( PDF ) Caracterização molecular do vírus da Hepatite C em indivíduos co-infectados com HIV-1

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

INSTITUTO DE BIOLOGIA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO

VÍRUS DA HEPATITE C EM INDIVÍDUOS

CO-INFECTADOS COM HIV-1

Claudiner Pereira de Oliveira

BRASÍLIA

2007

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

INSTITUTO DE BIOLOGIA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS DA

HEPATITE C EM INDIVÍDUOS CO-INFECTADOS COM

HIV-1

Claudiner Pereira de Oliveira

Orientador: Prof. Dr. Marcelo de Macedo Brígido

Co-orientadora: Profª. Drª. Cláudia Renata Fernandes Martins

Colaboradores:

Regina Maria Santos de Amorim

Luiz Sasso Filho

José Eduardo Trevizoli

BRASÍLIA

2007

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iii

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

INSTITUTO DE BIOLOGIA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS DA

HEPATITE C EM INDIVÍDUOS CO-INFECTADOS COM

HIV-1

Claudiner Pereira de Oliveira

Orientador: Prof. Dr. Marcelo de Macedo Brígido

Co-orientadora: Profª. Drª. Cláudia Renata Fernandes Martins

Banca examinadora:

Profª. Dra. Andréa Queiroz Maranhão (Suplente) – Universidade de Brasília

Prof. Dr. Bergmann Morais Ribeiro – Universidade de Brasília

Prof. Dr. José Paulo Gagliardi Leite – Fundação Oswaldo Cruz

Prof. Dr. Marcelo de Macedo Brígido – Universidade de Brasília

BRASÍLIA

2007

"Uma longa jornada começa com um único passo."

Lao Tzu

Aos meus pais, Francisco e Zenilde, que

iluminaram-me e incentivaram-me a trilhar

o caminho mais importante que eu poderia

seguir: o estudo.

Aos meus irmãos, Claubert e Claudiana,

por estimularem-me com o mais nobre

combustível da criatividade: a curiosidade.

Às duas mulheres mais fascinantes que

já conheci: Patrícia e Cláudia Renata. Por

inspirarem-me a maior virtude das grandes

pensadoras: a sabedoria.

Aos homens e mulheres vítimas da co-

infecção que, anonimamente, tornaram

possível este trabalho.

Dedico.

AGRADECIMENTOS

Embora uma dissertação seja, pela sua finalidade acadêmica, um trabalho

individual, há contribuições de natureza diversa que merecem ser enfatizadas aqui.

Por essa razão, desejo expressar os meus sinceros agradecimentos:

 aos meus ilustres orientadores Profª Drª Cláudia Renata Fernandes Martins e

Prof. Dr. Marcelo de Macedo Brígido que contribuíram singularmente para o

sucesso da minha vida profissional e pessoal, apresentando-me um projeto de

sonho, ajudando-me na sua compreensão e, principalmente, desafiando-me a

construí-lo;

 à todas as amigas e amigos do Grupo de Estudos em Virologia, veteranas e

veteranos do lendário HHV: Eduardo e Gegê, Tainá e Júnior, Daniela e Ugo,

Daniella e Diogo, Natália e Rafael, Dra. Regina, Nazle, Profª. Drª. Marisa

Xanthomonas e Mateus;

 ao Prof. Dr. José Paulo Gagliardi pelo inestimável apoio e por acreditar em

nosso trabalho;

 à „chefa‟ Dra. Regina M. Amorim pela grande amizade, pelo apoio

fundamental, pela existência do grupo do HCV, e pela sábias contribuições

para o realização deste trabalho;

 à Patrícia pelo amor, apoio e inspiração;

 à todos os membros da banca examinadora deste trabalho, em especial, Prof.

Dr. Bergmann M. Ribeiro e Profª. Dra. Andréa Q. Maranhão pelas relevantes

contribuições para este trabalho;

 aos colaboradores do LACEN-DF: Luiz Sasso Filho, Helena T. K. Fink, Cecília

M.S. Cunha, Eliane M. dos Santos, Larissa R. T. das Neves e Carlita C. Felix.

Obrigado a todos vocês pela ajuda na busca das amostras, pela paciência e,

principalmente, pela cordialidade;

 aos colaboradores Dr. José Eduardo Trevizoli do Hospital de Base (HBDF) e

Dra. Lara Velasco do Laboratório Sabin, que viabilizaram a realização desse

trabalho;

vii

 aos amigos ex-companheiros de bancada David Neves, Márcio Rojas, Verônica

Veras e Margareti Medeiros que em momentos distintos contribuíram cada um

do seu jeito para a minha vida acadêmica;

 aos Professores do Departamento de Biologia Celular, em especial, Profª Drª.

Sônia Báo e Prof. Dr.Renato Rezende e todos os colegas que trabalharam ou

que ainda trabalham no Laboratório de Microscopia Eletrônica;

 ao Prof. Dr. Ricardo Titze do MMB, pela acolhida fundamental em seu

laboratório para a realização de alguns experimentos do trabalho;

 a todos os Professores e Funcionários do Laboratório de Fitopatologia pela boa

receptividade e convivência no dia-a-dia;

 à querida funcionária Ana da Secretaria do Departamento de Biologia Celular

pela competência e dedicação ao trabalho. Sempre solucionando os problemas

de ordem burocrática que permitiram o correto andamento das etapas que

envolvem este trabalho;

 aos meus familiares, em especial, meus pais Francisco e Zenilde, meus irmãos

Claubert e Claudiana e minha cunhada Keila, pelo apoio fundamental e pela

grande harmonia;

 à minha querida sogra Fernanda e ao meu cunhado nerd Rafael que tanto me

ajudaram nos momentos mais difíceis;

 aos grandes amigos: Prof. Aloízio (pois “a vida é a arte dos encontros...”), Prof.

Clementino Neto (porque “sempre devemos usar o bom senso...”), Marcelo

Black Padilha e Marcelo Passa-a-Bola Salviano, e aos grandes seres humanos

que conheci na profissão (monitores, professores, empregados e alunos) e na

faculdade (colegas de turma, de disciplina e de saídas de campo) durante todos

esses anos;

 ao Programa de Pós-graduação da UnB;

 ao CNPq e a FINATEC pelo apoio financeiro;

 e por último, mas não menos importante, à todos àqueles que acreditam que a

ousadia e o erro são caminhos para as grandes realizações.

viii

ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 15

1.1 Histórico ..................................................................................................... 15

1.2 O vírus da Hepatite C ................................................................................ 20

1.3 O genoma do vírus da Hepatite C e as proteínas virais ........................... 21

1.4 A diversidade genética do vírus da Hepatite C e os subtipos virais ....... 23

1.5 Epidemiologia do vírus da Hepatite C ...................................................... 25

1.6 A replicação do vírus da Hepatite C ..........................................................28

1.7 Modelos de estudo da replicação do vírus da Hepatite C ....................... 29

1.8 A transmissão do vírus da Hepatite C ...................................................... 32

1.9 O diagnóstico laboratorial do vírus da Hepatite C .................................. 34

1.10 A genotipagem do vírus da Hepatite C ................................................. 35

1.11 A hepatite C ................................................................................................ 36

1.12 O vírus da Hepatite C e a infecção crônica ........................................... 38

1.13 Tratamento ............................................................................................ 40

1.14 A co-infecção HIV-1/HCV ..................................................................... 41

2. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS ................................................................ 45

3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 47

3.1 População Estudada ................................................................................... 47

3.2 Coleta das amostras ................................................................................... 47

3.3 Extração de RNA e Transcrição Reversa .................................................. 47

3.4 Amplificação pela nested-PCR ..................................................................48

3.5 Clonagem .................................................................................................... 50

3.6 Caracterização dos genótipos .................................................................... 51

3.6.1 Seqüenciamento automático ............................................................. 51

3.6.2 Análise das seqüências ....................................................................... 51

3.6.3 Análise filogenética ............................................................................ 51

4. RESULTADOS ................................................................................................ 53

4.1 Caracterização da população de co-infectados ........................................ 53

4.2 Transcrição reversa e amplificação pela nested-PCR .............................. 53

4.3 Genotipagem .............................................................................................. 55

4.3.1 Definição dos Genótipos do HCV com base na análise das regiões

genômicas 5‟UTR e NS5 ............................................................................................ 55

4.3.2 Análise Filogenética ........................................................................... 58

5. DISCUSSÃO ................................................................................................... 63

5.1 A prevalência do HCV em HIV-1 soropositivos ....................................... 63

5.2 Os genótipos do HCV ................................................................................. 65

5.3 A Diversidade Genética do HCV e a Co-infecção com o HIV-1 .............. 67

6. CONCLUSÕES ............................................................................................... 71

7. PERSPECTIVAS ............................................................................................. 72

8. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................. 73

RESUMO

As infecções pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) e pelo vírus da

hepatite C (HCV) são consideradas problemas de saúde pública com cerca de 40

milhões de pessoas infectadas com o HIV-1 e cerca de 170 milhões com HCV no

mundo. A co-infecção HIV-1/HCV é comum em indivíduos expostos a vias de

transmissão percutânea e a hepatite C tem emergido como a principal causa de morte

em pacientes HIV-1 soropositivos, devido à alta prevalência do HCV nessa população.

O HCV pertence à família Flaviviridae, gênero Hepacivirus, e é classificado em 6

genótipos e múltiplos subtipos. Diferenças na distribuição genotípica são observadas

em diferentes áreas do mundo e em um mesmo país. Alguns genótipos do HCV

parecem estar relacionados a uma melhor resposta virológica sustentada após o

tratamento, como os genótipos 2 e 3, que apresentam melhor resposta do que

indivíduos infectados com os genótipos 1 e 4. Existem poucos dados sobre populações

de co-infectados com HIV-1/HCV, a prevalência dos genótipos é relatada para as

infecções separadamente nas diferentes populações. Assim, esse trabalho teve como

objetivo caracterizar a prevalência dos genótipos e subtipos do HCV na população de

co-infectados com HIV-1/HCV no Distrito Federal e entorno. Para isso foram

analisadas 45 amostras de indivíduos co-infectados com HIV-1 e anti-HCV positivos

por meio de amplificação por PCR das regiões genômicas 5‟UTR e NS5B do HCV

seguida de seqüenciamento e análise filogenética. O genótipo 1 foi o mais prevalente

(81%), seguido dos genótipos 3 (10%), 2 (6%) e 4 (3%). Esse resultado está de acordo

com relatos de outros estudos da região Centro-Oeste, onde existe maior prevalência

do genótipo 1. Os genótipos 2 e 4, raros no Brasil, foram descritos pela primeira vez

na população HCV positiva do Distrito Federal (DF). A concordância entre os

resultados obtidos por meio da análise de homologia das seqüências pelo programa

HCV-BLAST para as regiões 5‟UTR e NS5B foi de 97% para os genótipos e 90% para

os subtipos, corroborando o descrito na literatura sobre a necessidade da análise de

mais de uma região para a correta determinação do subtipo. A análise filogenética das

seqüências definiu os genótipos e subtipos divergentes. A presença de genótipos 1, 2,

3 e 4 do HCV na população de co-infectados com HIV-1 atendidos no DF indica a

importância da genotipagem nessa população uma vez que esses genótipos têm

importância clínica na predição da resposta ao tratamento antiviral, sendo o HCV-1 o

que responde mal ao tratamento ao tratamento.

ABSTRACT

Human immunodeficiency virus (HIV-1) and Hepatitis C virus (HCV) are

considered problems of public health with about 40 millions infected by HIV-1 and

170 millions infected by HCV worldwide. The co-infection HIV-1/HCV is common in

individuals exposed to percutaneous pathways and the hepatitis C has been emerging

as the main cause of death in HIV-1 positive individuals due the high prevalence of

HCV in this population. The HCV is classified into 6 genotypes and several subtypes.

Differences in the genotypic distribution are observed in different areas worldwide

and within a country. Some HCV genotypes appear to be related to a better virological

response after treatment, as the genotypes 2 and 3 for example, that show better

response than individuals infected with genotypes 1 and 4. There is little information

about co-infected HIV-1/HCV population; the genotype prevalence is reported to the

infections separately. Thus, the aim of this study was to characterize the HCV

genotypes and subtypes prevalence in the co-infected HIV-1/HCV population of

Federal District. Forty-five samples from co-infected patients were analyzed by PCR

amplification of 5‟UTR and NS5B genomic sequences followed by automatic

sequencing and phylogenetic analysis. The HCV genotype 1 was the most prevalent

(81%), followed by genotype 3 (10%), 2 (6%) and 4 (3%). This result is in concordance

with reports from other studies from Central West region of Brazil, where there is a

major prevalence of genotype 1. The genotypes 2 and 4, rare in Brazil, were described

for the first time in the HCV positive population of Federal District. The agreement

between the results obtained by the analysis of the sequences homology by the

software HCV-BLAST to the regions 5‟UTR and NS5B was of 97% for genotypes and

of 90% for subtypes, corroborating with the described in literature as to the need to

the analyze more than one genomic region in order to achieve correct subtype

determination. The phylogenetic analysis defined the diverging genotypes and

subtypes. The presence of the genotypes 1, 2, 3, and 4 in the co-infected HIV-1/HCV

population attended in the Federal District indicates the importance of genotyping in

this population once these genotypes have clinical importance in the prediction of the

response to the antiviral treatment.

xii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura do genoma viral,. ............................................................................. 20

Figura 2. Organização do genoma do HCV ..................................................................... 23

Figura 3. Distribuição dos diferentes genótipos do HCV no mundo. ........................... 26

Figura 4. Distribuição dos genótipos de hepatite C nas diferentes regiões do Brasil. . 27

Figura 5. Filogenia do HCV. ............................................................................................. 27

Figura 6. Ciclo de replicação hipotético do HCV. ........................................................... 29

Figura 7. Análise eletroforética dos produtos de PCR .................................................... 54

Figura 8. Gráficos com prevalênica de genótipos e subtipos de HCV no DF. .............. 57

Figura 9. Análise filogenética da região 5‟UTR do HCV em amostras de co-infectados

com HIV-1 .......................................................................................................................... 59

Figura 10. Análise filogenética da região NS5B do HCV em amostras de co-infectados

com HIV-1. ........................................................................................................................ 60

xiii

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Seqüência e local de alinhamento dos iniciadores ......................................... 49

Tabela 2. Relação dos resultados de amplificação .......................................................... 54

Tabela 3. Número de amostras amplificadas .................................................................. 55

Tabela 4. Número de amostras e os respectivos genótipos do HCV encontrados ....... 56

Tabela 5. Número de amostras e os respectivos subtipos do HCV encontrados.......... 56

Tabela 6. Concordância na genotipagem do HCV. ......................................................... 57

Tabela 7. Amostras genotipadas somente para a região 5‟UTR do HCV ...................... 58

Tabela 8. Genótipo das amostras de co-infectados com HIV-1/HCV ........................... 61

xiv

LISTA DE ABREVIATURAS

AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

ALT – Alanina Aminotransferase

ARF-P – Proteínas de quadro de leitura alternativo - alternative reading frame

proteins

C – Proteína core

CTLs – Linfócitos CD8

citotóxicos

E – Proteínas estruturais

eIF-3 – Fator eucariótico de iniciação 3

FDA – Food and Drug Administration

HAART – Terapia anti-retroviral - Highly Active Antiretroviral Therapy

HAV – Vírus da hepatite A

HBsAg - Antígeno de superfície do vírus da hepatite B

HBV – Vírus da hepatite B

HCC – Hepatocarcinoma celular

HCV – Vírus da hepatite C

HCVpp – Pseudopartículas de retro- e lentivírus

HIV-1 – Vírus da imunodeficiência humana

HVR - Regiões hipervariáveis - Hypervariable Regions

IRES – Sítios internos de entrada ribossomal - Internal Ribossomal Entry Site

LACEN-DF – Laboratório Central de Saúde Pública do Distrito Federal

NANB - hepatite não-A, não-B

NIH - Instituto Nacional de Saúde dos EUA - National Institute of Health

NS – Proteínas não estruturais

OMS – Organização Mundial de Saúde

PCR – Reação em cadeia da polimerase – Polymerase Chain Reaction

RdRP – RNA polimerase dependente de RNA

RE – Retículo endoplasmático

RER – Retículo endoplasmático rugoso

ssRNA – RNA de fita simples - sigle stranded RNA

UTR – Região não traduzida - Untranslated Region

1. INTRODUÇÃO

1.1 Histórico

Vários vírus podem atingir o fígado no decurso de uma infecção sistêmica,

concomitantemente com o envolvimento de outros órgãos, originando uma hepatite.

Em muitos casos, a hepatite não chega a ter expressão clínica, sendo detectada

ocasionalmente por alterações em exames laboratoriais. As infecções por

citomegalovírus e o vírus Epstein-Barr, entre outros, são exemplos de tal

eventualidade. Nas regiões tropicais e subtropicais há também um grande número de

vírus, genericamente conhecidos pela designação vírus emergentes, como o vírus da

Febre Amarela, vírus Ebola, vírus Lassa e o vírus Marburg, que podem provocar

lesões hepáticas, por vezes de extrema gravidade, simultaneamente com lesões em

outros órgãos (Freitas, 2003 ).

