( PDF ) Caracterização fenotipica do vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) contendo duplicações no dominio tardio P(T/S)APP de p6Gag

Download PDF

ads:

Angélica Nascimento Martins

Caracterização Fenotípica do Vírus da

Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-1)

Contendo Duplicações no Domínio Tardio

P(T/S)APP de p6

Dissertação de Mestrado apresentado ao

Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de

Góes, Universidade Federal do Rio de

Janeiro.

Orientador: Rodrigo de Moraes Brindeiro

Co-orientador: Pedro Paulo Xavier Elsas

RIO DE JANEIRO

2007

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

_________________________ Ficha Catalográfica

MARTINS, Angélica Nascimento

Caracterização fenotípica do vírus da imunodeficiência humana do tipo 1

(HIV-1) contendo duplicações no domínio tardio P(T/S)APP de p6

Gag

. Rio de

Janeiro, 2007.

, 80f

Dissertação de Mestrado. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de

Microbiologia Prof. Paulo de Góes. Programa de Pós-Graduação em

Microbiologia e Imunologia.

1. HIV-1

2. p6

Gag

3. PTAPP

4. Fenotipagem

I. Brindeiro, Rodrigo de Moraes

II. Universidade Federal do Rio de Janeiro – Instituto de Microbiologia Prof.

Paulo de Góes

III. Caracterização do vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1)

contendo duplicações no domínio tardio PT/SAPP de p6

Gag

ads:

iii

Trabalho realizado no Laboratório de Virologia Molecular Animal do

Departamento de Genética, Instituto de Biologia, sob a orientação do Prof. Rodrigo

de Moraes Brindeiro e co-orientação do Prof. Pedro Paulo Xavier Elsas.

____________________________ Agradecimentos.

Agradeço à todos os amigos do laboratório!!!!.... Cel, Moniquinha, Dadá, Rapha,

Alex, Dê, Helena, Cecília, e muuuito a Paty q não tá mais no lab, mas sempre será do labs tb!!!

Especialmente ao chefinho Rodrigo!!!, por me aturar esses anos todos e todos os

próximos que virão também rsrsrsrs.

Agradeço muito ao grande mestre Amilcar.

Às amigas do Fundão: Rachel Regina e Pheebs.

À querida mami por tudo, sempre. E meus amadíssimos e queridíssimos avós!!

E por último...aos meus gatinhos liiindos, filhos queridos, meus felinos.

“Semeia um pensamento e colherás um desejo; semeia um desejo e colherás a acção; semeia a

acção e colherás um hábito; semeia o hábito e colherás o carácter.

(Tihamer Toth)”

___________________________________ Resumo

A proteína p6 derivada de Gag (Pr55

Gag

) possui 53 aminoácidos e é responsável

pelo brotamento viral, principalmente através do domínio conservado (“late domain”, motivo

P(T/S)APP). Foi observada em alguns isolados de HIV-1 do subtipo B, através da genotipagem

do gene gag, a existência de duplicações do domínio tardio da proteína p6, ou motivo

P(T/S)APP. Uma vez que este domínio é fundamental para o brotamento viral, é preciso

conhecer o papel destas duplicações na contribuição para a resistência viral aos inibidores da

protease (IP).

Clones plasmidiais contendo o cDNA do genoma completo do HIV-1 (subtipo

B, cepa HXB-2, vetor pR7gfp∆nef de 15Kb) foram mutados, para inserção de sítios de

restrição BstEII, flanqueando a região codificante de p6, ou a região codificante da protease, ou

ambas as regiões codificantes da p6 e da protease. A digestão destes clones, seguida de

religação com DNA ligase, nos permitiu reconstruir o genoma em cDNA do HIV-1 com

deleções nas ORF de p6

, PR e p6

+PR, gerando os vetores pR7Ugag, pR7Upro e

pR7Ugagpro, respectivamente.

Estes plasmídeos são co-transfectados em células MT-4 junto com os produtos

da amplificação gênica de p6

ins

(p6

ins

: +APP, +PTAPSRL/PE e +SFRPTAPPAE), ou PR

mut

(Protease mutante), ou p6

ins

+PR

mut

dos isolados de pacientes contendo 3 diferentes tipos de

duplicações do domínio P(T/S)APP, um total de 4 isolados do subtipo B, além do controle sem

duplicação e sem mutações (cepa viral NL4-3). Alguns isolados carregam mutações de

resistência a diferentes IP (PR

mut

). Os vírus recombinantes gerados, contendo estas regiões

quiméricas são titulados calculando-se o CCID

, e submetidos a ensaios in vitro (cultura de

MT-4) de fenotipagem viral contra os IP disponíveis no laboratório, em comparação com

controle susceptíveis aos IP.

