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Universidade de Brasília – UnB
Instituto de Ciências Biológicas – IB
Programa de pós-graduação em Biologia Animal
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E DESENVOLVIMENTO
DE MARCADORES ESPECÍFICOS PARA A DETECÇÃO DE
BIÓTIPOS DE MOSCA BRANCA Bemisia tabaci
Paulo Roberto Queiroz da Silva
Brasília
2006
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Livros Grátis
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Universidade de Brasília – UnB
Instituto de Ciências Biológicas – IB
Programa de pós-graduação em Biologia Animal
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E DESENVOLVIMENTO
DE MARCADORES ESPECÍFICOS PARA A DETECÇÃO DE
BIÓTIPOS DE MOSCA BRANCA Bemisia tabaci
Paulo Roberto Queiroz da Silva
Tese apresentada ao programa de Biologia
Animal do Instituto de Ciências Biológicas (IB)
da Universidade de Brasília (UnB) como requisito
para a obtenção do grau de Doutor em Biologia
Animal.
Brasília – DF
Abril de 2006
ii
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iii
Trabalho realizado no Laboratório de
Biologia Molecular, do Núcleo Temático de
Segurança Biológica (NTSB) da Embrapa –
Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília -
DF.
Orientadora:
Dra. Maria de Nazaré Klautau Guimarães Grisólia.
Co-orientadora:
Dra. Luzia Helena Corrêa Lima.
iv
Dedicatória
À minha mãe,
por me mostrar que mesmo diante da tormenta,
é possível vislumbrar a beleza do sol que vem em
seguida.
Por me mostrar que a verdadeira prova de amor
é se doar, diariamente, sem pedir nada em troca.
Por ser aquela que oferece o ombro amigo e que
tem sempre uma palavra encorajadora.
Por me mostrar que ser homem é ser capaz de
assumir, com coragem, as responsabilidades que a
vida nos impõe.
Dedico e te amo muito.
v
Oferecimento
À minha orientadora, mentora, amiga e,
sobretudo, mãe...
...Luzia Helena Corrêa Lima.
Por sempre ter estado ao meu lado ao longo de
toda a minha formação acadêmica e ser influência
decisiva naquilo que eu acredito que seja um
profissional de verdade.
De nada adianta a habilidade e a técnica se a
humanidade é deixada de lado.
Pelo verdadeiro exemplo de ser humano e pela
interminável “paciência” de suportar o meu gênio. Só
as mães fazem isso...
Ofereço de coração e espírito.
vi
Agradecimentos
À Deus,
pela mãe que me destes e por ter um espírito de luz chamado Luzia a
iluminar os meus caminhos...
...pela possibilidade de ser um amante da Biologia e pelos ensinamentos
diários.
...Te agradeço e Te dedico.
À minha orientadora Nazaré,
Pela empolgação na realização dos trabalhos, pela liberdade e confiança em
acreditar no meu esforço de estar fazendo sempre o melhor. Por permitir que meu
sonho se torne realidade...
À Zulmira,
Pela dedicação e pelo carinho em me acompanhar ao longo dessa jornada.
Por mostrar qual era o caminho certo a ser seguido...
Aos amigos...
...não irei citá-los pois, se esquecer um, estarei cometendo uma grande
injustiça. Sem vocês a viagem seria sem brilho e alegria.
O maior tesouro que um homem pode ter não são os títulos que ele
acumula ao longo da vida e, sim, os amigos que possui para compartilhar o pão e
a vitória.
Aos inimigos e invejosos...
...esses eu nem cito, mas agradeço pois, a pedra que é jogada, a palavra
vociferada e a citação jocosa, só me fizeram mostrar que estava no caminho certo...
...só se atira pedra nas árvores que dão bons frutos!!!
vii
Agradecimentos Especiais
Aos meus tios, padrinhos e pais, Afro Moura Negrão e Maria Aparecida
Queiroz Negrão...
...dizer que amo vocês é muito pouco diante de tanto carinho e ajuda ao
longo da vida. Agradeço por mim e pela minha mãe.
Às irmãs Rita, Fernanda e Cláudia, pelas brigas, broncas, amizade,
admiração, orientação espiritual e amor.
Ao meu irmão caçula e afilhado, Marco Antônio, pelo convívio, amizade e
companheirismo, sentimentos que são dignos apenas das pessoas puras de
coração.
À minha paixão, Beatriz.
...”Sobrinha que aprende rápido os ensinamentos do tio”.
Ao Monteiro e família, pela torcida, alegria, apoio e confiança que tudo, no
final, dá certo.
Às minhas paixões, Alonso e Edna, por toda a torcida e pela profunda
admiração e carinho que tenho por vocês. Simplesmente, adoro...
Aos meus cunhados, Sérgio, Marlon e Kênia, Gierck e Shirley, Marlos e “... “
pelos bons momentos e risadas.
À Universidade de Brasília – UnB, caso desavergonhado de amor, paixão
nada escondida e namoro desde a barriga da mãe...
À Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia pela minha formação
profissional e maturidade científica...
Ao UniCEUB, pelo exercício da profissão e confiança no meu potencial.
viii
Nada disso seria possível sem alguém muito especial...
À Érica,
Pelo companheirismo, cumplicidade, dedicação, segurança e carinho...
Pela admiração em ver a sua determinação de conseguir o que quer...
Pelas dores e sofrimentos compartilhados (masoquista!!!!)...
Pela alegria e confiança de que tudo será sempre melhor...
Só posso dizer...
Te amo muito.
ix
Homenagem
(in memorium)
Ao meu tio Paulo Queiroz, exemplo de filho, marido, pai e
homem e cujas lições de coragem, fé inabalável, persistência e
luta perante a enfermidade, servirão como uma lição de que a
vida e o amor são os maiores legados deixados por Deus.
x
Carinho Muito Especial
Aos amigos da Seção de Registros Funcionais do
Departamento de Polícia Federal
A todos vocês que me acompanharam e, muitas vezes, me
ajudaram nas tarefas escolares e nos trabalhos da faculdade,
serei eternamente grato, pois aprendi muito a respeito do
carinho e do fazer sem nada querer em troca.
Dizer muito obrigado ainda é pouco, diante das verdadeiras
lições que vocês me deram. Vocês são os meus maiores
mestres.
Obrigado de coração.
xi
Abreviaturas
A Adenina
Amp
r
Resistência ao antibiótico ampicilina
C Citosina
DNA Ácido desoxirribonucleico
dH
2
O Água destilada
dNTP Desoxirribonucleotídeo
DMSO Dimetilsulfóxido
EDTA Ácido etilenodiamino tetracético
g grama
g.L
-1
grama por litro
G Guanina
h hora
HCl Ácido clorídrico
IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo
kb quilobase (10
3
pb)
kDa quiloDalton (10
3
Da)
KCl Cloreto de potássio
L litro
min minuto
mg miligrama (10
-3
g)
mL mililitro (10
-3
L)
mM milimolar
M molar (mol L
-1
)
Mb Megabases (10
6
pb)
MgCl
2
Cloreto de magnésio
μg micrograma (10
-6
g)
μg.mL
-1
micrograma por mililitro
μg.μL
-1
micrograma por microlitro
μL microlitro (10
-6
L)
μM micromolar (10
-6
M)
ng nanograma (10
– 9
g)
nm nanômetro (10
-9
m)
xii
nmol nanomol (10
-9
mol)
ng.μL
-1
nanograma por microlitro
NaCl Cloreto de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
pb pares de base
pg picograma (10
-12
g)
pH potencial de hidrogênio
RNA Ácido ribonucleico
RNAseA Ribonuclease A
rpm rotação por minuto
s segundo
T Timina
TE Tris-EDTA
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
Tween 20 Polioxietileno sorbitan monolaurato 20
U Uracila
U.μL
-1
Unidade por microlitro
xg unidade gravitacional
X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D- galactopiranosídeo
°C Grau Celsius
% (p/v) Porcentagem (peso/volume)
% (v/v) Porcentagem (volume/volume)
xiii
RESUMO
A mosca-branca (Bemisia tabaci) tem assumido um papel de destaque na
agricultura mundial por ser uma praga de importância econômica em função das
infestações causadas pelo biótipo B de B. tabaci e que já se encontra distribuído em todos
os continentes. O conhecimento da diferenciação genética de B. tabaci permitirá o
desenvolvimento de estratégias para o controle da mosca-branca no Brasil. O presente
estudo teve como objetivo caracterizar e analisar a variabilidade genética da mosca-branca
B. tabaci, por meio de marcadores moleculares baseados em DNA. Os dados de
caracterização molecular por RAPD, revelaram a extrema complexidade da espécie
sugerindo uma possível separação das populações em função da planta hospedeira.
Posteriormente, os dados de variância molecular revelaram que, a maior fonte de
variabilidade era originária de diferenças entre as populações, do que em relação a
variações dentro das populações do biótipo B desse inseto. Observou-se, ainda, que o
biótipo BR, nativo do Brasil, apresentou baixa similaridade genética em relação ao biótipo
B, que foi introduzido no país. Sendo assim, fragmentos de RAPD de ocorrência
persistente nas populações estudadas dos biótipos B e BR, foram clonados e seqüenciados,
seguindo-se o desenvolvimento de dois conjuntos de primers, para a detecção do biótipo B
e um para a detecção do biótipo BR. Esses marcadores denominados SCAR (Seqüências
Caracterizadas de Regiões Amplificadas) mostraram-se sensíveis para a detecção dos
biótipos em questão, sendo capazes de discriminá-los em testes utilizando amostras de
DNA provenientes de diferentes insetos. Os resultados obtidos permitem propor um
modelo para a dispersão do biótipo B em campo. Possivelmente, as fêmeas de B. tabaci
biótipo B adotam um sistema multifatorial (detecção de predadores, interferência por
machos de outros biótipos, disponibilidade de recursos e competição entre populações de
um mesmo biótipo) para a seleção das culturas hospedeiras. Independente do fenômeno
ocorrido em relação à cultura hospedeira selecionada pelo biótipo B de B. tabaci, os
marcadores SCAR foram capazes de detectar os dois biótipos de ocorrência no Brasil. O
desenvolvimento de marcadores específicos para cada biótipo de B. tabaci é uma etapa
decisiva para o estabelecimento de estratégias baseadas em DNA para a detecção e a
prevenção da entrada de novos biótipos no Brasil, minimizando os riscos provocados pela
entrada de insetos exóticos no agro-ecossistema brasileiro.
xiv
ABSTRACT
The whitefly Bemisia tabaci has assumed an increasing importance because it is
one of the most harmful pests of plant production. An increasing number of plant diseases
were related to the B biotype of B. tabaci. This biotype is the most widespread pest of
economically important plant crops. The understanding of the genetic differentiation of B.
tabaci allows the development of methods to control this pest in many countries, including
Brazil. The objective of this study was the characterization and analysis of the genetic
variability of the B. tabaci using DNA based molecular markers. The molecular
characterization by RAPD revealed the extreme complexity of this species suggesting
possible population segregation by host culture. The molecular variance analysis
(AMOVA) revealed that the highest genetic variability were more due to variations among
the populations analyzed than genetic variation in the populations of the B biotype of B.
tabaci. The native B. tabaci biotype (called BR) showed low genetic similarity to the
introduced B. tabaci B biotype. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) fragments
occurring persistently in all B and BR populations studied were cloned, sequenced, and
used to design two sets of SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) primers to
detect the B biotype and one to detect the BR biotype. These SCAR markers were very
sensitive to discriminate the two biotypes analyzed in this study. The specific biotype
detection occurred in several conditions, including tests using DNA extracted from
different insect sources. These molecular results could be used in a proposition of a model
trying to explain the dispersion of B. tabaci in the field. Possibly, the B. tabaci B biotype
females could adopt a multifactorial system to select its host crops. This system could be
formed by factors like detection of predators of its offspring, interference by males from
different biotypes, availability of plant resources, and competition among populations of
the same biotype. Independently of which factors were interfering or influencing on B.
tabaci to take a decision about host plant, the SCAR markers developed in this study were
able to detect the most common B. tabaci biotypes occurring in Brazil. The development of
specific molecular markers to each B. tabaci biotypes is a very important step to the
establishment of DNA based strategies to detect and prevent the incoming of new biotypes
of whiteflies in Brazil, reducing the risks produced by the introduction of exotic insects in
the Brazilian agricultural system.
xv
Índice
Dedicatória ..................................................................................................................................v
Oferecimento..............................................................................................................................vi
Agradecimentos.........................................................................................................................vii
Agradecimentos especiais.........................................................................................................viii
Abreviaturas...............................................................................................................................xii
Resumo...........................................................................................…………………………..xiv
Abstract......................................................................................................................................xv
Índice de figuras.....................................................................................................................xviii
Índice de tabelas......................................................................................................................xxii
INTRODUÇÃO GERAL
Características biológicas, variabilidade genética e impacto econômico causados pela mosca
branca Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).......................................................................1
Resumo........................................................................................................................................1
Introdução....................................................................................................................................2
Objetivo Geral ...........................................................................................................................14
Hipótese.....................................................................................................................................14
Referências Bibliográficas.........................................................................................................15
CAPÍTULO 1
Identificação molecular e análise da variabilidade genética da mosca branca Bemisia tabaci
(Hemiptera: Aleyrodidae)..........................................................................................................26
Resumo......................................................................................................................................26
Introdução..................................................................................................................................27
Objetivos....................................................................................................................................34
Metodologia...............................................................................................................................35
Resultados e Discussão..............................................................................................................45
Referências Bibliográficas.........................................................................................................95
xvi
CAPÍTULO 2
Desenvolvimento de Marcadores SCAR para a Identificação de Biótipos de Bemisia tabaci
(Hemiptera: Aleyrodidae)........................................................................................................101
Resumo....................................................................................................................................101
Introdução................................................................................................................................102
Objetivos..................................................................................................................................108
Metodologia.............................................................................................................................108
Resultados e Discussão............................................................................................................119
Referências Bibliográficas.......................................................................................................147
Conclusão Geral ......................................................................................................................151
xvii
Índice de figuras
Figura 1 – Identificação de populações de mosca branca coletadas em culturas de várias
localidades por meio de perfis de fragmentos de DNA obtidos com o primer OPA-13...........46
Figura 2 – Padrões de bandas obtidos de amplificação com o primer OPA-10 dos biótipos de
mosca branca..............................................................................................................................49
Figura 3 – Distribuição das populações de B. tabaci nas diversas unidades da federação........50
Figura 4 – Comparação de perfis de fragmentos de DNA de mosca branca obtidos a partir de
amplificações com os primers OPA-04 e OPA-11....................................................................53
Figura 5 – Análise de agrupamento de populações de aleirodídeos coletadas em culturas de
mandioca do Brasil e do Paraguai..............................................................................................54
Figura 6 - Análise dos fragmentos de DNA obtidos com o primer OPA-13.............................60
Figura 7 - Análise de agrupamento das populações de B. tabaci coletadas em diferentes
culturas das regiões do Brasil e dos Estados Unidos.................................................................61
Figura 8 - Análise dos fragmentos de DNA obtidos com o primer OPA-02.............................64
Figura 9 - Análise de agrupamento das populações de B. tabaci coletadas em culturas
localizadas em diferentes regiões do Brasil...............................................................................65
Figura 10 – Análise dos fragmentos de DNA, de amostras coletadas em 2000, obtidos de
amplificação com o primer OPA-13..........................................................................................69
Figura 11 – Análise dos fragmentos de DNA, de amostras coletadas em 2001, obtidos de
amplificação com o primer OPA-13..........................................................................................69
Figura 12 - Análise dos fragmentos de DNA de mosca branca, obtidos de amplificação com o
primer OPA-15 a partir de populações coletadas no ano de 2000, em tomate e em
berinjela......................................................................................................................................70
Figura 13 - Análise dos fragmentos de DNA de mosca branca, obtidos de amplificação com o
primer OPA-15 em populações coletadas em campo no ano de 2001, tanto em tomate quanto
em berinjela................................................................................................................................70
Figura 14 – Análise das populações de B. tabaci coletadas no ano de 2000 em culturas
mantidas tanto em casa de vegetação quanto em campo...........................................................71
Figura 15 – Análise das populações de Bemisia coletadas no ano de 2001 em culturas
mantidas tanto em casa de vegetação quanto em campo...........................................................73
Figura 16 – Análise das populações de Bemisia coletadas em culturas originárias de várias
localidades do Brasil ao longo do ano de 1999..........................................................................75
xviii
Figura 17 - Análise dos fragmentos de DNA dos vários biótipos de B. tabaci obtidos de
amplificação com o primer OPA-10..........................................................................................78
Figura 18 – Análise de populações dos vários biótipos de B. tabaci presentes no Brasil e em
outros países...............................................................................................................................80
Figura 19 - Análise dos fragmentos de DNA de várias populações de aleirodídeos, obtidos de
amplificação com os primers OPA-03, OPA-04 e OPA-10......................................................83
Figura 20 - Análise das populações de aleirodídeos coletadas em diferentes
culturas.......................................................................................................................................85
Figura 21 – Perfis de marcadores moleculares gerados pela técnica de RAPD utilizando-se os
primers OPA-04 e OPA-13........................................................................................................87
Figura 22 – Determinação do grau de similaridade entre várias populações de insetos
pertencentes a diferentes famílias taxonômicas.........................................................................89
Figura 23 – Fragmentos de RAPD produzidos a partir do DNA extraído dos biótipos de
B. tabaci...................................................................................................................................120
Figura 24 – Digestões de plasmídios resultantes da clonagem de vários fragmentos de RAPD a
partir dos biótipos B e BR de B. tabaci...................................................................................121
Figura 25 – Composição de nucleotídios do fragmento de 831 pb obtido do biótipo B de B.
tabaci com o primer OPA-10...................................................................................................122
Figura 26 – Perfil de sítios de restrição distribuídos ao longo da seqüência de 831 pb originada
a partir da amplificação do DNA de B. tabaci biótipo B com o uso do primer OPA-10 de
RAPD.......................................................................................................................................123
Figura 27 – Composição de nucleotídios do fragmento de 582 pb obtido do biótipo B de B.
tabaci com o primer OPA-13...................................................................................................124
Figura 28 – Perfil de sítios de restrição distribuídos ao longo da seqüência de 582 pb originada
a partir da amplificação do DNA de B. tabaci biótipo B com o uso do primer OPA-13 de
RAPD.......................................................................................................................................125
Figura 29 – Composição de nucleotídios do fragmento de 793 pb obtido do biótipo BR de B.
tabaci com o primer OPA-15...................................................................................................126
Figura 30 – Perfil de sítios de restrição distribuídos ao longo da seqüência de 794 pb originada
a partir da amplificação do DNA de B. tabaci biótipo BR com o uso do primer OPA-15 de
RAPD.......................................................................................................................................127
Figura 31 – Reações de SCAR utilizando-se o primer BT-B1 para a detecção do biótipo B de
B.tabaci....................................................................................................................................129
xix
Figura 32 – Reações de SCAR utilizando-se o primer BT-B1 para a detecção do biótipo B de
B. tabaci entre várias amostras de insetos de diferentes famílias ou
gêneros.....................................................................................................................................130
Figura 33 – Uso do primer BT-B1 para a detecção do biótipo B quando comparado com outros
biótipos de B. tabaci................................................................................................................131
Figura 34 – Reações de SCAR com o primer BT-B3..............................................................132
Figura 35 – Teste do primer BT-B3 para a detecção do biótipo B quando comparado com
outros biótipos de B. tabaci.....................................................................................................132
Figura 36 – Reações de SCAR com o primer BT-BR1...........................................................134
Figura 37 – Teste do primer BT-BR1 para a detecção do biótipo BR quando comparado com
outros biótipos de B. tabaci.....................................................................................................135
Figura 38 – Perfis de marcadores RAPD obtidos com o primer OPA-13 a partir de amostras de
diferentes espécies de insetos...................................................................................................136
Figura 39 – Teste de eficiência dos primers BT-B1 e BT-B3 para a detecção do biótipo B de
B. tabaci a partir de vestígios do inseto como também quando comparados com machos e
fêmeas......................................................................................................................................137
Figura 40 – Teste de determinação das quantidades máximas de contaminação em uma
amostra de DNA do biótipo B de B. tabaci ainda viável para a identificação molecular com os
primers de SCAR BT-B1 e BT-B3..........................................................................................138
Figura 41 – Teste de determinação das quantidades máximas de contaminação em uma
amostra de DNA do biótipo BR de B. tabaci ainda viável para a identificação molecular com o
primer de SCAR BT-BR1........................................................................................................139
Figura 42 – Detecção do biótipo B de B. tabaci sob diferentes condições de
monitoramento.........................................................................................................................140
Figura 43 – Identificação do biótipo B de B. tabaci em rotina de laboratório empregando-se o
kit diagnóstico BT-B1 a partir de amostras coletadas em localidades do estado do
Maranhão.................................................................................................................................141
Figura 44 – Perfil de marcadores RAPD obtidos com o primer OPA-10 a partir de amostras
coletadas em localidades do Maranhão....................................................................................142
Figura 45 – Identificação do biótipo B de B. tabaci em rotina de laboratório empregando-se o
kit diagnóstico BT-B3 a partir de amostras coletadas em localidades do estado do
Maranhão.................................................................................................................................143
Figura 46 – Perfil de marcadores RAPD obtidos com o primer OPA-13 a partir de amostras
coletadas em localidades do Maranhão....................................................................................144
xx
Figura 47 – Modelo descritivo para a dispersão e a instalação de populações de B. tabaci
biótipo B em diferentes culturas distribuídas em várias áreas geográficas.............................152
Figura 48 – Fluxograma para a tomada de decisões quanto à utilização dos primers de SCAR e
para a detecção e a identificação de biótipos de B. tabaci......................................................154
xxi
Índice de tabelas
Tabela 1 – Primers de RAPD utilizados na determinação dos perfis eletroforéticos das
diversas populações de insetos submetidas à análise molecular................................................37
Tabela 2 – Populações de mosca branca ocorrendo em culturas de mandioca no Brasil e
Paraguai, utilizadas nos estudos de identificação e caracterização moleculares.......................39
Tabela 3 – Populações de B. tabaci coletadas em várias regiões do Brasil e utilizadas nos
estudos de variabilidade genética...............................................................................................40
Tabela 4 – Populações de B. tabaci coletadas no Distrito Federal nos anos de 2000 e 2001 e
em outras regiões do Brasil no ano de 1999..............................................................................
41
Tabela 5 – Biótipos de Bemisia tabaci usados nos estudos de determinação de perfis de
marcadores moleculares de RAPD............................................................................................42
Tabela 6 – Populações de aleirodídeos utilizados nas determinações dos perfis de marcadores
de RAPD para a identificação molecular..................................................................................43
Tabela 7 – Populações de insetos utilizadas nas determinações dos perfis de marcadores de
RAPD........................................................................................................................................44
Tabela 8 – Identificação molecular das amostras recebidas no ano de 2000.............................47
Tabela 9 – Identificação molecular das amostras recebidas no ano de 2001.............................48
Tabela 10 – Identificação por meio de três primers de RAPD de populações de mosca branca
coletadas em culturas de mandioca, provenientes do Brasil e do Paraguai, a serem utilizadas
nos estudos de caracterização molecular...................................................................................52
Tabela 11 – Populações de B. tabaci coletadas em culturas de várias regiões do Brasil usadas
nos estudos de variabilidade genética..
......................................................................................59
Tabela 12 – Análise de variância molecular (AMOVA) entre as populações coletadas em
várias culturas e entre os indivíduos de uma mesma população.
...............................................62
Tabela 13 – Populações de B. tabaci usadas nos estudos complementares de variabilidade
genética coletadas em várias regiões do Brasil..........................................................................63
Tabela 14 – Populações de Bemisia coletadas no Distrito Federal nos anos de 2000 e 2001 e
no Brasil no ano de 1999...........................................................................................................68
Tabela 15 – Fragmentos de DNA obtidos pelo emprego de vários primers de RAPD
candidatos ao desenvolvimento de marcadores moleculares específicos (SCAR) para a
identificação dos biótipos B e BR de B. tabaci.
........................................................................94
xxii
Tabela 16 – Biótipos de B. tabaci utilizados nos experimentos de desenvolvimento de
marcadores moleculares do tipo SCAR...................................................................................108
Tabela 17 – Primers de RAPD utilizados na obtenção dos perfis de bandeamento entre os
biótipos de B. tabaci................................................................................................................110
Tabela 18 – Insetos utilizados na análise da especificidade dos primers de SCAR para B.
tabaci.......................................................................................................................................114
Tabela 19 – Indivíduos de B. tabaci utilizados na detecção dos marcadores SCAR em partes
do inseto ou em função do gênero...........................................................................................117
Tabela 20 – Amostras utilizadas em rotina de detecção do biótipo B de B. tabaci utilizando-se
os primers de SCAR................................................................................................................
118
Tabela 21 – Seqüência de primers para reações de PCR específicas para os biótipos de B.
tabaci........................................................................................................................................129
xxiii
INTRODUÇÃO GERAL
Características biológicas, variabilidade genética
e impacto econômico causado pela
mosca branca Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae)
O estudo em geral, a busca da verdade e da
beleza são domínios em que nos é consentido ficar
crianças toda a vida.
Albert Einstein (1879-1955).
RESUMO
A mosca branca (Bemisia tabaci) foi descrita pela primeira vez, em 1889, por
Gennadius. A partir de então, passaram a constar da lista de insetos de grande importância
agro-econômica, sendo que estas estão entre as pragas mais prejudiciais da agricultura
contemporânea. Os danos são causados pelos adultos e ninfas tanto diretamente, atuando
como pragas, provocando debilidades e desordens fitotóxicas às plantas quanto
indiretamente, atuando como vetores de fitoviroses, destacando-se o grupo dos
geminivírus. A importância agrícola de B. tabaci vem do fato de que esta espécie é
atualmente uma das pragas de maior expressão econômica para a agricultura mundial e
muitas das epidemias relatadas têm sido identificadas como causadas pelo biótipo B, que já
se encontra em todos os continentes. Sua capacidade para colonizar 600 espécies
pertencentes a 74 famílias botânicas diferentes e de ser o vetor de mais de 60 diferentes
fitovírus é motivo de preocupação para todas as regiões agrícolas do mundo. Além da
importância dos estudos das características biológicas e genéticas soma-se, ainda, o
impacto econômico ocasionado pelos biótipos de B. tabaci. Cada biótipo apresenta
variações no grau de danos que provocam nas culturas hospedeiras. Atualmente, o biótipo
B de B. tabaci tem sido relacionado com os maiores prejuízos agrícolas. Estima-se que nas
últimas três décadas as perdas e os custos de controle provocados pelo inseto foram da
ordem de bilhões de dólares. Características comuns encontradas em praticamente todas as
regiões nas quais houve um ataque intensivo de populações desta espécie foram práticas
1
agrícolas intensivas com sobreposição de estações de cultivo, clima árido e quente,
associado a uma espécie com grande potencial biótico de adaptação a inúmeros ambientes,
plantas hospedeiras adequadas e uso de agrotóxicos. Recentemente, a tecnologia molecular
forneceu instrumentos valiosos para a investigação de marcadores moleculares presentes
nas populações naturais, dando o esclarecimento necessário sobre o comportamento e a
dinâmica das populações, no seu contexto ecológico. Assim, o conhecimento da
diferenciação genética da B. tabaci no Brasil, envolvendo populações de diferentes plantas
hospedeiras, de diferentes regiões geográficas e possivelmente ocorrência de variações
genéticas dentro de populações, terão implicações importantes para as estratégias de
controle da mosca branca no Brasil.
INTRODUÇÃO
A mosca branca da batata doce (Bemisia tabaci) também conhecida como a mosca
branca do algodão, da mandioca e do fumo foi descrita pela primeira vez por Gennadius,
na Grécia em 1889, como Aleyrodes tabaci. A introdução e o estabelecimento dessa praga
nos continentes americano, asiático, africano e ilhas do Oceano Pacífico nos 50 anos
subseqüentes ao seu primeiro relato, levaram a uma confusão taxonômica, resultando em
23 sinonímias para a espécie. Desde a sua primeira descrição, a mosca branca recebeu
inúmeras designações sendo que, Takashi (1936) e Russell (1957) reagruparam essas
sinonímias dentro da espécie B. tabaci de acordo com as descrições morfológicas citadas
para essa espécie (Perring, 2001). Posteriormente, Mound e Halsey (1978) sumarizaram
essas informações a partir das sinonímias, ano de detecção, região geográfica e plantas
hospedeiras associadas.
A grande variação morfológica associada à adaptação da arquitetura da planta e
condições climáticas contribuiu para o grau de variação externa das ninfas da mosca
branca sendo que atualmente, a identificação das espécies de mosca branca se faz por meio
das ninfas de quarto ínstar.
A partir de então, desde o seu primeiro relato por Gennadius, as moscas brancas do
gênero Bemisia passaram a constar da lista de insetos de grande importância agro-
econômica, sendo que estas estão entre as pragas mais prejudiciais da agricultura
contemporânea. As moscas brancas do gênero Bemisia são consideradas insetos tropicais e
semitropicais e, além da reprodução capaz de gerar machos e fêmeas, apresentam
2
partenogênese arrenótoca, gerando apenas machos do tipo XO (Byrne & Bellows, 1991).
Tanto o adulto quanto a ninfa possuem aparelho bucal do tipo picador-sugador. As
mandíbulas e maxilas formam um tubo duplo (probóscide) que é usado para succionar a
seiva dos canais do floema da planta atacada (Villas Bôas et al., 1997).
Os danos são causados pelos adultos e ninfas tanto diretamente, atuando como
pragas, provocando debilidades e desordens fitotóxicas às plantas quanto indiretamente,
atuando como vetores de fitoviroses, destacando-se o grupo dos geminivírus (Oliveira et
al., 1997). Com relação à transmissão de vírus por mosca branca, no início dos anos 50
foram registradas várias correlações entre a presença de B. tabaci e sintomas de doenças
caracterizadas por malformação foliar, enrolamento de folhas, nanismo e mosaico amarelo
em diferentes plantas cultivadas e selvagens nas Américas e na região do Caribe (Brown e
Bird, 1992). Muitas destas doenças foram posteriormente identificadas como sendo
causadas por geminivírus (Brown e Bird, 1992).
No início dos anos 90, vírus transmitidos por moscas brancas já eram considerados
um problema na produção de legumes. Desde então, altas incidências de geminivírus em
áreas produtoras de tomate na Flórida, Caribe, México, América Central, Venezuela e
Brasil têm sido registradas (Polston e Anderson, 1997).