No entanto, existe um grupo de vírus que tem em comum a capacidade de se

desenvolver nos hepatócitos, causando como principal manifestação, pelo menos na

fase inicial, uma hepatite aguda. O termo hepatite viral é convencionalmente

reservado para as doenças causadas por este restrito subgrupo de vírus

hepatotrópicos (Freitas, 2003).

A história das hepatites remonta, provavelmente, aos primórdios da civilização.

De fato, existem registros de surtos de icterícia na Babilônia ocorridos há mais de

2500 anos e Hipócrates no século IV a.C. fez referência nos seus escritos à icterícia

epidêmica. Geralmente na Idade Média, a eclosão de epidemias de icterícia estava

associada a catástrofes ou períodos de guerra que ameaçavam seriamente as

condições sanitárias (Freitas, 2003). O aumento da freqüência da icterícia epidêmica

na Europa acompanhou o rápido aumento da população nos séculos XVII, XVIII e

XIX, mas as grandes epidemias coincidiram quase sempre com as guerras. Surgiram

então as designações icterícia de campanha, usada desde a Idade Média, ou doença

do soldado, introduzida mais recentemente (Freitas, 2003).

As epidemias de icterícia constituíram no passado um grave problema das

campanhas militares nas quais, muitas vezes, influenciavam o desfecho. Na guerra da

Secessão Americana (1861-65) mais de 40 mil soldados foram atingidos. A dimensão

das epidemias era proporcional à dimensão dos campos de batalha e dos exércitos

envolvidos, como foi verificado nas grandes epidemias que acompanharam as duas

Guerras Mundiais da primeira metade do Século XX (Freitas, 2003).

O número de casos de hepatite durante a Segunda Grande Guerra foi estimado

em cerca de 16 milhões. Posteriormente, atribuiu-se estes grandes surtos epidêmicos

ao vírus da hepatite A e, eventualmente, ao vírus da hepatite E, em algumas zonas do

conflito. No entanto, na época da II Guerra Mundial, ainda não estava difundido o

conceito de que pudessem ser o resultado de infecções virais transmitidas por água

ou alimentos contaminados (Freitas, 2003).

A confirmação da natureza infecciosa da hepatite A só foi estabelecida durante o

período imediatamente a seguir à II Guerra Mundial, por meio de uma série de

estudos realizados com voluntários (Freitas, 2003). Em 1973, o vírus da hepatite A

(HAV) foi identificado e, em 1979, foi possível isolar o vírus em culturas de células.

Em 1995, o órgão norte-americano Food and Drug Administration (FDA) licenciou

uma vacina para prevenir a infecção pelo HAV (Swan e Raymond, 2004).

A hepatite A é endêmica em muitos países do mundo e uma vez a pessoa

infectada com o HAV, a re-infecção não ocorre. Entretanto a hepatite A aguda pode

ser fatal entre pessoas com infecções crônicas de hepatite B ou de hepatite C (Swan e

Raymond, 2004).

Em 1965, B. S. Blumberg descobriu um antígeno, nomeado Antígeno Austrália,

que posteriormente foi designado como antígeno de superfície (HBsAg) do vírus da

hepatite B (HBV). Em 1968, o antígeno foi associado com o agente infeccioso

responsável pelos casos de hepatite pós-transfusional. Atualmente, mais de 350

milhões de pessoas no mundo estão infectadas com hepatite B e 1,25 milhões de

pessoas desenvolvem infecção crônica (Swan e Raymond, 2004).

Uma vacina para prevenir a infecção pela hepatite B tornou-se disponível em

1982 e desde 1991, o Conselho Americano para Práticas de Imunização tem

recomendado a vacinação universal contra hepatite B para recém-nascidos e

adolescentes. Em 2001, o FDA aprovou uma vacina combinada para proteger contra

as infecções causadas pelo HAV e pelo HBV (Swan e Raymond, 2004).

Após a descoberta do HBsAg, a perspectiva de uma resolução definitiva para o

grave problema da hepatite pós-transfusional foi adiada com os resultados obtidos

em estudos prospectivos, onde ficou evidente que a introdução do rastreamento do

antígeno na seleção de doadores de sangue reduzia somente 25% os casos de hepatite

pós-transfusional (Swan e Raymond, 2004; Freitas, 2003). E ainda, outros estudos

alertaram para a elevada prevalência de hepatite quando se usava sangue de origem

comercial e chamaram a atenção para o fato de o sangue do doador pago apresentar

maior risco de transmissão de hepatite B pós-transfusional quando comparado com o

sangue de doadores voluntários. A adoção da política de exclusão do sangue de

doadores pagos teve uma repercussão muito maior na prevenção da hepatite do que o

rastreio do HBsAg. A introdução de técnicas cada vez mais sensíveis na detecção

deste antígenos permitiu reduzir progressivamente o risco de transmissão da hepatite

B pós-transfusional até praticamente desaparecer no final dos anos 70 nos países

desenvolvidos (Freitas, 2003).

No entanto, casos de hepatite continuaram a ocorrer em cerca de 5 a 10% dos

doentes que recebiam sangue ou seus derivados (Freitas, 2003). A hipótese de que o

responsável seria o então recém descoberto HAV foi verificada na época. A

descoberta do HAV e a introdução de testes laboratoriais para sua detecção tornaram

possível identificar os casos de hepatite pós-transfusional que não eram provocados

pelo vírus HBV e, então, verificaram que o HAV estava ausente em todos esses casos

(Freitas, 2003).

Um grupo de pesquisadores do Instituto Nacional de Saúde dos EUA (National

Institute of Health - NIH), liderados por H. J. Alter, envolvidos no estudo desses

casos decidiu então designar a doença por hepatite não-A, não-B (NANB). Na

seqüência lógica da nomenclatura das hepatites, introduzida por MacCallum em

1947, chegou a ser considerado o nome de hepatite C, mas Purcell propôs que esse

nome devia ser preterido enquanto não se esclarecesse se havia um ou mais vírus

envolvidos. A designação hepatite NANB, introduzida em 1975, viria a manter-se

durante 14 anos, tempo decorrido até a identificação do vírus da hepatite C (HCV)

(Alter e Houghton, 2000; Freitas, 2003).

Estudos clínicos e epidemiológicos permitiram obter informação pormenorizada

sobre muitos aspectos da hepatite NANB antes da identificação do HCV: o modo de

transmissão; o freqüente aparecimento de casos esporádicos adquiridos na

comunidade e sem registro de contato conhecido com sangue ou derivados; o período

de incubação; a fase aguda, muitas vezes clinicamente assintomática; a elevada

tendência de progressão para a hepatite crônica e para a cirrose (Freitas, 2003).

Embora a maioria das infecções NANB fosse identificada através dos aumentos

nos níveis das enzimas hepáticas durante a infecção aguda, outras formas de

diagnóstico envolviam os sintomas característicos desenvolvidos por parte das

pessoas infectadas, como fadiga, febre, perda de apetite, náusea, vômitos e icterícia

(Alter et al., 1992; Koretz, 1993). Posteriormente, observou-se em muitos pacientes

NANB a persistência dos valores elevados das enzimas hepáticas e, em alguns casos,

graves lesões no fígado (Swan e Raymond, 2004).

Em 1978, foi demonstrado que a hepatite NANB de transmissão parentérica

podia ser transmitida ao chimpanzé por meio de sangue infectado de doentes. A

obtenção de um modelo animal foi determinante para o progresso dos estudos que

viriam a culminar anos mais tarde na identificação do HCV (Freitas, 2003).

Pesquisadores do NIH organizaram um painel padrão de soroconversão de

chimpanzés infectados e de humanos não infectados, contra os quais foram testados

todos os possíveis suspeitos de serem o vírus não A, não B (Alter e Houghton, 2000).

Os virologistas e imunologistas buscavam a detecção sorológica do agente causal, mas

as técnicas convencionais não eram suficientemente sensíveis e específicas para tal

(Freitas, 2003).

Finalmente, Michel Houghton e colaboradores (1989) da Chiron Corporation,

Qui-Lim Choo, George Kuo e Daniel Bradley, após 7 anos de investigação,

conseguiram, utilizando ferramentas de biologia molecular, a clonagem de

fragmentos do genoma do HCV (Choo et al., 1989) e o posterior desenvolvimento de

um teste sorológico baseado na pesquisa de anticorpos contra antígenos do vírus

(Alter et al., 1989). A era pré-sorológica da hepatite NANB tinha terminado e um

novo vírus, o HCV, era acrescentado ao grupo dos outros vírus hepatotrópicos até

então conhecidos: HAV, HBV e HDV (vírus da Hepatite delta). A identificação do

HCV por clonagem molecular direta do seu genoma, sem prévio conhecimento da

natureza do agente infeccioso e da resposta imunológica envolvida, pela sua

originalidade e importância, constituiu um marco na história da virologia, que abriu o

caminho para a futura identificação de outros vírus (Freitas, 2003; Swan e Raymond,

2004).

Ao mesmo tempo, o estudo da infecção permitiu aprofundar o conhecimento da

sua epidemiologia, vias de transmissão, história natural e outros aspectos que já

tinham sido estudados relativamente à hepatite NANB. A hepatite NANB, de

transmissão parentérica, adquiriu oficialmente, em 1989, o nome que 14 anos antes, o

grupo de pesquisadores do NIH tinha preterido: hepatite C. Cerca de um ano depois

se identificou o vírus da hepatite NANB epidêmica, ou seja, o vírus da hepatite E

(Freitas, 2003; Swan e Raymond, 2004).

No estudo pioneiro que identificou o HCV, um chimpanzé foi identificado com

altos títulos de um agente que tinha capacidade de transmitir hepatite NANB. Do

soro deste animal foi obtida uma suspensão que provavelmente continha o vírus

causador da hepatite C. A partir do RNA extraído, foi sintetizado o DNA

complementar (cDNA) e inserido em um clone vetor e expresso em Escherichia coli.

A partir destes clones foram obtidas as proteínas expressadas e hibridizadas com

soros de pacientes que apresentavam diagnóstico de hepatite NANB. Um único clone

foi considerado reativo e sua clonagem e expressão em leveduras Saccharomyces

cerevisiae resultaram no antígeno C100-3. Esse antígeno foi o primeiro a ser utilizado

em testes sorológicos para detecção de anticorpos contra o HCV. Novas gerações de

testes, cada vez mais específicos e sensíveis têm sido descritos e pesquisados em todo

o mundo (Kuo et al. 1989; Choo et al. 1991; Morton e Kelen 1998; Zein, 2000). A

pesquisa por marcadores sorológicos prosseguiu, permitindo, dessa forma, avaliar

parâmetros como prevalência, incidência e transmissão do HCV (Smith et al., 1997;

Choo et al., 1989).

O desenvolvimento de testes sorológicos de grande sensibilidade e

especificidade e sua implementação na seleção de doadores de sangue reduziu a zero

a incidência da hepatite C pós-transfusional, nos Estados Unidos, em meados da

década de 90. Estima-se que 40 000 infecções sejam evitadas anualmente. Esse teste

é importante para o diagnóstico e tratamento dos pacientes com hepatite C (Freitas,

2003; Swan e Raymond, 2004).

A infecção pelo HCV se torna crônica em pelo menos 80% dos pacientes e em

10% dos casos evolui para cirrose ou carcinoma hepatocelular (HCC).

Aproximadamente, 20% dos portadores crônicos podem desenvolver cirrose hepática

após 20 anos e 10% carcinoma hepatocelular após 30 anos do início da doença.

Portanto, as conseqüências mais sérias da infecção pelo HCV se manifestam após um

longo período evidenciando a necessidade de um diagnóstico precoce para esses

pacientes assintomáticos. (Doorn et al., 1996; Weber et al., 1996).

1.2 O vírus da Hepatite C

O HCV é um vírus hepatotrópico, não-citopático pertencente à família

Flaviviridae e ao gênero Hepacivirus. É transmitido por meio de exposição ao

sangue ou derivados contaminados. Apesar de ser um flavivírus não se conhece vetor

invertebrado e por ser um hepacivirus difere dos outros gêneros na sua inabilidade de

ser propagado eficientemente em cultura de células (Fauquet et al., 2005; Chisari,

2005).

Estudos de microscopia eletrônica demonstraram que o vírus apresenta forma

esférica com aproximadamente 50 nm de diâmetro e contém um envelope lipídico. O

capsídeo viral possui simetria icosaédrica e, aproximadamente, 30 nm de diâmetro

(Fauquet et al., 2005).

O HCV possui como material genético um RNA de fita simples (ssRNA) de

polaridade positiva com aproximadamente 9,6 quilobases (kb). O genoma possui

regiões não traduzidas nas porções 3‟ e 5‟ (untranslated region – UTR), que incluem

elementos de controle necessários para a replicação e tradução (Lindenbach e Rice,

2005). As regiões UTR‟s flanqueiam uma fase de leitura aberta (ORF) que codifica

uma única poliproteína de aproximadamente 3011 resíduos de aminoácidos. Essa

poliproteína é processada por proteases do vírus e do hospedeiro em subunidades

protéicas estruturais (core, E1, E2 e p7) e não-estruturais (NS2, NS3, NS4A, NS4B,

NS5A e NS5B) (Penin, et al, 2004) (Figura 1).

Figura 1. Estrutura do genoma viral, incluindo a longa fase de leitura aberta codificando genes

estruturais e não-estruturais e 5‟ e 3‟UTR‟s. O esquema de processamento da poliproteína são

mostrados logo abaixo. Círculo claro é o sítio de atuação da pepetidase celular; círculos escuros são

sítios de atuação das peptidases virais; seta clara indica atuação da autoprotease NS2-NS3; e as setas

escuras os locais de atuação da protease NS3-NS4A. (Adaptado de Lindenbach e Rice, 2005).

A região 5‟UTR e o gene do core são os mais conservados, enquanto os genes do

envelope, E1 e E2, apresentam regiões hipervariáveis (Hypervariable Regions -

HVR) (Simmonds et al., 1993; Doglio et al., 1998; Zein, 2000).

1.3 O genoma do vírus da Hepatite C e as proteínas virais

A região 5‟UTR possui uma seqüência de 341 nucleotídeos (nt) e apresenta

estruturas secundárias e terciárias no RNA conhecidas como IRES (Internal

Ribossomal Entry Site – Sítios internos de entrada ribossomal), essenciais para a

tradução do genoma viral. Os IRES permitem a ligação direta da subunidade

ribossomal 40S, não necessitando de fatores de pré-iniciação, fazendo que o códon de

iniciação fique posicionado sob o sítio P (Appel et al., 2006). O complexo IRES-40S

recruta então o fator eucariótico de iniciação 3 (eIF-3) e o complexo ternário de Met-

tRNA-eIF2-GTP para formar um intermediário 48S, antes da lenta transição cinética

para o complexo traducional ativo 80S (Lindenbach e Rice, 2005).

A expressão das proteínas virais a partir do genoma monocistrônico é

primariamente alcançada por meio da produção de uma poliproteína que é clivada

proteoliticamente, em seguida, nas proteínas estruturais core, E1 e E2, no peptídeo

hidrofóbico p7 e nas proteínas não estruturais NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B.

As proteínas estruturais são clivadas por uma peptidase celular entre C/E1, E1/E2 e

E2/p7 (Lindenbach e Rice, 2005; Appel et al., 2006).

A primeira clivagem da poliproteína gera a proteína core (C) responsável pela

formação do nucleocapsídeo. Alguns trabalhos relatam que a proteína core interfere

no metabolismo intracelular de lipídeos e lipoproteínas, favorecendo o

desenvolvimento de esteatose (Alberti e Benvegnù, 2003). Uma forma alternativa da

proteína core, gerada por iniciação interna da tradução em uma fase alternativa de

leitura, tem sido relatada. Essas proteínas, designadas ARF-P ou proteínas-F

(alternative reading frame ou frameshifting), são dispensáveis para a replicação do

RNA, pelo menos em cultura de células (Appel et al., 2006).

Em seguida, ocorre a clivagem das proteínas do envelope E1 e E2. No gene que

codifica a proteína E2, existem duas regiões hipervariáveis (HVR-1 e HVR-2) que

apresentam uma grande variabilidade na seqüência devido às altas taxas de mutações

(Locarnini, 2002).

p7 é um pequeno peptídeo hidrofóbico que tem atividade de canal iônico para

os diferentes genótipos do HCV e sua necessidade para a replicação do HCV em

chimpanzés confirma a proteína como um possível alvo para a quimioterapia

antiviral, apesar de seu papel na replicação viral ser desconhecido (Sakai et al.,

2003).

A proteína não-estrutural NS2 associada com NS3 (Ns2/NS3 protease) é a

primeira protease viral ativada no polipeptídio e é responsável pela maturação das

proteínas NS restantes (Dumoulin et al., 2003). Até recentemente, algumas poucas

propriedades foram atribuídas para a proteína NS2 clivada madura, visto que ela

parece agir na inibição da apoptose, na modulação da expressão gênica e na

fosforilação de NS5A (Franck et al., 2005). A porção carboxi-terminal de NS2 possui

uma tríade catalítica da enzima cisteíno-protease, necessária para a clivagem de

NS2/3 (Lindenbach e Rice, 2005; Appel et al., 2006).