Foram fenotipados os vírus quimeras gerados a partir dos isolados virais. Os

resultados demonstraram que a duplicação do domínio na presença de uma PR susceptível aos

IP, não influenciou na resistência aos IP (Amprenavir (APV), Indinavir (IDV), Lopinavir

(LPV), Saquinavir (SQV), Ritonavir (RTV) e Nelfinavir (NFV)). Por outro lado, quando a

duplicação estava presente em conjunto com uma PR mutante, o nível de resistência a todos os

IP testados diminuia consideravelmente. Estudos adicionais são necessários para avaliação da

contribuição para a resistência aos antiretrovirais (ARV), mediada por polimorfismos fora dos

genes alvo da terapia, tais como a influência dos mesmos na clínica do paciente.

vii

_________________________________ Abstract

The p6 protein derived from the precursor P55

Gag

has 53 amino acids and plays a

critical role on the release of HIV-1 particles through its highly conserved late domain motif (L

domain: P(T/S)APP). Interestingly, some different patterns of duplications of this P(T/S)APP L

domain can be observed in some isolates of HIV-1 from B subtype, through genotyping assay

of gag gene, mainly in isolates carrying drug-resistance mutations in the protease gene. As this

domain is crucial for viral release, it is necessary to understand the effect of these duplications

on resistance to drugs that inhibit the viral protease (PI).

Site-directed mutagenesis were introduced into plasmidial infectious clone

pR7gfp∆nef (derived from the HXB2 isolate, subtype B) in order to introduce 2 sites for the

restriction enzyme BstEII, either flanking the p6

Gag

coding sequence, or flanking the protease

coding sequence, and a third clone with BstEII sites flanking both the p6

Gag

and protease coding

sequences. The digestion of these mutated clones followed by religation, allowed us to

reconstruct HIV-1 cDNA genomes lacking the ORF of p6

Gag

, PR and p6

Gag

+PR (and creating

the vectors pR7Ugag, pR7Upro and pR7Ugagpro, respectively).

Those vectors are co-transfected into MT-4 cells together with the respective

amplification products of p6

ins

(p6

ins

: +APP, +PTAPSRL/PE and +SFRPTAPPAE), PR

mut

(Protease with resistance genotype) and p6

ins

+PR

mut

from viral isolates of 4 different patients

carrying 3 different P(T/S)APP duplications together with protease mutations conferring

resistance to different PI (PR

mut

). The chimerical viruses generated were submitted to in vitro

phenotyping assay against PIs available in our laboratory. Our results showed that PTAPP

duplication in the presence of susceptible PR did not have any influence in the PI resistance to

APV, IDV, LPV, SQV, RTV and NFV. On the other hand when the PTAPP duplications were

present in the context of a resistant PR, the Fold Resistance was decreased. More studies are

needed to evaluate the contribution for resistance profile mediated by polymorphisms outside

the genes targeted by the antiretroviral therapy, as well as this influence to the treatment of the

HIV positive patients.

viii

________________________________ Abreviaturas.

-A Base nitrogenada adenina

-ABC Abacavir

-AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

-AIP1 Proteína que interage com aquitina 1

-ALV Vírus da leucemia aviária

-ARV Anti-retroviral

-APV Amprenavir

-AZT Zidovudina

-CA Capsídeo

-cDNA DNA complementar

-CDC Centro de Controle e Prevenção de Doenças Infecciosas dos Estados

Unidos da América

-Cél. Células

-C Base nitrogenada citocina

-CHMP4 Proteína modificadora de cromatina 4

-CPE Efeito Citopático

-CR Capacidade Replicativa

-CTL Linfócito do tipo T citotóxico

-ddC Zalcitabina

-DDI Didanosina

-D4T Stavudina

-DNA Ácido desoxiribonucleico

-dATP Desoxiadenosina trifosfato

-DLV Delavirdina

-dNTP Desoxiribonucleotídeos trifosfatados

-EFV Efavirenz

-ESCRT “Endossomal Sorting Complex Required for Transport”

-EUA Estados Unidos da América

-FDA “Food and Drug Administration”

-FR “Fold Resistance”

-G Base nitrogenada guanina

-gp41 Glicoproteína de 41kDa

-gp120 Glicoproteína de 120kDa

-HAART “Hight Active Antiretroviral Terapy”

-HIV Vírus da Imunodeficiência Humana

-HTLV Vírus Linfotrópico Humano de células T

-IP Inibidor da Protease

-IDV Indinavir

-INTR Inibidor Nucleosídico da Transcriptase Reversa

-INNTR Inibidor Não-Nucleosídico da Transcriptase Reversa

-kb 1000 bases

-kDa QuiloDaltons

-Log Logaritmo de base 10

-LPV Lopinavir

-LTR Repetições terminais longas

-M Molar (concentração em mol/L)

-MA Matriz

-mL mililitro

-mM Milimolar

-MOI “Multiplicity of Infection”

-MPMV Vírus de macaco Mason-Pfizer

-mRNA RNA mensageiro

-MuLV Vírus da leucemia murina

-MVB “Multivesicular bodies”

