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ONILDO NUNES DE JESUS
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE CULTIVARES DE
BANANEIRA
RECIFE-PE
FEVEREIRO, 2006
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ONILDO NUNES DE JESUS
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE CULTIVARES DE
BANANEIRA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Agronomia, Área de Concentração
em Melhoramento Genético de Plantas, da
Universidade Federal Rural de Pernambuco, como
parte dos requisitos para obtenção do grau de
Mestre em Agronomia, Área de Concentração:
Melhoramento Genético de Plantas.
COMITÊ DE ORIENTAÇÃO:
Professor Dra. Terezinha Rangel Câmara – Orientadora – Universidade Federal
Rural de Pernambuco
Pesquisadora Dra. Claudia Fortes Ferreira– Co-orientadora – Embrapa Mandioca e
Fruticultura Tropical
Pesquisador Dr. Sebastião de Oliveira e Silva – Co-orientador – Embrapa Mandioca e
Fruticultura Tropical
RECIFE-PE, BRASIL
FEVEREIRO, 2006
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Ficha catalográfica
Setor de Processos Técnicos da Biblioteca Central – UFRPE
J58c Jesus, Onildo Nunes de
Caracterização morfológica e molecular de cultivares de
Bananeira / Onildo Nunes de Jesus. -- 2006.
83 f. : il.
Orientadora: Terezinha Rangel Câmara.
Dissertação (Mestrado em Agronomia) – Universidade
Federal Rural de Pernambuco. Departamento de Agronomia.
Inclui bibliografia.
CDD 631.53
1. Melhoramento vegetal
2. Identificação varietal
3. Marcador molecular
4. Marcador morfológico
5. Lançamento de variedade
6. Musa spp.
7. Proteção de cultivar
8. Figerprinting varietal
9. RAPD
10. Microssatélite
I. Câmara, Terezinha Rangel
II. Título
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE CULTIVARES DE
BANANEIRA
ONILDO NUNES DE JESUS
Dissertação defendida e aprovada pela Banca Examinadora em:_____/___/_____.
ORIENTADORA: ______________________________________
Profa. Dra. Terezinha Rangel Câmara – UFRPE
EXAMINADORES:
_______________________________________
Profa. Dra. Luciane Vilela Resende– UFRPE
_____________________________________
Profa. Dra. Rosimar Santos Musser-– UFRPE
______________________________________
Dr.Sebastião de Oliveira e Silva
Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical
RECIFE – PE
FEVEREIRO, 2006
A minha mãe Almerinda Gomes e a meu pai
Antônio Santana, pela minha formação moral
que se consolida no profissional que sou, aos
irmãos e irmãs em especial a Girlande Nunes e
meu cunhado João Carlos Alves por todo
carinho, amor e compreensão.
OFEREÇO
A todos que acreditam que o prazer de continuar
buscando é infinitamente maior do que o sucesso de
alcançar
DEDICO
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela minha existência, me fortalecendo como pessoa, para vencer os
obstáculos da vida.
Aos meus pai, pela formação moral sólida que se consolida na pessoa que hoje sou.
À Universidade Federal Rural de Pernambuco pela oportunidade a mim concedida
para a realização do curso de Mestrado.
Á CAPES pela bolsa de estudo concedida durante estes dois anos de curso.
Aos meus irmãos e irmãs em especial a Ivoneide Nunes, Girlande Nunes, Lucidalva
Nunes e Antônia Nunes pelo apoio e incentivo.
Aos primos e primas, tios e tias por acreditar na minha vocação profissional, em
especial a minha prima Claudia.
A Dra. Cláudia Fortes Ferreira, pela orientação, apoio e amizade.
Ao Dr. Sebastião de Oliveira e Silva pela amizade, ensinamentos e orientação
durante toda a minha vida acadêmica, contribuindo para meu desenvolvimento
pessoal e intelectual.
A Dr. Terezinha Rangel Câmara pelo apóio e flexibilidade para realização desse
trabalho.
Ao Professor Gerson Quirino Bastos, pela amizade, conselhos e conhecimento
transmitidos que muito tem contribuído para o meu crescimento pessoal e
intelectual.
A todos os professores da Pós-Graduação em Agronomia na Área de Concentração
Melhoramento Genético em Plantas, pelos conhecimentos transmitidos em especial
a Edson Ferreira.
A Dra. Márcia Vanusa por todo apoio, amizade, carinho e conhecimentos
transmitidos.
A Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical pelo espaço físico e financiamento do
meu projeto de pesquisa.
Ao técnico, Epaminondas do Patrocínio, do Laboratório de Virologia e Biologia
Molecular da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical pelos ensinamentos das
práticas de laboratórios e apóio na execução desse trabalho.
A toda a equipe do Laboratório de Praticas Culturais pela dedicação e apóio na
coletas dos materiais.
Aos estatísticos Carlos Ledo e Cosme Damião e ao pesquisador Paulo Vanderlei
pela disposição em sanar minhas dúvidas.
Aos Colegas, Kátia Nogueira Pestana e Taliane Leila Soares pelo apoio e empenho
para o desenvolvimento desse trabalho, sem o qual esse trabalho não seria
possível.
Aos estagiários do Laboratório de Virologia e Biologia Molecular Helisson, Murilo,
Vânia, Danilo e Daniela pelos momentos de aprendizados conjuntos.
Aos estagiários da área de melhoramento genético de bananeira Carla Pestana,
Juliana Alves, Adriana Passos e Néia pelos momentos de convivência, descontração
e amizade.
Aos amigos Ricardo Lopes, Marlon Garrido e Luciene Mendes pelo incentivo, apoio
e amizade nessa trajetória da minha vida.
Aos colegas de turma Eric Carvalho Xavier, Marcelo Ataíde Filho, Vaubam Carvalho,
Gilmara Correia, Adriana Guedes, Conceição Martiniano e Marcus pelos momentos
de aprendizado em conjunto, apoio e amizade.
“Os caminhos conhecidos são seguros e fáceis, mas só conduzem
a lugares onde já estamos e não desejamos ficar.....mas os
caminhos novos são cheios de riscos, surpresas e cansaços, mas
sempre premia os que escolhem com a chance de descobrirem e
experimentarem a vida que imaginarem viver”
(Anônimo)
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E MOLECULAR DE CULTIVARES DE
BANANEIRA
RESUMO
O melhoramento genético de bananeira da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical
vêm conduzindo esforços na tentativa de obter cultivares de bananeira resistentes às
principais pragas e doença com boas características agronômicas, uma vez que a
maioria das cultivares existentes apresenta porte elevado, além de serem suscetíveis às
principais doenças. Nessa tentativa, grandes esforços financeiros e intelectuais são
requeridos para a obtenção de novos híbridos que apresentem características
desejáveis. Com a criação da Lei de Proteção de Cultivares, foi instituído o direito a
proteção da cultivar que é efetivada mediante a emissão de Certificado de Cultivar. Para
tal, torna-se necessário caracterizar os novos genótipos, para minimizar os riscos da
apropriação indevida dos mesmos e maximizar a eficiência dos programas de
melhoramento e a utilização do germoplasma elite. A caracterização atualmente aceita
é a baseada em descritores morfológicos, embora padrões de izoenzimas têm sido
também usados. A caracterização dos genótipos com descritores morfológicos e
izoenzimáticos, apresenta algumas limitações por ser influenciada pelo ambiente,
portanto, a utilização de descritores de DNA atuando diretamente no genoma da planta,
apresenta-se como solução para contornar estes problemas. O presente trabalho teve
como objetivo utilizar dois tipos de descritores: morfológico e molecular (RAPD e SSR),
na diferenciação de cultivares de bananeira recomendadas pela Embrapa Mandioca e
Fruticultura Tropical. Os descritores morfológicos constituíram-se de 12 características
quantitativas e 61 características qualitativas. Para a caracterização molecular, utilizou
48 primers de RAPD e 37 primers de microssatélites. Os resultados permitiram concluir
que a aplicação dos descritores qualitativos e quantitativos mostrou uma ampla
variabilidade genética entre os genótipos estudados, mas as cultivares Preciosa,
Pacovan Ken e Garantida apresentaram pouca diferença, diferença esta perceptível
somente em nível de DNA. Os descritores baseados em microssatélites foram
superiores aos demais pela repetibilidade e alta capacidade discriminatória detectada,
permitindo definir padrões moleculares para algumas cultivares avaliadas. Com os
primers selecionados, somados aos já indicados, tem-se o inicio da criação de um
banco de dados moleculares para a identificação varietal de bananeiras.
Palavras-chave: Musa spp., Melhoramento vegetal, identificação varietal, proteção de
cultivares, lançamento de variedades, figerprinting varietal, RAPD, microssatélites.
MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF BANANA
CULTIVARS
ABSTRACT
Banana genetic breeding at Embrapa Cassava and Tropical Fruits has carried out great
efforts in trying to obtain banana cultivars resistant to most pests and diseases and with
good agronomic characteristics, once most of the existing cultivars are tall in height and
susceptible to most diseases. In this attempt, great financial and intellectual efforts are
required for the obtainment of new hybrids that present desirable characteristics. With
the creation of the Cultivar Protection Law, the right to protect a cultivar being released,
with the emission of a Cultivar Certificate, was instituted. Therefore, the characterization
of new genotypes becomes necessary in order to minimize the risk of unlawful
acquirement of cultivars being released. The actual characterization being accepted, is
the one based in morphological descriptors, even though the isoenzime pattern has also
been used. The characterization of the genotypes with morphological and isoenzimatic
descriptors, present some limitations, for they are influenced by the environment and
therefore, the use of DNA descriptors acting directly in the plant genome presents
another tool to overcome these problems. The objective of the present work was to use
two types of descriptors: morphological and molecular (RAPD and SSR) in the
discrimination of banana cultivars being recommended by Embrapa Cassava and
Tropical Fruits. The morphological descriptors were made up of 12 quantitative and
sixty-one qualitative characteristics. For the molecular characterization, 48 RAPD
primers and 34 microsatellite primers were used. The results concluded that the
application of the qualitative and quantitative descriptors showed a broad genetic
variability between the genotypes studied, but the Preciosa, Pacovan Ken and Garantida
cultivars presented little perceptible differences, being perceptible only at DNA level. The
descriptors based on microsatellites were superior to the others due to their repeatability
and high discriminating power, enabling the definition of molecular patterns for some of
the cultivars evaluated. With the selected primers in addition to the ones indicated, the
creation of a molecular data bank for varietal identification takes its first steps.
Key-words: Musa spp., banana breeding, varietal identification, cultivar protection,
variety release, fingerprinting, RAPD, microsatellites.
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Páginas
CAPÍTULO II -Caracterização morfológica de cultivares elite de bananeira
mediante descritores quantitativos e qualitativo
Tabela 1. Genótipos de bananeira desenvolvidos e recomendados
pela Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, Cruz das Almas, BA, 2006.
39
Tabela 2. Classes multicategóricas consideradas nas 61 características
qualitativas avaliadas nos 12 genótipos de bananeira recomendados pela
Embrapa. Cruz das Almas, BA, 2006.
40
Figura 1. Dissimilaridade observada nas características morfológicas
vegetativas da planta (A), do cacho (C), da inflorescência (coração e flores
masculinas) e geral (D). Cruz das Almas, BA, 2006.
38
Tabela 3. Valores obtidos para cada classe multicategórica, considerando os
caracteres da planta (17), do cacho (23) e do coração (20). Cruz das Almas,
BA, 2006.
43
Figura 2. Distribuição dos 12 genótipos de bananeira ao longo dos dois
componentes
principais (A) e o dendrograma (B). Cruz das Almas, BA, 2006.
44
Tabela 4. Dados da herdabilidade média (
h
) das características quantitativas
e dos três componentes principais (CP) em genótipos de bananeira em dois
ciclos de produção. Cruz das Almas, BA, 2006.
2
m
44
Tabela 5. Características avaliadas de 12 genótipos de bananeira em dois
ciclos de produção em Cruz das Almas, BA, 2006.
45
CAPÍTULO III - Fingerprinting de variedades elites de bananeira
Tabela 1. Genótipos de bananeira desenvolvidos e recomendados pela
Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical. Cruz das Almas, BA, 2006.
67
Tabela 2. Primers de microssatélites testados na caracterização de 14
amostras de DNA de bananeira (Musa spp.), Cruz das Almas, BA, 2006.
68
Tabela 3. Análise de Bootstrap com os dados de RAPD e Microssatélites em
cultivares e híbridos de bananeira. Cruz das Almas, BA, 2006.
69
Tabela 4. Marcadores RAPD e Microssatélites que geram um perfil
característico para os cultivares de bananeira avaliados. Cruz das Almas, BA,
2006.
70
Tabela 5. Teste de sensibilidade do marcador microssatélites utilizando o
primer AGMI 24-25 na identificação de DNA contaminante. Cruz das Almas,
BA, 2006.
70
Figura 1. Dendograma das relações genéticas entre cultivares e híbridos de
bananeira obtido por RAPD (A) e Microssatélites (B), gerado pelo coeficiente
de dissimilaridade de Jaccard. Cruz das Almas, BA, 2006.
71
Figura 2. Amplificação com 22 primers RAPD para as cultivares Preciosa (1),
Garantida (2) e Pacovan Ken (3). M = Marcador de 1kb. OPN-20; OPC-04 não
amplificou. As setas indicam a presença ou ausência de bandas em um
genótipo particular.
71
Figura 3. Resultado da amplificação com os primers OPH-04 (A), OPC-08 (B)
e OPO-02 (C) em cultivares e híbridos de bananeira.
72
Figura 4. Resultado da amplificação com os primers AGMI 24-25 (A) E STMS
1FP-1RP (B) de microssatélites em cultivares e híbridos de bananeira.
72
Figura 5. Simulação da sensibilidade do marcador AGMI24-25 em detectar
DNA estranho em lotes de muda de bananeira.
73
SUMÁRIO
Páginas
1. INTRODUÇÃO GERAL........................................................................................ 01
2. REFERENCIAL TEÓRICO................................................................................... 04
2.1 BOTÂNICA DA ESPÉCIE.................................................................................. 04
2.2 MELHORAMENTO GENÉTICO DA BANANEIRA............................................ 07
2.3 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA.............................................................. 09
2.4 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR.................................................................. 11
2.5 ANÁLISES ESTATÍSTICAS............................................................................... 13
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................ 14
CAPÍTULO II
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DE CULTIVARES ELITE DE
BANANEIRA MEDIANTE DESCRITORES QUANTITATIVOS E QUALITATIVO
RESUMO.................................................................................................................. 24
ABSTRACT.............................................................................................................. 25
INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 26
MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................... 28
RESULTADOS E DISCUSSÕES............................................................................. 30
CONCLUSÕES......................................................................................................... 37
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................ 46
CAPÍTULO III
FINGERPRINTING DE VARIEDADES ELITES DE BANANEIRA
RESUMO................................................................................................................... 49
ABSTRACT............................................................................................................... 50
INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 51
MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................... 53
RESULTADOS E DISCUSSÕES.............................................................................. 56
CONCLUSÕES......................................................................................................... 60
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................... 61
CONCLUSÕES GERAIS.......................................................................................... 74
ANEXOS................................................................................................................... 75
CAPÍTULO I
___________________________________________________________________
INTRODUÇÃO GERAL
1
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
1. INTRODUÇÃO GERAL
A maioria dos cultivares de bananeira originou-se no continente Asiático por
cruzamento natural das espécies selvagens Musa acuminata Colla, com genoma A,
e Musa balbisiana Colla, com o genoma B, e apresentam níveis cromossômicos
diplóide, triplóide ou tetraplóides, com 22, 33 ou 44 cromossomos, respectivamente
(Simmonds & Shepherd, 1955).
O Brasil é o segundo maior produtor mundial de banana, com uma produção
estimada na ordem de 605 milhões de toneladas e área colhida de 485 mil ha (FAO,
2005). A cultura constitui-se em uma das principais fontes de renda para os
pequenos produtores. No Brasil, a Região Nordeste destaca-se como a maior
produtora com 36,12% de área cultivada, seguida pela Sudeste com 27,4%, Norte
com 21,2%, Sul com 10.1% e a Região Centro-oeste com 5,2% (Agrianual, 2005).
Sua importância econômica está no volume exportado no Brasil em 2005 que foi na
ordem de 212 mil toneladas representando cerca de 33 milhões de dólares (Brasil,
2006).
Quando se considera a preferência para o cultivo e consumo, no Brasil,
destacam-se as variedades tipo Maçã, Mysore, Prata, Plátano e as do tipo
Cavendish (Silva et al., 2003). No entanto, a maioria desses cultivares é de porte
elevado e vem sendo significativamente afetadas pelas principais doenças e pragas
que prejudicam o desenvolvimento da cultura em todo país.
Em todo mundo, são grandes os esforços das instituições de pesquisa para
obtenção de híbridos de bananeira que sejam produtivos, com porte reduzido e que
apresentem resistência às principais pragas e doenças que prejudicam o
desenvolvimento da cultura. Dentre as limitações para a obtenção de híbridos de
bananeira, está a baixa produção de pólen dos acessos diplóides, baixa produção
de sementes nos genitores femininos (variedades comerciais ou diplóides) e
ausência total de fecundação de alguns cruzamentos (Silva et al., 1998).
Considerando que a produção de sementes é possível em alguns
cruzamentos de diplóides selvagens com cultivares, o programa de melhoramento
genético de bananeira iniciado em 1983 na Embrapa Mandioca e Fruticultura
Tropical, vem conseguindo, por meio da hibridação artificial, disponibilizar aos
agricultores genótipos produtivos e resistentes às principais pragas. Para a obtenção
dessas novas cultivares estima-se que sejam gastos dois milhões de reais em um
1
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
período de oito anos, tempo estimado para lançamento de uma cultivar, além do
envolvimento de todo um conjunto de mão-de-obra treinada e qualificada.
Até antes da criação da Lei de Proteção de Cultivares (LPC) de número
9.456, sancionada em 25 de abril de 1997, o melhorista não podia obter direito legal
sobre a nova cultivar. A proteção conferida pela LPC assegura a seu titular o direito
à reprodução comercial no território brasileiro, ficando vedado a terceiros, durante o
prazo de proteção, a produção com fins comerciais e o oferecimento (Brasil, 1998).
Para que uma nova cultivar ou uma cultivar essencialmente derivada seja
protegida, é necessário que a mesma atenda ao teste de distinguibilidade,
homogeneidade e estabilidade (DHE) a qual a Lei define como sendo “o
procedimento técnico de comprovação de que a nova cultivar ou a cultivar
essencialmente derivada seja distinguível de outra cujos descritores sejam
conhecidos, homogêneos quanto à repetição das mesmas características ao longo
de gerações sucessivas”. Por distinto, a lei define “a cultivar que se distingue
claramente de qualquer outra cuja existência na data do pedido de proteção seja
reconhecida” (Brasil, 1999). Essas diferenças entre as variedades podem ser
determinadas pelas análises de características morfológicas ou de DNA (Staub et
al., 1996).
Tradicionalmente, os melhoristas têm utilizado para registrar e proteger uma
nova variedade, apenas características morfológicas, objetivando estabelecer a
distinção, uniformidade e estabilidade, o DHE referido na lei (Lombard et al., 1999;
Priolli et al., 2002). Esses marcadores, têm um papel fundamental na divulgação das
características agronômicas, sendo decisivos na escolha da nova cultivar. A
distinção de cultivares realizada por características morfológicas, apresenta como
desvantagens a necessidade de um grande número de descritores que são
identificados em plantas inteiras ou adultas. Além disso, estes tipos de marcadores
podem ser influenciados pelo ambiente (Padilha, et al., 2002) são complexos na sua
expressão (Lombard et al., 1999), podem ser modulados pelo efeito de um
determinado patógeno, etapa de crescimento e clima (Narváez et al., 2001); são
influenciados por interações intra e inter-loci, resultando em dados poucos confiáveis
(Staub et al., 1996) e apresentam problemas de identificação, principalmente em
plantas aparentadas e de base genética estreita (Priolli et al., 2002).
