacta após o espermatozóide ter sofrido reação do acrossoma (Fahrig, 2003). Dessa

forma, pode ser que o espermatozóide com acrossoma reagido possa ser capaz de se

ligar à zona pelúcida, mas não capaz de penetrar o oócito visto que o acrossoma

contém enzimas que são necessárias neste processo (Kaji & Kudo, 2004). Kawakami

et al. (1993) observou a ligação do espermatozóide com acrossoma reagido na zona

pelúcida após um minuto de incubação. Os testes de interação do espermatozóide com

157

oócitos requerem, normalmente, dezoito horas de incubação (Hay et al., 1997). Dessa

forma, é importante investigar se a ligação de um espermatozóide com acrossoma

reagido é verdadeira e, se o mesmo é capaz de penetrar no ooplasma.

Capítulo IV: Integridade e mudanças ultra-estruturais no espermatozóide canino

fresco e após criopreservação com diluente para sêmen de carnívoros à base de

água de coco em pó (ACP-106

)

Avaliou-se o sêmen canino através de diversos métodos como motilidade,

morfologia espermática e acrossomal, integridade funcional, microscopia de

fluorescência, análise computadorizada e, ainda, através de interações

espermatozóides-oócitos. Embora a criopreservação de sêmen canino com ACP-106

tenha sido eficiente, com base nos métodos que avaliamos, algumas mudanças na

metodologia precisam ser realizadas objetivando não só incrementar a eficiência como

também tornar o método mais prático. No entanto, antes que este protocolo seja

aperfeiçoado, é importante entender as crioinjúrias que causa uma redução na

longevidade espermática (Burgess et al., 2001). Estas crioinjúrias podem ser mais bem

caracterizadas através de uma avaliação ultra-estrutural (Oettlé & Soley, 1988;

Rodríguez-Martínez et al., 1993). A avaliação ultra-estrutural do espermatozóide

canino neste estudo caracterizou principalmente as alterações na membrana plasmática

e no acrossoma.

Com relação à membrana plasmática, é sabido que integridade da mesma é

um pré-requisito fundamental para a função espermática normal (Ström, 1999).

Durante o processo de criopreservação, as membranas espermáticas são consideradas

os principais locais de danos associados com mudanças de temperatura (Hammerstedt

et al., 1990, Watson, 1995). A integridade da membrana plasmática pode ser avaliada

através do teste hipoosmótico (England & Plummer, 1993), provas fluorescentes (Peña

& Linde-Forsberg, 2000) e microscopia eletrônica de varredura e de transmissão

158

(Ström Holst et al., 1998). Bacetti et al. (2002) relatam que o estudo das alterações do

espermatozóide, em casos de infertilidade humana, tem demonstrado que a

microscopia eletrônica pode ser uma valiosa ferramenta para o entendimento não

somente da presença, mas também da natureza dos defeitos.

A maioria dos espermatozóides parecia apresentar uma membrana intacta

mesmo apresentando edemaciamento da mesma. De acordo com Hurtgen & Johnson

(1982), membranas plasmáticas e acrossomais ondulantes, observadas no

edemaciamento, consistem num padrão regular em garanhões férteis, sugerindo que

estas alterações são mais devido ao procedimento de fixação do que aos de

congelação. Chirinéa et al. (2005) relataram a ocorrência de um leve edemaciamento

da membrana plasmática acima da região acrossomal observadas em espermatozóides

frescos caninos, explicando que isto seria uma conseqüência da exposição das

amostras de sêmen ao glutaraldeído durante a fixação.

As principais alterações pós-descongelação estão relacionadas ao

acrossoma. Embora este experimento não tenha quantificado estas alterações ultra-

estruturais, as mais observadas foram: edemaciamento, vesiculação e perda do

conteúdo acrossomal. Tais defeitos são denominados mudanças tipo capacitação

(Bailey et al., 2000) e podem ser resultantes de reação do acrossoma (Eilts, 2005). De

fato, Rodriguez-Martinez et al. (1993) sugeriram que as alterações ultra-estruturais

observadas no sêmen canino congelado podem ser interpretadas como uma falsa

reação do acrossoma. As mudanças físicas ocorridas nesta reação após a

criopreservação são indicativas de que o espermatozóide não pode fertilizar mesmo

que estejam móveis (Eilts, 2005). Similaridades entre o espermatozóide capacitado e

criopreservado têm sido demonstradas em relação à reorganização, fluidez e influxo de

cálcio na membrana plasmática (Green & Watson, 2001).

