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ADRIANA FREIRE MACHADO
Caracterização molecular das cepas do Vírus Sincicial
Respiratório identificadas nos anos de 2001 e 2002 em
unidade de transplante de células-tronco hematopoéticas
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Área de concentração: Doenças Infecciosas e
Parasitárias
Orientadora: Dra. Clarisse Martins Machado
São Paulo
2007
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família, meu sobrinho Kaíque, que há pouco tempo
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chegou na família e já é o responsável pela nossa constante alegria.
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Agradecimentos
À Dra. Clarisse Martins Machado, minha orientadora, pesquisadora dedicada e
sempre com sua visão à frente pela oportunidade, confiança, pelos ensinamentos.
Ao Profº Dr. Cláudio Sérgio Pannuti, pela oportunidade, pelo exemplo de
integridade e dedicação.
À Profª Dra. Maria Anice Sallum, pelas palavras de incentivo, pela disponibilidade,
pelo auxílio e ensinamentos nas análises filogenéticas.
À Lucy Vilas Boas, minha grande amiga, por ter-me “adotado” ainda como
estudante de iniciação científica, pelos seus conselhos maduros, pelo
processamento de algumas amostras deste trabalho.
À Alexanda Dias Reis, por ter me introduzido no “mundo do RSV” emprestando seu
conhecimento e seus reagentes, pelas dicas, pela amizade, pelos bate-papos.
À Adriana Fumie Tateno pela sua constante disponibilidade, pela ajuda na
execução das reações de seqüências, pelas suas valiosas dicas.
À Dra. Viviane F. Botosso por ter cedido as seqüências das cepas do RSV dos
pacientes do Hospital Universitário da USP e pelas valiosas sugestões no exame
de qualificação.
À Daniele Bruna Leah e Profº Dr. Edison L. Durigon por ter cedido as seqüências
das cepas do RSV dos pacientes do Hospital Universitário da USP e pela constante
disponibilidade e oferta de ajuda.
Às Dras. Sílvia F. Costa e Daisy M. Machado pelas dicas e valiosas sugestões
feitas no exame de qualificação.
Ao Bruno Gianfratti, meu companheiro, amigo, que sempre me apoiou, me
incentivou e vibra com minhas vitórias.
À Daniela S. de Angelis, ao José de Paula Paz Jr e ao Renato dos Reis Oliveira
pelos cinco anos de amizade, pelo convívio agradável, pelas dicas, pelo
companheirismo nos momentos de aflição.
Ao Dr. José Eduardo Levi, pelo ensinamento em biologia molecular e pela
oportunidade de sempre aprender mais.
À Dra. Vanda Ueda, exemplo de pesquisadora, que todo dia me ensina o que é o
amor em fazer pesquisa.
A toda equipe do Laboratório de Virologia do Instituto de Medicina Tropical da USP
ou pelos amigos que por lá já passaram, pela troca constante de aprendizado,
pelas conversas, pelos conselhos, pelos momentos de euforias nas festas do
laboratório: Alessandra, Dr. Aluísio, Amanda, Ana Carolina, Anderson, Carla, Célia,
Cícero, Cynthia, Daniel, Débora, Eduardo, Elaine, Érica, Eveline, Jaila, Jennifer,
Jussara, Laura, Luciano, Luiz Vicente, Maria, Maria Carolina, Maria Cristina, Marli,
Michela, Shinai, Sílvia, Synara, Sônia, Rodrigo Merlim, Rodrigo Vela, Tânia, Vera,
Viviane, Wilton.
Ao meu tio Luiz Carlos por sempre incentivar os meus estudos e me apoiar.
Às minhas queridas amigas do Mackenzie Marina e Michelle que me
acompanharam desde o início do mestrado dando-me conselhos, dicas e trocando
idéias.
Aos pacientes, cujas amostras foram usadas neste estudo, que mesmo com todo
sofrimento causado pela doença assinaram o termo de consentimento aceitando
participar do estudo.
À CAPES e ao CNPQ pelo auxílio financeiro.
“
““
“O que vale na vida não é o ponto de partida e sim a caminhada
O que vale na vida não é o ponto de partida e sim a caminhadaO que vale na vida não é o ponto de partida e sim a caminhada
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SUMÁRIO
Resumo
Summary
Lista de figuras
Lista de tabelas
Lista de abreviaturas, siglas e símbolos
1.Introdução .............................................................................................................................. 1
1.1 Histórico............................................................................................................................ 2
1.2 Classificação .................................................................................................................... 3
1.3 Estrutura viral ................................................................................................................... 4
1.4 Replicação Viral............................................................................................................... 10
1.5 Variação Antigênica ........................................................................................................ 12
1.5.1 Variabilidade genotípica.............................................................................................. 14
1.6 Diagnóstico laboratorial................................................................................................... 18
1.7 Epidemiologia.................................................................................................................. 21
1.8 Imunopatogênese............................................................................................................ 23
1.9 RSV em receptores de transplante de células-tronco hematopoéticas.......................... 26
1.9.1 Prevenção e tratamento.............................................................................................. 30
1.9.2 Infecção nosocomial ................................................................................................... 32
Justificativa ........................................................................................................................... 35
2.Objetivo ................................................................................................................................. 36
3. Casuística e Métodos........................................................................................................... 38
3.1 População estudada ....................................................................................................... 39
3.2 Características das unidades de internação e ambulatório de TCTH............................ 39
3.3 Definições ....................................................................................................................... 40
3.3.1 Infecção em serviços de saúde ................................................................................. 40
3.3.2 Período de diagnóstico positivo para o RSV ............................................................. 41
3.3.3 Infecção no trato respiratório superior e trato inferior................................................ 41
3.4 Medidas de controle de infecção por vírus respiratórios................................................ 41
3.5 Conduta mediante infecção pelo RSV............................................................................ 42
3.6 Métodos laboratoriais e de análise. ................................................................................ 43
3.7 Análise dos dados e construção das topologias............................................................. 51
3.8 Aspectos éticos............................................................................................................... 53
4. Resultados ........................................................................................................................... 54
5. Discussão............................................................................................................................. 69
6. Conclusões .......................................................................................................................... 82
7. Anexos ................................................................................................................................. 84
8. Referências bibliográficas.................................................................................................... 91
9. Apêndice
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Taxonomia do Vírus Sincicial Respiratório Humano e de outros vírus relacionados.. ..
...................................................................................................................................................... 4
Figura 2 - Desenho esquemático da proteína G.......................................................................... 9
Figura 3 - Genoma do RSV e um diagrama esquemático da partícula viral .............................. 12
Figura 4 - Fluxograma dos métodos laboratoriais deste trabalho............................................... 44
Figura 5 - Foto de gel de agarose do produto do RSV amplificado por “semi nested RT-PCR”
..................................................................................................................................................... 57
Figura 6 – Árvore filogenética pelo método de verossimilhança para amostras do grupo A junto
às cepas circulantes na comunidade.......................................................................................... 63
Figura 7 – Árvore filogenética pelo método de verossimilhança para amostras do grupo B junto
às cepas circulantes na comunidade.......................................................................................... 64
Figura 8 - Árvore filogenética pelo método de distância utilizando o algorítimo neighbour-joining
das amostras do RSV do grupo A junto às seqüências extraídas do Genebank para realização
da genotipagem........................................................................................................................... 65
Figura 9 - Árvore filogenética pelo método de distância utilizando o algorítimo neighbour-joining
das amostras do RSV do grupo B junto às seqüências extraídas do Genebank para realização
da genotipagem........................................................................................................................... 66
Figura 10 - Mapa da infecção RSV dentro da unidade de TCTH no HC nos anos de 2001 e
2002............................................................................................................................................. 67
Figura 11 - Mapa amplificado da infecção RSV dos pacientes que tiveram cepas altamente
relacionadas dentro da unidade de TCTH no HC nos anos de 2001 e 2002............................. 68
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Seqüência dos iniciadores utilizados nas reações de PCR....................................... 48
Tabela 2 - Características dos pacientes infectados pelo RSV no ano de 2001........................ 56
Tabela 3 - Características dos pacientes infectados pelo RSV no ano de 2002........................ 56
Tabela 4 - Grupo e genótipo do RSV dos pacientes infectados em 2001.................................. 58
Tabela 5 - Grupo e genótipo do RSV dos pacientes infectados em 2002.................................. 59
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
A-terminal: amino terminal
C-terminal: carboxi terminal
cDNA: DNA complementar
col.: colaboradores
DEPEC: Dietilpirocarbonato
DNA: Ácido desoxiribonucléico
DNTP: Desoxinucleotídeos trifosfatos
DRTI: Doença respiratória no trato inferior
DTT: Ditiotreitol
EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético
FMUSP: Faculdade de Medicina da USP
HC: Hospital das Clínicas
IFD: Imunofluorescência direta
IgA: Imunoglobulina A
IgE: Imunoglobulina E
IgG: Imunoglobulina G
IgM: Imunoglobulina M
IL: Interleucina
l: Litro
LNF: Lavado de nasofaringe
M: Molar
m: Mili (10
-3
)
µ: Micro (10
-6
)
NK: do inglês “natural killer”
Pb: Pares de base
PCR: Reação em cadeia polimerase
pmoles: Picomoles (10
-12
moles)
proteína F: proteína de fusão
Proteína G: proteína de adesão
qsp: Quantidade suficiente para
RNA: Ácido ribonucléico
RNAsin: inibidor de ribonuclease
RT: Transcriptase reversa
RSV: Vírus Sincicial respiratório (do inglês “Respiratory Syncitial Vírus”)
TAE: Tampão tris acetato EDTA
TCTH: Transplante de células-tronco hematopoiéticas
USP: Universidade de São Paulo
Machado AF. Caracterização molecular das cepas do Vírus Sincicial
Respiratório identificadas nos anos de 2001 e 2002 em unidade de
transplante de células-tronco hematopoéticas (dissertação). São Paulo:
Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2007.
RESUMO
O Vírus Sincicial Respiratório (RSV) é reconhecido como agente causador de
infecção nosocomial entre receptores de pacientes de células-tronco hematopoéticas
causando morbidade e mortalidade consideráveis nesses pacientes. O objetivo
desse estudo foi caracterizar as cepas do RSV isoladas de receptores de transplante
de células-tronco hematopoéticas (TCTH) do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo durante sua estação. As cepas do RSV
foram tipadas (em grupo A ou B) e genotipadas. Das sete cepas analisadas dos
receptores de TCTH durante o ano de 2001, somente duas pertenciam ao grupo B,
as outras cinco eram pertencentes ao grupo A. Dessas sete cepas, três eram
altamente relacionadas e haviam infectados pacientes que freqüentavam o
ambulatório. Em 2002, das doze cepas analisadas, três pertenciam ao grupo A e as
outras nove pertenciam ao grupo B. Sete cepas eram altamente relacionadas entre
elas e eram também de pacientes de ambulatório sugerindo que a transmissão em
hospital-dia era mais provável. Enfim, múltiplços genótipos do RSV co-circularam nas
unidades de TCTH (ambulatório e enfermaria) do Hospital das Clínicas entre 2001 e
2002. A transmissão nosocomial foi mais provável ocorrer no ambulatório da unidade
de TCTH quando comparada à enfermaria. Políticas de controle de infecção devem
ser também implementadas em ambulatórios para evitar transmissão nosocomial do
RSV e outros vírus respiratórios em pacientes de ambulatório.
Descritores: 1.Infecções por respiratório sincicial/transmissão 2.Transplante de
medula óssea. 3.Epidemiologia molecular 4.Infecção hospitalar 5.Hospedeiro
imunocomprometido 6.Células-tronco hematopoéticas
Machado AF. Molecular characterization of strains of Respiratory
Syncytial Virus in Hematopoietic Stem Cell Transplant Unit identified in
2001 and 2002 (dissertation). São Paulo: Faculdade de Medicina,
Universidade de São Paulo; 2007.
SUMMARY
Respiratory Syncytial Virus is recognized as the leading cause of nosocomial
respiratory infection among recipients of hematopoietic stem cell transplant (HSCT)
causing considerable morbity and mortality among theses patients. The aim this
study was characterize the strains of Respiratory Syncytial Virus in recipients
Hematopoietic Stem Cell Transplant Unit (HSCT) at Hospital das Clínicas, University
of São Paulo Medical School during RSV season in symptomatic HSCT recipients at
Hospital das Clínicas. The strains of RSV was typed (in group A or B) and genotyped.
Of the seven strains analyzed from HSCT recipients during 2001, only two belonged
to group B, the other five belonged to group A. Of these seven strains, three were
closely related and were from outpatients. In 2002 , of the twelve strains analyzed,
three belonged to group A and the other nine belonged to group B. Seven strains
were closely related and were also from outpatients suggesting that nosocomial
transmission in hospital-day was more likely. In conclusion, multiples genotypes of
RSV co-circulated in the Hematopoietic Stem Cell Transplant units (ward and day-
hospital) of Hospital das Clínicas between 2001 and 2002. Nosocomial transmission
was more likely to occur at the HSCT Day-hospital as compared to the HSCT ward.
Infection control practices should be also implemented at Day-hospital Units to avoid
nosocomial transmission of RSV and other respiratory viruses in outpatient units.
Descriptors: 1. Respiratory syncytial virus/transmission 2.Bone marrow
transplantation 3.Molecular epidemiology 4.Cross infection 5.Immunocompromissed
host 6.Hematopoietic stem cells.
______________________________________________________________
I INTRODUÇÃO
2
I. INTRODUÇÃO
1.1 Histórico
O primeiro relato do Vírus Sincicial Respiratório foi feito em 1956 por
Morris e col. Eles relataram doença respiratória ocorrida em 1955,
caracterizada por coriza, espirros, tosse, secreção mucopurelenta em uma
colônia de vinte chimpanzés no Walter Reed Army Institute of Research
(WRAIR) Washington, D.C. (Morris et al., 1956).
A secreção colhida da garganta de um chimpanzé doente foi inoculada
em cultura de células hepáticas e essas degeneraram-se e morreram após
sete dias da inoculação. O vírus foi inicialmente chamado de agente de coriza
de chimpanzé (chimpazee coriza agent - CCA). Posteriormente, o material
isolado foi inoculado em outros mamíferos (camundongos, coelhos, cobaias)
e ovos embrionados e não foram notados sinais de doença (Morris et al.,
1956).
Chanock et al. (1957) isolaram um vírus similar ao CCA de uma criança
com pneumonia e outra criança com crupe em Baltimore. Devido à
capacidade de formar sincícios em cultura de células e sua afinidade pelo
trato respiratório, o nome chimpanzee coriza agent foi substituído por Vírus
Sincicial Respiratório (Respiratory Syncytial Vírus - RSV) (Chanock al., 1957).
Em Baltimore, estudos sorológicos foram realizados avaliando a
infecção pelo RSV e verificou-se que a maioria das crianças com menos de
quatro anos de idade já tinham se infectado pelo vírus (Chanock et al., 1957).
Outros estudos em vários lugares do mundo mostraram que o RSV estava
3
associado à doença do trato respiratório inferior durante a infância (Collins et
al., 2001).
No Brasil, em 1964, Candeias isolou o RSV de amostras respiratórias
de quatro crianças com menos de seis meses de idade com quadro de
broncopneumonia e bronquiolite internadas em um hospital infantil na cidade
de São Paulo. A confirmação do isolamento foi realizada utilizando-se o teste
de neutralização com o soro padrão (Candeias, 1967).
1.2. Classificação
O Vírus Sincicial Respiratório Humano é pertencente ao gênero
Pneumovirus, gênero a qual pertence também o Vírus Sincicial Respiratório
Bovino e o Vírus da Pneumonia de Camundongos; à subfamília
Pneumovirinae junto ao Metapneumovirus Humano, recentemente
descoberto; à família Paramyxoviridae e à ordem Mononegavirales (figura 1)
(van den Hoogen et al., 2001; The Universal Virus Database of the
International Comitee on Taxonomy of Viruses, 2002; The NCBI Taxonomy
Homepage, 2006).
