( PDF ) Caracterização fisiológica da tolerância à seca em Coffea canephora: contribuição relativa do sistema radicular e parte aérea

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VÂNIA APARECIDA SILVA

CARACTERIZAÇÃO FISIOLÓGICA DA TOLERÂNCIA À SECA EM Coffea

canephora: CONTRIBUIÇÃO RELATIVA DO SISTEMA RADICULAR E DA

PARTE AÉREA

Tese apresentada à Universidade

Federal de Viçosa, como parte das

exigências do Programa de Pós-

Graduação em Fisiologia Vegetal,

para a obtenção do título de Doctor

Scientiae.

VIÇOSA

MINAS GERAIS - BRASIL

2007

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VÂNIA APARECIDA SILVA

CARACTERIZAÇÃO FISIOLÓGICA DA TOLERÂNCIA À SECA EM Coffea

canephora: CONTRIBUIÇÃO RELATIVA DO SISTEMA RADICULAR E DA

PARTE AÉREA

Tese apresentada à Universidade

Federal de Viçosa, como parte das

exigências do Programa de Pós-

Graduação em Fisiologia Vegetal,

para a obtenção do título de Doctor

Scientiae.

APROVADA: 30 de março de 2007

____________________________ ____________________________

Prof. Fábio Murilo DaMatta Dr. Alan Carvalho Andrade

(Co-orientador)

____________________________ ____________________________

Prof. Paolo Di Mascio Prof. Ney Sussumu Sakiyama

_____________________________

Prof. Marcelo Ehlers Loureiro

(Orientador)

“De tudo ficaram três coisas: a

certeza de que estava sempre

começando, a certeza de que era

preciso continuar e a certeza de

que seria interrompido antes de

terminar. Fazer da interrupção um

novo caminho. Fazer da queda um

passo de dança, do medo uma

escada, do sono uma ponte, da

procura um encontro”.

(Fernando Sabino)

Aos meus pais, Waldeci e Nazaré

Às minhas irmãs, Vanisse, Vanessa e Valéria

Ao meu sobrinho Rafael

Ao meu noivo Luiz Antônio,

pelo amor e pela motivação,

DEDICO

iii

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela saúde e pelas conquistas alcançadas.

À Universidade Federal de Viçosa, em especial aos seus

Departamentos de Biologia Vegetal, pela oportunidade para a realização

deste curso.

Aos meus pais e minhas irmãs, por tudo, e principalmente por serem

meus pais e minhas irmãs. Ao maior presente das nossas vidas, Rafael.

Ao meu noivo Luiz Antonio e família pelo carinho e amizade. Ao Luiz

Antonio, pelo amor e pela presença constante.

Aos meus queridos amigos Breno, Werner, Rita, José e Maurício, o

que seria de mim sem a ajuda de vocês! Vocês tornaram todos os

momentos mais leves e mais felizes!

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq), pelo apoio financeiro.

Ao professor Marcelo Ehlers Loureiro, pela orientação e apoio,

fundamentais para a execução desse trabalho.

Aos professores conselheiros Andréa, Eveline e Fábio, por todo o

auxílio prestado, em especial a Andréa, por ter intermediado o contato com o

professor Paolo.

Ao professor Paolo Di Mascio, do Departamento de Bioquímica da

Universidade de São Paulo (USP), pela orientação e colaboração nas

análises de ácido abscísico. A toda sua equipe, que nos recebeu com toda a

dedicação, em especial a Isaura e Fernanda, que ajudaram ativamente na

realização das análises.

A Maria Amélia, pesquisadora do Incaper, pela concessão das mudas

para o experimento.

Ao Marcelo Antônio Tomaz, pela amizade e colaboração para a

realização das enxertias.

Ao prof. Jorge Abdala Dergam, do departamento de Biologia Animal,

pelo carisma e pelo empréstimo do freezer.

Ao Dr. Alan Carvalho Andrade, pesquisador da Embrapa - Cenargen,

pelo apoio e por ter aceitado a proposta de ser meu co-orientador.

Infelizmente, não pude concluir o trabalho, mas valeu pela oportunidade de

acompanhar o seu trabalho durante um período no CENARGEN em Brasília.

Ao Departamento de Fitotecnia, em especial à equipe do viveiro de

café pelo importante apoio na condução do experimento.

Aos professores Raimundo Barros, Marco Aurélio, Marco Oliva,

Antônio Cordeiro, José Cambraia, Juraci de Oliveira, pela amizade e pelos

ensinamentos compartilhados durante o curso.

Aos funcionários Geraldo, Oswaldo, Reginaldo, José Antônio, Mercês,

Carlos Raimundo, e também aos demais funcionários do Departamento de

Biologia Vegetal, pela amizade e pelo auxílio.

Às inesquecíveis amigas Deise, Aline e Ana, pela convivência

harmoniosa, pela ajuda e, sobretudo pela amizade.

Ao Paulo Rogério (Palelo) e a Soami pela amizade e acolhida

carinhosa em São Paulo.

Aos amigos da unidade de crescimento de plantas (UCP), Cacilda,

Fábio, Rogério Ribas, Carla, Rogério Gomide e João Bosco e, em especial,

ao Alan, pela amizade e colaboração durante a realização dos experimentos.

A todos os colegas de curso, em especial a Giovani, Dimas, Gustavo

Resque, Ângela, Karine, Ana Maria, Elaine, Cláudio Ronchi, Wagner,

Franciscleudo, Adriano, Marcelo, Roberto, Agnaldo e Daniel.

A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para o êxito deste

trabalho.

“Agradecer é admitir que houve um momento em que se precisou de

alguém; é reconhecer que o homem jamais poderá lograr para si o dom de

ser auto-suficiente. Ninguém cresce sozinho; sempre é preciso um olhar de

apoio, uma palavra de incentivo, um gesto de compreensão, uma atitude de

amor. A todos vocês que compartilharam os meus ideais, dedico essa

vitória, com a mais profunda gratidão e respeito”.

BIOGRAFIA

VÂNIA APARECIDA SILVA, filha de Waldeci Nivaldo da Silva e Nazaré

Tavares da Silva, nasceu em Elói Mendes, MG, em 24 de setembro de 1977.

Concluiu o ensino básico no ano de 1995, no Colégio Tiradentes, em Lavras,

MG. Em março de 1996, iniciou o curso de Agronomia, na Universidade

Federal de Lavras (UFLA), em Lavras, MG, graduando-se em janeiro de

2001. Ingressou, em março de 2001, no Programa de Pós-graduação em

Fisiologia Vegetal da Universidade Federal de Viçosa (UFV), em Viçosa,

MG, obtendo o título de mestre em 15 de fevereiro de 2003. Em seguida,

iniciou o curso de doutorado também em Fisiologia Vegetal na UFV,

concluindo-o em 30 de março de 2007. Neste mesmo ano, ingressou na

FEAD-Minas, Belo Horizonte, MG, como professora do curso de Agronomia.

SUMÁRIO

RESUMO ...................................................................................................................vii

ABSTRACT................................................................................................................ix

INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 1

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................... 4

MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 9

1- Material vegetal................................................................................................ 9

2- Parâmetros biométricos...................................................................................... 10

3- Potencial hídrico da folha .................................................................................. 10

4- Trocas gasosas e parâmetros de fluorescência................................................... 10

5- Composição isotópica do carbono..................................................................... 11

6- Ácido abscísico.................................................................................................. 11

6.1- Extração e purificação ........................................................................................ 11

6.2- Separação por HPLC e detecção por MS/MS..................................................... 12

7- Açúcares, aminoácidos, prolina e amido ........................................................... 13

8- Extravasamento de eletrólitos............................................................................ 13

9- Ensaios enzimáticos........................................................................................... 14

10- Análises estatísticas ......................................................................................... 15

RESULTADOS.......................................................................................................... 16

1- Parâmetros biométricos...................................................................................... 16

2- Status hídrico ..................................................................................................... 18

3- Trocas gasosas ................................................................................................... 19

4- Composição isotópica do carbono (δ

C) .......................................................... 21

5- Ácido abscísico.................................................................................................. 22

6- Carboidratos e aminoácidos............................................................................... 27

7- Parâmetros de fluorescência da clorofila a e pigmentos fotossintéticos............ 31

8- Estresse oxidativo .............................................................................................. 32

DISCUSSÃO ............................................................................................................. 36

1- Efeito da enxertia e do déficit hídrico nos parâmetros de crescimento, trocas

gasosas e ácido abscísico ....................................................................................... 36

2- Efeito da enxertia e do déficit hídrico nas concentrações de carboidratos,

aminoácidos e prolina ............................................................................................ 41

3- Efeito da enxertia e do déficit hídrico no estresse oxidativo ............................. 43

CONCLUSÕES ......................................................................................................... 46

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 48

vii

RESUMO

SILVA, Vânia Aparecida, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, março de

2007. Caracterização fisiológica da tolerância à seca em Coffea

canephora: contribuição relativa do sistema radicular e da parte

aérea. Orientador: Marcelo Ehlers Loureiro. Co-orientadores: Andréia

Miyasaka de Almeida, Eveline Teixeira Caixeta e Fábio Murilo DaMatta,

A enxertia recíproca entre genótipos com respostas contrastantes à

seca (clones 109 e 120, respectivamente sensível e tolerante) foi realizada

com o objetivo de avaliar a contribuição relativa do sistema radicular e da

parte aérea na tolerância ao déficit hídrico em Coffea canephora. Foram

avaliadas as enxertias (enxerto/porta-enxerto) 120/109, 120/120, 109/120,

109/109, além dos respectivos pés francos 109 e 120. As plantas foram

cultivadas em vasos com 12 L de substrato, em casa de vegetação. Ao

atingirem seis meses, metade das plantas continuou sendo irrigada

constantemente, enquanto a outra metade foi submetida à seca, imposta

pela suspensão da irrigação. O pé-franco 120 e as enxertias que possuíam o

clone 120, como sistema radicular, apresentaram redução mais lenta do

potencial hídrico antemanhã (ψ

)

sob déficit hídrico, com um sistema

radicular mais profundo, e menor descriminação isotópica do carbono,

quando comparadas com o pé-franco 109 e autoenxertia 109/109. Aquelas

plantas também apresentaram uma redução na condutância estomática (g

)

sob ψ

= -0,5 Mpa, e maiores concentrações de ácido abscísico (ABA) foliar

sob déficit hídrico moderado (ψ

= -1,0 e -1,5 Mpa). Entretanto, não foi

possível observar associações entre alterações na concentração foliar de

ABA e g

, nem diferenças quanto à g

entre as plantas sob déficit moderado

e severo. Por outro lado, a concentração radicular de ABA foi maior nas

plantas que possuíam o sistema radicular 120, independentemente dos

regimes hídricos. Essas plantas também apresentaram, sob déficit hídrico

severo, reduções menos pronunciadas em A, menor extravasamento de

eletrólitos, menores atividades da APX e CAT e menores acúmulos de

hexoses, aminoácidos e prolina. Verificou-se também que assim como o

sistema radicular, a parte aérea do clone 120 também contribui para a

tolerância à seca, pois, quando comparada as plantas sensíveis 109 e

109/109, a enxertia 120/109 apresentou redução mais lenta do ψ

, menor

viii

discriminação isotópica, maior concentração de ABA foliar sob déficit hídrico

moderado, e menor extravasamento de eletrólitos sob déficit severo, quando

comparadas as plantas 109/109 e 109. Entretanto, a enxertia 120/109

apresentou queda mais rápida do ψ

do que as plantas que possuíam o

sistema radicular 120, destacando a relativa maior importância do sistema

radicular para conferir tolerância à seca. Em conjunto, estes dados mostram

a contribuição relativa da parte aérea e do sistema radicular na tolerância à

seca e indicam a perspectiva de utilização de porta-enxertos de clones

tolerantes para aumentar a tolerância à seca de genótipos mais sensíveis.

ABSTRACT

SILVA, Vânia Aparecida, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, March,

2007, Physiological characterization of drought tolerance in Coffea

canephora: relative contribution of root system and shoot. Adviser:

Marcelo Ehlers Loureiro. Co-advisors: Andréia Miyasaka de Almeida,

Eveline Teixeira Caixeta and Fábio Murilo DaMatta.

