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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
GISELDA MATOS XAVIER
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS GENES CODIFICADORES DE VP4 E VP7
DE ROTAVÍRUS DE SUÍNOS E HUMANOS
Campos dos Goytacazes
2008
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GISELDA MATOS XAVIER
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS GENES CODIFICADORES DE VP4 E
VP7 DE ROTAVÍRUS DE SUÍNOS E HUMANOS
Tese apresentada ao Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
como parte das exigências para obtenção do
título de Doutora em Produção Animal
ORIENTADOR: Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos
Campos dos Goytacazes
2008
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GISELDA MATOS XAVIER
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS GENES CODIFICADORES DE VP4 E
VP7 DE ROTAVÍRUS DE SUÍNOS E HUMANOS
Tese apresentada ao Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
como parte das exigências para obtenção do
título de Doutora em Produção Animal
Aprovada em de março de 2008
Banca examinadora
Dr. Victor Martin Quintana Flores (Doutor – Biociências e Bitecnologia) - UENF
Dra. Adriane Nunes de Souza (Doutora – Ciências/Biologia da Agricultura e Ambiente) –
UENF
Prof.
Cláudio de Moraes Andrade (Doutor – Microbiologia) - PESAGRO
Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos (Doutor, Microbiologia) – UENF
(Orientador)
A meus amores: Lucila, Gisele e Marlon
v
AGRADECIMENTO
Agradeço a Deus pelas vitórias e, principalmente, pelos desafios superados
durante a realização deste trabalho;
À minha mãe Lucila, pelo exemplo de persistência e paciência;
À minha irmã Gisele, pelo carinho e dedicação dispensados;
Ao meu esposo Marlon, pelo exemplo de competência e minuciosidade
durante a redação e pela compreensão, paciência e amor durante a finalização
deste trabalho;
Ao meu orientador Prof. Carlos Eurico Travassos, por ter acreditado e
confiado em mim para realização deste trabalho;
Ao Prof. Gonçalo Apolinário de Souza Filho, pela preciosíssima orientação;
A Valéria Marques e Verônica, técnicas do NAG, pela amizade,
companheirismo e cumplicidade;
A Iliani Bianchi e Joseane Oliveira, pela paciência e bom humor durante os
momentos nos quais parecia impossível prosseguir;
A FENORTE, pelo auxílio financeiro;
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a concretização
deste trabalho.
vi
“A persistência é o caminho
do êxito.”
Charles Chaplin
vii
RESUMO
Os rotavírus são os principais vírus associados à gastroenterite em humanos e
animais, e geram prejuízos econômicos e sociais tanto em países desenvolvidos
como em países em desenvolvimento. A principal meta para controle da rotavirose é
a imunização dirigida contra as cepas circulantes pelo mundo. Entretanto, para tal,
se faz necessário a vigilância epidemiológica, a partir da classificação molecular
destas cepas a fim de instituir um programa de imunização específico e eficaz.
Dentre as técnicas utilizadas para classificação molecular dos rotavírus destacam-se
a RT-PCR seguida por Nested-PCR e o seqüenciamento. Este estudo objetivou
analisar as seqüências de nucleotídeos de dois segmentos genéticos de rotavírus
recuperados de quatro amostras fecais de suínos e duas de humanos. O
seqüenciamento foi dirigido para os genes que codificam as proteínas VP4 e VP7,
que induzem a resposta imunitária de modo independente e foi aplicado a todas as
amostras testadas. Somente três amostras foram efetivamente seqüenciadas e
geraram fragmentos de tamanho esperado para o gene de VP7 (1062 pares de
bases). O gene de VP4 não foi seqüenciado em nenhuma amostra testada. Os
resultados indicam que os rotavírus circulantes pertencem ao genotipo G9 (amostra
79), G5 (amostra 204) e G1 (amostra Hum-1) e compartilham alta similaridade entre
amostras de suínos e de humanos, comprovando a diversidade genética
característica dos RVs.
viii
ABSTRACT
Rotaviruses are the most viruses associated to gastroenteritis in humans and
animals, causing economic and social burden both in developed countries and in
developing countries. To control rotavirus disease by vaccination, it is necessary
epidemiological surveillance from the molecular classification of these strains and
establishing a program of immunization specific and effective. Among the techniques
used for molecular classification of rotavirus it is the RT-PCR followed by nested-
PCR and sequencing. The present study aimed to characterize the VP4 and VP7
encoding genes of porcine and human samples. Just three samples were sequenced
and generated fragments of size expected for the gene of VP7 (1062 pairs of bases).
VP4 gene was not sequencing in any sample tested. The results indicate that
circulating rotavirus belong to genotype G9 (sample 79), G5 (sample 204) and G1
(sample Hum-1) and share high similarity between samples of pigs and humans,
proving the genetic diversity characteristic of the RVs.
Key words: rotavirus, VP7, G-type
ix
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................1
2. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................3
2.1. Histórico ...............................................................................................................3
2.2. Morfologia.............................................................................................................3
2.3. Classificação dos RVs..........................................................................................6
2.3.1. Sorogrupos e subgrupos ...................................................................................6
2.3.2. Sorotipos e genotipos........................................................................................6
2.4. Genoma dos RVs .................................................................................................7
2.4.1. Diversidade do genoma dos RVs....................................................................10
2.4.1.1. Mutações pontuais .......................................................................................10
2.4.1.2. Recombinação genética (“reassortment”) ....................................................11
2.4.1.3. Rearranjo genômico .....................................................................................12
2.4.1.4. Transmissão interespécies...........................................................................13
2.5. Proteínas dos RVs .............................................................................................15
2.5.1. Proteínas estruturais .......................................................................................15
2.5.1.1. Proteínas do cerne .......................................................................................15
2.5.1.2. Proteínas da camada intermediária..............................................................16
2.5.1.3. Proteínas da camada externa ......................................................................16
2.5.2. Proteínas não-estruturais ................................................................................18
2.6. Prejuízos causados por rotavírus .......................................................................19
2.7. Epidemiologia molecular dos RVs......................................................................21
2.7.1 Importância.......................................................................................................21
2.7.2. Tipos G e P .....................................................................................................21
2.7.3. Evolução e filogenia molecular........................................................................24
2.8. Patogênese viral.................................................................................................24
2.9. Replicação viral ..................................................................................................26
2.10. Apresentação clínica ........................................................................................27
2.11. Diagnóstico.......................................................................................................29
2.12. Tratamento, controle e prevenção....................................................................29
3. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................32
3.1. Obtenção e viabilidade das amostras ................................................................32
3.2. Extração de RNA de fita dupla ...........................................................................32
x
3.3. RT-PCR - Reação em cadeia da polimerase precedida de transcrição reversa 33
3.4. Visualização dos produtos da RT-PCR (amplicons)...........................................34
3.5. Precipitação, quantificação e seqüenciamento do DNA.....................................35
3.6. Análise das seqüências......................................................................................36
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................38
4.1. RT-PCR..............................................................................................................38
4.2. Seqüenciamento ................................................................................................40
5. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS .....................................................................48
6. REFERÊNCIAS.....................................................................................................49
ARTIGOS PARA PUBLICAÇÃO ...............................................................................60
EPIDEMIOLOGIA DOS GENOTIPOS P (VP4) E G (VP7) DE ROTAVÍRUS SUÍNOS
DURANTE 2000-2003...............................................................................................62
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS GENES CODIFICADORES DE VP4 E VP7
DE ROTAVÍRUS DE SUÍNOS E HUMANOS ............................................................69
1
1. INTRODUÇÃO
A gastroenterite relacionada aos rotavírus (RVs) é uma das principais
causas de morbi-mortalidade observada em humanos de todo o mundo. Além da
diarréia, a doença é acompanhada de vômito e febre entre 30-50% dos casos.
Apesar da rotavirose ocorrer tanto em países desenvolvidos como em
desenvolvimento, a epidemiologia entre as duas situações é distinta. Nos países em
desenvolvimento, as crianças adquirem a infecção no início da vida, as infecções
são registradas ao longo de todo o ano e a diversidade de cepas é maior do que em
países desenvolvidos (PAHO, 2003). Além disso, mais de 80% das mortes
relacionadas com a rotavirose ocorrem em países em desenvolvimento (PARASHAR
et al, 2006).
Estima-se que, anualmente, ocorram aproximadamente 111 milhões de
episódios diarréicos causados por RVs no mundo, somente entre crianças menores
de cinco anos, resultando em cerca de 450.000 óbitos (Fukai, 2004).
Entre as espécies animais também se observa índices elevados de diarréia,
principalmente entre indivíduos neonatos. A morbidade observada acarreta perda de
peso dos animais, custo elevado com tratamentos, além de um risco real para saúde
pública, uma vez que a transmissão interespécies é considerada possível
(MENEGHETTI et al, 2001; KHAMRIN et al, 2006; MARTELLA et al, 2006; FUKAI et
al, 2007). Entretanto, dentro de uma unidade de produção animal, a diarréia ainda é
considerada um problema relativamente comum, tanto para os produtores rurais,
como para os trabalhadores e profissionais de saúde envolvidos na produção. Por
ainda ser considerada comum, a diarréia é, muitas vezes, negligenciada pelos
produtores até que medidas efetivas possam ser adotadas.
Tanto em animais como entre a população humana, recomenda-se o
emprego de uma vacina eficaz, capaz de diminuir a gravidade da diarréia em
infecções subseqüentes e, conseqüentemente as taxas de morbidade e mortalidade.
Uma vez que a diversidade genômica dos RVs é reconhecidamente um
importante fator na ocorrência das diarréias, torna-se imprescindível uma vigilância
epidemiológica das cepas circulantes, antes e após a implementação de programas
2
de imunização, semelhante à empregada para o monitoramento do vírus influenza e
conforme preconizado pela Organização Mundial de Saúde (WHO, 2005).
Com o objetivo de contribuir para o programa nacional de vigilância
epidemiológica molecular, o presente trabalho descreve a caracterização molecular
de RVs obtidos a partir de amostras diarréicas de suínos e de crianças menores de
cinco anos de idade.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Histórico
Em 1943, Light e Hodes, citados por Gilio et al (1991) relataram a presença
de um agente filtrável relacionado com diarréia em crianças hospitalizadas em
Baltimore e Washington, nos Estados Unidos da América. O agente identificado
pelos pesquisadores foi inoculado via oral em bezerros e os animais desenvolveram
quadro diarréico.
Adams e Kraft, em 1963 observaram a partir de estudo por microscopia
eletrônica de secções de intestino delgado de camundongos com diarréia, partículas
virais inicialmente classificadas como vírus da epizootia diarréica de camundongos
jovens, EDIM (do inglês “Epizootic Diarrhoea of Infant Mice”) (FLEWETT e WOODE,
1978).
Em 1973; Ruth Bishop et al visualizaram partículas virais no epitélio duodenal
obtido de biopsias em crianças com diarréia e submetidas à análise por microscopia
eletrônica (KAPIKIAN et al, 2001).
O agente viral observado pelos pesquisadores - e descritos primeiramente
por Bishop (1973) - foi classificado como um novo gênero dentro da família
Reoviridade, o Rotavírus, e desde então tem sido reconhecido como a principal
causa, isolada ou associada a outros agentes infecciosos, de diarréia em humanos e
animais (NETO, 1987; KAMINJOLO e ADESIYUN, 1994; MURPHY et al, 1995;
LINHARES, 2000; KAPIKIAN et al, 2001).
O termo RV deriva da palavra em Latim “rota” (=roda) e foi sugerido devido
ao formato do capsídeo externo quando observado por microscopia eletrônica de
transmissão (KAPIKIAN et al, 2001), onde os capsômeros se apresentam irradiados
a partir da borda central, e o capsídeo externo delimita uma nítida borda (FLEWETT
e WOODE, 1978).
2.2. Morfologia
4
A partícula viral completa (vírion) tem simetria icosaédrica e é desprovida de
envelope, o que lhe confere resistência a agentes detergentes e alguns
desinfetantes, além de permitir sua presença no ambiente por longos períodos
(RAMOS et al, 2000).
Os RVs medem aproximadamente 100 nm de diâmetro e têm um triplo
capsídeo protéico, composto pelo cerne, camada intermediária e externa (KAPIKIAN
et al, 2001).
O cerne encerra o genoma viral, com 11 segmentos de RNA dupla fita. Cada
um dos segmentos responde pela codificação de pelo menos uma proteína (Figura
1), sendo seis destas proteínas estruturais e cinco não-estruturais. O segmento 11
da cepa símia SA11 responde pela codificação de duas proteínas não estruturais
(MATION et al, 1991). As proteínas estruturais são designadas como VP (“Viral
Protein”) e as não-estruturais como NSP (“Not Structural Protein”); ambas seguidas
por um número, que representa os pesos moleculares em ordem decrescente
(DESSELBERGER e McCRAES, 1994).
O cerne é formado pela proteína VP2, sendo esta a proteína mais abundante
desta região do vírus (DESSELBERGER e McCRAES, 1994). Esta proteína está
relacionada com a organização do genoma, interagindo com o RNA de fita dupla e
com as demais proteínas do cerne, VP1 e VP3. A VP1 tem função de RNA
polimerase RNA-dependente e a VP3 de ganilil metiltransferase (ESTES, 2001).
A proteína VP6 constitui a camada intermediária, sendo a proteína mais
abundante do vírion, uma vez que participa com 50% de sua composição
(DESSELBERGER e McCRAES, 1994).
A camada externa do vírion é composta pela proteína VP7, que contribui
com 30% do peso total do vírion e é considerada o principal antígeno indutor de
anticorpos neutralizantes (DESSELBERGER e McCRAES, 1994).
Delgadas espículas medindo aproximadamente 120 Å de comprimento são
freqüentemente observadas projetando-se a partir da superfície da camada externa,
em materiais submetidos à microscopia eletrônica (ESTES, 2001). Estas espículas
possuem uma porção distal bilobada (BOTH et al, 1994) e correspondem a dímeros
da hemaglutinina VP4. Apesar de representar apenas 1,5% das proteínas totais do
vírion, a VP4 é importante por também induzir a formação de anticorpos
5
neutralizantes (ROSEN et al, 1994), além de compor o capsídeo externo do vírus,
junto com a VP7 (PRASAD e CHIU, 1994).
As proteínas não-estruturais são NSP1, NSP2, NSP3, NSP4 e NSP5. Todas
estão envolvidas no processo de replicação viral e interagem com o ácido nucléico,
exceto NSP4, que participa da morfogênese viral, além de atuar como enterotoxina
(ESTES, 2001).
Uma característica da estrutura dos RV é a presença de 132 canais que, de
acordo com sua localização, são classificados nos tipos I, II e III. Estes canais
interligam a superfície externa com o cerne interno e possivelmente estão envolvidos
na importação de metabólitos requeridos para a transcrição do RNA e na exportação
dos RNA transcritos, para o subseqüente processo de replicação viral (PESAVENTO
et al, 2003).
Figura 1: Estrutura dos RVs. No painel à esquerda estão representados os 11 segmentos
genômicos do vírus, conforme seu padrão de migração em gel de poliacrilamida. No centro,
estão representadas as proteínas codificadas por cada segmento de RNA de fita dupla e na
direita a localização esquemática das proteínas estruturais e da tripla camada do vírion.
FONTE: ESTES (2001) (adaptado).
NOTA: Os segmentos numerados mostrados no painel à esquerda são baseados na
migração do genoma de RVs grupo A da cepa SA11.
6
2.3. Classificação dos RVs
2.3.1. Sorogrupos e subgrupos
A proteína VP6 contém antígenos que permitem a classificação dos RV em
7 sorogrupos: A, B, C, D, E, F e G, os quais podem ser identificados por testes
sorológicos como ELISA e Imunofluorescência (ESTES, 2001).
Os RVs do grupo A já estão bem estabelecidos como agentes causadores
de diarréia em animais e crianças. Os vírus pertencentes ao grupo B têm sido
associados a epidemias de diarréia aguda em adultos na China (ESTES, 2001). De
acordo com trabalhos de Saif e Jiang, 1994; Morin et al, 1990; Saif, 1980; Saif et al,
1980 citados por KIM et al (1999), os RVs do grupo C têm sido relatados como
causa de diarréia em leitões nas fases de amamentação e creche, enquanto que os
grupos D, E, F e G têm sido associados a eventos esporádicos de diarréia em
animais (ESTES, 2001).
2.3.2. Sorotipos e genotipos
Dentro de cada grupo, os RVs são classificados em sorotipos de acordo
com sua reatividade em ensaios de neutralização.
A VP4 permite classificar os RVs em diferentes sorotipos (Tabela 1), que
são denominados P devido à sensibilidade que esta proteína apresenta frente a
enzimas proteolíticas. Uma classificação, baseada em ensaios de neutralização,
permite a identificação de 14 sorotipos P, incluindo três subtipos (KAPIKIAN et al,
2001).
