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VANESSA SILVA RETUCI
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS CULTIVARES DE FEIJOEIRO
COMUM POR MEIO DE MARCADORES RAPD, ISSR E 5S-NTS
MARINGÁ
PARANÁ – BRASIL
FEVEREIRO – 2007
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VANESSA SILVA RETUCI
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS CULTIVARES DE FEIJOEIRO
COMUM POR MEIO DE MARCADORES RAPD, ISSR E 5S-NTS
Tese apresentada à Universidade
Estadual de Maringá, como parte das
exigências do Programa de Pós-
graduação em Agronomia, área de
concentração: Melhoramento Genético
Vegetal, para obtenção do título de
Doutor.
MARINGÁ
PARANÁ
– BRASIL
FEVEREIRO
– 2007
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ii
Dedico este trabalho...
A Deus - Criador, que permitiu
saúde, coragem e
sabedoria para eu tornar realidade
este trabalho.
Ao meu filhote, João Paulo, aos meus pais:
Francisco e Ivana, e, ao meu esposo Lucas
pelo amor, entendimento e alegria nas
horas difíceis.
iii
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual de Maringá, pelas instalações e suporte para
o desenvolvimento e execução deste trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico –
CNPq, à Fundação Nacional de Desenvolvimento do Ensino Superior Particular
– FUNADESP e à Faculdade Integrado de Campo Mourão, pelo suporte
financeiro para a realização deste trabalho.
Aos Professores orientadores e amigos, Alberto José Prioli e Carlos
Alberto Scapim.
Aos professores conselheiros - Sônia Maria Alves Pinto Prioli, Maria
Celeste Gonçalves Vidigal e Pedro Soares Vidigal Filho, pela amizade, pelos
ensinamentos e dedicação.
Ao meu filho, João Paulo Retuci Silvério, no qual encontro força e
alegria para as minhas realizações.
Aos meus pais, Francisco Retucci Netto e Ivana Maria da Silva Retuci,
e ao meu companheiro, Lucas Silvério, pelo amor, amizade e compreensão nos
momentos difíceis.
Aos técnicos do Laboratório de Biologia Celular, Maria José e Donizete
e às amigas do Núcleo de Pesquisas Aplicada a Agricultura – NUPAGRI, Vera
e Gisele, pela contribuição nas rotinas laboratoriais.
À Érica e ao Rui, funcionários da Secretaria do Programa de Pós-
graduação em Agronomia, que sempre me atenderam com respeito e amizade,
ajudando na resolução dos procedimentos administrativos.
À amiga, Professora Carmem Lúcia M. S. C. Rocha, pelas palavras
carinhosas nos momentos difíceis e pelos ensinamentos.
Aos colegas de laboratório e da pós-graduação, que me
acompanharam durante a caminhada, proporcionando momentos
inesquecíveis.
A todos que de alguma forma contribu
íram para o desenvolvimento
deste trabalho, agradeço.
iv
BIOGRAFIA
VANESSA SILVA RETUCI, filha de Francisco Retucci Neto e Ivana
Maria da Silva Retuci, nasceu em Maringá-PR, no dia sete de agosto de 1975.
Diplomou-se em Ciências Biológicas, habilitações Licenciatura e
Bacharelado, no ano de 1998, pela Universidade Estadual de Maringá.
No mês de março de 2001, iniciou na pós-graduação - Mestrado, área
de concentração: Melhoramento Genético Vegetal, no Programa de Pós-
graduação em Agronomia da Universidade Estadual de Maringá.
Em 2003, matriculou-se no Programa de Pós-graduação em
Agronomia, em nível de Doutorado, na Universidade Estadual de Maringá,
realizando estudos na área de concentração: Melhoramento Genético Vegetal
v
ÍNDICE
LISTA DE TABELAS.........................................................................................vi
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................vii
RESUMO ........................................................................................................ viii
ABSTRACT .......................................................................................................x
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................... 3
2.1 Feijoeiro Comum – Origem, Morfologia e Valor Nutricional .............. 3
2.2 Marcadores Moleculares ....................................................................... 8
2.2.1 Marcadores Moleculares RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) .....9
2.2.2 Marcadores Moleculares ISSR (Inter Simple Sequence Repeats)....10
2.2.3 Marcadores Moleculares 5S-NTS (5S Non-Transcribed Region) ....11
2.3 Variabilidade Genética em Feijoeiro Comum por meio de Marcadores
Moleculares ..........................................................................................12
3 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................20
3.1 Cultivares de Phaseolus vulgaris L. ....................................................20
3.2 Metodologia ..........................................................................................22
3.2.1 Extração do DNA ..........................................................................22
3.2.2 Quantificação do DNA genômico total...........................................23
3.2.3 Amplificações pelos marcadores RAPD ........................................23
3.2.4 Amplificações pelos marcadores ISSR..........................................24
3.2.5 Amplificação pelos marcadores 5S rDNA .....................................25
3.3 Análises dos dados obtidos por meio dos Marcadores RAPD .........26
3.3.1 Coeficiente de Similaridade de Jaccard ........................................26
3.3.2 Diferenciação de Cultivares pelo Teste de Mantel ........................27
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................28
5 CONCLUSÕES..............................................................................................38
REFERÊNCIAS ...............................................................................................39
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Cultivares de feijão (Phaseolus vulgaris
L.) pertencentes aos
conjuntos gênicos Mesoamericano e Andino ...............................
20
Tabela 2 “Primers” RAPD selecionados dos kits Operon
A, F, I, K, N, Y,
W e X, utilizados na comparação de cultivares de feijão
pertencentes aos “pools” gênicos Mesoamericano e Andino ......
28
Tabela 3 Compl
emento do coeficiente de similaridade de Jaccard entre
os pares de cultivares* de feijão ..................................................
30
Tabela 4
Matriz das ligações entre cultivares de feijão, formando dois
grupos em função da origem Mesoamericana e Andina ..............
33
Tabela 5 Relação dos “primers” RAPD que produziram Bandas-
Diagnóstico e seus respectivos comprimentos aproximados ......
33
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Localização dos Centros de Origem de Phaseolus vulgaris
L. e
dist
ribuição geográfica dos acessos selvagem (círculo fechado)
e cultivados (círculo aberto) (adaptado de CHACÓN et al
.,
2005).............................................................................................
5
Figura 2 Grãos de Feijão (Phaseolus vulgaris
L.) de cultivares
pertencentes ao Grupo Mesoamericano (1) e ao Grupo
Andino
(2). Cultivares: (1) PI 207262; (2) MSU-7; (3) FT-Soberano; (4)
Ouro Negro; (5) BAT 93; (6) AND-277; (7) Jalo Pintado; (8)
Kaboon; (9) Perry Marrow; (10) Michigan Dark Red Kidney.........
21
Figura 3
Dendrograma obtido com os marcadores RAPD para as dez
cultivares de feijões de origem Mesoamericano e Andino,
baseado na distância de Jaccard, método de agrupamento
UPGMA, com valores de “bootstrap” gerados por 10.000
reamostragens .............................................................................
29
Figura 4
Diagrama de dispersão em coordenadas principais obtido com
marcadores RAPD baseado em matriz de distância genética de
Jaccard entre cultivares de
feijões dos conjuntos gênicos:
Mesoamericano e Andino .............................................................
32
Figura 5 “Primers” RAPD e respectivas Bandas-Diagnóstico. (A) OPF-
10;
(B) OPI-07; (C) OPK-04; e (D) OPW-16 ......................................
34
Figura 6 “Primers” ISSR, (A) (GGAC)
3
T e (B) (TAGG)
4
e suas
respectivas bandas-diagnóstico ...................................................
36
Figura 7 Amplificação com o “primer” 5S-NTS. (A)
Imagem negativa,
com a identificação dos genótipos. (B)
Imagem original,
visualizada com transluminador UV .............................................
37
viii
RESUMO
RETUCI, Vanessa Silva, DS., Universidade Estadual de Maringá, fevereiro de
2007. Caracterização molecular das cultivares de feijoeiro comum por
meio de marcadores RAPD, ISSR e 5S-NTS. Orientador: Dr. Carlos Alberto
Scapim; Co-orientadores: Alberto José Prioli e Maria Celeste Gonçalves
Vidigal.
O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.), um dos principais constituintes da
alimentação humana, possui componentes essenciais à saúde, destacando-se
pelos altos teores protéicos. Do ponto de vista molecular, essa cultura, ainda
permite muitas investigações, e os marcadores moleculares, baseados em
DNA, são promissores, contribuindo desde a fase do pré-melhoramento até a
fase do pós-melhoramento, reduzindo o tempo para se obter uma cultivar
melhorada. No presente trabalho, propõe-se a utilização de marcadores
moleculares RAPD e ISSR, a fim de avaliar a distância genética dentro e entre
genótipos de feijoeiro comum de diferentes centros de origem e também
verificar os marcadores moleculares específicos para identificar e separar
feijões de acordo com o centro de origem - Mesoamericano e Andino. As
cultivares estudadas, PI207262, MSU-7, FT-Soberano, Ouro Negro, BAT93
(pertencentes ao conjunto gênico Mesoamericano) e AND-277, Jalo Pintado,
Kaboon, Perry Marrow e Michigan Dark Red Kidney (conjunto gênico Andino),
foram obtidas junto ao Banco de Germoplasma do Núcleo de Pesquisas
Aplicado a Agricultura (NUPAGRI) da Universidade Estadual de Maringá. Os
grãos foram plantados e após germinarem dos trifólios coletados, foi extraído o
DNA genômico. O DNA, após quantificado, foi diluído e submetido aos
processos de amplificação de segmentos pelas diferentes técnicas
moleculares. Para o marcador RAPD, 17 “primers” foram escolhidos, os quais
produziram 67 locos polimórficos e 19 monomórficos. Com os dados, foi
construída uma matriz binária e estimada a distância genética com o
coeficiente de similaridade de Jaccard. A amplitude das distâncias variou de
0,0143 entre as cultivares Michigan Dark Red Kidney e AND-277 (Andinos), até
0,60 para as cultivares, FT-Soberano (Mesoamericano) e AND-277 (Andino).
Os valores de “bootstrap” do dendrograma evidenciaram consistência na
ix
separação dos grupos pelo centro de origem, o que também foi confirmado
pela análise em coordenadas principais. O Teste de Mantel, com um
coeficiente de 0,8647 (P < 0,01), indicou correlação entre a matriz de distâncias
e a origem das cultivares. Para o marcador molecular ISSR, não foi possível
estimar valores de distâncias genéticas, pois não foi observado polimorfismo
suficiente. Os “primers” RAPD - OPF-10, OPI-07, OPK-04 e OPW-16 e os
“primers” ISSR - (GGAC)
3
T, (TAGG)
4
, amplificaram seqüências do DNA que
separaram por centro de origem as cultivares de feijoeiro comum, seqüências
denominadas de bandas-diagnóstico. O marcador 5S-NTS, que amplifica
regiões conservadas do genoma, também produziu bandas-diagnóstico para
identificação dos conjuntos gênicos: Mesoamericano e Andino.