-NC Proteína do núcleocapsídeo

-NFV Nelfinavir

-ng Nanograma

-NVP Nevirapina

-ORF Fases abertas de leitura

-p6

ins

Proteína p6

Gag

contendo inserção

-PCR Reação em cadeia da polimerase

-pb pares de bases

-p6

Gag

proteína de 6 kDa sintetizada a partir do poliprecurssor Pr55kDa

-p6

Pol

proteína sintetizada a partir do poliprecurssor Pr160kDa

-PRO Protease

-PR

mut

Protease com genótipo de resistência

-RT-PCR Reação de Transcrição Reversa

-RTV Ritonavir

-RNA Ácido Ribonucleico

-rpm rotação por minuto

-TR Enzima transcriptase reversa

-SQV Saquinavir

-SIV Vírus da Imunodeficiência Símia

-SIV

agm

SIV de macaco verde africano

- SIV

cpz

SIV de chimpanzés

- SIV

smn

SIV de sooty mangabey

-Taq pol DNA polimerase I termoestável de Thermus aquaticus

-TFP “Transframe protein”

-T CD4 Células linfocitárias CD4 positivas

-T CD8 Células linfocitárias CD8 positivas

-TCR Receptor de células T

-3TC Lamivudina

____________________________________Sumário

CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA

TIPO 1 (HIV-1) CONTENDO DUPLICAÇÕES NO DOMÍNIO TARDIO P(T/S)APP DE

GAG

._______________________________________________________________ I

FICHA CATALOGRÁFICA _____________________________________________ II

AGRADECIMENTOS _________________________________________________IV

RESUMO__________________________________________________________VI

ABSTRACT________________________________________________________ VII

ABREVIATURAS. ___________________________________________________VIII

SUMÁRIO __________________________________________________________XI

1. INTRODUÇÃO_____________________________________________________ 1

1.1. A origem do HIV. ___________________________________________________________________1

1.2. A epidemiologia da doença. ______________________________________________________________2

1. 3. O HIV-1 e seu ciclo replicativo.___________________________________________________________5

1.3.1. Estrutura da partícula viral. ____________________________________________________________5

1.3.2. Organização genômica. _______________________________________________________________ 6

1.3.3. Replicação._________________________________________________________________________8

1.3.4. O brotamento viral. __________________________________________________________________9

1.4. A p6

Gag

e o domínio P(T/S)APP.__________________________________________________________10

1.5. História natural da infecção pelo HIV-1.___________________________________________________14

1.6. A terapia antiretroviral._________________________________________________________________16

1.7. Resistência às drogas anti-retrovirais______________________________________________________17

1.8. Processamento de Gag e Gag-Pol pela PR e resistência aos ARV._______________________________21

2. OBJETIVO. ______________________________________________________ 25

3. MATERIAIS E MÉTODOS. __________________________________________ 26

3.1. Obtenção das amostras. _________________________________________________________________26

3.2. Preparo das amostras. __________________________________________________________________27

3.2.1. Extração do RNA viral. ______________________________________________________________ 27

3.2.2. Obtenção de cDNA._________________________________________________________________28

3.3. Construção dos vetores para geração de vírus recombinantes. _________________________________28

3.3.1. O vetor ___________________________________________________________________________28

3.3.2. Mutagênese sítio-dirigida. ____________________________________________________________28

3.3.3. Transformação em células competentes Stbl2

. ___________________________________________29

xii

3.3.4. Seleção dos clones mutantes. __________________________________________________________ 29

3.3.5. Sequenciamento automático e edição. ___________________________________________________ 30

3.3.6. Deleção para obtenção dos 3 vetores de recombinação. ______________________________________31

3.4. Geração de vírus não recombinantes e recombinantes. _______________________________________32

3.4.1. Amplificação dos genes da p6

ins

, PR

mut

e p6

ins

+PR

mut

. _______________________________________32

3.4.2. Linearização dos vetores deletados. _____________________________________________________33

3.4.3. Precipitação do DNA para co-transfecção.________________________________________________33

3.4.4. Co-transfecção em cultura de células MT-4. ______________________________________________33

3.4.5. Titulação dos Estoques Virais__________________________________________________________34

3.5. Fenotipagem dos vírus com e sem duplicações no domínio PTAPP/ com e sem protease respectiva

(mutada). ________________________________________________________________________________35

4. RESULTADOS.___________________________________________________ 37

4.1. Vetores para a geração de vírus recombinantes. ____________________________________________37

4.2. Geração de vírus recombinantes por co-transfecção contendo p6

ins

, PR

mut

ou p6

ins

+PR

mut

e seus

respectivos controles selvagens. ______________________________________________________________41

4.3. Titulação dos estoques virais contendo p6

ins

, PR

mut

ou p6

ins

+PR

mut

e seus respectivos controles selvagens.