With the intent to evaluate the relative contribution of the root system

in Coffea canephora to drought stress tolerance, was performed reciprocal

grafting experiments between genotypes with contrasting tolerance traits

(clone 109, sensible, and clone 120, tolerant). The plants used in these

experiments were control plants 109 and 120, and grafted plants 120/109,

120/120, 109/110 and 109/109. All plants were cultivated in 12 L pots for 6

months, under greenhouse conditions. After growth for six months, half

plants remained irrigated, whereas the other half was subjected to water

stress by withholding irrigation. Plants 120 and grafts having 120 as rootstock

have showed slower reduction of predawn leaf water potential (ψ

), deeper

roots and lower carbon isotopic discrimination under water deficit. These

plants also have shown bigger reduction in g

after light decrease in ψ

= -

0,5 MPa and higher leaf ABA concentration under moderate water deficit (ψ

= -1,0 e -1,5 MPa). However changes in ABA concentration was not

associated with changes in g

, and no differences for g

under moderate and

severe water deficit were observed between different plants. Additionally,

root ABA concentration was bigger in plants having the 120 root system, both

in presence or absence of drought. These plants also have shown, under

severe water deficit, less pronounced reductions in A, lower level of ion

leakage, lower APX and CAT activities, and lower levels of hexoses, amino

acids and proline. Otherwise, the 120 scion was also able to contribute to

drought tolerance, since it was able to retard the evolution of water deficit, to

result in higher leaf ABA concentration under moderate stress and in lower

leaf ion leakage. Altogether, these data show the important contribution of

root system to drought tolerance in C. canephora, and suggest the probable

viability of the use of grafting of tolerant rootstocks for improvement of

drought tolerance of more drought sensible genotypes that have other

important agronomical traits.

INTRODUÇÃO

O café é um dos principais produtos agrícolas no mundo, sendo

produzido por mais de 80 países, sendo que o Brasil é o maior produtor. Nos

países produtores de café, há freqüentemente oscilações na produtividade da

cultura ocasionadas por limitações climáticas, como ocorrência de períodos de

seca. O desenvolvimento de cultivares mais tolerantes a períodos de déficit

hídrico, bem como o desenvolvimento de tecnologias que auxiliem as plantas a

tolerar períodos prolongados de estiagem, são alternativas para a manutenção

da produção agrícola brasileira e mundial. Nesse contexto, a identificação e a

compreensão dos mecanismos de tolerância à seca são fundamentais no

desenvolvimento de novas cultivares mais tolerantes ao déficit hídrico.

A identificação e a seleção de genótipos de Coffea canephora tolerantes

à seca e com características agronômicas de interesse para formação de

variedades clonais têm sido realizadas em diferentes regiões de cultivo no

estado do Espírito Santo (Ferrão et al., 2000a). O desempenho de 500 clones

de café Conilon, sob déficit hídrico, foi analisado em campo, considerando-se

principalmente a produtividade média em condições ótimas de irrigação e em

condições não-irrigadas (Ferrão et al., 2000a, 2000b). Uma grande

variabilidade na produtividade média dos clones foi observada, destacando-se

entre os mais tolerantes os clones 120, 14, 75, 01, dentre outros, cujas

produtividades médias mostraram-se praticamente inalteradas, mesmo nas

condições de seca. De modo oposto, clones considerados sensíveis (143,

109A, 80, etc.) apresentaram produtividades médias reduzidas em mais de

50%, quando cultivados sem irrigação.

A partir desses estudos, Da Matta et al. (2000) selecionaram alguns

clones com respostas contrastantes quanto à tolerância ao déficit hídrico,

dentre eles, o clone 120 (tolerante) e clone 109 (sensível) com o objetivo de

identificar e compreender os mecanismos fisiológicos de tolerância à seca em

café.

As avaliações fisiológicas desses genótipos têm sugerido que a maior

tolerância à seca do clone 120 pode estar associada à maior tolerância ao

estresse oxidativo, à habilidade para manutenção da exportação de

assimilados e à capacidade de manutenção do status hídrico adequado, obtida

mediante a combinação de sistema radicular mais profundo e controle

estomático eficiente da transpiração (DaMatta e Ramalho, 2006).

Em diversas outras culturas, tem-se mostrado que a resposta estomática

à seca é mediada pelo ácido abscísico (Zhang e Davies , 1991) e que o ácido

abscísico (ABA) participa no mecanismo de tolerância à seca, pois seus níveis

aumentam significativamente em condições de déficit hídrico. Entretanto, não

existem na literatura, dados sobre o envolvimento do ABA no mecanismo de

tolerância à seca em café. A concentração do ABA nas folhas pode aumentar

até 50 vezes sob condições de seca, sendo esta a alteração de concentração

mais severa descrita para um hormônio em resposta a um sinal ambiental (Taiz

e Zeiger, 2004). O aumento de ácido abscisico nas folhas durante o déficit

hídrico pode ser resultado da biossíntese nas folhas, redistribuição nas células

do mesofilo e translocação de ABA sintetizado das raízes para a parte aérea

(Davies e Zhang, 1991).

A influência do sistema radicular em retardar o estabelecimento de

déficits hídricos internos pode, então, ocorrer em função das características

morfológicas do sistema radicular ou por meio de sinais bioquímicos, como o

ABA transportado da raiz para a parte aérea (Wilkinson e Davis, 1997). Uma

estratégia para a avaliação da contribuição relativa da parte área e do sistema

radicular na tolerância ao déficit hídrico consiste na utilização da técnica da

enxertia recíproca entre genótipos contrastantes quanto à tolerância à seca.

A maioria das pesquisas tem priorizado o aproveitamento do sistema

radicular de C. canephora para controlar os danos causados pelos nematóides

em cultivares de C. arabica (Costa et al., 1991; Fahl et al., 1998; Fazuoli et al.,

1983). Por outro lado, para as culturas em que a enxertia é normalmente

utilizada, como citros, maçã e videira já foram realizados trabalhos mostrando a

influência da enxertia na tolerância ao déficit hídrico (Lacono et al., 1998;

Medina et al., 1999; Policarpo et al., 2000).

Há grande interdependência fisiológica entre o sistema radicular e a

parte aérea de uma planta. Portanto, um equilíbrio fisiológico entre o

enxerto/porta-enxerto pode influenciar o crescimento e a tolerância a condições

ambientais (Hartmann e Kester, 1990). Dessa forma, os objetivos deste

trabalho foram averiguar se a utilização do porta-enxerto oriundo do clone

tolerante à seca influencia a tolerância em enxerto obtido de clone sensível à

seca (combinação enxerto sensível/porta-enxerto tolerante) e verificar a

contribuição relativa da parte aérea no mecanismo de tolerância à seca,

mediante a combinação enxerto tolerante/porta-enxerto sensível. Além disso,

buscaram-se evidências da participação do ABA no mecanismo fisiológico de

tolerância à seca.

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

O déficit hídrico pode causar um decréscimo na fotossíntese por meio de

uma limitação de CO2, resultante do fechamento dos estômatos ou através de

um efeito direto sobre a capacidade fotossintética nos cloroplastos (Chaves,

1991; Lawlor e Cornic, 2002). O controle estomático da transpiração é

considerado o principal processo determinando a resposta a curto-prazo de

uma planta a condições de seca, e afeta diretamente a taxa de depleção de

água do solo, o potencial hídrico da planta e o transporte de solutos no fluxo

xilemático (Tardieu e Simonneau, 1998). Muitas evidências mostram que esta

resposta estomática à seca é mediada pelo ácido abscísico (Zhang e Davies,

1991). O ácido abscisico (ABA) é um fitohormônio que possui funções

importantes no controle do desenvolvimento e na resposta a vários estresses

ambientais. As concentrações de ABA nos tecidos são reguladas pela

redistribuição, biossíntese, degradação, compartimentação, conjugação e

transporte (Qin e Zeevaart, 1999; Cutler e Krochko, 1999; Seo e Koshiba, 2002;

Nambara e Marion-Poll, 2005). O ABA pode ter uma tripla função nas respostas

das plantas ao déficit hídrico. A curto prazo, o ABA promove o fechamento

estomático ou inibe a abertura estomática, o que leva a redução da perda de

água, pela transpiração. A longo prazo, o ABA induz a síntese de proteínas que

aumentam a tolerância da planta à dessecação, como LEA (proteína expressa

durante a fase de dessecação da embriogênese ), canais iônicos, chaperones,

enzimas da biossíntese de prolina e de açúcares, proteínas reguladoras (e.g.

fatores de transcrição, proteínas-cinases e fosfolipases), enzimas

antioxidantes, entre outros (Bray, 1993; Liu e Baird, 2003), as quais estão

envolvidas em respostas ao estresse hídrico. A terceira função pode estar

relacionada à inibição do crescimento da parte aérea com a concomitante

estimulação do crescimento radicular, permitindo uma maior absorção de água

por área foliar (Saab et al., 1990).

A importância do ABA na tolerância ao déficit hídrico tem sido

evidenciada pela identificação e caracterização de mutantes deficientes em

ABA, que apresentam falhas em etapas específicas da via de sua síntese. Os

mutantes deficientes em ABA apresentam maior susceptibilidade ao

murchamento e aumento da condutância estomática sob condições de

deficiência hídrica, que podem ser corrigidos pela aplicação de ABA exógeno

(Schwartz et al., 2003). Além disso, maiores concentrações de ABA têm sido

associadas a maior tolerância ao déficit hídrico em diversas espécies de

plantas, como tomateiro (Thompson et al., 2004), Arabdopsis (Iuchi et al.,

2001), tabaco (Qin e Zeevaart, 2002) e videira (Lacono et al., 1998)

A limitação estomática da fotossíntese é associada com redução da

concentração de CO2 nos espaços celulares da folha (Ci), o qual tem sido

associado a alterações do metabolismo através da inibição de enzimas como

nitrato redutase e sacarose fosfato sintase (Lawlor e Cornic,, 2002). Quando a

fotossíntese diminui, há a redução da quantidade de assimilados disponíveis

para exportação como trioses-fosfato do cloroplasto para o citossol e,

consequentemente, a síntese de sacarose também pode ser reduzida. Por

restringir a produção e consumo de fotoassimilados, a seca inevitavelmente

altera o particionamento de carboidratos nas folhas e na planta como um todo.

Assim, sob déficit hídrico, a proporção entre diferentes carboidratos como

amido, glicose, frutose e sacarose podem ser alteradas (Chaves, 1991).

Alterações nas concentrações de carboidratos podem refletir diferenças

genotípicas na regulação e na aclimatação do metabolismo de carbono em

resposta ao déficit hídrico (Lawlor e Cornic, 2002). Em café, há poucos estudos

sobre efeitos do déficit hídrico no metabolismo de carboidratos. Alguns

trabalhos mostram que a redução na concentração de amido é uma resposta

comum das plantas de café a déficit hídrico moderado e severo (DaMatta et al.,

1997a; Praxedes et al., 2005; Ronchi et al., 2005). Isto não é necessariamente

acompanhado por aumento no conteúdo de hexoses, os quais dependem do

genótipo, condições de crescimento e taxa de progressão do estresse (Ronchi

et al., 2005), como também observado em outras espécies de plantas (Chaves,

1991).

Na medida em que a fotossíntese decresce sob condições de seca,

independentemente da natureza dessa redução, a intensidade de irradiância

interceptada pode exceder largamente àquela necessária para saturar a

fotossíntese. Considerando-se que a limitação da assimilação do CO

precede

a inativação das reações de transferência de elétrons nos cloroplastos, um

excesso de poder redutor é normalmente gerado nas plantas sob déficit hídrico.

Parte desse excesso pode ser usada para reduzir o oxigênio molecular,

levando à formação de espécies reativas de oxigênio (ERO), potencialmente

capazes de resultar em danos fotoinibitórios e fotooxidativos (Da Matta e Rena,

2001).

A intensidade do estresse oxidativo em uma célula é determinada pela

abundância de ERO, principalmente nas formas de superóxido, peróxido de

hidrogênio e radicais hidroxil. Portanto, o equilíbrio entre as enzimas

antioxidantes, como superoxido dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbato

peroxidase (APX), entre outras, é crucial para regulação dos níveis de ERO

nas células. Nos mecanismos enzimáticos de destoxificação de ERO, a SOD

atua como a primeira linha de defesa contra ERO, transformando o superóxido

em peróxido de hidrogênio. Este peróxido de hidrogênio produzido pode ser

convertido em água e oxigênio pela CAT (catalase) ou, somente a água pela

ação do ascorbato peroxidase. O ascorbato pode reduzir radical livre de

oxigênio com ou sem a catálise da APX e pode indiretamente regenerar

antioxidantes ligados à membrana como o α- tocoferol (Noctor e Foyer, 1998).