A utilização de anticorpos monoclonais dirigidos contra a VP7 e testes de
neutralização permitem a classificação dos RVs em pelo menos 15 sorotipos
(VARSHNEY et al, 2002), denominados G por ser a VP7 uma glicoproteína
(KAPIKIAN et al, 2001).
Os RVs podem ser classificados ainda com base nos segmentos genômicos
que codificam as proteínas indutoras de resposta imune, VP4 e VP7 (Figura 1).
7
VP7 sorotipo [VP4 Genotipo] Espécie
1[1] Humana, Suína, Bovina
2[2] Humana, Suína
3[3] Humana, Símia, Canina, Felina, Eqüina, Suína, Leporina, Ovina, Murina
4[4] Humana, Suína
5[5] Humana, Suína, Equina
6[6] Humana, Bovina, Ovina
7[7] Aviária, Bovina
8[8] Humana, Bovina
9[9] Humana, Suína, Ovina
10[10] Humana, Suína, Bovina, Ovina
11[11] Suína
12[12] Humana
13[13] Equina
14[14] Equina
[15] Bovina
1A[8] Humana, Suína, Ovina
1B[4] Humana
2A[6] Humana
2B[6] Suína
3[9] Humana, Felina
4[10] Humana
4[12] Equina
5A[3] Humana, Canina,Felina
5B[3] Símia
5B[2] Símia
6[1] Bovina, Símia, Ovina
7[5] Humana, Suína, Bovina
8[11] Humana, Bovina, Ovina
9[7] Suína, Equina
10[16] Murina
11[14] Leporina
12[19] Humana, Suina
13[20] Murina
[13] Suína
[15] Ovina
[17] Bovina, Ave
[18] Equina
[20] Murina
[21] Bovina
[22] Leporina
14[23] Suína
11[24] Humana
[25] Humana
[26] Suína
[27] Suína
[28] Suína
Tabela 1: Classificação sorotípica e genotípica de RVs do grupo A baseada na
especificidade de VP4 e VP7.
Fonte: Kapikian et al (2001) (modificado).
Através de técnicas de seqüenciamento, hibridização e amplificação de
ácidos nucléicos já foram descritos 28 tipos (ou genotipos) P diferentes de acordo
com a especificidade de VP4 e 15 tipos G (ou genotipos) distintos em relação a VP7
(KAPIKIAN et al, 2001).
2.4. Genoma dos RVs
8
Os segmentos de RNAs de fita dupla que compõem o genoma viral variam,
em peso molecular, de 200 a 2000 KDa, com um tamanho de 667 a 3302 pares de
base (pb), de acordo com a cepa (KAPIKIAN et al, 2001).
Os 11 segmentos podem ser divididos em quatro classes com pesos
moleculares diferentes (Figura 2). Esta distribuição pode ser evidenciada através de
eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE, do inglês ”Polyacrilamide Gel
Electrophoresis”), onde os segmentos de maior peso molecular migram mais
lentamente que os de menor peso (RAMIG, 1994).
De acordo com a migração dos segmentos genômicos durante a PAGE, os
segmentos de RNA de 1 a 4 são agrupados como classe I, os segmentos 5 e 6
como classe II, os segmentos 7 a 9 como classe III e os segmentos 10 e 11 como
classe IV (ESTES, 2001), formando, ao final da análise, uma migração característica
denominada eletroferotipo (SILVA et al, 2001a), que, no caso dos RVs do grupo A,
assume o padrão IV-II-III-II (4-2-3-2).
Três diferentes perfis (longo, curto e supercurto) estão associados com
diferenças na mobilidade do segmento 11 para cepas com padrão longo, e do
segmento 10 para cepas com padrão curto e supercurto (TANIGUCHI e URUSAWA,
1995).
Aparentemente o perfil longo predomina sobre os demais em infecções de
origem humana envolvendo os tipos G1, G3 e G4, enquanto que o perfil curto é o
dominante em infecções com o tipo G2 (LINHARES, 2000) e supercurto em
infecções envolvendo o tipo G8 (TANIGUSHI e URUSAWA, 1995).
9
Humano Humano Humano
Wa DS-1 69M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Humnano Suíno Bovino Ovino Murino
ADRV Ohio D531 E1101 IDIR
Humano Suíno Bovino
TG Cowden Shintoku
Galinha
132
Suíno
DC-9
Galinha
A4
Galinha
555
A
B
A
DC FE
I
II
III
IV
G
Humano Humano Humano
Wa DS-1 69M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Humnano Suíno Bovino Ovino Murino
ADRV Ohio D531 E1101 IDIR
Humano Suíno Bovino
TG Cowden Shintoku
Galinha
132
Suíno
DC-9
Galinha
A4
Galinha
555
A
B
A
DC FE
I
II
III
IV
G
Figura 2: Padrão de migração eletroforética dos RVs. São mostrados representantes dos
sete grupos (A-G) e as classes formadas (I, II, III e IV) de acordo com a migração dos
segmentos genômicos.
Fonte: Kapikian et al., 2001 (modificado).
O perfil longo é mais encontrado também em amostras de origem animal.
Entretanto, a correlação entre a origem da amostra e o padrão de migração dos
segmentos 10 e 11 não deve ser o único método de escolha para classificação dos
RVs, uma vez que a constituição genética destes vírus é muito grande e variável
(TANIGUSHI e URUSAWA, 1995).
Cada segmento de RNA começa com uma seqüência de guanidina,
localizada no terminal 5´ seguida por um conjunto de seqüências conservadas, que
fazem parte da região não codificadora do gene. Em seguida inicia-se a região
codificadora do gene com uma longa fase aberta de leitura (ORF) que, por sua vez,
termina com um códon de parada. Após o códon de parada é encontrado outro
conjunto de seqüências não codificadoras que contêm um subconjunto no terminal
3´, que termina com uma citidina (ESTES, 2001).
Assim, existem seqüências conservadas nos terminais 5´ e 3´ de cada
segmento genômico, que variam entre os diferentes segmentos de RNA de uma
cepa (DESSELBERGER e McCRAES, 1994). Esta conservação entre as seqüências
terminais sugere que elas possuam importantes sinais para transcrição, transporte
do mRNA, replicação ou montagem dos segmentos do genoma viral (ESTES, 2001).
10
2.4.1. Diversidade do genoma dos RVs
A presença de diferentes cepas de RVs envolvidas em uma infecção ou em
uma epidemia, associada à facilidade que estes vírus possuem em compartilhar
seus segmentos genômicos, gerando uma progênie distinta das cepas de origem,
caracterizam a diversidade genética destes vírus (GOUVEA e BRANTY, 1995).
Ressalta-se que, teoricamente, os 11 segmentos genômicos dos RVs podem se
reagrupar em 2
11
possibilidades diferentes, considerando o rearranjo como um
fenômeno randômico (GOMBOLD e RAMIG, 1994).
Considerando os 15 G e 28 P tipos descritos (Tabela 1) são possíveis 420
combinações G-P diferentes, o que esboça a enorme diversidade dos RVs.
Os RVs dispõem de vários mecanismos que aumentam sua diversidade e
dirigem sua evolução: mutações pontuais, permuta de segmentos de RNA entre
diferentes cepas (recombinação genética ou “reassortment”), rearranjo genômico e
transmissão interespécies (PORTELLA, 1999; PALOMBO, 2002).
2.4.1.1. Mutações pontuais
Estima-se que entre os RVs ocorra uma taxa de mutação de 10
-5
mutações
por nucleotídeo por replicação e o acúmulo destas mutações pontuais pode gerar
um novo fenótipo viral durante uma epidemia (PALOMBO, 2002).
Uma vez que as proteínas de superfície VP4 e VP7 são afetadas pelos
anticorpos neutralizantes do hospedeiro, os segmentos genéticos codificadores
destas proteínas são replicados mais rapidamente que aqueles que codificam as
proteínas internas (estruturais ou não) e, portanto, estão sujeitos a mutações mais
freqüentes (TANIGUSHI e URASAWA, 1995).
Dentre os principais G tipos que causam infecções em humanos (G1-G4), as
seqüências de aminoácidos deduzidas para VP7 variam em mais de 22%, enquanto
que as demais proteínas estruturais e não-estruturais
exibem uma diversidade de
15% (PALOMBO, 2002).
De acordo com a localização das mutações pontuais algumas características
virais podem ser alteradas. Análises da seqüência do gene que codifica VP7 da
11
cepa humana IAL-28 sugerem que a substituição de um ou dois aminoácidos na
posição 96 e 100 pode ter conferido dupla especificidade (G5 e G11) a esta cepa
(TIMENETSKY et al, 1997).
2.4.1.2. Recombinação genética (“reassortment”)
Quando as células são infectadas com duas ou mais cepas de RVs diferentes
e compatíveis, cerca de 30% da progênie resultante após 40 horas de infecção
contém novos agrupamentos de segmentos genéticos. As cepas resultantes dessas
infecções mistas podem responder por um surto ou epidemia, caracterizando o
processo evolutivo do vírus (TANIGUCHI e URUSAWA, 1995).
A recombinação genética é o principal mecanismo evolutivo entre cepas
circulantes de RVs e explica a presença de segmentos genéticos de cepas de
origem humana em animais e vice-versa. Por exemplo, na cepa humana 116E, o
gene que codifica VP4 está relacionado ao mesmo gene na espécie bovina -
P8[11]G10 - enquanto que os segmentos restantes relacionam-se a cepas humanas
típicas (GENTSCH et al, 1993).
Kool et al (1992) isolaram uma cepa resultante da co-infecção de células MA-
104, provenientes de rim fetal de macaco verde africano, com RVs de origem aviária
(Ty) e outro de origem símia (RRV), sugerindo que a recombinação genética entre
estas espécies in vivo não deve ser descartada.
A cepa humana CMH222, classificada como P[3]G3 durante um levantamento
epidemiológico na Tailândia, apresentou elevada homologia com gene que codifica
VP4 de RVs caprinos e com gene que codifica VP7 de RV símios, o que demonstra
a ocorrência de recombinação genética in natura (KHAMRIN et al, 2006).
Outros RVs resultantes de recombinação genética in natura e in vitro têm sido
identificados e caracterizados por diversos pesquisadores (CUNLLIFE et al, 2000;
TEODOROFF et al, 2005; MANEEKARN et al, 2006; PARK et al, 2006; MARTELLA
et al, 2006; BANERJEE et al, 2007; GULATI et al, 2007; MUNFORD et al, 2007).
12
2.4.1.3. Rearranjo genômico
O rearranjo genômico consiste em alterações de áreas consideráveis dentro
do segmento do gene em decorrência de deleções - observadas na PAGE como
bandas que migram mais rapidamente - ou de duplicações, observadas como
bandas que migram lentamente devido ao aumento do tamanho do segmento
genético (Figura 3) (TANIGUCHI e URUSAWA, 1995; ESTES, 2001).
No caso de rearranjos por duplicação, observa-se que a fase aberta de leitura
(ORF, do inglês “open reading frame”) e as regiões não codificadoras localizadas na
porção 5´ e 3´ do segmento genético são conservadas, embora algumas proteínas
de peso molecular anormal sejam produzidas em algumas cepas. Estima-se que até
2.000 pb podem ser adicionadas sem afetar a viabilidade do vírion (TANIGUCHI e
URUSAWA, 1995).
A ocorrência dos perfis curto e supercurto pode ser explicada quanto à
presença de rearranjos genéticos. Em algumas cepas de RVs, principalmente
classificadas como G2, um rearranjo genético no segmento 11 resulta migração
eletroforética mais lenta deste segmento em relação ao segmento 10, resultando no
padrão curto de RNA. Em outras cepas, o segmento 11 se torna muito maior e migra
mais rapidamente do que no padrão curto, gerando o padrão conhecido como
supercurto (AHMED et al, 2007). A análise da seqüência do gene que codifica NSP5
da cepa belga, B4106, por exemplo, revelou que a mobilidade alterada do
eletroferotipo deste segmento foi resultado de um rearranjo genético envolvendo
duas inserções pequenas e uma deleção, gerando este tipo de padrão
(MATTHIJNSSENS et al, 2006).
Teoricamente todos os segmentos genômicos podem sofrer rearranjos,
entretanto, nos segmentos cinco e onze a freqüência desses eventos é maior
(ESTES, 2001).
13
201
22
615
TAA
ATG
22
615
626
TAA
ATG
YK-1 (667 pb)
Clone 311(1092 pb)
201
22
615
TAA
ATG
22
615
626
TAA
ATG
YK-1 (667 pb)
Clone 311(1092 pb)
Figura 3: Rearranjo genético de gene 11 de RVs de origem símia. Diagrama esquemático
da seqüência do gene 11 da cepa símia YK-1 e do clone 311. O rearranjo consistiu na
duplicação parcial do segmento 11 da cepa YK-1 a partir do nucleotídeo localizado na
posição 201.
Fonte: Westerman et al, 2006.
2.4.1.4. Transmissão interespécies
A hipótese de que cepas de RVs de origem humana podem infectar e
produzir a rotavirose em animais e vice-versa surgiu a partir da identificação de uma
cepa classificada como sorotipo G3, subgrupo I e com padrão longo quando
submetida a PAGE; classificação até então observada somente em RV de origem
animal (NAKAGOMI e NAKAGOMI, 1993).
Desde então, diversos estudos têm comprovado que esta transmissão não
só ocorre, como também é um mecanismo de evolução que, em consonância com
os demais, favorece o aparecimento de novas e atípicas cepas (PALOMBO, 2002;
GENTSCH et al, 2005; MATTHIJNSSENS et al, 2006; KHAMRIN et al, 2006). A
Tabela 2 indica alguns exemplos de cepas de RVs possivelmente originadas pelo
mecanismo de transmissão interespécies.
Os eventos envolvendo recombinação genética são mais freqüentes em
países em desenvolvimento. As condições socioeconômicas e climáticas existentes
nesses países, associadas à baixa imunidade de crianças e animais, ao contato
próximo entre eles e a precariedade de algumas criações de animais, parece
favorecer o aparecimento de infecções mistas e, como conseqüência, a
recombinação genética (TANIGUCHI e URUSAWA, 1995; GOUVEA e BRANTY,
1995; KHAMRIN et al, 2006; GHOSH et al, 2007).
14
Cepa Espécie isolada Provável origem
AU-1 Humano Felino
Ro1845 Humano Felino/Canino
HCR3 Humano Felino/Canino
PA151 Humano Bovino (Felino)
PA169 Humano Bovino
HAL1166 Humano Bovino
I321 Humano Bovino
Rotavírus G5 Humano Suíno
ICB2185 Suíno Humano
Mc323/Mc345 Humano Suíno
P343 Suíno Bovino
H-1 Humano Suíno
B4106 Leporino Humano
116E Humano Bovino
CMH222 Humano Caprino/Símio
Sun9 Humano Bovino
Tabela 2: Cepas de RV derivadas da transmissão interespécies.
Fonte: Palombo, 2002 (adaptado).
Os RVs são transmitidos entre diferentes espécies animais como infecções
mistas. Esta observação é possível a partir da identificação de diferentes cepas
envolvidas em uma infecção dentro de uma comunidade específica. Entretanto,
estas diferentes cepas são submetidas à seleção natural imposta pelo ambiente e
pelo sistema imune do hospedeiro, resultando em novas e diversas populações de
vírus (GOUVEA e BRANTY, 1995).
A transmissão interespécies pode ocorrer com a transferência de todos os
11 segmentos genéticos da cepa “doadora”, ou por recombinação genética entre
cepas que estejam co-circulando no mesmo ambiente e que sejam provenientes de
espécies diferentes, favorecendo o aparecimento de outra cepa capaz de infectar a
espécie “receptora” (RAHMAN et al, 2005; KHAMRIN et al, 2006).
15
2.5. Proteínas dos RVs
As proteínas que compõem os RVs podem ser divididas em proteínas
estruturais e não-estruturais.
2.5.1. Proteínas estruturais
A Tabela 3 sumariza as funções conhecidas das proteínas constituintes dos
RVs.
Proteína Função
VP1 RNA Polimerase RNA-dependente; liga-se a RNA fita simples
VP2 Ligação de RNA; é requerida para a atividade de replicase de VP1
VP3 Guanilitransferase e metiltransferase
VP4 Antígeno de neutralização tipo P específico; determinante de virulência, proteína de ligação à célula; é clivada
em Vp5* (permeabiliza a membrana) e VP8*
NSP1
Associa-se com o citoesqueleto; atua na supressão da resposta por IFN-
α
do hospedeiro
VP6 Antígeno de grupo e subgrupo; é requerida para transcrição
NSP3 Envolvida na regulação da transcrição; liga o terminal 3´ do mRNA
NSP2 Envolvida na formação de viroplasmas; atividade NTPase e helicase; liga NSP5 e VP1; essencial para a
síntese de RNA de fita dupla
VP7 Antígeno de neutralização tipo G; proteína ligante de cálcio
NSP4 Enterotoxina; receptor para o brotamento das partículas duplo capsídeo através da membrana do Retículo
Endoplasmático
NSP5 Constituinte dos viroplasmas; liga ssRNA; interage com NSP2 e NSP6
NSP6 Constituinte dos viroplasmas; interage com NSP5
Tabela 3: Funções das proteínas estruturais (VP) e não-estruturais (NSP) dos RVs.