4
Figura 1- Taxonomia do Vírus Sincicial Respiratório Humano e de outros vírus
relacionado
s (
The Universal Virus database of the International Comitee on Taxonomy
of Viruses, 2002;
The NCBI Taxonomy Homepage
, 2006).
1.3 Estrutura Viral
O vírion RSV consiste de um envelope de duas camadas lipídicas
cobrindo o nucleocapsídeo de simetria helicoidal. Os vírions apresentam
formas esféricas ou pleomórficas, sua medida é de 150 a 300 nm de diâmetro
(Falsey & Walsh, 2000).
O genoma do RSV é RNA de fita simples, negativa, não segmentado,
composto de aproximadamente 15.222 nucleotídeos e 10 genes que
codificam 11 proteínas: NS1, NS2 (não estruturais), nucleoproteína (N),
fosfoproteína (P), proteína da matriz (M), pequena proteína hidrofóbica (SH),
proteína de adsorção (G), proteína de fusão (F), proteínas da matriz (M2-1,
M2-2) e complexo polimerase (L) (figura 3) (Falsey & Walsh, 2000;).
5
O vírion RNA envolto pelas proteínas N, P e L (que constituem a
replicase viral) formam o nucleocapsídeo. A dupla camada lipídica é obtida da
membrana da célula hospedeira na qual estão as três glicoproteínas
transmembranas (G, F e SH) (figura 3) (Falsey & Walsh, 2000).
A função das proteínas NS1 e NS2 não é completamente conhecida.
Entretanto, o fato de serem não estruturais sugere que estejam relacionadas
com a regulação da transcrição e da replicação do ácido nucléico viral. Há
evidência que a proteína NS1 é um potente inibidor da transcrição intracelular
e da replicação do RNA viral. Devido aos genes estarem localizados próximos
à região promotora da transcrição, esses genes são os mais transcritos pelo
vírus (Collins & Wertz, 1983; Atreya et al., 1998; Collins et al., 2001).
A proteína M (matrix) não é glicosilada e encontra-se na matriz.
Acredita-se que nos Pneumovirus, assim como em outros vírus RNA não
segmentados com polaridade negativa, a função dessa proteína é tornar o
nucleocapsídeo transcripcionalmente inativo antes do seu empacotamento e
mediar a associação do nucleocapsídeo com o envelope nascente (Collins et
al., 2001).
As proteínas M2 são restritas ao gênero Pneumovirus. Diferentemente
de outros genes do RSV, cada unidade transcripcional do gene M2 codifica
duas proteínas a M2-1 e a M2-2. (Collins et al., 1990; Cheng et al., 2005).
A proteína M2-1 é interna e não glicosilada e atua como um importante
fator para transcrição na polimerase, principalmente para genes longos. Sua
6
ação é como um fator de elongação permitindo a completa síntese dos
mRNAs (Collins et al., 1996; Mason et al., 2003).
A proteína M2-2 também é interna e não glicosilada. Atua com função
regulatória, está envolvida na mudança da transcrição para a replicação do
RNA viral durante o ciclo replicativo do vírus. Acredita-se que o fato de sua
“open reading frame” ser sobreposta à do M2-1 ocorre um fino ajuste na
expressão da M2-2 durante a replicação do RSV (Cheng et al., 2005).
A proteína L (large protein) é a maior proteína expressa pelo vírus.
Provavelmente, a proteína L é a enzima RNA polimerase RNA dependente,
baseado em seu tamanho e localização no nucleocapsídeo. Contém seis
segmentos altamente conservados e presume-se que apresentam domínios
funcionais (Collins et al., 2001).
A proteína P (phosphoprotein) é altamente fosforilada e,
provavelmente, apresenta-se como um fator de tradução e replicação, como
em outros vírus RNA não segmentados e de polaridade negativa (Collins et
al., 2001).
A proteína N (nucleoprotein) é a principal proteína estrutural do
nucleocapsídeo. Ela está associada ao RNA genômico e relaciona-se com a
regulação da transcrição e da replicação do ácido nucléico viral (Collins et al.,
2001).
A proteína F apresenta duas subunidades após a glicolisação: a F1 e
F2. A subunidade F1, relativamente bem conservada, fica ancorada à
membrana. Essa proteína é responsável pela ligação do envelope viral à
7
membrana da célula hospedeira e posterior liberação do nucleocapsídeo ao
citoplasma celular. As espículas da proteína F apresentam-se de forma
homotetramérica, ou seja, cada espícula é formada por quatro unidades
idênticas da proteína e induz à formação de anticorpos neutralizantes
(Sullender et al., 1998; Collins et al., 2001).
A proteína SH (small hydrofobic protein) ainda não apresenta uma
função bem estabelecida Entretanto, pelo fato de ser uma proteína
transmembrana, acredita-se que esteja envolvida com processos de
adsorção, penetração e desnudamento do vírus. Embora, haja estudos que a
proteína SH seja dispensável para replicação do vírus em cultura de tecido
(Collins et al., 2001; McDonald et al., 2006).
A proteína G apresenta maior variabilidade entre as proteínas do RSV.
Diversos estudos de epidemiologia molecular e imunologia são enfocados
nessa proteína (Cane, 2001). A maior ênfase na explicação aqui da
glicoproteína G é necessária para maior compreensão da metodologia e
desenvolvimento do trabalho.
Todas as proteínas exceto NS1, NS2 e M2-2 são componentes dos
vírions. As proteínas G e F são alvos da resposta humoral. As proteínas N, F,
M2-1 e SH são alvos de células T citotóxicas (Wertz & Moudy, 2004).
1.3.1 A glicoproteína G
O gene da glicoproteína G é o mais variável entre os diferentes
genótipos do RSV. Essa proteína é um tipo II de glicoproteína, ou seja, está
ancorada à membrana próxima à porção amino-terminal por um domínio
8
hidrofóbico, não clivável do tipo sinal-âncora. O sinal-âncora é uma região
responsável pela ancoragem da proteína ao envelope viral. A proteína G
apresenta de 289 a 299 aminoácidos dependendo da cepa do vírus, é
altamente glicosilada com nitrogênio e oxigênio ligados a açúcares e é rica
em resíduos de serina, prolina e treonina, características peculiares aos
Pneumovirus (Cane et al., 1991).
Recentemente, estudos observaram a inserção de sessenta
nucleotídeos no gene da proteína G, fato que confere um aumento de vinte
aminoácidos na cadeia peptídica da proteína G. A polimerase do RSV copia
repetidamente parte da seqüência do gene da proteína G, como um
mecanismo adicional gerando maior diversidade no vírus. Provavelmente,
essa inserção confere um aumento da glicolisação na proteína o que pode
determinar um aumento da antigenicidade e infectividade do vírus. (Trento et
al.¸ 2006; Nagai et al., 2004).
O ectodomínio da proteína G tem uma região central bastante
conservada, apresentando quatro resíduos de cisteína que são altamente
conservados, flanqueados por duas regiões quem mostram um alto nível de
variação na seqüência (figura 2). A região central conservada é levemente
hidrofóbica e propõe-se como um suposto sítio de ligação (Jhonson et al.,
1987).
Outra forma da proteína é produzida em abundância nas células
infectadas. Essa é uma versão solúvel que é desprovida da região
citoplasmática e transmembrana e é gerada pela iniciação num tripleto
alternativo AUG localizado no domínio hidrofóbico seguido por remoção
9
proteolítica do domínio sinal/âncora. A função biológica dessa forma protéica
ainda é desconhecida, porém parece relacionar-se com a imunopatologia das
infecções (Hendricks et al., 1988; Roberts et al., 1994).
Como apresenta alta variabilidade, a glicoproteína G possui um dos
mais altos graus de tolerância para mudança de aminoácidos entre as
proteínas estruturais dos vírus RNA. A diversidade genética do RSV é
fortemente associada com as mudanças da glicopoteína G. Esse modo de
evolução, que lembra o padrão de evolução do vírus Influenza B, é
provavelmente determinado por muitos fatores, incluindo a disseminação de
um lugar para o outro e o surgimento de novas variantes através da seleção
imune. Entretanto, as mudanças nessa proteína fornecem somente um grau
de heterogeneidade moderado, visto que ainda não existem estudos
consistentes mostrando a diversidade epidemiológica do RSV associada a
diferentes morbidades (Johnson et al., 1987; García et al., 1994; Cintra et al.,
2001).
Figura 2- Desenho esquemático da proteína G. As áreas rachuradas correspondem a
domínios citoplasmático e transmembrana respectivamente, e a área sem rachuras à
região extracelular. As duas regiões em verde correspondem à regiões hipervariáveis e
a região em verde mais claro corresponde à área mais conversada. Os “C” indicados
correspondem a resíduos de cisteína. Extraído de Cane, 2001
10
1.4 Replicação Viral
O ciclo replicativo do RSV obedece ao padrão do ciclo dos outros
paramixovirus, entretanto, é importante delinear vários aspectos da sua
patogênese, incluindo a sua entrada na célula hospedeira pelas proteínas de
superfície (as proteínas F e G), o que as difere dos outros paramixovirus
(Srinivasakumar et al., 1991; Collins et al., 2001).
Primeiramente, há ligação do vírus pela proteína de adsorção (proteína
G) à superfície da célula hospedeira. O receptor específico para a
glicoproteína G é a heparina ou outro glicosaminoglicano (GAs) presentes na
membrana celular (Martinez & Melero, 2000). A seguir, ocorre a fusão do
vírus e membrana celular por ação da proteína de fusão (proteína F) (Walsh &
Hruska, 1983; Levine et al., 1987). O nucleocapsídeo viral é liberado no
citoplasma celular e todas as etapas da replicação do RSV ocorrerão no
citoplasma celular, não ocorrendo envolvimento do núcleo celular (Kingsbury,
1990).
A proteína F também media a fusão de células infectadas com as
células adjacentes que ainda não foram infectadas induzindo a formação de
sincícios. As proteínas G e F são duas principais glicoproteínas de superfície
encontradas na superfície das células infectadas. A pequena proteína
hidrofóbica (proteína SH) codificada pelo RSV, também é expressa em altos
níveis na superfície de células infectadas, porém é incorporada de forma
ineficaz na partícula viral (Collins & Mottet, 1992).
Após a liberação do nucleocapsídeo viral no citoplasma celular, ocorre,
então, a transcrição do genoma viral, do sentido 3’ a 5’, a partir de um
11
promotor localizado na terminação 3’. A enzima RNA polimerase RNA
dependente adere-se à região “leader” do genoma iniciando a transcrição do
primeiro nucleotídeo. Na junção entre a região leader e o primeiro gene
(NS1), ocorre a liberação do transcrito e a polimerase recomeça a transcrição
de forma seqüencial do início ao fim, guiada pelos sinais de início e final do
gene, região “trailer”. Esse mecanismo resulta na produção de RNAs
mensageiros (mRNA) de cópias iguais ao gene original sem modificações. Os
RNAs são poliadenilados na extremidade 3’ e recebem um “cap” (nucleotídeo
guanosina conectado ao RNA pela ligação 5' a 5' trifosfato) na extremidade 5’
(Collins et al., 2001).
Adicionalmente à transcrição e à tradução de proteínas, ocorre a
replicação do genoma viral que produz uma fita de RNA intermediária positiva
(+ssRNA), esta servirá como molde para gerar cópias do genoma viral (-
ssRNA). A produção do intermediário positivo requer que a maquinaria de
produção de mRNAs entre em um modo “anti-terminação”, ignorando todos
os sinais de início e fim de cada gene, bem como a seqüência “leader” e NS1
(Collins et al., 2001).
A princípio, a maturação do vírus ocorre com a combinação das
proteínas N e P ao RNA genômico e subseqüente adição de outras proteínas
auxiliares ao nucleocapsídeo. As glicoproteínas virais, modificadas por
glicosilação durante o transporte pelo retículo endoplasmático e pelo
complexo de Golgi, ocupam o lugar das proteínas celulares na membrana
citoplasmática. A seguir, a proteína da matriz se junta na porção interna do
envelope nascente. O nucleocapsídeo alcança a superfície e ocorre seu
12
brotamento levando consigo uma porção da membrana plasmática
(Kingsbury, 1990).
Figura 3- Genoma do RSV e um diagrama esquemático da partícula viral- Le-
“leader” e tr- “trailer” (Wertz & Moudy, 2004).
1.5 Variação Antigência
Pioneiramente, Coates e col., em 1966, publicaram um trabalho que
mostrava a variabilidade antigênica de isolados de RSV pelo teste de
neutralização com soro hiperimune. Os pesquisadores demonstraram as
diferenças entre as cepas protótipo de laboratório A2 e 18537 por anti-soro
policlonal (Coates et al., 1966).
Posteriormente, com o advento de anticorpos monoclonais, um amplo
número desses anticorpos de camundongos foi utilizado contra as proteínas
N, P, M, F e G do Vírus Sincicial Respiratório. Observou-se que a
glicoproteína G apresentava maior divergência em relação às outras
proteínas. Foram então estabelecidos os dois grupos antigênicos do RSV:
grupo A e grupo B (Anderson et al., 1985; Mufson et al, 1985; García-Barreno
Proteínas do envelope
G (adesão)
F (fusão)
SH (pequena proteína
hidrofóbica)
M (matriz)
Proteínas não
-
-estruturais:
NS1 e NS2
“Core” Ribonucleoprotéico:
L
(
polimerase
)
13
et al., 1989). Em 1991, Cristina e col. correlacionaram os dois grupos
antigêncios a grupos distintos geneticamente (Cristina et al., 1991).
Com base em testes de reatividade de anticorpos monoclonais com um
amplo painel de cepas virais foram identificados três tipos de epítopos na
glicoproteína G: a) epítopos conservados que estavam presentes em todos os
isolados virais tanto do grupo A como do grupo B; b) epítopos grupos-
específicos divididos por todos os vírus do grupo antigênico e c) epítopos
cepa-específica ou epítopos variáveis que estão presentes em certos isolados
do mesmo grupo antigênico (Martinez et al., 1997).
Através da análise de nucleotídeos da proteína G de diversos isolados,
verificou-se que para cada grupo do vírus (A e B) e dentro de cada subgrupo,
a proteína G mostra uma alta divergência (Garcia et al., 1994). Essa é de 33%
de diferença na seqüência de nucleotídeos e 47% na seqüência de
aminoácidos, entre os subgrupos A e B (Johnson et al., 1987).
Embora, apresentem padrões evolutivos semelhantes, o grupo A do
RSV apresenta uma maior variação que a do grupo B. Tal fato explica a
predominância do grupo A em relação ao grupo B em diversos estudos
epidemiológicos (Coggins et al., 1998; Martinez et al.; 1999).
De acordo com Garcia, baseado na distribuição geográfica de
amostras do grupo A e sua prevalência em diferentes epidemias, é provável
que o vírus dissemina-se de um lugar a outro. Contudo, é importante ressaltar
a rapidez com que o vírus originário de um lugar move-se a lugares distantes
e a mudança genética viral devido à acumulação de mutações (García et al.,
1994).
14
1.5.1 Variabilidade genotípica
A variabilidade de isolados dentro dos grupos A e B do RSV foram
inicialmente demonstradas com diferença nas reações com anticorpos
monoclonais e depois usando métodos de clivagem com enzimas de
restrição, ensaio com RNAse, ensaio de mobilidade heteroduplex e análise de
seqüenciamento de nucleotídeos (Sullender et al., 1993; Cane, 2001; Kuroiwa
et al., 2004). O seqüenciamento de nucleotídeos do gene G mostra que a
variabilidade de aminoácidos é acima de 20% dentro do grupo A e 9% dentro
do grupo B (Cane, 2001).