_________________________________________________________________________________________41

4.4. Sequenciamento dos vírus recombinantes gerados ___________________________________________ 41

4.5. Fenotipagem.__________________________________________________________________________43

5. DISCUSSÃO._____________________________________________________ 48

6. CONCLUSÕES.___________________________________________________ 51

7. BIBLIOGRAFIA. __________________________________________________ 52

______________________________ 1. Introdução.

1.1. A origem do HIV.

Em 1981 surgiu uma nova doença que causava uma síndrome de imunodeficiência

adquirida em adultos (SIDA, em inglês AIDS) iniciando o caminho para a descoberta de

um novo retrovírus humano (Centers for Disease Control, 1982; Gottlieb et al., 1981). Os

sintomas comuns entre os pacientes que apresentavam esta síndrome eram anormalidades

imunológicas, desordens neurológicas, desenvolvimento de tumores atípicos,

normalmente seguidos por infecções oportunistas. Dois anos após a descoberta da doença

no Instituto Pasteur, Barré-Sinoussi e colaboradores isolaram de linfonodos de pacientes

apresentando linfoadenopatia um novo retrovírus, sendo então primeiramente chamado

de Vírus Associado à Linfoadenopatia, ou LAV (Barré-Sinoussi et al., 1983; Wain-

Hebson et al., 1991).

Nesta mesma época foram isolados alguns vírus em primatas que causavam uma

patologia similar à AIDS e possuíam uma grande homologia de suas sequências com as

dos HIV-1 e HIV-2, sendo denominado SIV (do inglês simian immunodeficiency virus)

(Daniel et al., 1985; Coffin et al., 1986).

Para provar a origem do HIV foram feitas análises filogenéticas do gene conservado

pol para relacionar os lentivírus de humanos, primatas e de não primatas. Foi visto que o

HIV do tipo 1 estava evolutivamente mais próximo do SIV

cpz

(Chimpanzé) e ambos eram

provenientes de um ancestral comum, o SIV

agm

(Macaco Verde Africano)

(Gao et al.,

1999). Além disso o HIV-2 apresentava maior identidade com o SIV

smn

(Sooty

Mangabey), ambos provenientes do SIV

syk

, um ancestral comum de SIV isolado de

macaco mandril. Estudos epidemiológicos da distribuição geográfica destas patologias

fortaleceram a teoria de que o SIV teria dado origem ao HIV em mais de dois eventos

distintos. Os locais na África onde prevaleciam o HIV-2 correspondiam aos mesmos

locais onde eram isolados os respectivos SIV de macacos mangabey e sykes; enquanto o

mesmo ocorria com o HIV do tipo 1 em relação aos SIVs de chimpanzés e de macacos

verdes africanos (Keele et al., 2006; Hirsh et al., 2000).

1.2. A epidemiologia da doença.

O HIV infecta pessoas de todas as idades, raças e sexos. Ainda não existe cura e nem

vacina eficaz, só tratamentos que visam prolongar ao máximo e com a melhor qualidade

possível a vida do paciente ou retardar a progressão.

A síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), é causada pelos dois vírus

HIV-1 e HIV-2, ambos pertencentes ao gênero dos lentivírus da família Retroviridae.

Análises filogenéticas das seqüências nucleotídicas dos genes env e gag de um grande

número de isolados de HIV-1 (Myers, 1994), identificaram a existência de pelo menos

nove diferentes subtipos do HIV-1, sendo classificados de A, B, C, D, F, G, H, J e K

(WHO Network for HIV Isolation and Characterization, 1994; Janssens et al., 1994),

estes subtipos genéticos formam o grupo M, ou grupo principal (do inglês “major”),

sendo relativamente eqüidistantes, com exceção do subtipo B e D que são mais próximos.

Um segundo grupo de vírus começou a ser isolado na República dos Camarões e

demonstrava ser diferente daqueles primeiros, sendo então denominado de grupo O ou

“outliers” (Nkengasong et al., 1994; Gürtler et al., 1994), sendo que menos de 10% da

população infectada de Camarões pertencia a este grupo. O grupo O também foi dividido

em 5 subtipos (A a E) devido à grande variação dentro do grupo. Por último foi descrito

um terceiro grupo classificado de N ou “non-M and non-O” (Hemelaar et al., 2006;

Simon et al., 1998).

Os subtipos genéticos do HIV-1 estão distribuídos em diferentes localizações

geográficas (Hemelaar et al., 2006; Myers et al., 1994; Louwangie et al., 1993;

Osmanov, Heyward & Esparza, 1994). O subtipo B é mais prevalente na América do

Norte, América Latina, Caribe, Europa, Japão e Austrália. O subtipo C é o mais

prevalente no mundo, presente no continente Africano, na Índia, China e sul do Brasil e é

o responsável por aproximadamente 50% da pandemia, segundo estimativas

(UNAIDS/WHO, 2002 e 2005). O subtipo F é encontrado no Brasil, Romênia e entre

outros países (Dumitrescu et al., 1994). O Brasil possui predominantemente o subtipo B

(Ministério da Saúde do Brasil, 2006).

O inicialmente chamado subtipo E foi identificado na Tailândia e República

Central Africana (Louwangie et al., 1993; Louwangie et al., 1995; Osmanov et al, 2002).

Os subtipos mais recentes descritos foram o G, encontrado na Rússia e Gabão, e o H

encontrado no Zaire e Camarões (Osmanov, Heyward & Esparza, 1995). Como

mencionado anteriormente o grupo O é encontrado na República dos Camarões, mas

também no Gabão e Guiné Equatorial. Embora a maioria destes estudos ainda sejam de

pequeno porte, no que diz respeito ao local e número de pacientes testados, eles nos dão

uma noção da distribuição geográfica destes subtipos (Esparza, Pattou & Osmanov,

2000). Existem ainda formas circulantes recombinantes (CRF) e mosaicos dos subtipos

puros.