Fonte: Angel et al, 2007.
2.5.1.1. Proteínas do cerne
A VP1 é codificada pelo segmento 1 (3302 pb) do genoma viral e responde
por apenas 2% do total de proteínas do vírion, sendo a proteína com maior peso
molecular (125 kDa) e número de aminoácidos (1088). Está localizada no cerne do
vírion e possui atividade de RNA polimerase RNA-dependente, além de funcionar
como componente estrutural do vírus (ESTES, 2001).
A VP2, codificada pelo segmento 2 (2690 pb) do genoma viral, contribui com
12-15% do total de proteínas do vírion e é composta por 881 aminoácidos. Esta
proteína possui grande habilidade de se ligar de modo inespecífico ao RNA de fita
dupla e, junto com a VP1, é requerida para a atividade de replicase (ESTES, 2001;
DESSELBERGER e McCRAES, 1994).
16
Das proteínas do cerne, a VP3 é o menor componente do vírion (0,5%) e do
cerne (3%). Postula-se que a VP3 forma um complexo com VP2, ligando-se a sua
porção N-terminal, requerida para a replicação do RNA, além de desempenhar a
função de guanilil e metiltransferase. Esta proteína, composta por 776 aminoácidos,
é codificada pelo segmento 3 do genoma, que possui 2591 pb (ESTES, 2001).
2.5.1.2. Proteínas da camada intermediária
O segmento 6 (1356 pb) do genoma viral responde pela codificação da
proteína viral mais abundante, a VP6 (Figura 4), que constitui 50% do peso total do
vírion (DESSELBERGER e McCRAES, 1994) e é composta por 397 aminoácidos
(ESTES, 2001).
Sua interação tanto com a VP4 como com a VP7 permite deduzir que a VP6
desempenha um importante papel na estrutura do vírion (ESTES, 2001), além de ser
o principal antígeno na detecção dos RV através de ensaios sorológicos (HOSHINO
e KAPIKIAN, 1994).
Figura 4: Características da proteína VP6. A prolina (P) parece estabilizar a estrutura
trimérica da proteína, que é muito estável e que por isso, parece ser o principal antígeno
alvo nos testes diagnóstico.
FONTE: Estes, 2001 (adaptado).
2.5.1.3. Proteínas da camada externa
A VP4 (Figura 6), produto do quarto segmento (2362 pb) do genoma é uma
proteína não-glicosilada do capsídeo externo, compõe apenas 1,5% das proteínas
do vírion e é constituída por 776 aminoácidos entre as cepas de origem animal e 775
entre as de origem humana. Além de funcionar como hemaglutinina é a proteína de
fixação do vírus na célula. Quando é clivada em VP5* (60 kDa) e VP8* (28 kDa),
17
através da ação de enzimas proteolíticas como tripsina, por exemplo, a
infecciosidade viral aumenta e a qualidade de penetração do vírus na célula
melhora.
Apesar de ser um dos componentes em menor proporção no vírion, a VP4
desempenha importante papel na indução de anticorpos neutralizantes
(DESSELBERGER e McCRAES, 1994).
Figura 5: Características da proteína VP4. Estão indicados os dois produtos da clivagem
por tripsina (VP8* e VP5*), os locais de clivagem (↓), as regiões variáveis (V) e conservadas
(CR), bem como as cisteínas (C) e prolinas (P) conservadas. Os domínios referentes à
atividade de hemaglutinação (HA) e os locais de ligação do ácido siálico (SA) também estão
indicados.
FONTE: ESTES, 2001 (adaptado).
A VP7 (Figura 6) é a principal proteína do capsídeo externo do vírus e o
principal antígeno para anticorpos neutralizantes. Ela pode ser codificada pelo 7
o
, 8
o
ou 9
o
(1104, 1059 e 1062 pb, respectivamente) segmento do gene, dependendo da
cepa viral e é composta por 315, 317 ou 326 aminoácidos, também de acordo com a
cepa. A VP7 compõe 30% do peso do vírion e é considerada a segunda proteína
mais abundante na partícula viral (DESSELBERGER e McCRAES, 1994; ESTES,
2001).
Os vários resíduos conservados de cisteína presentes na VP7 parecem ser
responsáveis pela formação de epítopos neutralizantes, na medida em que permitem
a formação de diversas pontes dissulfetos (DESSELBERGER e McCRAES, 1994).
Além de induzir a formação de anticorpos neutralizantes, parece que a VP7
também está envolvida no processo de adsorção do vírus à célula
(DESSELBERGER e McCRAES, 1994).
18
Figura 6: Características da proteína VP7. São mostrados os domínios hidrofóbicos H1 e
H2 da proteína, os domínios conservados entre RVs dos grupos A, B e C, bem como o local
de ligação do cálcio e de glicosilação ( ), cisteínas conservadas e os epítopos de
neutralização A, B, C e F.
FONTE: Estes, 2001 (adaptado).
2.5.2. Proteínas não-estruturais
A NSP1 é a proteína codificada pelo quinto
segmento (1581 pb) de RNA de
fita dupla, possui peso molecular de 53 kDa e é produzida em pequenas
concentrações no início da infecção viral, quando está ligada ao RNA de fita dupla. A
proteína é composta por 491 aminoácidos e possui um domínio relativamente
conservado de zinco, que pode não estar presente em algumas cepas, parece não
ser essencial na replicação viral (DESSELBERGER e McCRAES, 1994; ESTES,
2001).
A proteína NSP2 é produzida pelo oitavo segmento de RNA da cepa símia
SA11 e humana Wa, sétimo segmento da cepa bovina UK ou nono da cepa símia
RRV, possui peso molecular de 35 kDa e 317 aminoácidos. A NSP2 parece estar
envolvida na formação do complexo capsídeo-RNA (DESSELBERGER e McCRAES,
1994; ESTES, 2001) e na constituição, juntamente com a NSP5, dos viroplasmas
durante a replicação do RV (ROMERO e NORIEGA, 2006).
O segmento de número 7 na cepa SA11, número 8 em RRV e 9 na cepa
bovina UK é responsável pela codificação da proteína NSP3, com 35 kDa de peso e
315 aminoácidos. Esta proteína se liga ao mRNA viral, melhorando a qualidade de
translação do mRNA (DESSELBERGER e McCRAES, 1994; ESTES, 2001).
O segmento 10 do genoma viral, com 751 pb, contém a seqüência para a
proteína NSP4 (Figura 7), com 28 kDa e 175 aminoácidos. É a única proteína não-
estrutural que não está ligada ao RNA. Seu domínio C-terminal funciona como um
Ligação de
Ca
2+
Conservada em
RV A, B e C
Conservada em
RV A, B e C
19
receptor intracelular sobre a membrana do retículo endoplasmático, de modo que
quando é bloqueada (pela ação de, por exemplo, tunicamicina) todas as partículas
virais observadas no reticulo endoplasmático, permanecem envelopadas. Além
disso, parece que a NSP4 funciona como fator de virulência e age reduzindo a
absorção de glicose nas células epiteliais, bem como induzindo a secreção de
cloreto (DESSELBERGER e McCRAES, 1994; ESTES, 2001).
Figura 7: Características da proteína NSP4. H1, H2 e H3 indicam os domínios hidrofóbicos
e ( ) os locais de glicosilação. Resíduos no domínio H1 estão localizados no lúmen do
Retículo Endoplasmático, enquanto parte dos aminoácidos do domínio H2 são
citoplasmáticos.
FONTE: Estes, 2001 (adaptado).
A NSP5 é codificada pelo menor dos segmentos genômicos, o segmento
11, com 667 pb. A proteína tem 198 aminoácidos e um peso molecular aproximado
de 26 kDa, interagindo com a VP2 e ligando-se ao RNA de modo inespecífico
(DESSELBERGER e McCRAES, 1994; ESTES, 2001).
A NSP6 é codificada em uma ORF alternativa no segmento do gene 11 da
maioria dos RVs e é conhecida por interagir com a NSP5 e se acumular no
viroplasma. Parece que, juntamente com a NSP2 e a NSP5, a NSP6 responde pelo
recrutamento ou movimento das outras proteínas virais dentro do viroplasma, pela
encapsidação do RNA ou pelo movimento das partículas virais nascentes até a
membrana do retículo endoplasmático (DESSELBERGER e McCRAES, 1994;
ESTES, 2001;).
2.6. Prejuízos causados por rotavírus
20
Entre 2000 e 2004, 39% das internações hospitalares de crianças com
diarréia ocorreram devido aos RVs, em todo o mundo, e mais de 80% das mortes
foram registradas nos países mais pobres, como os do sul da Ásia e da África
(Figura 8), segundo estimativas de Parashar et al (2006).
Figura 8: Distribuição global de mortes relacionadas aos RVs. Cada ponto sobre o mapa
representa 1000 mortes.
Fonte: Parashar et al, 2006.
Em oito países que representam 68% do total anual de nascimentos na
América Latina, os RVs respondem por aproximadamente 190 mil hospitalizações e
5.000 mortes, gerando um ônus de cerca de US$ 85 milhões, somente no ano de
2003 (RHEINGANS et al, 2007), conforme mostrado na Tabela 3.
Países Número de hospitalizações Número de mortes Estimativa de gastos (em
US$)
Argentina 22.856 99 8.137.641
Brasil 120.513 2.475 33.537.642
Chile 8.008 13 5.402.388
Rep. Dominicana 4.882 443 1.032.454
Honduras 2.896 663 1.753.684
México 16.086 923 27.867.608
Panamá 1.684 37 1.152.441
Venezuela 13.502 384 6.183.961
Total 190.528 5.038 85.067.819
Tabela 3: Prejuízo econômico e de saúde pública causado por RVs. Estimativa referente ao
ano de 2003 e inclui custos diretos (como medicamentos, transporte e exames laboratoriais)
e indiretos (como visitas ao paciente internado e dias perdidos de trabalho).
Fonte: Rheingans et al, 2007 (modificado).
21
Existem poucos estudos relacionados aos prejuízos causados pelos RVs em
uma unidade de produção animal. De acordo com House (1978), o prejuízo
alcançado por surtos epidêmicos de RVs pode ultrapassar a cifra de 3 milhões de
dólares por ano somente para a espécie bovina dos Estados Unidos da América.
2.7. Epidemiologia molecular dos RVs
2.7.1 Importância
A partir da reunião regional sobre a implantação da vigilância
epidemiológica de rotavírus, que ocorreu no Peru em 2003, a Organização Pan-
Americana de Saúde (OPAS) elaborou uma série de recomendações, entre elas
algumas de caráter geral envolvendo os estudos epidemiológicos dos RVs e um
banco de dados sobre sua vigilância. Neste documento, destaca-se que “[...] é
prioridade a caracterização dos sorotipos G e P mais comuns, a fim de se considerar
sua inclusão na produção de vacinas” e que “após implantação das vacinas, é
essencial o monitoramento das cepas circulantes”. Além disso, “pode-se utilizar para
a genotipagem dos vírus, a Reação em Cadeia da Polimerase, precedida de
Transcrição-Reversa (RT-PCR, do inglês “Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction“)”. O documento também ressalta o uso de técnicas de seqüenciamento
para cepas não detectadas por anticorpos monoclonais ou pela RT-PCR (PAHO,
2003).
2.7.2. Tipos G e P
A correlação que existe entre sorotipos e genotipos, observada para VP7,
não se aplica a VP4. Devido à dificuldade de classificação dos sorotipos referentes à
proteína VP4, os estudos relacionados ao quarto gene do genoma dos RVs, têm
sido baseados em técnicas como seqüenciamento, hibridização e amplificação de
ácidos nucléicos pela reação em cadeia de polimerase (PCR, do inglês “Polymerase
Chain Reaction”) (KAPIKIAN et al, 2001).
22
Para integrar a denominação dos RVs, para a proteína VP4, a letra P
seguida por um número arábico refere-se a sorotipo e a letra maiúscula refere-se a
subtipo, enquanto que o genotipo é designado por um número arábico entre
colchetes. Para a VP7a letra G seguida por um número refere-se tanto ao sorotipo
como ao genotipo relacionado. (KAPIKIAN et al, 2001). Assim, por exemplo, as
cepas de RV de origem suína OSU (Ohio State University) e humana Wa são
classificadas como P9[7]G5 e P1A[8]G1, respectivamente (ESTES, 2001).
Dos 15 tipos G (tanto sorotipos como genotipos) até agora identificados, 10
foram encontrados em humanos (G1 a G6, G8 a G10, G12). Para os 28 genotipos P
(e 15 sorotipos) identificados, 12 tipos já foram descritos em humanos (P[1] a P[6],
P[8] a P[10], P [12], P[19] e P[24]). Devido às infecções mistas, rearranjos
moleculares dos vírus e possível transmissão interespécies, não são raros a
detecção de tipos G e P que são considerados de origem humana em animais e a
detecção de tipos animais em humanos (ESTES, 2001; KAPIKIAN et al, 2001).
SANTOS e HOSHINO (2005) realizaram uma análise de dados a partir de
108 estudos que foram publicados entre 1989 e 2003, envolvendo 50 países e
totalizando 42.757 cepas de RVs. A distribuição dos tipos G encontrados foi: G1
(66.0%), G2 (12.1%), G4 (8.6%), G3 (3.5%) e G9 (2.7%). A especificidade P dos
RVs é mais conservada em todo o mundo; e os tipos mais detectados globalmente
são P1A[8], P1B[4] e P2A[6], segundo Hoshino e Kapikian, citados por Santos et al,
2001.
Nas Américas também são encontrados os mesmos tipos, além de G5, G8 e
G10 (OSPINO, 2004). Entre os tipos P, os mais freqüentes correspondem a P[4] e
P[8], seguidos por P[6] e P[10] (CACERES et al, 2006). Assim, as combinações P e
G mais freqüentes são P[8]G1 (40%), P[4]G2 (30%), P[8]G3 (6%) e P[8]G4 (7%)
(CASTELO et al, 2004).
Os RVs G5 foram inicialmente reconhecidos como patógenos exclusivos de
suínos nos EUA e posteriormente em outros países, como Austrália e Venezuela
(GOUVEA e SANTOS, 1997). No Brasil foi isolado pela primeira vez em 1992, a
partir de amostras diarréicas de crianças menores de cinco anos de idade (GOUVEA
et al, 1994).
Os RVs provenientes de suínos têm sido identificados como tipos G3, G4,
G5, e G11 (NAGESHA et al, 1992), e estão associados mais freqüentemente a P[5],
23
P[6], P[8] e P[7] (SANTOS et al, 1999; RÁCZ et al, 2000; MARTELLA et al, 2001;
WINIARCZYK et al, 2002; BARREIROS et al, 2003). P[19], um tipo P raro foi descrito
também para a espécie suína (MANEEKARN et al, 2006). Outros tipos G e P
esporadicamente encontrados em suínos incluem: G9, P[13], P[23] (TEODOROFF et
al, 2005).
O tipo G3 foi descrito como agente causador de diarréia em bovinos
(VARSHNEY et al, 2002), murinos (USHIJIMA et al, 1995) felinos, caninos,
leporinos, eqüinos e símios, além de suínos (HOSHINO e KAPIKIAN, 1994).
Os tipos G6 e G10 são considerados os mais prevalentes entre bubalinos
(CHANG et al, 1995; GULATI et al, 1999; VENDE et al, 1999; KLINGENBERG et al,
1999). Entretanto, G1, G7, G8 e G11 também têm sido associados à infecção por
RVs entre esta espécie animal (KAPIKIAN et al, 2001; VARSHNEY et al, 2002;
MARTELLA et al, 2003). Os tipos P mais prevalentes entre bovinos são P6[1], P7[5]
e P8[11] (CHANG et al 1996; FUKAI et al, 1999; FALCONE et al, 1999; CHANG et
al, 2000; OKADA e MATSUMOTO, 2002; VARSHNEY et al, 2002; CIARLET et al,
2002). O tipo P[5] também tem sido considerado o mais prevalente entre búfalos e
caprinos na Itália (PRATELLI et al, 1999, GULATI et al, 1999).
Dentre os tipos G mais prevalentes em caprinos destacam-se G3, G6 e G10
(FITZGERALD et al, 1995; PRATELLI et al, 1999; LEE et al, 2003) e dentre os tipos
P, P6[1], P5[3] (LEE et al, 2003).
Apesar de poucos casos descritos entre a espécie canina, a combinação G
e P prevalente é P5A[3]G3 (SANTOS et al, 1998; NAKAGOMI e NAKAGOMI, 2000;
MARTELLA et al, 2001; GABAY et al, 2003).
Dentre os sorotipos G descritos até agora em animais, os mais prevalentes
entre eqüinos são G3 (subtipos G3A e G3B) e G14, seguidos por G5, G8, G10 e
G13 e G16, este último recentemente descrito na Índia (BROWNING e BEGG, 1996;
GULATI et al, 2007). Os tipos P4[11], P14[12] e P12[18] têm sido considerados os
mais prevalentes entre esta espécie, seguidos por P4[12] (BROWNING e BEGG et
al, 1996; CIARLET et al, 2001).