NS3 é uma proteína multifuncional, com um domínio serino-protease na porção

N-terminal e um domínio RNA helicase/ NTPase na porção C-terminal (Lindenbach e

Rice, 2005; Appel et al., 2006). Não se sabe qual o papel da helicase do HCV, mas

possivelmente ela está envolvida na iniciação da síntese de RNA, atuando na

dissociação das fitas nascentes de RNA de seus moldes ou no deslocamento de

proteínas ou de outro fator trans-atuante do genoma de RNA (Pang et al., 2002)

Embora NS3 possua uma atividade proteolítica intrínseca, a clivagem da

poliproteína é fortemente reforçada pelo co-fator NS4. Este pequeno peptídeo ancora

a protease às membranas intracelulares por meio de um segmento transmembrana

N-terminal presente em NS4A; estabiliza a protease contra a degradação proteolítica;

e ativa a protease mudando sua geometria e intercalando domínios de NS4A

(Lindenbach e Rice, 2005).

NS5A interage com muitas proteínas celulares e sua função ainda não é

completamente definida. Ela é fosforilada em vários resíduos de serina por uma

cinase celular e pode ser encontrada nas formas hipofosforilada (56 kDa) e

hiperfosforilada (58 kDa). Ainda não está claro quais cinases estão envolvidas, nem

quais sítios de fosforilação são funcionalmente relevantes (Appel et al., 2006).

NS5B é fundamental para a maquinaria de replicação do RNA viral, pois

codifica a RNA polimerase dependente de RNA (RdRP). A iniciação da síntese

dependente de RNA e não dependente de iniciador com um complexo multiprotéico

(replicase) foi demonstrada para essa proteína (Lindenbach e Rice, 2005; Appel et

al., 2006).

A região 3‟UTR apresenta uma região variável com aproximadamente 40nt

ligada à seqüência codificante do genoma do HCV, um segmento rico em

polipirimidina com aproximadamente 100nt e uma região terminal altamente

conservada de 98nt designada cauda-X (Appel et al., 2006). Todas as atividades das

enzimas virais, o gene p7 e as regiões 5‟ e 3‟ UTR necessárias para a replicação viral in

vivo são apresentados na Figura 2.

Figura 2. Organização do genoma do HCV com as funções de cada gene. IRES, sítio interno de

entrada do ribossomo. A primeira seta escura indica o sítio de clivagem de protease do hospedeiro, as

demais setas escuras e claras indicam os sítios de clivagem das proteases virais. Os números acima da

figura indicam as posições de aminoácidos no genoma do protótipo 1b HCV-J (Adaptado de Hofmann

et al., 2005)

O entendimento acerca do ciclo de replicação do HCV e da composição

molecular das partículas virais ainda continua hipotético. Entretanto, detalhes do

ciclo começam a emergir devido à disponibilidade de eficientes sistemas in vitro,

mais notavelmente o sistema de replicon do HCV (Lohmann et al., 1999; Blight et al.,

2000), pseudopartículas de HCV (Hsu et al., 2003) e, mais recentemente, o primeiro

sistema para produção eficiente de HCV infeccioso em culturas de células (Zhong et

al., 2005; Liendenbach et al., 2005). Como os componentes mínimos necessários

para a replicação e tradução do RNA-HCV estão nas regiões codantes NS3 a NS5B e

das não codantes UTR‟s os estudos acabam se concentrando nessas regiões (Appel et

al., 2006).

1.4 A diversidade genética do vírus da Hepatite C e os subtipos virais

A diversidade genética é um dos fatores mais importantes do genoma do HCV

(Zein, 2000). O vírus da hepatite C pode ser filogeneticamente classificado em 6

clados, baseados na heterogeneidade do genoma de isolados identificados pelo

mundo (Fauquet et al., 2005). O HCV é classificado em genótipos e subtipos de

acordo com a homologia de seqüências completas do genoma viral ou das regiões

genômicas 5‟UTR, core, E1 ou NS5B (Bukh et al., 1993; Simmonds et al., 1996; Thiers

et al., 1997). Os genótipos são numerados de 1 a 6 e divergem entre,

aproximadamente, 25 e 35% nas seqüências de nucleotídeos. Genótipos de 7 a 11

foram descritos, mas análises genéticas mais extensivas concluíram que os genótipos

7, 8, 9 e 11 pertenciam ao genótipo 6 e o genótipo 10 pertencia, na verdade, ao

genótipo 3. Os 6 genótipos são subdivididos em mais de 50 subtipos, que diferem

entre si em, aproximadamente, 15 a 25% na seqüência de nucleotídeos (Fauquet et

al., 2005).

A elevada taxa de replicação viral e a ausência de mecanismos de revisão dos

erros da polimerase viral explicam a modificação freqüente do RNA genômico do

HCV. Uma grande população de HCV se replicando em um indivíduo infectado

cronicamente produz um aglomerado de variantes genéticos denominados

quasispecies, cada um com um genoma viral individual. A diversidade das

quasispecies de HCV pode contribuir para o desenvolvimento de uma infecção

crônica e para o escape do sistema imune. Isso porque as proteínas do envelope

mudam rapidamente em resposta à pressão imune (Hoofnagle et al., 2002).

Tem sido sugerido que a infecção primária por HCV constitui um evento

oligoclonal no qual a adaptação do HCV para a persistência in vivo envolve um

aumento seletivo do número de poucos variantes do amplo espectro da população de

quasispecies, provavelmente representando a contraparte da adaptação viral para

cada hospedeiro. Recentemente, a análise filogenética usando seqüências 5‟UTR de

isolados do genótipo 1 no Uruguai, Chile, Brasil e Costa Rica revelou uma quasispecie

diferente das encontradas nos principais subtipos (1a e 1b), indicando um aumento

da diversificação dos vírus HCV nessa região (Cristina, 2005).

A investigação da evolução das quasispecies do HCV na população de indivíduos

co-infectados com HIV-1 (Human immunodificiency virus) e com HCV tem

apresentado resultados conflitantes. Quando comparados com controles infectados

apenas com HCV, indivíduos co-infectados com HIV-1/HCV apresentam maior

diversidade de quasispecies (Bowen e Walker, 2005; Cristina, 2005; Swan e

Raymond, 2004).

Por outro lado, outros estudos com indivíduos co-infectados sugerem que a

diversidade de quasispecies diminui com a imunossupressão e com menor variação

das células CD4

(Bowen e Walker, 2005; Cristina, 2005).

A associação entre o aumento da carga viral de HCV e o aumento da diversidade

das quasispecies pode ser explicada pela evolução adaptativa do HCV em resposta à

pressão imune ou seja, mutantes gerados nesse ambiente que conseguem escapar do

sistema imune podem se replicar mais livremente resultando na elevação da carga

viral. Por outro lado, uma resposta imune menos robusta não seleciona os mutantes

que escapam por meio de seu desempenho de replicação e, então, pacientes com

menor carga viral do HCV apresentam uma menor diversidade de quasispecies

(Bowen e Walker, 2005).

O aumento da diversidade de quasispecies do HCV com a pressão imune está de

acordo com o que já foi descrito para a evolução de quasispecies do HIV-1 durante o

curso da mono-infecção com HIV-1. Wolinsky et al. (1996) demonstraram que em

indivíduos HIV-1 como positivos, a rápida diminuição na contagem de células CD4

está associada com uma estagnação evolutiva do HIV-1; enquanto que uma menor

perda da contagem de células CD4

está associada com um acumulo de mutações e,

em particular, substituições não-sinônimas, indicando que a pressão seletiva exerce

um importante papel na evolução das quasispecies do HIV-1. Assim, HCV e HIV-1

agem de modo semelhante na resposta à pressão imune, ou seja, uma maior

competência imunológica está associada ao aumento adaptativo na diversidade

genética e evolução de ambos os vírus (Babik e Holodniy, 2003).

1.5 Epidemiologia do vírus da Hepatite C

Os genótipos de HCV apresentam diferença na distribuição geográfica (Figuras

3 e 4), na progressão da doença e na reposta à terapia (Figura 5) (Zein, 2000; Feld e

Hoofnagle, 2005), além de apresentar associação com grupos de risco específicos

(Simmonds, 2004).

O genótipo 1 é o mais prevalente nas Américas do Sul e Central região do Caribe

(Zein, 2000), os subtipos 1a e 1b os mais comuns nos Estados Unidos e Norte da

Europa, os subtipos 2a e 2b são comuns na América do Norte, Europa e o genótipo 3

é mais freqüente na Índia. O genótipo 4 é o mais comum na África e no Oriente

Médio. Os genótipos 5 e 6 são raros e encontrados em áreas geográficas isoladas, o

genótipo 5 na África do Sul e o genótipo 6 em Hong Kong e Sudeste Asiático

(Hoofnagle et al., 2002; Zein, 2000). No Japão o subtipo 1b é responsável por 75%

das infecções pelo HCV, mas também são encontrados os genótipos 2a e 2b. Nos

Estados Unidos e Europa, os genótipos 3a e 1a são os mais freqüentes entre os

usuários de drogas e o genótipo 1b parece ser o que predomina em pacientes que

adquiriram HCV por meio de transfusão, na maioria dos casos evoluindo para a

infecção crônica e resistência ao tratamento com interferon (Zein, 2000; Carvalho,

1999).

Figura 3. Distribuição dos diferentes genótipos do HCV no mundo. Os diferentes genótipos

e subtipos do vírus da hepatite C (HCV) apresentam distribuição geográfica distinta, com os

genótipos 1, 2 e 3 apresentando distribuição mundial e os outros genótipos distribuição limitada,

sendo o genótipo 4 mais comum na África e Oriente Médio e os genótipos 5 e 6 raros e encontrados em

áreas geográficas isoladas, o genótipo 5 na África do Sul e o genótipo 6 em Hong Kong e Sudeste

Asiático. Fonte: http://www.clevelandclinicmeded.com/hcv/print/phcvimages.htm (com adaptações).

No entanto, diferenças na distribuição genotípica podem ser observadas em

diferentes áreas da região bem como em diferentes áreas em um país. No Brasil,

estudos de genotipagem foram realizados nas regiões Sudeste (Rio de Janeiro e São

Paulo), Sul (Porto Alegre) e Nordeste (Natal, Salvador e Recife) (Amorim, 2003;

Campiotto et al, 2005) encontrando diferentes prevalências do HCV nas diferentes

populações anti-HCV soropositivas (Figura 4). Algumas variações são encontradas na

distribuição do subtipo 3a na população jovem, principalmente entre os usuários de

drogas intravenosas (Farci et al., 2000; Zein, 2000; Pybus et al., 2001).

Amorim (2003) caracterizou os genótipos do HCV em doadores de sangue no

Distrito Federal e observou uma prevalência de 60,9% para o genótipo 1 e 39,1% para

o genótipo 3 (Amorim, 2003).

Figura 4. Distribuição dos genótipos de hepatite C nas diferentes regiões do Brasil. Os

números ao lado dos gáficos reperentam o número absoluto de casos de cada genótipo em cada uma

das regiões. Fonte: Campiotto et al, 2005 (com modificações).

Figura 5. Filogenia do HCV. A análise filogenética foi realizada com seqüências codantes

completas dos diferentes genótipos do HCV. Os grupos de risco identificados para cada genótipo

(UDI‟s, receptores de sangue ou derivados não triados, outras exposições parenterais) foram indicados

com círculos escuros e texto. A árvore foi construída por neighbor-joining e implementada no

conjunto de programas MEGA, usando correções de distância Jukes-Cantor (Adaptado de: Simmonds

et al., 2005).

Outras diferenças na distribuição podem ser observadas entre isolados de HCV

na América Central e do Sul, onde o genótipo 1 é o mais prevalente, em comparação

com isolados da região do Caribe onde os genótipos 2 e 4 prevalecem (Zein, 2000).

1.6 A replicação do vírus da Hepatite C

Como todo vírus de RNA de fita positiva, a replicação do RNA-HCV ocorre em

associação com membranas citoplasmáticas alteradas. A atividade associada do RNA-

HCV, das proteínas NS e RdRP às estruturas vesiculares foi denominada

membranous web, conforme observado em hepatócitos infectados pelo HCV e em

sistemas de replicon do HCV. Experimentos recentes têm fornecido mais dados

acerca da relação entre membranas celulares, metabolismo de lipídeos e replicação

do RNA-HCV. Em cultura de células, a replicação do RNA-HCV é estimulada pelo

aumento da disponibilidade de ácidos graxos saturados e monosaturados e inibida

pelos ácidos graxos poliinsaturados ou por inibidores de síntese de ácidos graxos.

Estes resultados sugerem que a fluidez da membrana é importante para o

funcionamento da membranous web. (Lindenbach e Rice, 2005; Appel et al., 2006).

Uma área bastante explorada atualmente tem sido a delineação dos elementos

de RNA cis-atuantes que orientam a replicação viral. Quase toda a região de 5‟UTR é

necessária para a eficiente amplificação do RNA. Como essa região apresenta os

IRES, existe um interesse considerável no entendimento de como essa região pode

modular a tradução e replicação, que não ocorrem simultaneamente no mesmo RNA

molde (Lindenbach e Rice, 2005; Appel et al., 2006).

Pouco se sabe a respeito da síntese de RNA-HCV no complexo de replicação. Por

inferência, a partir do conhecimento de vírus relacionados, a síntese de RNA parece

ser semiconservativa e assimétrica: a fita positiva do genoma serve de molde para a

síntese de um intermediário de fita negativa que serve como molde para a produção

de vários genomas nascentes. Evidências sugerem que apenas uma pequena fração

das proteínas NS participa ativamente da replicação do RNA (Lindenbach e Rice,

2005; Appel et al., 2006).

A figura 6 apresenta um esquema do modelo hipotético da replicação do HCV

em hepatócitos.

Figura 6. Ciclo de replicação hipotético do HCV. Partículas de HCV se ligam à célula hospederia

via interação específica entre as glicoproteínas do envelope e receptores celulares. As partículas ligadas

são então internalizadas, provavelmente por meio de endocitose mediada pelo receptor. Após a

liberação do genoma viral no citoplasma (desnudamento) ocorre a tradução, no retículo

endoplasmático rugoso (RER) em uma poliproteína que é clivada nas proteínas estuturais e não

estruturais. As proteínas não estruturais participam da replicação viral e as estruturais fazem parte da

estrutura do capsídeo e glicoproteínas do envelope. O local da montagem das partículas virais ainda

não foi identificado, mas acredita-se que seja em membranas intracelulares derivadas do retículo

endoplasmático ou do compartimento de Golgi. Os vírions recém montados são então liberados da

célula hospedeira possivelmente por meio da via secretória. Fonte:

http://www.tibotec.com/content/backgrounders/www.tibotec.com/hcv_lifecycle.html (com

adaptações).

1.7 Modelos de estudo da replicação do vírus da Hepatite C

Importantes questões acerca da natureza das partículas infecciosas do vírus, das

vias de entrada do vírus e da montagem das proteínas estruturais e do RNA em novas

partículas virais ainda não estão completamente esclarecidas. O principal obstáculo

para o entendimento do ciclo de replicação do vírus e para o desenvolvimento de

terapias está na inabilidade de se isolar o HCV eficientemente em cultura de células

(Lindenbach et al., 2005). Numerosos modelos in vitro para investigação da

replicação do HCV têm sido desenvolvidos. Entretanto, até recentemente não existia

um modelo in vitro no qual o ciclo de replicação do HCV pudesse ser estudado por

meios bioquímicos diretos (Sheehy et al., 2007).

A expressão e o processamento dos produtos de genes estruturais foram

caracterizados em estudos de expressão heteróloga. A proteína E2 se liga com alta

afinidade ao receptor celular CD81, uma tetraspanina que é expressa em vários tipos

de células, incluindo hepatócitos. Embora seu padrão de expressão não explique o

hepatotropismo do HCV, CD81 parece estar envolvida na mediação da entrada do

HCV. Vários outros receptores de HCV foram identificados, incluindo receptores de

lipoproteínas de baixa densidade (Bartosch e Cosset, 2006). Vários sistemas

hospedeiros têm sido desenvolvidos para examinar a relevância dessas interações e

para estudar a estrutura e função de E1/E2, no entanto, o uso de pseudopartículas de

lentivírus (HCVpp) fornece a melhor compreeensão da entrada do HCV na célula.

HCVpp infectam hepatócitos humanos primários e uma variedade de linhagens

celulares hepáticas e sua entrada é dependente de CD81. A expressão de CD81 não é

suficiente para a entrada do HCV em células não-hepáticas, sugerindo a existência de

uma ou mais moléculas ainda não identificadas necessárias para a entrada e o

hepatotropismo do HCV (Swan e Raymond, 2004; Lindenbach et al., 2005; Bartosch

e Cosset, 2006; Appel et al., 2006;).

Vários estudos têm demonstrado que o HCV pode infectar linhagens de

hepatócitos e de células T e B, porém geram uma infecção passageira e de baixo

desempenho. A infecção in vitro de células de mamíferos com partículas do HCV não

resulta em uma replicação com desempenho suficiente para os estudos identificarem

agentes antivirais ou delinear as fases do ciclo de replicação do HCV. Dessa forma

modelos sustentáveis para a replicação do HCV dependem de estratégias que

envolvam manipulação genética do genoma do HCV (Sheehy et al., 2007).