Palavras-chave: feijoeiro comum, RAPD, ISSR, 5S-NTS, Mesoamericano,
Andino.
x
ABSTRACT
RETUCI, Vanessa Silva, DS., State University of Maringá, February 2008.
Molecular characterization of cultivars of the common bean by RAPD,
ISSR and 5S-NTS markers. Advisor: Dr. Carlos Alberto Scapim. Co-adviser:
Alberto Jose Prioli and Maria Celeste Gonçalves Vidigal.
The common bean (Phaseolus vulgaris L.), one of the main human staple food,
is provided with compounds essential for health and characterized by high
protein rates. From the molecular standpoint, bean culture may be the source of
numberless studies. DNA-based molecular markers are very promising from the
pre- to the post-improvement phase, with a time decrease for improved cultivar.
RAPD and ISSR molecular markers are deployed to evaluate the genetic
distance within and between genotypes of the common bean from different
centers of origin and to verify specific molecular markers to identify and
separate beans, Mesoamerican and Andine, according to their origin. Cultivars
under analysis PI207262, MSU-7, FT-Soberano, Ouro Negro, BAT93
(belonging to the Mesoamerican genetic set) and AND-277, Jalo Pintado,
Kaboon, Perry Marrow and Michigan Dark Red Kidney (Andine genetic set),
were obtained from the Germoplasm Bank of the Research Nucleus in
Agriculture (NUPAGRI) of the State University of Maringá. Genomic DNA was
extracted from the collected trifolium posterior to planting and germination of
grains. After quantification, DNA was diluted and underwent segment
amplification processes by several molecular techniques. Seventeen primers
were chosen for RAPD marker which produced 67 polymorphic and 19
monomorphic loci. Binary matrix was constructed from data and the genetic
distance estimated through Jaccard similarity coefficient. Distance amplitude
varied from 0.0143 between cultivars Michigan Dark Red Kidney and AND-277
(Andine) and 0.60 for cultivars FT-Soberano (Mesoamerican) and AND-277
(Andine). Dendrogram bootstrap rates showed consistency in the separation of
groups through center of origin. This fact was confirmed by principal coordinate
analysis. Mantel’s Test, coefficient 0.8647 (p < 0.01), showed a correlation
between distance matrix and cultivar origin. Estimates of genetic distances
xi
rates for ISSR molecular marker proved impossible since sufficient
polymorphism was not extant. Primers RAPD - OPF-10, OPI-07, OPK-04 and
OPW-16 and primers ISSR - (GGAC)
3
T, (TAGG)
4
, amplified DNA sequences,
called diagnostic bands, that separated common bean cultivars by center of
origin. 5S-NTS markers, which amplify the genome’s preserved regions, also
produced diagnostic bands for the identification of the Mesoamerican and
Andine genetic sets.
Key words: common bean; RAPD; ISSR; 5S-NTS; Mesoamerican; Andine.
1
1 INTRODUÇÃO
No Brasil, o feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) é indispensável na
dieta alimentar da população. Além de acessível economicamente, também é
constituído por: proteínas, carboidratos, vitaminas do complexo B, ferro, zinco,
magnésio e potássio, indispensáveis à saúde humana (CIAT, 2002).
O feijoeiro é uma leguminosa importante, cuja domesticação ocorreu
no Peru e no México e, portanto, tem origem no Novo Mundo. Os estudos de
faseolina, uma proteína existente no grão e; o tamanho das sementes tem
auxiliado na elucidação das rotas específicas de disseminação do gênero
Phaseolus, estabelecendo como centros de domesticação o Mesoamericano e
o Andino, e como centro secundário a Colômbia (GEPTS; DEBOUCK, 1991;
SINGH et al., 1991a, b).
É um grão cultivado, no território brasileiro, especialmente, entre os
pequenos agricultores (VIEIRA, 1967). Em decorrência da diversidade de
condições ambientais em que se explora essa cultura, é possível verificar a
ampla variabilidade genética existente no germoplasma nacional, variabilidade
essencial para o sucesso dos programas de melhoramento de praticamente
todos caracteres de importância econômica (RAMALHO et al., 1993). Alguns
autores concordam que a domesticação do feijoeiro tem resultado em
cultivares com hábito de crescimento compacto, precoces, com sincronismo de
maturação, aumento da área foliar, das vagens, e da produção de sementes
(SMARTT, 1978; SMARTT, 1988; GEPTS; DEBOUCK, 1991; BAYUELO-
JIMÉNEZ et al., 1994).
Diante da importância dessa cultura, os Programas de Melhoramento
Genético buscam por variedades promissoras, as quais atendam as
necessidades da população. Entretanto, sem deixar de levar em consideração
a importância da variabilidade genética, pesquisadores, focados no
conhecimento dos diferentes genótipos, trabalham a fim de obter caracteres de
interesse, tais como, a produtividade, a resistência, a estabilidade e a
adaptabilidade ao ambiente, e, a origem dos genótipos.
2
Assim sendo, nos últimos anos, a tecnologia do DNA recombinante,
concebida na década de 70, parece ter sido aquela que causou o maior
impacto nos meios científicos. É aplicada como método de alta resolução para
detectar e avaliar diferenças genéticas entre indivíduos, em relação ao DNA,
acelerando as avaliações a campo nos procedimentos de melhoramento de
plantas.
As diversas técnicas de biologia molecular estão, hoje, disponíveis para
detecção de variabilidade genética no que diz respeito à seqüência de DNA, ou
seja, para a detecção de polimorfismo genético. Assim, técnicas, dentre as
quais RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e ISSR (Inter Simple
Sequence Repeats), permitem a obtenção de marcadores moleculares
cobrindo todo o genoma de um organismo. Os marcadores mais restritos
também são úteis, como a região 5S-NTS rDNA (5S Non-Transcribed Region
rDNA), da região da família multigênica do rRNA 5S. Entretanto, para cada
aplicação existe uma metodologia mais adequada que poderá ser utilizada,
tanto no estudo de genética como na prática de melhoramento de plantas.
Diante do exposto, com a finalidade de ampliar os conhecimentos
moleculares sobre a cultura do feijoeiro comum e subsidiar o estabelecimento
de estratégias de melhoramento, o presente trabalho propõe a utilização de
marcadores moleculares RAPD e ISSR, a fim de avaliar a distância genética
dentro e entre genótipos de feijoeiro dos diferentes centros de origem, bem
como identificar marcadores moleculares que amplifiquem seqüências
específicas do DNA relacionadas aos centros de origem - Mesoamericano e
Andino.
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Feijoeiro Comum – Origem, Morfologia e Valor Nutricional
O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.), um dos alimentos mais
difundido no mundo, é importante fonte de proteínas e calorias para mais de
500 milhões de pessoas que habitam a América Latina e África (FAO, 2005).
No Reino Vegetal, é botanicamente classificado no Ramo
Embryophytae syphonogamae, seguido do Sub-ramo Angiospermae, Classe
Dicotyledoneae, Subclasse Archichlamydeae, Ordem Rosales, Família
Leguminosae, Subfamília Papilionoideae, Tribo Phaseoleae, Subtribo
Phaseolineae, Gênero Phaseolus L., culminando na Espécie Phaseolus
vulgaris L. (DEBOUCK, 1993). A planta possui ciclo de vida anual com número
diplóide de cromossomos 2n = 22, sendo considerada autógama, pois a
fecundação cruzada é, normalmente, inferior a 5% (ROYER et al., 1999).
Segundo Debouck (1991, 1999), o número de espécies para o gênero
Phaseolus é de 31 a 52, todas originárias do Continente Americano, sendo que
somente cinco são cultivadas: P. vulgaris L., P. lunatus L., P. coccineus L., P.
acutifolius A. Gray e P. polyanthus Greeman.
Quanto à origem, acredita-se que o feijão, juntamente com o milho e a
abóbora, surgiu como uma planta daninha em cultivos de mandioca e de batata
doce na América Central. Por milênios, os agricultores cultivaram misturas
complexas de tipos de feijão, produzindo, neste processo, uma variabilidade
genética ampla, visualmente observada pela grande variação de cores, textura
e de tamanho dos grãos. Pela variabilidade, pessoas de diferentes regiões
passaram a ter preferência por alguns grãos em relação a outros, baseando-se
nas condições de plantio e no sabor. Assim, o feijão foi ganhando espaço e
sendo cultivado desde o nível do mar até mais de 3.000.000l ms de altitude. Foi
cultivado, principalmente, por pequenos agricultores em áreas com menos de
um hectare, sem uso de irrigação ou utilização inadequada de fertilizantes ou
de pesticidas (SCHOONHOVEN; VOYSEST, 1991).
4
Indícios levam a crer que o feijão domesticado, na América do Sul, foi
transportado para a América do Norte. Recentemente, padrões eletroforéticos
de faseolina, e, o tamanho das sementes tem auxiliado na elucidação das rotas
específicas de disseminação do gênero Phaseolus, estabelecendo como
centros de domesticação o Mesoamericano e o Andino, e como centro
secundário a Colômbia (GEPTS; DEBOUCK, 1991; SINGH et al., 1991a, b). O
mesoamericano (sudeste dos Estados Unidos até o Panamá, tendo como
zonas principais o México e a Guatemala), reúne a maioria das cultivares de
grãos pequenos, como o Carioca; o sul dos Andes (norte do Peru até noroeste
da Argentina) é representado por cultivares de sementes grandes, semelhantes
à cultivar Jalo (GEPTS et al., 1986; GEPTS, 1988a, b; GEPTS; DEBOUCK,
1991; BAUDOIN et al., 1991). A Figura 1 apresenta a distribuição geográfica de
acessos de feijão selvagens (círculo fechado) e cultivados (circulo aberto),
destacando os centros de origem Mesoamericano e Andino.
Centros de pesquisa agronômica e universidades, tanto na América
quanto fora dela, possuem coleções valiosas de feijão e de outras leguminosas
comestíveis. A maior coleção de Phaseolus existente pertence ao Centro
Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). Esta coleção contém cerca de
40.000 acessos, dos quais, 26.500 da espécie Phaseolus vulgaris L. e seus
ancestrais silvestres constituem o maior componente (89,5%), seguido pelas
espécies Phaseolus lunatus (5,5%), Phaseolus coccineus (1,0%) e espécies
silvestres não-ancestrais (22 espécies, ou apenas 0,6% do total da coleção).
Isto permite que se tenha a idéia da dimensão da variabilidade armazenada, à
disposição dos pesquisadores (CIAT/CGIAR, 2006).
A rede de Bancos de Germoplasma Brasileiros é coordenada pelo
Centro Nacional de Recursos Genéticos e Biotecnologia, Embrapa/Cenargen, o
qual desenvolve pesquisas e atividades rotineiras de enriquecimento,
conservação, caracterização e avaliação de germoplasma, com o objetivo de
aumentar e usar sua variabilidade genética. Tais atividades são documentadas
por um sistema próprio de informação (FONSECA et al., 2002).