Entre aves, o tipo P[17]G7 tem sido encontrado como o único tipo em
galinhas e perus (ESTES, 2001).
24
2.7.3. Evolução e filogenia molecular
As análises de seqüências de nucleotídeos e da filogenia têm permitido
detectar e caracterizar eventos de recombinação entre RVs que ocorrem
naturalmente ou que são induzidos em laboratório (WOROBEY e HOLMES, 1999;
MARTELLA et al, 2001; PALOMBO, 2002).
De um modo geral, cepas de RVs dentro de um mesmo tipo G compartilham
uma identidade de pelo menos 90-91% de similaridade na seqüência de
aminoácidos referentes a VP7 (GREEN et al, 1988). Com relação a VP4, cepas com
similaridade superior a 89% são classificadas dentro do mesmo genotipo P,
enquanto que aquelas que compartilham identidade em relação à seqüência de
aminoácidos inferior a 89% pertencem a genotipos diferentes (ESTES, 2001), com
maior divergência observada entre os aminoácidos 71 e 204 da VP8*, a qual está
relacionada com a especificidade de VP4 (MARTELLA et al, 2006).
A análise da seqüência de genes de diferentes cepas de RVs sugere um
“ancestral” comum para algumas espécies. A relação entre RVs de origem humana e
de origem suína, por exemplo, é evidente na filogenia de proteínas e genes
estruturais e não-estruturais e pode indicar intercâmbio de genes no passado ou
atualmente (PALOMBO, 2002)
2.8. Patogênese viral
Os vírus liberados nas fezes podem chegar à ordem de 10
9
-10
11
partículas
infecciosas por mililitro de fezes (FLEWETT e WOODE, 1978) e a excreção máxima
ocorre entre o 3° e 4° dia após o início dos sinais clínicos (MASCARENHAS, 1999).
Água, alimentos e fômites contaminados funcionam como fontes de infecção
(MURPHY, 1995) tanto para o homem como para os animais.
Uma vez no hospedeiro, os RVs resistem ao pH ácido do estômago e
alcançam o trato intestinal, onde replicam nos enterócitos de revestimento das
vilosidades do intestino delgado (RAMIG, 1994), no duodeno e porção anterior do
jejuno (FLEWETT e WOODE , 1978).
25
Antígenos e partículas infecciosas de RVs já foram descritos em vários
órgãos diferentes do intestino: estômago, fígado, pulmões, baço, rins, pâncreas e
bexiga. Dentre as alterações histopatológicas observadas nesses órgãos destacam-
se inflamação aguda do ducto biliar, infiltrados parenquimais no fígado e nos
pulmões. Sua presença em macrófagos pulmonares sugere a possível via de
disseminação e expande a ação do vírus além dos limites do trato gastrointestinal
(AZEVEDO et al, 2005; CRAWFORD et al, 2006; BLUTT et al, 2007).
Estudos sugerem que a infecção por RVs causa um desligamento da
expressão de genes endógenos em favor da de genes virais e, associado à perda de
enterócitos maduros através de apoptose e substituição destas células por outras
menos diferenciadas, provavelmente conduz a uma disfunção absortiva do epitélio
intestinal (BOSHUIZEN et al, 2003; MARTIN-LATIL et al, 2007).
Além da má absorção, que parece estar relacionada ao dano inicial que o
vírus causa sobre o epitélio intestinal e à ação da enterotoxina viral NSP4, os
seguintes mecanismos relacionam-se ao quadro diarréico associado aos RVs:
ativação e estímulo por parte do Sistema Nervoso Entérico (SNE), que resulta em
secreção de eletrólitos e água a partir das células das criptas intestinais; isquemia
das vilosidades, que conseqüentemente danifica os enterócitos e aumento da
motilidade intestinal, em decorrência da diminuição do tempo de trânsito intestinal
(RAMIG, 2004).
De acordo com a Figura 9, anticorpos neutralizantes dirigidos contra VP4 e
VP7 podem prevenir a ligação e penetração viral, levando a exclusão viral (Passo 1).
Se este mecanismo falha (2) a replicação viral que ocorre dentro dos enterócitos
altera o metabolismo das proteínas de membrana destas células, induzindo a
diarréia osmótica. Os RVs também aumentam a concentração intracelular de Ca
+2
,
que rompe o citoesqueleto e as junções aderentes, aumentando a permeabilidade
paracelular. Durante o passo 3, a replicação viral pode ser inibida por IgA dirigida
contra VP6. A falha deste mecanismo (4) induz a secreção de citocinas por células
T, em uma
tentativa de impedir a ação do vírus. Se a replicação viral não cessa (5),
os RVs produzem NSP4, uma toxina que além de induzir a diarréia, provavelmente
estimula o sistema nervoso entérico (SNE), aumentando a diarréia e a motilidade
intestinal. Por último (7), a morte das células infectadas, contribui para o
agravamento da diarréia (ANGEL et al, 2007).
26
1
2
3
4
5
NSP4
Ca
2+
6
?
7
Cl
-
1
2
3
4
5
NSP4
Ca
2+
6
?
7
Cl
-
Figura 9: Possíveis mecanismos da diarréia induzida por RVs.
Fonte: Angel et, 2007.
2.9. Replicação viral
As características gerais da replicação dos RVs incluem:
A replicação ocorre no citoplasma, no Retículo Citoplasmático e em estruturas
específicas conhecidas como viroplasmas;
O vírus possui todas as enzimas necessárias a sua replicação;
Os transcritos funcionam tanto produzindo proteínas, como servindo de molde
para a produção da fita negativa, permanecendo associado a esta após a
síntese;
Os segmentos de RNAs de fita dupla são formados dentro da partícula
subviral e nunca são observados na forma livre ou fita simples nas células;
As proteínas do capsídeo externo são adquiridas quando as partículas
maduras atravessam a membrana do Retículo Endoplasmático;
As partículas infecciosas são liberadas por lise celular (ESTES, 2001).
Antes de iniciar a replicação viral, as partículas com tripla camada (TLPs, do
inglês “Triple-Layered Particles”) de RVs interagem com receptores celulares (ácido
siálico, por exemplo), através do domínio da VP5* (supbroduto da clivagem da VP4),
promovendo a penetração viral pela membrana celular. No citoplasma, as TLPs
perdem as proteínas VP4 e VP7 (desnudamento) e tornam-se partículas com dupla
camada (DLPs, do inglês “Double-Layered Particles”), transcricionalmente ativas. As
DLPs consistem em uma camada externa de VP6 e outra interna de VP2 que
27
encerra os 11 segmentos RNAs de fita dupla, além da VP1 (com atividade de RNA
polimerase RNA dependente) e da VP3 (com atividade de capeamento 5´ dos RNAs
de polaridade positiva) (SILVESTRI et al, 2004; TRASK e DORMITZER et al, 2006) e
se acumulam nos viroplasmas.
Os RNAs mensageiros virais (mRNA, do inglês “messenger RNA”)
produzidos a partir dos 11 RNAs de fita dupla contidos no interior do cerne são
exportados através de canais tipo II que atravessam as camadas de DLPs. As fitas
de RNA(+) dirigem a síntese das proteínas virais e servem como molde para a
produção de RNA (-) e, posteriormente, para montagem dos RNAs de fita dupla
(ESTES, 2001). Os RNAs virais também se acumulam nos viroplasmas.
A proteína não-estrutural NSP4 e as proteínas estruturais VP4 e VP7 são
sintetizadas associadas ao Retículo Endoplasmático. NSP4 e VP4 permanecem
acopladas de modo transmembranar ao retículo, enquanto VP7 encontra-se em seu
lúmen, até o momento da montagem do vírion (MIRAZIMI et al, 2003).
As demais proteínas estruturais (VP1, 2, 3 e 6) e não-estruturais (NSP2, 5 e
6) -sintetizadas no citoplasma - são direcionadas aos viroplasmas para montagem
das DLPs. Estas migram dos viroplasmas em direção ao lúmen do Retículo
Endoplasmático e quando atravessam a membrana desta organela (pela interação
entre NSP4 e VP6), incorporam as proteínas (temporariamente transmembranas)
Vp4, VP7 e NSP4, adquirindo um envoltório lipídico. Este envoltório é perdido
durante o processo de maturação das novas partículas TLPs formadas, que ocorre
no Retículo Endoplasmático e que envolve a reorganização das proteínas VP4 e
VP7 para formação do capsídeo externo (ESTES, 2001).
O ciclo termina quando a progênie formada é liberada por lise celular
(ESTES, 2001).
2.10. Apresentação clínica
As infecções por RVs produzem vários tipos de respostas, que variam de
infecções subclínicas a doença severa e fatal (KAPIKIAN et al, 2001). Inicialmente,
observa-se febre e, em seguida, diarréia, podendo ocorrer com ou sem vômito e
agravar-se quando associada a microorganismos.
28
O período de incubação varia de um a sete dias, sendo mais comum em
menos de 48 horas (ANDERSON e WEBER, 2004). Os vírus podem ser liberados
nas fezes por mais de sete dias (MIDDLETON, 1996; ANDERSON e WEBER, 2004).
Além da apresentação clássica das infecções causadas por RVs, outras
manifestações clínicas podem estar presentes. Em um estudo comparativo
envolvendo 78 crianças hospitalizadas com diarréia causada por rotavírus e 72 com
doença diarréica não associada ao vírus, observou-se que as manifestações clínicas
foram mais severas entre o grupo acometido por rotavírus (Tabela 4) (KAPIKIAN et
al, 2001).
Porcentagem de cada achado clínico
Achado clínico
Infecção relacionada aos RVs Infecção não relacionada aos RVs
Vômito 96 58
Febre (37,9-39°C) 46 29
Desidratação 83 40
Irritabilidade 47 40
Letargia 36 27
Eritema faríngeo 49 32
Exsudato tonsilar 3 3
Rinite 26 22
Linfonodos cervicais palpáveis 18 9
Tabela 4: Característica clinica da rotavirose em crianças hospitalizadas.
Fonte: KAPIKIAN et al, 2001.
Em sistemas de produção animal, as enterites podem ser agrupadas como
uma síndrome diarréica, uma vez que a presença de mais de um agente patogênico
é comum. Fatores imunológicos, ambientais e nutricionais também podem exacerbar
a doença (MURPHY et al, 1995). Dentre estes fatores destacam-se idade ao
desmame, tamanho do rebanho, tipo de manejo empregado, implantação de
programas de vacinação contra rotavírus e forma de aquisição de novos animais
(SILVA et al, 1999; DEWEY et al, 2003).
Os animais jovens podem mostrar-se levemente deprimidos e continuar a
ingerir o leite materno, recuperando-se dentro de um período de três dias. Contudo,
pode ocorrer o óbito como resultado de desidratação ou infecção bacteriana
secundária (MURPHY et al, 1995).
29
2.11. Diagnóstico
O diagnóstico de rotavirose não pode ser fundamentado apenas na
observação dos sinais clínicos, uma vez que muitas patologias provocam sinais
semelhantes. Dessa forma, torna-se necessária a detecção do vírus ou do antígeno
viral e/ou a manifestação da resposta sorológica (KAPIKIAN et al, 2001).
A detecção inicial dos RVs baseava-se em técnicas de microscopia eletrônica.
Apesar de útil, esta técnica está limitada a laboratórios de pesquisa e referência,
principalmente porque o preparo das amostras e a manutenção do microscópio
exigem mão-de-obra especializada (WILHELMI et al, 2003).
Apesar de alguns RVs poderem ser isolados em cultivo celular, a utilização
desta técnica como ferramenta de diagnóstico não apresenta valor prático, sendo
mais utilizada durante pesquisas científicas (KAPIKIAN et al, 2001).
Dentre as técnicas baseadas na detecção de antígeno viral incluem:
imunohistoquímica (IHC), aglutinação em látex, EIARA e ensaio imunoenzimático
(EIA, do inglês “Enzyme Immunoassay”), sendo estas últimas mais utilizadas em
clínicas e hospitais de atendimento a humanos.
Para detecção do genoma viral destacam-se o PAGE, RT-PCR, Hibridização
(“dot-blot”) e seqüenciamento. Variações destas técnicas como a RT-PCR em tempo
real, por exemplo, são mais restritas a investigações cientificas e laboratórios de
referência nacional e internacional.
Dentre as técnicas sorológicas utilizadas no diagnóstico de RVs, o ELISA é a
mais utilizada, uma vez que possui alta sensibilidade e não requer equipamentos
especializados. As demais técnicas sorológicas incluem: radioimunoensaio (RIA,
“radioimmunoassay”), imunofluorescência indireta (IFA, “indirect immunoflorescent
antibody assay”), dentre outras (KAPIKIAN et al, 2001).
2.12. Tratamento, controle e prevenção
O tratamento da rotavirose humana consiste na reposição das perdas
hidroeletrolíticas, preferencialmente pela via oral. Em casos mais graves a
reidratação venosa pode ser necessária e o uso de antibióticos é considerado
inapropriado (PAHO, 2007).
30
No caso da pecuária, a aplicação de antibióticos para controle de infecções
bacterianas secundárias pode auxiliar na recuperação do animal. Melhorias no
manejo, tais como desinfecção semanal, limpeza freqüente dos recintos dos animais
e da maternidade pode contribuir para a diminuição da incidência de infecções por
rotavírus (EMBRAPA, 1987).
Ainda que a adoção de práticas de higiene, abastecimento de água e a
eliminação de águas residuais possam contribuir diminuindo a mortalidade
associada aos RVs (PAHO, 2007), uma vacina eficiente é a principal meta a ser
alcançada para controlar e prevenir a doença, tanto em países desenvolvidos como
em desenvolvimento (LINHARES, 2000). Isto porque mesmo em países
desenvolvidos que não carecem de infra-estrutura hídrica, a ocorrência de surtos
relacionados aos RVs é significativamente relevante .
As primeiras vacinas utilizadas contra infecções humanas por RVs datam da
década de 80 e não conferiram proteção, provavelmente devido ao fato de os
sorotipos utilizados na vacina (de origem bovina e símia) divergirem dos circulantes.
Para contornar este problema, em 1998 foi licenciada uma vacina recombinante -
Rotashield (Laboratório “Wyeth Lederle Vaccines and Pediatrics”) - composta pelos
quatro sorotipos mais prevalentes e epidemiologicamente importantes (G1-G4).
Entretanto, a possível associação entre a vacina e o surgimento de intussuscepção
intestinal fez com que a comercialização da vacina fosse suspensa e o programa de
imunização cancelado (CDC, 1999).
Em 2004 uma nova vacina foi licenciada internacionalmente e incluída no
calendário brasileiro de imunizações a partir de 2006. A Vacina Oral de Rotavírus
Humano (VORH), comercializada sob o nome Rotarix
pelo Laboratório
GlaxoSmithKline, é monovalente e elaborada a partir de vírus humanos atenuados
cujo sorotipo é P[8]G1 (BRASIL, 2006).
Outra vacina que também se encontra disponível para imunização humana é
a Rotateq
(Laboratório MERCK); uma vacina pentavalente com os tipos G e P mais
comuns entre humanos quais sejam G1, 2, 3 e 4 e P[8] (PAHO, 2003).
Os programas de imunização em espécies animais são empregados, em sua
maioria, em regiões endêmicas ou com risco de ocorrência de infecções por RVs.
Estes programas estão disponíveis para eqüinos (WILSON, 1999), suínos (DEWEY
et al, 2003), bovinos e bubalinos (PISANELLI et al, 2005; MERIAL, 2008).
31
Apesar de não ser possível erradicar a rotavirose, devido à diversidade de
cepas circulantes, que podem ser evolutivamente selecionadas, espera-se que a
vacina diminua a severidade de episódios diarréicos subseqüentes à imunização,
diminuindo as taxas de morbidade e mortalidade e, conseqüentemente, os prejuízos
causados por esta virose.
32
3. MATERIAL E MÉTODOS
Todos os ensaios deste estudo foram realizados no Núcleo de Análise
Genômica da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro – Campos
dos Goytacazes, RJ.
3.1. Obtenção e viabilidade das amostras
Quatro amostras positivas para RVs e provenientes de suínos foram obtidas
e caracterizadas a partir de estudos conduzidos por Xavier (2003), que analisou 226
amostras de fezes no período de 2001 a 2003. Além das amostras de origem suína,
duas amostras positivas para RVs foram provenientes de crianças menores de cinco
anos, cedidas com consentimento escrito dos responsáveis. Todas as amostras
estavam acondicionadas em frascos próprios e armazenadas a -20°C.
As amostras positivas (Tabela 5) foram re-testadas por PAGE a fim de
garantir a viabilidade dos 11 segmentos genéticos característicos dos RVs.