Análises filogenéticas de seqüência de nucleotídeos do gene G
permitiram a definição de um número de genótipos (caracterização da análise
de nucleotídeos) do RSV pertencendo aos grupos A e B (Cane, 2001). As
designações de genótipo são muito úteis na ilustração da multiplicidade de
cepas circulando em um local, bem como a presença de genótipos
predominantes durante a estação de RSV, a mudança na proporção relativa
de cepas dos grupos A e B e na predominância de um genótipo a cada ano.
Enfim, a diferença nas cepas ajuda a entender a transmissão do RSV em
hospitais, na comunidade e globalmente (Peret el al., 1998).
A nomenclatura dos genótipos não é ainda consistente entre
laboratórios, está claro que novos genótipos costumam surgir, enquanto
outros não são amplamente detectáveis (Cane, 2001; Venter et al., 2001).
Peret e col., em 1998, mostraram em seu estudo que a ocorrência das
mudanças nas cepas de RSV é consistente e uma importante característica
da epidemiologia das infecções pelo RSV (Peret et al., 1998). Inúmeros
15
trabalhos, em diversos países do mundo: África do Sul, Brasil, Estados
Unidos, Quênia, demonstraram que múltipos genótipos co-circulam em uma
epidemia, genótipos diferentes predominam em cada epidemia e cepas
detectadas no final da estação tendem a ser predominantes na próxima
estação, que deve estar associado à evasão antigênica da imunidade do
hospedeiro (Peret et al. 2000; Venter et al., 2001; Sato et al., 2005). Os vírus
isolados em diferentes lugares e em diferentes epidemias podem apresentar
semelhanças, reforçando que RSV dissemina-se amplamente no mundo
inteiro (Anderson et al., 1985; Coggins et al., 1998).
Alguns genótipos podem predominar por anos. Choi & Lee observaram
na comunidade na Coréia em um estudo por nove anos seguidos, a mudança
do grupo A, com o desaparecimento de alguns genótipos e o aparecimento de
novos genótipos na mesma comunidade. Os genótipos predominantes em
mais de duas epidemias consecutivas tendem a aumentar em número por
muitos anos e entram em declínio (Choi & Lee, 2000).
Por outro lado, em Estolcomo, na Suécia, um único genótipo dominou
por quatro epidemias, especulando-se sobre a possibilidade que a variação
na região A-terminal da proteína G pode permitir a dominância prolongada do
genótipo. Entretanto, a função biológica da região A terminal variável da
proteína G na imunidade ainda é desconhecida (Rafiefard et al., 2004).
Kuroiwa e col. observaram na Coréia que um genótipo epidêmico em 1980 e
1981 ressurgiu 20 anos depois (Kuroiwa et al., 2004).
Em um estudo em comunidades nos Estados Unidos, Peret e col.
observaram que o padrão de circulação de genótipos era distinto na maioria
16
das comunidades. Isso indica que o padrão de circulação das cepas do RSV
durante surtos na comunidade é complexo, pois cepas iguais ou semelhantes
circulam ao nível de uma comunidade durante um surto, e não
necessariamente refletem no nível regional, nem nacional. Os autores
suspeitam que fatores locais, assim como imunidade prévia cepa-específica
contra o vírus e possivelmente a relativa aptidão do RSV circulante ditam qual
vírus que irá circular na próxima estação (Peret et al., 2000).
Muitos estudos de epidemiologia molecular concentram-se em países
desenvolvidos com boas conexões aéreas para o resto do mundo. Portanto, a
disponibilidade desses dados permite que se estude a dispersão viral para
diversas partes do mundo. No estudo de Cane e col., em 1999, foi observado
que em Gâmbia, na África, possivelmente, os RSV isolados eram
efetivamente uma mistura de cepas circulando no mundo desenvolvido,
entrando no país pela costa e distritos da área urbana, e cepas que eram
derivados de regiões do interior dessa parte da África (Cane et al., 1999).
A habilidade do vírus em causar reinfecções pode ser devido a uma
inadequada resposta imune ou à variabilidade do vírus. A infecção natural
pelo RSV fornece apenas imunidade protetora limitada. A proteína G está
envolvida na neutralização e com a resposta protetora dos anticorpos. Ainda
não está claro se a mudança nos genótipos do gene G pode explicar
infecções repetidas. Consistentes mudanças de genótipos em muitas
epidemias consecutivas sugerem que o aparecimento de um genótipo
particular pode ser causado em parte por aumento da imunidade para aquele
17
genótipo, ocasionando uma vantagem seletiva na mudança da proteína G
(Cane et al., 1991; Choi & Lee, 2000).
Embora haja muitas especulações sobre a função da glicoproteína G na
imunidade, é provável que haja outros fatores contribuintes para as
reinfecções. Outro antígeno do RSV, a proteína F, que é extremamente
sensível às mudanças na seqüência dos aminoácidos, deve ganhar uma
maior consideração e ser mais bem estudada (Wertz & Moudy, 2004).
Alguns estudos tentaram correlacionar diferença na morbidade de
infecções definida por hospitalização e necessidade de ventilação mecânica
com os diferentes grupos ou genótipos do RSV. Entretanto, a maioria deles
não evidenciou tais diferenças (Anderson et al., 1985; Cane, 2001; Kuroiwa et
al., 2004; Scott et al., 2004). Cintra e col. (2001) observaram que os pacientes
que apresentavam o RSV do grupo B tinham leve tendência a desenvolver
doença mais grave em relação pacientes infectados com o grupo A (Cintra et
al., 2001). Martinello e col., Fletcher e col., relataram que um determinado
genótipo do grupo A é mais grave (Fletcher el al. 1997; Martinello et al.,
2002). Devincenzo sugeriu uma pequena correlação entre determinados
subgrupos e uma maior carga viral (Devincezo, 2004).
De acordo com o estudo de Venter, sugere-se que a mesma cepa do
vírus pode causar infecção branda no trato respiratório superior, infecção no
trato respiratório inferior e grave doença respiratória. Mesmo em crianças
expostas a fatores de risco semelhantes, provavelmente há outros fatores,
assim como genética e a resposta imune individual, tendo maior influência na
gravidade da doença do que as cepas infectantes (Venter et al., 2002).
18
Mais recentemente, genótipos do tipo B estão surgindo e predominando
em alguns locais do mundo. O novo genótipo BA, cuja característica é
conferida pela inserção de 60 nucleotídeos na terceira região C-terminal da
proteína G, predominou na epidemia de 2002 a 2003 em Sapporo no Japão
(Sato et al., 2005).
Essa mudança drástica na proteína G introduzida durante a
propagação do RSV foi relatada em cepas nas epidemias do RSV em países
da América do Sul (Argentina em 2001, Brasil em 2005 e Uruguai), no Japão
e no Quênia. As cepas asiáticas e argentinas predominaram
aproximadamente durante três epidemias com pequenas mudanças, o que
atesta o alto vigor do vírus (Scott et al., 2004; Blanc et al., 2005; Galiano et
al., 2005; Sato et al., 2005; Reis, 2006; Trento 2006).
Nagai e col observaram um surto de infecção nosocomial de cepas
idênticas do genótipo BA em um hospital no Japão. Os sintomas desses
casos eram os mesmos das infecções do RSV causadas por genótipos
comuns indicando que essa variante tinha uma patogenicidade como dos
outros (Nagai et al., 2004).
1.6 Diagnóstico laboratorial
As amostras clínicas do RSV são obtidas por aspiração ou lavado
nasal de secreções de nariz ou nasofaringe ou por “swab” nasal. Devido ao
RSV ser um vírus lábil, a amostra depois de colhida deve ser guardada sob
refrigeração ou inoculada rapidamente (Collins et al., 2001).
19
O diagnóstico do RSV varia laboratório para laboratório. Existem várias
técnicas diagnósticas, entretanto, cada laboratório utiliza a técnica que lhe for
conveniente. O isolamento viral em cultura de células é técnica clássica para
diagnóstico do RSV, e considerado padrão ouro até recentemente. A
confirmação do efeito citopático é feita pela detecção de antígeno por
imunofluorescência (Collins et al., 2001). Entretanto, há técnicas mais
sensíveis para o diagnóstico do RSV e o padrão ouro vem sendo transferido
para técnicas moleculares, como a reação de PCR (Tantivanich et al., 1995;
van Elden et al., 2002; Reis, 2006).
Devido às dificuldades do isolamento viral em cultura de células, o
diagnóstico do RSV utilizado em muitos de laboratórios de rotina é feito por
detecção de antígenos do RSV em células epiteliais de nasofaringe, por
imunofluorescência ou ensaio imunoenzimático. Esses métodos são rápidos,
não necessitam de partículas virais viáveis e apresentam estabilidade nas
lâminas fixadas. Entretanto, há necessidade de um técnico bem treinado para
leitura das lâminas de imunofluorescência, já que pode haver inespecificidade
devido à presença de muco na amostra. Outra desvantagem da técnica de
imunofluorescência é que a lâmina deve conter um bom número de células,
dessa forma a coleta, o transporte e processamento das amostras devem ser
adequados para que as células não sejam destruídas (Kellogg, 1991; Tristam
& Welliver, 1996).
O método de detecção do antígeno utilizando técnicas de
imunofluorescência ou ensaio imunoenzimáticoo apresenta variações de 75 a
95% de sensibilidade em crianças. Entretanto, em adultos, o título viral é mais
20
baixo, podendo ser um fator para redução na sensibilidade da técnica (Falsey
& Walsh, 2000).
A sorologia pode ser útil para diagnóstico retrospectivo da infecção
pelo RSV em crianças maiores e adultos. Um aumento de anticorpos no soro
ou na saliva medidos por neutralização ou ensaio imunoenzimático revelou-se
um bom indicador de reinfecção (Collins & Pollard, 2002).
A detecção do ácido nucléico do vírus por RT-PCR oferece maior
sensibilidade em relação às técnicas citadas anteriormente e ainda permite o
ensaio multiplex que detecta também outros vírus respiratórios
simultaneamente (Hall, 2001).
Mais recentemente, diversos ensaios de PCR em tempo real foram
desenvolvidos para o RSV (Borg et al., 2003; Hu et al., 2003; van Elden et al.,
2003; Boivin et al., 2004; Dewhurst-Maridor et al., 2004). O sistema baseia-se
na detecção e quantificação de uma molécula repórter cujo sinal aumenta em
proporção conforme a quantidade de amplificação do produto gerado
(Niesters, 2001). Nessa técnica, não é necessária etapa pós-PCR como gel
de eletroforese e hibridação. A eliminação da etapa de pós-PCR aumenta a
rapidez do ensaio e reduz as chances de contaminação-cruzada, e
conseqüentemente de resultados falso-positivos (Boivin et al., 2004)
Já estão disponíveis técnicas de RT-PCR em tempo real que detecta,
quantifica e tipa o RSV simultaneamente (Hu et al., 2003). Borg e col
relataram, em seu ensaio com sonda TaqMan, uma sensibilidade trinta vezes
maior que um nested RT-PCR em pacientes com doença pulmonar (Borg et
al., 2003). Boivin e col. desenvolveram um ensaio multiplex para RSV e vírus
21
Influenza e encontraram 15% de sensibilidade a mais comparando com
método de detecção de antígeno de RSV (Boivin et al., 2004).
1.7 Epidemiologia
A infecção pelo RSV atinge todas as faixas etárias e o vírus distribui-se
mundialmente. A infecção pelo RSV é mais comum em meninos do que em
meninas. De um modo geral, quando o clima, a susceptibilidade imune e
fatores sociológicos se associam, a epidemia de RSV afeta, especialmente,
crianças menores, crianças desprotegidas imunologicamente, causando
também doença em crianças mais velhas, adultos e idosos (Stensballe et al.,
2003).
O RSV surge em surtos no mundo inteiro, com menor atividade durante
metade do ano e freqüentemente pico de intensa atividade num período de
dois a quatro meses. A sazonalidade do RSV varia consideravelmente entre
regiões. Em climas temperados, Mediterrâneo e deserto o RSV está
associado com estação fria enquanto que, em climas tropicais associa-se com
estação chuvosa (Weber et al., 1998).
O fato de o RSV comportar-se de forma diferente, geralmente
ocorrendo quando a umidade absoluta é alta nos trópicos e quando a
temperatura é baixa em climas temperados, é de difícil explicação. É possível
que essa sazonalidade do vírus não esteja relacionada a fatores climáticos,
mas sim, a mudanças no comportamento social em determinadas estações
ou a uma interação com outras infecções que são sazonalmente
determinadas (Weber et al., 1998).
22
De acordo com Waris & White, fatores como aumento da temperatura e
maior incidência de luz ultravioleta contribuiriam para o declínio da infecção
viral. Entretanto, o mais importante fator de declínio é provavelmente a
redução da aglomeração de pessoas em locais fechados, visto que no verão
há férias escolares e também reduz-se o número de crianças pequenas em
hospitais (Waris & White, 2006).
No Brasil, na cidade de São Paulo, região sudeste subtropical, Vieira e
col. observaram o início do surto no final de março ou começo de abril, e
tendo o pico no mês de maio, o surto estende-se até o inverno (Vieira et al.,
2001). Silva e col, também encontraram o pico de circulação do RSV em maio
durante anos seguidos em São Paulo em uma unidade de terapia intensiva
(Silva et al., 2004). Por outro lado, na região nordeste que apresenta clima
tropical, Moura e col. relataram o surto na estação chuvosa, na primeira
metade do ano (Moura et al., 2006). Na região Sul, na cidade do Rio Grande
do Sul, onde a temperatura é mais fria, o pico do surto é no inverno (Straliotto
et al., 2001).
A epidemia perde a força com a mudança de clima, aspectos
comportamentais e a queda do número de pessoas susceptíveis ao longo da
epidemia. Talvez essa combinação de fatores mais o reservatório do vírus em
adultos com doença pulmonar obstrutiva crônica e indivíduos
imunocomprometidos explicam a epidemia natural do RSV (Stensballe et al.,
2003).
23
1.8 Imunopatogênese
O aspecto clínico da infecção varia de acordo com a idade. A infecção
primária ocorre de seis meses a dois anos de idade, geralmente sintomática e
envolve o trato respiratório inferior. Infecções primárias assintomáticas pelo
RSV são raras em crianças (Ogra, 2004).
Infecções repetidas em crianças mais velhas e em adultos são menos
graves. Os sintomas comuns da infecção do RSV nesse grupo são rinorréia,
congestão nasal, faringite e tosse. As infecções mais graves no trato
respiratório são freqüentemente associadas à sibilância respiratório (causado
por bronquiolite ou bronquite e asma), pneumonia e otite média aguda (Ogra,
2004). Em idosos, o RSV pode causar doença respiratória no trato inferior,
sendo a pneumonia a complicação mais freqüente e levar à hospitalização
(Falsey et al., 1995; Dowell et al., 1996).
Entre as crianças, a infecção pelo RSV causa de 50 a 90% de
hospitalizações por bronquiolite, de 5 a 40% das hospitalizações por
pneumonia e de 10 a 30% por traqueobronquite. Os grupos que apresentam
maior morbidade na infecção pelo RSV, devido à sua fragilidade imunológica,
são os neonatos, prematuros, indivíduos portadores de doenças cardíacas e
os imunocomprometidos (Falsey & Wash 2000; Hall, 2001).
O RSV infecta predominantemente as células epiteliais de trato
respiratório(Hacking & Hull, 2002). Uma vez que o vírus infecta o indivíduo, o
período de incubação estimado do RSV é de cinco dias. No início da infecção,
o vírus se replica na nasofaringe, alcançando altos títulos de até 10
6
TCID
50
(doses por mL de secreção nasal)
em crianças pequenas. A migração do
24
vírus do trato respiratório superior ao trato inferior provavelmente envolve a
aspiração de secreções ou migração via epitélio respiratório (Domachowske &
Rosenberg, 1999).
A resposta imune contra o RSV, a princípio envolve defesas
inespecíficas. As células epiteliais respiratórias, embora sejam os principais
alvos da infecção pelo RSV são também as primeiras linhas de defesa inatas
contra o vírus, juntamente com os macrófagos e células “natural killer (NK)”. A
liberação de NF-Kβ, como resultado da entrada do RSV no epitélio
respiratório, estimula a transcrição de genes diretamente envolvidos na
resposta antiviral (Harris & Werling, 2003).