5
Figura 1 – Localização dos Centros de Origem de Phaseolus vulgaris L. e
distribuição geográfica dos acessos selvagem (círculo fechado) e
cultivados (círculo aberto) (adaptado de CHACÓN et al., 2005).
Morfofisiologicamente, a planta de feijão possui sistema radicular
superficial, sendo considerada uma espécie pouco tolerante ao estresse hídrico
(FANCELLI, 2001). Pode apresentar nódulos distribuídos nas raízes laterais,
geralmente, em forma poliédrica e de diâmetro de 2 a 5 mm, formados por
bactérias do gênero Rhizobium, as quais fixam o nitrogênio atmosférico. O
número de nódulos que uma planta pode apresentar depende da estirpe de
Rhizobium e da constituição genética da planta hospedeira (VILHORDO et al.,
1988).
As folhas simples e compostas aparecem inseridas no segundo nó do
caule e são denominadas folhas primárias ou primordiais, pois, geralmente
caem antes do completo desenvolvimento da planta. Elas são opostas, com
pecíolos glabros ou ligeiramente pubescentes e, estão associadas com
estípulas bífidas, que constituem caráter importante na sistemática das
Centro de Origem
Mesoamericano
Centro de Origem
Andino
6
leguminosas. As folhas compostas, que constituem as folhas típicas do feijão,
são trifolioladas, tendo um folíolo central ou terminal e dois laterais e opostos.
Sua disposição, no caule, é alternada e apresentam-se longos peciolados, com
pulvínulo (relacionado com os movimentos nictinásticos das folhas) na base do
pecíolo (OSPINA, 1982).
As folhas podem apresentar variações de cor, que vão desde verde-
clara até verde-escura (VILHORDO et al., 1988). As variações estão
relacionadas com a cultivar, posição na planta, idade e também com as
condições ambientais (OSPINA, 1982). O tamanho da folha madura apresenta
correlação com tamanho da semente, isto é, cultivares de grãos pequenos
produzem plantas de folhas maduras pequenas. Segundo o CIAT (1978), na
caracterização botânica, o tamanho das folhas (comprimento e largura) é
verificado apenas no folíolo central, completamente desenvolvido.
Conforme o hábito de crescimento da planta do feijão, este pode ser
classificado em determinado ou indeterminado. Quando determinado, a planta
tem o caule principal e as ramas laterais sempre terminando numa
inflorescência. Para o indeterminado, o caule principal e as ramas laterais
terminam em gemas vegetativas e as inflorescências aparecem nas axilas das
folhas. Como existe variação no padrão de desenvolvimento das plantas de
hábito indeterminado, foi proposta a seguinte classificação para as plantas de
feijão: Tipo I – determinado: Tipo II – indeterminado, com internódios curtos;
Tipo III – indeterminado, com internódios longos e tendência volúvel: Tipo IV –
indeterminado, com guias prostradas ou trepadoras (CIAT, 1978; BEEBE,
1989), entretanto como o crescimento é influenciado pelo ambiente, algumas
vezes é difícil classificar uma cultivar com relação ao hábito de crescimento
indeterminado.
A inflorescência do feijão é um racimo e ocorre, normalmente, em
cachos situados em posição axilar ou terminal. O androceu é formado por dez
estames diadelfos, isto é, nove aderentes pelo filete e um livre, denominado de
estame axilar. O gineceu é de ovário estreito e alongado, com os óvulos
distribuídos em linha e possui o estilete terminado num estigma provido de
pêlos, na margem inferior, que seguram os grãos de pólen na época da
polinização. A deiscência das anteras ocorre antes da abertura da flor.
Portanto, quando da sua abertura, ela já foi polinizada, sendo um mecanismo
7
que induz a autogamia, denominado cleistogamia (RAMALHO; SANTOS,
1982).
O fruto do feijão é uma vagem, constituí-se de duas valvas que unidas
apresentam duas suturas: uma dorsal e outra ventral. A cor das vagens é
característica marcante da cultivar (VILHORDO; MULLER, 1981). Podem ser
de diversas cores, uniformes ou rajadas, existindo diferenças entre vagens
maduras e secas (OSPINA, 1982). As vagens verdes, quando se aproximam
da maturação, tornam-se amarelas, vermelhas, rosadas, violeta-escura ou
amarelas com estrias violáceas ou vermelhas e possuem, em média, duas a
seis sementes (OSPINA, 1980). O número de vagens por planta apresenta
variação de acordo com o tipo de hábito de crescimento. As plantas de hábito
de crescimento determinado (Tipo I) concentram números menores de vagem
quando comparadas as dos Tipos II e III.
A semente do feijão é exalbuminosa e origina-se de um óvulo
campilótropo. Além de apresentar várias formas, tais como cilíndrica, esférica,
reniforme e elíptica, as sementes variam em tamanho, brilho e cor (CIAT,
1978). De acordo com Singh (1989), o tamanho das sementes de feijão
cultivado pode variar de menos de 15 g a 90 g por 100 sementes e são
agrupadas em pequenas (< 25 g), médias (25 a 40 g) e grandes (> 40 g por
100 sementes). A ampla variabilidade apresentada pelas características
externas tem sido utilizada como parâmetro diferencial de cultivares.
Nutricionalmente, o feijão apresenta conteúdo protéico relativamente
alto, e concentra um aminoácido importante, a lisina, que exerce efeito
complementar às proteínas dos cereais, e fibras alimentares com seus
reconhecidos efeitos hipocolesterolêmicos e hipoglicêmico (BENNINK, 2005).
O grão também apresenta alto conteúdo de carboidratos complexos e a
presença de vitaminas do complexo B, ferro, zinco, magnésio e potássio (CIAT,
2002). Entretanto, apesar das vantagens, também apresenta alguns problemas
nutricionais, como a baixa digestibilidade protéica, o conteúdo reduzido em
aminoácidos sulfurados, presença de fatores antinutricionais e a baixa
disponibilidade de minerais, assuntos que têm merecido a atenção especial de
vários grupos de pesquisas (IAREDOZA et al., 1989).
N
ão são muitos os trabalhos direcionados a avaliações na área de
qualidades nutricionais do feijão. Silva e Lachan (1975) avaliaram o teor
8
protéico de 33 cultivares tradicionais de feijão e verificaram valor médio de
21,9%. As variações não são apenas decorrentes da expressão genética, a
qual controla a síntese e o acúmulo de frações específicas de proteínas. São,
também, dependentes de genes que controlam outros fatores, tais como
absorção de nutrientes, vigor da planta, maturação, tamanho da semente,
síntese e acúmulo de amido (OSBORN, 1988).
Outro componente importante é a fibra alimentar que pode ser definida
como compostos endógenos de plantas da dieta, sendo resistentes à digestão
por enzimas humanas. Os feijões secos contêm quantidade substancial de
carboidratos como fibra na forma de celulose e hemicelulose, com quantidades
que variam de 3 a 7% em feijões cozidos (CHIARARDIA; GOMES, 1997).
Alguns estudos têm ressaltado os efeitos positivos dos feijões para a
saúde humana. Os feijões secos são excelentes para aumentar o consumo
dietético da fibra e apresentam várias vantagens para a boa saúde, reduzindo o
risco de doenças crônicas, tais como doenças cardíacas, diabetes, obesidade e
doenças coronárias. Os feijões são densos em nutrientes, ricos em fibras e
fontes de proteína de alta qualidade. Os efeitos protetores e terapêuticos do
feijão foram documentados, e, estudos mostram que o consumo de feijão tem o
potencial de diminuir concentrações do colesterol, melhorar muitos aspectos do
estado de diabéticos e fornecer os benefícios metabólicos que ajudam no
controle do peso (ANDERSON et al., 1999; IADEROZA et al., 1989).
Londero et al. (2005) estudaram a variabilidade genética para teores de
fibra e rendimento de grãos em 26 populações de feijão. Os caracteres fibra
bruta e fibra solúvel não apresentaram efeitos significativos, indicando que não
foi possível a identificação de variabilidade genética entre as populações. O
valor de fibra bruta variou de 3,42 a 4,30%, enquanto que a fibra alimentar total
variou de 33,39 a 39,39%.
2.2 Marcadores Moleculares
Os marcadores moleculares surgiram com o advento das técnicas
modernas de biologia molecular, o que possibilitou detectar o polimorfismo
genético diretamente ao nível do DNA.
9
Na literatura, trabalhos relatam a utilização dos marcadores
moleculares em estudos do material genético vegetal. Alguns trabalhos
relacionam o uso dos marcadores moleculares, no estudo do feijoeiro comum,
e citam os marcadores isoenzimáticos, os RFLP - Restriction Fragment Length
Polymorphism, QTLs - quantitives trait loci, RAPD - Random Amplified
Polymorphic DNA, SSR - Simple Sequence Repeats ou microssatélites, ISSR -
Inter Simple Sequence Repeats, 5S-NTS - 5S Non-Transcribed Region, e
outros. (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998; RODRIGUES, 2002; TAR’AN et
al., 2002; FALEIRO et al., 2003; GONÇALVES-VIDIGAL et al., 2003, 2004;
KELLY; VALLEJO, 2004; TEIXEIRA, 2004; ENDER; KELLY, 2005; SOUZA et
al., 2005; GONÇALVES-VIDIGAL; KELLY, 2006; SANTOS, 2006).
Entretanto, apesar das vantagens apresentadas pela utilização dos
marcadores moleculares, não se deve generalizar a aplicação particular a cada
espécie às outras. A definição do método, a ser empregado, deve considerar a
espécie de planta, o modo de reprodução, as características de interesse, o
valor da unidade de seleção, bem como, o progresso genético já obtido em
outros aspectos pertinentes (MILACH, 2000).
2.2.1 Marcadores moleculares RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
A classe de marcadores moleculares, do tipo RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA) ou DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso, baseia-se na
Reação de Polimerização em Cadeia (PCR), a qual é caracterizada pela
repetição em série de etapas de desnaturação, anelamento e extensão “in
vitro” de muitas cópias de um segmento específico de DNA. O segmento de
DNA é submetido a diferentes temperaturas, e a “primers” de seqüência
arbitrária, resultando em grande quantidade de segmentos que podem ser
facilmente visualizados em gel de eletroforese, sem a necessidade do
conhecimento prévio das seqüências.
A técnica de PCR, utilizando “primers” de seqüência arbitrária, abriu
nova perspectiva para as análises moleculares, facilitando e acelerando os
estudos das espécies. As aplicações incluem: a obtenção de “fingerprints”
genômicos de indivíduos, variedades e populações; a análise da estrutura e
diversidade genética em populações naturais, populações de melhoramento e
10
bancos de germoplasma; o estabelecimento de relacionamentos filogenéticos
entre diferentes espécies; a construção de mapas genéticos de alta cobertura
genômica e a localização de genes de interesse econômico.
