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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Caracterização sorológica, molecular e patogênica de isolados de
Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson agente causal da
escaldadura da cana de açúcar.
Mariana de Souza e Silva
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Agronomia. Área de concentração:
Fitopatologia.
Piracicaba
2005
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Mariana de Souza e Silva
Engenheiro Agrônomo
Caracterização sorológica, molecular e patogênica de isolados de Xanthomonas
albilineans (Ashby) Dowson agente causal da escaldadura da cana de açúcar.
Orientador:
Prof. Dr. IVAN PAULO BEDENDO
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Agronomia. Área de concentração:
Fitopatologia.
Piracicaba
2005
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Silva, Mariana de Souza e
Caracterização sorológica, molecular e patogêncica de isolados de Xanthomonas
albilineans (Ashby) Dowson agente causal escaldadura da cana de açúcar / Mariana de
Souza e Silva. - - Piracicaba, 2005.
60 p. : il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2005.
1. Cana-de-açucar 2. Escaldura da folha 3. Patogenicidade 4. Reação em cadeia por
polimerase 5. Variação genética em planta I. Título
CDD 633.61
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
Aos meus pais, José Antônio e Fátima,
pelo amor, apoio e confiança que
permitiram meu crescimento
como ser humano, DEDICO.
Ao meu irmão Gustavo,
ao meu marido Ricardo
e ao meu filho Matheus
OFEREÇO.
4
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo força concedida nos momentos de desânimo e decepção, tornando
possível a conclusão deste trabalho;
Ao Prof. Dr. Ivan Paulo Bedendo, pela preciosa orientação, pela confiança,
dedicação e incentivo;
Ao Centro de Tecnologia Canavieira (CTC) pela gentileza de fornecer o material
de cana-de-açúcar, para condução dos testes propostos neste trabalho;
A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo-FAPESP, pela
concessão da bolsa de mestrado, destinada à realização deste trabalho;
A todos os funcionários e professores do Setor de Fitopatologia da ESALQ/USP,
pelo companheirismo e amizade;
As minhas amigas Raquel e Marisa pelos bons momentos juntas;
Aos meus amigos do Laboratório de Fitopatologia do CTC, Celma, Cristina,
Georgete, Irani, Noemia, Thatiane, Sabrina, Silvana, Antonio, Vicente, Marcos, Rubens
e Álvaro pelo bom convívio, amizade e respeito;
A todos os amigos dos demais laboratórios do Setor de Fitopatologia da
ESALQ/USP e do Centro de Tecnologia Canavieira, que contribuíram para a realização
deste trabalho;
Obrigada
5
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS................................................................................................... 7
LISTA DE TABELAS................................................................................................... 12
RESUMO..................................................................................................................... 13
ABSTRACT.................................................................................................................. 14
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 15
2 DESENVOLVIMENTO.............................................................................................. 16
2.1 Revisão de Literatura............................................................................................ 16
2.1.1 A cana-de-açúcar............................................................................................... 16
2.1.2 O patógeno......................................................................................................... 16
2.1.3 Hospedeiros alternativos.................................................................................... 17
2.1.4 Importância da doença....................................................................................... 17
2.1.5 Sintomatologia.................................................................................................... 19
2.1.6 Transmissão da bactéria.................................................................................... 20
2.1.7 Métodos de detecção e identificação da bactéria.............................................. 21
2.1.8 A resistência varietal no controle da escaldadura.............................................. 23
2.2 Material e Métodos................................................................................................ 25
2.2.1 Amostragem de plantas...................................................................................... 25
2.2.2 Obtenção dos isolados de X. albilineans............................................................ 27
2.2.3 Teste sorológico DOT-BLOT.............................................................................. 28
2.2.4 Extração de DNA de X. albilineans para testes moleculares............................. 29
2.2.4.1 Extração de DNA para detecção da bactéria por PCR................................... 29
2.2.4.2 Extração de DNA para caracterização molecular dos isolados por rep-PCR. 29
2.2.4.3 Detecção de X. albilineans por PCR............................................................... 30
2.2.4.4 Caracterização dos isolados por rep-PCR...................................................... 31
2.2.4.5 Caracterização dos isolados por RFLP........................................................... 32
2.2.5 Teste de patogenicidade para isolados de X. albilineans.................................. 33
2.3 Resultados e Discussão........................................................................................ 35
2.3.1 Teste sorológico DOT-BLOT.............................................................................. 35
2.3.2 Detecção de X. albilineans por PCR.................................................................. 36
6
2.3.3 Caracterização dos isolados por rep-PCR ........................................................ 38
2.3.4 Caracterização dos isolados por RFLP.............................................................. 47
2.3.5 Teste de patogenicidade.................................................................................... 50
3 CONCLUSÕES........................................................................................................ 55
REFERÊNCIAS........................................................................................................... 56
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Detecção e identificação isolados de X. albilineans em caldo de 52
amostras de cana-de-açúcar exibindo sintomas típicos de
escaldadura, coletadas nas regiões de Piracicaba/SP, Jaú/SP e
Ribeirão Preto/SP. Colunas (de cima para baixo): 1)- isolados de 1-8;
2)- isolados de 9-16; 3)- 17-24; 4)- isolados de 25-32; 5)- isolados de
33-40; 6)- isolados de 41-48; 7)- isolados de 49-52, respectivamente
e os controles são as quatro últimas amostras: cultura pura de X.
albilineans, solução tampão PBST, caldo de xilema de planta de
cana infectada e caldo de xilema de planta de cana infectada diluído
1:10....................................................................................................... 36
Figura 2 - Identificação de isolados de X. albilineans obtidos a partir de
amostras sintomáticas de cana-de-açúcar com escaldadura,
coletadas em Piracicaba, utilizando Bio-PCR com primers
específicos. GEL 1- Colunas: 1)- Marcador molecular pGEM; 2)-
Controle positivo; 3)- Controle negativo; colunas de 4 a 14)- isolados
de 1-11, respectivamente; 15)- pGEM. GEL 2- Colunas: 1)- pGEM;
2)- Controle positivo; 3)- Controle negativo; colunas de 4 a 21)-
isolados de 12-27, respectivamente; 22)- água; 23)- Marcador
molecular pGEM................................................................................... 37
Figura 3 - Identificação de isolados de X. albilineans obtidos a partir de
amostras sintomáticas de cana-de-açúcar com escaldadura,
coletadas em Jaú, utilizando Bio-PCR com primers específicos.
Colunas: 1)- Marcador pGEM; 2)- Controle positivo; 3)- Controle
negativo; 4 a 16)- isolados de 28-40, respectivamente....................... 38
Figura 4 - Identificação de isolados de X. albilineans obtidos a partir de
amostras sintomáticas de cana-de-açúcar com escaldadura,
8
coletadas em Ribeirão Preto, utilizando Bio-PCR com primers
específicos. Colunas: 1)- Marcador molecular pGEM; 2)- Controle
positivo; 3)- Controle negativo; 4 a 13)- isolados de 41-52,
respectivamente.................................................................................... 38
Figura 5 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de
DNA de isolados de Xanthomonas albilineans coletados na região de
Piracicaba, através de PCR usando primer BOX. Coluna: 1)-
marcador 1Kb; 2 ao 13)- isolado 1-12, respectivamente; 14)-
marcador 1Kb........................................................................................ 40
Figura 6 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de
DNA de isolados de Xanthomonas albilineans coletados na região de
Piracicaba, através de PCR usando primer BOX. Coluna: 1)-
marcador 1Kb; 2 a 16)- isolados de 13-27, respectivamente; 17)-
marcador 1Kb........................................................................................ 41
Figura 7 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de
DNA de isolados de Xanthomonas albilineans coletados na região de
Jaú, através de PCR usando primer BOX. Coluna: 1)- marcador 1Kb;
2 a 14)- isolados de 28-40, respectivamente; 15)- marcador
1Kb......................................................................................................... 41
Figura 8 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de
DNA de isolados de Xanthomonas albilineans coletados na região de
Ribeirão Preto, através de PCR usando primer BOX. Coluna: 1)-
marcador 1Kb; 2 a 14)- isolados de 41-52 respectivamente; 15)-
marcador 1Kb........................................................................................ 41
Figura 9 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de
DNA de isolados de Xanthomonas albilineans coletados na região de
9
Piracicaba, através de PCR usando primer REP. Coluna: 1)-
marcador 1Kb; 2 ao 13)- isolado 1-12, respectivamente; 14)-
marcador 1Kb........................................................................................ 42
Figura 10 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de
DNA de isolados de Xanthomonas albilineans coletados na região de
Piracicaba, através de PCR usando primer REP. Coluna: 1)-
marcador 1Kb; 2 a 16)- isolados de 13-27, respectivamente; 17)-
marcador 1Kb........................................................................................ 42
Figura 11 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de
DNA de isolados de Xanthomonas albilineans coletados na região de
Jaú, através de PCR usando primer REP. Coluna: 1)- marcador 1Kb;
2 a 14)- isolados de 28-40, respectivamente; 15)- marcador 1Kb......... 42
Figura 12 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de
DNA de isolados de Xanthomonas albilineans coletados na região de
Ribeirão Preto, através de PCR usando primer REP. Coluna: 1)-
marcador 1Kb; 2 a 14)- isolados de 41-52 respectivamente; 15)-
marcador 1Kb........................................................................................ 43
Figura 13 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de
DNA de isolados de Xanthomonas albilineans coletados na região de
Piracicaba, através de PCR usando primer ERIC. Coluna: 1)-
marcador 1Kb; 2 ao 13)- isolado 1-12, respectivamente; 14)-
marcador 1Kb........................................................................................ 43
10
Figura 14 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de
DNA de isolados de Xanthomonas albilineans coletados na região de
Piracicaba, através de PCR usando primer ERIC. Coluna: 1)-
marcador 1Kb; 2 a 16)- isolados de 13-27, respectivamente; 17)-
marcador 1Kb........................................................................................ 44
Figura 15 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de
DNA de isolados de Xanthomonas albilineans coletados na região de
Jaú, através de PCR usando primer ERIC. Coluna: 1)- marcador 1Kb;
2 a 14)- isolados de 28-40, respectivamente; 15)- marcador
1Kb......................................................................................................... 44
Figura 16 - Figura 16 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de
fragmentos de DNA de isolados de Xanthomonas albilineans
coletados na região de Ribeirão Preto, através de PCR usando
primer ERIC. Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2 a 14)- isolados de 41-52
respectivamente; 15)- marcador 1Kb.................................................... 45
Figura 17 - Dendrograma construído com o índice de Similaridade de Dice e pelo
critério de agrupamento UPGMA com o emprego dos primers BOX,
REP e ERIC........................................................................................... 46
Figura 18 - Perfis eletroforéticos obtidos pela digestão com a enzima AluI de
fragmentos de DNA amplificado pelo par de primers PGBL1/PGBL2.
Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2)- isolado 8; 3)- isolado 11; 4)- isolado
27; 5)- isolado 29; 6)- isolado 40; 7)- isolado 41; 8)- isolado 47; 9)-
isolado 51; 10)- marcador 1Kb.............................................................. 48
Figura 19 - Perfis eletroforéticos obtidos pela digestão com a enzima BamHI de
fragmentos de DNA amplificado pelo par de primers PGBL1/PGBL2.
Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2)- isolado 8; 3)- isolado 11; 4)- isolado
11
27; 5)- isolado 29; 6)- isolado 40; 7)- isolado 41; 8)- isolado 47; 9)-
isolado 51; 10)- marcador 1Kb.............................................................. 49
Figura 20 - Perfis eletroforéticos obtidos pela digestão com a enzima EcoRI de
fragmentos de DNA amplificado pelo par de primers PGBL1/PGBL2.
Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2)- isolado 8; 3)- isolado 11; 4)- isolado
27; 5)- isolado 29; 6)- isolado 40; 7)- isolado 41; 8)- isolado 47; 9)-
isolado 51; 10)- marcador 1Kb.............................................................. 49
Figura 21 - Perfis eletroforéticos obtidos pela digestão com a enzima HaeIII de
fragmentos de DNA amplificado pelo par de primers PGBL1/PGBL2.
Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2)- isolado 8; 3)- isolado 11; 4)- isolado
27; 5)- isolado 29; 6)- isolado 40; 7)- isolado 41; 8)- isolado 47; 9)-
isolado 51; 10)- marcador 1Kb.............................................................. 50
Figura 22 - Reação de plantas de cana-de-açúcar, pertencentes às variedades
SP 78 5495 (V1) e SP 78 4467 (V2), inoculadas com isolados de X.
albilineans amostrados em diferentes regiões do estado de São
Paulo. A inoculação de cada isolado se constituiu em um tratamento
(T). A avaliação foi feita aos 90 dias após a inoculação, através de
uma escala de notas variável de 1-5, de acordo com a intensidade
crescente de sintomas observados nas plantas.................................... 52
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Relação dos isolados de X. albilineans, obtidos de amostras de
plantas coletadas em três regiões do Estado de São Paulo................ 25
Tabela 2 - Escala de notas para avaliação de sintomas de escaldadura
ocasionados por Xanthomonas albilineans em plantas de cana-de-
açúcar................................................................................................... 34
Tabela 3 - Reação de plantas de cana-de-açúcar da variedade SP 78 4467
inoculada com isolados de X. albilineans coletados em três regiões
do estado de São Paulo. A inoculação de cada isolado representou
um tratamento (T). A avaliação foi feita aos 90 dias após a
inoculação, através de uma escala de notas variável de 1-5, de
acordo com a intensidade crescente de sintomas observados nas
plantas................................................................................................... 53
13
RESUMO
Caracterização sorológica, molecular e patogênica de isolados de Xanthomonas
albilineans (Ashby) Dowson agente causal da escaldadura da cana de açúcar.
A escaldadura das folhas, causada por Xanthomonas albilineans, é uma
importante doença da cana-de-açúcar, a qual interfere no rendimento e na longevidade
de plantas infectadas. A intensidade de doença é variável, especialmente em relação a
fatores climáticos e variedades cultivadas. A quantificação de danos é difícil de ser feita
através de observações de plantas no campo. O uso de variedades resistentes tem sido
eficiente para controle da doença, mas a diversidade do patógeno pode promover a
quebra desta resistência. Em campos comerciais localizados no Estado de São Paulo,
tem sido observado que a mesma variedade de cana é resistente à escaldadura em
uma região, mas suscetível em outra. Este tipo de comportamento tem sugerido a
ocorrência de variantes de X. albilineans que podem ser responsáveis pela quebra da
resistência das variedades cultivadas. Seria relevante determinar a ocorrência de
variabilidade para este patógeno dentro do estado de São Paulo, pois esta informação
seria útil para indicação de variedades para as diferentes regiões e para orientar
programas de melhoramento visando a obtenção de variedades resistentes. Com base
nestas considerações, o objetivo do presente estudo foi investigar a diversidade
genética de isolados coletados em áreas comerciais, usando técnicas moleculares
como PCR, rep-PCR, RFLP e testes de patogenicidade. Os resultados mostraram que
todos os isolados de plantas que exibiam sintomas de escaldadura eram pertencentes à
espécie X. albilineans. Ainda, foi possível determinar a ocorrência de diversidade
genética e variabilidade patogênica entre os isolados amostrados nas diferentes
regiões. Os resultados obtidos no presente trabalho podem contribuir para novas
investigações visando confirmar a associação da quebra da resistência de variedades
com a variabilidade do patógeno.
Palavras chave: Caracterização; DOT-BLOT; PCR; Patogenicidade; RFLP
14
ABSTRACT
Sorologica, molecular and pathogenic characterization of isolates of
Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson causal agent of the escaldadura of the
sugarcane.
Leaf scald, caused by Xanthomonas albilineans, is an important disease of
sugarcane, That can interfere on the yield and longevity of infected plants. The disease
intensity is variable, especially according to climate factors and cultivated varieties, and
the damage quantification is very difficult through observation of plants in the field.
Resistant varieties has been efficient to disease control, but the pathogen diversity can
promote the breakdow of resistance. In commercial fields located in São Paulo State
has been observed that the same sugarcane variety is resistant to leaf scald in a region,
but susceptible in another one. This kind of behavior has suggested the occurrence of
strains of X. albilineans that can be responsible for the breakdow of resistance of the
cultivated varieties. It would be relevant to determinate pothogen variability in São Paulo
State, because that information would be useful to indicate varieties for different regions
and to guide breeding programs to obtain resistant varieties. Based upon the above
points, the objective of the present study was to investigate the genetic diversity of
bacterial isolates collected in commercial areas, using molecular techniques as PCR,
rep-PCR, RFLP, and pathogenicity assays. The results showed that all isolates from
plants exhibiting typical leaf scald symptoms belonged to species X. albilineans. It was
also possible to determinate the occurrence of genetic diversity and pathogenic
variability among the isolates sampled in the distinct regions. Thus, the results obtained
in the present study can contribute to new investigations to confirm the association of
the breakdow of resistance with the variability of the pathogen.
Keywords: Characterization; DOT-BLOT; PCR; Pathogenicity; RFLP
15
1 INTRODUÇÃO
A cana-de-açúcar tem importância econômica relevante para a agricultura
desenvolvida no Estado de São Paulo. A escaldadura vem sendo apontada como uma
das principais doenças da cultura, causando perdas significativas na produção. A forma
mais adequada de se controlar a doença é através do uso de variedades resistentes, as
quais têm se mostrado eficientes para essa finalidade. No entanto, dentro do Estado de
São Paulo, algumas variedades têm se apresentado como resistentes em algumas
regiões e suscetíveis em outras, evidenciando que a bactéria X. albilineans pode estar
apresentando variabilidade. Evidências semelhantes têm sido relatadas em outros
locais fora do Brasil. O conhecimento sobre a diversidade deste patógeno pode
contribuir tanto para a recomendação diferenciada de variedades de cana para plantio
nas diversas regiões do Estado de São Paulo, como para direcionar programas de
melhoramento visando a obtenção de variedades resistentes.
Com base nestas considerações, o presente trabalho de pesquisa teve como
objetivos:
- demonstrar a diversidade genética de isolados de X. albilineans coletados em
campos comerciais localizados no Estado de São Paulo
- correlacionar a diversidade genética dos isolados da bactéria com sua
patogenicidade
- relacionar a diversidade genética do patógeno com sua distribuição geográfica
dentro do Estado de São Paulo
- comprovar a presença de X. albilineans em plantas de cana-de-açúcar exibindo
sintomas típicos de escaldadura.
16
2 DESENVOLVIMENTO
2.1 Revisão de Literatura
2.1.1 A cana-de-açúcar
A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) originou-se no sudeste da Ásia, onde é
cultivada desde épocas remotas (AGROBYTE, 2002). Atualmente, encontra-se
disseminada numa extensa área, apresentando melhor comportamento nas regiões
tropicais em razão da ocorrência de duas estações distintas: uma quente e úmida para
melhor germinação e perfilhamento e outra mais fria e seca para favorecer a maturação
e acúmulo de sacarose nos colmos (ALVAREZ et al., 1995). A importância dessa
cultura pode ser atribuída à sua múltipla utilização, sendo principalmente empregada
como matéria prima para a produção de açúcar e álcool (AGROBYTE, 2002).
Sendo uma cultura de grande importância econômica, a cana-de-açúcar tem sido
muito estudada quanto aos aspectos produtivos. As doenças se constituem num dos
principais fatores que limitam o rendimento da cultura, sendo que mais de 100 doenças
já foram identificadas (RAMALLO et al., 2000). Dentre elas, carvão, mosaico,
escaldadura das folhas, raquitismo e ferrugem são consideradas as mais importantes,
pois seus danos são altamente significativos.
2.1.2 O patógeno
Wilbrink (1920) e North (1926) (DAVIS et al., 1997) foram os primeiros a
demonstrar que a bactéria Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson invade o xilema
causando a escaldadura das folhas.
A doença pode ser encontrada em praticamente todas as regiões do mundo onde
a planta é cultivada (DAVIS et al. 1997), causando sérios prejuízos econômicos, como
diminuição da produtividade, necessidade de reforma precoce dos canaviais e queda de
qualidade do caldo (ROTT e DAVIS, 1997; DAVIS et al., 1997; BIRCH, 2001,
JAUFEERALLY-FAKIM et al., 2000).