Atualmente, a América Latina é a região mais afetada pelo complexo populacional
Bemisia tabaci-geminivirus, tanto pelo número de culturas afetadas quanto pelas perdas na
produção e área agrícola devastada. A infecção por geminivírus dentro do agrossistema
ocorre de forma dinâmica. As interações são complexas e envolvem vários fatores tais
como os geminivírus, os sistemas de produção, o ambiente e os biótipos do vetor. Por esta
razão, a identificação dos vírus deve ser um processo permanente, visto que as novas
pragas vão requerer contínua mudança nas estratégias de controle (Zuniga e Ramirez,
2002). A família geminiviridae possui diversas espécies-tipo de vírus infectando
importantes espécies de monocotiledôneas e dicotiledôneas causando perdas significativas
para a agricultura. As espécies são transmitidas pela mosca branca B. tabaci de forma
persistente, circulativa e infectam plantas dicotiledôneas. Epidemias de populações de
B. tabaci são freqüentemente acompanhadas por alta incidência do gênero Begomovírus.
Durante as duas últimas décadas, a disseminação global do biótipo B de B. tabaci vem
sendo acompanhada pela ocorrência de geminivírus transmitidos por essa mosca branca.
Medidas de controle para conter a disseminação de geminivírus em regiões afetadas
são baseadas principalmente na limitação das populações do vetor, usando barreiras
químicas ou físicas. Entretanto, sob condições de ataque severo de mosca branca, nenhuma
3
destas medidas têm sido eficientes para prevenir a disseminação dessas viroses. A forma
mais eficiente para reduzir as perdas causadas por geminivírus é o uso de variedades
resistentes ou tolerantes obtidas por meio de melhoramento genético clássico ou de
engenharia genética. Os Begomovírus têm sido intensivamente pesquisados devido aos
danos causados às culturas afetadas levando a severo impacto econômico
(Lapidot e Friedmann, 2002).
Dados de revisão de literatura indicam que foram encontrados 183 vírus (ou
isolados) pertencentes ao gênero Begomovírus que podem ser transmitidos por B. tabaci.
Verificou-se também que além da família Geminiviridae, outras duas famílias possuem
gêneros de vírus que podem ser transmitidos por B. tabaci: a Potyviridae (3 Ipomovirus,
2 Potyvirus e 1 poty-like) e a Closteroviridae (3 Crinivirus e 4 Closterovirus). Foram
encontrados ainda 2 Carlavirus (gênero órfão) e 1 vírus o qual não foi possível determinar
a qual família e gênero pertence (Vidal et al., 2000).
A importância agrícola de B. tabaci vem do fato de que esta espécie é atualmente
uma das pragas de maior expressão econômica para a agricultura mundial e muitas das
epidemias relatadas têm sido identificadas como causadas pelo polífago biótipo B, que já
se encontra registrado em todos os continentes. Sua capacidade para colonizar diferentes
espécies de plantas e de ser o vetor de mais de 60 diferentes fitovírus é motivo de
preocupação para todas as regiões agrícolas do mundo (Secker et al., 1998).
Com relação ao comportamento do biótipo B de B. tabaci atuar como praga,
destaca-se o fato de que essa é uma espécie polífaga que se alimenta de, aproximadamente,
600 espécies de plantas pertencentes a 74 famílias botânicas diferentes, tanto
monocotiledôneas quanto dicotiledôneas (Secker et al., 1998). Em virtude desta
característica, B. tabaci vem causando perdas consideráveis em várias culturas de grande
importância sócio-econômica como tomate, abóbora, melão, melancia, pimentão e jiló, e
em plantas ornamentais como poinsétia e crisântemo.
Até o início da década de 1960, os problemas causados por B. tabaci no Brasil eram
de natureza variada, mais como vetor do que como praga direta. A transmissão de vírus,
tais como, vírus da clorose variegada das malváceas, vírus do mosaico do abutilon, vírus
do mosaico anão, vírus do mosaico dourado e vírus do mosaico das euforbiáceas,
ocasionava inúmeros prejuízos. As culturas que mais sofriam perdas devido aos ataques
desses vírus eram o algodão, tomate e feijão (Costa et al., 1973). É provável que mudanças
nas práticas agrícolas estimuladas pela “revolução verde” tenham favorecido o surgimento,
4
no final da década de 1960 e início da década de 1970, de surtos populacionais nos estados
de São Paulo e Paraná em algodoais, tomateiros e feijoeiros (Costa, 1975).
No início da década de 1990, altas populações de B. tabaci foram relatadas por Melo
(1992) na região de Campinas (SP), ocorrendo sobre tomate (Lycopersicon esculentum),
detectando-se inclusive o amadurecimento irregular dos frutos. As características descritas
levaram a suspeita de que o biótipo B de B. tabaci, até então ocorrendo em outros países
das Américas, havia finalmente entrado no país. A introdução inadvertida da praga,
provavelmente ocorreu por meio do trânsito internacional de passageiros ou pelo comércio
internacional de plantas ornamentais ou de partes de plantas (Lima et al., 1992).
Em maio de 1992, em propriedade de 12 ha cultivados em casas de vegetação no
município de Holambra (SP), Lima et al. (1992) avaliaram moscas brancas que causavam
altas infestações sobre Chrysantemum spp. (cultivares “Polaris Branco”, “Rupin”, “Towt
Talk”, “Super White” e “Dark Flamingo”). Estas infestações atingiam todos as fases de
crescimento da planta hospedeira, fato até então não registrado no Brasil. Foi também
constatada a presença de um viróide presente nas folhas das plantas, conforme relatado por
Marinho e Fonseca (1992). Na oportunidade, adultos de B. tabaci foram coletados para
determinação dos padrões eletroforéticos de isoenzimas α e β esterases, na tentativa de
encontrar marcadores moleculares que pudessem auxiliar na identificação do biótipo B
agora presente no país (Lima et al., 1992 e Oliveira e Lima 1997).
Em estudos realizados em 1998, adultos de B. tabaci foram coletados em Limoeiro
do Norte (CE) e nas colônias de criação da mosca branca da Embrapa Recursos Genéticos
e Biotecnologia, em Brasília (DF), onde observou-se que os padrões eletroforéticos eram
idênticos aos da população coletada em crisântemo, proveniente da região de Campinas
(SP), indicando que no período de seis anos o biótipo B havia dispersado para outras
regiões do país (Oliveira et al., 1998 e Lima et al., 2001).
Lourenção e Nagai (1994), por volta de 1992, também observaram este biótipo no
estado de São Paulo em culturas de tomate (L. esculentum), plantas invasoras (Sida
rhombifolia, Ipomoea acuminata, Sonchus oleraceus e Solanum viarum) e plantas
ornamentais (Cucumis spp., Brassica spp., S. melongena e G. hirsutum).
Uma hipótese sugerida para a dispersão do biótipo B de B tabaci para várias regiões
do Brasil pode ter sido, gradualmente, pela distribuição de plantas ornamentais pelo
transporte rodoviário de flores. Em 1996, durante um levantamento realizado pelo
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) e Secretaria de Agricultura
do Estado de São Paulo, constatou-se a presença deste biótipo em cinco estados da
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Federação: São Paulo, Bahia, Pernambuco, Ceará, Paraná e no Distrito Federal. Porém,
desde então, o complexo populacional B. tabaci tem sido encontrado em 23 dos 26 estados
da federação e no Distrito Federal (Lima et al., 2001).
A grande adaptabilidade dos indivíduos de B. tabaci tanto a diferentes temperaturas
quanto a resistência aos pesticidas pode ter sido um dos fatores que têm favorecido a
disseminação dos mesmos em todo o país, principalmente na região nordeste e do semi-
árido, permitindo a ocorrência deste inseto em alta densidade em várias regiões do Brasil
(Oliveira et al., 1998). Esse fenômeno ocorre, por exemplo, na região nordeste, que se
caracteriza por apresentar clima tropical seco com estação úmida curta, alta luminosidade e
calor constante. Essas são condições ideais para o plantio de diferentes tipos de culturas,
permitindo que na região do semi-árido seja encontrada a maior área plantada de
fruticultura do país. Em todas as áreas de cultivo dessa região, um surto populacional
expressivo desse inseto foi detectado em culturas de tomate, melão, melancia, uva,
algodão, entre outras. As perdas chegaram a 100 % na maioria das pequenas propriedades
dos estados do Ceará e do Rio Grande do Norte. As perdas nas culturas de melão e
melancia variaram entre 30 % e 100 %. Em Pernambuco, a situação tornou-se grave nas
culturas de tomate, onde a praga induziu sérias desordens fitotóxicas nas plantas atacadas,
como também, disseminou o geminivírus na região do vale do São Francisco, Bahia e
Paraíba. Na região de Mossoró (RN), o uso excessivo de produtos químicos selecionou
formas resistentes do inseto, provocando o aumento e a dispersão da mosca branca nas
propriedades agrícolas locais. Em algumas dessas propriedades foi observada grande
densidade populacional (em média 15 adultos/folha) da mosca branca.
Uma estratégia a esta situação seria a formação de uma linha de defesa
fitossanitária ao redor do semi-árido, criando um sistema de proteção para evitar a entrada
de novas pragas bem adaptadas àquele tipo de clima ou de prevenir à introdução de outras
pragas ou mesmo de biótipos da mosca-branca, mais agressivas, com uma maior
diversidade de hospedeiros e/ou de difícil controle (Byrne et al., 1990).
Além dos danos causados em culturas de expressão econômica, soma-se o potencial
da mosca branca provocar um grande impacto na cultura de mandioca (Manhiot esculenta
Crantz) estabelecida no Brasil. Esta cultura tem um importante papel sócio-econômico nas
regiões em desenvolvimento, pois 500 milhões de pessoas nos continentes africano,
asiático e americano dependem direta ou indiretamente do cultivo desta planta (Carvalho et
al., 2000). A produção mundial está estimada em 154 milhões de toneladas (Cereda et al.,
1996) sendo que, a América Latina ocupa o 3° lugar com uma produção de 32 milhões de
6
toneladas (Best & Henry, 1994) e o Brasil, o 1° lugar com uma produção de 25 milhões de
toneladas (Cereda et al., 1996). Nas últimas décadas, a mosca-branca (B. tabaci) tem
causado grande impacto sócio-econômico atuando como vetor de fitoviroses, tendo
potencial para transmitir vários tipos de vírus. O aparecimento e o estabelecimento de
populações de mosca branca em áreas produtoras de mandioca têm ocorrido em virtude do
trânsito de manivas de mandioca entre áreas produtoras. Isso tem causado danos na cultura
de mandioca pela transmissão do vírus do mosaico africano da mandioca (ACMV). Este
vírus tem causado no continente africano uma redução de 50 % na produção de mandioca
(Fauquet e Fargette, 1990) com prejuízos superiores a 2 bilhões de dólares (Basu, 1995).
Até o momento, este vírus não foi detectado nas culturas de mandioca brasileiras. Sendo
assim, torna-se imperioso o controle e a prevenção da entrada da mosca branca, uma vez
que, caso este vírus seja introduzido no Brasil, os prejuízos poderão ser elevados.
A identificação e a dispersão de B. tabaci presente em áreas agrícolas foram
relatadas por pesquisadores em outras partes do mundo. Esse mesmo fato correu em países
da Bacia do Mediterrâneo, no final da década de 1970, quando hortícolas e plantas
ornamentais foram atacadas pelo inseto de forma agressiva (Traboulsi, 1994). Outros
surtos populacionais de B. tabaci surgiram no final da década de 1980, causando grande
impacto econômico, por exemplo, na região da Flórida, nos Estados Unidos da América,
sobre a cultura do tomateiro quando desordens fisiológicas como o amadurecimento
irregular dos frutos foi relatado. Um outro sintoma observado foi o do prateamento das
folhas da aboboreira. Além desses fatores, essas populações apresentavam altos níveis de
resistência aos inseticidas e transmitiam viroses desconhecidas (De Barro et al., 2004).
Investigações mais elaboradas foram realizadas utilizando-se padrões de esterase e
dois biótipos foram então descritos, o biótipo A, coletado sobre populações no campo e o
biótipo B, sobre populações da mosca branca em casa de vegetação (Brown, 1995).
Entretanto, mudanças no comportamento das duas populações indicaram uma maior
agressividade do biótipo B sobre o A. O biótipo B, em um período de três anos, além de
dominar as áreas de cultivo, também deslocou o biótipo A para outras regiões dos EUA
(Brown et al., 1992). As primeiras análises das populações de B. tabaci baseadas em
padrões de esterases identificaram mais de 20 biótipos diferentes associados a várias
plantas hospedeiras, danos agrícolas e localizações geográficas (Bedford et al., 1994;
Brown et al., 1995; Brown et al., 2000; Perring, 2001 e De Barro et al., 2004).
Os termos raça ou biótipo apresentam o mesmo nível de distinção e são utilizados
para designar populações com ausência de caracteres morfológicos adequados para
7
identificação, mas que possuem outras características biológicas que permitem a separação
quando comparada a outras populações (Perring, 2001). A existência de biótipos distintos
não é simplesmente uma questão taxonômica e sim uma influência direta da dinâmica das
interações entre praga-vetor-hospedeiro (Maruthi et al., 2001).
A descrição de biótipos de B. tabaci é um tema recorrente na descrição taxonômica
dessa espécie. No final da década de 1950, Bird (1957), relatou a existência de populações
de B. tabaci com preferência a Jatropha e Sida indicando a formação de raças ou biótipos
na espécie, associado a plantas hospedeiras e transmissão de viroses. Trabalhos
subseqüentes de Brown et al. (1995), Markham et al. (1995) e Perring (2001) descrevem a
existência de, pelo menos, 40 biótipos diferentes. Em 2003, Simon et al., descreveram um
novo biótipo (denominado de T) de B. tabaci ocorrendo na Itália atacando Euphorbia
characias. Mais recentemente, Delatte et al. (2005) descreveram um novo biótipo,
denominado de Ms, ocorrendo nas ilhas do sudeste do Ocenao Índico.
Um outro fato que também chamou a atenção da comunidade científica foi em
relação aos comportamentos biológicos diferenciados de B. tabaci a diferentes plantas
hospedeiras. Como exemplo, cita-se a mandioca (Manihot esculenta), espécie endêmica
para o Brasil e que foi introduzida no continente africano. No país, a cultura da mandioca
não é atacada por B. tabaci (Costa e Russell, 1975). Contudo, no continente africano as
perdas ocasionadas pela transmissão de viroses são devastadoras (Fauquet et al., 1998).
Burban et al. (1992), observaram a presença de dois biótipos na Costa do Marfim, um que
coloniza exclusivamente mandioca e outro polífago, mas que não ataca essa cultura. A
espécie, também, ataca mandioca na Índia e Malásia (Basu, 1999).
De acordo com Mound (1983), as espécies quando introduzidas em novas áreas
levam consigo apenas parte de seu material genético viável, podendo ser uma das
explicações plausíveis para o surgimento de biótipos nas populações de B. tabaci. À
medida que populações da mosca-branca foram sendo introduzidas em novas áreas
geográficas ou diferentes locais dentro de um país, novos fatos foram relatados quanto a
comportamentos mais agressivos da espécie. Diferenças entre as populações de B. tabaci
tem sido um assunto polêmico e reconhecido como uma apresentação de vários biótipos
diferentes ou simplesmente uma espécie-complexo (Brown et al., 1995 e Perring, 2001).
A partir de então, amostragens intensivas têm sido realizadas em todo o mundo
sobre populações de B. tabaci, pela expressão econômica que essa espécie representa para
a agricultura mundial. Ela é considerada um dos insetos mais nocivos para os ecossistemas
agrícolas e está na lista das espécies invasoras de maior impacto agro-econômico. Isso
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ocorre em virtude da dificuldade em controlar as suas populações, da transmissão de
viroses, das mudanças biológicas associadas a plantas hospedeiras e das condições
geográficas que levam a formação de biótipos. As investigações científicas indicam que o
trânsito internacional de plantas ornamentais tenha contribuído para a dispersão de
diferentes populações de B. tabaci para o mundo.
Desde então métodos mais específicos, rápidos e seguros associados aos estudos de
cruzamento entre os diferentes biótipos têm sido realizados em vários países buscando-se a
identificação dos biótipos de B. tabaci. Esses métodos relacionam-se ao uso de marcadores
moleculares baseados em DNA. Por exemplo, Gawel e Bartlett (1993), De Barro e Driver
(1997), Guirao et al. (1997) e Lima et al. (1999, 2000 e 2002a) utilizaram os marcadores
RAPD para diferenciar variações genéticas entre populações da mosca-branca e
caracterizar os biótipos da espécie B. tabaci.
Além da importância dos estudos das características biológicas e genéticas soma-se,
ainda, o impacto econômico ocasionado pelos biótipos de B. tabaci. Cada biótipo apresenta
variações no grau de danos que provocam nas culturas hospedeiras. Atualmente, o biótipo
que tem sido relacionado com os maiores prejuízos agrícolas refere-se ao biótipo B de
B. tabaci. O biótipo B de B. tabaci, considerado o mais agressivo do mundo, tornou-se
evidente quando foi introduzido nos Estados Unidos, no início da década de oitenta (Costa
e Brown, 1990 e 1991; Brown et al., 1992 e Perring et al., 1993). Esse biótipo foi
considerado bem diferente do biótipo nativo (denominado de biótipo A), sendo descrito
como uma nova espécie, Bemisia argentifolii Bellows e Perring (Perring et al., 1993 e
Bellows et al., 1994), cujo nome vulgar é mosca branca da folha prateada (Perring et al.,
1993). A designação dessa nova espécie é controversa e não é aceita pela maioria da
comunidade científica. De Barro et al. (2004) confirmaram ser a denominação
B. argentifolii uma forma redundante de B. tabaci, sugerindo que o uso da mesma não seja
empregado. Atualmente, populações cosmopolitas como as do biótipo B estão presentes
em praticamente todas as regiões do mundo. O tratamento a base de diferentes inseticidas
selecionou novas características da praga como aumento na fecundidade e na adaptação a
outros hospedeiros surgindo então os biótipos que, cada vez mais, apresentam maiores
níveis de resistência a inseticidas (El-Kady et al., 2002 e Byrne et al., 2003).
Em se tratando desse último parâmetro, populações resistentes de mosca branca
B. tabaci têm sido selecionadas com relação aos pesticidas convencionais, tais como,
organofosforados, carbamatos, piretróides, hidrocarbonetos clorados e reguladores de
crescimento de insetos (Cahill et al., 1996). Uma nova classe de inseticida, os
9
neonicotinóides, sendo o mais proeminente dessa classe, o cloronicotinil (imidacloprid),
foi a inovação no controle químico da mosca branca a partir de 1991. Esse pesticida é
especialmente ativo contra hemípteros, incluindo aqueles especialmente resistentes aos
demais pesticidas químicos. O imidacloprid, como os demais neonicotinóides, atua
agonisticamente nos receptores nicotínicos como, por exemplo, nos receptores de
acetilcolina. Esse produto é usado no tratamento de sementes e em aplicações foliares ou
em solo. Em função das suas propriedades sistêmicas, ele é igualmente distribuído ao
longo da planta em crescimento (Elbert et al., 1998).
Resultados de monitoramento publicados em 1996 revelaram os primeiros sinais de
resistência ao imidacloprid em populções de Bemisia na região da Almeria, no sudeste da
Espanha (Cahill et al., 1996 e Elbert et al., 1996). Outros estudos têm mostrado que
populações de mosca branca localizadas em áreas produtoras de algodão no Arizona têm se
tornado menos suscetíveis ao imidacloprid no período de 1995 a 1997, quando de 1 % a
6 % da população, respectivamente, não responderam a dose de controle. Em experimentos
de laboratório usando moscas brancas do biótipo B coletadas a partir de culturas
comerciais de melão originárias da Califórnia, os autores observaram a seleção de
populações resistentes ao imidacloprid após 24 gerações quando estas foram mantidas em
um ensaio conduzido em cultura hidropônica. A natureza do mecanismo de seleção parece
ser instável, provavelmente associado com desvantagens no processo de desenvolvimento
do inseto, uma vez que, quando a pressão fora removida, a linhagem de característica
resistente fora revertida após poucas gerações (Elbert e Nauen, 2000).
Trabalhos de Morin et al. (2002) mostraram que no biótipo B a resistência estava
associada com a mutação L925I (substituição de uma leucina por uma isoleucina na
posição 925) no para-tipo no canal de voltagem de sódio. Alon et al. (2006) realizaram
estudos com os dois principais biótipos, B e Q, que são causadores de consideráveis perdas
na produção agrícola e que apresentam distribuição simpátrica no Mediterrâneo. Estes dois
biótipos se carcaterizam por apresentarem altos níveis de resistência a piretróides quando
potencializados por organofosforados. Os autores identificaram no biótipo Q duas
mutações no para-tipo no canal de voltagem de sódio associadas com a resistência a
piretróides potencializados por organofosforados. A primeira mutação foi a L925I que
ocorre no biótipo B e, a segunda, a substituição da treonina por valina na posição 929
(T929V). Para determinar se essas duas mutações tinham origens simples ou múltiplas,
foram seqüenciadas as regiões do DNA que flanqueavam essas mutações em 13 linhagens
dos biótipos B e Q de ocorrência ao redor do mundo. Os estudos revelaram cinco alelos
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resistentes e cinco alelos suscetíveis. No caso dos alelos resistentes a diversidade de
nucleotídeos era menor dentro dos biótipos e maior entre estes. Com relação à diversidade
de nucleotídeos nos alelos suscetíveis, esta foi maior entre os dois biótipos. Essas
informações foram consistentes com origens múltiplas independentes para o processo de
resistência. Embora os biótipos B e Q coexistam em várias regiões do Mediterrâneo, a
divergência nas seqüências de DNA entre os dois biótipos no locus do para-tipo do canal
de voltagem de sódio sugere que o fluxo gênico entre estes dois biótipos é baixo ou nulo.
Horowitz et al. (2005) realizaram o monitoramento de populações de B. tabaci de
ambos os biótipos, B e Q, ocorrendo em culturas comerciais de algodão em duas regiões de
Israel com relação à aplicação do inseticida pyriproxyfen no período de 1996 a 2003. O
uso desse inseticida foi suspenso nessas duas áreas no período de 1996-1997 em função da
descrição de casos de resistência em populações de mosca branca ocorrendo nas referidas
áreas. Os autores observaram que com a suspensão do inseticida, houve um declínio no
nível de resistência das populações. Contudo, a susceptibilidade não foi restaurada
completamente nas populações de B. tabaci. Dessa forma, duas populações coletadas nos
anos de 1999 e 2002 em áreas onde havia a aplicação de inseticida foram testadas com
relação às suas susceptibilidades ao pyriproxyfen na geração F1 e, subseqüentemente, uma
geração de cada uma dessas populações foi mantida em condições controladas sem
exposição ao inseticida. Após a manutenção por mais de 20 gerações em condições
controladas, a resistência ao inseticida nessas duas populações reduziu substancialmente.
Esse declínio era concorrente com a substituição do biótipo Q pelo biótipo B em regimes
sem presença de inseticidas. Os autores concluíram que, aparentemente, o biótipo B era
mais competitivo do que o biótipo Q resistente ao pyriproxyfen. A seleção sob condições
controladas com neonicotinóides das populações do biótipo B resultou em níveis
continuados de resistência ao inseticida, predominantemente em relação ao biótipo Q.
Baseado nesses dados, os autores concluíram que aplicações tanto do inseticida
pyriproxyfen ou de neonicotinóides poderiam selecionar para o biótipo Q que poderia
sobreviver quando presente em áreas onde ocorrem aplicações de inseticidas.
Muito embora o impacto socioeconômico efetivamente causado pelo complexo
B. tabaci na agricultura mundial seja de difícil mensuração e, por isso mesmo indisponível
nas publicações científicas, estima-se que nas últimas três décadas as perdas e os custos de
controle provocados pelo inseto foram da ordem de bilhões de dólares. Sob condições
ideais de temperatura e umidade relativa do ar, uma população capaz de produzir graves
danos à produção pode surgir em três semanas. Características comuns encontradas em
11
praticamente todas as regiões nas quais houve um ataque intensivo de populações desta
espécie foram práticas agrícolas intensivas com sobreposição de estações de cultivo e
clima árido e quente, associado a uma espécie com grande potencial biótico de adaptação a
inúmeros ambientes (Toscano et al., 1998), plantas hospedeiras adequadas e ambientes
apresentando estresse provocado por agrotóxicos (Gerling, 2002).
O impacto da alimentação direta e da excreção da substância açucarada em todos os
estágios da mosca branca leva à redução de qualidade e quantidade de produção, em todas
as culturas atacadas pela praga. Em frutas, plantas ornamentais e na cultura do algodoeiro,
por exemplo, o impacto da alimentação direta e a excreção de açúcares favorecem o
aparecimento de fumagina. A fumagina é causada pelo desenvolvimento de fungos
saprófitas sobre a excreção açucarada, deixando os produtos inadequados para
comercialização pela depreciação estética e, no caso específico do algodão, com fios
pegajosos que desgastam as máquinas nas indústrias têxteis (Ellsworth et al., 1999).
Atualmente, B. tabaci biótipo B é presença constante em todos os continentes. A
maior causa dessa dispersão se deve ao transporte e introdução de plantas ornamentais nos
diversos países. Na Europa, a grande massa populacional da praga está concentrada no
meio leste e presente até mesmo nas horticulturas protegidas do Norte da Europa. Um
biótipo bem próximo ao B, o B2, presente no Iêmen, destrói plantações inteiras de
melancia, tomate e tabaco, ocasionando prejuízos da ordem de milhões de dólares anuais
(Bedford et al., 1994). Recentemente, sua presença foi detectada ao norte da Índia,
acarretando danos em plantações de tomate, com a transmissão do vírus TLCV (Tomato
leaf curl virus) (Banks et al., 2001).
Desde 1991, no sul dos Estados Unidos, as perdas vêm ultrapassando a faixa de
US$ 500 milhões de dólares, apenas em relação às culturas de inverno além dos prejuízos
causados como praga e vetor no restante do país (Perring et al., 1993 e Perring, 2001). O
Vale Imperial da Califórnia sentiu os efeitos destrutivos do inseto no início da década de
1990, já que as perdas estimadas em 1991 e 1992 no Arizona, Califórnia, Texas e Flórida,
variaram de US$ 200 a 500 milhões (Henneberry et al., 1996 e 2000). No período entre
1991 a 1995, as perdas anuais no Vale Imperial foram superiores a US$ 100 milhões
(Henneberry et al., 1996 e 2000). Entre 1994 a 1998, produtores de algodão do Arizona,
Califórnia e Texas gastaram, aproximadamente, US$ 153,9 milhões para o controle de B.
tabaci e prevenção do sintoma de liga pegajosa dos fios do algodão provocado pela
substância açucarada eliminada pelo inseto (Ellsworth et al., 1999). Desde 1981 que B.
tabaci foi reconhecida como praga de expressão econômica de algodão na Baixa
12
Califórnia, México (Medina-Esparza e Leon-Paul, 1994). Contudo, os outonos de 1991 e
1992 também foram críticos para outras regiões nesse país, quando as perdas causadas por
B. tabaci excederam US$ 33 milhões nas culturas do algodão, melão, melancia e gergelim.
A produção de algodão foi reduzida de 39.415 ha em 1991 para somente 653 ha em 1992.
Os plantios de algodão, na região de Sonora, comparando-se os anos de 1995 e 1996, nesse
último, as perdas atingiram 65 % da produção (Silva-Sanchez, 1997).
O biótipo B também é predominante, tanto como praga quanto vetor, em El
Salvador, Honduras, Nicarágua, Costa Rica, Panamá e Cuba, somando prejuízos acima de
US$ 100 milhões de dólares em culturas como feijão, melão, pepino e principalmente
tomate. As perdas chegam até 100 % nas pequenas propriedades, ocasionando desemprego
e falência de algumas empresas de pequeno porte (Chang, 2000; Chicas e Cervantes, 2000;
Hilje et al., 2000; Sediles, 2000; Vasquez et al., 2000 e Morales e Anderson, 2001).
Na Colômbia a existência dos biótipos A e B de B. tabaci é um fato muito
problemático. As culturas mais afetadas nas regiões costeiras são algodão, tomate, melão e
berinjela; já, no interior do país, as culturas mais afetadas são tabaco, melão e ornamentais.
A distribuição do biótipo A está relacionada às culturas plantadas nas regiões mais centrais
do país. Os prejuízos ainda são muitos (perdas de 50 % a 80 % da safra) mas, com algumas
medidas preventivas, os produtores conseguem conviver com os problemas causados pela
mosca branca (Gonzáles e López-Ávila, 2000 e Morales e Anderson, 2001).
No Chile, B. tabaci foi encontrada pela primeira vez em 1998, em plantas de alfafa
provenientes dos EUA. Estas plantas logo receberam tratamento e o foco foi erradicado.
Em 1999, foi novamente detectada em viveiros de Hibiscus e Euphorbia no extremo norte
do país, nas áreas rurais e urbanas e também em parques públicos. Desde esse período, a
situação não tem sido fácil para os produtores, principalmente nas zonas mais produtivas,
com os cultivos de tomate, cucurbitáceas, brócolis e alface. Até aquele momento se
desconheciam os biótipos presentes no país (SAG, 1999 e 2000).
O Brasil sentiu os efeitos provocados pela presença do biótipo B de B. tabaci a
partir de 1995. Este inseto tem causado grandes prejuízos nos ecossistemas agrícolas,
semelhantemente aos problemas socioeconômicos provocados pela entrada do bicudo do
algodoeiro, Anthonomus grandis, na região Nordeste, na década de 80. Perdas e danos
diretos e indiretos, associados às reduções quantitativas e qualitativas na produção, além da
redução de empregos no campo, podem exceder vários bilhões de dólares. As principais
culturas atacadas têm sido P. vulgaris, L. esculentum, G. hirsutum, C. melo, C. lunatus,
Cucumis anguria, Cucumis sativa, Capsicum spp., G. max, C. pepo, Brassica oleracea,
13
Brassica oleracea var capitata, Brassica oleracea var. italica, Brassica oleracea var.
botrytis, Solanum gilo, Passiflora spp., H. esculentus, E. pulcherrima e Chrysantemum
spp. (Oliveira et al., 1998 e 2001).
A importância econômica da mosca branca como praga está se expandindo em todo
o mundo, inclusive no Brasil, principalmente como vetor de fitoviroses. Embora as moscas
brancas sejam consideradas insetos tropicais, atualmente elas podem ser encontradas em
quase todas as regiões do mundo, sendo muito resistentes a variações de temperatura e aos
inseticidas. A grande adaptabilidade dos indivíduos dessas espécies favorece o
aparecimento de biótipos entre as populações e aumento do espectro de plantas
hospedeiras. Recentemente, a tecnologia molecular forneceu instrumentos valiosos para a
investigação de marcadores moleculares presentes nas populações naturais, dando o
esclarecimento necessário sobre o comportamento e a dinâmica das populações, no seu
contexto ecológico. Assim, o conhecimento da diferenciação genética da B. tabaci no
Brasil, envolvendo populações de diferentes plantas hospedeiras, de diferentes regiões
geográficas e possivelmente ocorrência de variações genéticas dentro de populações, terão
implicações importantes para as estratégias de controle da mosca branca no Brasil.
OBJETIVO GERAL
Caracterizar e analisar a variabilidade genética da mosca branca Bemisia tabaci por
meio de marcadores moleculares baseados em DNA.