A metodologia de RAPD é, basicamente, uma variação do protocolo
PCR, ela utiliza um “primer” único ao invés de um par e o mesmo possui
seqüência arbitrária não possibilitando conhecer a seqüência alvo. A
amplificação de um fragmento RAPD, no genoma analisado, ocorre quando há
duas seqüências de DNA complementares ao “primer”, adjacentes (menos que
4.000 pares de bases) e em orientação oposta. A amplificação é visualizada
em gel de eletroforese (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998).
A característica fundamental dos marcadores RAPD é o fato deles se
comportarem como marcadores genéticos dominantes, não possibilitando
distinguir se as amplificações foram obtidas em um indivíduo diplóide
homozigoto para o loco RAPD, ou se foram para um indivíduo heterozigoto
para o mesmo loco. Portanto, a ausência de banda indica indivíduo homozigoto
recessivo, enquanto que a presença da banda pode estar relacionada tanto ao
genótipo homozigoto dominante, como ao heterozigoto para o loco RAPD.
O marcador RAPD, assim como todas as outras classes de
marcadores moleculares, apresenta vantagens e limitações. As vantagens
apresentadas podem ser resumidas em dois atributos: simplicidade e rapidez,
enquanto que as limitações estão voltadas para o baixo conteúdo de
informação genética por loco, e desconhecimento prévio da base genética das
bandas RAPD. Porém, dificilmente se classifica estas técnicas pela sua
eficiência, tendo em vista que o sucesso dependerá altamente dos
germoplasmas envolvidos no estudo (CHARCOSSET; ESSIOUX, 1994).
2.2.2 Marcadores moleculares ISSR (Inter Simple Sequence Repeats)
A técnica ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) gera marcadores
moleculares efetivos em plantas e animais (GUPTA et al., 1994). A
amplificação é realizada via PCR e a peculiaridade da técnica é o emprego de
um único “primer” com a seqüência repetitiva de um microssatélite
(ZIETKIEWICZ et al., 1994). Sendo assim, verifica-se grande semelhança entre
as técnicas ISSR e RAPD (WILLIAMS et al., 1990), que também é baseada em
11
um único “primer”. Porém, uma diferença marcante entre as duas metodologias
reside nas seqüências alvo dos “primers”. Enquanto o RAPD utiliza “primer”
que foi desenhado sem visar, “a priori”, a amplificação de determinados
segmentos do genoma, a técnica ISSR amplifica a região que intercala dois
blocos de microssatélites. Conseqüentemente, o resultado do ISSR pode ser
interpretado como um mapeamento de microssatélites no genoma do
organismo estudado.
Para a aplicação da técnica ISSR, não há necessidade de construção
da biblioteca genômica total ou parcial do organismo de interesse e o
seqüenciamento de muitos segmentos para posterior seleção. Os “primers” têm
alcance amplo e são imediatamente aplicáveis, a qualquer organismo. Os
“primers” ISSR com seqüência tetranucleotídica têm se mostrado eficientes na
produção de padrões polimórficos informativos intraespecíficos (GUPTA et al.,
1994) e interespecífico (FERNANDES-MATIOLI, 1999). Esta técnica apresenta
vantagem quando comparada ao RAPD, pois gera maior reprodutibilidade, pelo
uso de “primers” mais longos que os de RAPD, e permite o uso de
temperaturas maiores de anelamento (ZIETKIEWICZ et al., 1994; KOJIMA et
al., 1998; BORNET; BRANCHARD, 2001; REDDY et al., 2002).
2.2.3 Marcadores moleculares 5S-NTS (5S Non-Transcribed Region)
Marcadores que caracterizam e discriminam genótipos também podem
ser obtidos a partir de pontos bem localizados no genoma, como a região da
família multigênica 5S-NTS rDNA (5S Non-Transcribed Region rDNA). Estes
segmentos não-transcritos e repetidos podem variar tanto na seqüência de
nucleotídeos quanto no número de nucletídeos (ROSER et al., 2001). Na
literatura, alguns trabalhos relatam o sucesso na utilização desse marcador
para a caracterização de espécies diferentes (PAN et al., 2000; LI et al., 2003;
BECERRA, 2003). Por outro lado, a região 5S-NTS também foi muito eficiente
na geração de marcadores variedade-específicos (SUGIMOTO et al., 1999;
NEGI et al., 2002).
O gene de rDNA 5S compreende uma seq
üência codificante altamente
conservada de aproximadamente 120 pares de bases (rRNA 5S) e um
espaçador não-transcrito (NTS) de tamanho variável, conforme a espécie
12
(CÉSPEDES et al., 1999). Essas variações se devem a inserções, deleções e
minirrepetições (DANNA et al., 1996; SUZUKI et al., 1996). O arranjo repetitivo
dos genes rDNA 5S favorece acentuadas mudanças no genoma, o que produz
polimorfismos facilmente observados entre espécies relacionadas ou entre
membros da mesma espécie (DANNA et al., 1996).
Caracterizados pelas seqüências mais comuns e conservadas
encontradas na natureza, os genes do RNA ribossomal,são, atualmente,
investigados para análises filogenéticas e em estudos de seqüências
conservadas (KELLOGG; APPELS, 1995; FORD et al., 1997; PERSSON, 2000;
PAN et al., 2000; CLOIX et al., 2000; HASTEROK et al., 2001; ALLABY;
BROWN, 2001; CLOIX et al., 2002; PANDIAN et al., 2002; MESSIAS et al.,
2003; JANKUN et al., 2003).
O padrão de variantes de rDNA 5S, verificado, principalmente, nas
regiões espaçadoras intergênicas, tem mostrado alto nível de variação em
algumas populações e ausência em outras. Deste modo, o polimorfismo
apresentado constitui método eficiente para obtenção de marcadores espécie-
específicos (MARTINS; GALETTI, 2001).
2.3 Variabilidade Genética em Feijoeiro Comum por meio de Marcadores
Moleculares
O desenvolvimento dos marcadores isoenzimáticos, em meados da
década de 60, deu início à Revolução Molecular nos estudos de genética e
melhoramento.
Os estudos, que utilizam marcadores moleculares, passaram, então, a
auxiliar nos procedimentos requeridos no melhoramento genético de plantas, e
facilitaram na escolha dos melhores cruzamentos para obtenção de heterose;
na localização de genes envolvidos com a resistência a doenças ou genes
responsáveis por determinadas características numa população; participando
do mapeamento genético e ainda nos estudos filogenéticos. Juntamente com
os marcadores morfológicos (baseados nas marcas fenotípicas), auxiliam nos
estudos de diversidade genética nas populações e, desta forma, contribuem
em programas de melhoramento genético (KORZUN, 2002; TAR’AN et al.,
2002; PEDROSA et al., 2003).
13
Inicialmente, métodos isoenzimáticos foram utilizados. Weeden (1984)
separou cultivares de Phaseolus analisando os perfis isoenzimáticos dos
genótipos utilizados. Outros trabalhos relatam o grande polimorfismo existente
em grande parte dos sistemas isoenzimáticos em Phaseolus vulgaris
(BASSIRI; ADAMS, 1978; KOENING; GEPTS, 1989a, b; CHASE et al., 1991;
VALLEJOS; CHASE, 1991a, b). O acervo genético Mesoamericano demonstra
a ocorrência de maior diversidade alélica, assim como alta variabilidade para
as isoenzimas (KOENING; GEPTS, 1989).
Kami et al. (1995) distinguiram famílias multigenes de faseolina,
diferenciando-as pelas repetições em tandem de pares de bases do DNA,
buscando identificar ancestral para P. vulgaris. Anos depois, Parra e Bertorelli
(1999) trabalharam com polimorfismo enzimático para avaliar progenitores e
progênies de P. vulgaris, pertencentes aos conjuntos gênicos, Mesoamericano
e Andino; na Argentina, Santalla et al. (2004) estudaram a evolução durante a
domesticação de feijão comum, utilizando dados morfológicos e bioquímicos
baseados na proteína faseolina; Freitas (2006) analisou amostras modernas e
arqueológicas (encontrada em uma caverna no Norte de Minas Gerais),
utilizando-se de seqüências da proteína faseolina (Phs) para buscar evidências
sobre a origem de feijão comum no Brasil.
As investigações baseadas em métodos isoenzimáticos continuaram:
Kami et al. (2006) desenvolveram quatro caminhos para estudo filogenético de
feijão com avaliações de seqüências do loco APA, o qual compreende uma
família de proteínas de semente formada por três subfamílias que aparecem na
evolução, conhecidas como fitohaemaglutinina (PHA), inibidoras de á-amilase
(áAI) e arcelinas (ARL); no mesmo ano, Sharma et al. (2006), usando
marcadores isoenzimáticos com base em padrões moleculares de faseolina,
estudaram o complexo Phaseolus-Vigna.
Segundo Gepts (1984, 1988), os tipos de faseolina, em feijões
selvagens e cultivados, auxiliam no entendimento da distribuição geográfica do
gênero. Cultivares originadas do México - América Central, cruzadas com
cultivares dos Andes resultaram em anormalidades que levou as plantas F
1
à
morte ou comprometeu seu crescimento, indicando o isolamento geográfico
entre os germoplasmas das duas regiões. O acompanhamento da
disseminação das cultivares de feijão pelo estudo dos tipos de faseolina
14
existentes, nos grãos, auxilia na elucidação da origem e na previsão dos
melhores cruzamentos para obtenção de vigor hibrido (SINGH; GUTIERREZ,
1984; GEPTS; BLISS, 1988; GEPTS et al., 1988; VIEIRA et al., 1989; SINGH,
1991). No Brasil, há, predominantemente, cultivares de sementes pequenas e
faseolina do tipo ‘S’ (feijões Carioca, Chumbinho, Enxofre, Preto Vagem Roxa,
Rosinha), e feijões de grãos maiores com faseolina Tipo ‘T’ (Pintado,
Amendoim, Manteigão Tosco, Jalo, Goiano Precoce).
Baseados na atividade apresentada pelas esterases extraídas de
folhas jovens, Wall e Wall (1975) identificaram seis fenótipos de Phaseolus.
Pela enzima malato desidrogenase, detectou-se novo polimorfismo, o qual é
controlado pelo loco Mdh-2 (KOENING; GEPTS, 1989b). O loco Mdh-1
apresentou dupla banda, permitindo distinguir na F
2
os três genótipos possíveis
(CHASE et al., 1991; VALLEJOS; CHASE, 1991b). As diaforases foram
utilizadas como sistemas enzimáticos polimórficos tetraméricos, codificados
pelos genes ligados completamente nos loci Dia-1 e Dia-2 (KOENING; GEPTS,
1989a; SCHINKEL; GEPTS, 1989).
Em P. vulgaris, a sinquinato desidrogenase, uma enzima monomérica
codificada por um simples loco, Skdh (WEEDEN, 1984a), polimórfica e com
zona de atividade consistente de quatro bandas de intensidade variável
(SCHINKEL; GEPTS, 1989; GARVIN et al., 1989) possibilitou, nos híbridos,
SKDH, verificar uma combinação das bandas presentes nos pais (GARVIN et
al., 1989).