A AIDS é sem dúvida a maior pandemia de todos os tempos, a UNAIDS publicou

uma estimativa onde aproximadamente 40.3 milhões de pessoas vivem com HIV/AIDS,

4.9 milhões de pessoas se infectaram com o HIV e 3.1 milhões de pessoas morreram por

causa da AIDS, só no ano de 2005. Na tabela 1 vê-se um resumo da distribuição

geográfica dos casos.

No Brasil até fim de 2004 tinham sido estimados 593.787 casos de pessoas entre

15 e 49 anos HIV positivas (prevalência de 0.61%), onde 15% se encontrava em estágio

avançado de AIDS.

Ao fim de 2005, 28% dos indivíduos HIV positivos encontravam-se em terapia

ARV e a prevalência entre os homens era 0.84% e entre as mulheres 0.47% (Ministério

da Saúde do Brasil, 2006).

Tabela 1. Distribuição geográfica do HIV/AIDS, segundo último boletim da UNAIDS

dezembro de 2005.

Adultos/crianças

com HIV/AIDS

Pessoas

Infectadas em

2005

Pessoas que

morreram em

2005

América do

Norte

1.2 milhões

43 000

18 000

Caribe

300 000

30 000

24 000

América Latina

1.8 milhões

200 000 66 000

Europa

Ocidental

720 000 22 000 12 000

Norte da África /

Oriente Médio

510 000 67 000

58 000

Sub-Sahara

africano

25.8 milhões 3.2 milhões 2.4 milhões

Europa Oriental/

Ásia central

1.6 milhões

270 000

62 000

Leste asiático e

Pacífico

870 000 140 000 41 000

Sul e Sudeste

asiático

7.4 milhões 990 000 480 000

Austrália e

Nova Zelândia

74 000 8 200 3 600

1. 3. O HIV-1 e seu ciclo replicativo.

1.3.1. Estrutura da partícula viral.

Os vírions foram inicialmente descritos como esféricos e após feita a

microscopia eletrônica de varredura, descobriu-se que tratava-se de uma estrutura muito

mais complexa com formato icosaédrico, medindo 110nm de diâmetro e possuindo uma

membrana fosfobilipídica externa ou envelope (Mann, Tarantola & Netter, 1992; Nermut

et al., 1993). O envelope viral é um heterodímero, composto de duas subunidades de

glicoproteínas, a gp41 (TM) que é uma proteína transmembrana ligada em sua parte N-

terminal a outra subunidade, a gp120 (SU) ou glicoproteína de superfície responsável

pela ligação ao receptor celular CD4 e ao correceptor CCR5 ou CXCR4. (Figura 1).

Na parte interna do envelope há a matriz protéica, formada de p17 (MA), na qual a

glicoproteína trans-membrana gp41 se ancora. Envolvendo o material genético há o

capsídio (CA ou p24) que possui a forma cônica disposta no vírion transversalmente,

com o diâmetro de 100nm. No interior deste capsídio encontram-se duas moléculas de

RNA fita simples de 9.2Kb, ambas com polaridade positiva cujos os terminais 5’

interagem por pontes de hidrogênio e através de proteínas como a de nucleocapsídeo (p7)

(Sakaguchi et al., 1993)

Uma molécula de RNA transportador de lisina (tRNA

lys

) se encontra associada ao

terminal 5’ de cada uma das fitas do RNA genômico, e serve como oligonucleotídeo

iniciador da síntese do DNA fita negativa, ou cDNA, pela enzima transcriptase reversa

(TR) (Weiss et al., 1992). Encontram-se também empacotadas a proteína p6, as enzimas

transcriptase reversa (TR), protease (PR) e integrase (IN). A TR é um heterodímero

composto de duas proteínas, uma com 51kDa que corresponde a própria TR e outra com

66kDa (Kohlsteaedt et al, 1993). A p66 é a p51 com mais um domínio independente de

Rnase H, enzima esta responsável pela degradação da fita de RNA enquanto a fita

negativa de DNA é sintetizada. Outras proteínas como a Vpr, Vpu e Nef são

empacotadas com o vírion também (Hill, Tachedjian & Mak, 2005; Luciw, 1996).

Nucleocapsídeo (p7)

Protease

)

Protease

)

TR (p66/p51)

RNA viral

gp41 TM

gp120 SU

Capsídeo (p24)

Matriz (p17)

Inte

rase

)

Vif

Nef e

Figura 1. A partícula viral. (Adaptado de: www.bookscole.com).