Identificação Origem da amostra Classificação por RT-PCR
79 Suína P[7]G3
179 Suína P[7]G1G5
204 Suína P[7]G5
211 Suína P[1]G5
Hum-1 Humana P
(a)
G5
Cam-3 Humana P
(a)
G
(a)
Tabela 5: Identificação das amostras.
(a)
Sem classificação.
3.2. Extração de RNA de fita dupla
Os RNAs de fita dupla virais foram extraídos com TRIzol
LS (Invitrogen
Corporation, Carlsbad, Califórnia - USA), com modificações a partir da
recomendação do fabricante.
Foram adicionados aproximadamente 250 µL de fezes em um microtubo
(capacidade 1,5 mL) contendo 750 µL de TRIzol
. Após homogeneização e
33
incubação à temperatura ambiente durante 15 minutos, foi adicionado 150 µL de
clorofórmio e em seguida a mistura foi cetrifugada a 12.000 g durante 10 minutos a
uma temperatura de 4°C. A fase aquosa obtida foi transferida para um novo tubo
previamente identificado e adicionada de 375 µL de isopropanol. Após 10 minutos de
incubação à temperatura ambiente, a mistura foi submetida à centrifugação a 12.000
g/10 minutos/4°C. Ao término desta etapa o sobrenadante foi descartado e o
sedimento lavado uma vez com 1 mL de etanol 75% (v/v) gelado, sendo submetido à
homogeneização por vórtex e centrifugação a centrifugar 7.500 g/5 minutos/4°C.
Novamente descartou-se o sobrenadante e procedeu-se a secagem do sedimento
em banho seco (10 minutos/65°C). Por fim o RNA foi ressuspenso em 25 µL de água
ultrapura.
3.3. RT-PCR - Reação em cadeia da polimerase precedida de transcrição
reversa
Os RNAs de fita dupla extraídos foram utilizados como molde para obtenção
de cDNA, e estes utilizados para a transcrição reversa (RT) (GOUVEA et al, 1990;
GENTSCH et al, 1992), com modificações.
Uma alíquota de 3 µL do RNA de fita dupla extraído de cada amostra foi
misturada a 1,5 µL de dimetilsulfóxido (DMSO) e 0,25 µL dos primers Beg9-End9 ou
Con3-Con2 (Tabela 6), na concentração de 20 pmol. A mistura foi desnaturada por
aquecimento a 95°C durante 5 minutos e rapidamente resfriada em banho de gelo
por 3 minutos. A esta mistura foi adicionada a solução mix para RT (Tabela 7),
perfazendo um volume final de 15 µL.
Iniciador Seqüência (5’-3’)
Posição (nt)
Tamanho do fragmento (pb)
Beg9 GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG 1-28
End9 GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG 1062-1036
1062
Con3 TGGCTTCGCCATTTTATAGACA 11-32
Con2 ATTTCGGACCATTTATAACC 868-887
876
Tabela 6: Iniciadores utilizados para obtenção dos fragmentos referentes ao gene que
codifica VP7, 1062 pb e VP4, 876 pb.
Fonte: Gouvea et al 1990; Gentsch et al, 1992.
34
Reagentes (solução mix)
Volume por reação (1x) - µ
µµ
µL
5x PCR Buffer (Invitrogen) 5
RNase Out (Invitrogen) 2
dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 10 mM (Fermentas) 0,5
DTT (Dithiothreitol) 2,5
Super Script II RNase H
-
Reverse Transcriptase (Invitrogen )(40U/
µ
L)
0,25
Tabela 7: Composição da solução mix para RT.
A síntese de cDNA foi conduzida em termociclador a uma temperatura de
42°C durante 50 minutos.
O cDNA obtido pela RT foi utilizado para amplificação dos segmentos de
876 pb (VP4) e 1062 pb (VP7) , segundo descrito por Gouvea et al (1990) e Gentsch
et al (1992), com modificações e uma alíquota de 1 µL dcDNA foi adicionada à
solução mix para PCR (Tabela 8).
Reagentes (mix para PCR).
Volume por reação (1x) - µ
µµ
µL
Água ultra-pura 16,5
DMSO 1,75
10x PCR Buffer 2,5
Mg
2+
25 mM 1,5
dNTP 10 mM 0,5
Taq Polimerase (Fermentas) (50 U/
µ
L)
1,0
Beg9-End9 ou Con3-Con2 (20 pmol) 0,25
Tabela 8: Composição da solução mix para PCR.
A amplificação foi conduzida em termociclador com a programação de uma
desnaturação inicial a 94°C durante 2 minutos; seguida por 40 ciclos de
desnaturação (90°C/30s), anelamento (42°C/60s) e extensão (70°C/90s); e por uma
extensão final a 70°C durante 7 minutos.
3.4. Visualização dos produtos da RT-PCR (amplicons)
Uma alíquota de 3 µL de cada amplicon foi submetida à eletroforese em gel
de agarose a 0,8% contendo brometo de etila (5µL/100mL) em tampão Tris-Acetato-
EDTA (TAE: 48,4 g Tris-Base; 11,42 mL Ácido Acético; 20 mL EDTA; pH8,0) e sob
voltagem constante de 100 volts durante, aproximadamente, 30 minutos.
35
Após a eletroforese, o gel foi observado em transiluminador com luz
ultravioleta e, posterior à leitura das bandas fluorescentes, foto-documentado
utilizando-se o sistema eletrônico EagleEye.
3.5. Precipitação, quantificação e seqüenciamento do DNA
Os amplicons provenientes da RT-PCR foram precipitados com
propilenoglicol (PEG), conforme preconizado por Lewis e Metcalf (1988), com
modificações.
Uma alíquota de 18 µL de cada amplicon obtido pela RT-PCR foi adicionada
a um microtubo (tipo “eppendorf”) contendo 8µL da NaCl 5M, 14 µL de água
ultrapura autoclavada e 40 µL de PEG 8000 (Sigma). A mistura foi incubada a 4°C
(geladeira) por um período mínimo de 4 horas. Após esta incubação a mistura foi
centrifugada a 10.000 g/4°C/15 min e o sobrenadante descartado ao final do
procedimento. Um volume de 500 µL de etanol 70% gelado foi adicionado ao
sedimento e o conjunto centrifugado a 10.000 g/4°C/5 min. O sobrenadante foi
novamente descartado e o sedimento submetido à secagem a 65°C em banho seco.
Por fim o DNA peletizado foi ressuspenso em 10 µL de água ultrapura autoclavada.
O DNA purificado foi quantificado em gel de agarose a 0,8% sob as mesmas
condições descritas anteriormente (item 3.4), durante 15 minutos a 80 volts, sendo
utilizadas duas amostras de concentrações conhecidas e diferentes (20 ng/µL e 50
ng/µL) para comparação visual.
A seqüência de nucleotídeos dos genes que codificam VP4 e VP7 de RVs
foi determinada pelo método de nucleotídeos terminadores de cadeia (método de
Sanger-Coulson) utilizando-se o kit “Dyenamic ET Terminator Cycle Sequencing”
(Applied Biosystems).
Cada amostra de DNA previamente quantificada foi subdividida em duas
para condução do seqüenciamento. Uma solução mix (Tabela 9) foi preparada com
os reagentes e o amplicon adicionado a esta mistura.
36
Reagentes (mix para sequenciamento)
Volume por reação (µ
µµ
µL)
Água ultrapura autoclavada 9
MgCl
2+
25 mM 6
Premix de seqüenciamento (ET) 2
Amplicon 1
Primer - direto (Beg 9 ou Con3) ou reverso (End 9 ou Con2) 2
Tabela 9: Composição da solução mix para seqüenciamento.
A reação de seqüenciamento foi conduzida em termociclador com a
programação de uma desnaturação inicial a 96°C/60 s e 25 ciclos, cada um
composto por desnaturação a 96°C/20 s, anelamento a 42°C/5 s e extensão a
60°C/4 min.
Após o término da reação de seqüenciamento, as amostras foram
precipitadas de acordo com protocolo fornecido pelo fabricante do kit de
seqüenciamento (Applied Biosystems), com modificações.
Cada produto da reação de seqüenciamento foi adicionado de 2 µL de
acetato de sódio (fornecido juntamente com o kit) e 80 µL de etanol 96%, sendo
misturado em vórtex por, aproximadamente, 1 min. O descarte do sobrenadante foi
precedido por uma rápida centrifugação a 12.000 g/15 min. Um volume de 100 µL de
etanol 70% gelado foi adicionado ao sedimento e uma nova centrifugação a 12.000
g/ 3 min efetuada. Após novo descarte do sobrenadante o sedimento foi submetido à
secagem em banho seco (65°/15 min) e ressuspenso em 1,5 µL de formamida,
imediatamente antes de ser aplicado no Seqüenciador Automático ABI-Prism 3130
Genetic Analyser do Núcleo de Análise Genômica/UENF.
3.6. Análise das seqüências
Após obtenção das seqüências, as mesmas foram montadas utilizando-se
os programas Phred/Phrap/Consed em sistema operacional Linux (EWING e
GREEM, 1998; EWING et al, 1998; GORDON et al, 1998).
As seqüências montadas foram analisadas pelo BLASTn contra a base de
dados do Centro Nacional de Informação Biotecnológica (National Center of
Biotechnology Information’s - NCBI’s, website http://www.ncbi.nlm.mih.gov
) e
37
alinhadas utilizando-se o programa Clustal W 1.8 (website http://www.ebi.ac.uk)
(TOMPSON et al, 1994).
O ajuste das extremidades das seqüências de DNA, de modo que todas
tivessem o mesmo número de bases e estivessem alinhadas, foi realizado com
auxílio do recurso computacional BioEdit (HALL, 2001). O cálculo da significância
estatística de similaridade entre as seqüências foi realizado utilizando-se uma
reamostragem para 1000 replicações (SWOFFORD et al, 1996). O método de
distância (“Neighbour Joining”) (SAITOU e NEI, 1987) foi utilizado para construção
da árvore filogenética com auxílio do programa TREECON (PEER, 2001).
38
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. RT-PCR
Todas as amostras testadas (n=6) produziram o fragmento de tamanho
esperado para o gene que codifica VP7 (1062 pb). Entretanto, somente três
amostras renderam fragmentos de 876 pb, referentes à região VP8* do gene 4,
quando submetidas a RT-PCR (Figura 10).
O gene que codifica VP4 não foi amplificado nas amostras Hum-1 e Cam-3.
Apesar da amplificação do gene de VP7, a amostra Cam-3 não foi caracterizada
quanto ao genotipo G. Diante destes resultados, os genes de VP4 das amostras
Hum-1 e Cam-3 e o gene de VP7 da amostra Cam-3 não foram submetidos ao
seqüenciamento.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
2000 pb
1000 pb
2000 pb
750 pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
2000 pb
1000 pb
2000 pb
750 pb
Figura 10: Eletroforese em gel de agarose 0,8 % com brometo de etila, dos produtos
amplificados pela RT-PCR de rotavírus provenientes de amostras fecais de origem humana
e suína.
Linhas 1 e 18: marcador de peso molecular (1kb, Fermentas
).
Linhas 2 a 9: produtos de 1062 pb. Amostra 79 (linhas 2 e 3), 204 (4 e 5), 211 (6 e 7), Hum-
1 (8 e 9).
Linhas 10 a 17: produtos de 876 pb. Amostra 79 (linhas 10 e 11), 204 (12 e 13), 211 (14 e
15), Hum-1 (linhas 16 e 17).
Nota: não são mostrados os amplicons das amostras 179 e Cam3.
A falha em se amplificar genes codificadores de VP4 e VP7 de RVs tem sido
observada em vários estudos envolvendo RT-PCR. Iturriza-Gómara et al (2004)
descrevem métodos e primers desenvolvidos para caracterizar genotipicamente
39
cepas de rotavírus previamente classificadas como G3 e que falharam na
classificação para o tipo P. Segundo os autores, embora a RT-PCR esteja bem
estabelecida como método para caracterização dos RVs, se faz necessário a
atualização e revisão regular dos reagentes e métodos utilizados, considerando-se
os mecanismos evolutivos destes vírus. Martella et al (2005) e Heide et al (2005)
também correlacionaram alterações ocorridas na RT-PCR com variações nas
seqüências de nucleotídeos de RVs, na Itália. Nestes estudos foram seqüenciadas
amostras não caracterizadas por PCR ou que não foram passíveis de amplificação
pelo mesmo método.
Fischer et al (2003) descrevem algumas possíveis explicações para falha de
caracterização de RVs por RT-PCR, dentre elas mutações pontuais em locais de
ligação dos primers, que podem alterar, inclusive, a caracterização de amostras
consideradas resultado de infecções mistas. Quando estes autores submeteram
amostras consideradas mistas para o tipo G (G3-G8) ao seqüenciamento,
identificaram o genotipo G8 a partir da análise das seqüências de nucleotídeos.
Infelizmente, neste presente estudo, a amostra 179, caracterizada por RT-PCR
como mistura de G1-G5P[7] não foi submetida ao seqüenciamento, devido à
pequena quantidade de fezes disponível.
O acúmulo de mutações pontuais dentro da região de pareamento do primer
pode explicar a falha para amplificação dos fragmentos correspondentes nas
amostras Hum-1 (para o gene codificador de VP7) e Cam-3 (para os genes
codificadores de VP4 e VP7. O par de primers Con3-Con2 utilizado neste estudo foi
desenhado no ano de 1992 por Gentsch et al e é específico para regiões
conservadas do genoma viral. Para classificação do gene codificador da proteína
VP7 (tipo G) foi utilizado o par de primers Beg9-End9 desenhado em 1990 por
Gouvea et al. Alguns relatos demonstram que estes primers podem falhar na
detecção de novas cepas de RVs (GRIFFIN et al, 2002; FISCHER et al, 2003;
ITURRIZA-GÓMARA et al, 2004; HEIDE et al, 2005; MARTELLA et al, 2005).
A qualidade do RNA extraído também interfere no êxito da transcrição
reversa e amplificação a partir de cDNA e, pode ter sido igualmente responsável
pelas falhas na amplificação dos produtos analisados neste estudo (MANIATIS et al,
1992).
40
4.2. Seqüenciamento
Dentre as amostras analisadas, somente aquelas identificadas como 79G,
204G e Hum-1 foram eficientemente seqüenciadas para o produto de amplificação
do gene que codifica VP7. As seqüências obtidas foram editadas com auxílio do
recurso computacional BioEdit (HALL, 2001), excluindo-se parte das extremidades
5´e 3´, em decorrência da baixa qualidade do seqüenciamento.