Fisiologicamente, alguns fatores podem induzir reação do acrossoma como

o cálcio intracelular (Dragileva et al., 1999), pH (Florman et al., 1989), inositol

trifosfato (Walensky & Snyder, 1995), e diacilglicerol (Roldan, 1998). Então, um

159

importante ponto a ser considerado nos procedimentos de criopreservação e que pode

induzir reação do acrossoma é o glicerol.

As alterações aqui descritas já foram previamente relatadas para o

espermatozóide canino (Rodriguez-Martinez et al., 1993, Ström et al., 1998). Ström et

al. (1998) encontraram 89% de acrossomas edemaciados após congelação-

descongelação utilizando o método CLONE. As inseminações artificiais utilizando o

sêmen criopreservado com este método em altas taxas de concepção, sendo sugerido

que o edemaciamento de acrossoma não prejudica a fertilização. Para o

espermatozóide criopreservado com ACP-106

, pode-se sugerir a mesma afirmativa

uma vez que os defeitos foram similares. Além disso, a avaliação do espermatozóide

congelado-descongelado com ACP-106

pelo teste de interação oócito-

espermatozóide (dados não publicados) mostrou um total de 75% de interações

(oócitos somente ligados, somente penetrados e ligados mais penetrados). Ao menos in

vitro, tais defeitos não prejudicaram a função espermática, permitindo não somente a

ligação, mas também a penetração no oócito. Para a inseminação artificial, é

importante determinar o momento de realizá-la, pois o edemaciamento de acrossoma

diminui a vida útil do espermatozóide (Jones & Stewart, 1979).

Alterações na peça intermediária também foram observadas na avaliação

ultra-estrutural. Tais defeitos incluíram edemaciamento da membrana plasmática e

danos na área mitocondrial tais como desorganização do conteúdo. Burgess et al.

(2001) relatou um leve, mas não significante aumento no número de espermatozóides

com peça intermediária apresentando membrana plasmática não intacta após 4 horas

de incubação pós-descongelação.

As mudanças aqui descritas para os espermatozóides caninos após

criopreservação com ACP-106

não foram diferentes das já relatadas por outros

autores utilizando diluentes diferentes.

160

11. CONCLUSÕES

O sêmen canino pode ser, eficientemente, congelado com o diluente à base

de água de coco in natura (ACIN) ou em pó (ACP-106

) após diluição 1:1 ou a uma

concentração de 200 x 10

espermatozóides/mL. Embora o método de diluição a uma

taxa constante seja mais prático, a utilização de uma concentração fixa tem a vantagem

de simplificar o cálculo do número de espermatozóides por palheta.

O armazenamento do a -10 °C não diminui a eficiência do ACP-106

para a

criopreservação de sêmen canino. Além disso, proporciona uma maior praticidade ao

protocolo de congelação.

A diluição pós-descongelação não influencia a sobrevivência espermática

pós-descongelação durante incubação a 37 °C, mas este procedimento melhora a

avaliação da motilidade por diminuir a viscosidade no meio.

O procedimento de congelação-descongelação utilizando ACP-106

foi

eficiente na manutenção do potencial fertilizante do espermatozóide canino in vitro,

mantendo a sua capacidade de não somente de se ligar, mas também de penetrar a zona

pelúcida.

A microscopia eletrônica de transmissão foi uma valiosa ferramenta na

caracterização dos danos espermáticos sofridos no processo de criopreservação,

refirmando que as membranas são os principais locais que sofrem danos, onde as

membranas acrossomais são as mais afetadas.

O percentual de espermatozóides e acrossomas normais são preditivos do

número de espermatozóides ligados e penetrados no oócito, respectivamente.

161

12. PERSPECTIVAS

Com a comprovação da eficiência ACP-106

para a criopreservação de sêmen

canino, baseada na análise da motilidade, morfologia, integridade funcional e interação

oócito-espermatozóide, podemos sugeri-lo como uma nova opção de diluente para a

referida biotécnica.

No entanto, objetivando um maior embasamento científico para esta sugestão,

seria de relevante importância a comprovação da fertilidade in vivo utilizando sêmen

congelado com ACP-106

162

13. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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188

12. ANEXOS

189

Anexo I. Água de coco em pó (ACP

190

Anexo II. Esquema de congelação para o sêmen canino utilizando ACP-106

Etapa 1: Diluição a temperatura ambiente com ACP

-gema de ovo; Etapa 2: Resfriamento em caixa térmica por 40 minutos; Etapa 3:

Resfriamento em refrigerador por 30 minutos; Etapa 4: Diluição com ACP

-gema de ovo-glicerol; Congelação em vapores de nitrogênnio

por 5 minutos; Etapa 5: Armazenamento em nitrogênio líquido.