1.3.2. Organização genômica.

Quando começaram a ser analisadas as seqüências do HIV-1 (Figura 2),

descobriu-se que, ao contrário dos retrovírus padrão como ALV e MuLV, o HIV não

apresentava apenas os três genes comumente encontrados, gag, pol e env, mas seis

outros genes acessórios (vif, tat, rev, nef, vpr e vpu no HIV-1, e no lugar de vpu o HIV-2

possui vpx) que encontram-se arranjados de forma complexa entre as três fases de leitura

(ou ORF’s “open reading frame” ) que são utilizadas pelo HIV. Muitas funções já foram

descritas, menos se conhece sobre a influência no ciclo replicativo viral.

O primeiro gene localizado no terminal 5’ do HIV é o gag. As proteínas formadas

a partir de Gag são sintetizadas na forma de um precursor poliprotéico, que foi nomeado

com base na massa molecular deste polipeptídio, Pr55

Gag

e Pr160

Gag-Pol

. O mRNA para

produção destes poliprecursores não é processado, possui 9.2kb e requer Rev para ser

transportado para o citoplasma (Luciw, 1996). Durante a maturação do vírus ocorrem as

clivagens destes polipeptídios em seis proteínas de Gag no caso de Pr55

Gag

. Do sentido

N-terminal ao C-terminal da molécula, são geradas p17 (MA), p24(CA), p2, p7 (NC), p1

e p6. As proteínas de Gag participam de interações proteína-proteína, proteína-RNA e

proteína-lipídios. Durante a tradução de gag, pode ocorrer um deslizamento do

ribossomo no início da região espaçadora p1, devido à presença de uma região rica em

“A” e “U” levando à mudança na fase de leitura (“frameshift”). Assim ocorre a tradução

da proteína p6* ou p6

Pol

e a continuação da tradução sobre o códon terminador de Gag,

formando o precursor maior Pr160

Gag-Pol

. A proporção de formação de Pr160

Gag-Pol

e de

Pr55

Gag

é de 1:20 (Shehu-Xhilaga, Crowe & Mak, 2001). O precurssor de 160KDa

quando clivado proteoliticamente, gera as proteínas de Gag (MA, CA, NC e p6*) e as

proteínas de Pol. Além das outras proteínas de Gag já descritas, a p6* é indispensável

durante o processo de maturação das partículas virais (Chiu et al., 2006) atuando no

início da atividade proteolítica (Paulus et al., 1999) e é capaz de ligar a proteína

regulatória Nef (Costa et al., 2004). A p6* facilita a dimerização da PR mutante e

resistente a IP, recuperando a atividade enzimatica perdida em alguns isolados (Dautin,

Karimova & Ladant, 2003).

O gene pol é o segundo gene do HIV e codifica três enzimas virais que são

respectivamente: protease (PR, p10), transcriptase reversa (TR, p51 e p66) e integrase

(IN, p32). A Protease é a responsável pela clivagem de Gag e Gag-Pol levando a

maturação dos vírus, como mencionado antes. A TR tem o início de sua ação no

brotamento do vírus e continuação após a liberação do capsídeo viral no citoplasma

celular. Já a Integrase é a enzima que recombina o DNA viral ao DNA genômico celular

(Van Maele, 2006; Luciw, 1996).

Outro gene que é indispensável para o HIV é o env, este dá origem a duas

proteínas glicosiladas pelo Complexo de Golgi da célula hospedeira, gp120(SU) e

gp41(TM). Neste caso é traduzido um precursor de 160kDa que é clivado pela

maquinária celular. Os genes vif, vpr, vpu do HIV-1 são classificados como acessórios e

tat, rev e nef como regulatórios. (Luciw, 1996)

Figura 2. Organização genômica e das proteínas do HIV-1 modificada. (www.ncbi.nlm.nih.gov).

1.3.3. Replicação.

O ciclo replicativo do HIV-1 se inicia com a adsorção das partículas virais na

região da gp120 (SU) com o antígeno de superfície CD4, presente em linfócitos,

monócitos-macrófagos, células dendríticas e células de Langerhans (Wu &

KewalRamani, 2006). Quando ocorre esta ligação, o peptídeo de fusão da gp41 é exposto

e interage com algumas proteínas de membrana celular, fundindo com a célula

permissiva possibilitando a internalização do capsídeo. Para que haja a fusão é necessário

que a gp120 também interaja com uma segunda molécula, ou os receptores de

quimiocinas como CCR5 e CXCR4. Outros co-receptores foram descritos como via

alternativa: CCR-2b, CCR-3 e CCR-8, pois somente com a ligação à CD4, o vírus não é

capaz de entrar na célula (Garzino-Demo, Devico & Gallo, 1998; Huet et al., 1990).

Enquanto o vírus penetra, a TR volta a sintetizar o DNA viral de fita dupla.