HIPÓTESE
Marcadores moleculares baseados em RAPD podem ser utilizados na identificação
e caracterização genética, como também, no desenvolvimento de marcadores específicos
de DNA para a detecção dos diferentes biótipos de Bemisia tabaci.
14
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Alon, M., Benting, J., Lueke, B., Ponge, T, Alon, F. and Morin, S. (2006). Multiple origins
of pyrethroid resistance in sympatric biotypes of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).
Insect Biochemistry and Molecular Biology, 36, 71-79.
Banks, G. K., Colvin, J., Chowda, R. V., Maruthi, M. N., Muniyappa, V., Venkatesh, H.
M., Kiran Kumar, M., Padma, A. S., Beitia, F. J. E Seal, S. E. (2001). First report of the
Bemisia tabaci B biotype in India and an associated tomato leaf curl virus disease
epidemic. Plant Disease, 2 (85), 231-235.
Basu, A. N. (1995). Bemisia tabaci (Gennadius): crop protection and principal whitefly
vector of plant viruses. New Delhi: Westview Press. 183p.
Basu, A. N. (1999). Bemisia tabaci (Gennadius): crop protection and principal whitefly
vector of plant viruses. New Delhi: Westview Press. 183p.
Bedford, I., Briddon, R. W., Brown, J. K., Rosell, R. C. e Markham, P. G. (1994).
Geminivirus transmission and biological characterization of Bemisia tabaci (Gennadius)
biotypes from different geographic regions. Annals of Applied Biology, 125, 311-325.
Bellows, T. S. J. R., Perring, T. M., Gill, R. J. e Hendrick, D. H. (1994). Description of a
especies of Bemisia (Homoptera: Aleyrodidade). Annals of the Entomological Society of
America, 87, 195-206.
Best, R. e Henry, G. (1994). Cassava: towards the year 2000. In: International Network for
Cassava Genetic Resources. Report of the First Meting of the International Network
Cassava Genetic Resources, CIAT, CALI, Colombia, 18-23 August 1992. International
Crop Network Series No. 10. International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy.
Pp.3-11.
15
Bird, J. (1957). White-fly transmitted mosaic of Jatropha gossypifolia. Agriculture
Experimental Station University of Porto Rico, 22, 1-35.
Brown, J. K., Coats, S., Bedford, J. D., Markham, P. G. e Bird, J. (1992). Biotypic
characterization of Bemisia tabaci populations based on esterase profiles, DNA
fingerprinting, virus transmission, and bioassay to key host plant species. Phytopathology,
82, 1104.
Brown, J. K. e Bird, J. (1992). Whitefly-transmitted geminiviruses and associated disorders
in the Americas and the Caribbean basin: past and present. Plant Disease, 76, 220–225.
Brown, J. K., Frohlich, D. R. e Rosell, R. C. (1995). The sweetpotato a silverleaf
whiteflies: biotypes of Bemisia tabaci or a new species complex? Annual Review of
Entomology, 40, 511-534.
Brown, J. K. e Bird, J. (1995). Variability within the Bemisia tabaci species complex and
its relation to new epidemics caused by geminiviruses. CEIBA, 36, 73-80.
Brown, J. K., Idris, A. M., Olsen, M. W., Miller, M. E., Isakeit, T. e Anciso, J. (2000).
Cucurbit leaf curl virus, a new whitefly transmitted geminivirus in Arizona, Texas, and
Mexico. Plant Disease, 84 (7), 809.
Byrne, D. N., Bellows, Jr., T. S. e Parrella, M. P. (1990). Whiteflies in agricultural
systems. In: Whiteflies: their bionomics, pest status and management. Ed. D. Gerling.
Wimborne, UK: Intercept, Andover. Pp. 227-261.
Byrne, D. N. e Bellows, T. S. (1991). Whitefly biology. Annu. Rev. Entomol. 36, 431-
457.
Byrne, F. J., Castle, S., Prabhaker, N. e Toscano, N. C. (2003). Biochemical study of
resistance to imidacloprid in B biotype Bemisia tabaci from Guatemala. Pest
Management Science, 3 (59), 347-352.
16
Burban, C., Fishpool, L. D. C., Fauquet, C., Fargette, D. e Thouvenel, J. –C. (1992). Host-
associated biotypes within West African populations of the whitefly Bemisia tabaci
(Genn.). (Hom., Aleyrodidae). J. Appl. Ent., 113, 416-423.
Cahill, M., Denholm, I., Byrne, F. J. e Devonshire, A. L. (1996). Insecticide resistance in
Bemisia tabaci – current statusand implications for management. Proceedings of Brighton
Crop Protection Conference – Pests and Diseases, I, 75-80.
Cahill, M., Gorman, K., Day, S., Denholm, I., Elbert, A. e Nauen, R. (1996). Baseline
determination and detection of resistance to imidacloprid in Bemisia tabaci (Homoptera:
Aleyrodidae). Bulletin of Entomological Research, 86, 343-349.
Carvalho, L. J. C. B., Cabral, G. & Campos, L. (2000). Raiz de reserva de mandioca: um
sistema biológico de múltipla utilidade. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, Documentos, 44, 16p.
Cereda, M. P., Takitane, I. C., Chuzel, G. e Vilpoux, O. (1996). Starch potencial in Brazil.
In: Cassava Flour and Starch: Progress in Research and Development. Eds. Dufour, D.,
O’Brien, G. M. Best, R., Montpellier, France: Centre de Cóoperation Internationale en
Recherche Agronomique pour le Développement, Département des Systémes
Agroalimentaires et Ruraux; Cali, colômbia: Centro International de Agricultura Tropical,
pp. 19-29.
Chang, R. (2000). Informe de Panamá. In: INFORMES NACIONALES, 2000. Panama.
Anais... Panama: Luko Hilje. p. 26-28.
Chicas, J. M. S. e Cervantes, L. S. (2000). Informe de El Salvador. In: INFORMES
NACIONALES, 2000. Panama. Anais... Panama: Luko Hilje. p.10-17.
Costa, H. S. e Brown, J. K. (1990). Variability in biological characteristics, isozyme
patterns and virus transmission among populations of Bemisia tabaci in Arizona.
Phytopathology, 80, 888-893.
17
Costa, H. S. e Brown, J. K. (1991). Variation in biological characteristics and esterase
patterns among populations of Bemisia tabaci, and the association of one population with
silverleaf symptom induction. Entomologia Experimentalis et Applicata, 61, 211-219.
Costa, A. S., Costa, C. L. e Sauer, H. F. (1973). Surto de mosca-branca em culturas do
Paraná e São Paulo. Anais Sociedade Entomológica do Brasil. CEPEC, Itabuna, Brasil, 2
(1), 20-30.
Costa, A. S. e Russell, L. M. (1975). Failure of Bemisia tabaci to breed on cassava plants
in Brazil (Homoptera: Aleyrodidae). Ciência e Cultura São Paulo, 27, 388-390.
Dávila, A. G. H. (1999). La mosca blanca (Homoptera: Aleyrodidae) en Guatemala. In:
VII Taller Latinoamericano y del Caribe Sobre Moscas-Blancas y Geminivirus.
Anais…IPA, Recife, PE, Brazil. p. 125-126.
De Barro, P. J. e Driver, F. (1997). Use of RAPD-PCR to distinguish the B biotype from
other biotypes of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Australian
Journal of Entomology, 36, 149-152.
De Barro, P. J., Trueman, J. W. H. e Frohlich, D. R. Bemisia argentifolii is a population of
B. tabaci: the molecular genetic differentiation of B. tabaci populations around the world.
(mensagem pessoal) Mensagem recebida por [email protected]brapa.br em 04 março de
2004.
Delatte, H., Reynaud, B., Granier, M., Thornary, L., Lett, J. M., Goldbach, R. e
Peterscmitt, M. A. (2005). New silverleaf-inducing biotype Ms of Bemisia tabaci
(Hemiptera: Aleyrodidae) indigenous to the islands of the south-west Indian Ocean.
Bulletin of Entomological Research, 95, 29-35.
Elbert, A., Nauen, R., Cahill, M., Devonshire, A. L., Scarr, A. W., Sone, S. and Steffens,
R. (1996). Resistance management with chloronicotynil insecticides using imidacloprid as
an example. Pflanzenschutz Nachrichten Bayer, 49, 5-54.
18
Elbert, A. e Nauen, R. (2000). Resistance of Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) to
insecticides in southern Spain with special reference to neonicotinoids. Pest Management
Science, 56, 60-64.
Elbert, A., Nauen, R e Leicht, W. (1998). Imidacloprid, a novel chloronicotinil insecticide:
biological activity and agricultural importance. In: Insecticides with Novel Modes of
Action, Mechanism and Application. In: ISHAAYA, I. E DEGHEELE, D. (Eds.). Springer
Verlag, 50-73.
Ellsworth, P. C., Tronstad, R., Leser, J., Goodell, P. B., Godfrey, L. D., Henneberry, T. J.,
Hendrix, D., Brushwood D., Naranjo, S. E., Castle, S. e Nichols, R. L. (1999). Stick cotton
sources and solutions. The University of Arizona, Cooperative Extension. IPM Series, 13
(1156-12), 1- 4.
El-Kady, H., Denholm, I. e Devine, G. J. (2002). Insecticide resistance in Egyptian strains
of Bemisia tabaci. The BCPC Conference: Pests and Diseases, 1-2, 787-792.
EWSN. European Whitefly Studies Network. Disponível em: http://www.whitefly.org.
Acesso em 07 de fevereiro de 2004 (informações extraídas das edições de 1999).
EWSN. European Whitefly Studies Network. Disponível em: http://www.whitefly.org.
Acesso em 07 de fevereiro de 2004. (informações extraídas das edições de 2000).
Fauquet, C. e Fargette, D. (1990). African cassava mosaic virus: etiology, epidemiology,
and control. Plant disease, 74, 404-411.
Fauquet, C. M., Pita, J., Deng, D., Tores-Jerez, I., Otim-Nape, W. G., Ogwal, S., Sangare,
A., Beachy, R. N. e Brown, J. K. (1998). The east african cassava mosaic virus epidemic in
Uganda. International Workshop on Bemisia and Geminiviruses. San Juan, Puerto Rico,
June 7-12, L-4.
19
Gawel, N. J. e Bartlett, A. C. (1993). Characterization of differences between whiteflies
using RAPD-PCR. Insect Molecular Biology, 2 (1), 33-38.
Gennadius, P. (1889). Disease of tobacco plantations in the Trikonia. The aleurodid of
tobacco. Ellenike Georgia, 5, 1-3 (publicação em grego).
Gerling, D. (2002). Whiteflies revisited. Manejo Integrado de Plagas, 63, 13-21.
González, J. G. e López-Ávila, A. (2000). Informe de Colombia. In: INFORMES
NACIONALES, 2000. Panama. Anais... Panama: Luko Hilje. p. 40-46.
Guirao, P., Beitia, F. e Cenis, J. L. (1997). Biotype determination of Spanish populations
of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Bulletin of Entomological Research, 87,
587-593.
Henneberry, T. J., Toscano, N. C. e Castle, S. J. (1996). Bemisia spp. (Homoptera:
Aleyrodidae) in the United States: History, pest status and management. Recent Research
Development in Entomology, 2, 151-161.
Henneberry, T. J., Jones, W. A. e Faust, R. M. (2000). Brief industry, research progress
and current pest status of Bemisia in the United States. In: HENNEBERRY, T. J.; FAUST,
R. M.; JONES, W. A.; PERRING, T. M. (Eds.). Silverleaf Whitefly National Research,
Action and Technology Transfer Plan. Third Annual Review of the Second 5-Year Plan.
U.S. Department of Agriculture, p. 1-2.
Hilje, L., Ramírez, P. e Sibaja, G. (2000). Informe de Costa Rica. In: INFORMES
NACIONALES, 2000. Panama. Anais... Panama: Luko Hilje. p. 21-25.
Horowitz, A. R., Kontsedalov, S., Khasdan, V. e Ishaaya, I. (2005). Biotypes B and Q of
Bemisia tabaci and their relevance to neonicotinoid and pyriproxyfen resistance.
Archieves of Insect Biochemistry and Physiology, 58, 216-225.
20
Lapidot, M. e Friedmann, M. (2002). Breeding for resistance to whitefly-transmitted
geminiviruses. Annals of Applied Biology, 140 (2), 109-127.
Lima, L. H. C., Oliveira, M. R. V., Gomes, A. C. M. M.e Ferreira, D. N. M. (1992).
Análise eletroforética em populações da mosca branca, Trialeurodes vaporariorum e
Bemisia sp. (Homoptera, Aleyrodidae). Pesquisa em Andamento, 5, 1-5.
Lima, L. H. C.; Campos, L.; Moretzsohn, M. C.; Ferreira D. N. M; Ribeiro E Silva, O.L. &
Oliveira, M.R.V.
(1999). Populações de Bemisia tabaci (Gennadius) raça B no Brasil:
análise da diversidade genética por RAPD. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia. Pesquisa em Andamento, 22.
Lima, L .H. C., Návia, D., Inglis, P .W. e Oliveira, M. R. V. (2000). Survey of Bemisia
tabaci (Gennadius) (Hemiptera:Aleyrodidae) biotypes in Brazil using RAPD markers.
Genetics and Molecular Biology, 4 (23), 1-5.
Lima, L. H. C., Moretzsohn, M. C., Queiroz, P. R., Lago, W. N. M. e Oliveira, M. R. V.
(2001). Monitoramento e identificação de aleirodídeos por meios morfológicos e de
marcadores RAPD. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Documentos,
17.
Lima, L. H. C., Campos, L., Moretzsohn, M. C., Návia D. e Oliveira, M. R. V.
(2002a).
Genetic Diversity of Bemisia tabaci (Genn.) Populations in Brazil Revealed by RAPD
Markers. Genetics and Molecular Biology, 2 (25), 217-223.
Lourenção, A. L. e Nagai, H. (1994). Surtos populacionais de Bemisia tabaci no Estado de
São Paulo. Bragantia, 53 (1), 53-59.
Marinho, V. L. A. e Fonseca, M. E. N. (1992). Ocorrência de RNA do tipo viróide em
plantas de crisântemo proveniente do estado de São Paulo. Fitopalogia Brasileira, 17 (2),
p.179.
Markham, P., Bedford, J. D., Liu, S., Frolich, D. F., Rossel, R. e Brown, J. K. (1996). The
transmission of geminiviruses by biotypes of Bemisia tabaci (Gennadius). In: Gerling D.;
21
Mayer R. T. (Eds.) Bemisia 1995: Taxonomy, Biology, Damage, Control and
Management. Intercept, Andover, Hants, UK., pp. 69-75.
Mathurin, G. (1994). Integrated Pest Management in St. Lucia. Seminar Proceedings,
Setting up an Integrated Pest Management Network for the Caribbean, Anais... Barbados,
16-19 October. p. 47-53.
Maruthi, M. N.; Colvin, J.; Seal, S. (2001). Mating compatibility, life-history traits, and
RAPD-PCR variation in Bemisia tabaci associated with the cassava mosaic disease
pandemic in East Africa. Entomologia Experimentalis et Applicata, 99 (1), 13-23.
Medina Esparza, J. J.; Leon-Paul, R. L. (1994). Evaluation of pesticides for the control of
whitefly on cotton. INIFAP-CIRNO-CEMEXI, Mexicali Valley - 1993. Proc. International
Pest Work Committee, Mazatlan, Mexico. Anais…California Departament of Food and
Agriculture, Sacramento, CA. p.50-55.
Morales, F. J. e Anderson, P. K. (2001). The emergence and dissemination of whitefly-
transmitted geminiviruses in Latin America. Archives of Virology, 146, 415-441.
Morin, S., Williamson, M. S., Goodson, S. J., Brown, J. K., Tabashnik, B. E. e Dennehy,
T. J. (2002). Mutations in the Bemisia tabaci para sodium channel gene associated with
resistance to a pyrethroid plus organophosphate mixture. Insect Biochemistry and
Molecular Biology, 32, 1781-1791.
Mound, L. A., and Halsey, S. H. (1978). Whitefly of the world. A systematic catalogue of
the Aleyrodidae (Homoptera) with host plant and natural enemy data. New York: Wiley.
340p.
Mound, L. A. (1983). Biology and identity of whitefly vectors of plant pathogens. In: Plant
virus epidemiology (ed. Plumb, R. T. e Thresh, J. M.). Oxford: Blackwell Scientific, 305-
313 pp.
22
Munroet, L. A. (1994). Integrated Pest Management in Guyana. Seminar Proceedings,
Setting up an Integrated Pest Management Network for the Caribbean, Anais… Barbados,
16-19 October. p.47-53.
Oliveira, M. R. V. e Lima, L. H. C. (1997). Padrões isoenzimáticos de
Trialeurodes vaporariorum e de Bemisia tabaci (Homoptera, Aphelinidae). Pesquisa
agropecuária brasileira, 32 (7), 683-687.
Oliveira, M. R. V., Lima, L. H. e Ferreira, L. T. (1997). Análise eletroforética de
populações da mosca-branca, Bemisia tabaci raça B (= B. argentifolii) (Homoptera,
Aleyrodidae). Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA. Pesquisa em
andamento, 11, 1 –6.
Oliveira, M. R. V. de., Lima, L. H. C., Ferreira, D. M. N. e Vieira, P. R. G. (1998).
Avaliação das populações de Bemisia tabaci (Gennadius) por meio de RAPD-PCR, no
Brasil. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Pesquisa em Andamento,
18, 6p.
Oliveira, M. R. V. (2001). Mosca-branca, Bemisia tabaci raça B (Hemiptera: Aleyrodidae).
In: Histórico e impacto das pragas introduzidas no Brasil. Eds.: E. F. Vilela; R. A. Zucchi;
F. Cantor. Ribeirão Preto: Holos. p.61-71.
Pantoja, A. e Cabrera, I. (2000). Informe de Puerto Rico. In: INFORMES NACIONALES,
2000. Panama. Anais... Panama: Luko Hilje. p.37-39.
Perring, T. M. (2001). The Bemisia tabaci species complex. Crop Protection, 20 (9), 725-
737.
Perring, T. M., Cooper, A. D., Rodriguez, R. J., Farrar, C. A. e Bellows, Jr. T. S. (1993).
Identification of a whitefly species by genomic and behavioural studies. Science, 259, 74-
77.
23
Polston, J. E. e Anderson, P. K. (1997). The emergence of whitefly-transmitted
geminiviruses in tomato in the Western Hemisphere. Plant Disease, 81 (12), 1358-1369.
Russell, L. M. (1957). Synonyms of Bemisia tabaci (Gennadius) (Homoptera,
Aleyrodidae). Bulletin Brooklyn Entomological Society, 52, 122-123.
SAG. (1999-2000). Prospección de moscas blancas en la Zona Central de Chile.
Documento Interno. Chile: SAG. 70p.
SALAS, J. e ARNAL, E. (2001). Bemisia tabaci (Gennadius, 1899) biotype B, first record
for Venezuela using RAPD’s-PCR. Entomotropica, 3 (16), 181-185.
Secker, A. E., Bedford, I. D., Markham, P. G., Williams, M. E. C. De. (1998). Squash, a
reliable field indicator for the presence of the B biotype of tobacco whitefly, Bemisia
tabaci. Brighton Crop Protection Conference: Pests & Diseases - 1998: Volume 3:
Proceedings of an International Conference, Brighton, UK, 16-19 November 1998, p.837-
842.
Sediles, A. (2000). Informe de Nicaragua. In: INFORMES NACIONALES, 2000. Panama.
Anais... Panama: Luko Hilje. p.18-20.
Silva Sanchez, C. (1997). Behavior of the silverleaf whitefly (Bemisia argentifolii B&P) in
the cotton crop on the coast of Hermosillo, Sonora, p. 34. Annals… Proceedings
International Cotton Pest Work Committee, Mazatlan, Mexico. California Dept. Food and
Agric., Sacramento, CA.
Simon, B., Cenis, J. L., Demichelis, S., Rapisarda, C., Caciagli, P. e Bosco, D. (2003).
Survey of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) biotypes in Italy with the description
of a new biotype (T) from Euphorbia characias. Bulletin of Entomological Research, 3
(93), 259-264.
Takahashi, R. (1936). Some Aleyrodidae from Japan. Insecta Matsum, 21, 12-21.
24
Toscano, N. C., Castle, S. J., Henneberry, T. J. e Prabhaker, N. (1998). Invasions by
Bemisia and its exploitation if agricultural systems. Annals… International Workshop on
Bemisia and Geminiviruses. San Juan, Puerto Rico. L-6, June 7-12.
Traboulsi, R. (1994). Bemisia tabaci: a report on its pest status with particular reference to
the Near East. FAO Plant Protection Bulletin, 42(1-2), 58.
Valarezo, O. e López, M. A. (2000). Informe de Ecuador. In: INFORMES NACIONALES,
2000. Panama. Anais... Panama: Luko Hilje. p.59-61.
Valencia, L. V., Mujica, N. e Cisneros, F. (2000). Informe de Peru. In: INFORMES
NACIONALES, 2000. Panama. Anais... Panama: Luko Hilje. p.62-68.
Vazquez, L. L. V. (1999). Mosca blanca-geminivirus en el Caribbe: estado actual y
perspectivas. VIII Taller Latinoamericano y Del Caribbe sobre moscas blancas y
geminivirus. Anais... 17-20 de Outubro. p.45-58.
Vázquez, L. L., Gómez, O., González, G., Madelaine, Q. (2000). Informe de Cuba. In:
INFORMES NACIONALES, 2000. Panama. Anais... Panama: Luko Hilje. p.29-32.
Vidal, C. A., Nascimento, A. S., Barbosa, C. J., Marques, O. M. e Habibe, T. C. (2000).
Experimental transmission of “sticky disease” of papaya by Bemisia argentifolli Bellows
& Perring. Abstract book II - XXI International Congress of Entomology, Brazil, August
p.20-26.
Villar, A., Alvarez, P., Escarramán, V. e Gómez, E. (2000). Informe de La Republica
Dominicana. In: INFORMES NACIONALES, 2000. Panama. Anais... Panama: Luko
Hilje. p.33-36.
Villas Bôas, G. L., França, F. H., Ávila, A. C. e Bezerra, I. C. (1997). Manejo integrado da
mosca branca Bemisia argentifolii. Circular técnica da Embrapa hortaliças, 9, 11p.
Zuniga, V. E. e Ramirez, P. (2002). Geminivirus, pathogens of worldwide importance.
Manejo Integrado de Plagas y Agroecologia, 64, 25-33.
25
CAPÍTULO 1
Identificação molecular e análise da variabilidade genética
da mosca branca Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae)
“Há duas formas para viver a sua vida:
Uma é acreditar que não existe milagre.
A outra é acreditar que todas as coisas são um milagre”.
Albert Einstein (1879-1955).
RESUMO
Com a caracterização é possível discriminar as diversas espécies de insetos
fornecendo suporte na identificação e na análise filogenética de gêneros e espécies
relacionadas. Além disso, os marcadores moleculares podem ser empregados em estudos
complementares de caracterização de organismos. Várias estratégias moleculares têm sido
aplicadas nos estudos dos biótipos de B. tabaci, buscando-se a identificação e o
desenvolvimento de marcadores específicos para a caracterização de populações naturais,
permitindo o seu uso em associação a estudos de identificação de biótipos, no
estabelecimento de relações filogenéticas entre diferentes populações de um mesmo
biótipo, no monitoramento e na interceptação de amostras infestadas por meio de métodos
mais eficientes, precisos e de maior sensibilidade de detecção. Marcadores de RAPD foram
utilizados no estudo dos biótipos de B. tabaci e outras espécies de insetos, possibilitando
identificar populações de B. tabaci coletadas em várias culturas, analisar a dispersão das
populações de mosca branca, caracterizar as populações do biótipo B de B. tabaci
coletadas em várias culturas no Brasil e realizar um estudo comparativo do perfil
molecular de B. tabaci e outras espécies de insetos. Os resultados observados nas análises
moleculares apontam para um comportamento complexo da mosca branca em campo.
Dessa forma, uma resposta mais adequada para se avaliar o padrão da mosca branca deve
agrupar muitas variáveis, desde a estratégia reprodutiva da espécie até outros parâmetros,
entre eles, comportamentais, ambientais e biológicos. Os resultados indicaram também a
possibilidade de seleção de determinadas bandas de DNA, geradas por RAPD e específicas
para cada espécie, para o desenvolvimento de kits para a identificação das mesmas. Essa
26
estratégia é particularmente importante para estudos envolvendo os biótipos de B. tabaci,
uma vez que, cada biótipo apresenta características peculiares e a sua introdução em
determinadas regiões do mundo se constitui em risco quarentenário. A partir desse ponto,
esses dados poderão resultar em informações valiosas para a elaboração de estratégias de
controle mais eficientes e servir de referência para a elaboração de medidas fitossanitárias
mais efetivas contra essa espécie de aleirodídeo.
INTRODUÇÃO
O levantamento qualitativo e quantitativo de caracteres relacionados a um dado
organismo pemite a sua caracterização. Dessa forma, com a caracterização é possível
discriminar as diversas espécies de insetos por meio do conhecimento de seus padrões
fisiológicos, morfológicos e genéticos. Neste contexto, a caracterização também auxilia no
processo de identificação, quando a espécie não está bem definida (Frutos et al., 1994). O
conhecimento de cada um destes aspectos são complementares e definem cada organismo.
Quanto mais detalhados forem os conhecimentos sobre um organismo, maior será a chance
de realizar a sua identificação. A análise de várias características fornece suporte para
resolver questões geradas pela sistemática clássica na identificação de espécies, assim
como permite a análise filogenética de gêneros e espécies relacionadas (Sosa-Gómez et al.,
1998).
Dessa forma, os marcadores moleculares, então, são ferramentas complementares
para os estudos de caracterização de organismos. O marcador molecular representa todo e
qualquer fenótipo de um gene expresso, como no caso das isoenzimas, ou de um segmento
do DNA que corresponde a regiões, expressas ou não, do genoma. (Ferreira &
Grattapaglia, 1995). O desenvolvimento da Biologia Molecular permitiu o surgimento de
diversos métodos de detecção de polimorfismo g enético, tanto bioquímico quanto de ácido
nucleico. As principais vantagens do uso dos marcadores moleculares baseados em DNA
são: 1) a análise de um grande número de locus; 2) a neutralidade em relação a efeitos
fenotípicos (efeito epistático ou pleiotrópico mínimo ou nulo); 3) a co-dominância, com
maior quantidade de informação genética por locus; 4) a caracterização do genótipo de um
indivíduo a partir de amostras de células ou tecidos.
Essas propriedades podem então ser aplicadas ao estudo da mosca branca em
virtude dos problemas causados por esse inseto. Uma alternativa é a prevenção por meio da
27
identificação rápida do inseto na planta hospedeira, em áreas locais ou em campo. A
identificação da mosca branca foi feita inicialmente por meio de caracteres morfológicos
da pupa. Contudo, esses critérios podem levar a uma identificação incompleta ou até
mesmo errônea do indivíduo se forem consideradas isoladamente. Além disso, a
identificação a partir de adultos de algumas espécies de mosca branca é particularmente
difícil, pois estas compartilham características morfológicas semelhantes (Wool et al.,
1989). Essa característica também se aplica aos biótipos de B. tabaci que apresentam uma
elevada semelhança morfológica, dificultando a identificação e a individualização dos seus
vários biótipos.
Sendo assim, houve a necessidade de se estabelecer métodos mais precisos para a
identificação e a caracterização dos biótipos de B. tabaci. Inicialmente, Wool et al. (1989)
usando os padrões de esterase e α-glicerofosfato desidrogenase conseguiram diferenciar
populações de B. tabaci de outras espécies de aleirodídeos, tais como, B. tuberculata,
B. afer, Dialeurodes kirkoldyi, D. citri e Trialeurodes vaporariorum. Em 1991, Wool et al.
usando padrões de esterase sugeriram variações entre os biótipos de B. tabaci ocorrendo
em vários estados da Colômbia. A partir dessa evidência, os autores postularam a
existência de raças geográficas. Nesse mesmo estudo, observou-se que amostras de B.
tabaci originárias da Flórida, Califórnia e Kênya também possuíam diferenças em seus
padrões de isoenzimas. Liu et al. (1992) usando padrões definidos de esterase sugeriram o
método isoenzimático como uma alternativa para a diferenciação entre os biótipos de B.
tabaci. Perring et al., em 1992, usaram 14 sistemas de isoenzimas para analisar populações
de B. tabaci coletadas em culturas comerciais de algodão e brócolis e em uma cultura de
planta ornamental, poinsetia. Dos resultados obtidos, os autores observaram que dos 18
loci analisados, seis eram polimórficos e que, em cada um desses loci polimórficos, a
população coletada em cultura de algodão possuía um ou mais alelos únicos. Ainda nesse
mesmo estudo, postulou-se que as populações encontradas em brócolis e poinsetia
derivaram de uma mesma população ancestral. A partir das informações geradas pelos
perfis eletroforéticos de isoenzimas foram identificados por Coats et al. (1994), nos
Estados Unidos e América Central, dois biótipos de B. tabaci em função dos seus padrões
de esterase: o biótipo A (algodão, batata-doce ou tabaco) e o biótipo B (poinsétia ou
abóbora). O biótipo B difere em algumas características biológicas do A, principalmente
pela indução de desordens fitotóxicas, transmissão de fitoviroses, fecundidade, espectro de
hospedeiros e elevados níveis de resistência a inseticidas (Brown et al., 1995). Analisando-
se o perfil de esterase de 40 populações coletadas ao redor do mundo, Brown et al. (1995)
28
identificaram 12 variantes eletroforéticos de B. tabaci da América Central, África e Índia.
Nesse mesmo estudo, os autores postularam, a partir das informações geradas pelos
padrões de esterase, que o biótipo B representaria um complexo de espécies. Em 1997,
Gunning et al., usando padrões de esterase distinguiram o biótipo B, introduzido na
Austrália, do biótipo não B, nativo daquele país. Além disso, pelos padrões de isoenzima
os autores determinaram o potencial desses dois biótipos de B. tabaci em intercruzarem.
Por esse mesmo princípio, Ryckewaert e Alauzet (2001) analisaram populações de mosca
branca de ocorrência nas Antilhas e determinaram que uma parte dessas populações
possuía perfil isoenzimático relacionado ao biótipo B de origem americana e que
indivíduos coletados em Jatropha gossypifolia apresentavam diferenças nos perfis
isoenzimáticos e tinham a capacidade de trocar material genético, por meio de cruzamentos
entre machos e fêmeas, com o biótipo N de B. tabaci originário de Porto Rico.
