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VIVIANI FERREIRA
Caracterização morfológica e diversidade molecular de
Nostocales com ramificações verdadeiras da mata atlântica
paulista com ênfase em organismos aerofíticos
São José do Rio Preto
2008
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VIVIANI FERREIRA
Caracterização morfológica e diversidade molecular de Nostocales com
ramificações verdadeiras da mata atlântica paulista com ênfase em
organismos aerofíticos
Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre
em Microbiologia, área de Biologia e Sistemática de
Microrganismos junto ao Programa de Pós-Graduação em
Microbiologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências
Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto.
Orientador: Prof. Dr. Luis Henrique Zanini Branco
São José do Rio Preto
2008
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Ferreira, Viviani.
Caracterização morfológica e diversidade molecular de Nostocales
com ramificações verdadeiras da mata atlântica paulista com ênfase em
organismos aerofíticos / Viviani Ferreira. - São José do Rio Preto : [s.n.],
2008.
79 f.: il.; 30 cm.
Orientador: Luis Henrique Zanini Branco
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas.
1. Microrganismos - Evolução . 2. Morfologia (Biologia). 3.
Microrganismos - Filogenia. 4 Cyanobacteria - Cultivo. 5.
Cyanobacteria - Diversidade molecular. I. Branco, Luis Henrique
Zanini. II. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências,
Letras e Ciências Exatas. III.T.
CDU - 579.8
VIVIANI FERREIRA
Caracterização morfológica e diversidade molecular de Nostocales com
ramificações verdadeiras da mata atlântica paulista com ênfase em
organismos aerofíticos
Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre
em Microbiologia, área de Biologia e Sistemática de
Microrganismos junto ao Programa de Pós-Graduação em
Microbiologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências
Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Luis Henrique Zanini Branco
Professor Assistente Doutor
UNESP - São José do Rio Preto/SP
Profª Drª Marli de Fátima Fiore
Professora Doutora
CENA/USP - Piracicaba/SP
Profª Drª Célia Leite Sant'Anna
Pesquisadora Científica nível VI
Instituto de Botânica de São Paulo - São Paulo/SP
São José do Rio Preto, 18 de março de 2008.
Aos meus queridos pais, Elisabete e José Pascoal, e
irmãos, Patrícia e Juliano, por todo apoio e
dedicação em todos os momentos de minha vida,
pelos ensinamentos que me tornaram uma pessoa
persistente e determinada na realização de todos os
meus sonhos, pela confiança, admiração,
companheirismo, amizade e amor, dedico.
A Marcelo, meu querido esposo, pela incansável
ânsia em almejar um futuro de conquistas e
realizações, juntos nesta caminhada, ofereço.
A Deus, que está sempre ao meu lado e me
impulsiona para a vida.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Luis Henrique Zanini Branco pela incansável busca de conhecimentos, o
que proporciona vastos e sábios ensinamentos aos seus alunos, pela confiança e dedicação, pela
ânsia em superar os obstáculos das metodologias, pela perseverança e principalmente pela
dedicação em construir pessoas dignas e éticas no meio científico.
Ao Prof. Dr. Orlando Necchi Júnior pelas amostras de cianobactérias aquáticas e por
todos os seus conselhos.
Ao Prof. Dr. José Osmar Gaspar por autorizar o uso de seu laboratório e ceder os
equipamentos que são indispensáveis nas etapas de quantificação e clonagem molecular e pelos
inúmeros conselhos e ensinamentos.
À Prof. Dra. Marli Fiore e sua doutoranda Adriana Sturion Lorenzi do CENA/USP de
Piracicaba pelo treinamento em técnicas de Biologia Molecular de Cianobactérias, que foi
fundamental para o início desta etapa metodológica.
Às Profªs Drªs. Paula Rahal, Eleni Gomes e Neusa Taroda Ranga pela dedicação e
inúmeros incentivos para que eu persistisse nesta longa caminhada.
À Técnica Maria Helena Carabolante pelo apoio e amizade nestes anos.
Ao pessoal do Laboratório de Fitovirologia, Aninha, Lívia, Tadaiti e Ricardo pelo
inesquecível auxílio prestado no desenvolvimento das técnicas moleculares, e pela amizade.
A Carol, Fátima, Paola e Paulo do Laboratório de Estudos Genômicos pelo
sequenciamento de minhas amostras.
A todos do laboratório de ficologia em especial: Nádia, Marcos, Jéferson, Anna Isabel e
Carmélia, pela alegre rotina proporcionada no dia-a-dia de trabalho e principalmente pela grande
amizade.
Ao Programa de Pós-graduação em Microbiologia e a CAPES, pelo suporte financeiro.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL............................................................................................................ 1
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................................... 4
CAPÍTULO I - Flora de Nostocales com ramificações verdadeiras com ênfase em
ambientes aerofíticos da região de mata atlântica paulista..................................................... 5
RESUMO...................................................................................................................................... 6
I - INTRODUÇÃO........................................................................................................................ 7
II - OBJETIVOS........................................................................................................................... 10
III - MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................................10
1 - Coleta das cianobactérias...................................................................................................10
2 - Caracterização morfológica............................................................................................... 12
IV - RESULTADOS..................................................................................................................... 12
V - DISCUSSÃO.......................................................................................................................... 20
VI - CONCLUSÃO.......................................................................................................................22
VII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................23
CAPÍTULO II - Variações de condições de cultivo para o crescimento de Nostocales com
ramificações verdadeiras da mata atlântica paulista...............................................................28
RESUMO......................................................................................................................................29
I - INTRODUÇÃO........................................................................................................................30
II - OBJETIVOS........................................................................................................................... 32
III - MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................................33
1 - Meios de cultivo................................................................................................................ 33
2 - Inóculo............................................................................................................................... 34
3 - Manutenção dos cultivos................................................................................................... 35
4 - Potencialização do crescimento dos cultivos.....................................................................35
5 - Uso de antibióticos para a purificação dos cultivos...........................................................35
6 - Avaliação do desenvolvimento das cepas em cultivo........................................................36
IV - RESULTADOS..................................................................................................................... 38
V - DISCUSSÃO.......................................................................................................................... 41
VI - CONCLUSÃO.......................................................................................................................46
VII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................47
VIII - ANEXO.............................................................................................................................. 52
CAPÍTULO III - Caracterização molecular de populações de Nostocales com ramificações
verdadeiras da mata atlântica paulista com base no rRNA 16S.............................................54
RESUMO......................................................................................................................................55
I - INTRODUÇÃO........................................................................................................................56
II - OBJETIVOS........................................................................................................................... 59
III - MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................................59
A - Caracterização molecular das linhagens usando o rRNA 16S........................................59
1 - Extração do DNA genômico.......................................................................................59
2 - Amplificação do gene rRNA 16S............................................................................... 60
3 - Clonagem de produtos de PCR...................................................................................61
4 - Sequenciamento do rRNA 16S...................................................................................62
B - Processamento e análise filogenética das seqüências..................................................... 63
IV - RESULTADOS..................................................................................................................... 64
V - DISCUSSÃO.......................................................................................................................... 66
VI - CONCLUSÃO.......................................................................................................................70
VII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................70
VIII - ANEXOS............................................................................................................................ 75
RESUMO GERAL
As Cyanobacteria foram fundamentais no percurso dos seres vivos na Terra primitiva,
disponibilizando na atmosfera o oxigênio atmosférico e atuando como colonizadores primários.
São bem distribuídas e abundantes em ambientes terrestres e possuem importância econômica
devido à produção de compostos do metabolismo secundário. São classificadas com base em sua
morfologia, porém, atualmente, informações sobre o hábitat e análises moleculares passaram a
ser incluídas nas análises taxonômicas. Para resultados mais satisfatórios tornou-se importante o
cultivo laboratorial para obtenção de biomassa e controle de contaminantes. Organismos com
ramificações verdadeiras da Ordem Nostocales representam o mais alto grau de complexidade
morfológica entre os procariotos. Entretanto, como e quando o grupo se diversificou permanece
obscuro. Na região de mata atlântica paulista foram coletadas 21 amostras de cianobactérias
aerofíticas, provenientes de 15 pontos, resultando em 11 espécies, sendo duas do gênero
Hapalosiphon, uma de Nostochopsis, uma de Spelaeopogon e sete de Stigonema. Em relação às
características ambientais, foram mais freqüentemente encontradas em ambientes ácidos (pH
4,0-5,0), com irradiância de 3-2740 μmol fótons.m
-2
.s
-1
, temperatura de 18-38ºC e umidade 62-
94% e o substrato mais comum foi o rochoso. Em relação ao cultivo, pôde-se indicar um
conjunto de condições de crescimento mais favoráveis para estas cianobactérias, mas para um
melhor estabelecimento das condições específicas ainda são necessários estudos mais
abrangentes e aprofundados. Somente as espécies Stigonema ocellatum e Hapalosiphon sp.
tiveram seus genes rRNA 16S clonados e sequenciados com sucesso. Após análise BLAST,
verificou-se 98% de identidade destas cianobactérias, respectivamente, com S. ocellatum SAG
48.90 e com três diferentes espécies de Hapalosiphon disponíveis no GenBank. Devido à
escassez dos dados obtidos neste estudo e dos armazenados no Genbank para estes táxons em
particular pode-se dizer que a proximidade taxonômica entre estas populações ainda é incerta. As
análises filogenéticas, por sua vez, corroboraram a origem monofilética das cianobactérias
heterocitadas. Portanto, pode-se dizer que dados morfológicos integrados aos ecológicos,
biogeográficos e moleculares são indispensáveis para melhor definir e distinguir
filogeneticamente as cianobactérias da região de mata atlântica paulista.
Palavras-chave: Cyanobacteria, Nostocales, morfologia, cultivo, filogenia, rRNA 16S.
INTRODUÇÃO GERAL
As Cyanobacteria, também conhecidas como cianofíceas, cianoprocariotos ou algas
azuis, são organismos procariotos com clorofila a, sendo que alguns representantes, como
Prochloron, Prochlorothrix e Prochlorococcus, possuem também clorofila b e outros, como
Acharyochloris, sintetizam clorofila d. Esse grupo de organismos fotossintetizantes oxigênicos
possuem fotossistemas I e II (ZEHR et al., 1997). Por estas razões apresentam semelhanças
desde bactérias até as plantas e, portanto, é evidente a importância deles na relação evolutiva
entre as espécies viventes. Estima-se, a partir de registros fósseis, que tiveram origem há
aproximadamente 3,5 bilhões de anos e que foram indispensáveis para a conversão da atmosfera
terrestre primitiva na forma atual (HENSON et al., 2002).
Podem ser unicelulares (solitárias ou agregadas), coloniais e filamentosos com ou sem
ramificações, que podem ser do tipo falsa (simples ou duplas) ou verdadeira (V, T e Y, entre
outras) (DESIKACHARY, 1959).
Considerando-se o grupo como um todo, são organismos ecologicamente bem
distribuídos, presentes nos mais diversos tipos de biótopos, desde geleiras até às proximidades de
vulcões e fontes termais. Podem ser aquáticos, marinhos ou dulcícolas, de corpos d’água lênticos
ou lóticos, ou aerofíticos, vivendo aderidos a rochas, troncos ou mesmo partículas de solo.
A alta diversidade de hábitats e a conseqüente divergência ecológica podem explicar a
ampla diversificação de morfotipos (e especiação) dos tipos cianobacterianos. Esta diversificação
é baseada, muito provavelmente, em uma adaptabilidade rápida e a estabilização genética de
novos eco e morfotipos em novos ambientes (REJMANKOVA et al., 2004). A longevidade do
grupo também é um fator que pode ter papel importante na diversidade de formas e na ampla
distribuição ecológica.
A importância das cianobactérias é destacada tanto pela significativa representação na
biodiversidade e nos processos ecológicos do planeta quanto na produção de compostos
secundários de ampla utilização industrial, como os biofertilizantes, por exemplo, (WHITTON,
2000). Atualmente diversos estudos têm sido realizados enfocando diferentes grupos das
cianobactérias com o intuito de investigar suas qualidades e aplicabilidades na indústria de
alimentos, têxtil e farmacêutica ou, ainda, no melhoramento dos processos agrícolas (SINGH,
1961; DOKULIL & TEUBNER, 2000; GRAHAM & WILCOX, 2000; WHITTON, 2000).
Apesar da importância ecológica, econômica e medicinal do grupo, estudos sobre
cianobactérias aerofíticas não são muito abundantes e há relativamente poucas pesquisas
publicadas sobre eles.
As relações filogenéticas entre as cianobactérias, por sua vez, vêm sendo estudadas pelos
especialistas nas duas últimas décadas com a finalidade de construir o conhecimento sobre o
parentesco entre estes organismos. Inicialmente as cianobactérias eram classificadas segundo
suas características morfológicas, mas, a realização desta análise isoladamente não oferece
credibilidade, segundo os estudiosos WILMOTTE & HERDMAN (2001). Atualmente, são
observados outros aspectos, empregando ferramentas, que englobam análises do arranjo da
ultraestrutura (principalmente dos tilacóides), estudos moleculares e ecologia, constituindo uma
abordagem denominada polifásica.
Enquanto estudos ultraestruturais e ecológicos podem ser realizados sem muitas
limitações, para estudos moleculares especificamente torna-se recomendável à manutenção das
populações em bancos de cultura com condições adequadas para o crescimento das
cianobactérias. Este é um aspecto crítico, pois muitas cianobactérias não se estabelecem em
condições artificiais e, portanto, não são cultiváveis. A determinação de um meio de cultura e
das condições específicas para o crescimento destes organismos é um dos grandes obstáculos
nesta linha de pesquisa sobre as cianobactérias. No estudo do rRNA 16S, a ausência destas em
meio de cultura, com a conseqüente necessidade de uso de amostras provenientes do campo,
dificulta o processo de extração e amplificação do material genético pois, por exemplo, as
bactérias presentes nas amostras, que apresentam condição celular semelhante, também têm o
seu material genético amplificado. Assim, para se conseguir seqüências gênicas de amostras de
campo é indispensável o procedimento de clonagem molecular, para que se possa encontrar o
clone que contém o inserto (seqüência de DNA) de interesse. Culturas não axênicas também
requerem o mesmo tipo de procedimento, embora seja considerada uma situação mais favorável
do que o material proveniente diretamente do campo.
A Ordem Nostocales inclui os organismos mais complexos do Filo Cyanobacteria. São
essencialmente filamentosos, podendo ser ramificados ou não e apresentam, quase que
obrigatoriamente, uma célula diferenciada denominada de heterócito. Esta célula é responsável
por abrigar e proteger do contato com o oxigênio uma importante enzima, a nitrogenase, que é
capaz de reduzir o nitrogênio atmosférico em uma forma quimicamente mais simples e
biologicamente assimilável. A reprodução é exclusivamente assexuada e se dá pela formação de
hormogônios, hormocitos e acinetos (ANAGNOSTIDIS & KOMÁREK, 1990; HOFFMANN et
al., 2005).
Neste estudo são abordados os organismos que apresentam ramificações verdadeiras, ou
seja, que possuem células que se dividem em mais de um plano e que, em sistemas de
classificação anteriores, eram colocados em uma ordem própria, Stigonematales
(ANAGNOSTIDIS & KOMÁREK, 1990). Entretanto, alguns estudos vêm demonstrando que a
ocorrência de ramificações verdadeiras não é um critério filogeneticamente importante para a
separação no nível Ordem. Segundo o sistema de classificação mais recente, proposto por
HOFFMANN et al. (2005), os resultados de análises ultraestruturais e moleculares, têm revelado
que todas as cianobactérias heterocitadas provavelmente possuíram um ancestral único e muitas
análises filogenéticas apresentam estes organismos agrupados, constituindo uma mesma Ordem,
Nostocales, independentemente da presença ou mesmo do tipo de ramificação (GUGGER &
HOFFMANN, 2004). Tais dados indicam a relevância filogenética da ocorrência do heterócito
em detrimento à capacidade de formar filamentos verdadeiramente ramificados.
São raros os estudos realizados com as cianobactérias com ramificação verdadeira, tanto
aqueles que abordam análises morfológicas como os que enfocam aspectos moleculares.
Provavelmente isto se deve à dificuldade na obtenção de uma condição específica de crescimento
em laboratório destes organismos. Os dados genéticos disponíveis, por exemplo, são limitados,
restringindo-se a seqüências (muitas delas parciais com menos de 1000 pb) de alguns poucos
gêneros como Capsosira, Chlorogloeopsis, Fischerella, Nostochopsis, Stigonema e
Westiellopsis. Este último é um dos gêneros de cianobactérias aerofíticas mais comuns e
freqüentes em vários hábitats e, paradoxalmente, possui somente uma espécie parcialmente
seqüenciada e disponibilizada no GenBank.
Em razão de todo o exposto, torna-se evidente a necessidade de uma maior atenção para
com as cianobactérias aerofíticas heterocitadas de ramificação verdadeira, buscando-se a
obtenção de dados que ajudem a detalhar o conhecimento sobre estes organismos em termos de
diversidade e ecologia, bem como de elementos que auxiliem a esclarecer suas relações
filogenéticas.
Deste modo, o objetivo geral deste trabalho foi expandir os conhecimentos deste
importante, complexo e pouco conhecido grupo de cianobactérias, as Nostocales com
ramificações verdadeiras, por meio de estudos mais detalhados. Para isso, utilizaram-se dados
morfológicos e ecológicos, testes de cultivo em diferentes meios e condições de cultura,
procurando manter as células sob estas condições artificiais de crescimento. Por fim, foi feita a
caracterização molecular de populações a partir do sequenciamento do gene rRNA 16S para a
avaliação dos parentescos com outros organismos do grupo e também com os outros grupos
dentro das Cyanobacteria.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANAGNOSTIDIS, K.; KOMÁREK, J. Modern approach to the classification system of
cyanophytes.5-Stigonematales.Archiv für Hydrobiologie Supplementaband/Algological
Studies, Stuttgart, v. 59, p. 1-73, 1990.
DESIKACHARY, T.V. Cyanophyta. Indian Council Agricultural Research, New Delhi, 1959.
DOKULIL, M.T.; TEUBNER, K. Cyanobacterial dominance in lakes. Hydrobiologia,
Dordrecht, v. 438, p. 1-12, 2000.
GRAHAM, L.E.; WILCOX, L.W. Algae, ed. Prentice Hall, p. 97-131, 2000.
GUGGER, M.F.; HOFFMANN, L. Polyphyly of true branching cyanobacteria (Stigonematales),
International Journal of Systematic and evolutionary Microbiology, Luxemburgo, v. 54, p.
349-357, 2004.
HENSON, B.J.; WATSON, L.E.; BARNUM, S.R. Molecular differentiation of the heterocystous
cyanobacteria, Nostoc and Anabaena, based on complete nifD sequences. Current
Microbiology, v. 45, p. 161-164, 2002.
HOFFMANN, L.; KOMÁREK, J.; KASTOVSKÝ, J. System of cyanoprokaryotes
(Cyanobacteria) - state in 2004. Archiv für Hydrobiologie Supplementaband/Algological
Studies, Stuttgart, v. 117, p. 95-115, 2005.
REJMÁNKOVÁ, E.; KOMÁREK, J.; KOMÁRKOVÁ, J. Cyanobacteria - a neglected
component of biodiversity: patterns of species diversity in inland marshes of northern Belize
(Central America). Diversity and Distributions, v. 10, p. 189-199, 2004.
SINGH, R.N. Role of blue-green algae in nitrogen economy of India. Council of Agricultural
Research, New Delhi, Indian, 1961.