Um problema que ainda não está definitivamente solucionado em bananeira,
é a identificação de cultivares dentro dos grupos genômicos diplóides, triplóides e
tetraplóides, o que é de suma importância quando se considera aspecto econômico
2
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
e de melhoramento genético (Silva et al., 2000). Este problema tende a se agravar
com o crescente lançamento de genótipos mais produtivos, aparentados e
resistentes a doenças pelo programa de melhoramento, exigindo das empresas a
correta identificação de cada material lançado a fim de evitar problemas de
propriedade. Assim, a busca por descritores que permita de forma racional e prática
classificar as diversas cultivares de bananeira nos seus grupos genômicos, terá
grandes utilidades (Carvalho, 1995).
Uma alternativa que pode complementar os descritores morfológicos é o
desenvolvimento das técnicas dos marcadores moleculares que tem permitido
indicar com precisão as variações genéticas presentes no DNA de um organismo
qualquer. Os descritores de DNA baseados no genótipo do indivíduo, tem recebido
maior atenção, especialmente pelo seu potencial de distinção, uma vez que são
mais abundantes que os morfológicos, não sofrem interação com o meio ambiente
(Ude et al., 2002a) e são ideais para distinção de genótipos morfologicamente
similares e geneticamente aparentados (Beyene et al., 2005).
Dentre as técnicas moleculares, destacam-se os marcadores baseados em
PCR (Polimerase Chain Reaction), como o RAPD (Randomly Amplified
Polymorphic DNA) os de microssatélites ou SSR´s (Simple Sequence Repeats) e
os AFLP´s (Amplified Fragment Length Polymorphism). (Ferreira & Grattapaglia,
1998).
Das técnicas mencionadas, a de RAPD é a menos sugerida para a
identificação de cultivar, devido à baixa complementaridade entre primers e
seqüência alvo do DNA. No entanto, a conversão desta técnica em marcadores do
tipo SCAR´s (Sequence Characterized Amplified Regions) torna-se o processo mais
confiável, uma vez que aumenta a especificidade dos primers, diminuindo
problemas com a repetibilidade (Carvalho et al., 2003).
Alternativamente, os marcadores microssatélites (SSR´s) são marcadores
codominantes, capazes de distinguir todos os alelos de um lócus, são altamente
polimórfico e de alta capacidade informativa. Portanto sua natureza informativa
permite estabelecer relações genéticas entre germoplasma, registrados em bases
moleculares e o desenvolvimento de informações acumuladas para o fingerprint
varietal (Ghislain et al., 2000).
Os marcadores dos tipos SSR e RAPD, poderão ser utilizados como
ferramentas para a identificação e caracterização de genótipos de bananeira.
Existem vários trabalhos na literatura objetivando a caracterização e identificação
3
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
varietal de genótipos utilizando essas técnicas na cultura da bananeira (Creste et al.,
2005; Creste et al., 2001; Creste et al., 2003; Paz, 2000; Pillay et al; 2000; Crouch et
al., 1998).
Apesar da grande potencialidade do uso de marcadores como uma
ferramenta poderosa na identificação varietal alguns trabalhos revelam, que a
caracterização molecular por si só não permite a completa diferenciação de
mutantes somáticos -mudanças em um ou poucos genes de algumas características
comuns em muitas espécies cultivadas. No entanto, a maioria desses mutantes é
identificada por descritores como cor e forma do fruto, altura da planta e hábito de
crescimento. Assim, as observações fenotípicas podem complementar o
fingerprinting por meio do uso de marcadores para identificar clones que diferem em
um ou poucos genes (Bonamico et al., 2004; Wünsch & Hormaza, 2002). Diante dos
problemas de influência ambiental, os marcadores morfológicos poderão ser
complementados por marcadores polimórficos, mais estáveis, para a identificação
varietal e para estimar as relações genéticas entre os indivíduos (Persson, 2001).
O presente trabalho teve como objetivo utilizar dois tipos de descritores:
morfológico e molecular (RAPD e SSR), na diferenciação de cultivares de bananeira
recomendadas pela Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical.
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Botânica da espécie
As bananeiras comestíveis pertencem à classe Monocotyledoneae, ordem
Scitaminales, família Musaceae, da qual fazem parte as subfamílias Heliconioideae,
Strelitzioideae e Musoideae. Esta última inclui o gênero Musa, constituído por quatro
séries ou seções dentro das quais a mais importante é a Eumusa, englobando as
espécies denominadas de Musa acuminata Colla e Musa balbisiana Colla, genitores
da grande maioria das bananas e plátanos comestíveis (Simmonds, 1973;
Simmonds & Shepherd, 1955).
A bananeira é um vegetal herbáceo completo, apresentando raiz, caule,
folhas, flores, frutos e sementes. O caule é representado pelo rizoma e o conjunto de
bainhas das folhas de pseudocaule. Sua multiplicação se processa naturalmente no
campo, por via vegetativa, pela emissão de novos rebentos a qual recebe
denominações específicas de acordo com o desenvolvimento, detalhes em Souza et
al., (1999). Seu plantio também pode ser feito por meio de sementes, processo esse
4
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
feito, quando se pretende fazer a criação de novas variedades ou híbridos (Moreira,
1999).
O pseudocaule termina com uma copa de folhas longas e largas com nervura
central bem definida. O pseudocaule apresenta uma coloração externa verde, no
entanto esta coloração pode variar a depender do genótipo e de sua origem.
Genótipos com pouca pigmentação no pseudocaule tendem a se aproximar mais da
espécie Musa balbisiana Colla e aqueles com deposição de antocianina e presença
de manchas no pseudocaule tendem a se aproximar mais da espécie Musa
acuminata Colla (Stover & Simmonds, 1987).
As folhas são formadas por bainha foliar, pecíolo, nervura e limbo foliar. Sua
posição varia amplamente entre grupos genômicos, sendo erectas nos diplóides e
pendentes a bem arcadas nos triplóides e tetraplóides, respectivamente (Shephered,
1984). A bainha foliar apresenta base ampla que se envolvem uma na outra para
formar o pseudocaule. Seu envolvimento é completo na base do pseudocaule e na
região de saída é menos envolvente dado aspecto da roseta da planta. Na parte
mais alta do pseudocaule nota-se um estrangulamento em U até o início onde se
iniciam os lóbulos foliares, onde surge o pecíolo da folha. O pecíolo une a bainha ao
limbo, apresentando na sua parte superior um canal e na parte inferior, adquire uma
forma arredondada (Moreira, 1999). A coloração da parte inferior do pecíolo pode
variar segundo o genótipo em estudo. As margens desse, podem ser abertas,
fechadas ou erectas com coloração diferenciada, desde púrpura, vermelha a verde
(Carvalho, 1995). Em alguns genótipos, essa faixa pode ser bem delimitada em
forma de uma fita visível; em outras, presente apenas como uma linha bem discreta,
e em alguns casos pode estar misturada com a cor do pecíolo e em outros estar
ausente.
O prolongamento do pecíolo dá origem à nervura central, com mesma
anatomia e mais fina à medida que se aproxima da parte terminal do limbo. O limbo
é também formado por nervuras secundárias que se estendem desde a nervura
principal até a atingir obliquamente a extremidade da folha (Moreira, 1999).
Quando se inicia a emergência da folha, pode-se perceber a formação de
uma estrutura compacta denominada de vela, onde percebe-se um filamento (parte
superior) denominado de pavio que logo desaparece. Antes da emissão da
inflorescência, ocorre a emissão das últimas folhas com dimensões cada vez
menores. Dentro desta, a menor de todas, a “pitoca”, com uma conformação típica,
mais coriácea, podendo secar durante o desenvolvimento do cacho (Moreira, 1999).
5
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Em mudas convencionais aparecem sempre manchas irregulares de cor
pardo- chocolate, bem visível nas folhas. Tais manchas são formadas pela reação
da antocianina ao pH do suco foliar que, nesta ocasião é mais ácido. Em mudas
agregadas a mãe isso não acontece, sendo mais comum em mudas denominadas
“guarda-chuva” que apresentam folhas típicas de uma planta adulta e não é aderida
à planta mãe (Moreira, 1999).
Logo após a diferenciação foliar, surge a gema floral, (Simmonds, 1973). Esta
fase floral é percebida pela forma cônica adquirida pelo ápice meristemático, ainda
no interior do pseudocaule. A partir deste ponto, esta começa a crescer até o
rompimento da bainha foliar que a protege. Nessa fase, ocorre a formação do
palmito, que confere juntamente com a fibra das bainhas, resistência à planta para
suportar o peso do cacho e a formação do engaço, que é o pedúnculo da
inflorescência na qual poderá ser revestido de pêlos rudimentares com comprimento
e densidade variando de acordo com a cultivar. A inflorescência pode ficar em
posição ereta, horizontal ou pendida para baixo (Moreira, 1999) e apresenta
brácteas normalmente roxo-avermelhada, em cujas axilas nascem as flores. O
desenvolvimento dos grupos de flores formam as pencas (mão) e cada penca
apresenta um número variável de frutos (dedos) que se originam por partenocarpia.
A ráquis é a continuação do engaço. É dividida em ráquis feminina, ráquis masculina
e ráquis hermafrodita, conforme o sexo das pencas das flores que nela se inserem.
A ráquis inicia-se na primeira penca termina no botão floral. Algumas vezes a ráquis
é tida pelos produtores como a parte masculina desse órgão (Moreira, 1999).
O coração ou inflorescência é formado por brácteas estas vão caindo e
expondo as flores masculinas que secam e caem, formando um eixo denominado de
ráquis masculinas onde nota-se as cicatrizes florais, denominadas de almofadas
(Carvalho, 1995; Dantas et al., 1999).
As brácteas que protegem as pencas são sempre caducas nos grupos
femininos e podem permanecer nos grupos masculinos, a qual denominamos de
“rabo sujo”, ao passo que plantas de “rabo limpo”, são aquelas onde há queda das
brácteas (Dantas, et al., 1999).
As flores são constituídas de perianto, androceu e gineceu. O perianto por
apresentar cálice e a corola com mesma forma e cor, recebe a denominação de
perigônio, que é a tépala maior e composta em cuja extremidade apresenta-se
fendilhada resultando em uma estrutura denominada de lóbulos. O perigônio
apresenta coloração creme e em alguns genótipos, apresenta manchas violáceas
6
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
devido à deposição de antocianina, oposta ao perigônio existe uma peça menor,
denominada de tépala livre. Esta apresenta na sua parte superior, uma estrutura fina
denominada de apículo, onde abaixo dessa estrutura observa-se a formação de
dobras ou rugas transversais (Carvalho, 1995).
As flores masculinas como as femininas apresentam cinco estames (antera +
filamentos) bastante semelhantes, assim como o pistilo (ovário + estilo + estigma).
Os estames das flores masculinas possuem anteras normais e os sacos polínicos
estão dispostos ao longo do filamento em duas linhas paralelas. Os grãos de pólen
são geralmente de cor branco-amarelada. Nas flores femininas, as anteras são
atrofiadas, o filamento é mais curto e o pólen, degenerado (Moreira, 1999).
As flores femininas, masculinas ou hermafroditas estão reunidas em pencas
separadas e protegidas cada uma delas por uma bráctea. A bráctea é sempre
caduca para as femininas, podendo ou não ocorrer esse fato nas demais. A flor da
bananeira comestível é completa, com os órgãos femininos e masculinos,
verificando-se em algumas a atrofia das anteras (flores femininas) que formarão as
pencas (frutos) e, em outras ocorre atrofia dos ovários (flores masculinas). Tal
característica permite identificar os sexos das flores (Dantas et al., 1999, Moreira,
1999,). Nos ovários das flores masculinas, nota-se a deposição de antocianina em
alguns genótipos. Em alguns casos podem desenvolver frutos de flores
hermafroditas como ocorre na cultivar Mysore, porém são menores e de qualidade
inferior (Moreira, 1999).
A polinização da bananeira é cruzada, pois a maturação dos órgão
masculinos e femininos ocorre em épocas diferentes (dicogamia) e geralmente é
feita por insetos. A polinização só é realizada objetivando o melhoramento genético
já que os frutos da bananeira originam-se por paternocarpia.
2.2 Melhoramento Genético da Bananeira
A maioria das cultivares de bananeira originou-se no continente asiático por
meio do cruzamento natural das espécies selvagem Musa acuminata Colla, genoma
A e Musa balbisiana Colla genoma B e apresentam níveis cromossomicos di, tri ou
tetraplóides, com 22, 33 ou 44 cromossomos, respectivamente (Simmonds &
Shepherd, 1955).
Existe um número expressivo de variedades de banana, no entanto, quando
se considera aspectos como preferência dos consumidores, produtividade, tolerância
7
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
a pragas e doenças, resistência à seca, porte e resistência ao frio, restam poucas
cultivares com potencial agronômico, justificando-se assim a criação de novas
variedades para serem usadas comercialmente. O programa de melhoramento
genético da bananeira visa desenvolver variedades com menor porte, maior
produtividade, além de resistência às principais doenças, nematóides e pragas. No
Brasil, doenças como o mal-do-Panamá (Fusarium oxysporum f.sp. cubense),
Sigatoka-amarela (Mycosphaerella musicola), Moko (Ralstonia solanacearum),
nematóides (Radopholus similis) e pragas, especialmente a broca-do-rizoma
(Cosmopolites sordidus) causa grandes prejuízos a bananicultura, e recentemente
foi introduzido a Sigatoka-negra (Mycosphaerella fijiensis), que vem dizimando o
cultivo em todo o país. Umas das ações para contornar os problemas mencionados,
é a criação de novas variedades resistentes a doenças e pragas mediante o
melhoramento genético (Silva et al., 2003).
Grandes são os esforços para a obtenção de híbridos de bananeira devido a
esterilidade parcial ou total de algumas cultivares diplóides e triplóides utilizados nos
cruzamentos para obtenção de híbridos tetraplóides. Alguns diplóides produzem um
mínimo razoável de sementes no entanto, a produção de sementes em tetraplóides
polinizados por diplóides é mais rara (Silva et al., 1998). Segundo Resende, (2005),
a ausência de sementes deve estar associada ao processo de seleção agronômica
contra esta característica, podendo estar relacionada à domesticação da espécie.
Apesar destas dificuldades a Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, vem
obtendo alguns híbridos superiores por meio de hibridação artificial (Silva et al.,
1998).
O melhoramento por hibridação usado na Embrapa envolve duas etapas
distintas. A primeira fase compreende o melhoramento de diplóides (AA).
Posteriormente, busca-se transferir características desejáveis dos diplóides
melhorados às variedades comerciais triplóides (AAB), obtendo-se, assim, na
segunda fase, híbridos tetraplóides AAAB. A exemplo de variedades obtidas por
hibridação com características de maior produtividade e resistentes a doenças,
temos a Caipira, a Thap Maeo, a FHIA-18, a Prata Baby (Nam), a Pacovan Ken
(PV42-68), a Prata Graúda (SH3640), a Preciosa (PV42-85), a Maravilha (FHIA-01)
e a Tropical (YB42-21) (Silva, et al., 2003).
Como ferramenta auxiliar ao melhoramento clássico da bananeira, tem
crescido nos últimos anos, o uso de várias técnicas que visam acelerar a obtenção
de novas variedades (Silva & Santos-Serejo, 2003). A exemplo temos uso de
8
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
mutações (Resende, 2005), fertilização in vitro (Soares et al., 2004), engenharia
genética, hibridação somática (Matsumoto, 2001), biologia molecular (Ude et al.,
2002a; Creste et al., 2003), cultura de tecidos e seleção in vitro de genótipos
resistentes ao estresse abiótico (Gomes et al., 2005). Crouch et al., (1998) também
apresenta uma extensa lista de trabalho envolvendo a biotecnologia como uma
ferramenta auxiliar ao melhoramento clássico de bananeira.
2.3 Caracterização Morfológica
Nas últimas décadas tem crescido o interesse pela caracterização de
variedades em todo mundo, devido principalmente, à necessidade de proteção de
variedades comerciais em mercado econômico cada vez mais competitivo (Milach,
1999). Oficialmente a caracterização no Brasil é feita com marcadores morfológicos
o qual Ramalho et al., (2000) define com sendo o uso características herdáveis e de
alta herdabilidade, onde seu genótipo é de fácil avaliação por meio de seu fenótipo.
A caracterização de cultivares é extremamente importante em programas de
certificação genética por descrever e reconhecer o material vegetal em todo passo
de produção, permitindo o monitoramento da qualidade genética, melhoramento e
conservação do germoplasma (Zubrzycki, 1997, Bianchi et al., 2004). Em alho, por
exemplo, tem-se utilizado os descritores registrados como peso, diâmetro do bulbo,
número de bubilhos, cor, forma da planta, rendimento, dias para a maturação para
garantir a qualidade genética (Nome, 1999).
Quando se considera a Lei de Proteção de Cultivares, a caracterização é um
instrumento importante para testar a DHE (Distinção – Homogeneidade –
Estabilidade). Mediante os resultados das avaliações das características registra-se
ou protege-se uma cultivar (Lima et al., 2003). Essa lei, possibilitará um maior
controle das mudas produzidas. Somente quem tiver permissão do detentor da
cultivar poderá produzir as mudas. Com isso, espera-se a oferta de mudas de
qualidade genética o que garantirá um maior sucesso na implantação de um pomar
(Bianchi et al., 2003).
Tradicionalmente, a caracterização dos genótipos é feita baseando-se em
descritores morfológicos, herdáveis, facilmente visíveis e mensuráveis, que, em
princípio, são expressos em todos os ambientes (IPGRI, 1996). Um dos grandes
problemas da utilização dos descritores morfológicos é o grande número de
descritores necessário e a grande influencia ambiental tornando o método pouco
9
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
eficiente, principalmente quando se considera caracteres métricos que são na
maioria das vezes influenciados por grande número de genes e conseqüentemente
muito influenciados pelo ambiente. Assim, a seleção de descritores com alta
herdabilidade e estáveis a exemplo de descritores qualitativos poderão ser de
grande importância para a caracterização da bananeira.
Uma série de descritores tem sido elaborados objetivando caracterizar e
identificar acessos de bananeira, a exemplo dos descritores elaborados por Silva et
al., (1999) e IPGRI, (1996). A literatura apresenta vários trabalhos com a utilização
de descritores morfológicos, como em morango (Nielsen & Lovell, 2000), em
variedades de café (Aguiar et al., 2004; Severino et al., 2002); mandioca
(Chumacero, 1992); batata-doce (Daros et al., 2002, Augustin et al., 2000); mamão
(Pinto et al., 1999) e bananeira (Caravalho, 1995; Ortiz, 1997; Ortiz et al., 1998;
Nsabimana & Staden, 2005).
Para a caracterização morfológica da bananeira é inicialmente necessária a
distinção entre os acessos diplóides, triplóides e tetraplóides (Shepherd, 1984) e
dentro de cada grupo de ploidia podem ocorrer mutações resultando em genótipos
(subgrupos) distintos tornando o processo de caracterização ainda mais difícil. A
discriminação dos grupos genômicos ou ploidia, segundo Shepherd, (1984), pode
ser feita por contagem cromossômica ou por observação de uma série de
caracteres, dentre eles, a orientação da folha, sendo que nos acessos diplóides são
eretas, nos triplóides são medianamente pendentes e nos tretraplóides são bem
arcadas, o que indica em parte, a eficiência dos descritores morfológicos na
distinção de cultivares. No entanto, ainda há deficiência de descritores eficientes na
diferenciação de cultivares dentro de cada grupo, principalmente devido à base
estreita das cultivares tetraplóides desenvolvidos a partir de cultivares tipo Prata,
resultando em indivíduos com características morfológicas semelhantes.
