ads:
Centro de Ciências Agrárias
Departamento de Tecnologia de Alimentos e Medicamentos
Programa de Doutorado e Mestrado em Ciência de Alimentos
NEUSA FÁTIMA SEIBEL
CARACTERIZAÇÃO, FRACIONAMENTO E HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DOS
COMPONENTES DO RESÍDUO DO PROCESSAMENTO DA SOJA [GLYCINE
MAX (L.) MERRILL], FIBRAS DOS COTILÉDONES
Tese apresentada ao Curso de Doutorado
em Ciência de Alimentos, do Departamento
de Tecnologia de Alimentos e Medicamentos
da Universidade Estadual de Londrina, como
requisito para a obtenção do grau de Doutor
.
Prof. Dra. ADELAIDE DEL PINO BELÉIA
Orientadora
Londrina/PR
Outubro 2006
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
Centro de Ciências Agrárias
Departamento de Tecnologia de Alimentos e Medicamentos
Programa de Doutorado e Mestrado em Ciência de Alimentos
NEUSA FÁTIMA SEIBEL
CARACTERIZAÇÃO, FRACIONAMENTO E HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DOS
COMPONENTES DO RESÍDUO DO PROCESSAMENTO DA SOJA [GLYCINE
MAX (L.) MERRILL], FIBRAS DOS COTILÉDONES
Tese apresentada ao Curso de Doutorado
em Ciência de Alimentos, do Departamento
de Tecnologia de Alimentos e Medicamentos
da Universidade Estadual de Londrina, como
requisito para a obtenção do grau de Doutor
.
Prof. Dra. ADELAIDE DEL PINO BELÉIA
Orientadora
Londrina/PR
Outubro 2006
ads:
BANCA EXAMINADORA
________________________________________
Dra. Graciette Matioli
________________________________________
Dra. Lenita Brunetto Bruniera
__________________________________________
Dra. Marta de Toledo Benassi
__________________________________________
Dra. Sandra Helena Prudêncio
__________________________________________
Orientadora - Dra. Adelaide Del Pino Beléia
Londrina, 16 de outubro de 2006.
ii
DEDICATÓRIA
Ao meu marido Juliano e
aos meus pais Arno e Elide,
por todo o amor, carinho e
compreensão recebidos
iii
AGRADECIMENTOS
Especialmente à professora Adelaide pela orientação, carinho no momento
que mais precisei, confiança depositada em mim e no meu trabalho e por todos os
conhecimentos transmitidos.
Ao meu marido Juliano, por todo o seu amor e companheirismo, sua
compreensão e ajuda psicológica.
A minha família, em especial aos meus pais e minha irmã pelo amor e
compreensão recebidos, mesmo eles morando longe sempre estiveram perto de
coração.
A todos que de uma ou de outra forma me ajudaram, em especial aos meus
colegas Simone e Cláudio, pela ajuda na eletroforese, Lyssa por todos os artigos
trazidos de Campinas e Carol pela “terapia”. Por estas e outras lindas amizades
conquistadas nestes quatro anos, pois sei que serão para sempre.
Aos meus amigos que mesmo de longe sempre me passaram força e
coragem para que eu alcançasse meu objetivo.
A todos os professores que sempre estavam à disposição no momento que
eu precisei, em especial ao Fábio e à Marta e aos funcionários da UEL.
À indústria Solae Company de Esteio/RS pelo fornecimento da matéria-prima.
Ao CNPq pelo suporte financeiro, o qual foi imprescindível para a execução
deste trabalho.
Às instituições UEL, EMBRAPA e Instituto de Botânica de São Paulo pelo
apoio, através de seus laboratórios e equipamentos.
iv
SUMÁRIO
SUMÁRIO....................................................................................................................iv
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................vi
LISTA DE TABELAS..................................................................................................vii
RESUMO.....................................................................................................................ix
ABSTRACT..................................................................................................................x
1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................1
2. JUSTIFICATIVA.......................................................................................................2
3. OBJETIVOS.............................................................................................................3
3.1. Objetivo geral........................................................................................................3
3.2. Objetivos específicos.............................................................................................3
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................................4
4.1. Ingredientes Alimentares Derivados de Soja........................................................4
4.1.1. Ingredientes protéicos........................................................................................4
4.1.2. Fibra de Soja......................................................................................................7
4.2. Parede Celular.......................................................................................................8
4.2.1. Composição da Parede Celular..........................................................................8
4.2.2. Estrutura da Parede Celular...............................................................................9
4.2.2.1. Substâncias Pécticas....................................................................................11
4.2.2.2. Celulose.........................................................................................................12
4.2.2.3. Hemicelulose.................................................................................................13
4.2.2.4. Lignina...........................................................................................................14
4.2.2.5. Proteínas.......................................................................................................15
4.3. Propriedades Fisiológicas e Funcionais das Fibras............................................16
4.4. Compostos de Soja com Atividades Fisiológicas................................................18
4.4.1. Ácido Fítico.......................................................................................................18
4.4.2. Isoflavonas.......................................................................................................20
4.5. Hidrólise Enzimática............................................................................................22
5. DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO................................................................24
Caracterização Química e Funcional Comparativa de Ingredientes de Soja
[Glycine Max (L.) Merrill] Baseados em Carboidratos e Proteínas
Resumo......................................................................................................................24
Introdução...................................................................................................................25
v
Material e Métodos.....................................................................................................27
Resultados e Discussão.............................................................................................31
Conclusões.................................................................................................................44
Referências Bibliográficas..........................................................................................45
Polissacarídeos das Fibras de Cotilédones e Proteínas das Fibras, Farinha
Desengordurada e Concentrado Protéico de Soja [Glycine Max (L.) Merrill]
Resumo......................................................................................................................49
Introdução...................................................................................................................50
Material e Métodos.....................................................................................................52
Resultados e Discussão.............................................................................................56
Conclusões.................................................................................................................68
Referências Bibliográficas..........................................................................................69
Hidrólise Enzimática de Fibras de Cotilédones de Soja [Glycine Max (L.) Merrill]
e Caracterização das Frações Solúveis e Sólidas
Resumo......................................................................................................................71
Introdução...................................................................................................................72
Material e Métodos.....................................................................................................73
Resultados e Discussão.............................................................................................79
Conclusões.................................................................................................................91
Referências Bibliográficas..........................................................................................92
6. CONCLUSÕES GERAIS.......................................................................................95
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................97
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura da parede celular vegetal............................................................10
Figura 2: Constituintes aromáticos da lignina.............................................................14
Polissacarídeos e Proteínas de Fibras de Cotilédones de Soja [Glycine Max (L.)
Merrill]
Figura 1: Projeção das variáveis nos Componentes Principais 1 e 2........................60
Figura 2: Análise de Componentes Principais obtidos a partir dos dados
cromatográficos para análise de monossacarídeos...................................................61
Figura 3: Dendograma da Análise de Agrupamento obtidos a partir dos dados
cromatográficos para análise de monossacarídeos...................................................61
Figura 4: Quantidades dos monossacarídeos em cada fração da fibra de cotilédones
de soja original (%).....................................................................................................62
Figura 5: Quantidades dos monossacarídeos em cada fração da fibra de cotilédones
de soja micronizada (%).............................................................................................63
Figura 6: Eletroforese dos ingredientes alimentares derivados de soja.....................66
Hidrólise Enzimática de Fibras de Cotilédones de Soja [Glycine Max (L.) Merrill]
e Caracterização das Frações Solúveis e Sólidas
Figura 1: Tempo de hidrólise enzimática para obter a solubilização máxima dos
carboidratos das fibras de cotilédones de soja......................................................... 81
Figura 2: Tempo de hidrólise enzimática para obter a solubilização máxima das
proteínas das fibras de cotilédones de soja...............................................................82
Figura 3: Eletroforese de fibras de soja, original e micronizada, e amostras
hidrolisadas com protease e carboidrase...................................................................88
Figura 4: Microscopia eletrônica de varredura das fibras de soja, original (A),
micronizada (B) (160x), original hidrolisada com protease (C), micronizada
hidrolisada com protease (D), original hidrolisada com carboidrase (E) e micronizada
hidrolisada com carboidrase (F) (800x)......................................................................90
vii
LISTA DE TABELAS
Caracterização Química e Funcional Comparativa de Ingredientes de Soja
[Glycine Max (L.) Merrill] Baseados em Carboidratos e Proteínas
Tabela 1: Composição centesimal de fibras de cotilédones, concentrado protéico e
farinha desengordurada de soja (%)..........................................................................33
Tabela 2: Minerais presentes em fibras de cotilédones, concentrado protéico e
farinha desengordurada de soja.................................................................................33
Tabela 3: Teor de fósforo inorgânico, fósforo fítico e ácido fítico presentes em fibras
de cotilédones, concentrado protéico e farinha de soja.............................................35
Tabela 4: Isoflavonas presentes em fibras de cotilédones, concentrado protéico e
farinha desengordurada de soja (mg/100g)...............................................................38
Tabela 5: Efeito do pH na solubilidade protéica de fibras de cotilédones, concentrado
protéico e farinha desengordurada de soja (% de proteínas solúveis em relação às
proteínas totais)..........................................................................................................40
Tabela 6: Propriedades funcionais relacionadas com água e óleo de fibras de
cotilédones, concentrado protéico e farinha desengordurada de soja.......................43
Polissacarídeos e Proteínas de Fibras de Cotilédones de Soja [Glycine Max (L.)
Merrill]
Tabela 1: Rendimento do fracionamento da parede celular da fibra de soja (%)......57
Tabela 2: Proteínas de ingredientes de soja extraídas com diferentes solventes (%
de proteínas solúveis em relação às proteínas totais)...............................................64
Hidrólise Enzimática de Fibras de Cotilédones de Soja [Glycine Max (L.) Merrill]
e Caracterização das Frações Solúveis e Sólidas
Tabela 1: Planejamento da hidrólise de carboidratos e proteínas de fibras de
cotilédones de soja (experimento fatorial 2³ com dois pontos centrais, variáveis
codificadas e não codificadas)...................................................................................75
Tabela 2: Carboidratos e proteínas solúveis das fibras de cotilédones, após hidrólise
enzimática (experimento fatorial 2³ mais dois pontos centrais)..................................79
Tabela 3: Médias dos carboidratos e proteínas solúveis antes do tratamento e após
a hidrólise química (solubilidade em relação ao total de cada composto).................81
viii
Tabela 4: Proteínas e propriedades funcionais da fração sólida, carboidratos totais e
ácidos urônicos da fração solúvel das fibras dos cotilédones de soja após a hidrólise
com a carboidrase, comparadas com as amostras não hidrolisadas.........................84
Tabela 5: Efeito do pH na solubilidade protéica das frações sólidas das fibras dos
cotilédones de soja após a hidrólise enzimática com a carboidrase, comparadas com
as fibras não hidrolisadas (% de proteínas solúveis em relação às proteínas
totais)..........................................................................................................................86
Tabela 6: Caracterização das fibras de cotilédones de soja não hidrolisadas e das
frações sólidas das fibras hidrolisadas com a protease (%)......................................87
ix
SEIBEL, Neusa Fátima. Caracterização, fracionamento e hidrólise enzimática dos
componentes do resíduo do processamento da soja [Glycine Max (L.) Merrill],
fibras dos cotilédones.
RESUMO
Ingredientes derivados de soja, fibras de cotilédones, farinha desengordurada e concentrado
protéico foram avaliados quanto às características químicas e propriedades funcionais. O
macromineral de maior concentração foi o potássio e o micromineral foi o ferro em todos os
ingredientes. O maior percentual de ácido fítico estava nas amostras protéicas, assim como
as isoflavonas, no entanto, as fibras apresentaram mais genisteína e daidzeína e o total de
isoflavonas correspondeu a 45% do valor encontrado na farinha. As fibras alimentares
tiveram as melhores propriedades de hidratação e as propriedades relacionadas com o óleo
foram similares à da farinha de soja, mesmo tendo menores percentuais de proteínas. A
parede celular das fibras dos cotilédones de soja foi fracionada e o componente majoritário
foi a hemicelulose, correspondendo a 55%, em média. Com a constituição dos
monossacarídeos das frações houve a distinção de dois grupos: (1) celulose e (2) pectina e
hemiceluloses. A classificação das proteínas foi baseada na solubilidade em diferentes
solventes, a farinha desengordurada de soja apresentou a maior fração extraída com
solução salina e o concentrado protéico, assim como as fibras de cotilédones, com solução
alcalina. A eletroforese apresentou as proteínas majoritárias da soja, β-conglicinina e
glicinina nas fibras de cotilédones e nos ingredientes protéicos. A proteína extraída das
fibras também revelou bandas com peso molecular próximo aos 30KDa, sendo
provavelmente glicoproteínas de parede celular, ricas em hidroxiprolina. Após a
determinação das melhores condições, as fibras de soja foram hidrolisadas com carboidrase
e com protease. As frações sólidas das fibras hidrolisadas com carboidrase tiveram maior
quantidade de proteínas e aumento nas propriedades hidrofílicas, enquanto que a fração
solúvel teve 73% dos carboidratos e 50% dos ácidos urônicos da quantidade inicial das
amostras. A protease foi capaz de solubilizar 54% do total das proteínas, produzindo uma
fração sólida contendo 76% de fibras alimentares totais. A fração solúvel teve peptídeos de
baixo peso molecular, menor que 10KDa e uma banda de peso molecular próximo aos
25KDa. As micrografias da MEV confirmaram a redução das partículas na amostra
micronizada em relação à original. A estrutura física da fibra original hidrolisada com
protease ficou mais porosa superficialmente do que a fibra micronizada. As amostras
hidrolisadas com carboidrase apresentaram uma estrutura mais compactada.
Palavras-Chave: fibras alimentares, parede celular, compostos químicos e funcionais,
classificação e eletroforese de proteínas, carboidrase, protease, microscopia.
x
SEIBEL, Neusa Fátima. Characterization, isolation and enzymatic hydrolysis of
cotyledon fiber from soybean [Glycine Max (L.) Merrill].
ABSTRACT
Soybean derived ingredients: cotyledon fibers, defatted flour and protein concentrate were
evaluated for chemical characteristics and functional properties. Potassium was the macro
and iron the micro mineral in highest concentration in all the ingredients. The highest
concentration of phytic acid was in the protein concentrate, as well as the highest
concentration of isoflavones, however, the fibers had more genistin and daidzein and the
total isoflavones in the fibers corresponded to 45% of the amount in the defatted flour.
Dietary fibers had the best hydration properties and in properties related to oil emulsification
had similar indexes to soybean flour, despite the lower protein concentration. The cell wall
soybean cotyledon fiber was fractioned and the major component was hemicellulose,
corresponding to 55% on the average. Based on monosaccharide composition of the cell
wall fractions there were two groups: (1) cellulose and (2) pectin and hemicelluloses. Protein
classification due to solubility in different solvents showed that defatted flour had a major
protein fraction extracted with salt solution while the protein concentrate and dietary fibers
had higher protein solubility with alkaline solution. The electrophoresis presented the major
soybean proteins, β-conglicinin and glicinin in cotyledon fibers and in protein ingredients. The
protein extracted from fibers also reveled bands with molecular weigh next 30KDa, probably
cell wall hydroxyproline-rich glycoproteins. After identifying the best conditions, the soybean
fibers were hydrolyzed with carbohydrase and protease. The solid fraction of carbohydrase
hydrolyzed fiber had higher protein concentration and increased hydrophilic properties, while
the soluble fraction had 73% carbohydrates and 50% uronic acids of the initial quantity in
samples. The protease hydrolyzed 54% of the total protein in the fiber samples, producing a
solid fraction with 76% total dietary fiber. The soluble fraction had peptides of low molecular
weigh, lower than 10KDa, and one band of molecular weigh close to 25KDa. The SEM
micrographies confirmed the reduced particle in the milled sample in relation to the original
sample. The physical structure of the original fiber hydrolyzed with protease had more
superficial porosity than the reduced particle fiber. The hydrolyzed samples with
carbohydrase presented a more compact structure.
Key-Words: dietary fiber, cell wall, chemical and functional components, protein
classification and electrophoresis, carbohydrase, protease, microscopy.
1
1. INTRODUÇÃO
A soja é considerada um alimento funcional devido aos benefícios que traz à
saúde humana. Antigamente o interesse na produção de soja estava relacionado
somente com a produção de óleo e de proteínas, atualmente é dada atenção a todos
os outros componentes e fitoquímicos que ela fornece. Uma fração que ainda não
está bem estudada é a fibra dos cotilédones de soja, o resíduo insolúvel do
processamento de obtenção da proteína isolada de soja, é constituída
principalmente de carboidratos de parede celular, e não contém casca. Estas fibras
têm várias propriedades funcionais, entre elas o alto poder de absorção de água e
por isto apresentam uma série de aplicações na indústria de alimentos, além de
proporcionar o sabor mais brando entre todas as fontes de fibras (Duxbury, 1991).
A estrutura das paredes celulares não é uniforme: composição, forma e
tamanho dependem da função da célula dentro do tecido da planta. São estruturas
complexas, constituídas de multicomponentes formando uma rede de
polissacarídeos unidos por ligações intermoleculares. Apesar da estrutura química
dos componentes individuais da parede celular já ter sido bem caracterizada, a
proporção relativa de cada um deles é pouco conhecida, e desta forma, um
entendimento completo da estrutura da parede celular vegetal está ainda para ser
estabelecido. Numa descrição simples, pode-se dizer que a parede celular contém
quatro componentes principais: celulose, polissacarídeos não celulósicos (PNC),
proteínas e polifenóis (Da-Silva et al, 1997).
As fibras proporcionam efeitos fisiológicos a quem ingere a quantidade diária
recomendada de fibras totais (25-30g), sendo que 75% desta quantidade devem
estar na forma insolúvel. As propriedades fisiológicas das fibras são relacionadas
com a principal característica físico-química, a propriedade de hidratação,
2
possivelmente pela presença de componentes de fibras alimentares insolúveis,
como celulose, hemicelulose e lignina, que são materiais hidrofílicos (Auffret et al,
1994; López et al, 1996). A composição química e as características físicas das
fibras influenciam nesta propriedade, pois compostos de parede celular primária
absorvem mais água do que compostos de parede celular secundária. Estas e
outras características podem ser modificadas por vários tratamentos, sendo a
hidrólise enzimática a preferida, porque pode ser controlada, havendo uma alteração
total, parcial ou específica, dependendo do interesse (Guillon e Champ, 2000; Lahl e
Braun, 1994; Sgarbieri, 1996).
2. JUSTIFICATIVA
Na indústria de alimentos, são conhecidos como “resíduos”, partes da
matéria-prima não utilizadas no processamento do produto principal. A utilização das
matérias-primas residuais faz surgir novas fontes de riquezas e torna-se praticável a
existência, no mercado, de subprodutos mais variados e de menor preço. Além de
muitas vezes, solucionar problemas ambientais e perdas de nutrientes. A fibra de
soja se caracteriza como resíduo, já que o objetivo inicial é a produção da proteína
isolada de soja a partir da farinha desengordurada. Embora seja um subproduto,
apresenta muitas vantagens e potenciais aplicações, pois tem propriedades
funcionais e o sabor mais brando entre todas as fontes de fibras (Duxbury, 1991).
Para a aplicação industrial de novos ingredientes alimentares é necessário o
conhecimento da composição e das propriedades funcionais, pois estas são
altamente correlacionadas com as características físico-químicas e efeitos
fisiológicos. Estas e as outras características das fibras dos cotilédones de soja não
estão disponíveis na literatura. Desta forma, pretendeu-se investigar os
3
componentes deste produto, contribuindo para o entendimento das propriedades e
possíveis aplicações industriais. Para isso ingredientes protéicos, farinha
desengordurada e concentrado protéico de soja, foram usados para comparação.
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
O objetivo do trabalho foi caracterizar as propriedades químicas e funcionais
das fibras de cotilédones de soja, obtidas durante a extração aquosa de proteínas
isoladas, e fracionar os principais compostos presentes com métodos químicos e
enzimáticos.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Determinar a composição da fibra de soja.
- Quantificar compostos com atividade fisiológica, tais como fibras alimentares, ácido
fítico e isoflavonas.
- Determinar as características tecnológicas da fibra de soja.
- Quantificar os componentes estruturais da parede celular presentes na fibra.
- Classificar as proteínas da fibra quanto à solubilidade e pesos moleculares.
- Relacionar as características de ingredientes de fibras alimentares com
ingredientes protéicos.
- Hidrolisar os principais compostos das fibras de soja e caracterizar as frações.
4
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1. Ingredientes Alimentares Derivados de Soja
Inicialmente o interesse na produção de soja estava relacionado somente com
a produção de óleo e de proteínas. A cada tonelada de óleo bruto de soja, são
produzidas 4,5 toneladas de farinha de soja, contendo aproximadamente 44% de
proteína. Atualmente são conhecidos os inúmeros benefícios que outros
componentes da soja trazem para a saúde humana, por isso a soja está intitulada
como um alimento funcional. O aumento no consumo de soja é atribuído a vários
fatores: benefícios para a saúde do consumidor; novos hábitos alimentares; aumento
da tecnologia dos produtos de soja e aumento na produção mundial de soja. Outro
fator influente é a comprovação da crescente ênfase nos benefícios da ingestão de
baixa quantidade de gordura saturada e alta quantidade de fibras, assim, a soja é
uma alternativa apropriada (Kumar et al, 2002; Riaz, 2001).
4.1.1. Ingredientes Protéicos
A farinha de soja desengordurada é o primeiro produto sólido a ser gerado
após a prensagem dos grãos, para a extração do óleo. Este produto contém
aproximadamente 50% de proteínas e 30-35% de carboidratos, é formada dos
“pellets” finos, já que estes são classificados em grossos (10-20 mesh), médios (20-
40 mesh) e finos (40-80mesh), sendo que 97% das partículas da farinha passam
através de 100mesh. O concentrado protéico é obtido a partir da farinha
desengordurada por lavagem alcoólica (etanol 60-80%), água acidificada (pH 4,5) ou
água fervente. Nesse processo de lavagem, componentes são arrastados, deixando
as proteínas e os polissacarídeos. O concentrado protéico de soja não pode ter
5
menos que 65% de proteínas. O isolado protéico é preparado a partir da farinha
desengordurada por solubilização das proteínas e carboidratos usando uma solução
aquosa (pH 7-10). A fração insolúvel é removida por centrifugação, seguida por
precipitação das proteínas da soja, utilizando o ponto isoelétrico (pH 4,5). Este
produto tem aproximadamente 90% de proteínas (Fernández-Quintela et al, 1993;
Liu, 1997; Pearson, 1982).
As principais proteínas da soja são β-conglicinina (7S) e glicinina (11S). A β-
conglicinina é constituída de subunidades α, α’ e β, com pesos moleculares de 84,
72 e 51KDa, respectivamente, e a glicinina tem subunidades ácidas (36-40KDa) e
básicas (18-20KDa) (Garcia et al, 1997; Riblett et al, 2001). A glicinina é a maior
fração das proteínas totais do grão, 25-35%, sendo composta por no mínimo seis
subunidades não idênticas, totalizando um peso molecular de 350KDa. Cada
subunidade tem um polipeptídeo ácido associado a um básico por ligações
dissulfeto e ligações de hidrogênio (Garcia et al, 1997; Liu 1997; Sathe et al, 1987).
Além destas subunidades a soja pode apresentar uma banda de menor intensidade,
ao redor de 15KDa. Riblett et al (2001) comentaram que esta banda é uma outra
subunidade da glicinina, uma vez que quando as frações 7S e 11S foram avaliadas
separadamente, ela foi revelada somente na eletroforese da glicinina. Devido a
diferenças na composição e estrutura, as globulinas 7S e 11S exibem diferenças nas
características nutricionais e funcionais: todas as subunidades da β-conglicinina são
glicoproteínas, contendo 4-5% de carboidratos e somente uma pequena porção de
glicinina é glicosilada; a 11S tem 3 a 4 vezes mais metionina e cisteína do que a 7S,
e tem melhor formação de gel, enquanto que a 7S tem melhor capacidade
emulsificante (Liu, 1997).
6
As proteínas de soja, sob a forma de farinhas desengorduradas, concentrados
e isolados protéicos, são largamente utilizadas em carnes processadas, alimentos
lácteos, maioneses, molhos, produtos de panificação, entre outros, devido a sua
principal característica funcional: a solubilidade. Esta propriedade influencia na
maioria das outras propriedades, tais como: geleificação, capacidade espumante e
emulsificante. Portanto, o conhecimento da habilidade das proteínas em combinar
água à sua estrutura é muito importante na maioria das aplicações alimentares
(Chou e Morr, 1979; Souza et al, 2000).
As propriedades funcionais têm recebido atenção, principalmente em novos
ingredientes alimentares, pois afetam as características nutritivas e sensoriais dos
produtos, além de ter um importante papel físico na preparação, processamento ou
estocagem dos alimentos. As propriedades funcionais dos componentes alimentares
estão relacionadas com: capacidade de hidratação e características relacionadas
com tamanho, forma e propriedades de superfície das moléculas (Auffret et al, 1994;
Sgarbieri, 1998; Thibault et al, 1992). Existe uma correlação entre as propriedades
físico-químicas e as propriedades funcionais das proteínas, especialmente as da
soja, as quais podem ser alteradas, favoravelmente ou não, por temperatura,
secagem, métodos de preparação ou outros tratamentos durante o processamento e
estocagem dos produtos (Lee et al, 2003). As proteínas da soja são tenso-ativas,
agrupam-se nas interfaces óleo-água reduzindo a tensão superficial, promovendo e
estabilizando as emulsões. Na absorção de gordura, estas proteínas permitem a
retenção, reduzindo as perdas em diversas etapas do processamento e ajudam a
manter as dimensões originais dos alimentos evitando o encolhimento. A água é
mantida no produto final porque as regiões polares ao longo das moléculas facilitam
a absorção. A melhora da textura em alguns produtos é talvez a propriedade mais
7
importante da utilização das proteínas de soja, isto ocorre devido a capacidade de
geleificação (Souza et al, 2000).
4.1.2. Fibra de Soja
A fibra dos cotilédones da soja é um produto obtido de duas formas: pela
extração aquosa da farinha desengordurada de soja em solução neutra e alcalina
(pH 7-10), é a fração insolúvel separada por centrifugação, durante o processo de
obtenção do isolado protéico, ou por desnaturação protéica antes da extração
aquosa. A primeira forma de extração é considerada como sendo a que proporciona
produtos mais agradáveis ao consumidor (Lusas e Riaz, 1995). O produto final
contém proteínas, mas seu maior constituinte é o material não celulósico, constituído
de polissacarídeos ácidos e arabinogalactanos. Também possui 10% de celulose,
oriundos das paredes celulares dos tecidos dos cotilédones, podendo totalizar até
80% de fibra alimentar, mas este valor é variado, pois depende do método utilizado
para a determinação (Riaz, 2001; Slavin, 1991).