O desequilíbrio entre ERO e a atividade das enzimas antioxidantes pode

gerar, portanto, um excesso de ERO que pode causar peroxidação de lipídeos

(Lima et al., 2002), desnaturação de proteínas e mutação do DNA (Manscher et

al., 2002, Asada, 1999). Além disso, a peroxidação de lipídeos de membrana

pode resultar na perda de compartimentalização celular e aumento do

extravasamento de eletrólitos (Thompson et al.,1987; Asada,1999). Lima et al.

(2002) e Pinheiro (2004) associaram a maior tolerância à seca do clone 120 à

maior tolerância ao estresse oxidativo, pois o clone 120 apresentou menor

peroxidação de lipídios e menor extravasamento de eletrólitos que o clone

sensível (clone 109), sob déficit hídrico.

O crescimento e características do sistema radicular têm um papel

crucial em manter o suprimento de água para a planta, e plantas adaptadas à

seca são freqüentemente caracterizadas por um sistema radicular profundo e

vigoroso. Ramos e Carvalho (1997), trabalhando com 29 genótipos de café,

associaram a tolerância à seca com a distribuição e estrutura do sistema

radicular e Pinheiro et al. (2005) verificou que o clone 120 (tolerante à seca)

apresentou o sistema radicular mais profundo que o clones sensível à seca

109.

A influencia do sistema radicular no desenvolvimento das plantas e

tolerância a estresses ambientais tem sido verificadas utilizando a técnica da

enxertia. A enxertia é uma técnica de propagação assexuada em que se

colocam em contato duas partes de tecido vegetal, de tal maneira que se unam

através da regeneração dos tecidos e, posteriormente se desenvolvam,

originando uma nova planta (Hoffmann et al., 1996). As interações entre

enxertos e porta-enxertos podem envolver uma série de mecanismos, como a

influência da enxertia no transporte de água e minerais à parte aérea (Olien e

Lakso, 1986), alterações nos fatores endógenos de crescimento (hormônios,

proteínas, vitaminas) (Sorce et al., 2002), influência direta da cicatrização após

a enxertia no transporte através do xilema e floema (Atkinson et al., 2003).

Em plantas frutíferas, porta-enxertos clonais são amplamente utilizados

para controlar o desenvolvimento vegetativo e para melhorar o rendimento e

qualidade (Lockard e Schneider, 1981; Castle, 1995). Em videiras e macieiras,

tem sido realizada a seleção de porta-enxertos tolerantes à seca (Souza et al.,

2003). Alguns genótipos de porta-enxertos de videira e macieira são capazes

de modular a fotossíntese, a condutância estomática e aumentar a tolerância

ao déficit hídrico do genótipo enxertado, porém este efeito específico depende

da interação entre os genótipos utilizados na enxertia (Carboneau, 1985 e

Atkinson et al., 2000).

A maioria das pesquisas tem priorizado o aproveitamento do sistema

radicular de C. canephora para controlar os danos causados pelos nematóides

em cultivares de C. arabica (Fazuoli et al., 1983; Costa et al., 1991; Fahl et al.,

1998). Enxertia de cultivares de Coffea arabica em porta-enxertos de Coffea

canephora, em regiões infestadas por nematóides (Meloidogyne incógnita)

resultam em aumentos na altura, no diâmetro de copa e na produção de

plantas de café enxertadas, em relação às não enxertadas (Fazuoli et al., 1983;

Costa et al. (1991). De forma a verificar a possibilidade de melhoria no vigor da

planta, aumento de produção de frutos, maior eficiência no aproveitamento de

nutrientes, Fahl e Carelli (1985) observaram, em condições isentas de

nematóides, que plantas jovens de C. arabica, enxertadas sobre C. canephora

var. robusta, apresentaram taxa de crescimento superior às plantas não

enxertadas, tanto para altura como para parte área foliar. Fahl et al. (1998)

verificaram maior desenvolvimento da parte aérea (altura e diâmetro de copa),

e maior formação de gemas frutíferas em plantas adultas de C. arabica

enxertadas sobre progênies de C. canephora e de C. congensis. Plantas de C.

canephora possuem um sistema radicular mais desenvolvido (Moraes e

Franco, 1973), o que poderia explicar o maior crescimento dos enxertos.

Efeitos positivos de porta-enxertos de C. canephora em enxertos de C.

arábica também foram recentemente observados por Tomaz et al. (2005).

Entretanto estes autores observaram que alguns genótipos de C. canephora

podem ter o efeito inverso. Nenhum estudo ainda tem sido realizado

explorando o potencial de diferentes genótipos de C. canephora na tolerância à

seca em café.

MATERIAL E MÉTODOS

1- Material vegetal

Foram utilizadas plantas de Coffea canephora Pierre var. Conilon,

sendo um clone tolerante (120) e um clone sensível (109) ao déficit hídrico.

Mudas com quatro pares de folhas obtidas, do enraizamento de estacas, no

Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão Rural –

Incaper, foram utilizadas como pés-franco e também para as enxertias

recíprocas entre os clones citados e para auto-enxertias.

A enxertia foi realizada pelo método de garfagem em fenda cheia,

descrita por Oda (1995). Após a enxertia, as mudas foram mantidas em câmara

de nebulização fechada por 30 dias. Após esse período, as mudas enxertadas

foram colocadas em casa de vegetação, onde permaneceram por 20 dias, para

aclimatação. Uma vez aclimatadas, foram transferidas para vasos de 12 litros.

As plantas pés-franco foram submetidas às mesmas condições que as plantas

enxertadas. O substrato utilizado para enchimento dos vasos consistiu de uma

mistura de solo, areia e esterco bovino (3:1:1, v/v/v). A adubação foi feita de

acordo com a análise do solo, segundo recomendações de Ribeiro et al.

(1999). As mudas foram mantidas em casa de vegetação, cujas laterais

permitiam livre troca de ar entre seu interior e exterior. A densidade média de

fluxo de fótons fotossintético na casa de vegetação foi de 900 μmol m

-2

-1

, ao

meio-dia.

Após seis meses de cultivo (abril de 2006), as plantas foram avaliadas

em condições de plena irrigação (controle) e sob deficiência hídrica, imposta

pela suspensão da irrigação. O potencial hídrico foliar foi acompanhado

periodicamente até que as plantas atingissem o potencial hídrico (ψ

)

-3,0

MPa, na antemanhã.

O delineamento experimental foi em blocos casualizados, com doze

tratamentos e cinco repetições, formando um esquema em fatorial 6 x 2 (seis

tipos de planta e dois regimes hídricos). A parcela foi constituída de uma planta

por vaso. Dessa forma, o experimento foi constituído pelas plantas:

1) 120/109: Porta-enxerto do clone sensível (109) x enxerto do clone tolerante

(120);

2) 109/120: Porta-enxerto do clone tolerante (120) x enxerto do clone sensível

(109);

3) 120/120: Auto-enxertia do clone tolerante (120);

4) 109/109: Auto-enxertia do clone sensível (109);

5) 109: Pé-franco 109;

6) 120: Pé-franco 120.

2- Parâmetros biométricos

O diâmetro do caule (entre os dois primeiros entrenós) foi mensurado

com um paquímetro e o comprimento do caule com uma fita métrica. A área

foliar foi determinada de acordo com o método de dimensões foliares (Barros et

al. 1973). Ao final do experimento, as plantas irrigadas e não irrigadas foram

colhidas e separadas em parte aérea e raiz para análise da massa seca dos

tecidos e comprimento da raiz. Para determinação da massa seca, os tecidos

foram secos a 70ºC, em estufa com ventilação forçada, por 72 h. O

comprimento da maior raiz foi determinado com auxílio de uma fita métrica.

3- Potencial hídrico da folha

Foi determinado em folhas individuais com uma bomba de pressão tipo

Scholander, na antemanhã, em folhas completamente expandidas de ramos

plagiotrópicos, do meio das plantas.

4- Trocas gasosas e parâmetros de fluorescência

As trocas gasosas e parâmetros de fluorescência foram analisados em

folhas completamente expandidas do terceiro ou quarto pares a partir do ápice

de ramos plagiotrópicos medianos das plantas. As taxas de assimilação líquida

de carbono (A), a condutância estomática (g

), a transpiração (E) e a razão

entre concentrações interna e externa de CO

) foram medidas em

sistema aberto, 08:00 e 09:00 h, sob luz saturante artificial (1000 μmol m

-2

-1

concentração de CO

ambiente, com um analisador de gás a infravermelho

portátil (LCA4, Analytical Development Company-ADC, Kings Liyn, Reino

Unido). A temperatura foliar estava em torno de 22+ 2 °C e a umidade relativa

80%. Os parâmetros de fluorescência da clorofila a foram medidos, usando-se

de um fluorômetro com amplitude de pulso modulado (FMS2, Hansatech,

Norfolk, Reino Unido). A fluorescência inicial (F

), fluorescência máxima (F

eficiência fotoquímica máxima do FSII (F

), eficiência de captura de energia

de excitação pelos centros de reação abertos do FSII (F

’/F

’), coeficiente de

extinção fotoquímica (q

), rendimento quântico do transporte de elétrons (

FSII

coeficiente de extinção não-fotoquímica (NPQ) e a fração de energia absorvida

não utilizada na fotoquímica nem dissipada termicamente (P

) foram estimados

exatamente como descrito em DaMatta et al. (2002a) e Lima et al. (2002).

5- Composição isotópica do carbono

A composição isotópica do carbono foliar (δ

C) foi determinada em

relação ao padrão internacional PDB (Pee Dee Belemnite), utilizando-se de um

espectrômetro de massa (DELTA-S, Finnigan MAT, Bremen, Alemanha),

conforme descrito por DaMatta et al. (2002a). As diferenças em δ

C entre

duplicatas de cada amostra foram menores que 0,2 ‰.

6- Ácido abscísico

As amostras de folhas foram coletadas no mesmo horário em que foram

realizadas as análises de trocas gasosas. Foram coletadas 5 discos foliares

de (1,25 cm diâmetro) de folhas completamente expandidas do terceiro ou

quarto pares a partir do ápice de ramos plagiotrópicos medianos das plantas.

Quando os potenciais hídricos foliares das plantas estressadas

chegaram a -0,5; -1,0; -1,5 e -3,0 MPa, as amostras de folhas das enxertias

(120/109 e 109/120) e auto-enxertias (109/109 e 120/120) foram coletadas em

plantas controle e estressadas. Com o objetivo de reduzir o grande número de

amostras a serem analisados, nas plantas pés-francos, as amostras foliares

foram coletadas somente quando os potenciais hídricos foliares das plantas

estressadas estavam em -0,5 e -3,0 MPa.

Ao final do experimento, quando as plantas estressadas atingiram o

potencial hídrico foliar de -3,0 MPa, 5 gramas de raízes foram coletadas

aleatoriamente no sistema radicular de plantas controle e estressadas.

Após a coleta, as amostras de folhas e raízes foram imediatamente

congeladas em N líquido e posteriormente liofilizadas.