Os macrófagos presentes nos alvéolos têm um importante papel na
defesa inata contra o RSV, regulando a resposta imune seguinte através da
liberação de citocinas pró-inflamatórias, como fator de necrose tumoral (TNF),
interleucina-6 (IL-6) e IL-8 ou IL-10 que pode levar a imunossupressão local
ou estimular uma resposta tipo TH2. Por outro lado, a produção de IL-12, que
favorece o desenvolvimento de uma resposta tipo TH-1 e estimula as células
NK, é inibida pelo RSV. A liberação de TNF e IL-10 é estimulada na presença
de SPA (proteína produzida pelas células epiteliais) aumentando a
opsonização do RSV e desse modo, aumentando a proteção (Harris &
Werling, 2003).
A resposta imune não adaptativa também inclui mediadores
inflamatórios, como quimiocinas, leucotrienos e citocinas quimiotáticas. Esses
mediadores ajudam atrair células T, portanto, levam ao desenvolvimento da
imunidade adaptativa com linfócito T auxiliar (Harris & Werling, 2003).
25
Crianças com uma infecção primária pelo RSV desenvolvem uma
resposta imune celular dentro de 10 dias da infecção. Entretanto, não é bem
determinada a função desses linfócitos CD4+ e CD8+ na infecção pelo RSV.
Essas células podem reduzir a disseminação do vírus pelo pulmão ou
aumentar os danos causados pela infecção (Hacking & Hull, 2002). De acordo
com Graham e col. (2002), a patogênese crítica na primo-infecção é uma
aberrante resposta da célula TCD8+, devido a mecanismos citolíticos
ineficientes que levam à prolongada remoção do vírus (Graham et al., 2002).
A infecção primária pelo RSV induz a resposta por anticorpos IgM em 5
a 10 dias, dependendo da idade do paciente. A resposta específica por IgG
pode ser vista em muitos pacientes de 20 a 30 dias do início dos sintomas.
Um ano após a primeira infecção os anticorpos IgG tendem a declinar. Após a
reinfecção há um aumento nos níveis de IgG. Os anticorpos IgA, aparecem
posteriormente, podem ser encontrados livres ou ligados às células nas
secreções de nasofaringe. Os anticorpos IgE também podem ser encontrados
da mesma forma do IgA (Ogra, 2004)
Os anticorpos contra a proteína F apresentam reatividade cruzada com
os diferentes grupos antigênicos do RSV. Entretanto, a resposta contra a
glicoproteína G é grupo específico (Walsh et al., 1987; Cane, 1997). Embora,
já tenha sido discutido sobre o papel da diversidade da glicoproteína G,
outros fatores imunológicos devem ser levados em consideração em relação
à imunidade ao vírus.
À medida que a idade das crianças aumenta e ocorrem reinfecções, a
gravidade da doença vai diminuindo, ou seja, diminui chance de doença no
26
trato respiratório baixo e bronquiolite. A idade influencia em determinantes
anatômicos na patogênese da doença. Entretanto, o acúmulo da experiência
adquirida pela infecção sugere fortemente que fatores imunes, provavelmente
por limitar a extensão e quantidade da replicação viral, influenciam nas
características da doença associada com reinfecção (Henderson et al., 1979).
Os anticorpos neutralizantes (contra as proteínas F e G) presentes nas
reinfecções apresentam um importante papel na redução da gravidade da
doença, bem como, como proteção à infecção pelo RSV, porém a proteção
está distante de ser completa e duradoura (Kawasaki et al., 2004; Hall et al.¸
1991). Por outro lado, nos indivíduos idosos, especula-se que ocorra um
desequilíbrio na resposta imune celular Th1/Th2, fato que pode ocasionar
maior morbidade pelo RSV nessa faixa etária (Looney et al, 2002).
1.9 RSV em receptores de transplante de células-troncohematopoéticas
Após o transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH), a
reconstituição do sistema imune é complexa e pode levar muitos anos para se
completar. Ela começa ocorrer após a “pega medular”. Esse termo refere-se
ao aumento do número de neutrófilos no sangue periférico e inicia-se a
resposta imune inata celular. Posteriormente ao aumento de granulócitos,
ocorre aumento de plaquetas e hemácias (Ross, 1996).
A recuperação da imunidade não ocorre de forma instantânea e
também depende de muitos fatores, como o tipo de TCTH (autólogo,
alogênico ou singênico), ocorrência de doença do enxerto contra o
27
hospedeiro, imunodepressão, estímulos antigênicos, idade, etc. De acordo
com a revisão de Lum, nessa fase de recuperação pós-TCTH, muitos
pacientes sofrem reinfecção por microorganismos devido à imunidade estar
incompleta (Lum, 1987).
Nos receptores de transplante de células-troncos hematopoéticas
(TCTH), Whimbey e col., no Anderson Cancer Center, nos Estados Unidos;
Bowden e col. no Fred Hutchinson Center Research Center, também nos
Estados Unidos; Ljungman e col. no European Group for Blood and Bone
Marrow Transplantation, em centros de transplante da Europa; Machado e
col. na Unidade de Transplante de Células-tronco Hematopoéticas do Hospital
das Clínicas de São Paulo, no Brasil; e Raboni e col. na Unidade de
Transplante de Células-tronco Hematopoéticas da Universidade Federal do
Paraná, também no Brasil, observaram que nos anos de seus estudos, o RSV
é o vírus respiratório que mais afetava esses pacientes, causando graves
complicações, como pneumonia, a qual pode levar à morte (Whimbey et al.,
1995; Bowden, 1997; Ljungman, 2001; Machado et al., 2003; Raboni et al.,
2003).
A infecção pelo RSV inicia-se no trato respiratório superior progredindo
para doença respiratória no trato respiratório inferior (DRTI) (Falsey & Walsh,
2000). Taxas de mortalidade em torno de 20% podem ser observadas em
imunocomprometidos portadores de leucemia com pneumonia pelo RSV (Van
Elden et al., 2002).
Em unidades de TCTH a incidência de infecção por RSV nos pacientes
é cerca de 6% (McCarthy et al., 1999; Small et al. 2002). Cinqüenta a 76 %
28
dos pacientes com infecção por RSV em trato respiratório superior
desenvolvem pneumonia por esse vírus ocasionando taxa de mortalidade de
6,6 a 19,2% (Whimbey et al., 1996; Bowden, 1997; McCarthy et al., 1999;
Ljungman, 2001; Small et al., 2002; Machado et al., 2003). No estudo de
Whimbey e col., os pacientes que foram autopsiados por morte por
pneumonia com infecção pelo RSV (sete de 12) apresentavam no tecido
pulmonar células multinucleadas ou células gigantes com inclusão viral
intracitoplasmática, características de pneumonia por RSV. O uso de
anticorpos monoclonais confirmou o diagnóstico. Apenas um paciente
apresentava co-infecção (candidíase disseminada) (Whimbey et al., 1996).
Os pacientes transplantados passam por um esquema de
quimioterapia com ou sem radioterapia, conhecido como regime de
condicionamento que visa destruir os elementos imuno-hematopoéticos,
diminuir a chance de recaída da doença e a rejeição do enxerto. Um dos
efeitos imediatos do condicionamento é a ocorrência de mucosite. Esses
danos podem facilitar a passagem do vírus ao trato respiratório (Hertz et al.,
1989).
O risco de pneumonia e morte nesse grupo nos receptores de TCTH
está intimamente relacionado ao tempo pós-transplante. O primeiro mês pós-
transplante é de alta morbidade para esses pacientes. De acordo com
Harrington (1992), o período que antecede a “pega medular” também é crítico.
Em seu estudo, os pacientes no período de pré-“pega medular” (de sete a 15
dias pós transplante) tendiam a desenvolver pneumonia mais freqüentemente
que os indivíduos que já sofreram a “pega medular”, mas a mortalidade era
29
similar nesses grupos quando ambos tinham pneumonia (Harrington et al.,
1992). Whimbey e col. (1997) encontraram 70% de pneumonia por RSV no
período correspondente ao primeiro mês pós-transplante (Whimbey et al.,
1997).
Embora, com menor morbidade, o RSV também pode causar
pneumonia em pacientes em período tardio pós-transplante (Khushalani et al.,
2001). De acordo com Martino (2005), mais fatores de risco estão envolvidos
na primeira infecção pós-transplante por vírus respiratórios e sua progressão
clínica: excreção viral prolongada na infecção no trato superior e progressão a
DRTI (Martino et al., 2005).
Frente à importância da infecção por RSV nesses pacientes
imunodeprimidos, segundo as recomendações do Center of Control of
Infectious Diseases e Prevention e American Society of Blood and Bone
Marrow Transplantation,
caso haja DRTI e for diagnosticada uma infecção por
RSV no período pré-transplante, o transplante deve ser adiado (Sullivan et al.,
2001).
Em seu estudo retrospectivo no Fred Hutchinson Center Research
Center, nos Estados Unidos, Peck e col. analisaram receptores de TCHT que
tiveram ou não o transplante adiado caso após a confirmação de infecção
pelo RSV. Os pacientes cujo transplante foi adiado, apresentaram menor risco
de desenvolver pneumonia, enquanto que a maioria dos pacientes cujo
transplante foi realizado diante à infecção desenvolveram pneumonia (Peck et
al., 2004).
30
1.9.1 Prevenção e Tratamento
Atualmente, a ribavirina inalatória é o único medicamento licenciado
para o tratamento da infecção pelo RSV. A ribavirina é um análogo de
nucleosideo sintético que atua na inibição da replicação viral de vírus DNA e
RNA, inibindo a síntese de proteínas virais estruturais (Chidgey & Broadley,
2005).
Alguns mostram que a terapia precoce à infecção do RSV aumenta a
sobrevivência dos receptores de TCTH (Ottolini & Hemming, 1997; McColl et
al., 1998; Adams et al., 1999). Alguns autores relatam aumento da
sobrevivência desses pacientes com a combinação do tratamento com
ribavirina e anticorpos neutralizantes (De Vincenzo et al., 2000; Ghosh et al.,
2000). Boeckh e col. realizaram um estudo randomizado com a administração
de ribavirina 2 vezes ao dia em receptores de TCTH com infecção por RSV
em vias aéreas superiores. Os autores notaram redução da progressão à
pneumonia e diminuição da carga viral nos pacientes que haviam recebido o
tratamento (Boeckh et al., 2007). Entretanto, a maioria dos estudos ainda não
é consistente em relação à eficácia da ribavirina.
Atualmente, dois tipos de imunoglobilinas contra o RSV estão
disponíveis para prevenção do RSV: imunoglobulina RSV-específica (RSV-
IGIV; Respigam, MedImmune Inc.) e palivizumab (Synagis, MedImmune,
Inc.). A RSV-IGIV é uma preparação policlonal contendo anticorpos
neutralizantes concentrados produzidos do soro de adultos humanos. O
palivizumab é um anticorpo monoclonal IgG quimérico humanizado produzido
31
por tecnologia recombinante direcionado a um epítopo do domínio A da
proteína F (Chidgey & Broadley, 2005).
Outra forma de prevenção seria vacina, porém, o desenvolvimento de
uma vacina contra o RSV é complicado pelo fato de a resposta imune
contribuir para a patogênese da doença. Dois tipos de vacinas estão sendo
desenvolvidos no momento para diferentes grupos de indivíduos (Girard et al.,
2005).
A imunização por vacinas de subunidades deve ser útil para idosos,
mães grávidas e crianças de alto-risco. A administração de vacinas
candidatas baseadas na proteína F purificada mostrou segurança em adultos
saudáveis, em crianças maiores de um ano, com ou sem doença respiratória,
em idosos e mulheres grávidas (Girard et al., 2005).
Por outro lado, a imunização por vacinas atenuadas vivas tem
preferência em crianças sem histórico de infecção pelo RSV. Essa vacina
pode ser administrada pela mucosa nasal através da imunização intranasal. A
dificuldade para o desenvolvimento dessa vacina consiste alcance do
equilíbrio entre uma alta ou baixa atenuação do vírus e da limitada
estabilidade genética (Girard et al., 2005).
O principal objetivo da vacinação contra o RSV não é prevenir a
infecção, mas especialmente prevenir suas complicações, ou seja, a infecção
do trato respiratório inferior (Dudas & Karron, 1998).
Enfim, de acordo com Couch e col. (1997) há três categorias gerais de
opções de controle para as infecções respiratórias que são: a prevenção da
32
exposição; fornecimento da imunidade e administração de antivirais. (Couch
et al., 1997).
1.9.2 Infecção Nosocomial
Há três vias de transmissão do RSV. A primeira é por pequenas
partículas de aerosol, geralmente por tosse ou espirros, não sendo necessário
contato direto. A segunda via é por gotas ou partículas maiores, isso requer
contato direto de pessoa a pessoa. A terceira via e a mais importante delas é
a contaminação de superfícies que pode ser transmitida à pele e permanecer
tempo suficiente para auto-inoculação no trato respiratório. A facilidade da
transmissão desse vírus respiratório, provavelmente, é a responsável pela
ocorrência de infecções hospitalares (Hall, 2000).
Em seus estudos em uma unidade de TCTH, Whimbey e col.
observaram que em torno de 50% das infecções pelo RSV são adquiridas por
transmissão intra-hospitalar. Nesses estudos, a infecção hospitalar foi definida
pela presença de sintomas sete dias após internação e posteri or confirmação
virológica (Whimbey et al, 1996; Whimbey et al., 1997).
Diferentes cepas do RSV podem ser introduzidas no hospital. Uma vez
introduzido na unidade, o vírus infecta outras pessoas. A infecção intra-
hospitalar é adquirida provavelmente por exposição a uma pessoa infectada
ou contato com superfícies contaminadas. As pessoas transmissoras do vírus
podem ser: os funcionários do hospital (incluindo enfermeiras, médicos); os
pacientes e a visita de familiares (principalmente crianças). Um fator
contribuinte para a transmissão e aquisição dessas infecções é a estadia
prolongada destes pacientes imunodeprimidos e sua longa excreção viral
33
(Englund et al., 1991; Storch et al., 1993; Couch et al., 1997; Mazzulli et al.,
1999; Taylor et al., 2001).
De acordo com Hall, embora a maioria dos funcionários infectados pelo
RSV seja sintomática, a excreção do vírus ocorre em cerca de 20% dos
funcionários assintomáticos, o que pode ser uma importante fonte de
transmissão do vírus em hospitais (Hall, 2000).
Medidas preventivas devem ser adotadas para redução da infecção
nosocomial, tais como: programa de educação continuada aos funcionários
do hospital com relação à infecção pelo RSV; diagnosticar a infecção do RSV
em funcionários e pacientes; uso de máscara, avental e luvas para o contato
com pacientes infectados ou com sintomas (isolamento de contato); lavagem
das mãos; proibição de visitas com sintomas de infecção respiratória;
afastamento temporário dos funcionários sintomáticos, isolamento dos
pacientes infectados ou na ausência de leitos disponíveis; colocação de
pacientes com a mesma infecção no mesmo quarto (Raad et al., 1997).
De acordo com as recomendações de The Centers for Disease Control
e Prevention, Infectious Diseases Society of America, e American Society for
Blood and Marrow Transplantation Practice Guidelines and Beyond, o
isolamento de contato deve ser instituído para todos os pacientes
sintomáticos, ainda antes da confirmação virológica (Sullivan et al., 2001).
No acompanhamento de oito epidemias do RSV em um hospital
pediátrico, ao adotar medidas preventivas à infecção hospitalar pelo RSV,
Macartney e col. conseguiram reduzir a incidência do RSV adquirido dentro
do hospital em 39% e ainda economizar recursos que seriam gastos no
34
tratamento dos possíveis doentes pelo RSV (Macartney et al., 2000). Essas
intervenções incluíam: reconhecimento precoce dos pacientes com sintomas
de infecção respiratória, confirmação da infecção pelo RSV por testes
laboratoriais, estabelecimento de “cohorting” de pacientes e equipe de
enfermagem, uso de luvas e máscaras, monitoramento e programa
educacional aos funcionários. Já em relação a unidades de TCTH, também
houve redução nas taxas de incidência após a adoção de medidas
preventivas à infecção hospitalar (Garcia et al., 1997).