Associado a isso, em bananeira, assim como em outras culturas, existe a
dificuldade de discriminação dos genótipos na fase jovem, devido ao número
reduzido de características, bem definidas o que poderá agravar ainda mais o
problema ao se adquirir mudas geneticamente não certificadas. O problema só será
perceptível na fase adulta e conseqüentemente acarretando grandes prejuízos. No
entanto, o uso de características como à cor do pecíolo, cor e forma da faixa
colorida, cor e forma da roseta, cor e forma das manchas escuras, manchas nas
folhas, poderá ser de grande utilidade como instrumento de diferenciação de
genótipos.
10
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
2.4 Caracterização Molecular
Marcador molecular é definido como qualquer fenótipo molecular oriundo de
um gene expresso ou de um segmento específico de DNA (Ferreira & Grattapaglia,
1998). Milach, (1998) descreve que marcadores moleculares são características de
DNA que diferenciam dois ou mais indivíduos e são herdados geneticamente. Os
principais tipos de marcadores são os morfológicos, isoenzimáticos e os de DNA,
porém cada tipo de marcador pode ser adequado para uma aplicação e não para
outra.
Na busca pela diferenciação varietal o homem tem utilizado padrões
izoenzimáticos em espécies de importância econômica. A Embrapa Trigo utiliza
descritores de proteína para identificar genótipos com boa aptidão para panificação
baseando-se no conteúdo de gliadinas e gluteninas (proteína de reserva) de alto e
baixo peso molecular, respectivamente (Zanatta et al., 2002). Izoenzimas tem sido
utilizadas em bananeira para identificar alguns grupos genômicos BB (Espino &
Pascua, 1992). No entanto, o uso de izoenzimas é comprometido pois essas só se
expressam em certas regiões do tecido, são dependentes do estádio de
desenvolvimento da planta (Ude et al., 2002b), apresentam-se em número limitado e
cobrem pequena parte do genoma, impossibilitando a comparação de dados (Royo
& Itoiz, 2004).
Alternativamente, o uso de marcadores genéticos baseados na identificação
de polimorfismo de DNA, poderá ser utilizado pelo melhorista para criar um padrão
genético (fingerprinting) próprio de cada cultivar (Staub et al., 1996) pois não
depende da idade da planta, do ambiente, estado sanitário e clima. Assim, a
identidade genética do material poderá ser feita em plantas jovens micropropagadas
facilitando sua identificação, comercialização (Hinrichsen, 1999) e no intercâmbio de
germoplasma (Ghislain et al., 2000).
Nos últimos anos, a identificação genética tem merecido atenção especial, em
virtude do interesse do melhorista em proteger suas variedades e também devido a
um mercado internacional competitivo (Staub & Meglic, 1993; Milach, 1999) que
exige certificado de identidade e de pureza dos materiais vendidos.
Para utilização dos marcadores moleculares na diferenciação varietal, três
requisitos básicos são essenciais: 1º) distinção - diferentes genótipos devem
apresentar padrões de bandas distintos; 2º) uniformidade - o mesmo padrão de
11
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
bandas deve ser obtido se o procedimento for repetido e 3º) estabilidade - o padrão
de bandas não se altera mesmo que o genótipo seja cultivado em diferentes
ambientes (UFSC, 2005).
Dentre as técnicas moleculares, destacam-se os marcadores baseados em
hibridização ou hibridação, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ou
polimorfismo de tamanho de fragmento, onde o genoma é fragmentado por enzima
de restrição e observado por hibridização destes fragmentos com seqüência
homóloga e marcadas radiotivamente (sondas); e os derivados de aplicação da PCR
(Polimerase Chain Reaction) como o RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)
ou DNA polimórfico amplificado ao acaso, onde nesta técnica, o segmento de DNA
utiliza um primer que irá se anelar arbitrariamente à seqüência complementar no
DNA; os microssatélites ou SSR´s (Simple Sequence Repeats) ou STMS (Sequence
Tagged Microsatellite Sites) que são seqüências repetidas de um, dois, três ou
quatro nucleotídeos e que estão espalhadas pelo genoma de um indivíduo. As
regiões do SSR são delimitadas por seqüências conservadas de DNA para os quais
são desenhados primers específicos (Guimarães et al.; 2004) e complementares à
seqüência única que flanqueia o microssatélite e os AFLP´s (Amplified Fragment
Length Polymorphism), ou polimorfismo de comprimento de fragmentos
amplificados, onde utiliza-se ações combinadas de enzimas de restrição e da reação
da polimerização em cadeia (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Os marcadores RAPD, embora tenham baixa repetibilidade, apresentam as
vantagens por serem de fácil execução, baixo custo e pouco espaço de tempo para
a obtenção dos resultados e não dependerem de equipamentos sofisticados. Por
isto têm sido extensivamente utilizados, objetivando a identificação de espécies.
Utilizando essa técnica foram identificados marcadores específicos para os genomas
A e B em bananeira (Pillay et al., 2000), estudando a pureza varietal em alho na
cultivar Amarante, após multiplicação in vitro (Cortopassi et al., 2004), a identificação
de cultivares de morango confirmando o valor do marcador RAPD para a
identificação varietal visando proteção (Zebrowska & Tyrka, 2003) e utilizando 15
primers de RAPD, Nhan et al., (2003) conseguiram diferenciar 37 variedades de
citros.
Por outro lado, os marcadores microssatélites por serem altamente
polimórficos, codominantes e serem facilmente reproduzíveis e de fácil interpretação
(Creste, 2003), com possibilidade de automação e análise, além de não necessitar
de hibridização e não utilizar de meios radioativos (Ford-Lioyd et al., 1997), vem se
12
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
destacando pelo seu uso na caracterização varietal para fins de proteção e de
conservação de germoplasma.
Variações nos SSR´s apresentam elevado poder discriminatório, onde poucos
loci garantem a diferenciação dos genótipos, o que é importante quando se
considera genótipos muito próximos ou essencialmente derivados (Guimarães et al.,
2004). Além da alta resolução, o trabalho com os marcadores microssatélites pode
ser semi-automatizados o que aumenta a capacidade de processamento de dados,
uma vez que possibilita analisar até três produtos de amplificação numa mesma
faixa de tamanho ou amplitude de tamanhos diferentes, aumentando assim o
número de marcas a serem analisadas (Guimarães et al., 2004). A utilização dos
marcadores de microssatélites tem sido citada na literatura, Bonamico et al., (2004)
conseguiram diferenciar híbridos simples de milho de três fontes diferentes,
utilizando 17 marcadores SSR’s sugerindo ser essa técnica importante para aqueles
que desejam proteger ou identificar a pureza varietal dos híbridos plantados. Creste
et al., (2003) conseguiu com uso de marcadores microssatélites em bananeira,
identificar bandas específicas para o genoma B e identificou genótipos de difícil
caracterização morfológica.
2.5 Análises Estatísticas
A determinação das diferenças genéticas é importante quando se deseja
identificar materiais com o propósito de registro ou proteção de cultivares. Aparência
fenotípica, constituição genética (pedigree informação), distância genética
(composição alélica), são ferramentas importantes na decisão da infração da lei de
proteção de cultivares (Staub et al., 1996). Dentre as ferramentas estatísticas,
destaca-se o uso de distância genética, que pode ser definida como diferenças entre
duas variedades que podem ser descritas pela variação alélica. Estas diferenças
podem também ser examinadas comparando as distâncias genéticas mediante o
uso de marcadores morfológicos ou moleculares (Staub et al.; 1996).
Além de servir para orientar cruzamentos em programas de melhoramento, o
estudo da variabilidade genética pode ser um instrumento importante para eleger
descritores essenciais na caracterização e identificação de amostras duplicadas em
bancos de germoplasma (Ferreira, 2003).
Para Cruz & Carneiro, (2003) a diversidade pode ser analisada por meio de
estudos de marcadores moleculares, onde os dados são computados como
13
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
presença (1) e ausência de bandas (0) e as medidas de similaridade são obtidos por
esses valores a depender do índice utilizado. Apesar de existir muitos índices de
similaridade e dissimilaridade na prática tem se utilizado mais o índice de Jaccard e
de Nei e Li. Ambos excluem a coincidência do tipo “0-0” como fator de similaridade.
Para dados qualitativos categóricos tem sido utilizado o índice de similaridade
Sii=C/C+D, onde C quantifica a concordância de categoria e D a discordância de
categoria.
Para dados quantitativos tem sido utilizado a técnica de componentes
principais que consiste em transformar um conjunto original de variáveis como altura
e produção por exemplo, em outro conjunto de dimensões equivalentes, com cada
componente sendo independente entre si, retendo o máximo de informações em
termos da variação dos dados originais, possibilitando destacar e eliminar caracteres
que contribuam pouco com a discriminação da cultivar e reduzindo custo com mão –
de-obra na caracterização e experimentação (Cruz & Regazzi, 1997). Como medida
de dissimilaridade, pode-se utilizar a Distância Euclidiana Média.
Os métodos de agrupamento consistem em obter uma representação gráfica
dos dados obtidos. Existem muitos métodos de agrupamento, um deles é o método
hierárquico, onde os genótipos são agrupados por um processo que se repete níveis
até a obtenção do dendrograma. Um dos método hierárquico utilizado é a Ligação
Média Entre Grupo (UPGMA) onde o dendrograma é estabelecido pelos genótipos
de maior similaridade (Cruz & Carneiro, 2003).
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23
CAPÍTULO II
___________________________________________________________________
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DE CULTIVARES ELITE DE BANANEIRA MEDIANTE
DESCRITORES QUANTITATIVOS E QUALITATIVO
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Caracterização morfológica de cultivares elite de bananeira mediante descritores
quantitativos e qualitativos
Onildo Nunes de Jesus
1
, Sebastião de Oliveira e Silva
2
, Terezinha Rangel Câmara
3
, Cláudia
Fortes Ferreira
4
, Taliane Leila Soares
5
e Kátia Nogueira Pestana
6
Resumo
A maioria das cultivares de bananeira hoje disponível para os agricultores são de porte
elevado e suscetível a muitas pragas e doenças que prejudicam o desenvolvimento da cultura
em todo país. Em todo mundo, são grandes os esforços das instituições de pesquisas para
obtenção de híbridos de bananeira face a natureza quase estéril da planta. Apesar disto, novas
variedades têm sido desenvolvidas. Para proteção destes novos genótipos, o interesse na
caracterização de cultivares tem crescido bastante. Nesse contexto, insere-se o uso de
descritores morfológicos qualitativos e quantitativos como instrumento oficialmente aceito
para o registro e/ou proteção de cultivares. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a
eficiência dos descritores qualitativos e quantitativos como instrumento para diferenciação
varietal. Foram avaliados 12 descritores quantitativos e 61 descritores qualitativos, sendo 17
características vegetativas da planta; 24 do cacho e 20 do coração e das flores masculinas. Os
dados quantitativos foram submetidos a uma análise de componentes principais e os
resultados de ambos os descritores foram expressos na forma de um dendrograma de
dissimilaridade. Os descritores qualitativos foram eficientes na discriminação das cultivares
avaliadas, sendo as características da planta e do cacho as mais importantes nesta tarefa. As
características quantitativas; peso do cacho, comprimento e diâmetro do fruto e diâmetro do
pseudocaule, são características importantes na discriminação de cultivares. As cultivares
Preciosa, Garantida e Pacova Ken, apresentaram uma baixa dissimilaridade para as
características avaliadas.
Palavras-chave: Descritores morfológicos, melhoramento, Musa spp., proteção de cultivares,
análise multivariada, dissimilaridade
1
Engenheiro Agrônomo (UFBA), Bolsita da CAPES, Mestrando em Agronomia “Melhoramento Genético de Plantas” da
UFRPE. E- mail:[email protected]
2
Engenheiro Agrônomo, DSc. Pesquisador da Embrapa Mandioca e Futicultura Tropical, Cruz das Almas-BA. E-
mail:[email protected]
3
Professora Adjunta da Universidade Federal Rural de Pernambuco, E-mail: [email protected]
4
Engenheira Agrônoma, DSc. Pesquisador da Embrapa Mandioca e Futicultura Tropical. E-mail:[email protected]
5
Engenheira Agrônoma, Bolsita da CAPES, Mestranda em Ciências Agrárias da UFBA, E-mail: [email protected]
24
6
Estudante de Agronomia (UFBA), Bolsista do PIBIC, Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Morphological characterization of elite banana cultivars using qualitative and
quantitative descriptors
Abstract
Most banana cultivars available to producers nowadays are tall in height and susceptible to
most pests and diseases, leading to great losses in the development of the crop throughout the
entire Country. However, efforts of research centers worldwide for the obtainment of banana
hybrids due to their sterile nature, are cumbersome. Despite this scenery, new varieties have
been developed. The interest for the protection of these new varieties has been rising. In this
context, the use of qualitative and quantitative morphological descriptors is being officially
accepted for the registration and/or protection of cultivars. The present work aimed to
evaluate the efficiency of qualitative and quantitative descriptors as an instrument for varietal
discrimination. Twelve quantitative and sixty-one qualitative descriptors; whereas 17 were
vegetative characteristics of the plant; 24 of the bunch and 20 of the heart and male flowers,
were evaluated. The qualitative data was submitted to a principal components analysis,
whereas the results of both descriptors were expressed in the form of a dendrogram of
dissimilarities. The qualitative descriptors were efficient in the discrimination of the cultivars
evaluated, whereas plant characteristics and bunch characteristics were the most important
ones in this task. The quantitative characteristics, bunch weight, length and fruit diameter and
pseudostem diameter, are important characteristics for the discrimination of the cultivars. The
Preciosa, Garantida and Pacovan Ken cultivars presented low dissimilarity for the
characteristics evaluated.
Key-words: Morphological descriptors, breeding, Musa spp., cultivar protection, multivariate
analysis, dissimilarity.
25
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
INTRODUÇÃO
A maioria das cultivares de bananeira (Musa spp.) atualmente utilizadass na
alimentação originou-se do Continente Asiático e resultaram do cruzamento interespecífico
entre as espécies Musa acuminata e Musa balbisiana; razão pela qual as cultivares
apresentam características comuns a estas duas espécies. As bananeiras possuem três níveis de
ploidia, em combinações variadas dos genomas A (M. acuminata) e B (M. balbisiana):
diplóides com 22 cromossomos (2x), triplóides com 33 (3x) e tetraplóides (4x) (SIMMONDS
e SHEPHERD, 1955; SIMMONDS, 1973; SHEPHERED, 1984).
A cultura da bananeira no Brasil é praticada desde a faixa litorânea até os planaltos
interioranos ocupa o segundo lugar em volume de frutos produzidos, com uma produção
estimada da ordem de 605 milhões de toneladas e área colhida de 485 mil ha (FAO, 2005).
Como toda cultura plantada em grandes áreas, a bananicultura apresenta uma série de
problemas que reduzem a produtividade. Entre os entraves que provocam baixos rendimentos,
podem ser citados o baixo uso de tecnologia e a presença de pragas e doenças. Doenças como
a Sigatoka amarela e negra, além do mal-do-Panamá, causam grandes perdas na produção.
Por outro lado, atualmente, são criadas novas variedades de bananeira produtivas e resistentes
às principais doenças da cultura. Este processo requer altos investimentos financeiros e
intelectuais para a geração de cultivares e híbridos com alto valor agregado, fazendo-se
necessária a caracterização de forma inequívoca de cultivares passíveis de proteção,
minimizando assim o risco de apropriação indevida deste produto tecnológico (GUIMARÃES
et al., 2004).
A caracterização correta das variedades recomendadas com uso de descritores
apropriados facilita a sua certificação, proteção e o monitoramento da sua qualidade genética,
principalmente nos casos de genótipos aparentados. Nos últimos anos, a Embrapa Mandioca e
Fruticultura Tropical, tem lançado vários genótipos de bananeira e por essa razão tem
26
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
crescido a preocupação em buscar descritores eficientes na identificação de cada cultivar.
Embora possam ser usados descritores bioquímicos, morfológicos e moleculares, os
morfológicos, devido sua facilidade de aplicação, têm sido os mais empregados na
caracterização de germoplasma e na identificação de genótipos e cultivares em catálogos
usados nos estudos de distinção, homogeneidade e estabilidade como os do Ministério da
Agricultura (Brasil, 2006) e da UPOV- União Internacional para Proteção de Novas
Variedades de Plantas (PERSSON, 2001).
Um dos grandes problemas do uso de descritores morfológicos é a influência
ambiental. Quando se usa caracteres quantitativos (os mais influenciados pelo ambiente) o
problema pode ser contornado pele emprego de ensaios comparativos (PEARSON, 2001).
Descritores qualitativos de alta herdabilidade facilmente visíveis e mensuráveis, que a
princípio são expressos em todos os ambientes, são imprescindíveis em uma caracterização
morfológica eficiente (IPGRI, 1996).
Apesar da limitação no que se refere a influência ambiental, ao tipo de herança
envolvida e aos problemas referentes a identificação de cultivares semelhantes
fenotipicamente, os descritores morfológicos têm sido utilizados com êxito para caracterizar
um grande número de cultivares (STAUB et al., 1996). Estes descritores são encontrados
sendo empregados na diferenciação de cultivares de citros (RADMANN e OLIVEIRA, 2003),
alho (NOME, 1999), milho (SALGADO et al., 2001) e café (GUERREIRO FILHO et al.,
2003). Em bananeira, as secções Musa e Rhodochlamys, apesar de apresentarem muitas
características comuns, inclusive número de cromossomos, podem ser diferenciadas mediante
o uso de descritores baseados em aspectos vegetativos e do cacho (WONG et al., 2002).
SILVA et al. (1999) avaliando acessos de um banco de germoplasma, conseguiram uma
diferenciação segura em alguns acessos avaliados. ORTIZ, (1997) utilizou análises de
componentes principais em dados qualitativos e quantitativos para avaliação de bananeira
com diferentes níveis de ploidia, destacando algumas características importantes na
27
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
caracterização de genótipos.
No entanto, para muitas variedades de banana, principalmente as variedades
comerciais ou híbridas em fase de lançamento, carecem de informações a cerca de descritores
para sua identificação e caracterização.
O presente trabalho tem como objetivo avaliar a eficiência dos descritores
morfológicos qualitativos e quantitativos na discriminação de cultivares de bananeira.
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido na Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical localizada no
município de Cruz das Almas, situado no Recôncavo da Bahia, Brasil.
O clima da Região é do tipo Cl (seco e subúmido), segundo a classificação de
Thornthwaite com precipitação média anual de 1200 mm, temperatura média de 24,28ºC e
umidade relativa de 60,47%. O solo da área experimental é um latossolo amarelo distrófico A
moderado, textura franco argilo arenosa, fase transição floresta tropical subperenifólia e
subcaducifólia, declive de 0 a 3%. (EMBRAPA, 1993).
Foram caracterizados 12 genótipos de bananeira (Tabela 1) sendo nove recomendados
(Caipira, Thap Maeo, Tropical, FHIA-18, FHIA-01, Pacovan Ken, Nam Preciosa e Garantida)
e três promissores (FHIA-21, PA42-44 e Bucaneiro). O delineamento utilizado no
experimento foi o inteiramente casualizado com três repetições para os caracteres qualitativos.