6.1- Extração e purificação

Foi utilizado o protocolo descrito por Ross et al.(2004), com algumas

modificações. Os tecidos de folha e raiz liofilizados foram macerados em N

líquido com 100% de PVPP. Foram utilizados 50 mg de massa seca de folhas e

200 mg de massa seca de raiz. Em seguida, foi colocado o solvente de

extração (acetona/H

O/ácido acético: 80/19/1). Para folhas utilizou-se 1,5 mL e

para raiz 2,5 mL do solvente de extração. O extrato foi transferido para outro

tubo. O almofariz foi lavado com mais 500 μL do solvente de extração

(acetona/H

O/ ácido acético : 80/19/1) e transferido para o mesmo tubo,

adicionando-se 40 ng de (-)-5,8',8',8'-d4-ABA deuterado. As amostras foram

então agitadas por 30-40 min a 4°C e centrifugadas (15000 x g /10 min/4°C). O

sobrenadante foi coletado e transferido para outro frasco e o resíduo lavado

com mais 250 μL do solvente de extração, centrifugado (15000 x g /10

min/4°C) e o sobrenadante foi novamente coletado e adicionado ao primeiro

sobrenadante. Os sobrenadantes combinados foram liofilizados, dissolvidos em

100 μL de metanol/ácido acético (99/1) mais 900 μL de H

O/ácido acético

(99/1) e, em seguida, centrifugado (15000 x g /2 min/4°C). O sobrenadante foi

transferido para coluna de extração de fase sólida (SPE) (Oasis HLB 1, Waters,

Milford, MA, USA) e o ABA foi eluído com 1 mL de metanol/H

O/ácido acético

(80/19/1). O extrato foi liofilizado e o concentrado foi ressuspendido em 220 μL

de (85/15) (H

O/acetonitrila com 0,07% de ácido acético), agitado em baixa

velocidade por 5 min ( 4°C), sonicado por 5 min e centrifugado (15000 x g /10

min/ 4ºC). O sobrenadante foi, em seguida, transferido para via injetora.

6.2- Separação por HPLC e detecção por MS/MS

As separações cromatográficas das amostras de folhas e raizes foram

feitas em um cromatógrafo líquido de alto desempenho (Shimadzu, Tóquio,

Japão) acoplado a um espectrômetro de massa triplo quadrupolo (Micromass,

modelo Quattro II com fonte Z-spray

, Manchester, Reino Unido). O HPLC

possuía duas bombas LC-ADvp, um detector UV/VIS SPD-10ADvp, um

autoinjetor SIL-10ADvp e um controlador de sistema SCL-10Avp.

As análises foram feitas por cromatografia líquida acoplada à

espectrometria de massa no modo de ionização electrospray negativo

(HPLC/MS/ESI-). As amostras foram analisadas, utilizando-se de uma coluna

cromatográfica C-18 Supelcosil (Supelco; 15 cm de comprimento x 4,6 mm de

diâmetro interno, 5 μm de tamanho da partícula), com fluxo de 0,3 mL min

-1

. Os

eluentes usados foram ácido fórmico 0,1% (A) e acetonitrila (B). O gradiente

linear utilizado foi de 15% a 100% de B em 20 min, 100% de B por mais 5 min,

100% a 15% de B em 2 min e 15% até 30 min. O comprimento de onda

selecionado foi de 252 nm. As condições de ionização foram: voltagem do

capilar de 4 kV, temperatura da fonte de 100 °C e temperatura de

dessolvatação de 200 °C, voltagem do cone de amostragem e extrator de 30 V

e 5 V, respectivamente, energia de colisão de 15 eV, fluxo de gás de secagem-

400 L h

-1

, fluxo de gás de dessolvatação de 15 L.h

-1

e argônio como gás de

colisão. Os dados foram processados pelo software MassLynx NT (versão

3,2,Micromass, Altricham, Reino Unido). A detecção e quantificação de ABA

nas amostras foram feitas mediante o monitoramento de reações múltiplas

(MRM) via seleção da transição de massa específica da molécula de interesse

(para o ABA, 263 → 153 e, para o ABAd

267 → 156).

7- Açúcares, aminoácidos, prolina e amido

Com o objetivo de avaliar o efeito do déficit hídrico moderado (-1,5 MPa)

e déficit hídrico severo (-3,0 MPa) no metabolismo de carboidratos, quando as

plantas atingiram os potenciais hídricos de -1,5 e -3,0 MPa, foram coletadas

amostras de folhas completamente expandidas do terceiro ou quarto pares a

partir do ápice de ramos plagiotrópicos medianos das plantas. O horário de

coleta das folhas foi por volta de 9:00 h. As amostras foliares foram

imediatamente congeladas em nitrogênio líquido, para a determinação das

concentrações foliares de glicose, frutose, sacarose, amido e aminoácidos

solúveis totais. As amostras vegetais foram, então, submetidas à extração

etanólica, a quente, determinando-se, na fração solúvel em etanol, os teores de

açúcares e aminoácidos e prolina e, na fração insolúvel, os de amido (Stitt et

al., 1989; Trethewey et al., 1998; Praxedes et al., 2006). Os teores de prolina

foram determinados segundo Bates et al. (1973).

8- Extravasamento de eletrólitos

A porcentagem de extravasamento de eletrólitos foi determinada quando

as plantas atingiram os potenciais de -1,5 e -3,0 MPa. Os discos foliares foram

coletados às 10:00 h. Após a coleta, os discos foram lavados e imersos em 10

ml de água deionizada em placas de petri. As placas foram fechadas e

mantidas durante 6 horas a temperatura ambiente. O extravasamento de

eletrólitos na água deionizada foi estimado usando um condutivímetro (DM 31,

Digimed, Santo Amaro, Brasil) e expressado como a porcentagem da

condutividade total, a qual foi obtida após colocar as placas em estufa a 90ºC

por 2 horas.

9- Ensaios enzimáticos

Foram determinadas as atividades de algumas enzimas-chave do

sistema antioxidante: SOD, APX e CAT. As enzimas foram extraídas utilizando-

se de almofariz e pistilo pré-resfriados, com polivinilpolipirrolidona (PVPP) 200

% (p/p) e 4 mL de meio de extração específico para cada enzima, como se

segue: SOD [tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 7,8), EDTA 0,1 mM , DTT

1mM, β-mercaptoetanol 10 mM e Triton-100 0,1 % (v/v)]; APX [tampão fosfato

de potássio 50 mM (pH 7,0), EDTA 2 mM , ascorbato 20 mM e Triton-100 0,1 %

(v/v)]; CAT [tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0), EDTA 2 mM ,

ascorbato 20 mM e Triton-100 0,1% (v/v)]. O homogenato resultante foi

centrifugado a 15000 g , por 15 min, a 4° C. O sobrenadante foi coletado e

usado para quantificações protéicas (Bradford, 1976) e atividades enzimáticas.

A atividade total da SOD foi determinada de acordo com o método

espectrofotométrico, descrito por Giannopolitis e Ries (1977), em que a

atividade da SOD é dada pela capacidade da enzima em inibir a redução

fotoquímica do azul de nitrotetrazólio (NBT), sob luz. Para os ensaios de

atividade, uma alíquota do extrato enzimático (5 μL) foi aplicada a 3 mL

(volume final) de meio de reação contendo tampão fosfato de potássio 52,5 mM

(pH 7,8), EDTA 0,1 μM, NBT 75 μM, metionina 13 mM (pH 7,8) e riboflavina 2

μM. A interferência inespecífica inerente ao extrato enzimático foi determinada

pela adição de extrato desnaturado à mistura de reação, enquanto a produção

total de azul de formazana foi determinada utilizando-se apenas o meio de

reação. O ensaio de atividade foi iniciado pela exposição dos tubos contendo

as referidas misturas a uma câmara contendo luz fluorescente (15 W), a 25º C,

por 10 min. A reação foi paralisada desligando-se a luz, sendo a produção

fotoquímica de azul de formazana determinada em espectrofotômetro (Hitachi

mod. U-2000, Tókio, Japão), a 560 nm. Uma mistura de reação mantida sob

obscuridade foi utilizada como branco. A atividade da SOD (unidades mL-1) foi

proporcional à relação V/v -1, em que V é a variação em absorbância por

minuto, sem o extrato enzimático, e v é a variação em absorbância por minuto,

com o extrato. Considerou-se que 1 U de SOD corresponde à quantidade da

enzima capaz de inibir a redução do NBT em 50%.

A atividade da APX foi determinada de acordo com Nakano e Asada

(1981), com algumas modificações. O ensaio enzimático foi realizado em

espectrofotômetro, após a adição de 15 μL de extrato enzimático a 985 μL de

meio de reação contendo tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0), 0,5 mM

ascorbato e 0,1 mM de H

. A atividade da enzima foi determinada pelo

decréscimo na absorbância a 290 nm, durante 1 min, a 25 ºC. Para os cálculos

da atividade, utilizou-se o coeficiente de extinção molar do ascorbato (2,8 mM

-1

), considerando-se que 1 U de APX corresponde à quantidade da enzima

capaz de oxidar 1 μmol de ascorbato por minuto.

A atividade da CAT foi determinada pelo consumo de H

, de acordo

com Havir e McHale (1989), com algumas modificações. O ensaio enzimático

foi realizado em espectrofotômetro, após a adição de 15 μL de extrato

enzimático a 985 μL de meio de reação contendo tampão fosfato de potássio

50 mM (pH 7,0) e H

12,5 mM . A atividade da enzima foi determinada pelo

decréscimo na absorbância a 240 nm, durante 1 min, a 30 ºC. Para os cálculos

da atividade, utilizou-se o coeficiente de extinção molar do H

(39,4 mM-1

cm-1), considerando-se que, nas condições de ensaio, 1 U de CAT

corresponde à quantidade da enzima capaz de oxidar 1 μmol de H

por

minuto.

10- Análises estatísticas

As análises estatísticas foram feitas, com base no delineamento em

blocos casualizados, com doze tratamentos e cinco repetições, formando um

esquema em fatorial 6 x 2 (seis tipos de planta e dois regimes hídricos). A

parcela foi constituída de uma planta por vaso.

Realizou-se a análise de variância dos dados à significância de 5% de

probabilidade, pelo teste F, utilizando-se o programa computacional ‘Sisvar’,

desenvolvido por Ferreira (2000). Quando diferenças significativas foram

detectadas, as médias foram agrupadas pelo teste de Newman-Keuls a 5% de

probabilidade.

RESULTADOS

1- Parâmetros biométricos

As plantas alcançaram o ψ

am =

-3,0 MPa em diferentes períodos, após a

imposição do déficit hídrico, portanto as alterações de crescimento não foram

completamente comparáveis entre as plantas estressadas. Além disso, os

efeitos do déficit hídrico no crescimento das plantas não foram significativos

devido ao curto período de imposição do déficit hídrico (dados não

apresentados).

Comparando-se as plantas pés-franco, não foram observadas diferenças

quanto à área foliar, diâmetro do caule, massa seca raiz/ área foliar. Apesar de

a biomassa radicular ter sido 20% maior no pé-franco 109 do que no pé-franco

120, o comprimento da raiz foi 36% maior no último (Tab. 1).

As plantas auto-enxertadas tiveram menor biomassa total e área foliar,

quando comparadas às respectivas plantas pés-franco. Entretanto, as

diferenças entre auto-enxertias 109/109 e 120/120 seguiram padrões

semelhantes aos observados nos pés-franco. As enxertias recíprocas 120/109

e 109/120 também apresentaram menores áreas foliares quando comparados

a ambos os pés-francos, porém as massas secas da raiz e biomassas totais

foram menores somente em relação ao pé-franco 109 (Tab. 1).

Quanto à comparação entre as enxertias, a exemplo do observado para

o pé-franco 120, o comprimento da raiz foi maior nas plantas constituídas pelo

sistema radicular 120 (120/120 e 109/120) do que nas plantas com o sistema

radicular 109 (Tab. 1), não apresentando diferenças com relação aos

parâmetros área foliar e diâmetro do caule. Entretanto, observou-se que na

auto-enxertia 120/120, a massa seca da raiz, a relação massa seca raiz/ área

foliar e biomassa total foram menores do que nas demais enxertias (Tab. 1).