A bactéria apresenta a forma de bastonete reto, medindo 0,25-0,30 x 0,6-1,0µm,
tendo sua mobilidade promovida por um único flagelo polar, é gram-negativa, aeróbia e
apresenta crescimento lento (BIRCH, 2001). As células bacterianas podem ocorrer de
17
forma isolada ou formando cadeias, dando origem a colônias amarelas, brilhantes,
convexas, de bordos lisos, viscosas, sendo seu crescimento favorecido por
temperaturas variáveis de 25 a 28ºC (BIRCH, 2001).
2.1.3 Hospedeiros alternativos
Além da cana-de-açúcar, seu principal hospedeiro, X. albilineans infecta
naturalmente milho-doce, bambu, sorgo selvagem, capim-colonião, capim-elefante e
algumas outras gramíneas, como Brachiaria piligera, Imperata cylindrica, Paspalum sp.,
Rottboellia cochinchinensis (MARTIN e ROBINSON, 1961). Particularmente, a bactéria
pode sobreviver em Imperata cylindrica por um longo período de tempo e,
conseqüentemente, esta espécie pode atuar como fonte de inóculo. Em geral, quando
essas gramíneas estão infectadas, somente exibem faixas estreitas nas folhas ou o
sintoma mais característico que é a estria branca (BIRCH, 2001).
2.1.4 Importância da doença
A escaldadura das folhas foi i
18
No Brasil, a importância da escaldadura tem sido subestimada, devido aos erros
de identificação e à confusão com danos causados pelo raquitismo da soqueira
(CASAGRANDE et al., 1997). Quando a doença se manifesta em variedades
extremamente suscetíveis, pode causar 100% de perdas por queima completa das
folhas e morte dos colmos, no entanto, mesmo variedades comerciais que apresentam
certa tolerância podem ser portadoras do patógeno (DAVIS et al., 1997).
A severidade e importância da doença variam grandemente de um país para
outro, dentro do mesmo país e surtos esporádicos da doença, após longos períodos de
ausência, não são incomuns (JAUFEERALLY-FAKIM et al., 2000, ALVAREZ et al.,
1995). Diferenças na suscetibilidade das variedades ao patógeno tem sido notada tanto
entre como dentro de países, sendo esse fenômeno atribuído a fatores ambientais,
variabilidade do patógeno ou mesmo reação das variedades cultivadas (ROTT e
DAVIS, 1997).
Na Austrália, observações sobre a disseminação da escaldadura mostraram que
a doença é favorecida por estações úmidas. Os danos causados pela doença parecem
ser influenciados pelas condições ambientais prevalecentes durante os estágios de
maturação da safra. Estresse imposto pela seca, encharcamento e baixas temperaturas
podem contribuir para aumentar a severidade da escaldadura (BIRCH, 1980).
Variações nas características do patógeno têm sido sugeridas como a causa das
diferenças na severidade da doença e reações varietais (ALVAREZ et al., 1995).
Variação no tamanho da colônia, mudança na forma da célula em culturas de X.
albilineans foram notadas já em 1926 (ROTT e DAVIS, 1997). Birch (1980) demonstrou
que isolados que apresentavam colônias de crescimento lento ou colônias pequenas
eram mais agressivos.
Comparação da reação varietal em diferentes países sugere que “patótipos” de
X. albilineans devem existir. A variedade B34104 se constituiu em bom exemplo, pois
foi caracterizada como altamente suscetível na Guiana, mas, resistente nas Ilhas
Maurício (ROTT e DAVIS, 1997).
Birch (1980) observou que os sintomas da escaldadura encontrados no Hawai
eram muito menos severos que aqueles observados na Austrália. Comparando isolados
desses dois países, não se encontrou variação nas características do patógeno, o que
19
levou à conclusão de que a variação de severidade poderia estar relacionada a
características das variedades ou a fatores climáticos. No entanto, há indicações da
existência de “patótipos” da bactéria dentro de um mesmo país, evidenciadas por um
surto epidêmico de escaldadura em duas variedades relatadas como resistentes, nas
Ilhas Maurício em 1964 (ROTT e DAVIS, 1997).
O grau de suscetibilidade de uma variedade e a proporção de variedades
suscetíveis em uma área são importantes fatores determinantes da incidência e
severidade da escaldadura. No passado, ocorreram sérias perdas onde variedades
altamente suscetíveis eram cultivadas em extensas áreas (MARTIN e ROBINSON,
1961). A troca das variedades altamente suscetíveis por tolerantes foi muito efetiva na
redução de perdas diretas causadas pela escaldadura.
2.1.5 Sintomatologia
A expressão dos sintomas e sua severidade estão associados com o nível de
resistência da variedade cultivada, condições ambientais e agressividade do patógeno
(LOPES et al., 2001).
As plantas atacadas pela bactéria da escaldadura podem apresentar três formas
de infecção, ou seja, latente, crônica e aguda, dificultando a identificação da doença
(TOKESHI, 1980).
A forma latente é impossível de ser reconhecida no campo, pois a planta infectada
não apresenta sintomas. Na crônica, o hospedeiro apresenta vários tipos de sintomas
externos, sendo o mais típico a presença de uma fina estria branca de 1 a 2 mm de
largura, paralela à nervura central, muitas vezes estendendo-se por toda a folha.
Internamente, no colmo, observa-se descoloração do xilema na região nodal,
estendendo-se até o entrenó. Na forma aguda, a estria pode ser mais larga, se
estendendo até a bainha e o limbo foliar, podendo originar clorose parcial ou total. A
morte de gema apical pode provocar uma excessiva brotação lateral nos colmos
adultos, diminuindo o tamanho dos mesmos, provocando murcha e possível morte das
plantas afetadas (CASAGRANDE et al., 1997).
Os colmos podem apresentar estrias vermelhas em seu interior, devido à necrose
dos vasos, sendo mais comum nas regiões dos nós, no entanto, quando as condições
20
edafoclimáticas são muito favoráveis ao desenvolvimento da planta, pode ocorrer o
desaparecimento completo desses sintomas, mesmo em variedades mais suscetíveis
(CASAGRANDE et al., 1997). Segundo Martin e Robinson (1961), muitas variedades
podem permanecer assintomáticas ou com sintomas pouco aparentes por longos
períodos, de maneira que a doença é notada apenas quando atinge o ponto crítico, ou
seja, folhas com estrias mais largas e uma excessiva brotação lateral dos colmos.
O efeito maior de doença é verificado nas soqueiras, onde podem ocorrer
grandes falhas de plantio, especialmente em épocas secas (TOKESHI, 1980).
Geralmente, o sintoma agudo ocorre em variedades suscetíveis, intolerantes ou com
resistência intermediária, em condições extremamente favoráveis ao patógeno.
2.1.6 Transmissão da bactéria
O agente causal da escaldadura das folhas é transmitido principalmente por
toletes infectados ou mecanicamente por ferramentas cortantes (ROTT e DAVIS, 1997;
SAUMTALLY, et al., 1995). Algumas variedades de cana-de-açúcar conseguem se
desenvolver mesmo que estejam infectadas pela bactéria, não demonstrando nenhum
sintoma visual e, por isso, essas plantas representam importantes fontes de inóculo.
(JAUFEERALLY-FAKIM et al., 2000). Toletes contaminados são um importante meio de
disseminação da bactéria a longas distâncias. O patógeno pode ser disseminado na
colheita pelos facões de corte e colheitadeiras mecânicas, pois uma vez contaminado o
instrumento de corte, a bactéria pode ser espalhada para várias touceiras. A
contaminação por facão ou máquina ocorre mais rapidamente em rebentos jovens que
são feridos por cima da gema apical (CASAGRANDE et al., 1997).
As facas de corte das colheitadeiras de cana têm o potencial de espalhar o
patógeno de maneira similar aos facões de corte (CASAGRANDE et al., 1997).
21
2.1.7 Métodos de detecção e identificação da bactéria
Diferentes técnicas têm sido usadas para demonstrar a presença da bactéria nos
tecidos do hospedeiro, bem como sua variabilidade. São exemplos os testes de ELISA
(“enzime-linked immunosorbent assay”) usados por Irey e Comstock (1991), método da
imunofuorescência dos tecidos, descrito por Leóville e Coleno (1976), isolamento em
meio sólido seletivo desenvolvido por Davis et al. (1994), com base no meio sólido de
Wilbrink e a técnica de RFLP (“restriction fragment length polymorphisms”), empregada
por Rott e Davis (1996), Alvarez et al. (1996), Davis et al. (1997). No entanto, merece
destaque a técnica de PCR (polymerase chain reaction), a qual vem obtendo grande
sucesso quando usada para diagnósticos de doenças em plantas. O PCR permite a
detecção da bactéria X. albilineans mesmo quando esta encontra-se presente em
baixas concentrações nos tecidos vegetais. Primers desenvolvidos para X. albilineans
mostraram ser altamente específicos para a detecção e a identificação da bactéria, em
relação a outras espécies bacterianas para as quais foram testados (PAN et al., 1999).
A técnica rep-PCR tem sido muito útil para fins de determinação da identidade
genômica das bactérias, pelo uso de primers de DNA (REP, ERIC E BOX-PCR)
correspondentes aos elementos repetitivos que ocorrem no genoma bacteriano (LOPES
et al., 1998; LOWS et al., 1994). A técnica permite distinguir estirpes relacionadas,
conhecer as relações filogenéticas existentes entre estirpes e estudar a diversidade da
bactéria em diferentes ecossistemas. Seqüências repetitivas de nucleotídeos se
encontram distribuídas ao acaso no genoma de praticamente todas as bactérias e
podem servir como locais para anelamento de primers para amplificação genômica de
DNA (VERSALOVIC et al. 1991; 1994; de BRUIJN 1992). Muitas famílias de seqüências
repetitivas já foram identificadas em genomas de diversas espécies bacterianas. Três
famílias de seqüências repetitivas têm sido bem estudadas, ou seja, uma seqüência
repetitiva extragênica palindrômica 35-40 bp (REP); uma seqüência consensual
intergênica repetitiva enterobacteriana 124-127 bp (ERIC) e o elemento 154 bp BOX
(VERSALOVIC et al. 1994). Essas seqüências parecem estar localizadas em posições
intergênicas distintas em volta de todo o cromossomo. Os elementos repetitivos devem
estar presentes nas duas orientações do cromossomo e primers de PCR foram
desenhados para leitura de repetições invertidas em REP e ERIC e para a sub-unidade
22
boxA do BOX (VERSALOVIC et al. 1994). O uso desses primers leva à amplificação
seletiva de regiões genômicas distintas localizadas entre seqüências REP, ERIC ou
BOX. Os protocolos correspondentes são referidos como REP-PCR, ERIC-PCR e BOX-
PCR, ou rep-PCR coletivamente (VERSALOVIC et al. 1991; 1994). As bandas
amplificadas têm tamanhos diferenciados, gerando, no gel de eletroforese, padrões de
identidade que lembram códigos de barra, análogos aos códigos UPC usados em lojas
de conveniência e que funcionam como uma assinatura para estirpes específicas de
bactérias (VERSALOVIC et al. 1994).