Mesmo em função do potencial de uso das isoenzimas, esta técnica apresenta
algumas limitações, tais como: 1) o perfil isoenzimático gerado por um indivíduo pode
estar relacionado a expressão de uma dada isoenzima em um dado tecido; 2) por ser um
marcador de natureza bioquímica, este pode sofrer oscilações em função das características
fisiológicas do inseto em um dado momento. Soma-se a isso, o fato de que em
determinados casos, os caracteres morfológicos não são suficientes para a distinção entre
os biótipos de B. tabaci. Dessa forma, surge a necessidade de se utilizar outras estratégias
que possam ser mais precisas e que não sofram influência de condições fisiológicas do
organismo em um dado momento e assim garantir uma identificação mais precisa da
espécie de aleirodídeo que está sendo estudada. Por isso, os métodos moleculares baseados
em DNA estão sendo desenvolvidos e usados como ferramentas auxiliares para a
identificação dos biótipos de B. tabaci em virtude desse inseto representar uma ameaça
para as culturas de valor comercial (De Barro & Driver, 1997).
Os principais tipos de marcadores moleculares baseados em DNA podem ser
classificados em dois grupos de acordo com a metodologia utilizada para identificá-los: a)
hibridação ou; b) amplificação de DNA. No primeiro caso, utiliza-se uma sonda de DNA
marcada com isótopo radioativo ou fluorescente que seja complementar a região do
genoma que se deseja estudar. No segundo, são utilizados primers sintéticos de DNA que
sejam específicos para uma dada região do genoma. Nesse caso, ocorre a amplificação de
um número considerável de cópias apenas do segmento que se deseja estudar. A vantagem
desse último está no fato de que se dispensa o emprego de material radioativo, como
também, pode-se realizar as análises a partir de pequenas quantidades de DNA extraídos da
29
amostra. Essa estratégia é particularmente importante para a mosca branca B. tabaci, uma
vez que, em virtude das suas dimensões reduzidas (em torno de 1 mm de comprimento),
técnicas baseadas na amplificação de regiões do genoma são mais adequadas para esse
inseto. Esse fato foi confirmado por Brown et al. (2005) que analisaram o conteúdo de
DNA do núcleo de machos e fêmeas de B. tabaci por citometria de fluxo e determinaram
que estes possuíam em torno de 1,04 pg e 2,06 pg de DNA. Fazendo-se as devidas
conversões, os autores determinaram que o genoma de B. tabaci possuía em torno de
1020 Mb, correspondendo a cinco vezes o tamanho do genoma da mosca de fruta
Drosophila melanogaster. Assim, técnicas baseadas em DNA estão sendo aplicadas ao
estudo da variabilidade genética desse aleirodídeo em função dessas quantidades de DNA
por núcleo haplóide. Uma técnica aplicada ao estudo da variabilidade de B. tabaci é o
RAPD (DNA polimórfico amplificado ao acaso). O princípio dessa técnica consiste em
utilizar primers de 10 nucleotídeos de comprimento e de seqüência aleatória em reações de
PCR ajustadas para baixas condições de anelamento desses primers randômicos (Williams
et al., 1990). O resultado consiste na amplificação de vários fragmentos de DNA em
virtude do anelamento aleatório dos primers ao longo do genoma da amostra estudada.
Esses fragmentos são convertidos em dados binários (presença ou ausência de bandas) e,
posteriormente, usados para a determinação das relações filogenéticas entre populações ou
espécies, como também, para a determinação de perfis eletroforéticos (fingerprints
genômicos) das amostras analisadas. Utilizando-se essa técnica, por exemplo, Gawel &
Bartlett (1993) e Perring et al. (1993) usando o DNA de indivíduos de B. tabaci
distinguiram dois biótipos: A e B. Os resultados indicaram que essas moscas-brancas,
similares morfologicamente, representavam biótipos diferentes. Assim, devido a existência
de numerosas formas variantes de B. tabaci, seria adequado conduzir um estudo sobre a
diversidade genética, fisiológica e morfológica de todas as formas variantes de B. tabaci
antes de uma definição das relações taxonômicas entre as formas A e B. Guirao et al.
(1994) utilizando a técnica de RAPD, determinaram os perfis eletroforéticos específicos
para T. vaporariorum e B. tabaci. Além disso, para as populações de B. tabaci, foi possível
observar diferenças intrapopulacionais, como também, diferenciar as populações coletadas
nas regiões de Múrcia e Tenerife na Espanha. Em 2000, Lima et al. distinguiram os
biótipos B e BR por perfis de amplificação de RAPD, correlacionando a distribuição de
populações dentro do biótipo B em função do tipo da planta hospedeira. Nesse mesmo ano,
Martinez et al. (2000) usando um único primer de RAPD fizeram a distinção entre três
biótipos de B. tabaci, sendo que, um desses biótipos era restrito à cultura de mandioca. Em
30
todos os trabalhos utilizando-se a técnica de RAPD fica evidente que os perfis de
marcadores indicam a existência de vários biótipos, como também, a variação nos perfis
desses marcadores intrapopulacionalmente. Esse resultado, em função das características
da técnica, pode estar associado a variações nas condições de amplificação, resultando em
perfis de difícil reprodução. Sendo assim, uma alternativa, é a utilização de outros
marcadores para corroborar ou desfazer as premissas obtidas com a técnica de marcadores
moleculares RAPD.
Cervera et al. (2000) utilizaram a técnica de AFLP (Polimorfismo de Comprimento
de Fragmentos Amplificados) para a determinação das relações filogenéticas entre biótipos
de B. tabaci. A técnica de AFLP consiste em quatro etapas: 1) digestão do DNA genômico
com duas enzimas de restrição; 2) adaptadores de DNA são ligados aos terminais dos
fragmentos genômicos gerados pela clivagem; 3) uma fração dos fragmentos é amplificada
por PCR utilizando-se primers desenhados para a região dos adaptadores; 4) eletroforese
dos fragmentos amplificados pelo PCR específico. Por essa técnica um grande número de
marcadores pode ser analisado em um único gel, permitindo uma amostragem ampla e
simultânea de um genoma. Soma-se a isso o seu grande poder de detecção de variabilidade
genética por meio do polimorfismo de presença ou ausência de sítios de restrição e a
ocorrência ou não de amplificação. Por esse método, então, os autores anteriormente
citados, analisando 354 bandas polimórficas obtidas em duas reações de amplificação com
o uso de duas combinações de primers, conseguiram diferenciar B. tabaci das espécies de
B. medinae e B. afer. Analisando-se, apenas, os biótipos de B. tabaci, os autores
distinguiram quatro grupos: 1) K (Paquistão), H (índia), II (Paquistão), M (Turquia) e I
(Paquistão); 2) Q (Espanha), Cowpea (Nigéria) e B (Espanha); 3) A (Arizona) e; 4) S
(Espanha) e Cassava (Nigéria).
Várias estratégias têm sido aplicadas aos estudos de caracterização molecular dos
biótipos de B. tabaci buscando-se uma melhor compreensão dessa espécie de aleirodídeo.
Uma dessas novas abordagens é a análise da região ITS1 do rDNA. Essas seqüências
caracterizam-se pela conservação em sua composição nucleotídica. Pequenas variações
podem ser detectadas nas seqüências e então utilizadas como parâmetro de comparação
entre os vários biótipos de mosca branca. Por essa metodologia, De Barro et al. (2000)
sustentam a teoria de ocorrência de monofilia para cada biótipo e, também, um forte
padrão de distribuição geográfica. Pelas análises de seqüenciamento da região ITS, os
autores demonstraram que as populações das Américas (incluindo o biótipo A) formavam
um clado de elevada similaridade genética com o clado de B. tabaci biótipo B (responsável
31
pelo prateamento das folhas de certas espécies de plantas) e com o clado de um biótipo
proveniente do norte da África e região do Mediterrâneo que não provocava o
característico prateamento das folhas. Ainda pelo estudo do rDNA, os autores sugerem que
o fenômeno de prateamento é um evento recente e que o biótipo de não prateamento é a
forma ancestral.
Frohlich et al. (1999) analisando as regiões 16S rDNA e citocromo oxidase I (COI)
no DNA mitocondrial fizeram uma reconstrução filogenética e geográfica para os biótipos
de B. tabaci. Pelos dados obtidos pelas análises das seqüências, observou-se que a região
16S foi menos informativa do que a COI. Dos 429 caracteres examinados para a região
COI, 185 locais foram invariáveis, ou seja, não houve variação de bases nitrogenadas em
determinada posição da seqüência, 244 foram variáveis, apresentando mudanças em uma
dada posição da seqüência e 108 foram informativos, ou seja, houve mudança de base
nitrogenada, permitindo identificar os biótipos de B. tabaci. Para a região 16S rDNA foram
analisados 456 caracteres, sendo 298 invariáveis, 158 variáveis e 53 informativos. Por esse
método, a construção de um dendrograma e a sua conseqüente análise filogenética
revelaram uma separação de B. tabaci em função da sua origem geográfica. As
informações geradas pela análise de DNAmt a partir das seqüências COI e 16S rDNA
indicaram que o biótipo B originou-se no velho mundo (Europa, Ásia e África).
Fazendo a análise da região de DNA mitocondrial relacionada com o gene da
citocromo oxidase I (COI), Viscarret et al. (2003) analisaram populações de B. tabaci
coletadas em várias culturas estabelecidas em diferentes pontos geográficos de seis
províncias da Argentina e uma colonizando a cultura de tomate na Bolívia. Nesse estudo,
os autores relataram a presença do biótipo B de B. tabaci no país argentino, como também,
apresentaram evidências para novos haplótipos (chamados pelos autores de nativos ou
locais) presentes tanto na Argentina quanto na Bolívia. Além disso, pela análise de
comparação de seqüência gerada pela amplificação da região COI, esses haplótipos
formaram um agrupamento sul-americano filogeneticamente distinto do agrupamento de B.
tabaci presente no Novo Mundo.
Abdullahi et al. (2004) utilizando a técnica de PCR-RFLP conseguiram obter perfis
para a discriminação entre as populações de B. tabaci associadas a infestações em culturas
de mandioca das demais populações desse mesmo inseto que eram capazes de infestar
culturas diferentes da mandioca. A partir da amplificação da região ITS1 seguida da
digestão com enzimas de restrição, os autores obtiveram perfis de digestão que indicaram
que as populações da África associadas à infestação de culturas de mandioca
32
representavam um grupo distinto, com um nível significativo de separação em sub-grupos
não sendo estes sub-grupos ligados a distribuição geográfica. Ainda, nesse mesmo estudo,
utilizando-se o padrão de digestão produzido pela endonuclease SmaI foi possível obter um
perfil para ser usado no monitoramento do biótipo B de B. tabaci ao longo do cinturão
produtor de mandioca africano.
Recentemente, De Barro et al. (2005) compararam as relações filogenéticas entre os
genótipos de B. tabaci utilizando dados de seqüências que foram gerados por ITS1 e COI.
A partir dessas informações, os autores sugerem seis grupos: 1) Ásia; 2) Bali; 3) Austrália;
4) África sub-Sahara; 5) Mediterrâneo/Ásia Menor/África; 6) Novo Mundo. Além desses
grupos, uma grande coleção de genótipos oriundos de regiões da Ásia também foi
identificada. Entretanto, esse grupo não apresentou forte associação com nenhum dos
grupos descritos pelos autores. A partir dessas informações, os autores sugerem um sistema
de identificação para B. tabaci a partir dos seis grupos descritos anteriormente.
Ainda, em 2005, De Barro estudando a coleção de genótipos da região da Ásia-
Pacífico, obtida pela comparação de seqüências das regiões 16S e COI, por meio da análise
de 15 loci de microssatélites demonstrou que aqueles genótipos poderiam ser agrupados
em seis populações genéticas com pouco ou nenhum fluxo gênico entre elas. Além disso,
quatro dessas seis populações genéticas foram ainda divididas em duas subpopulações com
pouca evidência de fluxo gênico. Os dados do autor sugerem uma forte estrutura de
populações com separação geográfica. Entretanto, o autor não descarta a possibilidade de
influência de outros fatores na organização geral e na distribuição dessas populações de
mosca branca.
Das informações obtidas, entende-se que as metodologias de marcadores
moleculares fornecem hoje, valiosos instrumentos para a caracterização de populações
naturais. Esses instrumentos tais como, o estudo da variação de proteínas (isoenzimas) e da
variação do DNA (RAPD) poderão fornecer marcadores específicos para o complexo B.
tabaci. O uso de marcadores moleculares específicos tem como vantagem principal a sua
facilidade de detecção além de permitir o seu uso em associação a estudos de identificação
de biótipos, o estabelecimento de relações filogenéticas entre diferentes espécies ou
populações e a construção de mapas genéticos de interesse econômico. Os marcadores
apresentam muitas vantagens, pois independem do estágio de desenvolvimento do
organismo e não são influenciados pelas condições ambientais (Haymer, 1994). Esses
dados serão de grande importância no monitoramento de populações com genes resistentes
33
à inseticidas, no estudo da dispersão das populações e no controle da entrada de novos
biótipos de mosca branca em regiões agrícolas do Brasil.
Além da distinção entre os biótipos de B. tabaci, as metodologias moleculares são
ferramentas úteis na identificação de outros aleirodídeos considerados pragas de interesse
quarentenário como, por exemplo, a mosca negra dos citros, Aleurocanthus woglumi. A
introdução de novas pragas em áreas isentas pode ocasionar sérios problemas à agricultura
de um país, não apenas sob o ponto de vista econômico, mas também ambiental e social.
Visando minimizar o risco de introdução de novas espécies ou biótipos de organismos
potencialmente nocivos, adotam-se medidas quarentenárias, as quais têm como referência
básica, a lista de pragas quarentenárias para o país.
Por isso, a identificação e o desenvolvimento de marcadores moleculares
específicos para os biótipos de B. tabaci será de grande utilidade para o estabelecimento de
estratégias baseadas em DNA, para o monitoramento destes quando em áreas agrícolas,
auxiliando na interceptação de amostras infestadas por meio de métodos mais eficientes,
precisos e de maior sensibilidade de detecção.
OBJETIVOS
Utilizando-se os marcadores de RAPD no estudo dos biótipos de B. tabaci e outras
espécies de insetos, os objetivos foram:
- Identificar molecularmente as populações de B. tabaci coletadas em várias
culturas;
- Analisar a dispersão das populações de mosca branca no Brasil;
- Caracterizar as populações do biótipo B de B. tabaci coletadas em várias culturas
no Brasil por meio de marcadores RAPD;
- Realizar estudo comparativo do perfil molecular de B. tabaci e outras espécies de
insetos.
34
METODOLOGIA
MANUTENÇÃO DAS POPULAÇÕES DE INSETOS
Adultos de várias populações de B. tabaci, assim como, outros aleirodídeos ou
demais insetos, tanto de importância quarentenária quanto exóticos, enviados pelas DFA’s
(Delegacias Federais de Agricultura), por agricultores, instituições de ensino ou por
empresas agrícolas, foram identificados segundo critérios morfológicos adotados
internacionalmente e mantidos em etanol 70 % a – 20 ° C para posterior análise molecular.
EXTRAÇÃO DE DNA A PARTIR DE B. tabaci e OUTROS ALEIRODÍDEOS
Para a análise por RAPD, o DNA foi obtido macerando-se fêmeas adultas e
individualizadas de cada amostra em 60 μL de tampão de extração (Tris-HCl 10 mM pH 8;
EDTA 1 mM; Triton X-100; proteinase K 60 μg.mL
-1
). O macerado foi incubado por 15
min a 65 °C, seguindo-se fervura durante 10 min. O homogenato final foi armazenado a –
20 °C até o momento do uso.
EXTRAÇÃO DE DNA A PARTIR DE LEPIDÓPTEROS E COLEÓPTEROS
Para os estudos moleculares, o DNA de indivíduos de terceiro ínstar de
lepidópteros e larvas de coleópteros foram extraídas a partir de um método previamente
estabelecido (Queiroz et al., 2004) seguindo-se adaptações dos protocolos de Agusti et al.
(1999) e Monnerat et al. (2004).
Submeteu-se um inseto inteiro à maceração e, a seguir, adicionou-se 500 μL de
tampão de extração (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM, Triton X-100 0,3 % e
Proteinase K 120 μg.mL
-1
), incubando-se por 30 min a 65 ºC. O homogenato foi
centrifugado por 10 min a 10000xg e, o sobrenadante, transferido para um tubo plástico.
Adicionou-se 500 μL de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) e as fases foram
homogeneizadas em vortex por 5 s. O material foi centrifugado por 10 min a 10000xg a
35
10 ºC. A fase aquosa foi então transferida para um novo tubo plástico, repetindo-se a etapa
anteriormente descrita.
O DNA foi precipitado pela adição de 30 μL de NaCl 5 M e 1 mL de etanol
absoluto incubando-se por 2 h a – 20 ºC. Após centrifugação a 10000xg por 10 min a 10
ºC, o DNA precipitado foi lavado duas vezes com 500 μL de etanol 70 %, seco à
temperatura ambiente, ressuspenso em TE 0,1 X (Tris-HCl 1 mM pH 8, EDTA 0,1 mM) e
armazenado a – 20 ºC. Para as análises de RAPD, utilizou-se o DNA diluído dez vezes
(100 ng) em TE 0,1 X.
EXTRAÇÃO DE DNA DE MOSCA NEGRA Aleurocanthus woglumi
Fêmeas individualizadas de A. woglumi foram maceradas e o seu DNA extraído em
100 μL de tampão de extração (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM, Triton X-100 0,3 %
e proteinase K 60 μg.mL
-1
). A seguir, completou-se o volume com 200 μL de tampão de
extração. O macerado foi incubado por 15 min a 65 °C, seguindo-se fervura durante 6 min
e centrifugação a 10000xg por 10 s. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo
plástico e mantido a – 20 °C até o momento do uso.
EXTRAÇÃO DE DNA A PARTIR DE COCCINELÍDEOS
Para a caracterização molecular, amostras individualizadas de coccinelídeos foram
maceradas e o DNA extraído em 100 μL de tampão de extração (Tris-HCl 10 mM pH 8;
EDTA 1 mM; Triton X-100; proteinase K 60 μg.mL
-1
). A seguir, completou-se o volume
com 500 μL de tampão de extração e o macerado foi incubado por 15 min a 65 °C,
seguindo-se fervura durante 6 min e centrifugação a 10000xg por 10 s. O sobrenadante foi
transferido para um novo tubo plástico e mantido a – 20 °C até o momento do uso. Para a
realização das reações de RAPD, adicionou-se 5 μL do sobrenadante em 100 μL de
tampão TE 0,1 X.
36
REAÇÃO DE RAPD
As reações de amplificação foram realizadas em 30 µL de uma mistura contendo
24,9 μL de água milliQ autoclavada, 3,0 μL de tampão 10 X (Tris-HCl 60 mM pH 8,8,
KCl 500 mM e MgCl
2
20 mM, Amersham, CA, USA), 1,2 μL de um primer de seqüência
aleatória (Operon Technologies, Inc.) na concentração de 10 μM (Tabela 1), 0,6 μL de
dNTP 10 mM, 0,3 μL de Taq DNA polimerase na concentração de 1 U.μL
-1
(Amersham,
CA, USA) e 4 μL de DNA (20 ng).
PRIMERS DE RAPD USADOS NAS ANÁLISES MOLECULARES
Para a obtenção dos perfis de marcadores moleculares das populações de insetos
analisadas nesse trabalho, foram utilizados vários primers (Operon Technologies, Inc.)
decaméricos de composição aleatória de nucleotídeos (Tabela 1).
Tabela 1 – Primers de RAPD utilizados na determinação dos perfis
eletroforéticos das diversas populações de insetos submetidas à análise
molecular.
Primer
Seqüência 5’ → 3’
OPA-02 TGCCGAGCTG
OPA–03 AGTCAGCCAC
OPA-04 AATCGGGCTG
OPA–05 AGGGGTCTTG
OPA–10 GTGATCGCAG
OPA–11 CAATCGCCGT
OPA–13 CAGCACCCAC
OPA–15 TTCCGAACCC
OPA-17 GACCGCTTGT
OPA–20 GTTGCGATCC
OPR–06 GTCTACGGCA
OPR-07 ACTGGCCTGA
37
CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO DE DNA GENÔMICO
As amplificações foram efetuadas em termociclador (PTC-100 MJ Research)
contendo uma etapa inicial de desnaturação de 3 min a 94 °C, programado para 45 ciclos
de desnaturação de 1 min a 93 °C, anelamento por 1 min a 35 °C e extensão por 2 min a 72
°C e uma etapa final de extensão de 5 min a 72 °C.
PROCEDIMENTO PADRÃO PARA A IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE INSETOS
Foi realizada com a padronização utilizando-se os primers OPA-04, OPA-10,
OPA-11 e OPA-13 para a identificação molecular dos biótipos de mosca branca, demais
aleirodídeos e insetos quarentenários, recebidos de várias localidades do país e
armazenados na coleção biológica de referência de insetos e ácaros da Estação
Quarentenária de Germoplasma Vegetal da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia,
uma vez que, aqueles primers foram os que apresentaram variação nos perfis de
fragmentos de DNA entre as populações de insetos analisados (Lima et al., 2000). Este
procedimento foi utilizado como triagem para a identificação dos biótipos de B. tabaci e
outros insetos antes de cada experimento.
VARIAÇÃO MOLECULAR UTILIZANDO MARCADORES RAPD
As análises de variabilidade genética utilizando RAPD foram realizadas em
diferentes parâmetros, tais como, cultura, região geográfica, espécies e biótipos. Nesse
sentido, foram feitas comparações com populações de B. tabaci de outros países, com
populações de diferentes localidades dentro do Brasil e com populações de diferentes
culturas dentro do Distrito Federal.
A) ANÁLISE DE POPULAÇÕES DE MOSCAS BRANCAS EM CULTURA DE
MANDIOCA
O perfil de RAPD em populações de aleirodídeos ocorrendo em culturas de
mandioca do Brasil e do Paraguai (Tabela 2) foi obtido a partir de cinco indivíduos
38
coletados aleatoriamente e analisados com os primers OPA-02, OPA-04, OPA-10, OPA-11
e OPA-13.
Tabela 2 – Populações de mosca branca ocorrendo em culturas
de mandioca no Brasil e Paraguai, utilizadas nos estudos de
identificação e caracterização moleculares.
Código Localidade Cultura
54 Magé - RJ Mandioca
101 Paraguai Mandioca
127 Paraguai Mandioca
128 Paraguai Mandioca
130 Paraguai Mandioca
186 Magé - RJ Mandioca
187 Porto Real - RJ Mandioca
212 Cajazeiras - CE Melão
226 Brasília - DF Algodão
228 Feira de Santana - BA Mandioca
229 Coração de Maria - BA Mandioca
230 Conceição do Jacuípe - BA Mandioca
235 Ivinhema - MS Quiabo
236 Deadópolis - MS Mandioca
237 Deadópolis - MS Mandioca
238 Ivinhema - MS Mandioca
249 Tibau - RN Mandioca
250 Santo Amaro - BA Mandioca
251 Santo Amaro - BA Mandioca
252 Governador Mangabeira - BA Mandioca
253 Governador Mangabeira - BA Mandioca
254 Cruz das Almas - BA Mandioca
255 João Pinheiro - MG Mandioca
B) ANÁLISE DE POPULAÇÕES DE MOSCA BRANCA EM DIFERENTES
CULTURAS NO BRASIL
Para as análises de variabilidade genética foram utilizados cinco indivíduos
pertencentes a populações de B. tabaci que foram coletadas em culturas dos Estados
Unidos, como também, em culturas estabelecidas em várias localidades do Brasil (Tabela
3), com os primers OPA-02, OPA-03, OPA-05, OPA-10, OPA-11, OPA-13, OPA-15,
OPA-20, OPR-06 e OPR-07.
39
Tabela 3 – Populações de B. tabaci coletadas em várias regiões do Brasil e
utilizadas nos estudos de variabilidade genética.
Região Código Procedência Cultura
61 Riverside – CA - USA Melão
62 Riverside – CA - USA Melão
23 Janaúba - MG Algodão
60 Recife - PE Malva
81 Campo Grande - MS Leguminosa Forrageira
106 Miguelópolis - SP Soja
119 Limoeiro do Norte - CE Feijão
179 Tibau - RN Tomate
194 Cambucí - RJ Pepino
Análise 1
Cento-Oeste
Nordeste
Sudeste
USA
226 Brasília - DF Algodão
8 Aracati - CE Melão
15 Boa Vista - RR Melão
138 Viçosa - MG Soja
151 Campos de Goytacazes - RJ Couve
158.5 Recife - PE Couve
168 Buritis - GO Feijão
184 Park Branco - RN Melão
222 Juazeiro - BA Melancia
233.1 Mogi Mirim - SP Algodão
Análise 2
Cento-Oeste
Nordeste
Sudeste
Norte
240 Itiquira - MT Algodão
X Cultura não especificada.
C) MONITORAMENTO DE POPULAÇÕES DE MOSCA BRANCA NO DISTRITO
FEDERAL EM DIFERENTES CULTURAS
Nos estudos de monitoramento para a verificação da presença das populações do
biótipo B de B. tabaci, utilizaram-se fêmeas adultas coletadas nas mesmas localidades do
Distrito Federal nos anos de 2000 e 2001, ocorrendo em culturas de berinjela, tomate,
pepino, abóbora e feijão, mantidas tanto em campo quanto em casa de vegetação.
A seguir, para a análise da dinâmica da variabilidade genética daquelas populações
coletadas nos anos de 2000 e 2001, foram usadas como padrão de comparação outras
populações de B. tabaci biótipo B coletadas em várias culturas no Brasil em 1999
(Tabela 4).
40
Nas análises de RAPD de ambas as estratégias empregaram-se os primers OPA-04,
OPA-10, OPA-11, OPA-13 e OPA-15 utilizando-se cinco indivíduos de cada amostra.
Tabela 4 – Populações de B. tabaci coletadas no Distrito Federal nos anos de
2000 e 2001 e em outras regiões do Brasil no ano de 1999.
Região (Ano) Código Localidade Cultura
226
1
Cenargen - DF Algodão
249
2
Tibau - RN Mandioca
64
3
Mançuba - BA Abóbora
75
3
Goiânia - GO Pepino
116
3
Limoeiro do Norte - CE Feijão
126
3
Jaboticabal - SP Berinjela
BRASIL
1999
220
3
Juazeiro - BA Tomate
226
1
Cenargen - DF Algodão
249
2
Tibau - RN Mandioca
263
3
Planaltina - DF Berinjela
264
3
Planaltina - DF Tomate
265
3
Planaltina - DF Pepino
266
3
Planaltina - DF Abóbora
288
4
Cenargen - DF Tomate
289
4
Cenargen - DF Abóbora
Distrito
Federal 2000
290
4
Cenargen - DF Feijão
226
1
Cenargen - DF Algodão
249
2
Tibau - RN Mandioca
02
4
Cenargen - DF Tomate
03
4
Cenargen - DF Abóbora
04
4
Cenargen - DF Feijão
18
3
Planaltina - DF Tomate
19
3
Planaltina - DF Pepino
Distrito
Federal 2001
20
3
Planaltina - DF Berinjela
1 Biótipo BR de Bemisia tabaci usado como padrão;
2 Biótipo B de Bemisia tabaci usado como padrão;
3 Populações coletadas em campo;
4 Populações coletadas em culturas mantidas em casa de vegetação na Embrapa –
Recursos Genéticos e biotecnologia.
41
D) ANÁLISE MOLECULAR ENTRE OS BIÓTIPOS DE B. tabaci
Realizaram-se várias reações de amplificação com os primers OPA-04, OPA-10,
OPA-11, OPA-13 e OPA-15 para a determinação dos perfis de marcadores de RAPD que
sejam específicos para a distinção entre os biótipos de B. tabaci (Tabela 5).
Tabela 5 – Biótipos de Bemisia tabaci usados nos estudos de determinação de perfis de
marcadores moleculares de RAPD.
Código Localidade Cultura Biótipo de B. tabaci
7 Marrocos Pepino Q
8 Nigéria Mandioca Cassava
14 Espanha Tomate Q
NI Várzea Grande - MT Algodão NI
61 Riverside – CA - USA Melão B
62 Riverside – CA - USA Melão A
140 Carolina - MA Soja B
184 Park Branco - RN Melão B
226
Embrapa – Recursos Genéticos e
Biotecnologia - DF
Algodão BR
288
Embrapa – Recursos Genéticos e
Biotecnologia - DF
Tomate B
NI Amostra não identificada;
X Cultura não especificada.
E) ANÁLISE E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE POPULAÇÕES DE
ALEIRODÍDEOS
Para a caracterização molecular, cinco indivíduos coletados a partir de várias
populações de aleirodídeos (Tabela 6) foram comparados por meio dos seus padrões de
marcadores moleculares de RAPD com a mosca branca B. tabaci, biótipos B e BR usando-
se os primers OPA-02, OPA-03, OPA-04, OPA-05, OPA-10, OPA-11, OPA-13, OPA-15,
OPA-17 OPA-20 e OPR-06, para a determinação de possíveis bandas de DNA com
potencial para a identificação dessas diferentes espécies de aleirodídieos.
42
Tabela 6 – Populações de aleirodídeos utilizados nas determinações dos perfis de
marcadores de RAPD para a identificação molecular.
Código Procedência Cultura Identificação
34 Rondonópolis – MT Tomate e Almeirão B. tabaci biótipo BR
236 Deadópolis – MS Mandioca B. tuberculata
255 Embrapa Cerrado - DF Mandioca Aleurothrixus aepim
261 Floriano – PI Caju Aleurodicus cocois
264 Planaltina – DF Tomate B. tabaci biótipo B
278 Flórida – USA Citros Aleurocanthus woglumi
279 Texas – USA Citros A. woglumi
282
Embrapa Recursos Genéticos
e Biotecnologia – DF
Fumo Trialeurodes vaporariorum
F) ANÁLISE COMPARATIVA ENTRE B. tabaci E OUTRAS ESPÉCIES DE INSETOS
DE INTERESSE AGRONÔMICO
Indivíduos de várias espécies de insetos de interesse agrícola (Tabela 7) foram
comparados por meio dos seus padrões de marcadores moleculares de RAPD com a mosca
branca B. tabaci, biótipo B usando-se os primers OPA-04, OPA-07, OPA-10, OPA-11 e
OPA-13. Em função dos resultados foi possível a determinação de possíveis bandas de
DNA com potencial para a clonagem e desenvolvimento de marcadores a serem utilizados
na identificação do biótipo B de B. tabaci.
43
Tabela 7 – Populações de insetos utilizadas nas determinações dos perfis de marcadores de
RAPD.
Procedência Cultura Identificação
Mossoró – RN Melão B. tabaci biótipo B
Texas – USA Citros A. woglumi
Embrapa –
Recursos Genéticos e biotecnologia
X Trichogramma
Embrapa –
Recursos Genéticos e biotecnologia
X A. grandis
Embrapa –
Recursos Genéticos e biotecnologia
X S. frugiperda
Embrapa –
Recursos Genéticos e biotecnologia
X A. gemmatalis
Embrapa –
Recursos Genéticos e biotecnologia
X Nephaspis gemini
X Indica a manutenção em criação sob condições controladas (dieta, fotoperíodo e umidade).