O experimento foi irrigado por microaspersão, e os tratos culturais seguiram as
recomendações sugeridas por ALVES e OLIVEIRA (1999) e BORGES et al. (1999).
Foram avaliados 61 descritores qualitativos (Tabela 2) sendo 17 características
vegetativas da planta; 24 características do cacho e 20 relacionados à inflorescência (coração)
e as flores masculinas. Os detalhes das avaliações, bem como ilustrações, encontram-se
descritos em SILVA et al. (1999) e em IPGRI (1996). Os descritores forma da roseta, cor da
28
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
base do perigônio, forma do estilete e sabor dos frutos, foram alterados para melhor
adequarem-se às avaliações.
As notas para as características qualitativas foram observadas por três avaliadores
diferentes e as notas foram assumidas em consenso comum. Os dados referentes aos
caracteres quantitativos referem-se à média de 18 plantas em dois ciclos de produção.
Foram também avaliadas em dois ciclos, 12 características quantitativas, conforme a
metodologia descrita por SILVA et al. (1999) e enumeradas a seguir: altura de planta (ALP);
perímetro do pseudocaule (PPC); dias do plantio a colheita (DPC); comprimento do engaço
(CEG); diâmetro do engaço (DEG); número de frutos (NDF); peso do cacho (PCA); peso
médio dos frutos (PMF);comprimento do fruto sem pedicelo e ápice na segunda (CFR1) e
última penca (CFR2); calibração lateral do fruto na segunda (DFR1) e última penca (DFR2).
Foram eliminadas da avaliação todos os dados que apresentaram características
comuns a todos os genótipos, bem como os descritores cujos estados não eram uniformes.
Para estimar a dissimilaridade dos dados qualitativos multicategóricos, foi utilizado o índice
de similaridade (CRUZ e CARNEIRO, 2003):
DC
D
Dii
+
=
Onde, D
ii
: índice de dissimilaridade; C: concordância de categoria e D: discordância
de categoria.
Posteriormente com a matriz de dissimilaridade obtida, utilizou-se o método de
agrupamento hierárquico de ligação média entre grupos (UPGMA) para a obtenção dos
dendrogramas.
Os dados quantitativos foram submetidos a uma análise estatística multivariada,
utilizando-se a análise por Componentes Principais (PCA) com transformação dos dados.
Como medida de dissimilaridade foi utilizada a distância Euclidiana média e como método
hierárquico UPGMA, citado por CRUZ e CARNEIRO, (2003).
29
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Os dados foram submetidos a uma análise de variância e a partir da decomposição da
análise, por meio da esperança dos quadrados médios, permitiu-se a obtenção da
herdabilidade média (
) conforme a fórmula sugerida por CRUZ (2005):
h
2
m
2
2
2
2
g
g
m
r
h
∂+
∂
∂
=
Onde: ∂
2
: quadrado médio do erro; ∂
g
2
: variância genética e r: repetição.
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa estatístico GENES -
Aplicativo Computacional em Genética e Estatística (CRUZ, 2001), e para a confecção dos
dendrogramas utilizou o programa STATGRAPHICS – Statistical Graphics System
(STATGRAPHICS, 2002).
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Descritores qualitativos
Os dados referentes às características qualitativas avaliadas nos 12 genótipos de
bananeira encontram-se na Tabela 3. De uma maneira geral, a maioria dos genótipos
avaliados apresentou uma ampla variabilidade para as características estudadas, uma vez que
a maioria dos descritores utilizados apresentou todas as classes possíveis nos genótipos
avaliados.
As características que menos favoreceram para a variabilidade genética foram a cor da
casca do fruto quase maduro (CCQ) e maduro (CCM), sabor do fruto (SAB) e consumo do
fruto (CNF). Quanto à cor da casca do fruto quase maduro (CCQ), oito genótipos avaliados
tiveram a coloração amarelada e três apresentaram coloração verde clara. Comportamento
semelhante foi observado para cor da casca dos frutos maduros (CCM), onde oito genótipos
tinham coloração amarela e quatro cor amarela laranjada. As classes de cores cinzas,
30
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
vermelha e marrom não foram observadas nos genótipos avaliados. Tais resultados
concordam com o obtido por SILVA et al. (1999) nas avaliações realizadas no banco de
germoplasma da Embrapa. A baixa variabilidade com relação às características sabor (SAB) e
consumo (CNF) é perfeitamente aceita pelo fato de que a maioria dos genótipos utilizados
nessas avaliações serem destinados ao consumo in natura, uma única exceção é a FHIA-21,
que é consumida cozida frita por ser do grupo dos plátanos.
Os descritores da planta, do coração e das flores, foram os que mais apresentaram
características capazes de diferenciar um genótipo em particular. As cultivares FHIA-01,
PA42-44 e Pacovan Ken não apresentaram características morfológicas particulares. Por outro
lado, a Thap Maeo apresentou nove características (três referentes ao aspecto vegetativo da
planta e seis da flor) capazes de diferenciarem das demais (Tabela 3).
Os descritores vegetativos da planta foram os que apresentaram maior facilidade de
avaliação, pois não dependerem da fase reprodutiva para avaliação, portanto são os mais
recomendados na descrição de cultivares. Com o uso desses descritores a ‘Garantida’ pode ser
diferenciada das demais pela cor verde claro (TVC) e sem antocianina (ANT) no pseudocaule,
presença de manchas grandes (FME) em alta densidade (DME) distribuídas pelo pseudocaule.
Tais características coincidem em parte, com a classificação no grupo AAAB prosposta por
SIMMONDS e SHEPHERED, (1955).
Os dados das 17 características da planta permitiram a obtenção do dendrograma que
separou as variedades em dois grupos. No primeiro ficou a variedade FHIA-21 e no segundo
as demais variedades (Figura 1A). As características que permitiram separar a FHIA-21 das
outras variedades, foram: presença de antocianina no pseudocaule (ANT) que é contínua
nessa cultivar, a forma da margem dos pecíolos (FMP) mais ou menos fechada, forma da
faixa colorida da margem do pecíolo (FFP) que confunde com a cor do pecíolo da folha e
presença de manchas roxas (CLM) fracas nas folhas das mudas (Tabela 3).
Pela análise gráfica (Figura 1), nota-se que a maioria dos genótipos avaliados
31
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
apresentou uma dissimilaridade de 40%. Dentro desses, destacaram-se as variedades Caipira x
Nam; PA42-44; FHIA-01 x Bucaneiro e Pacovan Ken x FHIA-18. Esses dois últimos
agrupamentos ficaram com uma dissimilaridade menor que 30%. Tal fato reflete a dificuldade
de se avaliar genótipos apenas se baseando-se nos aspectos vegetativos da planta. Os
genótipos que apresentaram os mais baixos índices de dissimilaridade foram a FHIA-01 e
Bucaneiro (18%) e Caipira e Nam (24%). Apesar de apresentar um índice de similaridade
baixo, estes genótipos são perfeitamente distinguíveis por poucas características. Assim, a
FHIA-01, é diferenciada da Bucaneiro, pela forma das margens do pecíolo (FMP) e cor
inferior da nervura principal da folha da muda (NIC). A diferenciação das variedades Caipira
e Nam pode ser feita por meio da densidade (DME) e forma das manchas escuras (FME) no
pseudocaule e a cor inferior da nervura principal da folha da muda (NIC) (Tabela 3). SILVA
et al. (1999) avaliando genótipos dos grupos AAA e AAB, conseguiram resultado semelhante
para a maioria das características aqui avaliadas para as cultivares Caipira (AAA), Nam
(AAA) e Thap Maeo (AAB).
Quando se considera as características do coração (inflorescência) e das flores
masculinas, observa-se que todos os genótipos apresentaram uma similaridade menor que
45%. Nesse grupo, destaca-se a ‘Thap Maeo’ como genótipo mais divergente do grupo.
Dentre as características que permitem separá-lo das demais, citam-se a cor rosada da base do
perigônio (CBP), presença de antocianina distribuída ao longo do perigônio (CVP), com
vermelha na antera (CAT), ausência do apículo (FAT) e ausência de pólen (POL). Por outro
lado, esses descritores não foram eficientes na discriminação das cultivares Preciosa e
Pacovan Ken (com 21% de dissimilaridade) e as cultivares FHIA-01 e FHIA-18 (com 30% de
dissimilaridade) já que cultivares aparentadas apresentam morfologia semelhante da
inflorescência. ORTIZ et al. (1998) trabalhando com espécies cultivadas de bananeira
encontraram agrupamento semelhante, indicando que variedades com mesma inflorescência,
apresentam um ancestral comum. No presente estudo variedades dentro dos grupos
32
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
apresentaram os mesmos genitores confirmando em parte essa teoria (Tabela 3).
Os descritores do cacho (Figura 1B) separaram as cultivares em dois grandes grupos,
ficando no primeiro com todos os genótipos triplóides e no segundo os tetraplóides. Os
genótipos mais próximos foram Preciosa, Garantida e a Pacovan Ken com uma
dissimilaridade de 21%.
A FHIA-21, embora tetraplóide e usada para o consumo cozido ou frito, agrupou-se
junto às variedades Thap Maeo, Nam e Caipira (triplóides), para todos os caracteres
avaliados, indicando que essa é próxima morfologicamente dessas variedades, apesar de
grandes diferenças em outros caracteres. Por outro lado, considerando que essa é a única
pertencente ao grupo dos plátanos, justifica-se seu posicionamento separada dos outros
tetraplóides. ORTIZ (1997) através de avaliação com descritores qualitativos, separar plátanos
de outras variedades pertencentes a diferentes grupos genômicos.
A análise conjunta das 63 características qualitativas mostrou que as cultivares
apresentaram comportamento semelhante ao apresentado quando se analisou os caracteres do
cacho, dividindo-se em dois grandes grupos. O primeiro grupo alocou todos os triplóides
AAB e AAA e a FHIA-21 (AAAB) sendo essa cultivar agrupada juntamente com a Thap
Maeo (AAB), enquanto a Caipira e Nam (AAA) ficaram no mesmo subgrupo. O segundo
grupo ficou representado pelos tetraplóides (AAAB), enquanto o tetraplóide AAAA,
representado pela Bucaneiro, ficou em um subgrupo isolado. Uma das características que
contribuiram para esse arranjo, foi a altura das folhas, sendo medianamente pendente e bem
arcado nos tetraplóides avaliados confirmando em parte a afirmação de SHEPHERED (1984)
que diz ser esse descritor importante na identificação dos níveis de ploidia (Tabela 3).
A observação desses descritores demonstra que os mesmos foram eficientes em
separar genótipos segundo sua ploidia e origem, indicando ser uma ferramenta importante na
caracterização de germoplasma desconhecido.
De maneira geral, nota-se uma baixa taxa de dissimilaridade entre as cultivares
33
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Preciosa, Pacovan Ken e Garantida, híbridos de Pacovan; e as cultivares PA42-44, FHIA-01 e
FHIA-18 híbridos de Prata Anã, o que era esperado, visto que possuem como background
comum o diplóide M53. Essa tendência está de acordo com o que afirma PRIOLLI et al.
(2002) onde as variedades derivadas de outras apresentaram maior dificuldade de distinção,
necessitando de outros descritores, além dos morfológicos, que complementem sua
caracterização. Assim, este tipo de caracterização deve ser acompanhada de estudos
moleculares para melhor entender a diversidade das espécies.
Alguns dos descritores morfológicos usados podem ser afetados pelo ambiente.
Caracteres como densidade e coloração do pseudocaule, podem ser afetados durante os
processos de multiplicação in vitro por meio da variação somaclonal ou da mutação como a
observada na cultivar Pacovan Ken (RESENDE, 2005).
Muitos estados apresentados por alguns descritores levam a problemas de
subjetividade nas avaliações. O descritor, cor das manchas do pseudocaule, por exemplo, com
os estados marrom clara e marrom pálida, devem ser transformados em um único estado
devido a problemas de diferenciação dessas cores. Da mesma forma os estados da cor da
polpa dos frutos maduros (branca e branca fosca) e cor da antera (marrom pálida e creme).
Descritores quantitativos
As 12 características avaliadas foram submetidas a uma análise de componentes
principais (Tabela 4). Os três primeiros componentes explicaram 90,38% da variabilidade
observada nos dados. A contribuição de cada componente para a variabilidade foram
respectivamente 42,09; 35,15 e 13,13%.
A observação da influência dos caracteres nos últimos componentes é importante por
indicar os caracteres com menor importância para a divergência genética nas amostras
avaliadas. Por outro lado, os maiores pesos nos primeiros componentes indicam as variáveis
que mais contribuem para a divergência (CRUZ & REGAZZI, 1997). As variáveis com
maiores pesos para o primeiro componente foram o diâmetro do engaço, peso do cacho e
34
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
número de dias do plantio à colheita. No segundo componente, destacaram-se o comprimento
dos frutos nas duas pencas avaliadas e o diâmetro dos frutos na primeira penca. No terceiro
componente destacaram-se as variáveis comprimento e diâmetro dos frutos nas duas pencas
avaliadas como de maior peso na variação desse componente (Tabela 4). Tais características
mostram ser importantes para a diversidade observada. NSABIMAN e STADEN, (2005)
encontraram resultados semelhantes para os caracteres comprimento e diâmetro dos frutos
avaliados.
A distribuição dos genótipos em relação aos dois primeiros componentes e o
dendrograma de dissimilaridade obtido por distância Euclidiana média é mostrado na Figura
2. De maneira geral, nota-se que a distribuição dos genótipos não foi uniforme para os
genótipos avaliados, destacando como o mais divergente dos demais as cultivares FHIA-21 e
Nam. Em seguida, o dendrograma dividiu as variedades em três subgrupos ficando as
cultivares Caipira, Thap Maeo e FHIA-18 no primeiro, FHIA-01 e Bucaneiro no segundo,
PA42-44, Garantida, Preciosa, Pacovan Ken e Tropical no último subgrupo.
Apesar de não ter sido observado grandes coincidências nos agrupamentos das
cultivares com relação aos caracteres qualitativos e quantitativos (Figura e 1D e 2), observou-
se que para as cultivares Garantida, Preciosa, Pacovan Ken e Tropical permaneceram nos
mesmos grupos de forma semelhante aos observados nos descritores morfológicos qualitativo,
indicando que além da uniformidade morfológica apresentada, tais genótipos apresentam
também, uniformidade para as características agronômicas. Vale a pena ressaltar que todos
estes genótipos são híbridos AAAB, e que apesar de terem genitores femininos diferentes,
possuem o mesmo genitor masculino que é o diplóide M53, portanto são considerados meios-
irmãos (SILVA et al., 2003).
Por outro lado, genótipos como o PA42-44, o FHIA-01 e o FHIA-18, apresentaram
comportamento diferenciado quando submetidos à descrição quantitativa em relação à
descrição qualitativa (Figura 1D e Figura 2). Tais comportamentos estão de acordo com a
35
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
afirmação de que para alguns genótipos, é necessária a complementação com os dois tipos de
descritores (NSABRIMANA e STADEN, 2005; ORTIZ et al., 1998).
O subgrupo apresentado pela Caipira, Thap Maeo e FHIA-18, pode ser explicado
acompanhando o desempenho das cultivares (Tabela 6). As cultivares FHIA-18 e Thap Maeo,
apresentaram comportamento semelhante para as características, diâmetro do pseudocaule,
diâmetro do engaço, peso do cacho e diâmetro do fruto. A Caipira e a Thap Maeo
apresentaram comportamento semelhante para as características número de dias do plantio à
colheita, peso médio do fruto e comprimento dos frutos. Caipira e FHIA-18 nas características
altura de planta, comprimento do engaço, número de dedos e diâmetro do fruto. Não houve
nos três genótipos avaliados características métricas semelhantes, o que justifica a separação
da Caipira nesse subgrupo (Tabela 5). O desempenho semelhante dessas três variedades
também foi observado por SILVA et al. (2000) e SILVA et al. (2002).
A precisão experimental é muito importante quando objetiva a análise dos descritores
quantitativos. Os descritores: diâmetro do pseudocaule, número de frutos e peso do cacho,
apresentaram respectivamente um coeficiente de variação 26,30%, 26,36% e 28,02%
superiores ao obtidos por SILVA et al. (2002), que obtiveram 11,90%; 16,26% e 39,80%,
respectivamente, porém semelhante aos obtidos por ORTIZ, (1997) quais sejam 26,10%,
36,90% e 21,80%, respectivamente, estando dentro dos limites observados. Os demais
coeficientes tiveram um valor de médio a baixo, indicando precisão dos descritores utilizados.
Dentre esses, os menores foram apresentados pelo comprimento e diâmetro dos frutos,
confirmando também pelos dados de ORTIZ (1997) onde alta herdabilidade e baixo
coeficiente de variação foram encontrados para esses dois caracteres (Tabela 4 e 5).
Considerando que as características métricas são muito influenciadas pelo ambiente,
justifica-se a análise da herdabilidade para quantificar quanto da variância fenotípica
observada é devido a causas genéticas. Pela Tabela 4 nota-se que todas as características
apresentaram uma alta herdabilidade (acima de 0,82) sendo superior aos valores de
36
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
herdabilidade obtidos por ORTIZ (1997), indicando que nesse experimento houve baixa
influência ambiental nas características avaliadas.
Vários trabalhos provam alguma eficiência na utilização desses descritores na
classificação de germoplasma (CARVALHO, 1995; ORTIZ et al., 1998; NSABIMANA e
STADEN, 2005 e ORTIZ, 1997).
De maneira geral, percebe-se que os descritores utilizados foram eficientes na
caracterização dos genótipos de bananeira, separando as cultivares em grupos distintos. Os
descritores quantitativos bem como os descritores qualitativos não conseguiram discriminar
perfeitamente as cultivares Preciosa, Pacovan Ken e Garantida, necessitando de
complementação com outros tipos de descritores como os moleculares para sua diferenciação.
CONCLUSÕES
As variedades apresentaram uma ampla variabilidade quando avaliadas por descritores
morfológicos qualitativos e quantitativos.
Os descritores qualitativos e quantitativos foram eficientes na distinção da maioria dos
genótipos, com exceção das cultivares Preciosa, Garantida e Pacovan Ken que ficaram no
mesmo grupo e apresentaram uma alta similaridade.
As variáveis que mais contribuíram para a dissimilaridade observada foram os caracteres da
planta e do cacho para os descritores qualitativos e diâmetro do pseudocaule, peso do cacho
comprimento e diâmetro do fruto, para os quantitativos.
Para o emprego eficiente dos descritores morfológicos, as avaliações deverão ser realizadas
em mais de um ambiente.
37
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
FHIA-2
Linkage Distance
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
1
Thap Maeo
Caipira
Nam
PA42-44
FHIA-01
Bucaneiro
Pacovan Ken
FHIA-18
Preciosa
Garantida
Tropical
Linkage Distance
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
FHIA-21
Thap Maeo
Caipira
Nam
Bucaneiro
FHIA-01
PA42-44
FHIA-18
Garantida
Preciosa
Pacovan Ken
Tropical
Linkage Distance
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Thap Maeo
Caipira
FHIA-21
Nam
FHIA-01
FHIA-18
PA42-44
Bucaneiro
Preciosa
Pacovan Ken
Garantida
Tropical
Linkage Distance
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
Caipira
FHIA-21
Thap Maeo
Nam
FHIA-01
Preciosa
Garantida
Pacovan Ken
PA42-44
FHIA-18
Bucaneiro
Tropical
D
C
B
A
Figura 1. Dissimilaridade observada nas características morfológicas vegetativas da planta
(A), do cacho (C), da inflorescência (coração e flores masculinas) e geral (D). Cruz das
Almas, BA, 2006.