Seqüência do gene codificador de VP7 da amostra 79 – tamanho do fragmento: 1002 pb
GATTTTAGAATCATGTATATGCTGCTGTATTTAATGACCGTGATCTTTTGGACATAACTTGTACAATCTGACCC
TTCTGAGGTACCACTGTATAGAAAACTTGCCACCATTTCTTCCCATTTAGTCGCATCATACGCTCAGTTTGTG
GTGTAGTAGTTGGATCCGCCGTAATATCTAACACTTCTGAGCCACCGACTTGTATAATTGCTACGTTCTCTCT
TGGTCCTAACTTCTTACAATTTCTAATCGTACAGGTATTTGTAGTTACATCAAGTTTATGATTCACACCGTCAA
CGACATCGGTTATTACCAATTTTTCACCTGTAGCCACTTCTTCAAATGTCGCTGCATTTGTAGTAGTACAACCT
ATTCCCAAAGTCTGTGTATTCAATGGACATACTTTTATGGTACAAGACTGTCCCATTGATATCCATTTATTCGC
TTCATCCGTTTGCTGATAATAATATAATGTTATATCCATTGGGTTACATAACCATTCATTTAAAATCAGATCAGC
CAATTCAGACATATCTAATTCTAACGTTGAATCATACTTCATCAGTACAACATTATAATCACAGTAAAGTTGTG
GGTCAATTGAGAATGAAGCGATATCGGTATATTCTTTAAAATAGACTGATCCAGTTGGCCACCCCTTAGTCAA
GAATAATTGAGACAGAGTATCTTTCCATTCCGTGTCTCCAATTTGAGTTGATGCTTCAGTAGGATAATATAAGC
ATAGCGTTGAAGTTAAAAATGTTTCTTGTTGCGACGAATTCGCATATGCTGTGTCCATAGAGCCAGTGATTGG
TAAATTAATTCCATAATTTTGCGTTTTAACAAATGGTGACACAATAACAATAAGTAGAAGAAATCGACAAAGGA
TAAAGTCCATCGCACTAGTTAGTGATTTTAATCTGTAAAAGGGTAAAATTATTGATATCAGAAAGGTTAGAACT
GTGGTATATGCAATATCATACATAATAGAGTTTATCAAATGGG
Seqüência do gene codificador de VP7 da amostra 204 – tamanho do fragmento: 890 pb
AGCGTGATCGCTTGGACATGACTTGCACAATCTGATTGACGTAATCAACTATTGTATAAAAGACTTGCCACCA
CCTCTTCCAATTTATACGCATCATTCTTTCAGTCTGTGGTGCAGTTGTTGGATCAGCTGTTATGTCGAGTACAT
TTGGACCTCCCACCTGAATCACAGCAACGTTTTCTCTTGGTCCAAGTTTTTTACAATTTCTTATGGTGCATGTA
CTCGTTGTTACGTCCAATTTGTGATTAACTCCATCGACAACATCAGTTATAGCTAGTTTCTCTGCATTAGCGAC
TGTTTCAAATGAATTTACGTCTGTAGTCGAACACCCTATTCCGAGAGTCTGTGTATTTAAGGGACATACTTTAA
TTGTACATGATGCGCCCATTGATATCCATTTGTTAGCTTCATCTGTTTGTTGATAATAATATAGCGTTATATCCA
TTGGATTACATAGCCATTCATTCAATATTAAATCAGCCAACTCAGACATATCTAGCTGTAAATTTCCATCATACT
TCATTAGTACAATATTATAGTCACAATATAACTGTGGTTCTACAGAAAATGACGCGATATCTGCATCCCCTTTA
AAATAAACTGACCCCGTTGGCCATCCTTTTGTTAGGAACAACTGCGATAATGTTTCCGTCCATTTTGCATCTG
CAATTTCTGTAGCTGCTTCATTTGGATAATATAGACATAATGTTGAAGTTAAAAATGTTTCACTTGTAGTGGAAT
TCATATATGGCGTATCCATAGATCCAGTTATTGGTAAATTAATTCCGTAATTTTGAGCTTTAATAAGTGGTGCA
AGTATGACTATAATCAATAAAAACCTATAAATGATAAAGTCCATTATTCTGATAACTGATTTCAGTATATAATTA
Seqüência do gene codificador de VP7 da amostra Hum-1 – tamanho do fragmento: 944 pb
TATACCACAATTCTAATCTTTCTGATATCAATCATTCTACCCAACTATATATTAAAATCAGTGACTCGAATGATG
GACTACATTCTTTATAGATCTTTGTTGATTTCTGTAGCATTATTTGCCTTGACAAGAGCTCAGAATTATGGACTT
AACTTACCAATAACAGGATCAATGGACACTGCATACGCTAACTCTACTCAAGAAGGAATATTTCTAACATCCA
CATTATGTTTGTATTATCCAACTGAAGCAAGTACTCAAATTAATGATGGTGAATGGAAAGACTCATTGTCACAA
ATGTTTCTCACAAAAGGTTGGCCAACAGGATCAGTCTATTTTAAAGAGTATTCAAGTATTGTTGATTTTTCTGT
TGATCCACAATTATATTGTGATTATAACTTAGTACTGATGAAATATGATCAAAATCTTGAATTAGATATGTCAGA
GTTAGCTGATTTAATATTGAACGAATGGTTGTGTAATCCAATGGATATAACATTATATTATTATCAACAATCGG
GAGAATCAAATAAGTGGATATCAATGGGATCATCATGTACTGTGAAAGTGTGTCCACTGAATACGCAAACGTT
AGGAATAGGTTGTCAAACAACAAATGTAGACTCGTTTGAAATGGTTGCTGAGAATGAGAAATTAGCTATAGTA
GATGTCGTTGATGGGATAAATTATAAGATAAATTTGACAACTACGACATGTACTATTCGAAATTGTAAAAAATT
GGGTCCAAGAGAGAATGTAGCTGTAATACAAGTTGGTGGCTCTAATGTATTAGACATAACAGCAGATCCAAC
GACTAATCCACAAACTGAGAGTATGATGAGAGTGAAAGGGAAAAAATGGTGGCAAGTATTTTATACTATAGTA
CCTAGATAGAGGTCAGATCGTGCAGGTAATGTCCAAAAGATCAAGATCATTAAATTCTG
Utilizando-se a ferramenta de comparação de seqüência de nucleotídeos
Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), a amostra 79G, previamente classificada
por RT-PCR como G3, foi alinhada com várias seqüências do gene que codifica a
41
proteína VP7 de RVs de origem suína e humana (Tabela 10), sendo, em seguida
classificada como G9 (Figura 11).
Acesso no GenBank
Cepa isolada Origem Tipo G
DQ873678 Y111 Humana
DQ873679 L226 Humana
EF088832 5290 Humana
EF495127 RUS79 Humana
AY707788 CMP039 Suína
L35079 A138 Suína
L35060 A411 Suína
L35059 A34 Suína
L35058 C134 Suína
L35057 - Suína
L35056 CC117 Suína
L35054 A46 Suína
NC_007468 B4106 Humana
EU348715 P50 Suína
3
AB176677 HOKKAIDO-14
Suína
AB176680 JP16-3 Suína
AB176679 JP13-3 Suína
AB176683 JP35-7 Suína
AB176682 JP32-4 Suína
AB176681 JP29-6 Suína
AB176678 JP3-6 Suína
AB180969 WI-61 Bovina
L14072 116E Humana
AB180972 O-1 Suína
9
M63266 NCDV Bovina 6
Tabela 10: Cepas de RVs classificados como G3 e como G9 de origem suína e humana
utilizadas neste estudo.
42
Figura 11: Dendograma para a amostra 79, obtida pelo método do vizinho mais próximo
(neighbour-joining), de acordo com a seqüência de nucleotídeos de RVs G3 e G9, de origem
suína e humana. A cepa NCDV (G6) foi utilizada como raiz para grupo externo. Os valores
de bootstrap (%) são mostrados. As cepas estão referenciadas na Tabela 10.
De acordo com a Figura 11, observa-se a formação de dois grandes grupos,
A e B, com algumas particularidades. O grupo A corresponde aos RVs G3 e exceto
pela cepa humana número de acesso B4106 (acesso nº NC_007468), dividi-se em
dois subgrupos distintos, A1 (humano) e A2 (suíno). B4106 mostra-se como um
grupo isolado devido ao fato de não somente seu gene codificador de VP7, como os
demais segmentos genômicos compartilharem elevado nível de identidade com
cepas de RVs de origem leporina, diferindo sobremaneira de outras cepas de origem
humana (MATTHIJNSSENS et al, 2006).
Dentro deste grupo observa-se ainda uma grande diversidade entre cepas
de origem suína, comprovada pela formação de pequenos subgrupos internos (A2).
A
A1
A2
B2
B1
B
43
O grupo B subdivide-se de acordo com a origem das cepas de RVs em B1
(origem humana) e B2 (origem suína). Com relação ao subgrupo B1, vale ressaltar
que a cepa 116E (acesso nº L14072) é resultado provável de reagrupamento entre a
cepa humana Wa e a cepa bovina KK3 (DAS et al, 1993). A mesma diversidade
entre cepas de origem suína observada no subgrupo A2 é novamente comprovada
para o subgrupo B2.
A análise das seqüências de genes de RVs provenientes de diferentes
espécies tem mostrado uma relação genética que sugere um ancestral comum para
algumas espécies. A relação entre cepas humanas e suínas, particularmente, é
evidente na filogenia de genes que codificam proteínas estruturais e não-estruturais,
indicando um intercâmbio de genes entre estas espécies, que pode ter ocorrido no
passado e ainda estar ocorrendo (PALOMBO, 2002).
A amostra 79G foi agrupada junto com as demais cepas de RVs de origem
suína e classificada como G9, ainda que tenha sido caracterizada por RT-PCR como
G3. Este resultado sugere que esta amostra apresenta mutações que possam
interferir na caracterização por RT-PCR. Entretanto, uma melhor avaliação é
necessária para confirmar esta hipótese.
O nível de homologia entre a amostra 79G e as demais foi maior entre
cepas de origem suína e provenientes do Japão. Santos et al (2001) encontraram
resultado semelhante ao analisarem 157 amostras positivas de RVs provenientes de
crianças menores de cinco anos de idade, internadas ou atendidas em ambulatórios
do estado do Rio de Janeiro, durante 1997 e 1999. No referido estudo, entretanto, os
autores observaram elevada similaridade genética entre cepas de procedência
brasileira e classificadas como G3P[9] e o vírus AU-1 de procedência japonesa, que
por sua vez é geneticamente similar aos RVs felinos, o que sugere uma infecção
zoonótica envolvendo cepas humana e felina. Infelizmente, no presente estudo não
foi possível correlacionar a ocorrência do genotipo G9 com a presença de felinos na
propriedade onde a amostra 79G foi coletada. Entretanto, levando-se em
consideração os mecanismos evolutivos que favorecem a diversidade de RVs, é
possível que tal similaridade observada seja resultado de recombinação genética
interespécies com ou sem a participação de felinos como hospedeiros
intermediários.
A similaridade entre cepas de procedência brasileira e asiática também foi
observada em estudo conduzido por Wang et al (2007), que avaliaram os genotipos
44
de maior ocorrência em adultos e crianças com diarréia, entre os anos de 2001 e
2006. No referido estudo as cepas G9 agruparam-se com outros tipos G9 dos
Estados Unidos, Brasil, Índia, Bangladesh, Tailândia, Austrália, Itália e alguns países
da África, compartilhando níveis de homologia entre 97-99%.
As amostras 204G e Hum-1, ambas classificadas por RT-PCR como G5
foram alinhadas com cepas de RVs de diferentes tipos G (Tabela 11), utilizando-se a
ferramenta Blast, previamente descrita.
Acesso no GenBank Origem/tipo G Acesso no GenBank Origem/tipo G
D16328 Hu1/G1 AF039524 Lh/G8
EF199723 Hu/G2 AB176683 Su1/G9
NC_007468 Hu/G3 AB176682 Su2/G9
EU139427 Hu/G4 AB176681 Su3/G9
AB257126 Hu/G5 AB176680 Su4/G9
AF421183 Hu/G6 AB176679 Su5/G9
AB272753 Hu1/G8 AB176678 Su6/G9
AY855064 Hu2/G8 AB176677 Su7/G9
AB180969 Hu1/G9 AB176672 Su8/G9
L14072 Hu2/G9 AY707787 Su9/G9
AY843333 Hu/G10 U35850 Su/G10
AB264007 Hu/G11 L24163 Su/G11
EU284736 Hu1/G12 DQ204743 Su/G12
EF059917 Hu1/G12 DQ13549 Eq/G13
L24164 Su/G1 AY750923 Eq1/G14
DQ534015 Su/G2 D25229 Eq2/G14
DQ786577 Su/G3 L49042 Eq3/G14
DQ683521 Su/G4 AB046468 Eq4/G14
DQ515961 Su/G5 U05348 Eq5/G14
X04613 OSU/G5 U05349 Eq6/G14
AF242393 Eq/G5 AB046467 Eq7/G14
M63266 Bo/G6 M61876 Eq8/G14
S58166 Av2/G7 AF237666 Bo/G15
X56784 Av3/G7 DQ981479 Su/G16
Tabela 11: Cepas de RVs utilizadas neste estudo. Hu=humana, Su=suína, Eq=eqüina,
Bo=bovina, Lh=Lhama (camelídeo), Av=ave (peru e galinha). OSU corresponde ao protótipo
suíno do grupo G5.
45
Figura 12: Dendograma para as amostras 204G e Hum-1, obtida pelo método do vizinho
mais próximo (neighbour-joining), de acordo com a seqüência de nucleotídeos de RVs G5
de origem suína e humana. O representante Eq/G13 foi utilizado como raiz para grupo
externo. Os valores de bootstrap (%) são mostrados. As cepas estão referenciadas na
Tabela 11.
46
De acordo com a Figura 12, a amostra 204G foi agrupada junto com outras
cepas de RVs G5, mostrando elevada homologia (94%) com a cepa eqüina (H-1)
(dados não mostrados). Esta cepa eqüina representa um exemplo de possível
transmissão interespécies de suínos para eqüinos, conforme observado em estudos
conduzidos por Ciarlet et al (2001), onde foram analisadas as seqüências dos genes
codificadores das proteínas estruturais VP4, VP6, VP7 e não-estruturais NSP1 e
NSP4, constatando-se elevada similaridade com o protótipo suíno OSU.
O genotipo G5 já está bem estabelecido como prevalente entre amostras de
RVs de origem suína e de origem humana, particularmente no Brasil. Estudos
conduzidos por Gouvea et al (1994) demonstraram pela primeira vez a ocorrência
deste genotipo nos estados do Rio de Janeiro, São Paulo, Pernambuco e Goiás,
entre crianças com diarréia e com uma prevalência de 4,6% (n=329). Desde então, o
genotipo G5 vem sendo considerado de importância epidemiológica, tanto no Brasil
como em outros países da América do Sul (SANTOS e HOSHINO, 2005).
Em suínos, G5, G3, G4 e G11 têm sido considerados os tipos mais
prevalentes em todo o mundo (ROSEN et al, 1994), ainda que G9 tenha emergido
no início dos anos 90 (TEODOROFF et al, 2005).
Um dado interessante deve-se ao fato da amostra 204G apresentar maior
nível de identidade com a cepa eqüina H-1 do que com a cepa suína OSU (93%).
Entretanto, uma análise mais detalhada, incluindo o seqüenciamento de todos os 11
segmentos genômicos da amostra 204G deve ser realizada para explicar tal
similaridade, uma vez que o agrupamento dos três isolados em um mesmo ramo do
dendograma era esperado.
O dendograma permite ainda observar a manutenção da identidade entre os
tipos G5 e G11, já comprovada por um estudo conduzido por Timenetsky et al
(1997). As autoras sugerem que cepas suínas G5 e G11 podem ter evoluído a partir
de uma cepa em comum (de origem humana ou suína), apresentando assim
especificidade sorológica para G5 e G11. Este resultado reforça os possíveis
mecanismos evolutivos que permitem o surgimento de novas cepas de RVs.
Com relação à amostra de origem humana analisada neste estudo, Hum-1,
observa-se que a mesma foi classificada como G1, apesar da análise por RT-PCR
indicar o genotipo G5. Quando submetida ao agrupamento com outras cepas de
RVs G5, tanto de origem humana como suína, a amostra Hum-1 não forma um
47
cluster com estas cepas (dados não mostrados), comprovando sua diferença
genética.
A ocorrência de G1, G2, G3 e G4 entre amostras de origem humana
representa mais de 88% das cepas analisadas em todo mundo (SANTOS E
HOSHINO, 2005). A despeito da análise de somente uma amostra de origem
humana neste estudo, pode-se inferir que o tipo G1 circulante é o mesmo utilizado
como alvo nos programas de imunização contra RVs adotados no mundo todo. No
Brasil, desde março de 2006 foi adotado o programa de imunização nacional com a
Vacina Oral de Rotavírus Humano (VORH), licenciada no mercado internacional com
o nome de Rotarix
e fabricada pelo Laboratório GlaxoSmithKline. Esta é uma
vacina elaborada com vírus isolados de humanos e atenuados e é monovalente, ou
seja, a cepa RIX4414 utilizada possui apenas um sorotipo em sua composição que é
o G1[P8] (Brasil, 2006).
A estreita relação genética entre amostras suínas e humanas,
principalmente no Brasil, é muitas vezes relacionada a condições sanitárias
inadequadas e ao contato muito próximo entre humanos e animais domésticos,
incluindo suínos (MASCARENHAS et al, 2007). No presente estudo não foi possível
tal correlação, haja vista que nas propriedades onde as amostras foram coletadas
não se procedeu a coleta de fezes humanas.
48
5. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
A análise das seqüências de 79G e Hum-1 permitiu a classificação destas
amostras como G9 e G1. Estes resultados demonstram a importância em se
proceder ao seqüenciamento das amostras de RVs circulantes,
principalmente nos casos em que resultados obtidos por RT-PCR possam ser
considerados conflitantes.
A diversidade genética característica dos RVs foi confirmada neste estudo
através da similaridade de seqüências observada entre a amostra 79G e a
cepa japonesa JP32-4. Os mecanismos genéticos que favorecem esta
diversidade devem ser melhor avaliados com o intuito de contribuir para a
compreensão da ecologia dos RVs.
O desenho de novos primers se faz necessário para caracterização das
amostras 79 (tipo P), 179 (tipos G e P), 204 (P), 211 (G e P), Hum-1 (P) e
Cam-3 (G e P), com posterior seqüenciamento para monitoramento e
entendimento das relações genéticas que possam ter ocorrido entre estas.
A pesquisa de RVs entre animais deve ser incentivada, uma vez que estes
podem servir como reservatórios e transmissores desta virose para os
humanos, ocasionando prejuízos consideráveis no âmbito da saúde pública.
49
6. REFERÊNCIAS
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60
APÊNDICE
ARTIGOS PARA PUBLICAÇÃO
61
ARTIGO N° 1
62
EPIDEMIOLOGIA DOS GENOTIPOS P (VP4) E G (VP7) DE ROTAVÍRUS SUÍNOS
DURANTE 2000-2003.