Pés-franco Enxertias

Parâmetros Clone 109 Clone 120 109/109 120/120 109/120 120/109

Comprimento

caule (m) 0,37 ± 0,02 a 0,32 ± 0,01 b 0,36 ± 0,02 a 0,28 ± 0,01 b 0,35 ± 0,02 a 0,31 ± 0,02 b

Diâmetro

caule (cm)

0,54 ± 0,01 a 0,52 ± 0,02 a 0,51 ± 0,03 a 0,47 ± 0,01 a 0,51 ± 0,02 a 0,48 ± 0,02 a

Área

foliar (m2) 0,261 ± 0,03 a 0,245 ± 0,02 a 0,193 ± 0,04 b 0,164 ± 0,04 b 0,180 ± 0,03 b 0,185 ± 0,02 b

Massa seca raiz/

Massa seca parte aérea 0,196 ± 0,02 a 0,193 ± 0,01 a 0,195 ± 0,03 a 0,186 ± 0,01 a 0,218 ± 0,02 a 0,194 ± 0,02 a

MS raiz (g) 9,65 ± 0,81 a 8,04 ± 0,18 b 6,84 ± 0,71 b 4,94 ± 0,3 c 7,24 ± 0,56 b 7,04 ± 0,68 b

Comprimento raiz (m)

0,53 ± 0,02 c 0,72 ± 0,02 a 0,53 ± 0,02 c 0,63 ± 0,02 b 0,64 ± 0,01 b 0,57 ± 0,02 bc

Massa seca raiz/

Área foliar (g.m

) 36,97 ± 3,50 a 33,01 ± 4,03ab 35,44 ± 2,50 a 30,12 ± 4,50 b 40,22 ± 4,30 a 38,05 ± 3,25 a

Biomassa total (g) 58,88 ± 4,50 a 49,72 ±4,92 b 41,81 ± 4,74 b 32,86 ±1,95 c 40,4 ± 1,8 b 43,33 ± 2,7 b

Tabela. 1. Características morfológicas de pés -franco e enxertias de Coffea canephora em condições irrigadas. Letras

minúsculas diferentes representam diferenças significativas entre médias de clones (Teste Newman-Keuls, P≤0,05). Cada

valor representa a média

o erro

padrão de cinco repetições

0 5 10 15 20 25 30

-4

-3

-2

-1

109I

109 NI

120I

120NI

0 5 10 15 20 25 30

-4

-3

-2

-1

109/109I

109/109NI

120/120I

120/120NI

0 5 10 15 20 25 30

-4

-3

-2

-1

109/120I

109/120NI

120/109I

120/109NI

(MPa)

2- Status hídrico

Nas plantas-controle, o potencial hídrico foliar na ante-manhã (ψ

)

foi

sempre superior a -0,05 MPa. Após a suspensão da irrigação, nas plantas

pés-

franco e auto-enxertias do clone 109 (sensível à seca), ψ

diminui mais

rapidamente que nas plantas pés-franco e auto-enxertia do clone 120 (Fig. 1a e

1b). O déficit hídrico severo (-3,0 MPa) foi alcançado aos 18 dias pelas plantas

109 e 109/109. As plantas 120 e 120/120 só atingiram -3,0 MPa aos 25 e 27

dias, após a imposição do déficit, respectivamente (Fig. 1a e 1b).

Quando comparado ao

pé-franco 109 e auto-enxertia 109/109, ψ

tendeu a diminuir mais lentamente nas combinações de enxertia 120/109 e

109/120, sendo que ψ

-3,0 MPa foi alcançado aos 22 e 25 dias,

respectivamente (Fig. 1c).

Dias após a imposição do déficit hídrico

FIG. 1. Perfil temporal do potencial hídrico foliar na antemanhã (ψ

) de pés-

franco (a), auto-enxertias (b) e enxertias recíprocas (c) de diferentes clones de

Coffea canephora em condições irrigadas (símbolos cheios) e sob déficit

hídrico (simbolos vazios). Cada ponto representa a média + erro padrão de

cinco repetições. I = Irrigado, NI= Não irrigado (não irrigado após a imposição

do déficit hídrico)

3- Trocas gasosas

Sob irrigação, não houve diferença em A e na razão C

entre as

plantas pés-franco, auto-enxertia e enxertia recíproca (Fig. 2a e 2c). Quanto a

, de modo geral, em condição irrigada, maior g

foi observada na auto-

enxertia 109/109 (Fig. 2b).

Analisando-se g

, após a suspensão da irrigação, sob ψ

am =

-0,5 MPa,

foi possível observar uma redução significativa em g

nas plantas 120/120, 120

e nas combinações de enxertia 109/120 e 120/109. Esse fato não foi

observado nas plantas 109 e 109/109 (Fig. 2b). As taxas transpiratórias

seguiram padrão semelhante aos observados para g

(dados não

apresentados). Sob ψ

= -1,0, -1,5 e -3,0 MPa, foi possível observar redução

em g

em todas as plantas, inclusive 109 e 109/109 (Fig. 2 a,b e c).

Quanto a fotossíntese, sob ψ

am =

-0,5 MPa, foi possível observar uma

redução significativa em A no pé-franco 120 (Fig. 2a). Embora tenha sido

verificada redução em A em todas as plantas a ψ

= -1,0, -1,5 e -3,0 MPa, foi

possível observar que no ψ

am =

-3,0MPa, as plantas 109 e 109/109 tenderam a

apresentar reduções mais pronunciadas em A, quando comparadas as demais.

Nesse potencial, no pé-franco 120 e na auto-enxertia 120/120, houve redução

de 55% em A e de 93% em g

. No pé-franco 109 e auto-enxertia 109/109 a

redução da A foi de 75% e, em g

, de 96%. Nas combinações de enxertia

120/109 e 109/120, houve uma redução em torno de 60% em A e 95% em g

(Fig. 2a). A ψ

= -3,0MPa, foi possível observar também que no pé-franco 109

e na auto-enxertia 109/109 a razão C

permaneceu mais elevada (Fig 2c).

Independentemente dos clones avaliados, as reduções em g

ocorreram em

maior extensão que as reduções em A, fato acompanhado por redução na

razão C

(Fig. 2a, b e c ).

0 MPa

Controle

Estressado

Taxa fotossintética líquida - A (μmol CO

-2

-1

)

: -0,5 MPa

Controle

Estressado

: -1,0 MPa

Controle

Estressado

: -1,5 MPa

Controle

Estressado

: -3,0 MPa

Controle

Estressado

109/109

120/109

109/120

120/120

109

120

: 0,0 MPa

Controle

Estressado

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Condutância estomática - g

(mol m

-2

-1

)

: -0,5 MPa

Controle

Estressado

: -1,0 MPa

Controle

Estressado

: -1,5 MPa

Controle

Estressado

: -3,0 MPa

Controle

Estressado

109/109

120/109

109/120

120/120

109

120

: 0,0 MPa

Controle

Estressado

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Razão C

: -0,5 MPa

Controle

Estressado

: -1,0 MPa

Controle

Estressado

: -1,5 MPa

Controle

Estressado

: -3,0 MPa

Controle

Estressado

109/109

120/109

109/120

120/120

109

120

FIG. 2. Taxa fotossintética líquida de CO

, condutância estomática e razão

entre concentração de CO

interna e externa (C

) à folha, em plantas de

Coffea canephora enxertadas e não enxertadas. Os gráficos foram ligeiramente

deslocados horizontalmente de modo a facilitar a visualização das linhas

verticais que representam o erro padrão da média. n = 5. Barras verticais

pretas sem símbolo indicam ausência de diferença significativa para os pontos

localizados verticamente na mesma posição (P > 0,05; teste de Duncan).

4- Composição isotópica do carbono (δ

Após a imposição do déficit hídrico, δ

C aumentou, significativamente,

em todas as plantas (Fig. 3), o que sugere que a eficiência do uso da água (E

)

tenha aumentado durante o período de estresse. Não houve efeito da auto-

enxertia, pois os valores de δ

C não defeririam entre os pés-franco e suas

respectivas auto-enxertias. Independentemente do déficit hídrico, observa-se

que o clone 120 apresentou maior δ

C que a planta 109. Do mesmo modo, a

auto-enxertia 120/120 apresentou maior δ

C em relação à auto-enxertia

109/109. Nas combinações de enxertia 109/120 e 120/109, a δ

C foi

semelhante entre os tratamentos 120 e 120/120, ambos os quais apresentaram

maior descriminação quando comparadas aos tratamentos 109 e 109/109

(Fig. 3).

C (‰)

-30

-29

-28

-27

-26

-25

-24

Controle

Estressado

FIG. 3. Efeitos do déficit hídrico na composição isotópica de carbono foliar

(δ

C) de pés-franco e enxertias de Coffea canephora. Letras minúsculas

diferentes representam diferenças significativas entre médias de clones

irrigados, e letras maiúsculas diferentes denotam diferenças significativas entre

médias de clones estressados (Newman-Keuls, P≤0,05). As médias de plantas

estressadas marcadas com um asterisco diferem das médias das plantas-

controle (Teste F; P ≤0,05). As colunas representam a média, e as barras o

erro-padrão, de cinco repetições.

C (‰)

5- Ácido abscísico

Detecção e quantificação da ABA por HPLC/MS/MS

A detecção e quantificação da ABA e a detecção de 5,8’,8’,8’-ABAd

foram feitas através do monitoramento de reação múltipla (MRM), que é a

seleção de uma transição de massa específica (ou fragmentação) da molécula

de interesse. Para o ABA, a transição escolhida foi m/z 263→153 e para o

padrão interno 5,8’,8’,8’-ABAd

a transição m/z 267→156. Os cromatogramas

dos padrões ABA (Fig. 4a) e 5,8’,8’,8’-ABAd

(Fig. 4b) possuem, em 16

minutos, dois picos intensos, referentes ao íons moleculares do ABA e do

5,8’,8’,8’-ABAd

0.00 2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00 32.50 35.00

100

16.0316.03

16.26

Abundância relativa (%)

Tempo (min)

FIG. 4. Cromatogramas dos padrões ABA (a) e 5,8’,8’,8’-ABAd

(b) obtidos por

HPLC/MS/ESI

Os espectros de massas do ABA (Fig. 5a) e do 5,8’,8’,8’-ABAd

(Fig. 5b)

obtidos em 16 minutos, possuem dois picos predominantes com m/z 263 e m/z

267, referentes aos íons moleculares do ABA e do 5,8’,8’,8’-ABAd

respectivamente. No espectro de massas do ABA (Fig. 5a) foi possível

observar que além do pico do íon molecular (m/z 263), existe os picos com m/z

219 e m/z 153, que correspondem aos fragmentos da molécula de ABA,

produzidos na ionização dentro do espectrômetro de massas. O espectro de

massas do padrão interno 5,8’,8’,8’-ABAd

(Fig. 5b) também possui fragmentos

com m/z 223 e m/z 156.

100 110 120 130 140 150 160 170100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290

100

263

153

113

219

263

153

113

219

267

156

223

245

Abundância relativa (%)

m/z

m/z 263

m/z 219

m/z 153

ABA

m/z 267

m/z 223

m/z 156

5,8’,8’,8’-ABAd

8´

FIG. 5. Espectros de massas dos padrões ABA (A) e 5,8’,8’,8’-ABAd

(B) em 16

minutos, obtidos por HPLC/MS/ESI

na faixa de massa com m/z de 100 a 300.

Na figura 6 tem-se os cromatogramas obtidos no modo de detecção MRM,

monitorando as transições de massas dos padrões ABA (m/z 263→153) e

5,8’,8’,8’-ABAd

(m/z 267→156).

0.00 2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00 32.50 35.00

100

16.6316.63

16.43

ABA

5,8’,8’,8’-ABAd

Abundância relativa (%)

Tempo (min)

MRM

m/z 263

153

MRM

m/z 267

156

FIG. 6. Cromatogramas obtidos no modo de detecção MRM dos padrões ABA

(A) e 5,8’,8’,8’-ABAd

(B).

Após a análise dos padrões ABA e 5,8’,8’,8’-ABAd

por HPLC/MS/MS,

foi realizada a análise das amostras de folha e raiz de café. Como era

esperado, tanto em condição controle (irrigadas) quanto em condição de déficit

hídrico, as amostras de folha e raiz possuíam pequenas quantidades de ABA

(nanogramas por grama de massa seca). Foi possível detectar e quantificar o

ABA nas amostras utilizando-se uma curva de calibração, onde tanto as

amostras quanto os padrões utilizados foram analisados por HPLC/MS/MS no

modo MRM. A curva de calibração foi obtida através da razão entre as áreas

dos picos de ABA e 5,8’,8’,8’-ABAd

(área de ABA/área de 5,8’,8’,8’-ABAd

)

versus diferentes concentrações de ABA. O cromatograma no modo MRM

(FIG. 7) de uma amostra de folha de café possui a transição característica do

ABA (m/z 263→153) e do padrão interno 5,8’,8’,8’-ABAd

(m/z 267→156),

comprovando que a detecção por HPLC/MS/MS do ABA e do padrão interno

adicionado na extração, foi eficiente e validou a metodologia para a

quantificação da molécula de ABA.