A ocorrência e a variabilidade de X. albileneans têm sido relatadas em diversos
trabalhos conduzidos com as diferentes técnicas de detecção e identificação. Assim,
Permaul e colaboradores, citados por Jaufeerally-Fakim et al., (2000), constataram
variabilidade em cinco isolados da bactéria através de amplificações obtidas com
primers. Wang et al., (1998) compararam cinco métodos de detecção e concluíram que
o PCR foi o mais sensível e específico dos métodos testados, permitindo separar X.
albileneans de outras bactérias consideradas contaminantes.
Para o melhoramento genético de variedades visando a incorporação de
resistência, há interesse de se conhecer a diversidade da população bacteriana
envolvida na interação patógeno-hospedeiro, pois as populações dos microrganismos
podem variar geneticamente, dependendo da região geográfica. Em um trabalho
realizado para caracterizar X. albilineans ocorrente em Mauritius, Jaufeerally-Fakim et
al., (2000) compararam isolados de Mauritius com outros originários do Brasil, Florida,
Guadalupe, Taiwan, África do Sul e Austrália, através de técnicas moleculares. A
diversidade genética entre os isolados foi demonstrada através do PCR e da
hibridização do DNA com sonda molecular. Como resultado, os isolados do Brasil,
alguns da Florida, Guadalupe, Taiwan e Mauritius produziram uma banda de 5 kb na
hibridização; isolados do Sul da África e outros da Florida produziram bandas de 5.2 kb;
isolados da Austrália e outros da Florida, mostraram bandas de 7 kb, demonstrando a
diversidade existente no patógeno. Uma investigação sobre a variabilidade genética
presente em X. albilinenas, Davis et al., (1996) analisaram 218 isolados coletados em
diversos países e obtiveram 54 padrões distintos, inclusive com diferenças na
patogenicidade entre isolados. Lopes et al., (1998)
utilizaram na identificação de X.
23
albilineans testes de patogenicidade em milho doce, sistema metabólico Biolog e rep-
PCR. O método Biolog permitiu a identificação do patógeno em 31% dos casos, porém
os melhores resultados foram conseguidos com a aplicação dos testes de
patogenicidade usando milho doce e com PCR. A técnica de PCR permitiu a obtenção
de resultados em algumas horas, contribuindo para uma rápida diagnose da
escaldadura das folhas da cana-de-açúcar.
2.1.8 A resistência varietal no controle da escaldadura
A forma mais apropriada para controlar a doença é a utilização de variedades
resistentes, porém a quebra dessa resistência têm sido relatada em diferentes países,
causando grandes problemas. A quebra de resistência pode estar relacionada com a
variabilidade do patógeno, inviabilizando o controle através do emprego de variedades
resistentes (ROTT e DAVIS, 1995).
No Brasil, há várias evidências da ocorrência de variabilidade em X. albilineans,
pois variedades comerciais de cana-de-açúcar consideradas resistentes e cultivadas
em diferentes regiões estão desenvolvendo os sintomas da doença. Nas áreas
plantadas com estas variedades, a doença vem causando danos à cultura, resultando
em prejuízos ao agricultor. Esta evidência se torna ainda mais clara para o caso de
determinadas variedades se mostrarem resistentes à doença em algumas regiões e
muito suscetíveis em outras áreas de plantio, dentro do Estado de São Paulo
(CASAGRANDE, M.V. e MORAES, V.A./ Centro de Tecnologia Canavieira
(Piracicaba/SP), comunicação pessoal, 2003).
Recentes quebras de resistência em variedades comerciais na Florida,
Guadalupe, República Dominicana, México, Louisiana e Mauritius (ROTT et al., 1997;
SAUMTALLY et al.,1995) são fortes indícios da diversidade desta bactéria (MOHAMED
et al., 1996). No caso específico da Florida, a quebra de resistência tem sido atribuída à
introdução de um variante de X. albilineans (ROTT at al., 1997), porém esta hipótese
ainda não foi definitivamente comprovada. Situação similar tem sido registrada em
material de cana cultivado em Mauritius (ROTT e DAVIS, 1995).
A variabilidade entre isolados de X. albilineans tem sido identificada através da
caracterização de morfologia de células e colônias, análise de proteínas totais, técnicas
24
serológicas e moleculares (ROTT e DAVIS, 1995). No entanto, a correlação entre essas
características e patogenicidade não trouxe resultados conclusivos quando se avaliou
isolados originários de regiões diversas. A variabilidade do patógeno pode se constituir
num fator limitante da produção de cana, além de trazer sérios problemas para o
desenvolvimento de variedades resistentes (DAVIS et al., 1996). Assim, o
conhecimento sobre a diversidade do patógeno se constitui num ponto chave para se
promover o manejo da doença (JAUFEERALLY-FAKIM et al., 2000).
25
2.2 Material e Métodos
2.2.1 Amostragem de plantas
Amostras foram coletadas em três regiões do Estado de São Paulo nos anos de
2003 e 2004. Um total de 52 amostras foram obtidas, sendo 27 da região de Piracicaba,
12 da área canavieira de Ribeirão Preto e 13 de lavouras instaladas na região de Jaú
(Tabela 1).
As amostras foram constituídas por colmos que apresentavam sintomas visíveis
da doença, tais como colmos com presença de folhas secas e brotações laterais;
colmos com folhas secas, porém sem brotações laterais; e colmos que exibiam folhas
com sintoma de bandeira branca. Os colmos sintomáticos foram coletados
aleatoriamente nas parcelas, de acordo com as condições das gemas, sendo
escolhidas aquelas de melhor aparência para posterior plantio em campo experimental.
O material coletado nos campos comerciais foi trazido para o laboratório de
Fitopatologia do Centro de Tecnologia Canavieira (CTC), localizado em Piracicaba/SP.
Os colmos foram picados em minitoletes e suas gemas plantadas em bandejas,
contendo como substrato duas partes de torta de filtro e uma de composto Plantmax
(Eucatex). As ferramentas utilizadas foram constantemente flambadas para a execução
dos cortes, para evitar a contaminação das amostras. As mudas foram produzidas em
casa de vegetação e após 3 meses de plantio, foram transplantadas para o campo
experimental, com o objetivo de manter o inóculo.
Tabela 1 - Relação dos isolados de X. albilineans, obtidos de amostras de plantas coletadas em três
regiões do Estado de São Paulo
(continua)
Número do
isolado
Número CTC Variedade Procedência
1 1 Cruz 96-234 CTC – Piracicaba
2 17 Cruz 96-234 CTC – Piracicaba
3 24 Cruz 96-234 CTC – Piracicaba
4 31 Cruz 96-234 CTC – Piracicaba
5 39 Cruz 96-234 CTC – Piracicaba
6 45 Cruz 96-234 CTC – Piracicaba
26
Tabela 1 - Relação dos isolados de X. albilineans, obtidos de amostras de plantas coletadas em três
regiões do Estado de São Paulo
(continuação)
Número do
isolado
Número CTC Variedade Procedência
7 59 Cruz 96-234 CTC – Piracicaba
8 63 Cruz 96-234 CTC – Piracicaba
9 65 Cruz 96-234 CTC – Piracicaba
10 72 Cruz 96-234 CTC – Piracicaba
11 74 Cruz 96-234 CTC – Piracicaba
12 75 Cruz 96-234 CTC – Piracicaba
13 76 Cruz 96-234 CTC – Piracicaba
14 88 Cruz 96-234 CTC – Piracicaba
15 90 Cruz 96-234 CTC – Piracicaba
16 CP CP 44-101 CTC – Piracicaba
17 D SP 80-1842 CTC – Piracicaba
18 F SP 93-3503 CTC – Piracicaba
19 G F 11-23 CTC – Piracicaba
20 H F 11-27 CTC – Piracicaba
21 I F 12-11 CTC – Piracicaba
22 J F 12-13 CTC – Piracicaba
23 K F 12-16 CTC – Piracicaba
24 L F 12-23 CTC – Piracicaba
25 M F 12-33 CTC – Piracicaba
26 R F 24-25 CTC – Piracicaba
27 T SP 84-5560 CTC – Piracicaba
28 P SP 90-1107 CTEJ – Jaú
29 Q SP 78-5495 CTEJ – Jaú
30 6
CTC 93-199 X SP 83-
5073
CTEJ – Jaú
31 9 SP 78-5495 CTEJ – Jaú
32 10 SP 81-3250 CTEJ – Jaú
33 11
CTC 93-199 X SP 80-
3280
CTEJ – Jaú
34 12
CTC 93-199 X SP 80-
3280
CTEJ – Jaú
35 13
SP 91-1049 X RB 85-
5536
CTEJ – Jaú
36 14
CTC 93-199 X SP 83-
5073
CTEJ – Jaú
37 15
SP 90-3723 X SP 80-
3280
CTEJ – Jaú
38 21 SP 91-1049 CTEJ – Jaú
27
Tabela 1 - Relação dos isolados de X. albilineans, obtidos de amostras de plantas coletadas em três
regiões do Estado de São Paulo
(conclusão)
Número do
isolado
Número CTC Variedade Procedência
39 22
CTC 93-199 X SP 83-
5073
CTEJ – Jaú
40 23 Q 170 CTEJ – Jaú
41 S SP 90-1644 Usina São Carlos (Ribeirão Preto)
42 U SP 92-4230
Usina Santo Antônio AB (Ribeirão
Preto)
43 V SP 91-1049
Usina São João Dedini (Ribeirão
Preto)
44 X SP 94-3172 Usina Nova Aliança (Ribeirão Preto)
45 Z SP 91-1301 Usina Iturama (Ribeirão Preto)
46 B RB 85-5536 Usina Iturama (Ribeirão Preto)
47 C SP 92-4394 Usina Iturama (Ribeirão Preto)
48 E RB 72-454 Usina Iturama (Ribeirão Preto)
49 16 SP 91-1049
Usina Sto Antonio AB (Ribeirão
Preto)
50 18 SP 91-3629 Usina São Luiz AS (Ribeirão Preto)
51 19 SP 80-1842 Usina São Carlos (Ribeirão Preto)
52 20 SP 91-3629 Usina São Luiz AS (Ribeirão Preto)
2.2.2 Obtenção dos isolados de X. albilineans
Para o isolamento da bactéria adotou-se a metodologia descrita por Wang et al.