WHITTON, B.A. Soils and rice fields. In: WHITTON, B.A.; POTTS, M. (eds) The Ecology of
Cyanobacteria. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, p. 233-255, 2000.
WILMOTTE, A.; HERDMAN, M. Phylogenetic relationships among the cyanobacteria based on
16S rRN sequences. In GARRITY, GM (ed) Bergey’s Manual of Systematic Bacterioloy, 2
nd
ed. Springer, New York, p. 487-493, 2001.
ZEHR, J.P.; MELLON, M.T.; HIORNS, W.D. Phylogeny of cyanobacterial nifH genes:
evolutionary applications and potential applications to natural assemblages. Microbiology, v.
143, p. 1443-1450, 1997.
CAPÍTULO I
Flora de Nostocales com ramificações
verdadeiras com ênfase em ambientes
aerofíticos da região de mata atlântica paulista
Flora de Nostocales com ramificações verdadeiras em ambientes aerofíticos da região de
mata atlântica paulista
RESUMO: Tradicionalmente, as cianobactérias são classificadas com base em sua morfologia,
porém, exibem grande variação nas formas e dimensões em resposta às condições ambientais.
Mais recentemente, informações sobre o hábitat passaram a ser mais relevantemente incluídas
nas análises taxonômicas, pois se considera que diferentes unidades taxonômicas
morfologicamente definidas possuem adaptabilidade ecológica restrita e que a idéia de
ubiqüidade das espécies não corresponde à realidade. Organismos com ramificações verdadeiras
da Ordem Nostocales representam o mais alto grau de complexidade e diferenciação morfológica
de organização do nível procariota. Comumente encontrados em ambientes aerofíticos como
rochas, troncos de árvores e solos, constituem um grupo cuja taxonomia tem se revelado
problemática, principalmente daqueles provenientes de regiões de clima tropical. Na região de
mata atlântica paulista foram coletadas 21 amostras de cianobactérias aerofíticas, provenientes
de 15 pontos amostrados, resultando no levantamento de 11 espécies, sendo duas do gênero
Hapalosiphon, uma de Nostochopsis, uma de Spelaeopogon e sete de Stigonema. Em relação às
características ambientais, foram mais freqüentemente encontradas em ambientes levemente
ácidos (pH 4,0-5,0), com irradiância de 3 a 2740 μmol fótons.m
-2
.s
-1
, temperatura de 18-38ºC e
umidade 62-94% e o substrato ocupado mais comum foi o rochoso. Devido à importância e
representatividade desta ordem em comunidades aerofíticas pode-se dizer que os dados
morfológicos integrados aos dados ecológicos e biogeográficos são indispensáveis para melhor
definir e distinguir filogeneticamente os organismos da região de mata atlântica paulista.
I - INTRODUÇÃO
As Cyanobacteria fósseis datam de cerca de 3,5 bilhões de anos e são muito próximas às
formas viventes existentes, o que sugere uma lenta taxa evolutiva sendo que estes organismos
foram os responsáveis pela conversão de uma atmosfera primitiva anaeróbica em aeróbica, o que
permitiu a diversidade de vida existente atualmente (HENSON et al., 2002). São procariotos
fotossintéticos que formam um grupo monofilético morfologicamente diverso dentro do domínio
Bacteria (LITVAITIS, 2002). Podem apresentar-se de diferentes formas, unicelulares (solitárias
ou agregadas), coloniais ou filamentosas, ramificadas ou não, podendo estas ser falsas ou
verdadeiras (ANAGNOSTIDIS & KOMÁREK, 1990). Outras características morfológicas de
interesse taxonômico são, bainhas, pigmentação, dimensões, plano de divisão celular, forma da
célula e número de células em uma colônia, entre outros, entretanto, muitas destas características
podem ser variáveis devido a alterações das condições ambientais (SILVA & SANT’ANNA,
1996; LITVAITIS, 2002).
São organismos ecológica e biotecnologicamente importantes, pois são produtores
primários e uma rica fonte de compostos secundários bioativos (CASTIGLIONI et al., 2004).
São exemplos disto, as associações simbióticas das cianobactérias com líquens e a produção de
biofertilizantes e antibióticos, amplamente utilizados na agricultura e na indústria,
respectivamente, verificados pelos trabalhos realizados por ANTARIKANONDA et al. (1994),
WOERGOETTER (2002) e SOLTANI et al. (2005). Estudos recentes com um representante de
Nostocales com ramificação verdadeira, Fischerella 43239, demonstram que esta cianobactéria é
capaz de formar um biofilme que contém compostos inseticidas contra larvas de Chironomus sp.
(insetos), comprovando o papel destes organismos como bioinseticidas naturais (BECHER &
JUTTNER, 2005). MORALES et al. (2005) estudaram a biomassa e a taxonomia de
comunidades de cianobactérias, incluindo espécies de Stigonema, de ambiente tropical que
formam biofilmes com outros organismos como diatomáceas e outras microalgas eucariotas.
A hipótese que diferentes genótipos e morfotipos são estrita e ecologicamente
delimitados (KOMÁREK, 1994) tem sido corroborada e entendida como a interpretação mais
adequada sobre a distribuição ecológica das espécies. Teoricamente especiação ecológica pode
ser devida à seleção natural em decorrência, por exemplo, de um isolamento geográfico
(OGDEN & THORPE, 2002). REJMÁNKOVÁ et al. (2004) argumentam que a alta diversidade
de hábitats, principalmente a verificada nos trópicos e a conseqüente divergência ecológica
podem explicar a ampla diversificação de morfotipos (e especiação) dos tipos cianobacterianos.
Segundo estes autores, a diversificação é baseada muito provavelmente em uma adaptabilidade
rápida e a estabilização genética de novos eco e morfotipos em novos ambientes.
Apesar da importância ecológica, econômica e medicinal do grupo, são escassos os
estudos e/ou publicações sobre cianobactérias aerofíticas. Vários trabalhos encontrados em
literatura foram principalmente realizados enfocando-se as cianobactérias de regiões tropicais do
mundo como HOFFMANN (1986), SARTHOU et al. (1995), BÜDEL et al. (1997, 2002) e
COUTÉ et al. (1999). No Brasil, alguns exemplos de estudos científicos são SANT'ANNA et al.
(1991) que realizaram o levantamento da flora de cianobactérias de uma pequena caverna com
escoamento de água em suas paredes (Gruta-que-chora, Ubatuba-SP) e registraram a ocorrência
de 41 táxons sendo 51,1% refere-se às espécies heterocitadas e AZEVEDO (1991) que estudou a
flora edáfica de cianobactérias do Jardim Botânico de São Paulo com base em material cultivado
a partir de amostras de terra de três profundidades diferentes. Seus resultados revelaram a
ocorrência de 24 táxons e o domínio qualitativo de Nostocales. Outros trabalhos também
importantes são SANT'ANNA (1984), SANT'ANNA et al. (1991) e AZEVEDO (1991). Alguns
artigos publicados com o único objetivo de descrever novos táxons são HOFFMANN (1991),
AZEVEDO & SANT'ANNA (1994 a,b), ASENCIO et al. (1996), BRANCO & NECCHI-
JÚNIOR (1999), FLECHTNER et al. (2002), KOMÁREK (2003), BRANCO et al. (2006) e
SANT’ANNA et al. (2007).
As relações filogenéticas entre as cianobactérias são ainda escassamente entendidas.
Tradicionalmente são classificadas usando caracteres morfológicos e ecológicos (GEITLER,
1932; DESIKACHARY, 1959; LANE et al., 1985). Estruturas morfológicas podem ser
utilizadas para reconstruir a filogenia, pois são homólogas, porém estruturas distintamente
diferentes podem ter uma origem comum ou estruturas similares podem ter diferentes origens,
pois morfologia comum não necessariamente implica em descendente comum (HOFFMANN et
al., 2005). STANIER et al. (1978) e RIPPKA et al. (1979) argumentam que a sistemática das
cianobactérias não deve basear-se somente nos métodos tradicionais da Botânica, mas também
utilizando os organismos depositados em coleções de cultura permanentes como as Bacteria. É
extremamente árduo definir as relações taxonômicas e filogenéticas das cianobactérias por causa
das poucas distinções de características consistentes que suportam um esquema taxonômico seja
este pelo sistema nomenclatural botânico ou bacteriano (ZEHR et al., 1997; HENSON et al.,
2002). FIORE et al. (2007), em seu estudo com organismos do gênero Brasilonema aerofíticos
de região tropical, descreveram os táxons combinando dados citomorfológicos e moleculares de
acordo com os dois códigos nomenclaturais Botânico e Bacteriológico. Atualmente as
cianobactérias são consideradas bactérias autotróficas com fotossíntese oxigênica (ISHIDA et al.
1997).
Segundo GOLÚBIC (1976), os organismos da ordem Stigonematales constituem os
procariotos mais evoluídos em termos de organização do talo e diferenciação celular. Estes
apresentam filamentos com ocorrência obrigatória de heterócitos e ramificação verdadeira em
todas as famílias podendo ser combinada facultativamente com ramificação falsa
(ANAGNOSTIDIS & KOMÁREK, 1990), mas pouco se sabe sobre organismos desta ordem
presentes nos ecossistemas brasileiros (SILVA & SANT’ANNA, 1996). São imprescindíveis
estudos mais amplos sobre estes organismos em particular, devido a sua importância tanto na
ecologia quanto na economia mundial.
O que caracteriza as Nostocales é a presença de uma célula especializada, denominada de
heterócito, que protege a nitrogenase da oxidação pelo oxigênio. Segundo BERMAN-FRANK et
al. (2003), as diversas estratégias para se superar o problema do oxigênio reflete na ampla
flexibilidade e nichos ocupados por estas cianobactérias. Este se desenvolve em intervalos de
aproximadamente 10-15 células vegetativas (ADAMS, 2000).
Em um passado recente a classificação das Nostocales com ramificações verdadeiras
baseava-se no estudo realizado por ANAGNOSTIDIS & KOMÁREK (1990) que as
classificavam como ordem Stigonematales sendo esta subdividida em 8 famílias
(Chlorogloecapsaceae, Capsosiraceae, Stigonemataceae, Fischerellaceae, Borzinemataceae,
Loriellaceae, Nostochopsaceae e Mastigocladaceae) e 48 gêneros (sendo vários deles não
claramente definidos). A partir do alto grau de complexidade morfológica diferenciavam-nas
pela estrutura do filamento, tipo de ramificação, posição de heterócito e processo de reprodução.
Atualmente, a classificação de Nostocales baseia se no trabalho publicado por HOFFMANN et
al. (2005) que criaram um novo sistema de classificação baseado em dados polifásicos como:
caracteres morfológicos (tipo de divisão celular, polaridade celular, tipo de ramificação,
morfologia do talo, etc.), em muitos gêneros por dados moleculares, arranjo da ultraestrutura
(tilacóides), características ecológicas, entre outros.
Há poucas coletas e estudos no país sobre cianobactérias aerofíticas, principalmente de
Nostocales com ramificações verdadeiras, além disso, o fato destes ocorrerem geralmente em
locais não poluídos, limita ainda mais sua distribuição, pois são muito sensíveis aos efeitos da
poluição, sendo um dos primeiros organismos a desaparecerem quando afetados (SILVA &
SANT’ANNA, 1996).
Segundo KOMÁREK (2006), estudos florísticos são pouco populares na pesquisa
moderna ficológica, entretanto, estudos comparativos de populações provenientes de diferentes
hábitats (ou de hábitats similares e diferentes regiões) são importantes para o entendimento do
diverso mundo cianobacteriano. Diz ainda que os estudos florísticos e ecológico-taxônomicos
devem considerar os conhecimentos modernos da taxonomia cianobacteriana e que estudos
florísticos são particularmente importantes se combiná-los a analises fenotípicas e moleculares.
Entretanto, segundo o mesmo autor, combinar estas diferentes metodologias pode ser
complicado e consumir tempo, e requer uma ampla experiência com a diversidade morfológica
cianobacteriana.
Nostocales com ramificações verdadeiras é uma das ordens mais freqüentes em
ambientes terrestres (verificado, por exemplo, em trabalhos científicos de SANT’ANNA et al.,
1991; AZEVEDO, 1991 & ASENCIO, 1996) e a taxonomia do grupo, principalmente em
regiões tropicais tem se revelado uma problemática, e devido à esta importância e
representatividade nas comunidades aerofíticas pode-se dizer que os dados morfológicos
integrados aos dados ecológicos e biogeográficos são indispensáveis para melhor definir e
distinguir filogeneticamente estes organismos em particular.
II - OBJETIVOS
Ampliação do conhecimento taxonômico das cianobactérias aerofíticas com ramificações
verdadeiras da região de mata atlântica paulista.
Caracterização morfológica das populações encontradas.
Levantamento de variáveis ambientais (substrato, pH, irradiância, temperatura e
umidade) sob os quais as populações ocorrem.
III - MATERIAL E MÉTODOS
1 - Coleta das cianobactérias
Amostras de cianobactérias foram coletadas na região de mata atlântica ao longo do
litoral norte paulista, na Serra do Mar (Figura 1), e a vegetação pode ser formalmente descrita
como Floresta Ombrófila Densa. As temperaturas médias anuais variam de acordo com a
altitude ao nível do mar oscilam entre 14 e 21ºC e nas maiores altitudes, entre 18 a 19ºC. A
precipitação média anual é de 2100 mm ao nível do mar e 4600 mm nas regiões montanhosas e a
umidade relativa do ar é superior a 80%. (SALATI FILHO & COTTAS, 2003).
Figura 1. Esquema do estado de São Paulo, mostrando os remanescentes de Floresta
Ombrófila (Imagem de satélite) e a área amostrada (circulado) (EMBRAPA).
As amostragens foram feitas ao longo das seguintes rodovias: Mogi-Bertioga, Tamoios,
Osvaldo Cruz, Rio-Santos e Cunha-Parati (Tabela 1). Os locais amostrados foram visitados entre
os dias 31 de março e 1º de abril de 2004, logo após o período de chuvas, 16 e 17 de outubro de
2006 e novamente nos dias 22 e 23 de novembro de 2007.
Tabela 1. Localização, coordenadas geográficas e altitude dos pontos de coleta.
PONTOS LOCAIS E COORDENADAS
01
Rodovia Mogi-Bertioga (Km 62) - 46º10’08”W; 23º35’51”S - Altitude: 800 m
02
Rodovia Mogi-Bertioga (Km 76) - 46º05’52”W; 23º41’07”S - Altitude: 791 m
03
Rodovia Mogi-Bertioga (Km 76) - 46º05’52”W; 23º41’09”S - Altitude: 787 m
04
Rodovia BR-101 (Km 202) - 45º57’14”W; 23º46’21”S - Altitude: 22 m
05
Rodovia Tamoios (Km 78) - 45º26’43”W; 23º36’10”S - Altitude: 183 m
06
Rodovia Tamoios (Km 71) - 45º26’57”W; 23º35’16”S - Altitude: 600 m
07
Rodovia Rio-Santos (Km 79) - 45º14’47”W; 23º32’56”S - Altitude: 23 m
08
Rodovia Rio-Santos (Km 65) - 45°08’38”W; 23º29’39”S - Altitude: 66 m
09
Rodovia Rio-Santos (Km 65) - 45°07’56”W; 23º30’34”S - Altitude: nível mar
10
Rodovia Oswaldo-Cruz (Km 86) - 45°07’19”W; 23º23’06”S - Altitude: 122 m
11
Rodovia Oswaldo-Cruz (Km 85) - 45°07’07”W; 23°22’37”S - Altitude: 309 m
12
Rodovia Rio-Santos (Km 40) - 45°01’43”W; 23°24’50”S - Altitude: 77 m
13
Rodovia Cunha - Parati - 44°50’21”W; 23°09’54”S - Altitude: 1460 m
14
Paraibuna - rio Negro (Cachoeira) - 45°27’31”W; 23°33’48”S
15
Caraguatatuba - rio Massaguaçu - 45°19’31”W; 23°33’51”S
Massas visíveis de cianobactérias foram aleatoriamente coletadas com espátula ou
canivete e, após o recolhimento, as amostras foram mantidas secas (em temperatura ambiente)
em sacos de papel.
Além das características macroscópicas das massas, os seguintes parâmetros ambientais
foram também anotados na primeira coleta: coordenadas geográficas e altitude (GPS - Global
Positioning System), temperatura do ar e da massa de cianobactérias (termômetro), umidade do
ar e da massa de cianobactérias (higrômetro), pH (phmetro) e irradiância (fotômetro).
Adicionalmente foram coletadas duas amostras de cianobactérias de ambientes lóticos
(aquáticos), para comparar as possíveis diferenças de crescimento entre cianobactérias aerofíticas
e aquáticas.
2 - Caracterização morfológica
As populações encontradas foram caracterizadas sob microscópio estereoscópio (Carl
Zeiss Jena, modelo Laboval 3) e microscópio fotônico (Carl Zeiss Jena, modelo Jenamed), com
câmara clara acoplada ao sistema óptico, segundo os critérios usuais da taxonomia morfológica,
o que inclui parâmetros quali e quantitativos. Os organismos foram fotografados (Câmera
Olympus PM-20, acoplada a microscópio fotônico Olympus - modelo BX-50), para ilustrar as
características mais importantes para a taxonomia destes organismos.
Os táxons encontrados e identificados foram tratados sob o sistema de classificação
proposto por HOFFMANN, KOMÁREK & KASTOVSKÝ (2005).
IV - RESULTADOS
1 - Caracterização das amostras de cianobactérias
Dos 15 pontos distintos de mata atlântica foram coletadas 21 amostras de cianobactérias
aerofíticas resultando em 11 espécies da ordem Nostocales com ramificações verdadeiras, das
quais, duas são do gênero Hapalosiphon, uma do gênero Nostochopsis, uma do gênero
Spelaeopogon e sete do gênero Stigonema. As características dos pontos amostrados com relação
a irradiância total (IT) e da massa (IM), temperatura do ar (TA) e da massa (TM) e umidade
relativa do ar (URA) e sobre a massa (URAm) foram muito diversificadas entre os pontos
amostrados (Tabela 2).
Tabela 2: Características ambientas selecionadas das amostras coletadas nos diferentes
pontos: IT - Irradiância Total (μmol fótons.m
-2
s
-1
); IM - Irradiância na Massa (μmol fótons.m
-2
s
-
1
); TA - Temperatura do Ar (ºC); TM - Temperatura da Massa (ºC); URA - Umidade Relativa do
Ar (%); URAm - Umidade Relativa do Ar sobre a massa (%).
Ponto Amostra pH IT IM TA TM URA URAm Substrato
01 01 5,0 385 110 19,6 19,9 85,0 90,0 Solo
02 02 4,0 300 110 21,8 20,6 74,0 81,0 Solo
03 03 5,0 300 85 21,1 19,5 76,0 79,0 Rocha
04 04 10,0 800 260 27,4 28,1 83,0 84,0 Rocha
05 05 4,0 1900 1900 27,0 26,5 65,0 71,0 Rocha
06 06 4,0 1700 1700 26,0 36,0 55,0 62,0 Solo
07 4,0 1700 1700 26,0 36,0 55,0 62,0 Solo
07 08 4,0 2740 2740 30,6 38,4 67,0 70,0 Rocha
08 09 4,0 680 330 27,7 23,9 74,0 81,0 Rocha
10 4,0 680 330 27,7 23,9 74,0 81,0 Rocha
11 4,0 680 35 27,7 22,9 74,0 75,0 Rocha
12 4,0 680 280 27,7 24,0 74,0 77,0 Rocha
09* 13 _ _ _ _ _ _ _ Rocha
10 14 5,0 314 160 24,6 25,5 80,0 87,0 Rocha
11 15 4,0 65 30 22,3 21,7 92,0 94,6 Solo
12 16 5,0 10 3 25,1 23,8 90,0 93,0 Rocha
17 5,0 10 4 25,1 25,5 90,0 141,0 Solo
13 18 5,0 2400 60 21,9 19,5 59,0 67,0 Rocha
19 9,0 2400 2200 21,9 28,1 67,0 68,0 Rocha
14* 20 - - - - - - - Aquática
15* 21 - - - - - - - Aquática
* dados não coletados.