A produção de vírus infecciosos em células transfectadas com RNA foi descrito

para vírus de RNA de fita positiva e, no caso do HCV, foi descrito um modelo de

replicação após a transfecção de linhagens de células de hepatomas com transcritos

de RNA-HCV. A construção de clones moleculares de HCV com seqüência consenso

de aminoácidos do genótipo 1a (isolado Hutchinson 77 ou H77) levou à primeira

demonstração da natureza infecciosa de transcritos sintéticos de RNA-HCV em

chimpanzés. Apesar do pioneirismo desses estudos, limitações no curso variável da

infecção do HCV e no risco requerido para realizá-los requerem o desenvolvimento de

modelos mais práticos para futuros estudos da replicação do HCV (Swan e Raymond,

2004; Lindenbach et al., 2005; Bartosch e Cosset, 2006; Appel et al., 2006; Sheehy

et al., 2007).

Modelos in vitro onde ocorrem expressão de clones moleculares de HCV em

linhagens de células de mamíferos foram obtidos nos últimos anos e esses modelos

são úteis para o estudo do RNA-HCV, caracterização do efeito da expressão do mRNA

celular durante a síntese das proteínas do HCV, análise da interferência do interferon

na sinalização celular e investigação das propriedades/funções de várias proteínas do

HCV. No entanto, algumas limitações ainda precisam ser superadas como, por

exemplo, a dificuldade de transmitir a infecção para células não infectadas e tornar a

expressão de proteínas não tóxica para a cultura de células (Swan e Raymond, 2004;

Lindenbach et al., 2005; Bartosch e Cosset, 2006; Appel et al., 2006; Sheehy et al.,

2007).

A descrição da replicação autônoma de um replicon de HCV foi a primeira

demonstração de uma replicação do HCV in vitro com bom desempenho e representa

o caminho mais promissor para o delineamento de muitos processos do ciclo de

replicação viral. O desenvolvimento do replicon de HCV fundamenta-se na

capacidade de replicação autônoma in vitro de regiões subgenômicas do genoma de

flavivírus e no uso de marcadores em clones moleculares de flavivírus que permitem a

seleção de células que possuem níveis elevados de replicação viral. Várias evidências

demonstraram que o replicon subgenômico de RNA-HCV em células Huh-7

representa um modelo para o estudo da replicação e da expressão das proteínas

virais. Os níveis de replicação do HCV parecem estar ligados aos níveis de

crescimento da célula hospedeira, sendo os maiores níveis de RNA-HCV encontrados

nas células que crescem exponencialmente. Apesar dos bons resultados, limitações

experimentais existem nesse modelo. Replicons de RNA-HCV somente se replicam

com maior eficiência em células Huh-7, apresentam mutações adaptativas que não

ocorrem freqüentemente nos genomas do HCV e que podem responder

diferentemente à agentes antivirais comparado com o tipo selvagem do HCV, e

podem diminuir os níveis de infectividade do HCV em chimpanzés. No entanto, ainda

assim replicons de RNA-HCV representam o principal avanço no estudo da biologia

molecular do HCV (Bartosch e Cosset, 2006; Sheehy et al., 2007).

Recentemente, foram desenvolvidos replicons subgenômicos do HCV derivados

de uma seqüência de genótipo 2a, isolado de um paciente japonês com hepatite

fulminante (denominado JFH-1). Esse modelo constitui uma poderosa ferramenta

para o estudo do ciclo de replicação e para o desenvolvimento de novas estratégias

antivirais contra o HCV (Lindenbach et al., 2005; Bartosch e Cosset, 2006; Sheehy et

al., 2007). Contudo, estudos estruturais e bioquímicos das proteínas virais bem como

análises moleculares da replicação do RNA viral estão entre os maiores desafios

(Lindenbach e Rice, 2005; Appel et al., 2006).

1.8 A transmissão do vírus da Hepatite C

Os principais fatores citados associados à transmissão do HCV são as

transfusões de sangue ou hemoderivados, uso de drogas injetáveis, uso de materiais

perfuro-cortantes não esterilizados e uso de órgãos transplantados de doadores

infectados. Em países desenvolvidos o uso de drogas injetáveis, nas últimas décadas,

tem sido o principal fator de novas infecções pelo HCV. Nos países em

desenvolvimento, injeções terapêuticas não esterilizadas e transfusões de sangue e

derivados contaminados são os principais modos de transmissão, especialmente nos

países onde as taxas de soroprevalência idade-específica sugerem um risco crescente

da infecção pelo HCV. Nos países desenvolvidos com elevada prevalência do HCV em

grupos de idosos, o uso de injeções terapêuticas não esterilizadas provavelmente teve

um papel fundamental na transmissão 30-50 anos atrás (Zein, 2000; Shepard et al.,

2005).

Em muitos países em desenvolvimento, o fornecimento de seringas estéreis

pode não ser adequado ou ser inexistente e, ainda, injeções não esterilizadas podem

ser utilizadas para aplicar medicações que poderiam ser administradas por via oral.

Neste ambiente, pessoas podem ter contato com várias injeções contaminadas ao

longo do tempo, promovendo um risco cumulativo para infecção pelo HCV.

Equipamentos de injeção contaminados constituem o principal fator de risco para

infecção do HCV em vários países, incluindo nações populosas como Egito, Índia,

Paquistão e Taiwan (Shepard et al., 2005).

A transfusão de sangue é um meio extremamente eficaz de transmissão do HCV.

Na maioria dos países desenvolvidos, várias medidas tomadas nas últimas quatro

décadas resultaram em uma redução no risco de infecções do HCV transmitidas por

meio de transfusões. Entre as medidas adotadas estão inclusas a adoção de sistema

de doador voluntário, triagem do sangue doado com testes laboratoriais para doenças

hepáticas, triagem de potenciais doadores baseada em respostas de questões relativas

aos fatores de risco do HIV-1, testes anti-HCV e testes para RNA do HCV, HIV-1 e

HBV (Freitas, 2003; Shepard et al., 2005).

Muitos países em desenvolvimento não fazem triagem para o HCV nas doações

de sangue. O Banco de Dados Global para Segurança do Sangue, órgão da

Organização Mundial de Saúde, estima que 43% das doações de sangue não são

triadas adequadamente para as infecções transmitidas por transfusão, incluindo o

HCV. Na Índia, a triagem para o HCV em produtos sanguíneos é determinada por lei,

mas não é cumprida devido aos custos financeiros envolvidos. Em Gana, estima-se

que um terço das 2578 doações é contaminado com HCV (Shepard et al., 2005).

A transmissão do HCV por meio ocupacional, perinatal e exposição sexual

ocorre com uma prevalência menor quando comparada com a transmissão por meio

de grandes ou repetidas exposições percutâneas. A transmissão ocupacional do HCV

entre os profissionais na área de saúde apresenta baixos níveis, em torno de 0,3% e,

normalmente, envolvem contaminações por materiais perfuro-cortantes. A

transmissão perinatal é estimada entre 2,7% e 8,4%; e a proporção é maior no caso de

mães co-infectadas com HIV-1/HCV. A transmissão sexual entre parceiros infectados

ou entre múltiplos parceiros tem sido um fator de risco para essa forma de

transmissão do HCV, que é menos eficiente quando comparada com outros vírus

transmitidos sexualmente. Outros modos de transmissão incluem procedimentos

cosméticos e religiosos ou práticas culturais como tatuagem, body-piercing,

barbeamento comercial, rituais de escarificação, circuncisão e acupuntura (Zein,

2000; Shepard et al., 2005).

No entanto, em 20-40% das infecções não se identifica um fator clássico

associado à transmissão do HCV. Em um estudo caso-controle realizado por

Karmochkine et al. (2006), os autores identificaram 15 novos fatores de risco

independentes para a infecção pelo HCV em indivíduos sem um fator de risco padrão.

O estudo concluiu que internação hospitalar, endoscopia digestiva, alguns

procedimentos dermatológicos e uso de cocaína por via intra-nasal são os fatores de

risco mais importantes para aquisição de HCV na comunidade em geral e que outros

fatores menos reconhecidos tais como prática de esportes violentos, uso regular de

manicure, depilação em salão de beleza e procedimentos dermatológicos também

parecem estar envolvidos. Todos esses fatores explicam 74% das rotas não

identificadas de infecção pelo HCV.

1.9 O diagnóstico laboratorial do vírus da Hepatite C

O HCV pode ser diagnosticado por meio de testes imunoenzimáticos de segunda

e terceira geração que podem detectar os anticorpos após 4-12 semanas, mas o

padrão-ouro, em termos de sensibilidade e especificidade, no diagnóstico da infecção

pelo HCV, particularmente em populações imunodeprimidas, é o RT-PCR. Como o

RNA-HCV pode ocasionalmente não ser detectado, decisões de diagnóstico e

tratamento não devem ser embasadas nos resultados de um único resultado de RT-

PCR. As RT-PCRs qualitativos são ferramentas importantes porque são

significativamente mais sensíveis que a maioria dos testes quantitativos. Atualmente

a sensibilidade destes ensaios é de 50 cópias de UI/mL. A especificidade destes

ensaios excede a 99%. Um único teste positivo para o RNA-HCV confirma a

replicação ativa do HCV, mas um resultado negativo isolado não garante que o

paciente não seja virêmico. Nesse caso, um seguimento clínico-laboratorial com a

pesquisa do RNA-HCV deverá ser feito para confirmar a ausência de replicação ativa

do HCV. Uma vez confirmada a infecção pelo HCV, a repetição do teste qualitativo

para o RNA-HCV, em pacientes em seguimento clínico, porém sem tratamento, não

apresenta nenhuma utilidade diagnóstica. A maioria dos pacientes permanece

virêmico e um resultado negativo pode apenas refletir um declínio transiente da carga

viral abaixo do limite de detecção do ensaio utilizado (Davies, 2005).

A caracterização molecular do HCV pode ser realizada pela análise direta da

seqüência genômica ou pela hibridização reversa sobre sondas de oligonucleotídeos

genótipo-específico. A hibridização reversa é um teste comercial que permite a

determinação fácil e rápida dos seis genótipos e seus subtipos. O ensaio é baseado nas

variações encontradas na região 5‟UTR de diferentes genótipos do HCV. Este ensaio

permite a interpretação em 100% dos casos. O teste de genotipagem apresenta

importância clínica, principalmente em relação ao tempo e resposta à terapia com

interferon (Zein, 2000; Davies, 2005).

Diferente dos testes de RNA-HIV-1, os testes quantitativos de RNA-HCV não

fornecem informações prognósticas para a hepatite C (Davies, 2005). Tanto o nível

da enzima hepática alanina aminotransferase (ALT) quanto o nível do RNA-HCV não

permitem indicar ou predizer com clareza a gravidade da doença hepática e ambos

não apresentam o mesmo grau de confiabilidade dos marcadores do hospedeiro

utilizados para guiar o tratamento do HIV-1. E ainda, pessoas com níveis normais de

ALT podem apresentar sérios danos hepáticos e mesmo as drogas anti-retrovirais

podem elevar os valores de ALT (Davies, 2005).

Embora as análises por meio de ultra-som e de painéis de biomarcadores

sorológicos forneçam alternativas aos procedimentos invasivos, eles ainda não foram

validados em pacientes co-infectados com HIV-1/HCV. A biópsia do fígado tem sido

usada para avaliar o dano hepático embora seu uso deva ser criterioso por ser um

teste invasivo (Davies, 2005).

1.10 A genotipagem do vírus da Hepatite C

As regiões genômicas mais utilizadas para genotipagem são 5‟UTR, core, E1 e

NS5B (Zein, 2000; Erensoy, 2001; Corbet et al., 2003; Busek e Oliveira, 2003). A

região 5‟UTR é a mais conservada do genoma e por isso muito usada para diagnóstico

e genotipagem. No entanto, essa região não diferencia o subtipo 1a do subtipo 1b, por

apresentar apenas uma diferença nucleotídica na posição –99 com uma adenina (A)

no subtipo 1a ou uma guanina (G) no subtipo 1b (Chen e Weck, 2002; Corbet et al.,

2003). Assim, a análise da seqüência de mais de uma região pode ser necessária para

a discriminação dos subtipos (Erensoy, 2001).

Alguns genótipos do HCV parecem estar relacionados a uma resposta virológica

sustentada após o tratamento. Indivíduos infectados com os genótipos 2 e 3 do HCV

respondem melhor ao tratamento que indivíduos infectados com os genótipos 1 e 4. A

genotipagem de todos os indivíduos precisa ser realizada ao tempo do primeiro

diagnóstico e em casos onde a exposição ao HCV for suspeita, o genótipo pode variar

ao longo do tempo por meio de re-infecção e por isso precisa ser testado

periodicamente (Davies, 2005).

A genotipagem do HCV é clinicamente significativa, pois indivíduos com

genótipos 1a, 1b, 4 e 5 não apresentam respostas satisfatórias ao tratamento com

interferon (Zein et al., 1996a; Poynard et al., 1998; Mondelli e Silini, 1999; Neumann

et al., 2000; Fried et al., 2002; Swan e Raymond, 2004). A infecção pelo genótipo 1

também está associada com altos níveis de RNA-HCV (Blatt et al., 2000; Swan e

Raymond, 2004). A infecção com o subtipo 1b pode aumentar a probabilidade de

infecção crônica (Amoroso et al., 1998; Swan e Raymond, 2004) e está associada com

doenças do fígado mais agressivas e mais graves, porém essa associação apresenta

resultados controversos em diferentes estudos (Takahashi et al., 1996; Yano et al.,

1993; Yotsuyanagi et al., 1995; Zein et al., 1996b; Reide et al., 1999; Swan e

Raymond, 2004). Casos de re-infecção e co-infecção com mais de um genótipo do

HCV foram documentados, embora o impacto clínico dessa infecção mista ainda não

esteja claro (Swan e Raymond, 2004).

A determinação do genótipo do HCV é importante nos pacientes co-infectados

com HIV-1. Em um estudo com pacientes co-infectados Fried et al. (2002)

mostraram que a prevalência dos genótipos 1, 2, 3 e 4 foi de 60%, 12%, 28% e 8%,

respectivamente. Comparativamente, em outro estudo, Torriani et al. (2004)

evidenciaram que pacientes mono-infectados com HCV apresentaram prevalência de

65% para o genótipo 1, 12% para o genótipo 2, 19% para o genótipo 3 e 3% para o

genótipo 4. Dados da influência do genótipo do HCV na doença são limitados.

Pacientes hemofílicos HIV-1 soropositivos, infectados com HCV genótipo 1,

apresentam maior mortalidade do que indivíduos infectados com outros genótipos do

HCV (Yoo et al., 2005).

As infecções com mais de um genótipo do HCV parecem ser comuns (>10%) em

pacientes co-infectados com HIV-1/HCV, particularmente em usuários de drogas

intravenosas e hemofílicos (Forns e Costa, 2006).

1.11 A hepatite C

O curso da infecção aguda do HCV é normalmente assintomático, embora

possam ser observados os sintomas típicos de hepatite como icterícia (em cerca de

20% dos pacientes), anorexia, mal-estar e elevação das enzimas transaminases

hepáticas. Elevados níveis de viremia são observados, com mais de 10 trilhões de

partículas virais sendo produzidas por dia (comparada com os 10 bilhões de

partículas por dia do HIV-1). Se o HCV for eliminado espontaneamente e a carga viral

tornar-se indectectável, os níveis de enzimas hepáticas se normalizam e os anticorpos

podem persistir por muitos anos (Davies, 2005).

A infecção crônica do HCV é freqüentemente assintomática, com viremia

persistente e níveis normais de transaminases. A ALT tem sido considerada a enzima

hepática mais sensível para a infecção com HCV, embora a gravidade da infecção não

esteja diretamente correlacionada com a elevação da ALT, que pode ter suas taxas

variando consideravelmente de um mês para o outro (Davies, 2005).

Embora a infecção pelo HCV possua as formas aguda e crônica, a principal

morbidade associada com a infecção está relacionada ao desenvolvimento da doença

crônica do fígado em um subgrupo de indivíduos infectados anos após o início da

infecção. Entretanto, é difícil estabelecer a incidência da infecção do HCV porque a

maioria das infecções é assintomática (Shepard et al., 2005).

Visto que é impraticável medir diretamente a incidência da infecção do HCV,

pesquisadores têm contado com modelos matemáticos para inferir as tendências da

incidência. Isso tem ocorrido mais freqüentemente em países onde dados de

soroprevalência idade-específica da população estão disponíveis e levam em conta

que a prevalência atual reflete o risco cumulativo de adquirir a infecção (Shepard et

al., 2005).

As principais descrições da epidemiologia do HCV contam apenas com estudos

de soroprevalência. Esses estudos, tipicamente transversais e pontuais, são feitos em

populações pouco representativas tais como a de doadores de sangue, de pacientes

com infecção crônica pelo HCV ou doentes renais crônicos. Estudos baseados em

populações representativas são mais eficazes, porém são impraticáveis na maioria

dos países do mundo, particularmente, naqueles em desenvolvimento (Shepard et al.,

2005).

Os países com maior prevalência de infecção pelo HCV estão localizados na

África e na Ásia, enquanto que na América do Norte, Norte e Oeste da Europa, e

Austrália apresentam menor prevalência. Dentre os países com baixa prevalência a

Alemanha apresenta 0,6%, Canadá 0,8%, França e Austrália 1,1%. A soroprevalência

nos EUA é de 1,8%, no Japão varia entre 1,5-2.3% e na Itália é de 2,2% (Zein, 2000;

Shepard et al., 2005).