(1999). A partir de cada amostra foi retirada a parte basal dos colmos, sendo o material
centrifugado para extração da seiva do xilema. Os toletes foram descascados com uma
faca, colocados em tubos do tipo “Falcons” de 50 mL e centrifugados a 3000 rpm por 15
minutos. Após a centrifugação, o caldo obtido foi riscado, com o auxílio de uma alça de
platina, em meio seletivo contido em placa de Petri. O meio usado foi o XAS (DAVIS et
al., 1994), composto por 10g de sacarose, 5g de bactopeptona, 0.5g de K
2
HPO
4,
0.25g
de MgSO
4
.7H
2
O, 0.05g de Na
2
SO
3
, 5g de KBr, 0.002g de benomyl, 15g de agar para
um volume final de 1 litro de água destilada. O pH foi ajustado para 6 e o meio
esterilizado a 1 atmosfera de pressão por 20 minutos. Os antibióticos ciclohexamida
(0.1g), cefalexina (0.025g), novobiocina (0.03g) e kasugamicina (0.05g) foram
dissolvidos em 100ml de água destilada, filtrados em um filtro de 0.22µm e adicionados
28
ao meio após a autoclavagem. Os isolados foram identificados após 5 dias de
incubação a 28°C, no escuro.
A identificação da bactéria foi feita com base na taxa de crescimento, na
pigmentação e morfologia das colônias, sendo as colônias típicas mantidas em glicerol
a -80°C para uso nos experimentos programados. A lista de isolados esta presente na
Tabela 1.
2.2.3 Teste sorológico DOT-BLOT
A condução do teste sorológico foi feita com base nos procedimentos descritos por
Davis et al. (1994), com algumas modificações. Uma alíquota de 100µL de suspensão
bacteriana foi transferida para uma membrana de nitrocelulose (BioAgency; 0,45um).
Após a aplicação das amostras e controles, saturou-se a membrana em PBST 5% por
30 minutos e, posteriormente, incubou-se a membrana em antissoro (1:10000),
específico para X. albilineans por 60 minutos.
Após a incubação, a membrana foi lavada 3 vezes por 3 minutos com PBST.
Incubada novamente com anticorpo IgG em PBST (6µL/20mL) por 60 minutos e
posteriormente, lavada 3 vezes com PBST por 3 minutos.
A coloração da membrana foi feita incubando-a por 30 minutos em solução
substrato (20mL) misturado com corante “fast-blue” (0,020g) e MgCl
2
0,1M (100µL).
Lavou-se 1 vez com PBST e incubou-se por 15 minutos em solução de hipoclorito de
sódio 30%. Após a incubação, a membrana foi lavada com H
2
O e deixada secar ao ar.
O resultado do teste foi considerado positivo quando a amostra apresentou coloração
azulada.
Os controles utilizados neste teste foram: cultura pura de X. albilineans, solução
tampão PBST, caldo puro de cana de planta infectada e caldo de cana de planta
infectada diluído 1:10.
29
2.2.4 Extração de DNA de X. albilineans para testes moleculares
2.2.4.1 Extração de DNA para detecção da bactéria por PCR
A extração foi processada segundo a metodologia utilizada por Davis et al.
(1998). Para cada isolado, foi usado um volume aproximado de 0,5 mL de extrato de
caldo de cana, sendo o mesmo centrifugado a 6.000rpm por 10 minutos para obtenção
de um pellet. Ao pellet foi acrescentado 0,5mL de meio Wilbrink, sendo as amostras
levadas para incubação a 28
o
C, no escuro por 2 dias, sob agitação para que ocorresse
a multiplicação da bactéria.
Após o período de incubação, cada amostra foi centrifugada a 2.500rpm por 10
minutos. Uma alíquota de 0.5mL do sobrenadante foi diluída com 1 mL de água
deionizada e destilada, e centrifugada a 6.000rpm por 15 minutos. Posteriormente, foi
descartado o sobrenadante e o pellet re-suspendido em 1 mL de TAE (0.04 M Tris-
acetato; 1.0mM de EDTA pH 8.0) e centrifugado novamente a 6.000rpm por 15 minutos.
Após o descarte do sobrenadante, o pellet foi coberto com 0.5mL de TAE ajustado com
0.4% de “skim milk”. As amostras foram incubadas a 100°C por 10 minutos, em seguida
em gelo seco/álcool por 3 minutos, novamente a 100°C por 3 minutos e em gelo
seco/álcool por 3 minutos. Após esta etapa as amostras foram armazenadas a -80°C.
2.2.4.2 Extração de DNA para caracterização molecular dos isolados por rep-PCR
Neste caso foi adotada a metodologia descrita por Alsubel et al. (1992). Cerca de
1.5mL da cultura da bactéria com crescimento saturado foi centrifugada a 10.000rpm
durante 2 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet re-suspendido em 567µL
de TE (1mL de Tris 1M pH 7.5, 200µL de EDTA 0.5M pH 8.0, completando com H
2
O
para 100mL) mais 30µL de SDS 10% e 3µL de proteinase K 20mg/mL (concentração
final de 100µg/mL). A amostra foi incubada por 1 hora a 37°C. Após esse período,
adicionou-se à amostra 100µL de NaCl 5M e 80µL de CTAB 10% (10g de CTAB 10%,
14mL de NaCl 5M, completando com H
2
O para 100mL), incubando-se a mesma por 10
minutos a 65°C. Foi adicionado 800µL de clorofórmio/álcool isolamílico (24:1,
respectivamente), centrifugando a amostra por 5 minutos a 12.000rpm.
30
A fase superior foi removida para outro tubo de microcentrífuga e adicionado igual
volume de clorofórmio/álcool isolamílico (24:1), centrifugando novamente por 5 minutos
a 10.000rpm. O sobrenadante foi transferido para outro tubo e adicionado 2 V de etanol.
A mistura foi mantida à -20°C durante 2 horas, centrifugando após esse período por 5
minutos a 12.000rpm, à temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e o pellet
lavado com 600µL de etanol 70%. Nova centrifugação a 10.000rpm foi feita durante 5
minutos, à temperatura ambiente.
O sobrenadante foi removido e o pellet lavado com 300µL de etanol 100% e
centrifugado a 10.000rpm durante 5 minutos, à temperatura ambiente. Após a secagem,
o pellet foi dissolvido em 50µL de 1/10 de TE + Rnase e mantido à -20°C.
2.2.4.3 Detecção de X. albilineans por PCR
A reação de PCR foi conduzida de acordo com os procedimentos descritos por
Pan et al. (1999). Uma alíquota de 2.5µL de DNA extraído de cada amostra foi
adicionada a uma mistura composta por: 2.5µL de tampão 10X PCR (Gibco BRL), 1.0µL
de MgCl
2
(50mM), 1.0µL de cada primer (30 pmol/µL), 100µM de cada dNTP, 0.2µL de
Taq DNA polymerase (5U/µL), totalizando um volume final de reação de 25µL. Para
amplificação foram usados os primers específicos PGBL1: 5’- CTT TGG GTC TGT AGC
TCA GG – 3’ e PGBL2: 5’- GCC TCA AGG TCA TAT TCA GC – 3’ (PAN et al., 1999). A
reação foi processada em termociclador com uma etapa inicial a 95°C por 5 minutos
para completa desnaturação do DNA molde, posteriormente 35 ciclos com etapas de 45
segundos a 94°C, 30 segundos a 42°C (para o anelamento), 30 segundos a 72°C (para
a extensão do primer) e uma etapa final de extensão a 72°C por 2 minutos.
A amplificação foi analisada através de eletroforese em gel de agarose 1%,
contendo 0.04µg/µL de brometo de etídio, visualizado em transiluminador de
ultravioleta. Foram considerados como resultados positivos as amostras que
apresentaram no gel fragmentos de DNA, visualizados na forma de bandas,
correspondentes a 350pb.
31
Como padrão positivo foi usado o DNA extraído de planta de cana-de-açúcar
sabidamente doente, enquanto o padrão negativo foi representado pelo DNA de planta
assintomática e pela água deionizada. O marcador molecular utilizado foi o PGEM.
2.2.4.4 Caracterização dos isolados por rep-PCR
Após a extração do DNA genômico da bactéria, foi feito um teste rápido para
quantificação do DNA presente nas amostras, usando-se um gel a 0.8% de agarose
contendo 0.04µg/mL de brometo de etídio. Para cada amostra foi colocado 1µL do DNA
extraído, 9µL de água esterilizada, 2µL de tampão de carregamento “blue juice”, num
volume final da amostra de 12µL. As amostras foram aplicadas no gel e submetidas à
eletroforese por 1 hora e meia a 80volts em tampão TBE 0.5X. Após a corrida, a
visualização foi feita em luz ultravioleta, através da observação da presença de
fragmentos de DNA, na forma de bandas. Em função da intensidade de cada banda foi
feita a estimativa da quantidade de DNA contida em cada amostra.
Após a quantificação, o DNA de cada o isolado bacteriano foi submetido à reação
de rep-PCR para caracterização molecular, buscando-se identificar polimorfismo entre
os fragmentos amplificados, seguindo-se o protocolo descrito por Lopes et al. (1998),
com algumas modificações. A ocorrência de polimorfismo demonstra a variabilidade
existente entre os diversos isolados.