2 - Descrição das espécies
Hapalosiphon aureus W. West & G.S. West, J. Bot. 35: 241, 1897. (Figuras 2-3)
Massa com filamentos emaranhados, cespitosa; filamentos sem distinção nítida entre
filamento principal e ramificações, unisseriados, 7,0-15,0(-17,5) μm diâm.; ramificações
geralmente de um único lado do filamento; bainha fina a moderadamente espessa, hialina a
amarelo-acastanhado; tricomas constritos, 5,0-13,0 μm diâm.; células 4,0-10,0(-12,0) μm compr.,
0,4 a 1,5 vezes mais longas do que largas; células contendo granulações, conteúdo azul-
esverdeado; heterócitos não visualizados.
Condições ambientais: n = 1; amostra: 01; TA = 19.6ºC, TM = 19.9ºC, URA = 85%, URM =
90%, IM = 110 μmol fótons.m
-2
.s
-1
, pH = 5, S = solo.
Hapalosiphon sp. (Figuras 4-5)
Massa formada por filamentos densamente emaranhados, prostados, sem distinção nítida
entre o filamento principal e as ramificações, unisseriado, 6,0-9,0(-10,7) μm diâm.; ramificações
geralmente em um lado do filamento muito longas, ramificações falsas ocasionalmente
presentes; bainha fina a moderadamente grossa, hialina a amarelo-acastanhado; tricomas
constritos, 5,0-7,2(-7,6) μm diâm.; células 5,0-7,0(-10,5) μm compr., 0,75 a 1,33(-1,6) vezes
mais longas do que largas; células contendo granulações, conteúdo celular verde claro a verde-
azul claro; heterócitos freqüentes, cilíndricos a sub-quadráticos, (4-)5,0-7,0(-10,0) μm compr.,
5,0-8,0 μm diâm.; acinetos cilíndricos, as vezes em longas cadeias, usualmente com uma grande
gota de óleo no seu interior, 8,0-11,0 μm de compr., 5,5-7,0 μm diâm., epispório espesso, liso,
amarelo acastanhado escuro.
Condições ambientais: n = 1; amostra: 15; TA = 22.3ºC, TM = 21.7ºC, URA = 92%, URM =
94%, IM = 30 μmol fótons.m
-2
.s
-1
, pH = 4, S = solo.
Comentário: esta população apresenta características muito próximas às de H. hibernicus e H.
welwitschii. Assemelha-se à primeira em relação ao diâmetro dos filamentos, ocorrência
freqüente de heterócitos, ramificações unilaterais contíguas longas, diferenciando-se pelo
diâmetro e comprimento de suas células. Com a segunda, assemelha-se ao diâmetro do
filamento, principalmente da variedade vaginatus (Ghose), porém nestas os heterócitos são raros
e os ramos são curtos e afilados nas extremidades, características não encontradas no organismo
em estudo. Foram encontrados somente na primeira coleta em período de seca.
Nostochopsis lobatus Geitler, L. Proc. Amer. Phil Soc., 11: 119, 1869. (Figuras 6-9)
Massa gelatinosa mais ou menos irregular, verde-azulada ou verde-oliva com filamentos
emaranhados, cespitosa, filamento principal fortemente constrito e distinto das ramificações,
unisseriado, 8,0-10 μm diâm.; ramificações de ambos os lados do filamento, longas e estreitas no
ápice; bainha delgada, hialina a esverdeada; células esféricas a elipsoidais, 8,0-12,0 μm compr.,
6,0-8,0 μm diâm.; conteúdo celular verde claro a escuro, granulado; heterócitos pouco
numerosos, intercalares, laterais (sésseis) e terminais (pedicelados); hormogônios ocasionais,
geralmente com 6 células.
Condições ambientais: n = 1; amostra de rio 2; S = rocha.
Spelaeopogon sommierii Borzi, A. Bot. Ital. 24:107, 1917. (Figuras 10-13)
Massa de filamentos emaranhados, cespitosa ou prostrada, ocasionalmente filamentos
isolados ou em pequenos aglomerados crescendo em massas gelatinosas de outras
cianobactérias; filamentos principais e secundários distintos, irregularmente ramificados,
ramificações em T, ramificações falsas (Y) presentes, geralmente unisseriados, com regiões
multisseriadas, 10,0-11,0 μm diâm.; bainhas mucilaginosas finas, hialinas; tricomas com
constrição variável, (8-)9-10(-13) μm diâm.; células 10-12(-15) μm compr.; heterócitos
presentes, intercalares ou terminais, (8-)10-12(-13) μm diâm., (9-)10-15(-16) μm compr..
Condições ambientais: n = 1; amostra 09; S = rocha
Stigonema hormoides Bornet & Flahault, Ann. Sci. Nat. Bot., ser. 7, 5: 68, 1887. (Figuras 14-
17)
Massa formada por filamentos emaranhados, cespitosos, acastanhada a marrom escuro,
ocasionalmente filamentos isolados ou em pequenos aglomerados crescendo em massas
gelatinosas de outras cianobactérias; filamentos unisseriados, raramente bi (7,0-)9,0-17,5(-22,0)
μm diâm.; ramificações geralmente curtas; bainha relativamente espessa, lisa, castanha; células
de forma variável, subesféricas, discóides, esféricas, ovais ou arredondadas, 2,4-9,6(-14,0) μm
compr., (-2,5)4,0-12,0 μm diâm.; conteúdo celular homogêneo ou granulado, conteúdo verde-
amarelado; heterócitos hemisféricos ou arredondados, laterais ou intercalares, 4,0-9,6 μm
compr., 3,2-9,6 μm diâm.; hormogônios terminais, 25,0-30,0(-70,0) μm compr..
Condições ambientais: n = 9; amostras 3, 5, 8, 10, 11, 12, 14, 15 e 19; TA = 21.1-30.6ºC, TM =
19.5-38.4ºC, URA = 65-92%, URM = 70-94%, IM = 30-2740 μmol fótons.m
-2
.s
-1
, pH = 4, 5 e 9,
S = rocha e solo.
Stigonema informe Bornet & Flahault, Ann. Sci. Nat. Bot., ser. 7, 5: 75, 1887. (Figuras 18-19)
Massa formada por filamentos emaranhados, cespitosa, amarela a marrom; filamento
principal prostrado, filamentos multisseriados com até 4 séries de células, 56,0-87,4 μm diâm.;
ramificações 24,0-44,0 μm diâm.; bainha espessa, lisa, amarela a castanha; células comumente
agrupadas, hemisféricas a oblongas, 7,2-16,0 μm compr., 6,4-12,0 μm diâm.; conteúdo celular
verde-azulado, granulado; heterócitos 7,2-12,0 μm compr., 3,2-11,2 μm diâm.; hormogônios
terminais nas ramificações, 16,0-32,0 μm compr., 6,9-12,0 μm diâm..
Condições ambientais: n = 1; amostra 14; TA = 24.6ºC, TM = 25.5ºC, URA = 80%, URM =
87%, IM = 160 μmol fótons.m
-2
.s
-1
, pH = 5, S = rocha.
Stigonema minutum C. Agardh ex Bornet & Flahault, Ann. Sci. Nat. Bot., ser. 7, 5: 72, 1886.
(Figuras 20-21)
Massa formada por filamentos emaranhados, cespitosos (filamento principal prostrado e
ramificações eretas); filamento principal com três fileiras de células, 20,0-28,0 μm diâm.;
filamentos secundários com duas fileiras de células, 14,0-18,2 μm diâm.; bainha ampla, lisa,
amarela; células hemisféricas, 5,0-12,0(-15,0) μm compr., 5,0-13,0 μm diâm.; conteúdo celular
verde-amarelado e granulado; heterócitos hemisféricos, laterais, 7,0-11,0 μm compr. e 6,0-13,0
μm diâm.; hormogônios pequenos e terminais nas ramificações.
Condições ambientais: n = 4; amostras 07, 12, 16 e 19; TA = 21.9-27.7ºC, TM = 22.9-36.0ºC,
URA = 55-90%, URM = 62-93%, IM = 3-2200 μmol fótons.m
-2
.s
-1
, pH = 4 e 5, S = rocha e solo.
Stigonema ocellatum Thuret ex Bornet & Flahault, Ann. Sci. Nat. Bot., ser. 7, 5: 69, 1887.
(Figuras 22-24)
Massa formada por filamentos emaranhados, crescendo de maneira ereta, agrupada ou
isolada em massas gelatinosas de outras cianobactérias; filamentos com uma fileira de células,
ocasionalmente duas,18,0-45,0 μm diâm.; bainha ampla, lisa, hialina a castanha; células variadas,
hemisféricas, ovais, quadradas, retangulares, mais comumente arredondadas 3,0-20,0 μm compr.
e 4,0-25,6 μm diâm.; conteúdo celular amarelo a castanho com granulações; heterócitos
arredondados e laterais, 8,7-21,6 μm compr. e 6,4-22,4 μm diâm.; hormogônios terminais e
grandes nas ramificações, (20,0-)38,0-180,0 μm compr. e 9,6-20,0 μm diâm..
Condições ambientais: n = 11; amostras 03, 04, 05, 06, 08, 10, 11, 12, 13, 14 e 18;TA = 21.1-
30.6ºC, TM = 19.5-38.4ºC, URA = 55-83% (71%), URM = 62-87%, IM = 85-2740 μmol
fótons.m
-2
.s
-1
, pH = 4, 5 e 10, S = rocha e solo.
Stigonema robustum Gardner, University of California Publications in Botany 14(1): 9, 1927.
(Figuras 25-26)
Massa com filamentos intensamente emaranhados, cespitosos, rígidos e coriáceos;
ramificações distintas do filamento principal; filamento principal multisseriado, (80,0-)100,0-
160,0(-230,0) μm diâm.; ramos freqüentes, em ambos os lados do filamento, principalmente nas
extremidades, ápices geralmente unisseriados, atenuados; bainha estreita, lisa, castanha a hialina
nas partes jovens, homogênea; células hemisféricas a oblongas, a maioria quase tão longa quanto
larga, (7,0-)8,0-15,0(-20,0) μm diâm., nas regiões multisseriadas, geralmente reunidas em grupos
(geralmente de 4-6 células) envoltos por bainha comum, ocasionalmente mais escura ao redor
das células; conteúdo celular azul-esverdeado a esverdeado-acastanhado, granulado; heterócitos
raros e de difícil visualização; hormogônios não observados.
Condições ambientais: n = 1; amostra aquática de rio 1; S = rocha.
Stigonema turfaceum Cooke ex Bornet & Flahault, Ann. Sci. Nat. Bot., ser. 7, 5: 74, 1887.
(Figuras 27-31)
Massa formada por filamentos cespitosos, castanha a marrom escura; filamento com mais
de quatro fileiras de células, (20,0-)26,0-35,0(-40,0) μm diâm.; ramificações delgadas no ápice;
bainha ampla, lisa, às vezes com lamelação paralela, amarelo claro a castanho; células
arredondadas a oblongas, 4,8-12,5 μm compr., 4,0-11,0 μm diâm.; conteúdo celular verde-
azulado, granulado; heterócitos hemisféricos, laterais; hormogônios terminais, 9,5-45,0 μm
compr., 4,0-11,0 μm diâm..
Condições ambientais: n = 5; amostras 02, 10, 11, 12 e 17; TA = 21.8-27.7ºC, TM = 20.6-
25.0ºC, URA = 74-90%, URM = 75-141%, IT = 4-330 μmol fótons.m
-2
.s
-1
, pH = 4 e 5, S = rocha
e solo.
Stigonema sp. (Figuras 32-33)
Filamentos isolados entre outras espécies de Stigonema, 8,0-12,8 μm diâm.; tricomas
unisseriados, 4,0-7,2 μm diâm.; bainha ampla, lisa, hialina; células sub-quadráticas, 2,4-8,0 μm
compr.; conteúdo celular verde-amarelado e homogêneo.
Condições ambientais: n = 1; amostra: 14; TA 24.6ºC, TM 25.5ºC, URA 80%, URM 87%, IM
160 μmol fótons.m
-2
.s
-1
(5,0% da IT), pH = 5, S = rocha.
Comentários: esta população tem características muito próximas às de Stigonema hormoides,
porém a medida do filamento é muito menos variável e tem valor inferior à média do diâmetro
do filamento desta espécie (7-15 μm diâm.). Devido à escassez de material biológico disponível,
ficou inviável a obtenção de análises morfológicas adicionais.
Figuras: 2-3. Hapalosiphon aureus; 4-5. Hapalosiphon sp.; 5: acinetos; 6-9. Nostochopsis lobatus; 8:
heterócito pedicelado; 9: heterócito intercalar; 10-13. Spelaeopogon sommierii; 11: ramificação falsa; 14-
17. Stigonema hormoides; 15: heterócito arredondado; 17: hormogônio.
(Escalas: 2-13, 15, 17: 10 μm; 14, 16: 20 μm).
2 3 4 5
6 7 8 9
14 15 16 17
10 11 12 13
Figuras: 18-19. Stigonema informe; 19: hormogônio; 20-21. Stigonema minutum; 22-24. Stigonema
ocellatum; 25-26. Stigonema robustum; 25: heterócito intercalar; 27-31. Stigonema turfaceum; 31:
hormogônio; 32-33. Stigonema sp.
(Escalas: 22, 32-33: 10
µ
m; 18-19, 21: 20 μm; 23-25: 40 μm; 20, 28-31: 50 μm; 26-27: 60 μm).
18 19 20 21
22 23 24 25
26
27
28
29
30
31
32
33
Os resultados observados em relação às espécies da mata atlântica ao longo dos pontos
amostrados demonstram que a riqueza de espécies de Nostocales com ramificações verdadeiras é
pequena, variável e às vezes distinta, além de maior diversidade de espécies nos pontos de
menores altitudes (Tabela 3). A maior riqueza de espécies foi verificada entre membros do
gênero Stigonema, nas altitudes entre 22 a 600 m (chegando até 1460 m), enquanto organismos
do gênero Hapalosiphon foram somente encontrados nas maiores altitudes, entre 300 e 800 m,
diferindo amplamente dos organismos do gênero Spelaeopogon que somente foram encontrados
no nível do mar. A espécie mais freqüente entre os pontos amostrados foi Stigonema ocellatum
(n = 11).
Tabela 3. Distribuição de espécies em relação a altitude. I - H. aureus; II - Hapalosiphon sp.; III - S.
sommierii; IV - S. hormoides; V - S. informe; VI - S. minutum; VII - S. ocellatum; VIII - S. turfaceum; IX -
Stigonema sp.
Altitude / (Ponto) I II III IV V VI VII VIII IX
Nível do mar X
22 m (04) X X
23 m (07) X
66 m (08) X X X X X
77 m (11) X X
122 m (09) X X
183 m (05) X
309 m (10) X X
600 m (06) X X
787 m (03) X
791 m (02)
800 m (01) X
1460 m (12) X X X
Em relação às características ambientais em que os organismos se encontravam, pode-se
dizer que as cianobactérias estudadas foram mais freqüentes em lugares ácidos (pH entre 4,0 e
5,0), mas podendo ser encontradas em outros básicos (pH 9 a 10). A irradiância, a temperatura e
a umidade nas massas de cianobactérias foram bem variáveis, oscilando entre 3 a 2740 μmol
fótons.m
-2
.s
-1
, de 18 a 38ºC e de 62 a 94%, respectivamente, sendo o substrato mais comum o
rochoso (Tabela 2).
V - DISCUSSÃO
No trecho de mata atlântica estudado foram encontrados 11 táxons de Nostocales com
ramificações verdadeiras, duas pertencentes aos gêneros Hapalosiphon, uma do gênero
Nostochopsis (Família Hapalosiphonaceae), uma do gênero Spelaeopogon (Família
Borzinemataceae) e sete do gênero Stigonema (Família Stigonemataceae).
Em comparação com o trabalho de HOFFMANN (1986), nota-se a ocorrência comum de
duas espécies (S. hormoides e S. minutum), sendo que a pouca coincidência florística pode ser
resultado da diferença geográfica abordada. Quando, entretanto, os resultados obtidos são
comparados com os apresentados por COUTÉ et al. (1999), as semelhanças revelaram-se um
pouco maiores, resultando em cinco táxons de ocorrência comum a ambos os trabalhos (S.
hormoides, S. minutum, S. ocellatum, S. informe e S. turfaceum) e, neste caso, as semelhanças
ambientais também são maiores visto que ambas as localidades são de clima tropical.
Considerando-se especificamente trabalhos realizados em território brasileiro, foi
observada em SANT’ANNA et al. (1991), a ocorrência comum de quatro táxons, S. sommierii,
S. hormoides, S. minutum e S. ocellatum. Essa baixa similaridade provavelmente é devida à
diferença de escala geográfica, visto que o trabalho de SANT’ANNA et al. (1991) foi realizado
em uma única localidade (Gruta-que-chora, Ubatuba) e o presente estudo abrangeu uma área
muito mais ampla. Entretanto, fatores ambientais locais, como por exemplo, temperatura,
umidade, irradiância e pH, podem também ter colaborado para esta diferenciação florística, pois
sabe-se que as condições ambientais são altamente limitantes à distribuição das cianobactérias,
sobretudo, a umidade, que é um parâmetro fundamental ao desenvolvimento destes organismos
no ambiente terrestre (FRÉMY, 1930; GEITLER, 1932; DESIKACHARY, 1959).
Um outro fator a ser considerado quanto à biogeografia, é que as espécies apresentam
amplitudes ecológicas relativamente estreitas, embora nem sempre limitação ecológica implica
em limite geográfico restrito (KOMÁREK 1985, 1994). Ainda não está totalmente claro se
populações morfometricamente semelhantes vivendo em ambientes distintos podem ou não ser o
mesmo táxon específico, tornando o conhecimento da distribuição biogeográfica das espécies de
cianobactérias um tema de difícil abordagem. Aspectos metodológicos, como áreas de
amostragem, conceito de espécie utilizado e identificações taxonômicas duvidosas, tornam o
trabalho de avaliação biogeográfica pouco preciso (HOFFMANN, 1994) e, até o momento,
restringe-se às espécies mais bem delimitadas (HOFFMANN, 1994, 1996, 1999).
A taxonomia de cianobactérias passa por um momento de reavaliação. Acreditava-se que
a ocorrência geográfica de cianobactérias era aleatória, o que hoje é considerado inadmissível,
pois a caracterização de uma espécie particular propriamente dita depende não só de sua
morfologia, mas também de sua ecologia. Atualmente, é difícil admitir que haja grande número
de espécies de ocorrência ubíqua. Da mesma maneira, ainda não são claros os limites da variação
fenotípica expressada pelo genótipo de determinadas espécies. Isto explica o uso freqüente de
“conferato” (cf.) nos trabalhos taxonômicos realizados nos últimos anos. O uso de sp. ocorre
devido à ausência de estruturas indispensáveis ou até mesmo pela falta de material e à
dificuldade em estimar variações fenotípicas, o que ocorreu com Stigonema sp. e Hapalosiphon
sp. descritas neste trabalho.