Enfim, para interromper a transmissão nosocomial em hospitais,
particularmente em unidade de transplante de células-tronco hematopoéticas,
onde a morbidade pela infecção pelo RSV é grande, é essencial que a equipe
de controle de infecção hospitalar seja informada precocemente do
diagnóstico de infecção respiratória em todos pacientes, para que medidas
apropriadas sejam implementadas (Aitken & Jeffries, 2001).
Atualmente, o termo “infecção hospitalar” vem sendo gradualmente
substituído por infecção em serviços de saúde, termo que abrange infecções
em áreas emergentes tais como assistência domiciliar, hospitais de pacientes
crônicos, clínicas de procedimentos ambulatoriais, etc (Maragoni & Santos,
2005). Neste trabalho, daqui a diante, o termo atual “infecção em serviços de
saúde” será adotado.
35
JUSTIFICATIVA
Poucos estudos caracterizando as cepas do RSV foram feitos em
unidades de internação, e principalmente em ambulatório, que atende
receptores de Transplante de Células-tronco Hematopoéticas (TCTH). Tendo
em vista a grande importância dessas infecções nesses pacientes e a
ausência de estudos similares em nosso meio, este projeto buscou
caracterizar epidemiologicamente as cepas de RSV detectados nos
receptores de TCTH do Hospital das Clínicas da FMUSP entre abril de 2001 a
dezembro de 2003.
______________________________________________________________
II OBJETIVO
37
II OBJETIVO
Caracterizar de forma molecular as cepas do RSV encontradas nos
receptores de Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas do
Hospital das Clínicas nos surtos de 2001 e 2002.
______________________________________________________________
III CASUÍSTICA E MÉTODOS
39
III. CASUÍSTICA E MÉTODOS
3.1. População estudada
Amostras de lavado de nasofaringe (LNF) de receptores de TCTH, com
sintomas de infecção do trato respiratório superior, foram colhidas no período
de 2001 a 2002. Esses pacientes estavam internados na enfermaria ou
freqüentavam o ambulatório (hospital-dia) da Divisão de Transplante de
Células-tronco Hematopoéticas do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo.
3.2 Características das unidades de internação e ambulatório de TCTH
3.2.1 Unidades de internação
Os receptores de TCTH eram internados em quartos individuais nessa
unidade para o transplante ou em caso de complicações pós-transplante. A
unidade de TCTH apresentava seis quartos com ar filtrado e pressão positiva,
separados da unidade de internação da Hematologia por uma ante-sala. Na
enfermaria da Hematologia, não há ambientes de ar filtrado e pressão positiva
e dois pacientes podem ocupar o mesmo quarto, se necessário. Receptores
de transplante de TCTH com diagnóstico de infecção por vírus respiratórios
e/ou em tratamento com ribavirina inalatória eram transferidos da unidade de
transplante para a Hematologia a fim de minimizar a dispersão de vírus
respiratório pelo ar em função da pressão positiva desses quartos.
40
3.2.2 Ambulatório
O ambulatório de TCTH atende pacientes em diversos períodos pós-
transplante. Nesse local eram realizadas as coletas de exames e era feito
todo o atendimento médico, como consultas e infusão de medicação. O
ambulatório funcionava diariamente das 7.00 às 19.00h.
Os pacientes partilhavam, por longos períodos, o salão de medicação
que continha seis poltronas pantográficas, os sanitários e uma pequena sala
de espera. O local de coleta de amostras para exames era o salão de
medicação. O atendimento médico era feito em salas isoladas (consultórios)
que eram também utilizadas para o “cohorting” de pacientes com infecções
por vírus respiratórios e que necessitavam receber medicação no ambulatório
(foto do local vide anexo D).
3.3 Definições
3.3.1 Infecção em serviços de saúde
Transmissão cruzada ou intra-hospitalar do vírus foi definida para os
pacientes internados na enfermaria.
Infecção de origem nosocomial pelo RSV foi definida pela presença de
sinais e sintomas de doença respiratória no trato superior e/ou doença
respiratória no trato inferior em associação com os seguintes critérios: (1)
ausência de sinais ou sintomas de doença respiratória na admissão; (2) teste
de imunofluorescência direta negativa para o RSV em amostra de secreção
respiratória na admissão, e (3) teste de imunofluorescência direta positiva ao
41
menos cinco dias após a admissão (baseado na média do período de
incubação do RSV que é de 5 dias) (Garcia et al., 1997).
3.3.2 Período de diagnóstico positivo para o RSV
O período de diagnóstico positivo para o RSV foi estabelecido pelo
período que as amostras respiratórias sucessivas dos pacientes mostravam-
se positivas para o RSV pelas técnicas de imunofluorescência direta e/ou
PCR.
3.3.3 Infecção no trato respiratório superior e trato inferior
A infecção no trato respiratório superior era definida como a presença de
coriza, faringite e/ou tosse com ou sem febre e radiografia do tórax limpa.
Infecção no trato respiratório inferior foi definida pela presença de sibilo,
hipóxia ou pneumonia com radiografia com infiltrado de aparecimento recente.
3.4 Medidas de controle de infecção por vírus respiratórios
3.4.1 Unidade de internação:
Coleta de lavado de nasofaringe de todos os pacientes sintomáticos
para pesquisa de vírus respiratórios por imunofluorescência direta;
Isolamento de contato nos casos positivos;
Proibição de visitas de crianças menores de 12 anos de idade;
Retirada dos pacientes dos quartos com pressão positiva no caso de
detecção de vírus respiratórios e transferência para quartos da
Hematologia, conforme citado anteriormente.
42
3.4.2 Ambulatório da unidade TCTH:
Coleta de lavado de nasofaringe de todos os pacientes sintomáticos
para pesquisa de vírus respiratórios por imunofluorescência direta;
Uso de máscara na unidade em caso de sintomas respiratórios e/ou
diagnóstico de vírus respiratórios;
Uso de lençóis descartáveis nas cadeiras pantográficas;
Uso de um consultório individualizado compartilhado, se necessário,
com outros pacientes infectados pelo RSV (“cohorting”).
3.5 Conduta mediante infecção pelo RSV
Pacientes com diagnóstico de infecção pelo RSV recebiam tratamento
com ribavirina inalatória nas seguintes situações: presença de infecção em
trato respiratório baixo demonstrada por raio X de tórax e/ou tomografia
computadorizada; diagnóstico de RSV antes da enxertia da medula óssea ou
pacientes com DECH aguda ou crônica.
O tratamento era feito com ribavirina inalatória administrada pelo
nebulizador SPAG – 2, administrado por máscara na dose de 6g/dia (20
mg/mL durante 18h à noite) por sete dias. Em associação, imunoglobulina
endovenosa era administrada em dias alternados na dose de 500 mg/kg.
Frente ao diagnóstico de RSV, coletas de lavado de nasofaringe (LNF)
eram colhidas a cada dois dias, tanto em pacientes internados como
atendidos no ambulatório. Os pacientes eram retirados do isolamento de
contato após duas amostras negativas com intervalo de uma semana.
43
3.6 Métodos Laboratoriais e de análise
O fluxograma dos métodos laboratoriais está mostrado na figura 4.
3.6.1 Coleta das amostras e identificação do RSV
As amostras de lavado de nasofaringe estudadas foram obtidas de
receptores de TCTH e pacientes que estavam no período de
condicionamento pré-TCTH, que apresentaram sintomas de infecção
respiratória entre abril de 2001 a dezembro de 2002.
As amostras de lavado nasal foram coletadas de acordo com Englund et
al. (1996) e processadas por imunofluorescência direta (IFD) com anticorpo
monoclonal para o RSV com kit Dako (Imagen, Dako, Cambridgeshire, Reino
Unido) para o projeto “Viroses respiratórias em receptores de transplante de
medula óssea” realizado nos anos de 2001, 2002 e 2003.
O diagnóstico de infecção pelo Vírus Sincicial Respiratório foi feito em
21 dos 141 pacientes analisados em 2001e 22 dos 181 pacientes em 2002.
3.6.2 Estocagem das amostras
Após preparação da lâmina para IFD, o restante da amostra foi
aliquotado e estocado em tampa de lise. Foram utilizados 400µl de lavado de
nasofaringe para 600µl de tampão de lise para a estocagem da amostra
clínica em freezer à temperatura de –70ºC.
Quando a quantidade de material foi insuficiente para estocagem, foi
dada prioridade ao diagnóstico rápido pela imunofluorescênsica direta (IFD)
no projeto “Viroses Respiratórias”.
44
Figura 4- Fluxograma dos métodos laboratoriais deste trabalho. As setas com maior
espessura indicam procedimentos realizados no projeto “Viroses Respiratórias”.
IFD
+
+
Seqüenciamento automatizado e
análise das seqüências
Coleta da amostra
Extração do RNA
IFD
processamento e aliquotagem
armazenamento freezer -70ºC
Síntese de cDNA
Amplificação-PCR-1ª etapa
2ª etapa- semi nested
Purificação do produto de PCR Reação de seqüência e
Precipitação do DNA
Genotipagem
IFD
+
+
Seqüenciamento automatizado e
análise das seqüências
Coleta da amostra
Extração do RNA
IFD
processamento e aliquotagem
armazenamento freezer -70ºC
Síntese de cDNA
Amplificação-PCR-1ª etapa
2ª etapa- semi nested
Purificação do produto de PCR Reação de seqüência e
Precipitação do DNA
Genotipagem
45
3.6.3 Extração do RNA total
A extração de RNA foi realizada em uma sala separada do laboratório,
onde há manipulação das amostras e é específica para extração de ácidos
nucléicos.
As extrações de RNA de amostra clínica de lavado de nasofaringe
contavam com um controle positivo (RSV de cepa padrão A2 isolado em
cultura de células) e controle negativo (cultura de células permissivas para
RSV negativa).
O RNA das amostras positivas para RSV diagnosticado por
imunofluorescência foi extraído pelo método de extração com sílica-gel
(Nuclisens
Biolab-Mérieux).
As amostras contendo 400µl de amostra e 600µl de tampão de lise 5
mol/L (Nuclisens
Biolab-Mérieux,) foram retiradas do freezer e foram
adicionados 50µl de sílica (Nuclisens
Biolab-Mérieux), e essas foram
homogeneizadas e mantidas à temperatura ambiente por 10 minutos, afim de
se obter a ligação da sílica ao RNA. Após, os tubos contendo as amostras
foram centrifugados por 20 minutos a 6800 xg e o sobrenadante foi aspirado à
vácuo. A seguir, foram adicionados 1000 µl de tampão de lavagem
(Nuclisens
Biolab-Mérieux). Os tubos foram homogeneizados vigorosamente
no agitador de tubos até que se dissolvesse o “pellet” formado e a seguir,
centrifugados por 20 minutos a 6800 xg. Após, o sobrenadante foi
desprezado. O procedimento com o tampão de lavagem foi repetido duas
vezes. A solução contendo a amostra do RNA viral foi lavada duas vezes com
etanol 70% (Merck, Darmstadt, Alemanha), realizando-se centrifugação
46
durante 20 minutos por 6800 xg e uma vez com acetona pura (Merck,
Darmstadt, Alemanha). A seguir, o RNA extraído foi seco por 10 minutos a
56ºC e foram adicionados 50 µl de tampão de eluição (Nuclisens
Biolab-
Mérieux). Após, os tubos foram agitados no agitador de tubos e centrifugados
durante um minuto a 15300 xg. O RNA extraído foi estocado no freezer à
temperatura de -70ºC ou foi feita a transcrição reversa.
3.6.4 Transcrição reversa
A síntese de DNA complementar (cDNA) foi realizada dentro de um fluxo
laminar e uma sala diferente à sala de extração.
Para a síntese de cDNA foram preparados duas misturas. Foram
adicionados 22 µl do RNA extraído na mistura I. Essa foi preparada com os
seguintes reagentes com suas respectivas concentrações finais: buffer (1,0X)
(Invitrogen, São Paulo, Brasil), desoxiribonucleotídeos (dNTPs) (0,2mM)
(Invitrogen), MgCl
2
(5,0mM) (Invitrogen), enzima inibidora de ribonuclease
(40U) (RNAseout, Invitrogen) , DTT(103M) (Invitrogen) e água DEPC (Gibco).
Essa mistura junto ao RNA foi aquecida no termociclador Mastercycler
Gradient Eppendorf 5331 (Eppendorf, Hamburg, Alemanha), a 65ºC por 5
minutos para linearizar a fita de RNA e após, à temperatura de 22ºC, a
mistura II foi adicionada. A mistura II foi preparada com iniciadores
randômicos (2,5 µM) (Invitrogen), M-MLV (enzima transcriptase reversa)
(2,5U) (Invitrogen). O volume final da reação era de 45 µl. Uma vez
adicionada a mistura II à amostra, ocorreu o emparelhamento dos iniciadores
randômicos à temperatura de 22ºC por 15 minutos. A síntese do cDNA foi
47
realizada a 37ºC por 30 minutos e à 95ºC, por 5 minutos, a reação foi
cessada.
3.6.5 Amplificação
A montagem das reações de PCR foi realizada em uma sala de pré-PCR
dentro de um fluxo laminar, onde após cada montagem de reação e
manipulação de cDNAs, o fluxo era limpo com álcool 70% e a luz ultravioleta
era acesa.
As reações de PCR contavam com um controle positivo (cDNA de RSV
de cepa padrão A2 isolado em cultura de células) e controle negativo (água
adicionada à mistura no lugar da amostra).
1ª etapa
A amplificação do cDNA foi efetuada por PCR com iniciadores
complementares aos RNAs mensageiros das proteínas de fusão (F) e adesão
(G). Primeiramente foi preparada uma mistura de reagentes com as
respectivas concentrações finais: tampão de reação (Invitrogen
®
) (1X); dNTPs
(Invitrogen
®
) a 0,2mM; MgCl
2
a 1,5mM; iniciadores FV(anti-senso) e
GAB(senso)(Invitrogen
®
) a 0,5 µM e; enzima taq polimerase (Invitrogen
®
) a 2
unidades e; água bi destilada auto-clavada em um volume final de reação de
50 µl. A sequência dos iniciadores está mostrada na tabela 1. A seguir, 5µl da
amostra de cDNA foi adicionada à mistura. O volume final da reação era de
50 µl. Posteriormente, a amostra junto à mistura foram colocada no
termociclador Mastercycler Gradient Eppendorf 5331 (Gradient Eppendorf,
48
Hamburg, Alemanha), cujo programa era: 10 minutos a 95ºC; 1 minuto a
94ºC, 55ºC e 72ºC em 35 ciclos; e 7 minutos a 72ºC para extensão final.
2ª etapa
Foi realizada a reação “semi-nested” PCR. Foi feita outra mistura de
reagentes contendo: tampão de reação (1x concentrado), dNTPs a 0,25mM,
MgCl
2
a 1,5 mM, iniciador F1AB (anti-senso) e GAB(senso) a 0,3 µM, taq
polimerase (2 unidades) e água bidestilada auto-clavada. Foram adicionados
5µl do DNA amplificado na primeira etapa a essa mistura. A seguir, a amostra
junto à mistura foi colocada no termociclador Mastercycler Gradient Eppendorf
5331, cujo programa era igual ao da primeira etapa.