A fibra de soja possui cor bege clara, aroma e sabor suaves e pode ser
apresentada em várias granulometrias, entretanto, a incorporação nos alimentos
pode acarretar problemas com as propriedades físicas e sensoriais do produto, os
quais os tornam inaceitáveis pelos consumidores. Este ingrediente pode ser
adicionado com sucesso em muitos alimentos, tais como snacks extrusados, barras
energéticas, cereais, pães integrais (podendo ser usado na proporção de 5-20% do
peso seco da farinha), dietas líquidas, sopas, assados em geral, alimentos enlatados
e fórmulas nutricionais hospitalares (Riaz, 2001; Slavin, 1991).
É previsto um crescimento no desenvolvimento de novos produtos utilizando
fibras de soja, já que estas têm diferentes funções no produto final, além de reduzir o
8
valor calórico, proporcionam benefícios à saúde humana (Tockman, 2002). Estas
fibras têm várias propriedades funcionais, entre elas o alto poder de absorção de
água e, por isto, apresentam uma série de aplicações na indústria de alimentos,
além de proporcionar o sabor mais brando entre todas as fontes de fibras (Duxbury,
1991). Mas a maior vantagem da fibra de soja em relação às demais fontes é a não
influência sobre a absorção de minerais como o zinco (Erdman e Weingartner,
1981). Quando comparada à adição de fibra de soja na dieta com a adição, em igual
quantidade, de fibra de trigo, não houve a diminuição da absorção de zinco e cobre
proporcionada pela fibra de trigo (Riaz, 2001).
4.2. Parede Celular
A parede celular do tecido vegetal forma uma zona de fronteira entre cada
célula e apresenta diversas funções tais como: conferir rigidez, tamanho e forma às
células; controlar a expansão celular; dar proteção contra ataque de insetos e
agentes patogênicos; controlar o transporte intercelular e armazenar reservas
alimentares (Brett e Waldron, 1996).
4.2.1. Composição da Parede Celular
A parede da célula vegetal é formada por três camadas: lamela média, parede
celular primária e parede celular secundária. A lamela média é composta de
substâncias pécticas, sendo chamada de substância intercelular, pois mantém juntas
as paredes primárias das células adjacentes (Cutter, 1996). A parede celular
primária é a primeira parede a ser formada pela célula e é depositada sobre cada
lado da lamela média pelas células adjacentes, recobrindo a membrana plasmática,
sendo encontrada em plantas dicotiledôneas e os principais constituintes são
9
pectinas e xiloglucanos. As substâncias pécticas da lamela média têm,
relativamente, uma menor proporção de oligossacarídeos na cadeia principal e
ramificações não tão extensas como a pectina da parede celular primária (Thakur et
al, 1997; Waldron et al, 2003). A parede celular secundária é considerada
suplementar e caracterizada pela fração mais lignificada, sendo encontrada em
maior quantidade nos cereais (Heredia et al, 1995).
A parede celular é constituída por duas fases: uma fase cristalina e outra
amorfa. A fase cristalina apresenta uma conformação química relativamente
homogênea, composta por microfibrilas, nas quais as moléculas de celulose são os
maiores componentes, alinhadas paralelamente ao eixo da cadeia. A matriz amorfa
da parede celular apresenta uma composição química bastante complexa, sendo
constituída por uma variedade de polissacarídeos, proteínas e compostos fenólicos.
Possui composição variável segundo as diversas partes da parede, o tipo de célula,
o estágio do ciclo celular e a espécie em questão. A variação desta composição não
se refere somente quanto à proporção dos polímeros presentes, mas também
quanto à estrutura de cada polímero (Heredia et al, 1995).
4.2.2. Estrutura da Parede Celular
As paredes celulares não são uniformes: sua composição, forma e tamanho
dependem da função da célula dentro do tecido da planta. Elas são estruturas
complexas, constituídas de multicomponentes, formando uma rede de
polissacarídeos unidos por ligações intermoleculares (Figura 1). Apesar da estrutura
química dos componentes individuais da parede já ter sido bem caracterizada, a
proporção relativa de cada um deles é pouco conhecida, e desta forma, um
entendimento completo da estrutura da parede celular vegetal está ainda para ser
10
estabelecido. Numa descrição simples, pode-se dizer que a parede celular contém
quatro componentes principais: celulose, polissacarídeos não celulósicos (PNC),
proteínas e polifenóis (Da-Silva et al, 1997).
Figura 1: Estrutura da parede celular vegetal.
Fonte: Da-Silva et al (1997)
Os PNC podem ser classificados pelos seus resíduos: neutros, quando
possuem na sua maioria resíduos de açúcares neutros; e ácidos, quando seus
resíduos forem basicamente ácidos urônicos (Asp 1996). Mais comumente os PNC
são divididos em polissacarídeos hemicelulósicos e pectínicos. Certas
generalizações podem ser feitas sobre os tipos de polímeros encontrados em
cereais (monocotiledôneas) e vegetais comestíveis (dicotiledôneas). Pectinas e
xiloglucanos são os principais PNC da maioria dos vegetais, mas são encontrados
em menores quantidades nos cereais, onde as β-glucanas são mais importantes. As
hemiceluloses estão ligadas às microfibrilas de celulose formando estruturas
11
resistentes que protegem a membrana plasmática e o protoplasma da célula. As
ligninas estão situadas na camada secundária proporcionando maior resistência aos
ataques de agentes químicos e de microrganismos (Da-Silva et al, 1997).
Os polissacarídeos da parede celular de cotilédones de soja, geralmente são
avaliados quanto aos teores de monossacarídeos e ácidos urônicos, os quais
indicam a presença das frações; ou os polissacarídeos são determinados como
fibras alimentares totais, solúveis e insolúveis, para após serem hidrolisados e então
avaliar os monossacarídeos. Independentemente da metodologia utilizada,
galactose, glicose, arabinose e ácidos urônicos são os principais componentes,
enquanto que xilose, ramnose e fucose são encontradas em menores quantidades
(Brillouet e Carré, 1983; Huisman et al, 1998; Mullin e Xu, 2000; Ouhida et al, 2002;
Stombaugh et al, 2000).
4.2.2.1. Substâncias Pécticas
As pectinas contribuem com a firmeza e estrutura dos tecidos das plantas,
são os principais componentes da lamela média e um dos principais polímeros da
parede celular vegetal. Os polissacarídeos pécticos são ricos em ácido
galacturônico, ramnose, arabinose e galactose. Os resíduos de ácidos
galacturônicos são carregados negativamente, devido a estas cargas estes
polímeros são altamente hidratáveis e ácidos, podendo ligar-se ionicamente a
cátions bivalentes. As substâncias pécticas podem ser divididas em três
polissacarídeos:
Ramnogalacturonano I (RG I): este polissacarídeo é o maior componente da lamela
média e parede celular primária de dicotiledôneas. Possui ligações α-1,4 de ácido
galacturônico e ligações α-1,2 de ramnose. Apresenta inúmeras cadeias laterais que
12
podem estar alternadas com moléculas de homogalacturonanos, formando extensas
cadeias. Muitos dos resíduos de ácido galacturônico são metil ou etil esterificados.
Apresenta, ainda, diversas cadeias laterais ligadas à posição 4 da ramnose. Estas
cadeias laterais são compostas, principalmente, por arabinose e galactose, e estão
unidas à ramnose através de ligações 1,5 e 1,4, respectivamente.
Homogalacturonanos: são formados por ligações α-1,4 de cadeias de ácido
galacturônico, que podem estar parcialmente metil esterificados. Outros açúcares
podem estar presentes em baixas concentrações. Estão unidos através de ligações
covalentes ao RG I ou a outros polissacarídeos. Interagem com íons Ca
+2
formando
uma estrutura em “caixa de ovos”. São encontrados na parede primária de
dicotiledôneas e em muitas frutas. Homogalacturonanos com baixo grau de metil
esterificação são chamados ácidos pécticos e os altamente metil esterificados são
chamados ácidos pectínicos, ou simplesmente pectinas.
Ramnogalacturonano II (RG II): encontrado em menor quantidade na parede
primária de dicotiledôneas, ligado ao RG I e a homogalacturonanos. É constituído
por ácido galacturônico, ramnose, arabinose e galactose (Brett e Waldron, 1996;
McDougall et al, 1996; Thakur et al, 1997).
4.2.2.2. Celulose
A celulose é o principal componente de sustentação das estruturas vegetais;
é um homopolissacarídeo neutro formado por cadeias retilíneas de anidro D-glucose
unidas em β-1,4. A ausência de substituintes nas longas cadeias de glicose permite
a associação intermolecular por grande número de ligações de hidrogênio, tendo
alto grau de polimerização, 2000 a 6000 na parede celular primária e mais de 10000
na parede secundária, produzindo áreas de cristalinidade, as quais contribuem para
13
sua insolubilidade e pouca reatividade. A celulose é insolúvel em água e
parcialmente hidrolisada por enzimas (celulase), em meio ácido é parcialmente
hidrolisada nas regiões amorfas formando microcristais. A celulose nativa difere em
cristalinidade quanto à localização na parede celular: a camada secundária contém
celulose altamente cristalina enquanto a camada primária contém principalmente
celulose amorfa (Da-Silva et al, 1997; Theander et al, 1993; Waldron et al, 2003).
4.2.2.3. Hemicelulose
A hemicelulose corresponde a um grupo heterogêneo de polissacarídeos
ramificados que se ligam firmemente à superfície das microfibrilas de celuloses e
entre si, cobrindo as microfibrilas e mantendo ligações cruzadas, via ligações de
hidrogênio, em uma rede complexa, sendo facilmente solubilizados em álcali diluído
após a eliminação da lignina. Os polímeros das hemiceluloses são formados por
vários resíduos de açúcares como D-xilose, D-manose, D-arabinose e D-galactose,
dentre outros. Estes açúcares estão ligados entre si por ligações glicosídicas β-1,4
formando uma estrutura principal composta por um tipo específico de resíduos, a
partir da qual surgem ramificações laterais de cadeias curtas de outros açúcares.
São classificados de acordo com o açúcar predominante na cadeia principal e na
ramificação lateral: xilanos (principal componente), galactomananos, arabinoxilanos,
galactosanas, ramnogalactosanas, etc. As hemiceluloses estão presentes em todas
as camadas da parede celular, mas concentram-se principalmente nas camadas
primária e secundária de monocotiledôneos e dicotiledôneos, onde estão
intimamente associadas à celulose e lignina (Da-Silva et al, 1997; Heredia et al,
1995; Waldron et al, 2003).
14
4.2.2.4. Lignina
São compostos polifenólicos altamente insolúveis formados pela
polimerização de três álcoois: álcool trans-p-cumaril, álcool-coniferil e álcool trans-
sinapil (Figura 2). Eles mantêm uma extensa rede de ligações cruzadas dentro da
parede celular, conferindo-lhes elevada resistência, pela eliminação de água entre
os polímeros (Da-Silva et al, 1997). Os precursores destes compostos são álcoois
cinâmicos que formam as unidades de fenilpropano. Estes são transformados em
ligninas por ligações complexas de polimerização, formando éter e ligações C-C,
durante estas ligações. Diferenças nas proporções relativas destas unidades
fenólicas são características para diferenciar ligninas de diferentes fontes (Theander
et al, 1993). A quantidade de polimerização é dependente da atividade dos
precursores e dos espaços vazios na parede celular, pois estas moléculas tendem a
ocupá-los, deixando na estrutura final a incapacidade de ocorrer extensão plástica. A
lignina também é uma efetiva barreira contra a penetração de patógenos, tal que as
células totalmente lignificadas morrem sem serem infectadas (Brett e Waldron,
1996).
Figura 2: Constituintes aromáticos da lignina.
Fonte: Theander et al (1993).
15
4.2.2.5. Proteínas
A parede celular vegetal contém proteínas estruturais que desempenham
papel importante na arquitetura da parede por meio de ligações cruzadas com outros
componentes. Dentre elas, a proteína melhor descrita é a extensina, que constitui
aproximadamente 5% da camada primária dos vegetais dicotiledôneos. É uma
glicoproteína constituída de cerca de 40% de hidroxiprolina e outros aminoácidos,
lisina, serina e tirosina. Este último está envolvido em ligações cruzadas com
compostos fenólicos contribuindo para a insolubilidade da proteína na parede (Da-
Silva et al, 1997; Waldron et al, 2003).
As proteínas podem reagir reversível ou irreversivelmente com os compostos
polifenóis reduzidos ou oxidados. Na forma reduzida os polifenóis reagem com as
proteínas de maneira reversível através de ligações de hidrogênio e/ou interações
hidrofóbicas. Quando oxidados seus produtos de oxidação, as quinonas, formam
ligações covalentes com alguns grupos funcionais das proteínas, sendo que os
grupos sulfidrilos (cisteína) e os epsilon-amino (lisina) são os mais reativos
(Sgarbieri, 1996).
Showalter (1993) cita mais quatro classes de proteínas em paredes celulares:
- Proteínas ricas em glicina: são caracterizadas por estrutura primária repetitiva,
contendo mais de 70% de glicina arranjadas em curtas seqüências de aminoácidos;
- Proteínas ricas em prolina: caracterizam-se pela ocorrência de unidades repetidas
de prolina-prolina. Estas proteínas estão envolvidas no desenvolvimento vegetal e
na formação de nódulos fixadores de nitrogênio;
- Lectinas: este grupo apresenta a habilidade de se ligar especificamente a certos
açúcares. O principal monossacarídeo presente nestas proteínas é arabinose (92%),
16
o qual está ligado à hidroxiprolina (16%) (Heredia et al, 1995). As lectinas parecem
estar relacionadas com a interação célula-célula e com o sistema de defesa vegetal.
- Proteínas de arabinogalactanos: são glicoproteínas ricas em hidroxiprolina que
estão glicosiladas por cadeias de arabinogalactanos. Estas proteínas compreendem
apenas 2 a 10% do total de proteínas presentes na parede. Devido à sua
abundância na lamela média tem sido proposto que agiriam como colas e
lubrificantes e também em processos de reconhecimento célula-célula.
4.3. Propriedades Fisiológicas e Funcionais das Fibras
Fibras alimentares são macromoléculas resistentes à digestão pelas enzimas
do trato gastrointestinal humano e são essencialmente compostas de componentes
de parede celular, tais como polissacarídeos e lignina. As fibras proporcionam
efeitos fisiológicos a quem ingere a quantidade diária recomendada de fibras totais
(25-30g), sendo que 75% desta quantidade devem estar na forma insolúvel. Os
benefícios descritos são: aumento da saciedade, regulação do trânsito intestinal,
aumento do volume fecal (principalmente as insolúveis), redução do colesterol,
aumento na excreção de sais biliares e prevenção de algumas doenças, incluindo o
câncer de cólon (principalmente as solúveis) (Tharanathan e Mahadevamma, 2003).
Parte das respostas fisiológicas benéficas é devido a maior mastigação
exigida pelas fibras e, portanto, o bolo alimentar tem maior quantidade de saliva. No
estômago podem diminuir a velocidade da vazão e causar o retardamento da
digestão e, por conseguinte, da absorção no intestino delgado por mecanismos
variados: a) formação de uma matriz que prende os glicídios entre suas malhas
(quando se tratam de fibra viscosa) ou nas paredes celulares; b) fenômenos de
dispersão por absorção e insorção de água, sais biliares e intercâmbio iônico com a
17
soma de cátions e maior eliminação de colesterol; este último é subtraído ao diminuir
o ciclo êntero-hepático da bílis e transportado ao intestino grosso onde as bactérias
o transformam em coprostanol sendo eliminado pelas fezes; c) inibição de enzimas
digestivas como as amilases, enteroglucagon, modificação do GIP (polipeptídeo
inibidor gástrico), em especial pela fibra viscosa (Salinas, 2002; Mälkki, 2001;
Schneeman, 1986).
Em pacientes que ingeriram dietas preparadas com fibra de soja, houve o
aumento do volume fecal e o decréscimo do tempo de trânsito intestinal, efeitos
comuns das fibras com componentes insolúveis. No entanto, a fibra de cotilédones
de soja também apresenta ações fisiológicas oriundas de fibras solúveis. Em alguns
estudos foi verificada a diminuição do colesterol em animais e humanos e da glicose
(8,5%) quando os pacientes ingeriram 25g destas fibras. A fibra de soja parece ser
extremamente fermentável em humanos, um estudo comprovou que 93% das fibras
foram digeríveis quando os pacientes ingeriram 30g diárias e 86% quando ingeriram
60g, sendo uma diferença não significativa. Mas esta alta digestibilidade da fibra de
soja pode ajudar a explicar alguns dos efeitos fisiológicos (Slavin, 1991; Riaz, 2001).
Um efeito nutricional negativo, associado à ingestão de fibras, que tem sido
relatado em alguns estudos in vitro é a absorção, pela fibra, de alguns minerais
importantes, como o zinco e o cálcio. Mas quando os mesmos estudos foram
realizados em ratos e em humanos foi verificado que as fibras não exerceram efeito
na absorção de minerais (Gordon, 1989; Roehrig, 1988; Schneeman, 1986).
As propriedades fisiológicas das fibras são relacionadas com a principal
característica físico-química, a propriedade de hidratação, possivelmente pela
presença de componentes de fibras alimentares insolúveis, como celulose,
hemicelulose e lignina, que são materiais hidrofílicos (Auffret et al, 1994; López et al,
18
1996). A composição química e as características físicas das fibras influenciam
nesta propriedade, pois compostos de parede celular primária absorvem mais água
do que compostos de parede celular secundária. Além disso, processos
tecnológicos, como moagem, secagem, aquecimento e extrusão modificam as
propriedades físicas da matriz, afetando as propriedades de hidratação (Guillon e
Champ, 2000).
O conhecimento das propriedades de hidratação, tais como: capacidade de
absorção de água, volume de intumescimento e solubilidade, das fibras alimentares
é importante para a aplicação em alimentos. A presença de cargas, ácidos urônicos
dissociados, sulfatos e fitatos tendem a favorecer a solubilização, mas suas cargas
elétricas dependem do pH e da temperatura (Tharanathan e Mahadevamma, 2003).
Segundo Erdman e Weingartner (1981) as fibras de cotilédones de soja têm maior
poder de absorção de água do que as fibras extraídas de cereais.
4.4. Compostos de Soja com Atividades Fisiológicas
4.4.1. Ácido Fítico
O ácido fítico ou inositol hexafosfato (C
6
H
18
O
24
P
6
) na soja e seus derivados
varia de 1 a 2%. Este composto constitui a principal forma de armazenamento de
fósforo nos vegetais, correspondendo de 60 a 90% do fósforo total (Cheryan, 1980).
No entanto, este fósforo não é nutricionalmente disponível (Torre et al, 1991), ao
menos que ocorra uma hidrólise pelas fitases ou fosfatases alcalinas, capazes de
digerir os fitatos, as quais não são encontradas no trato gastrointestinal humano
(Plaami, 1997). Os níveis de fitato nos grãos podem ser influenciados pela genética,
condições ambientais, localização, condições de irrigação, tipo do solo, ano e
aplicações de fertilizantes. A proporção de fósforo fítico aumenta com o aumento da
19
suplementação de P
2
O
5
para a planta, pois quando a planta recebe maior
quantidade de fósforo do que necessita, este é estocado sob a forma de ácido fítico
(Oatway et al, 2001).
Normalmente o ácido fítico é encontrado sob a forma de complexos com
minerais essenciais e proteínas. Em pH ácido, a proteína possui cargas positivas e o
ácido fítico cargas negativas, ocorrendo a forte interação eletrostática proteína-ácido
fítico. A quantidade da interação parece ser dependente do número de cargas
positivas dos grupos aminos que estarão disponíveis para reagir com os ésteres
fosfatos aniônicos do ácido fítico (Cheryan, 1980). As interações ácido fítico-minerais
e ácido fítico-minerais-proteína, podem ter a molécula de ácido fítico associada a
mais de um mineral, sendo estes complexos mais estáveis do que quando o fitato
encontra-se ligado a um único mineral.
O ferro é o mineral menos influenciado por altas concentrações de ácido
fítico, porque o complexo ferro-fitato não se forma no pH alcalino da porção superior
do duodeno, onde a maior parte do ferro é absorvida (Coelho, 1995), e também
porque 40% do total de ferro em carne, aves e peixes estão na forma heme, a qual é
muito melhor absorvida, pelo organismo humano, do que a forma não-heme (Plaami,
1997). A biodisponibilidade do cálcio pode ser afetada pela interação com o ácido
fítico, pois este componente tem alta afinidade com todas as formas de Ca,
formando complexos insolúveis em baixo pH (Torre et al, 1991). O zinco é o mineral
essencial mais afetado pelo fitato, porque é capaz de formar os complexos mais
fortes e insolúveis: fitato-Zn-proteína e fitato-Zn, por isto foi criado um indicador de
biodisponibilidade do zinco. A taxa molar do fitato:Zn é calculada pela divisão dos
milimoles de fitato (mg de fitato/peso molecular do fitato) pelos milimoles de Zn (mg
de Zn/peso molecular do Zn) e a taxa molar do complexo fitato x Ca : Zn é dada
20
pelos milimoles de fitato multiplicada pelos milimoles de Ca e dividida pelos
milimoles de Zn (Ellis et al, 1987). Taxas molares de fitato:Zn maiores que 15mmol
indicam absorção reduzida e menores que 10mmol mostram disponibilidade
adequada, mas quando o cálcio estiver presente neste complexo (fitato x Ca : Zn) a
taxa molar recomendada aumenta para um máximo de 200mmol (Adeyeye et al,
2000; Ellis et al, 1987).
O poder quelante do ácido fítico, especialmente com o Fe, tem ação
antioxidante, inibindo a formação do radical livre (*OH) e da peroxidação lipídica.
Efeitos sinergísticos de misturas de tocoferol (vitamina E) e ácido fítico têm sido
usados na proteção contra a autoxidação de lipídios. Esta propriedade também foi
verificada em carnes, onde a interação foi dependente da concentração e pH
(Oatway et al, 2001). O consumo de ácido fítico também tem demonstrado alguns
benefícios para controlar doenças: prevenção ou redução do tamanho e da
proliferação celular de alguns tipos de câncer, principalmente câncer de cólon;
diminuição dos riscos de doenças coronárias; redução da glicose sangüínea e de
cálculos renais (Anderson et al, 1991; Frühbeck et al, 1995; Plaami, 1997).
4.4.2. Isoflavonas
Isoflavonas são compostos fenólicos pertencentes ao grupo dos flavonóides
encontradas principalmente na soja e podem existir em 4 formas químicas:
glicosídeos (daidzina, genistina e glicitina), agliconas (daidzeína, genisteína e
gliciteína) e duas formas conjugadas malonil-glicosídeo (6”O-malonil-daidzina, 6”O-
malonil-genistina e 6”O-malonil-glicitina) e acetil-glicosídeo (6”O-acetil-daidzina, 6”O-
acetil-genistina e 6”O-acetil-glicitina) (Liu, 1997). As isoflavonas não são
encontradas no tegumento da semente. O hipocótilo, mesmo sendo somente 2% do
21
peso seco da semente, tem de 5,5 a 6 vezes mais isoflavonas do que os
cotilédones. A forma glicosídica glicitina e seus derivados ocorrem somente no
hipocótilo (Kudou et al, 1991; Tsukamoto et al, 1995).
Malonil-genistina foi a isoflavona encontrada em maior concentração nos
grãos (25-42%), seguido por genistina, malonil-daidzina e daidzina respectivamente,
num total que variava entre 83-93% de isoflavonas (Wang e Murphy, 1994). Os
conjugados malonil e acetil-glicosídicos são termicamente instáveis, sofrendo
hidrólise pela ação de temperaturas elevadas (80ºC) (Kudou et al, 1991; Liu, 1997),
dando origem às formas glicosídicas, através de uma reação de de-esterificação das
ligações éster entre o grupo carboxila-malonato ou carboxila-acetato, produzindo
metil-malonato ou metil-acetato e a forma glicosídica (Barnes et al, 1994).
Das diferentes isoflavonas, as agliconas, sobretudo a genisteína tem
despertado maior interesse dos pesquisadores. Estudos in vitro demonstraram que
ela previne a transformação de células normais em pré-malignas, torna mais lenta a
proliferação celular e atenua a angiogênese (Anderson et al, 1999), sendo que a
biodisponibilidade das agliconas é maior que dos conjugados glicosídeos (Kurzer e
Xu, 1997). Assim, considerando que a disponibilidade da enzima β-glicosidase é
limitada no organismo, a ingestão de alimentos com maiores concentrações de
agliconas torna o processo de absorção mais rápido.
Além do efeito anticarcinogênico, as isoflavonas têm sido associadas
beneficamente ao tratamento da osteoporose, uma doença bastante grave em
mulheres pós-menopausa, pois baixos níveis de estrógenos estimulam a perda de
massa óssea (Neven, 1998; Chambô Filho et al, 2000). Segundo Messina (1999),
além das isoflavonas, a proteína de soja também contribui para a diminuição da
perda de massa óssea, reduzindo a excreção de cálcio através da urina,
22
provavelmente devido ao baixo teor de aminoácidos sulfurados que apresenta. A
quantidade de isoflavonas na dieta necessária para produzir efeitos biológicos no
organismo humano parece ser de 30 a 50 mg/dia (Setchell, 1998).
4.5. Hidrólise Enzimática
As propriedades físico-químicas de macromoléculas, proteínas e carboidratos,
podem ser manipuladas por tratamentos químicos, mecânicos, enzimáticos ou
térmicos. Os objetivos destas modificações intencionais são: aumentar a
funcionalidade e a disponibilidade de nutrientes, produzir hidrolisados com peptídeos
definidos, isolar peptídeos fisiologicamente ativos e remover sabores ou odores
assim como compostos tóxicos. A hidrólise enzimática é preferida em proteínas e
carboidratos porque pode ser controlada, havendo uma alteração total, parcial ou
específica, dependendo do interesse (Lahl e Braun, 1994; Sgarbieri, 1996).
Em proteínas os tratamentos mecânicos e térmicos causam desnaturação,
resultando em menor solubilidade, perda da atividade biológica e aumento de
interações proteína-proteína ou proteína com outras substâncias, lipídios,
carboidratos e minerais. Estas interações também são ocasionadas por tratamentos
químicos, que provocam modificações na polaridade, além de serem caros, não
específicos e formar compostos tóxicos. Enquanto que os tratamentos enzimáticos
têm proteólise limitada e seletiva; aumentam a solubilidade, a capacidade
emulsificante e espumante; melhoram a disponibilidade dos aminoácidos e os
processos podem ser acelerados com maior quantidade de enzimas, reduzindo
tempo e custos operacionais. Devido ao maior controle na hidrólise, os produtos
resultantes de modificações enzimáticas podem ser utilizados em dietas especiais,
23
para doentes, idosos e crianças (Fischer et al, 2001; Lahl e Braun, 1994; Liu, 1997;
Marsman et al, 1997; Tsumura et al, 2005).