Adicionalmente, foi associado que as aconitases (loco Aco-1) permitem
diferenciar cultivares dos grupos com faseolina tipos "C/T" e que as glutamato
oxalato transaminases (loco Got-2) e BNAG diferenciaram os grupos com
faseolina tipo "S" (CHASE et al., 1991). Estabeleceu-se, também, que a
isoenzima no loco Aco-2 é monomérica. A isoenzima IDH como dímero com
quatro zonas de atividade distribuídos, três na região anodal (Idh-1, 2 e 3) e um
cátodo (Idh-4) (GARVIN et al., 1989).
Segundo, Parra e Bertorelli (1999), os genótipos de Phaseolus,
provenientes dos centros de origem, Mesoamericano e Andino, onde se
realizou a atividade de alguns locos das isoenzimas SKDH, PRX, BNAG, SOD,
DIA, IDH, GOT e EST, apresentam polimorfismo em seus sistemas enzimáticos
exceto para o loco Got1, conforme vários autores (BASSIRI; ADAMS, 1978;
15
SCHINKEL; GEPTS, 1989; KOENING; GEPTS, 1989 a, b; CHASE et al., 1991;
VALLEJOS; CHASE, 1991 a, b, PARRA, 1999). Os resultados concordam com
os de Chase et al. (1991), enquanto que o loco Dia-1 permite diferenciar linhas
Mesoamericanas de linhas Andinas.
O loco Aco-1 diferencia híbridos formados, a partir do cruzamento entre
linhagens pertencentes ao grupo Andino, o qual é caracterizado por possuir
como principal proteína de reserva faseolinas do tipo "C/T", enquanto que a
isoenzima SKDH e o loco Aco-2 distinguem, especificamente, híbridos que se
formaram entre as linhas pertencentes aos grandes centros de domesticação
de Phaseolus, Mesoamericano e Andino. Os locos Mdh-1, Adh-1 e Got-2,
também diferenciaram os híbridos formados, a partir de cruzamentos
realizados entre os grandes grupos citados; pelos locos Adh-1 e Got-2
possibilitam diferenciar cruzamentos entre linhagens pertencentes ao grupo
dos Phaseolus Mesoamericanos que apresentam como proteína de reserva
faseolinas tipo "S". O loco Mdh-1 diferencia dentro do grupo dos Phaseolus de
origem Andino. Estes resultados não diferem dos encontrados por Chase et al.
(1991) e Vallejos et al. (1991) que estabeleceram diferenças entre os
Phaseolus analisados, baseando-se nos locos Adh-1, Mdh-1, Skdh, Aco-1 e
Got-2.
Diante do relatado nos trabalhos, conclui-se que os padrões de
isoenzimas permitem realizar uma comparação adequada e definir a identidade
de cada uma das linhas de P. vulgaris, pertencentes aos grandes centros de
domesticação e diversificação, Mesoamericano e Andino e sua descendência.
A partir da década de 70, com o advento das técnicas modernas de
biologia molecular, surgem outros marcadores, baseados em polimorfismos de
DNA. Dentre as diversas técnicas empregadas, nos estudos moleculares, na
literatura, algumas são relatadas mais freqüentemente por apresentarem
vantagens específicas, como por exemplo, o polimorfismo de DNA amplificado
ao acaso (RAPD) e o polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição
(RFLP).
O uso de RAPD e RFLP foi relatado por vários pesquisadores, os quais
os utilizaram para medir a diversidade genética entre e dentro de espécies
animais, microrganismos e plantas, incluindo o feijoeiro (VILARINHOS et al.,
1995; BERKUM et al., 1996; TOHME et al., 1996; VASCONCELOS et al., 1996;
16
LANZA et al., 1997; DUARTE et al., 1999; MACIEL et al., 2001; NOWOSIELSKI
et al., 2002; JOHNSON; GEPTS, 2002; ALZATE-MARIN et al., 2003; CHACÓN
et al., 2005; CHIORATO et al., 2006). Entretanto, dentre os marcadores
citados, o RAPD, pela simplicidade técnica e capacidade em detectar
diferenças entre genótipos relacionados, é o mais utilizado (FRANCO et al.,
2001).
No estudo do feijoeiro comum, os marcadores RAPD foram utilizados
para caracterizar variedades e demonstraram-se eficientes na detecção do
grau de parentesco entre diferentes genótipos (VILARINHO et al., 1995; BAI et
al., 1998). Beebe et al. (1995), utilizando este tipo de marcador, constataram
que feijões que possuíam sementes pretas e vermelhas, intimamente
aparentados, da América Central, formaram dois grupos distintos. Análises
moleculares em germoplasma de feijão revelaram resultados que
complementaram conceitos anteriores quanto à sua estrutura racial
(BONIERBALE et al., 1995). Segundo estes autores, marcadores RAPD
também foram desenvolvidos para aipim e mostraram-se úteis nos estudos de
mapeamento das heranças de cruzamentos interespecíficos e para estudos de
variabilidade genética. Avaliações de origem e estrutura genética de
populações tradicionais de feijoeiros, em continentes e regiões, foram
efetuadas na América Latina e Nordeste da Argentina por Beebe et al. (2001) e
Cattan-Toupance et al. (1998), respectivamente.
Franco et al. (2001) utilizaram marcadores RAPD para avaliar a
diversidade genética entre 19 cultivares de feijão. Encontraram 70 locos
polimórficos, e analisaram o agrupamento pelo emprego dos métodos UPGMA
e Tocher, os quais confirmaram a ampla diversidade genética existente entre
os germoplasmas tropicais de feijão.
Emygdio et al. (2003) caracterizaram com a mesma técnica molecular a
diversidade genética dentro e entre as cultivares locais e as comerciais de
feijão cultivado no Rio Grande do Sul; testaram a capacidade desta diversidade
em agrupar genótipos de acordo com o centro de domesticação e coloração de
sementes; observaram que, em geral, o grau de similaridade encontrado, tanto
entre as cultivares comerciais quanto entre as locais, representa reduzida
variabilidade molecular em relação ao uso de RAPD, em contraposição,
verificaram diversidade de características morfológicas e agronômicas
17
observadas entre estes genótipos. Isto pode ser atribuído à pressão de seleção
artificial a que são submetidos, seja pelos melhoristas nas cultivares
comerciais, ou pelos próprios agricultores, nas cultivares locais. Por sua vez,
isso pode ser explicado pelo fato dos marcadores bioquímicos e moleculares
não terem efeito direto sobre o fenótipo da planta, não sendo afetados
diretamente pelo processo de seleção.
Outra aplicação dos marcadores RAPD e RFLP, descrita na literatura,
foi relatada por Beaumont et al. (1996), que compararam a habilidade dos dois
marcadores no mapeamento genético. Esses pesquisadores, utilizando
gerações F
2
’s, concluíram que RAPDs podem ser ótimos para tal finalidade,
principalmente em situações onde genótipos heterozigotos não estão
presentes, como em tecidos haplóides ou linhagens haplodiplóides.
Nos estudos de polimorfismo em feijão, Yu et al. (1999) encontraram
maior freqüência de dinucleotídeos SSR. Galván (2003), estudando feijão do
conjunto gênico Argentino e Francês, relatou que SSR dinucleotídeos e
trinucleotídeos ocorrem mais freqüentemente no genoma de feijão comum.
Masi (2003) relata a consistência dos marcadores SSR para estudos de
diversidade genética em feijão. Outros estudos baseados em marcadores SSR
também foram realizados em feijão (BLAIR et al., 2006; GUERRA-SANZ, 2004;
BLAIR et al., 2003; YU et al., 1999, 2000; CAIXETA et al., 2005; RODRIGUES;
SANTOS, 2006) bem como outras leguminosas, como soja (CREGAN et al.,
1999), amendoim (HOPKINS et al., 1999), ervilha (HUTTEL et al., 1999;
CHENG et al., 2001).
Buso et al. (2006) avaliaram uma bateria de 20 novos marcadores SSR
para análise genética de P. vulgaris desenvolvidos de uma biblioteca genômica
enriquecida por seqüências repetidas de AG/TC, os dados foram obtidos de
estudos realizados em 85 acessos de feijão, e demonstram a contribuição dos
marcadores para seleção e mapeamento genético. Díaz e Blair (2006)
avaliaram 60 genótipos pertencentes ao “pool” gênico Mesoamericano e
Andino, utilizaram 52 marcadores SSR e identificaram subgrupos dentro dos
dois grupos maiores.
A partir dos marcadores SSR, surgem os marcadores ISSR relatados
no estudo de diversidade genética em milho (KANTETY et al., 1995), na
identificação de cultivares de batatas (BORNET et al., 2002), no mapeamento
18
cromossômico em plantas (KOJIMA et al., 1998) e mapeamento de genes
específicos (AKAGI et al., 1996).
Em P. vulgaris, Galván et al. (2003) trabalharam com ISSR para
estudar divergência para feijão comum pertencentes ao “pool” gênico da
Argentina e França. Compararam seus resultados com os obtidos por Galván
et al. (2001), utilizando marcadores RAPD, e verificaram eficiência de 40% de
polimorfismo para ISSR e 25% para RAPD. Também, relataram a eficiência
dos marcadores ISSR, ressaltando que são os marcadores genéticos mais
apropriados para identificação de feijão pertencente ao conjunto gênico de
origem. González et al. (2005) trabalharam com ISSR para diferenciar
populações de feijão, selvagens e domesticadas dos Estados de Puebla,
México.
Outros pesquisadores utilizaram os marcadores moleculares nos
estudos de feijão comum, avaliando progenitores e a divergência genética
entre genomas (PAPA; GEPTS, 2003; GONZÁLEZ et al., 2005; PAYRO´ DE LA
CRUZ et al., 2005 apud PAPA, 2005; ZIZUMBO-VILLARREAL et al., 2005).
Os marcadores 5S-NTS estão entre os mais, recentemente,
desenvolvidos. Compreendem seqüências codificantes altamente conservadas.
O padrão de variantes de DNA ribossomal, verificado, principalmente, nas
regiões espaçadoras intergênicas, tem mostrado alto nível de variação em
algumas populações e ausência em outras. Deste modo, o polimorfismo
apresentado constitui método eficiente para obtenção de marcadores espécie-
específicos (MARTINS; GALETTI, 2001). Alguns trabalhos já garantem a
eficiência do uso dos marcadores de DNA ribossomal (KELLOGG; APPELS,
1995; FORD et al., 1997; PERSSON, 2000; PAN et al., 2000; CLOIX et al.,
2000; ALLABY; BROWN, 2001; HASTEROK et al.; 2001; CLOIX et al., 2002;
PANDIAN et al., 2002; MESSIAS et al., 2003; JANKUN et al., 2003).