38
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Tabela 1. Genótipos de bananeira desenvolvidos e recomendados pela Embrapa Mandioca e
Fruticultura Tropical, Cruz das Almas, BA, 2006.
Genótipos
Grupo
Genômico
Subgrupo
Genealogia
(Origem)
Reação as doenças
Tropical AAAB Maçã Yangambi nº2 x M53
(Embrapa)
Resistente a Sigatoka
amarela e tolerante ao
mal-do-Panamá
1
FHIA-18 AAAB Prata ‘Prata Anã’ x 2n (FHIA) Moderadamente
resistente a Sigatoka
amarela e resistente a
Sigatoka negra
Preciosa AAAB Prata ‘Pacovan’ x M53
(Embrapa)
Resistentes às
sigatokas amarela e
negra e mal-do-
Panamá
Thap Maeo AAB Mysore Cultivar tipo Mysore
(Tailândia)
Resistentes às
sigatokas amarela e
negra e mal-do-
Panamá
Garantida AAAB Prata ‘Prata São Tomé’ x M53
(Embrapa)
Resistentes às
sigatokas amarela e
negra e mal-do-
Panamá
Caipira AAA - Cultivar (África
Ocidental)
Resistentes as
sigatokas amarela e
negra e mal-do-
Panamá
Bucaneiro AAAA Gros Michel Híbrido High Gate
(Jamaica)
Resistentes a sigatoka
amarela e mal-do-
Panamá
Pacovan Ken AAAB Prata ‘Pacovan’ x M53
(Embrapa)
Resistentes às
sigatokas amarela e
negra e mal-do-
Panamá
1
FHIA-01 AAAB Prata ‘Prata Anã’ x SH3142 Moderadamente
resistentes a Sigatoka
amarela, resistente a
Sigatoka negra e mal-
do-Panamá
1
FHIA-21 AAAB Terra Honduras Resistentes às
sigatokas amarela e
negra e mal-do-
Panamá
PA42-44 AAAB Prata ‘Prata Anã’ x M53
(Embrapa)
Resistentes a sigatoka
amarela e mal-do-
Panamá
Nam AAA - Tailândia Resistentes a sigatoka
amarela e mal-do-
Panamá
1
FHIA: Federación Hondureña de Investigación Agrícola
39
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Tabela 2. Classes multicategóricas consideradas nas 61 características qualitativas avaliadas
nos 12 genótipos de bananeira recomendados pela Embrapa, Cruz das Almas, BA, 2006.
DESCRITORES AVALIADOS CLASSES DOS DESCRITORES
1. CARACTERÍSTICAS GERAIS DA PLANTA
1.1. Pseudocaule
01. Roseta da coroa (ROS)
3
1. Forte, 2. Fraca.
02. Tonalidade da cor verde (TCV) 1. Pálida; 2. Amarelada; 3. Clara; 4. Escura.
03. Cerosidade (CER)
1
1. Muita; 2. Média; 3. Pouca; 4. Ausente.
04. Cor da manchas escuras (CME) 1. Preta; 2. Marrom escuro; 3. Marrom-clara; 4. Marrom-
pálida.
05.Presença e quantidade de antocianina no
pseudocaule (ANT)
2
1. Alta e contínua; 2. Média à fraca e contínua; 3. Só na
base da planta; 4. Ausente.
06. Forma das manchas escuras do pseudocaule
(FME)
2
1. Manchas grandes e irregulares; 2. Manchas circulares; 3.
Manchas irregulares e pequenas; 4. Ausente.
07.Densidade das manchas escuras (DME) 1. Mais ou menos contínua; 2. Alta; 3. Média-manchas
difusas; 4. Média manchas discretas; 5. Baixa; 6. Muito
baixa.
1.2. Folhagem
08. Posição ou altura das folhas (ALF) 1. Quase ereta; 2. Medianamente pendente; 3. Bem arcada.
09. Forma da margem do pecíolo (FMP) 1. Bem aberta; 2. Pouco aberta; 3. Ereta; 4. Pouco fechada;
5. Mais ou menos fechada
10. Margem da base (MBA)
1
1. Muito escariosa; 2. Pouca escariosa; 3. Não escariosa.
11. Cor da margem do pecíolo (CMP) 1. Purpúreo; 2. Vermelho-rosada; 3.Verde; 4. Marrom.
12. Forma de faixa colorida do pecíolo (FFP)
2
1. Em foram de fita bem visível; 2. Visível mas confunde
com a cor do pecíolo; 3. Apenas uma linha pouco
perceptível; 4. Uma linha pouco perceptível; 5. Ausente.
13. Tamanho da faixa colorida (TFC)
1.Larga (>3mm); 2. Estreita ≤3mm; 3. Apenas uma linha; 4.
Variável entre as notas 3 e 5; 5. Mais ou menos nenhuma.
14. Tonalidade escura do pecíolo (ESC)
1
1. Bem escuro; 2. Pouco escuro; 3. Não escuro.
15. Cor da face superior da nervura principal da
colheita (NSA)
1
1. Muito colorida; 2. Pouco colorida; 3. Não colorida
(verde).
16. Cor da face inferior da nervura principal na
colheita (NIA)
1. Purpúrea; 2. Vermelho-rosada; 3. Variavelmente rosada;
4. Mais ou menos verde.
17. Cor da face superior da nervura principal muda
chifrão (NSC)
1. Muito colorida; 2. Pouco colorida; 3. Não colorida
(verde).
18. Cor da face inferior da nervura principal muda
chifrão (NIC)
1
1. Purpúrea; 2. Vermelho-rosada; 3. Variavelmente rosada;
4. Mais ou menos verde.
19. Cor da face inferior do limbo jovem (CFJ)
1
1. Purpúra; 2. Verde (normal).
20. Cor do limbo da muda (CLM) 1. Manchas roxas conspícuas; 2. Manchas fracas variáveis;
3. Sem manchas-verde.
21. Comparação dos tamanhos das bases do limbo
(IGB)
1. Mais ou menos iguais; 2. Desiguais; 3. Variável na
mesma planta.
22. Forma das bases do limbo foliar (FOB) 1. Ambas abruptas; 2. Ambas afiladas; 3. Uma abrupta e
outra afilada.
23. Cerosidade do limbo na superfície ventral (CEV)
1
1. Muita; 2. Média; 3. Pouca ou nenhuma.
24. Cerosidade do limbo na superfície dorsal (CED)
1
1. Muita; 2. Média; 3. Pouca ou nenhuma.
2. CARACTERÍSTCIAS DO CACHO
2.1. Características do engaço e do cacho
25. Cor do engaço juvenil (CJU) 1. Tingido de vermelho; 2. Verde-escura; 3. Verde-clara
26 .Purbescência do engaço (PUB) 1. Densa e comprida (2-3 mm); 2. Densa e curta; 3. Bastante
esparsa; 4. Muito esparsa; 5. Nenhuma.
27. Forma do cacho (FCA) 1. Frouxo; 2. Compacto; 3. Muito Compacto.
2.2. Características dos frutos
28. Flexão das pencas (FLX)
1. Bem recurvada; 2. Medianamente recurvada; 3. Pouco ou
não recurvada.
29. Forma da seção transversal (SEC)
1. Fortemente pentagonal; 2. Fracamente Pentagonal; 3.
Mais ou menos arredondado.
30. Tamanho do ápice (TAP) 1. Comprido (1 cm); 2. Curto; 3. Sem ápice.
31. Forma do ápice (FAP)
1. Em gargalo largo; 2. Em gargalo estreito; 3. Afilado; 4.
Outra forma.
40
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
32. Forma prevalecente dos estilos persistentes (FES) 1. Mais ou menos vivos; 2. Bases dura; 3. Completamente
secos; 4. Sem estilos (decíduos).
33. Freqüência dos estilos persistentes (FRE) 1. Maior que 40 %; 2. Entre 20-40 %; 3. Menor que 20 %.
34. Persistência de restos florais na ráquis masculina
(PRF)
2
1. Em toda ráquis; 2. Média; 3. Pouca com flores isoladas na
ráquis; 4. Só próximo a última penca; 5. Nenhuma.
35. Persistência de restos bracteais (PRB)
2
1. Em toda ráquis; 2. Em parte da ráquis; 3. Apenas próximo
ao coração; 4. Nenhuma.
36. Cor da casca dos frutos quase madura (CCQ)
1. Verde-escura; 2. Verde-clara; 3. Amarelada; 4. Cinza; 5.
Mais ou menos purpúrea ou rosado; 6. Marrom pálido.
37. Cor da polpa dos frutos quase madura (CPQ) 1. Branca (pálida); 2. Amarelada; 3. Laranja ou pouco
rosado.
38. Cor da casca dos frutos maduros (CCM) 1. Amarela pálida; 2. Amarela; 3. Amarela com laranja; 4.
Vermelha ou púrpura; 5. Marrom pálido; 6. Verde; 7.
Verde-amarelada.
39. Espessura da casca dos frutos maduros (ECA) 1. Espessa (>3 mm); 2. Média (2-3 mm); 3. Fina (<2mm).
40. Aderência da casca dos frutos maduro (ADE) 1. Aderente; 2. Não aderente.
41. Fragilidade da base do pedicelo dos frutos ma duro
(FRA)
1. Frágil, 2. Pouco frágil; 3. Não frágil.
42. Cor da polpa dos frutos maduro (CPM)
1. Branca; 2. Branco-fosca; 3. Cinzenta; 4. Creme; 5.
Amarela; 6. Rosada.
43. Consistência da polpa dos frutos maduros (CPO) 1. Dura; 2. Macia; 3. Mole.
44. Aroma da polpa dos frutos maduros (ARO) 1. Aromática; 2. Pouco aromática; 3. Não aromática.
45. Sabor da polpa dos frutos maduros (SAB)
3
1. Açucarada; 2. Doce; 3. Insípida; 4. Farinhosa.
46. Acidez da polpa (ACD)
2
1. Ácida; 2. Com ésteres; 3. Neutra.
47. Consumo normal do fruto (CNF) 1. Cru; 2. Cozido; 3. Assado ou frito; 4. Como compota.
2.3. Características da ráquis masculina
48. Duração da ráquis (DRA)
1
1. Muito breve; 2. Menor que a maturidade do cacho; 3.
Igual a maturidade do cacho; 4. Sobrevive à maturidade do
cacho.
49. Posição da ráquis (ATI)
1. Vertical; 2.Inclinada; 3. Recurvada; 4. Mais ou menos
horizontal.
3. CORAÇÃO E FLORES MASCULINAS
3.1 Características do coração
50. Forma visual do coração (FVC) 1.Delgada; 2. Lanceolada; 3. Ovada; 4. Ovada larga; 5.
Truncada.
51. Imbricação das brácteas (IMB) 1.Muito imbricadas; 2. Medianamente imbricadas; 3. Pouco
imbricada; 4. Não imbricadas.
52. Forma do ápice da bráctea (APB) 1. Aguda; 2. Quase aguda; 3. Quase obtusa; 4. Obtusa; 5.
Arredondada, às vezes dividida.
53. Cerosidade da bráctea (CER)
1
1. Muita; 2. Média; 3. Muito pouca até nenhuma.
54. Cor conferida pela presença ou não de antocianina
na parte externa da bráctea ou matiz externa (MAE)
1
1. Vermelho claro; 2. Vermelho-escura; 3. Purpúreo; 4.
Violeta; 5. Mais ou menos verde amarelada (sem
antocianina).
55. Ocorrência de outras cores (mistura) nas brácteas
(MIT)
1. Verde amarelado; 2. Marrom pálido; 3. Não misturado.
56. Cor conferida pela presença de antocianina na
parte interna da bráctea ou matiz interna (MAI)
1. Vermelho-escura; 2. Vermelho-clara embaçado;
3.Vermelho-clara brilhante; 4. Púrpuro-escura; 4. Púrpuro-
clara embaçada; 6. Rosada; 7. Amarelada.
3.2 Características das flores
56. Porção sem antocianina na base da bráctea (PNC) 1. Maior que 25%; 2. entre 10-25%; 3. Menor que 10%; 4.
Cor atenuada; 5. Cor contínua.
57. Cor da base do perigônio (CBP)
3
1. Branco; 2. Creme; 3. Amarelado; 4. Rosado.
58. Presença de antocianina no perigônio (CVP)
1. Ausente; 2. Apenas na parte basal; 3. Com listas; 4. Em
todo perigônio.
59. Cor dos lóbulos do perigônio (CLO) 1. Laranja; 2. Laranja amarelada; 3. Amarela; 4. Amarelo-
pálida.
60. Relação tépala livre com o perigônio (RTL)
1
1. Maior que a metade; 2. Metade; 3. Menor que a metade.
61. Cor da tépala livre (CTL) 1. Incolor; 2. Branco-opaca; 3. Amarelada; 4. Rosada.
62 Presença de rugas transversais próximo ao ápice
(RTA)
1. Forte; 2. Média; 3. Fraca; 4. Ausente.
62. Forma do apículo da tépala (FAT) 1. Larga; 2. Fina; 3. Ausente.
63. Comprimento do apículo (COA) 1. Menor que 2 mm; 2. Entre 2-4 mm; 3. Maior que 4 mm.
41
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
64. Cor posterior do estame (CPE)
1
1. Branca; 2. Creme; 3. Amarelo-Clara; 4. Amarelo-fosca;
5. Preta (estames abortivos).
65. Cor da antera (CAT)
1. Branca; 2. Marrom-pálida; 3. Creme; 4. Amarela; 5.
Rosada; 6. Vermelha ou púrpura; 7. Preta (abortiva).
66. Presença de pólen (POL)
1. Ausente; 2. Esparso (<10 %); 3. Conspícuo (15-25 %); 4.
Abundante.
67. Forma do estigma (FOE)
1. Fortemente lobulada; 2. Pouco lobulada; 3. Espatulada. 4.
Arredondada.
68. Cor do estigma (CET)
1. Laranja; 2. Laranja-amarelado; 3. Amarelo-clara; 4.
Pálida ou creme; 5. Rosado.
69. Forma do estilete (FET)
3
1. Reto e Dobrado; 2. Reto; 3. Dobrado.
70. Presença de antocianina no estilete (ANE) 1. Conspícua; 2. Pouca; 3. Ausente.
71. Tamanho do estilete em relação ao perigônio
(ERP)
1
1. Mais ou menos igual; 2. Muito mais curto.
72. Presença de antocianina no ovário (PAO) 1. Ausente; 2. Tingido variavelmente.
1
Esses descritores foram retirados das análises devido à ausência de diversidade ou devido a subjetividade para esses caracteres nos
genótipos avaliados.
2
Novos descritores criados para a caracterização de genótipos.
3
Descritores alterado de SILVA et al. (1999).
42
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Tabela 3. Valores obtidos para cada classe multicategórica, considerando os caracteres da planta (17), do cacho (23) e do coração
1
. Cruz das Almas,
BA, 2006.
Característica Vegetativa da Planta
Genótipos
ROS TCV CME DME FME ANT ALF FMP CMP FFP TFC NSC NIC NIA CLM IGB FOB
Tropical 2 2 3 2 2 2 3 3 4 4 5 3 3 4 3 1 1
FHIA-18 1 2 3 4 3 2 3 3 4 1 4 3 3 4 3 1 1
NAM 1 2 3 4 3 2 1 3 2 1 1 3 4 4 3 2 3
Thap Maeo 1 4 3 2 2 2 1 3 2 2 1 1 2 3 1 1 1
Pacovan Ken 2 2 1 2 3 2 3 3 2 1 1 3 4 4 3 1 1
Bucaneiro
1 2 1 4 3 2 2 1 2 1 1 1 2 4 1 1 1
Caipira 1 2 3 2 2 2 1 3 2 1 1 2 2 4 3 2 3
FHIA-21 2 2 1 2 3 1 2 5 2 2 1 1 2 2 2 1 1
Garantida 2 3 1 2 1 4 3 3 4 5 5 3 4 4 3 1 1
FHIA-01 1 2 1 4 3 2 2 3 2 1 2 3 3 4 1 1 1
Preciosa 2 2 3 4 3 3 2 3 4 5 5 3 4 4 3 1 1
PA42-44 1 2 3 4 3 1 3 1 2 1 1 2 2 4 3 1 1
Nº Classes 2 4 4 6 4 4 3 4 4 5 5 3 4 4 3 3 3
Nº Classes Obs
2
. 2 3 3 3 3 4 3 3 2 5 4 3 3 3 3 2 2
Característica do Cacho
Genótipos
CJU PUB FLX SEC TAP FAP FES FRE CCQ CPQ CCM ECA ADE FRA CPM CPO ARO SAB ACD CNF ATI FCA RBP RFP
Tropical 1 2 1 3 1 1 4 3 3 1 2 2 1 2 1 2 1 2 1 1 1 2 4 5
FHIA-18 1 2 2 2 2 1 4 3 3 1 2 1 2 1 2 2 1 2 3 1 1 1 1 1
NAM 1 2 3 3 1 2 2 1 3 3 3 2 2 3 6 2 1 2 3 1 4 3 4 3
Thap Maeo 1 2 1 3 1 2 4 3 3 3 3 2 2 3 6 2 2 2 1 1 1 3 4 5
Pacovan Ken
1 4 2 1 1 1 4 3 3 3 2 1 2 1 4 2 2 2 3 1 1 1 4 5
Bucaneiro 2 2 2 2 1 1 2 2 2 1 2 1 1 3 1 2 1 2 1 1 3 2 4 4
Caipira 3 2 2 3 1 2 2 1 3 1 3 2 1 3 4 1 2 2 3 1 3 3 4 4
FHIA-21 1 2 2 1 1 1 2 3 3 3 3 2 1 3 6 2 2 2 1 3 1 1 4 5
Garantida
1 4 2 1 1 1 4 3 3 3 2 1 2 2 6 1 2 2 1 1 1 3 4 5
FHIA-01 1 2 2 1 1 1 4 3 2 2 2 1 2 3 6 2 3 2 3 1 1 3 4 4
Preciosa 1 4 2 1 1 1 4 3 2 1 2 1 1 2 4 2 2 2 3 1 1 3 4 5
PA42-44 1 3 2 1 1 1 4 3 3 1 2 1 1 2 4 2 2 2 3 1 1 3 1 1
Nº Classes 3 5 3 3 3 4 4 3 6 3 7 3 2 3 6 3 3 4 3 4 4 3 4 5
Nº Classes Obs. 3 3 3 3 2 2 2 3 2 3 2 2 2 3 4 2 3 1 2 2 3 3 2 4
Características do coração e flores masculinas
Genótipos
FVC IMB APB MIT MAI PNC CBP CVP CLO CTL RTA FAT COA CAT POL FOE CET FES ANE ANO
Tropical 1 3 4 3 3 2 3 1 3 2 1 2 2 2 3 2 4 2 3 1
FHIA-18 5 1 5 3 3 3 3 1 3 2 1 1 2 3 2 2 3 1 1 1
NAM
1 3 1 3 2 3 3 1 2 2 2 2 1 5 2 2 3 2 3 1
Thap Maeo 1 3 5 3 1 5 4 3 2 2 3 3 4 6 1 1 3 3 2 2
Pacovan Ken 1 3 4 3 3 5 3 1 3 2 1 1 3 3 3 1 2 2 2 2
Bucaneiro 1 3 2 3 2 5 3 1 3 2 3 1 1 2 3 4 2 2 1 1
Caipira 1 3 5 2 3 3 3 1 2 1 2 2 2 3 3 4 2 1 2 1
FHIA-21 3 4 1 3 1 5 3 1 2 3 1 2 1 5 3 1 3 2 1 1
Garantida 4 3 4 3 3 5 3 1 3 3 1 2 2 2 3 1 2 1 1 1
FHIA-01 3 2 5 3 3 5 3 3 3 2 1 2 2 3 2 2 3 1 2 1
Preciosa
1 3 4 3 3 5 3 1 3 2 1 2 3 5 3 1 2 2 2 2
PA42-44 5 1 4 3 3 1 3 1 2 2 1 1 3 3 3 2 2 2 1 1
Nº Classes 5 4 5 3 7 5 4 4 4 4 4 3 3 7 4 4 5 3 3 2
Nº Classes Obs. 4 4 4 2 3 4 2 2 2 3 3 3 3 4 3 3 3 3 3 2
1
Descritor observado apenas para um genótipo, estão identificados por um retângulo.