Existe uma grande variação nos valores estimados para a prevalência da

hepatite C nos países em desenvolvimento e, geralmente, são poucos os dados

disponíveis que permitem validar o impacto da doença. Essa variação na prevalência

se reflete nas estimativas não confiáveis dos países em desenvolvimento que estão

entre as nações mais populosas do mundo. China e Índia, que representam juntas

dois quintos da população mundial, possuem registros de soroprevalência em torno

de 3,2% e 0,9%, respectivamente. Para a Indonésia os valores registram 2,1%, mas

são baseados na soroconversão de voluntários doadores de sangue. Dados mais

precisos podem ser obtidos da soroprevalência no Paquistão com valores que variam

entre 2,4% e 6,5%. Egito, cuja população é estimada em 73 milhões de indivíduos,

possui uma das maiores soroprevalências com 22% (Shepard et al., 2005; Zein,

2000).

No Brasil, Focaccia et al. (1998) reportou uma prevalência estimada em 1,42%

para a hepatite C na população geral do município de São Paulo. Dados da infecção

do HCV no Brasil mostraram que a prevalência em doadores de sangue para as

diferentes regiões do Brasil: 0,9% a 2,4% para a região Norte; 1,7% a 3,4% para a

região Nordeste; 1,0 a 1,4% para a região Centro-Oeste; 0,8% a 2,8% para a região

Sudeste; e, 1,1 a 2,1% para a região Sul (Campiotto et al., 2005).

Em indivíduos portadores de HCV, vários co-fatores estão associados à

acelerada progressão da fibrose hepática ou ao aumento da incidência das

complicações relacionadas ao HCV como, por exemplo, as complicações da doença

hepática ou hepatocarcinoma celular (HCC). Esses co-fatores incluem sexo

masculino, idade avançada, forma de aquisição da infecção pelo HCV, co-infecção

com HBV e consumo de álcool. São de particular interesse os co-fatores que podem

ser evitados por meio de programas preventivos de saúde pública tais como infecção

com HIV-1, HBV e consumo de álcool (Shepard et al., 2005).

A infecção pelo HCV implicou no aumento da incidência do HCC em muitos

países desenvolvidos como Japão, Espanha, França e Itália, onde a proporção de

casos de HCC atribuída ao HCV varia entre 50% e 70% dos casos. A contribuição do

HCV para a morbidade por HCC é particularmente evidente em países com elevada

prevalência em grupos de idosos como foi verificado em 71% dos idosos infectados

com HCV no Japão, 42% na Indonésia e 11% na China (Zein, 2000; Shepard et al.,

2005).

1.12 O vírus da Hepatite C e a infecção crônica

Aproximadamente, 70% dos 85% de indivíduos que desenvolvem infecção

crônica pelo HCV apresentarão um curso lento, com baixa elevação de ALT e

progressão ou não para cirrose durante algumas décadas. Depressão e fadiga são os

sintomas mais comuns da infecção crônica do HCV. Aproximadamente, 20% das

pessoas com infecção crônica desenvolverão cirrose em um intervalo de 15 a 20 anos,

alguns podem desenvolver cirrose posteriormente e outros podem não desenvolver

nenhum dano hepático significativo. A co-infecção com o HIV-1 acelera essa

progressão (Davies, 2005).

As variações no genoma viral que permitem sua replicação mais eficiente à

medida que cada sistema imune do hospedeiro sugere a atuação de seleção genética

Darwiniana. Estudos verificaram que, quando a resposta do sistema imune

enfraquece, o vírus naturalmente apresenta mutação ao longo do conjunto de 3000

aminoácidos – o estado mais favorável para o vírus. Durante a fase aguda, sob

intensa pressão imune, o vírus é forçado a distanciar-se do grupo de seqüência

ancestral (a seqüência consenso), usando mutações que permitem escapar do sistema

imune. Uma vez que o vírus foi bem sucedido em escapar de um sistema imune em

particular, ocorre reversão na sua seqüência de aminoácidos para o grupo consenso.

Assim é proposto que este direcionamento genético é o mecanismo pelo qual o vírus

escapa da resposta imune aguda e estabelece o estado crônico da infecção (Bowen e

Walker, 2005).

O dano hepático e a oncogênese são causados por distúrbios na apoptose

celular. A injúria do fígado desencadeada pelo HCV é mediada principalmente por

mecanismos imunes do hospedeiro. A via pró-apoptótica pode estar envolvida no

dano hepático enquanto que a inibição da apoptose, modulada por proteínas do HCV

e da célula, pode contribuir para a persistência viral e desenvolvimento do HCC.

Recentemente, demonstrou-se que a proteína E2, em conjunto com a glicoproteína

gp120 do HIV-1 induz a apoptose em hepatócitos (Bantel e Shulze-Osthoff, 2003).

O dano nos hepatócitos não é provocado por efeitos citopáticos da infecção viral,

mas por indução de apoptose nas células infectadas pelo HCV. Os mecanismos

moleculares que causam a apoptose nas células hepáticas durante a infecção aguda e

crônica do HCV ainda não estão completamente definidos (Davies, 2005). Uma

possível explicação para a patogênese da doença hepática é que devido à resposta

celular imune contra o vírus, que inclui linfócitos CD8

citotóxicos (CTLs), as células

estreladas hepáticas são ativadas levando à inflamação e fibrose do tecido. Também

tem sido observado que o HCV pode escapar à resposta inata anti-viral do hospedeiro

de várias formas, seja inibindo os genes que estimulam a síntese de interferon ou

mesmo inibindo a sinalização do interferon e bloqueando a proteínas cinases

induzidas por interferon (Mercer et al., 2001).

O mecanismo preciso pelo qual o HCV causa o HCC é pouco conhecido.

Diferentemente do HBV, o HCV não é incorporado aos núcleos dos hepatócitos.

Provavelmente, o HCC é resultado de uma série de eventos que envolvem a

inflamação e regeneração, associada com a injúria do fígado devido à hepatite crônica

(Davies, 2005).

Fatores que podem estar relacionados ao aumento do desenvolvimento de HCC,

são: idade, sexo masculino e gravidade da doença hepática. O genótipo viral pode ser

um fator importante, embora as evidências de que a infecção com o genótipo 1b é

mais propensa para o desenvolvimento do HCC ainda não tenham sido confirmadas

em grandes estudos. Nenhuma ligação foi estabelecida entre os níveis de RNA-HCV

no soro e a progressão do HCC (Davies, 2005).

1.13 Tratamento

A terapia para a infecção com HCV é baseada no uso de interferon e é um

componente importante na prevenção da morbidade e mortalidade da infecção do

HCV com taxas de resposta sustentada entre 80-98% (Zein, 2000). A combinação de

terapias de interferon com ribavirina introduzida em 2001 induziu uma resposta

sustentada em 42-82% dos pacientes com hepatite C crônica, dependendo do

genótipo. Em países onde a prevenção primária da infecção foi direcionada à

implementação de práticas seguras do uso de injeções e de transfusões, a prevenção

secundária da morbi-mortalidade da infecção pelo HCV concentrou-se no uso de

terapias baseadas em interferon para as pessoas infectadas (Shepard et al., 2005).

Entretanto, os tratamentos disponíveis ainda apresentam alto custo – cerca de

25 mil dólares para uma terapia de 48 semanas para a infecção com o genótipo 1 do

HCV (Shepard et al., 2005; Deuffic-Burban et al., 2007). Um aumento exponencial

para os próximos 10-20 anos, previsto por modelos matemáticos, no número de casos

de doenças hepáticas relacionadas à infecção com HCV deverá dificultar o acesso ao

tratamento, tornando este um grave problema de saúde pública. Uma análise

econômica recente projetou em 10,7 bilhões de dólares as despesas médicas diretas

nos EUA para as doenças relacionadas com o HCV entre 2010 e 2019, baseando-se na

estimativa de crescimento de duas vezes no número de casos anuais de mortes

relacionadas com o HCV durante estes anos, comparado com 1991. Entretanto, de

acordo com os custos envolvidos com a hepatite C nos últimos anos estas projeções

podem se exceder na próxima década (Shepard et al., 2005; Deuffic-Burban et al.,

2007).

1.14 A co-infecção HIV-1/HCV

As infecções pelo HIV-1 e pelo HCV são consideradas problemas de saúde

pública. Atualmente, estima-se que 40 milhões de pessoas estejam infectadas com o

HIV-1 no mundo, e cerca de 3% da população mundial infectada pelo HCV levando a

estimativa de mais de 170 milhões de indivíduos co-infectados por esse vírus

(Rockstroh et al., 2005). A co-infecção HIV-1/HCV é comum na Europa e nos EUA

com aproximadamente 30% dos indivíduos infectados com HIV-1 e 10% dos

pacientes infectados com HCV (Sherman et al., 2002). Sendo assim, estima-se que 17

milhões de pessoas estejam co-infectadas com HIV-1/HCV no mundo. Como o HCV é

um vírus de transmissão parenteral, sua incidência é elevada em países onde o HIV-1

se tornou uma epidemia entre usuários de drogas intravenosas, como pode ser

observado em alguns países do leste europeu (Davies, 2005).

Os dois vírus compartilham vias de transmissão percutânea. Portanto, a co-

infecção é comum em indivíduos expostos à essas vias de transmissão (Rockstroh e

Spengler, 2004). O HCV é muito mais infeccioso que o HIV-1 na exposição

percutânea ao sangue, sendo transmitido entre 15 e 30 de 1000 injúrias provocadas

por materiais perfuro-cortantes, comparado com 3 de 1000 do HIV-1 (CDC, 2001). E

ainda, o vírion do HCV é mais resistente podendo continuar infeccioso no ambiente

por pelo menos 16 horas (Kamili et al., 2007) enquanto que o HIV-1 torna-se não

infeccioso em menos de 6 horas (Wei et al., 2003). Além disso, as taxas de replicação

do HCV são mais elevadas do que as do HIV-1, resultando em elevada viremia, o que

por si só constitui um fator para a transmissão (Davies, 2005).

Dados de prevalência da co-infecção HIV-1/HCV são raros. Estimativas de

prevalência da co-infecção em pessoas HIV-1 soropositivas nos EUA e na Europa

variam entre 16% e 33% (Davies, 2005; Rockstroh et al., 2005; Swan e Raymond,

2004; Rockstroh e Spengler, 2004).

O HCV é encontrado em 60 a 90% dos hemofílicos HIV-1 soropositivos e em 50

a 70% dos usuários de drogas intravenosas (Rockstroh e Spengler, 2004). Cerca de

30% dos indivíduos infectados pelo HIV-1 estão co-infectados pelo HCV nos Estados

Unidos (Rockstroh et al., 2005).

Nos países em desenvolvimento, os dados são escassos para que a prevalência

da co-infecção possa ser estimada. Nessas regiões, o uso de drogas injetáveis é um

comportamento menos comum e a transmissão heterossexual é responsável pela

maioria dos novos casos de HIV-1. Apesar da transmissão sexual do HCV ainda não

ser bem compreendida, a estimativa de prevalência da co-infecção HIV-1/HCV nos

países em desenvolvimento se baseia no principal fator de risco para a transmissão

do HIV-1. São poucos os estudos de soroprevalência do HCV entre indivíduos HIV-1

soropositivos que contraíram o vírus por relação heterossexual e dados sobre co-

infecção HIV-1/HCV em pessoas com exposição freqüente à injeções terapêuticas não

esterilizadas. No entanto, recentes estudos sobre um surto de infecção com HIV-1 e

HCV ocorrido na Líbia, relacionado ao uso de equipamentos hospitalares não

esterilizados, mostraram que 47% das mais de quatrocentas crianças atendidas em

um hospital foram co-infectadas com ambos os vírus (de Oliveira et al., 2006;

Shepard et al., 2005).

Na Argentina, a prevalência da co-infecção varia entre 5,8% e 88,3% (Consenso

Argentino, 2005). Fainboim et al. (1999) ao estudar 484 pacientes HIV-soropositivos

observou que 58,5% estavam co-infectados com HCV, embora 48,3% desses

pacientes fossem usários de drogas intravenosas. No Brasil, existem poucos dados

sobre pacientes co-infectados por HIV-1/HCV. A prevalência da co-infecção varia

entre 17,5% e 95% em diferentes estudos realizados com diferentes populações de co-

infectados (Mendes-Corrêa e Barone, 2005).

Em contraste, a transmissão sexual do HCV é rara, o que explica a baixa

freqüência (4 a 8%) das co-infecções em pacientes homossexuais infectados pelo

HIV-1. A prevalência da transmissão sexual não é significativa entre parceiros

heterossexuais monogâmicos infectados apenas com HCV (Halfon et al., 2001a); no

entanto, é mais expressiva entre os homossexuais masculinos HIV-1 soropositivos

(Matthews-Greer et al., 2001).

A co-infecção com HIV-1/HCV aumenta o risco da transmissão perinatal, e

mães com alta carga viral de HCV apresentam risco maior de transmissão perinatal

do HCV (Rockstroh e Spengler, 2004). O risco de transmissão vertical do HCV

aumenta de 2-5% dos recém nascidos de mães infectadas com HCV para 17-20% caso

a mãe esteja co-infectada com HIV-1. E ainda, diferentemente do que já foi descrito

para o HIV-1, não se observou associação entre a amamentação e aquisição do HCV

(Roberts e Yeung, 2002).

As evidências sugerem que o HCV se comporta como uma infecção oportunista

em indivíduos infectados com o HIV-1. Após a introdução da terapia anti-retroviral,

os indivíduos co-infectados apresentaram uma maior progressão da doença hepática

e, em conseqüência, uma menor sobrevida. O HCV pode aumentar a morbidade e

mortalidade relacionada ao HIV-1. Devido ao aumento da hepatotoxicidade da

terapia anti-retroviral em indivíduos co-infectados, a infecção pelo HCV pode

comprometer o resultado do tratamento para o HIV-1 (Hall et al, 2004).

O efeito da infecção do HCV na progressão da doença do HIV-1 permanece

controverso (Dorrucci et al., 2004). Possivelmente, a associação entre a terapia anti-

retroviral com as diferentes características da resposta imune e da doença por HCV

possam explicar os resultados contraditórios que têm sido descritos até hoje (Caudai

et al., 2005).

Estudos realizados na era pré-HAART (Terapia anti-retroviral - Highly Active

Antiretroviral Therapy) falharam em demonstrar que o HCV acelera a progressão da

doença causada pelo HIV-1 por meio da avaliação de parâmetros clínicos e

imunológicos. Apesar disso, o HCV é considerado co-fator na progressão da doença

do HIV-1 estimulando a replicação do HIV-1 por meio de uma resposta imune não-

específica, favorecendo a depleção do grupo de células CD4 por meio da infecção de

células do sistema imune, comprometendo a recuperação imune da qual depende o

sucesso da terapia anti-retroviral e, finalmente, o HCV pode comprometer o benefício

da HAART elevando a incidência de hepatotoxicidade e descontinuidade do

tratamento (Greub et al., 2000; Swan e Raymond, 2004).

O uso da HAART tem reduzido drasticamente a morbidade e a mortalidade nos

indivíduos infectados pelo HIV-1. Entretanto, paralelamente ao sucesso da terapia, a

hepatite C tem emergido como a principal causa de morte em indivíduos HIV-1

soropositivos, devido à alta prevalência do HCV nessas populações e ao aumento de

sua patogenicidade na co-infecção com o HIV-1 (Braitstein et al, 2004).

Os indivíduos co-infectados que recebem tratamento para HCV apresentam

uma resposta virológica sustentada menor sendo 40% nos pacientes HIV-1

soropositivos contra 55% nos HIV-1 soronegativos. Entre os infectados com o

genótipo 1 do HCV a resposta virológica sustentada é 29% quando são HIV-1

soropositivos contra 45% quando são HIV-1 soronegativos. A eficácia da resposta ao

tratamento para HCV é limitada por numerosos fatores, entre os quais se incluem a

contra-indicação para o tratamento, os elevados custos, o direcionamento do

tratamento, a prevalência maior do genótipo 1, e a co-infecção com HIV-1 (Braitstein

et al, 2004).

O efeito da HAART no perfil de quasispecies dos indivíduos co-infectados com

HIV-1/HCV ainda não foi descrito. Dado o valor do potencial preditivo da variação

das quasispecies como marcador para a doença relacionada ao HCV e à resistência ao

interferon, a determinação de como a HAART afeta a diversidade genética do HCV

fornece importantes implicações no entendimento do curso da doença do HCV no

ambiente da infecção com HIV-1, além disso, ajuda a ter uma melhor definição do

tratamento terapêutico dos indivíduos co-infectados (Swan e Raymond, 2004; Greub

et al., 2000).

Existe pouca evidência de que haja uma interação direta entre o HIV-1 e o HCV

no fígado. O HIV-1 é linfotrópico e não infecta hepatócitos diretamente. Por outro

lado, o HCV que é um vírus hepatotrópico parece ser linfotrópico visto que

seqüências virais foram amplificadas a partir de células mononucleares periféricas

(PBMCs) de indivíduos infectados. A infecção de células extra-hepáticas pode

constituir um reservatório que poderia favorecer a seleção de variantes do HCV e dos

mecanismos de persistência viral. De fato, a recorrência quase universal de infecção

pelo HCV após transplantes de fígado corrobora a existência de sítios extra-hepáticos

onde o HCV pode persistir e replicar (Davies, 2005).

2. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS

Pouca informação está disponível acerca da infecção pelo HCV em indivíduos

HIV-1 soropositivos na América Latina e no Brasil (Mendes-Corrêa e Barone, 2005).