Tabela 1- Seqüência dos iniciadores utilizados nas reações de PCR
* iniciador também utilizado na reação de seqüência
3.6.6 Análise dos produtos amplificados
Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese em gel de
agarose. Uma mistura de 10µl do produto amplificado e 2µl de tampão de
corrida (bromofenol azul) foi aplicado em um gel de agarose (ultra pura
Iniciador
Posição (nucleotídeo - nt) Seqüência (5’-3’)
F1AB (anti-senso)* 3-22 - proteína F
CAACTCCATTGTTATTTGCC
(Peret et al., 1998)
FV (anti-senso) 163-186 proteína F
GTTATGACACTGGTATACCAACC
(Zheng et al., 1996)
GAB (senso)* 504-524 proteína G
YCAYTTTGAAGTGTTCAACTT
(Peret et al., 2000)
49
GIBCO- BRL, Gai Hersburg, MD, EUA) contendo 1,5% de agarose tampão
TAE 0,1X (40mM Tris acetado e 1mM de EDTA, Gibco) em cuba horizontal,
com a adição de brometo de etídio no gel numa concentração final de
0,4µg/ml. Foi utilizado um marcador de peso molecular de 100 pb a 0,25µg
(GIBCO-BRL, Gai Hersburg, MD, EUA). O gel foi submetido à eletroforese em
uma carga de 90 volts por 30 minutos. A leitura do gel foi feita em
transluminador de luz ultravioleta e foi fotografado (AlphaImager EC, Alpha
Innotech Corporation).
3.6.7 Purificação do produto de PCR
Os produtos da semi nested PCR foram purificados a fim de remover
dNTPs e iniciadores residuais da reação de PCR, utilizou-se o kit Microcon
Millipore Purification (Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA). Adicionou-se
400µl de água DEPC (Gibco) em uma coluna contida em um tubo de 1,5 ml. A
seguir, foram adicionados 40 µl do produto de PCR à coluna. Os tubos foram
levados à centrífuga (Eppendorf
®
) e centrifugados a 500xg por 15 minutos. A
seguir, os tubos foram retirados das colunas e descartados e as colunas
foram colocadas invertidas em tubos novos. Foram adicionados mais 40 µl de
água DEPEC a cada coluna e os tubos foram novamente levados à centrífuga
e centrifugados a 500xg por 5 minutos. As colunas foram removidas e
descartadas e as amostras de DNA foram retidas no tubo. O produto de PCR
foi purificado.
50
3.6.8 Quantificação do DNA
Os produtos purificados foram submetidos à corrida em um gel de
agarose 1,5% (conforme já descrito) e quantificadas com o auxílio do
marcador de massa molecular (DNA Mass Leader, Gibco BRL). A quantidade
dos produtos de PCR de cada amostra foi comparada às intensidades das
bandas do marcador de massa molecular pela foto do gel.
3.6.9 Reação de Seqüenciamento
Para cada amostra foram feitas duas reações em paralelo utilizando-se
os iniciadores GAB e F1AB. Foi utilizado o kit Big Dye v2,0 (Applied
Biosystems, Foster City, CA, EUA). Para cada reação com o iniciador GAB, o
DNA amplificado da amostra (30-90ng) foi misturado a uma mistura de
reagentes contendo: 8µl de Terminator Ready Reaction mistura, tampão Save
Money (Applied Biosystems), iniciador GAB (4,0 pmoles) e água qsp, num
volume final de reação de 20 µl. O mesmo procedimento foi repetido para o
iniciador anti-senso FAB. A reação foi levada ao termociclador Eppendorf,
cujo programa era: aquecimento a 96ºC por 10 segundos, 50ºC por 15
segundos, 60ºC por 4 minutos, em 25 ciclos.
3.6.10 Precipitação do DNA
A precipitação foi realizada a fim de se remover o excesso de
dideoxinuclotídeos terminadores presentes na reação de seqüência. O
método utilizado foi de precipitação por isopropanol. Primeiramente, foi
transferido o conteúdo total da reação de extensão para os microtubos de
51
microcentrifuga e foram adicionados 80µl de isopropanol 75% e agitou-se no
agitador de tubos. Após, os tubos foram incubados à temperatura ambiente
por 15 minutos para a precipitação dos produtos de extensão. A seguir, os
tubos foram centrifugados por 20 minutos. Passado esse tempo, o
sobrenadante foi retirado, foram adicionados 250µl de etanol 75% e os tubos
foram agitados no agitador de tubos. Após, os tubos foram centrifugados por
5 minutos. Posteriormente, as amostras foram secas no “speed vacum”. A
seguir, o pellet da amostra foi ressuspenso com formamida e corante e o DNA
das amostras foi denaturado à 95ºC por 2 minutos e após, foram refrigerados
em blocos de metal refrigerados.
3.6.11 Seqüenciamento e análise das seqüências
As amostras foram corridas no seqüenciador ABI PRISM 377 DNA
sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os eletroferogramas
foram analisados com programa Seq Man (DNASTAR, Inc, EUA para PC) de
modo a obter um segmento de 270 nucleotídeos correspondente à segunda
região variável do gene codificador da glicoproteína G, designada como G2,
que compreende os nucleotídeos 649-918 para o grupo A e 652-921 para o
grupo B (Peret et al., 1998).
3.7 Análise dos dados e construção das topologias
As seqüências foram alinhadas com o programa ClustalX (Thompson
et al., 1997) e convertidas em arquivos no formato NEXUS.
52
Seqüências do RSV circulante na comunidade nos anos de 2001,
2002 e 2003 adquiridas de crianças atendidas no Hospital Universitário da
USP foram cedidas gentilmente por Daniele Bruna, Dra. Viviane Botosso e
Prof.º Edison Luiz Durigon do Laboratório de Virologia do Instituto de Ciências
Biomédicas da USP. Duas seqüências de RSV isoladas de receptores de
TCTH no ano de 2003 (paciente 1171 e paciente 976) também foram
incorporadas na análise. Essas seqüências foram incluídas na análise a fim
de obter um perfil das cepas circulantes nesses anos, verificar se a cepa
circulante na unidade de TCTH tinha o mesmo perfil das cepas da
comunidade ou se era uma cepa restrita a esse local e se as cepas
circulantes no ano já haviam circulado em ano anterior ou circularia em ano
seguinte. As árvores filogenéticas foram construídas através de alinhamentos
do grupo A e amostras do grupo B, usando o método de máxima
verossimilhança com o programa PAUP*4.0 versão Beta – Sinauer
Associates, Inc, (Swofford, 1998), para Power Macintosh e Unix.
Para a realização da genotipagem das amostras, seqüências foram
adquiridas do GeneBank de acordo com Peret e col., e Venter e col., e foi
utilizado o método de distância utilizando-se o algorítmo Neighbor Joining
(Saitou and Nei, 1987) com o programa PAUP*4.0 versão Beta – Sinauer
Associates, Inc, (Swofford, 1998), para Power Macintosh e Unix (Peret et al.,
1998; Venter et al., 2002) (vide apêndice).
53
3.8 Aspectos Éticos
O presente estudo foi aprovado pela Comissão de Ética par Análise de
Projetos de Pesquisa – CAPPesq da Diretoria Clínica do Hospital das Clínicas
e da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (USP)(protocolo
nº047/05) (Vide Anexo A).
Esse grupo seguido na Divisão de Transplante de Células-tronco
Hematopoéticas do Hospital das Clínicas de São Paulo assinou termo de
consentimento livre e esclarecido para o projeto “Viroses Respiratórias em
receptores de Transplante de Medula Óssea” e teve sua aprovação do comitê
de ética da CAPPesq em 2001(protocolo nº 589/01) (Vide anexos B e C).
______________________________________________________________
IV RESULTADOS
55
IV. RESULTADOS
4.1 Amostras estudadas
Das 21 amostras positivas por imunofluorescência direta para o Vírus
Sincicial Respiratório no ano de 2001, sete puderam ser analisadas. Em
relação às amostras do ano de 2002, das 22 amostras positivas, 12 puderam
ser analisadas.
Entretanto, como o objetivo deste trabalho não foi comparar a
positividade entre a técnica de biologia de molecular e imunofluorescência,
mas sim analisar as cepas virais, as amostras que puderam ser recuperadas
por biologia molecular foram analisadas.
4.2 Características da população estudada
As características dos pacientes receptores de transplante de células-
tronco hematopoéticas que tiveram a cepa do RSV analisada estão
mostradas nas tabelas 2 e 3. A tabela 2 refere-se aos pacientes do ano de
2001 e a tabela 3 aos pacientes de 2002.
Os pacientes do ano de 2001, a maioria era do sexo feminino. A idade
dos pacientes no momento em que foi diagnosticada a infecção variou de 37
a 51 anos, apresentando média de 41,5 anos e mediana de 39 anos. O tempo
pós-transplante no momento em que ocorreu o diagnóstico da infecção variou
de -6 a 1947 dias, apresentando média de 392 dias e mediana de 14 dias. A
maioria dos pacientes sofreu transplante alogênico e apresentava leucemia
mielóide crônica como doença de base, as outras eram: leucemia mielóide
aguda, mieloma múltiplo e linfoma não Hodkgin.
56
No ano de 2002 a maioria dos pacientes também era do sexo feminino.
A idade dos pacientes variou de 8 a 51 anos, apresentando média de 31,8
anos e mediana de 31 anos. O tempo pós-transplante no momento variou de -
13 a 3786 dias, apresentando uma média de 462,75 e mediana de 123 dias.
A maioria dos pacientes sofreu transplante alogênico e apresentava leucemia
mielóide crônica como doença de base, seguida por leucemia mielóide aguda
e mieloma múltiplo.
Tabela 2– Características dos pacientes infectados pelo RSV no ano de 2001
paciente
sexo*
idade**
tipo de
transplante
dia pós
transplante
doença de
base
Unidade de TCTH**
687 M 37,06 alogênico
754
LMC Ambulatório
445 F 51,93 alogênico 1947 LMC Ambulatório
997 M 42,76 alogênico 2 LMC Ambulatório
1034 F 32,19 alogênico 25 LLA Ambulatório
1032 F 49,48 autólogo 14 MM Ambulatório
1023 M 38,13 autólogo -6 LNH Enfermaria
1152 F 39 alogênico 6 LMC Ambulatório
*as abreviaturas da coluna “sexo” correspondem à: F-feminino M-masculino** idade do paciente no
momento em que foi diagnosticada a infecção *** local onde o paciente se encontrava no momento
em que foi diagnosticada a infecção
Tabela 3 – Características dos pacientes infectados pelo RSV no ano de 2002
* as abreviaturas da coluna “sexo” correspondem à: F-feminino M-masculino** idade do paciente no
momento em que foi diagnosticada a infecção *** local onde o paciente se encontrava no momento em que foi
diagnosticada a infecção
paciente
sexo*
idade**
tipo de
transplante
dia pós
transplante*
doença de
base
Unidade de TCTH***
147
F 50,92 alogênico 3786 LMC Ambulatório
1322
F 28,34
alogênico 57 LMA Ambulatório
1329
M 37,99
alogênico 42 LMC Ambulatório
1370
F 38,82
alogênico -13 LMC Ambulatório
1321
F 29,2
alogênico 62 LMC Ambulatório
1149
M 14,4
alogênico 326 LLA Ambulatório
817
M 8,14
alogênico 155 LLA Ambulatório
1220
F 46,21
autólogo 276 MM Ambulatório
1328
F 29,15
alogênico 59 LMA Ambulatório
858
F 21,66
alogênico 557 LMA Ambulatório
1248
M 44,06
alogênico 134 LMC Ambulatório
1308
M 32,81
autólogo 112 MM Ambulatório
57
4.3 PCR
O produto da primeira etapa resultava em fragmento de 653 pares de
bases (pb) para amostras do grupo A e 656 pb para amostras do grupo B. O
fragmento gerado pela reação “semi nested PCR” resultou em fragmentos de
489 para amostras do grupo A e 492 para amostras do grupo B (figura 5).
Figura 5- Foto de gel de agarose (gel 1,5% corado com brometo de etídeo) do
produto do RSV amplificado por “semi nested RT-PCR”. As bandas das amostras 1 e 2
correspondem ao produto do 2ª etapa (em torno de 490 pb), a banda da amostra 4
corresponde ao produto da 1ª etapa (em torno de 650 pb).
4.4 Análise das cepas virais
Das sete cepas analisadas dos pacientes infectados em 2001, cinco
pertenciam ao grupo A e duas ao grupo B (tabela 4). Três cepas do grupo A
desse ano foram consideradas altamente relacionadas. Uma cepa do grupo B
58
do ano de 2001 era altamente relacionada a uma cepa do ano de 2002.
(figura 6). Uma cepa do grupo A também era altamente relacionada a uma
cepa do ano de 2002 (figura 7). O genótipo predominante nesse ano foi o
GA2, seguido pelo GA5 e SAB1 (tabela 4).
A figura 8 mostra a análise genotípica das amostras encontradas do
grupo A e a figura 9 mostra a análise genotípica das amostras encontradas do
grupo B.
Das doze cepas analisadas do ano 2002, oito cepas pertenciam ao
grupo B e quatro, ao grupo A (tabela 5). Sete cepas do grupo B desse ano
foram consideradas altamente relacionadas entre elas (figura 7). O genótipo
predominante nesse ano foi o SAB3, seguido pelo SAB1 e GA2 (tabela 4).
Tabela 4- Grupo e genótipo do RSV dos pacientes infectados em 2001
Nº Paciente Grupo do RSV Genótipo
687 B
SAB1
997 A
GA2
445 B
SAB1
1034 A
GA2
1032 A
GA2
1023 A
GA5
1152 A
GA5
59
Tabela 5- Grupo e genótipo do RSV dos pacientes infectados em 2002
Nº Paciente Grupo do RSV Genótipo
147 A
GA2
1322 B
SAB3
1329 B
SAB3
1370 B
SAB3
1321 B
SAB3
1149 B
SAB3
817 A
GA2
1220 A
GA5
1328 B
SAB3
858 B
SAB1
1248 B
SAB1
1308 B
SAB3
A figura 10 mostra um mapa do momento da infecção pelo RSV em
pacientes internados e ambulatoriais, o momento da internação do paciente, o
dia da visita do paciente para coleta de amostra, o período em que o vírus
ficou sendo diagnosticado e o perfil da cepa aos demais pacientes nos anos
de 2001 e 2002. Para a interpretação das descrições a seguir foram utilizadas
as figuras 6 e 7 e figuras 8 e 9.
4.4.1 Ano de 2001
O paciente 687 foi um dos primeiros a ser infectado pelo RSV no ano
de 2001, no outono, início do mês de maio (figura 10). A cepa do vírus desse
paciente não era relacionada filogeneticamente a nenhuma cepa dos
pacientes infectados em 2001. Entretanto, essa cepa era intimamente
60
relacionada à cepa que infectou o paciente 1248 e também foi uma das cepas
que abriu a temporada do surto do RSV em 2002. Essas cepas
compartilhavam o mesmo genótipo (SAB1) que as cepas isoladas de alguns
pacientes do ano de 2001 (TMO4451) e do ano de 2002 (TMO12482 e
TMO8582).
Os pacientes 997, 1034 e 1032 estavam infectados com cepas
altamente relacionadas filogeneticamente. Essas cepas compartilhavam o
mesmo genótipo (GA5) que cepas circulantes na unidade de TCTH no ano de
2002 (TMO1472 e TMO8172) e no ano de 2003 (TMO9763). Um aspecto
mais detalhado do momento em que esses pacientes foram diagnosticados
com infecção pelo RSV pode ser visto na figura 11.
O paciente 445 estava infectado com uma cepa do RSV que era
divergente das demais cepas nos surtos. Entretanto, compartilhava o mesmo
genótipo (SAB1) que a cepa TMO6871 isolada do paciente 687 no ano de
2001 e do paciente 1248 cuja cepa foi isolada no ano de 2002.
O paciente 1023 também foi infectado com uma cepa divergente das
demais encontradas nos pacientes infectados no ano de 2001, porém a cepa
era altamente relacionada à cepa que infectou o paciente 1220 no ano de
2002. Ambas, compartilhavam o mesmo genótipo (GA5) que a cepa
TMO11521 (isolada do paciente 1152 no ano de 2001) e a cepa TMO11713
(isolada do paciente 1171 no ano de 2003).