ANÁLISE POR ELETROFORESE DOS FRAGMENTOS DE DNA GERADOS POR
RAPD
Os produtos de amplificação originários das reações de RAPD foram separados em
gel de agarose 1,5 % submerso em tampão TBE 1X (Tris-borato 90 mM e EDTA 1 mM)
durante 3 h a 160 V. Ao término da corrida, os géis foram corados por 30 min em uma
solução corante contendo brometo de etídio (5 μg.mL
-1
), descorados por 30 min em água
destilada e fotografado sob luz ultravioleta no comprimento de onda de 300 nm. A
documentação fotográfica foi feita usando-se o sistema EagleEye II still video system™
(Stratagene).
Em todos os géis, marcadores de massa molecular (100 bp Ladder -
INVITROGEN) foram usados para a determinação da massa molecular dos fragmentos
amplificados pela técnica de RAPD.
44
ANÁLISE DOS DADOS
As fotos das amplificações realizadas com os primers selecionados foram usadas
para a análise do polimorfismo entre os indivíduos da população. As bandas presentes nos
géis foram consideradas como marcadores RAPD. Foi gerada então uma matriz de
similaridade levando-se em consideração as relações entre indivíduos, primers e massas
moleculares das bandas obtidas com um dado primer. Utilizou-se o valor 1 para a presença
de um marcador e 0 para a ausência. No caso de dúvida o número 9 foi usado como
padrão. A seguir, a planilha obtida foi submetida a um programa de análise estatística
multivariada para a determinação das distâncias genéticas entre os indivíduos. A matriz de
similaridade foi obtida por meio do coeficiente de Jaccard (Sneath e Sokal, 1973) e que,
por meio da análise por UPGMA (unweighted pair-group method analysis), produziu-se
um dendrograma que evidenciou o agrupamento dos indivíduos, utilizando-se o programa
NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) versão 2.02 pc
(Rholf, 1993).
A seguir, os valores obtidos e tabelados em uma planilha foram submetidos à
análise de variância molecular (AMOVA) para a determinação estatística das possíveis
origens das variabilidades encontradas nas populações pela aplicação de algoritmos
específicos pelo programa Arlequin ver. 2000 (Schneider et al., 2000).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR
As amostras de insetos coletadas em várias culturas de diversas localidades foram
recebidas e mantidas na coleção biológica de referência de insetos da Estação
Quarentenária de Germoplasma Vegetal da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
e, posteriormente, tiveram os seus perfis moleculares estabelecidos para identificação com
o primer OPA-13. Os padrões de bandas produzidos por cinco indivíduos de cada
população a ser identificada foram comparados com padrões de mosca branca B. tabaci
previamente determinadas como sendo biótipo B ou BR (Figura 1).
45
B
B
260 262.1 262.2 262.3
B. tabaci B
B
B
280 281 282 283
M
46
M
B. tabaci B B. tabaci B
T.vaporariorum
Figura 1 – Identificação de populações de mosca branca coletadas em culturas de várias
localidades por meio de perfis de fragmentos de DNA obtidos com o primer OPA-13. A
letra M indica o marcador 100 pb ladder (Gibco); As letras B e BR correspondem aos
biótipos de B. tabaci usados como padrão de identificação. A barra indica os indivíduos
analisados em cada amostra e, o número, o processo da amostra na coleção biológica de
referência de insetos.
Das amostras analisadas no ano de 2000, 29 foram identificadas como sendo o
biótipo B de B. tabaci, uma foi identificada como Aleurodicus cocois e duas como
Trialeurodes vaporariorum. Amostras de mosca negra (Aleurocanthus woglumi),
provenientes dos EUA, tiveram o seu padrão de bandas determinado para fazer parte do
acervo de identificação do banco de mosca branca. Além disso, uma amostra coletada em
feijão proveniente de Chapecó - SC apresentou um perfil de bandeamento não
correspondente àqueles pertencentes ao banco de marcadores moleculares de insetos de
interesse quarentenário (Tabela 8).
Tabela 8 – Identificação molecular das amostras recebidas no ano de 2000.
Código Localidade Cultura Identificação
226
1
Vitrine Cenargen - DF Algodão Bemisia tabaci BR
249
2
Tibau - RN Mandioca Bemisia tabaci B
260 Lavras - MG Brócolis B. tabaci B
261 Floriano - PI Cajú
Aleurodicus cocois
262.1 Baraúna - RN Melão B. tabaci B
262.2 Baraúna - RN Melão B. tabaci B
262.3 Baraúna - RN Melão B. tabaci B
262.4 Baraúna - RN Melão B. tabaci B
263 Planaltina - DF Berinjela B. tabaci B
264 Planaltina - DF Tomate B. tabaci B
265 Planaltina - DF Pepino B. tabaci B
266 Planaltina - DF Abóbora B. tabaci B
267 Petrolina - PE Tomate/Plantas invasoras B. tabaci B
268.1 Nova Porteirinha - MG Batata B. tabaci B
268.2 Nova Porteirinha - MG Tomate B. tabaci B
269 Mossoró - RN Melão B. tabaci B
270 Mossoró - RN Melão B. tabaci B
271 Mossoró - RN Melão B. tabaci B
272 Mossoró - RN Melão B. tabaci B
273 Mossoró - RN Melão B. tabaci B
274 Mossoró - RN Melão B. tabaci B
275 Mossoró - RN Melão B. tabaci B
276 Mossoró - RN Melão B. tabaci B
277 Mossoró - RN Melão B. tabaci B
280 Lavras - MG Pepino B. tabaci B
281 Águas Mornas - SC Abobrinha/Pepino
Trialeurodes vaporariorum
282 Cenargen - DF Fumo T. vaporariorum
283 Pau Branco - RN Melão B. tabaci B
284 Cajazeiras - CE Melão B. tabaci B
285 Mossoró - RN Melão B. tabaci B
286 Baraúna - RN Melão B. tabaci B
287 Chapecó - SC Feijão NI
288 Cenargen - DF Tomate B. tabaci B
289 Cenargen - DF Abóbora B. tabaci B
290 Cenargen - DF Feijão B. tabaci B
1 Biótipo BR de Bemisia tabaci usado como padrão;
2 Biótipo B de Bemisia tabaci usado como padrão;
NI Amostra ainda não identificada.
A mesma estratégia utilizada para a identificação de amostras de mosca branca no
ano de 2000 foi aplicada para a análise molecular dos indivíduos recebidos no ano de 2001,
onde observou-se a predominância de amostras contendo indivíduos pertencentes ao
biótipo B de B. tabaci (Tabela 9).
47
Tabela 9 – Identificação molecular das amostras recebidas no ano de 2001.
Localidade Cultura Identificação
Jaboticabal - SP Feijão NI
Cenargen - DF Tomate Bemisia tabaci B
Cenargen - DF Abóbora B. tabaci B
Cenargen - DF Feijão B. tabaci B
Sinop - MT Soja/Algodão/Erva daninha NI
Várzea Grande - MT Algodão NI
Várzea Grande - MT Erva Daninha NI
Várzea Grande - MT Algodão NI
Várzea Grande - MT Algodão NI
Várzea Grande - MT Soja NI
Pau Branco - RN Feijão B. tabaci B
Pau Branco - RN Tomate B. tabaci B
Pau Branco – RN Mandioca B. tabaci B
Cajazeiras - PB Melão B. tabaci B
Cajazeiras - PB Melão B. tabaci B
Mossoró - RN Melão B. tabaci B
Mossoró - RN Melão B. tabaci B
Mossoró - RN Melão B. tabaci B
Mossoró - RN Melão B. tabaci B
Mossoró - RN Melão B. tabaci B
Mossoró - RN Melão B. tabaci B
Mossoró - RN Melão B. tabaci B
Mossoró - RN Melão B. tabaci B
Planaltina - DF Tomate B. tabaci B
Planaltina - DF Pepino B. tabaci B
Planaltina - DF Berinjela B. tabaci B
Mossoró - RN Melão B. tabaci B
Mossoró - RN Melão B. tabaci B
Mossoró - RN Melão B. tabaci B
Baraúna - RN Melão B. tabaci B
Tibau - RN Melão B. tabaci B
Toca da Raposa - RN Melão B. tabaci B
PADF - DF Couve verde B. tabaci B
PADF - DF Couve manteiga B. tabaci B
PADF - DF Couve verde NI
PADF - DF Couve verde NI
Tibau - RN Melão B. tabaci B
Baraúna - RN Melão B. tabaci B
NI Amostra ainda não identificada.
Além disso, duas amostras enviadas da Espanha e de Marrocos, contendo o biótipo
Q de B. tabaci, tiveram os seus padrões de bandeamento determinados para fazer parte dos
perfis eletroforéticos do banco de aleirodídeos. O mesmo foi feito com uma amostra
proveniente da Nigéria contendo o biótipo cassava de B. tabaci (Figura 2).
48
M 61 62 226
288 8 7 14
184 140
M
6-
B. tabaci B. tabaci B. tabaci B. tabaci B. tabaci
B. tabaci B. tabaci
B. tabaci
Q
B. tabaci
Não
Identifica
Figura 2 – Padrões de bandas obtidos de amplificação com o primer OPA-10 dos biótipos
de mosca branca. A letra M indica o marcador 100 pb ladder (Gibco). O número e a barra
indicam o código no banco de aleirodídeos e o número de indivíduos analisados.
Ao longo da identificação molecular, as amostras originárias de duas localidades de
Mato Grosso apresentaram um padrão molecular não relacionado com os biótipos de B.
tabaci ou qualquer outro aleirodídeo cujo perfil tenha sido anteriormente determinado. Em
futuros surtos populacionais em Mato Grosso, amostras poderão ser coletadas nas mesmas
localidades e culturas, para um estudo mais detalhado para a averiguação dessa possível
variabilidade entre os aleirodídeos em estudo.
Dos resultados obtidos a partir da identificação das amostras provenientes das
várias localidades do Brasil, pode-se observar que o biótipo B de B. tabaci apresenta-se
disperso na maioria dos estados do Brasil. As exceções ficam com os estados do
Amazonas, Acre, Amapá, Paraná e Sergipe (Figura 3).
49
Figura 3 – Distribuição das populações de B. tabaci nas diversas unidades da federação. Os
pontos indicam a procedência das amostras que foram identificadas por metodologia
molecular de RAPD.
Resultados anteriores de identificação, descritos por Lima et al. (1999), têm
demonstrado que o biótipo BR pode estar presente em alguns estados, tais como, Mato
Grosso, Minas Gerais, Rio de Janeiro, Goiás e Distrito Federal. Nas regiões de Baraúna
(RN), Mossoró (RN), Pau Branco (RN) e Tibau (RN), por exemplo, o biótipo B de B.
tabaci é o predominante. Esses resultados indicam uma dispersão do biótipo B de B. tabaci
nas diferentes localidades do Brasil. Além disso, percebe-se que não existe uma
preferência por cultura predada, indicando a extrema adaptabilidade dessa praga a
diferentes condições nutricionais.
Wool et al. (1994) usando padrões de esterase foram capazes de diferenciar as
espécies B. tabaci e B. tuberculata em função dos seus perfis eletroforéticos a partir de
amostras coletadas em várias localidades da Colômbia. Por esse estudo, os autores
50
observaram sutis diferenças sugerindo, então, uma diferenciação genética em função da
distribuição geográfica dessas populações. Além disso, analisando-se apenas as populações
de B. tabaci, os autores observaram variações nas freqüências de esterase associadas com
as localidades de coleta. Além disso, em algumas dessas localidades foram descritas a
aplicação de inseticidas. Esse último fato pode ser responsável por variações fisiológicas
no inseto terminando por influenciar nos padrões de esterase, uma vez que, esse marcador
bioquímico sofre influência de fatores ambientais. Dessa forma, surge a necessidade de se
utilizar uma estratégia complementar para a confirmação dessas informações.
Em 1993, Gawel e Bartlett utilizaram a técnica de RAPD para o estudo de B.
tabaci. Utilizando vinte primers de RAPD, os autores distinguiram dois biótipos de
ocorrência nas culturas dos Estados Unidos: os biótipos A e B. Em função desses
resultados, os autores apontam para a aplicação do RAPD na diferenciação de biótipos de
B. tabaci que apresentem semelhança morfológica e proximidade genética.
Sendo assim, os perfis moleculares de RAPD obtidos nesse estudo confirmaram as
descrições estabelecidas anteriormente por Lima et al. (1999), expandindo-se a
possibilidade de uso desses marcadores para a distinção entre os biótipos de B. tabaci e
para o monitoramento da dispersão de populações específicas de um determinado biótipo
de mosca branca.
Além disso, De Barro & Driver (1997) sugerem que a técnica de RAPD é adequada
para a análise de insetos pois permite utilizar amostras frescas ou conservadas em álcool
para a identificação dos biótipos de B. tabaci e outros aleirodídeos. Desta forma, uma
estratégia molecular pôde ser estabelecida para atender a necessidade de se detectar a
presença do biótipo B nas culturas do Brasil a partir de amostras armazenadas em álcool
com relativa rapidez e com precisão para o estabelecimento de laudos de interesse
quarentenário.
ESTUDOS MOLECULARES DE MOSCA BRANCA EM MANDIOCA
A partir do estabelecimento de uma estratégia de identificação molecular por
RAPD, cinco indivíduos das populações de mosca branca, coletadas em culturas de
mandioca do Brasil e do Paraguai, foram usados para a determinação do perfil de
51
fragmentos de DNA com o primer OPA-13, onde observou-se a presença de diferentes
populações de mosca branca (Tabela 10).
Tabela 10 – Identificação por meio de três primers de RAPD de populações de mosca
branca coletadas em culturas de mandioca, provenientes do Brasil e do Paraguai, a serem
utilizadas nos estudos de caracterização molecular.
Código Origem Cultura Identificação
54 Magé – RJ Mandioca NI
101 Paraguai Mandioca B. tabaci B
127 Paraguai Mandioca B. tabaci B
128 Paraguai Mandioca B. tabaci B
130 Paraguai Mandioca NI
186 Magé – RJ Mandioca NI
187 Porto Real – RJ Mandioca NI
2121 Cajazeiras – CE Melão B. tabaci B
2262 Brasília – DF Algodão B. tabaci BR
228 Feira de Santana – BA Mandioca
Aleurothrixus aepim
229 Coração de Maria – BA Mandioca
A. aepim
230 Conceição do Jacuípe – BA Mandioca
A. aepim
2353 Ivinhema – MS Quiabo
B. tuberculata
236 Deadópolis – MS Mandioca
B. tuberculata
237 Deadópolis – MS Mandioca
B. tuberculata
238 Ivinhema – MS Mandioca
B. tuberculata
249 Tibau – RN Mandioca
B. tabaci B
250 Santo Amaro – BA Mandioca
A. aepim
251 Santo Amaro – BA Mandioca
A. aepim
252 Governador Mangabeira – BA Mandioca
A. aepim
253 Governador Mangabeira – BA Mandioca
A. aepim
254 Cruz das Almas – BA Mandioca
A. aepim
255 João Pinheiro – MG Mandioca
A. aepim
1 Biótipo B de B. tabaci usado como padrão de comparação;
2 Biótipo BR de B. tabaci usado como padrão de comparação;
3 Amostra padrão de comparação de B. tuberculata;
NI Amostra não identificada.
A análise molecular permitiu identificar a presença de B. tuberculata, B. tabaci
biótipo B e Aleurothrixus aepim nas culturas de mandioca, assim como, outros biótipos
ainda não identificados (Figura 4).
52
53
B. tuberculata B. tabaci
M
M
A. aepim
B. tabaci
M
M
235
249
128
250
Figura 4 – Comparação de perfis de fragmentos de DNA de mosca branca obtidos a partir
de amplificações com os primers OPA-04 e OPA-11. A letra M indica o marcador
molecular 100 pb ladder (GIBCO). A barra indica o número de indivíduos analisados em
cada população.
Usando esses primers foi possível identificar, molecularmente, as populações de B.
tabaci biótipo B, B. tuberculata e Aleurothrixus aepim. Dos resultados obtidos, o que
apresentou maior preocupação foi a detecção do biótipo B de B. tabaci em culturas de
mandioca na região de Tibau (RN). Este inseto é o vetor do vírus ACMV (African Cassava
Mosaic Vírus ou, vírus do mosaico africano da mandioca), causador de sérios prejuízos nas
culturas de mandioca em vários países africanos.
Uma vez identificadas as amostras de mosca branca, estas foram analisadas pela
técnica de RAPD com os primers OPA-02, OPA-04, OPA-10, OPA-11 e OPA-13 para a
determinação das relações filogenéticas entre estas populações (Figura 5).
Não Identificada
Aleurothrixus aepim
Aleurothrixus aepim
Não Identificada
Bemisia tabaci B
Bemisia tabaci B
Bemisia tuberculata
Bemisia tabaci B
Não Identificada
Bemisia tabaci BR
Mandioca RJ
Mandioca BA
Mandioca BA
Mandioca BA
Mandioca BA
Melão CE
Mandioca
Paraguai
Quiabo MS
Mandioca BA
Mandioca RN
Mandioca
Para
D
F
A
E
G
B
g
uai
Algodão DF
C
Figura 5 – Análise de agrupamento de populações de aleirodídeos coletadas em culturas de
mandioca do Brasil e do Paraguai. Os códigos representam: CS54, CS186 e CS187,
amostras coletadas em mandioca (RJ); CS101, CS127, CS128 e CS130, mandioca
(Paraguai); CS212, melão (CE); CS226, algodão (DF); CS228, CS229, CS230, CS250,
CS251, CS252, CS253 e CS254, mandioca (BA); CS235, quiabo (MS); CS236, CS237 e
CS238, mandioca (MS); CS249, mandioca (RN); e CS255, mandioca (MG).
54
Por meio da análise molecular observou-se a distribuição das populações de
aleirodídeos em três agrupamentos principais. No agrupamento A foram encontradas todas
as populações de A. aepim e uma população de B. tabaci. A partir da análise do
dendrograma observou-se que A. aepim formou um agrupamento distinto de B. tuberculata
e B. tabaci biótipo B (agrupamento B), apresentando similaridade em torno de 12 % em
relação a essas espécies. Para A. aepim, foram identificadas duas divisões (D e E) que
apresentaram em torno de 32 % de similaridade genética. A divisão D foi constituída pelas
populações coletadas em 3 localidades distintas do estado da Bahia: Conceição do Jacuípe,
Coração de Maria e Feira de Santana. A divisão E ficou composta por duas subdivisões (F
e G) apresentando 57 % de similaridade entre si. A divisão F ficou composta por amostras
de mosca branca coletadas em duas localidades da Bahia: Governador Mangabeira e Santo
Amaro. A sub-divisão G ficou composta por duas populações coletadas em áreas distintas
(BA e MG), apresentando 85 % de similaridade genética. Dentro do agrupamento A
também foi identificada uma população de B. tabaci coletada em melão no Ceará. Essa
amostra apresentou 15 % de similaridade em relação às populações de A. aepim.
No agrupamento B foram identificadas todas as populações de B. tabaci coletadas
em mandioca no Paraguai, todas as populações de B. tuberculata do Brasil (MS e BA) e
uma população de B. tabaci do Brasil. Nesse grupo, um resultado interessante observado
foi que as populações de B. tuberculata do Brasil e B. tabaci biótipo B originárias do
Paraguai apresentaram similaridade em torno de 31 %, formando um agrupamento único.
Já as populações de B. tabaci biótipo B coletadas em culturas de mandioca na região de
Tibau (RN) apresentaram menor grau de similaridade (em torno de 17 %) com as
populações de B. tuberculata coletadas no Brasil e com as populações de B. tabaci do
Paraguai.
O biótipo BR de B. tabaci apresentou baixa similaridade (10 %) em relação às
demais populações analisadas neste estudo, formando um agrupamento distinto
(agrupamento C).
A análise do dendrograma permitiu identificar que duas amostras de populações
coletadas em culturas de mandioca nos estados do Rio de Janeiro e Bahia e uma originária
do Paraguai formaram clados distintos nos agrupamentos A e C. Esse resultado reflete com
o observado para a análise por RAPD, cujo padrão de bandas dessas populações não
permitiu uma identificação por método molecular.
55
Nesse estudo, ressalta-se a variabilidade das populações de B. tabaci, uma vez que,
estas apresentaram ampla distribuição, sendo identificadas nos três agrupamentos formados
no dendrograma.
A partir das informações geradas pelos perfis eletroforéticos de RAPD pelas várias
populações de aleirodídeos, os dados binários dessas amostras foram utilizados em uma
análise de variância molecular (AMOVA) para a determinação das fontes de variabilidade
genética que foram identificadas no dendrograma. Dos resultados obtidos, observou-se que
90,25 % da fonte de variação era originária de variações entre os grupos analisados e que,
9,75 % da variação era proveniente de dentro das populações. Esses dados indicam uma
elevada fonte de variabilidade genética para cada espécie de aleirodídeo analisada nesse
estudo. Além disso, as amostras de B. tabaci biótipo B coletadas em culturas de melão no
Ceará e em mandioca no Rio Grande do Norte, formaram um agrupamento distinto dos
demais indivíduos do mesmo biótipo, sugerindo uma possível preferência pela cultura
dentro de um mesmo biótipo.
A mosca branca (B. tabaci) biótipo B é o principal vetor do vírus do mosaico
africano da mandioca (ACMV), responsável por enormes prejuízos na cultura de mandioca
no continente africano, causando uma redução de 50 % na produção de mandioca (Fauquet
& Fargette, 1990), com prejuízos superiores a 2 bilhões de dólares (Basu, 1995). Em uma
revisão analisando a disseminação do vírus ACMV e B. tabaci no continente africano,
Legg (1999) indica que a disseminação do vírus do mosaico da mandioca ocorre de duas
formas: 1) por meio das manivas infectadas pelo vírus ou; 2) pela mosca branca, B. tabaci
atuando como vetor. Estudos têm demonstrado que B. tabaci é o único vetor do ACMV
(African Cassava Mosaic Vírus – Vírus do Mosaico Africano da Mandioca). Ainda, alguns
estudos têm relatado a eficiência de transmissão do vírus por esse aleirodídeo. Esses
valores variam de 0,15 % a 1,7 %, mas podem chegar até a 13 %. O autor da revisão ainda
sugere que o fator chave da epidemiologia observada nos países africanos se deve à
mobilidade da mosca branca pois, em determinadas circunstâncias, este inseto pode se
deslocar até 7 km do seu ponto original. Ainda, nessa mesma revisão, o autor relaciona que
um dos fatores responsáveis pela epidemia desse vírus é o aumento da densidade
populacional de B. tabaci. Após um levantamento sobre os dados de epidemia do ACMV
em alguns países africanos, concluiu-se que a incidência do vírus estava relacionada com o
aumento populacional da mosca branca. Isso foi comprovado em experimentos em
Uganda, onde observou-se que entre os anos de 1992 e 1998, a população de B. tabaci
aumentou 15 vezes.
56
Em função dessas informações, Maruthi et al. (2001) fizeram um estudo para
determinar se a disseminação do ACMV estava associada a um novo biótipo de B. tabaci.
Para essas determinações foram realizados testes de compatibilidade reprodutiva,
fecundidade, desenvolvimento de ninfa e RAPD com 26 primers. Dos 26 primers
utilizados, seis primers indicaram que uma considerável variação era observada entre os
indivíduos de uma mesma população. Fazendo-se a análise por UPGMA, a partir do
polimorfismo de bandas produzido por cinco indivíduos de uma mesma população
coletada em áreas de epidemia do ACMV, como também, de áreas livres do vírus, o
dendrograma gerado produziu um único e grande grupo, não havendo distinção entre as
populações coletadas em culturas de mandioca em áreas de epidemia ou não do vírus
ACMV. Os graus de similaridade entre os sub-grupos formados dentro do grupo principal
variaram de 78 % a 89 %. Um resultado interessante apontado também pelos autores nesse
trabalho foi a distinção entre as populações de B. tabaci coletadas na Índia em culturas de
algodão e mandioca. Pelo dendrograma, essas duas populações se segregaram à parte do
grupo principal, apresentando 45 % de similaridade genética. Além disso, Essas duas
populações coletadas na Índia formaram dois agrupamentos distintos, com similaridade
genética de 82 %. Esses resultados estão de acordo com aqueles obtidos na análise das
populações de B. tabaci e outros aleirodídeos desse estudo.
Em 2003, Abdullahi et al. analisaram populações de B. tabaci coletadas em
mandioca na África e em outras culturas distribuídas ao redor do mundo pelas técnicas de
RAPD e ITS. Os resultados de RAPD indicaram a formação de dois agrupamentos no
dendrograma com a clara separação das populações de B. tabaci infectando culturas de
mandioca. A análise de AMOVA indicou que 63,2 % da variação total era atribuída a
diferenças entre as populações, 27,1 % era devida a variações em função da cultura
predada e 9,8 % era em função de variações dentro das populações. Os autores fazendo a
análise da região de ITS1 observaram que as populações de B. tabaci infectado a cultura de
mandioca eram diferentes das demais populações e específicas em colonizar aquela
cultura.
Abdullahi et al. (2004) utilizaram a técnica de PCR-RFLP a partir da região ITS1
de B. tabaci para obter perfis para a distinção entre as populações de mosca branca de
ocorrência em mandioca e as populações de ocorrência em outras culturas. A partir da
análise dos perfis de restrição da região ITS1, os autores sugerem que as populações de B.
tabaci associadas a culturas de mandioca da África representam um grupo distinto, com
um significativo nível de separação em sub-grupos e que estes não estavam ligados a
57
distribuição geográfica. A análise de variância molecular (AMOVA) revelou que a
variação genética total de 47 % era atribuída a diferenças entre populações dentro dos
grupos associados ao seu hospedeiro. Utilizando-se a enzima de restrição SmaI, os autores
obtiveram um perfil de restrição para a identificação e monitoramento do biótipo B de B.
tabaci ocorrendo em culturas de mandioca.
A partir dos dados observados nesse estudo e com a literatura disponível surge a
necessidade de se estabelecer estratégias quarentenárias para evitar a entrada do vírus
ACMV (African Cassava Mosaic Vírus - Vírus do Mosaico Africano da Mandioca), uma
vez que, o aparecimento e o estabelecimento de populações de mosca-branca em áreas
produtoras tem ocorrido em virtude do trânsito de manivas de mandioca. Recentemente,
esse vírus foi detectado no Brasil em manivas de mandioca, provenientes de Angola. Além
disso, foi encontrado nesse estudo o biótipo B de B. tabaci em cultura de mandioca no
Brasil. Dessa forma, ressalta-se a necessidade de maiores estudos a respeito da
variabilidade dessa espécie de aleirodídeo para o entendimento de quais fatores podem ser
responsáveis por uma possível preferência pela cultura dentro de um mesmo biótipo de B.
tabaci. Sendo assim, a partir dessas informações, uma estratégia molecular poderá ser
estabelecida para atender a necessidade de se monitorar a presença do biótipo B na cultura
da mandioca como uma prevenção à entrada do vírus do mosaico africano no Brasil.
ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES DE MOSCA
BRANCA PRESENTES NO BRASIL
Inicialmente aos trabalhos de variabilidade genética, procedeu-se à identificação
molecular das amostras coletadas para a determinação dos biótipos de mosca branca. Das
amostras analisadas, observou-se que oito populações coletadas no Brasil pertenciam ao
biótipo B e uma correspondia ao biótipo BR de B. tabaci (Tabela 11).
58
Tabela 11 – Populações de B. tabaci coletadas em culturas de várias regiões do Brasil
usadas nos estudos de variabilidade genética.
Localidade Cultura Biótipo de B. tabaci
Riverside – CA – USA
1
Melão Biótipo B
Riverside – CA – USA
2
Melão Biótipo A
Janaúba – MG Algodão
Recife – PE Malva
Campo Grande – MS Leguminosa Forrageira
Miguelópolis – SP Soja
Limoeiro do Norte – CE Feijão
Tibau – RN Tomate
Cambucí – RJ Pepino
Biótipo B
Brasília – DF Algodão Biótipo BR
1 Biótipo B de B. tabaci usado como padrão de comparação;
2 Biótipo BR de B. tabaci usado como padrão de comparação.
A partir das informações geradas pelos perfis de marcadores de RAPD, realizou-se
um estudo de caracterização molecular de populações provenientes de várias culturas
coletadas nas regiões nordeste, centro-oeste e sudeste do Brasil, como também, dos
Estados Unidos, para efeitos de comparação. Submetendo-se o DNA dos indivíduos das
dez populações de mosca branca ao procedimento de RAPD com dez primers decaméricos,
foram observadas diferenças nos perfis de marcadores entre as várias amostras analisadas
(Figura 6).
59
M USA
60
USA MS PEMG
M
SP CE RN RJ DF
B. tabaci A B. tabaci B B. tabaci B B. tabaci B B. tabaci
ci B
B. tabaci B B. tabaci B B. tabaci B B. tabaci BR
B. taba
Figura 6 - Análise dos fragmentos de DNA obtidos com o primer OPA-13. A letra M
indica o marcador de massa molecular 100 pb ladder. A barra indica o número de
indivíduos analisados para cada população.
A análise dos marcadores moleculares produzidos pelo primer OPA-13 para o
biótipo B de B. tabaci permitiu identificar dois distintos sinais de amplificação de 1050 pb
e de 2000 pb em todas as amostras. Entretanto, para a amostra proveniente dos EUA,
observou-se perfil de bandas na faixa de 300 pb a 1700 pb não identificável nas amostras
originárias do Brasil. O biótipo A dos EUA produziu um perfil diferente de marcadores
com uma banda de 550 pb característica. Resultado similar foi encontrado para o biótipo
BR, produzindo um padrão de bandeamento na faixa de 1500 pb a 1800 pb. A população
coletada em leguminosa forrageira no estado do Mato Grosso do Sul gerou um perfil de
bandas não relacionado aos biótipos envolvidos no estudo.
A partir da variação nos perfis de bandas e da impossibilidade de correlação da
população coletada em leguminosa forrageira com os demais biótipos de mosca branca,
utilizou-se os perfis de bandas de DNA produzidos pelos vários primers de RAPD pelas
dez populações para a determinação do agrupamento destas por meio do programa
NTSYS-pc (Rohlf, 1993). A análise dos padrões de bandas das amostras de mosca branca
provenientes das regiões do Brasil e dos Estados Unidos permitiu organizar as populações
em quatro agrupamentos principais (Figura 7).
Similaridade
61
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
A1
A2
A3
A4
B1
B2
B3
B4
231
232
233
234
235
601
604
602
603
605
1061
1062
1063
1064
1065
1191
1943
1945
1192
1193
1194
1195
1941
1942
1944
1791
1792
1794
1795
1793
2261
2262
2263
2264
2265
811
813
815
812
814
Similaridade
Bemisia tabaci A
Bemisia tabaci B
Bemisia tabaci BR
Bemisia tabaci
USA
USA
Algodão MG
Malva PE
Soja SP
Feijão CE
Pepino RJ
Tomate RN
Algodão DF
Leguminosa
forrageira MS
Grupo A
Grupo B
Figura 7 - Análise de agrupamento das populações de B. tabaci coletadas em diferentes
culturas das regiões do Brasil e dos Estados Unidos.