Existem poucos dados sobre a população de co-infectados com HIV-1/HCV e a

prevalência dos genótipos é relatada para as infecções de forma separada nas

diferentes populações. Alguns estudos têm relatado a co-infecção HIV-1/HCV na

população de usuários de drogas injetáveis, nas quais o genótipo 1 do HCV apresenta

maior prevalência (Shire e Sherman, 2005; Garten et al., 2005).

A genotipagem do HCV é um importante marcador epidemiológico e, em

combinação com outros métodos, pode auxiliar no controle da infecção crônica e no

prognóstico da terapia com interferon (Ichimura et al., 1994; Pozzato et al., 1995;

Martins et al., 1998; Zein, 2000; Lauer et al., 2001).

Dentre os fatores que interferem na resposta ao tratamento antiviral e que

podem variar de acordo com genótipo ou subtipo do HCV estão a patogenicidade da

infecção, o perfil demográfico dos pacientes e a detecção viral nos testes de

diagnósticos (Carvalho, 1999).

Em pacientes co-infectados com HIV-1 e HCV o genótipo do HCV pode ser

usado como prognóstico para reposta ao tratamento, pois as infecções com genótipos

2 e 3 apresentam uma resposta significativa quando são tratados durante um ano

com interferon peguilado e ribavirina (Forns e Costa, 2006).

Na região Centro-Oeste do país existe uma carência de dados sobre a

variabilidade genotípica do HCV encontrado nas diferentes populações de indivíduos

mono- e co-infectados.

Em 2003 nosso grupo de pesquisa realizou a caracterização molecular do HCV

em população de doadores de sangue do Distrito Federal (Amorim, 2003) e,

recentemente, vem trabalhando com outras populações de mono-infectados pelo

HCV, tais como as populações de doentes renais crônicos e população em geral.

No sentido de caracterizar molecularmente a infecção do HCV em populações

de co-infectados com outros vírus e, com vistas a ampliar o conhecimento acerca dos

genótipos e subtipos que infectam a população de co-infectados com HIV-1/HCV no

Distrito Federal e Entorno o presente trabalho tem como objetivos específicos:

 Caracterizar os genótipos de HCV e sua prevalência na população de indivíduos

co-infectados com HIV-1/HCV;

 Caracterizar os subtipos de HCV e sua prevalência na população de indivíduos co-

infectados com HIV-1/HCV do Distrito Federal;

 Estabelecer uma correlação entre os genótipos obtidos por meio de

seqüenciamento da região 5‟UTR com aqueles obtidos para a região NS5B do genoma

do HCV;

 Realizar a análise filogenética das seqüências obtidas das amostras para

confirmação dos genótipos obtidos para a população de co-infectados com HIV-

1/HCV;

 Comparar dados da prevalência de genótipos e subtipos encontrados em co-

infectados com HIV-1/HCV com dados disponíveis.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 População Estudada

A população estudada consistiu de 45 indivíduos co-infectados com HIV-1/HCV

atendidos pelos serviços públicos de assistência à saúde no Distrito Federal. As

amostras analisadas foram encaminhadas ao Laboratório Central de Saúde Pública

do Distrito Federal (LACEN-DF) para a realização de exames qualitativos,

quantitativos ou de genotipagem do HCV. O trabalho foi submetido e aprovado pelo

Comitê de Ética e Pesquisa do Distrito Federal.

Este é um estudo anônimo, transversal e descritivo, de série histórica, onde

foram analisadas amostras coletadas durante o período de 2004 a 2006, de

indivíduos co-infectados com HIV-1/HCV residentes do Distrito Federal e Entorno,

atendidos pela rede pública de saúde do Distrito Federal.

A representatividade da população foi calculada utilizando-se o programa

Statcalc (EPIINFO 6.0), para um intervalo de confiança de 99,9%. Para tanto, foi

considerada a população estimada de 30% de indivíduos co-infectados com HCV

(http://www.hepatites.com.br/sc/hepatite/web/noticias/default.aspx?IDNoticia=36208)

entre o número total de indivíduos HIV-1 soropositivos do Distrito Federal (n=5000).

Utilizou-se a freqüência de 90% para o menor resultado de amplificação e 98% como

freqüência de amplificação esperada.

3.2 Coleta das amostras

As 45 amostras foram coletadas de indivíduos comprovadamente co-infectados

com HIV-1/HCV atendidos no Distrito Federal e Entorno. Para a realização dos

experimentos foi coletada uma alíquota de 140 μL do plasma de cada amostra que foi

encaminhada ao laboratório em recipiente térmico e foi armazenada em temperatura

de -80ºC para posterior extração do RNA.

3.3 Extração de RNA e Transcrição Reversa

O RNA do plasma foi extraído utilizando um kit comercial QIAamp Viral RNA

(Qiagen) em um volume final de 60 μL conforme o protocolo indicado pelo

fabricante. A reação de transcrição reversa foi realizada em um volume final de 20

μL, a partir da extração do RNA. Inicialmente, uma solução contendo 0,02 μg de

oligonucleotídeos randômicos, 5,00 μg de RNA viral total, 0,5 mM de cada dNTP

(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (Invitrogen, Life Technologies) e água Milli-Q para um

volume final de 13 μL, foi mantida a 65ºC por 5 minutos e, imediatamente,

transferida para um recipiente com gelo por 1 minuto. Adicionou-se, em seguida, 0,75

de tampão first-strand (Invitrogen, Life Technologies), 5 mM de ditiotreitol (DTT),

100 mM de inibidor de RNAse (Pharmacia Biotech) e 200U da enzima SuperScript®

Transcriptase Reversa (Invitrogen, Life Technologies). Esta reação foi inicialmente

incubada a 25 ºC por 5 minutos e, em seguida, a 50 ºC por 60 minutos. A reação foi

interrompida com a inativação da enzima a 70ºC por 15 minutos. O cDNA sintetizado

foi armazenado a -20ºC.

3.4 Amplificação pela nested-PCR

O cDNA obtido foi amplificado por meio de nested-PCR, utilizando-se

iniciadores específicos para as regiões 5‟UTR e NS5B do HCV (Tabela 1) (Ginabreda

et al., 1997; Chen e Weck, 2002). No primeiro ciclo foram usados os iniciadores

externos e, no segundo ciclo, os iniciadores internos das respectivas regiões

genômicas.

Para a amplificação do fragmento da região NS5B entre os nucleotídeos 7935 e

8266 foram utilizados no primeiro ciclo, os iniciadores S1 e AS1 (Integrated DNA

Technologies) e, no segundo ciclo, os iniciadores S2 e AS2 (Integrated DNA

Technologies) (Chen e Weck, 2002) (Tabela 1).

Para a amplificação do fragmento entre os nucleotídeos -258 e -50 da região

5‟UTR foram utilizados no primeiro ciclo os iniciadores P7 e P8 (Integrated DNA

Technologies) e no segundo ciclo os iniciadores P10 e P17 (Integrated DNA

Technologies) (Ginabreda et al., 1997). As seqüências e as posições de alinhamentos

no genoma do HCV podem ser observadas na tabela 1.

O primeiro ciclo de amplificação para 5‟UTR foi realizado em um volume final

de 50,0 µL contendo, respectivamente, 1,0 µL de cDNA, 0,2 mM de dNTPs

(Invitrogen, Life Technologies), 0,8 µM dos iniciadores externos P7/P8 (Integrated

DNA Technologies), 1,25 U da enzima Taq DNA Polimerase (Invitrogen, Life

Technologies), 1X de tampão da enzima (Invitrogen, Life Technologies), 5 mM de

cloreto de magnésio (Invitrogen, Life Technologies) e água Milli-Q qsp 50,0 µL. As

reações foram realizadas em termociclador (PTC-100 Research Inc) com os

parâmetros dos ciclos térmicos descritos na Tabela 1. Um microlitro do produto de

PCR foi submetido a um segundo ciclo de amplificação usando os iniciadores internos

P10/P17 (Integrated DNA Technologies) sob as mesmas condições de amplificação

do primeiro ciclo.

O primeiro ciclo de amplificação para NS5B foi realizado em um volume final de

50,0 µL contendo, respectivamente, 5,0 µL de cDNA, 0,2 mM de dNTPs (Invitrogen,

Life Technologies), 0,8 µM dos iniciadores externos S1/AS1 (Integrated DNA

Technologies), 1,25 U da enzima Taq DNA Polimerase (Invitrogen, Life

Technologies), 1X de tampão da enzima (Invitrogen, Life Technologies), 5 mM de

cloreto de magnésio (Invitrogen, Life Technologies) e água Milli-Q qsp 50,0 µL . Os

parâmetros dos ciclos térmicos estão descritos na Tabela 1. Um microlitro do produto

da primeira amplificação foi submetido a um segundo ciclo usando os iniciadores

internos S2/AS2 (Integrated DNA Technologies) nas mesmas condições do primeiro

ciclo, porém, usando 25 ciclos de amplificação.

Tabela 1. Seqüência e local de alinhamento dos iniciadores externos e internos usados no

estudo, e parâmetros dos ciclos térmicos do nested-PCR para as regiões genômicas NS5B e 5‟UTR do

HCV.

Regiões

genômicas

Ciclo

Seqüências e Posição de Alinhamento dos

Iniciadores

Parâmetros da PCR

NS5B

1º

S1 (7904 a

7922): 5‟TGGGGTTCTCGTATGATACCC3‟

AS1 (8295 a 8275): 5‟CCTGGTCATAGCCTCCGTGAA3‟

95ºC - 1 min

95ºC - 20 s

54ºC - 30 s 40 ciclos

72ºC - 1 min

72ºC - 10 min

2º

S2 (7916 a 7935): 5‟GATACCCGCTGCTTTGACTC3‟

AS2 (8284 to 8266): 5‟CCTCCGTGAAGGCTCTCAG3‟

95ºC - 1 min

95ºC - 20 s

54ºC - 30 s 25 ciclos

72ºC - 1 min

72ºC - 10 min

5’UTR

1º

P7 (-304 a -280): 5‟CACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTC3‟

P8 (+3 a -23): 5‟ATGGTGCACGGTCTACGAGACCTCC3‟

94ºC - 2 min

94ºC - 15 s

55ºC - 45 s 35 ciclos

72ºC - 1 min

72ºC - 7 min

2º

P17 (-279 a -258): 5‟TTCACGCAGAAAGCGTCTAGCC3‟

P10 (-26 a -50): 5‟GGGCACTCGCAAAGCACCCTATCAGG3‟

94ºC - 2 min

94ºC - 15 s

55ºC - 45 s 35 ciclos

72ºC - 1 min

72ºC - 7 min

As amostras amplificadas por nested-PCR foram submetidas à eletroforese em

gel de agarose na concentração de 1%. Brometo de etídio foi utilizado para impregnar

e permitir a visualização dos fragmentos de DNA. Controles negativos foram

incluídos durante os procedimentos de amplificação para monitorar possíveis

contaminações.

3.5 Clonagem

Para as amostras que precisaram de confirmação dos resultados de genotipagem

foi realizada a reação de ligação dos produtos de PCR no plasmídeo pGEM®-T easy

(Promega) seguindo as instruções do fabricante.

Os plasmídeos foram utilizados para transformar bactérias Escherichia coli da

linhagem DH5, pelo método de choque térmico. Inicialmente, 10 L da solução

contendo os plasmídeos foram incubados com 300 L das células competentes no

gelo por 40 minutos. Em seguida, as células foram submetidas a 42 °C por 2 minutos,

em banho-maria, e novamente transferidas para o banho de gelo por 1 minuto. Foram

adicionados 700 L de meio líquido 2xYT (1,6 mg/mL de triptona, 1,0 mg/mL de

extrato de levedura e 85,6 mM de NaCl), que em seguida foi incubado a 37 °C por 1

hora. Após a incubação, os tubos foram centrifugados por 5 minutos a 3000 rpm

(Jouan S.A. A14/V1), e 700 L foram removidos por aspiração. As bactérias foram

espalhadas em placas de Petri contendo meio sólido 2xYT, com 16,7 ηmol de IPTG,

800 ηg de X-Gal e 4mg/mL de ampicilina.

As placas de Petri foram incubadas overnight em estufa a 37 °C. Os clones

recombinantes foram selecionados e incubados overnight a 37°C sob agitação em

meio líquido 2xYT, contendo 4mg/mL de ampicilina. O DNA plasmidial foi extraído

utilizando-se o Kit Sephaglas FlexiPrep™ (GE Healthcare) seguindo as instruções do

fabricante.

O DNA plasmidial foi utilizado como molde para amplificação por PCR,

utilizando os iniciadores universais M13. A reação foi realizada em um volume final

de 50 L, contendo: 1 L do DNA plasmidial, 0,2 mM de dNTPs (Invitrogen), 0,4 M

dos iniciadores M13F/M13R (Integrated DNA Technologies), 1,25 U da enzima Taq

DNA Polimerase (Invitrogen), 1X de tampão da enzima (Invitrogen) e 1 mM de

cloreto de magnésio (Invitrogen). As seguintes condições foram adotadas:

desnaturação a 94°C por 2 minutos, seguidos de 35 ciclos de desnaturação a 94°C por

30 segundos, anelamento dos iniciadores a 55°C por 25 segundos e extensão a 72°C

por 30 segundos.

Os clones amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de agarose na

concentração de 1%. Brometo de etídio foi utilizado para permitir a visualização dos

fragmentos de DNA. Controles negativos foram incluídos durante os procedimentos

de amplificação, para monitorar possíveis contaminações.

3.6 Caracterização dos genótipos

3.6.1 Seqüenciamento automático

Os produtos de nested-PCR foram seqüenciados automaticamente, pelo menos

duas vezes, somente no sentido senso, utilizando-se os iniciadores internos P17

(Ginabreda et al., 1997) para 5‟UTR e S2 (Chen e Weck, 2002) para NS5B. As reações

de seqüenciamento nucleotídico foram realizadas no laboratório de Biologia

Molecular da Universidade de Brasília, utilizando-se o Kit ET-Terminator, no

Sistema Molecular Dynamics MegaBACE 500 plus (GE Healthcare) e no laboratório

Plataforma de Seqüenciamento de DNA da EMBRAPA-CENARGEN utilizando-se o

Kit ABI PRISM® BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction versão 3.1

(Applied Biosystems).

3.6.2 Análise das seqüências

A qualidade das seqüências obtidas nas reações de seqüenciamento automático

foi verificada pelo programa PHRED (Ewing and Green, 1998). A homologia das

seqüências nucleotídicas com seqüências depositadas no banco genômico do HCV foi

determinada pelo programa HCV-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

(Karlin, e Altschul, 1990; Karlin, e Altschul, 1993), disponível no sítio HCV Sequence

Database (http://hcv.lanl.gov) (Kuiken et al., 2005). A seqüência mais similar à

amostra foi considerada.

3.6.3 Análise filogenética

Para a realização das análises filogenéticas, as seqüências dos isolados do

Distrito Federal (DF) foram alinhadas com seqüências referência dos genótipos 1, 2, 3

e 4 do HCV, obtidas no sítio do HCV Sequence Database (http://hcv.lanl.gov), pela

ferramenta ClustalW Multiple Alignment (Thompson et al., 1994). As regiões com

falta de informação de seqüência para qualquer uma das amostras foram descartadas

de todas as seqüências. Foi utilizado um fragmento de no mínimo 208 nucleotídeos

correspondendo ao gene NS5B e 198 nucleotídeos correspondendo à região 5‟UTR.

A análise de Maximum likelihood PHYLIP package (Felsenstein, 1981) foi

utilizada para o estudo das relações filogenéticas de HCV. Os valores de bootstrap

foram calculados pelo método neighbor joinning com fator de correção de 2

parâmetros de Kimura (Kimura, 1980). A confiabilidade das árvores foi avaliada pela

análise de 1000 réplicas (bootstrap). Foram usadas como grupo externo a seqüência

referência do genótipo 5a para NS5B e 2e para 5‟UTR. As árvores foram desenhadas

com o programa TreeView 1.6.6 (Page, 1996).

4. RESULTADOS

4.1 Caracterização da população de co-infectados

Nesse estudo foram analisadas 45 amostras de plasma de indivíduos reagentes

para anti-HCV e co-infectados com HIV-1, atendidos no DF e Entorno, que

realizaram exames no LACEN-DF. O cálculo dessa amostragem, representativa da

população alvo, foi realizado no programa Statcalc (EPIINFO 6.0), considerando-se o

total de 5000 indivíduos HIV-1 soropositivos no DF no ano de 2006 e uma

soroprevalência de 30% do anti-HCV, com um intervalo de confiança de 99,9%

A faixa etária dos pacientes variou de 15 a 52 anos com média de 41 anos. A

freqüência de pacientes com mais de 40 anos foi de 71,11% (32/45). O sexo que

predominou foi o masculino, com 60% (27/45) do total. Entre os pacientes, 77,77%

(35/45) tiveram contagem de células CD4 abaixo de 200 céls/µL, caracterizando

quadro de Síndrome da Imunodeficiência Adquirida – AIDS.

A procedência da maior parte dos pacientes foi do Distrito Federal, com um

percentual de 86,66% (39/45), três pacientes foram provenientes de Goiás, um de

Minas Gerais e dois de São Paulo.