O paciente 1152 foi também infectado com uma cepa divergente em
relação às outras cepas encontradas. Essa cepa foi uma das últimas
encontradas no surto do RSV no ano de 2001.
61
No ano de 2001, as cepas do RSV circularam na unidade de TCTH
principalmente nos meses de maio e junho, sendo mostrado pelo período de
diagnóstico de infecção pelo RSV de todos os pacientes infectados tanto os
quais as cepas puderam ser analisadas e os que não puderam ser analisadas
(figura 10).
4.4.2 Ano de 2002
O paciente 1248, como já foi citado, foi infectado com uma cepa
altamente relacionada filogeneticamente à cepa (TMO6871) presente na
unidade de TCTH no ano de 2001. Essa cepa iniciou o surto em 2002, no
outono, final do mês de abril (figura 10).
O paciente 147 foi infectado com uma cepa divergente das cepas dos
outros pacientes infectados. Entretanto, essa cepa estava relacionada com
cepas que circulariam na comunidade no ano de 2003, cepa BR11903 e
BR13903 e na própria unidade de TCTH, cepa TMO9763 . A cepa TMO1472
compartilhava o mesmo genótipo (GA2) que as cepas isoladas de outros
pacientes da unidade de TCTH.
Os pacientes 1322, 1329, 1370, 1321, 1149, 1308 e 1328 foram
infectados com cepas altamente relacionadas pertencentes ao genótipo
SAB3. As cepas desses pacientes relacionavam-se com cepas circulantes na
comunidade no ano de 2001: BR8601 e BR1501. Um aspecto mais
detalhado do momento em que esses pacientes foram diagnosticados com
infecção pelo RSV pode ser visto na figura 11.
62
O paciente 817 foi infectado com uma cepa divergente em relação às
cepas circulantes na unidade de TCTH, entretanto, essa cepa apresenta o
mesmo padrão de uma cepa circulante na comunidade no ano de 2001 (cepa
BR5901) e no ano de 2002 (cepa BR8502). Essa cepa viral surgiu de forma
tardia, no mês de agosto e permanecendo até a primavera, no meio de
outubro, quando a circulação de RSV na unidade de TCHT encerrou-se no
ano de 2002.
O paciente 1220, como já citado, foi infectado com uma altamente
relacionada à cepa (cepa TMO10231) presente na unidade de TCTH no ano
de 2001. A cepa TMO12201 compartilha o mesmo genótipo (GA5) que cepas
isoladas da unidade TCTH no ano de 2001(TMO10231 e TMO1152) e no ano
de 2003 (TMO11713).
O paciente 858 estava infectado com uma cepa do RSV que era
divergente das demais cepas nos surtos, entretanto, compartilhava o mesmo
genótipo (SAB1) que cepas circulantes na unidade de TCTH no ano de 2001
e uma cepa do ano de 2002 e apresentava alta proximidade com a cepa
SA0025.
Um primeiro grupo de infectados foi visto entre o meio de abril ao
começo de junho, infelizmente essas cepas não puderam ser analisadas. Um
outro grupo de pacientes, cujas cepas também não puderam ser analisadas,
apresentou o período de infecção entre agosto e setembro (figura 10).
63
Figura 6 – Árvore filogenética pelo método de verossimilhança para amostras do
grupo A junto às cepas circulantes na comunidade. Modelo de evolução utilizado:
GTRG. Valor de verossimilhança: 955,3 .Bootstrap com 500 réplicas
.
Nota: As cepas que
começam com a sigla TMO correspondem aos pacientes receptores de TCTH, o número seguinte à
sigla, indica o número do paciente e as amostras que começam com BR são de amostras da
comunidade. O dígito final mostra o ano em que as amostras foram encontradas: dígito final 1-ano
de 2001, dígito final “2”- ano de 2002 e dígito final “3” –ano de 2003. Os valores em cima dos ramos
indicam os valores de “bootstrap”.
60
93
59
94
87
96
100
71
97
57
65
65
62
66
60
93
59
94
87
96
100
71
97
57
65
65
62
66
64
Figura 7 – Árvore filogenética pelo método de verossimilhança para amostras do
grupo B junto às cepas circulantes na comunidade. Modelo de evolução utilizado:
TNRI. Valor de verossimilhança: 717,9. Bootstrap com 500 réplicas
.
Nota: As cepas que
começam com a sigla TMO seguida por número correspondem ao número dos pacientes receptores
de TCTH e as amostras que começam com BR são de amostras da comunidade. O dígito final
mostra o ano em que as amostras foram encontradas: dígito final 1-ano de 2001, dígito final “2”- ano
de 2002 e dígito final “3” –ano de 2003. Os valores em cima dos ramos indicam os valores de
“bootstrap”.
97
84
63
92
68
84
97
84
63
92
68
84
65
Figura 8- Árvore filogenética pelo método de distância utilizando o algorítimo
neighbour-joining das amostras do RSV do grupo A junto às seqüências extraídas
do Genebank para realização da genotipagem.
As cepas que começam com a sigla TMO
correspondem aos pacientes receptores de TCTH, número seguinte à sigla indica o número
do paciente. O dígito final mostra o ano em que essas amostras foram encontradas: dígito
final 1-ano de 2001, dígito final “2”- ano de 2002 e dígito final “3” –ano de 2003. Cepa A2 e
Long-cepas padrão do grupo A.As seqüências adquiridas do GeneBank estão incluídas,
identificadas pelas iniciais indicando a sua origem: Al- Alabama; NY-New York; MO-Missouri; TX-
Texas, CN-Canadá, e SA-África do Sul. Os valores em cima dos ramos indicam os valores de
“botstrap”.
GA5
GA2
GA3
GA7
GA6
GA4
GA1
GA5
GA2
GA3
GA7
GA6
GA4
GA1
66
Figura 9 –Árvore filogenética pelo método de distância utilizando o algorítimo
neighbour-joining das amostras do RSV do grupo B junto às seqüências extraídas
do Genebank para realização da genotipagem
.
As cepas que começam com a sigla TMO
correspondem aos pacientes receptores de TCTH, o número seguinte à sigla indica o número do
paciente. O dígito final mostra o ano em que essas amostras foram encontradas: dígito final 1-ano
de 2001, dígito final “2”- ano de 2002 e dígito final “3” –ano de 2003. Cepa Ch18537- cepa padrão do
grupo B. As seqüências adquiridas do GeneBank estão incluídas, identificadas pelas iniciais
indicando a sua origem: Al- Alabama; NY-New York; MO-Missouri; TX-Texas, CN-Canadá, e SA-
África do Sul. Os valores em cima dos ramos indicam os valores de “botstrap”.
GB3
SAB2
GB2
SAB1
GB1
SAB3
GB3
SAB2
GB2
SAB1
GB1
SAB3
Figura 10
-
Mapa da
infecção RSV dentro da unidade de TCTH no HC nos anos de 2001 e 2002
Nota-Os pacientes infectados com quadros de cores iguais indicam infecção com cepa altamente relacionada, exceto os quadros pintados de vermelho (cepas não
analisadas). No quadro a risca forte preta delimita na parte de cima as cepas coloridads que foram analisadas e na parte de baixo as cepas em vermelho que não
foram analisadas.
(ou outra cor) data da amostra positiva para RSV
cuja cepa viral foi seqüenciada
(ou outra cor) período em que o RSV foi
diagnosticado positivo
óbito
(ou outra cor) data de amostra positiva para o
RSV
.
dia em que o paciente esteve hospitalizado
x
c
data de visita ao ambulatório sem coleta de
lavado nasal
L
L
L
data de amostra negativa para o RSV
paciente
1 5 10 15 20 25 30 1 5 10 15 20 25 30 1 5 10 15 20 25 30 1 5 10 15 20 25 30
687
c L L L L
445
L L L
997
L L . . L . . . . . . L . . . . . L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x
1034
L c L . . . . L . . . . . L
1032
L c L L . . . . . . . L . . . . . . . . . . . . . . . . .
1023
L c c . . L . L . . . . . . L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1152
L L . . . . . . L . . L . . . . . L . . . . . .
1004
L
913
L L
1030
L L . . . L . . . . . . . . . . . . . . . . .
959
L L
720
L L
1033
L . . . . L . . . . . . . . . . . . . L . . L . . . . L
929
L L . . . . . . .
1050
. . . . . . . L . . L . . . . . . L . . . . . L . .
1048
L L L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
944
L L L
788
L L L
706
L L
1009
L L L L
570
L L L . .
MAIO JUNHO JULHO AGOSTO
paciente
20 25 30
1 5
10 15 20 25 30
1 5
10 15 20 25 30
1 5
10 15 20 25 30
1 5
10 15 20 25 30
1 5
10 15 20 25 30
1 5
10 15
1322
.
.
.
.
L
c c L L L L
1329
L L L L L L L
1370
L L
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
x
1321
c c L
.
.
.
.
L L L L
L
1149
c
L
L
L
1308
c L L L L
1328
L c c c L
817
c c L L
L
.
.
.
.
.
.
.
.
L
.
.
.
.
.
.
L
1220
L L
L
L
1248
c
. . . . . . . . . . . . . .
147
L
c L
L
858
c
L
L
L
L
1041
L
807
L
L
L
L
1316
L L
L
L
1310
L L L
1325-10
. . . . . . . . . . . . . .
L
. . . .
L
.
L
. . . . . .
L
. .
L
. . . . . . . . . . . . . . X
624-39
L
L
1378
. . . . . . L L L
L
793
L
L
L
L
L
L
1364
L
L
L
702
L
L L L
L
L
AGOSTO SETEMBRO OUTUBROABRIL MAIO JUNHO JULHO
2001
2002
67
Figura 11
-
Mapa amplificado da infecção RSV dos pacientes que tiveram cepas altamente relacionadas dentro da unidade de TCTH no HC nos anos
de 2001 e 2002. As cores iguais indicam cepas altamente relacionadas.
paciente
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
997
L L . . L . . . . . . L . . . . . L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1034
L c L . . . . L . . . . . L
1032
L c L L . . . . . . . L . . . . . . . . . . . . . . . . .
paciente
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
1322
L c c L L L L
1329
L L L L L L L
1370
L L
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1321
c c L
. . . .
L L L L L
1149
c L L L
1308
c L L L L
1328
L c c c L
MAIO
JUNHO
JULHO
2002
MAIO
JUNHO
JULHO
2001
68
_____________________________________________________________
V DISCUSSÃO
70
V. DISCUSSÃO
No presente estudo, a infecção pelo RSV ocorreu em receptores de
transplante de células-tronco hematopoéticas de ambos os sexos, em
diversos períodos pós-transplante, com diferentes tipos de transplante,
indicando que o RSV circula amplamente em sua estação. O início da
estação do RSV em São Paulo ocorreu em abril em 2001 e em março no
ano de 2003. Em 2001 o pico ocorreu em maio e a ocorrência de casos
registrou-se até o final do inverno desse ano, concordando dados de regiões
com mesmo clima (Raboni et al. 2003; Reis, 2006). No ano de 2002, a
estação do RSV teve pico no final do outono e inverno e estendeu-se até o
mês de outubro, no início da primavera.
Um aspecto que chama atenção nesse grupo de pacientes é a
amplitude do tempo pós-transplante em que foi diagnosticada a infecção. O
paciente 147, que recebeu um transplante alogênico, teve seu diagnóstico
de infecção pelo RSV por volta de 3700 dias pós-transplante. Na unidade de
transplante do Hospital das Clínicas de São Paulo, o acompanhamento e
vigilância pós-transplante são feitos por longos períodos se o paciente
apresentar complicações. Conforme a revisão de Copelan em 2006, a
doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) é a complicação mais
importante em transplante alogênico. O paciente com DECH crônica recebe
tratamento com drogas imunossupressoras por tempo prolongado, o que
aumenta o risco de complicações infecciosas mesmo tardiamente pós-
transplante (Copelan, 2006).
71
De acordo com Khushalani e col. (2001), a infecção pelo RSV num
período tardio pós-transplante provavelmente apresenta menor gravidade,
entretanto, mesmo nessas situações, é necessária a realização do
diagnóstico para introdução de suporte clínico necessário, para que a
infecção fique restrita ao trato respiratório superior (Khushalani et al., 2001).
O seqüenciamento de uma parte variável de um gene do RSV tem
sido relatado em trabalhos de epidemiologia molecular em comunidades e
hospitais. Os genes utilizados são da proteína N e G (Cane, 2001). Neste
estudo, mesmo que o genoma completo do vírus não tenha sido
seqüenciado, a análise da segunda região variável foi uma ferramenta útil
para analisar a circulação de cepas como em vários outros estudos (Peret
al., 2000; Venter et al., 2002; Sato et al., 2005).
Para certificar que todas as amostras analisadas eram fiéis ao seu
verdadeiro aspecto, vários cuidados foram tomados e precisam ser
ressaltados para a validação desse trabalho e afastar a hipótese de
contaminação ocasionando falsos resultados. A reação de “nested PCR”
aumenta a chance de contaminação das amostras devido à manipulação de
material já amplificado. Foram adotadas algumas medidas para evitar a
contaminação nessa etapa: a) uso de mais de um controle negativo na
reação; b) realização das reações com no máximo 20 amostras e; c) limpeza
do fluxo antes da realização da segunda etapa da reação. A maioria das
amostras cujas cepas virais eram idênticas neste trabalho não foi
processada por PCR no mesmo dia, o que já afasta a possibilidade de
contaminação durante o processamento. Muitas amostras foram
72
seqüenciadas mais de uma vez, muitas amostras foram amplificadas
novamente por PCR e outras amostras positivas para RSV do mesmo
paciente (extraídas, amplificadas e seqüenciadas em dias diferentes) foram
também processadas para comparar com a seqüência da amostra
anteriormente seqüenciada.
De acordo com Peret e col, (2000), a presença de cepas com
seqüências idênticas na proteína G não necessariamente indica uma origem
comum de transmissão. Entretanto, em nosso estudo algumas cepas
mostraram-se altamente relacionadas filogeneticamente. Os pacientes
apresentavam as mesmas características e freqüentavam o mesmo
ambiente periodicamente, é possível que a origem do vírus tenha sido de um
paciente e este tenha transmitido o vírus dentro do ambiente fechado, como
o hospital.
Muitas amostras neste estudo não puderam ser seqüenciadas. As
razões pelas quais não foi possível o seqüenciamento de todas as amostras
de RSV identificadas em 2001 e 2002 foram: a) indisponibilidade de algumas
amostras para processamento por biologia molecular, visto que o
armazenamento da mesma só era possível quando havia material suficiente
para processamento para imunofluorescência direta; b) perda do RNA viral
presente nas amostras, devido à falha ou tempo de estocagem e; c) a
amplificação por PCR gerou produtos com pouco DNA, o que impossibilitou
a realização de reação de seqüência com qualidade.
Neste estudo, a maioria das cepas virais analisadas nos anos de 2001
e 2002 era de pacientes que freqüentavam o ambulatório da unidade de
73
TCTH. Dois “clusters” de cepas altamente relacionadas foram encontrados
na análise de verossimilhança, um no ano de 2001 com cepas do grupo A do
RSV (TMO9971, TMO 10321 e TMO10341) e outro no ano de 2002, com
cepas do grupo B (TMO13702, TMO13222, TMO13292, TMO13212,
TMO11492, TMO13282 e TMO3082).
Alguns desses pacientes do ano de 2002 freqüentaram o ambulatório
no mesmo dia ou dias após. Esta observação sugere que pode ter havido
transmissão dentro do ambulatório, em decorrência da pequena área física
do ambulatório que é compartilhada pelos pacientes e da dificuldade de
implementação das medidas de controle de RSV nesse setor. Nichols e col.
também observaram indício de transmissão cruzada do vírus Parainfluenza
3, também pertencente à família Paramyxoviridae dentro do ambulatório no
Fred Hutchinson Cancer Research Center em Seattle, durante um surto de
parainfluenza na instituição. Os autores observaram agrupamento de um
genótipo do Parainfluenza 3 nos pacientes ambulatoriais em comparação
com os pacientes internados, atendidos no mesmo período (Nichols et al.,
2004).