Em P. vulgaris, Pedrosa-Harand et al. (2006) investigaram a extensão
5S e 45S do DNA ribossomal em 37 acessos conhecidos dentro da espécie de
feijão comum, selvagem e domesticado, pertencentes a diferentes “pool”
gênicos. Os estudos basearam-se na técnica citogenética - fluorescência de
hibridização “in situ” (FISH). Os resultados demonstraram conservação da
seqüência 5S e grande variação da 45S na espécie. Outros estudos, utilizando
técnicas citogenéticas, relacionam a freqüência de ocorrência de seqüências
19
ribossomais nos genomas das espécies (FRELLO; HESLOP-HARRISON,
2000; HAYASAKI et al., 2001; MELO; GUERRA, 2003; PEDROSA et al., 2003;
NAVRATILOVA et al., 2003; RASKINA et al., 2004; MARCON et al., 2005;
VAIO et al., 2005). Ainda, existem muitas indagações sobre a origem das
espécies, divergência genética entre e dentro das populações, rotas de
disseminação, previsão de cruzamentos para os genótipos das espécies
existentes no intuito de obter vigor híbrido, entretanto, o desafio maior é a
correta tomada de decisão, encontrando a técnica que melhor atenda às
necessidades do pesquisador e responda a questão em estudo, auxiliando nos
Programas de Melhoramento Genético de Plantas.
20
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Cultivares de Phaseolus vulgaris L.
As dez cultivares de feijão, da espécie Phaseolus vulgaris L., obtidas
junto ao Banco de Germoplasma do Núcleo de Pesquisas Aplicado a
Agricultura (NUPAGRI) da Universidade Estadual de Maringá, foram escolhidas
em função da origem, e separadas em dois grupos divergentes geneticamente
entre si, sendo uma pertencente ao “pool” gênico Mesoamericano e o outro ao
Andino (Tabela 1).
Tabela 1 – Cultivares de feijão (Phaseolus vulgaris L.) pertencentes aos
conjuntos gênicos Mesoamericano e Andino
Nº Cultivares Origem* Tamanho dos Grãos** Cor dos Grãos**
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
PI 207262
MSU-7
FT-Soberano
Ouro Negro
BAT-93
AND-277
Jalo Pintado
Kaboon
Perry Marrow
Michigan Dark Red Kidney
Mesoamericano
Mesoamericano
Mesoamericano
Mesoamericano
Mesoamericano
Andino
Andino
Andino
Andino
Andino
Pequeno
Pequeno
Pequeno
Pequeno
Pequeno
Grande
Grande
Grande
M
édio
Grande
Bege
Preto/Brilhante
Preto/Fosco
Preto/Fosco
Bege
Vermelho/Rajado
Bege/Rajado
Branco
Branco
Vermelho/Escuro
*Grupo 1 – conjunto gênico Mesoamericano; Grupo 2 – conjunto gênico Andino.
** Figura 1 – Fotografia dos grãos de feijão.
Na Figura 2, observam- se os grãos de feijão avaliados neste trabalho,
onde se verifica o tamanho e a cor dos mesmos. Os grãos menores reúnem-se
no Grupo 1, Mesoamericano, e grãos maiores, no Grupo 2, conjunto gênico
Andino.
21
Figura 2 – Grãos de Feijão (Phaseolus vulgaris L.) de cultivares pertencentes
ao Grupo Mesoamericano (1) e ao Grupo Andino (2). Cultivares:
(1) PI 207262; (2) MSU-7; (3) FT-Soberano; (4) Ouro Negro; (5)
BAT 93; (6) AND-277; (7) Jalo Pintado; (8) Kaboon; (9) Perry
Marrow; (10) Michigan Dark Red Kidney.
22
3.2 Metodologia
3.2.1 Extração do DNA
Os grãos das dez cultivares de feijão foram colocados para germinar
na casa-de-vegetação do NUPAGRI, em bandejas contendo terra vegetal,
devidamente enriquecida com os nutrientes necessários para o bom
desenvolvimento das plantas. Para cada cultivar, cinco grãos foram plantados.
As bandejas permaneceram em temperatura ambiente e regas foram
realizadas periodicamente.
Após dez dias, as plântulas, medindo cerca de 15 cm, apresentavam
seus primeiros trifólios, os quais foram retirados e transferidos para almofarizes
previamente esterilizados e resfriados. Utilizando-se nitrogênio líquido as
plantas foram maceradas até a consistência de pó, que foi transferido para
microtubos para o início da extração do DNA genômico total. A extração do
DNA seguiu o protocolo proposto por Murray e Thompson (1980), o qual é
baseado no método CTAB (brometo de hexadecyltrimetilamônio), um tampão
utilizado com a finalidade de separar o DNA, já que polissacarídeos e ácidos
nucléicos possuem solubilidade diferenciada na sua presença (BRASILEIRO;
ROMANO, 1998).
As amostras maceradas foram transferidas para microtubos (tipo
eppendorf 1,5 mL), onde foram adicionados 800 µl do Tampão de Extração
(DOYLE; DOYLE, 1987). Este tampão contém CTAB 1%; Tris-HCl pH 8,0, 100
mM; NaCl 1,4 M; EDTA pH 8,0, 20 mM; -mercaptoetanol 0,1% e PVP
(Polivinilpirrolidona) 1%. Em seguida, as amostras foram incubadas a 65ºC,
durante 30 min com agitação a cada 10 min para homogeneizar a suspensão.
Posteriormente, as amostras foram colocadas para resfriar a
temperatura ambiente e foram acrescentadas 600 µL de uma solução de 24
partes de clorofórmio para uma parte de álcool isoamílico. A cada 5 min, os
tubos foram invertidos para homogeneização. O passo seguinte contou com a
centrifugação a 12.000 rpm, aproximadamente, por 5 min, o que resultou na
separação da amostra em duas fases. A primeira, contendo o sobrenadante
com o DNA, foi transferida para um novo tubo, ao qual foi adicionado um
volume equivalente de isopropanol gelado, promovendo a precipitação do DNA.
23
Os microtubos com a solução foram, então, incubados a -20ºC por 08h,
e, posteriormente, centrifugados, desta vez a 14.000 rpm, por 10 min. O
sobrenadante foi descartado e o “pellet” (massa de DNA) sofreu lavagens com
etanol resfriado, 80% e 100%, respectivamente. A finalização do procedimento
consiste na secagem dos “pellets” ao ar livre com posterior acondicionamento
deles em uma solução tampão TE [Tris-HCl 1 mM, pH 7,5; EDTA 0,1 mM, pH
8,0] com RNAse [10 µg mL
-1
] e incubação por 1 h a 37ºC.
3.2.2 Quantificação do DNA genômico total
A quantidade de DNA, extraído de cada amostra, foi estimada pela
comparação com DNA do fago , em três concentrações conhecidas, 25, 50 e
100 ng L
-1
. O procedimento foi realizado em gel de agarose 0,8%, contendo
agarose diluída em tampão TBE (89 mM Tris-base; 89 mM ácido bórico; 2 mM
EDTA pH 8,0), em uma cuba contendo o mesmo tampão e água na proporção
1:9.
Após a quantificação, cada amostra de DNA, foi diluída em água
millique até atingir 5 ng L
-1
, concentração do DNA para as reações com os
marcadores moleculares.
3.2.3 Amplificações pelos marcadores RAPD
Primeiramente, foi realizada a verificação da consistência no padrão de
bandas, onde pares de amostras da mesma cultivar foram comparados,
totalizando numa seqüência de 20 reações/“primer”. Essa avaliação preliminar
permitiu verificar a fidelidade existente entre os pares e dispensar a repetição
para as cultivares nas avaliações posteriores.
Nos procedimentos de amplificação de segmentos do DNA, foram
utilizados 20 “primers” RAPD: OPA-01, OPA-19, OPF-10, OPI-01, OPI-02, OPI-
03, OPI-07, OPI-09, OPK-01, OPK-03, OPK-04, OPN-05, OPN-20, OPX-05,
OPX-11, OPY-06, OPW-16 todos pertencentes aos kits da Operon
Technologies, Alameda, CA.
24
As amostras de DNA das plantas foram submetidas à amplificação em
termociclador (Perkin Elmer DNA Termocycler), conforme protocolo de Williams
et al. (1990), com pequenas modificações. Para cada reação, o volume total foi
de 13 L, sendo 1,3 L tampão Tris-KCl (Tris-HCl 20 mM pH 8,4 and KCl 50
mM), 0,52 L MgCl
2
2 mM, 1,5 L do “primer” RAPD 0,46 µM, 1,0 L de dNTP
0,19 mM, 1 U/reação de Taq DNA Polymerase (Invitrogen Life Technologies™),
1,5 L de DNA (10 ng) e água millique autoclavada para completar o volume.
Para as amplificações, o termociclador foi programado para uma etapa inicial
de 5 min a 94ºC, seguidos de 40 ciclos de 1 min a 94ºC, 1 min a 36°C e 10 min
a 72ºC, e uma etapa final de 10 min a 20ºC.
As amostras amplificadas foram fracionadas em gel de agarose 1,4%
(contendo agarose diluída em tampão TBE e brometo de etídio 0,02%),
mergulhado em uma cuba de eletroforese contendo o mesmo tampão com
água, na proporção de 1:9.
Os géis foram submetidos à eletroforese, num campo elétrico de 3 V
cm
1
, até o DNA migrar pelo menos 10 cm. Os padrões de bandas obtidos
foram, então, visualizados sobre um transluminador de luz UV e fotografados
(câmara Polaroid), para registro e análise. Os tamanhos dos fragmentos RAPD
foram estimados pela comparação com padrões de DNA conhecido (Ladder
100 pb, Invitrogen Life Technologies™).
3.2.4 Amplificações pelos marcadores ISSR
Para os marcadores ISSR, foram selecionados 11 “primers”, de
seqüências 5’→3’, (GGAC)
3
T, (GACA)
4
, (CCTA)
4
, (GGAC)
3
A, (GGAC)
3
C,
(TAGG)
4
, (CACT)
4
, (AACC)
4
, (GGAC)
4
, (AAGC)
4
, (TGTC)
4
, os quais
apresentaram resultados satisfatórios nos procedimentos de amplificação.
As amostras de DNA das plantas foram submetidas à amplificação em
termociclador (Perkin Elmer DNA Termocycler), conforme protocolo de Williams
et al. (1990), com pequenas modificações. Para cada reação, o volume total foi
de 13 L, sendo 1,3 L tampão Tris-KCl (Tris-HCl 20 mM pH 8,4 and KCl 50
mM), 0,52 L MgCl
2
2 mM, 1,5 L do “primer” RAPD 0,46 µM, 1,0 L de dNTP
0,19 mM, 1 U/reação de Taq DNA Polymerase (Invitrogen Life Technologies™),
25
1,5 L de DNA (10 ng) e água millique autoclavada para completar o volume.