4°C

Etapa 3

°C

- 60 °C

5 cm

Líquido

Etapa 2 Etapa 1

196° C

Etapa 4

Etapa 6

15°C

Etapa 5

27 °C

191

Anexo III. Composição dos corantes para avaliação da morfologia espermática

1. Solução de eosina-nigrosina

Eosina amarealada – 1g

Nigrosina – 2g

Tricitrato de sódio 2H

O – 2,941g

100 mL de água destilada

OBS: Após preparo, a solução fica em repouso por 24h, filtrada e conservada a 4 °C.

2. Solução Rosa de Bengala

20 mL de água destilada

0,58g de citrato de sódio

0,8 mL de formaldeído

0,3g de Rosa de Bengala

OBS: Após a mistura dos três primeiros componentes, a solução é homogeneizada e

acrescenta-se a Rosa de Bengala

Anexo IV. Composição da solução trabalho para verificação da integridade de

membrana por microscopia de fluorescência

1. Solução estoque de fluoresceína

6-Diacetato de carboxifluoresceína - 9,2 mg

DMSO - 20 mL

192

2. Solução estoque de iodeto de propídio

Iodeto de propídio - 10 mg

Solução fisológica 20 mL

3. Solução de formaldeído

Solução 1:80 de formalina 40%, em solução fisiológica

4. Solução trabalho

Solução estoque de fluoresceína - 20 µL

Solução estoque de iodeto de propídio - 10 µL

Citrato de sódio 3% - 0,96 mL

Anexo V. Composição dos meios usados para o teste de interação oócito

espermatozóide

1. Solução estoque de íons

Cloreto de sódio (NaCl) - 2,28 M (6,665g / 50mL)

Cloreto de potássio (KCl) – 158mM (0,88g / 50mL)

Bicarbonato de sódio (NaHCO

- 250 mM (1,05g / 50mL)

Fosfato de sódio (NaH

O) – 35mM (0,235g / 50mL)

Cloreto de cálcio (CaCL

.2H

O) – 16,46 mM (1,47g / 50mL)

Cloreto de magnésio (MgC

.6H

O) – 10mM (1,015g / 50mL)

Hepes - 1M (1,19g / 5mL)

193

2. Solução de estoque TL

2.1. Espermatozóide TL – Osmolaridade 295 mOsm/L

19,81 mL de H

1,085mL de NaCl

0,49mL de KCl

2,50mL de NaHCO

0,25mL de NaH

0,09mL de Lactato de sódio

0,25mL de Hepes

0,25mL de CaCL

.2H

0,275mL de MgCL

.6H

2.2. FIV TL – Osmolaridade 295 mOsm/L

44,125mL de H

1,25mL de NaCl

0,50mL de KCl

2,50mL de NaHCO

2,50mL de NaH

0,045mL de Lactato de sódio

0,25mL de CaCL

.2H

0,125mL de MgCL

.6H

194

3. Solução TALP

3.1. TALP-SPERM (pH 7,4)

9,5mL Espermatozóide TL

60mg de BSA (Fração V)

100µL de Piruvato de Sódio (2,2 mg/mL)

83,5µL de Gentamicina (50mg/mL)

10µL de Vermelho Fenol (1mg/100mL)

3.2. TAP-FIV (pH 7,4)

9,5mL de FIV TL

30,0mg de BSA (Fração V)

10µL de Piruvato de Sódio (2,2mg/mL)

83,5µL de Gentamicina (50mg/mL)

10µL de Heparina (2,0mg/mL)

10µL de Vermelho Fenol (1mg/100mL)

OBS. Todas as solução são preparadas com água MiliQ.

195

Anexo VI .Espermatozóides caninos criopreservados em ACP-106

. (a) Apresentando

cauda reflexa e corado com eosina-nigrosina; (b) Apresentando cauda enrolada (seta

preta), acrossoma normal (seta branca) e corado com Rosa de Bengala.

(a) (b)

196

Anexo VII. Espermatozóides caninos criopreservados em ACP-106

e corados com 6-

Diacetato de carboxi-fluoresceína/iodeto de propídio. (a) Espermatozóide com

membrana plasmática não intacta (corado totalmente em vermelho com iodeto de

propídio - seta branca); Espermatozóide com membrana plasmática não intacta na

região equatorial (corado em vermelho) e região acrossomal intacta (corado em verde

com 6-Diacetato de carboxi-fluoresceína – ponta de seta branca). (b) Espermatozóides

com membrana plasmática intacta (corado em verde com 6-Diacetato de carboxi-

fluoresceína – seta branca).

(a) (b)

197

Anexo XIII. Oócitos (n=2) de cadelas apresentando espermatozóides caninos

criopreservados em ACP-106

ligados à zona pelúcida (seta branca e ponta de seta

branca) e penetrados no ooplasma (seta preta).

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