2
Número de classes observadas.
43
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
CP1
CP2
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
6 8 10 12 14 16 18
Linkage Distance
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
FHIA-21
Nam
Caipira
Thap Maeo
FHIA-18
FHIA-01
Bucaneiro
PA42-44
Garantida
Preciosa
Pacovan Ken
Tropical
(B)
(A)
Pacovan Ken
Preciosa
Garantida
PA42-44
Tropical
Bucaneiro
FHIA-18
Thap Maeo
FHIA-21
Caipira
FHIA-01
Nam
Figura 2. Distribuição dos 12 genótipos de bananeira ao longo dos dois componentes principais (A) e o
dendrograma (B) Cruz das Almas, BA, 2006.
Tabela 4. Dados da herdabilidade média (
) das características quantitativas e dos três
componentes principais (CP) em genótipos de bananeira em dois ciclos de produção. Cruz das
Almas, BA, 2006.
h
2
m
Autovetores Associados
Características Avaliadas
h
2
m
CP1 CP2 CP3
Altura de Planta-m
0,93
0,2660 0,2419 0,3224
Diâmetro Pseudocaule- cm
0,88
0,4111 0,0275 -0,0123
Nº de dias até Colheita
0,88
0,3589 -0,1189 0,0621
Comprimento do Engaço- mm
0,92
0,3961 0,1471 -0,0363
Diâmetro do Engaço- mm
0,92
0,4222 0,1044 0,0302
Número de Frutos
0,96
0,3253 -0,3081 0,0466
Peso do Cacho- kg
0,90
0,4135 0,0572 -0,1559
Peso Médio do Fruto-g
0,96
-0,0246 0,4700 -0,1089
Comprimento do Fruto (1ª penca)-cm
0,97
0,0226 0,4066 -0,4276
Comprimento do Fruto (última penca)-cm
0,95
-0,0269 0,4098 -0,4052
Diâmetro do fruto (1ª penca)-mm
0,82
0,0084 0,3322 0,5439
Diâmetro do fruto (última penca)-mm
0,87
-0,1327 0,3626 0,4567
Variância (%) - 42,09 35,16 13,13
Variância Acumulada (%) - 42,09 77,25 90,38
44
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Tabela 5. Características avaliadas de 12 genótipos de bananeira em dois ciclos de produção em Cruz das Almas,
BA, 2006.
Características avaliadas
3
GENÓTIPO
1
ALP DPC NDC CEG DEG NDE PEC PMD CFR1 CFR2 DFR1 DFR2
Tropical 3,20b 25,78b 811,15c 44,00b 58,55c 108,40e 17,21c 147,48c 15,85c 14,35b 40,45a 39,20a
FHIA-18
2,39d 19,75c 802,86c 39,18c 56,55c 123,09d 16,75c 127,37d 16,41c 14,45b 36,00b 34,91b
Nam 3,41a 30,62a 978,58a 54,67a 67,25a 196,67a 20,68b 94,60e 14,00d 12,50c 36,08b 33,42c
Thap Maeo 2,87c 21,55c 869,08b 43,92b 55,00c 164,75b 17,89c 102,83e 13,42d 11,63c 38,46a 36,42b
Pacovan Ken 3,44a 20,75c 788,57c 49,07b 61,64b 86,29f 18,14c 198,97a 18,50b 16,50a 40,36a 38,86a
Bucaneiro 2,80c 22,88c 888,13b 46,50b 62,75b 141,38c 22,08b 146,53c 19,44a 18,00a 37,31b 35,63b
Caipira 2,33d 16,29d 849,73b 34,13c 47,73d 120,80d 12,64d 90,82e 12,87d 11,20c 34,67b 33,53c
FHIA-21
2
2,35d 17,16d 457,56d 37,67c 41,33e 58,33g 10,17d 160,90c 19,11a 18,33a 36,00b 36,02b
Garantida 3,45a 19,99c 842,95b 46,20b 55,90c 80,30f 14,82c 172,03b 17,65b 17,15a 38,25a 37,85a
FHIA-01 3,15b 30,56a 1048,50a 56,42a 69,42a 141,00c 26,96a 175,98b 20,33a 17,92a 34,08c
Preciosa 3,54a 21,94c 706,18c 47,35b 59,47c 85,94f 16,52c 174,65b 19,18a 17,47a 39,35a 38,12a
PA42-44 2,48d 20,06c 899,80b 36,75c 55,90c 84,95f 15,54c 167,44b 17,60b 16,55a 39,60a 38,10a
CV(%) 16,90 26,30 20,09 16,51 13,03 26,36 28,02 19,18 11,06 15,37 8,59 8,04
36,25b
1
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não difere entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Scott & Knott.
2
Dados apenas do 2º Ciclo.
3
Altura de planta (ALP),
Diâmetro do pseudocaule (DPC), Dias do plantio a colheita (DPC), Comprimento do engaço (CEG), Diâmetro do engaço (DEG), Número de frutos (NDF), Peso do cacho
(PCA), Peso médio dos frutos (PMF), Comprimento do fruto da segunda penca (CFR1) e da última (CFR2) e Calibração Lateral da primeira penca (DFR1) e da última
(DFR2).
45
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
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48
CAPÍTULO III
___________________________________________________________________
FINGERPRINTING DE VARIEDADES ELITES DE BANANEIRA
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Fingerprinting de variedades elites de bananeira
1
Onildo Nunes de Jesus
2
, Terezinha Rangel Câmara
3
, Cláudia Fortes Ferreira
4
, Sebastião de
Oliveira e Silva
4
, Kátia Nogueira Pestana
5
, Taliane Leila Soares
6
1
Capíltulo da dissertação de mestrado em Melhoramento Genética de Plantas, UFRPE, Recife-PE
2
Engenheiro Agrônomo (UFBA), Bolsista da CAPES, Mestrando em Agronomia “Melhoramento Genético de
Plantas” da UFRPE. E-mail:[email protected]
3
Professora Adjunta da Universidade Federal Rural de
Pernambuco, E-mail: [email protected].
3
Engenheira Agrônoma, DSc. Pesquisadores da Embrapa
Mandioca e Fruticultura Tropical. E-mail:[email protected].
3
Engenheira Agrônoma, DSc.
Pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical. E-mail:[email protected].
4
Estudante de
Agronomia (UFBA),
5
Bolsista do PIBIC, Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical.
6
Engenheira Agrônoma,
Bolsista da CAPES, Mestranda em Ciências Agrárias da UFBA, E-mail:[email protected]
RESUMO
A maioria dos cultivares de bananeira utilizados no Brasil apresentam suscetibilidade a uma
ou mais das principais pragas e doenças que afetam a cultura. A Embrapa tem nos últimos
anos desenvolvido variedades com boas características agronômicas e resistente às principais
pragas e doenças. Face a reprodução vegetativa da espécie é grande a preocupação em
caracterizar estes genótipos para registro e ou proteção das cultivares, permitindo assim,
controle sobre a multiplicação e comercialização. Para tanto, descritores homogêneos quanto
as características genéticas, independente do estádio de desenvolvimento da cultura e estáveis
ao longo de gerações sucessivas, são de grande importância. Nessa categoria, inserem-se os
descritores moleculares como uma ferramenta importante para a caracterização da espécie. O
objetivo desse trabalho foi caracterizar genótipos de bananeira recomendados pela Embrapa
Mandioca e Fruticultura Tropical por meio dos marcadores RAPD e microssatélites. Foram
utilizados 47 primers de RAPD e 37 primers de microssatélites. No geral, as duas técnicas
não diferiram nos resultados de agrupamento em triplóides e tetraplóides de bananeira,
indicando que ambas as técnicas podem ser usadas isoladas ou em conjunto para maior
caracterização genética das cultivares. No entanto, a capacidade discriminatória dos
microssatélites aliada a sua maior repetibilidade, foi superior à dos RAPD´s, possibilitando
identificar oito variedades que apresentaram um padrão de banda único para os genótipos
avaliados com apenas dois primers. Desta forma, os marcadores microssatélites permitiram
dar os primeiros passos na criação de um banco de dados genético para cada cultivar lançada.
Palavras-chave: Musa spp., certificação genética, proteção de cultivares, fingerprinting,
melhoramento, marcadores moleculares, poliploidia.
49
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Fingerprinting of elite banana varieties
ABSTRACT
Most banana cultivars used in Brazil are susceptible to main pests and diseases. However,
research towards banana breeding focused on these problems are being undertaken. Many
varieties with good agronomic characteristics and resistance to main pests and diseases have
been released by Embrapa Cassava and Tropical Fruits in the last 25 years. With this regard,
the characterization of these varieties for registration and/or protection, enabling the control
over the multiplication and commercialization, due to the species vegetative mode of
reproduction, has gained great concern, being necessary the adoption of a more accurate mode
of characterization. Therefore, the use of homogeneous descriptors regarding genetic
characteristics, regardless of the stage of development of the crop, and that are stable
throughout successive generations, is of great importance. In this category, molecular
descriptors can me mentioned as an important tool for species characterization. The objective
of this work was to characterize banana genotypes being recommended by Embrapa Cassava
and Tropical Fruits using RAPD and microsatellite markers. Forty-eight RAPD primers and
37 microsatellite primers were used. In general, both techniques did not differ in the cluster
analysis (triploids and tetraploids), indicating that both techniques can be used to provide
greater genetic information of the species. However, the discriminatory capacity of the
microsatellite markers, combined with its repeatability, demonstrated superior results when
compared to the RAPD markers, enabling the identification of eight varieties that presented a
unique band pattern for the genotypes tested with only two primers, also setting out the first
steps towards the establishment of a genetic data bank of each variety being released.
Key-words: Musa spp., genetic certification, variety protection, fingerprinting, breding,
molecular markers, poliploidy.
50
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
INTRODUÇÃO
A bananeira (Musa spp.) é cultivada de norte a sul do país e a grande maioria dos
bananicultores são pequenos agricultores que utilizam esta fruteira como fonte de alimentação
e renda. O Brasil é o segundo maior produtor mundial de banana, perdendo apenas para a
Índia, com uma produção estimada de 6,5 milhões de toneladas e área colhida de 485 mil
hectares (FAO, 2005). A exportação no Brasil, foi na ordem de 212 mil toneladas e
representado cerca de 33 milhões de dólares (Brasil, 2006).
Os principais cultivares de bananeira usados no Brasil apresentam baixa produtividade
e suscetibilidade às principais pragas da cultura. No entanto, novos cultivares de bananeira
vem sendo produzidos pela Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, resultando na
recomendação de algumas variedades com resistência genética às sigatokas e mal-do-Panamá.
Com o surgimento de novas cultivares, teve início a preocupação em caracterizar
geneticamente estes genótipos para registro e ou proteção, permitindo assim, o controle sobre
sua multiplicação e comercialização (Bonamico et al., 2004; Priolli et al., 2002). O
desenvolvimento de novas cultivares é um processo caro, para mantê-lo em funcionamento as
instituições de pesquisas tem buscado recursos na proteção de cultivares, que lhes dá direito
sobre a comercialização das variedades recomendadas. No Brasil, essa proteção está
amparada na lei de nº 9.456, de 1997, que instituiu a proteção de cultivares, reconhecendo a
propriedade intelectual e os direitos ao titular de materiais genéticos protegidos. Antes da
aprovação da Lei de Proteção de Cultivares (LPC), o melhorista não tinha direitos legais sobre
a cultivar que tinha criado. A LPC assegura a seu titular o direito à reprodução comercial da
cultivar no território brasileiro, ficando vedados a terceiros, durante o prazo de proteção, a
produção com fins comerciais e o oferecimento à venda ou à comercialização do material de
propagação do cultivar sem sua autorização. Com isso, espera-se que a Instituição possa
recolher os devidos royalties (Brasil, 1998).
51
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Assim, torna-se necessária a caracterização de forma precisa do cultivar, com
aplicação de descritores homogêneos quanto a sua expressão em cada estádio de
desenvolvimento e ao longo dos ciclos (Carvalho et al., 2003).
Os melhoristas ao longo dos anos têm utilizado características morfológicas e
bioquímicas para registrar e proteger suas variedades. Entretanto, embora o emprego destas
metodologias seja importante, há limitações em casos de cultivares aparentados (Priolli et al.,
2002), principalmente no caso do programa de melhoramento de bananeira da Embrapa, onde
se usa um pequeno número de genótipos femininos muito próximos geneticamente. Associado
a isso, estes descritores são influenciados pelo ambiente, são complexos nas suas interações
alélicas (Lombard et al., 1999) e constituem uma base pobre para medir a identidade por
apresentarem uma medida indireta da composição genética do material (Binneck et al., 2002).
De uma forma diferente, os descritores de DNA, apresentam a vantagem de
representarem o genótipo, mantendo consistência nos resultados, evitando o problema da
avaliação dos dados e da expressão do fenótipo (Wünsch & Hormaza, 2002). A possibilidade
de acessar a variabilidade genética diretamente em nível de DNA, vem fazendo com que, cada
vez mais, sejam disponibilizadas técnicas precisas que possam vir a auxiliar o processo
proteção intelectual de materiais genéticos (Padilha et al., 2002).
O marcador molecular do tipo RAPD (Polimorfismo do DNA Amplificado ao Acaso),
consiste em utilizar primers de seqüência arbitrária para dirigir reações de amplificação. Tal
artefato da técnica oferece a oportunidade de gerar grande quantidade de polimorfismo de
fragmentos de DNA oriundos de diferentes partes espalhados por todo o genoma (incluindo
regiões de DNA repetitivo), permitindo assim que possam ser usados no fingerprinting,
distinguindo divergências mínimas entre espécies ou clones ou dentro destes. (Brammer,
2000). Porém, essa técnica apresenta o inconveniente da baixa repetibilidade, a conversão
desta técnica em marcadores do tipo SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions),
52
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
numa segunda etapa, possibilita contornar esse problema (Carvalho et al., 2003).
Alternativamente, os microssatélites, ou SSR´s (Simple Sequence Repeats), são
seqüências curtas de DNA consistindo de mono, di, tri ou tetranucleotídeos repetidas em
tandem e são marcadores altamente polimórficos, altamente informativos e cada indivíduo
pode apresentar um fingerprinting único (Decroocq, et al., 2004). Os locos SSR´s parecem ser
somaticamente estáveis, possuem expressão co-dominante, são multialélicos, sendo ideais,
para a identificação e discriminação de genótipos (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Os marcadores dos tipos SSR e RAPD, tem sido amplamente utilizados como
ferramentas para a identificação e caracterização de variedades. Existem vários trabalhos na
literatura objetivando a caracterização e identificação varietal de genótipos utilizando essas
técnicas em bananeira (Creste et al., 2001; Creste et al., 2003; Paz, 2000; Pillay et al; 2000;
Crouch et al., 1998). Assim, o uso de marcadores baseados em DNA pode ser empregada para
comprovar a identidade de uma cultivar que tenha sido registrada com base apenas em
descritores morfológicos (Nielsen & Lovell, 2000).
O presente trabalho teve como objetivo caracterizar molecularmente genótipos elites e
recomendados de bananeira por meio de marcadores RAPD e microssatélites.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram caracterizadas molecularmente, 14 variedades de bananeira adaptadas,
desenvolvidas e recomendadas pela Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, que
pertencem a diferentes grupos genômicos, bem como possuem resistência variada a diferentes
pragas e doenças (Tabela 1).
A extração de DNA foliar foi realizada no Laboratório de Virologia e Biologia
Molecular da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical. O DNA foi extraído de folhas
53
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
jovens seguindo a metodologia descrita por Doyle e Doyle (1990). A avaliação da quantidade
e qualidade do DNA foi efetuada mediante análise comparativa das amostras em gel de
agarose 0,8%, corado com brometo de etídio (0,5 µgmL
-1
). As amostras foram diluídas em
água ultrapura e foram padronizadas em 10 ng µL
-1
para serem utilizadas nas análises de
microssatélites e RAPD. As reações de amplificação via RAPD foram conduzidas de acordo
com os procedimentos descritos por Williams et al. (1990). As bandas de DNA foram
visualizadas sob luz ultravioleta e as imagens captadas pelo sistema Kodak Digital de
fotodocumentação e as fotos armazenadas em computador.
As reações de amplificação via SSR´s foram completadas para o volume final de 25
µL, contendo: KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl
2
2,4 mM, 100 mM de cada um
dos dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), 0,2 mM de primer, 50 ng de DNA e uma unidade de
Taq polimerase (Pharmacia Biotech, EUA). Os primers foram cedidos pelo Laboratório de
Biologia Molecular do CENA-USP, em Piracicaba –SP e pela Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, em Brasília-DF. As amplificações foram realizadas em termociclador BioRAD
My-Cycler Thermo Cycler e cada primer foi testado conforme a temperatura de anelamento
sugerida pelo fabricante, seguido de um programa de touchdown com os seguintes ciclos: um
ciclo a 94° C por 3 minutos, 10 ciclos a 94ºC por 40 segundos, 40 segundos em touchdown de
65°C com diminuição de 1ºC a cada ciclo, 72ºC por um minuto, 24 ciclos a 94ºC por 40
segundos, 55ºC por 40 segundos, um ciclo de 72ºC por 4 minutos e um ciclo a 4ºC até a
retirada do termociclador.
Após a montagem das placas o gel poliacrilamida (5%) foi aquecido por 45 min.a 45
W até a temperatura de 45ºC. Os DNAs amplificados foram desnaturados por 5 min. a 95ºC
em 5 µL de tampão desnaturaste e colocadas imediatamente em gelo. Em seguida foi aplicado
8 µL de cada amostra no gel e feito uma corrida a 80 W durante 90min. Posteriormente foi
conduzida a coloração com prata e após a revelação, os géis foram colocados para secar
54
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
durante 24 h e posteriormente foram escaneados e as imagens captadas e armazenadas em
computador. O preparo gel de poliacrilamida (5%), montagem das placas e revelação com
prata encontam-se em Creste, (2002).
Os produtos das amplificações foram computados como ausência (0) e presença de
bandas (1) para as 14 variedades elites avaliadas. A dissimilaridade entre os genótipos foi
calculadas pelo coeficiente de dissimilaridade de Jaccard. O calculo da dissimilaridade foi
feita utilizando o programa GENES (Cruz, 2001), que gerou as matrizes de distância genética
entre todas as variedades. A partir da matrizes e com o auxílio do programa STATISTICA
(Statistica, 2002) foram gerados agrupamentos pelo método da média aritmética não
ponderada (UPGMA), com 1000 simulações expressos na forma de dendrogramas.
Capacidade dos microssatélites na detecção da pureza varietal
Com o intuito de demonstrar a eficiência dos marcadores microssatélites na detecção
de DNA estranho (contaminantes) em lotes de mudas de bananeira, foi efetuado uma
simulação misturando-se diferentes concentrações de DNA exógeno seguindo as quantidades
mostrada na Tabela 6. Nesta simulação a amostra 1(‘Tropical’) cujo padrão de banda já é
conhecido, foi submetida a duas condições de amplificação utilizando o primer AGMI 24-25.