4.2 Transcrição reversa e amplificação pela nested-PCR

No presente trabalho, 45 amostras de RNA total foram transcritas reversamente

e as regiões genômicas 5‟UTR e NS5B foram amplificadas pela nested-PCR. As

amostras amplificadas foram submetidas à eletroforese em gel de agarose a 1%,

posteriormente corado com brometo de etídio. Os produtos de PCR obtidos

apresentaram aproximadamente 253 pares de base (pb) para 5‟UTR e 331 pb para

NS5B (Figura 7). Adicionaram-se controles negativos durante os procedimentos de

amplificação para monitoramento de possíveis contaminações.

Figura 7. Análise eletroforética dos produtos de PCR das regiões genômicas 5‟UTR (a) e NS5B

(b) em gel de agarose 1% impregnado com brometo de etídio. Os poços com o número 1 representam

os fragmentos amplificados para as duas regiões genômicas, de acordo com o tamanho esperado para

5‟UTR (≈253 pb) e NS5B (≈331 pb). M1 = marcador DNA ladder 100 pb (Ludwig Biotecnologia), M2 =

marcador DNA ladder 100 pb (Invitrogen) e CN = controle negativo.

Do total de 45 amostras avaliadas para a região 5‟UTR, 40 amostras (89%)

tiveram o cDNA amplificado pela nested-PCR e em 5 amostras (11%) não foi possível

estabelecer uma amplificação. A análise da carga viral do HCV revelou que todas as 5

amostras apresentaram valores abaixo do limite de detecção (< 615 UI/ml) nos

exames quantitativos realizados no LACEN-DF (Tabela 2).

Do total de 45 amostras avaliadas para a região NS5B obteve-se a amplificação

de 33 amostras (73%) e para 12 amostras (27%) não foi possível estabelecer uma

amplificação. Por meio da análise dos resultados dos exames de carga viral do HCV

realizados no LACEN-DF verificou-se que das 12 amostras PCR negativas testadas, 10

amostras apresentaram carga viral menor que 615 UI/mL e 2 amostras apresentaram

carga viral maior que 615 UI/mL (Tabela 2).

Tabela 2. Relação dos resultados de amplificação por nested-PCR para as regiões genômicas de

5‟UTR e de NS5B do HCV com os resultados de carga viral do HCV realizados com as amostras de

indivíduos co-infectados com HIV-1 e HCV do Distrito Federal.

5’UTR

NS5B

Carga viral HCV

PCR +

PCR -

TOTAL

PCR +

PCR -

TOTAL

< 615 UI/ mL

> 615 UI/ mL

TOTAL

500 pb

300 pb

1 CN

CN 1

600 pb

400 pb

≈253 pb

≈331 pb

4.3 Genotipagem

4.3.1 Definição dos Genótipos do HCV com base na análise das regiões genômicas

5’UTR e NS5

O seqüenciamento automático foi realizado no sentido senso para as 40

amostras amplificadas para a região de 5‟UTR e para as 33 amostras amplificadas

para NS5B. Desse total, todas as 40 amostras amplificadas para 5‟UTR apresentaram

seqüências satisfatórias para realização da genotipagem por seqüenciamento. No

entanto, somente 31 das 33 amostras amplificadas para NS5B apresentaram

seqüências satisfatórias para a realização da genotipagem e 2 amostras amplificaram,

mas não produziram seqüências com qualidade o suficiente para permitir a correta

identificação dos genótipos do HCV pelo programa HCV-BLAST (Tabela 3).

Tabela 3. Número de amostras amplificadas por nested-PCR e seqüenciadas automaticamente

para as regiões 5‟UTR e NS5B do HCV e número de seqüências usadas na genotipagem pelo programa

HCV-BLAST (Kuiken et al., 2005).

Região genômica

Amplificação e Seqüenciamento

Genotipagem

5’UTR

NS5B

Os genótipos e subtipos do HCV foram definidos de acordo com a similaridade

das seqüências analisadas por meio do programa HCV-BLAST (Karlin, e Altschul,

1990; Karlin, e Altschul, 1993), onde as mesmas são alinhadas com as seqüências do

HCV disponíveis no banco genômico do HCV - HCV Sequence Database no sítio

(http://hcv.lanl.gov) (Kuiken et al., 2005).

Trinta e uma amostras foram genotipadas para ambas as regiões genômicas

(Tabela 4). Dentre essas amostras o genótipo 1 apresentou prevalência de 81%,

seguido pelo genótipo 3 com 10% e genótipo 2 com 6% (Figura 8).

Tabela 4. Número de amostras e os respectivos genótipos do HCV encontrados por meio

da análise da homologia das seqüências das regiões 5‟UTR e NS5B do HCV no programa HCV-BLAST

(Kuiken et al., 2005).

Genótipo HCV

5’UTR

NS5B

TOTAL

A concordância obtida entre os resultados de genotipagem para as regiões

genômicas de 5‟UTR e NS5B do HCV foi de 97%, com 30 das 31 amostras

apresentando subtipos concordantes para ambas as regiões genômicas (Tabela 5).

Tabela 5. Número de amostras e os respectivos subtipos do HCV encontrados para as

regiões 5‟UTR e NS5B do HCV por meio da análise da homologia das seqüências no programa HCV-

BLAST (Kuiken et al., 2005).

Subtipo HCV

5’UTR

NS5B

1a/1b

4c/4d

Total

Sendo assim, 77% foram classificadas como subtipo 1a, 3% como subtipo 1b,

10% como subtipo 3a, e 6% como subtipo 2b (Figura 8). Todas as amostras 2b

tiveram seus genótipos confirmados por clonagem, purificação e seqüenciamento.

Figura 8. Gráficos com prevalênica de genótipos e subtipos de HCV no DF. Porcentagem de

genótipos e subtipos do HCV obtidos por meio de seqüenciamento das regiões 5‟UTR e NS5B do HCV

nos indivíduos co-infectados com HIV-1/HCV analisados no presente estudo.

Uma amostra (3%), entre as 31, apresentou divergência de genótipo encontrado

na análise das duas regiões genômicas, caracterizando-se subtipo 3a quando foi

analisada a seqüência de NS5, e subtipos 1a e 1b quando foi analisada a seqüência de

5‟UTR. Sendo assim, a concordância dos resultados de genotipagem realizados para

as regiões genômicas 5‟UTR e NS5B do HCV foi de 97% entre os genótipos

encontrados para o HCV, mas obteve 90% de concordância quando a análise verificou

o subtipo da amostra (Tabela 6).

Tabela 6. Concordância na genotipagem do HCV por meio de comparação da análise das

seqüências das regiões genômicas 5‟UTR e NS5B de amostras de indivíduos co-infectados com HIV-

1/HCV do presente estudo.

n=3

Concordância entre resultados de genotipagem com as regiões 5’UTR

e NS5B

Genótipo

97%

Subtipo

90%

Para as 9 amostras que foram amplificadas e genotipadas apenas para a região

5‟UTR os resultados de genotipagem encontrados são apresentados na tabela 7 a

seguir. Dessas destaca-se uma amostra cuja seqüência apresentou similaridade com

os subtipos 4c e 4d do HCV. Esse resultado de genotipagem foi confirmado por meio

da análise de hibridização do produto da PCR (INNO-LiPA, Innogenetics) no

LACEN-DF.

Tabela 7. Amostras genotipadas somente para a região 5’UTR do HCV por meio da análise

da homologia das seqüências no programa HCV-BLAST (Kuiken et al., 2005).

Amostra

Resultado da Genotipagem para 5’UTR

4c/4d

1a/1b

4.3.2 Análise Filogenética

A análise filogenética foi realizada utilizando-se o programa PHYLIP

(Felsenstein, 1981), para as seqüências obtidas com o mínimo de 198 nucleotídeos

para as regiões de 5‟UTR e 208 para NS5B. Desse modo, 38 amostras caracterizadas

para 5‟UTR foram utilizadas na análise filogenética juntamente com as seqüências

referência dos subtipos 1a (>1a.GB.Glasgow.AY885238_), 1b (>1b.DE.HCV-

AD78P1.AJ132997_), 3a (>3a._.CB.AF046866_), 2b (>2b.JP.HC-J7.D10077_) e

seqüências provenientes do banco genômico 4c (número de acesso: AY766511) e 4d

(AY766523). Como grupo externo, utilizou-se a seqüência referência do genótipo 2e

(>2e.ID.JK020.D49745_) (Figura 9).

Para a análise filogenética de NS5B foram usadas 27 amostras mais as

seqüências referência dos subtipos 1a (>1a._.H77.NC_004102_), 1b (>1b.CN.HCV-

S.AY460204_), 3a (>3a.DE.HCVCENS1.X76918_) e 2b (>2b.JP.HC-J8.D10988_)

tendo como grupo externo a seqüência referência do genótipo 5a

(>5a._.FR741.D50466_) (Figura 10).

Figura 9. Análise filogenética da região 5’UTR do HCV em amostras de co-infectados

com HIV-1. Árvore de máxima verossimilhança enraizada com HCV 2e como grupo externo. Os

valores nos ramos correspondem aos valores de bootstrap calculados pelo método neighbor joinning

com fator de correção de 2 parâmetros de Kimura em 1000 réplicas. São mostrados valores de

bootstrap acima de 70%. O valor da barra de escala no canto esquerdo inferior de cada figura

representa a distância genética em substituições por nucleotídeo do fragmento analisado. As setas

vermelhas indicam os subtipos de referência.

0.1

2e 5'UTR

2b 5'UTR

3a 5'UTR

4c 5'UTR

4d 5'UTR

1b 5'UTR

1a 5'UTR

94%

100%

77%

70%

Figura 10. Análise filogenética da região NS5B do HCV em amostras de co-infectados

com HIV-1. Árvore de máxima verossimilhança enraizada com HCV 5a como grupo externo. Os

valores nos ramos correspondem aos valores de bootstrap calculados pelo método neighbor joinning

com fator de correção de 2 parâmetros de Kimura em 1000 réplicas. São mostrados valores de

bootstrap acima de 70%. O valor da barra de escala no canto esquerdo inferior de cada figura

representa a distância genética em substituições por nucleotídeo do fragmento analisado. As setas

vermelhas indicam os subtipos de referência.

0.1

5a NS5B

1a NS5B

1b NS5B

3a NS5B

2b NS5B

100%

87%

100%

Como pode ser observado nas figuras 9 e 10, todas as amostras agruparam com

as seqüências de referência dos genótipos correspondentes, com um valor mínimo de

bootstrap de 70% na árvore de 5‟UTR e de 87% na árvore de NS5B. Também pode ser

observado que em ambas as árvores as amostras não formaram subgrupos distintos

evidenciando uma transmissão que não possui a mesma origem. Além disso, todos os

isolados de referência do mesmo genótipo formaram grupos bem caracterizados, com

valores de bootstrap acima de 70%, evidenciando a confiabilidade da análise.

A confirmação dos genótipos para cada região genômica foi baseada nos

agrupamentos observados na análise filogenética com um valor de bootstrap igual ou

superior a 70%. A análise em conjunto dos genótipos detectados por meio da análise

das seqüências pelo programa HCV-BLAST (Kuiken et al., 2005) das regiões

genômicas de 5‟UTR e NS5B, bem como a análise filogenética, permitiu a

classificação em genótipos para todas as 40 amostras e em subtipos para 38

amostras. Assim, as amostras 17, 21 e 47, que apresentaram genótipos ou subtipos

divergentes na análise das seqüências pelo programa HCV-BLAST (Kuiken et al.,

2005) foram, finalmente, classificadas de acordo com os agrupamentos observados

nas árvores. O subtipo não pode ser definido para as amostras 37 e 45, pois as

mesmas não tiveram a seqüência de NS5B analisada devido à baixa carga viral e à

ausência de conservação dessa região, impossibilitando a amplificação para essa

região. Além disso, a análise filogenética de 5‟UTR não permitiu a distinção entre os

subtipos, pois não houve formação de aglomerado com valor de bootstrap

significativo separando os subtipos 1a de 1b e 4c de 4d (Figura 9). Os resultados

obtidos pela análise de similaridade e confirmados pela análise filogenética estão

sumarizados na Tabela 8. Algumas amostras puderam também ter seus genótipos e

subtipos determinados pela técnica de hibridização Inno-LiPA HCV II (Innogenetics)

realizada no LACEN-DF (dados apresentados na Tabela 8) (Stuyver et al., 1996).

Tabela 8. Genótipo das amostras de co-infectados com HIV-1/HCV de acordo com os

resultados obtidos por meio da análise da homologia das seqüências de 5‟UTR e NS5B no programa

HCV-BLAST (Kuiken et al., 2005) confirmadas pela análise filogenética no programa PHYLIP

(Felsenstein, 1981) e pela técnica da Inno-LIPA HCV II (Innogenetics) (Stuyver et al., 1996). Em

vermelho as amostras discordantes ou com subtipo indefinido pela análise do programa HCV-BLAST

(Kuiken et al., 2005).

Amostra

N=40

Genótipo

e Subtipo

HCV-

BLAST

5’UTR

Genótipo

Análise

Filogenética

5’UTR

Genótipo

e Subtipo

HCV-

BLAST

NS5B

Genótipo e

Subtipo

Análise

Filogenética

NS5B

Genótipo e

Subtipo

Consenso

dos

Resultados

Genótipo

e Subtipo

InnoLiPA

HCV II

1a/1b

4c/4d

1a/1b

Total

5. DISCUSSÃO

5.1 A prevalência do HCV em HIV-1 soropositivos

A co-infecção HIV-1/HCV atinge mais de um terço dos pacientes infectados com

HIV no mundo. Estima-se que nos EUA a prevalência da co-infecção HCV/HIV-1

esteja entre 15% e 30%, enquanto que entre os usuários de drogas injetáveis, estes

valores chegam a 90%. No continente europeu a co-infecção HIV-1/HCV apresentou

prevalência de 33% entre os indivíduos infectados com HIV-1 (Rockstroh et al.,

2005).

No Brasil, a elevada soroprevalência de HCV na população de pacientes HIV-1

soropositivos supera a registrada para populações como a de doadores de sangue ou

população em geral (Fainboim et al., 1999). Em muitos países da América, inclusive

no Brasil, diferenças na distribuição dos casos de HIV-1 soropositivos, de acordo com

a categoria de exposição, foram observadas na década passada quando comparada

com os anos 80. Inicialmente, no Brasil, a epidemia afetou principalmente

homossexuais ou bissexuais do sexo masculino, hemofílicos e outros que recebiam

derivados de sangue. Entretanto, com o passar dos anos, houve um aumento na

infecção pelo HIV-1 entre usuários de drogas intravenosas e heterossexuais

(Fainboim et al., 1999). O uso de drogas intravenosas é responsável por cerca de 20%

dos casos acumulados de AIDS no Brasil (Soto et al., 1997). Treitinger et al. (2000)

estudaram a soroprevalência do HCV em 93 pacientes HIV-1 soropositivos em Santa

Catarina e encontraram 88,2% de prevalência do HCV entre 34 usuários de drogas

intravenosas.

Em um estudo realizado com 232 pacientes anti-HIV soropositivos cerca de

54% foram considerados também anti-HCV soropositivos (Pavan et al., 2003). Em

um estudo retrospectivo com 2.821 pacientes com AIDS do Brasil, onde 29,5% foram

testados para sorologia, a prevalência do anti-HCV foi de 33% (Marins et al., 2005). A

prevalência do HCV em pacientes HIV-1 soropositivos tratados nos serviços de saúde

em estudo realizado em Belém, região Norte do Brasil, foi de 16% (Monteiro e

Nascimento, 2004) e na cidade de Santos, região Sudeste, 36,2% (Segurado et al.,

2004). Na cidade de São Paulo (região Sudeste) entre 1.457 pacientes HIV-1

soropositivos analisados, 17,7% eram soropositivos para o HCV (Mendes-Corrêa et

al., 2000).

Na cidade de Goiânia (região Centro-Oeste) (n = 592), Pereira et al. (2006)

encontraram uma prevalência do HCV em 42% dos indivíduos HIV-1 soropositivos. A

prevalência da co-infecção HIV-1/HCV no Distrito Federal e Entorno ainda não foi

estimada, tornando-se necessário a realização de estudos mais aprofundados. É

importante que se amplie o conhecimento epidemiológico da hepatite C em função do

tempo, da diversidade genética do HCV, das características da população e da região

geográfica afetada, com a identificação dos principais fatores de risco associados à

transmissão do HCV para que, no futuro, se ampliem as estratégias de detecção, de

prevenção e de controle da infecção.

A prevalência de anticorpos anti-HCV em indivíduos co-infectados com HIV-

1/HCV varia de acordo com os fatores de risco da co-infecção e com o teste sorológico

utilizado. Entre os hemofílicos HIV-1 soropositivos, a prevalência de anticorpos anti-

HCV varia entre 60% a 90% (Navarro et al., 2005). E ainda, a prevalência de anti-

HCV pode ser subestimada devido às flutuações de anticorpos anti-HCV em pacientes

soropositivos para o HIV-1, conforme foi observado em um estudo no qual 18 de 52

pacientes HIV-1 soropositivos e anti-HCV não reagentes apresentaram RNA-HCV

positivo (Mendes-Corrêa et al., 2001). No entanto, os testes para detecção de

anticorpos anti-HCV são úteis para diagnosticar a exposição ao vírus, mas não

evidenciam a viremia ativa (Majid e Gretch, 2002). Além disso, a presença de

anticorpos anti-HCV não determina o estágio da infecção em que o indivíduo se

encontra (Carvalho, 1999; Amorim, 2003).