O estudo de cianobactérias terrestres é relativamente recente (JOHANSEN & SHUBERT,
2001) e a maioria dos trabalhos realizados até hoje baseia-se apenas no uso de critérios
morfológicos. São necessárias então, novas abordagens na classificação taxonômica, com a
realização de trabalhos que enfoquem critérios ultra-estruturais e moleculares que respondam a
estas peculiaridades, para que futuramente haja uma maior e melhor compreensão das relações
filogenéticas e delineamentos taxonômicos.
Segundo GARCIA-PICHEL et al. (1996) e PALINSKA et al. (1996), a sistemática
cianobacteriana ainda é muito confusa e a reorganização desta baseada somente na morfologia
pode não ser o método mais adequado. Esses são alguns dos vários problemas existentes para a
identificação de cianobactérias, por esta razão que diferentes análises (polifásicas) têm sido
atualmente aplicadas para melhor distinguir os diferentes níveis taxonômicos (ITEMAN et al.,
2002; ZEHR et al., 2003; RAJANIEMI et al., 2005; MARUARDT & PALINSKA, 2007)
combinando o fenótipo com o genótipo (STACKEBRANDT, 2001; WILMOTTE &
HERDMAN, 2001; MARQUARDT & PALINSKA, 2007).
Desta forma, torna-se evidente a importância dos levantamentos de cianobactérias em
diferentes biótopos de regiões tropicais, contribuindo para o conhecimento da variabilidade
morfológica das espécies e, por conseqüência sua distribuição geográfica. Paralelamente, estudos
com abordagens moleculares podem também esclarecer mais sobre a biogeografia das
cianobactérias, cujos membros desempenham papel ecológico fundamental nos diversos
ecossistemas onde ocorrem (BRANCO et al., 2003).
VI - CONCLUSÃO
Na região de mata atlântica paulista foram encontrados 11 táxons de Nostocales com
ramificações verdadeiras (9 aerofíticos e 2 aquáticos) são eles: Hapalosiphon aureus,
Hapalosiphon sp. e N. lobatus (Família Hapalosiphonaceae), Spelaeopogon sommierii (Família
Borzinemataceae), Stigonema hormoides, S. informe, S. minutum, S. ocellatum, S. robustum, S.
turfaceum e Stigonema sp (Família Stigonemataceae). Isto demonstrou a baixa riqueza de
espécies desta ordem no trecho estudado.
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CAPÍTULO II
Variações de condições de cultivo para o
crescimento de Nostocales com ramificações
verdadeiras da mata atlântica paulista
Variações de condições de cultivo para o crescimento de Nostocales com ramificações
verdadeiras
RESUMO: As Cyanobacteria são dominantes em diversos tipos de ambientes, são
especialmente bem distribuídas e abundantes em ambientes terrestres e possuem importante
função ecológica no ecossistema. Em ambientes aerofíticos, atuam como colonizadores
primários e na economia na produção de compostos de interesse industrial como auxinas,
antivirais, antifúngicos, antibacterianos, biofertilizantes, entre outros. Atualmente, para o estudo
de cianobactérias tornou-se importante o cultivo laboratorial para que se consiga biomassa e
controle de contaminantes. Porém, são escassos os trabalhos sobre o cultivo, em particular das
Nostocales com ramificações verdadeiras, e vários dos poucos existentes relatam tentativas
frustradas na obtenção de cultivos específicos demonstrando a forte resistência destes
organismos ao crescimento em condições laboratoriais. Os resultados presentemente obtidos
indicaram que in vitro as Nostocales com ramificações verdadeiras seguem as mesmas
características de crescimento quando em hábitat natural: crescimento lento, baixa taxa de
colonização e competição. Dentre as variações testadas, a diluição de 2:1 (tanto líquido quanto
sólido) foi considerada a melhor concentração do meio de cultivo e a agitação em shaker
resultou em melhorias para o crescimento. A realização ou não de repicagens não foi suficiente
para o estabelecimento de coleções, pois estes organismos não resistem a muitos meses sob
condições de cultura. O teste de antibióticos para o controle de contaminantes mostrou-se
ineficiente e, portanto, não foi possível estabelecer quantidade segura para o seu emprego. As
pesquisas em relação ao cultivo destes organismos são ainda muito escassas. Neste estudo pôde-
se indicar um conjunto de condições de crescimento mais favoráveis para estes organismos, mas
para um melhor estabelecimento das condições ainda são necessários estudos mais abrangentes e
aprofundados.
I - INTRODUÇÃO
Cyanobacteria, segundo GALLON (2001), representam o maior grupo de organismos
fototróficos amplamente distribuídos na natureza e, embora sejam procariotos, são caracterizados
por realizar fotossíntese oxigênica, similar à verificada em algas e plantas.
Esses organismos são especialmente bem distribuídos e abundantes em ambientes
terrestres e possuem função ecológica importante nos ecossistemas, como relatado no estudo de
FLETCHER & MARTIN (1948), que demonstraram que massas incrustantes de cianobactérias
promovem a retenção de limo e argila e acarretam um rearranjo das partículas de terra. Como
colonizadores primários, promovem o desgaste de minerais e criam condições ligeiramente
ácidas devido à produção de ácido carbônico gerado por meio da fotossíntese, o que os
caracteriza como colonizadores primários (METTING, 1981). SCHWABE, já em 1972, havia
demonstrado sua importância neste papel estudando a ecogênese da Ilha de Surtsey (Islândia).
As cianobactérias também apresentam importante papel funcional em ambientes alagados
(McCORMICK et al., 1996, 1998; REJMÁNKOVÁ & KOMARKOVÁ, 2000). O conhecimento
e o entendimento da diversidade das espécies somados a função e as respostas destas sob
alterações nos ecossistemas ambientais são necessários para efetivar a proteção e o potencial na
utilização destes na população cianobacteriana (REJMÁNKOVÁ et al., 2004).
Estudos evidenciam que estes organismos são produtores de substâncias promotoras de
crescimento semelhantes a auxinas e também vitaminas, responsáveis em parte por maiores
produções vegetais (VENKATARAMAN, 1975; WHITTON, 2000). Além disso, pesquisas têm
demonstrado que as cianobactérias terrestres produzem compostos (SMITKA et al., 1992; JAKI
et al., 1999; RESHEF & CARMELI, 2002), como os metabólitos secundários ativos
(KREITLOW et al., 1999), além de sintetizarem diversos compostos com atividade citotóxica,
antifúngica e antiviral utilizados na medicina (PATTERSON & BOLIS, 1997; KUMAR et al.,
2000; BOKESCH et al., 2003; JHA & MISHRA, 2005). JUNGBLUT & NEILAN (2006)
estudaram, através de técnicas moleculares, o potencial de cianobactérias na formação de
substâncias tóxicas em florações de cianobactérias produzindo compostos responsáveis pela
promoção ou iniciação de tumores. Também têm sido investigadas produções de compostos
capazes de degradar pesticidas lançados indiscriminadamente no ambiente (SMITKA et al.,
1992; JAKI et al., 1999; RESHEF & CARMELI, 2002; JHA & MISHRA, 2005).
A taxonomia das cianobactérias é basicamente alicerçada nas características morfológicas
e métricas. A amplitude de certas características expressadas é dependente da forma e do
tamanho do organismo, sendo que, por exemplo, a formação de colônias e agregados é um fator
importante e determinante para a realização de processos fisiológicos das cianobactérias
(DOKULIL & TEUBNER, 2000).
Condições ambientais também interferem no desenvolvimento dos organismos. As altas
temperaturas, por exemplo, podem resultar em aumento da abundância de cianobactérias
aquáticas especialmente durante o verão e, por outro lado, é baixo o requerimento de energia
luminosa, que é um fator decisivo na formação de florações. Possuem ainda alta requisição de
elementos-traço se comparado ao fitoplâncton eucarioto (DOKULIL & TEUBNER, 2000).
Segundo BERMAN-FRANK et al. (2003), uma especialização celular característica e
altamente refinada do grupo das Nostocales é encontrada nos heterócitos. A trajetória evolutiva
dos mecanismos adaptativos que protegem a nitrogenase do oxigênio molecular e espécies
oxigênio-reativas pode ser distinguida por padrões de fisioecologia, da morfologia microbiana,
bioquímica, fisiologia e estrutura da comunidade ao longo de um gradiente anaeróbio até um
ambiente completamente aeróbio. A nitrogenase, segundo estes autores, é uma enzima que
converte o nitrogênio atmosférico em uma forma assimilável pelo organismo, é confinada em
uma célula micro-anaeróbia, o heterócito.
A distribuição das cianobactérias é comumente influenciada por diversos fatores
ambientais como diferentes concentrações de fósforo, nitrogênio, razão N/P, luz, oxigênio e pH
(WHITTON, 1992), por esta razão as espécies podem variar seus requerimentos ecológicos
(PERONA et al., 1998; BRANCO et al., 2001). Segundo WHITTON (1992), as cianobactérias
possuem a capacidade de se desenvolver em ambientes com média a baixa concentração de íons
e, ao mesmo tempo, ter vantagens sob condições de estresse de nutrientes. PAERL et al. (1994,
1996) estudaram a limitação de ferro, a fixação de nitrogênio e a produção primária de
cianobactérias marinhas que habitam oceanos oligotróficos e constataram que o ferro tem um
importante papel no controle da produção primária de cianobactérias planctônicas e no fluxo de
nutrientes em ambientes marinhos. Isto representa um dos diversos exemplos demonstrados na
literatura (WEISBURG et al., 1991; CASTIGLIONI et al., 2004) da dificuldade de se reproduzir
em laboratório as mesmas condições ambientais para se estabelecer uma condição de
crescimento para estes organismos.
Estudos de microbiologia ambiental são muitas vezes limitados por dificuldades na
identificação da diversidade de populações naturais porque o isolamento e cultivo de
microrganismos de ambientes naturais são muitas vezes impossíveis (CASTIGLIONI et al.,
2004).
Atualmente, estudos sobre as características moleculares das cianobactérias utilizam
amostras provenientes de bancos de cultura, mas relativamente poucas espécies têm crescimento
apropriado sob condições de cultura ou são mantidas em culturas axênicas (ZEHR et al., 1997).
Com relação especificamente as Nostocales com ramificação verdadeira, objeto deste estudo,
apenas uns poucos morfotipos têm sido cultivados (GUGGER & HOFFMANN, 2004),
indicando a complexidade e desconhecimento nos procedimentos para o estabelecimento de
cultivos em condições adequadas. Entretanto, também se verifica a existência de trabalhos que se
baseiam em amostras ambientais devido à grande dificuldade no isolamento e crescimento destes
organismos em laboratório (CASTENHOLZ, 1992).
Um problema adicional com relação às culturas disponíveis em bancos é a imprecisão nas
identificações taxonômicas, levando a um potencial equívoco na análise dos dados obtidos.
Estima-se que mais de 50% das linhagens de cianobactérias existentes em coleções de cultura
têm sido identificadas incorretamente ou sido colocadas erroneamente em alguns grupos
taxonômicos (ANAGANOSTIDIS & KOMÁREK, 1990).
Entretanto, alterações morfológicas podem ser induzidas em condições de cultivo e esta
plasticidade pode ser uma problemática para a taxonomia das cianobactérias baseadas
unicamente na morfologia (CASAMATA et al., 2003). Devido à variabilidade expressa pela
morfologia, as características usadas para classificação de linhagens de cianobactérias em níveis
de gênero ou espécie podem ser ambíguas, particularmente quando culturas de laboratório e
amostras da natureza são comparados (NEILAN et al., 1997).
Em resumo, investigações mais detalhadas sobre as cianobactérias de ambientes
aerofíticos têm revelado a presença de táxons ainda desconhecidos e estes organismos podem
desempenhar papel importante no entendimento das relações filogenéticas e biogeográficas do
grupo. Para obtenção destes dados mais facilmente adquiridos, preferencialmente devem ser
utilizadas cepas provenientes de cultivos e, por isto, torna-se recomendável o estabelecimento de
um protocolo adequado, com o intuito de viabilizar abordagens mais refinadas.
II - OBJETIVOS
Com base na demanda de estudos mais detalhados sobre as cianobactérias de ambientes
aerofíticos tropicais, principalmente aqueles envolvendo organismos da ordem Nostocales com
ramificação verdadeira, é importante a construção de um banco de culturas com metodologia
padronizada e adequada para o cultivo. Deste modo, com este estudo pretendeu-se:
Realizar diferentes procedimentos de triagem e purificação dos organismos;
Aplicar e testar diferentes protocolos de cultivo, visando obter condições de cultivo mais
adequadas;
Produção de culturas puras.
III - MATERIAL E MÉTODOS
1 - Meios de cultivo
Todos os meios utilizados, sólidos ou líquidos assim como tubos e placas de Petri, foram
autoclavados a 120ºC sob pressão de 1 atm por 20 minutos, com a finalidade de esterilização dos
mesmos.
1.1 - Meio sólido
Foram realizadas culturas em meio sólido com agar-agar Powder Dab 6 da Merck
(1%) utilizando-se diferentes meios específicos para o crescimento de cianobactérias: o meio
BG-11 (ALLEN, 1968) e o meio ASM-1 modificado de AGUIAR & AZEVEDO (1992)
(Anexo).
Como as Nostocales com ramificação verdadeira são organismos dotados de
heterócitos e são capazes de obter nitrogênio combinado diretamente da atmosfera, testes com
diferentes proporções de NaNO
3
(0%, 5%, 10%, 15%, 25% e 50%) em relação ao meio original,
foram realizados com o meio BG-11 a fim de verificar se as baixas quantidades deste composto
preveniam o crescimento de cianobactérias não heterocitadas, atuando, desta forma, como um
agente seletivo. O meio de cultura sólido de BG-11 com 25% de NaNO
3
em relação o meio
original foi diluído em uma proporção de 1:1 e 2:1 com água destilada autoclavada.
Para verificar se o espaço físico é um fator limitante para o crescimento das
cianobactérias, os meios sólidos testados, BG-11 e ASM-1, foram acondicionados em placas de
Petri de diferentes dimensões, 100 e 60 mm (Figura 1), e, ainda, de forma inclinada em tubos
com 200/20 mm altura/largura. Para diminuir a possível contaminação e perda de umidade do
meio durante o tempo de incubação, todas as placas de Petri foram vedadas com filme de PVC
ou Parafilm (American National Can), para se verificar qual era o mais eficiente. Os tubos foram
fechados com tampa plástica e com tampões de algodão e gaze para se verificar a eficiência nas
trocas gasosas e contra os contaminantes.
1.2 - Meio líquido
Foram realizados cultivos com os seguintes meios: BG-11, ASM-1 e água solo
(NICHOLS, 1973), com a finalidade de testar a melhor condição nutricional de crescimento das
cianobactérias em meio líquido estático. Assim como em meio BG-11 sólido, foram realizados
testes com diferentes proporções de NaNO
3
(0%, 5%, 10%, 15%, 25% e 50%) em relação ao
meio original como agente seletivo, baseando-se na presença de heterócito. Assim como em
meio sólido, o meio de cultivo BG-11 com 25% de NaNO
3,
em relação ao meio original, foi
diluído nas proporções de 1:1 e 2:1 com água destilada autoclavada.
Foi realizado, ainda, teste de espaço físico com tubos de diferentes diâmetros:
100/10 mm altura/largura e 200/20 mm altura/largura (Figura 2), ambos em meio BG-11.
Inicialmente os tubos também foram tampados com tampa plástica, e posteriormente com
tampões de algodão e gaze, a fim de permitir as trocas gasosas, como feito em meio sólido
inclinado.
2 - Inóculo
As amostras secas de cianobactérias, provenientes da coleta feita no campo, foram re-
hidratadas por um período de 12 a 24 horas para que os organismos retomassem a atividade
metabólica normal. Posteriormente, o material foi separado sob lupa, com auxílio de pinças e
estiletes, com o intuito de minimizar os possíveis contaminantes (outras cianobactérias,
macroalgas, briófitas, fungos, etc).
Depois de separados, os filamentos triados foram lavados repetidas vezes em água
destilada e colocados em tubos com tampa de rosca, devidamente esterilizados, com 1/3 de seu
volume ocupado com água destilada. Depois de fechado e com os filamentos em seu interior, o
tubo foi vigorosamente agitado, visando desprender das células de cianobactérias outros
possíveis organismos. Em seguida, o material foi novamente analisado sob lupa em placa de
Kline com 12 escavações (6 x 8cm) (Figura 3), para maior limpeza a partir da técnica de
“pescaria”. O material selecionado foi observado ao microscópio (em lâminas e lamínulas
esterilizadas) para assegurar baixa freqüência de contaminantes.
Os filamentos selecionados foram, então, inoculados em câmara de fluxo laminar
(previamente esterilizada com luz UV por 30 minutos e aplicação de álcool 70% sob a superfície
de trabalho) e com utilização de bico de Bunsen para a esterilização de todo o material usado no
procedimento (Figura 4).
Todas as culturas foram constantemente acompanhadas (7, 15 30 e 60 dias), analisadas e
repicadas com a finalidade de manter os cultivos puros e em bom estado para serem utilizados
em estudos futuros.
Deve-se esclarecer que os inóculos iniciais não permitiram uma avaliação quantitativa da
biomassa utilizada. Este fato deve-se às características peculiares do grupo, como as dimensões
reduzidas e as pequenas quantidades de inoculo, com a finalidade de reduzir a quantidade de
contaminantes. Outro aspecto que inviabilizou quantificação inicial é que, em geral, após triagem
e limpeza, o material geralmente resultava em filamentos separados, não formando um tufo ou
qualquer unidade que possibilitasse seu recolhimento e pesagem.
3 - Manutenção dos cultivos
Os cultivos tanto sólidos quanto líquidos foram mantidos em incubadoras com controle
de temperatura (A402 Marconi). As condições de cultivo utilizadas foram temperatura 20-23ºC
+/-1ºC, irradiância entre 40-70 µmol fótons.m
-2
.s
-1
constantes, com regime de 12:12 horas
luz/escuro, e umidade relativa do ar entre 35-70% (Figura 5).
4 - Potencialização do crescimento dos cultivos
Com o intuito de testar métodos para acelerar o crescimento das cianobactérias foram
realizados dois diferentes procedimentos de aeração nos cultivos.
4.1 - Sistema de aeração forçada
Aparato similar ao fotobiorreator fechado (REICHERT et al., 2006), este consiste
em um sistema que realiza adição de gases em cultivos feitos em diferentes erlenmeyers. Uma
bomba envia o ar do ambiente para um cano delgado de plástico transparente principal (com
algodão em suas extremidades atuando como filtro contra contaminantes), que é ligado a um
regulador de aeração. Interligados a este regulador, são acoplados outros canos de plástico
delgados e transparentes que adentravam nos erlenmeyers de 250 mL com 100 mL de meio BG-
11 com 25% de NaNO
3
(porcentagem previamente selecionada) tampados com rolhas de
algodão, gaze e Parafilm. A aeração foi, portanto, individual, direta e contínua durante 8 horas
diárias, sob iluminação junto a uma janela e temperatura ambiente (Figuras 6-7).
O aparato foi montado com três erlenmeyers, sendo que dois continham as espécies
aerofíticas de Stigonema ocellatum e Stigonema turfaceum e um com a espécie aquática
Nostochopsis lobatus.