Em ambas as condições, a cultivar Tropical foi mantida como genótipo predominante no lote.
No primeiro tratamento (T
1
), a variedade Tropical foi misturada com diferentes quantidades
de DNA da amostra 8 (‘Prata Graúda’) e no segundo tratamento (T
2
) a variedade Tropical foi
misturada com quantidades de DNA das amostras 6 (‘Caipira’) e a amostra 8 ( ‘Prata
Graúda’) como duas fontes de contaminação. Nesta situação, volumes iguais das duas
amostras foram misturados e retiradas alíquotas conforme a Tabela 5.
55
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram avaliados 47 primers de RAPD que produziram um total de 328 bandas
evidentes. Dessas, 328 bandas, 82 monomórficas e 246 polimórficas foram utilizadas para as
análises. A média de bandas polimórficas por primer foi de 5,35. Os primers OPA-05 e
OPAA-12 geraram o maior número de bandas polimórficas, 14 e 16, respectivamente. O
menor número de bandas polimórficas oscilou entre um para os primers OPE-10, OPF-G-17 e
OPE-08 e dois, para os primers OPB-06, OPI-03, OPH-14 e OPH-16.
Para as análises com microssatélites testou-se 34 primers. Destes, 20 produziram
bandas evidentes e foram utilizadas nas análises. Sete primers apresentaram bandas não
evidentes, três apresentaram falha na amplificação na maioria dos genótipos, três primers não
geraram produtos de amplificação e apenas um primer apresentou bandas monomórficas.
A análise de agrupamento para ambas as técnicas está ilustrada na Figura 1. Pode-se
observar que de forma geral, não houve muitas diferenças nos agrupamentos gerados pelos
marcadores RAPD e os de SSR´s, quando analisados os dados separadamente, o que já era
esperado, por ambos mostrarem a variabilidade a nível de DNA. Os dendrogramas mostraram
claramente a separação dos grupos (triplóides e tetraplóides), e a confiabilidade dos dados e
consistência das bifurcações (bootstrapping), foram constatados pelos altos valores do
bootstrap (Tabela 3). Ambas as técnicas apresentaram valores alto de bootstrap (acima de
50%) para a maioria dos grupos formados. De maneira geral, houve uma maior consistência
das bifurcações quando as cultivares foram analisados com microssatélites.
Os valores altos de bootstrap demonstram que os marcadores RAPD foram capazes de
separar nitidamente as variedades segundo o grau de ploidia e os grupos genômicos. No
primeiro grupo, compreendendo todos os genótipos portadores do genoma A, e no segundo
grupo, os genótipos portadores do genoma AB, incluindo nesse último, todos os híbridos
tetraplóides avaliados. O primeiro grupo incluiu as variedades Nam (AAA), Caipira (AAA) e
56
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Bucaneiro (AAAA). O segundo grupo incluiu as variedades Thap Maeo (AAB) e os híbridos
tetraplóides AAAB, representados pelos cultivares FHIA-01, FHIA-02, FHIA-18, FHIA-21,
Garantida, Preciosa, Pacovan Ken, Prata Graúda, Tropical e o híbrido PA42-44.
Os marcadores microssatélites revelaram comportamento semelhante aos apresentados
pelos marcadores RAPD em relação à separação de acordo com o grupo genômico, nível de
ploidia e origem dos híbridos, porém, FHIA-21, ficou separado dos demais genótipos AAAB.
Resultado semelhante foi obtido por Bhat et al., (1995) trabalhando com marcadores RFLP e
RAPD e Howell et al., (1994) trabalhando com nove primers RAPD.e por Creste, (2002), que
avaliou cultivares e híbridos de bananeira por meio de marcadores microssatélites
conseguindo separar os genótipos segundo o nível de ploidia, grupo genômico e subgrupos.
Esta classificação, assim obtida, se assemelha à caracterização morfológica, que separa
a FHIA 21 dos demais genótipos por ser do subgrupo Terra (Plátano). Cultivares deste
subgrupo, apresentam frutos compridos com quinas evidentes, polpas rosadas e consistentes,
ideais para o consumo cozido ou frito (Moreira, 1999). Os demais genótipos AAAB são tipo
Prata ou Maçã e mais adequados para consumo in natura.
Como era de se esperar, os híbridos tetraplóides Garantida, Preciosa e Pacovan Ken
respectivamente, resultantes dos cruzamentos dos cultivares (AAB) Prata São Tomé e
Pacovan e com o genitor masculino diplóide (AA) M53, ficaram agrupados. Vale ressaltar
que os cultivares Preciosa e Pacovan Ken são irmãos completos e que a ‘Pacovan’ é uma
mutação da ‘Prata’ intensificando assim o grau de parentesco entre os genótipos.
Morfologicamente existem poucas diferenças entre essas três variedades.
O resultado da amplificação com 22 primers via RAPD, reforça ainda mais a alta
similaridade genética desses cultivares (Figura 2) . Foi possível verificar que apenas o cultivar
Preciosa apresentou bandas características, enquanto a Garantida e a Pacovan Ken não
diferiram para alguns primers avaliados. Creste et al., (2003), trabalhando com marcadores
57
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
SSR´s e como no presente estudo, também encontrou dificuldade em discriminar tais
genótipos. O arranjo dos dendrogramas alocando variedades com origem comum, como os do
mesmos subgrupos, é perfeitamente justificado pelos altos níveis de similaridade genética
observados (Creste et al., 2003).
A identificação de cultivares utilizando marcadores do tipo RAPD é bastante
divulgada em trabalhos de caracterização molecular (Sawazaki, et al., 2002; Bianchi et al.,
2003; This et al., 1997; Crochemore et al., 2004). Em alguns casos ela é baseada na seleção de
bandas e primers (Binneck et al., 2002). Neste trabalho os cultivares FHIA-18, Caipira,
FHIA-21 foram identificados com o primer OPH-04. A Caipira foi também identificada com
OPC-08, enquanto os genótipos Caipira, FHIA-02, FHIA-21 e Nam tiveram sua identificação
com o primer OPO-02 (Figura 3).
Os primers de microssatélites, AGMI 24-25; Ma 3/103; STMS 1FP-1RP e Ma 1/24
permitiram a identificação dos cultivares Bucaneiro, Caipira, FHIA-0, FHIA-18, FHIA-21,
Tropical, PA42-44 e Nam (Figuras 4). O primer AGMI 24-25 é também mencionado por
Kaemmer et al., (1997) na identificação genótipos com o genoma B. Tal fato, foi confirmado
nos trabalhos de Creste et al., (2003) e no presente trabalho. No entanto, os cultivares Terra
(AAB) Creste et al., (2003) e FHIA 21 (AAAB) no presente trabalho, que são plátanos, não
apresentaram o alelo de identificação produzido pelo primer AGMI 24-25. De forma similar,
o primer Ma 1/103 também identificou alelos característicos do genoma B, não demostrando
a presença desses alelos no plátano Terra (Creste et al, 2003) e plátano FHIA-21 no presente
estudo.
O tamanho dos alelos observados variou de 100 a 500 pb e o número de alelos variou
entre 4 e 10. De maneira geral, as variações no tamanho (pb) dos alelos foram diferentes do
observado por Creste et al., (2003), que por sua vez, diferiram dos resultados de Kaemmer et
al., (1997) embora tenham utilizado os mesmos marcadores. Esta discrepância pode ser
58
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
devida às condições de desnaturação durante a eletroforese, às diferenças na composição de
bases e ao tipo de marcador de peso molecular (ladder) Testolin et al. (2000) .
Com os primers AGMI 24-25 e STMS 1FP-1RP, nove genótipos foram discriminados.
Desses, sete o foram pelas diferentes bandas de alelos produzidas pelo primer AGMI 24-25,
isso indica sua alta capacidade discriminatória e também reforça a sua característica
multialélica (Figura 4).
A superioridade dos SSR´s em relação ao RAPD pode ser demonstrada, pela sua
capacidade de identificar sete dos quatorze genótipos avaliados com o padrão de bandas
gerado por um único primer, o AGMI 24-25. Creste, (2002), trabalhando com os mesmos
primers, conseguiu uma discriminação de 83% dos genótipos avaliados. Não foram
produzidas bandas características para os genótipos Preciosa, Garantida, FHIA-02. Todavia, a
caracterização destas variedades pode ser complementada com as informações dos primers de
RAPD. Os primes de RAPD e SSR´s foram capazes de formarem um fingerprinting para as
demais variedades elites de bananeira estudadas (Tabela 4).
A simulação de contaminação em lotes de muda de bananeira é mostrado na Figura 5.
Observa-se que o emprego do primer AGMI24-25 como marcador, permitiu observar
variações mínimas presentes no DNA. Tanto no tratamento T
1
como no T
2
, este primer foi
capaz de identificar todos os alelos das amostras utilizadas como contaminantes. No entanto,
quando se analisa a intensidade das bandas, nota-se que a visualização melhor ocorre quando
temos um volume de 1,5 µL (30%) do DNA contaminante ou da amostra padrão (amostra 1).
Como pode ser observado, embora com baixa visibilidade, foi possível detectar o
DNA da ‘Tropical’ em um volume de 0,5 µL (10%). Assim sendo, com uma reação de 25 uL
contendo uma massa final de 50 ng de DNA, o primer é capaz de amplificar um DNA
específico que esteja presente em uma quantidade de 5 ng. Esse resultado indica a alta
especificidade da técnica de SSR na detecção de qualquer vestígio mínimo de DNA exógeno
59
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
ou contaminante. Tal fato está relacionado a especificidade dos iniciadores que são
construídos para uma região específica do genoma, amplificando mesma em quantidades
mínimas de DNA (Ramos, 2004).
De posse desse resultado, verifica-se que a técnica é confiável quando se busca
identificar a pureza varietal nas amostras analisadas. Vários trabalhos reportam a utilização
dos marcadores moleculares para identificação de pureza genética (Ramos, 2004; Padilha et
al., 2003; Priolli et al., 2002).
CONCLUSÕES
As análises de RAPD e SSR conseguiram separar 14 variedades segundo os grupos
genômicos e o nível de ploidia para a maioria dos genótipos avaliados.
As cultivares Garantida, Preciosa e Pacovan Ken, apresentaram uma alta similaridade
genética para ambos marcadores.
Os primers AGMI24-25 e STMS 1FP-1RP apresentaram a maior capacidade de discriminar a
maioria dos genótipos avaliados.
Mediante ao uso de marcadores de DNA é possível obter um fingerprinting de variedades de
banana.
O primer AGMI 24-25 mostrou-se eficiente em discriminar todos os alelos de cada genótipos
quando misturados, indicando ser uma ferramenta importante em detectar a pureza varietal de
cultivares de bananeira.
AGRADECIMENTOS
Os autores gostariam de agradecer à Universidade Federal Rural de Pernambuco, aos técnicos
do Laboratório de Virologia e Biologia Molecular da Embrapa Mandioca e Fruticultura
Tropical, ao CENA-USP, à Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia à CAPES e à
FAPESB pelo apoio recebido na execução deste trabalho.
60
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
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66
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Tabela 1. Genótipos de bananeira desenvolvidos e recomendados pela Embrapa
Mandioca e Fruticultura Tropical. Cruz das Almas, BA, 2006.
Genótipos
Grupo
Genômico
Subgrupo
Genealogia
(Origem)
Reação às doenças
Tropical AAAB Maçã Yangambi nº2 x M53
(Embrapa)
Resistente a Sigatoka
amarela e tolerante ao mal-
do-Panamá
1
FHIA-18 AAAB Prata ‘Prata Anã’ x 2n
(FHIA)
2
Moderadamente resistente
a Sigatoka amarela e
resistente a Sigatoka negra
Preciosa AAAB Prata ‘Pacovan’ x M53
(Embrapa)
Resistente às Sigatokas
amarela e negra e mal-do-
Panamá
Thap Maeo AAB Mysore Cultivar tipo Mysore
(Tailândia)
Resistente às Sigatokas
amarela e negra e mal-do-
Panamá
Garantida AAAB Prata ‘Prata São Tomé’ x
M53 (Embrapa)
Resistente às Sigatokas
amarela e negra e mal-do-
Panamá
Caipira AAA - Cultivar (África
Ocidental)
Resistente às Sigatokas
amarela e negra e mal-do-
Panamá
Bucaneiro AAAA Gros
Michel
Híbrido High Gate
(Jamaica)
Resistente a Sigatoka
amarela e mal-do-Panamá
Prata
Graúda
AAAB Prata Prata Anã x SH 3393 Suscetível às Sigatokas
amarela e negras e
resistente ao Mal- do-
Panamá e
Pacovan
Ken
AAAB Prata ‘Pacovan’ x M53
(Embrapa)
Resistente às sigatokas
amarela e negra e mal-do-
Panamá
FHIA-01 AAAB Prata ‘Prata Anã’ x SH 3142 Resistente a Sigatoka
negra e mal-do-Panamá
FHIA-21 AAAB Terra Honduras Resistente às Sigatokas
amarela e negra e mal-do-
Panamá
FHIA-02
AAAB Williams x SH 3393 Moderadamente resistente
a Sigatoka amarela e ao
mal-do-Panamá
PA42-44 AAAB Prata ‘Prata Anã’ x M53
(Embrapa)
Resistente a Sigatoka
amarela e mal-do-Panamá
Nam AAA - Tailândia Resistente a Sigatoka
amarela e mal-do-Panamá
1
FHIA: Federación Hondureña de Investigación Agrícola
67
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Tabela 2. Primers de microssatélites testados na caracterização de14 amostras de DNA de
bananeira (Musa spp.). Cruz das Almas, BA, 2006.
Primers Seqüência de
bases (5’-3’)
Resultado
Ma 3/90 F: GCACGAAGAGGCATCAC
R: GGCCAAATTTGATGGACT
Bandas evidentes
MaO –1G10 F: TCTCAGGAAGGGCAACAATC
R: GGACCAAAGGGAAAGAAACC
Bandas evidentes
MaO-1H06 F: GGAGGAAATGGAGGTCAACA
R: TTCGGGATAGGAGGAGGAG
Bandas evidentes
MaO –2 C07 F: ACCTGTGGCTTCGTTCTG
R: TTGTCCTTTTTCGTTATTTCCT
Falha na amplificação
MaO –2 C11 F: GGAAGAAAGAAGTGGAGAATGAA
R: TGAAATGGATAAGGCAGAAGAA
Bandas evidentes
MaO –2 D09 F: GCAAGAAAGAACGAGAAGGAAA
R: GTGGGGAGGGAGGCATAG
Bandas evidentes
MaO –2D10 F: GCTGCTATTTTGTCCTTGGTG
R: CTTGATGCTGGGATTCTGG
Bandas com arraste
STMS 1FP-1RP F: TGAGGCGGGGAATCGGTA
R: GGCGGGAGACAGATGGAGTT
Bandas evidentes
STMS 7FP-7RP F: AAGAAGGCACGAGGGTAG
R: CGAACCAAGTGAAATAGCG
Bandas com arraste
Ma 3/60 F: TGGCTGACAATTACATGACA
R:GCGCACTGTGGTGTGT
Bandas evidentes
Ma 3/48 F: CCCGTCCCATTTTCTCA
R: TTCGTTGTTCATGGAATCA
Bandas evidentes
Ma 3/81 F: CTAGGTCTTCCTGCTGCTC
R: TGAGCGAATTTGATCAGAAC
Falha na amplificação
Ma 3/46 F: CTTTGGAAGGTGGTTCTCA
R: ACGACTGAGACCGATTGAG
Bandas evidentes
Ma 2/7 F: TGAATCCCAAGTTTGGTCAAGA
R: CAACTCTTGTCCCTCACTTCA
Bandas evidentes
Ma 3/41 F: GAAGCATCCAATGGACCTA
R: GCGAACTCACAATAGCGA
Falha na amplificação
Ma 3/50 F: GGTGGATGGCTGGGTA
R: GGATCCAAGCTTATCGAGTT
Não amplificou
Ma 2/4 F: CTCCTTTGTGAGCTCGGCATAT
R: AGGGTCCAAGAAACTCCTCCAA
Bandas não evidentes
AGMI 103-103 F: CAGAATCGCTAACCCTAATCCTCA
R: CCCTTTGCGTGCCCCTAA
Bandas evidentes
AGMI 105-105 F: TCCCAACCCCTGCAACCACT
R: ATGACCTGTCGAACATCCTTT
Bandas evidentes
AGMI 125-125 F: TCCCATAAGTGTAATCCTCAGTT
R: CTCCATCCCCCAAGTCATAAAG
Banda com arraste
AGMI 127-127 F: AAGTTAGGTCAAGATAGTGGGATTT
R: CTTTTGCACCAGTTGTTAGGG
Bandas evidentes
AGMI 24-25 F: TTTGATGTCACAATGGTGTTCC
R: TTAAAGGTGGGTTAGCATTAGG
Bandas evidentes
AGMI 33-33 F: AGTTTCACCGATTGGTTCAT
R: TAACAAGGACTAATCATGGGT
Bandas evidentes
68
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
AGMI 35-35 F: TGACCCACGAGAAAAGAAGC
R: CTCCTCCATAGCCTGACTGC
Monomórfica
AGMI 59-59 F:AATCGAAATCGAGTCAACAAGG
R:TTTTGTGGATGGTTGGTTCC
Não amplificou
AGMI 93-93 F: ACAACTAGGATGGTAATGTGTGGAA
R: GATCTGAGGATGGTTCTGTTGGAGTG
Bandas com arraste
AGMI 95-95 F: ACTTATTCCCCCGCACTCAA
R: ACTCTCGCCCATCTTCATCC
Banda com arraste
Ma 1/16 F: TTTGCCTGGTTGGGCTGA
R: CCCCCCTTTCCTCTTTTGC
Bandas com arraste
Ma 1/17 F: AGGCGGGGAATCGGTAGA
R: GGCGGGAGACAGATGGAGT
Bandas evidentes
Ma 1/2 F: GATGATGGTGAGAGGCTGATGA
R: GGTCGGTATGGGAAGCACC
Não amplificou
Ma 1/24 F: GAGCCCATTAAGCTGAACA
R: CCGACAGTCAACATACAATACA
Bandas evidentes
Ma 1/27 F: TGAATCCCAAGTTTGGTCAAG
R: CAAAACACTGTCCCCATCTC
Bandas evidentes
Ma 1/139 F: ACTGCTCTCCACCTCAAC
R: GTCCCCCAAGAACCATATGATT
Bandas evidentes
Ma 3/103 F: TCGCCTCTCTTTAGCTCTG
R: TGTTGGAGGATCTGAGATTG
Bandas evidentes
Tabela 3. Análise de Bootstrap com os dados de RAPD e Microssatélites em cultivares e
híbridos de bananeira. Cruz das Almas, BA, 2006.
RAPD Microssatélites
Consistência das
bifurcações
Repetibilidade
(%)
Consistência das
bifurcações
Repetibilidade
(%)
Prata Graúda FHIA-01 86,5 Preciosa Garantida 100
Pacovan Ken PA42-44 47,3 Preciosa Pacovan Ken 99,2
Preciosa Garantida 68,2 Thap Maeo Prata Graúda 96,8
Prata Graúda Pacovan Ken 44,9 Thap Maeo FHIA-02 60,5
Preciosa Thap Maeo 73,8 FHIA-01 PA42-44 30,4
Preciosa Prata Graúda 62,5 Thap Maeo FHIA-01 67,4
Tropical FHIA-18 100 Preciosa Thap Maeo 85,7
Tropical Preciosa 97,6 Tropical FHIA-18 100
Bucaneiro Nam 43,8 Preciosa Bucaneiro 60,2
Tropical FHIA-02 63,1 Tropical Preciosa 90,4
Caipira Bucaneiro 58,7 Caipira Nam 71,9
Tropical FHIA-21 87,5 Tropical Caipira 94,8
Tropical Caipira 98,3 Tropical FHIA-21 91,4
1
Boostrap realizado com 1000 simulações.