Proteínas virais e celulares compõem um complexo carreador do DNA transportando-o

para o núcleo. Neste momento o DNA viral é integrado ao material genético celular

servindo de molde para a síntese de RNA pela RNA Pol II. As poliproteínas Gag e Gag-

Pol se associam a dímeros de RNA genômico e são endereçadas para a membrana

plasmática, formando uma estrutura elétrondensa. Em seguida ocorre o brotamento de

partículas esféricas imaturas em domíneos ricos em esfingolipídeos e colesterol resitentes

a detergentes, chamados “lipid rafts” (Wilflingseder & Stoiber, 2007; Nguyen &

Hildreth, 2000; Ono & Freed, 2001; Chasal & Gerlier, 2003). Durante o brotamento

ocorre a clivagem proteolítica de Gag e Pol, liberando os peptídios responsáveis pela

morfologia do vírion maduro. Com o arranjo destes peptídios a partícula adquire a

formato icosaédrico e já está pronta para infectar uma nova célula (Briggs et al., 2003;

Luciw, 1996).

1.3.4. O brotamento viral.

O HIV e outros retrovírus adquirem seus envelopes e perpetuam a infecção por

brotamento viral através das células produtoras de vírus. Para facilitar o brotamento, os

retrovírus se utilizam de uma via celular normalmente utilizada na geração de vesículas

que brotam em compartimentos endossomais tardios chamados MVB (ou corpos multi-

vesiculados) através do recrutamento dos fatores celulares envolvidos nesta via. Os

retrovírus conseguem redirecionar esta maquinaria celular para a membrana plasmática

ou brotar diretamente nos compartimentos MVB, quando são liberados pelas células por

exocitose. Esta segunda via de brotamento é observada em macrófagos (Nguyen et al.,

2003) e alguns tipos celulares não linfocitários (Ono & Freed, 2004). O brotamento

direto da membrana ou a saída por exocitose ocorrem em domínios celulares

especializados no contato célula-célula (Mazze & Degreve, 2006; Moritta & Sundquist,

2004; Freed & Ross, 2004).

Até o momento foram identificadas aproximadamente 25 proteínas celulares

necessárias para a formação destas vesículas e para o brotamento do HIV-1. Dentre estas

podemos destacar as proteínas de classe E, tais como AIP1 e Tsg101. A proteína viral

responsável por iniciar o recrutamento destes fatores é a p6

Gag

(Moritta & Sundquist,

2004).

1.4. A p6

Gag

e o domínio P(T/S)APP.

Enquanto as proteínas MA, CA e NC estão presentes em todos os retrovírus, a

proteína de 6 kDa sintetizada a partir da porção C-terminal de Gag é característica do

HIV-1 e de outros lentivírus de primatas. A p6

Gag

não possui uma estrutura secundária

rígida (Stys, Blaha & Strop, 1993) e é a principal proteína fosforilada nos resíduos de

Ser, Thr e Tyr presentes na partícula viral (Müller, Patschinsky & Kräusslich, 2002), mas

a relevância da fosforilação ainda não foi determinada.

A p6

Gag

possui 53 aminoácidos, e apesar da grande variabilidade, tanto em seu

tamanho quanto em sua sequência entre os diferentes subtipos do HIV-1, p6

Gag

possui

dois domínios extremamente conservados: o domínio envolvido nas etapas finais do ciclo

replicativo, ou tardias do brotamento (conhecido como “late domain”, “L domain” ou

domínio tardio, com seqüência de aminoácidos P(T/S)APP; descrito adiante) e um outro

domínio principal -o LXXLF (Kondo & Gottlinger, 1996; Lu et al., 1995)- o qual em

conjunto com o próprio domínio PTAPP é responsável pela incorporação de Vpr à

partícula(Checroune et al., 1995).

Gag

também é mono-ubiquitinado nos resíduos de Lisina, K27 e K33 (Ott et al.,

1998; Ott et al. , 2000) Acredita-se que a ubiquitinação da p6

Gag

seja importante para as

interações com as proteínas celulares envolvidas no brotamento, já que no processo

natural de formação dos MVB esta ubiquitinação serve como sinal para o carregamento

das proteínas celulares em microdomínios dos endossomas tardios (Katzmann, Babst &

Emr, 2001; Raiborg, Rusten & Stenmark, 2003). Embora algumas observações

demonstrem que a ubiquitinação de Gag seja importante para o brotamento e dependente

de PTAPP, o mecanismo preciso ainda não foi estabelecido. Entretanto não foi verificada

nenhuma ligação de PTAPP a alguma ubiquitina-ligase (Strack et al., 2000; Strack,

Calistri & Gottlinger, 2002). Por outro lado foi demonstrado que PTAPP leva a uma

redução de ubiquitinas ligadas a Gag. Este fato pode ser devido ao recrutamento das

proteínas de classe E, algumas com atividade de de-ubiquitinação (Martin-Serrano,

Perez-Caballero & Bieniasz, 2004).

A proteína p6

Gag

possui ainda três domínios de ligação a AIP1: (a) o domínio

principal LXXLF (aminoácidos 41-45), considerado como tardio também, (b) LYP

(aminoácidos 35-37) e (c) um terceiro domínio, o YPLTSL (36-41) (Strack et al., 2003;

Moritta & Sundquist, 2004). A AIP1 é uma importante proteína celular associada a

formação de MVB que faz a conexão entre ESCRT-I via Tsg101 e ESCRT-III via

CHMP4 (ESCRT, complexos associados a endossomas requeridos para transporte). Os

domínios LXXLF e LYP são extremamente conservados, sendo descritos alguns

polimorfismos nessa região associados à não-progressão para a AIDS (Holguin, Alvarez

& Soriano, 2006; Alexander et al., 2000).