Para as amplificações, o termociclador foi programado para uma etapa inicial
de 45 s a 94ºC, seguidos de cinco ciclos de 1 min a 51ºC, 1 min a 72ºC, e 30
ciclos de 45 s a 94ºC, 1 min a 50ºC, 1 min a 72ºC.
As amostras amplificadas foram fracionadas em gel de agarose 1,4%
(contendo agarose diluída em tampão TBE, contendo brometo de etídio 0,02
%) mergulhado em cuba com o mesmo tampão e água na proporção 1:9. Os
géis foram submetidos a um campo elétrico de 3 V cm
-1
, até o DNA migrar pelo
menos 10 cm. Os padrões de bandas obtidos foram, então, visualizados sobre
um transluminador de luz UV e fotografados (câmara Polaroid), para registros e
análises posteriores. Os tamanhos dos fragmentos foram estimados pela
comparação com padrões de DNA conhecido (Ladder 100 pb, Invitrogen Life
Technologies™).
3.2.5 Amplificação pelos marcadores 5S rDNA
Os “primers” 5S-NTS de seqüência (1) 5’-
ATTAGTGCTGGTATGATCGC-3’ e (2) 5’-TGGGAAGTCCTTGTGTTGCA-3’
foram utilizados nas amplificações das amostras de DNA de Feijões. As
seqüências, em questão, foram obtidas de regiões flanqueadoras do gene 5S
de Pisum sativum (ELLIS et al., 1988) e que sofreram modificações a partir de
“primers”, previamente usados para identificação de cereais (KO et al., 1994).
O procedimento de amplificação em termociclador (Perkin Elmer DNA
Termocycler) seguiu o protocolo de Williams et al. (1990), com pequenas
modificações. Para cada reação, o volume total foi de 13 L, sendo 1,3 L
tampão Tris-KCl (Tris-HCl 20 mM pH 8,4 and KCl 50 mM), 0,52 L MgCl
2
2
mM, 1,5 L do “primer” 5S seqüência (1) 0,46 µM, 1,5 l do “primer” 5S
seqüência (2) 0,46 µM, 1,0 L de dNTP 0.19 mM, 1 U/reação de Taq DNA
Polymerase (Invitrogen Life Technologies™), 1,5 L de DNA (10 ng) e água
millique autoclavada para completar o volume. Para as amplificações, o
termociclador foi programado para uma etapa inicial de 5 min a 94ºC, seguidos
de 35 ciclos de 1 min a 95ºC, 30 s a 63ºC, 1 min a 72ºC, finalizando em 10 min
a 72ºC.
26
As amostras amplificadas foram fracionadas em gel de agarose 1,25%
(com agarose diluída em tampão TBE, contendo brometo de etídio 0,02%)
mergulhado em cuba, contendo o mesmo tampão e água na proporção 1:9. Os
géis foram submetidos a um campo elétrico de 3 V cm
-1
, até o DNA migrar pelo
menos 10 cm. Os padrões de bandas obtidos foram, então, visualizados sobre
um transluminador de luz UV e fotografados (câmara Polaroid), para registros e
análises posteriores. Os tamanhos dos fragmentos foram estimados pela
comparação com padrões de DNA conhecido (Ladder 100 pb, Invitrogen Life
Technologies™).
3.3 Análises dos dados obtidos por meio dos Marcadores RAPD
3.3.1 Coeficiente de similaridade de Jaccard
Com base na presença (1) ou ausência (0) de cada fragmento
específico de DNA amplificado, gerado por 17 “primers” em cada genótipo, foi
obtida uma matriz de dados binários. Os dados 1/0 dessa matriz foram usados
para estimar o coeficiente de similaridade de Jaccard - GS (ROHLF, 1992), que
é dado por:
)(
)(
cba
a
ijGS
em que: GS
(i,j)
é a medida da similaridade entre indivíduos i e j; a é o número
de bandas polimórficas que são compartilhadas por i e j; b é o número de
bandas presentes em i e ausentes em j; e c é o número de bandas presentes
em j e ausentes i.
Na contagem das bandas, apenas as que apresentaram brilho intenso
foram consideradas. Com base na matriz de similaridade, e empregando o
método UPGMA (Unweighted Pair-Group Method With Arithmetic Averages), os
genótipos de feijão foram agrupados e o dendrograma gerado pelo programa
computacional NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate System), versão
1.7 (ROHLF, 1992).
27
3.3.2 Diferenciação de cultivares pelo Teste de Mantel
O teste de significância de Mantel (1967) foi utilizado para comparar
duas matrizes simétricas. Esse teste é dado por:
Zm=∑
i
∑
j
n
i j
g
i j ,
em que: n
ij
e g
ij
elementos das matrizes N e G a serem comparadas. Neste
teste, alguns requisitos devem ser respeitados, sendo que o mais relevante é
que as duas matrizes sejam independentes. A associação ou correlação entre
as duas matrizes é testada por permutações de seus elementos, gerando em
cada reamostragem um valor Zm. Como Zm mantém uma relação monotônica
com o r de Pearson, o teste de Mantel é um procedimento para testar a
significância da matriz de correlação entre as duas matrizes (DINIZ-FILHO,
1998; RODRIGUES et al., 2002).
A matriz de distâncias genéticas pode ser comparada com uma matriz-
modelo obtida por algum critério, que mostra a ligação entre as populações ou
amostras (RODRIGUES et al., 2002). A matriz-modelo não pode ser derivada
da matriz de distâncias.
O teste de Mantel foi empregado na comparação da matriz de
distâncias de Jaccard e a matriz-modelo baseada nas origens -
Mesoamericana e Andina. O software NTSYS 1.7 foi utilizado para a realização
do teste de Mantel.
28
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na Tabela 2, estão relacionados os 86 locos obtidos com os 17 “primers”
RAPD. A amplitude de variação registrada foi de duas e nove bandas por
“primer”, o que resultou na média de 5,05 bandas. O tamanho dos fragmentos
de DNA amplificados variou de 300 a 2.400 pb e totalizou em 86 locos, dos
quais 67 polimórficos (78% das bandas analisadas).
Tabela 2 – “Primers” RAPD selecionados dos kits Operon A, F, I, K, N, Y, W e
X, utilizados na comparação de cultivares de feijão pertencentes
aos “pools” gênicos Mesoamericano e Andino
Bandas
“Operon
Primer
”
Seq
üência de nucleotídeos
(5
’→3’)
Polim
órficas
Total
OPA-01
OPA-19
OPF-10
OPI-01
OPI-02
OPI-03
OPI-07
OPI-09
OPK-01
OPK-03
OPK-04
OPN-05
OPN-20
OPY-06
OPW-16
OPX-05
OPX-11
CAGGCCCTTC
CAAACGTCGG
GGAAGCTTGG
ACCTGGACAC
GGAGGAGAGG
CAGAAGCCCA
CAGCGACAAG
TGGAGAGGAG
CATTCGAGCC
CCAGCTTAGG
CCGCCCAAAC
ACTGAACGCC
GGTGCTCCGT
AAGGCTCACC
CAGCCTACCA
CCTTTCCCTC
GGAGCCTCAG
04
06
01
06
04
04
05
07
05
02
01
04
05
04
06
00
03
05
06
04
06
04
04
05
09
05
02
04
04
07
08
07
01
05
Os 86 locos obtidos possibilitaram discriminar e estimar as distâncias
genéticas entre os genótipos das cultivares de feijoeiro em estudo.
A matriz binária construída, a partir dos dados obtidos com os
marcadores RAPD, foi utilizada para a análise da distância genética entre as
cultivares de feijoeiro, empregando o coeficiente de similaridade de Jaccard. O
agrupamento foi apresentado por meio de um dendrograma obtido pelo método
UPGMA, que separou os genótipos estudados em dois grupos, um composto
29
pelas cultivares: PI 207262, MSU-7, FT-Soberano, Ouro Negro e BAT 93,
pertencentes ao conjunto gênico Mesoamericano, e outro constituído pelas
cultivares: AND-277, Jalo Pintado, Kaboon, Perry Marrow e Michigan Dark Red
Kidney, do conjunto gênico Andino (Figura 3).
Figura 3 – Dendrograma obtido com os marcadores RAPD para as dez
cultivares de feijões de origem Mesoamericano e Andino, baseado
na distância de Jaccard, método de agrupamento UPGMA, com
valores de “bootstrap” gerados por 10.000 reamostragens.
Na Tabela 3, estão presentes as estimativas da distância genética
entre as cultivares, e a variação na sua distribuição. A amplitude delimita-se na
menor distância observada, com valor de 0,0143 para a combinação entre as
cultivares Michigan Dark Red Kidney e AND-277, ambas de origem Andina; e a
maior distância, 0,60 determinada entre as cultivares de origens distintas, FT-
Soberano (Mesoamericano) e AND-277 (Andino). Como se esperava, os
maiores valores encontrados para a distância genética entre as cultivares foi
intergrupo, sendo os valores intragrupo, praticamente, de mesma magnitude.
AND-
277
Michigan Dark Red Kidney
Perry Marrow
Kaboon
Jalo Pintado
ANDINO
BAT 93
PI 207262
MSU-7
FT-Soberano
Ouro Negro
MESOAMERICANO
55
61
84
100
48
96
73
91
0.05
30
Tabela 3 – Complemento do coeficiente de similaridade de Jaccard entre os
pares de cultivares* de feijão
PI 207262
MSU-7
FT-
Soberano
Ouro
Negro
BAT 93 AND-277
Jalo
Pintado
Kaboon
Perry
Marrow
Michigan
Dark
Red
Kidney
PI 207262 0
MSU-7 0,2857 0
FT-Soberano
0,2857 0,0800 0
Ouro Negro
0,3830 0,4762 0,4390 0
BAT 93 0,2500 0,3125 0,2581 0,3269 0
AND-277
0,5172 0,5714 0,6000 0,5060 0,5714
0
Jalo Pintado
0,5091 0,5532 0,5833 0,4730 0,5556
0,0896 0
Kaboon
0,4909 0,5435 0,5745 0,4810 0,5455
0,0571 0,1212 0
Perry Marrow
0,5000 0,5625 0,5918 0,4938 0,5588
0,0286 0,0909 0,0294 0
Michigan
Dark Red
Kidney
0,5088 0,5625 0,5918 0,5000 0,5652
0,0143 0,0758 0,0435 0,0145 0
* Mesoamericano: PI 207262; MSU7; FT-Soberano; Ouro Negro; BAT 93.
* Andino: AND 277; Jalo Pintado; Kaboon; Perry Marrow; Michigan Dark Red Kidney.
Para os marcadores moleculares RAPD, resultados similares foram
encontrados por Vilarinho et al. (1995) na caracterização da diversidade
genética e formação de grupos heteróticos e por Johns et al. (1997) em estudo
de cultivares chilenos, ambos, estudando feijoeiro comum. No trabalho de
Johns et al. (1997), ainda foi possível verificar que 50 bandas, escolhidas ao
acaso, produziram nos processos de amplificação com marcadores RAPD,
agrupamento similar ao obtido com 106 bandas.