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00

100

16.68

3.34

4.76

13.96

18.27

23.14

18.54

25.19

16.68

3.34

4.76

13.96

18.27

23.14

18.54

25.19

16.65

Abundância relativa (%)

Tempo (min)

ABA

5,8’,8’,8’-ABAd

MRM

m/z 263

153

MRM

m/z 267

156

FIG. 7. Detecção de ABA em amostra de café. Cromatogramas obtidos no

modo de detecção MRM do ABA (A) e do padrão interno 5,8’,8’,8’-ABAd

(B).

Quantificação de ABA nas folhas e raízes de Coffea canephora

Sob irrigação, não houve diferença nas concentrações foliares de ABA

entre as diferentes combinações analisadas, situação que se repetiu a ψ

= -

0,5 MPa (Fig. 8). Aumentos nas concentrações foliares de ABA em resposta ao

déficit hídrico somente foram observados quando ψ

foi menor que – 1,0

MPa.

Sob ψ

= -1,0 e -1,5 MPa, foi possível observar maior concentração de

ABA foliar nas plantas 120/120, 109/120 e 120/109, ao compararem-se essas

plantas com a planta 109/109 (Fig. 8).

Em condições de déficit hídrico severo (-3,0 MPa), não houve diferença

nas concentração foliares de ABA entre as plantas tolerante (120) e sensível

(109), bem como entre as plantas 109/120, 120/120/ e 109/109. Entretanto, a

planta 120/109 apresentou maior concentração de ABA, quando comparadas

às demais plantas (Fig. 8).

De modo geral, foi verificado que quanto menor ψ

am,

maiores foram as

concentrações de ABA foliar . Entretanto, não se observou diferença entre as

plantas 120/120 e 109/120 submetidas aos ψ

= -1,5 e -3,0MPa (Fig. 8) .

ABA (ng g

-1

MS)

100

200

300

400

500

600

Controle

Estressado

ABA (ng g

-1

MS)

100

200

300

400

500

600

Controle

Estressado

a a a

a a

AA AA A

a a a a

ABA (ng g

-1

MS)

100

200

300

400

500

600

Controle

Estressado

ABA (ng g

-1

MS)

100

200

300

400

500

600

Controle

Estressado

B*B*

a a

A* A* A* A*

aaa a

FIG. 8. Concentração foliar de ácido abscísico (ABA) em pés -franco e

enxertias de Coffea canephora irrigados (colunas brancas) e submetidos ao

déficit hídrico (colunas cinzas), Ψ

am =

-0,5, -1,0, -1,5 e -3,0 MPa. Outros

detalhes estatísticos conforme Fig. 2.

A concentração de ABA nas raízes, sob de déficit hídrico severo (-3,0

MPa) teve um aumento de aproximadamente 70 % em todas as plantas,

quando comparadas às respectivas plantas-controle (Fig. 9).

Independentemente do déficit hídrico, as concentrações de ABA foram maiores

= -3,0 MPa Ψ

= -1,5 MPa

= -0,5 MPa Ψ

= -1,0 MPa

nas raízes das plantas 120, 120/120 e 109/120 quando comparados aos das

plantas 109, 120/109 e 109/109 (Fig. 9). Observou-se, também, em todas as

plantas, que as concentrações de ABA na raiz foram sempre maiores do que

as da folha, independente dos regimes hídricos.

ABA (ng g

-1

MS)

200

400

600

800

1000

Controle

Estressado

FIG. 9. Concentração de ácido abscísico (ABA) nas raízes de pés -franco e

enxertias de Coffea canephora irrigados (colunas brancas) e submetidos a

déficit hídrico (colunas cinzas), Ψ

am =

-3,0 MPa. Outros detalhes estatísticos

conforme Fig. 2.

6- Carboidratos e aminoácidos

Sob déficit hídrico moderado, não houve diferenças nas concentrações

de glicose entre os pés-francos 120 e 109, bem como entre as enxertias

120/120 e 109/109 (Fig. 10a).

Sob déficit hídrico severo, o teor de glicose aumentou nas plantas 109,

109/109 e 109/120, fato não observado para 120, 120/120 e 120/109. Já

quanto ao teor de frutose, não houve diferença entre as plantas estressadas e

plantas-controle (Fig. 10a e 10b).

As concentrações de sacarose e amido foliar sofreram forte redução,

tanto sob estresse hídrico moderado, quanto sob severo em todas os

tratamentos, indistintamente. Os níveis de redução de sacarose foram, em

média, de 38 % a Ψ

= -1,5 MPa e 57 %, a Ψ

= -3,0 MPa. Em ambos os

potenciais foliares, a percentagem média de redução da concentração de

amido foi de 70% (Fig. 10c e 11a) .

Verificou-se, a Ψ

= -1,5 MPa, que a razões amido:sacarose e

hexoses:aminoácidos foram reduzidas nas plantas 120, 120/120, 109/120 e

120/109, fato não observado no clone 109 e 109/109 (Fig. 12). Já sob -3,0

MPa, a razão amido:sacarose permaneceu inalterada em todas as plantas,

enquanto a razão hexoses:aminoácidos diminuiu nas plantas 120, 109/120 e

120/109 (Fig. 12).

A concentração de aminoácidos aumentou significativamente em todas

as plantas, sob déficit hídrico moderado e severo, mais particularmente sob

déficit moderado (Fig. 11b). Esse aumento foi mais pronunciado nas plantas

109 e 109/109, quando comparado ao das plantas 120 e 120/120. Entre as

enxertias 120/109 e 109/120, sob déficit moderado, a concentração de

aminoácidos foi maior na 120/109, que apresentou concentrações semelhantes

às das plantas 109 e 109/109 (Fig. 11b).

A concentração de prolina não diferiu entre as plantas-controle, mas

aumentou sob déficit hídrico moderado somente nas plantas 109, 109/109 e

109/120 (Fig. 11c). Sob déficit hídrico severo, as concentrações de prolina

aumentaram em todas as plantas, com exceção da combinação de enxertia

120/109. Foi observado que as plantas 109 e 109/109 apresentaram as

maiores concentrações de prolina e que houve um efeito do porta-enxerto 120,

que reduziu as concentrações de prolina no enxerto 109 a valores semelhantes

àqueles observados para as plantas 120,120/120 e 120/109.

Sacarose (mmol kg

-1

MS)

Frutose (mmol kg

-1

MS)

Glicose (mmol kg

-1

MS)

FIG. 10. Concentrações de glicose, frutose e sacarose, em folhas de pés-

franco e enxertias de Coffea canephora irrigados (colunas brancas) e

submetidos a déficit hídrico (colunas cinzas) moderado (Ψ

= -1,5 MPa) e

severo (Ψ

= -3,0 MPa). Outros detalhes estatísticos conforme Fig. 2.

= -3,0 MPa Ψ

= -1,5 MPa

Amido (mmol kg

-1

MS)

100

Aminoácidos (mmol kg

-1

MS)

200

400

600

800

200

400

600

800

AB*

Prolina (mmol kg

-1

MS)

a A

AB*

FIG. 11. Concentrações de amido, aminoácidos e prolina, em folhas de pés-

franco e enxertias de Coffea canephora irrigados (colunas brancas) e

submetidos a déficit hídrico (colunas cinzas) moderado (Ψ

= -1,5 MPa) e

severo (Ψ

= -3,0 MPa). Outros detalhes estatísticos conforme Fig. 2

= -3,0 MPa Ψ

= -1,5 MPa

Razão amido:sacarose

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

Razão amido:sacarose

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

Razão hexoses:AA

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

Razão hexoses:AA

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

AB*

FIG. 12. Razões amido: sacarose e hexoses: aminoácidos, em folhas de pés-

franco e enxertias de Coffea canephora irrigados (colunas brancas) e

submetidos a déficit hídrico (colunas cinzas) moderado (Ψ

= -1,5 MPa) e

severo (Ψ

= -3,0 MPa). Outros detalhes estatísticos conforme Fig. 2

7- Parâmetros de fluorescência da clorofila a e pigmentos fotossintéticos

Não foi observada diferença quanto aos parâmetros fotoquímicos e

concentração de pigmentos fotossintéticos entre os pés-francos, auto-enxertias

e combinações de enxertia, em condições irrigadas (Fig. 13). Sob déficit hídrico

moderado e severo, não foram verificadas alterações na eficiência fotoquímica

máxima do FSII (avaliada pela razão F

) (Fig. 13a) e nos teores de

pigmentos fotossintéticos (dados não apresentados).

= -3,0 MPa Ψ

= -1,5 MPa

Algumas alterações nos demais parâmetros fotoquímicos foram

verificadas sob déficit hídrico, mas também não houve diferença entre as

plantas. (Fig. 13). Sob déficit hídrico moderado e severo, não foram observadas

alterações na razão F

’/F

’, enquanto q

decresceu em média 24 % (Ψ

am=

-1,5

MPa) e 30 % (Ψ

am=

-3,0 MPa) (Fig. 13b e 13c). A redução em q

esteve

associada ao decréscimo em ø

FSII

(24 %, Ψ

am=

-1,5 e 36 %, Ψ

am=

-3,0) (Fig.

13d). Entretanto, não houve alterações significativas em NPQ (Fig. 13e). Nas

plantas submetidas ao déficit hídrico moderado e severo foram observados

aumentos de 34% e 23% em P

, respectivamente (Fig. 13f).

8- Estresse oxidativo

Em geral, pode-se observar menor extravasamento de eletrólitos em

folhas do clone tolerante ao déficit hídrico, tanto a ψ

am =

-1,5 quanto -3,0

MPa

(Fig. 14). Sob déficit hídrico moderado, o extravasamento de eletrólitos

aumentou nas folhas das plantas 109, 109/109 e 109/120, mas não nas folhas

dos tratamentos 120, 120/120 e 120/109.

Sob déficit severo (-3,0 MPa), o extravasamento de eletrólitos aumentou

significativamente em todas as plantas, particularmente nos pé-franco 109 e

auto-enxertia 109/109 (~100% maior que nas plantas pé- franco 120 e auto-

enxertia 120/120; Fig. 14). Ainda, pode-se observar que o porta-enxerto 120

reduziu o extravasamento de eletrólitos em folhas do enxerto 109 (plantas

109/120), quando comparado ao pé-franco 109. A tendência do mesmo efeito

também pode ser observada sob déficit hídrico moderado, embora a diferença

ainda não tenha sido significativa.

Sob irrigação adequada, não houve diferenças nas atividades das

enzimas peroxidase do ascorbato (APX), dismutase do superóxido (SOD) e

catalase (CAT) entre todas as plantas (Fig. 14).

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

a A

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

a A

NPQ

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

a A

NPQ

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

A* A*

PSII

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

a a

PSII

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

'/F

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

a A

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

a A

Fig. 13. Efeitos de níveis de déficit hídrico sobre a eficiência fotoquímica

máxima do FSII – F

(a), eficiência de captura de energia de excitação pelos

centros de reação abertos do FSII-F

’/F

’ (b), coeficiente de extinção

fotoquímica -q

(c), rendimento quântico do transporte de elétrons – ø

FSII

(d),

= -1,5 MP a Ψ

= -3,0 MPa

coeficiente de extinção não-fotoquímica- NPQ (e) e fração de energia absorvida

não utilizada na fotoquímica nem dissipada termicamente - P

(f) em folhas de

pés- franco e enxertias de Coffea canephora irrigados (colunas brancas) e

submetidos a déficit hídrico (colunas cinzas) moderado (Ψ

= -1,5 MPa) e

severo (Ψ

= -3,0 MPa). Outros detalhes estatísticos conforme Fig. 2.

Extravasamento de eletrólitos (%)

Controle

Estressado

Controle

Estressado

FIG. 14. Extravasamento de eletrólitos (%) em folhas de pés -franco e enxertias

de Coffea canephora irrigados (colunas brancas) e submetidos a déficit hídrico

(colunas cinzas) , moderado (Ψ

= -1,5 MPa) e severo (Ψ

= -3,0 MPa).

Outros detalhes estatísticos conforme Fig. 2.

A ψ

-1,5 MPa, não houve alteração na atividade da APX e SOD,

porém a atividade da CAT aumentou significativamente em todos os

tratamentos. Sob déficit hídrico moderado houve uma tendência de maior

atividade da CAT nas plantas 109 e 109/109 quando comparados às das

demais (Fig. 15).

