SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS................................................................................................. v
LISTA DE FIGURAS.................................................................................................. vi
LISTA DE ABREVIATURAS.................................................................................... viii
RESUMO...................................................................................................................... ix
ABSTRACT................................................................................................................. x
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................ 1
1.1 FIXAÇÃO BIOLÓGICA DE NITROGÊNIO........................................................ 1
1.2 ORGANIZAÇÃO DOS GENES nif E mod EM DIAZOTROFOS 3
1.3 METABOLISMO DE MOLIBDATO.................................................................... 6
1.3.1 Transporte de Molibdato em Bactéria.................................................................. 8
1.3.1.1 Sistema de transporte de molibdênio e regulação em E. coli............................ 9
1.3.1.2 Proteína ModE................................................................................................... 15
1.4 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE MOLIBDOENZIMAS EM E. coli............ 20
1.5 Herbaspirillum seropedicae.................................................................................... 23
2 OBJETIVOS............................................................................................................. 25
2.1 OBJETIVO GERAL................................................................................................ 25
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................. 25
3 MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................... 26
3.1 BACTÉRIAS E PLASMÍDEOS............................................................................. 26
3.2 MEIOS DE CULTURA.......................................................................................... 28
3.3 ANTIBIÓTICOS..................................................................................................... 29
3.4 ESTOCAGEM......................................................................................................... 29
3.5 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA............................................................ 30
3.5.1 Mini-preparação de Plasmídeos........................................................................... 30
3.5.2 Extração de DNA Cromossomal.......................................................................... 31
3.5.3 Purificação de DNA em gel de Agarose de Baixo Ponto de Fusão...................... 31
3.6 ELETROFORESE EM GEL DE ÁGAR................................................................ 32
3.7 ESTRATÉGIAS DE CLONAGEM........................................................................ 33
3.7.1 Digestão com Endonucleases de Restrição.......................................................... 33
3.7.2 Ligação de DNA................................................................................................... 33
3.8 TRANSFORMAÇÃO POR ELETROPORAÇÃO................................................. 34
3.8.1 Preparo de Células Eletrocompetentes................................................................. 34
3.8.2 Eletroporação........................................................................................................ 35
3.9 SEQUENCIAMENTO DE DNA............................................................................ 36
3.9.1 Reação de Sequenciamento.................................................................................. 36
3.9.2 Edição e Análise das Sequências.......................................................................... 36
3.10 MUTAGÊNESE.................................................................................................... 37
3.10.1 Mutagênese Sítio Dirigida.................................................................................. 37
3.10.2 Mutagênese de H. seropedicae........................................................................... 41
3.10.3 Hibridização de DNA (Southern Blot)............................................................... 41
3.10.3.1 Digestão do DNA cromossomal e separação em gel de agarose..................... 41
3.10.3.2 Transformação e fixação do DNA à membrana de
nylon..............................................................................................................................
42
3.10.3.3 Preparo da sonda de DNA marcada com [
32
P]dCTP....................................... 42
3.10.3.4 Pré-hibridização e hibridização....................................................................... 43
3.11 EXPERIMENTOS DE FISIOLOGIA................................................................... 44