Os primers utilizados nas reações foram (LOUWS et al., 1994; VERSALOVIC et
al., 1994):
- ERIC (ERIC1R [5’- ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C – 3’] e
- ERIC2 [5’- AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G – 3’]);
- BOX (BOXA1R [5’- CTA CGG CAA – GGC GAC GCC TGA CG – 3’]) e;
- REP (REP1R – I [5’- III ICG ICG ICA TCI GGC – 3’]) e;
- REP2 – I [5’- ICG ICT TAT CIG GCC TAC – 3’])
Cada reação foi processada utilizando um volume final de 25µL, contendo para o
PCR BOX 14.8µL de água esterilizada; 2.5µL de tampão10X PCR; 1.0µL de MgCl
2
50Mm; 1.5µL de dNTP 10mM; 4.0µL do primer BOX (solução 5 pmol/µL); 0.2µL de
Amplitaq 5U/µL e 1.0µL de DNA da amostra. Para os PCRs ERIC e REP: 10.8µL de
água esterilizada; 2.5µL de tampão10X PCR; 1.0µL de MgCl
2
50mM; 1.5µL de dNTP
32
10mM; 4.0µL de cada primer ERIC, ERIC2, REP, REP2 (solução 30 pmol/µL); 0.2µL de
Amplitaq 5U/µL e 1.0µL de DNA da amostra.
A amplificação foi realizada em termociclador utilizando os seguintes ciclos: um
ciclo inicial a 95°C por 7 minutos; 30 ciclos compostos por etapas de 94°C por 1 minuto,
de 44°C, 52°C e 53°C por 1 minuto com os primers REP, ERIC e BOX,
respectivamente,e de 65°C por 8 minutos; um ciclo final de extensão a 65°C por 15
minutos.
O produto amplificado pelo PCR foi mantido a 4°C, sendo uma alíquota de 5µL do
produto separada para eletroforese em gel de agarose 1.5% em tampão TBE 0.5X por
14 horas a 10 volts, sendo posteriormente fotografado sob luz UV.
Os fragmentos gerados pela amplificação foram identificados de acordo com o
peso molecular de cada um, assim recebendo a denominação de 1 (um) quando
presentes e 0 (zero) quando ausentes. Um dendrograma foi obtido por meio de análise
de matriz de similaridade gerada com a utilização do algoritmo UPGMA (Unweighted
pair group method with arithmetic mean) no programa NTSYS, utilizando o coeficiente
de similaridade de Jaccard.
2.2.4.5 Caracterização dos isolados por RFLP
Para a análise de RFLP, foi feita a digestão enzimática de fragmentos
amplificados pelos primers PGBL1 e PGBL 2, os quais amplificam a região espaçadora
16S-23S rDNA. As enzimas de restrição utilizadas foram AluI, BamHI, EcoRI e HaeIII,
sendo a digestão enzimática conduzida de acordo com as recomendações dos
fabricantes destas endonucleases.
A digestão foi feita usando-se 3,0µL do DNA amplificado de cada amostra, 1,5µL
de tampão específico para cada enzima, 0,5µL da enzima e 10µL de água. As amostras
foram incubadas à uma temperatura de 37°C por 12 horas.
Os produtos de digestão foram analisados através de eletroforese em gel de
agarose 3%, em função do tamanho dos fragmentos gerados pela digestão enzimática.
A eletroforese foi conduzida por 4 horas a 80volts em tampão 0,5XTBE. Após a
eletroforese foi feita a coloração do gel com brometo de etídio e visualização dos perfis
de banda em transiluminador de ultravioleta.
33
Os isolados analisados foram escolhidos dentro dos três grupos distintos
caracterizados pela técnica de rep-PCR, usando-se também como critério a
agressividade dos mesmos em relação às plantas de cana-de-açúcar mantidas no
campo. Assim, para o Grupo 1 foram escolhidos os isolados 8, 11, 27; para o Grupo 2,
os isolados 29, 40, 41, 51; e para o Grupo 3, o isolado 47.
2.2.5 Teste de patogenicidade para os isolados de X.albilineans
Com o objetivo de se constatar diferença na patogenicidade ou agressividade
dos isolados da bactéria, foi instalado um experimento em casa de vegetação,
utilizando-se duas variedades de cana-de-açúcar, SP 78 5495 e SP 78 4467, ambas
consideradas suscetíveis, sendo a segunda mais suscetível à escaldadura do que a
primeira.
Os isolados utilizados no teste de patogenicidade foram escolhidos com base
nos resultados obtidos na caracterização dos mesmos feita por rep-PCR. Assim, estes
isolados foram escolhidos dentre aqueles que constituíram cada um dos grupos
distintos obtidos pela análise dos resultados do teste de rep-PCR. Para a escolha
destes isolados também foi levada em consideração a agressividade dos mesmos,
observada em plantas de cana mantidas no campo. Assim, para o Grupo 1, no qual
foram agrupados os isolados da região de Piracicaba, foram escolhidos os isolados 8,
11, 27; para o Grupo 2, onde foram agrupados isolados da região de Jaú e Ribeirão
Preto, foram escolhidos, respectivamente, os isolados 29, 40, 41, 51; e para o Grupo 3,
composto por somente dois isolados de Ribeirão Preto, foi escolhido o isolado 47.
Plantas sadias das variedades SP 78 5495 e SP 78 4467, mantidas em viveiro,
forneceram os toletes para os testes de patogenicidade. Estes toletes foram inoculados
através do corte do colmo com facão, cuja lâmina foi mergulhada anteriormente em
caldo extraído de planta doente. Em seguida, estes toletes foram plantados em
substrato constituído por duas partes de torta de filtro e uma de composto Plantmax
(Eucatex), contido em bandejas de 28 células e mantidos em casa de vegetação. O
facão foi lavado com uma solução 0.2% de cloreto de benzalcônico em água e
flambado, a cada inoculação com os diferentes isolados.
34
No total, foram utilizados 1260 toletes ou gemas (45 caixas) para cada variedade
de cana, sendo usados 140 toletes de cada variedade (5 caixas) para cada tratamento.
Cada um dos isolados selecionados constitui um tratamento, sendo a testemunha
representada pela inoculação de caldo proveniente de planta sadia. A inoculação das
plantas foi feita com o caldo de planta infectada, pois de acordo com o pré-teste
realizado, este tipo de inóculo promoveu melhores resultados quanto à obtenção de
doença.
As avaliações do experimento foram realizadas aos 60 e 90 dias após a
inoculação. Os sintomas foram observados e atribuiu-se notas de 1 a 5, de acordo com
o grau de desenvolvimento dos mesmos. A escala empregada para avaliação está
apresentada na Tabela 2, sendo utilizada pelo Centro de Tecnologia Canavieira para a
avaliar a resistência de clones à escaldadura, no programa de melhoramento.
A análise estatística foi realizada com base nos dados obtidos na avaliação do
experimento feita aos 90 dias após a inoculação. O delineamento utilizado na instalação
do experimento foi o de blocos ao acaso, sendo os dados analisados pelo Teste F à 5%
de significância.
Tabela 2 - Escala de notas para avaliação de sintomas de escaldadura ocasionados por Xanthomonas
albilineans em plantas de cana-de-açúcar
(continua)
Nota Sintomas
1
Sem sintomas, folhas verdes e sem estrias, perfilhos e colmo principal
sem manchas cloróticas. Amarelecimento nas pontas das folhas
cortadas causado por dano mecânico.
2
Infecção localizada, aparecimento de manchas cloróticas no limbo
foliar das folhas velhas, no local onde foi feita a inoculação ou alguns
centímetros abaixo, sem o aparecimento de estrias ao longo das
folhas.
3
Aparecimento de estrias, presença de estrias brancas e finas ao longo
do limbo foliar ou manchas cloróticas no limbo foliar, no local onde foi
feita a inoculação ou alguns centímetros mais abaixo, com estrias
35
saindo da mancha e descendo por toda a folha.
4
Manchas cloróticas intensas no limbo foliar em estágio evoluído de
necrose (secamento do limbo), presença de estrias grossas e brancas
saindo das manchas e descendo pelo limbo. Amarelecimento geral
das folhas inoculadas.
5 Morte e seca do colmo onde ocorreu a inoculação.
(conclusão)
2.3 Resultados e Discussão
2.3.1 Obtenção dos isolados e teste sorológico DOT-BLOT
Todos os 52 isolados foram obtidos de plantas que apresentavam sintomas
característicos da doença, como estrias cloróticas e superbrotamento de colmos.
Os isolados provenientes das 52 amostras cresceram em meio de cultura seletivo
e a identificação da bactéria, feita com base na taxa de crescimento, pigmentação e
morfologia das colônias, demonstrou que todos eles eram característicos de X.
albilineans. Os resultados do teste serológico foram positivos para todos os isolados,
confirmando que o patógeno pertencia à espécie X. albilineans (Figura 1). A intensidade
da coloração azul, observada na membrana, variou de acordo com a concentração da
bactéria no caldo analisado, sendo mais intensa quando a concentração da bactéria era
maior na amostra. Para os controles também pode-se observar a coloração azulada,
quando positivos e, nenhuma coloração para o controle negativo composto pelo tampão
PBST. Resultados similares foram obtidos por Davis et al. (1994), quando foram
amostradas 27 plantas da cultivar CP 78-1247 plantada na Florida. Neste caso, os
isolados cresceram em meio seletivo para X. albilineans e o teste serológico aplicado
aos mesmos revelou resultados positivos, demonstrando que todos pertenciam a esta
espécie bacteriana.
36
Figura 1 - Detecção e identificação de isolados de X. albilineans em caldo de 52 amostras de cana-de-
açúcar exibindo sintomas típicos de escaldadura, coletadas nas regiões de Piracicaba/SP,
Jaú/SP e Ribeirão Preto/SP. Colunas (de cima para baixo): 1)- isolados de 1-8; 2)- isolados de
9-16; 3)- 17-24; 4)- isolados de 25-32; 5)- isolados de 33-40; 6)- isolados de 41-48; 7)- isolados
de 49-52, respectivamente e os controles são as quatro últimas amostras: cultura pura de X.
albilineans, solução tampão PBST, caldo de xilema de planta de cana infectada e caldo de
xilema de planta de cana infectada diluído 1:10
2.3.2 Detecção de X. albilineans por PCR
A partir de todos os isolados provenientes das 52 amostras submetidas ao teste
de PCR foram constatadas amplificações do fragmento alvo de DNA, quando se utilizou
os primers específicos PGBL1/PGBL2. As amplificações foram visualizadas, em gel de
agarose, na forma de bandas correspondentes a fragmentos de 350 pb (Figuras 2, 3 e
4). Fragmentos de 350pb também foram observados para amostra de planta
sabidamente doente e usada como controle positivo, no entanto, nenhuma amplificação
ocorreu para o DNA extraído de planta assintomática e quando a água foi usada no
lugar de DNA, nas reações de PCR. Estes resultados confirmaram que todos os
isolados obtidos de amostras de plantas com sintomas de escaldadura eram
pertencentes à espécie X. albilineans.