4.2 - Agitação em shaker
Erlenmeyers de 250mL com 100mL de meio BG-11 com 25% de NaNO
3
foram
agitados em incubadora refrigerada com placa agitadora (shaker MA830/A Marconi) a 100 rpm,
sob temperatura de 24-27ºC, com irradiância entre 40-50 µmol fótons.m
-2
.s
-1
constantes e com
regime de 12:12 horas luz/escuro por 15 dias consecutivos. (Figura 8).
As espécies aerofíticas utilizadas foram: S. hormoides, S. minutum, S. ocellatum, S.
turfaceum; e as espécies aquáticas S. robustum e N. lobatus.
5 - Uso de antibióticos para a purificação dos cultivos
Os inóculos foram periodicamente analisados quanto à presença de contaminantes
(bactérias, outras microalgas e fungos) e, quando presentes, novos procedimentos para a
purificação das culturas foram realizados, como: limpeza, repicagens, lavagens, micropipetagem
(Micropipet automática de 40-200 μL da Oxford) e agitação em vórtex (GV Lab da Gilson).
Soluções inibidoras de crescimento foram utilizadas tanto em meio líquido quanto em
meio sólido para eliminação de contaminantes. Para eliminar o desenvolvimento de eucariotos,
foi adicionado 0,05 g de cicloheximida (3-[2-(3,5-Dimetil-2-oxociclohexil)2
hidroxietil]glutarimide - Sigma) por litro de meio, em algumas situações também foi testada uma
concentração duas vezes superior a esta. Para inibir a contaminação por bactérias foram
acrescidos no meio de cultura, 100 μl de solução antibiótica 1 (0,6 g de Penicilina e 1 g de
sulfato de estreptomicina em 200 mL de água destilada) e 100 μl de solução antibiótica 2 (7,5
mg de Penicilina G, 5 mg de Cloranfenicol, 6 mg de Neomicina e 5 mg de Polimixina B em 200
mL de água destilada).
6 - Avaliação do desenvolvimento das cepas em cultivo
Devido à impossibilidade de uma análise quantitativa da biomassa do pré-inóculo em
razão da pequena quantidade de cianobactérias presentes na amostra de campo, analisou-se os
dados obtidos de forma qualitativa no decorrer do tempo de cultivo. Estes dados foram definidos
em quatro categorias de crescimento, verificadas abaixo, baseados em porcentagens estimadas
por análise visual para melhor avaliação do crescimento das Nostocales com ramificações
verdadeiras em cultivo.
Categorias Valores quantitativos (%)
Insatisfatório < 20
Regular 20-50
Satisfatória 50-80
Excelente > 80
Figuras: 1 - Placas de Petri de 60 e 100 mm; 2 - Tubos de 100 e 200 mm; 3 - Placa de Kline (“pescaria”); 4 -
Inóculo na Câmara de Fluxo; 5 - Placas e tubos na incubadora; 6-7 - Sistema de aeração forçada (fotobiorreator
fechado): 1. Motor; 2. Cano delgado principal com algodão como filtro; 3. Regulador de aeração; 4. Canos
delgados para aeração individual; 5. Erlenmeyers de 250 mL. (adaptado de REICHERT et al., 2006); 8 -
Erlenmeyers no shaker.
1
2
3
4
5
6
7
8
IV - RESULTADOS
1 - Meio de cultivo
1.1 - Crescimento das cianobactérias em meio sólido
Foram obtidos diferentes resultados com as culturas realizadas com os meios
sólidos BG-11 e ASM-1.
Comparando o crescimento dos organismos aerofíticos e aquáticos observou-se
crescimento 3% superior do último, ou seja, categoria de crescimento insuficiente, em meio
sólido ASM-1. O mesmo tipo de crescimento também foi observado em meio BG-11 sólido, pois
95% das cianobactérias do gênero Nostochopsis morreram nestas condições. Em geral,
comparando ambos os meios sólidos testados, qualitativamente, o meio BG-11 obteve melhores
resultados.
Em relação ao teste de quantidade de NaNO
3
(0, 5, 10, 15, 25 e 50%) como agente
seletivo observou-se que a contaminação por outras cianobactérias é realmente diminuída
(aproximadamente 40%) em menores porcentagens de fonte nitrogenada, mas em ausência de
nitrogênio o crescimento dos organismos em estudo é inibido, e em altas quantidades deste
composto (50%) o número de cianobactérias contaminantes extrapola o número de
cianobactérias da ordem Nostocales com ramificações verdadeiras. Verificou-se após diversas
vezes inoculado e repicado em triplicatas que 25% de NaNO
3
é a quantidade mais adequada para
o crescimento destes organismos com a inibição satisfatória dos contaminantes. As porcentagens
entre 0 e 15% de NaNO
3
apresentaram resultados insatisfatórios se comparado a 25% de NaNO
3
.
O teste de espaço físico foi realizado com o melhor meio de cultura selecionado para
estas cianobactérias (BG-11) em placas de Petri de 60 e 100 mm. Observou-se que a placa menor
é melhor no manuseio e na redução do número de contaminantes, o que pode ser devido a sua
menor área de exposição, mas entre 20 a 30 dias de cultura algumas placas apresentaram-se
completamente secas, mesmo estando revestidas com filme de PVC, e a menor quantidade de
ágar, portanto as placas de Petri de 100 mm são mais adequadas para o cultivo das
cianobactérias. Em relação ao meio sólido inclinado, em tubos de vidro com 200/20 mm de
altura/largura, demonstrou ser um método de cultura inaplicável para esse tipo de cianobactéria,
pois algumas se fixaram tão fortemente ao substrato que foi impossível a sua retirada com a alça
de platina durante os repiques, além de uma intensa contaminação por bactérias e leveduras. Esse
tipo de cultura pode ser mais indicado a culturas de cianobactérias com morfologia unicelular.
Quanto ao teste de uso de filme de PVC e Parafilm para envolver as placas, verificou-se
que o filme de PVC é mais adequado, pois o Parafilm por ser um excelente vedante proporciona
o acúmulo de gotículas de água no interior da placa, o que pode levar em poucos dias ao
acúmulo de água no fundo da mesma, aumentando desta maneira a umidade interna da placa e
propiciando o crescimento de fungos, além reduzir as trocas gasosas com o meio externo.
Inicialmente, o fechamento dos tubos foi realizado com tampas plásticas, o que
provavelmente diminui as trocas gasosas. Portanto realizou-se posteriormente um tamponamento
com chumaços de algodão enrolados em gaze que gerou melhores resultados.
O crescimento das diferentes espécies de cianobactérias com ramificações verdadeiras
cultivadas em meio sólido pode ser definido como um crescimento com forma de “bola”, ou seja,
os filamentos se emaranham-se fortemente, impossibilitando boa visualização do crescimento.
Nos testes realizados, independente das condições utilizadas, o desenvolvimento das cepas foi
insatisfatório e muito lento, sendo na maioria dos casos nulo, independente de estarem na
superfície ou infiltrados no ágar. Mesmo com a realização de repicagens constantes e métodos de
purificação periódicos (15, 30 e 60 dias), as Nostocales com ramificação verdadeira não
resistiram às condições de cultivo.
No meio de cultivo diluído nas proporções de 1:1 e 2:1 de água destilada autoclavada e
BG-11 com 25% de NaNO
3
em relação o meio original em ágar 1%, verificou-se que em ambas
as proporções de diluições que em condições mais escassas de nutrientes o crescimento destas
cianobactérias é regular (20%) se comparado a este mesmo meios não diluído. A quantidade de
contaminantes também foi diminuída (50%), sendo também regular, porém em poucos meses de
cultivo, mesmo realizando procedimentos de repicagem as cianobactérias não resistiram, assim
como nos meios não diluídos.
1.2 - Crescimento das cianobactérias em meio líquido
As culturas em meio líquido foram realizadas com três diferentes meios: BG-11,
ASM-1 e água-solo. Em geral, as cianobactérias obtiveram resultados semelhantes nos dois
primeiros, e nulo em água-solo.
Houve crescimento regular dos organismos (30%), tanto aerofíticos quanto aquáticos, em
meio líquido se comparado ao meio sólido. Porém não houve diferenças do crescimento entre
aerofíticos e aquáticos.
A variação na concentração de NaNO
3
(0, 5, 10, 15, 25 e 50%) em meio BG-11 como
agente seletivo resultou, assim como em meio sólido, em diminuição da contaminação por outras
cianobactérias quando adicionadas menores porcentagens de NaNO
3
. Em maiores porcentagens
de NaNO
3
(25% e 50%) resultaram em cultivos fortemente contaminados por outras
cianobactérias. Já nas menores porcentagens de NaNO
3
(0, 5, 10 e 15%), o crescimento das
Nostocales com ramificações verdadeiras foi reprimido. Por esta razão a proporção de 25% de
NaNO
3
foi considerada a mais satisfatória, assim como em meio sólido. Todas as cianobactérias
aquáticas do gênero Nostochopsis morreram em poucos dias em meio líquido com 0% de
NaNO
3
, indicando que este organismo mesmo sendo heterocitado necessita de quantidades
mínimas deste composto para seu estabelecimento.
O teste de espaço físico foi realizado com o meio definido como satisfatório para o
crescimento das Nostocales com ramificações verdadeiras (BG-11), em tubos com 100/10 mm
de altura/largura e 200/20 mm de altura/largura. Observou-se que há limitações de espaço físico
para o crescimento dos organismos, pois nenhuma espécie resistiu nos tubos pequenos. Portanto,
pode-se dizer que as cianobactérias testadas necessitam de amplo espaço para o crescimento,
mesmo que este seja lento ou quase insignificante. Por esta razão as culturas foram mantidas em
tubos grandes (200/20 mm).
Assim como para os tubos com meio sólido inclinado, foram colocados chumaços de
algodão enrolados em gaze para o fechamento.
Em relação ao tipo de crescimento em meio líquido, tanto as espécies aerofíticas quanto
as aquáticas, é caracterizado como regular e extremamente lento, o que foi confirmado
microscopicamente devido à presença de novas ramificações, além da presença de hormogônios
e, em alguns casos, de acinetos. Assim como em meio sólido as cianobactérias tendem a formar
“bolas”, ou seja, vão se emaranhando, o que dificulta a visualização do crescimento.
A realização ou não de repiques a cada 15, 30 e 60 dias não é suficiente para que estas
cianobactérias se estabeleçam por muitos meses às condições de cultivo. Portanto, também não
se conseguiu estabelecer uma forma de mantê-las em culturas líquidas.
No meio de cultivo diluído nas proporções de 1:1 e 2:1 assim como descrito para o meio
sólido, resultou que em condições mais escassas de nutrientes o crescimento destas
cianobactérias também é regular (20%) se comparado a este mesmo meios não diluído. E que a
quantidade de contaminantes também foi regular, porém em poucos meses de cultivo, mesmo
realizando procedimentos de repicagem as cianobactérias não resistiram, assim como nos meios
não diluídos.
2 - Potencialização do crescimento dos cultivos
O sistema de aeração forçada mostrou-se ineficaz devido ao aumento da presença de
contaminantes. Em três dias de experimento, observaram-se colônias amareladas de bactérias por
todo o líquido. Isto evidencia que o sistema de filtração (algodão nas duas extremidades do cano
delgado transparente principal) não é eficiente contra a entrada de contaminantes do meio
externo para o interior dos erlenmeyers, resultando em uma técnica de aeração que não apresenta
praticidade e eficiência, e, portanto, não aplicável.
A agitação em shaker foi realizada com seis erlenmeyers de 250mL com 100mL de meio
líquido de BG-11, sendo quatro com as espécies aerofíticas S. hormoides, S. minutum, S.
ocellatum e S. turfaceum e os outros dois com as espécies aquáticas S. robustum e N. lobatus A
velocidade de agitação foi de 100 rpm por 15 dias consecutivos. O teste apresentou resultados
regulares. Observou-se crescimento de 25%, se comparado com as culturas estáticas tanto de
meio sólido quanto líquido. Porém, assim como no sistema de aeração forçada, apresentou
intensa contaminação por bactérias. Isto pode ser devido as culturas prévias não estarem
axênicas, sendo, portanto, um resultado esperado, pois a aeração também favorece o crescimento
de outros organismos. O crescimento de ambas as espécies aquáticas foi pouco mais expressivo
(10%) se comparado ao crescimento obtido pelas aerofíticas. Comparativamente ao outro
método de aeração testado, a agitação em shaker obteve melhores resultados.
3 - Uso de antibióticos para purificação dos cultivos
Devido à composição orgânica básica do ágar verificou-se alta contaminação por fungos
(bolores e leveduras). Inicialmente foi adicionando 0,05 g/L de cicloheximida, para inibir o
crescimento dos organismos eucarióticos, porém os resultados foram insatisfatórios. Portanto
tentou-se adicionar o dobro desta quantidade (0,1 g/L) o que diminuiu, mas não eliminou
totalmente os contaminantes eucariotos como os fungos e as leveduras. Em meio líquido a
quantidade inicial de cicloheximida foi suficiente e, portanto, satisfatória no combate aos
eucariotos.
A utilização de soluções antibióticas (1 e 2) para diminuir a contaminação por bactérias
obteve resultados satisfatórios, pois não houve morte das cianobactérias, porém não foi
estabelecido se essa quantidade poderá acarretar em danos celulares futuros nas cianobactérias,
baseando-se no fato de também serem procariotas. Em razão disto, o controle de contaminantes
como as bactérias foi dificultado, pois possuem fisiologia semelhante e, portanto, a utilização de
antibióticos pode tornar-se fator de risco para o desenvolvimento das cianobactérias.
V - DISCUSSÃO
Segundo ANAGNOSTIDIS & KOMÁREK (1990), Stigonematales (atualmente
Nostocales com ramificação verdadeira segundo HOFFMANN et al., 2005) é o grupo mais
diferenciado de cianobactérias, possui ciclo de vida complexo, além de estrutura altamente
variável e organização complexa de filamentos. Possuem baixa atividade fisiológica, pouca
habilidade na competição com outras cianobactérias, atividade metabólica reduzida, lentas taxas
de colonização, além de possuir limitação e restrição de nutrientes. O talo bem elaborado é a
causa provável da sua baixa atividade metabólica. Alguns poucos organismos, como Stigonema
informe, são dominantes em biótopos com condições ecológicas muito especializadas
(extremas). Representam um grupo de organismos procarióticos autotróficos altamente
especializados devido as suas características biológicas, morfológicas, fisiológicas, bioquímicas
e filogenéticas.
Todas essas características de crescimento e metabolismo foram fortemente visualizadas
em ambos os tipos de cultivo testados, sólido e líquido. O crescimento demasiadamente lento, às
vezes quase nulo, a competição com outras cianobactérias, bactérias e organismos heterotróficos,
além da baixíssima taxa de colonização, foi visualmente negativo para as cianobactérias em
estudo. Isto também foi verificado em campo, pois, em hábitat natural, as Nostocales de
ramificação verdadeira foram encontradas esparsamente entre grandes crescimentos de outras
cianobactérias e muito raramente ocupavam grandes extensões, além de formarem crostas
extremamente delgadas sobre o substrato. Desta forma, pode-se dizer que as cianobactérias em
condições artificiais de crescimento (laboratório) responderam de maneira semelhante àquela em
seu hábitat original.
Segundo ANDERSEN (2005), não é comum que as espécies cresçam nos estágios
iniciais do isolamento, mas somente após uma ou muitas transferências de meio de cultura
fresco. Isto pode ser reflexo de deficiência do meio de cultura a alguns elementos particulares ou
compostos orgânicos existentes no seu hábitat natural, e, portanto, impossíveis de serem
proporcionados em meio artificial. Isto pode ser descoberto muito tempo após a primeira cultura,
podendo acarretar na perda da amostra e/ou do isolado original. De acordo com o mesmo autor,
outro fator importante pode estar relacionado com o hábitat natural do organismo. O acúmulo de
compostos tóxicos do ambiente pode causar a morte em cultura, pois na natureza estes resíduos
geralmente são diluídos ou metabolizados por outros organismos (por exemplo, as bactérias).
Isto de fato ocorreu ambos os representantes aquáticos Nostochopsis lobatus e Stigonema
robustum que não suportaram as condições de cultura e com as aerofíticas Hapalosiphon aureus
e Hapalosiphon sp. que também pode ser devido à pequena quantidade de biomassa inicial.
Adicionalmente, há numerosos relatos na literatura que indicam que alterações nos níveis
de nutrientes, intensidade de luz, pH e temperatura podem modificar o crescimento e o
metabolismo secundário das cianobactérias (ANDERSEN, 2005).
Comparando as duas formas de meio, sólido e líquido, os diferentes meios testados (BG-
11, ASM-1 e água solo) e as diferentes concentrações de NaNO
3
, verificou-se que o meio líquido
BG-11 com 25% da concentração original de NaNO
3
permitiu o melhor crescimento das
cianobactérias da ordem Nostocales com ramificação verdadeira, também utilizado nos trabalhos
de NEILAN et al. (1997), GUGGER & HOFFMANN (2004) e TATON et al. (2006) tendo
como diferencial a ausência de NaNO
3
.
Em relação à presença/ausência de NaNO
3
diluído no meio, constatou-se que a
cianobactéria aquática Nostochopsis lobatus não sobrevive em meio isento de fonte nitrogenada.
Segundo MORI et al. (2003), a nutrição por nitrogênio modula o estresse responsável pela
regulação da expressão de proteínas, resultando então, em um potencial mecanismo de
integração ambiental e de desenvolvimento.
As cianobactérias aquáticas foram às exceções quanto ao meio de cultura preferencial,
pois também apresentaram crescimento em meio líquido ASM-1, assim como utilizado nos
estudos de comparação fisiológica e morfológica de Nostocales de ramificação verdadeira por
MARTIN & WYATT (1974).
Inicialmente, na elaboração do meio BG-11, tanto em meio sólido quanto em meio
líquido, visualizava-se um precipitado de coloração alaranjada. Isto foi um problema inicial
crítico, pois compostos precipitados não são disponíveis, ou seja, não podem ser utilizados pelos
organismos, o que resultou em estagnação do crescimento nos primeiros meses de cultura. O
problema foi solucionado a partir da utilização da técnica de HUISMAN et al. (2002), segundo a
qual os compostos K
2
HPO
4
.3H
2
O, Na
2
CO
3
e Fe(III) (NH
4
)
3
têm, necessariamente, que ser
autoclavados separadamente e somente misturados após total resfriamento, pois não são
quelados pelos agentes presentes no meio (EDTA e Ácido cítrico) quando expostos a altas
temperaturas, e, portanto, precipitam. Desta forma as fontes de ferro, potássio, fosfato e carbono
estavam restritas.
Em meio líquido estático observou-se um sutil aumento do crescimento quando trocadas
as tampas plásticas pelos chumaços de algodão e gaze, permitindo maior troca gasosa entre os
meios externo e interno do tubo de cultura, confirmando que as trocas gasosas são fundamentais
(YAMAMOTO & NAKAHARA, 2005).
A aeração forçada foi uma opção relativamente eficaz para acelerar o crescimento destes
organismos. Tais resultados foram também observados nos trabalhos de FÁBREGAS et al.
(1996), que estudaram métodos de cultivos para Chorella autrophica, de YUSOFF et al. (2001),
sobre culturas de cianobactérias aquáticas, de DUARTE FILHO et al. (2002), analisando
cultivos com Spirulina platensis, de LIU et al. (2005), induzindo o crescimento de Nostoc
flagelliforme para obtenção de ácidos graxos, e de REICHERT et al. (2006), que realizaram
cultivo semicontínuo com Spirulina platensis em fotobiorreator fechado.