O primeiro agrupamento foi constituído apenas pela população de mosca branca
biótipo A originária dos EUA, apresentando uma similaridade de 7 % em relação aos
demais grupos analisados. A segunda distribuição de populações ficou relativa ao biótipo
B de B. tabaci, apresentando dois grupos (A e B) com aproximadamente 30 % de
similaridade. Para o grupo A, observou-se que o biótipo B originário dos Estados Unidos
apresentou similaridade de 80 % com as populações do Brasil coletadas em algodão e
malva. Já as populações de mosca branca coletadas em algodão e malva apresentaram uma
relação filogenética mais próxima, em torno de 90 %. O grupo B revelou que a população
coletada em soja apresentou uma similaridade de 85 % em relação às populações de feijão,
pepino e tomate. Observou-se, também, que as populações encontradas em feijão e pepino
apresentaram maior similaridade entre si (97 %) do que em relação à população de tomate
(95 %). No terceiro agrupamento, identificou-se o biótipo BR, coletado em algodão,
apresentando baixa similaridade (20 %) em relação às populações de B. tabaci biótipo B
do Brasil e Estados Unidos. O último agrupamento correspondeu à população coletada em
leguminosa forrageira cujos marcadores não apresentaram correspondência com as marcas
genéticas dos demais biótipos, sugerindo ser um grupo diverso em relação aos demais
biótipos analisados nesse estudo.
Em função dos agrupamentos observados no dendrograma, procedeu-se a análise de
variância molecular (AMOVA) para a identificação da variabilidade genética entre os
grupos e dentro de cada população em estudo (Tabela 12).
Tabela 12 – Análise de variância molecular (AMOVA) entre as populações coletadas em várias
culturas e entre os indivíduos de uma mesma população.
Algodão
MG
Malva
PE
Forrag.
MS
Soja
SP
Feijão
CE
Tomate
RN
Pepino
RJ
Algodão
DF
Algodão - MG 0
62.50 99.10 98.40 98.12 98.37 97.24 99.18
Malva – PE 37.50 0
97.08 97.14 96.71 97.27 95.87 98.25
Forrageira - MS 0.90 2.92 0
98.82 98.68 98.80 97.79 99.40
Soja – SP 1.60 2.86 1.18 0
60.00 90.00 77.27 99.37
Feijão – CE 1.88 3.29 1.32 40.00 0
-25.00 -13.64 99.32
Tomate - RN 1.63 2.73 1.20 10.00 125.00 0
-13.64 99.36
Pepino - RJ 2.76 4.13 2.21 22.73 113.64 113.64 0
98.19
Algodão - DF 0.82 1.75 0.60 0.63 0.68 0.64 1.81 0
Os números em negrito indicam a porcentagem de variação (%) entre as populações analisadas;
Os números na parte inferior da tabela indicam a porcentagem de variação (%) dentro das populações em estudo.
Observou-se que a maior fonte de variação genética era proveniente da
variabilidade entre as populações. Essa variação correspondeu a um intervalo de 96,71 %
até 99,40 %. As exceções ficaram para as relações entre as populações coletadas em feijão-
PE e soja-SP (60 %), malva-PE e algodão-MG (62,5 %) e pepino-RJ e soja-SP (77,27 %).
Essas informações sugerem que as diferenças entre os grupos possam ser devidas a
fatores relacionados com a disponibilidade da dieta, presença de predadores e com a
aplicação de produtos químicos que podem atuar selecionando grupos com perfis genéticos
ligeiramente diferentes dentro de um dado biótipo de B. tabaci. Soma-se ainda a essa
variação dentro dos biótipos, a estratégia reprodutiva adotada pela espécie, uma vez que, a
partenogênese arrenótoca é a forma de reprodução preferencial para manter os genes nas
populações desse inseto. Essa estratégia é particularmente interessante para B. tabaci em
virtude desta espécie representar um grupo cosmopolita. A reprodução assexuada assegura
62
o rápido crescimento da população para a utilização rápida dos recursos disponíveis. Sob
condições ainda desconhecidas, a reprodução sexuada é a forma alternativa para a geração
de novas combinações genéticas com o intuito de superar alguma barreira seletiva como,
por exemplo, a pressão provocada pelo uso de produtos químicos. Esses fatores podem ser
os responsáveis pela variação dentro de um biótipo, refletindo as diferenças que são
observadas no dendrograma. Além disso, pelas análises de variância molecular (AMOVA)
excluiu-se a influência da localização geográfica como fator determinante na separação
entre as populações de B. tabaci biótipo B.
Em função dos resultados obtidos com as populações coletadas ao longo do ano de
2000 e visando confirmar os fatos obtidos anteriormente, realizou-se outra análise
molecular com os mesmos primers de RAPD anteriormente citados para complementar os
estudos de caracterização entre populações coletadas em culturas estabelecidas nas regiões
norte, nordeste, centro-oeste e sudeste do Brasil (Tabela 13).
Tabela 13 – Populações de B. tabaci usadas nos estudos complementares de variabilidade
genética coletadas em várias regiões do Brasil.
Localidade Cultura Biótipo de B. tabaci
Aracati/CE Melão
Boa Vista/RR Melão
Viçosa/MG Soja
Campos de Goytacazes/RJ Couve
Recife/PE Couve
Biótipo B
Buritis/GO Feijão Biótipo BR
Park Branco/RN Melão
Juazeiro/BA Melancia
Mogi Mirim/SP Algodão
Biótipo B
Itiquira/MT Algodão
Biótipo BR
A análise das amostras provenientes de culturas das regiões Centro-Oeste,
Nordeste, Sudeste e Norte com o primer OPA-02 permitiu distinguir padrões de bandas
diferentes entre as populações analisadas (Figura 8).
63
M
M
RR MG RJ PE GO
RN BA SP MT CE
B. tabaci B B. tabaci B
B. tabaci B
B. tabaci B B. tabaci B B. tabaci BR
B. tabaci BR
B. tabaci B B. tabaci B
B. tabaci B
Figura 8 - Análise dos fragmentos de DNA obtidos com o primer OPA-02. A letra M
indica o marcador de massa molecular 100 pb ladder. A barra indica o número de
aleirodídeos analisados.
As populações de B. tabaci biótipo BR coletadas em GO e MT produziram um
perfil de bandas similar com dois sinais de amplificação em torno de 400 pb e 800 pb. Para
as amostras de B. tabaci biótipo B observou-se polimorfismo nos fragmentos de RAPD
sendo que, as populações coletadas em RJ, PE, RN e BA produziram uma banda de 350 pb
comum a essas amostras.
Mais uma vez, em função da variação nos marcadores gerados entre as amostras,
utilizou-se os perfis de bandas para a determinação do agrupamento destas pelo programa
NTSYS-pc (Rohlf, 1993). A análise dos fragmentos obtidos pelas amostras de mosca
branca provenientes das regiões do Brasil permitiu organizar as populações em 2
agrupamentos principais com similaridade de 22,5 % (Figura 9).
64
Projeto mosca branca 2001
Similaridade
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
151
152
153
154
155
1381
1382
1383
1384
1511
1512
1513
1514
1515
15851
15852
15853
15854
15855
1841
1842
1843
1844
1845
2221
2222
2223
2224
2225
1681
1682
1683
1684
1685
23311
23312
23313
23314
23315
2401
2402
2403
2404
2405
81
82
83
Bemisia tabaci B
B. tabaci BR
B. tabaci B
B. tabaci B
Bemisia tabaci BR
Melão RR
Soja MG
Couve RJ
Couve PE
Melão RN
Feijão GO
Melão CE
Algodão SP
Algodão MT
Melancia BA
Figura 9 - Análise de agrupamento das populações de B. tabaci coletadas em culturas
localizadas em diferentes regiões do Brasil.
O primeiro grupo ficou composto apenas pelas populações de B. tabaci biótipo B.
Dentro desse grupo as populações coletadas em melão (RN) e melancia (BA) apresentaram
43 % de similaridade em relação aos demais do grupo. As populações coletadas em soja
(MG) e couve (RJ) formaram um grupo apresentando similaridade de 82 %. A única
amostra obtida da região norte formou um grupo independente dos demais, apresentando
50 % de similaridade genética. Uma amostra coletada em couve (PE) apresentou maior
proximidade genética (58 %) com as populações coletadas em couve na região sudeste.
Para o segundo grupo, observou-se a presença dos dois biótipos de B. tabaci. O biótipo BR
coletado em cultura de feijão formou um grupo independente com 38 % de similaridade
em relação às demais populações. A amostra de biótipo B coletada em melão no CE
apresentou a menor similaridade em relação às demais populações componentes do grupo
(26 %). Além disso, os indivíduos coletados em culturas de algodão nos estados de SP e
MT apresentaram a maior similaridade dentro deste agrupamento (72 %). Contudo, pela
65
metodologia molecular previamente estabelecida para a identificação dos biótipos de
mosca branca, observou-se a presença de biótipos distintos nessas amostras. Dessa forma,
os resultados sugerem uma separação por cultura predada. Para averiguar essas
observações, os marcadores moleculares gerados pelas populações foram submetidos a
análise molecular de variância (Schneider et al., 2000).
As populações coletadas em uma mesma cultura foram agrupadas e submetidas ao
teste de variância molecular. Os resultados indicaram que 86,20 % da fonte de variação
genética observada era resultante da composição genética das populações dentro dos
grupos, 11,37 % resultante da variação entre os grupos e 2,44 % era proveniente da
variabilidade dentro das populações. Prosseguiu-se à análise das amostras em função das
regiões de coleta e observou-se que a maior fonte de variação era devida a variabilidade
entre as populações dentro dos grupos. Por último, realizou-se a análise da variação entre
as populações desse estudo observando-se que a maior fonte de variação era resultante da
variabilidade entre as populações (97,53 %) e, em menor escala (2,47 %), dentro das
populações. Os resultados indicam assim, que o fator cultura e local de estabelecimento da
população não exercem efeitos pronunciados sobre a dinâmica genética dessas populações.
Provavelmente, a estratégia reprodutiva adotada pela espécie, ou seja, ciclos
partenogenéticos intercalados por eventos de reprodução sexuada sejam fatores
independentes ou pouco influenciados pelo tipo de dieta. Poderia-se postular também que
as populações clonais estabelecidas em um área em conjunto quando em uma baixa
freqüência de migração e sob pressão de seleção provocada por agentes químicos possam
estar contribuindo mais diretamente na variação dos perfis de marcadores moleculares que
são encontrados nas popualções de mosca branca B. tabaci.
Estudos bioquímicos e moleculares de B. tabaci têm fornecido substancial
evidência no que diz respeito ao grau de polimorfismo entre populações de distintas
regiões geográficas e/ou hospedeiros. Esta evidência é corroborada pela existência de
biótipos. Recentes análises filogenéticas do DNA mitocondrial de populações de B. tabaci
coletadas em diferentes hospedeiros e regiões geográficas, têm sugerido uma importante
divergência genética entre populações geograficamente separadas. Entretanto, ainda não
existem suficientes evidências biológicas e genéticas para separar o biótipo B do complexo
B. tabaci (Kirk et al., 2000).
Maiores estudos precisam ser conduzidos para se obter dados que possam ser
aplicados na identificação e no monitoramento destes biótipos específicos em campo,
66
assim como, na averiguação dos fatores que são responsáveis pela sua distribuição
geográfica e pela flutuação de marcadores dentro de um biótipo.
MONITORAMENTO DE POPULAÇÕES DE MOSCA BRANCA OCORRENDO EM
CULTURAS NO DISTRITO FEDERAL
Em seguida, visando analisar se o mesmo fenômeno observado para os marcadores
moleculares de populações de B. tabaci biótipo B coletadas em várias culturas e em vários
locais do país, também ocorre em uma mesma localidade, foram realizados estudos de
monitoramento de populações de mosca branca, a partir da análise com cinco primers de
RAPD de fêmeas adultas coletadas nas mesmas áreas do Distrito Federal nos anos de 2000
e 2001, ocorrendo em culturas de berinjela, tomate, pepino, abóbora e feijão, mantidas
tanto em campo quanto em casa de vegetação. Nesse estudo, também foram utilizadas
populações de mosca branca, coletadas em várias localidades do Brasil, ao longo do ano de
1999, para comparação nos estudos de monitoramento. A partir das análises moleculares
de identificação dos biótipos, observou-se que todas as populações de mosca branca
coletadas pertenciam ao biótipo B (Tabela 14).
67
Tabela 14 – Populações de Bemisia coletadas no Distrito Federal nos anos de 2000 e 2001
e no Brasil no ano de 1999.
Ano Código Localidade Cultura Identificação
226
1
Cenargen - DF Algodão B. tabaci BR
249
2
Tibau – RN Mandioca B. tabaci B
64
3
Mançuba - BA Abóbora B. tabaci B
75
3
Goiânia - GO Pepino B. tabaci B
116
3
Limoeiro do Norte - CE Feijão B. tabaci B
126
3
Jaboticabal - SP Berinjela B. tabaci B
1999
BRASIL
220
3
Juazeiro - BA Tomate B. tabaci B
226
1
Cenargen - DF Algodão B. tabaci BR
249
2
Tibau – RN Mandioca B. tabaci B
263
3
Planaltina - DF Berinjela B. tabaci B
264
3
Planaltina - DF Tomate B. tabaci B
265
3
Planaltina - DF Pepino B. tabaci B
266
3
Planaltina - DF Abóbora B. tabaci B
288
4
Cenargen - DF Tomate B. tabaci B
289
4
Cenargen - DF Abóbora B. tabaci B
2000
DF
290
4
Cenargen - DF Feijão B. tabaci B
226
1
Cenargen - DF Algodão B. tabaci BR
249
2
Tibau – RN Mandioca B. tabaci B
02
4
Cenargen - DF Tomate B. tabaci B
03
4
Cenargen - DF Abóbora B. tabaci B
04
4
Cenargen - DF Feijão B. tabaci B
18
3
Planaltina - DF Tomate B. tabaci B
19
3
Planaltina - DF Pepino B. tabaci B
2001
DF
20
3
Planaltina - DF Berinjela B. tabaci B
1 Biótipo BR de B. tabaci usado como padrão;
2 Biótipo B de B. tabaci usado como padrão;
3 Populações coletadas em campo;
4 Populações coletadas em casa de vegetação no CENARGEN.
Em relação aos indivíduos coletados no ano de 2000, tanto em casa de vegetação
quanto em campo, predadores de culturas de abóbora e tomate, não houve uma diferença
significativa nos padrões de DNA quando amplificados com o primer OPA-13 (Figura 10).
68
M BR B
Abóbora
69
casa vegetação casa vegetação
Tomate
Tomate Abóbora
campo campo
Figura 10 – Análise dos fragmentos de DNA, de amostras coletadas em 2000, obtidos de
amplificação com o primer OPA-13. A letra M indica o marcador de massa molecular 100
pb ladder. As letras BR e B correspondem aos biótipos BR e B de B. tabaci usados como
padrão de identificação.
O mesmo resultado foi observado quando utilizou-se o primer OPA-13 nas reações
de amplificação de RAPD para as amostras coletadas em tomate, tanto em campo quanto
em casa de vegetação, no ano de 2001 (Figura 11).
M
BR B
Tomate
M
Tomate
Abóbora
campo campo
casa vegetação
Figura 11 – Análise dos fragmentos de DNA, de amostras coletadas em 2001, obtidos de
amplificação com o primer OPA-13. A letra M indica o marcador de massa molecular 100
pb ladder. As letras BR e B correspondem aos biótipos de B. tabaci usados como padrão de
identificação.
Os padrões de comparação para abóbora não puderam ser obtidos para o ano de
2001, pois não foi possível coletar indivíduos nessa cultura em campo no referido período.
Utilizando-se o primer OPA-15, detectou-se diferenças entre as populações
coletadas em tomate e berinjela em 2000 (Figura 12).
M M BR BR B B
Berinjela Tomate
Figura 12 - Análise dos fragmentos de DNA de mosca branca, obtidos de amplificação
com o primer OPA-15 a partir de populações coletadas no ano de 2000, em tomate e em
berinjela. A letra M indica o marcador de massa molecular 100 pb ladder. As letras BR e B
correspondem aos biótipos de B. tabaci usados como padrão de referência.
Entretanto, a análise molecular dessas mesmas amostras, coletadas em 2001, não
permitiu observar diferenças no padrão de bandeamento quando utilizou-se o mesmo
primer (Figura 13).
M
Berinjela PepinoTomateAbóbora
campo
Figura 13 - Análise dos fragmentos de DNA de mosca branca, obtidos de amplificação
com o primer OPA-15 em populações coletadas em campo no ano de 2001, tanto em
tomate quanto em berinjela. A letra M indica o marcador de massa molecular 100 pb
ladder. As letras BR e B indicam os biótipos de mosca branca usados como referência.
Os padrões de bandas obtidos pelas populações de mosca branca coletadas em 2000
produziram 2 agrupamentos principais: 1) o agrupamento A, sendo formado apenas pelas
populações de B. tabaci biótipo BR coletadas em algodão e; 2) o agrupamento B,
constituído apenas pelas populações de B. tabaci biótipo B, coletadas em mandioca,
abóbora, pepino, feijão, berinjela e tomate (Figura 14).
70
Monitoramento DF 2000
Similaridade
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
2261
2262
2263
2264
2265
2491
2492
2493
2494
2495
2891
2892
2893
2895
2894
2661
2662
2663
2664
2665
2881
2882
2883
2884
2885
2641
2642
2643
2644
2645
2631
2633
2634
2635
2632
2652
2651
2655
2653
2654
2901
2902
2903
2904
2905
Bemisia tabaci BR
Bemisia tabaci B
Mandioca - RN
Abóbora - DF
Casa vegetação
Campo
Tomate - DF
Casa vegetação
Campo
Berinjela - DF
Pepino – DF Campo
Feijão – DF Campo
A
B
C
D
E
Figura 14 – Análise das populações de B. tabaci coletadas no ano de 2000 em culturas
mantidas tanto em casa de vegetação quanto em campo.
O agrupamento E ficou constituído pelas populações de mosca branca presentes em
culturas de feijão e pepino que apresentaram uma similaridade genética de 43 %. Além
disso, observou-se que as populações do agrupamento D presentes em culturas de berinjela
e tomate apresentaram um grau de similaridade em torno de 33 %. Por sua vez, esses dois
agrupamentos apresentaram similaridade genética de 25 %.
Pela análise do dendrograma, observou-se que o agrupamento C foi constituído
pelas populações coletadas em abóbora e mandioca. Essas duas populações apresentaram
12,5 % de similaridade genética em relação aos agrupamentos D e E. A amostra coletada
em abóbora apresentou relação filogenética mais próxima com a população coletada em
mandioca, originária do RN, apresentando grau de similaridade de 40 % e mostrando-se
diferente em relação às demais populações que foram coletadas na região de Planaltina
(DF).
71
Observou-se também diferenças entre os indivíduos coletados em culturas mantidas
tanto em casa de vegetação quanto em campo. As populações coletadas em abóbora
(campo e casa de vegetação) apresentaram um grau de similaridade em torno de 65 %. Para
as populações coletadas em tomate, sob as mesmas condições, observou-se similaridade
em torno de 75 %. O dendrograma revelou que a população de B. tabaci biótipo BR
(agrupamento A) apresentou menor grau de similaridade em relação às demais populações
analisadas nesse estudo (10 %).
Os dados binários, gerados pelos perfis de marcadores moleculares obtidos pelo uso
dos primers de RAPD, foram usados na análise de variância molecular (AMOVA). Por
meio da comparação de todas as populações de B. tabaci biótipos B e BR, observou-se que
92,06 % da fonte de variação genética era originária de variações entre as populações e
que, 7,94 % era proveniente de variações dentro das populações. Comparando-se as
populações coletadas em tomate e abóbora tanto em campo quanto em casa de vegetação,
observou-se uma variação de: 73,89 % entre populações dentro dos grupos; 23,08 % entre
os grupos; e 3,04 % dentro das populações. A seguir, fazendo-se uma comparação entre
todas as populações coletadas em campo e em casa de vegetação, observou-se uma
variação de: 76,58 % entre populações dentro dos grupos; 18,50 % entre os grupos; e
4,92 % dentro das populações.
As informações de variância molecular refletem resultados semelhantes aos das
análises de populações de mosca branca coletadas em várias culturas em várias regiões do
Brasil, ou seja, o fator cultura e localidade não influenciam na separação das populações.
Sendo assim, foi proposta nova coleta de populações na região do Distrito Federal para a
confirmação dos resultados anteriormente descritos.
A análise das populações coletadas em 2001, revelou diferenças em relação à
analise do ano anterior. Observou-se que as populações de B. tabaci biótipo B formaram
dois agrupamentos: o agrupamento A, formado pela população de B. tabaci biótipo BR; e o
agrupamento B, formado pelas populações de B. tabaci biótipo B coletadas tanto em
campo quanto em casa de vegetação, em culturas de mandioca, tomate, feijão, abóbora,
pepino e berinjela (Figura 15).
72
Monitoramento DF 2001
Similaridade
73
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
2261
2262
2263
2264
2265
2491
2492
2493
2494
2495
21
22
23
24
25
42
44
41
45
43
31
32
33
34
35
181
183
185
191
193
194
201
203
204
205
182
195
184
192
202
Bemisia tabaci BR
Bemisia tabaci B
Mandioca RN
Tomate
Casa vegetação
Feijão
Casa vegetação
Abóbora
Casa vegetação
Tomate Campo
Pepino Campo
Berinjela Campo
Algodão DF
A
C
B
D
Figura 15 – Análise das populações de Bemisia coletadas no ano de 2001 em culturas
mantidas tanto em casa de vegetação quanto em campo.
Nesse estudo, mais uma vez, confirmou-se que a população de B. tabaci biótipo
BR, apresentou baixa similaridade genética (5 %) em relação às amostras de B. tabaci
biótipo B utilizadas, formando um clado em separado (agrupamento A).
Para o agrupamento B, foram identificadas duas divisões (C e D). Na divisão C, as
populações coletadas em tomate e feijão, ambas provenientes de casa de vegetação,
apresentaram similaridade em torno de 94 %. Essas populações coletadas em casa de
vegetação formaram um grupo único e apresentaram 83 % de similaridade com a
população coletada em mandioca originária do RN. Na divisão D, as populações coletadas
em tomate, pepino e berinjela, coletadas em campo, apresentaram similaridade em torno de
96 %, formando um grupo único. Esse resultado apresentou-se diferente de todas as
análises que foram realizadas, uma vez que, o padrão que parecia estar estabelecido era o
de separação das populações do biótipo B de B. tabaci em função do tipo cultura. Além
disso, os indivíduos coletados em cultura de abóbora mantida em casa de vegetação,
apresentaram similaridade de 89 % com as culturas coletadas em campo, agrupando-se
com estas populações.
Em seguida, realizou a análise de variância molecular (AMOVA) para a
determinação das fontes de variação observadas no dendrograma. Dos resultados obtidos
pela AMOVA, quando todas as populações foram analisadas em conjunto, determinou-se
que 96,66 % da fonte de variação observada era proveniente de variações entre as
populações analisadas e que 3,34 % era de variações dentro das populações. Comparando-
se os principais agrupamentos (A, C e D), observou-se que a variação era devida a: 52,85
% entre populações dentro dos grupos; 44,28 % entre os grupos e 2,86 % dentro das
populações. Analisando-se apenas as populações de B. tabaci biótipo B (agrupamentos C e
D) determinou-se que a variação era devida a: 83,75 % entre populações dentro dos
grupos; 11,05 % entre os grupos; e 5,20 % dentro das populações. Comparando-se as
populações coletadas tanto em campo quanto em casa de vegetação, a variação genética
observada foi de: 85,76 % entre populações dentro de grupos; 8,99 % entre os grupos; e
5,24 % dentro das populações. Dos resultados da AMOVA, confirmou-se, mais uma vez,
que a variabilidade genética encontrada entre as populações não era influenciada pela
cultura, localidade de coleta ou ano. Esse resultado é válido mesmo considerando-se o caso
das populações do agrupamento D.
Em função dos resultados encontrados entre as populações de B. tabaci biótipo B
coletadas no Distrito Federal, realizou-se mais uma análise utilizando-se, agora,
populações de várias localidades do Brasil coletadas em culturas ao longo do ano de 1999
para o estabelecimento de padrões de comparação. Os resultados revelaram a formação de
dois agrupamentos: 1) o primeiro (agrupamento A), foi constituído pela população de B.
tabaci biótipo BR e; 2) o segundo (agrupamento B), foi constituído por populações de B.
tabaci biótipo B coletadas em abóbora, feijão, pepino, berinjela, tomate e mandioca
(Figura 16).
74
Monitoramento Brasil
Similaridade
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
641
642
643
644
645
1161
1162
1163
1164
1165
751
752
754
755
753
1261
1262
1263
1265
1264
2201
2202
2203
2204
2205
2491
2492
2493
2494
2495
2261
2262
2263
2264
2265
Bemisia tabaci BR
Bemisia tabaci B
Abóbora BA
Feijão CE
Pepino GO
Berinjela SP
Tomate BA
Mandioca RN
Algodão DF
A
B
C
D
Figura 16 – Análise das populações de Bemisia coletadas em culturas originárias de várias
localidades do Brasil ao longo do ano de 1999.
A análise do dendrograma revelou que o biótipo BR de B. tabaci apresentou o
menor índice de similaridade em relação às demais populações analisadas (16 %),
formando um agrupamento à parte. Para as populações de B. tabaci biótipo B foram
identificados dois agrupamentos (C e D). No agrupamento C, as populações de abóbora e
feijão apresentaram 75 % de similaridade em relação às amostras coletadas em pepino e
berinjela. As populações de abóbora (BA) e feijão (CE) apresentaram 85 % de similaridade
e, as populações de pepino (GO) e berinjela (SP), apresentaram similaridade de 78 %. No
agrupamento D, observou-se que a similaridade das populações de tomate (BA) e
mandioca (RN) foi de 82 %. O dendrograma revelou que as populações provenientes de
estados da região nordeste formaram dois grupos distintos, enquanto as populações do
Cento-Oeste e Sudeste formam um grupo único. A análise do dendrograma sugere também
uma possível separação das populações em função do tipo de cultura.
Dessa forma, os dados obtidos a partir dessas populações foram submetidos a
análise de variância molecular (AMOVA). Fazendo-se a comparação entre todas as
populações do estudo, observou-se que a variação era devida a: 95,69 % entre as
75
populações e 4,31 % dentro das populações. Considerando-se apenas as populações do
biótipo B de B. tabaci observou-se que a variação era devida a 95,26 % entre as
populações e 4,74 % dentro das populações. Com esses resultados, confirmou-se que a
variabilidade observada entre as populações de B. tabaci está correlacionada,
provavelmente, com a estratégia de reprodução adotada por essa espécie. Soma-se a esses
fatos, a ampla variabilidade genética que é encontrada dentro dessa espécie de aleirodídeo.
A análise dos dendrogramas permitiu destacar algumas características, dentre as
quais:
- O biótipo BR de B. tabaci apresentou baixa similaridade em todas as análises,
variando de 10 % a 15 %, em relação ao biótipo B;
- A comparação das populações coletadas em mandioca e tomate, tanto no
monitoramento realizado em 2001 quanto na análise das populações coletadas no Brasil,
revelou um grau de similaridade variando de 80 % a 85 %;
- O monitoramento de 2000 e 2001 indicou que as populações coletadas em
berinjela e em tomate apresentaram diferenças no grau de similaridade, variando de 35 %
no ano de 2000 para 90 % em 2001. A análise das populações coletadas em 1999 no Brasil,
revelou que estas duas populações apresentam-se em agrupamentos distintos;
- A comparação das populações coletadas em mandioca e tomate, no
monitoramento de 2001 e no estudo realizado nas populações ao longo de 1999, revelou
que estas apresentaram variação de 80 % a 85 % no grau de similaridade;
- A análise das populações coletadas em berinjela e pepino, indicou uma
similaridade de 80 % nas populações coletadas em 1999 e de 99 % no monitoramento
realizado em 2001;
- No monitoramento realizado em 2001, observou-se que as populações coletadas
em campo formaram um agrupamento único;
- Na análise das populações de 1999, observou-se que aquelas amostras coletadas
na região nordeste formaram grupos distintos em relação àquelas coletadas no Centro-
Oeste e Sudeste.
- A variação observada nos monitoramentos pode ser devida às alterações
climáticas ocorridas no mês de agosto, tanto em 2000 (quente e seco) quanto em 2001 (frio
e chuvoso).
- Os resultados quando organizados em um dendrograma sugerem que as
populações de um mesmo biótipo podem se agregar de acordo com a cultura predada.
Contudo, por meio da análise de variância molecular (AMOVA), observou-se que a fonte
76
de variabilidade estava relacionada a variações entre as populações do que em relação a
variações dentro das populações.
Utilizando padrões de esterase, Liu et al. (1992) observaram que populações de B.
tabaci biótipo B coletadas em culturas de poinsetia e hibisco estabelecidas nos Estados
Unidos apresentaram perfis idênticos de isoenzimas, indicando que esses padrões
isoenzimáticos não eram influenciados pela cultura vegetal hospedeira.
Entretanto, Wool et al. (1994) a partir dos padrões de esterase obtidos de
populações de B. tabaci coletadas em diferentes regiões geográficas da Colômbia,
sugeriram que esta espécie de aleirodídeo não era uma entidade genética única, ou seja, por
meio dos padrões de isoenzimas, as moscas brancas da Colômbia eram diferenciadas
geograficamente. Os autores apresentam a definição de raças geográficas para melhor
definir essa característica revelada pelas isoenzimas.
Em 2001, Moya et al. por meio de marcadores moleculares RAPD e fazendo a
análise de variância determinaram que os biótipos contribuem significativamente mais para
a variabilidade observada do que as populações dentro de um mesmo biótipo, ou seja, o
fluxo gênico entre dois biótipos de uma mesma população é menor do que entre
populações de biótipos idênticos.
Independentemente dos eventos que influenciam a distribuição das populações de
B. tabaci, a técnica de RAPD demonstrou-se sensível o bastante para revelar flutuações
ocorridas nas populações ao longo de um ano. Com isso, as técnicas moleculares baseadas
em DNA mostram-se úteis para confirmar a existência de biótipos e avaliar o grau de
separação entre estes. Para propósitos epidemiológicos e agro-econômicos, torna-se
essencial entender a íntima relação que se desenvolve entre as populações locais de B.
tabaci e, especialmente, qualquer diferenciação entre populações que estejam relacionadas
com o hospedeiro (Burban et al., 1992).