G.M. Xavier, C.E.P.F. Travassos, BELICO, P. V. Gouvea
Setor de Virologia Veterinária do Laboratório de Sanidade Animal da
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Rio de Janeiro, Brasil
RESUMO: O crescimento da produção interna e da exportação de carne suína
depende da sanidade das granjas brasileiras. Leitões com rotavírus podem
sobreviver à infecção, mas o número de refugos e os gastos com medicamentos
geram prejuízos aos produtores. No período de 2000 a 2003, de 226 amostras de
fezes de leitões testadas através de PAGE, quatro foram positivas para rotavírus e
caracterizadas através de RT-PCR como G3P[7]; G1-G5P[7]; G5P[7] e G5P[5]. Uma
das amostras caracterizou-se por mistura de duas espécies diferentes de rotavírus.
Palavras-chave: diarréia, leitões, PAGE, RT-PCR.
EPIDEMIOLOGY OF P (VP4) AND G (VP7) GENOTYPES IN PORCINE
ROTAVIRUSES ISOLATED DURING 2000-2003.
ABSTRACT: The growth of internal produce and of pork meat exportation depend on
the health conditions of Brazilian farm animals. Piglets contaminated by rotavirus
could survive but the number of refusals and the costs on veterinary drugs is
considered. In the period of 2000 to 2003, of two hundred and twenty-six fecal
specimens from piglets were positive to group A rotavirus and characterized by RT-
PCR in G3P[7]; G1-G5P[7], G5P[7] and G5P[1]. One of fecal samples presented a
case of mixed infection involving two different strains of rotavirus.
Key words: diarrhea, piglets, RT-PCR, PAGE.
INTRODUÇÃO
O Brasil ocupa a quarta colocação em
exportação de carne suína, sendo
superado apenas pelos Estados
Unidos, Canadá e União Européia
(
DESOUZART, 2002
). O manejo
apropriado em granjas suinícolas pode
aumentar o desempenho reprodutivo,
reduzir a mortalidade entre os animais
(
SOBESTIANSKY et al, 1998
) e,
conseqüentemente, favorecer o
crescimento da produção interna e do
volume de exportação. Por outro lado,
um manejo inadequado pode
comprometer o desempenho dos
animais, influenciando direta e
indiretamente a qualidade da
produção. Dentre os fatores
decorrentes de um manejo inadequado
cita-se a síndrome diarréica dos leitões
(
GREGORI et al 2000; DEWEY et al,
2003; BRITO et al, 1999
), cuja etiologia
é complexa, podendo envolver
bactérias, protozoários e vírus
(
MURPHY et al, 1995; KAPIKIAN et al,
2001
).
Os rotavírus têm sido reconhecidos
como os principais agentes
causadores de gastroenterite aguda
em humanos e animais desde a sua
primeira descrição por Ruth Bishop,
em 1973 (
TAGLIARI e BRITO, 1998
).
Ainda que leitões infectados por
rotavírus possam sobreviver, o número
de refugos e os gastos com
medicamentos aumentam
consideravelmente, gerando prejuízos
63
significativos aos suinocultores
(SOBESTIANSKY et al 1998;
TAGLIARI e BRITO, 1998)
.
Diante da importância que as diarréias
assumem em relação à produtividade
das granjas suinícolas, o presente
estudo teve por objetivos avaliar a
presença de rotavírus através da
técnica de eletroforese em gel de
poliacrilamida (PAGE) e caracterizar
os genotipos circulantes utilizando a
técnica de reação em cadeia de
polimerase (RT-PCR).
MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção das amostras
Foram coletadas 226 amostras de
fezes entre o período de março de
2001 e janeiro de 2003, a partir de
leitões com idade variando de dois a
60 dias (Tabela 1).
Tabela 1: Locais de colheita das amostras fecais.
Municípios (Estado)
Número de
amostras
Campos (RJ) 16
Itaocara (RJ) 10
Carapebus (RJ) 14
Itaperuna (RJ) 29
Quissamã (RJ) 01
São João da Barra (RJ) 06
Magé (RJ) 06
Rio das Ostras (RJ) 07
Macaé (RJ) 01
São Francisco de
Itabapoana (RJ)
01
Amparo do serra (MG) 39
Muriaé (MG) 50
Limeira (MG) 07
Guarapari (ES) 13
Castelo (ES) 19
Cachoeiro de Itapemirim
(ES)
03
Venda Nova do Imigrante
(ES)
04
Total 226
As amostras de fezes foram coletadas
diretamente da ampola retal dos
animais, por meio de massagem
abdominal ou estímulo com “swabs” e
em condições que inviabilizaram estes
procedimentos foram coletadas das
superfícies das instalações, desde que
recentes.
As fezes foram classificadas de acordo
com sua consistência, em líquidas (53
amostras), pastosas (101 amostras) e
normais (72 amostras).
Depois de acondicionadas e
identificadas em frascos coletores, as
amostras foram devidamente
encaminhadas ao Setor de Virologia
Veterinária do Laboratório de
Sanidade Animal da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro, onde foram armazenadas em
freezer a –20
o
C, até o processamento.
PAGE
A presença de rotavírus nas amostras
foi detectada pela identificação dos
segmentos dsRNA em PAGE. Para
tanto, uma suspensão fecal (20%) de
cada amostra foi preparada em
tampão fosfato salina (PBS) e
clarificada por centrifugação a 8.000
g/5min/4°C.
Uma alíquota de 15 µL foi submetida à
PAGE, com concentração final de
7,5%, por aproximadamente 4 horas, a
100 volts e o gel corado com nitrato de
prata (
HERRING, 1982
).
RT-PCR
Os dsRNA virais foram
extraídos com TRIzol
LS (Invitrogen
Corporation, Carlsbad, Califórnia -
USA), com modificações a partir da
recomendação do fabricante. Foram
adicionados aproximadamente 250 µL
de fezes em um microtubo
(capacidade 1,5 mL) contendo 750 µL
de TRIzol
. Após homogeneização e
incubação à temperatura ambiente
durante 15 minutos, foi adicionado 150
µL de clorofórmio (200 µL para cada 1
mL de TRIzol utilizado inicialmente) e
em seguida a mistura foi cetrifugada a
12.000 g durante 10 minutos a uma
temperatura de 4°C. A fase aquosa
obtida foi transferida para um novo
64
tubo previamente identificado e
adicionada de 375 µL de isopropanol
(5000 µL para cada 1 mL utilizado
inicialmente). Após 10 minutos de
incubação à temperatura ambiente, a
mistura foi submetida à centrifugação
a 12.000 g/10 minutos/4°C. Ao término
desta etapa o sobrenadante foi
descartado e o sedimento lavado uma
vez com 1 mL de etanol 75% (v/v)
gelado, sendo submetido à
homogeneização por vórtex e
centrifugação a 7.500 g/5 minutos/4°C.
Novamente descartou-se o
sobrenadante e procedeu-se a
secagem do sedimento em banho
seco (10 minutos/65°C). Por fim o RNA
foi ressuspenso em 25 µL de água
ultrapura.
Os pares de iniciadores consensuais
Beg9-End9 (
GOUVEA et al, 1990
)
(Tabela 2) e Con3-Con2 (
GENTSCH et
al, 1992
) (Tabela 3) foram utilizados
neste estudo para primeira
amplificação da RT-PCR.
Cada produto da RT-PCR foi
submetido a uma segunda
amplificação (Nested-PCR) com os
iniciadores Beg9 (para o tipo G) e
Con3 (para o tipo P) e um coquetel de
iniciadores genotipo-específicos
(Tabelas 2 e 3).
Os produtos da PCR foram
submetidos à eletroforese em gel de
agarose 0,8% e foto-documentados
pelo sistema EagleEye.
Tabela 2: Iniciadores utilizados para amplificação
do fragmento de 1062 pb do gene da VP7 (G) e
para tipagem por Nested-PCR (GOUVEA et al,
1990).
Nome
Seqüência (5’-3’)
Posição
(nt)
Beg9 GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG
1-28
End9 GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG 1062-1036
aAT8 GTCACACCATTTGTAAATTCG 178-198
aBT1 CAAGTACTCAAATCAATGATGG 314-335
aCT2 CAATGATATTAACACATTTTCTGTG 411-435
aDT4 CGTTTCTGGTGAGGAGTTG 480-498
aET3 CGTTTGAAGAAGTTGCAACAG 689-709
aFT9 CTAGATGTAACTACAACTAC 757-776
Tabela 3: Iniciadores utilizados para amplificação
do fragmento de 876 pb do gene da VP4 (P) e para
tipagem por Nested-PCR (GENTSCH et al, 1992).
Nome
Seqüência (5’-3’)
Posição
(nt)
Con 3 TGGCTTCGCCATTTTATAGACA 11-32
Con 2 ATTTCGGACCATTTATAACC 868-887
1T-1 TCTACTTGGATAACGTGC 339-356
2T-1 CTATTGTTAGAGGTTAGAGTC 474-494
3T-1 TGTTGATAGTTGGATTCAA 259-278
4T-1 TGAGACATGCAATTGGAC 385-402
5T-1 ATCATAGTTAGTAGTCGG 575-594
RESULTADOS
As granjas visitadas caracterizaram-se
por apresentar dois padrões
tecnológicos distintos: produção
rústica (38 granjas) e tecnificada (11
granjas), estas últimas com restrição à
entrada de pessoas.
Em 44,8% (22/49) das propriedades
foram observados casos de diarréias
entre leitões no dia da visita.
Das 226 amostras de fezes de leitões
examinadas, quatro (1,77%) foram
positivas para rotavírus. Do total de
amostras testadas por PAGE, 53
(23,45%) foram classificadas como
diarréicas, 101 (44,69%) como
pastosas e 72 (31,86%) foram
classificadas como normais.
Das amostras positivas para rotavírus
(n=4), duas eram diarréicas (204 e
211) e duas eram pastosas (79 e 179)
no momento da coleta. Três amostras
apresentaram os 11 segmentos de
dsRNA, distribuídos de acordo com o
padrão 4-2-3-2, característico do grupo
A, quando analisadas por PAGE e
foram colhidas após períodos de
chuvas (jan/2003). A amostra 179
apresentou uma banda extra entre os
segmentos 3 e 4 após coloração do
gel (Figura 1) e foi a única amostra
positiva colhida em jul/2002.
Os genes para VP4 e VP7 foram
amplificados em todas as amostras
testadas e renderam fragmentos com
tamanhos esperados, 876 pb e 1062
pb, respectivamente (Figura 2). A
caracterização genotipo-específico
65
também foi possível em todas as
amostras testadas (dados não
mostrados) e foram classificadas
conforme Tabela 4.
A B C D A B C D
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
A B C D A B C D
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Figura 1: Perfil eletroforético de RVs identificados
no estudo. À esquerda, diagrama ilustrativo
mostrando a migração 4-2-3-2 e o segmento extra
(seta) entre os segmentos 3 e 4. A, amostra 79, B,
204, C, 179 e D, 211.
1 2 3 4 5 6 7
2000 pb
1000 pb
8 9 10 11 12 13
750 pb
1 2 3 4 5 6 7
2000 pb
1000 pb
8 9 10 11 12 13
750 pb
Figura 2: RT-PCR (1ª amplificação). A figura da
esquerda refere-se à amplificação do gene da VP7
(1062 pb) e a da direita ao gene da VP4 (876 pb).
Marcador de 1000 pares de bases (linha 1);
amostra 79 (linhas 2, 3, 8 e 9), 204 (4, 5, 10 e 11) e
211 (6, 7, 12 e 13).
Tabela 4: Associação entre os genotipos P e G
encontrados, consistência das fezes e idade dos
animais.
Amostra
Consistência
das fezes
Idade
dos animais
PCR
79 pastosas 9 dias P[7]G3
179 pastosas 21 dias P[7]G1-G5
204 líquidas 9 dias P[7]G5
211 líquidas 21 dias P[1]G5
DISCUSSÃO
Das 38 granjas de produção rústica,
17 não possuíam qualquer tipo de
manejo nutricional ou sanitário. A
ocorrência de diarréia nestas granjas
foi considerada fator de risco que
interfere no desempenho dos leitões
(SILVA et al, 1999; BRITO et al, 1999),
e o índice elevado (44,8%),
responsável por baixas performances
no ganho de peso, e na taxa de
sobrevivência, aumentando o número
de refugos e gastos com
medicamentos (
SILVA et al, 1999;
BRITO et al, 1999
).
A presença de rotavírus durante todo o
ano já está bem estabelecida em
países de clima tropical, com registro
de picos ocorrendo durante os meses
mais frios e secos do ano (SANDERS,
1985; KAPIKIAN et al, 2001;
LINHARES, 2000; SILVA et al, 2001).
Entretanto, neste estudo, apesar do
pequeno número de amostras
positivas, a maior freqüência de
rotavírus foi registrada no mês de
janeiro. Coiro et al (1985) encontraram
resultado semelhante, com maior
freqüência de rotavírus ocorrendo
durante o mês de janeiro (78,1%) e a
menor durante o mês de setembro
(16,7%)
As possíveis razões para o baixo
índice de prevalência dos rotavírus
entre as amostras analisadas incluem
a excreção de vírus em níveis não
detectáveis ou em períodos que
antecederam ou sucederam à coleta.
Entretanto, a baixa positividade
também foi registrada entre bezerros
(0,5%) (MARTELLA et al, 2001),
ovelhas (2,1%) (GHOSH et al,
2007
) e
cães (3%) (
GABBAY et al, 2003
).
A faixa etária dos animais, a
consistência das fezes e sua
correlação com a positividade nos
ensaios (Tabela 4) corroboram com os
estudos que demonstram que a
rotavirose é mais prevalente entre
animais jovens e com diarréia
(KAPIkIAN et Al, 2001
SILVA et al,
2001; MUÑOZ et al 1996
). Entretanto,
como animais muito jovens geralmente
eliminam fezes de consistência
pastosa, que podem ser consideradas
normais, é importante que a coleta não
seja restrita a fezes líquidas (SILVA et
al, 2001).
Os rotavírus têm sido identificados em
suínos com freqüência que varia de
8% (RÁCZ et al, 2000) a 35% (SILVA
66
et al, 2001) e os principais tipos G e P
encontrados referem-se a G3, G4, G5,
G11 e P[6] e P[7] (ESTES, 2001).
A amostra caracterizada como G1-G5
foi a mesma que apresentou uma
banda extra de dsRNA revelada
através do PAGE (Figura 1). A mistura
G1-G5 foi também observada em
estudo desenvolvido no Brasil, onde
de 10 amostras analisadas, uma
demonstrou o caso de infecção mista
em suínos, entretanto, no referido
estudo não foi possível relacionar o
surgimento de banda extra a um
padrão eletroforético diferente de 4-2-
3-2 observado no grupo A de rotavírus
(GABBAY et al, 2003). Neste estudo,
contudo, foi possível correlacionar a
mistura G1-G5 detectada por RT-PCR
a um padrão de migração 5-2-3-2.
A presença de um ou mais segmentos
adicionais nos eletroferogramas pode
indicar que um mesmo animal tenha
sido infectado com dois ou mais tipos
de rotavírus e que a progênie
resultante apresente um perfil diferente
das cepas que lhe deram origem. Isto
demonstra a diversidade genética que
os rotavírus apresentam e indica como
os vírus evoluem através da
recombinação entre seus segmentos
genéticos.
As combinações P[7]G3, P[7]G5,
P[7]G1-G5 e P[1]G5 encontradas
correspondem àquelas observadas em
outros estudos (RÁCZ et al, 2000;
SILVA et al, 2001; GHOSH et al, 2007;
GABBAY et al, 2003).
CONCLUSÕES
A interpretação deste estudo foi
limitada pelo baixo número de
amostras analisadas e pelo fato destas
amostras terem sido coletadas em
regiões restritas dos estados do Rio de
Janeiro, Minas Gerais e Espírito Santo
(Tabela 1). Entretanto, estes achados
demonstram a circulação de rotavírus
em granjas de distintos padrões
tecnológicos e reforçam a importância
do monitoramento destes vírus entre
as unidades de produção animal.
Este estudo pretende contribuir para o
conhecimento dos genotipos
circulantes nas regiões estudadas e
fornecer subsídios para novos estudos
que objetivem a vigilância e
caracterização molecular dos RVs.
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68
ARTIGO N° 2
69
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS GENES CODIFICADORES DE VP4 E
VP7 DE ROTAVÍRUS DE SUÍNOS E HUMANOS
G.M. Xavier
1
, V.C.L. Marques
2
; G.A.S. Filho
2
, Souza, A.N.
2
, C.E.P.F.
Travassos
1
1
Laboratório de Sanidade Animal, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro, Rio de Janeiro, Brasil
2
Núcleo de Análise Genômica, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro, Rio de Janeiro, Brasil
Resumo: Os rotavírus são os principais vírus associados à gastroenterite em
humanos e animais, e geram prejuízos econômicos e sociais tanto em países
desenvolvidos como em países em desenvolvimento. Este estudo objetivou analisar
as seqüências de nucleotídeos dos genes codificadores de VP4 e VP7 de amostras
fecais de suínos e de humanos. Os resultados indicam que os rotavírus isolados
pertencem ao genotipo G9 (amostra 79), G5 (amostra 204) e G1 (amostra Hum-1) e
compartilham alta similaridade entre amostras de suínos e de humanos,
comprovando a diversidade genética característica dos RVs.