O ágar é rotineiramente utilizado como agente solidificante em meio de cultura para
bactérias, mas possui impurezas e várias destas podem ser as responsáveis pela inibição do
crescimento de várias cianobactérias (FERRIS & HIRSCH, 1991). Segundo ANDERSEN
(2005), várias cianobactérias podem não crescer na superfície, mas embebidas no ágar. Neste
estudo todas as cianobactérias plaqueadas não apresentaram crescimento.
O isolamento e caracterização de linhagens de cianobactérias de diversos biótipos,
associada a técnicas de cultura e a análises baseadas no genótipo, é extremamente importante
para o estudo da diversidade cianobacteriana. Isso permite uma ligação entre os aspectos do
genótipo e do fenótipo ajudando a compreender a fisiologia, a autoecologia e o potencial
biotecnológico das cianobactérias. Além disso, caracterizações baseadas em estudos polifásicos
aperfeiçoam a resolução da taxonomia das cianobactérias, permitindo investigação de morfotipos
e genótipos paralelamente (TATON, 2006).
Para um isolamento bem sucedido é necessário entender e proporcionar o que ocorre
naturalmente em condições ambientais, além da eliminação de contaminantes, especialmente os
que podem competir com as espécies em estudo. Técnicas de diluição, isolamento de uma única
célula por micropipetagem e estrias em ágar são amplamente utilizadas, entre outros métodos, e
ao final destes passos, requer ainda continuação do crescimento em sub-culturas. Várias espécies
de cianobactérias são facilmente isoladas e cultivadas, enquanto outras são difíceis ou
visivelmente incapazes de crescerem em meios de cultura artificiais, como visto no estudo
realizado com as Nostocales de ramificação verdadeira da região tropical de mata atlântica. São
raros os estudos de elaboração de culturas específicas de cianobactérias aerofíticas
(ANDERSEN, 2005).
A purificação de Nostocales com ramificações verdadeiras é muito mais trabalhosa se
comparada a organismos com outras formas morfológicas de cianobactérias, como as de forma
cocóide, onde se utiliza a técnica de isolamento por estrias com êxito. Estes organismos
apresentam forma robusta e muito ramificada o que resulta em abrigo a diversos tipos de
contaminantes. Para efetuar a limpeza mecânica com agitação em vórtex ou manual, os
filamentos, que são relativamente sensíveis, desmembram-se e distribuem-se esparsamente pelo
líquido, o que dificulta a sua captura para o posterior inóculo. A técnica de micropipetagem não
obteve sucesso, também pela espessura do filamento, pois ao pipetar um único filamento,
cianobactérias incrustadas na bainha do filamento não são separados. A utilização de antibióticos
para a prevenção de crescimento de contaminantes tanto procarióticos (bactérias) quanto
eucarióticos (fungos) também não apresentou resultados muito satisfatórios, principalmente em
meio sólido. O problema na utilização de antibióticos para eliminar bactérias está na
proximidade fisiológica destas com as cianobactérias. Antibióticos são efetivos contra
cianobactérias, pois, assim como as bactérias, são procariotos (ANDERSEN, 2005). Diversos
estudos trataram da utilização de antibióticos para eliminação de bactérias do meio de cultivo
(FERRIS & HIRSCH, 1991; MORI et al., 2003; MARTÍNEZ-VÁSQUEZ et al., 2004).
Entretanto, não há na literatura a indicação de uma quantidade segura de antibiótico em cultura
de cianobactérias, além do que cada organismo é sensível a uma determinada dose deste tipo de
composto químico. SALOMON et al. (2003) estudaram inúmeras linhagens de bactérias que
vivem sobre os filamentos das cianobactérias e verificaram que estas agem como
“cianobactericidas”, podendo impedir em 38% o crescimento das cianobactérias sob cultivo.
O cultivo em laboratório pode causar alterações morfológicas nas cianobactérias
(CASAMATA et al. 2003). Quando coletados, apresentam estágios típicos de desenvolvimento,
mas devido às modificações de hábitat e diferentes concentrações de elementos químicos, várias
espécies podem desestabilizar suas formas de crescimento gerando morfotipos atípicos, como
formas semelhante a aglomerações cocóides, ausência de ramificações e tricomas atipicamente
ramificados (ANDERSEN, 2005).
Neste estudo só foi observada leve alteração da morfologia da cianobactéria
Nostochopsis lobatus. Quando retirada da natureza e analisada ao microscópio, observaram-se
poucos heterócitos e coloração verde-clara. Após meses em cultura, independente do meio
testado, foi verificado expressivo aumento na quantidade de heterócitos, sendo estes, na maioria,
intercalares. Os filamentos dispuseram-se em intensos aglomerados e houve mudança da
coloração para um verde mais escuro e vivo. As demais cianobactérias testadas, e principalmente
as aerofíticas, não sofreram alterações morfológicas por causa do meio de cultivo no período
estudado. Segundo LAKATOS et al. (2001), um tipo de xantofila, a Zeaxantina, tem papel
importante de proteção em plantas contra a fotoinibição, e é especulado que possa ter papel
similar em cianobactérias. Ainda segundo estes autores, o conteúdo deste pigmento pode ser
relativamente alto em certas cianobactérias aquáticas e ser aumentado sob altas irradiâncias, e
em várias cianobactérias terrestres não se encontram altas concentrações de Zeaxantina e isto
não é aumentado em altas exposições de luz.
HOFFMANN & DEMOULIN (1985), em estudo sobre a variabilidade morfológica de
várias espécies de Scytonemataceae (Nostocales com ramificações falsas) em diferentes
condições de cultura, relataram pouca variação em meio líquido e que a composição do meio
pode afetar ou não a presença do heterócito.
Há interesse intenso da sociedade científica na busca de métodos mais detalhados,
específicos e realmente eficazes para o cultivo das cianobactérias em geral, sendo várias delas
recentes como os realizados por: YUSOFF et al. (2001), GUPTA et al. (2002), TATON et al.
(2003), MARTÍNEZ-VÁZQUEZ et al. (2004), KURANO & MIYACHI (2005) e YAMAMOTO
& NAKAHARA (2005). Com o meio BG-11, considerado pelo estudo em questão como o ideal
para o crescimento das Nostocales com ramificação verdadeira, existem alguns trabalhos atuais
que o utilizaram como os de GAO & YE (2003), LIU et al. (2005) & TATON et al. (2006).
Os gêneros Fischerella, Hapalosiphon e Mastigocladus são membros desta ordem mais
freqüentemente representados em cultura. Entretanto, são poucos os estudos com estes
organismos tanto de biótipos aerofíticos como aquáticos, e apenas dois gêneros são bem
caracterizados em culturas unicianobacterianas, Fischerella e Chlorogloeopsis (GUGGER &
HOFFMANN, 2004).
Atualmente, em estudos sistemáticos, é imprescindível a utilização de abordagens
polifásicas com a combinação de análises fenotípicas, moleculares e ultraestruturais. Somente
com os dados destes parâmetros pode-se elucidar satisfatoriamente a diversidade de
cianobactérias como um todo (KOMÁREK & KASTOVSKY, 2003). Para isto, o
estabelecimento de métodos de cultura e meios de cultivo eficazes para crescimento de linhagens
de cianobactérias é bastante recomendável e, principalmente com os organismos da ordem
Nostocales de ramificação verdadeira, ainda é um procedimento que deve ser melhor estudado e
detalhado.
VI - CONCLUSÃO
In vitro, as Nostocales de ramificação verdadeira seguem as mesmas características de
crescimento quando em hábitat natural: crescimento lento, baixa taxa de colonização e
competição. O meio líquido ou em sólido a diluição de 2:1 de água destilada e BG-11 com 25%
de NaNO
3
(em relação ao meio original) foi considerada uma condição de cultivo regular para o
crescimento destas cianobactérias, assim como o sistema de aeração de agitação em shaker.
Repicagens constantes ou a não realização deste procedimento não foram suficientes para o
estabelecimento de coleções de cultura, pois as Nostocales de ramificação verdadeira não
resistem a muitos meses sob as condições de cultura testadas. Também não se conseguiu
estabelecer quantidade segura de antibiótico para eliminação de outros procariotos
contaminantes nos cultivos de Nostocales de ramificação verdadeira.
VII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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VIII - ANEXO
Meio BG-11 (ALLEN, 1968)
Composto por solução de EDTA, Citrato férrico amoniacal, Metais traços, NaNO
3
,
K
2
HPO
4
+3H
2
O, MgSO
4
+7H
2
O, CaCl
2
+2H
2
O, Na
2
CO
3
e Ácido cítrico, todos a 1%, com exceção
dos metais traços a 0,1%, o pH da solução acertado em 7,4. A água bideionizada utilizada no
preparo foi destilada no momento da preparação, pra não perder sua validade isenta de sais.
Meio ASM-1 (AGUIAR & AZEVEDO, 1992)
É composto por quatro soluções:
1) Solução A: NaNO
3
, MgSO
4
+7H
2
O, MgCl
2
+6H
2
O, CaCl
2
+2H
2
O;
2) Solução B: KH
2
PO
4,
Na
2
HPO
4
+12H
2
O;
3) Solução C: H
3
BO
3
, MnCl
2
+4H
2
O, FeCl
2
+6H
2
O, ZnCl
2
, CoCl
2
+6H
2
O, CuCl
2
+2H
2
O;
4) Solução D: EDTA titriplex.
Nas seguintes proporções:
Solução A - 2%
Solução B - 0,2%
Solução C - 0,01%
Solução D - 0,04%
CAPÍTULO III
Caracterização molecular de populações de
Nostocales com ramificações verdadeiras
com base no rRNA 16S
Caracterização molecular de populações de Nostocales com ramificações verdadeiras da
mata atlântica paulista com base no rRNA 16S
RESUMO: As Cyanobacteria têm papel importante na história da Terra como produtores
primários e fonte de oxigênio atmosférico. Até hoje, entretanto, como e quando o grupo se
diversificou permanece obscuro. Durante as últimas décadas, biologistas têm empregado uma
variedade de técnicas moleculares para responder questões de filogenia, evolução e diversidade
de populações. A comparação de seqüências de rRNA é uma poderosa ferramenta para deduzir
as relações filogenéticas e evolucionárias. Para estudos filogenéticos, dados desta seqüência são
comumente empregados e sua utilização é adequada para distinguir grupos de altos níveis
taxonômicos (ordens) bem como de espécies. Os genes do rRNA 16S têm sido o critério para
determinação de relações filogenéticas ou da diversidade no ambiente e a detecção e
quantificação de populações específicas. Das onze espécies coletadas na região da mata atlântica
nove tiveram seus DNAs amplificados por PCR usando iniciadores para seqüências do gene do
rRNA 16S, porém, somente Stigonema ocellatum e Hapalosiphon sp. foram clonadas e
seqüenciadas com sucesso. Após análise BLAST, verificou-se 98% de identidade destas
cianobactérias com S. ocellatum SAG 48.90 e três diferentes espécies de Hapalosiphon
disponíveis no GenBank. Devido à escassez de dados obtidos neste estudo e dos armazenados no
Genbank para estes táxons em particular pode-se dizer que a proximidade taxonômica entre estas
populações ainda é incerta. As análises filogenéticas, por sua vez, corroboraram a origem
monofilética das cianobactérias heterocitadas.
I - INTRODUÇÃO
Muitos microfósseis do Pré-Cambriano podem se relacionar com as cianobactérias
modernas a partir de um estudo comparativo entre fósseis (KNOLL & GOLÚBIC, 1992).
Entretanto, registros geológicos são sempre acompanhados da preservação incompleta da história
evolutiva, portanto tal percurso das cianobactérias tem ainda permanecido obscuro (TOMITANI,
2004). Durante a última década, biologistas têm empregado uma variedade de técnicas
moleculares para responder questões de filogenia, evolução e diversidade de populações
cianobacterianas (BOYER et al., 2001; TOMITANI, 2004) e, para esse fim, a maioria baseia-se
na seqüência do rRNA 16S (subunidade pequena ribossomal) (GIOVANNI et al., 1988;
TURNER et al., 1999; WILMOTTE & HERDMAN, 2001; GUGGER & HOFFMANN, 2004).
O advento da sistemática molecular permite comparar seqüências de DNA de
cianobactérias com outros procariotos e eucariotos inferindo uma filogenia. Análises baseadas
em uma ordem de extensão de seqüências gênicas revelam claramente que estes organismos
constituem um dos onze maiores clados do domínio Bacteria. Esta filogenia explica a disposição
de muitas similaridades em estruturas celulares e fisiológicas que cianobactérias compartilham
com outros procariotos (GRAHAM & WILCOX, 2000).
A comparação de seqüências de rRNA é uma poderosa ferramenta para deduzir as
relações filogenéticas e evolutivas entre Bacteria, Archaea e Eukarya (WEISBURG et al.,
1991). CASAMATTA et al. (2003) relatam que, em uma classificação, muitas vezes a variação
morfológica pode não corresponder a diferenças genéticas em cianobactérias, e que métodos
moleculares são essenciais na detecção do curso biogeográfico de espécies potencialmente
críticas.
Em geral, seqüências macromoleculares têm sido utilizadas porque permitem uma
inferência quantitativa de parentescos, além de serem cumulativas. O uso de macromoléculas em
análises filogenéticas, como os RNAs ribossomais, particularmente o rRNA 16S tem
providenciado o estabelecimento de relacionamentos por conter muitas informações, como a
conservação e distribuição natural das espécies (LANE et al., 1985) o que reflete a riqueza das
formas microbianas no ambiente (STACKEBRANDT & RAINEY, 1995). Segundo
YAMAMOTO & HARAYAMA (1998), a taxa de evolução do rRNA 16S é de 1% a cada 50
milhões de anos e a de sítios sinônimos de proteínas é de 0,7 a 0,8% por milhões de anos.
Análises do rRNA 16S e, mais recentemente, dos Espaçadores Transcritos Internos (ITS)
entre os genes de rRNA 16S-23S têm ampliado os estudos, propiciando alusões do parentesco
filogenético de gêneros de cianobactérias das ordens propostas por ANAGNOSTIDIS E
KOMÁREK (1990) (BOYER et al., 2001).
Segundo NÜBEL et al. (1997), a análise comparativa deste gene proporciona uma nova
significância para a investigação da discrepância entre linhagens de coleções e comunidades
naturais. Segundo estes mesmos autores, o gene rRNA 16S é independente de cultivo ou de
condições de crescimento, pois podem ser recuperados por amplificação do DNA. Porém,
relatam ainda, que há várias armadilhas potenciais nesta técnica, como a formação de quimeras
ou a amplificação de moléculas-molde com diferentes eficiências.
Embora as seqüências do rRNA 16S sejam rotineira e amplamente utilizadas para
distinguir e estabelecer relações entre gêneros com espécies bem resolvidas, há cientistas que
refutam o uso desta seqüência. Segundo FOX et al. (1992), quando o nível de identidade do
rRNA 16S é de 99%, a hibridização DNA-DNA pode ou não documentar a existência de uma
identidade de espécies. O que se observa, então, é que a identidade das seqüências de rRNA 16S
pode não garantir a identidade das espécies, porém pode determinar relacionamentos inter e
intragenéricos, e que, segundo este raciocínio portanto, os dados do rRNA 16S não são
apropriados. Os autores relatam ainda que as linhagens são denominadas como espécies com
base em outros critérios e atribuem as diferenças à possível diversidade de interespécies antes de
criar uma nova espécie.
Em alguns estudos, entretanto, são utilizadas seqüências de rRNA 16S para distinguir
grupos taxonômicos superiores (como as ordens) bem como espécies individuais
(CASAMATTA et al., 2005). Segundo GARCIA-PICHEL et al. (1998), a porcentagem de
similaridade usualmente utilizada nas seqüências de rRNA 16S para distinguir espécies é maior
que 97,5% o que corresponde a, pelo menos, 70% de hibridização DNA-DNA.
Árvores filogenéticas podem ser construídas a partir de outras seqüências genéticas além
do rRNA 16S, como gyrB (DNA girase topoisomerase tipo II), hetR (formação do heterócito),
nifD, nifH, nifK (nitrogenase), rpoB, rpoC1, rpoD1(RNA polimerase) e rbcLX (Rubisco) (SEO
& YOKOTA, 2003; HENSON et al., 2004a,b; RAJANIEMI et al., 2005; TOMITANI, 2004). A
comparação dos resultados das análises filogenéticas destes diferentes genes geralmente são
confrontadas com os de rRNA 16S. SEO & YOKOTA (2003) relatam que a árvore baseada nos
genes rpoC1 e rpoD1 corroboram resultados obtidos por análises segundo o rRNA 16S, que
indicam que Nostocales e Stigonematales são grupos monofiléticos, enquanto TOMITANI
(2004) afirma que árvores com base em hetR suportam a topologia do rRNA 16S.
Entretanto, todos os métodos moleculares para avaliação das relações filogenéticas (por
ex. hibridização DNA-DNA, DNA-RNA, rRNA 5S, seqüenciamento de proteínas,
oligonucleotídeos, rRNA 16S e padrão enzimológico, entre outros) têm suas vantagens e
limitações (LANE et al., 1985). A exata relação filogenética das cianobactérias é ainda, portanto
controversa (GIOVANNONI et al., 1988; TURNER et al., 1999; DOUGLAS & TURNER,
1991; WILMOTTE et al., 1992; ISHIDA et al., 2001; ROBERTSON et al., 2001).
As árvores filogenéticas do rRNA 16S mais comumente utilizadas baseiam-se nos
métodos de neighbor-joining (NJ), máxima parcimônia (MP) e máxima verossimilhança (ML)
como verificado, por exemplo, nos trabalhos de PALINSKA et al. (2006), WILLAME et al.
(2006), FIORE et al. (2007) e SARUHASHI et al. (2007).
A classificação taxonômica tem como função registrar a biodiversidade da Terra baseada
nas relações evolutivas (genéticas) e ecológicas, bem como as variações fenotípicas e pode gerar
uma certa confusão devido à sua amplitude de variantes (morfologia, ecologia, ultraestrutura e
molecular) (MARQUARDT & PALINSKA, 2007). O uso de nomes para a designação de vários
passos evolutivos (unidades taxonômicas) é constantemente a única via para a organização clara
do sistema. Nenhum outro método é, até agora, mais prático para determinação e comparação de
táxons em ambas as pesquisas de campo ou experimental. Entretanto, isto é necessário para usar
e para integrar todos os dados avaliados para o sistema para que a classificação possa ser
continuamente alterada, corrigida e reavaliada (HOFFMANN et al., 2005). Entretanto, os
estudos moleculares com cianobactérias cultivadas ou ambientais apresentam dois imponentes
obstáculos que são a eliminação de contaminantes da bainha e da mucilagem. O primeiro
interfere no resultado das análises, pois pode ter seu DNA amplificado e seqüenciado, resultando
em perda de tempo e de recursos, além de interferir nas conclusões obtidas. A bainha, por sua
vez, é rica em polissacarídeos, polifenóis e outras substâncias que dificultam a remoção do DNA
e impedem a ação de substâncias como o fenol e a lisozima que são amplamente utilizados na
lise celular (WU et al., 2000; SRIVASTAVA et al., 2007).
Contudo, são escassos os estudos com gêneros das Nostocales com ramificação
verdadeira, sendo que os existentes abordam poucos gêneros como Capsosira, Chlorogloeopsis,
Fischerella, Hapalosiphon, Nostochopsis, Stigonema e Westiellopsis, com reduzido número de
espécies. De fato, isto é muito pouco para se estabelecer e resolver a história evolutiva das
cianobactérias filamentosas heterocitadas com ramificações verdadeiras (TOMITANI, 2004).