Estas informações poderão servir de base para maiores estudos visando identificar
quais fatores influem na distribuição das populações em uma dada área, como também,
poderão ser úteis na determinação de métodos de controle químico da mosca-branca em
relação a uma cultura hospedeira específica. Passa a ser de grande importância a obtenção
de informações a respeito das fontes de variação que ocorrem dentro do biótipo B de B.
tabaci, uma vez que, populações resistentes de mosca branca podem ser selecionadas com
relativa facilidade após a aplicação de inseticidas químicos. Maiores estudos precisam ser
realizados para se obter dados que possam ser aplicados na identificação destas populações
específicas de mosca branca.
77
ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA ENTRE OS BIÓTIPOS DE B. tabaci
Para as análises genéticas das populações B. tabaci, fêmeas adultas pertencentes
aos seus vários biótipos, incluindo Q e cassava, tiveram os seus padrões de bandas
determinados, por RAPD, com os primers OPA-04, OPA-10, OPA-11, OPA-13 e OPA-15.
Para todos os biótipos usados no estudo, incluindo aqueles provenientes de
localidades fora do Brasil, o volume de tampão de extração de DNA foi o mesmo já
estabelecido para as populações de B. tabaci biótipos B e BR. Uma vez determinadas as
condições de extração de DNA dos diversos biótipos, estes tiveram seus padrões de
bandeamento comparados com outras populações presentes no banco de mosca branca,
para fins de identificação por meio molecular. Observou-se diferenças entre os padrões
eletroforéticos obtidos para os biótipos de B. tabaci (Figura 17).
M
M
61 62 226 140
14
184
7 8
6-02 288
B. tabaci B B. tabaci BR B. tabaci A B. tabaci B B. tabaci B
B. tabaci B B. tabaci Q B. tabaci Q
B. tabaci
cassava
Não
Identificada
Figura 17 - Análise dos fragmentos de DNA dos vários biótipos de B. tabaci obtidos de
amplificação com o primer OPA-10. A letra M indica o marcador 100 pb ladder. Os
números acompanhados das barras indicam o número de indivíduos pertencentes àquele
código do banco de aleirodídeos que foram analisados.
78
A análise das amostras com o primer OPA-04, revelou diferenças entre os vários
biótipos. Com relação ao biótipo Q, foram identificadas bandas de 550 pb e 900 pb que não
são correspondentes nos demais biótipos de B. tabaci. Possivelmente, esse primer poderá
ser usado na identificação molecular desse biótipo. Por sua vez, o biótipo cassava
apresentou um forte sinal de amplificação de 950 pb. Apenas o biótipo BR possui uma
banda de massa molecular de valor aproximado, em torno de 950 pb, quando se usa esse
primer. A análise com o primer OPA-10 indicou grande polimorfismo na faixa de 600 pb a
1300 pb para o biótipo Q. Além disso, esse biótipo apresentou diferença em relação ao
biótipo B, pela ausência de sinal de amplificação na faixa de 450 pb. O biótipo cassava
apresentou polimorfismo na faixa de 500 pb a 1100 pb em relação às demais amostras
analisadas. O uso do primer OPA-11 nas reações de amplificação produziu uma banda
característica para o biótipo Q na faixa de 750 pb. O biótipo cassava apresentou sinal de
amplificação em torno de 550 pb. Ambos os biótipos não apresentaram as bandas de 350
pb e 500 pb características dos biótipos B e BR, respectivamente. Observou-se, também,
diferenças entre os biótipo Q e cassava, quando utilizou-se o primer OPA-13. O uso deste
primer permitiu identificar uma banda extra (superior a 1900 pb) no biótipo cassava que
não apresenta correspondência no biótipo Q. Além disso, esse primer produziu um
polimorfismo muito similar entre esses dois biótipos e o biótipo B. Em relação ao biótipo
BR, notou-se a ausência de banda na região correspondente a 850 pb. Com o primer OPA-
15, observou-se uma banda comum, de 700 pb, entre os biótipos Q, B e BR. Entretanto, o
biótipo cassava apresentou uma banda em torno de 800 pb, diferenciando-se dos demais
padrões. Esse primer poderá ser então usado para a identificação do biótipo cassava.
Uma vez estabelecida a identificação molecular dos biótipos de mosca branca por
RAPD, poderão ser realizados estudos destas populações. Os resultados obtidos poderão
ser utilizados para a determinação das relações filogenéticas entre biótipos de importância
econômica.
A análise dos perfis eletroforéticos produzidos pelos biótipos de B. tabaci, permitiu
organizar as populações em 3 agrupamentos principais (Figura 18).
79
80
Biótipo Q
Similaridade
0.16 0.37 0.58 0.79 1.00
611
612
613
614
615
1841
1842
1843
1844
1845
1404
1401
1402
1403
e1
e2
e3
e4
e5
m1
m2
m3
m4
m5
n1
n2
n3
n4
n5
2881
2882
2883
2884
2885
621
622
623
624
625
2261
2262
2263
2264
2265
ni1
ni2
ni3
ni4
Bemisia tabaci B
USA
Brasil
B. tabaci
Espanha
Marrocos
Biótipo Q
Biótipo casava
B. tabaci
Biótipo A
Biótipo BR
Não Identificada
Melão
Soja
Tomate
Pepino
Mandioca
Tomate
Algodã
Algodã
Biótipo B
o
o
A
B
C
Melão
Melão
Figura 18 – Análise de populações dos vários biótipos de B. tabaci presentes no Brasil e
em outros países.
O agrupamento A foi constituído pelo biótipo B que apresentou baixa similaridade
(16 %) em relação aos demais biótipos de B. tabaci. A análise revelou ainda que o biótipo
B dos Estados Unidos apresentou similaridade de 79 % em relação ao mesmo biótipo
coletado em culturas no Brasil. Além disso, as populações, de B. tabaci B, coletadas em
melão e soja no Brasil apresentaram, aproximadamente, 95 % de similaridade genética.
Para o agrupamento B, observou-se que as duas populações do biótipo Q
apresentaram 83 % de similaridade entre si e 37 % em relação ao biótipo cassava. Além
disso, uma população do biótipo B de B. tabaci, coletada em cultura de tomate no Brasil,
apresentou maior similaridade com aqueles dois biótipos do que com populações do
mesmo biótipo coletadas no Brasil.
O agrupamento C foi constituído pelas populações de B. tabaci pertencentes aos
biótipos A e BR. Estas duas populações de mosca branca apresentaram similaridade
genética em torno de 79 %. Além disso, uma população não identificada, coletada em
cultura de algodão no Mato Grosso, apresentou maior similaridade com os biótipos A e
BR. Uma possibilidade seria de que esta população constitua uma variante do biótipo BR.
Contudo, experimentos envolvendo o cruzamento entre estes biótipos precisam ser
realizados para a confirmação dessa suposição.
A análise de AMOVA utilizando todos os biótipos de B. tabaci indicou que a fonte
de variação era proveniente de: 96,22 % entre as populações e 3,78 % de dentro das
populações. A seguir, fazendo-se a comparação entre os três agrupamentos observou-se
que 56,95 % da variação era proveniente dentre os grupos, 39,84 % entre populações
dentro dos grupos e 3,21 % de dentro das populações. Esse último resultado pode ser
devido ao fato de que os biótipos B e Q compartilham uma maior similaridade genética
sendo, também, descrita a ocorrência de formação de híbridos B/Q resultantes de
cruzamentos entre esses dois biótipos (Ronda et al., 1999).
Em 2001, Moya et al. por meio de marcadores moleculares RAPD e fazendo a
análise de variância determinaram que os biótipos contribuem significativamente mais para
a variabilidade observada do que as populações dentro de um mesmo biótipo, ou seja, o
fluxo gênico entre dois biótipos de uma mesma população é menor do que entre
populações de biótipos idênticos.
Um estudo da distribuição de biótipos na Península Ibérica, revelou a presença de
dois biótipos: B e Q. Na Espanha, ambos os biótipos coexistem na mesma área, sendo que
o biótipo Q é o predominante. Eles diferem em várias características biológicas como:
período de desenvolvimento, preferência por hospedeiro e eficiência na transmissão de
vírus. O biótipo Q também foi encontrado em Marrocos. Em virtude do potencial do
biótipo Q se tornar uma praga tão prejudicial quanto o biótipo B, surge a necessidade de
uma contínua vigilância para se evitar a disseminação daquele no Mediterrâneo e em
outras regiões do mundo. Além disso, a riqueza de interações entre os biótipos de B. tabaci
e os vírus que eles transmitem, determinam a importância dos estudos de genética das
populações de mosca branca de forma a melhor se entender a epidemiologia dessas viroses
(Moya et al., 2001).
Uma vez que os perfis eletroforéticos foram determinados para os biótipos de
B. tabaci, estas informações poderão ser usadas em trabalhos futuros de identificação,
monitoramento e dispersão destes biótipos de expressão quarentenária. Além disso,
maiores estudos poderão ser realizados para se estabelecer as relações entre a biologia e a
genética destas populações de aleirodídeos.
81
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE POPULAÇÕES DE ALEIRODÍDEOS
Indivíduos de várias populações de artrópodos incluindo um inseto exótico, a
mosca negra (Aleurocanthus woglumi), tiveram seus padrões de bandas determinados com
os primers OPA-02, OPA-03, OPA-04, OPA-05, OPA-10, OPA-11, OPA-13, OPA-15,
OPA-17 OPA-20 e OPR-06 e comparados com os perfis de marcadores moleculares já
determinados para os biótipos de B e BR de B. tabaci.
Para a análise da mosca negra (Aleurocanthus woglumi), foi estabelecido um
protocolo de extração de DNA, uma vez que, para as demais amostras usadas no
experimento, inclusive B. tabaci biótipos B e BR, o volume de tampão de extração de
DNA foi de 60 μL. No caso da mosca negra, determinou-se um volume de 300 μL de
tampão de extração de DNA. Uma vez determinadas as condições de extração de DNA da
mosca negra, esta teve seu padrão de bandeamento comparado com outras populações
presentes no banco de aleirodídeos, para fins de identificação por meio molecular.
Observou-se que os perfis eletroforéticos obtidos para as diversas populações de
artrópodos apresentaram diferenças em relação aos biótipos de B. tabaci (Figura 19).
82
83
M
34
236 255 261 264 278 279 282
M
34
236
279
M
255
261
264 278 279 282
34236
255
261264278
282
Primer OPA-10
Primer OPA-04
Primer OPA-03
Figura 19 - Análise dos fragmentos de DNA de várias populações de aleirodídeos, obtidos
de amplificação com os primers OPA-03, OPA-04 e OPA-10. A letra M indica o marcador
de massa molecular 100 pb ladder. Os códigos indicam: 34, Bemisia tabaci biótipo BR;
236, B. tuberculata; 255, Aleurothrixus aepim; 261, Aleurodicus cocois; 264, B. tabaci
biótipo B; 278, Aleurocanthus woglumi; 279, A. woglumi; 282, Trialeurodes
vaporariorum. As barras indicam o número de indivíduos analisados.
Utilizando-se os perfis de fragmentos de DNA obtidos para as populações de mosca
negra como padrão de comparação, observou-se que: um forte sinal de amplificação na
região de 1000 pb foi obtido com o primer OPA-11; com o primer OPA-13, um fragmento
de massa molecular de 600 pb; utilizando-se o primer OPA-10 obteve-se uma banda de
massa molecular de 800 pb; já o primer OPA-03, amplificou um sinal de amplificação de
750 pb; o primer OPA-05 produziu um fragmento de 450 pb não encontrado nas demais
amostras; o primer OPA-20 produziu bandas de 650 pb e de 1000 pb que não apresentaram
correspondência com os biótipos B e BR de B. tabaci; o primer OPA-15 produziu um
fragmento de 950 pb, que poderá ser usado na identificação molecular da mosca negra.
Usando-se o primer OPA-11, observou-se que o biótipo BR de B. tabaci produziu
um fragmento de DNA de 500 pb que também foi encontrado na amostra de
B. tuberculata. Entretanto, aquele não foi observado na amostra do biótipo B de B. tabaci.
As reações de amplificação com o primer OPA-13 produziram uma banda de 850 pb na
amostra do biótipo BR de B. tabaci. Esta mesma banda apresentou correspondência nas
amostras de mosca negra, mas com fraco sinal de amplificação. O uso deste primer
permitiu identificar molecularmente os biótipos de B. tabaci.
O primer OPA-03, por sua vez, produziu um fragmento de 850 pb característico
para a identificação de amostras de Bemisia tuberculata. Provavelmente, este primer
poderá ser empregado na identificação molecular daquele inseto.
O uso do primer OPA-05 nas reações de RAPD, produziu uma banda característica
de 900 pb na amostra de B. tabaci biótipo B. Contudo, para as amostras de B. tabaci
biótipo BR foram visualizados dois sinais de amplificação de 900 pb e de 1200 pb.
Os biótipos B e BR de B. tabaci, assim como, a mosca negra apresentaram padrões
distintos de bandeamento utilizando-se o primer OPA-04. Além disso, com o uso desse
mesmo primer, determinou-se um padrão para Aleurodicus cocois. A identificação de
Aleurothrixus aepim também foi possível nas reações de amplificação de RAPD quando
utilizou-se o primer OPA-10.
Gawel & Bartlett (1993) identificaram os biótipos A e B de B. tabaci empregando a
técnica de RAPD. Além disso, Haymer (1994) sugere o uso de primers de seqüências
aleatórias para o estudo de variações genéticas em populações de insetos. Guirao et al.
(1994) empregaram a técnica de RAPD para a identificação, por meio de diferenças entre
os perfis de marcadores moleculares, das espécies de T. vaporariorum e B. tabaci.
Além da obtenção de perfis moleculares para a identificação de T. vaporariorum e
B. tabaci, outros insetos poderão ser identificados por meio dessa estratégia baseada em
DNA como, por exemplo, a mosca negra dos citros A. woglumi. Esse inseto é considerado
uma praga de nível A1 para o Brasil e outros países do Comitê de Sanidade Vegetal do
Cone Sul (COSAVE), principalmente em ralação aos citros e outras frutíferas. Este inseto
faz parte do alerta máximo e é considerado uma das pragas que estão na iminência de
entrada no país. Sendo assim, de modo a estabelecer critérios para uma identificação rápida
e eficiente deste inseto caso ele venha a ser detectado em pontos de entrada do país e ainda
visando auxiliar em medidas fitossanitárias necessárias para a erradicação do inseto
conforme determinação do DDIV/DAS/MA, padrões moleculares foram estabelecidos para
84
este inseto, assim como, determinou-se o seu grau de similaridade genética em relação a
outras populações de aleirodídeos.
Uma vez estabelecida a identificação molecular das amostras de moscas branca e
negra por meio de RAPD, poderão ser realizados estudos destas populações. Os resultados
obtidos foram utilizados para a determinação das relações filogenéticas entre estes insetos
de importância econômica. A análise dos perfis eletroforéticos, permitiu organizar as
populações em 2 agrupamentos principais (Figura 20).
Mosca Negra
Similaridade
85
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
341
342
343
344
345
2643
2641
2642
2644
2645
2781
2782
2783
2784
2785
2791
2792
2793
2794
2795
2361
2362
2363
2364
2365
2551
2552
2553
2554
2555
2821
2822
2823
2824
2825
Bemisia tabaci BR
Bemisia tabaci B
Aleurocanthus woglumi
Bemisia tuberculata
Aleurothrixus aepim
Trialeurodes vaporariorum
Tomate MT
Tomate DF
Citros Flórida
Citros Texas
Mandioca MS
Mandioca DF
Fumo DF
A
B
C
D
E
F
Figura 20 - Análise das populações de aleirodídeos coletadas em diferentes culturas.
Com relação ao primeiro agrupamento (definido com A), observou-se que as
populações de B. tabaci biótipos B e BR, assim como, A. woglumi, formaram um
agrupamento com 17 % de similaridade em relação às demais populações de aleirodídeos.
Dentro desse agrupamento foram encontradas duas divisões (C e D), sendo que, os
biótipos B e BR de B. tabaci formaram um grupo único (divisão C) apresentando 28 % de
similaridade entre si e 25 % em relação às populações de A. woglumi (divisão D). As duas
populações de mosca negra, apresentaram uma relação filogenética de 89 %.
No agrupamento B, observou-se que B. tuberculata e A. aepim, apresentaram
similaridade de 24 % entre as suas populações, formando um grupo único (divisão E). E,
em relação à população de T. vaporariorum, apresentam um grau de similaridade
filogenética de 20 %.
Da análise da distribuição das populações de insetos no dendrograma, observa-se
um resultado interessante que está relacionado com o agrupamento das populações em
função da cultura predada. Esse padrão foi observado tanto para as populações dos biótipos
de B. tabaci predando tomate, quanto para A. woglumi atacando citros, formando o
agrupamento A no dendrograma. As mesmas observações puderam ser feitas para as
populações de insetos encontradas no agrupamento B do dendrograma, uma vez que, B.
tuberculata e A. aepim foram encontradas predando culturas de mandioca. Fazendo-se a
comparação com o trabalho das populações de aleirodídeos atacando cultura de mandioca,
confirmou-se também, nesse trabalho, a baixa similaridade entre estas duas populações.
Por fim, a população de T. vaporariorum apresentou similaridade em torno de 20 % em
relação às populações coletadas em mandioca.
As análises sugerem, mais uma vez, uma possível separação das populações de
aleirodídeos em função da cultura predada. Dessa forma, foram conduzidas análises de
AMOVA para a determinação das fontes de variação entre as populações desse estudo.
Comparando-se os padrões binários produzidos por cada população, observou-se que:
97,75 % da fonte de variação era proveniente de variações entre as populações e 2,25 % de
variações dentro das populações de insetos. Comparando-se a influência das culturas na
separação das populações no dendrograma observou-se que: 59,47 % da variação era
devida a variações entre populações dentro dos grupos, 38,41 % de variações entre os
grupos e 2,13 % de variações dentro das populações. Mais uma vez, exclui-se a
interferência das culturas sobre o padrão de separação das espécies de artrópodos no
dendrograma. Provavelmente, o resultado observado possa ser devido às estratégias
reprodutivas de cada espécie, por exemplo, reprodução assexuada gerando populações
clonais e, dessa forma, isogênicas. Uma vez determinados os perfis eletroforéticos e as
relações filogenéticas das populações de aleirodídeos, estudos poderão ser realizados
usando marcadores desenhados especificamente para cada população de inseto buscando-
se averiguar quais fatores são determinantes para a escolha de uma dada cultura para
predação e para o estabelecimento das populações em uma determinada área.
Por sua vez, foi também possível determinar bandas de DNA candidatas para o
desenvolvimento de marcadores moleculares que sejam específicos para os biótipos de B.
86
tabaci. Essa praga que foi introduzida no país apresenta-se dispersa na maioria dos estados
da federação, provocando prejuízos à produção e causando impactos ao agro-ecossistema.
COMPARAÇÃO DE PERFIS DE MARCADORES MOLECULARES ENTRE B. tabaci
E VÁRIAS ESPÉCIES DE INSETOS DE INTERESSE AGRONÔMICO
Utilizando-se primers de RAPD para a obtenção de perfis de marcadores
moleculares entre os vários insetos de interesse agronômico, foram observadas diferenças
entre os padrões de bandas produzidos pelo biótipo B de B. tabaci em relação aos demais
insetos analisados (Figura 21).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
OPA-04
87
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
OPA-13
Figura 21 – Perfis de marcadores moleculares gerados pela técnica de RAPD utilizando-se
os primers OPA-04 e OPA-13. Os números indicam: 1 a 4, B. tabaci biótipo B; 5 a 8, A.
woglumi; 9 a 12, Trichogramma; 13 a 16, A. grandis; 17 a 20, S. frugiperda; 21 a 24, A.
gemmatalis; 25 a 28, N. gemini. A letra M indica o marcador de massa molecular 100 pb
Ladder. As setas indicam fragmentos de DNA característicos para a o biótipo B de
B. tabaci.
Utilizando-se o primer OPA-04 nas reações de RAPD foram obtidos diferentes
perfis de DNA para cada população de inseto. Observou-se que a população de
Tichogramma produziu um único e forte sinal de amplificação de 450 pb. Para A. grandis
obteve-se uma banda de 400 pb. Para S. frugiperda identificou-se uma banda característica
para essa população de 800 pb. Já a população de A. gemmatalis produziu uma banda de
350 pb específica para essa população. Para N. gemini obteve-se, também, uma banda de
350 pb Entretanto, o perfil de fragmentos de DNA para essa população foi diferente se
comparado com a população de A. gemmatalis. Para B. tabaci biótipo B foram
identificadas três bandas de DNA de 150 pb, 350 pb e 700 pb. Além disso, observou-se
que o perfil eletroforético para esse hemíptero foi diferente se comparado aos perfis de
coleópteros, lepidópteros e himenópteros usados nesse estudo.
Utilizando-se o primer OPA-13 obteve-se uma banda de DNA de 750 pb
característica para A. woglumi. Para a população de Trichogramma foram obtidas duas
bandas características de 450 pb e 550 pb. Já as espécies de lepidópteras apresentaram
intenso polimorfismo variando de 300 pb a 1700 pb. Um resultado interessante foi a
grande semelhança entre os perfis eletroforéticos do biótipo B de B. tabaci e A. grandis. A
diferença entre estas duas espécies ficou relacionada com a presença de duas bandas de
DNA de 1700 pb e 1800 pb que são encontradas apenas na população de B. tabaci biótipo
B. Por meio da técnica de RAPD foi possível identificar diferenças moleculares entre
importantes espécies de insetos de interesse agronômico. Além disso, a técnica de RAPD
revelou possíveis bandas de DNA candidatas à clonagem e ao desenvolvimento de
marcadores mais específicos para a detecção de uma determinada espécie de inseto.
Uma vez obtidos os perfis de marcadores de RAPD entre as populações de inseto,
estes foram usados para a determinação de um dendrograma para a análise do grau de
similaridade entre as espécies analisadas nesse estudo (Figura 22).
88
89
Coefficient
0.09 0.28 0.47 0.66 0.85
tric1MW
1101
1102
1104
1103
ant1
ant2
ant3
ant4
sf1
sf2
sf3
sf4
ag1
ag2
ag3
ag4
ng3
ng1
ng2
ng4
2791
2792
2793
2794
tric1
tric2
tric3
tric4
Bemisia tabaci bióti
p
o B
A
nthonomous
g
randis
S
p
odo
p
tera
f
ru
g
i
p
erda
A
nticarsia
g
emmatalis
Ne
p
has
p
is
A
leurocanthus wo
g
lumi
Tricho
g
ramma
A
B
C
D
E
F
Similaridade
Figura 22 – Determinação do grau de similaridade entre várias populações de insetos
pertencentes a diferentes famílias taxonômicas.
A análise com os cinco primers de RAPD permitiu organizar as populações de
insetos em dois agrupamentos principais. No agrupamento A foram encontradas as
espécies B. tabaci biótipo B, A. grandis, S. frugiperda, A. gemmatalis e N. gemini. Dentro
desse agrupamento, encontrou-se a divisão C compreendendo as espécies B. tabaci biótipo
B e A. grandis que apresentaram 20 % de similaridade genética. Dentro da divisão D foram
encontradas as espécies de lepidópteras S. frugiperda e A. gemmatalis e o coccinelídeo N.
gemini. As lepidópteras formaram um grupo em separado (divisão E) apresentando 32 %
de similaridade filogenética em relação ao coccinelídeo. Entre as lepidópteras, o grau de
similaridade compreendeu 38 %.
Já o agrupamento B ficou constituído pelas espécies A. woglumi e Trichogramma
que apresentaram um grau de similaridade de 23 %.
A distribuição das populações de insetos no dendrograma indicou uma baixa
similaridade genética entre estas espécies, sendo encontrado um grau de similaridade
abaixo de 38 %.
Contudo, o grau de similaridade encontrado dentro de cada população de inseto
ficou acima de 54 % sendo que para B. tabaci biótipo B, encontrou-se o maior valor de
similaridade, ficando em torno de 73 %.
A análise por AMOVA de todas as populações consideradas em conjunto indicou
que 77,04 % da variabilidade encontrada era devida a variações entre as populações e que
22,96 % era devida a variações dentro das populações. Fazendo-se a análise das espécies
distribuídas nos três agrupamentos principais (B, C e D), observou-se que 53,16 % da
variabilidade encontrada era devida a variações entre as populações dentro de cada grupo,
25,26 % era proveniente de variações entre os grupos e que 21,58 % estava relacionada
com variações dentro das populações.
Esses resultados indicaram a possibilidade de seleção de determinados fragmentos
de DNA, gerados por RAPD e específicos para cada espécie, para o desenvolvimento de
kits para a identificação das mesmas. Essa estratégia é particularmente importante para
estudos envolvendo os biótipos de B. tabaci, uma vez que, cada biótipo apresenta
características peculiares e a sua introdução em determinadas regiões do mundo se
constitui em risco quarentenário. Sendo assim, o desenvolvimento de kits diagnósticos, a
partir de bandas de DNA geradas por primers de RAPD, que sejam estritamente
relacionadas a um dado biótipo, é uma ferramenta crucial para a prevenção da entrada de
determinados biótipos em áreas agrícolas, minimizando os prejuízos provocados pela
entrada de espécies exóticas, diminuindo a demanda pelo uso de produtos químicos
nocivos ao homem e ao ambiente, como também, garantindo a manutenção das condições
de elevada produtividade.
Provavelmente, o comportamento revelado nos dendrogramas e nas análises de
variância molecular apontam para um comportamento complexo da mosca branca em
campo. Dessa forma, uma resposta mais adequada para se avaliar o padrão da mosca
branca deve agrupar muitas variáveis, desde a estratégia reprodutiva da espécie até outros
parâmetros, entre eles, comportamentais, ambientais e biológicos.
Dessa forma, em 1999, Bernays apresenta parâmetros comportamentais para B.
tabaci durante a escolha da planta hospedeira. Experimentos com fêmeas adultas de B.
tabaci demonstraram que quando uma mistura de plantas hospedeiras é encontrada em uma
90
área, a performance do inseto é diminuída quando são comparados os mesmos dados
utilizando-se apenas uma planta conhecida como sendo a melhor hospedeira. Em misturas
de plantas hospedeiras, as moscas brancas ficam menos tempo sobre a superfície foliar,
movendo-se a maior parte do seu tempo e mais freqüentemente para novos locais de
alimentação, ficando menos tempo em um determinado ponto de nutrição. O autor sugere
que B. tabaci acaba por perceber locais alternativos de alimentação e que a performance
observada deve estar relacionada com mecanismos de processamento de informação e
tomada de decisão pelo inseto. Os dados apontados pelo autor sugerem que esse
comportamento observado é o resultado de uma perda de atenção característica quando o
inseto está na presença de uma mistura de vários sinais sensoriais complexos. Isso pode
resultar em um efeito de distração e conseqüente redução na tomada de decisão por parte
do inseto.
De Barro e Hart (2000) estudando as interações de acasalamento entre um biótipo
nativo e um exótico de B. tabaci ocorrendo na Austrália, observaram uma redução no
tamanho da população, um aumento na proporção de machos e pouca produção de ovos
por fêmeas acasaladas com machos do outro biótipo. Observou-se, ainda, que não existiam
diferenças na produção de ovos por fêmeas não acasaladas ou por fêmeas acasaladas com
machos do mesmo biótipo. Além disso, quando é feita um mistura entre machos e fêmeas
de biótipos diferentes, o tempo de atividade de corte é maior do que se comparado entre
machos e fêmeas do mesmo biótipo. A partir desses dados, os autores apresentam três
hipóteses para o comportamento sexual e reprodutivo de B. tabaci: 1) hipótese de distração
provocada pelo macho. Nessa hipótese observa-se que casais constituídos por machos e
fêmeas de diferentes biótipos gastam mais tempo na atividade de corte e, assim, as fêmeas
gastam menos tempo na atividade de oviposição, ou seja, machos e fêmeas não se
reconhecem e não terminam o processo de corte com a atividade de acasalamento. Assim,
as fêmeas passam menos tempo em atividade de oviposição, como também, os ovos que
são depositados não são fecundados e geram apenas machos; 2) modelo de determinação
do sexo por complementaridade de locus simples. Esse modelo relaciona que a redução na
oviposição possa ser devida a produção de zigotos de machos diplóides inviáveis. Esse
modelo se apóia no fato de que o sexo é determinado por múltiplos alelos em um único
locus. Nesse locus, fêmeas são heterozigotas (diplóides), machos podem ser hemizigotos
(haplóides) e homozigotos (diplóides). Neste último caso, os machos não são viáveis.
Dessa forma, em um sistema de isolamento pós-acasalamento, os cruzamentos entre
91
membros de colônias diferentes provocam um aumento na heterozigozidade e um aumento
no número de machos diplóides às expensas de fêmeas heterozigotas, resultando em um
aumento nos machos e um declínio no tamanho da colônia. Isso poderia explicar o fato de
que mesmo que machos e fêmeas de biótipos diferentes de B. tabaci consigam terminar o
processo de corte seguindo-se a cópula, ovos de machos diplóides seriam formados durante
a embriogênese e, conseqüentemente, reabsorvidos pela fêmea. O resultado seria a redução
na taxa de crescimento da colônia com a concomitante produção de um número reduzido
de fêmeas, e; 3) incompatibilidade citoplasmática provocada por Wolbachia. Esse
endossimbionte é conhecido por causar completo ou parcial isolamento reprodutivo pós
acasalamento entre espécies ou populações. Se esse for o caso, o resultado será a produção
predominante de machos.
Outro parâmetro importante pode ser a presença de predadores na cultura. Nomikou
et al. (2003) em seu trabalho indicaram que artrópodos herbívoros não selecionam as
plantas hospedeiras apenas pela sua qualidade, mas também, pelo risco de predação
associado a cada planta hospedeira, ou seja, insetos herbívoros excluem plantas com alto
risco de predação do seu perfil de preferência. Essa informação sugere, então, que o inseto
herbívoro assume um constante e previsível risco de predação ao invés de um
comportamento estático. Dessa forma, plantas hospedeiras são ignoradas a respeito do seu
alto risco de predação. A partir dessa informação, os autores relatam que fêmeas adultas de
B. tabaci aprendem a evitar plantas hospedeiras com ácaros predadores que sejam capazes
de atacar as suas formas juvenis. Ao mesmo tempo, B. tabaci é capaz de se estabelecer na
mesma espécie de planta hospedeira desde que esta não possua predadores para os seus
ovos e ninfas. Isso se deve ao fato de que ácaros predadores de mosca branca apresentam
dispersão mais lenta, pois são incapazes de voar e, alternativamente, se deslocam de uma
planta a outra. Sendo assim, evitando plantas com possíveis predadores, as moscas brancas
criam um refúgio temporário para a sua prole. Dessas informações, observa-se que
artrópodos herbívoros fazem a associação dos riscos associados às plantas hospedeiras.
Esse parece ser um critério importante para a tomada de decisão para a seleção da planta
hospedeira.
Sendo assim, ressalta-se a importância de métodos bem estabelecidos para a
identificação de biótipos específicos de mosca branca, evitando-se denominações
diferentes para o mesmo tipo de biótipo em virtude da dinâmica genética dessa espécie.