Palavras-chave: rotavírus, VP7, tipo G
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF ENCODING GENES OF VP4 AND VP7
FROM PORCINE AND HUMAN ROTAVIRUS
Abstract: Rotaviruses are the most viruses associated to gastroenteritis in humans
and animals, causing economic and social burden both in developed countries and in
developing countries. The present study aimed to characterize the VP4 and VP7
encoding genes of porcine and human samples. The results indicate that isolates
rotavirus belongs to genotype G9 (sample 79), G5 (sample 204) and G1 (sample
Hum-1) and share high similarity between samples of pigs and humans, proving the
genetic diversity characteristic of the RVs.
Key words: rotavirus, VP7, G-type
INTRODUÇÃO
A gastroenterite causada por
rotavírus (RVs) é uma das principais
causas de morbi-mortalidade
observada em humanos de todo o
mundo. Entre as espécies animais
também se observa índices elevados
de diarréia, principalmente entre
indivíduos neonatos. A morbidade
observada acarreta perda de peso dos
animais, custo elevado com
tratamentos, além de um risco real
para saúde pública, uma vez que a
transmissão interespécies é
considerada possível (MENEGHETTI
et al, 2001;
KHAMRIN et al, 2006;
MARTELLA et al, 2006; FUKAI et al,
2007).
A partir da reunião regional
sobre a implantação da vigilância
epidemiológica de rotavírus, que
ocorreu no Peru em 2003, a
Organização Pan-Americana de Saúde
(PAHO) elaborou uma série de
recomendações, entre elas algumas
de caráter geral envolvendo os
estudos epidemiológicos dos RVs e
um banco de dados sobre sua
vigilância. Uma vez que a diversidade
genômica dos RVs é
reconhecidamente um importante fator
na ocorrência das diarréias, torna-se
imprescindível uma vigilância
70
epidemiológica das cepas circulantes,
antes e após a implementação de
programas de imunização, semelhante
à empregada para o monitoramento do
vírus influenza e conforme
preconizado pela Organização Mundial
de Saúde (WHO, 2005).
Com o objetivo de contribuir para o
programa de vigilância epidemiológica
molecular, o presente trabalho
descreve a caracterização molecular
de RVs obtidos a partir de amostras
diarréicas de suínos e de crianças
menores de cinco anos de idade.
MATERIAL E MÉTODOS
Extração de dsRNA e RT-PCR: Os
dsRNA virais de quatros amostras de
fezes provenientes de suínos e duas
de humanos foram extraídos com
TRIzol
LS (Invitrogen Corporation,
Carlsbad, Califórnia - USA), de acordo
com a recomendação do fabricante.
Os dsRNAs extraídos foram utilizados
como molde para obtenção de cDNA,
e estes utilizados para a transcrição
reversa (RT) (GOUVEA et al, 1990;
GENTSCH et al, 1992) A síntese de
cDNA foi conduzida em termociclador
a uma temperatura de 42°C durante 50
minutos. O cDNA obtido pela RT foi
utilizado para amplificação dos
segmentos de 876 pb (VP4) e 1062 pb
(VP7) , segundo descrito por Gentsch
et al (1992) e Gouvea et al (1990),
respectivamente., A amplificação foi
conduzida em termociclador com a
programação de uma desnaturação
inicial a 94°C durante 2 minutos;
seguida por 40 ciclos de desnaturação
(90°C/30s), anelamento (42°C/60s) e
extensão (70°C/90s); e por uma
extensão final a 70°C durante 7
minutos. Os produtos da amplificação
foram visualizados em gel agarose
0,8% com brometo de etila e foto-
registrados pelo sistema
computacional Eagle-Eye.
Seqüenciamento:Os amplicons
provenientes da RT-PCR foram
precipitados com propilenoglicol
(PEG), conforme preconizado por
Lewis e Metcalf (1988), com
modificações. Resumidamente, uma
alíquota de 18 µL de cada amplicon
obtido pela RT-PCR foi adicionada a
um microtubo contendo 8µL da NaCl
5M, 14 µL de água ultrapura
autoclavada e 40 µL de PEG 8000
(Sigma). A mistura foi incubada a 4°C
por um período mínimo de 4 horas e
em seguida centrifugada a 10.000
g/4°C/15 min, sendo o sobrenadante
descartado ao final do procedimento.
Um volume de 500 µL de etanol 70%
gelado foi adicionado ao sedimento e o
conjunto centrifugado a 10.000 g/4°C/5
min. O sobrenadante foi novamente
descartado e o sedimento submetido à
secagem a 65°C em banho seco. Por
fim o DNA peletizado foi ressuspenso
em 10 µL de água ultrapura
autoclavada.
A seqüência de nucleotídeos dos
genes que codificam VP4 e VP7 de
RVs foi determinada utilizando-se o kit
“Dyenamic ET Terminator Cycle
Sequencing” (Applied Biosystems),
conforme instruções dos fabricantes.
A reação de seqüenciamento foi
conduzida em termociclador com a
programação de uma desnaturação
inicial a 96°C/60 s e 25 ciclos, cada um
composto por desnaturação a 96°C/20
s, anelamento a 42°C/5 s e extensão a
60°C/4 min.
Após o término da reação de
seqüenciamento, as amostras foram
purificadas de acordo com protocolo
fornecido pelo fabricante do kit de
seqüenciamento (Applied Biosystems)
e aplicadas no seqüenciador ABI-
Prism 377 DNA (Perkin Elmer, Applied
Biosystems Instruments).
Análise das seqüências: Foram
utilizados os recursos computacionais
Bioedit Sequence Alignment Editor
versão 7.0.9.0 (HALL, 2001), Treecon
71
versão 1.3b (PEER, 2001), além das
ferramentas disponibilizadas pelo
Centro Nacional de Informação
Biotecnológica (National Center of
Biotechnology Information’s - NCBI’s)
e Laboratório de Biologia Molecular
Europeu (European Molecular Biology
Laboratory’s - EMBL’s), via rede
mundial de computadores.
Para análise comparativa foram
utilizadas seqüências de RVs humano
e suíno classificados com G3 e G9
(Tabela 1) e seqüência de RVs
abrangendo os 15 tipos G descritos
até o momento (Tabela 2).
Tabela 1: Cepas de RVs classificados como G3 e como G9 de origem suína e humana
utilizadas neste estudo.
Acesso no
GenBank
Cepa
isolada
Origem Tipo
G
Acesso no
GenBank
Cepa isolada
Origem Tipo
G
DQ873678 Y111 Humana
EU348715 P50 Suína 3
DQ873679 L226 Humana
AB176680 JP16-3 Suína
EF088832 5290 Humana
AB176679 JP13-3 Suína
EF495127 RUS79 Humana
AB176683 JP35-7 Suína
AY707788 CMP039 Suína AB176682 JP32-4 Suína
L35079 A138 Suína AB176681 JP29-6 Suína
L35060 A411 Suína AB176678 JP3-6 Suína
L35059 A34 Suína AB180969 WI-61 Bovina
L35058 C134 Suína L14072 116E Humana
L35057 - Suína AB180972 O-1 Suína
L35056 CC117 Suína AB176677 HOKKAIDO-
14
Suína
9
L35054 A46 Suína M63266 NCDV Bovina 6
NC_007468 B4106 Humana
3
Tabela 2: Cepas de RVs utilizadas neste estudo. Hu=humana, Su=suína, Eq=eqüina,
Bo=bovina, Lh=Lhama (camelídeo), Av=ave (peru e galinha). OSU corresponde ao protótipo
suíno do grupo G5.
Acesso no
GenBank
Origem/tipo G
Acesso no
GenBank
Origem/tipo G
Acesso no
GenBank
Origem/tipo G
Acesso no
GenBank
Origem/tipo
G
D16328 Hu1/G1 AF039524 Lh/G8 EF059917 Hu1/G12 EU284736 Hu1/G12
EF199723 Hu/G2 AB176683 Su1/G9 L24164 Su/G1 DQ204743 Su/G12
NC_007468 Hu/G3 AB176682 Su2/G9 DQ534015 Su/G2 AY750923 Eq1/G14
EU139427 Hu/G4 AB176681 Su3/G9 DQ786577 Su/G3 DQ981479 Su/G16
AB257126 Hu/G5 AB176680 Su4/G9 DQ683521 Su/G4 D25229 Eq2/G14
AF421183 Hu/G6 AB176679 Su5/G9 DQ515961 Su/G5 L49042 Eq3/G14
AB272753 Hu1/G8 AB176678 Su6/G9 X04613 OSU/G5 AB046468 Eq4/G14
AY855064 Hu2/G8 AB176677 Su7/G9 AF242393 Eq/G5 U05348 Eq5/G14
AB180969 Hu1/G9 AB176672 Su8/G9 M63266 Bo/G6 U05349 Eq6/G14
L14072 Hu2/G9 AY707787 Su9/G9 S58166 Av2/G7 AB046467 Eq7/G14
AY843333 Hu/G10 U35850 Su/G10 X56784 Av3/G7 M61876 Eq8/G14
AB264007 Hu/G11 L24163 Su/G11 DQ13549 Eq/G13 AF237666 Bo/G15
72
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dentre as amostras analisadas,
somente aquelas identificadas como
79G, 204G e Hum-1 foram
eficientemente seqüenciadas para o
produto de amplificação do gene que
codifica VP7.
A amostra 79G foi agrupada junto
com as demais cepas de RVs de
origem suína e classificada como G9
(Figura 1), ainda que tenha sido
caracterizada por RT-PCR como G3.
Este resultado sugere que esta
amostra apresenta mutações que
possam interferir na caracterização
por RT-PCR. Entretanto, uma melhor
avaliação é necessária para confirmar
esta hipótese.
O nível de homologia entre a amostra
79G e as demais foi maior entre
cepas de origem suína e
provenientes do Japão. Santos et al
(2001) encontraram resultado
semelhante ao analisarem 157
amostras positivas de RVs
provenientes de crianças menores de
cinco anos de idade, internadas ou
atendidas em ambulatórios do estado
do Rio de Janeiro, durante 1997 e
1999. No referido estudo, entretanto,
os autores observaram elevada
similaridade genética entre cepas de
procedência brasileira e classificadas
como G3P[9] e o vírus AU-1 de
procedência japonesa, que por sua
vez é geneticamente similar aos RVs
felinos, o que sugere uma infecção
zoonótica envolvendo cepas humana
e felina. Infelizmente, no presente
estudo não foi possível correlacionar
a ocorrência do genotipo G9 com a
presença de felinos na propriedade
onde a amostra 79G foi coletada.
Entretanto, levando-se em
consideração os mecanismos
evolutivos que favorecem a
diversidade de RVs, é possível que
tal similaridade observada seja
resultado de recombinação genética
interespécies com ou sem a
participação de felinos como
hospedeiros intermediários.
A similaridade entre cepas de
procedência brasileira e asiática
também foi observada em estudo
conduzido por Wang et al (2007), que
avaliaram os genotipos de maior
ocorrência em adultos e crianças com
diarréia, entre os anos de 2001 e
2006. No referido estudo as cepas G9
agruparam-se com outros tipos G9
dos Estados Unidos, Brasil, Índia,
Bangladesh, Tailândia, Austrália,
Itália e alguns países da África,
compartilhando níveis de homologia
entre 97-99%.
As amostras 204G e Hum-1, ambas
classificadas por RT-PCR como G5
foram comparadas às cepas de RVs
de diferentes tipos G (Figura 2).
73
Figura 1: Dendograma para a amostra 79,
obtida pelo método do vizinho mais próximo
(neighbour-joining), de acordo com a
seqüência de nucleotídeos de RVs G3 e G9,
de origem suína e humana. A cepa NCDV (G6)
foi utilizada como raiz para grupo externo. Os
valores de bootstrap (%) são mostrados. As
cepas estão referenciadas na Tabela 1.
De acordo com a Figura 2, a amostra
204G foi agrupada junto com outras
cepas de RVs G5, mostrando elevada
homologia (94%) com a cepa eqüina
(H-1) (dados não mostrados). Esta
cepa eqüina representa um exemplo
de possível transmissão interespécies
de suínos para eqüinos, conforme
observado em estudos conduzidos
por Ciarlet et al (2001), onde foram
analisadas as seqüências dos genes
codificadores das proteínas
estruturais VP4, VP6, VP7 e não-
estruturais NSP1 e NSP4,
constatando-se elevada similaridade
com o protótipo suíno OSU.
O genotipo G5 já está bem
estabelecido como prevalente entre
amostras de RVs de origem suína e
de origem humana, particularmente
no Brasil. Estudos conduzidos por
Gouvea et al (1994) demonstraram
pela primeira vez a ocorrência deste
genotipo nos estados do Rio de
Janeiro, São Paulo, Pernambuco e
Goiás, entre crianças com diarréia e
com uma prevalência de 4,6%
(n=329). Desde então, o genotipo G5
vem sendo considerado de
importância epidemiológica, tanto no
Brasil como em outros países da
América do Sul (SANTOS e
HOSHINO, 2005).
Em suínos, G5, G3, G4 e G11 têm
sido considerados os tipos mais
prevalentes em todo o mundo
(ROSEN et al, 1994), ainda que G9
tenha emergido no início dos anos 90
(TEODOROFF et al, 2005).
Um dado interessante deve-se ao
fato da amostra 204G apresentar
maior nível de identidade com a cepa
eqüina H-1 do que com a cepa suína
OSU (93%). Entretanto, uma análise
mais detalhada, incluindo o
seqüenciamento de todos os 11
segmentos genômicos da amostra
204G deve ser realizada para explicar
tal similaridade, uma vez que o
agrupamento dos três isolados em
um mesmo ramo do dendograma era
esperado.
Com relação à amostra de origem
humana analisada neste estudo,
Hum-1, observa-se que a mesma foi
classificada como G1, apesar da
análise por RT-PCR indicar o
genotipo G5. Quando submetida ao
agrupamento com outras cepas de
RVs G5, tanto de origem humana
como suína, a amostra Hum-1 não
forma um cluster com estas cepas
(dados não mostrados), comprovando
sua diferença genética.
A ocorrência de G1, G2, G3 e G4
entre amostras de origem humana
representa mais de 88% das cepas
analisadas em todo mundo (SANTOS
E HOSHINO, 2005). A despeito da
análise de somente uma amostra de
origem humana neste estudo, pode-
se inferir que o tipo G1 circulante é o
mesmo utilizado como alvo nos
programas de imunização contra RVs
adotados no mundo todo. No Brasil,
desde março de 2006 foi adotado o
programa de imunização nacional
com a Vacina Oral de Rotavírus
Humano (VORH), licenciada no
mercado internacional com o nome
de Rotarix
e fabricada pelo
Laboratório GlaxoSmithKline. Esta é
uma vacina elaborada com vírus
isolados de humanos e atenuados e é
74
monovalente, ou seja, a cepa
RIX4414 utilizada possui apenas um
sorotipo em sua composição que é o
G1[P8] (Brasil, 2006).
Figura 2: Dendograma para as amostras
204G e Hum-1, obtida pelo método do
vizinho mais próximo (neighbour-joining), de
acordo com a seqüência de nucleotídeos de
RVs G5 de origem suína e humana. O
representante Eq/G13 foi utilizado como raiz
para grupo externo. Os valores de bootstrap
(%) são mostrados. As cepas estão
referenciadas na Tabela 2.
A estreita relação genética entre
amostras suínas e humanas,
principalmente no Brasil, é muitas
vezes relacionada a condições
sanitárias inadequadas e ao contato
muito próximo entre humanos e
animais domésticos, incluindo suínos
(MASCARENHAS et al, 2007). No
presente estudo não foi possível tal
correlação, haja vista que nas
propriedades onde as amostras foram
coletadas não se procedeu a coleta
de fezes humanas.
CONCLUSÕES
A análise das seqüências de 79G e
Hum-1, anteriormente classificadas
por RT-PCR como G3 e G5, permitiu
uma melhor caracterização destas
amostras, como G9 e G1. Estes
resultados demonstram a importância
em se proceder ao seqüenciamento
das amostras de RVs circulantes,
principalmente nos casos em que
resultados obtidos por RT-PCR
possam ser considerados
conflitantes.
A diversidade genética característica
dos RVs foi confirmada neste estudo
através da similaridade de
seqüências observada entre a
amostra 79G e a cepa japonesa
JP32-4. Os mecanismos genéticos
que favorecem esta diversidade
devem ser melhor avaliados com o
intuito de contribuir para a
compreensão da ecologia dos RVs.
Como um dos desafios para eficácia
de programas de imunização contra
RVs é o surgimento de cepas com
genotipos incomuns, o
monitoramento constante dos
genotipos circulantes se faz
necessário, tanto entre amostras de
origem humana (como preconizado
pela PAHO) como animal, haja vista a
possibilidade destes agirem como
reservatórios e transmissores da
rotavirose.
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