37
A amplificação de um fragmento genômico de aproximadamente 350pb, obtido
para os isolados usados neste ensaio, corresponde ao fragmento típico de X.
albilineans resultante do emprego dos primers PGBL1/PGBL2, como relatado para esta
espécie (PAN et al.,1999). A especificidade deste par de primer para identificação de X.
albilineans foi demonstrada quando o mesmo amplificou fragmentos genômicos de
350pb somente a partir de DNA extraído desta espécie, em comparação com outras
espécies bacterianas avaliadas (PAN et al.,1999). Os resultados positivos de PCR
confirmando que todos os isolados deste trabalho pertenciam à X. albilineans
complementam aqueles já revelados pelo isolamento em meio seletivo e pelo teste
sorológico. O emprego de PCR neste estudo para identificação de X. albilineans
demonstrou a utilidade da técnica para este finalidade, confirmando a validade da sua
aplicação como já relatado em outros trabalhos de mesma natureza (WANG et
al.,1998).
Figura 2 - Identificação de isolados de X. albilineans obtidos a partir de amostras sintomáticas de cana-
de-açúcar com escaldadura, coletadas em Piracicaba, utilizando Bio-PCR com primers
específicos. GEL 1- Colunas: 1)- Marcador molecular pGEM; 2)- Controle positivo; 3)- Controle
negativo; colunas de 4 a 14)- isolados de 1-11, respectivamente; 15)- pGEM. GEL 2- Colunas:
1)- pGEM; 2)- Controle positivo; 3)- Controle negativo; colunas de 4 a 21)- isolados de 12-27,
respectivamente; 22)- água; 23)- Marcador molecular pGEM
350pb
350pb
38
Figura 3 - Identificação de isolados de X. albilineans obtidos a partir de amostras sintomáticas de cana-
de-açúcar com escaldadura, coletadas em Jaú, utilizando Bio-PCR com primers específicos.
Colunas: 1)- Marcador pGEM; 2)- Controle positivo; 3)- Controle negativo; 4 a 16)- isolados de
28-40, respectivamente
Figura 4 - Identificação de isolados de X. albilineans obtidos a partir de amostras sintomáticas de cana-
de-açúcar com escaldadura, coletadas em Ribeirão Preto, utilizando Bio-PCR com primers
específicos. Colunas: 1)- Marcador molecular pGEM; 2)- Controle positivo; 3)- Controle
negativo; 4 a 13)- isolados de 41-52, respectivamente
2.3.3 Caracterização dos isolados por rep-PCR
A diversidade genética foi avaliada entre os 52 isolados de X. albilineans pela
comparação de haplótipos gerados por elementos repetitivos amplificados por rep-PCR.
O padrão eletroforético gerado pela amplificação destas seqüências conservadas e
repetitivas resultou em múltiplos produtos com variados tamanhos ou pesos
moleculares.
A análise dos padrões eletroforéticos obtidos revelou a ocorrência de diversidade
genética entre os isolados originários da região de Piracicaba, Jaú e Ribeirão Preto,
350pb
350pb
39
tanto para o primer BOX (Figuras 5, 6, 7 e 8) como para os pares de primers REP
(Figuras 9, 10, 11 e 12) e ERIC (Figuras 13, 14, 15 e 16).
Os haplótipos obtidos com os primers BOX, REP e ERIC foram analisados em
conjunto e permitiram reunir os 52 isolados em três grupos distintos. O Grupo 1 foi
constituídos por 27 isolados, todos coletados em Piracicaba. No grupo 2 foram reunidos
23 isolados: isolados 28 ao 40, obtidos em Jaú e os isolados 41 ao 46, 49 ao 52
coletados em Ribeirão Preto. No Grupo 3 foram reunidos somente 2 isolados (47 e 48),
ambos coletados em Ribeirão Preto.
Com o objetivo de relacionar a ocorrência de similaridade e diversidade genética
existentes entre os isolados de X. albilineans, independente da região de origem, foi
construída uma matriz de similaridade a partir do peso molecular dos fragmentos
produzidos pela amplificação obtida com os primers BOX, REP e ERIC. Na comparação
entre os padrões de banda de cada isolado, foi atribuído o número 1(um) para presença
de banda e o número 0 (zero) quando a banda estava ausente. Este tipo de avaliação
gerou uma tabela a partir da qual foi obtido um dendrograma (Figura 17), através do
programa de computador conhecido por NTSYS. A observação dos resultados
expressos pelo dendrograma permite identificar 3 grupos distintos, sendo que cada
grupo reúne isolados coletados em diferentes regiões geográficas do estado de São
Paulo, como já especificado anteriormente no texto. Ressalta-se que para os isolados
31 e 45 não ocorreu amplificação de fragmento e, portanto, estes isolados não foram
considerados na elaboração do dendrograma.
A análise dos resultados gerados pela aplicação da técnica de rep-PCR
demonstrou que há diversidade genética entre os isolados de X. albilineans coletados
no estado de São Paulo. Quando se procurou associar os grupos de isolados
determinados pelo rep-PCR com local de origem, foram observados aspectos
interessantes sobre a distribuição geográfica destes isolados. Assim, no Grupo 1 foram
agregados somente os isolados coletados em Piracicaba; no Grupo 2, todos os isolados
provenientes de Jaú e a maioria do isolados originários de Ribeirão Preto; e no Grupo 3,
somente dois isolados distintos de todos os demais e originários de Ribeirão Preto.
Portanto, a caracterização molecular revelou que a diversidade genética dos isolados
de X. albilineans apresenta uma certa relação com sua distribuição geográfica.
40
A variabilidade genética de X. albilineans também já foi constatada em outros
países, pesquisada em trabalhos que empregaram técnicas moleculares e sorológicas
para evidenciar esta característica presente no agente da escaldadura da cana-de-
açúcar. Variantes desta espécie foram identificados através do uso de anticorpos
monoclonais (ALVAREZ et al., 1996), enquanto pela aplicação de técnica molecular foi
demonstrada a ocorrência de variação genômica intra-específica (DAVIS et al., 1997).
Através da técnica de rep-PCR, foi encontrada similaridade genética entre 26 isolados
de X. albilineans, porém foi demonstrado que estes isolados eram distintos de isolados
pertencentes a outras espécies bacterianas e de outros isolados de bactérias não
identificadas ocorrentes na cana-de-açúcar (LOPES et al,1998). Esta mesma técnica
permitiu avaliar uma coleção de isolados de X. albilineans, revelando a existência de
uma relação entre diversidade genética dos isolados e área geográfica de origem dos
mesmos (LOPES, 1996).
Figura 5 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de DNA de isolados de
Xanthomonas albilineans coletados na região de Piracicaba, através de PCR usando primer
BOX. Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2 ao 13)- isolado 1-12, respectivamente; 14)- marcador 1Kb
3054pb
506pb
1018pb
41
Figura 6 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de DNA de isolados de
Xanthomonas albilineans coletados na região de Piracicaba, através de PCR usando primer
BOX. Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2 ao 16)- isolado 13-27, respectivamente; 17)- marcador 1Kb
Figura 7 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de DNA de isolados de
Xanthomonas albilineans coletados na região de Jaú, através de PCR usando primer BOX.
Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2 a 14)- isolados de 28-40, respectivamente; 15)- marcador 1Kb
Figura 8 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de DNA de isolados de
Xanthomonas albilineans coletados na região de Ribeirão Preto, através de PCR usando
primer BOX. Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2 a 14)- isolados de 41-52 respectivamente; 15)-
marcador 1Kb
3054pb
3054pb
3054pb
1018pb
1018pb
1018pb
506pb
506pb
506pb
42
Figura 9 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de DNA de isolados de
Xanthomonas albilineans coletados na região de Piracicaba, através de PCR usando primer
REP. Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2 ao 13)- isolado 1-12, respectivamente; 14)- marcador 1Kb
Figura 10 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de DNA de isolados de
Xanthomonas albilineans coletados na região de Piracicaba, através de PCR usando primer
REP. Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2 a 16)- isolados de 13-27, respectivamente; 17)- marcador
1Kb
Figura 11 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de DNA de isolados de
Xanthomonas albilineans coletados na região de Jaú, através de PCR usando primer REP.
Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2 a 14)- isolados de 28-40, respectivamente; 15)- marcador 1Kb
3054pb
3054pb
3054pb
1018pb
1018pb
1018pb
506pb
506pb
506pb
43
Figura 12 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de DNA de isolados de
Xanthomonas albilineans coletados na região de Ribeirão Preto, através de PCR usando
primer REP. Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2 a 14)- isolados de 41-52 respectivamente; 15)-
marcador 1Kb
Figura 13 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de DNA de isolados de
Xanthomonas albilineans coletados na região de Piracicaba, através de PCR usando primer
ERIC. Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2 ao 13)- isolado 1-12, respectivamente; 14)- marcador 1Kb
3054pb
3054pb
1018pb
1018pb
506pb
506pb
44
Figura 14 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de DNA de isolados de
Xanthomonas albilineans coletados na região de Piracicaba, através de PCR usando primer
ERIC. Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2 a 16)- isolados de 13-27, respectivamente; 17)- marcador
1Kb
Figura 15 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de DNA de isolados de
Xanthomonas albilineans coletados na região de Jaú, através de PCR usando primer ERIC.
Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2 a 14)- isolados de 28-40, respectivamente; 15)- marcador 1Kb
3054pb
3054pb
1018pb
1018pb
506pb
506pb
45
Figura 16 - Perfis eletroforéticos obtidos pela amplificação de fragmentos de DNA de isolados de
Xanthomonas albilineans coletados na região de Ribeirão Preto, através de PCR usando
primer ERIC. Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2 a 14)- isolados de 41-52 respectivamente; 15)-
marcador 1Kb
3054pb
1018pb
506pb
46
Coefficient
0.32 0.49 0.66 0.83 1.00
1
9
10
11
8
2
3
4
12
5
6
13
14
23
24
25
26
27
15
16
21
17
18
22
19
20
7
29
30
34
35
37
38
39
44
47
48
50
31
49
36
40
41
42
43
28
32
33
45
46
Figura 17 - Dendrograma construído com base no Coeficiente de Similaridade de Dice e pelo critério de
agrupamento UPGMA, com o emprego dos primers BOX, REP e ERIC
47
2.3.4 Caracterização dos isolados por RFLP
Com base no dendrograma gerado pelos resultados do rep-PCR, foram escolhidos
8 isolados para a realização das análises de RFLP. Pode-se observar no dendrograma
a existência de três grupos, dentro dos quais os isolados mostraram perfis
eletroforéticos semelhante. A partir de cada grupo, foram escolhidos os isolados que
causaram os sintomas mais característicos da doença nas plantas mantidas no campo.