A incorporação de fibras em alimentos pode causar modificações
indesejáveis, particularmente quanto ao sabor e textura, por isso estes
polissacarídeos têm sofrido tratamentos antes do uso para alterar a complexa
estrutura física existente em compostos de parede celular (Marsman et al, 1997;
Tharanathan e Mahadevamma, 2003). As fontes das fibras e as condições
operacionais influenciam no impacto do tratamento. Tratamentos enzimáticos são os
preferidos para a produção de hidrolisados que serão utilizados em alimentos,
resultando no aumento das quantidades de fibras solúveis; no aumento do volume
de intumescimento das fibras insolúveis, provavelmente pelo aumento da
porosidade, e na maior ou menor absorção de água dependendo do tamanho e da
distribuição dos poros (Guillon e Champ, 2000).
24
5. DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E FUNCIONAL COMPARATIVA DE
INGREDIENTES DE SOJA [Glycine Max (L.) Merrill] BASEADOS EM
CARBOIDRATOS E PROTEÍNAS
RESUMO
O objetivo do trabalho foi quantificar componentes químicos e determinar
propriedades funcionais de ingredientes à base de soja. Ingredientes de carboidratos
ou fibras alimentares derivadas de cotilédones e ingredientes protéicos como
concentrado e farinha desengordurada foram avaliados. Os ingredientes protéicos
tinham em média 72% de proteína e os ingredientes de fibras, em média 60% de
fibra alimentar. O macromineral de maior concentração foi o potássio e o
micromineral foi o ferro em todos os ingredientes. As várias formas de fósforo
diferiram nos dois tipos de ingredientes: fósforo inorgânico que variaram de 0,1 a
0,6mg/g, fósforo fítico de 1,0 a 4,9mg/g e ácido fítico de 3,6 a 17,3mg/g, os maiores
valores estavam associados com as frações protéicas. Taxas molares de ácido fítico:
minerais foram avaliadas e o Zn, mineral mais afetado, apresentou uma taxa menor
da necessária para ter a absorção prejudicada. Dos oito isômeros de isoflavonas
quantificados, daidzina e malonil daidzina estavam somente nos produtos protéicos,
e as formas gliciteína e acetil genistina somente nas amostras de fibra alimentar. As
propriedades funcionais avaliadas foram índice de absorção de água (IAA), volume
de intumescimento (VI), índice de absorção de óleo (IAO), capacidade emulsificante
(CE) e atividade emulsificante (AE). Os ingredientes de fibras alimentares tiveram as
melhores propriedades de hidratação (IAA 8,4g/g; VI 18mL/g) e nas propriedades
25
relacionadas com o óleo, mesmo tendo menores percentuais de proteínas,
apresentaram índices similares à da farinha de soja (IAO 2,4g/g; CE 187,8mL/g e AE
53%).
Palavras-Chave: ingredientes alimentares de soja, propriedades tecnológicas, fibra
alimentar, ácido fítico, isoflavonas, minerais.
INTRODUÇÃO
Comercialmente a soja é industrializada para obtenção de óleo e de
proteínas, a cada tonelada de óleo bruto de soja, são produzidas 4,5 toneladas de
farinha de soja, contendo aproximadamente 44% de proteína (Kumar et al, 2002). A
farinha de soja desengordurada é o primeiro produto sólido a ser gerado após a
prensagem dos grãos, para a extração do óleo. O concentrado protéico é separado
da farinha desengordurada por desnaturação e precipitação com soluções de álcool
(etanol 60-80%) ou de ácido diluído (pH 4,5). O isolado protéico é preparado a partir
da farinha desengordurada por solubilização das proteínas e carboidratos usando
uma solução aquosa (pH 7-10), e a fração insolúvel é removida por centrifugação,
seguida por precipitação das proteínas da soja, utilizando o ponto isoelétrico (pH
4,5) (Liu, 1997b). A fibra de soja, ou fração insolúvel, é separada por centrifugação,
contém principalmente carboidratos da parede celular dos cotilédones da soja, mas
não contém casca de soja. É um produto com características ainda não descritas, o
que é necessário para a posterior utilização.
Alguns compostos químicos presentes na soja e seus derivados têm sido
investigados devido às suas propriedades nutricionais e funcionais, relacionadas à
saúde. Isoflavonas, com atividades anticarcinogênicas, são compostos fenólicos
presentes na soja e podem existir em 4 formas químicas: os glicosídeos, as
26
agliconas e duas formas conjugadas o malonil-glicosídeo e o acetil-glicosídeo (Liu,
1997a; Wang e Murphy, 1994).
O ácido fítico ou inositol hexafosfato (C
6
H
18
O
24
P
6
) constitui a principal forma
de armazenamento de fósforo nos vegetais, correspondendo de 60 a 90% do fósforo
total (Cheryan, 1980). A soja e seus derivados contêm de 1 a 2% de ácido fítico, que
podem quelar íons metálicos di e trivalentes, tais como Ca, Mg, Zn e Fe, formando
compostos insolúveis que atrapalham a absorção destes íons metálicos no intestino
(Anderson e Wolf, 1995; Liu, 1997a). No entanto a ligação do ferro pelo ácido fítico,
pode ter um efeito benéfico, atuando como antioxidante, inibindo a taxa de formação
de radicais livres e da oxidação lipídica (Plaami, 1997).
As propriedades funcionais também têm recebido atenção, principalmente em
novos ingredientes alimentares, pois afetam as características nutritivas e sensoriais
dos produtos, além de ter um importante papel físico na preparação, processamento
ou estocagem dos alimentos. As propriedades funcionais dos componentes
alimentares estão relacionadas com: capacidade de hidratação e propriedades
relacionadas com tamanho, forma e propriedades de superfície das moléculas
(Auffret et al, 1994; Sgarbieri, 1998; Thibault et al, 1992). Existe uma correlação
entre as propriedades físico-químicas e as propriedades funcionais das proteínas,
especialmente as da soja, as quais podem ser alteradas, favoravelmente ou não, por
temperatura, secagem, métodos de preparação ou outros tratamentos durante o
processamento e estocagem dos produtos (Lee et al, 2003).
Os ingredientes protéicos, farinhas desengorduradas e concentrados
protéicos, têm como principal característica funcional a solubilidade, pois esta
influencia na maioria das outras propriedades, tais como: geleificação, capacidade
espumante e emulsificante. Portanto o conhecimento da habilidade das proteínas
27
em combinar água à sua estrutura é muito importante na maioria das aplicações
alimentares (Chou e Morr, 1979). Fibras alimentares são macromoléculas resistentes
à digestão pelas enzimas do trato gastrointestinal humano e são essencialmente
compostas de componentes de parede celular, tais como polissacarídeos e lignina
(Tharanathan e Mahadevamma, 2003). A composição química destes compostos é
variável em decorrência da origem e tem sido relacionada com efeitos fisiológicos
para o organismo humano, tais como, regulação do trânsito intestinal, aumento do
volume fecal e prevenção de algumas doenças, incluindo o câncer de cólon. As
responsáveis por estes efeitos são as propriedades de hidratação, as principais
características físico-químicas das fibras, as quais podem ser avaliadas pelo volume
de intumescimento e índice de absorção de água (Auffret et al, 1994).
O objetivo do presente estudo foi quantificar os compostos químicos e
determinar as propriedades funcionais de ingredientes derivados de soja.
MATERIAL E MÉTODOS
As matérias-primas utilizadas foram fibras de cotilédones de soja,
apresentadas sob duas formas: fibra alimentar original (FAO) e com redução do
tamanho das partículas (fibra alimentar micronizada - FAM), concentrado protéico e
farinha desengordurada, fornecidas pela empresa Solae Company (Esteio/RS).
Propriedades Químicas
Composição centesimal: umidade determinada por secagem a 105ºC até peso
constante, cinzas por incineração em mufla a 550ºC, o conteúdo de nitrogênio por
Microkjeldahl usando sulfato de cobre e sulfato de potássio como catalisadores, o
conteúdo de proteínas foi calculado multiplicando o nitrogênio por 6,25 e os lipídios
28
foram extraídos em Soxhlet com éter de petróleo, todas as análises foram segundo
A.O.A.C. (1995). Carboidratos não identificados foram determinados por diferença.
Fibras alimentares insolúveis, solúveis e totais: fibras alimentares insolúveis e
solúveis foram determinadas com a metodologia enzimática-gravimétrica segundo o
método nº 985.29 da AOAC (1995), usando o kit de ensaio de fibra alimentar total da
Sigma (TDF 100A) e tampão fosfato 0,08M pH 6. Fibras alimentares totais foram
determinadas como a soma das frações insolúveis e solúveis.
Minerais: foram determinados, nas cinzas das amostras após solubilização em
ácido clorídrico, por absorção atômica no Espectrofotômetro Perkin-Elmer. Foi
utilizado padrão Merck para comparação.
Fósforo inorgânico e fítico: foram determinados segundo a metodologia de
Thompson e Erdman (1982). O fósforo inorgânico foi extraído com ácido
tricloroacético 12,3% em shaker horizontal Marconi MA830/A (125 rpm a
temperatura ambiente). O fósforo fítico foi extraído com ácido tricloroacético 3% e
sulfato de sódio 10% no mesmo shaker e condições, e precipitado com cloreto
férrico em banho-maria a 100ºC. Os fósforos foram determinados segundo Chen et
al (1956), a leitura das absorbâncias foi feita em 820nm em Espectrofotômetro UV-
visível Cintra 20, usando uma curva de calibração de 10 pontos, com concentração
de 10 a 100ug de fósforo e com R
2
= 0,9991.
Ácido fítico: foi calculado assumindo-se que na molécula há 28,2% de fósforo.
Isoflavonas: foram extraídas com etanol e ácido acético, sob agitação de 250 rpm
por uma hora em uma mesa agitadora Tecnal Orbital, Modelo TE 140. A separação
das isoflavonas foi realizada em cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE)
(Waters, Milford, E.U.A.) equipado com coluna de fase reversa (YMC Pack ODS-AM,
250 mm x 0,4 mm de diâmetro) e detector de Arranjo de Diodo (Waters 996)
29
ajustado para o comprimento de onda de 260nm. A fase móvel constituiu um
gradiente linear binário de metanol contendo 0,025% de ácido trifluoroacético (TFA)
(Solvente A) e água destilada deionizada ultrapura contendo 0,025% de TFA
(Solvente B) num fluxo de 1mL/min. A condição inicial do gradiente foi de 20% para
o solvente A, que aos 40 minutos atingiu a concentração de 100% para, em seguida,
retornar a 20% aos 41 minutos e permanecer nestas condições até os 60 minutos. A
identificação foi realizada por comparação com uma solução padrão contendo
daidzina, daidzeína, genistina e genisteína (Fujicco) e a quantificação das
isoflavonas foi por padronização externa (área dos picos). Os conjugados malonil-
glicosídeos foram calculados com base em seus pesos moleculares (Song et al
1998), considerando sua absortividade molar igual à absortividade molar dos
glicosídeos e confirmado com os espectros.
Propriedades Funcionais
Solubilidade em diferentes pHs: Um grama de amostra foi suspensa em 25mL de
soluções tampão Mcllvaine em pH 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 e 7,0, e agitada por 30 minutos
em shaker horizontal Marconi MA830/A (125 rpm a temperatura ambiente). Após
centrifugação (3000 rpm por 20 minutos, em centrífuga Harrier 15/80 MSE), as
amostras foram filtradas em papel filtro Whatman n° 3. No sobrenadante foi
determinada proteína, pelo método de Microkjeldahl, usando uma alíquota de 2mL.
%proteína solúvel = Proteína solúvel no sobrenadante x 100
Proteína total
Volume de intumescimento: um grama de amostra foi misturado com excesso de
água destilada em proveta de 100 mL. A suspensão foi continuamente agitada por 2
horas com barra magnética e posteriormente deixada em repouso para completa
30
decantação. O volume ocupado pela amostra na proveta foi denominado volume de
intumescimento e foi expresso em mL/grama de matéria seca.
Índice de absorção de água: dois gramas de amostra foram misturados com 20 mL
de água destilada a temperatura ambiente em tubos de centrífuga, previamente
pesados, foram continuamente agitados durante 30 minutos em agitador horizontal
Marconi MA830/A (75 rpm a temperatura ambiente), e centrifugados a 3000 rpm por
10 minutos em centrífuga Harrier 15/80 MSE. O sobrenadante de cada tubo foi
descartado e o sedimento úmido pesado. O IAA foi obtido através da razão entre o
peso do sedimento úmido e o peso da matéria seca e expresso em gramas de água
absorvida / grama de matéria seca.
Índice de absorção de óleo: foi determinado como o índice de absorção de água,
substituindo a água por óleo de soja comercial.
Capacidade emulsificante: um grama de amostra e 50mL de água destilada foram
homogeneizados por 30 segundos e adicionado óleo de soja a uma taxa de
10mL/min e misturados com shaker DIAX 600 Heidolph, em velocidade máxima. O
ponto de inversão de fase foi registrado visualmente com a liquefação da emulsão. A
capacidade emulsificante foi calculada como a quantidade de óleo emulsificado por
grama de amostra.
Atividade emulsificante: um grama de amostra, 10 mL de água destilada e 10 mL
de óleo de soja comercial foram emulsificados em um béquer de 100 mL com shaker
DIAX 600 Heidolph por 1 minuto, em velocidade máxima. A suspensão foi
centrifugada em tubos graduados a 3600 rpm por 10 minutos em centrífuga Harrier
15/80 MSE, onde o volume da camada emulsificada e o volume total foram lidos.
Atividade emulsificante = V da camada emulsificada
x 100
V total no tubo
31
Análises estatísticas: os resultados das amostras foram avaliados por ANOVA e
para comparar a diferença das médias, o teste de Tukey com intervalo de confiança
de 95% (p<0,05) foi usado.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A média de proteínas nas fibras de cotilédones foi de 28% e dos carboidratos
foi de 65%, dos quais 60% são fibras alimentares totais (Tabela 1). O concentrado e
a farinha desengordurada apresentaram médias de 72% de proteínas e como
componentes minoritários os carboidratos, média de 16% sendo 12,5% de fibras
alimentares totais. As maiores quantidades de fibras alimentares totais eram fibras
insolúveis, em todos os ingredientes, isto porque os carboidratos solúveis foram
retirados durante o processamento. As maiores concentrações de cinzas e de
lipídios estavam na farinha e no concentrado protéico, 7,9% e 6,5%,
respectivamente. O concentrado protéico diferiu da farinha desengordurada por ter
maior concentração de proteínas e lipídios, e menores de cinzas e fibras alimentares
totais, enquanto que os ingredientes de carboidratos apresentaram composição
similar.
Analisando a composição química de diferentes fibras alimentares Chang e
Morris (1990) relataram teores menores de proteínas (21,4%), cinzas (3,6%) e
lipídios (1,7%) para a fibra de soja, mas os dados foram expressos em base úmida.
Os resultados de fibra alimentar total, expressos em base seca, igualaram à da
amostra de fibra alimentar micronizada (62,3%), enquanto que a fibra solúvel foi
maior (7,3%), e a fibra insolúvel menor (53,2%). Martins (1995) relatou teores
menores de proteínas (25,3%), cinzas (2,8%), lipídios (1,1%) e fibra total (47,1%),
assim como as frações solúvel (2,2%) e insolúvel (44,9%) para a fibra de soja. Os
32
valores menores para os componentes determinados resultam em um valor superior
(23,7%) em carboidratos não identificados comparado ao valor máximo encontrado
nas amostras aqui avaliadas, que variou de 1,4 a 5,2%. Kumar et al (2002) relatou
teores menores de proteínas na farinha (48%) e no concentrado (64%), e maiores
para os carboidratos totais na farinha (31%) e valor semelhante no concentrado
protéico (14%). Liu (1997b) relatou que o concentrado protéico tem, em média, 5,0%
de cinzas e 72% de proteínas, valores próximos aos quantificados neste trabalho,
mas lipídios (1,0%) e carboidratos (20%) os teores foram diferentes. Na farinha, o
mesmo autor relatou teores menores de proteínas (59%), lipídios (1,1%) e cinzas
(6,5%), e maiores de carboidratos (32%), calculados por diferença para ambos os
produtos, mas sem análise de fibra alimentar. Lee et al (2003), avaliaram produtos
de soja oriundos de várias indústrias, quantificaram teores máximos de proteínas em
concentrados de 66,1% e em farinhas de 52,3%, os quais foram inferiores aos
determinados neste trabalho. As fibras de cotilédones, obtidas como a fração
insolúvel do processamento de isolado protéico de soja, juntamente com o
concentrado protéico e a farinha desengordurada são ingredientes industriais que
apresentam variações na composição que podem ser atribuídas às variedades de
sojas utilizadas como matéria-prima e aos diferentes métodos de processamento.
Macro e microminerais foram quantificados (Tabela 2). Os ingredientes de
fibras alimentares tiveram a mesma composição, pois os dois ingredientes diferem
somente no tamanho das partículas, tiveram maior quantidade de cálcio e menor de
fósforo, enxofre, zinco, manganês e cobre quando comparados aos ingredientes
protéicos. A farinha desengordurada e o concentrado protéico apresentaram teores
similares entre si para o fósforo, cálcio, enxofre e cobre. Em todas as amostras o
macromineral de maior concentração foi o potássio e entre os microminerais foi o
33
ferro. Com exceção do cálcio e do enxofre, todos os minerais da farinha
desengordurada apresentaram teores maiores do que nas outras amostras, o que é
conseqüência do maior percentual de cinzas quantificado nesta amostra.
Tabela 1: Composição centesimal de fibras de cotilédones, concentrado protéico e farinha
desengordurada de soja (%).
Amostras Proteínas Cinzas Lipídios Fibra
insolúvel
Fibra
solúvel
Fibra
total
Carboidratos
não
identificados
FAO
28,2
c
± 0,1
4,1
b
± 0,1
3,1
b
± 0,3
55,5
a
± 0,6
3,8
a
± 0,1
59,4
a
± 0,5
5,2
FAM
27,6
c
± 0,1
4,3
b
± 0,1
2,9
b
± 0,4
56,6
a
± 0,6
5,9
a
± 1,4
62,5
a
± 0,8
2,7
Concen-
trado
76,1
a
± 1,4
4,8
b
± 0,1
6,5
a
± 0,9
8,2
c
± 0,1
3,0
a
± 1,0
11,2
b
± 1,0
1,4
Farinha
68,8
b
± 3,8
7,9
a
± 0,1
4,3
b
± 0,3
13,8
b
± 0,4
0,2
b
± 0,1
14,0
b
± 0,3
5,0
FAO= fibra alimentar original; FAM= fibra alimentar micronizada.
Médias de determinações em triplicata, em base seca. Carboidratos não identificados foram determinados por
diferença.
Médias seguidas pela mesma letra, nas colunas, não diferiram ao nível de 5% pelo teste de Tukey.
Assim como os outros nutrientes, os minerais são influenciados pela
variedade, local e época de plantio (Liu, 1997a). A fibra de soja apresentou maiores
quantidades de cálcio, ferro, cobre e potássio do que o grão inteiro de soja, as
quantidades determinadas por Garcia et al (1998) foram: 125; 1,89; 0,33; 1316
mg/100g; respectivamente. O fósforo e o zinco no grão da soja foram maiores (443 e
3,5 mg/100g, respectivamente) do que a quantia determinada nas fibras alimentares.
A farinha de soja analisada por Koplik et al (2002) apresentou valores similares para
o fósforo (7160 µg/g), magnésio (2990 µg/g), zinco (52,9 µg/g), manganês (41,7
34
µg/g) e ferro (140 µg/g), maior teor de cálcio (3160 µg/g) e menores de potássio
(24000 µg/g) e cobre (16,1 µg/g).
Tabela 2: Minerais presentes em fibras de cotilédones, concentrado protéico e farinha
desengordurada de soja.
Amostras P
(mg/g)
K
(mg/g)
Ca
(mg/g)
Mg
(mg/g)
S
(mg/g)
Zn
(µg/g)
Mn
(µg/g)
Fe
(µg/g)
Cu
(µg/g)
FAO
2,4
b
±0,2
14,2
b
±0,3
4,6
a
±0,1
1,4
b
±0,1
2,3
b
±0,1
22,9
b
±2,8
19,8
b
±0,7
106,4
b
±2,3
7,9
b
±0,1
FAM
2,5
b
±0,1
15,6
b
±0,0
5,4
a
±0,1
1,5
b
±0,1
2,4
b
±0,2
19,4
b
±0,1
20,6
b
±0,0
86,3
b
±0,8
8,1
b
±0,1
Concentrado
6,6
a
±0,2
9,7
c
±0,4
2,4
b
±0,5
1,4
b
±0,2
3,9
a
±0,1
28,2
b
±0,2
25,6
b
±2,2
127,6
b
±1,5
16,1
a
±0,2
Farinha
6,8
a
±0,2
30,7
a
±1,8
2,5
b
±0,2
3,3
a
±0,2
3,7
a
±0,1
53,1
a
±2,4
43,3
a
±2,3
137,9
a
±12,1
20,2
a
±0,8
FAO= fibra alimentar original; FAM= fibra alimentar micronizada.
Médias de determinações em duplicata, em base seca.
Médias seguidas pela mesma letra, nas colunas, não diferiram ao nível de 5% pelo teste de Tukey.
Houve diferença nos teores de fósforo inorgânico entre todas as amostras e
nos teores de fósforo fítico entre os dois grupos de ingredientes alimentares (Tabela
3). Em relação ao fósforo total determinado na amostra de fibra alimentar original,
45,7% estava na forma de fósforo fítico e 6,1% na forma de inorgânico. Na amostra
de fibra alimentar micronizada 41,0% do fósforo total era fósforo fítico e 8,1% era
fósforo inorgânico. Na farinha desengordurada e no concentrado protéico,
respectivamente, 69,1% e 74,2% estavam na forma de fítico e 8,8% e 6,1% estavam
na forma de inorgânico. O ácido fítico quantificado na fibra alimentar original
equivale a 0,39% do peso da amostra, na fibra alimentar micronizada 0,36% e nas
amostras de ingredientes protéicos 1,7%.
35
Tabela 3: Teor de fósforo inorgânico, fósforo fítico e ácido fítico presentes em fibras
de cotilédones, concentrado protéico e farinha de soja.
Amostras Fósforo Inorgânico
(mg/g)
Fósforo Fítico
(mg/g)
Ácido Fítico
(mg/g)
FAO
0,15
d
± 0,01 1,10
b
± 0,05 3,89
b
± 0,16
FAM
0,20
c
± 0,01 1,03
b
± 0,03 3,64
b
± 0,10
Concentrado
0,42
b
± 0,01 4,89
a
± 0,25 17,34
a
± 1,68
Farinha
0,60
a
± 0,01 4,74
a
± 0,11 16,79
a
± 0,51
FAO= fibra alimentar original; FAM= fibra alimentar micronizada.
Médias de determinações em triplicata, em base seca.
Médias seguidas pela mesma letra, nas colunas, não diferiram ao nível de 5% pelo teste de Tukey.
Na soja até 75% do fósforo total pode ser fósforo fítico e 4,5% fósforo
inorgânico e do peso total do grão 1,4% pode ser ácido fítico, valores encontrados
nos ingredientes protéicos, porque a maior fração de fósforo, o ácido fítico,
geralmente se associa às proteínas durante o processamento. Em pH ácido, a
proteína possui cargas positivas e o ácido fítico cargas negativas, ocorrendo a forte
interação eletrostática proteína-ácido fítico. A quantidade da interação parece ser
dependente do número de cargas positivas dos grupos aminos que estarão
disponíveis para reagir com os ésteres fosfatos aniônicos do ácido fítico (Cheryan,
1980). A interação explica a maior quantidade de ácido e fósforo fítico nos
ingredientes protéicos e a menor quantidade nos ingredientes de fibras alimentares
que são resíduos do isolado protéico. No entanto, Honig et al (1984) não verificou
diferença estatística nos teores de ácido fítico do isolado protéico (1,60%) e dos
respectivos resíduos insolúvel (1,31%) e solúvel (1,23%).
Além das interações ácido fítico-proteína, podem existir outros complexos:
ácido fítico-minerais e ácido fítico-minerais-proteína, sendo que uma molécula de
ácido fítico pode se associar a mais de um mineral, formando complexos mais
36
estáveis do que quando o fitato encontra-se ligado a um único mineral. O ferro é o
mineral menos influenciado por altas concentrações de ácido fítico, porque o
complexo ferro-fitato não se forma no pH alcalino da porção superior do duodeno,
onde a maior parte do ferro é absorvida (Coelho, 1995), e também porque 40% do
total de ferro em carne, aves e peixes estão na forma heme, a qual é muito melhor
absorvida, pelo organismo humano, do que a forma não-heme (Plaami, 1997). A
biodisponibilidade do cálcio pode ser afetada pela interação com o ácido fítico, pois
este componente tem alta afinidade com todas as formas de Ca, formando
complexos insolúveis em baixo pH (Torre et al, 1991). O zinco é o mineral essencial
mais afetado pelo fitato, porque é capaz de formar os complexos mais fortes e
insolúveis: fitato-Zn-proteína e fitato-Zn, por isto foi criado um indicador de
biodisponibilidade do zinco. Taxas molares de fitato:Zn maiores que 15mmol indicam
absorção reduzida e menores que 10mmol mostram disponibilidade adequada, mas
quando o cálcio estiver presente neste complexo (fitato x Ca : Zn) a taxa molar
recomendada aumenta para um máximo de 200mmol (Adeyeye et al, 2000; Ellis et
al, 1987).
A taxa molar do fitato:Zn foi calculada pela divisão dos milimoles de fitato (mg
de fitato/peso molecular do fitato) pelos milimoles de Zn (mg de Zn/peso molecular
do Zn) e a taxa molar do complexo fitato x Ca : Zn é dada pelos milimoles de fitato
multiplicada pelos milimoles de Ca e dividida pelos milimoles de Zn (Ellis et al, 1987).
Para as quatro amostras a taxa molar do fitato:Zn foi maior que 15, indicando
redução na biodisponibilidade do zinco. As amostras de fibra alimentar
apresentaram valores mais próximos deste índice (original 19,3mmol e micronizada
17,8mmol), mas as amostras de ingredientes protéicos foram duas e quatro vezes
maiores (farinha 33,3mmol e concentrado 57,14mmol). Estes valores são maiores do
37
que a taxa molar do grão da soja (8mmol) determinada por Adeyeye et al (2000), a
qual foi menor que a taxa recomendada para a disponibilidade adequada. Segundo
Ellis et al (1987) a taxa fitato x Ca : Zn é a melhor para predizer a biodisponibilidade
do Zn, e por esta taxa a absorção do zinco não é afetada. Todas as amostras
apresentaram índices inferiores ao máximo permitido (fibra alimentar original
2,2mmol; fibra alimentar micronizada 2,4mmol; farinha 2,1mmol e concentrado
3,4mmol). É importante ressaltar que a absorção de qualquer nutriente pelos
humanos depende das condições de saúde e dos hábitos alimentares e sociais.