Atualmente, sabe-se que táxons heterocitados são monofiléticos, enquanto as formas
unicelulares e filamentosas sem heterócito e/ou acinetos são heterogêneos, com linhas evolutivas
distintas. A monofilia das cianobactérias heterocitadas é comprovada por análises filogenéticas
baseadas em diferentes genes, observação que é corroborada pelo arranjo similar dos tilacóides
em todas as cianobactérias heterocitadas.
Independentemente de limitações das seqüências do rRNA 16S, que representam apenas
uma pequena fração do genoma total, e o número limitante de gêneros e espécies que possuem
seqüências avaliadas, vários discernimentos emergiram pela combinação de dados moleculares e
morfológicos, que não devem ser ignorados na classificação cianobacterial.
Investigações mais detalhadas sobre as cianobactérias, principalmente as de ambientes
aerofíticos, têm revelado um número consideravelmente elevado de táxons ainda desconhecidos.
Estes podem ainda guardar uma série de informações importantes para o entendimento das
relações de parentesco entre as diferentes espécies e esclarecer a estabilidade dos diferentes
caracteres utilizados na sistemática do grupo. Deste modo, a caracterização molecular de
populações (ou espécies) de ambientes tropicais e de hábitats especiais, como os aerofíticos,
assume grande importância nos estudos realizados nesta linha de pesquisa.
II - OBJETIVOS
Caracterizar populações de cianobactérias com ramificações verdadeiras encontradas na
mata atlântica paulista do ponto de vista molecular.
Comparar as seqüências obtidas com outras de mesmas espécies com a finalidade de
avaliar as possíveis variações produzidas pela distribuição geográfica.
Avaliar a proximidade molecular com espécies ou gêneros próximos, procurando por
relacionamentos de parentesco entre os organismos do grupo.
III - MATERIAL E MÉTODOS
A - CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS LINHAGENS USANDO O RRNA 16S
Foram utilizadas amostras de cianobactérias provenientes de campo (da natureza), devido
a impossibilidade de seu crescimento e manutenção em meios de cultivo.
A metodologia utilizada no estudo molecular das espécies de cianobactérias foi baseada
nos trabalhos de NEILAN et al. (1997) e LANE (1991).
1 - Extração do DNA genômico
A extração do DNA foi realizada com as nove espécies de cianobactérias coletadas ao
longo do litoral norte paulista em mata atlântica. São elas: Hapalosiphon aureus, Hapalosiphon
sp., Nostochopsis lobatus, Spelaeopogon sommierii, Stigonema hormoides, S. minutum, S.
ocellatum, S. robustum e S. turfaceum.
A quebra celular foi realizada primeiramente por maceração mecânica, utilizando-se
nitrogênio líquido para facilitar o procedimento. Depois do congelamento, a amostra de
cianobactéria foi então esmagada com auxílio de pistilo de plástico autoclavado. A quantidade de
biomassa a ser utilizada correspondeu a aproximadamente ao fundo do eppendorf.
Para a extração foi utilizado rotineiramente o kit Ultra Clean Microbial DNA Isolation
(MoBio Laboratories), segundo as especificações do fabricante. Em uma única situação
(Spelaeopogon sommierii) foi necessário o emprego do kit Gnome (QBIOgene), seguindo o
procedimento indicado pelo fabricante, pois o procedimento com o kit de rotina não produziu
resultados satisfatórios.
Ao DNA extraído (aproximadamente 5 µL por amostra) foram acrescidos 2 µL de
tampão de carregamento (ficol 15%, azul de bromofenol 0,25%, xilenocianol 0,25%) e a
integridade do produto foi verificada em gel de agarose 1%, contendo brometo de etídio (0,3 µ
g/mL de gel), em corrida eletroforética usando o tampão TBE 1,5 X (TBE 1 X: Tris-borato 44
mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). A documentação do gel foi feita utilizando fotografia digital do gel
em transluminador. Como padrão de tamanho de DNA foi utilizado o marcador de peso
molecular DNA Ladder de 1 Kb (Invitrogen). As amostras foram estocadas à temperatura de −
20
o
C até a próxima etapa.
2 - Amplificação do gene rRNA 16S
Para a amplificação das seqüências do gene do rRNA 16S (Figura 1) a partir do DNA
extraído, foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores 27F1
(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3’) e 1494Rc (5’-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3’),
segundo NEILAN et al. (1997). A amplificação do rRNA 16S foi realizada utilizando-se o kit
“Pure Taq Ready To-Go PCR Beads” (GE Life Science), seguindo-se as recomendações do
fabricante.
A termociclagem foi realizada nas seguintes condições: desnaturação a 94ºC por 4
minutos, 30 ciclos de desnaturação a 94ºC por 20 segundos, anelamento a 50ºC por 30 segundos
e extensão a 72ºC por 2 minutos e extensão final a 72ºC por 7 minutos. A concentração dos
produtos amplificados foi avaliada em gel de agarose 1% e purificado com Wizard PCR Preps
DNA Purification System (Promega). A verificação do tamanho dos amplicons resultantes será
realizada através do padrão de massa molecular Low DNA Mass Ladder (Invitrogen) e a
quantificação, através do aparelho Qubit Fluorometer (Invitrogen) a partir de 1 µL da amostra do
produto de PCR.
Figura 1 - Mapa do operon do gene rRNA 16S-23S demonstrando o gene rRNA 16S, a região dos ITS
(Espaçadores Transcritos Internos) contendo os genes ISR-B, ISR-C e ISR-D intercalados pelos genes de tRNA
isoleucina (tIle) e alanina (tAla) e o gene rRNA 23S, respectivamente (adaptado de BOYER et al. , 2001). Acima,
os primers utilizados na PCR (*) e no sequenciamento demonstrando suas regiões de anelamento e extensão (sem
escala).
3 - Clonagem de produtos de PCR
Após a amplificação por PCR das seqüências de DNA, foi realizada a clonagem dos
amplicons, utilizando-se o kit de clonagem “pGEM
®
-T Easy Vector Systems”, fabricado pela
Promega, seguindo as instruções do fabricante.
3.1 - Transformação
A introdução do vetor contendo o inserto nas células competentes de Escherichia
coli DH5α foi feita por meio de choque térmico (SAMBROOK et al., 1989). Alíquotas de 5 µL
do produto de ligação e 50 µL de suspensão de células competentes de E. coli DH5α foram
misturadas em um microtubo esterilizado e incubadas em gelo por 30 minutos. Posteriormente, o
microtubo foi colocado em banho-maria a 41°C por 1 minuto e em seguida novamente incubado
em gelo por 2 minutos. Um volume de 250 µL de meio SOC sob temperatura ambiente
(SAMBROOK et al., 1989) foi adicionado ao microtubo. A mistura foi, então, incubada a 37°C
por 1 hora sob agitação de 200 rpm. As células competentes transformadas foram plaqueadas em
meio LB sólido contendo ampicilina (USB Corporation, Cleveland, OH, EUA) e X-Gal
ITS
Primers
27F1* / M13F
1494Rc* / Sp6R
357F
357R
704F
704R
1114F
1114R
(Invitrogen), nas respectivas concentrações finais de 100 µg/mL e 100µg/mL de meio, por 14-16
horas a temperatura de 37°C.
3.2 - PCR de colônia
Após o plaqueamento, foram escolhidas as colônias brancas para uma nova
reação de PCR e confirmação da presença dos insertos de interesse. Uma pequena quantidade de
células transformadas de cada clone foi adicionada a 25 µL de reação de PCR utilizando-se os
primers: 27F1 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) e 1494Rc
(5’-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3’) (NEILAN et al., 1997). A amplificação foi feita em
solução contendo tampão para a reação PCR 1 X (Tris HCl 20 mM, pH 8,4; KCl 50 mM); 0,2
mM de cada dNTP, 3 mM de MgCl
2
, 1,5 U de Platinum
®
Taq DNA Polimerase (Invitrogen,
Carlsbad, California, USA), 10 ηg de DNA, 5 ρmol de cada primer, água ultrapura (Milli-Q,
Millipore, EUA) esterilizada, para um volume final de 25 µL. As condições da termociclagem
foram: desnaturação a 94ºC por 5 minutos, 25 ciclos de desnaturação a 95ºC por 20 segundos,
anelamento a 50ºC por 15 segundos e extensão a 60ºC por 1 minuto. A verificação do tamanho e
quantificação dos amplicons resultantes foi feita nas mesmas condições descritas anteriormente.
3.3 - Extração do DNA plasmidial
A extração dos plasmídios das células de Escherichia coli DH5α contendo os
insertos foi feita pelo método de preparação em pequena escala de plasmídeo, usando hidrólise
alcalina, de acordo com BIRNBOIM & DOLY (1979). As colônias brancas que fizeram parte da
seleção foram transferidas para 3,5 mL de meio LB contendo ampicilina e cultivadas por 14 a 16
horas a 37°C e sob agitação de 200 rpm. Em microtubos de 1,5 mL foram colocadas as células
produzidas e em seguida centrifugadas a 5.000 rpm por 5 minutos. O precipitado formado foi
ressuspendido em 100 µL de solução gelada (Tris-HCl 1 M, pH 8,0, EDTA 0,5 M, 0,9 de
glucose e água para um volume final de 100 mL). Em seguida, 200 µL de uma solução 1:1
(NaOH 0,4 N e SDS 2%) foram adicionados e misturados gentilmente. Após incubação no gelo
por 10 minutos, foram adicionados aos microtubos 150 µL de outra solução também gelada
(acetato de potássio 5m, 11,5 mL de ácido acético glacial e água, para um volume final de 100
mL). Posteriormente foram centrifugados a 13.000 rpm durante 20 min e o sobrenadante
transferido para um novo tubo, o qual foi tratado com RNase A (10mg/mL) por 30 min a 37 °C.
Foi adicionado 1 mL de etanol 100% gelado e centrifugado em seguida (13.000 rpm por 15 min).
O sobrenadante foi eliminado e o precipitado lavado com 750 µL de etanol 70% gelado e
centrifugado a 13.000 rpm por 5 min. Para eliminação total do etanol, o precipitado foi colocado
em bloco aquecedor a 40ºC até total evaporação. Posteriormente foi ressuspendido em 30 µL de
água ultrapura (Milli-Q) e incubado a 37°C por 10 min. Os plasmídios extraídos foram
verificados em gel de agarose 1% conforme descrito anteriormente e armazenados a -20°C até a
próxima etapa.
4 - Sequenciamento do rRNA 16S
Os amplicons clonados foram reamplificados por PCR usando o “DYEnamic ET
Terminator Cycle Sequencing” (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA). Para a reação
foram utilizados 200 ηg de cada plasmídeo contendo o inserto, 5 ρmol.µL
-1
do iniciador M13F
(5’-GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3’) e do SP6 (5’- ATTTAGGTGACACTATAGAA-
3’). Os oligonucleotídeos 357F (CCTACGGGAGGCAGCAG), 357R (CTGCTGCCTCCCGTA
GG), 704F (GTAGSGGTGAAATSCGTAGA), 704R (TCTACGSATTTCACCSCTAC), 1114F
(GCAACGAGCGCAACCC) e 1114R (GGGTTGCGCTCGTTGC) descritos por LANE (1991)
foram usados em reações adicionais, buscando-se o seqüenciamento do fragmento total com
aproximadamente 1500 pb.
A reação de termociclagem para seqüenciamento foi realizada sob as seguintes
condições: desnaturação a 95°C por 20 segundos, anelamento a 50ºC por 15 segundos e extensão
a 60°C por 1 minuto em 25 ciclos. Após a amplificação dos fragmentos parciais de interesse,
procedeu-se a precipitação dos mesmos conforme manual de instruções do kit. Foi utilizado o
seqüenciador capilar ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), os dados
foram coletados e processados pelo programa “ABI PRISM® DNA Sequencing - Analysis
Software” versão 3.7 (Applied Biosystems).
Com a finalidade de se obter uma seqüência gênica de maior confiabilidade, o amplicon
foi seqüenciado em triplicata com os primers externos (M13F e Sp6R) e internos (357F, 357R,
704F, 704R, 1114F e 1114R).
B - Processamento e análise filogenética das seqüências
As seqüências geradas foram processadas para remoção de bases produzidas com baixa
qualidade (índice de qualidade < 20). Os fragmentos parciais seqüenciados foram alinhados e
editados por correção manual usando-se o programa BioEdit v 7.0.5 (HALL, 1999), em sistema
operacional Windows XP. As seqüências foram comparadas com outras previamente depositadas
no GenBank do National Center for Biotechnology Information (NCBI), utilizando-se a
ferramenta Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) (ALTSCHUL et al., 1990).
As seqüências obtidas, somadas as outras selecionadas foram novamente alinhadas,
editadas e utilizadas para a análise filogenética. Com base em táxons próximos apontados por
análises preliminares, onde se buscou uma comparação mais abrangente com outros membros do
grupo, foram utilizados os seguintes: Cyanobium sp. JJ27STR, Prochlorococcus marinus,
Phormidium sp. UTCC487, Leptolyngbya boryana UTEX B485, Nostoc commune EV1-KK1,
Brasilonema terrestre CENA116, Scytonema hofmanni PCC7110, Fischerella mucicola
PCC7414, Fischerella sp. CENA19, Nostochopsis sp., Chlorogloeopsis sp. Greenland_5,
Hapalosiphon welwitschii, Hapalosiphon delicatulus, Symphyonemopsis sp. VAPOR1,
Stigonema ocellatum SAG48.90 e Westiellopsis prolifica SAG16.93. Seus códigos de acesso e
quantidade de pares de bases estão descritos no Anexo 2.
As matrizes de dados foram exportadas no formato NEXUS (MADDISON et al., 1997),
arquivo de entrada para o software PAUP (“Phylogenetic Analysis Using Parsimony and other
methods”) (SWOFFORD, 2003).
As árvores filogenéticas foram construídas pelos métodos de distância neighbor-joining,
máxima parcimônia e máxima verossimilhança (maximum likelihood) (SCHNEIDER, 2003). Os
limites de confiança dos grupos (clados) das árvores filogenéticas foram calculados com os
valores de suporte de bootstrap com 1.000 réplicas de buscas heurísticas, o que gerou árvores de
consenso com o critério maior que 50% de semelhança nos ramos das árvores.
A edição das árvores foi realizada utilizando-se o programa TreeView v.1.6.1 (PAGE,
1996).
IV - RESULTADOS
Das nove espécies de cianobactérias testadas, oito resultaram em amostras positivas
quanto à extração de DNA, apresentando, entretanto, baixa quantidade de DNA extraído e
purificado quando comparada à quantidade de material bruto utilizado na extração (0,1 a 0,25g).
Porém, o DNA extraído apresentou, na maioria dos casos, boa qualidade constatada pela
amplificação e posteriormente comprovada pela eletroforese em gel de agarose (Figura 2).
M 1 2 3 4 M M 5 6 7 8 9 M
Figura 2 - Géis representativos dos produtos de amplificação (PCR) do gene rRNA 16S. M - marcador de
peso molecular 1 Kb DNA Ladder (Invitrogen). 1 - Hapalosiphon aureus; 2 - Hapalosiphon sp.; 3 -
Nostochopsis lobatus (negativo); 4 - Spelaeopogon sommierii; 5 - Stigonema hormoides; 6 - S. minutum; 7 -
S. ocellatum; 8 - S. robustum; 9 - S. turfaceum.
A partir dos produtos de PCR conseguidos, foram realizadas clonagens com as espécies
Hapalosiphon sp., Stigonema hormoides, S. ocellatum, S. turfaceum, S. robustum e
Spelaeopogon sommierii. Os resultados de ligação com o vetor de clonagem ρGEM
®
-T Easy,
etapa inicial no procedimento de clonagem das amostras estão demonstrados abaixo (Tabela 1).
Considerou-se satisfatório quando houve ligação com o vetor e obtenção de clone com o inserto
de interesse, insatisfatório quando a ligação com o vetor foi bem sucedida, mas não se conseguiu
1636 pb
1482 pb
nenhum clone com o inserto de interesse e nulo quando não houve sequer a ligação com o vetor.
As razões para o alto índice de resultados práticos negativos ainda não são nítidas.
Tabela 1 - Resultados do procedimento de ligação ao vetor de clonagem ρGEM
®
-T Easy.
Espécie Ligação com o vetor de clonagem ρGEM
®
-T Easy
Hapalosiphon sp. Satisfatório
Stigonema ocellatum Satisfatório
Stigonema hormoides Insatisfatório
Stigonema turfaceum Insatisfatório
Stigonema robustum Insatisfatório
Spelaeopogon sommierii Nulo
As clonagens de Hapalosiphon sp. e S. ocellatum resultaram em 14 e 22 clones,
respectivamente. Dos 22 clones de S. ocellatum três foram eliminados após o PCR de colônia por
não conterem inserto. Os clones contendo o inserto de interesse de ambas as espécies foram para
a etapa de seqüenciamento com a utilização do primer universal M13F, sendo que destes, dez
foram positivos para o inserto do rRNA 16S de cianobactérias e os outros 23, insertos de
diversos gêneros de bactérias.
Por meio da análise BLAST, as seqüências resultantes para o primer M13F foram
comparadas às do banco de dados GenBank e um clone de S. ocellatum e três de Hapalosiphon
sp. encontraram correspondência com as seqüências quase completas do rRNA 16S,
respectivamente, de S. ocellatum (SAG 48.90 - AJ544082 - 96%) e H. welwitschii (AY034793 -
98%). Posteriormente, foi possível o alinhamento de todas as seqüências provenientes dos
primers internos em ambas as espécies e o estabelecimento de uma seqüência com 1352 e 1390
nucleotídeos de S. ocellatum e Hapalosiphon sp., respectivamente, consistindo, portanto, em
duas novas seqüências quase completas do gene rRNA 16S provenientes, agora, de hábitat
tropical. A análise BLAST destas seqüências resultou em identidade de Hapalosiphon sp. com
H. welwitschii e de S. ocellatum com S. ocellatum SAG 48.90 do GenBank, ambas no nível de
98% (Anexo).
As análises filogenéticas geraram a formação de três clados que merecem destaque. O
clado 1 reúne as formas heterocitadas, o clado 2 as populações de Stigonema ocellatum e o clado
3 sustenta todas as populações do gênero Hapalosiphon (Figura 3).
Figura 3 - Árvore filogenética resultante das análises de neighbor-joining, máxima parcimônia e máxima
verossimilhança. Valores de bootstrap utilizando os métodos citados estão respectivamente indicados nos nós,
quando superiores a 50%. Os números de acesso no GenBank dos táxons utilizados para a construção desta árvore
estão no Anexo 2.
V - DISCUSSÃO
A extração de DNA é o passo inicial para análise molecular bem sucedida. Uma das
etapas deste processo é a quebra celular, considerada crítica para a extração em cianobactérias
(WU et al., 2000), principalmente quando o material de interesse procede diretamente de
amostras de campo. Vários estudos têm proposto diferentes técnicas para o processo de extração
(TSAI & OLSON, 1991; MILLER et al., 1999; NEILAN, 1995; TILLET & NEILAN, 2000),
mas todos apresentam limitações que vão desde a toxicidade até a complexidade excessiva dos
protocolos empregados, passando, inclusive, por métodos de custo elevado (SARUHASHI et al.,
0,05
CLADO 1
CLADO 2
CLADO 3
2007). Um dos principais complicadores no processo de quebra celular e extração do DNA em
cianobactérias é a presença de exopolissacarídeos mucilaginosos produzidos pelos organismos e
freqüentemente depositados na forma de uma bainha ou de uma mucilagem amorfa. Muitos
processos utilizam fenol e lisozimas para promover a quebra celular, mas a presença da
mucilagem dificulta o acesso das substâncias à célula (DE PHILIPPIS & VINCENZINI, 1998) e,
assim, os protocolos não resultam em uma extração eficiente. Os resultados conseguidos
revelaram que o processo de extração adotado foi relativamente eficiente, gerando um produto
de boa qualidade, mas, contudo, de baixa eficiência quantitativa. Como sugerido em diversos
trabalhos, ponderamos que a pouca quantidade de DNA resultante da extração pode ser devida à
presença de exomucopolissacarídeos, muitas vezes abundantes nos organismos estudados,
dificultando, portanto uma extração quantitativamente mais produtiva.