Nas avaliações para o grupo Mesoamericano, as cultivares mais
promissores para obtenção de heterose foram Ouro Negro e MSU-7, com valor
de 0,4762, o maior detectado para a distância intraconjunto gênico
Mesoamericano. O menor valor para a distância intraconjunto gênico
Mesoamericano foi de 0,08, encontrado entre as cultivares de grãos pretos, FT-
Soberano e MSU-7, seguido do valor 0,25, observado para a combinação BAT
93 e PI 207262, registrando a similaridade entre BAT 93 que é derivada da PI
207262.
No grupo de origem Andina, a maior dist
ância genética intraconjunto
gênico foi de 0,1212, para as cultivares Kaboon e Jalo Pintado. Os valores
31
obtidos para a distância genética interconjunto gênico Mesoamericano e
Andino, registraram 0,6, para a maior distância, obtida entre as cultivares FT-
Soberano e AND-277.
Na Figura 3, o dendrograma, obtido pelo método UPGMA, revela pela
inspeção da matriz de distâncias, a separação do grupo Mesoamericano e do
grupo Andino. No estudo do centro de origem, Maciel et al. (2003), também,
encontraram resultados similares.
A consistência na separação entre e dentro dos grupos é revelada
pelos valores de “bootstrap” descritos no dendrograma.
Os valores apresentados, na matriz de distância e a distribuição dos
cultivares nos ramos do dendrograma, demonstram a separação, segundo o
centro de origem para os genótipos de feijoeiro avaliados com os marcadores
RAPD. Também foi evidenciado que dentro do grupo Andino, as variações nas
distâncias não são tão significativas quanto as distância das cultivares dentro
do grupo de origem Mesoamericano. A separação dos grupos, obtida pelo
marcador molecular RAPD, corrobora com o encontrado no acervo genético de
feijoeiro, avaliado pelo método isoenzimático (BASSIRI; ADAMS, 1978;
SCHINKEL; GEPTS, 1989; KOENING; GEPTS, 1989 a, b; CHASE et al., 1991;
VALLEJOS; CHASE, 1991 a, b; PARRA, 1999) e também para os marcadores
SSR (DÍAZ; BLAIR, 2006).
A mesma matriz de distâncias foi empregada na análise em
coordenadas principais e construção de gráfico de dispersão (Figura 04). A
análise em coordenadas principais, usualmente, é apresentada como
complemento da análise de agrupamento. O gráfico é uma projeção das
distâncias genéticas existentes entre as cultivares de feijão.
No diagrama de dispersão em coordenadas principais (Figura 4), o eixo
I apresenta absorção de 74,9%, e demonstra a nítida separação dos dois
grupos, segundo a origem.
A soma dos eixos I e II atinge o nível de 90%, ultrapassando a margem
dos 80%, que usualmente é a referência de consistência para a representação
gráfica.
32
PI47262
MSU-7
Soberano
O uro Negro
BAT-93
-0. 3 -0. 2 -0. 1 0. 0 0. 1 0. 2 0. 3 0. 4
Ei xo I ( 74, 9%)
-0. 2
-0. 1
0. 0
0. 1
0. 2
0. 3
0. 4
Ei xo I I ( 15, 1% )
Figura 4 – Diagrama de dispersão em coordenadas principais obtido com
marcadores RAPD baseado em matriz de distância genética de
Jaccard entre cultivares de feijões dos conjuntos gênicos:
Mesoamericano e Andino.
O Teste de Mantel foi utilizado para correlacionar matrizes e testar as
hipóteses genéticas. É um teste de significância e neste aspecto, quando pode
ser aplicado, proporciona a possibilidade de decisões objetivas, diferentemente
da análise de agrupamento e análise em coordenadas principais (Rodrigues et
al., 2002).
A hipótese a ser testada está relacionada com a origem das cultivares.
Como as mesmas provêm de centros de origem distintos, portanto, sem
misturas genéticas, a homogeneidade deve ser encontrada dentro dos grupos
e não entre eles. Com base nesta hipótese, foi construída uma matriz-modelo
(Tabela 4), em que combinações de cultivares do mesmo grupo receberam
valor 1 (um) e as combinações entre cultivares de grupos distintos receberam
valor 0 (zero). O passo seguinte consistiu na comparação desta matriz-modelo
com a matriz de distâncias de Jaccard com 10.000 permutações aleatórias
para seus elementos.
33
Tabela 4 – Matriz das ligações entre cultivares de feijão, formando dois grupos
em função da origem Mesoamericana e Andina
PI
207262
MSU-7
FT-
Soberano
Ouro
Negro
BAT 93 AND-277
Jalo
Pintado
Kaboon
Perry
Marrow
Michigan
Dark Red
Kidney
PI 207262 -
MSU-7 1 -
FT-
Soberano
1 1 -
Ouro
Negro
1 1 1 -
BAT 93 1 1 1 1 -
AND-277 0 0 0 0 0 -
Jalo
Pintado
0 0 0 0 0 1 -
Kaboon 0 0 0 0 0 1 1 -
Perry
Marrow
0 0 0 0 0 1 1 1 -
Michigan
Dark Red
Kidney
0 0 0 0 0 1 1 1 1 -
(1) Combinações no mesmo grupo indicando parentesco genético;
(0) Pares de cultivares de origem diferente.
O Teste de Mantel demonstrou correlação positiva de 0,8647 (P < 0,01)
entre a matriz de distâncias de Jaccard e, a matriz-modelo que indica consistência
nos dados, e evidencia que marcadores moleculares RAPD são eficientes no
estudo do agrupamento de cultivares de feijoeiro de centros de origem distintos.
Outro resultado foi encontrado neste trabalho: possibilidade de
identificação dos conjuntos gênicos, Andino e Mesoamericano, por meio de
bandas com potencial para diagnóstico do local de origem, as quais foram
resultantes nas amplificações dos “primers” OPF-10, OPI-07, OPK-04 e OPW-
16 (Tabela 5). Essas bandas, associadas à origem das cultivares, são
denominadas “Bandas-Diagnóstico”. A Figura 5 apresenta as bandas-
diagnóstico, obtidas nas amplificações com os “primers” RAPD citados.
Tabela 5 – Relação dos “primers” RAPD que produziram Bandas-Diagnóstico e
seus respectivos comprimentos aproximados
“Operon
Primer
”
Seq
üência de nucleotídeos
(5
’→3’)
Tamanho aproximado da Banda
Diagnóstico
(pb)
OPF-10
OPI-07
OPK-04
OPW-16
GGAAGCTTGG
CAGCGACAAG
CCGCCCAAAC
CAGCCTACCA
1.100
1.200
1.000
1.300
34
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 5 – “Primers” RAPD e respectivas Bandas-Diagnóstico. (A) OPF-10; (B)
OPI-07; (C) OPK-04; e (D) OPW-16.
35
Os resultados obtidos com os marcadores moleculares ISSR,
seqüências 5’→3’, (GGAC)
3
T, (GACA)
4
, (CCTA)
4
, (GGAC)
3
A, (GGAC)
3
C,
(TAGG)
4
, (CACT)
4
, (AACC)
4
, (GGAC)
4
, (AAGC)
4
, (TGTC)
4
não apresentaram
polimorfismo suficiente para os cálculos de distâncias genéticas utilizando
coeficientes de similaridade. Num total de 11 “primers”, 32 bandas foram
observadas, ou seja, uma média de três bandas/“primer”. O número reduzido
de bandas amplificadas e a relação de bandas polimórficas x monomórficas de
2:1, não possibilitaram as análises de distância genética.
Conforme relatam Galván et al. (2003), no estudo de feijoeiro utilizando
“primers” ISSR, os marcadores em questão são eficientes para a identificação
de conjunto gênico de origem, mas não atribuíram a eles, eficiência na
diferenciação de indivíduos como pode ser detectado para os marcadores
RAPD. O resultado com os marcadores ISSR não apresentaram alta freqüência
de bandas polimórficas, o que é claramente observado quando se avalia o total
de 75 bandas, obtidas com nove “primers”, em que somente 44% foram
consideradas polimórficas.
Para os 11 “primers” ISSR utilizados nesse trabalho, foram
identificadas bandas-diagnóstico para o centro de origem em dois dos
marcadores, “primers” (GGAC)
3
T e o (TAGG)
4
. Estes marcadores moleculares
apresentaram bandas, com aproximadamente 600 pb e 1.200 pb,
respectivamente, as quais possibilitam identificar em fase de atração o
conjunto gênico Andino e em fase de repulsão o conjunto gênico
Mesoamericano (Figura 6).
A outra classe de marcador utilizada 5S-NTS, que amplifica regiões
conservadas do genoma (PEDROSA-HARAND et al., 2006), também
demonstrou eficiência no processo de identificação do centro de origem para P.
vulgaris L.
36
(A)
(B)
Figura 6 – “Primers” ISSR, (A) (GGAC)
3
T e (B) (TAGG)
4
e suas respectivas
bandas-diagnóstico.
O resultado confirma a amplificação de um fragmento com
aproximadamente 600 pb para o conjunto gênico Andino e um de
aproximadamente 650 pb para o conjunto gênico Mesoamericano (Figura 7).
37
(A)
(B)
Figura 7 – Amplificação com o “primer” 5S-NTS. (A) Imagem negativa, com a
identificação dos genótipos. (B) Imagem original, visualizada com
transluminador UV.
Os resultados obtidos, nesse trabalho, com a utilização de marcadores
moleculares, auxiliam nos Programas de Melhoramento. Os marcadores
moleculares RAPD demonstraram ser eficiente ferramenta para estudo da
distância genética intergrupo e intragrupo em cultivares de feijoeiro, como
também junto com os marcadores ISSR e 5S-NTS formaram um grupo de
marcadores moleculares, apresentando bandas-diagnóstico para identificação
dos conjuntos gênicos: Mesoamericano e Andino.
38
5 CONCLUSÕES
Os marcadores moleculares RAPD geraram bandas de amplificação que
possibilitaram obter a distância genética entre as cultivares estudadas.
As cultivares Andinas: Michigan Dark Red Kidney, AND-277 e Perry Marrow
foram as mais similares, enquanto que para o conjunto gênico
Mesoamericano, as mais similares foram FT-Soberano e MSU-7. Por sua
vez, AND-277 e FT-Soberano apresentaram-se como as mais dissimilares.
Os marcadores ISSR revelaram a presença de bandas-diagnóstico com
tamanho de 600pb e 1200pb nas cultivares de origem Andina.
O marcador 5S-NTS apresentou uma banda de 600pb nas cultivares
Andinas e outra banda de 650pb nas cultivares Mesoamericanas.
Todos os marcadores moleculares estudados (RAPD, ISSR e 5S-NTS)
produziram bandas associadas às regiões de origem e que podem ser
utilizadas para diagnóstico do centro de origem de cultivares de feijoeiro
comum (Phaseolus vulgaris L.).
39
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