O poder quelante do ácido fítico, especialmente com o Fe, tem ação
antioxidante, inibindo a formação do radical livre (*OH) e da peroxidação lipídica.
Efeitos sinergísticos de misturas de tocoferol (vitamina E) e ácido fítico têm sido
usados na proteção contra a autoxidação de lipídios, esta propriedade também foi
verificada em carnes, onde a interação foi dependente da concentração e pH
(Oatway et al, 2001). O consumo de ácido fítico também tem demonstrando alguns
benefícios para controlar doenças: prevenção ou redução do tamanho e da
proliferação celular de alguns tipos de câncer, principalmente câncer de cólon;
diminuição dos riscos de doenças coronárias; redução da glicose sangüínea e de
cálculos renais (Anderson et al, 1991; Frühbeck et al, 1995; Plaami, 1997).
Oito formas químicas de isoflavonas foram quantificadas nos produtos de soja
(Tabela 4). Daidzina e malonil daidzina estavam presentes somente nos produtos
protéicos, e as formas gliciteína e acetil genistina somente nas amostras de fibra
alimentar original e micronizada. Não houve diferença na quantidade de genistina,
malonil genistina e nas isoflavonas totais presentes nas amostras de fibra alimentar.
O concentrado protéico e a farinha desengordurada de soja apresentaram diferentes
quantidades para todas as formas de isoflavonas detectadas. A farinha de soja foi o
38
produto com maior concentração de isoflavonas totais, isto se deve ao processo de
desengorduramento que concentra estes componentes na fração não lipídica (Wang
e Murphy, 1994). O concentrado protéico de soja apresentou menores quantidades
de isoflavonas totais do que na farinha, devido provavelmente ao processamento, o
qual muitas vezes é feito com extração aquosa de etanol 65%, que é um excelente
solvente para isoflavonas (Coward et al, 1993), este efeito foi verificado por Wang e
Murphy (1994) que quantificaram 73µg/g de isoflavonas totais em concentrado de
soja extraído com álcool. Os glicosídeos e malonil-glicosídeos predominaram nos
ingredientes protéicos, correspondendo a 79% no concentrado e 94% na farinha do
total das isoflavonas presentes. Na farinha 50% das isoflavonas eram malonil
glicosídio, concordando com Coward et al (1993), que cita que glicosídeos estão em
maior proporção nos produtos de soja minimamente processados, tais como a
farinha. Wang e Murphy (1994) encontraram 134,1mg/100g de malonil glicosídeo
dos 201,4mg/100g de isoflavonas totais na farinha de soja.
Os ingredientes de fibra alimentar apresentaram os menores valores de
isoflavonas totais e a quantidade determinada foi similar com a relatada por Coward
et al (1993), que avaliaram amostras de fibra de soja quanto às agliconas e
conjugados, totalizando 49,4mg/100g de isoflavonas. A concentração total de
isoflavonas nas fibras correspondeu a 45% do valor encontrado na farinha, e
apresentou mais genisteína e daidzeína, assim estes ingredientes alimentares
também poderão atuar na prevenção de osteoporose, doenças cardíacas, alguns
tipos de câncer e sintomas da menopausa, propriedades associadas com o
consumo de isoflavonas (Brouns, 2002). A identificação de gliciteína na amostra de
fibra alimentar micronizada sugere a presença de hipocótilo, pois Tsukamoto et al
(1995) afirma que o glicosídeo glicitina e suas agliconas são encontrados somente
39
nesta fração do grão. Provavelmente as amostras são de diferentes extrações de
proteínas e na amostra micronizada não houve a separação completa do hipocótilo
dos cotilédones. Outro indício de que as amostras são oriundas de diferentes
extrações foi a presença da forma conjugada acetil genistina na fibra alimentar
original, muito associada com tratamento térmico do material. De acordo com
Anderson e Wolf (1995) e Kurzer e Xu (1997) em produtos com tratamento térmico a
forma malonil é instável e pode ser transformada na forma acetil.
Tabela 4: Isoflavonas presentes em fibras de cotilédones, concentrado protéico e
farinha desengordurada de soja (mg/100g).
Tipos de Isoflavonas
Amostras
Daidzina Genistina Daidzeína Genisteína Gliciteína Malonil
Daidzina
Malonil
Genistina
Acetil
Genistina
Total
FAO
nd 11,8
c
±0,1
10,9
b
±0,2
8,3
b
±0,1
nd nd 6,3
c
±0,1
11,3
±0,2
48,6
c
±2,2
FAM
nd 11,0
c
±0,3
14,1
a
±0,1
11,0
a
±0,1
8,0
±0,3
nd 5,6
c
±0,3
nd 49,7
c
±3,0
Concentrado
7,4
b
±0,3
17,1
b
±0,2
6,9
c
±0,1
5,8
c
±0,1
nd 9,1
b
±0,3
14,7
b
±0,6
nd 61,0
b
±1,1
Farinha
17,8
a
±0,4
28,0
a
±0,9
4,1
d
±0,4
2,9
d
±0,6
nd 23,6
a
±0,9
32,5
a
±0,8
nd 108,9
a
±1,7
nd = não detectado. FAO= fibra alimentar original; FAM= fibra alimentar micronizada.
Médias de determinações em triplicata, em base seca.
Médias seguidas pela mesma letra, nas colunas, não diferiram ao nível de 5% pelo teste de Tukey.
O efeito do pH na solubilidade protéica foi avaliado utilizando soluções com
pH de 3,0 a 7,0 (Tabela 5). Para os ingredientes de fibra alimentar o conteúdo de
proteínas solúveis foi menor no pH 3,0 (original 5,7% e micronizada 4,7%), atingindo
máximo de 10,7% na solução com pH 7,0, pois a proteína solúvel já havia sido
40
extraída. O concentrado protéico e a farinha desengordurada apresentaram menor
solubilidade em pH 4,0 (2,8% e 8,0% respectivamente), pois próximo do pI a
quantidade de cargas positivas e negativas são iguais e se neutralizam
intramolecularmente. Nas soluções com pH acima do pI, a solubilidade os
ingredientes protéicos aumentou, atingindo um máximo de 7,2% para o concentrado
e 30,1% para a farinha, no pH 7,0.
Tabela 5: Efeito do pH na solubilidade protéica de fibras de cotilédones, concentrado
protéico e farinha desengordurada de soja (% de proteínas solúveis em relação às
proteínas totais).
Amostras pH 3,0 pH 4,0 pH 5,0 pH 6,0 pH 7,0
FAO
5,7
c
± 0,5 6,0
b
± 0,5 6,7
c
± 0,1 7,7
b
± 0,4 7,6
c
± 0,1
FAM
4,7
c
± 0,3 6,4
b
± 0,7 9,6
b
± 0,2 10,5
b
± 0,3 10,7
b
± 0,3
Concentrado
16,3
b
± 0,5 2,8
c
± 0,3 4,1
d
± 0,1 6,1
b
± 0,9 7,2
c
± 0,1
Farinha
39,4
a
± 0,5 8,0
a
± 0,5 18,4
a
± 0,6 28,3
a
± 4,6 30,1
a
± 0,7
FAO= fibra alimentar original; FAM= fibra alimentar micronizada.
Médias de determinações em triplicata, em base seca.
Médias seguidas pela mesma letra, nas colunas, não diferiram ao nível de 5% pelo teste de Tukey.
A fração solúvel dos ingredientes protéicos foi similar aos conteúdos relatados
por Lee et al (2003) que avaliaram a solubilidade protéica de concentrados e
farinhas desengorduradas de soja oriundas de diversas indústrias. A proteína solúvel
em soluções de pH 7,0 foi menor que 10% para a maioria dos concentrados, e
variou de 20% a 50% para as farinhas desengorduradas. Chau et al (1997)
relataram que aproximadamente 75% das proteínas de concentrado protéico de soja
estavam solúveis em pH 7,0, e para a farinha de soja Chau e Cheung (1998)
comentaram que aproximadamente 70% das proteínas eram solúveis em pH 7,0. A
41
temperatura do processamento afeta a fração solúvel nos produtos, diminuindo a
solubilidade com a maior temperatura de processamento por alteração da
conformação molecular e causando a agregação das proteínas. Concentrados
obtidos a partir de soluções alcoólicas têm menor solubilidade protéica devido à
desnaturação (Liu, 1997b). A habilidade das proteínas em se associar e imobilizar a
água na estrutura é útil em várias aplicações alimentares e é uma variável para a
caracterização físico-química dos produtos finais. Para a indústria alimentícia este
conhecimento é fundamental, já que a maioria das propriedades funcionais depende
das propriedades de hidratação das proteínas.
As propriedades funcionais dos ingredientes de fibras alimentares e protéicos
foram avaliadas utilizando as análises de índice de absorção de água (IAA), volume
de intumescimento (VI), índice de absorção de óleo (IAO), capacidade emulsificante
(CE) e atividade emulsificante (AE) (Tabela 6). Os IAA das quatro amostras
apresentaram diferença estatística, a amostra original apresentou o maior índice
(8,4g/g) e a farinha o menor (3,8 g/g). O VI foi similar entre os ingredientes protéicos
e entre as duas amostras de fibras, mas diferiu entre estes dois grupos, pois os
ingredientes de fibras alimentares apresentaram maior capacidade de hidratação
(média de 17,6 mL/g). Valores de IAA para farinhas e concentrados da literatura
foram menores que os encontrados neste trabalho: farinha de cowpea 1,8g/g
(Prinyawiwatkul et al, 1997), farinha de soja 1,8g/g; 3,5g/g e 1,2g/g (respectivamente
Chau e Cheung, 1998; Onweluzo et al, 1995; Padilla et al, 1996) e concentrado
protéico de soja 3,5g/g (Chau et al, 1997). O IAA dos ingredientes de fibra alimentar
foi maior do que a casca de soja 2,4g/g (Chen et al, 1984) e as fibras de lima bean
(Phaseolus lunatus) e Jack bean (Canavalia ensiformis) que foram, respectivamente,
0,3g/g e 0,4g/g (Betancur-Ancona et al, 2003).
42
Tabela 6: Propriedades funcionais relacionadas com água e óleo de fibras de
cotilédones, concentrado protéico e farinha desengordurada de soja.
Amostras IAA VI IAO CE AE
FAO
8,4
a
± 0,2 17,2
a
± 1,0 2,5
b
± 0,1 187,8
b
± 1,5 52,4
b
± 1,4
FAM
5,7
c
± 0,1 18,0
a
± 0,5 2,4
b
± 0,1 250,4
a
± 2,3 53,0
b
± 0,3
Concentrado
6,8
b
± 0,1 8,3
b
± 1,5 2,9
a
± 0,2 194,7
b
± 10,6 85,1
a
± 0,7
Farinha
3,8
d
± 0,1 8,7
b
± 0,6 2,4
b
± 0,1 197,6
b
± 1,8 56,8
b
± 0,3
FAO= fibra alimentar original; FAM= fibra alimentar micronizada. IAA= índice de absorção de água (g água
absorvida/ g de amostra); VI= volume de intumescimento (mL de água/ g de amostra); IAO= índice de absorção
de óleo (g óleo absorvido/ g de amostra); CE= capacidade emulsificante (mL de óleo emulsificado/ g de amostra);
AE= atividade emulsificante (%).
Médias de determinações em triplicata.
Médias seguidas pela mesma letra, nas colunas, não diferiram ao nível de 5% pelo teste de Tukey.
As propriedades de hidratação são medidas pelo índice de absorção de água
e pelo volume de intumescimento e diferentes resultados são obtidos ao se avaliar
produtos iguais, porque o VI, que é definido como a fixação espontânea de água
pela matriz protéica, depende da densidade, porosidade e solubilidade. O IAA é
determinado após o completo intumescimento da amostra e estima a quantidade de
água retida na matriz sem que haja exsudação após a ação de uma força centrífuga,
este índice depende da conformação molecular, tamanho das partículas, números
de sítios de ligação das moléculas e força de centrifugação (Auffret et al, 1994; Chou
e Morr, 1979; Thibault et al, 1992). Nas fibras de cotilédones de soja avaliadas, a
redução do tamanho das partículas juntamente com as mudanças na estrutura física
da matriz molecular foram responsáveis pela menor absorção de água na amostra
micronizada em relação à amostra de fibra alimentar original. As fibras apresentam
como principal característica físico-química a propriedade de hidratação,
possivelmente pela presença de componentes de fibras alimentares insolúveis,
como celulose, hemicelulose e lignina, que são materiais hidrofílicos (López et al,
43
1996). Esta propriedade tem sido relacionada com os efeitos fisiológicos
proporcionados a quem ingere a quantidade diária recomendada de fibras totais (25-
30g), sendo que 75% desta quantidade devem estar na forma insolúvel. Os
benefícios descritos são: aumento da saciedade, regulação do trânsito intestinal,
aumento do volume fecal (principalmente as insolúveis), redução do colesterol,
aumento na excreção de sais biliares e prevenção de algumas doenças, incluindo o
câncer de cólon (principalmente as solúveis) (Tharanathan e Mahadevamma, 2003).
O concentrado protéico de soja apresentou a maior absorção de óleo (2,9g/g)
e a fibra de cotilédones de soja micronizada teve maior capacidade emulsificante
(250,4 mL/g), diferindo das outras amostras. As amostras de fibras e a farinha de
soja não diferiram entre si quando a atividade emulsificante foi avaliada, mas o
concentrado protéico diferiu e apresentou a maior AE (85,1%). Os IAO das quatro
amostras avaliadas foram maiores do que os índices da farinha de cowpea, 0,9g/g
(Prinyawiwatkul et al, 1997), farinha de soja, 1,9g/g; 1,5g/g e 0,3 g/g
(respectivamente Chau e Cheung, 1998; Onweluzo et al, 1995; Padilla et al, 1996) e
das fibras de lima bean (Phaseolus lunatus) e Jack bean (Canavalia ensiformis)
0,2g/g (Betancur-Ancona et al, 2003). O concentrado protéico de soja avaliado por
Chau et al (1997) apresentou IAO igual ao avaliado neste trabalho, e AE menor
(58,2%). Chau e Cheung (1998) obtiveram AE máxima de 62% para a farinha de
soja e Onweluzo et al (1995) determinaram AE de 55% para a farinha de soja, muito
similar às amostras de farinha e de fibras alimentares de soja deste trabalho e
Prinyawiwatkul et al (1997) encontraram 49,3% de AE para a fibra de lima bean
(Phaseolus lunatus).
A maior atividade emulsificante e IAO do concentrado protéico de soja,
provavelmente são decorrentes da maior quantidade de proteína, pois a atividade
44
emulsificante mede, indiretamente, a área superficial da membrana protéica que
recobre as gotículas de óleo, e a absorção de óleo é atribuída principalmente à
combinação de gordura aos grupos não polares das proteínas ou à disponibilidade
de grupos lipofílicos (Padilla et al, 1996). Betancur-Ancona et al (2003) comenta que
um baixo índice de absorção de óleo está associado à diminuição da absorção do
colesterol, portanto estes ingredientes poderiam ser úteis na alimentação de
pacientes hipercolesterolêmicos. A maior capacidade emulsificante apresentada pela
fibra de cotilédones de soja micronizada significa que ela incorporou mais óleo na
emulsão, provavelmente porque esta amostra tem mais superfície de contato. López
et al (1996) comentaram que as fibras têm propriedade de absorver óleo devido à
presença de lignina na composição química e que as fibras insolúveis absorvem
maior quantidade de óleo do que as fibras solúveis.
CONCLUSÕES
Nos ingredientes protéicos (farinha desengordurada e concentrado protéico) e
de fibras alimentares (fibras dos cotilédones, original e micronizada), o macromineral
de maior concentração foi o potássio e o micromineral foi o ferro. A
biodisponibilidade do zinco não foi afetada pela presença do ácido fítico, de acordo
com as taxas molares do complexo fitato x Ca : Zn. Os ingredientes protéicos
tiveram a maior concentração de fósforo fítico, ácido fítico e isoflavonas, mas as
fibras de cotilédones de soja contêm maiores quantidades de daidzeína e
genisteína. A farinha desengordurada apresentou a maior quantidade de proteína
solúvel em pH 7,0 e o menor índice de absorção de água, enquanto que o
concentrado protéico teve os maiores índice de absorção de óleo e atividade
emulsificante. Os ingredientes de fibras alimentares apresentaram as melhores
45
propriedades de hidratação e as outras propriedades funcionais foram similares ou
melhores que os ingredientes protéicos, mesmo tendo menores percentuais de
proteínas.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento
(CNPq), pelo financiamento desta pesquisa; à Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (EMBRAPA – Londrina), pelas análises de minerais e isoflavonas e à
empresa Solae Company pelo fornecimento das amostras.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADEYEYE, E.I.; AROGUNDADE, L.A.; AKINTAYO, E.T.; AISIDA, O.A.; ALAO, P.A.
Calcium, zinc and phytate interrelationships in some foods of major consumption in
Nigeria. Food Chemistry, v.71, p.435-441, 2000.
ANDERSON, R.L.; HAMILTON, C.C.; HORN, J.L.; SPENCER, D.B.; DILLON, D.W.;
ZEIGLER, J.A. Metabolic effects on insoluble oat fiber on lean men with type II
diabetes. Cereal Chemistry, v.68, n.3, p.291-294, 1991.
ANDERSON, R.L., WOLF, W.J. Compositional changes in Trypsin inhibitors, phytic
acid, saponins and isoflavones related to soybean processing. The Journal of
Nutrition, v.125, p.581S-588S, 1995.
AOAC. Official Methods of Analysis. Association of Official Analytical Chemists
16ed. v. I e II. 1995.
AUFFRET, A.; RALET, M.C.; GUILLON, F.; BARRY, J.L.; THIBAULT, J.F. Effect of
grinding and experimental conditions on the measurement of hydration properties of
dietary fibres. LWT, v.27, p.166-172, 1994.
BETANCUR-ANCONA, D.; PERAZA-MERCADO, G.; MOGUEL-ORDOÑEZ, Y.;
FUERTES-BLANCO, S. Physicochemical characterization of lima bean (Phaseolus
lunatus) and jack bean (Canavalia ensiformis) fibrous residues. Food Chemistry,
p.1-9, 2003.
BROUNS, F. Soya isoflavones: a new and promising ingredient for the health foods
sector. Food Research International, v.35, p.187-193, 2002.
46
CHANG, M.C.; MORRIS, W.C. Effect of heat treatments on chemical analysis of
dietary fiber. Journal of Food Science, v.55, n.6, p.1647-1650, 1990.
CHAU, C.F.; CHEUNG, C.K. Functional properties of flours prepared from three
chinese indigenous legume seeds. Food Chemistry, v.61, n.4, p.429-433, 1998.
CHAU, C.F.; CHEUNG, C.K.; WONG, Y.S. Functional properties of protein
concentrates from three chinese indigenous legume seeds. Journal of Agriculture
and Food Chemistry, v.45, p.2500-2503, 1997.
CHEN, J.Y.; PIVA, M.; LABUZA, T.P. Evaluation of water binding capacity (WBC) of
food fiber sources. Journal of Food Science, v.49, p.59-63, 1984.
CHEN, P.S.; TORIBARA, T.Y.; WARNER, R.N. Microdetermination of phosphorus.
Anal. Chem, v.28, n.11, p.1786-1758, 1956.
CHERYAN, M. Phytic acid interactions in food systems. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, v.14, n.4, p.297-335, 1980.
CHOU, D.H.; MORR, C.V. Protein-water interactions and functional properties.
JAOCS, v.56, p.53A-62A, 1979.
COELHO, R.G. Interações nutricionais. Parte 1: Interações ao nível do trato
gastrointestinal. Revista de Metabolismo e Nutrição, v.3, n.2, p.106-117, 1995.
COWARD, L.; BARNES, N.C.; SETCHELL, K.D.R.; BARNES, S. Genistein, daidzein
and their β-glycoside conjugates: antitumor isoflavones in soybeanbean foods from
american and asian diets. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.41,
p.1961-1967, 1993.
ELLIS, R.; KELSAY, J.L.; REYNOLDS, R.D.; MORRIS, E.R.; MOSER, P.B.;
FRAZIER, C.W. Phytate:zinc and phytate x calcium:zinc millimolar ratios in self –
selected diets of Americans, Asian Indians, and Nepalese. Journal of the American
Dietetic Association, v.87, p.1043-1047, 1987.
FRÜHBECK, G.; ALONSO, R.; MARZO, F.; SANTIDRIÁN, S. A modified method for
the indirect quantitative analysis of phytate in foodstuffs. Analytical Biochemistry,
v.225, n.2, p.206-212, 1995.
GARCIA, M.C.; MARINA, M.L.; LABORDA, F.; TORRE, M. Chemical characterization
of commercial soybean products. Food Chemistry, v.62, n.3, p.325-331, 1998.
HONIG, D.H.; WOLF, W.J.; RACKIS, J.J. Phytic acid and phosphorus content of
various soybean protein fractions. Cereal Chemistry, v.61, n.6, p.523-526, 1984.
KOPLIK, R.; PAVELKOVÁ, H.; CINCIBUCHOVÁ, J.; MESTEK, O.; KVASNICKA, F.;
SUCHANEK, M. Fractionation of phosphorus and trace elements species in soybean
flour and common white bean seeds by size exclusion chromatography – inductively
coupled plasma mass spectrometry. Journal of Chromatography B, v.770, p.261-
273, 2002.
47
KUMAR, R.; CHOUDHARY, V.; MISHRA, S.; VARMA, I.K.; MATTIASON, B.
Adhesives and plastics based on soy protein produts. Industrial Crops and
Products – an International Journal, v.16, p.155-172, 2002.
KURZER, M.S.; XU, X. Dietary phytoestrogens. Annual Review Nutrition, v.17,
p.353-381, 1997.
LEE, K.H.; RYU, H.S.; RHEE, K.C. Protein solubility characteristics of commercial
soy protein products. JAOCS, v.80, n.1, p.85-90, 2003.
LIU, K. Chemistry and Nutritional Value of Soybean Components. In: LIU, K.
Soybeans: Chemistry, Technology and Utilization. New York: Chapman & Hall,
1997a. p.25-99.
LIU, K. Soybean Protein Products. In: LIU, K. Soybeans: Chemistry, Technology
and Utilization. New York: Chapman & Hall, 1997b. p. 379-411.
LÓPEZ, G.; ROS, G.; RINCON, F.; PERIAGO, M.J.; MARTÍNEZ, M.C.; ORTUÑO, J.
Relationship between physical and hydration properties of soluble and insoluble fiber
of artichoke. J. Agric. Food Chem, v.44, p.2773-2778, 1996.
MARTINS, T.R. Efeito do tratamento alcalino associado à extrusão nas
propriedades funcionais da fibra de cotilédone de soja. 1995. Dissertação
(Mestrado em Ciência de Alimentos). Universidade Estadual de Londrina.
Londrina/PR.
OATWAY, L.; VASANTHAN, T; HELM, J.H. Phytic Acid. Food Reviews
International, v.17, n.4, p.419-430, 2001.
ONWELUZO, J.C.; ONUOHA, K.C; OBANU, Z.A. A comparative study of some
functional properties of Afzelia africana and Glycine max flours. Food Chemistry,
v.54, p.55-59, 1995.
PADILLA, F.C.; ALVAREZ, M.T.; ALFARO, M.J. Functional properties of barinas nut
flour (Caryodendron orinocense Karst., Euphorbiaceae) compared to those of
soybean. Food Chemistry, v.57, n.2, p.191-196. 1996.
PLAAMI, S. Myoinositol Phosphates: Analysis, Content in Foods and Effects in
Nutrition. LWT, v.30, p.633-647. 1997.
PRINYAWIWATKUL, W.; BEUCHAT, L.R.. McWATTERS, K.H.; PHILLIPS, R.D.
Functional properties of cowpea (Vigna unguiculata) flour as affected by soaking,
boiling, and fungal fermentation. Journal of Agriculture and Food Chemistry,
v.45, n.2, p.480-486. 1997.
SONG, T.; BARUA, K.; BUSEMAM, G.; MURPHY, P.A. Soybean isoflavone analysis:
quality control and a new internal standard. The American Journal of Clinical
Nutrition, v.68, p.1474S-1479S. 1998.
THARANATHAN, R.N.; MAHADEVAMMA, S. Grain legumes – a boon to human
nutrition. Trends in Food Science & Technology, v.14, p.507-518. 2003.
48
THIBAULT, J.F.; LAHAYE, M.; GUILLON, F. Physico-chemical properties of food
plant cell wall. In: SCHEIZER, T.; EDWARDS, C.A. Dietary Fibre: a component of
food: nutritional function in health and disease. Berlin: Springer-Verlag, 1992.
p.21-39.
THOMPSON. D.B.; ERDMAN, J.W. Phytic acid determination in soybeans. Journal
of Food Science, v.47, n.2, p.513-517, 1982.
TORRE, M.; RODRIGUEZ, R.; SAURA-CALIXTO, F. Effects of dietary fiber and
phytic acid on mineral availability. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,
v.1, n.1, p.1-22, 1991.
TSUKAMOTO, C.; SHIMADA, S.; IGITA, K.; KUDOU, S.; KOKUBUN, M.; OKUBO,
K.; KITAMURA, K. Factors affecting isoflavones content in soybean seeds: changes
in isoflavones, saponins and compsition of fatty acids at different temperatures during
seed development. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v.43, p.1184-
1192, 1995.
WANG, H.; MURPHY, P.A. Isoflavone content in commercial soybean foods. Journal
of Agriculture and Food Chemistry, v.42, p.1666-1673, 1994.
49
POLISSACARÍDEOS DAS FIBRAS DE COTILÉDONES E PROTEÍNAS DAS
FIBRAS, FARINHA DESENGORDURADA E CONCENTRADO PROTÉICO DE
SOJA (Glycine Max (L.) Merril)
RESUMO
Fibras alimentares obtidas de cotilédones de soja original (FAO) e micronizada
(FAM) foram fracionadas e avaliadas quanto aos polissacarídeos e
monossacarídeos constituintes. O componente majoritário foi a hemicelulose,
totalizando 59% na amostra original e 51,1% na micronizada. Pectina representou
14%, em média, e celulose 8,5%. As duas amostras de fibras apresentaram
17,1mg/g de ácidos urônicos e a mesma composição de monossacarídeos nas
frações de hemicelulose, extraídas com hidróxido de sódio 0,1M e 4M, e na fração
de celulose. Na fração de pectina, a FAO tinha mais xilose e manose do que a FAM.