As amostras originárias diretamente da natureza carregam um grande número de
contaminantes procariotos (outras bactérias), mesmo com os cuidados de limpeza iniciais podem
ter seus DNAs extraídos junto ao das cianobactérias de interesse. Este fato pode ter sido
intensificado pela existência de bainha de mucilagem nas cianobactérias, que impõe as
dificuldades acima comentadas.
STACKEBRANDT & GOEBEL (1994), utilizando linhagens de bactérias pertencentes
ao gênero Bacillus, correlacionaram resultados de hibridização DNA-DNA com a similaridade
das seqüências gênicas do rRNA 16S e concluíram que as linhagens com valores acima de 70%
de hibridização, consideradas pertencentes a mesmas espécies, também possuíam acima de
97,5% de similaridade entre suas seqüências do rRNA 16S. Deste modo, em estudos
bacteriológicos (que incluem as cianobactérias), este valor de similaridade passou a ser
amplamente utilizado como um delimitador entre genótipos que potencialmente definiriam
espécies ou relacionamentos filogenéticos mais distantes (GARCIA-PICHEL et al., 1998; LI et
al., 2000; GKELIS et al., 2003; CASAMATTA et al., 2006; TATON et al., 2006;
MARQUARDT & PALINSKA, 2007).
As similaridades observadas (98%) entre as populações de Hapalosiphon sp. e Stigonema
ocellatum da mata atlântica brasileira e as populações de H. welwitschii e de S. ocellatum
presentes no Genbank (americana e européia, respectivamente) indicam que estas pertencem à
mesma espécie, pois o valor de porcentagem foi superior ao limite comumente utilizado para a
definição de táxons específicos comparados pelo rRNA 16S. Porém, não foram encontradas as
características morfométricas de H. welwitschii americana (dados não publicados pelos autores)
para que se pudesse confrontar os dados morfológicos com os moleculares e, portanto, afirmar
que se trata de uma mesma espécie. Um fator complicador é que a população de Hapalosiphon
sp. estudada apresenta divergências métricas em relação à H. welwitschii descrita na literatura
especializada.
Discrepâncias em termos de similaridade entre seqüências podem ser geradas por erros de
identificação em alguma das populações, levando, portanto, a uma consideração equivocada
sobre a variação genotípica da espécie. Registros de equívocos como este são relativamente
comuns na literatura (p.ex. GUGGER & HOFFMANN, 2004; CASAMATTA et al., 2006;
PALINSKA et al., 2006; WILLAME et al., 2006). As populações brasileiras estudadas estão de
acordo com os dados morfológicos e métricos constantes na literatura e, em especial, na
descrição original da espécie no caso de S. ocellatum (BORNET & FLAHAULT, 1886-1888). A
população européia identificada como S. ocellatum, cuja seqüência foi depositada no GenBank
(AJ504082), tem suas características morfológicas principais fornecidas no trabalho de
GUGGER & HOFFMANN (2004) e, até onde se pode julgar, parece também corresponder à
espécie, mesmo com a falta de dados específicos sobre as características métricas.
A alta similaridade das seqüências de rDNA 16S entre as linhagens de Fischerella,
Hapalosiphon e Westiellopsis obtida em nosso estudo corrobora a apresentada por GUGGER &
HOFFMANN (2004). Estes autores relatam que estas linhagens são co-específicas, e que a alta
variabilidade nos caracteres morfológicos já foi verificada em Westiellopsis
(STRACKEBRANDT & GOEBEL, 1994; JEEJI-BAI, 1972). Confirmam, então, a necessidade
de uma revisão destes três gêneros, já que o critério estabelecido para definição de gênero é de
95% de similaridade.
Alguns estudos sugerem a existência de variações genotípicas para mesmos morfotipos
(ou morfoespécies ou UTOs - unidades taxonônimas operacionais). TATON et al. (2006)
encontraram, em seus estudos sobre linhagens de cianobactérias da Antártica, um conjunto de 21
diferentes genótipos enquanto a diversidade fenotípica, que se esperava correspondente, revelou
a existência de apenas 12 morfoespécies. Ou seja, existem diferentes genótipos dentro de uma
mesma espécie definida segundo caracteres morfológicos e métricos. Segundo os autores,
apoiados em FUHRMAN & CAMPBELL (1998), variações entre 97,5 e 99,9% dentro da mesma
UTO podem representar remanescentes da microdiversidade do rRNA 16S, o que pode ser
explicado, por exemplo, pela ocorrência de diferentes ecotipos. Espécies com ampla distribuição
geográfica e variação de hábitats (não ubiqüas - KOMÁREK, 1994) devem apresentar variações
genotípicas em diferentes graus, como verificado no presente estudo.
Um dos problemas para uma proposta mais robusta com relação a este tema é a falta de
dados moleculares para espécies dos gêneros. Com o progresso dos estudos e conseqüente
resultados de seqüenciamentos de outras espécies do grupo, acredita-se que o cenário poderá ser
interpretado com maior clareza, o que levará a conclusões mais bem alicerçadas.
Do ponto de vista filogenético dos níveis taxonômicos mais elevados (Figura 3), mesmo
que a árvore construída seja ainda limitada, pode-se destacar a formação de três clados
significativos. O clado 1 reúne as formas heterocitadas e o 2 agrupa as duas populações de
Stigonema ocellatum e o 3 as populações do gênero Hapalosiphon.
O clado 1 reforça a já constatada origem monofilética das cianobactérias heterocitadas,
demonstrada por autores como GUGGER & HOFFMANN (2004), HOFFMANN et al. (2005) e
TOMITANI et al. (2006). Embora todas as cianobactérias dotadas de heterócitos tenham uma
origem comum, fica obscuro se a distribuição atual reflete uma descendência vertical ou perda
secundária por transferência horizontal de genes dentro das cianobactérias (TOMITANI et al.,
2006).
A população de Stigonema ocellatum proveniente da mata atlântica posicionou-se
próxima à população européia, o mesmo foi observado com a população de Hapalosiphon sp.
com as populações de H. delicatulus e H. welwitschii formando dois clados distintos (clado 2 e
clado 3, respectivamente, Figura 3) com grande suporte nas análises filogenéticas, pois os
valores de neighbor-joining, máxima parcimônia e máxima verossimilhança obtidos foram acima
de 67%.
A ausência de clados distintos que separem as Nostocales com ramificações verdadeiras
das de ramificações falsas confirmam que esta característica morfológica não é um critério
adequado para se identificar linhagens. Isto foi observado neste estudo pelas posições ocupadas
na árvore filogenética por Nostoc commune (próxima as Stigonema ocellatum) e
Symphyonemopsis sp. VAPOR1 (próxima a Brasilonema terrestre e Scytonema hoffmanni).
GUGGER E HOFFMANN (2004) relatam que são necessários novos estudos sobre uma possível
evolução das cianobactérias heterocitadas com ramificações verdadeiras em Y das com
ramificações falsas.
Seqüências de rDNA têm um papel central no estudo de evolução e ecologia microbiana
e, particularmente os genes do rRNA 16S, têm sido o critério para determinação de relações
filogenéticas ou determinação da diversidade no ambiente e a detecção e quantificação de
populações específicas. (ACINAS et al., 2004).
As coincidências e correlações entre citomorfologia, fisiologia e características
bioquímicas representam o critério evolucionário mais importante da diversidade
cianobacteriana. Especialmente as definições ecológica e bioquímica são limitadas por um único
passo de diversificação cianobacteriana e a procura de limites entre estes é evidentemente
importante para o futuro da pesquisa destes organismos (KOMÁREK, 1994).
Análises moleculares são especialmente importantes, pois podem assegurar (ou reduzir) a
confiabilidade de determinados critérios morfológicos e/ou métricos e refletir a filogenia destas
mesmas características. Entretanto, em alguns casos, esta interpretação não é um processo
simples, como ressaltado por TATON et al. (2006).
A taxonomia moderna é, hoje, uma ciência sintética que procura utilizar todas as
informações acessíveis do material biológico em questão. A progressão de estudos como o
presente, abordando grupos de regiões ainda pouco exploradas como as tropicais, é de extrema
importância para o entendimento das relações evolutivas e produção de um sistema de
classificação mais natural para este importante grupo de organismos.
VI - CONCLUSÃO
Duas espécies oriundas de amostras de campo, Stigonema ocellatum e Hapalosiphon sp., tiveram
seus DNAs amplificados, clonados e seqüenciados com sucesso por meio de iniciadores para
seqüências do gene do rRNA 16S. Foi verificada identidade de 98% destas cianobactérias com
S. ocellatum SAG 48.90 e três diferentes espécies de Hapalosiphon disponíveis no GenBank.
Devido à escassez de dados obtidos neste estudo e dos armazenados no Genbank para estes
táxons em particular pode-se dizer que a proximidade taxonômica entre estas populações ainda é
incerta. As análises filogenéticas, por sua vez, corroboraram a origem monofilética das
cianobactérias heterocitadas.
VII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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VI - ANEXOS
ANEXO 1. Primers utilizados na amplificação e seqüenciamento do gene 16S rRNA das cianobactérias.
Primers Seqüência 5’ → 3’ Referências
27F1 AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG NEILAN et al., 1997
1494Rc TAC GGC EAC CTT GTT ACG AC NEILAN et al., 1997
M13F* GCC AGG GTT TTC CCA GTC ACG A LANE, 1991
Sp6R* ATT TAG GTG ACA CTA TAG AA LANE, 1991
357F* CCT ACG GGA GGC AGC AG LANE, 1991
357R* CTG CTG CCT CCC GTA GG LANE, 1991
704F* GTA GSG GTG AAA TSC GTA GA LANE, 1991
704R* TCT ACG SAT TTC ACC SCT AC LANE, 1991
1114F* GCA ACG AGC GCA ACC C LANE, 1991
1114R* GGG TTG CGC TCG TTG C LANE, 1991
* Primers de seqüenciamento.
ANEXO 2. Códigos de acesso e quantidade de pares de bases dos táxons retirados do Genbank utilizados na
montagem da árvore filogenética.
Táxon Código de acesso Nº pares de bases
Brasilonema terrestre CENA116 EF490447 1415
Chlorogloeopsis sp. Greenland_5 DQ431000 1437
Cyanobium sp. JJ27STR AM710383 1458
Fischerella mucicola PCC7414 AB075986 1147
Fischerella sp. CENA19 AY039703 1412
Hapalosiphon delicatulus AB093484 1440
Hapalosiphon welwitschii AY034793 1480
Leptolyngbya boriana UTEX B485 AF132793 1410
Nostoc commune EV1-KK1 AY577536 1112
Nostochopsis sp. AJ544081 1361
Phormidium sp. UTCC487 AF218376 1396
Prochlorococcus marinus X63140 1147
Scytonema hoffmanni PCC7110 AF132781 1412
Stigonema ocellatum SAG48.90 AJ544082 1352
Symphyonemposis sp. VAPOR1 AJ544085 1360
Westiellopsis prolifica SAG16.93 AJ544086 1347
ANEXO 3. Seqüência parcial do rRNA 16S composta pelos quatro nucleotídeos Adenina (A), Citosina (C),
Guanina (G) e Timina (T), identificando os nucleotídeos que diferem entre a amostra seqüenciada no presente
trabalho (Stigonema ocellatum mata atlântica) e a retirada do GenBank SAG 48.90 - AJ544082.
10 20 30 40 50 60
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 TTAGAGTTTGATTCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGTATGCTTAACACATGCAAGTCG
S. ocellatum MA ............................................................
70 80 90 100 110 120
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 AACGGACTCTTCGGAGTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGAATCTGCCTTTAGG
S. ocellatum MA .......G....................................................
130 140 150 160 170 180
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 TCTGGGACAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGGATATGCTTAACGGTGAAAGATTAA
S. ocellatum MA ...............................................A............
190 200 210 220 230 240
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 TTGCCTAAAGATGAGCTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAGAGCCTACCAAGGC
S. ocellatum MA ......G....G................................................
250 260 270 280 290 300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 GACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAG
S. ocellatum MA ............................................................
310 320 330 340 350 360
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAA
S. ocellatum MA ............................................................
370 380 390 400 410 420
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 TACCGCGTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCAGGGAAGAATAATG
S. ocellatum MA .......................................................GTT..
430 440 450 460 470 480
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 ACGGTACCTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGG
S. ocellatum MA ................C...........................................
490 500 510 520 530 540
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 ATGCAAGCGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGCAGTGTAAGTCTG
S. ocellatum MA ............................................................
550 560 570 580 590 600
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 CTGTTAAAGAGTCTGGCTCAACCAGATAAGGGCAGTGGAAACTACACAGCTAGAGTACGT
S. ocellatum MA ........................................................G..G
610 620 630 640 650 660
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 TCGGGGCAGAGGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAAGAACACCG
S. ocellatum MA .A..........................................................
670 680 690 700 710 720
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 GTGGCGAAAGCGCTCTGCTAGGCCGTAACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGA
S. ocellatum MA ............................................................
730 740 750 760 770 780
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 ATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTTGCTTGTA
S. ocellatum MA ............................................................
790 800 810 820 830 840
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 TCGACCCGAGCAGTACCGTAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCA
S. ocellatum MA ........................................................G...
850 860 870 880 890 900
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 AGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAAT
S. ocellatum MA .C..........................................................
910 920 930 940 950 960
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 TCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATGTCGCGAATCTCAGGGAAACTTG
S. ocellatum MA ...............................................C..A.........
970 980 990 1000 1010 1020
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 AGAGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA
S. ocellatum MA ............................................................
1030 1040 1050 1060 1070 1080
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCATCATTAAGTT
S. ocellatum MA ............................................................
1090 1100 1110 1120 1130 1140
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 GGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCA
S. ocellatum MA ............................................................
1150 1160 1170 1180 1190 1200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 GCATGCCCCTTACGTCCTGGGCTACACACGTACTACAATGCTACGGACAGAGGGCAGCGA
S. ocellatum MA ..........................................C.................
1210 1220 1230 1240 1250 1260
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 GCTAGCGATGGCAAGCTAATCCCGTAAACCGTAGCTCAGTTCAGATCGCAGGCTGCAACT
S. ocellatum MA ......A.AT......A.......A......G............................
1270 1280 1290 1300 1310 1320
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S. ocellatum SAG 48.90 CGCCTGCGTGAAGGTGGAATCGCTAGTAATTGCAGGTCAGCATACTGCAGTGAATTCGTT
S. ocellatum MA .............T..................................G...........
1330 1340 1350
....|....|....|....|....|....|....|....
S. ocellatum SAG 48.90 CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCA-------
S. ocellatum MA ................................-------
ANEXO 4. Seqüência parcial do rRNA 16S composta pelos quatro nucleotídeos Adenina (A), Citosina (C),
Guanina (G) e Timina (T), identificando os nucleotídeos que diferem entre a amostra seqüenciada no presente
trabalho (Hapalosiphon sp. mata atlântica) e a retirada do GenBank de H. welwitschii - AY034793.
10 20 30 40 50 60
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii ---------------AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGTATGCTTAAC
Hapalosiphon sp. CGCGGGAATTCGATT.............................................
70 80 90 100 110 120
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii ACATGCAAGTCGAACGGTCTCTTCGGAGATAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGAA
Hapalosiphon sp. .................A.C......G.T...............................
130 140 150 160 170 180
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii TCTGGCTCTAGGTCTGGGACAACCACTGGAAACGGTGGCTAATACCGGATGTGCCTATGG
Hapalosiphon sp. .......................................................C....
190 200 210 220 230 240
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii GTGAAAGGTTAACTGCCTGGAGATGAGCTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGTGTAAGA
Hapalosiphon sp. ...........................................................G
250 260 270 280 290 300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii GACTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGA
Hapalosiphon sp. ............................................................
310 320 330 340 350 360
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGC
Hapalosiphon sp. ............................................................
370 380 390 400 410 420
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii CTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCAA
Hapalosiphon sp. ...........................................................C
430 440 450 460 470 480
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii GGAAGAATGATGACGGTACTTGAGGAATCAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG
Hapalosiphon sp. ...................C........................................
490 500 510 520 530 540
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii GTAATACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGCGTCCGTAGGTGGC
Hapalosiphon sp. ............................................................
550 560 570 580 590 600
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii TGTGTGTGTCTATTGTTAAAGAGTTTGGCTCAACCAAATAAGGGCGGTAGAAACTACACA
Hapalosiphon sp. ............................................................
610 620 630 640 650 660
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii GCTAGAGTGCGTTCGGGGCAGAGGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCA
Hapalosiphon sp. ............................................................
670 680 690 700 710 720
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii GGAAGAACACCGGTGGCGAAAGCGCTCTGCTAGGCCGCAACTGACACTGAGGGACGAAAG
Hapalosiphon sp. ............................................................
730 740 750 760 770 780
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii CTAGGGGAGCGAATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAG
Hapalosiphon sp. ............................................................
790 800 810 820 830 840
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii GCGTTGAGAGTATCGACCCTCTCAGTGCCGTAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGG
Hapalosiphon sp. ......CTT...................................................
850 860 870 880 890 900
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii AGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGT
Hapalosiphon sp. ........G....C..............................................
910 920 930 940 950 960
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii ATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATGTCTGGAATCT
Hapalosiphon sp. ............................................................
970 980 990 1000 1010 1020
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii CTGGGAAACTAGAGAGTGCCTTCGGGAGCCAGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAG
Hapalosiphon sp. T...........................................................
1030 1040 1050 1060 1070 1080
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii CTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTACTTAGTTGC
Hapalosiphon sp. ............................................................
1090 1100 1110 1120 1130 1140
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii CAGCATTTAGGATGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGA
Hapalosiphon sp. ............................................................
1150 1160 1170 1180 1190 1200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii TGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCCTGGGCTACACACGTACTACAATGCTACGGA
Hapalosiphon sp. ............................................................
1210 1220 1230 1240 1250 1260
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii CAAAGGGCAGCGAGACTGCGAAGTTAAGCAAATCTCAGAAACCGTGGCTCAGTTCAGATC
Hapalosiphon sp. ............................................................
1270 1280 1290 1300 1310 1320
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii GCAGGCTGCAACTCGCCTGCGTGAAGGAGGAATCGCTAGTAATTGCAGGTCAGCATACTG
Hapalosiphon sp. ............................................................
1330 1340 1350 1360 1370 1380
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii CAGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGCTGGTCACG
Hapalosiphon sp. ..........C.................................................
1390 1400 1410 1420 1430 1440
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii CCCGAAGTCGTTACCCTAACTGTTCGCAGAGGGGGATGCCGAAGGTAGGACTGGTGACTG
Hapalosiphon sp. ..........--------------------------------------------------
1450 1460 1470 1480 1490
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
H.welwitschii GGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTT
Hapalosiphon sp. -------------------------------------------------------
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