Em condições de déficit hídrico severo a atividade da APX aumentou

somente nas plantas 109 (93%), 109/109 (77%) e 109/120 (65%), entretanto, a

atividade da SOD e CAT aumentou significativamente em todas as plantas (Fig.

15). A atividade da SOD aumentou aproximadamente 75 % e não diferiu entre

as plantas. O aumento da atividade da CAT foi em torno de 95 % nas plantas

109 e 109/109, e 65 % nas plantas 120, 120/120, 120/109 e 109/120 (Fig. 15).

= -1,5 MP a Ψ

= -3,0 MPa

= -1,5 MP a Ψ

= -3,0 MPa

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

CAT (µmol H

min

-1

proteína)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

AB*

A* A*

SOD (unidades mg

-1

proteína)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

AB*

APX (µmol Asc min

-1

proteína)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

FIG. 15. Atividade de enzimas antioxidantes, ascorbato peroxidase-APX ,

superóxido dismutase -SOD e catalase-CAT, em folhas de pés- franco e

enxertias de Coffea canephora irrigados (colunas brancas) e submetidos a

déficit hídrico (colunas cinzas) moderado (Ψ

= -1,5 MPa) e severo (Ψ

= -3,0

MPa). Outros detalhes estatísticos conforme Fig. 2.

DISCUSSÃO

1- Efeito da enxertia e do déficit hídrico nos parâmetros de crescimento,

trocas gasosas e ácido abscísico

Não foram verificados sintomas de incompatibilidade das combinações

de enxertia, o que corrobora com a observação de que as características

morfológicas, como comprimento do caule, diâmetro do caule e razão MSR/AF

não diferem entre as plantas enxertadas e plantas pés-franco. Os dados

sugerem que há uma interação entre enxerto e porta-enxerto que pode

influenciar as características biométricas das plantas, visto que foi observado

maior comprimento da raiz nas plantas cujo porta-enxerto é o clone 120, e que

a enxertia 120/120 apresentou menores valores de acúmulo de massa seca na

raiz e biomassa total. É comum a enxertia exercer um efeito inibitório no

crescimento vegetativo e tem-se associado esse efeito à restrição do fluxo de

água, minerais e reguladores de crescimento pelo sistema vascular entre

enxerto e porta-enxerto (Jones, 1984; Simons, 1986; Soumelidou et al., 1994b).

Em concordância com estas observações, Atkinson et al. (2003), comparando

porta-enxertos com diferenças na capacidade de produzir nanismo na macieira,

observaram que as enxertias que produziam maior efeito de nanismo possuíam

uma menor condutividade hidráulica. Dessa forma, é possível que a enxertia

tenha ocasionado uma redução da condutância hidráulica do xilema nas plantas

120/120, resultando em uma redução do acúmulo de biomassa total da planta.

As plantas alcançaram o ψ

am =

-3,0 MPa em diferentes dias, após a

imposição do déficit hídrico, portanto as alterações de crescimento não foram

completamente comparáveis entre as plantas estressadas. Além disso, os

efeitos do déficit hídrico no crescimento das plantas não foram significativos

devido ao curto período de imposição do déficit hídrico. De forma semelhante

ao verificado por Pinheiro et al. (2005), o pé-franco 120 apresentou maior a

tolerância ao déficit hídrico e um sistema radicular mais profundo que o pé-

franco 109. As enxertias que possuíam o clone 120 como sistema radicular

também apresentaram maior tolerância ao déficit hídrico, a julgar-se pela

redução mais lenta do ψ

e pelo menor extravasamento de eletrólitos. Na

enxertia 120/109 foi observado uma contribuição da parte aérea do clone 120

em retardar a queda do ψ

am.

Estes efeitos não podem ser explicados por

diferenças na área foliar, ou na razão massa raiz/área foliar. Em frutíferas,

como macieira (Olien e Lakso, 1986, Policarpo et al., 2000) e videira

(Carboneau, 1985), porta-enxertos oriundos de genótipos tolerantes aumentam

a tolerância à seca da parte aérea de outros genótipos, mas esse efeito

depende da interação entre os genótipos utilizados. Em condições de campo,

onde a disponibilidade da água do solo não foi limitante, a enxertia de cultivares

de C. arabica em porta-enxerto de C. canephora cv. Apoatã contribuiu também

para manutenção de um melhor status hídrico nas cultivares de C. arabica, fato

atribuído especulativamente à arquitetura, tamanho e condutividade hidráulica

das raízes de C. canephora (Fahl et al., 2001).

A ψ

= -0,5 MPa, as plantas tolerantes 120 e 120/120 apresentaram

maior sensibilidade estomática do que as plantas sensíveis 109 e 109/109, pois

reduziu apenas nas plantas tolerantes. Além disso, as análises de g

mostraram que o porta-enxerto 120 pode conferir menor g

à parte aérea do

clone 109, mas também que há uma contribuição da parte aérea do clone 120

no controle de g

, visto que g

da combinação 120/109 foi semelhante a g

outras plantas que possuíam o sistema radicular do clone 120. Em enxertias de

macieira utilizando-se de diferentes porta-enxertos, tanto reduções quanto

aumentos em g

são observados quando comparadas com os pés-francos, sob

déficit hídrico (Higgs e Jones, 1990). Alguns genótipos de porta-enxertos de

videira também são capazes de modular A e g

de folhas de genótipos

enxertados (Lacono et al., 1998). O efeito do porta-enxerto sobre g

foi

verificado também quando a variedade Catuaí (C. arabica) foi enxertada sobre

café conilon (Tomaz et al., 2006). Estes resultados contrastam com os

experimentos de enxertia recíproca com os mutantes de girassol e tomate,

deficientes em ABA, em que g

dependeu somente do genótipo do enxerto

(Fabrini et al., 1995; Holbrook et al., 2002).

Em potenciais iguais ou menores que -1,0 MPa, g

reduziu em todas as

plantas indistintamente. Estes resultados contrastam parcialmente com os

resultados obtidos por Pinheiro et al. (2005), em que se observaram diferenças

significativas entre os clones 109 e 120, sob potenciais iguais ou menores que -

1,0 MPa. Tal discrepância pode estar associada a diferenças entre tamanhos

de vaso ou interferência ambiental durante a realização das medições.

Sob déficit hídrico severo, reduções mais pronunciadas em A foram

observadas nas plantas sensíveis 109 e 109/109 do que nas plantas tolerantes

120 e 120/120, apesar de não terem ocorrido diferenças em g

e C

. Em

concordância com estas observações, foi possível verificar uma tendência de

reduções menos pronunciadas em A nas enxertias 120/109 e 109/120. Visto

que o fechamento estomático acarreta decréscimos proporcionalmente maiores

à transpiração que à fotossíntese, a eficiência instantânea do uso da água foi

maior nas plantas tolerantes e nas enxertias 120/109 e 109/120.

Independentemente das plantas avaliadas sob déficit hídrico, as reduções em

ocorreram em maior extensão que as reduções em A, fato acompanhado por

redução na razão C

. Estes dados sugerem que a inibição fotossintética

pode ter sido ocasionada principalmente devido ao fechamento dos estômatos.

Estes resultados são consistentes com os apresentados por Praxedes et al.

(2006). Entretanto, à medida que se intensifica o estresse, pode ocorrer

também uma inibição não-estomática da fotossíntese, determinada

possivelmente pelo comprometimento da regeneração da ribulose -1,5-

bisfosfato e também por um decréscimo na atividade de carboxilação dessa

enzima (DaMatta et al., 2002b). Contudo, a severidade do déficit hídrico está

intimamente relacionada à taxa de progressão do déficit, sendo que, quanto

mais rápida menor a habilidade da planta para se aclimatar à seca (DaMatta e

Ramalho, 2006). Sendo assim, os resultados podem indicar que naquelas

plantas em que o déficit hídrico progrediu mais lentamente, pode ter ocorrido

aclimatação ao déficit hídrico e, portanto, os efeitos deletérios da seca podem

ter sido minimizados, como, por exemplo, menor dano oxidativo, permitindo a

maior manutenção parcial das taxas fotossintéticas.

Medidas instantâneas de trocas gasosas podem não refletir o

desempenho da planta ao longo do tempo e, portanto, devem ser consideradas

com cautela. Por outro lado, δ

C na massa seca foliar pode ser tomada como

um indicador sensível da capacidade fotossintética e do comportamento

estomático integrados no tempo e, usualmente, é usada para expressar a E

(Farquhar et al., 1982). Conforme evidenciado pelos valores de δ

C , o déficit

hídrico promoveu um aumento na δ

C em todas as plantas, indicando que

houve um aumento de E

, reflexo de uma redução proporcionalmente maior em

que em A. Maiores valores de δ

C foram associados com maior tolerância

à seca, pois o pé- franco 120 e auto-enxertia 120/120 apresentaram maior

C que o clone 109 e auto-enxertia 109/109. Nas plantas tolerantes, os

maiores valores de δ

C, associados a maior E

, podem ter resultado do

controle mais eficiente de g

, acompanhada por uma redução menos

pronunciada em A, quando comparados aos das plantas sensíveis ao déficit

hídrico. Pinheiro et al. (2005) também evidenciaram que maior δ

C foi

verificado no clone 120, em relação ao clone 109, tanto em condições irrigadas

quanto de déficit hídrico. Em condições de déficit hídrico no campo, DaMatta et

al. (2003) verificaram que o clone 120 apresentou uma maior E

associada a

uma menor discriminação isotópica do carbono. Os maiores valores de δ

verificados na enxertia 109/120 em relação 109/109 e 109 sugerem que há uma

contribuição do porta-enxerto 120 em aumentar a E

das folhas do clone 109,

via maior fechamento estomático das folhas do clone 109, acompanhado de

redução menos pronunciada em A. A partir destes resultados, pode-se inferir

que algum sinal produzido nas raízes do clone 120 estaria promovendo redução

em g

. Já no caso da enxertia 120/109, os maiores valores de δ

C em relação

109/109 e 109, indicam que a parte aérea do 120 possui mecanismos que,

independentemente do sistema radicular, seriam capazes de controlar, de

alguma forma, g

e A.

O controle de g

, em condições de déficit hídrico, tem sido atribuído

principalmente ao ABA (Zhang e Davies 1991; Borel et al., 2001). Entretanto,

apesar de ter ocorrido um aumento da concentração de ABA foliar sob ψ

= –

1,0 e -1,5 MPa, que foi maior, principalmente, nas plantas 120/120, 109/120 do

que nas plantas 109/109, não se observou uma associação clara entre

alterações nas concentrações de ABA foliar e em g

. Uma possível explicação

para a ausência de associação entre os aumentos em ABA na folha e redução

em g

poderia ser a existência de uma sinalização hidráulica que poderia

parcialmente controlar os movimentos dos estômatos, pois o café é uma

espécie anisoídrica, caracterizada por um mecanismo de retroinibição da

abertura estomática (Tardieu e Simmonneau, 1998). O fechamento estomático

induzido pelo sinal hidráulico pode ocorrer em paralelo ou até mesmo

desencadear uma redistribuição de ABA entre as células do mesofilo e do

apoplasto. Esse sinal hidráulico está associado a uma mudança na tensão do

xilema em plantas sob déficit hídrico, e pode modificar a sensibilidade ao ABA

(Tardieu e Davies, 1992; Comstock, 2002) ou reduzir o crescimento dos brotos

(Saab e Sharp, 1990) ou as trocas gasosas (Davies et al., 1991; Tardieu e

Davies et al., 1992). Desta forma, as plantas poderiam responder a pequenas

alterações no status hídrico do solo sem a necessidade de síntese adicional de

ABA (Taiz e Zeiger, 2002). Ainda, durante as fases iniciais do déficit hídrico, o

aumento do pH apoplástico, pode funcionar como um sinal das raízes

promovendo o controle da resposta estomática ao ABA, quando ainda não

ocorrem alterações detectáveis na concentração de ABA no xilema (Wilkinson e

Davies, 1997; Wilkinson et al., 1998, Netting, 2000). Alternativamente, outras

alterações também podem afetar a abertura estomática, como a redução na

concentração de hormônios como citocininas (Badenoch-Jones et al. 1996) ou

auxinas (Dunleavy e Ladley, 1995), nas concentrações iônicas (Ridolfi et al.