Na fração de hemicelulose, extraída com hidróxido de sódio 1M, a fibra alimentar
original apresentou mais glicose e manose e menores níveis de arabinose/ramnose,
quando comparada com a mesma fração da fibra alimentar micronizada. As
proteínas de concentrado protéico, farinha desengordurada e fibras alimentares
(FAO e FAM) foram avaliadas quanto à solubilidade em diferentes solventes
(solução salina, água, etanol e solução alcalina) e quanto ao peso molecular. A
farinha desengordurada de soja teve a maior parte das proteínas passível de
extração com solução salina, e o concentrado protéico juntamente com as fibras de
cotilédones com solução alcalina. A fração protéica que não foi extraída com
nenhum dos quatro solventes utilizados permaneceu no resíduo, o maior percentual
estava no concentrado, seguido pela fibra alimentar micronizada e a farinha, a
menor quantidade desta fração estava na fibra alimentar original. A eletroforese das
50
proteínas dos quatro ingredientes alimentares derivados de soja mostrou as frações
β-conglicinina, constituída de subunidades α, α’ e β, com pesos moleculares de 84,
72 e 51KDa, respectivamente, e glicinina com as subunidades ácidas (36-40KDa) e
básicas (18-20KDa). Bandas com peso molecular próximo aos 30KDa foram
reveladas nas proteínas extraídas das fibras de cotilédones de soja, sendo
provavelmente glicoproteínas de parede celular, ricas em hidroxiprolina.
Palavras-Chave: fracionamento de parede celular, monossacarídeos, ácidos
urônicos, classificação de proteínas, eletroforese, hidroxiprolina.
INTRODUÇÃO
A fibra de soja, ou fração insolúvel do processamento de concentrado
protéico, é separada por centrifugação, contém principalmente carboidratos de
parede celular dos cotilédones da soja, sem componentes da casca. É um produto
que necessita de caracterização para posterior utilização. Fibras alimentares são
macromoléculas resistentes à digestão pelas enzimas do trato gastrointestinal
humano e são essencialmente compostas de componentes de parede celular, tais
como polissacarídeos e lignina. A parece celular é composta principalmente por
pectina, lignina, hemicelulose e celulose, recentemente estes compostos têm tido
importância devido aos efeitos benéficos à saúde humana, como regulação do
trânsito intestinal e prevenção de algumas doenças, incluindo o câncer (Tharanathan
e Mahadevamma, 2003). No entanto, é necessário o conhecimento da constituição
destas frações, isto é possível com o fracionamento da parede celular, que promove
uma separação dos polissacarídeos, podendo então identificar os seus constituintes.
A pectina é rica em ramnose, arabinose, galactose e ácidos galacturônicos,
(ligados ionicamente a Ca e Mg), esta fração é covalentemente ligada a fenóis,
51
proteínas e celulose, em todos os tipos de parede celular. Ligninas são compostos
polifenólicos altamente insolúveis formados pela polimerização de três álcoois:
álcool trans-p-cumaril, álcool-coniferil e álcool trans-sinapil, que mantêm uma
extensa rede de ligações cruzadas na parede celular, conferindo-lhes elevada
resistência, pois substituem a água entre os polímeros (Brett e Waldron, 1996). A
hemicelulose corresponde a um grupo heterogêneo de polissacarídeos ramificados
que se ligam firmemente à superfície das microfibrilas de celuloses e entre si,
cobrindo as microfibrilas e mantendo ligações cruzadas, via ligações de hidrogênio,
em uma rede complexa. A celulose é constituída exclusivamente de glicose que
forma cadeias por ligações β 1-4, e de ligações de hidrogênio entre as cadeias, com
alto grau de polimerização, 2000 a 6000 na parede celular primária e mais de 10000
na parede secundária, produzindo áreas de cristalinidade (Waldron et al, 2003). Os
polissacarídeos totais da parede celular de quatorze variedades de soja
representaram em média 21% do grão, e os principais componentes foram
galactose, glicose, arabinose e ácidos urônicos, enquanto que xilose, ramnose e
fucose foram encontradas em menores quantidades (Brillouet e Carré, 1983;
Huisman et al, 1998; Stombaugh et al, 2000).
As proteínas da soja são amplamente utilizadas em produtos alimentícios sob
a forma de vários ingredientes e para este uso é importante conhecer as classes das
proteínas presentes. A classificação das proteínas, usada inicialmente em cereais, é
baseada na solubilização destas macromoléculas em diferentes soluções extratoras,
não existindo certeza de que alguns polipeptídeos possam ser extraídos em outra
classe, devido às associações com outras proteínas ou que permaneçam no resíduo
insolúvel quando associados a outros compostos (Liu, 1997). As proteínas
majoritárias da soja são β-conglicinina e glicinina, respectivamente, globulinas 7S e
52
11S. A β-conglicinina é constituída de subunidades α, α’ e β, com pesos moleculares
de 84, 72 e 51KDa, respectivamente e a glicinina tem subunidades ácidas (36-
40KDa) e básicas (18-20KDa). Devido a diferenças na composição e estrutura, as
globulinas 7S e 11S exibem diferenças nas características nutricionais e funcionais
(Liu, 1997; Riblett et al, 2001).
Proteínas de parede celular podem ser divididas em três classes estruturais.
As extensinas, glicoproteínas básicas ricas em hidroxiprolina, serina, tirosina e lisina,
contém muitas seqüências repetidas de Ser(Hyp)
4
e são os componentes
majoritários da parede celular primária, podendo conter 40% de hidroxiprolina. As
proteínas ricas em glicinas são caracterizadas pela repetitividade (Gly-X), onde X,
frequentemente é glicina. As proteínas ricas em prolina e hidroxiprolina contêm
unidades repetidas de Pro-Pro-Val-X-Lys, onde X, frequentemente é histidina,
tirosina ou glicina (Kleis-San Francisco e Tierney, 1990; Waldron et al, 2003).
Durante o desenvolvimento do grão de soja até 30% das extensinas podem ser
extraídas por soluções salinas, no entanto, quando o grão é dessecado estas
proteínas tornam-se insolúveis devido a mudanças irreversíveis da parede celular
durante a secagem (Cassab e Varner, 1988; Waldron et al, 2003).
O objetivo do trabalho foi avaliar os carboidratos das fibras de cotilédones de
soja, quanto aos polissacarídeos e monossacarídeos, e as proteínas das fibras,
farinha desengordurada e concentrado protéico quanto à solubilidade em diferentes
solventes e à distribuição de pesos moleculares por eletroforese.
MATERIAL E MÉTODOS
As matérias-primas utilizadas para análise dos carboidratos foram fibras de
cotilédones de soja, FAO e FAM. Para a classificação das proteínas foram utilizados
53
concentrado protéico, farinha desengordurada e fibras alimentares (FAO e FAM),
oriundas de outro lote e com diferente composição. Todas as amostras foram
fornecidas pela empresa Solae Company (Esteio/RS).
Açúcares totais: foram determinados pelo método colorimétrico de fenol-sulfúrico,
segundo Dubois et al (1956) e quantificados por absorção em Espectrofotômetro
UV-visível Cintra 20 a 490nm, usando uma curva de calibração de 10 pontos, com
concentração de 10 a 100ug de glicose e com R
2
= 0,9848.
Ácidos urônicos: foram determinados segundo Kintner e Van Buren (1982). As
amostras foram hidrolisadas em ácido sulfúrico contendo tetraborato de sódio
0,0125M, reação com m-hidroxidifenil 0,15% em NaOH 0,5% e quantificados por
absorção em Espectrofotômetro UV-visível Cintra 20 a 520nm. Os teores de ácidos
urônicos foram calculados com base na curva de calibração de 6 pontos, com
concentraçãos de 10 a 60µg de ácido galacturônico e com R
2
=0,9791.
Fracionamento da parede celular: foi realizado a partir de 500mg de amostras.
Primeiramente os açúcares solúveis foram extraídos com etanol 80%, por 20
minutos a 80ºC, com agitação eventual. O material foi centrifugado a 8000xg por 15
min (Centrífuga Sorvall, rotor SL 50 T) e o precipitado foi seco em estufa a 60ºC por
12 horas e pesado. A extração da pectina foi conduzida com 20 mL de oxalato de
amônio 0,5% (p/v), para cada 200mg de material, submetido à extração por 1h a
80ºC com agitação constante em agitador magnético (3 vezes). Terminada a
extração foi centrifugado a 8000xg por 15 minutos e o sobrenadante dialisado com
água potável (4 a 5 trocas) e com água destilada (2 a 3 trocas) e o precipitado foi
lavado 3 vezes com água destilada, liofilizado e pesado. A delignificação foi
realizada em banho-maria (70-80ºC) com 40 mL de água deionizada, 1,25g de
NaClO (clorito de sódio), 150µL de ácido acético glacial, usando o resíduo da
54
extração com oxalato. O material foi agitado manualmente para quebrar os grumos.
Após 1 hora adicionou-se 0,4g NaClO e 150µL de ácido acético glacial. Depois de
mais 1 hora de extração, o material foi centrifugado a 8000xg por 15 minutos, o
sobrenadante foi dialisado, liofilizado e pesado, o resíduo foi lavado com água e
liofilizado. As hemiceluloses foram extraídas em três frações: ao material residual
foram adicionados 20 mL de solução NaOH 0,1M com NaBH
4
(3mg/mL), as
amostras permaneceram sob agitação, com barra magnética, por 1h à temperatura
ambiente. Em seguida, o material foi centrifugado a 8000xg por 15 minutos. O
sobrenadante foi recolhido e neutralizado com ácido acético a pH 7,0, dialisado com
água potável por 24 horas e água destilada por 24 horas e centrifugado a 8000xg
por 15 minutos, o sobrenadante foi liofilizado e pesado. No precipitado foi repetido o
processo com adição de NaOH 1M mais NaBH
4
(3mg/mL) e depois com NaOH 4M
mais NaBH
4
(3mg/mL). Metade do precipitado remanescente da extração com NaOH
4M foi pesado e colocado em tubos cônicos de vidro. A esse material foi adicionado
reagente de Updegraff (5% ácido nítrico e 15% ácido acético em água) e levado ao
banho-maria a 100°C por 90 minutos, com agitação a cada 15 minutos. Após
esfriado, foi centrifugado a 8000xg por 15 minutos a 10°C e o sobrenadante
descartado. O precipitado foi lavado 3 vezes com água deionizada e liofilizado. O
peso resultante da hidrólise correspondeu à fração celulósica.
Monossacarídeos: 1mg de material seco de cada fração de parede celular foi pré-
hidrolisado em 100µL de ácido sulfúrico 72% em banho-maria a 30ºC por 45
minutos. Após este período foram adicionados 1,7mL de água destilada e o material
foi autoclavado por 1 hora a 120ºC. Em seguida o material foi neutralizado com
hidróxido de sódio 50% e submetido à retirada de sais com resinas aniônicas
(Dowex 1x8 50-100mesh, Cl Form Supelco) e catiônicas (Dowex 50wx8 50-
55
100mesh, H Form Supelco). Os monossacarídeos foram analisados por
cromatografia aniônica de alta resolução com detector amperométrico (HPAEC-PAC)
utilizando coluna Carbopack PA1 num sistema Dionex DX-500, em corrida isocrática
com fluxo de 1mL/min e injeção automática de 10µL. Foi utilizado padrão Sigma de
monossacarídeos para comparação.
Classificação das proteínas: foi realizada segundo o método modificado de
Chavan et al (2001). Amostras secas (2,5g) foram dispersas em 30mL de NaCl 5% e
extraídas por 30 minutos em temperatura ambiente (25±1ºC) usando um shaker
MA830/A Marconi a 125 rpm. A suspensão foi centrifugada a 4000g por 20 minutos,
em centrífuga Harrier 15/80 MSE, e o sobrenadante guardado. O resíduo foi
reextraído uma vez no mesmo solvente e o sobrenadante somado ao anterior
também guardado. O resíduo foi extraído sucessivamente com água deionizada,
etanol 70% a 60ºC e com NaOH 0,2% nas mesmas condições da extração com
solução salina. As frações solubilizadas foram coletadas separadamente e
determinada proteína por Microkjeldahl. A mesma determinação foi feita no resíduo.
Eletroforese: foi realizada segundo Marsman et al (1997) e Maruyama et al (2003).
As amostras foram extraídas em solução tampão Tris-HCl 62,5mM, pH 6,8, 2% de
SDS, 1% de β-mercaptoetanol e 10% de glicerol, durante 1 hora sob agitação com
barra magnética, após foram centrifugadas a 10000rpm por 30 minutos a 10ºC. No
sobrenadante foram quantificadas as proteínas totais por Microkjeldahl. Gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE) foi usado para a análise (gel separador 12% e gel
concentrador 4%). Uma alíquota contendo 2mg de proteína foi diluída em tampão de
amostra e utilizada para a corrida em corrente elétrica de 100V. As bandas
eletroforéticas foram reveladas e fixadas com solução metanol 40%, ácido acético
10% e água 50%, contendo 0,1% de corante Coomassie Brilhante Blue. O excesso
56
do corante foi retirado com solução metanol 40%, ácido acético 10% e água 50%. O
padrão utilizado foi o BenchMark Protein Ladder INVITROGEN, com bandas de 10 a
220KDa.
Hidroxiprolina: foi realizada segundo Woessner (1961). A hidroxiprolina foi oxidada
com cloramina T, ao complexo formado foi adicionado para-dimetilaminobenzaldeído
e quantificado por absorção em Espectrofotômetro UV-visível Cintra 20 a 557 nm,
usando uma curva de calibração de 9 pontos, com concentração de 0,5 a 2,5ug de
hidroxiprolina e com R
2
= 0,9958.
Análise estatística: para caracterizar as frações quanto aos monossacarídeos foi
aplicada estatística Multivariada para a interpretação dos resultados, empregando-se
Análise de Componentes Principais (ACP) e Análise de Agrupamentos (AA). Para
isto, foram utilizados os procedimentos “Multivariate Exploratory Techniques” –
“Cluster Analysis” e “Principal Componentes & Classification Analysis”, do programa
computacional Statistica 6.0. Os dendogramas foram obtidos por estratégia de
agrupamento não-ponderado aos pares e considerando-se a distância euclidiana
como coeficiente de semelhança. A classificação das proteínas foi avaliada por
ANOVA e para comparar a diferença das médias, o teste de Tukey com intervalo de
confiança de 95% (p<0,05) foi usado.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Carboidratos
As fibras de cotilédones de soja apresentaram concentrações de açúcares
totais de 19,7mg/g (FAO) e 21,2mg/g (FAM), que representam os açúcares livres,
enquanto que a grande maioria dos açúcares está associada formando os
polissacarídeos. Além disso, muitos carboidratos solúveis foram retirados, por
57
centrifugação, durante o processo industrial de obtenção das fibras de cotilédones.
Karr-Lilienthal et al (2005) relataram que em dez amostras de grãos de soja, os
açúcares livres encontrados foram galactose, glicose e frutose, com o total variando
de 0,7mg/g a 4,7mg/g.
Com o fracionamento do material de parede celular das duas amostras de
fibras alimentares (Tabela 1) foi observado que o componente majoritário foi a
hemicelulose, totalizando 59% na amostra original e 51% na micronizada. A
extração de hemicelulose foi realizada em três etapas para ser mais eficiente. A
primeira extração removeu os polissacarídeos mais solúveis e promoveu o
intumescimento das amostras. A segunda extração removeu hemiceluloses de baixo
grau de polimerização (~100), enquanto que as hemiceluloses com maior grau de
polimerização (~200) requerem uma solução de álcali mais forte, sendo retiradas na
terceira extração (Selvendran e O’Neill, 1987). Ouhida et al (2002) também
encontraram mais hemicelulose na fração insolúvel da farinha de soja, mas as
quantidades do fracionamento foram diferentes, 40% de hemicelulose, 34% de
pectina e 10,7% de celulose.
Tabela 1: Rendimento do fracionamento da parede celular da fibra de soja (%).
Frações FAO FAM
Pectina
13,2
±1,3 15,4 ±4,0
Hemicelulose (extraída em NaOH 0,1M)
12,4
±0,5 13,2 ±0,2
Hemicelulose (extraída em NaOH 1M)
8,1
±0,7 7,8 ±0,7
Hemicelulose (extraída em NaOH 4M)
38,5
±2,1 30,1 ±5,2
Celulose
8,4
±1,6 8,5 ±0,8
FAO= fibra alimentar original; FAM= fibra alimentar micronizada.
Média ± desvio padrão de análises em triplicata.
A pectina das duas amostras de fibras foi extraída com oxalato de amônio
para ter a mínima degradação possível e máximo poder quelante dos cátions Ca e
58
Mg, complexados com os resíduos dos ácidos galacturônicos (Selvendran e O’Neill,
1987). Esta fração rendeu 14%, em média, estando coerente com Karr-Lilienthal et
al (2005), pois os autores comentaram que em parede celular de soja pode haver
até 20% de ácidos galacturônicos. Stombaugh et al (2000) avaliou paredes celulares
de quatorze variedades de soja, encontrando, em média, 10% de pectina, no entanto
os autores definiram esta fração como a soma de galactose, arabinose, ramnose,
fucose e ácidos urônicos. Os ácidos urônicos das fibras de cotilédones de soja foram
quantificados nas frações pécticas e presumidamente considerados, sendo
essencialmente do tipo galacturônico. As duas amostras apresentaram a mesma
quantidade 17,1mg/g, cujo valor é muito similar ao encontrado na farinha de soja
(1,58%), de uma dieta para aves, na qual era a única fonte de polissacarídeos (Karr-
Lilienthal et al, 2005). Stombaugh et al (2000) encontrou valores superiores, 24mg/g.
Huisman et al (1998) comentaram que 90% dos ácidos urônicos presentes na
farinha de soja estão na fração insolúvel, isto pode ser uma indicação da
complexidade ou diversidade das moléculas pécticas na parede celular.
A celulose representou o componente minoritário da FAO e FAM (8,5%),
porque esta fração está localizada predominantemente nas cascas de soja
(Stombaugh et al, 2000). Ouhida et al (2002) encontraram 10,7% de celulose nos
cotilédones, mas as amostras incluíam as cascas, e comentaram que a maior parte
da glicose estava na fração insolúvel das cascas. Brillouet e Carré (1983)
encontraram 11% de celulose, mas os autores usaram outro método de análise,
hidrolisando a parede celular com TFA (ácido trifluoroacético) para a obtenção desta
fração. A lignina teve, em média, 22%, mas esta fração está superestimada, porque
durante a delignificação, carboidratos (5-10%), compostos fenólicos e glicoproteínas
ricas em hidroxiprolina são solubilizados em clorito sódico, o reagente usado para a
59
delignificação (Selvendran e O’Neill, 1987). Brillouet e Carré (1983) encontraram
menores quantidades de lignina (3,7%) ao analisar paredes celulares do grão de
soja, porém usaram metodologias diferentes, a farinha dos grãos foi primeiramente
hidrolisada com proteases e amilases e a lignina analisada por espectrofotometria.
Para uma avaliação em conjunto da capacidade de caracterização das
amostras de fibras alimentares, utilizando a composição de monossacarídeos,
empregou-se a Análise de Componentes Principais (ACP) e a Análise de
Agrupamentos (AA). O primeiro (λ ≅ 4,24) e segundo componentes (λ ≅1,19)
explicaram, em conjunto, 90,5% da variabilidade dos dados (Figuras 1 e 2). As
equações (1) e (2), obtidas pelos loadings ou autovalores dos CPs, geraram as
coordenadas (escores) do gráfico de componentes principais (Figura 1).
CP1 = 0,922 fucose + 0,963 arabinose/ramnose + 0,957 galactose - 0,978 glicose +
0,768 xilose + 0,012 manose (1)
CP2 = 0,299 fucose + 0,131 arabinose/ramnose - 0,082 galactose + 0,102 glicose -
0,277 xilose - 0,994 manose (2)
60
fucose
arabinose/ramnose
galactose
glicose
xilose
manose
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
CP 1 : 70,69%
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
CP 2 : 19,79%
Figura 1: Projeção das variáveis nos Componentes Principais 1 e 2.
Com o gráfico bidimensional da ACP e o dendograma da AA (Figuras 2 e 3),
foi possível verificar a distinção de dois grandes grupos: (1) fração da celulose e (2)
frações da pectina e das hemiceluloses (frações solúveis em NaOH 0,1M; NaOH 1M
e NaOH 4M). As amostras do grupo 1 ficaram isoladas das demais, pois a fração de
celulose é constituída somente de glicose. No grupo 2 houve a separação das
amostras da fração de NaOH 1M, porque a FAO apresentou mais glicose e manose
e menores níveis de arabinose/ramnose, provocando o deslocamento da amostra
para baixo e para a esquerda do gráfico. As duas amostras de fibras apresentaram
composição de monossacarídeos similar nas frações de hemicelulose, extraídas
com NaOH 0,1M e NaOH 4M, e celulose. Na pectina, a FAO apresentou mais xilose
e manose do que a FAM, por isso ficou locada mais abaixo. Estas diferenças podem
ser pelo uso de diferentes variedades de soja no processamento, pois sendo as
fibras produtos industriais, não se têm conhecimento de quais variedades foram
utilizadas e a amostra original pode ser de variedade diferente da micronizada.
61
Stombaugh et al (2003) analisando treze cultivares de soja, quanto aos
monossacarídeos, encontraram diferenças nas composições devido às variedades.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
-6-5-4-3-2-10123456
CP 1: 70,69%
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
CP 2: 19,79%
Figura 2: Análise de Componentes Principais obtidos a partir dos dados
cromatográficos para análise de monossacarídeos.
1: FAO pectina; 2: FAM pectina; 3: FAO NaOH 0,1M; 4: FAM NaOH 0,1M; 5: FAO NaOH 1M; 6: FAM NaOH 1M;
7: FAO NaOH 4M; 8: FAM NaOH 4M; 9: FAO celulose; 10: FAM celulose.
10965874321
0
20
40
60
80
100
120
Linkage Distance
Figura 3: Dendograma da Análise de Agrupamento obtido a partir dos dados
cromatográficos para análise de monossacarídeos.
1: FAO pectina; 2: FAM pectina; 3: FAO NaOH 0,1M; 4: FAM NaOH 0,1M; 5: FAO NaOH 1M; 6: FAM NaOH 1M;
7: FAO NaOH 4M; 8: FAM NaOH 4M; 9: FAO celulose; 10: FAM celulose.
62
Os principais monossacarídeos das fibras alimentares de soja foram
galactose, glicose e arabinose/ramnose (Figuras 4 e 5), o que está de acordo com
relatos de literatura. Independentemente da metodologia utilizada, galactose,
glicose, arabinose e ácidos urônicos são os principais componentes, encontrados
em polissacarídeos de parede celular de cotilédones de soja, enquanto que xilose,
ramnose e fucose são encontrados em menores quantidades. Os polissacarídeos
geralmente são avaliados quanto aos teores de monossacarídeos e ácidos urônicos,
os quais indicam a presença das frações, ou são determinados como fibras
alimentares totais, solúveis e insolúveis, para após serem hidrolisados e então
avaliar os monossacarídeos (Brillouet e Carré, 1983; Huisman et al, 1998; Mullin e
Xu, 2000; Ouhida et al, 2002; Stombaugh et al, 2000).
Fibra de Soja Original
0
20
40
60
80
100
120
Pectina NaOH 0,1M NaOH 1M NaOH 4M Celulose
Frações da Parede Celular
Percentuais
Fucose
Arabinose/Ramnose
Galactose
Glicose
Xilose
Manose
Figura 4: Quantidades dos monossacarídeos em cada fração da fibra de cotilédones
de soja original (%).
63
Fibra de Soja Micronizada
0
20
40
60
80
100
120
Pectina NaOH 0,1M NaOH 1M NaOH 4M Celulose
Frações da Parede Celular
Percentuais
Fucose
Arabinose/Ramnose
Galacto se
Glicose
Xilose
Manose
Figura 5: Quantidades dos monossacarídeos em cada fração da fibra de cotilédones
de soja micronizada (%).
Os compostos de parede celular, pectina, celulose e hemicelulose, são
materiais higroscópicos, classificados como fibras alimentares insolúveis, e estão
relacionados com as propriedades funcionais dos alimentos, por apresentar como
principal característica físico-química a propriedade de hidratação e intumescimento
(López et al, 1996). Esta propriedade tem sido relacionada com os efeitos
fisiológicos proporcionados a quem ingere a quantidade diária recomendada de
fibras totais (25-30g), sendo que 75% devem estar na forma insolúvel. Os benefícios
descritos são: aumento da saciedade, regulação do trânsito intestinal, aumento do
volume fecal (principalmente as insolúveis), redução do colesterol, aumento na
excreção de sais biliares e prevenção de algumas doenças, incluindo o câncer de
cólon (principalmente as solúveis) (Tharanathan e Mahadevamma, 2003).
Proteínas
A classificação protéica dos ingredientes alimentares derivados de soja foi
realizada homogeneizando-os em diferentes solventes para obter as frações de
proteínas extraídas em solução salina, água, etanol, solução alcalina e o resíduo
(Tabela 2). As quantidades de proteínas extraídas da farinha desengordurada, do
64
concentrado protéico e das fibras de cotilédones apresentaram diferença estatística
entre todas as frações solubilizadas e nos resíduos das extrações, com exceção dos
percentuais solubilizados pelo etanol na farinha e no concentrado.
Tabela 2: Proteínas de ingredientes de soja extraídas com diferentes solventes (%
de proteínas solúveis em relação às proteínas totais).
Amostras
Extração
com NaCl
Extração
com água
Extração
com etanol
Extração com
NaOH
Resíduo
Farinha
46,72
a
±1,95
6,26
c
±0,20
2,96
c
±0,19
18,40
d
±0,24
26,31
b
±3,62
Concentrado
10,26
d
±0,47
2,69
d
±0,36
1,49
c
±0,19
47,08
a
±3,22
36,96
a
±3,85
FAO
25,12
b
±0,42
16,78
a
±1,25
9,12
a
±0,95
30,46
c
±0,06
16,78
c
±0,45
FAM
17,51
c
±1,08
9,07
b
±0,77
6,08
b
±0,98
37,88
b
±0,57
26,82
b
±2,38
FAO= fibra alimentar original; FAM= fibra alimentar micronizada.
Média de três extrações determinadas em duplicata ± desvio padrão, em base seca
Médias seguidas pela mesma letra, nas colunas, não diferiram ao nível de 5% pelo teste de Tukey.
A farinha desengordurada de soja tinha 69% de proteínas, sendo a maior
parte passível de extração com solução salina. O concentrado protéico tinha 76% de
proteínas e a maior fração foi extraída em solução alcalina, assim como as amostras
de fibras de cotilédones, que inicialmente tinham 24% (original) e 43% (micronizada)
de proteínas. As proteínas que constituem o resíduo devem estar associadas com
outros compostos e não foram extraídas com os quatro solventes utilizados. O
concentrado apresentou o maior percentual de proteínas não extraíveis, seguido
pela fibra alimentar micronizada e a farinha, a menor quantidade desta fração estava
na fibra alimentar original.