A principal forma de transmissão do RSV, através do contato com
superfícies contaminadas com RSV, favorece a transmissão do vírus em
hospitais (Raad et al.,1997). Na unidade de internação da Divisão de
Transplante de Células-tronco Hematopoéticas não foi detectada infecção
em serviços de saúde pelo RSV no período estudado, entretanto, outros
autores demonstram a transmissão do vírus dentro da enfermaria (Englund
74
et al, 1991; Whimbey et al., 1996; Garcia et al., 1997;
Harrington et al. 1992;
Mazzulli et al., 1999; Taylor et al., 2001).
O paciente 1023 foi diagnosticado com infecção pelo RSV estando
hospitalizado, entretanto, o vírus foi diagnosticado dois dias após a
internação do paciente, o que de acordo com nossos critérios sugere
aquisição na comunidade. Em outro centro de transplante no Brasil, no
estado do Paraná, Raboni e col. observaram que a maioria dos pacientes
infectados pelo RSV estava internada na enfermaria. Entretanto, o tipo de
transmissão não era o objetivo do estudo e não foi possível demonstrar
cadeias de transmissão (Raboni et al., 2003).
Medidas de controle de RSV são fácil e rapidamente implementadas
em unidades de internação, frente à necessidade de isolamento de contato.
No presente estudo, a ausência de infecções em serviço de saúde causadas
pelo RSV na enfermaria atesta a efetividade dessas medidas. Entretanto, no
ambulatório do transplante onde os pacientes passam várias horas do dia,
muitas medidas não podem ser implementadas. Apenas o cohorting e o uso
de máscara podem ser implementados para os pacientes com diagnóstico
de RSV e que necessitavam continuar freqüentando o ambulatório. Por outro
lado, os pacientes mantinham contato direto uns com os outros,
compartilhando os mesmos objetos e sanitários, tocando superfícies (por
exemplo: maçanetas, cadeiras na sala de espera e outros objetos), entre
outros. Como este estudo foi retrospectivo, infelizmente, não foi possível
advertir a equipe de funcionários sobre o possível tipo de transmissão que
estava ocorrendo no ambulatório da unidade de TCTH.
75
O grupo de pacientes estudado era caracterizado por excretar o RSV
por longos períodos. O paciente 997, cuja cepa (TMO9971) era altamente
relacionada a outras duas cepas do ano de 2001 (cepas TMO10341 e
TMO10321), teve o diagnóstico de infecção pelo RSV em quatro amostras
num período de 24 dias, sendo que os 10 últimos dias da excreção ele
esteve internado na enfermaria. É possível que o vírus tenha ficado
circulando pela unidade de transplante e tenha infectado outros pacientes
indiretamente. De acordo com Martino et al. (2005), a excreção prolongada
do vírus é um fator de risco para aquisição da infecção por vírus respiratórios
(Martino et al., 2005). A rápida identificação da infecção pelo RSV e posterior
“cohorting” são fatores cruciais para o manejo da infecção pelo RSV em
unidades de transplante, visto que a excreção prolongada em altos títulos
em pacientes imunodeprimidos são fatores que elevam o risco da
transmissão do RSV (Garcia et al., 1997).
O RSV foi diagnosticado em quatro amostras do paciente 817,
sugerindo um período de excreção de 66 dias. A possibilidade de infecção
por outra cepa durante esse período foi afastada pelo seqüenciamento das
cepas das amostras no início e final da infecção, tendo-se comprovado
tratar-se da mesma cepa. Outros pacientes, cuja excreção viral foi menor,
também tiveram mais de uma amostra analisada e também se tratava da
mesma cepa. O paciente 1033 do ano de 2003 foi hospitalizado no momento
em que foi diagnosticada infecção pelo RSV e manteve-se internado
enquanto cinco amostras apresentaram-se positivas (27 dias). Dessa forma,
76
é possível que o vírus desse paciente tenha ficado circulando na unidade,
entretanto, infelizmente, essa cepa não pôde ser seqüenciada e analisada.
Apesar de não sermos capazes de provar a transmissão do vírus de
um paciente para outro diretamente através uma rota direta de inoculação
dentro da unidade de TCTH, o RSV pode ficar em superfícies por horas, e
pode ter infectado os pacientes ou até funcionários do hospital. Por isso, a
lavagem freqüente das mãos é de grande valia no controle de infecção do
RSV (Hall & Douglas, 1981).
Por outro lado, de acordo com Anaisse e col., em seu trabalho com
pequeno número de pacientes, cuja doença de base era mieloma múltiplo,
foi encontrado infecção pelo RSV em pacientes assintomáticos. De acordo
com os autores, o RSV pode infectar o trato respiratório e não é
necessariamente causar doença. Dessa forma, as medidas de controle do
RSV dentro de hospitais são ineficazes e acabam sendo de alto custo. Além
disso, a maioria dos receptores de transplante freqüenta o ambulatório,
podendo adquirir infecção da comunidade (Anaisse et al., 2004).
Há duas grandes limitações neste estudo o quais impossibilitaram o
desfecho conclusivo da transmissão do RSV dentro do ambulatório. A
primeira é pela pequena quantidade de amostras analisadas fato que
impossibilita a visualização de cadeias de transmissão, principalmente em
amostras do ano de 2001. Outro aspecto importante é a impossibilidade de
colheita de amostras clínicas dos familiares e indisponibilidade de amostra
clínica dos funcionários da unidade de TCTH para análise. Os pacientes
podem adquirir infecção comunitária em contato com sua família,
77
especialmente com menores de 12 anos, e podem chegar ao ambulatório já
estando infectados (Hall, 2000; Aitken & Jeffries, 2001; Martino et al., 2005).
Embora, tenha sido feita a coleta de secreção respiratória de
funcionários com sintomas de infecção respiratória, há possibilidade de
infecção assintomática ou oligossintomática, portanto, é possível que o
diagnóstico não tenha sido feito em alguns funcionários e que a transmissão
tenha ocorrido sem que se possa demonstrá-la (Hall, 2000). A explicação
para a falta de sintomas nesse grupo de pessoas pode ser o contato
constante com o vírus causando reinfecções freqüentes (Hashem & Hall,
2003). Além disso, as amostras colhidas dos funcionários infectados tiveram
seu diagnóstico realizado apenas por imunofluorescência que é uma técnica
menos sensível que a RT-PCR e pode subestimar o número de funcionários
infectados, visto que em imunocompetentes há menor excreção viral. No
estudo que observou infecção pelo RSV em indivíduos saudáveis durante 20
anos, Hashem & Hall, observaram que 96% dos 7% da população total de
infectados (funcionários de hospital, estudantes e familiares de crianças)
eram funcionários de hospital ou estudantes, provando que essa população
de pessoas está mais exposta ao vírus (Hashem & Hall, 2003).
Múltipas cepas infectaram os pacientes receptores de TCTH nos anos
de 2001 e 2002 corroborando os dados de Mazzulli e col., e Englund e col.
os quais também observaram a introdução de múltiplas cepas dentro do
hospital e sua disseminação (Englund et al., 1991; Mazzuli et al., 1999).
Neste estudo, como a maioria dos pacientes não estava internada, eles
tinham contato com os vírus da comunidade, fato que pode explicar a
78
ocorrência da variabilidade de cepas e genótipos dentro da unidade de
TCTH.
De acordo com a revisão de Cane em 2001, os grupos A e B do RSV
podem co-circular em uma comunidade, embora cepas do grupo A sejam
mais dominantes que as cepas do grupo B (Cane, 2001).
Surpreendentemente, as cepas analisadas no ano de 2001 eram em sua
maioria do grupo A, cujo genótipo predominante era GA2, seguido por GA5,
e as cepas circulantes predominantes na comunidade, no Hospital
Universitário na cidade de São Paulo nesse ano, eram do grupo B. No ano
de 2002 as cepas dos receptores de TCTH eram em sua maioria do grupo B,
cujo genótipo predominante era SAB3 e SAB1, e as cepas circulantes
predominantes na comunidade também no mesmo hospital eram do grupo A
(comunicação oral profº Edison Durigon dados não publicados). Esses
dados podem sugerir uma vantagem seletiva do vírus, visto que os
receptores de TCTH são frágeis imunologicamente, e as cepas dos vírus
que infectam esses pacientes não eram as predominantes no surto na
comunidade que provavelmente estaria imune a esse genótipo (Cane &
Pringle, 1995; Melero et al., 1997). Deve-se salientar que as crianças
atendidas no Hospital Universitário, cujas cepas virais foram analisadas
neste estudo, representam apenas uma amostragem das cepas da
comunidade.
Entretanto, mesmo havendo predomínio de um genótipo, outros
genótipos do mesmo grupo ou de outro grupo co-circularam na mesma
epidemia. Além disso, duas cepas altamente relacionadas (TMO6871 e
79
TMO12482, TMO10231 e TMO12202) circularam em anos diferentes. Em
seu estudo por nove anos na Koréia, Choi & Lee observaram que as cepas
não desaparecem completamente de um ano para outro, embora haja mais
de um genótipo circulando em uma epidemia, há sempre predomínio de um
e ao longo do tempo um genótipo particular desaparece (Choi & Lee, 2000).
A mudança anual nas cepas do RSV deve contribuir para a habilidade do
vírus em causar epidemias anuais e continuar causando doença (Peret et
al., 1998).
As sete cepas do grupo B que são altamente relacionadas
filogeneticamente isoladas dos pacientes, agruparam-se com isolados da
comunidade do ano 2001. Entretanto, na análise genotípica, essas cepas
ficaram distantes de outras cepas isoladas no mundo. Após, uma análise no
BLAST, notou-se que essas cepas eram próximas às cepas circulantes da
América do Sul que também pertenciam ao genótipo SAB3. Essas cepas
eram próximas das cepas BA3768/99, BA3773/99 isoladas na Argentina no
ano de 1999 e SAL/141/99 isolada no Brasil, no ano de 1999 na cidade de
Salvador (Moura et al., 2004; Galiano et al., 2005). Em relação às cepas do
grupo A, as cepas TMO10231 e TMO12202 que na análise genotípica
também estiveram mais distante que as outras cepas, após uma análise no
BLAST, eram bem próximas de cepas isoladas no Uruguai, pertencentes ao
genótipo GA5: Mon/1/98 isolada no ano de 1998 e Mon/2/01, Mon/3/01
isoladas no ano de 2001 (Arbiza et al., 2005). De acordo com alguns
autores, há transferência de cepas entre as comunidades, visto a
80
proximidade e a facilidade de meios de transporte entre esses países (Peret
et al, 2000; Venter et al., 2001).
Por outro lado, na análise genotípica, a cepa TMO8582 isolada no
ano 2002, mostrou-se bem próxima à cepa Sa0025 isolada na África do Sul
no ano 2000. Esse genótipo SAB1 foi identificado por Venter e col em 2001
através do não agrupamento de algumas seqüências de seu estudo com as
seqüências dos genótipos Peret e col (1998) (Venter et al., 2001). Moura e
col. observaram que algumas cepas isoladas em Salvador, nordeste do
Brasil também eram relacionadas à cepas isoladas em locais distantes,
como Moçambique (Moura e et al., 2004). De acordo com Peret e col (1998),
devido à estabilidade da proteína G, as cepas dispersam-se amplamente
pelo mundo e apresentam uma origem comum podendo ocorrer em mais
anos e não necessariamente em uma única epidemia, como o Influenza A
(Peret et al., 1998).
É importante ressaltar a necessidade de prevenir a infecção do RSV
em hospitais, pois dessa forma, há prevenção de outros vírus respiratórios
de importante morbidade também. Jalal e col. diagnosticaram infecção mista
por Parainfluenza e RSV em quatro pacientes num total de 22 receptores de
TCTH. Em 2001, o estudo das infecções por vírus respiratórios nos
receptores de TCTH incluídos no presente trabalho, mostrou co-infecção do
RSV em 9 de 68 pacientes (13,2%) nos quais algum vírus respiratório foi
identificado (Machado et al., 2003). A prolongada excreção desses vírus e o
prolongado tempo de isolamento dos pacientes infectados facilitam a
81
transmissão desses vírus dentro de enfermarias de hospitais (Jalal et al.,
2007).
Por fim, novos conceitos de infecção em serviços de saúde devem ser
incorporados, levando em consideração as infecções nosocomiais de
etiologia viral. O período de incubação dessas infecções é, em geral,
superior a 48 horas, período utilizado para definir infecção de origem
nosocomial, e que se refere à infecção de etiologia bacteriana (Peri, 1993).
_____________________________________________________________
VI CONCLUSÕES
83
VI. CONCLUSÕES
Múltiplas cepas do RSV co-circularam na unidade de Transplante de
Células-tronco Hematopoéticas (ambulatório e enfermaria) do
Hospital das Clínicas de São Paulo entre os anos de 2001 e 2002.
No ano de 2001 houve predomínio de cepas do grupo A e em 2002
do grupo B. Os genótipos encontrados no ano de 2001 foram: GA2,
GA5 e SAB1 e no ano de 2002: SAB3, SAB1 e GA2.
A ocorrência de cepas altamente relacionadas em pacientes
ambulatoriais pode indicar uma maior probabilidade de transmissão
nessa unidade em relação à enfermaria da Divisão de TCTH.
Medidas de controle devem ser também implementadas no
ambulatório para prevenir a infecção do RSV em serviços em saúde e
outros vírus respiratórios em pacientes ambulatoriais.
Algumas cepas do RSV presentes em um determinado ano continuam
a circular no ano seguinte.
_____________________________________________________________
VII ANEXOS
85
Anexo A - Aprovação do comitê de ética do presente estudo
86
Anexo B - Aprovação do comitê de ética do projeto “Viroses
respiratórias em receptores de transplante de medula óssea.
Abordagens de diagnóstico e controle”.
87
Anexo C – Termo de consentimento livre e esclarecido do projeto
“Viroses respiratórias”.
88
Anexo C – Termo de consentimento livre e esclarecido do projeto
“Viroses respiratórias” (continuação).
89
Anexo C – Termo de consentimento livre e esclarecido do projeto
“Viroses respiratórias” (continuação).
90
Anexo IV - Foto do salão de medicação do ambulatório da Divisão de
Transplante de Medula Óssea do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo
_____________________________________________________________
VIII REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
92
VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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_____________________________________________________________
APÊNDICE
APÊNDICE
Código de acesso do GenBank de cepas utilizadas na genotipagem
Cepas do grupo A
Genótipo Cepa Código
GA1
CH34
NY108
MO48
AL19471-5
AF65257
AF233917
AF232914
AF233902
GA2
AL 19376-1
CH57
CH28
TX69564
MO55
AF233900
AF065258
AF065256
AF233923
AF233915
GA3
TX68481
TX68532
MO16
MO13
CN395
AF233920
AF233921
AF233913
AF2333911
AF233905
GA4 CH09 AF065254
GA5
CN3114
AL19556-3
CH17
TX69343
NY103
TX67951
MO15
CN2708
MO01
AF233908
AF233903
AF065255
AF233922
AF233016
AF233919
AF233912
AF233906
AF233901
GA6
NY20
AL19452-2
AF233918
AF233901
GA7
MO02
CN2851
CN1973
AF233910
CN2851
AF233904
SAV1
SA97D669
SA98D707
AF348801.1
AF348810.1
Cepas do grupo B
A2 e Long- Cepas padrão do grupo A
Ch18537- Cepa padrão do grupo B
Genótipo Cepa Código
GB1 CH10b
AF065251
GB2 CH939b AF0652251
GB3
NY97
MO53
MO35
CN521
AL19794-1
TX69208
AF233932
AF233930
AF233929
AF233927
AF233925
AF233933
GB4
AL197334-4
NY01
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