Perring (2001) em uma revisão a respeito do assunto refere-se à B. tabaci como um
92
complexo de espécies, formado por biótipos e duas espécies crípticas, B. tabaci e B.
argentifolii. Nessa revisão o autor com o auxílio de dados de identificação baseados em
características biológicas, bioquímicas e moleculares, agrupa esse complexo de espécies
em sete grupos: 1) biótipos A, C, N e R do Novo Mundo; 2) biótipos B (B. argentifolii) e
B2 que são cosmopolitas; 3) biótipos E e S; 4) biótipo H; 5) biótipos L, Q e J, e um biótipo
desconhecido encontrado no Egito; 6) biótipo M e dois biótipos desconhecidos e
encontrados em Hainan e na Coréia; 7) biótipo AN. Contudo, nessa mesma publicação, o
autor destaca a falta de métodos bem estabelecidos para a análise dos biótipos visando a
sua identificação e classificação taxonômica. Já em 2005 De Barro et al. por meio de
análises moleculares baseadas no estudo das regiões ITS e COI levantaram a hipótese de
que não existem critérios biológicos e moleculares suficientes para a separação entre
B. tabaci e B. argentifolii e que o termo B. argentifolii deveria não ser utilizado. Esses
dados refletem a complexidade da espécie B. tabaci, uma vez que, dependendo dos
critérios adotados para a análise das populações em questão, dúvidas e inconsistências
taxonômicas e filogenéticas aparecem de forma pronunciada, provocando uma série de
dificuldades para se chegar a um consenso definitivo sobre essa espécie.
Sendo assim, o desenvolvimento de novos critérios de identificação usando outras
marcas moleculares, torna-se imperioso para dirimir dúvidas e para o entendimento da
dinâmica dessa espécie. Em função dessa demanda, bandas de DNA monomórficas,
consistentes e específicas para os biótipos B e BR, provenientes de populações coletadas
em diferentes culturas de várias localidades geográficas e que foram produzidas por perfis
de RAPD (Tabela 15) poderão ser usadas para o desenvolvimento de um método mais
preciso (SCAR, por exemplo) de identificação de biótipos, para o monitoramento da
dispersão e para o entendimento da dinâmica desses biótipos específicos de mosca branca.
93
Tabela 15 – Fragmentos de DNA obtidos pelo emprego de vários primers de RAPD
candidatos ao desenvolvimento de marcadores moleculares específicos (SCAR) para a
identificação dos biótipos B e BR de B. tabaci.
Prim
Biótipo ragmento de RAPD
er
F (pb)
OPA-05 B
600
900
B
400
900
OPA
BR 1000
B
550
1100
-10
OPA
BR 500
B
600
1000
1600
-11
BR 800
OPA
P3 800
B 700
-13
OPA
BR
700
1100
-15
A partir desse ponto, esses dados poderão resultar em informações valiosas para a
elabora
ção de estratégias de controle mais eficientes e servir de referência para a
elaboração de medidas fitossanitárias mais efetivas contra essa espécie de aleirodídeo.
94
REFE NCIAS BIBLIOGRÁFICAS
bdullahi, I., Winter, S., Atiri, G I. e Thottappilly, G. (2003). Molecular characterization
bdullahi, I., Atiri, G. I., Thottappilly, G e Winter, S. (2004). Discrimination of cassava-
gusti, N., De Vicente, M. C. e Gabarra, R. (1999). Development of sequence amplified
asu, A. N. (1995). Bemisia tabaci (Gennadius): crop protection and principal whitefly
ernays, E. A. (1999). When host choice is a problem for a generalist herbivore:
rown, F. J., Cahill, M., Denholm, I. e Devonshire, A. L. (1995). Characterisation and
rown, J. K., Lambert, G. M., Ghanim, M.,Czosnek, H. e Galbrath, D. W. (2005). Nuclear
RÊ
A
of whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) populations infesting cassava.
Bulletin of Entomological Research, 93, 97-106.
A
associated Bemisia tabaci in Africa from polyphagous populations, by PCR_RFLP on the
internal transcribed spacer regions of ribosomal DNA. J. Appl. Entomol., 128, 81-87.
A
characterized region (SCAR) markers of Helicoverpa armigera: a new polymerase chain
reaction-based technique for predator gut analysis. Molecular Ecology, 8, 1467-1474.
B
vector of plant viruses. New Delhi: Westview Press. 183p.
B
experiments with the whitefly, Bemisia tabaci. Ecological Entomology, 24, 260-267.
B
distribution of esterase electrophoresis in the whitefly, Bemisia tabaci (Genn.)
(Homoptera: Aleyrodidae). Biochem. Genetics, 33, 205-214.
B
DNA content of the whitefly Bemisia tabaci (Aleyrodidae: Hemiptera) estimated by flow
cytometry. Bulletin of Entomological Research, 95, 309-312.
95
Burban, C., Fishpool, L. D. C., Fauquet, C., Fargette, D. e Thouvenel, J. –C. (1992). Host-
associated biotypes within West African populations of the whitefly Bemisia tabaci
(Genn.). (Hom., Aleyrodidae). J. Appl. Ent., 113, 416-423.
Byrne, D. N. e Bellows, T. S. (1991). Whitefly biology. Annu. Rev. Entomol., 36, 431-
457.
Cervera, M. T., Cabezas, J. A., Simon, B., Martinez-Zapater, J. M., Beitia, F. e Cenis, J. L.
(2000). Genetic relationship among biotypes of Bemisia tabaci (Hemíptera: Aleyrodidae)
based onAFLP analysis. Bulletin of Entomological Research, 90, 391-396.
Coats, S. A., Brown, J. K. e Hendrix, D. L. (1994). Biochemical characterization of
biotype-specific esterase in the whitefly, Bemisia tabaci Genn (Homoptera: Aleyrodidae).
Insect Biochem. Molec. Biol., 24 (7), 723-728.
De Barro, P. J. e Driver, F. (1997). Use of RAPD-PCR to distinguish teh B biotype from
other biotypes of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Australian
Journal of Entomology, 36, 149-152.
De Barro, P. J., Driver, F., Trueman, J. W. H. e Curran, J. (1999). Phylogenetic
relationship of world populations of Bemisia tabaci (Gennadius) using ribosomal ITS1.
Molecular Phylogenetics and evolution, 16 (1), 29-36.
De Barro, P. J. e Hart, P. J. (2000). Mating interactions between two biotypes of the
whitefly, Bemisia tabaci (Hemíptera: Aleyrodidae) in Austrália. Bulletin of
Entomological Research, 90, 103-112.
De Barro, P. J. (2005). Genetic structure of the whitefly Bemisia tabaci in the Asia-Pacific
region revealed using microsatellite markers. Molecular Ecology, 14, 3695-3718.
De Barro, P. J., Trueman, J. W. H. e Frohlich, D. R. (2005). Bemisia argentifolii is a race
of B. tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae): the molecular genetic differentiation of B. tabaci
populations around the world. Bulletin of Entomological Research, 95, 193-203.
96
Fauquet, C. e Fargette, D. (1990). African cassava mosaic virus: etiology, epidemiology,
and control. Plant Disease, 74, 404-411.
Ferreira, M. E. e Grattapaglia, D. (1998). Introdução ao uso de marcadores moleculares em
análise genética. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN, 220 pp.
Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G. e Brown, J. K. (1999). A
phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial
DNA markers. Molecular Ecology, 8, 1683-1691.
Frutos, R., Federici B. A., Revet, B. e Bergoin, M. (1994). Taxonomic studies of
Rickettsiella, Rickettsia, and Chlamydia using genomic DNA. J. Invertebr. Pathol., 63,
294-300.
Gawel, N. J. e Bartlett, A.C. (1993). Characterization of differences between whiteflies
using RAPD-PCR. Insect Molecular Biology, 2 (1), 33-38.
Guirao P., Beitia, F e Cenis, J. L. (1994). Aplicación de la técnica RAPD-PCR a la
toxonomía de moscas blancas (Homotera, Aleyrodidae). Bol. San. Veg. Plagas, 20, 757-
764.
Gunning, R. V., Byrne, F. J. e Devonshire, A. L. (1997). Electrophoretic analysis of non-B
and B-biotype Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) in Australia.
Australian Journal of Entomology, 36, 245-249.
Haymer, D. S. (1994). Arbitrary (RAPD) primer sequences used in insect studies. Insect
Molecular Biology, 3 (3), 191-194.
Kirk, A. A., Lacey, L. A., Brown, J. K., Ciomperlik, M. A., Goolsby, J. A., Vacek, D. C.,
Wendel, L. E. e Napompeth, B. (2000). Variation in the Bemisia tabaci s. 1. species
complex (Hemiptera: Aleyrodidae) and its natural enemies leading to successful biological
control of Bemisia biotype B in the USA. Bulletin of Entomological Research, 90, 317-
327.
97
Legg, J. P. (1999). Emergence, spread and strategies for controlling the pandemic of
cassava mosaic vírus isease in east and central África. Crop protection, 18, 627-637.
Lima, L. H., Campos, L., Moretzsohn, M. C., Návia, D., Ribeiro e Silva, O. L. e Oliveira,
M. R. V. (1999). II. Populações de Bemisia tabaci (Gennadius) raça B no Brasil: análise da
diversidade genética por RAPD. Pesquisa em Andamento, 99, 1-6.
Lima, L. H. C., Návia, D., Inglis, P. W. e de Oliveira, M. R. V. (2000). Survey of Bemisia
tabaci (Gennadius) (Hemíptera: Aleyrodidae) biotypes in Brazil using RAPD markers.
Genetics and Molecular Biology, 23 (4), 781-785.
Liu, H. Y., Cohen, S. e Duffus, J. E. (1992). The use of isozyme patterns to distinguish
sweetpotato whitefly (Bemisia tabaci) biotypes. Phytoárasitica, 20 (3), 187-194.
Martinez, S. S., de Carvalho, A. O. R., Vieira, L. G. Nunes, L. M. e Bianchini, A. (2000).
Identification, geographical distribution and host plants of Bemisia tabaci (Genn.) biotypes
(Homoptera: Aleyrodidae) in the state of Paraná, Brazil. An. Soc. Entomol. Brasil, 29 (3),
597-603.
Maruthi, M. N., Colvin, J. e Seal, S. (2001). Mating compatibility, life-history traits, and
RAPD-PCR variation in Bemisia tabaci associated with the cassava mosaic disease
pandemic in East Africa. Entomologia Experimentalis et Applicata, 99, 13-23.
Monnerat, R.G., Leal-Bertioli, S., Bertioli, D., Butt, T. e Bordat, D. (2004). Variabilidade
genética do parasitóide Diadegma sp. através de RAPD-PCR. Horticultura Brasileira, 22
(1), 90-92.
Moya, A., Guirao, P., Cifuentes, D., Beitias, F. e Cenis, J. L. (2001). Genetic diversity of
Iberian populations of Bemisia tabaci (Hemíptera: Aleyrodidae) based on random
amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction. Molecular Ecology, 10, 891-897.
Nomikou, M., Janssen, A. e Sabelis, M. W. (2003). Herbivore host plant selection:
whitefly learns to avoid host plants that harbour predators of her offspring. Oecologia, 136,
484–488.
98
Oliveira, M. R. V., Lima, L. H. e Ferreira, L. T. (1997). Análise eletroforética de
populações da mosca-branca, Bemisia tabaci raça B (= B. argentifolii) (Homoptera,
Aleyrodidae). Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA. Pesquisa em
andamento, 11, 1–6.
Oliveira, M. R. V., Lima, L. H. C., Návia, D. e Vieira, P. R. G. (1998). Avaliação das
populações de Bemisia tabaci (Gennadius) através de RAPD-PCR, no Brasil.. Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA. Pesquisa em andamento, 18, 1–6.
Perring, T. M., Cooper, A. e Kazmer, D. J. (1992). Identification of the poinsetia strain of
Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) on broccoli by electrophoresis. J. Econ.
Entomol., 85 (4), 1278-1284.
Perring, T. M., Cooper, A. D., Rodriguez, R. J., Farrar, C. A. e Bellows, T. S. (1993).
Identification of a whitefly species by genomic and behavioral studies. Science, 259, 74-
77.
Perring, T. M. (2001). The Bemisia tabaci species complex. Crop Protection, 20, 725-
737.
Queiroz, P. R., Martins, E. S., Monneratt, R. G. e Lima, L. H. C. (2004). Análise da
variabilidade de uma população de Spodoptera frugiperda (J.E. SMITH, 1797)
(Lepidóptera: Noctuidae) por meio de marcadores moleculares RAPD. Boletim de
pesquisa e desenvolvimento, 75, 18 p.
Rohlf, F. J. (1993). NTSYS-pc. Numerical taxonomy and multivariate system. Version
1.80. Applies Biostatistics Inc., New York.
Ronda, M., Adán, A., Cifuentes, D., Cenis, J. L. e Beitia, F. (1999). Laboratory evidence of
interbreeding between biotypes of Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) present in
Spain. Abstracts VII international Plant Virus Epidemiology Sumposium, Aguadulce
(Almería), pp. 83-84.
99
Ryckewaert, P. e Alauzet, C. (2001). Characterization of Bemisia (Hom., Aleyrodidae)
from the lesser Antilles by electrophoresis. J. Appl. Ent., 125, 263-266.
Schneider, S., Roessli, D. e Excoffier, L. (2000). Arlequin ver. 2000: A software for
populations genetics data analysis. Genetics and biometry laboratory. University of
Geneva, Switzerland.
Sneath, P. H. A. e Sokal, R. R. (1973). Numerical Taxonomy. Freeman: San Francisco.
573 pp.
Sosa-Gómez, D. R., Tigano, M. S. e Arantes, O. M. N. (1998). Caracterização de
entomopatógenos. In: Controle Microbiano de Insetos, (ed. Alves, S. B.), Piracicaba – SP,
FEALQ = Fundação de Estudos Agrários Luiz de Queiroz, pp. 731-763.
Viscarret, M. M., Torres-Jerez, I., Agostini de Manero, E., López, S. N., Botto, E. E. e
Brown, J. K. (2003). Mitochondrial DNA evidence for a distinct new world group of
Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) indigenous to Argentina and
Bolívia, and presence of the old world B biotype in Argentina. Ann. Entomol. Soc. Am.,
96 (1), 65-72.
Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A. e Tingey, S.V. (1990). DNA
polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids
Research, 18 (22), 6531-6535.
Wool, D., Gerling, D., Nolt, B. L., Constantino, L. M., Bellotti, A. C. e Morales, F. J.
(1989). The use of electrophoresis for identification of adult whiteflies (Homoptera:
Aleyrodidae) in Israel and Colombia. J. Appl. Entomol., 107, 344-350.
Wool., D., Gerling, D. Bellotti, A. C., Morales, F. J. e Nolt, B. (1991). Spatial and
temporal genetic variation in populations of the whitefly Bemisia tabaci (Genn.) in Israel
and Colombia: an interim report. Insect Sci. Appl., 12, 225-230.
Wool, D., Calvert, L., Constantino, L. M., Bellotti, A. C. e Gerling, D. (1994).
Differentiation of Bemisia tabaci (Genn.) (Hom., Aleyrodidae) populations in Colombia. J.
Appl. Ent., 117, 122-134.
100
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abe, H., Harada, T., Kanebara, M., Shimada, T., Ohbayashi, F. e Oshiki, T. (1998).
Genetic mapping of RAPD markers linked to the densonucleosis refractioness gene, nsd-1,
in the silkworn, Bombyx mori. Genes Genet. Syst., 73, 237-242.
Agusti, N., De Vicente, M. C. e Gabarra, R. (1999). Development of sequence amplified
characterized region (SCAR) markers of Helicoverpa armigera: a new polymerase chain
ervera, M. T., Cabezas, J. A., Simon, B., Martinez-Zapater, J. M., Beitia, F. e Cenis, J. L.
000). Genetic relationship among biotypes of Bemisia tabaci (Hemíptera: Aleyrodidae)
ase don AFLP analysis. Bulletin of Entomological Research, 90, 391-396.
uirao, P. Beitia, F e Cenis, J. L. (1997). Biotype determination in Spanish populations of
reaction-based technique for predator gut analysis. Molecular Ecology, 8, 1467-1474.
Agusti, N., de Vicente, M. C. e Gabarra, R. (2000). Developing SCAR markers to study
predation on Trialeurodis vaporariorum. Insect Molecular Biology, 9 (3), 263-268.
Behura, S. K., Sahu, S. C., Rajamani, S., Devi, A., Mago, R. Nair, S. e Mohan, M.
Differentiation of asian rice gall midge, Orseolia oryzae (Wood-Mason), byotipes by
sequence characterized amplified regions (SCARs). Insect Molecular Ecology, 8 (3), 391-
397.
Borém, A. e Dos Santos, F. R. (2002). Marcadores moleculares. In: Biotecnologia
simplificada. Editora Suprema: Viçosa-MG. 249 p.
Botstein, D., White, R. L., Skolnick, M., Davis, R. V. (1980). Construction of a genetic
linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum.
Genet., 32, 314-331.
C
(2
b
G
Bemisia tabaci (Hemíptera: Aleyrodidae). Bulletin of Entomological Research, 87, 587-
593.
147
Horowitz, A. R., Kontsedalov, S. Khasdan, V e Ishaaya, I. (2005). Biotypes B and Q of
Bemisia tabaci and their relevance to neonicotinoid and pyriproxyfen resistance. Archieve
of Insect Biochemistry and Physiology, 58, 216-225.
Jain, A., Ariyadasa, R., Kumar, A. Srivastava, M. N., Mohan, M e Nair, S. (2004). Tagging
and mapping of a rice gall midge resistance gene, Gm8, and development of SCARs for
se in marker-aided selection and gene pyramiding. Theor. Appl. Genet., 109, 1377-1384.
ethidi, D. R., Roden, D. B., Ladd, T. R., Krell, P. J., Retnakaran, A. e Feng, Q. (2003).
hysiology, 52, 193-204.
ucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am. J. Hum.
enet., 44, 388-396.
ational, 102,
11-119.
mans, M. (2002). SCAR markers and multiplex PCR-based identification of
omorphic species in the Anopheles dirus complex in Southeast Asia. Medical and
ções no melhoramento de plantas.
ttp://www.biotecnologia.com.br/revista/bio05/marcadoresdna.pdf
u
Jeffreys, A. J., Wilson, V., Thein, S. L. (1985). Hypervariable 'minisatelite' regions in
human DNA. Nature, 316, 76-79.
K
Development of SCAR markers for the DNA-based detection of the asian long-horned
beetle, Anoplophora glabripennis (Motschulsky). Archives of insect Biochemistry and
P
Litt, M. e Luty, J.A. (1989). A hypervariable microsatellite revealed by in vitro
amplification of a din
G
Malgorn, Y. e Coquoz, R. (1999). DNA typing for identification of some species of
Calliphoridae. An interest in forensic entomology. Forensic Science Intern
1
Manguin, S., Kengne, P., Sonnier, L., Harbach, R. E., Baimai, V. Trung, H. D. e
Coose
is
Veterinary Entomology, 16, 46-54.
Milach, S. C. K. (2005). Marcadores de DNA. Aplica
h acesso em 23/12/2005.
148
Monnerat, R.G., Leal-Bertioli, S., Bertioli, D., Butt, T. e Bordat, D. (2004). Variabilidade
aran, I. e Michelmore, R. W. (1993). Development of reliable PCR-based markers linked
ins, E. S., Monneratt, R. G. e Lima, L.H.C. (2004). Análise da
ariabilidade de uma população de Spodoptera frugiperda (J.E. SMITH, 1797)
abello, A. R., Queiroz, P. R., Simões, K. C., Hiragi, C. O., Lima, L. H. C., Oliveira, M.
omanowski, G., Lorenz, M. G. e Wackernagel, W. (1993), Use of polymerase chain
446.
etween biotypes of Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) present in
pain. Abstracts VII international Plant Virus Epidemiology Sumposium, Aguadulce
nalysis of morphological variation in distinct populations of Bemisia tabaci (Homoptera:
Aleyrodidae). Ann. Entomol. Soc. Am., 90, 575-589.
Genética do Parasitóide Diadegma sp. através de RAPD-PCR. Horticultura Brasileira,
22 (1), 90-92.
Moya, A., Guirao, P., Cifuentes, D., Beitias, F. e Cenis, J. L. (2001). Genetic diversity of
Iberian populations of Bemisia tabaci (Hemíptera: Aleyrodidae) base don random
amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction. Molecular Ecology, 10, 891-897.
P
to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Genet., 85, 985-993.
Queiroz, P. R., Mart
v
(Lepidotera: Noctuidae) por meio de marcadores moleculares RAPD. Boletim de pesquisa
e desenvolvimento, 75, 18 p.
R
R. V. e Mehta, A. (2005). Diferenciação de biótipos de Bemisia tabaci utilizando PCR-
RFLP e sequenciamento da região ITS1 rDNA. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento,
95, 24 p.
R
reaction and electroporation of Escherichia coli to monitor the persistance of extracellular
plasmid DNA introduced into natural soils. Appl. Environ. Microbiol., 59(10), 3438-
3
Ronda, M., Adán, A., Cifuentes, D., Cenis, J. L. e Beitia, F. (1999). Laboratory evidence of
interbreeding b
S
(Almería), pp. 83-84.
Rosell, R. C., Bedford, J. D., Frohlich, D. R., Brown, J. K. e Markham, P. G. (1997).
A
149
Simon, J. C., Letreme, N. e Latorre, A. (1999). Molecular markers linked to breeding
stem differences in segregating and natural populations of the cereal aphid
hain reaction. Appl. Environ. Microbiol., 58, 754-757.
illiams, J. G. K., Kubelik, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A. e Tingey, S. V. (1990).
sy
Rhopalosiphum padi L. (1999). Molecular Ecology, 8, 965-973.
Tsai, Y. –L. e Olson, B. H. (1992a). Detection of low numbers of bacterial cells in soils
and sediments by polymerase c
Tsai, Y. –L. e Olson, B. H. (1992b). Rapid method for separation of bacterial DNA from
humic substances in sediments by polymerase chain reaction. Appl. Environ. Microbiol.,
58, 2292-2295.
W
DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic
Acids Research, 18, 6531-6535,
150
Conclusão Geral
A importância econômica da mosca branca B. tabaci como praga vem se
xpandindo em todo o mundo, inclusive na agricultura brasileira. Essa espécie pode ser
des e o seu amplo espectro de plantas hospedeiras,
cluindo espécies vegetais daninhas, ornamentais e agrícolas.
Dos resultados obtidos nos experimentos de identificação molecular, foi possível
bservar a rápida dispersão do biótipo B para todas as unidades da federação e, em função
a elevada diversidade genética, obtida pelas análises moleculares, ressalta-se a
omplexidade da espécie B. tabaci. Além disso, os resultados obtidos dos estudos de
opulação sugerem que dentro do biótipo B, possa haver distinções entre os indivíduos de
cordo com a cultura predada. Provavelmente, a variabilidade genética encontrada nas
opulações de B. tabaci biótipo B possa ser o reflexo da estratégia reprodutiva adotada
ela espécie para superar condições adversas, tais como, a pressão provocada por
bstâncias químicas. Sendo assim, a cultura predada pelos indivíduos não influenciaria
iretamente na dinâmica dos marcadores moleculares na população. Os efeitos combinados
a baixa freqüência de migração em associação com o efeito clonal produzido pela
tividade partenogenética da espécie podem ser as responsáveis pela identificação de perfis
oleculares específicos em cada amostra analisada. Os ciclos de reprodução podem ser
stratégias adotadas para a garantia do estabelecimento da população em uma dada cultura
para promover o aumento de variabilidade quando em condições de pressão de seleção.
sses eventos somados podem ser os responsáveis pela considerável variação dentro de um
esmo biótipo.
Dos dados obtidos ao longo do estudo observa-se a extrema complexidade da
espécie B. tabaci. Essa complexid aracterização molecular, onde as
nálises de agrupamento pelo programa NTsys-pc indicaram, inicialmente, a separação
e
encontrada em quase todas as regiões do mundo em virtude da sua grande adaptabilidade e
resistência a pesticidas. Essas características biológicas vêm favorecendo a sua dispersão,
sobrevivência em várias localida
in
o
d
c
p
a
p
p
su
d
d
a
m
e
e
E
m
ade se revelou na c
a
dentro do biótipo B de B. tabaci em função das culturas hospedeiras.
Fazendo-se uma análise pormenorizada dos dados anteriores, por meio das
determinações de variância molecular (AMOVA), estas revelaram que a maior fonte de
variabilidade era originária de diferenças entre as populações do que em relação a
variações dentro das populações.
151
152
Fatores que influenciam a distribuição
das populações de B. tabaci:
* Predadores;
* Outros biótip
es atizado na figura 47.
os;
de B. tabaci na seleção de suas plantas hospedeiras poderia ser
quem
Figura
Esse fenômeno pode ser devido a extrema habilidade desse inseto em discernir
culturas onde estejam presentes possíveis predadores. De alguma forma, a fêmea adulta é
capaz de avaliar as possíveis culturas que sejam mais seguras para a sua oviposição e
instalação da população.
Somado-se a esse fator está ainda a capacidade de B. tabaci selecionar a espécie
hospedeira. Em função de ser uma espécie generalista, B. tabaci é capaz de selecionar,
provavelmente, por estímulos sensoriais, as espécies vegetais hospedeiras mais adequadas
para a oviposição e que forneçam os melhores recursos para a manutenção da sua prole.
Além disso, existe ainda, a possibilidade de interferência no processo de corte
quando machos de mais de um biótipo coabitam um mesmo local de nutrição. Nesse
processo, o macho de um biótipo interfere no comportamento sexual de acasalamento,
resultando em uma alteração na proporção entre machos e fêmeas dentro da população
daquele biótipo.
Outro fator que não pode ser desprezado é a ação dos produtos químicos que atuam
selecionando populações cada vez mais resistentes em uma determinada localidade.
Em virtude de todas essas variáveis, um modelo plausível para se tentar entender o
comportamento
* Disponibilidade de hospedeiros;
* Competição entre populações.
47 – Modelo descritivo para a dispersão e a instalação de populações de B. tabaci
biótipo B em diferentes culturas distribuídas em várias áreas geográficas. Os números
indicam as populações de um mesmo biótipo de B. tabaci. O sinal indica a presença do
marcador molecular detectado pela técnica de SCAR.
fariam uma avaliação da relação custo-benefício na escolha de uma
determ
nça na
icial poderiam se separar e, cada uma, se estabelecer em uma
eterminada planta hospedeira seja planta daninha, ornamental ou de interesse agrícola. A
artir desse estabelecimento inicial, a fêmea seria responsável pela oviposição e
stabelecimento de uma população clonal em uma determinada planta hospedeira. Sendo
ssim, o perfil de marcadores moleculares praticamente não apresentaria variação em
irtude da reprodução assexuada. Isso é confirmado pelos perfis de marcadores RAPD que
ram observados nas populações analisadas nesse estudo. No dendrograma, essas
opulações apresentaram elevada similaridade genética intrapopulacional sugerindo,
icialmente, uma diferenciação em função da cultura predada. A análise de AMOVA
força essa hipótese, pois, foi encontrada maior variação entre populações do que dentro
as populações.
Em seguida, pelo tratamento dado a cada cultura seja pela forma de cultivo
iar a suposição da formação de uma
ova espécie. O resultado observado nesse estudo seria o efeito das estratégias adotadas
Nesse modelo poderia se propor um comportamento para o estabelecimento das
populações de B. tabaci em uma determinada região geográfica. A população colonizadora
inicial seria representada por diferentes fêmeas, cada uma pertencendo ao biótipo B de B.
tabaci, mas com sutis diferenças em alguns de seus marcadores moleculares. A partir desse
ponto, as fêmeas
inada cultura hospedeira. Essa relação levaria em consideração questões tais como,
presença de ácaros predadores em uma determinada cultura, a influência da prese
região de monoculturas ou não e a interferência provocada por outros biótipos da mesma
espécie, já presentes, na planta hospedeira. Em virtude dessa tomada de decisão, as fêmeas
da população colonizadora in
d
p
e
a
v
fo
p
in
re
d
(orgânica ou não) e pela aplicação de coquetéis de inseticidas, populações resistentes
poderiam ser selecionadas reforçando a manutenção de uma população clonal com um
perfil de marcador ligeiramente diferente das demais populações do mesmo biótipo.
Entretanto, essa variação não seria suficiente para apo
n
pelas fêmeas de B. tabaci em função das melhores escolhas de recursos e proteção para o
desenvolvimento de sua prole.
Independentemente desses fatos, observou-se, também, que determinados
marcadores moleculares de RAPD apresentaram comportamento monomórfico e
consistente, sendo encontrados em várias populações de um mesmo bióipo de B. tabaci
quando coletadas em várias culturas de diferentes localidades do Brasil ao longo de
diferentes anos de estudo. Esse dado reforçou então a possibilidade do desenvolvimento de
um novo marcador que fosse mais preciso e eficiente do que os marcadores baseados em
153
RAPD. Esse marcador denominado SCAR caracteriza-se por uma reação de PCR
específica para um dado biótipo. A alta sensibilidade dos marcadores SCAR associada com
a sua acurácia permitiram o desenvolvimento de ferramentas moleculares seguras para a
identificação de biótipos de mosca branca, B. tabaci. A partir da identificação de
fragmentos de RAPD específicos para os biótipos B e BR de B. tabaci foi possível o
desenvolvimento de conjuntos de primers para a identificação de biótipos de ocorrência no
Brasil.
Além disso, esses primers mostraram-se específicos para cada biótipo, não havendo
sinal de amplificação caso haja a presença de DNA originário de outras espécies de
insetos. Dessa forma, foi possível o estabelecimento de testes de identificação de biótipos
de B. tabaci por meio da técnica de SCAR.
A partir
Amostra suspeita
Kit BT-B1
154
SIM
NÃO
B. tabaci biótipo BR
Kit BT-BR1
SIM NÃO
Biótipo não BR
B. tabaci biótipo B
Kit BT-B3
SIM NÃO
B. tabaci biótipo B
B. tabaci biótipo Q
Biótipo não B
das informações geradas pelos marcadores SCAR foi possível a
organiz
para a detecção e a identificação de biótipos de B. tabaci.
ação de um fluxograma para a tomada de decisões quanto à identificação molecular
dos biótipos de B. tabaci (Figura 48).
Figura 48 – Fluxograma para a tomada de decisões quanto à utilização dos primers de
SCAR e
A vantagem dessa estratégia molecular reside no fato da possibilidade de se reduzir
o tempo para a elaboração de laudo quarentenário de 36 h para 12 h. Isso permite então
tomadas de decisão mais rápidas para o controle da entrada de B. tabaci em áreas ainda
livres dessa praga agrícola. Além disso, os marcadores SCAR que foram desenvolvidos
permiti
o biótipo dessa praga quarentenária.
ram identificar os biótipos B e BR de B. tabaci mesmo que ainda não se conheçam
todas as características biológicas e comportamentais desse inseto, permitindo identificar
com segurança populações de um mesm
155
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