As principais proteínas da soja são classificadas como globulinas, extraídas
em solução salina e no grão esta fração pode corresponder até 80% do total destas
65
macromoléculas (Liu, 1997). A farinha desengordurada, que é o primeiro produto
sólido gerado no processamento da soja, teve a maior quantidade de proteínas
nesta fração, pois foi a amostra com menor grau de processamento. As outras
amostras podem ter sido afetadas pelo processamento subseqüente, que pode
alterar as propriedades funcionais das proteínas, incluindo a solubilidade. Além
disso, alguns polipeptídeos podem ser extraídos em outra classe, devido às
associações com outras proteínas ou permanecer no resíduo insolúvel quando
associados a outros compostos (Liu, 1997).
Os percentuais de proteínas extraídas das fibras de cotilédones de soja, neste
trabalho, foram diferentes dos encontrados em cotilédones de beach pea (Lathyrus
maritimus L.), uma leguminosa com 43% de proteínas e que contém amido. Chavan
et al (2001) relataram que a maior fração de proteínas foi extraída com solução
salina (62%), seguida pela extração alcalina (19%) e pela água (15%), mas os
autores também encontraram o menor percentual de extração em etanol (3%). Estas
variações são explicadas pelas diferenças das leguminosas e também porque os
autores fizeram o processamento de separação dos cotilédones em laboratório,
manualmente e logo após a colheita, sem os processamentos sofridos pela FAO e
FAM.
Os quatro ingredientes alimentares derivados de soja apresentaram as
proteínas majoritárias da leguminosa, β-conglicinina e glicinina, respectivamente,
globulinas 7S e 11S (Figura 6). A β-conglicinina é constituída de subunidades α, α’ e
β, com pesos moleculares de 84, 72 e 51KDa, respectivamente e a glicinina tem
subunidades ácidas (36-40KDa) e básicas (18-20KDa) (Garcia et al, 1997; Riblett et
al, 2001). A glicinina é a maior fração das proteínas totais do grão, 25-35%, é
composta por no mínimo, seis subunidades não idênticas, totalizando um peso
66
molecular de 350KDa, cada subunidade tem um polipeptídeo ácido associado a um
básico por ligações dissulfeto e ligações de hidrogênio (Garcia et al, 1997; Liu, 1997;
Sathe et al, 1987). Uma banda de menor intensidade foi verificada ao redor de
15KDa, nas quatro amostras, provavelmente é uma subunidade da glicinina, a qual
também foi verificada por Riblett et al (2001) quando avaliaram as frações 7S e 11S
separadamente, esta fração foi revelada somente nas corridas de glicinina, com
baixa intensidade. Devido a diferenças na composição e estrutura, as globulinas 7S
e 11S exibem diferenças nas características nutricionais e funcionais: todas as
subunidades da β-conglicinina são glicoproteínas, contendo 4-5% de carboidratos, e
somente uma pequena porção de glicinina é glicosilada; a 11S tem 3 a 4 vezes mais
metionina e cisteína do que a 7S e melhor formação de gel, enquanto que a 7S tem
melhor capacidade emulsificante (Liu, 1997).
Figura 6: Eletroforese dos ingredientes alimentares derivados de soja.
1: padrão; 2: concentrado protéico; 3: farinha desengordurada; 4: fibra alimentar original; 5: fibra alimentar
micronizada.
A farinha desengordurada é o primeiro produto sólido após a retirada do óleo,
portanto rico em proteínas e o concentrado protéico é produzido com as proteínas
solúveis da soja, principalmente β-conglicinina e glicinina. As fibras de cotilédones
67
de soja são ricas em carboidratos, mas o segundo componente é proteína (28%),
nas quais foi verificada uma fração remanescente de 7S e 11S, que devido aos
vários processos sofridos podem ter tido a solubilidade diminuída, permanecendo na
fração insolúvel. Estas proteínas podem não terem sido totalmente solubilizadas no
processo de obtenção do isolado protéico, pois a solubilização ocorreu em pH 7-10 e
a precipitação em pH 4,5, e segundo Liu (1997) o pH utilizado para a solubilização é
6,4 (11S) e 6,2 (7S) e a precipitação de 90% da fração 11S ocorre em pH 5,5,
enquanto que em pH 4,5 a precipitação é constituída de 70% da 7S e 30% da 11S.
Devido à presença destas proteínas, as fibras de cotilédones tiveram maior
solubilidade em pH 6 e 7, original 7,7% e micronizada 10,6%, quando o efeito do pH
na solubilidade protéica foi avaliado.
A eletroforese das proteínas das fibras também mostrou bandas com peso
molecular próximo aos 30KDa, que provavelmente, são glicoproteínas de parede
celular ricas em hidroxiprolina, extensinas, segundo Kleis-San Francisco e Tierney
(1990) estas proteínas têm peso molecular de 30 a 33 KDa e têm a mesma
quantidade de hidroxiprolina e prolina. Averyhart-Fullard et al (1988) avaliou
proteínas de parede celular de soja ricas em hidroxiprolina pela constituição de
aminoácidos, 20% eram hidroxiprolina e 20% eram prolina, além destes, estas
proteínas são ricas em serina, histidina e valina. A hidroxiprolina dos ingredientes
alimentares foi quantificada, as amostras de fibras de cotilédones tiveram
quantidades superiores (original 381,9ug/g e micronizada 359,3ug/g), às amostras
protéicas (concentrado 218,2ug/g e farinha 191,5ug/g), mesmo tendo menores
quantidades de proteínas, média de 28% nas fibras e 72% nos ingredientes
protéicos. Estes resultados confirmam a presença de proteínas de parede celular e
indicam que estas macromoléculas permanecem associadas aos outros compostos
68
de parede celular. As extensinas são os componentes majoritários da parede celular
primária, podendo conter 40% de hidroxiprolina, que está associada com arabinose
na parede celular da soja. Durante o desenvolvimento do grão de soja a maioria das
extensinas (30%) pode ser extraída por soluções salinas, no entanto, quando o grão
é dessecado estas proteínas tornam-se insolúveis devido a mudanças irreversíveis
na conformação da parede durante a secagem (Cassab e Varner, 1988; Waldron et
al, 2003).
CONCLUSÕES
Os dois compostos majoritários da fibra de cotilédones de soja foram
caracterizados. A maior fração de carboidratos é a hemicelulose. Com a constituição
dos monossacarídeos das frações houve a distinção de dois grupos: (1) celulose e
(2) pectina e hemiceluloses, sendo galactose, glicose e arabinose/ramnose, os
principais componentes das amostras. A maioria das proteínas da farinha
desengordurada de soja foi extraída em solução salina e a solução alcalina extraiu a
maior quantidade de proteínas do concentrado protéico e das fibras de cotilédones.
Na eletroforese dos quatro ingredientes alimentares derivados de soja foi constatada
a presença das proteínas majoritárias, β-conglicinina e glicinina, além de bandas
com peso molecular próximo aos 30KDa nas fibras dos cotilédones, sendo
provavelmente glicoproteínas de parede celular, ricas em hidroxiprolina.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento
(CNPq), pelo financiamento desta pesquisa; ao Instituto de Botânica de São Paulo
pelo uso do laboratório para a análise dos componentes de paredes celulares; à
69
Professora Marta de Toledo Benassi pela ajuda na avaliação dos dados e à empresa
Solae Company pelo fornecimento das amostras.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AVERYHART-FULLARD, V.; DATTA, K.; MARCUS, A. A hydroxyproline-rich protein
in the soybean cell wall. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.85, p.1082-1085, 1988.
BRETT, C.T.; WALDRON, K.W. The molecular components o the wall. In: BRETT,
C.T.; WALDRON, K.W. Physiology and Biochemistry of Plant Cell Walls. 2 ed.
London : Chapman & Hall. 1996. p. 5-43.
BRILLOUET, J.M.; CARRÉ, B. Composition of cell walls from cotyledons of Pisum
Sativum, Vicia Faba and Glycine Max. Phytochemistry, v.22, n.4, p.841-847, 1983.
CASSAB, G.I.; VARNER, J.E. Cell wall proteins. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant
Mol. Biol, v.39, p.321-353, 1988.
CHAVAN, U.D.; McKENZIE, D.B.; SHAHIDI, F. Protein classification of beach pea
(Lathyrus maritimus L.). Food Chemistry, v.75, p.145-153, 2001.
DUBOIS, M.; GILLES, K.A.; HAMILTON, J.K.; REBERS, P.A.; SMITH,F.
Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal.
Chem., v.28, p.350, 1956.
GARCIA, M.C.; TORRE, M.; MARINA, M.L.; LABORDA, F. Composition and
characterization of soybean and related products. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, v.37, n.4, p.361-391, 1997.
HUISMAN, M.M.H.; SCHOLS, H.A.; VORAGEN, A.G.J. Cell wall polysaccharides
from soybean (Glycine max) meal. Isolation and characterization. Carbohydrate
Polymers, v.37, p.87-95, 1998.
KARR-LILIENTHAL, L.K.; KADZERE, C.T.; GRIESHOP, C.M.; FAHEY Jr., G.C.
Chemical and nutritional properties of soybean carbohydrates as related to
nonruminants: A review. Livestock Production Science, v.97, p.1-12, 2005.
KINTNER, P.K.; VAN BUREN, J.P. Carbohydrate interference and its correction in
pectin analysis using the m-hydroxydiphenil method. Journal of Food Science,
v.47, p.756-764, 1982.
KLEIS-SAN FRANCISCO, S.M.; TIERNEY, M.L. Isolation and characterization of a
proline-rich cell wall protein from soybean seedlings. Plant Physiol., v.94, p.1897-
1902, 1990.
LIU, K. Chemistry and Nutritional Value of Soybean Components. In: LIU, K.
Soybeans: Chemistry, Technology and Utilization. New York : Chapman & Hall.
1997. p. 25-99.
70
LÓPEZ, G.; ROS, G.; RINCON, F.; PERIAGO, M.J.; MARTÍNEZ, M.C.; ORTUÑO, J.
Relationship between physical and hydration properties of soluble and insoluble fiber
of artichoke. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 44, p. 2773-2778,
1996.
MARSMAN, G.J.P.; GRUPPEN, H; MUL, A.J.; VORAGEN, A.G.J. In vitro
accessibility of untreated, toasted, and extruded soybean meals for proteases and
carbohydrases. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.45, p.4088-4095,
1997.
MARUYAMA,N.; FUKUDA, T.; SAKA, S.; INUI, N.; KOTOH, J.; MIYAGAWA, M.;
HAYASHI, M.; SAWADA, M.; MORIYAMA, T.; UTSUMI, S. Molecular and structural
analysis of electrophoretic variants of soybean seed storage proteins.
Phytochemistry, v.64, p.701-708, 2003.
MULLIN, W.J.; XU, W. A study of the intervarietal differences of cotyledon and seed
coat carbohydrates in soybeans. Food Research International, v.33, p.883-891,
2000.
OUHIDA,I.; PÉREZ, J.F.; GASA, J. Soybean (Glycine max) cell wall composition and
availability to feed enzymes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.50,
p.1933-1938, 2002.
RIBLETT, A.L.; HERALD, T.J.; SCHMIDT, K.A.; TILLEY, K.A. Characterization of β-
conglycinin and glycinin soy protein fractions from four selected soybean genotypes.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.49, p.4983-4989, 2001.
SATHE, S.K.; LILLEY G.G.; MASON, A.C.; WEAVER, C.M. High-resolution sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis of soybean (Glycine max L.) seed
proteins. Cereal Chemistry, v.64, n.6, p. 380-384. 1987.
SELVENDRAN, R.R.; O’NEILL, M.A. Isolation and analysis of cell walls from plant
material. Methods of Biochemical Analysis, v.32, p.25-153, 1987.
STOMBAUGH, S.K.; ORF, J.H.; JUNG, H.G.; SOMERS, D.A. Relationships between
soybean seed cell wall polysaccharides, yield, and seed traits. Crop Science, v.43,
p.571-576, 2003.
STOMBAUGH, S.K.; JUNG, H.G.; ORF, J.H.; SOMERS, D.A. Genotypic and
environmental variation in soybean seed cell wall polysaccharides. Crop Science,
v.40, p.408-412, 2000.
THARANATHAN, R.N.; MAHADEVAMMA, S. Grain legumes – a boon to human
nutrition. Trends in Food Science & Technology, v.14, p.507-518, 2003.
WALDRON, K.W.; PARKER, M.L.; SMITH, A.C. Plant cell walls and food quality.
Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, v.2, p.101-119, 2003.
WOESSNER, J.F., The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples
containing small proportions of this amino acid. Arch. Biochem. Biophys, v.93,
p.440-447, 1961.
71
HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE FIBRAS DE COTILÉDONES DE SOJA (Glycine
Max (L.) Merril) E CARACTERIZAÇÃO DAS FRAÇÕES SOLÚVEIS E SÓLIDAS
RESUMO
Após a determinação das melhores condições, fibras alimentares obtidas de
cotilédones de soja, original (FAO) e micronizada (FAM), foram hidrolisadas
enzimaticamente com carboidrase (Viscozyme L – Novozymes) utilizando 200µL/g,
durante 12 horas sob agitação a 30ºC, e com protease (P3910 – Sigma) utilizando
150µL/g durante 5 horas sob agitação a 55ºC. A fração sólida das fibras hidrolisadas
com carboidrase apresentou maior quantidade de proteínas e aumento nas
propriedades de hidratação: solubilidade, índice de absorção de água e volume de
intumescimento; a fração solúvel foi composta de 73% dos carboidratos e 50% dos
ácidos urônicos da quantidade inicial das amostras. A protease solubilizou 54% do
total das proteínas das amostras, formando peptídeos com peso molecular menor
que 10 KDa e uma banda de peso molecular próximo aos 25KDa, provavelmente a
glicoproteína de parede celular, rica em hidroxiprolina, parcialmente hidrolisada e
uma fração sólida contendo 76% de fibras alimentares totais. A eletroforese revelou
as proteínas majoritárias da soja, β-conglicinina e glicinina nas fibras alimentares
não hidrolisadas. As análises por microscopia eletrônica de varredura confirmaram
que a amostra micronizada é constituída por partículas menores em relação à fibra
alimentar original. A estrutura física da amostra original hidrolisada com protease
ficou mais porosa superficialmente do que a fibra micronizada e a solubilização das
proteínas parece ter deixado as amostras menos compactadas do que a
solubilização dos carboidratos.
72
Palavras-Chave: fibras alimentares, enzimas, microscopia eletrônica de varredura,
eletroforese, hidrolisados.
INTRODUÇÃO
Fibra dos cotilédones de soja é a fração insolúvel do processamento do
isolado protéico, constituída principalmente de polissacarídeos de parede celular. As
fibras alimentares são definidas como macromoléculas resistentes à digestão pelas
enzimas do trato gastrointestinal humano e são essencialmente compostas de
componentes de parede celular, tais como polissacarídeos e lignina. As fibras
proporcionam efeitos fisiológicos a quem ingere a quantidade diária recomendada de
fibras totais (25-30g), sendo que 75% desta quantidade deve ser fibra insolúvel,
além de apresentar propriedades funcionais. A principal característica físico-química
é a propriedade de hidratação, possivelmente pela presença de componentes de
fibras alimentares insolúveis, como celulose, hemicelulose e lignina, que são
materiais higroscópicos (Auffret et al, 1994; López et al, 1996; Tharanathan e
Mahadevamma, 2003). No entanto, processos tecnológicos, como moagem,
secagem, aquecimento e extrusão modificam as propriedades físicas da matriz,
afetando as propriedades de hidratação (Guillon e Champ, 2000).
A incorporação de fibras em alimentos pode causar modificações
indesejáveis, particularmente quanto ao sabor e textura, por isso estes
polissacarídeos têm sofrido tratamentos antes do uso para alterar a complexa
estrutura física existente em compostos de parede celular (Marsman et al, 1997;
Tharanathan e Mahadevamma, 2003). Modificações intencionais podem ser por
tratamentos químicos, mecânicos, enzimáticos ou térmicos, com objetivos de
aumentar a funcionalidade e a disponibilidade de nutrientes, produzir hidrolisados
73
com peptídeos definidos, isolar peptídeos fisiologicamente ativos e remover sabores
ou odores, assim como compostos tóxicos (Lahl e Braun, 1994). A hidrólise
enzimática é preferida em produtos alimentícios porque pode ser controlada,
havendo uma alteração total, parcial ou específica, dependendo do interesse.
Após a hidrólise, os polissacarídeos de parede celular têm aumento de fibras
solúveis; aumento do volume de intumescimento das fibras insolúveis,
provavelmente pelo aumento da porosidade, e maior ou menor absorção de água,
dependendo do tamanho e da distribuição dos poros (Guillon e Champ, 2000).
Também aumenta a digestibilidade dos componentes da parede celular, por produzir
compostos mais solúveis (Karr-Lilienthal et al, 2005). O efeito nas proteínas é
percebido, principalmente nas propriedades funcionais, aumento da solubilidade, da
capacidade emulsificante e espumante; além de melhorar a disponibilidade dos
aminoácidos (Fischer et al, 2001; Tsumura et al, 2005).
O objetivo do trabalho foi hidrolisar enzimaticamente fibras de cotilédones de
soja, usando carboidrase e protease comercial, e caracterizar os hidrolisados
solúveis e sólidos.
MATERIAL E MÉTODOS
A matéria-prima utilizada foi fibra de cotilédones de soja, fibra alimentar
original (FAO) e fibra alimentar micronizada (FAM), fornecidas pela empresa Solae
Company (Esteio/RS). As enzimas utilizadas foram carboidrase de Aspergillus
aculeatus Viscozyme L (Novozymes), atividade 100unidades/mL, lote KTN02106 e
protease de Bacillus licheniformis P3910 (Sigma), E.C. 3.4.21.14.
74
Planejamento experimental: O experimento fatorial escolhido foi 2
3
mais dois
pontos centrais, totalizando 10 experimentos, realizados em duplicata e
aleatoriamente (Tabela 1).
Tabela 1: Planejamento da hidrólise de carboidratos e proteínas de fibras de
cotilédones de soja (experimento fatorial 2³ com dois pontos centrais, variáveis
codificadas e não codificadas).
Carboidratos Proteínas
Experi-
mento
X1 concen-
tração (µL)
X2 tempo de
hidrólise
(min)
X3
tempera-
tura (ºC)
X1 concen-
tração (µL)
X2 tempo de
hidrólise
(min)
X3
tempera-
tura (ºC)
1 -1 (100) -1 (20) -1 (30) -1 (50) -1 (20) -1 (55)
2 +1 (200) -1 (20) -1 (30) +1 (150) -1 (20) -1 (55)
3 -1 (100) +1 (40) -1 (30) -1 (50) +1 (40) -1 (55)
4 +1 (200) +1 (40) -1 (30) +1 (150) +1 (40) -1 (55)
5 -1 (100) -1 (20) +1 (50) -1 (50) -1 (20) +1 (65)
6 +1 (200) -1 (20) +1 (50) +1 (150) -1 (20) +1 (65)
7 -1 (100) +1 (40) +1 (50) -1 (50) +1 (40) +1 (65)
8 +1 (200) +1 (40) +1 (50) +1 (150) +1 (40) +1 (65)
9 0 (150) 0 (30) 0 (40) 0 (100) 0 (30) 0 (60)
10 0 (150) 0 (30) 0 (40) 0 (100) 0 (30) 0 (60)
Para a hidrólise dos carboidratos o pH da solução extratora (água) foi fixado
em 5,5±0,1 e ajustado com NaOH 5% e HCl 10%. Os fatores avaliados foram:
concentração de enzima (100µL, 150µL e 200µL por grama de amostra), tempo de
hidrólise (20, 30 e 40 minutos) e temperatura (30ºC, 40ºC e 50ºC). Para a hidrólise
das proteínas o pH da solução extratora (água) foi fixado em 7,5±0,1 e ajustado com
as mesmas soluções do ensaio para os carboidratos. Os três fatores avaliados
75
foram: concentração de enzima (50µL, 100µL e 150µL por grama de amostra),
tempo de hidrólise (20, 30 e 40 minutos) e temperatura (55ºC, 60ºC e 65ºC). As
hidrólises foram realizadas com agitação em Banho Dubnoff T-053 TECNAL.
Os carboidratos solúveis foram determinados pelo método fenol-sulfúrico,
segundo Dubois (1956), quantificados por absorção em Espectrofotômetro UV-
visível Cintra 20 a 490nm, usando uma curva de calibração de 10 pontos, com
concentração de 10 a 100ug de glicose e com R
2
= 0,9961. As proteínas solúveis
foram determinadas segundo Lowry (1951), quantificadas por absorção em
Espectrofotômetro UV-visível Cintra 20 a 490nm, usando uma curva de calibração
de 10 pontos, com concentração de 40 a 400ug de albumina de soro bovina e com
R
2
= 0,9929. Nas amostras sem tratamento foram determinados carboidratos e
ácidos urônicos solúveis em etanol 80% e proteínas solúveis em água (ponto inicial).
Em amostras completamente hidrolisadas (ponto final), para os carboidratos totais
foi realizada uma hidrólise com ácido sulfúrico 72% em autoclave por 1 hora e para
proteínas, Microkjeldahl (usando sulfato de cobre e sulfato de potássio como
catalisadores e calculadas com fator de correção 6,25).
Após obter a indicação das condições com as maiores solubilizações foram
realizados novos experimentos para definir qual o tempo de hidrólise necessário
para maximizar a solubilização de carboidratos e proteínas. Para a solubilização dos
carboidratos foi utilizada a carboidrase em concentração de 200µL/g de amostra e a
temperatura de hidrólise foi 30ºC. Para a solubilização das proteínas foi utilizada a
protease em concentração de 150µL/g de amostra e a temperatura de hidrólise foi
55ºC. As análises foram realizadas de hora em hora, com o ponto inicial após 30
minutos de hidrólise, em banho-maria, como descrito anteriormente, assim como o
ajuste do pH da solução extratora (água). O ponto final da hidrólise enzimática foi
76
definido experimentalmente, verificando-se o menor tempo para obter a máxima
solubilização. As frações solúveis foram determinadas com os métodos acima
citados.
Análise dos hidrolisados: Após a verificação dos menores tempos de hidrólise
para obter o percentual máximo de carboidratos e proteínas solúveis, foram
realizados novos ensaios, com as condições ideais, para a caracterização das
frações solúveis e sólidas. Os resíduos sólidos, após as hidrólises, foram secos em
uma fina camada sobre lâmina de vidro em estufa com circulação e renovação de ar
TE-394/3 TECNAL a 30ºC. Os sólidos foram recuperados e triturados em moinho
para pequenas amostras IKA A11 basic QUIMIS. Nos sólidos oriundos da ação da
carboidrase foram determinadas proteínas totais, que foram avaliadas para
funcionalidade e peso molecular (por eletroforese). As frações sólidas da hidrólise
com a protease foram avaliadas quanto aos teores de proteínas totais usando o
método de Microkjeldahl e de fibras alimentares solúveis, insolúveis e totais, com a
metodologia enzimática-gravimétrica segundo o método nº 985.29 da AOAC (1995)
usando o kit de ensaio de fibra alimentar total da Sigma (TDF 100A) e tampão
fosfato 0,08M pH 6. Na fração solúvel da hidrólise com a carboidrase foram
determinados carboidratos totais e ácidos urônicos e a fração oriunda do ensaio com
protease foi caracterizada por eletroforese. A estrutura física dos hidrolisados
sólidos, assim como das amostras não hidrolisadas, foram avaliadas por microscopia
eletrônica de varredura.
Solubilidade em diferentes pHs: Um grama de amostra foi suspensa em 25mL de
soluções tampão Mcllvaine em pH 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 e 7,0, e agitada por 30 minutos
em shaker horizontal Marconi MA830/A (125 rpm a temperatura ambiente). Após
centrifugação (3000 rpm por 20 minutos, em centrífuga Harrier 15/80 MSE), as
77
amostras foram filtradas em papel filtro Whatman n° 3. No sobrenadante foi
determinada proteína, pelo método de Microkjeldahl, usando uma alíquota de 2mL.
%proteína solúvel = Proteína solúvel no sobrenadante x 100
Proteína total
Volume de intumescimento: um grama de amostra foi misturado com excesso de
água destilada em proveta de 100 mL. A suspensão foi continuamente agitada por 2
horas com barra magnética e posteriormente deixada em repouso para completa
decantação. O volume ocupado pela amostra na proveta foi denominado volume de
intumescimento e foi expresso em mL/grama de matéria seca.
Índice de absorção de água: dois gramas de amostra foram misturados com 20 mL
de água destilada a temperatura ambiente em tubos de centrífuga, previamente
pesados, foram continuamente agitados durante 30 minutos em agitador horizontal
Marconi MA830/A (75 rpm a temperatura ambiente), e centrifugados a 3000 rpm por
10 minutos em centrífuga Harrier 15/80 MSE. O sobrenadante de cada tubo foi
descartado e o sedimento úmido pesado. O IAA foi obtido através da razão entre o
peso do sedimento úmido e o peso da matéria seca, e expresso em gramas de água
absorvida / grama de matéria seca.
Índice de absorção de óleo: foi determinado como o índice de absorção de água,
substituindo a água por óleo de soja comercial.
Capacidade emulsificante: um grama de amostra e 50mL de água destilada foram
homogeneizados por 30 segundos e adicionado óleo de soja a uma taxa de
10mL/min e misturados com shaker DIAX 600 Heidolph, em velocidade máxima. O
ponto de inversão de fase foi registrado visualmente com a liquefação da emulsão. A
capacidade emulsificante foi calculada como a quantidade de óleo emulsificado por
grama de amostra.
78
Atividade emulsificante: um grama de amostra, 10 mL de água destilada e 10 mL
de óleo de soja comercial foram emulsificados em um béquer de 100 mL com shaker
DIAX 600 Heidolph por 1 minuto, em velocidade máxima. A suspensão foi
centrifugada em tubos graduados a 3600 rpm por 10 minutos em centrífuga Harrier
15/80 MSE, onde o volume da camada emulsificada e o volume total foram lidos.
Atividade emulsificante = V da camada emulsificada x 100
V total no tubo
Eletroforese: foi realizada segundo Marsman et al (1997) e Maruyama et al (2003).
As amostras foram extraídas em solução tampão Tris-HCl 62,5mM, pH 6,8, 2% de
SDS, 1% de β-mercaptoetanol e 10% de glicerol, durante 1 hora sob agitação com
barra magnética, após foram centrifugadas a 10000 rpm por 30 minutos a 10ºC. No
sobrenadante foram quantificadas as proteínas totais por Microkjeldahl. Gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE) foi usado para a análise (gel separador 12% e gel
concentrador 4%). Uma alíquota contendo 2mg de proteína foi diluída em tampão de
amostra e utilizada para a corrida em corrente elétrica de 100V. As bandas
eletroforéticas foram reveladas e fixadas com solução metanol 40%, ácido acético
10% e água 50%, contendo 0,1% de corante Coomassie Brilhante Blue. O excesso
do corante foi retirado com solução metanol 40%, ácido acético 10% e água 50%. O
padrão utilizado foi o BenchMark Protein Ladder INVITROGEN, com bandas de 10 a
220KDa.