69
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Tabela 4. Marcadores RAPD e Microssatélites que geram um perfil característico para os
cultivares de bananeira avaliados. Cruz das Almas, BA, 2006.
Primers identificados na caracterização
Genótipos RAPD´s SSR´s
Tropical OPH-04; OPA-05; OPF-07 AGMI 24-25
FHIA-18 OPH-04; OPA-05 AGMI 24-25; STMS 1FP-1RP
Preciosa OPA-05; OPF-15; OPH-09; OPAA-19;
OPG-17
*
Thap Maeo OPF-05 MaO-2C11
Garantida
1
OPA-13; OPA-18
*
Caipira OPH-04; OPC-08; OPO-02; OPI-09; AGMI 24-25; Ma 2-7FR; STMS
1FP-1RP; Ma 3-90; Ma 1-27
Bucaneiro OPF-12; OPH-09; OPI-06; OPH-14 AGMI 24-25
Prata Graúda * MaO-2C11
Pacovan Ken OPA-04 STMS1FP-1RP
FHIA-01 * Ma 3-90; STS 1FP-1RP
FHIA-21 OPH-04; OPO-02;OPF-12; OPH-11 AGMI 24-25; Ma 1-27; MaO-
2C11, STMS 1FP-1RP
FHIA-02 OPO-02; OPAA-12 *
PA42-44 * AGMI24-25; STMS 1FP-1RP
Nam OPO-02; OPH-07 AGMI 24-25; MaO-2D09; STMS
1FP-1RP, Ma 3-103
1
A ‘Garantida’ não apresentou banda particular apenas ausência quando comparado a Preciosa e Pacovan Ken com os
primers RAPD citado. * Não foram encontradas marcas específicas para essas cultivares.
Tabela 5. Teste de sensibilidade do marcador microssatélites utilizando o primer AGMI 24-
25 na identificação de DNA contaminante.Cruz das Almas, BA, 2006.
Simulação da contaminação
1
Com um contaminante no lote (T
1
) Com dois contaminantes no lote(T
2
)
DNA Tropical (µL)
DNA Prata Graúda
(µL)
DNA Tropical
(µL)
Prata Graúda + Caipira
(µL)
4,5 0,5 4,5 0,5
3,5 1,5 3,5 1,5
2,5 2,5 2,5 2,5
1,5 3,5 1,5 3,5
0,5 4,5 0,5 4,5
1
Quantidade total de DNA em cada poço foi de 5µL
70
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Linkage Distance
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
Nam
Bucaneiro
Caipira
FHIA-21
FHIA-02
PA42-44
Pacovan Ken
FHIA-01
Prata Graúda
Thap Maeo
Garantida
Preciosa
FHIA-18
Tropical
Linkage Distance
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
FHIA-21
Nam
Caipira
Bucaneiro
PA42-44
FHIA-01
FHIA-02
Prata Graúda
Thap Maeo
Pacovan Ken
Garantida
Preciosa
FHIA-18
Tropical
(A)
(
B
)
Figura 1. Dendrograma das relações genéticas entre cultivares e híbridos de bananeira obtido
por RAPD (A) e Microssatélites (B), gerado pelo coeficiente de dissimilaridade de Jaccard.
Cruz das Almas, BA, 2006.
M
OPB-10 OPF-07 OPF-14 OPH-18 OPA-04 OPA-05 OPAA-12 OPF-15 OPH-09 OPO-04 OPH-19
M
OPD-04 OPA-03 OPG-12 OPN-20 OPA-13 OPA-18 OPAA-19 OPH-04 OPC-04 OPI-09 OPG-17
12312312312 3123123123123 123123123
Figura 2. Amplificação com 22 primers RAPD para as cultivares de bananeira Preciosa (1),
Garantida (2) e Pacovan Ken (3). M = Marcador de 1kb. OPN-20; OPC-04 não amplificou.
As setas indicam a presença ou ausência de bandas em um genótipo particular.
71
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
A B C
Figura 3. Resultado da amplificação com os primers OPH-04 (A), OPC-08 (B) e OPO-02 (C)
em cultivares e híbridos de bananeira. 1. Tropical; 2.FHIA-18; 3. Preciosa; 4.Thap Maeo; 5.
Garantida; 6. Caipira; 7. Bucaneiro; 8. Prata Graúda; 9. Pacovan Ken; 10. FHIA-01; 11.
FHIA-21; 12. FHIA-02; 13. PA42-44 e 14. Nam. M: marcador 1kb. As setas indicam a
presença de bandas particulares de cada genótipo.
Figura 4. Resultado da amplificação com os primers AGMI 24-
25 (A) E STMS 1FP-1RP (B) de microssatélites em cultivares e
híbridos de bananeira. 1. Tropical; 2. FHIA-18; 3. Preciosa; 4.
Thap Maeo; 5. Garantida; 6. Caipira; 7. Bucaneiro; 8. Prata
Graúda; 9. Pacovan Ken; 10. FHIA-01; 11. FHIA-21; 12. FHIA-
02; 13. PA42-44 e 14. Nam. M: marcador 123pb. Seta na
horizontal mostra alelos presentes no genoma B; seta na vertical
indica os padrões dos genótipos identificados.
(B)
M
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
(A)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
M
72
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
M
Contaminante (8)
2,5 3,5 4,5
1,5
0,5
Contaminantes (6 e 8)
2,5 3,5 4,5
0,5
1,5
1
6
8
T
2
T
1
8
1
Figura 5. Simulação da sensibilidade do marcador AGMI24-25 em detectar DNA estranho
em lotes de muda de bananeira. Tratamento T
1
com apenas um contaminante (8) e tratamento
T
2
com dois contaminantes (6 e 8). 1: Tropical; 6: Caipira e 8. Prata Graúda. 0,5; 1,5; 2,5; 3,5;
4,5µL são os volumes adicionados de DNA estranho (6 e 8) na placa, essa com DNA da
amostra 1 nos volumes de 4,5; 3,5; 2,5; 1,5 e 0,5µL e M: marcador molecular de 123pb. Setas
indicam os alelos identificados.
73
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
CONCLUSÕES GERAIS
Os descritores qualitativos e quantitativos mostraram uma ampla variabilidade genética entre
os genótipos estudados permitindo sua perfeita caracterização. No entanto, considerando a
natureza dos descritores morfológicos um estudo em novos ambientes poderá validar melhor
sua utilização.
Os descritores morfológicos juntamente com os de DNA apresentaram uma baixa
discriminação para os genótipos Preciosa, Garantida e Pacovan Ken, indicando a necessidade
de utilização de novos primers para uma melhor caracterização desses genótipos.
Os descritores morfológicos e moleculares agruparam as variedades em função da ploidia e do
grupo genômico da bananeira.
Os descritores baseados em microssatélites foram superiores aos demais pela repetibilidade e
alta capacidade discriminatória detectada, permitindo definir padrões moleculares para
algumas cultivares avaliadas.
Com os primers selecionados, somados aos já indicados, tem-se o inicio da criação de um
banco de dados moleculares para a identificação varietal de bananeiras recomendas pela
Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical.
74
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
ANEXOS
75
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Primers RAPD utilizados para amplificação de 14 amostras de DNA de
bananeira. Cruz das Almas, BA, 2006.
Primers Seqüência 5’-3’ Primers Seqüência 5’-3’
OPA-03 AGTCAGCCAC OPF-12 ACGGTACCAG
OPA-04 AATCGGGCTG OPF-14 TGCTGCAGGT
OPA-05 AGGGGTCTTG OPF-15 CCAGTACTCC
OPA-13 CAGCACCCAC OPF-20 GGTCTAGAGG
OPA-15 TTCCGAACCC OPG-12 CAGCTCACGA
OPA-18 AGGTGACCGT OPG-13 CTCTCCGCCA
OPAA-12 GGACCTCTTG OPG-17 ACGACCGACA
OPAA-19 TGAGGCGTGT OPG-19 GTCAGGGCAA
OPB-06 TGCTCTGCCC OPH-09 TGTAGCTGGG
OPB-07 GGTGACGCAG OPH-02 TCGGACGTGA
OPB-10 CTGCTGGGAC OPH-03 AGACGTCCAC
OPB-14 TCCGCTCTGG OPH-04 GGAAGTCGCC
OPB-19 ACCCCCGAAG OPH-14 ACCAGGTTGG
OPC-04 CCGCATCTAC OPH-15 AATGGCGCAG
OPC-08 TGGACCGGTG OPH-16 TCTCAGCTGG
OPD-03 GTCGCCGTCA OPH-18 GAATCGGCCA
OPD-04 TCTGGTGAGG OPH-19 CTGACCAGCC
OPD-05 TGAGCGGACA OPI-03 CAGAAGCCCA
OPE-08 TCACCACGGT OPI-06 AAGGCGGCAG
OPE-10 CACCAGGTGA OPI-09 TGGAGAGCAG
OPE-16 GGTGACTGTG OPI-10 ACAACGCGAG
OPE-18 GGACTGCAGA OPM-01 GTTGGTGGCT
OPF-07 CCGATATCCC OPN-20 GGTGCTCCGT
OPO-04 AAGTCCGCTC - -
76
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
C
B
A
Estigma
Antera
Apículo
Estame
Tépala livre
Estilete
Perigônio
Lóbulo
Ovário
Detalhamento da flor masculina da cultivar Thap Maeo. Conjuntos de flores maculinas
(A), flor individualizada (B) e detalhamento da flor (C).
(A)
Nervura
Principal
Faixa colorida
Penca em Engaço
Coração
(B)
Roseta
Pecíolo
©
(D)
Manchas
irregulares
Manchas
circulares
Manchas
pretas
e
g
randes
(C)
Ráquis
Feminina
(Frutos)
C
Ráquis Masculina
Pseudocaule
Almofada
Rabo sujo
(Brácteas)
Detalhamento da planta de bananeira.
Inflorescência (A), Roseta (B), Cacho (C),
manchas do
p
eseudocaule
(
D
)
77
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
(B)
(A)
(D)
(C)
Forma da faixa colorida do pecíolo: Em forma de fita visível (A) e (B), Faixa
confunde com a cor do pecíolo (C); Ausente (D).
Bucaneiro FHIA-21
Thap Maeo Tropical
FHIA-18
Cor da casca, polpa e a presença de quinas nas cultivares de bananeira avaliadas.
Cruz das Almas-BA, 2006.
78
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
ISSN 1678-4499 versão online
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a) Título; Autor (es).
b) Resumo (no máximo 250 palavras) em português, palavras-chave. Deve incluir as
razões e objetivos da investigação, local e data da pesquisa, como foi feita, resultados
mais importantes e conclusões.
c) Título em inglês (ou espanhol), Abstract e key words. É a versão para o inglês do
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JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
Resumo e das palavras-chave.
d) Introdução (contendo revisão de literatura) com duas páginas, no máximo.
e) Material e Métodos: somente métodos novos e material incomum devem ser descritos
detalhadamente, ou descrevê-los resumidamente fornecendo a citação bibliográfica
correspondente.
f) Resultados e Discussão.
g)Conclusões.
h)Agradecimentos.
i) Referências Bibliográficas.
Quando o artigo for apresentado em língua estrangeira, o título, resumo e palavras-
chave deverão também ser feitos em português. As Notas Científicas não precisam seguir
essa subdivisão. Iniciar sempre uma nova página para as seguintes seções ou itens:
Referências Bibliográficas; Quadro com título e rodapé; Figura com título.
Preparação de originais
Citações no texto: as citações de autores no texto devem ser em letras maiúsculas
(caixa alta reduzida, ou versalete), seguidas do ano de publicação. Para dois autores,
usar e ou and se o texto for em inglês. Havendo mais de dois autores, citar o sobrenome
do primeiro, seguido de et al. Ex.: STEEL e TORRIE (1980) ou (STEEL e TORRIE, 1980).
HAAG et al. (1992) ou (HAAG et al., 1992). Mais de um artigo dos mesmos autores, no
mesmo ano, devem ser discriminados com letras minúsculas: HAAG et al. (1992a,b).
Comunicações pessoais, trabalhos ou relatórios não publicados devem ser citados no
rodapé, não devendo aparecer nas referências bibliográficas.
Referências Bibliográficas: devem ser normalizadas segundo a NBR 6023 da ABNT,
estar em ordem alfabética de autores e, dentro desta, em ordem cronológica de
trabalhos; havendo dois ou mais autores, separá-los por ponto e vírgula; os títulos dos
periódicos devem ser escritos por extenso; incluir apenas os trabalhos citados no texto,
em tabelas e/ou em figuras.
Quadros: contêm título, cabeçalho, conteúdo e elementos complementares (fonte, notas
e chamadas). Devem ser apresentados em folhas separadas e numerados com
algarismos arábicos. Não usar linhas verticais; as horizontais devem separar o título do
cabeçalho, o cabe-çalho do conteúdo e o conteúdo dos elementos complementares. O
título do quadro deve ser auto-explicativo, prescindindo de consulta ao texto.
Unidades: usar exclusivamente o Sistema Internacional de Medidas. Nos quadros,
apresentar as unidades no topo das colunas respectivas, fora do cabeçalho do quadro.
Figuras: gráficos, desenhos, mapas, fotografias e fotomicrografias aparecem no texto
como figuras. Devem ser numeradas com algarismos arábicos e ter título auto-
explicativo. Indicar o local da inserção das figuras no texto. Fotografias e
fotomicrografias devem ser remetidas em papel fotográfico. Figuras elaboradas
eletronicamente devem vir acompanhadas de seus arquivos originais em Excel, Origin,
Corel Draw, etc. Para outras figuras, enviar o original ou cópia xerográfica de boa
qualidade. Não inserir quaisquer figuras no texto.
Encaminhamento de trabalhos
O trabalho submetido à publicação em Bragantia deve estar aprovado por todos os seus
autores e pela Instituição onde foi realizado e ser encaminhado por carta assinada por
todos os autores para o seguinte endereço:
BRAGANTIA Av. Barão de Itapura, 1.481
Caixa Postal 28 CEP: 13001-970 Campinas (SP) – BRASIL
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JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
NORMAS DAS REVISTAS- PAB
INSTRUÇÕES AOS AUTORES
Objetivos
A revista Pesquisa Agropecuária Brasileira é uma publicação mensal da Embrapa, que
edita e publica trabalhos técnico-científicos originais, em português, espanhol ou inglês,
resultantes de pesquisas de interesse agropecuário. A principal forma de contribuição é o
Artigo, mas a PAB também publica Notas Científicas, Novas Cultivares e Revisões a
convite do Editor.
Submissão
Os originais submetidos à publicação devem ser enviados por via eletrônica
) acompanhados de mensagem com os seguintes dados: nome,
formação profissional, grau acadêmico e endereço institucional e eletrônico dos autores;
indicação do autor-correspondente; declaração de não-submissão do trabalho à
publicação em outro periódico. Cada autor deve enviar mensagem expressando sua
concordância com a submissão do artigo. Os manuscritos podem também ser
encaminhados pelos correios, para o seguinte endereço:
Embrapa Informação Tecnológica
Pesquisa Agropecuária Brasileira - PAB
Caixa Postal 040315
70770-901 Brasília, DF
Apresentação
• O artigo deve ser digitado em Word, espaço duplo, Times New Roman, corpo 12, folha
formato A4, com páginas e linhas numeradas.
• As figuras, na forma de gráficos, devem ser apresentadas no final do texto, em Excel
ou Word.
• As figuras, na forma de fotografias, imagens ou desenhos, com 8,5 cm ou 17,5 cm de
largura, devem ser escaneadas com 300 dpi e gravadas, separadas do texto, em
arquivos TIF.
• As tabelas devem ser apresentadas em Word, no final do texto, somente com linhas
horizontais; os dados devem ser digitados em fonte Times New Roman.
Estrutura e organização
O artigo, com no máximo 20 páginas, deve ser apresentado na seguinte seqüência:
título, nome completo dos autores, endereços institucionais e eletrônicos, Resumo,
Termos para indexação, Título em inglês, Abstract, Index terms, Introdução, Material e
Métodos, Resultados e Discussão, Conclusões, Agradecimentos, Referências, Tabelas e
Figuras.
Título: 15 palavras no máximo, em letras minúsculas.
Autores: nomes completos, com chamada para nota de endereços; autores de uma
mesma instituição devem ter a mesma nota de endereço.
Notas de endereços: endereços institucionais e eletrônicos dos autores.
Resumo: máximo de 200 palavras; Abstract deve ser tradução fiel do Resumo.
Termos para indexação: mínimo três e máximo seis.
Conclusões: frases curtas, com o verbo no presente do indicativo, sem comentários
adicionais e elaboradas com base nos objetivos do artigo.
Citações: não são aceitas citações de dados não publicados, comunicação pessoal,
resumos e publicações no prelo.
Referências: de acordo com a NBR 6023 da ABNT; em ordem alfabética dos nomes dos
autores; principalmente dos últimos dez anos e de artigos de periódicos. Exemplos:
Eventos (considerados em parte)
ALBUQUERQUE, F.C.; DUARTE, M.L.R.; NUNES, A.M.L.; STEIN, R.L.B.; OLIVEIRA, R.P.
Comportamento de germoplasma de pimenta-do-reino em áreas de ocorrência de
fusariose no Estado do Pará. In: SEMINÁRIO INTERNACIONAL SOBRE PIMENTA E
CUPUAÇU, 1., 1996, Belém. Anais. Belém: Embrapa-CPATU; JICA, 1997. p.269-276.
81
JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
(Embrapa-CPATU. Documentos, 89).
Artigos de periódicos
BAK, P.; TANG, C.; WIESENFELD, K. Self-organized criticality. Physical Review A, v.38,
p.364-374, 1988.
Capítulos de livros
DIAS-FILHO, M.B. Pastagens cultivadas na Amazônia oriental brasileira: processos e
causas de degradação e estratégias de recuperação. In: DIAS, L.E.; MELLO, J.W.V. (Ed.).
Recuperação de áreas degradadas. Viçosa: UFV; Sociedade Brasileira de Recuperação de
Áreas Degradadas, 1998. p.135-147.
Livros
FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares
em análise genética. 3.ed. Brasília: Embrapa-Cenargen, 1998. 220p.
Teses e dissertações
MACHADO, C.A.E. Padrões isoenzimáticos de superóxido dismutase de alguns
genótipos de pessegueiro Prunus persica (L.) Batsch. 1984. 36p. Dissertação
(Mestrado) - Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Outras informações
• Todos os manuscritos são revisados por no mínimo dois especialistas.
• O editor e a assessoria científica reservam-se o direito de solicitar modificações nos
artigos e de decidir sobre a sua publicação.
• São de exclusiva responsabilidade dos autores as opiniões e conceitos emitidos nos
trabalhos.
• Os trabalhos aceitos não poderão ser reproduzidos, mesmo parcialmente, sem o
consentimento expresso do editor da PAB.
• Contatos com a secretaria da revista podem ser feitos pelos fones: (61) 448-4231 e
273-9616, fax: (61) 340-5483 ou e-mail: [email protected]
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JESUS, O.N. Caracterização morfológica e molecular de cultivares de bananeira
DECLARAÇÃO DE ENVIO DE TRABALHO
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