No presente estudo, dentre as amostras de co-infectados analisadas, 5 amostras

não tiveram o material genético amplificado para a região 5‟UTR e 12 amostras não

foram amplificadas para NS5B. A maioria dessas amostras anti-HCV positivas

(10/12) apresentou níveis indetectáveis de carga viral nos testes quantitativos do HCV

realizados no LACEN-DF. Na situação onde o teste anti-HCV é positivo e o PCR

negativo, pode-se considerar algumas possibilidades como infecção crônica com os

níveis de RNA flutuantes, eliminação viral espontânea ou supressão da infecção por

meio de tratamento (Erensoy, 2001). E ainda, as amostras (2/12) que apresentaram

valores elevados de carga viral, possivelmente não tiveram seu material genético

amplificado pela PCR devido às limitações da técnica que envolve, por exemplo, a

escolha dos iniciadores e a conservação da região genômica utilizada (Zein, 2000).

Corroborando os resultados encontrados neste estudo, a região NS5B não apresenta a

mesma conservação encontrada na região 5‟UTR (Majid e Gretch, 2002).

5.2 Os genótipos do HCV

A determinação do genótipo do HCV é um parâmetro para o prognóstico da

resposta ao tratamento antiviral uma vez que o genótipo 1 está associado a uma

menor resposta virológica sustentada (40-45%) quando comparado com os genótipos

2 e 3, cuja resposta virológica sustentada é de 70-80% na terapia combinada de

interferon com ribavirina. Além disso, a genotipagem é importante

epidemiologicamente, pois os seis genótipos apresentam distribuição geográfica

distinta. Embora os genótipos 1, 2 e 3 apresentem uma distribuição mundial, sua

relativa prevalência varia de uma área geográfica pra outra. O genótipo 4 do HCV, por

exemplo, é encontrado no Oriente Médio e Norte da África, e os genótipos 5 e 6 no

Sul da África e Ásia, respectivamente (Simmonds et al., 2005).

No Brasil, um país de dimensões continentais, estudos realizados na população

de doadores de sangue retratam a diversidade genotípica do HCV. Na região Centro-

Oeste do país, em um estudo realizado em Goiânia (n = 42), o subtipo 1a foi o mais

prevalente (50%), seguido dos subtipos 3a (30,9%) e 1b (16,7%). Outro estudo,

realizado no Mato Grosso (n = 44), entretanto, encontrou que o subtipo 1b (29,5%)

foi mais freqüente que o subtipo 3a (25%). No Mato Grosso do Sul (n = 38), subtipos

1a e 1b foram igualmente detectados (36,8%), seguidos pelo subtipo 3a (21,1%). O

subtipo 2b raramente foi encontrado nesses estudos, com valores de 2,4%, 4,5% e

5,3%, respectivamente (Martins et al., 2006). No Distrito Federal (n = 41), Amorim

(2003) encontrou que o genótipo 1 foi o mais prevalente (60,9%) na população de

doadores de sangue, seguido pelo genótipo 3 (39,1%) sendo o subtipo 3a (39%) mais

freqüente que os subtipos 1a (34,1%) e 1b (26,8%).

Estudos sobre a prevalência de genótipos do HCV na população de indivíduos

co-infectados com HIV-1 e HCV são escassos no Brasil. Em um estudo realizado em

indivíduos co-infectados do noroeste de São Paulo e do Mato Grosso do Sul (n = 35)

77% dos HCVs foram caracterizados como genótipo 1 e os demais como genótipo 3

(Aguiar et al., 2005). Em Goiânia (Centro-Oeste) Pereira et al. (2006) demonstraram

que o subtipo 3a foi encontrado em 86% das amostras, seguido de 14% do subtipo 1a.

No presente estudo sobre a caracterização molecular em indivíduos co-

infectados HCV/HIV-1, a prevalência dos genótipos na população de indivíduos co-

infectados foi determinada por meio de seqüenciamento das regiões genômicas

5‟UTR e NS5B do HCV e confirmada por meio de análise filogenética dessas regiões

genômicas. O genótipo do HCV mais prevalente nas amostras de indivíduos com co-

infecção HIV-1/HCV foi o genótipo 1 com 81%, seguido dos genótipos 3 (10%), 2 (6%)

e 4 (3%). Os genótipos 2 e 4, raros no Brasil (Martins et al., 2006), foram descritos

aqui pela primeira vez na população HCV positiva do Distrito Federal mono ou co-

infectada com outros vírus.

Trabalhos demonstram que quando diferentes regiões do genoma, como 5‟UTR,

core, NS3 e NS5 são seqüenciadas, os resultados dos genótipos são concordantes

(Zein, 2000; Majid e Gretch, 2002). A concordância entre os resultados de

genotipagem encontrados neste estudo e feito para as regiões 5‟UTR e NS5B foi de

97% para os genótipos e 90% para os subtipos, resultado corroborado por outros

trabalhos da literatura (Zein, 2000; Majid e Gretch, 2002). A concordância

apresentada para a determinação dos subtipos (90%) foi menor porque a análise de

diferentes regiões do genoma pode resultar em diferentes subtipos (Arens, 2001) e,

além disso, em 5% a 10% das amostras cujos subtipos são determinados por meio da

seqüência da região 5‟UTR o método não consegue distinguir os subtipos 1a do 1b

(Erensoy, 2001).

O seqüenciamento de 5‟UTR fornece uma efetiva discriminação dos principais

genótipos, embora apresente limitações na distinção entre alguns subtipos (Germer

et al., 1999; Halfon et al., 2001b), sendo indicado o seqüenciamento de outras regiões

genômicas para uma melhor exatidão na determinação dos subtipos (Robertson et al,

1998). Outros estudos analisando diferentes regiões genômicas do HCV precisam ser

conduzidos para permitir um melhor entendimento da dinâmica da infecção do HCV

no Brasil, uma vez que a maioria dos dados disponíveis é proveniente da análise de

5‟UTR e, geralmente, não classificam os isolados virais até o nível de subtipo devido

às conhecidas limitações do uso de 5‟UTR.

No presente estudo, duas amostras (2/31) tiveram seus resultados limitados na

determinação do subtipo na análise da região 5‟UTR porque em alguns isolados,

apenas uma ou duas mudanças nucleotídicas distinguem os subtipos como, por

exemplo, a substituição na posição -99 da adenina pela guanina entre os subtipos 1a e

1b. No entanto, tem sido demonstrado que a classificação do HCV em nível de

genótipo é suficiente para o prognóstico clínico e terapêutico (Campiotto et al.,

2005).

A prevalência dos genótipos e subtipos encontrada neste estudo está de acordo

com os resultados de outros estudos de caracterização molecular do HCV circulante

na população de doadores de sangue da região do Centro-Oeste (Martins et al., 1998;

Amorim, 2003), onde existe maior prevalência do genótipo 1, o que tem importância

epidemiológica e clínica, sendo útil no prognóstico e no tratamento da infecção (Zein

et al, 2002; Hoofnagle, 2002).

A falta de concordância entre os subtipos encontrados em 10% das amostras

sugere que os métodos de genotipagem que visam à obtenção de maior distinção

entre os variantes do HCV por meio da amplificação pela nested-PCR e

seqüenciamento de uma única região genômica não asseguram a definição exata do

subtipo, embora os resultados do presente estudo indiquem que, na maioria dos

casos, existe uma alta concordância quando seqüências de 5‟UTR e NS5B são usadas

para definição apenas de genótipos do HCV.

A amostra 7 foi caracterizada como genótipo 1 pela análise de similaridade de

seqüências do banco genômico do HCV e análise filogenética para a região 5‟UTR e

como genótipo 3 para a região NS5B. Uma das possíveis explicações seria a infecção

mista por mais de um genótipo, apesar de raros, casos de co-infecção com mais de

um genótipo do HCV já foram documentados (Swan e Raymond, 2004). Além disto,

como se trata de um paciente com provável comportamento de risco, uma vez que

apresenta co-infecção com HIV-1/HCV este paciente pode ter sido exposto a mais de

um genótipo de HCV.

5.3 A Diversidade Genética do HCV e a Co-infecção com o HIV-1

O estudo da diversidade viral fornece um melhor entendimento sobre a origem e

dinâmica da infecção viral. Pybus et al. (2001) encontraram diferença significativa de

comportamento entre os diferentes genótipos do HCV ao observarem que os

genótipos 1 e 3 se espalharam antes dos métodos de triagem de doação de sangue

serem adotados, enquanto que infecções com genótipos 4 e 6 seguiram o padrão das

doenças adquiridas por uma ampla variedade de rotas domésticas e sociais não

definidas.

Identificar o genótipo do HCV é clinicamente importante porque pode predizer

a resposta à terapia antiviral, sendo o genótipo 1 associado à maior resistência ao

tratamento. Entretanto, não existe consenso se a diferença na gravidade clínica e

histológica da doença pode ser explicada pelas diferenças entre os genótipos

infectantes. Estudos sugerem que o genótipo 1b esteja associado a uma maior

gravidade da doença embora esses resultados apresentem divergência com outros

estudos que relataram pouca ou nenhuma influência do genótipo na progressão da

doença (Harris et al., 2006).

Estudos que analisam o papel dos genótipos do HCV na eliminação viral

espontânea também apresentam resultados controversos. Alguns estudos não

encontram associação entre o genótipo do vírus e a eliminação do RNA-HCV, com

fatores do hospedeiro, como o sexo do paciente, sendo mais importantes, enquanto

que alguns estudos têm sugerido que a infecção com subtipo 1b pode ter menor

capacidade de ser eliminada espontaneamente quando comparada com a infecção

causada por outros genótipos (Campiotto, 2005; Harris et al., 2006).

Após a introdução da terapia antiretroviral a infecção do HCV tem sido

considerada a principal causa de morbidade e mortalidade entre indivíduos co-

infectados com HIV-1. Indivíduos co-infectados apresentam uma morbidade mais

elevada do que indivíduos mono-infectados com HIV-1, e a infecção pelo HCV é

considerada um prognóstico para mortalidade (Rockstroh et al., 2005).

Alguns estudos sugerem que a viremia do HCV é maior em pacientes HIV-1 positivos

quando comparado com pacientes não co-infectados com HIV-1 (Hall et al., 2004).

Um estudo realizado em São Paulo com 1457 pacientes HIV-1 soropositivos

demonstrou que 17,7% eram anti-HCV positivos e, destes, 98% eram positivos

também para RNA-HCV (Mendes-Corrêa e Barone, 2000). Ainda com relação à co-

infecção HIV-1/HCV, foi observado por alguns autores que a resposta à HAART sofre

influência do HCV, com resultados inferiores, sobretudo da contagem de células CD4,

quando comparados com o que ocorre nos pacientes sem co-infecção (Swan e

Raymond, 2004; Rockstroh et al., 2005).

O tratamento da infecção pelo HCV torna-se importante para alcançar maior

sobrevida e melhor qualidade de vida dos indivíduos co-infectados (Zocratto et al.,

2006). A co-infecção com HIV-1/HCV representa um maior risco de progressão para

a doença crônica do fígado do que a infecção apenas com HCV (Swan e Raymond,

2004). A elevação da hepatotoxicidade foi relatada em pacientes co-infectados devido

ao uso de drogas inibidoras de protease (Mendes-Corrêa e Barone, 2000).

O genótipo do HCV é o principal determinante na resposta ao tratamento da

hepatite C crônica. Apesar dos dados relativos às taxas de resposta na infecção com o

genótipo 4 do HCV serem limitados e controversos, um grande estudo realizado com

amostras da França e do Egito infectadas com genótipo 4 observou que pacientes

infectados com o subtipo 4a respondem melhor ao tratamento do que aqueles

infectados com subtipo 4d. Observou-se ainda que, assim como ocorre com a infecção

do genótipo 1 do HCV, uma baixa carga viral do genótipo 4 antes do tratamento tem

significativa associação com melhor resposta ao tratamento. De acordo com o estudo,

o subtipo do HCV influencia a resposta ao tratamento em pacientes infectados com

HCV 4 (Roulot et al., 2007).

Entre os genótipos do HCV, o genótipo 3 tem sido associado à elevação do nível

de transaminases durante a HAART, exercendo um papel mais expressivo do que as

drogas na hepatotoxicidade. No estudo de Mendes-Corrêa e Barone (2000), relativo a

pacientes infectados com genótipo 3 atendidos na cidade de São Paulo, 89,2%

apresentavam níveis de ALT muito elevados, mas ainda não está claro se o HCV

genótipo 3 pode representar um fator de risco adicional na elevação das

transaminases durante a HAART (Torti et al., 2006).

O efeito da HAART na carga viral do HCV ainda é controverso. Muitos estudos

demonstraram nenhuma mudança nos títulos do RNA-HCV com o uso da HAART

(Rockstroh et al., 1998; Torre et al., 2001) enquanto que em outros estudos houve um

aumento transiente (Rutschman et al, 1998; Puoti et al., 2000) ou sustentado (Ragni

et al., 1999) na carga do HCV e, ainda, outros estudos demonstraram uma diminuição

nos níveis de RNA-HCV e, em alguns casos, o clareamento do HCV (Swan e

Raymond, 2004). O aumento da carga viral do HCV associado ao longo tratamento

da HAART pode não ser um fator prognóstico da gravidade da doença causada pelo

HCV ou pelo HIV-1, mas pode ser importante para predizer a resposta à terapia com

interferon (Babik e Holodniy, 2003).

No presente estudo, as análises das seqüências por meio do programa

HCV_BLAST (Kuiken et al., 2005) e análise filogenética definiram os genótipos e os

subtipos das amostras de HCV circulantes em indivíduos co-infectados com HIV-

1/HCV no Distrito Federal. Como pôde ser observado nas figuras 9 e 10, as amostras

se agruparam junto aos isolados referência dos genótipos 1, 2, 3 e 4 com valores de

bootstrap superiores a 87% para NS5B e 70% para 5‟UTR validando essas

informações. Não foi possível a distinção entre os subtipos 1a e 1b pela análise

filogenética da região 5‟UTR, pois as seqüências desses subtipos apresentam grande

similaridade, e assim as amostras de genótipo 1 se agruparam aleatoriamente, sem a

formação de aglomerados distintos de subtipos 1a e 1b. A presença de genótipos 1, 2,

3 e 4 do HCV na população de co-infectados com HIV-1-HCV merece ser investigada

mais profundamente, pois esses genótipos têm importância na predição da resposta

ao tratamento antiviral.

6. CONCLUSÕES

 A prevalência do Genótipo 1 (81%) do HCV na população de co-infectados

atendidos no DF e Entorno foi significativamente maior do que a dos

genótipos 2, 3 e 4 juntos (19%);

 A prevalência do subtipo 1a (77%) do HCV foi significativamente maior do que

a dos outros subtipos juntos (23%);

 A concordância entre a genotipagem realizada para as regiões de 5‟UTR e

NS5B foi de 100% na caracterização dos genótipos e 93% na caracterização dos

subtipos;

 A análise filogenética das seqüências se mostrou uma importante ferramenta

para genotipagem, uma vez que permitiu confirmar os resultados da

genotipagem e definir, com base nos agrupamentos da árvore de NS5B,

aqueles subtipos que não puderam ser definidos por meio da genotipagem de

5‟UTR;

 Os dados obtidos por este trabalho estão de acordo com aqueles obtidos em

estudos realizados com outras populações mono-infectadas com HCV da

região Centro-Oeste.

7. PERSPECTIVAS

O presente trabalho é um estudo de série histórica de amostras de indivíduos

co-infectados por HIV-1/HCV atendidos pelo sistema de saúde pública do Distrito

Federal e Entorno, que teve como principal objetivo caracterizar molecularmente os

genótipos e subtipos e suas respectivas prevalências nesta região geográfica do Brasil.

Nesse contexto, deve-se ressaltar a importância de se conhecer por meio de

mais estudos a prevalência da população de indivíduos co-infectados por HVI-1/HCV

na população de indivíduos HIV-1 soropositivos e na população de HCV soropositivos

do Distrito Federal e Entorno, visto a escassez de dados que afeta essa região do país.

Com isso, juntamente com os dados gerados por meio dessa avaliação de série

histórica será possível obter um melhor perfil epidemiológico da população de co-

infectados por HIV-1/HCV.

Mais análises são necessárias para se obter um perfil da infecção do HCV nos

indivíduos do Distrito Federal e Entorno co-infectados por HIV-1/HCV que

possibilitem gerar dados que contribuirão para as análises da história evolutiva do

HCV nessa região e que permitirão comparar com os dados obtidos em outras regiões

do país contribuindo, possivelmente, para um melhor entendimento da epidemia de

HCV no Brasil.

Em conclusão, a necessidade de uma cuidadosa avaliação epidemiológica no

Brasil nos diferentes grupos populacionais é reforçada pelo fato do conhecimento da

freqüência e distribuição dos genótipos poderem fornecer informações fundamentais

para o entendimento da dispersão do HCV bem como fornecer subsídios para

direcionamentos do tratamento. E ainda, esses dados podem ajudar profissionais da

saúde a tratarem melhor os pacientes infectados com HIV-1 e reforçam a necessidade

de programas de prevenção da transmissão do HIV-1.

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