Microscopia eletrônica de varredura: as amostras secas foram colocadas sobre
uma fita de carbono dupla face, a qual foi colada em “stubs”. As amostras foram
recobertas com ouro em metalizador BAL-TEC SCD 050 Sputter Coater e
observadas em Microscópio Eletrônico de Varredura Quanta 200 (FEI) da Philips,
sob tensão de 20KV.
79
Densidade direta: foi determinada diretamente, utilizando um cilindro de vidro
graduado para medir 9 mL, este volume foi pesado e a densidade foi calculada pela
razão de peso e volume e expressa em g/mL.
Análise estatística: o planejamento experimental foi gerado e avaliado pelo
programa Statistica 5.1. Os resultados das amostras foram avaliadas por ANOVA e
para comparar a diferença das médias, o teste de Tukey com intervalo de confiança
de 95% (p<0,05) foi usado.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O experimento fatorial indicou os fatores e níveis que produziram maior
solubilização e se haviam interações entre os fatores. As médias dos experimentos
(Tabela 2), com a avaliação estatística, indicaram efeito positivo da concentração de
enzima na produção de carboidratos solúveis. O nível superior de concentração
enzimática (experimentos 2, 4, 6 e 8) teve um efeito positivo na solubilização dos
carboidratos de 2,8% para FAO e 2,2% para FAM, quando comparado à menor
concentração de enzima.
As proteínas solúveis da FAO tiveram efeito positivo de 10,2% quando usado
o maior nível de concentração enzimática e 8% com maior tempo de hidrólise. Para
a amostra micronizada houve interação entre tempo e temperatura, se usados nos
maiores níveis (experimentos 7 e 8) houve efeito positivo de 6,8% em proteínas
solubilizadas. Outra interação foi entre concentração de enzima e temperatura de
hidrólise que produziu efeito positivo de 9,5% quando um dos fatores fosse utilizado
no nível superior e outro no inferior, mas quando a concentração foi utilizada no
maior nível o efeito positivo foi de 12% (experimentos 2 e 4).
80
Tabela 2: Carboidratos e proteínas solúveis das fibras de cotilédones, após hidrólise
enzimática (experimento fatorial 2³ mais dois pontos centrais).
% Carboidratos Solúveis % Proteínas Solúveis
Experimentos FAO FAM FAO FAM
1 7,4 ±1,5 9,8 ±0,3 15,4 ±0,6 26,5 ±1,5
2 11,2 ±0,3 12,8 ±1,9 26,9 ±1,0 41,5 ±0,2
3 6,8
±0,5 10,1 ±0,4 24,2 ±3,5 18,0 ±0,8
4 9,4
±0,1 13,4 ±0,3 36,3 ±1,3 46,0 ±1,2
5 6,6
±0,4 11,3 ±0,8 19,9 ±0,5 28,6 ±1,6
6 9,7
±0,2 13,4 ±1,3 29,5 ±1,2 35,2 ±0,3
7 7,5
±0,5 11,5 ±0,9 27,8 ±1,2 44,3 ±3,4
8 9,0
±0,3 11,8 ±1,1 35,3 ±0,5 42,6 ±1,9
9 8,8
±0,3 13,5 ±0,4 21,9 ±1,6 26,0 ±0,2
10 10,2
±0,8 12,1 ±1,2 24,8 ±0,6 26,2 ±2,3
FAO: fibra alimentar original. FAM: fibra alimentar micronizada
Médias dos experimentos realizados em duplicata. Carboidratos e proteínas solúveis, em relação ao total destes
compostos nas amostras, em base seca.
Um novo experimento de solubilização dos carboidratos foi realizado para
saber qual o tempo necessário para a obtenção da extração máxima dos
carboidratos, utilizando a concentração máxima de enzima (200µL/g) e a mínima
temperatura de hidrólise (30ºC), já que este fator não apresentou influência (Figura
1). A solubilização dos carboidratos foi determinada por até 13 horas, mas a partir
das 7 horas de hidrólise a fibra alimentar micronizada não apresentou mais diferença
estatística, enquanto que a fibra alimentar original teve o mesmo comportamento a
partir das 10 horas de hidrólise. As duas amostras tiveram valor máximo de
solubilização após 12 horas de hidrólise, original 68% e micronizada 70%, portanto
este foi considerado o menor tempo para obter a maior extração de carboidratos.
81
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Tempo de hidrólise (hs)
% Carboidratos Solúveis
FAO
FAM
Figura 1: Tempo de hidrólise enzimática para obter a solubilização máxima dos
carboidratos das fibras de cotilédones de soja.
FAO: fibra alimentar original. FAM: fibra alimentar micronizada
Para comparar a capacidade de hidrólise da enzima foram determinados os
açúcares solúveis nas amostras sem tratamento e foram feitas hidrólises químicas,
com ácido sulfúrico 72%, presumidamente considerando que a quantidade máxima
de carboidratos da amostra seria hidrolisada. A quantidade de carboidratos
solubilizados pela ação da enzima foi a mesma, na fibra micronizada (70%), que a
solubilização promovida pela hidrólise química (Tabela 3). A amostra original teve a
solubilidade diminuída em 6% quando tratada enzimaticamente, isto pode ter
ocorrido pela diferença no tamanho das partículas. Sendo assim, pode-se dizer que
esta enzima é adequada para hidrolisar os carboidratos das fibras de cotilédones de
soja, pois uma completa hidrólise não é conseguida, devido à complexidade
estrutural dos carboidratos da soja (Fischer et al, 2001).
82
Tabela 3: Médias dos carboidratos e proteínas solúveis antes do tratamento e após
a hidrólise química (solubilidade em relação ao total de cada composto).
% Carboidratos Solúveis % Proteínas Solúveis
Experimentos FAO FAM FAO FAM
Sem Tratamento 4,0 ±0,1 8,5 ±0,3 7,9 ±0,6 13,3 ±0,4
Hidrólise Química 73,9 ±2,5
70,0 ±0,9 28,2* ±0,2 27,6* ±0,1
FAO: fibra alimentar original. FAM: fibra alimentar micronizada
Médias das determinações realizadas em triplicata, em base seca.
* total de proteínas presentes na amostra, em base seca.
Para que o experimento do tempo fosse realizado com as duas amostras, e
assim obter a máxima solubilização das proteínas, a temperatura ideal foi baseada
nos resultados da amostra micronizada, pois este fator não influenciou na amostra
original. Assim, foram utilizadas a maior concentração (150µL/g) e a menor
temperatura de hidrólise (55ºC), evitando a desnaturação protéica (Figura 2). As
duas amostras foram hidrolisadas por até 11 horas. A amostra original não
apresentou diferença estatística a partir de 5 horas de hidrólise, onde a quantidade
de proteínas solubilizadas foi a mesma (61%). Para a amostra micronizada, o
máximo da extração (67%) ocorreu com 4 horas, portanto, o menor tempo para a
máxima solubilização das proteínas das fibras de soja é de 5 horas.
Após a determinação dos menores tempos capazes de solubilizar os maiores
percentuais de carboidratos e proteínas, foi possível a realização de novas
hidrólises, com as condições ideais para a carboidrase e para a protease, tendo
como objetivo a caracterização das frações solúveis e sólidas.
83
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0123456789101112
Tempo de solubilização (hs)
% Protéinas solúveis
FAO
FAM
Figura 2: Tempo de hidrólise enzimática para obter a solubilização máxima das
proteínas das fibras de cotilédones de soja.
FAO: fibra alimentar original. FAM: fibra alimentar micronizada
As frações sólidas da hidrólise com carboidrase tiveram, em média, 62% a
mais de proteínas do que as amostras antes da hidrólise (Tabela 4), portanto, se há
interesse em aumentar rendimento em proteínas por extração, a aplicação da
Viscozyme L poderia extrair quantidades adicionais de proteínas. A hidrólise
enzimática afetou as propriedades tecnológicas dos materiais sólidos resultantes da
hidrólise. O índice de absorção de água (IAA) foi menor após a hidrólise, enquanto
que o volume de intumescimento (VI) foi maior, provavelmente devido às mudanças
na estrutura física ocorridas durante a hidrólise, pois o IAA depende da conformação
molecular, tamanho das partículas, números de sítios de ligação das moléculas e
força de centrifugação e o VI depende da densidade, porosidade e solubilidade
(Auffret et al, 1994; Chou e Morr, 1979; Thibault et al, 1992). O VI da fração sólida
da hidrólise da FAM foi menor que da FAO, provavelmente devido às diferenças
ocorridas em conseqüência da diminuição do tamanho das partículas pela
micronização. Guillon e Champ (2000) justificaram o aumento do volume de
intumescimento das fibras insolúveis, provavelmente pelo aumento da porosidade, e
a menor absorção de água pelo tamanho e distribuição dos poros.
84
Tabela 4: Proteínas e propriedades funcionais da fração sólida, carboidratos totais e
ácidos urônicos da fração solúvel das fibras dos cotilédones de soja após a hidrólise
com a carboidrase, comparadas com as amostras não hidrolisadas.
Frações Sólidas Frações Solúveis
Amostras Proteínas
(%)
IAA VI IAO AE
Carboidratos
Totais (%)
Ácidos Urônicos
(mg/g)
FAO não
hidrolisada
28,2
b
± 6,5
8,4
a
± 0,2
17,2
c
± 1,0
2,5
a
± 0,1
52,4
a
± 1,4
64,6ª
± 0,2
17,5
a
± 0,3
FAO após a
hidrólise
45,5
a
± 1,6
4,1
c
± 0,1
31,0
a
± 0,3
2,4ª
± 0,2
7,9
b
± 1,2
47,8
b
± 0,2
8,5
b
± 0,1
FAM não
hidrolisada
27,6
b
± 0,1
5,7
b
± 0,1
18,0
c
± 0,5
2,4
a
± 0,1
53,0
a
± 0,3
65,2ª
± 0,4
17,4
a
± 0,1
FAM após a
hidrólise
45,0
a
± 1,2
3,3
d
± 0,1
21,5
b
± 0,8
2,4ª
± 0,2
9,4
b
± 2,0
46,5
b
± 0,7
8,1
b
± 0,1
FAO= fibra alimentar original; FAM= fibra alimentar micronizada. IAA= índice de absorção de água (g água
absorvida/ g de amostra); VI= volume de intumescimento (mL de água/ g de amostra); IAO= índice de absorção
de óleo (g óleo absorvido/ g de amostra); AE= atividade emulsificante (%).
Médias de determinações em triplicata. Proteínas, carboidratos totais e ácidos urônicos, em base seca.
Médias seguidas pela mesma letra, nas colunas, não diferiram ao nível de 5% pelo teste de Tukey.
O índice de absorção de óleo (IAO) não sofreu influência da hidrólise
enzimática. A atividade emulsificante das frações sólidas das fibras hidrolisadas foi
menor do que as amostras não hidrolisadas e a capacidade emulsificante não pôde
ser verificada porque durante a determinação não houve a formação da emulsão. As
propriedades emulsificantes são típicas de produtos protéicos e estão relacionadas
com a solubilidade, mas não basta ter maior quantidade de proteínas com maior
solubilidade, é necessário ter aumento na razão hidrofobicidade/hidrofilicidade, pois
uma hidrofobicidade relativamente elevada favorece as características
emulsificantes das proteínas da soja (Sgarbieri, 1998). Estas características são
atribuídas principalmente à combinação de gordura aos grupos não polares das
proteínas ou à disponibilidade de grupos lipofílicos (Padilla et al, 1996).
85
Provavelmente a ação enzimática, juntamente com a secagem das frações sólidas
das fibras alimentares hidrolisadas com carboidrase, mudaram a conformação e
indisponibilizaram os grupos não polares das proteínas, ocorrendo associações
proteína-proteína, produzindo uma superfície compactada (Figura 4E e 4F).
A quantidade total dos ácidos urônicos, das fibras alimentares antes da
hidrólise, é a soma dos ácidos quantificados na fração péctica (17,1mg/g) e na
extração com etanol antes do fracionamento (0,3mg/g). Huisman et al (1998)
comentaram que 90% dos ácidos urônicos da farinha de soja estão na fração
insolúvel, isto pode ser uma indicação da complexidade ou diversidade das
moléculas pécticas na parede celular. Sendo as fibras a fração insolúvel da farinha é
coerente apresentar 98% do total dos ácidos urônicos nas pectinas. A carboidrase
foi capaz de solubilizar 73% dos carboidratos totais e 50% dos ácidos urônicos da
quantidade inicial. Fischer et al (2001) solubilizaram 76% dos carboidratos de farinha
de soja após tratamento enzimático e comentaram que a extração incompleta é
devido à complexa estrutura dos compostos majoritários da soja. Marsman et al
(1997) solubilizaram praticamente a metade dos ácidos urônicos presentes em
farinha de soja, quando utilizaram enzima para degradação de parede celular, mas
isto ocorreu somente após 24 horas de hidrólise.
O efeito do pH na solubilidade protéica de fibras alimentares e das frações
sólidas das fibras hidrolisadas com a carboidrase foi avaliado utilizando soluções
com pH de 3,0 a 7,0 (Tabela 5). Para os ingredientes de fibra alimentar o conteúdo
de proteínas solúveis foi menor no pH 3,0 (original 5,7% e micronizada 4,7%),
atingindo máximo de 10,7% na solução com pH 7,0, pois a proteína solúvel já havia
sido extraída no processo industrial de produção de isolado protéico. As frações
sólidas oriundas da hidrólise com carboidrases tiveram maior solubilidade protéica,
86
em todas as soluções avaliadas, quando comparadas com as amostras não
hidrolisadas (p>0,05). O hidrolisado sólido da fibra original teve a solubilidade
triplicada e o hidrolisado oriundo da fibra micronizada duplicada, esta diferença pode
ser devido à diminuição das partículas pela micronização. As quantidades de
proteínas solúveis nos pHs 3,0; 5,0 e 6,0 das frações sólidas da fibra alimentar
original foram maiores do que as frações sólidas da fibra alimentar micronizada,
provavelmente devido às diferenças nas conformações e agregações formadas
pelas proteínas e também do tamanho e da distribuição dos poros (Guillon e Champ,
2000).
Tabela 5: Efeito do pH na solubilidade protéica das frações sólidas das fibras dos
cotilédones de soja após a hidrólise enzimática com a carboidrase, comparadas com
as fibras não hidrolisadas (% de proteínas solúveis em relação às proteínas totais).
Amostras pH 3,0 pH 4,0 pH 5,0 pH 6,0 pH 7,0
FAO não hidrolisadas
5,7
c
± 0,5 6,0
b
± 0,5 6,7
d
± 0,1 7,7
c
± 0,4 7,6
c
± 0,1
FAO após a hidrólise
13,5ª ± 0,3 15,2ª ± 1,8 18,6ª ± 0,4 20,8ª ± 0,3 19,5ª ± 0,6
FAM não hidrolisadas
4,7
c
± 0,3 6,4
b
± 0,7 9,6
c
± 0,3 10,5
c
± 0,3 10,7
b
± 0,3
FAM após a hidrólise
10,4
b
± 0,4 12,5ª ± 0,7 13,3
b
± 0,4 16,4
b
± 2,2 19,8ª ± 1,6
FAO= fibra alimentar original; FAM= fibra alimentar micronizada.
Médias de determinações em triplicata, em base seca.
Médias seguidas pela mesma letra, nas colunas, não diferiram ao nível de 5% pelo teste de Tukey.
As frações sólidas das fibras alimentares, original e micronizada, hidrolisadas
com a protease, foram avaliadas quanto aos teores de proteínas e fibras alimentares
e comparadas com os resultados das amostras antes da hidrólise (Tabela 6). Em
média a protease foi capaz de solubilizar 54% do total das proteínas presentes nas
amostras, assim o percentual de fibras alimentares totais aumentou de 60% para
76%, sendo as fibras insolúveis, as frações majoritárias nas duas amostras, antes e
87
depois da hidrólise. Estas frações sólidas das hidrólises podem ser utilizadas como
ingredientes em vários produtos, pois o aumento da concentração de fibras totais
permite o uso como ingrediente (fonte de fibras) em concentrações menores em
comparação com os ingredientes originais. Além disso, podem ser usados como
componentes benéficos à saúde, pois as fibras apresentam efeitos fisiológicos
proporcionados a quem ingere a quantidade diária recomendada, 25 a 30g no total,
sendo que 75% desta quantidade devem estar na forma insolúvel. Os benefícios
descritos são: aumento da saciedade, regulação do trânsito intestinal, aumento do
volume fecal (principalmente as insolúveis), redução do colesterol, aumento na
excreção de sais biliares e prevenção de algumas doenças, incluindo o câncer de
cólon (principalmente as solúveis) (Tharanathan e Mahadevamma, 2003).
Tabela 6: Caracterização das fibras de cotilédones de soja não hidrolisadas e das
frações sólidas das fibras hidrolisadas com a protease (%).
Amostras Proteínas Fibras
insolúveis
Fibras
solúveis
Fibras totais
FAO não hidrolisada
28,2ª
± 6,5 55,5
b
± 0,5 3,8
c
± 0,1 59,4
c
± 0,4
FAO após a hidrólise
16,1
b
± 0,2 70,6ª ±1,2 4,4
bc
± 0,6 75,0
a
± 0,8
FAM não hidrolisada
27,6ª
± 0,1 56,6
b
± 0,4 5,9
ab
± 1,0 62,5
b
± 0,6
FAM após a hidrólise
14,8
b
± 0,3 72,4ª ±1,8 4,9
bc
± 0,1 77,2ª ± 1,8
FAO: fibra alimentar original. FAM: fibra alimentar micronizada
Médias de determinações em triplicata, em base seca.
Médias seguidas pela mesma letra, nas colunas, não diferiram ao nível de 5% pelo teste de Tukey.
As frações solúveis da proteólise foram avaliadas quanto ao peso molecular
dos peptídeos, juntamente com as proteínas das fibras alimentares não hidrolisadas
e das proteínas das amostras tratadas com carboidrase (Figura 3). Para a
eletroforese em gel foi usado 2mg de proteínas solubilizadas em tampão (Tris-HCl,
SDS, β-mercaptoetanol e glicerol). Os sobrenadantes da hidrólise com a protease
88
foram diluídos no tampão, enquanto que as outras amostras foram extraídas neste
tampão. Para as duas amostras de fibras alimentares a extração das proteínas foi
total, mas parcial para as amostras de fibras hidrolisadas com carboidrase, original
60% e micronizada 50%.
A fração protéica remanescente nas fibras é parte das proteínas majoritárias
da soja, β-conglicinina e glicinina, respectivamente, globulinas 7S e 11S. As
amostras apresentaram as subunidades que constituem a β-conglicinina, α, α’ e β,
com pesos moleculares de 84, 72 e 51KDa, respectivamente, e as subunidades
ácidas (36-40KDa) e básicas (18-20KDa) que compõem a glicinina (Garcia et al,
1997; Riblett et al, 2001). Uma banda de menor intensidade foi verificada em 15KDa,
sendo provavelmente uma subunidade da glicinina, também verificada por Riblett et
al (2001), quando avaliaram as frações 7S e 11S separadamente, esta banda foi
revelada na eletroforese de glicinina, com baixa intensidade. De acordo com a
análise visual da eletroforese, a protease hidrolisou as proteínas das fibras de soja a
peptídeos com baixos pesos moleculares (menores que 10KDa). Lee et al (2001)
comentaram que os hidrolisados de farinha de soja, oriundos da proteólise de várias
proteases, incluindo a produzida pelo Bacillus licheniformis, apresentaram baixos
pesos moleculares, 95% das proteínas tinham menos de 12,5KDa após 6 horas de
hidrólise. O mesmo comportamento foi verificado quando a enzima utilizada foi a
Viscozyme L (carboidrase), isto ocorreu porque, provavelmente esta enzima não é
pura e contém protease. Esta redução de peso molecular, pela carboidrase, também
pode ter sido influenciada pelo tempo de hidrólise, 12 horas, mais do que duas
vezes ao da proteólise.
89
Figura 3: Eletroforese de fibras de soja, original e micronizada, e amostras
hidrolisadas com protease e carboidrase.
1: padrão; 2: fibra alimentar original; 3: fibra alimentar original hidrolisada com protease; 4: fibra alimentar original
hidrolisada com carboidrase; 5: fibra alimentar micronizada; 6: fibra alimentar micronizada hidrolisada com
protease; 7 fibra alimentar micronizada hidrolisada com carboidrase.
Bandas com peso molecular próximo aos 30KDa também foram reveladas na
eletroforese das amostras de fibras de cotilédones, provavelmente glicoproteínas de
parede celular ricas em hidroxiprolina. Segundo Kleis-San Francisco e Tierney
(1990) estas proteínas têm peso molecular variando de 30 a 33 KDa e tem a mesma
quantidade de hidroxiprolina e prolina. Quando as fibras foram hidrolisadas com
protease por 5 horas (colunas 3 e 6) apresentaram uma banda com peso molecular
próximo aos 25KDa, sendo resultado da ação das enzimas, pois as amostras não
hidrolisadas não contêm esta banda. Possivelmente é a glicoproteína de parede
celular parcialmente hidrolisada, pois estes polipeptídeos são mais resistentes à
hidrólise enzimática devido à complexa estrutura e associação com outros
compostos, que dificultam o acesso da enzima (Karr-Lilienthal et al, 2005). Marsman
et al (1997) recomendaram o uso de misturas de várias enzimas para degradação
de compostos de parede celular, em menores concentrações, ao invés de adicionar
uma protease ou carboidrase separadamente, em maior concentração.
As análises por microscopia eletrônica de varredura das fibras de cotilédones
de soja, original e micronizada (Figura 4A e 4B) representaram a real estrutura física
90
das amostras, pois a micronização foi realizada na empresa fornecedora do material.
A redução, visível ao comparar as amostras na mesma magnificação, mostra que a
fibra de cotilédones de soja micronizada é constituída, em maior proporção, de
partículas menores em relação à fibra alimentar original. A diferença no tamanho das
partículas justifica a maior densidade apresentada pela fibra alimentar original
(0,46g/mL), quando comparada com a fibra alimentar micronizada (0,39g/mL), as
quais apresentaram diferença estatística (p>0,05). Este comportamento foi
observado por Cadden (1987) ao avaliar fibras de trigo e aveia, onde comentou que
o volume específico pode ser usado como um índice de diferença estrutural.
As microfotografias das amostras hidrolisadas com protease e com
carboidrase não representam o tamanho real das partículas, pois o processo de
secagem foi realizado com uma fina camada de amostra sobre uma superfície de
vidro. O material seco formou uma cobertura compactada de fibras alimentares
hidrolisadas, as quais foram moídas para proceder as análises microscópicas. A
estrutura física da amostra original hidrolisada com protease (Figura 4C) ficou mais
porosa superficialmente do que a fibra micronizada hidrolisada com a mesma
enzima (Figura 4D), provavelmente porque esta amostra não tinha sofrido
modificações na estrutura antes da ação da enzima. A solubilização e retirada das
proteínas parece ter deixado as amostras menos compactadas do que a
solubilização e retirada dos carboidratos, pois as duas fibras alimentares
hidrolisadas com carboidrase (Figuras 4E e 4F), cuja fração sólida continha mais
proteínas, apresentaram uma estrutura mais compacta. É possível que as proteínas,
mais concentradas após a hidrólise dos carboidratos, associaram-se
intermolecularmente e intramolecularmente, mudando a agregação destas
91
macromoléculas e a temperatura, do processo e da secagem, também pode ter
influenciado.
Figura 4: Microscopia eletrônica de varredura das fibras de soja, original (A), micronizada (B)
(160x), original hidrolisada com protease (C), micronizada hidrolisada com protease (D),
original hidrolisada com carboidrase (E) e micronizada hidrolisada com carboidrase (F)
(800x).
92
CONCLUSÕES
As melhores condições de hidrólise das fibras dos cotilédones de soja foram
determinadas para obter a maior solubilização de carboidratos e proteínas. Foi
utilizada 200µL/g de carboidrase durante 12 horas sob agitação a 30ºC, e 150µL/g
de protease durante 5 horas sob agitação a 55ºC. Na fração sólida das fibras
hidrolisadas com carboidrase houve concentração de proteínas e aumento nas
propriedades hidrofílicas. A fração solúvel teve 73% dos carboidratos e 50% dos
ácidos urônicos da quantidade inicial das amostras. A protease foi capaz de
solubilizar 54% do total das proteínas, produzindo uma fração sólida contendo 76%
de fibras alimentares totais, e uma fração solúvel com peptídeos de peso molecular
menor que 10KDa e uma banda de peso molecular próximo aos 25KDa. As
micrografias das fibras confirmaram que a amostra micronizada é constituída por
partículas menores em relação à original. A estrutura física da FAO hidrolisada com
protease ficou com aparência mais porosa superficialmente do que a FAM e as
amostras hidrolisadas com carboidrase apresentaram uma estrutura mais
compactada.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento
(CNPq), pelo financiamento desta pesquisa; ao Professor Fábio Yamashita pela
ajuda prestada no planejamento experimental e à empresa Solae Company pelo
fornecimento das amostras.
93
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AOAC. Official Methods of Analysis. Association of Official Analytical Chemists 16.
ed. v. I e II, 1995.
AUFFRET, A.; RALET, M.C.; GUILLON, F.; BARRY, J.L.; THIBAULT, J.F. Effect of
grinding and experimental conditions on the measurement of hydration properties of
dietary fibres. LWT, v.27, p.166-172, 1994.
CADDEN, A.M. Comparative effects of particle size reduction on physical structure
and water binding properties of several plant fibers. Journal of Food Science, v.52,
n.6, p.1595-1599, 1987.
CHOU, D.H.; MORR, C.V. Protein-water interactions and functional properties.
JAOCS, v.56, p.53A-62A, 1979.
DUBOIS, M.; GILLES, K.A.; HAMILTON, J.K.; REBERS, P.A.; SMITH, F.
Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical
Chemistry, v.28, n.3, p.350-356, 1956.
FISCHER, M.; KOFOD, L.V.; SCHOLS, H.A.; PIERSMA, S.R.; GRUPPEN, H.;
VORAGEN, A.G.J. Enzymatic extractability of soybean meal proteins and
carbohydrates: heat and humidity effects. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, v.49, p.4463-4469, 2001.
GARCIA, M.C.; TORRE, M.; MARINA, M.L.; LABORDA, F. Composition and
characterization of soybean and related products. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, v.37, n.4, p.361-391, 1997.
GUILLON, F.; CHAMP, M. Structural and physical properties of dietary fibres, and
consequences of processing on human physiology. Food Research International,
v.33, p.233-245, 2000.