Assim, do Grupo 1, no qual se encontram agrupados todos os isolados da região de
Piracicaba, foram escolhidos os isolados 8, 11, 27; do Grupo 2, onde foram reunidos
isolados da região de Jaú e Ribeirão Preto, foram escolhidos, respectivamente, os
isolados 29, 40 e 41, 51; e do grupo 3, constituído somente por dois isolados de
Ribeirão Preto, foi escolhido o isolado 47.
A técnica de RFLP, para cada isolado, foi conduzida através da digestão
enzimática dos fragmentos de aproximadamente 350pb, amplificados pelos primers
PGBL1 e PGBL 2. As enzimas de restrição utilizadas foram AluI, BamHI, EcoRI e
HaeIII, relatadas freqüentemente como apropriadas para identificação molecular de
bactérias.
A análise de RFLP revelou que a digestão enzimática promovida pelas diferentes
endonucleases, isoladamente, gerou padrões eletroforéticos idênticos para os isolados
avaliados. As enzimas AluI, BamHI, EcoRI geraram um fragmento de aproximadamente
350pb, mostrando que não encontraram sítio de restrição para clivagem do fragmento
de DNA amplificado no PCR. A enzima HaeIII encontrou um sítio de restrição no
fragmento amplificado e gerou, para todos os isolados, dois fragmentos, os quais foram
observados na forma de bandas no gel de acrilamida. Portanto, nas condições deste
ensaio, os isolados de X. albilineans foram indistinguíveis entre si, não tendo sido
possível demonstrar a ocorrência de diversidade genética entre os mesmos. Uma
interpretação para este tipo de resultado seria o fato do fragmento amplificado pelos
primers PGBL1/PGBL2 possuir um número relativamente pequeno de pares de bases,
o que restringiria a ocorrência de sítios de restrição para atuação das enzimas. Assim
sendo, não houve geração de fragmentos genômicos de tamanhos diferenciados,
comprometendo a obtenção de resultados (Figuras 18, 19, 20 e 21). O uso destas
enzimas, no presente caso, não foi apropriado, pois comprometeram a eficiência da
48
técnica de RFLP, a qual se baseia justamente na análise de padrões eletroforéticos
gerados por fragmentos de diferentes tamanhos ou pesos moleculares.
No entanto, a técnica tem sido útil para demonstrar a diversidade genética
existente entre isolados de X. albilineans. O emprego da técnica de RFLP, conduzida
com DNA total da bactéria e com a endonuclease SpeI, permitiu separar em oito grupos
distintos os 218 isolados coletados em 31 locais, caracterizando a diversidade genética
existente entre os isolados deste patógeno (DAVIS et al., 1997). Neste caso, o sucesso
do emprego da técnica pode ser creditado à ocorrência de vários sítios de restrição ao
longo do material genético íntegro da bactéria. A aplicação desta mesma técnica,
usando DNA total da bactéria e a endonuclease EcoRI, também foi útil para segregar
isolados da bactéria em dois grupos distintos, quando se investigou a variabilidade do
patógeno como possível causa de quebra de resistência de variedade de cana-de-
açúcar à escaldadura, na região do Caribe (ROTT e DAVIS, 1996). Isolados de X.
albilineans foram reunidos em três grupos através de análise de RFLP usando DNA
total e EcoRI, inclusive permitindo relacionar grupo de variabilidade e região de origem
destes isolados (ALVAREZ et al., 1996).
Figura 18 - Perfis eletroforéticos obtidos pela digestão com a enzima AluI de fragmentos de DNA
amplificado pelo par de primers PGBL1/PGBL2. Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2)- isolado 8; 3)-
isolado 11; 4)- isolado 27; 5)- isolado 29; 6)- isolado 40; 7)- isolado 41; 8)- isolado 47; 9)-
isolado 51; 10)- marcador 1Kb
506pb
344pb
49
Figura 19 - Perfis eletroforéticos obtidos pela digestão com a enzima BamHI de fragmentos de DNA
amplificado pelo par de primers PGBL1/PGBL2. Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2)- isolado 8; 3)-
isolado 11; 4)- isolado 27; 5)- isolado 29; 6)- isolado 40; 7)- isolado 41; 8)- isolado 47; 9)-
isolado 51; 10)- marcador 1Kb
Figura 20 - Perfis eletroforéticos obtidos pela digestão com a enzima EcoRI de fragmentos de DNA
amplificado pelo par de primers PGBL1/PGBL2. Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2)- isolado 8; 3)-
isolado 11; 4)- isolado 27; 5)- isolado 29; 6)- isolado 40; 7)- isolado 41; 8)- isolado 47; 9)-
isolado 51; 10)- marcador 1Kb
506pb
344pb
506pb
344pb
50
Figura 21 - Perfis eletroforéticos obtidos pela digestão com a enzima HaeIII de fragmentos de DNA
amplificado pelo par de primers PGBL1/PGBL2. Coluna: 1)- marcador 1Kb; 2)- isolado 8; 3)-
isolado 11; 4)- isolado 27; 5)- isolado 29; 6)- isolado 40; 7)- isolado 41; 8)- isolado 47; 9)-
isolado 51; 10)- marcador 1Kb
2.3.5 Teste de patogenicidade
Com base no rep-PCR e no dendograma, os isolados foram reunidos em três
grupos distintos. Para o teste de patogenicidade foram escolhidos os isolados 8, 11 e
27 pertencentes ao Grupo 1, coletados na região de Piracicaba; os isolados 29 e 40,
originários da região de Jaú, 41 e 51, da região de Ribeirão Preto, todos pertencentes
ao Grupo 2; e o isolado 47 pertencente ao Grupo 3, procedente de Ribeirão Preto.
Os isolados foram inoculados através de corte de colmos sadios provenientes de
plantas das variedades SP 78 5495 e SP 78 4467. O caldo usado para inocular cada
isolado foi obtido de plantas infectadas por cada um destes isolados, mantidas no
campo. Como testemunha, foi usado caldo obtido de plantas sadias das duas
variedades anteriormente referidas. A inoculação de cada isolado representou um
tratamento. Desta forma, o tratamento T1 correspondeu à inoculação do isolado 8, T2
ao isolado 11, T3 ao isolado 27, T4 ao isolado 40, T5 ao isolado 29, T6 ao isolado 41,
T7 ao isolado 51, T8 ao isolado 47, T9 foi uma das testemunhas, representada pela
inoculação de caldo sadio obtido da variedade SP 78 5495 e T10 outra testemunha,
representada pela inoculação de caldo sadio obtido da variedade SP 78 4467.
Os resultados do teste de patogenicidade foram analisados com base na
avaliação feita aos 90 dias após a inoculação, através da escala de notas
representativa da sintomatologia exibida pela planta. Aos 90 dias, as plantas exibiram
506pb
344pb
51
sintomas mais característicos da doença e permitiram melhor observação do efeito de
cada isolado sobre a planta inoculada.
As duas variedades apresentaram comportamento diverso em relação ao
patógeno (Figura 22). A variedade SP78 4467 se mostrou mais suscetível que a
variedade SP78 5495, confirmando as informações anteriores de que, mesmo sendo
ambas suscetíveis, a variedade SP78 4467 possuía maior grau de suscetibilidade. Por
esta razão, os dados obtidos com a variedade SP78 4467 foram utilizados para análise,
pois nesta variedade a intensidade de doença foi mais alta, facilitando a interpretação
dos resultados.
Todos os isolados testados se mostraram patogênicos, no entanto a
agressividade dos mesmos variou, mostrando que uns são capazes de causar sintomas
mais intensos do que outros. Estes resultados demonstraram a ocorrência de
variabilidade entre os isolados e a análise estatística dos dados obtidos na variedade
SP78 4467 permitiu identificar os isolados mais agressivos e os menos agressivos
(Tabela 3). A variabilidade dos isolados em relação à variedade SP78 5495 (menos
suscetível) também pode ser verificada, confirmado os resultados obtidos com a
variedade mais suscetível.
Os isolados T6 e T7, provenientes de Ribeirão Preto, se mostraram mais
agressivos que os isolados T4, T3 e T8, respectivamente, originários Jaú, Piracicaba e
Ribeirão Preto. No entanto, os isolados T6 e T7 não diferiram dos isolados T1, T2 e T5,
sendo os dois primeiros coletados em Piracicaba e o outro procedente de Jaú. O
isolado T8, obtido em Ribeirão Preto, foi o isolado significativamente menos agressivo
em comparação com os demais isolados avaliados. A agressividade foi variável entre
os isolados, considerados individualmente, inclusive de forma significativa demonstrada
pela análise estatística, porém não foi possível reunir os isolados em grupos
suficientemente distintos. Neste aspecto, os resultados mostraram claramente que o
isolado T8 foi o único que diferiu em agressividade de todos os demais isolados dentro
daqueles testados.
52
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T10 T11
Tratamentos
Média das notas
V2
V1
Figura 22 - Reação de plantas de cana-de-açúcar, pertencentes às variedades SP 78 5495 (V1) e SP 78
4467 (V2), inoculadas com isolados de X. albilineans amostrados em diferentes regiões do
estado de São Paulo. A inoculação de cada isolado se constituiu em um tratamento (T). A
avaliação foi feita aos 90 dias após a inoculação, através de uma escala de notas variável de 1-
5, de acordo com a intensidade crescente de sintomas observados nas plantas
54
agressividade. No entanto, observou-se que um dos dois isolados pertencentes ao
55
3 CONCLUSÕES
- Os isolados de X. albilineans mostraram diversidade genética, havendo uma
tendência desta característica estar relacionada com a região geográfica de origem dos
isolados
- Os isolados de X. albilineans apresentaram variabilidade patogênica, evidenciada
através da agressividade
- A diversidade genética dos isolados, aparentemente, não mostrou relação com a
variabilidade patogênica
- A espécie X. albilineans foi identificada em todas as amostras de plantas de
cana-de-açúcar que apresentaram sintomas típicos de escaldadura.
56
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