1996) ou na sensibilidade estomática ao ABA (Blatt, 2000; Hetherington, 2001;

Schroeder et al., 2001; Fan et al., 2004; Bray 2002; Davies et al., 2002; Prokic

et al., 2006;).

A maior concentração de ABA foliar nas plantas 120/120, 109/120, sob

= – 1,0 e -1,5 MPa, sugere também que o ABA poderia estar sendo

translocado do sistema radicular das raízes do clone 120 para a parte aérea,

uma vez que as raízes deste clone possuem mais ABA na raiz do que as

plantas que possuem o sistema radicular 109. A influência da raiz em aumentar

o teor de ABA da parte aérea foi verificada também em experimentos de

enxertia recíproca em girassol e tomate (Fambrini et al., 1995; Holbrook et al.,

2002).

Em condições de déficit hídrico severo, não houve diferenças quanto aos

teores de ABA foliar entre as plantas tolerantes e sensíveis ao déficit hídrico, o

que pode ser atribuído, especulativamente, ao fato de que o déficit hídrico pode

induzir também o catabolismo do ABA e quando a taxa de biossíntese é

equivalente à taxa catabólica, a concentração de ABA pode ser

aproximadamente constante, considerando-se que já não esteja mais havendo

importação ou exportação de ou para, outras partes da planta (Ren et al.,

2006).

O ABA pode exercer efeito positivo no crescimento as raízes, mesmo em

condições adequadas de irrigação, portanto, as maiores concentrações de ABA

nas raízes oriundas do clone 120 (tolerante) podem contribuir para maior

comprimento dessas raízes. Em plantas de milho, o comprimento da raiz é

maior nas plantas selvagens (com níveis normais de ABA) do que nas plantas

mutantes deficientes em ABA, mesmo quando o suprimento de água é

abundante (Saab et al., 1990; Spollen et al., 2000). Efeito semelhante também

tem sido observado para outras plantas (Sharp et al., 2004).

2- Efeito da enxertia e do déficit hídrico nas concentrações de

carboidratos, aminoácidos e prolina

Presume-se que a enxertia não alterou a alocação do carbono fixado

para a síntese de compostos de reserva, utilização metabólica e síntese de

compostos translocados, pois a enxertia não alterou as concentrações foliares

de glicose, frutose, sacarose, amido, aminoácidos e prolina. O aumento da

concentração de hexoses, principalmente glicose, foi mais evidente nas plantas

que possuíam a parte aérea do clone mais sensível, mas não foi possível

observar uma associação entre maior acúmulo de hexoses e maior redução da

fotossíntese. Alguns autores têm proposto que o acúmulo de hexoses sob

déficit hídrico pode ser uma das causas da redução da fotossíntese (Paul e

Driscoll, 1997), fato também não observado em café por Praxedes et al. (2006).

A provável redução da força-dreno e a redução das taxas fotossintéticas das

plantas submetidas ao déficit hídrico foram acompanhadas por redução nas

concentrações de sacarose e amido de modo semelhante entre as plantas. Este

resultado não concorda com maiores reduções no teor de sacarose observadas

para o clone 109 por Praxedes et al. (2006) e Ronchi et al. (2005), e aumento

na concentração de sacarose, sob ψ

= –3 MPa (Praxedes et al., 2006).

Entretanto, a razão amido:sacarose foi reduzida somente nas plantas 120,

120/120, 109/120 e 120/109, o que pode ter sido devido a uma tendência

observada de menores reduções no teor de sacarose nessas plantas. Por outro

lado, a redução na concentração de amido é uma resposta bem caracterizada

em plantas de café, tanto sob estresse hídrico moderado quanto severo

(DaMatta et al., 1997; Ronchi et al., 2005; Praxedes et al., 2006).

Tem sido proposto que o acúmulo de hexoses, aminoácidos e prolina

pode contribuir para ajustamento osmótico, evitando maiores danos celulares

associados à desidratação celular (Valliyodan e Nguyen, 2006). Entretanto,

neste trabalho, o acúmulo de hexoses, aminoácidos e prolina, sob déficit

hídrico, ocorreu em maiores proporções nas plantas sensíveis ao déficit hídrico

(onde ocorreram maiores danos celulares) do que nas plantas tolerantes

(menores danos celulares). Portanto, o acúmulo de prolina não foi associado a

maior tolerância à seca, conforme observado em outras cultivares de café

arábica e robusta (Vasudeva, 1981; Maestri et al., 1995). Em alguns casos, a

síntese de tais compostos sob déficit hídrico parece ser um indicador sensível

do status hídrico foliar (Maestri et al., 1995) e pode estar associada à injúria

causada pela seca (Mazzafera e Teixeira, 1989). Neste caso, o acúmulo de

prolina e aminoácidos pode ser mais uma conseqüência do déficit hídrico do

que um mecanismo fisiológico, como ajustamento osmótico, envolvido nas

respostas adaptativas ao déficit hídrico (Serraj e Sinclair, 2002).

3- Efeito da enxertia e do déficit hídrico no estresse oxidativo

Nenhuma combinação de enxertia apresentou respostas diferentes

quanto aos parâmetros fotoquímicos e não foi possível fazer uma associação

entre tolerância ao déficit hídrico e as respostas fotoquímicas. Conforme

mostrado em outros trabalhos (DaMatta et al., 2002a; Lima et al., 2002; Pinheiro

et al., 2004), a eficiência fotoquímica máxima do FSII (avaliada pela razão

) foi estável sob condições de seca, sugerindo que não houve danos

fotoinibitórios. A redução em A não foi acompanhada por aumento em NPQ, e

assim não ocorreu alteração na dissipação térmica induzida pela seca. Sob

déficit hídrico, houve um aumento da “pressão de excitação" no PSII (conforme

indicado por redução em q

) o que significa que uma fração do

centro de

reação do PSII se encontrava em estado "fechado" durante a exposição à

irradiância actinica, causando um decréscimo em ø

PSII

, (Maxwell e Johnson,

2000). As reduções em ø

PSII

paralelas a Fv/Fm inalterado estão provavelmente

associados com a inibição do PSII durante a fotossíntese. Tal redução poderia

representar uma capacidade de fotoproteção das plantas, que, em condições

de déficit hídrico, ajustariam a taxa de transporte de elétrons à taxa de consumo

de poder redutor (Ronchi et al., 2005; Praxedes et al., 2006). A fração da

energia absorvida não utilizada na fase fotoquímica nem dissipada

termicamente aumentou em condições de estresse. Essa fração de energia

pode reduzir o oxigênio molecular, levando à formação de espécies reativas de

oxigênio (ERO).

O extravasamento de eletrólitos a ψ

= -1,5 MPa parece ter sido

associado a características do genótipo da parte aérea, uma vez que o

extravasamento de eletrólitos aumentou nas folhas das plantas 109, 109/109 e

109/120 e não aumentou nas folhas das plantas 120, 120/120 e 120/109.

Entretanto, em geral, as atividades das enzimas APX, SOD e CAT, sob

condições de déficit hídrico moderado, não diferiram entre os tratamentos, e

somente a atividade da CAT aumentou naquelas condições. Portanto, desde

que a CAT é localizada principalmente nos peroxissomos, o aumento da

atividade da CAT pode ser um indício de aumento da fotorrespiração (Willekens

et al., 1997).

Sob déficit hídrico severo, aumento do extravasamento de eletrólitos

ocorrido em todas as plantas foi acompanhado por um acréscimo na atividade

de todas as enzimas analisadas, porém tanto o extravasamento quanto as

atividades da CAT e APX foram mais intensos nas plantas sensíveis 109 e

109/109, conforme observado por Lima et al. (2002). Os resultados obtidos para

as atividades da SOD e APX, mas não para CAT, estão de acordo com Pinheiro

et al. (2004). Tais diferenças podem estar associadas às diferenças nas

condições fisiológicas da planta e na integração de diferentes estímulos

ambientais e de desenvolvimento (Reddy et al., 2004).

Sob déficit severo, foi possível verificar que há uma contribuição do

sistema radicular do clone 120 em reduzir o estresse oxidativo em folhas, pois

nas plantas 109/120, o extravasamento de eletrólitos e a atividade da CAT

foram menores do que nas plantas 109 e 109/109. Os dados também sugerem

que há uma contribuição da parte aérea do clone 120 na redução do estresse

oxidativo, pois o extravasamento de eletrólitos e as atividades da APX e CAT

foram menores nas plantas 120/109 do que nas plantas 109 e 109/109.

De modo geral, o clone 120 apresentou uma maior tolerância ao estresse

oxidativo, pois uma adaptação do sistema anti-oxidativo parece ter contribuído

para minimizar danos oxidativos como aquele que acompanha o

extravasamento de eletrólitos. Em contrapartida, o clone 109 foi menos

tolerante ao estresse oxidativo, visto que as alterações nas atividades das

enzimas não foram suficientes para controlar os danos celulares. O efeito do

porta-enxerto 120 em retardar o estresse, possivelmente contribuiu para que

adaptações do mecanismo anti-oxidativo diminuísse também os efeitos

oxidativos na parte aérea. Um possível mecanismo para explicar este efeito

envolveria a maior concentração de ABA nas raízes e folhas (estresse hídrico

moderado) do clone tolerante. Aumentos nas concentrações de ABA

aumentam significativamente a concentração de H

na folha, o qual é um

conhecido indutor da expressão de várias enzimas antioxidativas (Kwak et al.,

2003; Hu et al., 2006; Zhang et al., 2006), e sob déficit hídrico o ABA induz a

expressão de genes que codificam várias enzimas antioxidantes (Guan et al.,

2000; Jiang e Zhang, 2001; 2002a, 2002b, 2003; Hu et al., 2005).

CONCLUSÕES

A utilização da enxertia recíproca entre dois genótipos contrastantes quanto à

tolerância ao déficit hídrico permitiu observar que há uma contribuição do

sistema radicular do clone 120 em retardar o déficit hídrico na parte aérea 109.

Foi possível observar também que, assim como o sistema radicular, a parte

aérea do clone 120 também contribui para a tolerância à seca, pois a utilização

do porta-enxerto sensível não tornou a parte aérea 120 tão sensível à seca

quanto o clone 109. A parte aérea e o sistema radicular do clone 120 são

capazes de, principalmente, influenciar a condutância estomática, a

concentração de ABA foliar e minimizar danos oxidativos nas folhas. A

capacidade do porta-enxerto 120 em retardar o início de déficits foliares severos

ocorreu simultaneamente com um fechamento estomático mais precoce e uma

maior razão de composição isotópica do carbono, salientando a importância do

comportamento estomático para a tolerância a seca em café. Embora não tenha

sido possível observar uma associação entre maiores concentrações de ABA e

menor g

, foi possível verificar que o clone 120 e as enxertias em que o clone

120 era utilizado como porta-enxerto apresentaram maior concentração de ABA

nas folhas e raízes, sob déficit hídrico moderado e severo, respectivamente.

Estes resultados sugerem que o ABA pode estar envolvido nos mecanismos de

tolerância ao déficit hídrico e que há a possibilidade de ocorrência de outros

sinais que influenciam g

, como a mudança no pH ou alterações na

condutividade hidráulica do xilema. Assim, o clone tolerante produz um sinal

radicular que é acompanhado por um retardo da desidratação celular e um

menor estresse oxidativo nas folhas sob déficit hídrico, permitindo melhor

adaptação das folhas, o que pode ser deduzido pela maior taxa de fotossíntese

líquida sob déficit hídrico severo. Em suma, estes dados indicam a perspectiva

de utilização de porta-enxertos de clones tolerantes para aumentar a tolerância

à seca de genótipos mais sensíveis. As pesquisas devem continuar sendo

realizadas estendendo a análise deste efeito a outros genótipos de forma a

verificar a existência de especificidade da interação entre diferentes porta-

enxertos e enxertos. Essas avaliações devem ser realizadas a campo em

diferentes condições climatológicas de cultivo e sob diferentes intensidades de

déficit hídrico natural. Dessa maneira, tornar-se-á possível verificar a

variabilidade dos diferentes mecanismos fisiológicos da tolerância à seca. Isso

é importante, para que, em um programa de melhoramento, tais avaliações

fisiológicas possam tem importante valor na seleção genética e na seleção de

combinações de enxertia que sejam efetivas em melhorar a tolerância à seca

no cafeeiro.

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