HUISMAN, M.M.H.; SCHOLS, H.A.; VORAGEN, A.G.J. Cell wall polysaccharides
from soybean (Glycine max) meal. Isolation and characterisation. Carbohydrate
Polymers, v.37, p.87-95, 1998.
KARR-LILIENTHAL, L.K.; KADZERE, C.T.; GRIESHOP, C.M.; FAHEY Jr., G.C.
Chemical and nutritional properties of soybean carbohydrates as related to
nonruminants: A review. Livestock Production Science, v.97, p.1-12, 2005.
KLEIS-SAN FRANCISCO, S.M.; TIERNEY, M.L. Isolation and characterization of a
proline-rich cell wall protein from soybean seedlings. Plant Physiol., v.94, p.1897-
1902, 1990.
LAHL, W.J.; BRAUN, S.D. Enzymatic production of protein hydrolysates for food
use. Food Technology, p.68-71, 1994.
LEE, J.Y.; LEE, H.D.; LEE, C.H. Characterization of hydrolysates produced by mild-
acid treatment and enzymatic hydrolysis of defatted soybean flour. Food Research
International, v.34, p.217-222. 2001.
94
LÓPEZ, G.; ROS, G.; RINCON, F.; PERIAGO, M.J.; MARTÍNEZ, M.C.; ORTUÑO, J.
Relationship between physical and hydration properties of soluble and insoluble fiber
of artichoke. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.44, p.2773-2778,
1996.
LOWRY, O. H. et al. Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal
Biological Chemistry, v.193, p.265-275, 1951.
MARSMAN, G.J.P.; GRUPPEN, H; MUL, A.J.; VORAGEN, A.G.J. In vitro
accessibility of untreated, toasted, and extruded soybean meals for proteases and
carbohydrases. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.45, p.4088-4095.
1997.
MARUYAMA,N.; FUKUDA, T.; SAKA, S.; INUI, N.; KOTOH, J.; MIYAGAWA, M.;
HAYASHI, M.; SAWADA, M.; MORIYAMA, T.; UTSUMI, S. Molecular and structural
analysis of electrophoretic variants of soybean seed storage proteins.
Phytochemistry, v.64, p.701-708, 2003.
PADILLA, F.C.; ALVAREZ, M.T.; ALFARO, M.J. Functional properties of barinas nut
flour (Caryodendron orinocense Karst., Euphorbiaceae) compared to those of
soybean. Food Chemistry, v.57, n.2, p.191-196, 1996.
RIBLETT, A.L.; HERALD, T.J.; SCHMIDT, K.A.; TILLEY, K.A. Characterization of β-
conglycinin and glycinin soy protein fractions from four selected soybean genotypes.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.49, p.4983-4989, 2001.
SGARBIERI, V.C. Propriedades funcionais de proteínas em alimentos. Boletim
SBCTA, v.32, n.1, p.105-126, 1998.
THARANATHAN, R.N.; MAHADEVAMMA, S. Grain legumes – a boon to human
nutrition. Trends in Food Science & Technology, v.14, p.507-518, 2003.
THIBAULT, J.F.; LAHAYE, M.; GUILLON, F. Physico-chemical properties of food
plant cell wall. In: SCHEIZER, T.; EDWARDS, C.A. Dietary Fibre: a component of
food: nutritional function in health and disease. Berlin: Springer-Verlag, 1992.
p.21-39.
TSUMURA, K.; SAITO, T.; TSUGE, K.; ASHIDA, H.; KUGIMIYA, W.; INOUYE, K.
Functional properties of soy protein hydrolysates obtained by selective proteolysis.
LWT, v.38, p.255-261, 2005.
95
6. CONCLUSÕES GERAIS
- Nos ingredientes protéicos (farinha desengordurada e concentrado protéico) e de
fibras alimentares (fibras dos cotilédones, original e micronizada), o macromineral de
maior concentração foi o potássio e o micromineral foi o ferro. A biodisponibilidade
do zinco não foi afetada pela presença do ácido fítico, de acordo com as taxas
molares do complexo fitato x Ca : Zn. Os ingredientes protéicos tiveram a maior
concentração de fósforo fítico, ácido fítico e isoflavonas, mas as fibras de
cotilédones de soja contêm maiores quantidades de daidzeína e genisteína.
- A farinha desengordurada apresentou a maior quantidade de proteína solúvel em
pH 7,0 e o menor índice de absorção de água, enquanto que o concentrado protéico
teve os maiores índice de absorção de óleo e atividade emulsificante. Os
ingredientes de fibras alimentares apresentaram as melhores propriedades de
hidratação e as outras propriedades funcionais foram similares ou melhores que os
ingredientes protéicos, mesmo tendo menores percentuais de proteínas.
- A maior fração de carboidratos da fibra de cotilédones de soja é a hemicelulose,
correspondendo a 55%, em média. Com a constituição dos monossacarídeos das
frações houve a distinção de dois grupos: (1) celulose e (2) pectina e hemiceluloses,
sendo galactose, glicose e arabinose/ramnose os principais componentes das
amostras.
- A maioria das proteínas da farinha desengordurada de soja foi extraída em solução
salina e a solução alcalina extraiu a maior quantidade de proteínas do concentrado
protéico e das fibras de cotilédones. Na eletroforese dos quatro ingredientes
alimentares derivados de soja foi constatada a presença das proteínas majoritárias,
96
β-conglicinina e glicinina, além de bandas com peso molecular próximo aos 30KDa
nas fibras dos cotilédones, sendo provavelmente glicoproteínas de parede celular,
ricas em hidroxiprolina.
- As condições ideais de hidrólise das fibras dos cotilédones de soja foram
determinadas para obter a maior solubilização de carboidratos e proteínas. Foi
utilizada 200µL/g de carboidrase durante 12 horas sob agitação a 30ºC e 150µL/g de
protease durante 5 horas sob agitação a 55ºC.
- A fração sólida das fibras hidrolisadas com carboidrase apresentou maior
quantidade de proteínas e aumento nas propriedades de hidratação. A fração
solúvel teve 73% dos carboidratos e 50% dos ácidos urônicos da quantidade inicial
das amostras.
- A protease foi capaz de solubilizar 54% do total das proteínas, produzindo uma
fração sólida contendo 76% de fibras alimentares totais, e uma fração solúvel com
peptídeos de peso molecular menor que 10KDa e com uma banda de peso
molecular próximo aos 25KDa.
- As micrografias das fibras mostraram que a amostra micronizada é constituída por
partículas menores em relação à original. A estrutura física da fibra original
hidrolisada com protease ficou mais porosa superficialmente do que a fibra
micronizada e as amostras hidrolisadas com carboidrase apresentaram uma
estrutura mais compactada.
97
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADEYEYE, E.I.; AROGUNDADE, L.A.; AKINTAYO, E.T.; AISIDA, O.A.; ALAO, P.A.
Calcium, zinc and phytate interrelationships in some foods of major consumption in
Nigeria. Food Chemistry, v.71, p.435-441, 2000.
ANDERSON, R.L.; HAMILTON, C.C.; HORN, J.L.; SPENCER, D.B.; DILLON, D.W.;
ZEIGLER, J.A. Metabolic effects on insoluble oat fiber on lean men with type II
diabetes. Cereal Chemistry, v.68, n.3, p.291-294, 1991.
ANDERSON, J.W.; SMITH, B.M.; WASHNOCK, C.S. Cardiovascular and renal
benefits of dry bean and soybean intake. The American Journal of Clinical
Nutrition, v. 70, n. 3, p. 464S-474S, 1999.
ANDERSON, R.L., WOLF, W.J. Compositional changes in Trypsin inhibitors, phytic
acid, saponins and isoflavones related to soybean processing. The Journal of
Nutrition, v.125, p.581S-588S, 1995.
AOAC. Official Methods of Analysis. Association of Official Analytical Chemist,
16.ed. v. I e II. 1995.
ASP, N.G. Dietary carbohydrates: classification by chemistry and physiology. Food
Chemistry, v.57, n.1, p.9-14, 1996.
AUFFRET, A.; RALET, M.C.; GUILLON, F.; BARRY, J.L.; THIBAULT, J.F. Effect of
grinding and experimental conditions on the measurement of hydration properties of
dietary fibres. LWT, v.27, p.166-172, 1994.
AVERYHART-FULLARD, V.; DATTA, K.; MARCUS, A. A hydroxyproline-rich protein
in the soybean cell wall. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.85, p.1082-1085, 1988.
BARNES, S.; KIRK, M.; COWARD, L. Isoflavones and their conjugates in soy foods:
extraction conditions and anlysis by HPLC – Mass Spectrometry. Journal of
Agriculture and Food Chemistry, v.42, p.2466-2474, 1994.
BETANCUR-ANCONA, D.; PERAZA-MERCADO, G.; MOGUEL-ORDOÑEZ, Y.;
FUERTES-BLANCO, S. Physicochemical characterization of lima bean (Phaseolus
lunatus) and jack bean (Canavalia ensiformis) fibrous residues. Food Chemistry,
p.1-9, 2003.
BRETT, C.T.; WALDRON, K.W. The molecular components o the wall. In: BRETT,
C.T.; WALDRON, K.W. Physiology and Biochemistry of Plant Cell Walls. 2.ed.
London: Chapman & Hall, 1996. p.5-43.
BRILLOUET, J.M.; CARRÉ, B. Composition of cell walls from cotyledons of Pisum
Sativum, Vicia Faba and Glycine Max. Phytochemistry, v.22, n.4, p.841-847, 1983.
BROUNS, F. Soya isoflavones: a new and promising ingredient for the health foods
sector. Food Research International, v.35, p.187-193, 2002.
98
CADDEN, A.M. Comparative effects of particle size reduction on physical structure
and water binding properties of several plant fibers. Journal of Food Science, v.52,
n.6, p.1595-1599, 1987.
CASSAB, G.I.; VARNER, J.E. Cell wall proteins. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant
Mol. Biol, v.39, p.321-353, 1988.
CHAMBÔ FILHO, A.; CHAMBÔ, D.; CHAMBÔ, F. A soja como alimento funcional em
ginecologia. Revista Brasileira de Nutrição Clínica, v.15, n.2, p.326-329, 2000.
CHANG, M.C.; MORRIS, W.C. Effect of heat treatments on chemical analysis of
dietary fiber. Journal of Food Science, v.55, n.6. p.1647-1650, 1990.
CHAU, C.F.; CHEUNG, C.K. Functional properties of flours prepared from three
chinese indigenous legume seeds. Food Chemistry, v.61, n.4, p.429-433, 1998.
CHAU, C.F.; CHEUNG, C.K.; WONG, Y.S. Functional properties of protein
concentrates from three chinese indigenous legume seeds. Journal of Agriculture
and Food Chemistry, v.45, p.2500-2503.1997.
CHAVAN, U.D.; McKENZIE, D.B.; SHAHIDI, F. Protein classification of beach pea
(Lathyrus maritimus L.). Food Chemistry, v.75, p.145-153, 2001.
CHEN, J.Y.; PIVA, M.; LABUZA, T.P. Evaluation of water binding capacity (WBC) of
food fiber sources. Journal of Food Science, v.49, p.59-63. 1984.
CHEN, P.S.; TORIBARA, T.Y.; WARNER, R.N. Microdetermination of phosphorus.
Anal. Chem, v.28, n.11, p.1786-1758, 1956.
CHERYAN, M. Phytic acid interactions in food systems. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, v.14. n.4. p.297-335, 1980.
CHOU, D.H.; MORR, C.V. Protein-water interactions and functional properties.
JAOCS, v.56, p.53A-62A, 1979.
COELHO, R.G. Interações nutricionais. Parte 1: Interações ao nível do trato
gastrointestinal. Revista de Metabolismo e Nutrição, v.3, n.2, p.106-117, 1995.
COWARD, L.; BARNES, N.C.; SETCHELL, K.D.R.; BARNES, S. Genistein, daidzein
and their β-glycoside conjugates: antitumor isoflavones in soybeanbean foods from
american and asian diets. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.41,
p.1961-1967, 1993.
CUTTER, E.G. Células e Tecidos – Parte 1. In: Anatomia Vegetal. 2ed. São Paulo
: Rocca. 1996.
DA-SILVA, R.; FRANCO, C.M.L.; GOMES, E. Pectinases, hemicelulases e celulases,
ação, produção e aplicação no processamento de alimentos: revisão. Boletim
SBCTA, v.31, n.2, p.249-260, 1997.
99
DUBOIS, M.; GILLES, K.A.; HAMILTON, J.K.; REBERS, P.A.; SMITH,F. Colorimetric
method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem, v.28,
p.350, 1956.
DUXBURY, D.D. Dietary fiber many sources, multi-functional. Food Processing,
p.136-139. 1991.
ELLIS, R.; KELSAY, J.L.; REYNOLDS, R.D.; MORRIS, E.R.; MOSER, P.B.;
FRAZIER, C.W. Phytate:zinc and phytate x calcium:zinc millimolar ratios in self –
selected diets of Americans, Asian Indians, and Nepalese. Journal of the American
Dietetic Association, v.87, p.1043-1047. 1987.
ERDMAN, J.W.; WEINGARTNER, K.E. Nutrition aspects of fiber in soya products.
JAOCS, p.511-514. 1981.
FERNÁNDEZ-QUINTELA, A.; LARRALDE, J.; MACARULLA, M.T.; MARCOS, R.;
MARTÍNEZ, J.A. Leguminosas y concentrados de proteína: nuevas perspectivas y
aplicaciones. Alimentaria, p.59-63. 1993.
FISCHER, M.; KOFOD, L.V.; SCHOLS, H.A.; PIERSMA, S.R.; GRUPPEN, H.;
VORAGEN, A.G.J. Enzymatic extractability of soybean meal proteins and
carbohydrates: heat and humidity effects. Journal of Agriculture and Food
Chemistry, v.49, p.4463-4469, 2001.
FRÜHBECK, G.; ALONSO, R.; MARZO, F.; SANTIDRIÁN, S. A modified method for
the indirect quantitative analysis of phytate in foodstuffs. Analytical Biochemistry,
v.225, n.2, p.206-212, 1995.
GARCIA, M.C.; MARINA, M.L.; LABORDA, F.; TORRE, M. Chemical characterization
of commercial soybean products. Food Chemistry, v.62, n.3, p.325-331, 1998.
GARCIA, M.C.; TORRE, M.; MARINA, M.L.; LABORDA, F. Composition and
characterization of soybean and related products. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, v.37, n.4, p.361-391, 1997.
GORDON, D.T. Functional properties vs physiological action of total dietary fiber.
Cereal Foods World, v.34, n.7, p.517-525, 1989.
GUILLON, F.; CHAMP, M. Structural and physical properties of dietary fibres, and
consequences of processing on human physiology. Food Research International,
v.33, p.233-245, 2000.
HEREDIA, A.; JIMENEZ, A.; GUILLEN, R. Composition of plant cell walls.
Zeitschrift fuer Lebensmittel Untersuchung und Forschung, v.200, p.24-31,
1995.
HONIG, D.H.; WOLF, W.J.; RACKIS, J.J. Phytic acid and phosphorus content of
various soybean protein fractions. Cereal Chemistry, v.61, n.6, p.523-526, 1984.
HUISMAN, M.M.H.; SCHOLS, H.A.; VORAGEN, A.G.J. Cell wall polysaccharides
from soybean (Glycine max) meal. Isolation and characterization. Carbohydrate
Polymers, v.37, p.87-95, 1998.
100
KARR-LILIENTHAL, L.K.; KADZERE, C.T.; GRIESHOP, C.M.; FAHEY Jr., G.C.
Chemical and nutritional properties of soybean carbohydrates as related to
nonruminants: A review. Livestock Production Science, v.97, p.1-12, 2005.
KINTNER, P.K.; VAN BUREN, J.P. Carbohydrate interference and its correction in
pectin analysis using the m-hydroxydiphenil method. Journal of Food Science,
v.47, p.756-764, 1982.
KLEIS-SAN FRANCISCO, S.M.; TIERNEY, M.L. Isolation and characterization of a
proline-rich cell wall protein from soybean seedlings. Plant Physiol, v.94, p.1897-
1902, 1990.
KOPLIK, R.; PAVELKOVÁ, H.; CINCIBUCHOVÁ, J.; MESTEK, O.; KVASNICKA, F.;
SUCHANEK, M. Fractionation of phosphorus and trace elements species in soybean
flour and common white bean seeds by size exclusion chromatography – inductively
coupled plasma mass spectrometry. Journal of Chromatography B, v.770, p.261-
273, 2002.
KUDOU, S.; FLEURY, Y.; WELTI, D.; MAGNOLATO, D.; UCHIDA, T.; KITAMURA,
K.; OKUBO, K. Malonil isoflavone glycosides in soybeans seeds (Glicine max Merrill).
Agriculture and Biological Chemistry, v.55, n.9, p.2227-2233, 1991.
KUMAR, R.; CHOUDHARY, V.; MISHRA, S.; VARMA, I.K.; MATTIASON, B.
Adhesives and plastics based on soy protein produts. Industrial Crops and
Products – an International Journal, v.16, p.155-172, 2002.
KURZER, M.S.; XU, X. Dietary phytoestrogens. Annual Review Nutrition, v.17,
p.353-381, 1997.
LAHL, W.J.; BRAUN, S.D. Enzymatic production of protein hydrolysates for food use.
Food Technology, p.68-71, 1994.
LEE, J.Y.; LEE, H.D.; LEE, C.H. Characterization of hydrolysates produced by mild-
acid treatment and enzymatic hydrolysis of defatted soybean flour. Food Research
International, v.34, p.217-222, 2001.
LEE, K.H.; RYU, H.S.; RHEE, K.C. Protein solubility characteristics of commercial
soy protein products. JAOCS, v.80, n.1, p.85-90, 2003.
LIU, K. Soybeans: Chemistry, Technology and Utilization. New York: Chapman &
Hall, 1997. 531p.
LÓPEZ, G.; ROS, G.; RINCON, F.; PERIAGO, M.J.; MARTÍNEZ, M.C.; ORTUÑO, J.
Relationship between physical and hydration properties of soluble and insoluble fiber
of artichoke. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v.44, p.2773-2778,
1996.
LOWRY, O. H. et al. Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal
Biological Chemistry, v.193, p.265-275, 1951.
LUSAS, E.W.; RIAZ, M.N. Soy protein products: processing and use. The Journal
of Nutrition, v.125, n.3S, p.573-580, 1995.
101
MÄLKKI, Y. Physical properties of dietary fiber as keys to physiological functions.
Cereal Foods World, v.46, n.5, p.196-199, 2001.
MARSMAN, G.J.P.; GRUPPEN, H; MUL, A.J.; VORAGEN, A.G.J. In vitro
accessibility of untreated, toasted, and extruded soybean meals for proteases and
carbohydrases. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v.45, p.4088-4095,
1997.
MARTINS, T.R. Efeito do tratamento alcalino associado à extrusão nas
propriedades funcionais da fibra de cotilédone de soja. 1995. Dissertação
(Mestrado em Ciência de Alimentos). Universidade Estadual de Londrina.
Londrina/PR.
MARUYAMA,N.; FUKUDA, T.; SAKA, S.; INUI, N.; KOTOH, J.; MIYAGAWA, M.;
HAYASHI, M.; SAWADA, M.; MORIYAMA, T.; UTSUMI, S. Molecular and structural
analysis of electrophoretic variants of soybean seed storage proteins.
Phytochemistry, v.64, p.701-708, 2003.
McDOUGALL, G.J.; MORRISON, I.M.; STEWART, D.; HILLMAN, J.R. Plant cell
walls as dietary fibre: range, structure, processing and function. J. Sci. Food Agric.,
v.70, p.33-150, 1996.
MESSINA, M. Soy and breast cancer risk. The Soy Connection, v.7, n.1, p.1-7.
1999.
MULLIN, W.J.; XU, W. A study of the intervarietal differences of cotyledon and seed
coat carbohydrates in soybeans. Food Research International, v.33, p.883-891,
2000.
NEVEN, L. Isoflavones – na overview of benefits for health and market. Agro Food
Industry Hi-Tech, p.39-41, 1998.
OATWAY, L.; VASANTHAN, T; HELM, J.H. Phytic Acid. Food Reviews
International, v.17, n.4, p.419-430, 2001.
ONWELUZO, J.C.; ONUOHA, K.C; OBANU, Z.A. A comparative study of some
functional properties of Afzelia africana and Glycine max flours. Food Chemistry,
v.54, p.55-59. 1995.
OUHIDA,I.; PÉREZ, J.F.; GASA, J. Soybean (Glycine max) cell wall composition and
availability to feed enzymes. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v.50,
p.1933-1938, 2002.
PADILLA, F.C.; ALVAREZ, M.T.; ALFARO, M.J. Functional properties of barinas nut
flour (Caryodendron orinocense Karst., Euphorbiaceae) compared to those of
soybean. Food Chemistry, v.57, n.2, p.191-196, 1996.
PEARSON, A.M. Soy Proteins. In: HUDSON, B.J.F. Developments in Food
Proteins. London: Applied Science, 1982, v.2. p.67-108.
PLAAMI, S. Myoinositol Phosphates: Analysis, Content in Foods and Effects in
Nutrition. LWT, v.30, p.633-647. 1997.
102
PRINYAWIWATKUL, W.; BEUCHAT, L.R.. McWATTERS, K.H.; PHILLIPS, R.D.
Functional properties of cowpea (Vigna unguiculata) flour as affected by soaking,
boiling, and fungal fermentation. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v.45,
n.2, p.480-486. 1997.
RIAZ, M.N. Uses and benefits of soy fiber. Cereal Foods World, v.46, n.3, p.98-
100. 2001.
RIBLETT, A.L.; HERALD, T.J.; SCHMIDT, K.A.; TILLEY, K.A. Characterization of β-
conglycinin and glycinin soy protein fractions from four selected soybean genotypes.
Journal of Agriculture and Food Chemistry, v.49, p.4983-4989, 2001.
ROEHRIG, K.L. The physiological effects of dietary fiber – a review. Food
Hydrocolloids, v.2, n.1, p.1-18, 1988.
SALINAS, R.D. Fibras e Nutrição. In: Alimentos e Nutrição. Introdução à
Bromatologia. 3 ed. Porto Alegre : Artmed. 2002, p.182-187.
SATHE, S.K.; LILLEY G.G.; MASON, A.C.; WEAVER, C.M. High-resolution sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis of soybean (Glycine max L.) seed
proteins. Cereal Chemistry, v.64, n.6, p.380-384. 1987.
SCHNEEMAN, B.O. Dietary fiber: physical and chemical properties, methods of
analysis, and physiological effects. Food Technology, p.104-110. 1986.
SELVENDRAN, R.R.; O’NEILL, M.A. Isolation and analysis of cell walls from plant
material. Methods of Biochemical Analysis, v.32, p.25-153, 1987.
SETCHELL, K.D.R. Phytoestrogens: the biochemistry, physiology and implications
for human health of soy isoflavones. The American Journal of Clinical Nutrition,
v.68, p.1333S-1346S, 1998.
SGARBIERI, V.C. Deterioração e Modificações Químicas, Físicas e Enzimáticas de
Proteínas. In: Proteínas em Alimentos Protéicos – Propriedades, Degradações e
Modificações. São Paulo : Varela. 1996, p.387-517.
SGARBIERI, V.C. Propriedades funcionais de proteínas em alimentos. Boletim da
SBCTA, v.32, n.1, p.105-126, 1998.
SHOWALTER, A.M. Structure and functions of plant cell wall proteins. The Plant
Cell, v.5, p.9-23, 1993.
SLAVIN, J. Nutritional benefits of soy protein and soy fiber. Perspectives in
Practice, v.91, n.7, p.816-819, 1991.
SONG, T.; BARUA, K.; BUSEMAM, G.; MURPHY, P.A. Soybean isoflavone analysis:
quality control and a new internal standard. The American Journal of Clinical
Nutrition, v.68, p.1474S-1479S, 1998.
SOUZA, G.; VALLE, J.L.E.; MORENO, I. Efeitos dos componentes da soja e seus
derivados na alimentação humana. Boletim SBCTA, v.34, n.2, p.61-69, 2000.
103
STOMBAUGH, S.K.; JUNG, H.G.; ORF, J.H.; SOMERS, D.A. Genotypic and
environmental variation in soybean seed cell wall polysaccharides. Crop Science,
v.40, p.408-412, 2000.
STOMBAUGH, S.K.; ORF, J.H.; JUNG, H.G.; SOMERS, D.A. Relationships between
soybean seed cell wall polysaccharides, yield, and seed traits. Crop Science, v.43,
p.571-576, 2003.
THAKUR, B.R.; SINGH, R.K.; HANDA, A.K. Chemistry and uses of pectin – a
review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v.37, n.1, p.47-73, 1997.
THARANATHAN, R.N.; MAHADEVAMMA, S. Grain legumes – a boon to human
nutrition. Trends in Food Science & Technology, v.14, p.507-518, 2003.
THEANDER, O.; WESTERLUND, E.; AMAN, P. Structure and components of dietary
fiber. Cereal Foods World, v.38, n.3, p.135-141, 1993.
THIBAULT, J.F.; LAHAYE, M.; GUILLON, F. Physico-chemical properties of food
plant cell wall. In: SCHEIZER, T.; EDWARDS, C.A. Dietary Fibre: a component of
food: nutritional function in health and disease. Berlin: Springer-Verlag, 1992.
p.21-39.
THOMPSON. D.B.; ERDMAN, J.W. Phytic acid determination in soybeans. Journal
of Food Science, v. 47, n. 2, p. 513-517, 1982.
TOCKMAN, J. Capitalizing on increasing consumer interest in soy protein. Cereal
Foods World, v.47. n.5. p.172-174. 2002.
TORRE, M.; RODRIGUEZ, R.; SAURA-CALIXTO, F. Effects of dietary fiber and
phytic acid on mineral availability. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,
v.1, n.1, p.1-22, 1991.
TSUKAMOTO, C.; SHIMADA, S.; IGITA, K.; KUDOU, S.; KOKUBUN, M.; OKUBO,
K.; KITAMURA, K. Factors affecting isoflavones content in soybean seeds: changes
in isoflavones, saponins and compsition of fatty acids at different temperatures during
seed development. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v.43, p.1184-
1192, 1995.
TSUMURA, K.; SAITO, T.; TSUGE, K.; ASHIDA, H.; KUGIMIYA, W.; INOUYE, K.
Functional properties of soy protein hydrolysates obtained by selective proteolysis.
LWT, 38, p.255-261, 2005.
WALDRON, K.W.; PARKER, M.L.; SMITH, A.C. Plant cell walls and food quality.
Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, v.2, p.101-119, 2003.
WANG, H.; MURPHY, P.A. Isoflavone content in commercial soybean foods. Journal
of Agriculture and Food Chemistry, v.42, p.1666-1673, 1994.
WOESSNER, J.F., The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples
containing small proportions of this amino acid. Arch. Biochem. Biophys, v.93,
p.440-447, 1961.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