Estes três domínios não são fundamentais para o brotamento viral, já que Gag é

capaz de recrutar muito mais eficientemente AIP1 com a única interação do domínio

PTAPP com Tsg101, mimetizando a atividade das proteínas humanas Hrs que recrutam

Tsg101 (Pornillos et al., 2003) (Figura 3).

Figura 3. Os domínios tardios da p6

Gag

PTAPP e LXXLF recrutando Tsg 101 e AIP1

respectivamente. Adaptado de Moritta & Freed, 2004.

Todos os retrovírus e alguns outros vírus não relacionados como rabdovírus e

filovírus possuem este domínio tardio ou “L-domain”, cuja ausência resulta em um

defeito na liberação das partículas virais. (Wills et al., 1994; Huang et al., 1995; Craven

et al., 1999). Domínios tardios foram classificados em 3 grupos P(T/S)AP, PPXY ou

YP(X)

L (Munshi et al., 2007). Muitas vezes estes domínios podem ser trocados entre si,

colocados em diferentes posições da região de Gag, ou complementar-se em trans

(Martin-Serrano & Bieniasz, 2003), sem perder suas atividades (Parent et al., 1995; Yuan

et al., 2000; Ott et al., 2005).

O domínio tardio de quatro peptídeos P(T/S)APP age em cis e está localizado na

porção C-terminal da proteína p6

Gag

(aminoácidos 7-10). Ele foi o primeiro domínio

caracterizado no HIV-1 (Gottliger et al. em 1991) e descrito logo após também em

HTLV-I (Bouamr et al., 2003), MPMV (Gottwein et al., 2003) e Ebola (Martin-Serrano

et al., 2001; Licata et al., 2003), entre outros (Morita & Sundquist, 2004).

O domínio PTAPP atua recrutando e ligando Tsg101 (“tumor susceptibility gene

101”) um componente do complexo ESCRT-I (Colgrove, 2005; Garrus et al., 2001;

Martin-Serrano et al., 2001; VerPlank et al., 2001). Esta ligação ocorre no domínio UEV

(“ubiquitin E2 variant”) da Tsg101, onde todos os resíduos da PTAPP fazem contatos

com o domínio UEV para a estabilidade da ligação, mas são os aminoácidos Ala-9 e Pro-

10 que se ligam à fenda deste domínio UEV da Tsg101 (Porniollos et al., 2002). UEV

possui estrutura tridimenssional similar à enzima ubiquitina ligase E2 e pode se ligar à

ubiquitina, porém não possui uma cisteína necessária para a atividade enzimática de

transferência de ubiquitina (Morita & Sundquist, 2004).

Tsg 101 é conhecida também como proteína 23 do carregamento de proteínas em

vesículas, ou Vps23 e sua função está no tráfego endocítico. A ligação de p6 a Tsg101

depende de PTAPP, e esta ligação é aumentada se p6 estiver ubquitinado (Garrus et al.,

2001; VerPlank et al., 2001). Sem Tsg101, as partículas virais ficam presas na membrana

plasmática sem brotamento posterior (Garrus et al., 2001; Martin-Serrano & Bieniasz,

2003). O papel da ubiquitina no brotamento viral ainda não está muito bem estabelecido,

mas sem ubiquitinas livres na célula o brotamento viral é abolido, sendo este restaurado

pela adição de ubiquitinas (Patnaik et al., 2000). O fato da Tsg 101 se ligar a ubiquitinas

é essencial para o recrutamento dos complexos ESCRT-II e ESCRT-III (Babst et al.,

2002a; Babst et al., 2002b; Stuchell et al., 2004), levando à invaginação e

estrangulamento da membrana plasmática, com conseqüente liberação das partículas

virais (no caso do HIV-1) ou de corpos vesiculares nos endossomas pré-MVB, durante o

processo natural celular (Goff et al., 2003; Ono & Freed, 2004). O HIV-1 utiliza das vias

de MVB, naturais da maquinaria celular, para liberar seu envelope viral através da

interação via o domíneo PTAPP (Figuras 4a e 4b).

Figura 4a. Esquema proposto por Von Schwedler et al., 2003, em conjunto com

micrografia do brotamento viral.

Figura 4b. Esquema proposto Moritta & Freed em 2004, para associação do HIV-1 com

membrana de células dendríticas e suas possíveis vias endossomais.

1.5. História natural da infecção pelo HIV-1.

O HIV pode ser transmitido por contato com mucosas oral, retal e vaginal durante o

ato sexual ou amamentação; por sangue através de transfusão, uso de material cirúrgico

contaminado, seringas compartilhadas no uso de drogas injetáveis ou materno-fetal

durante o parto. A evolução da infecção pode estender-se por até mais de uma década,

onde os estágios incluem infecção primária, disseminação do vírus para órgãos linfóides,

latência clínica, indução da expressão do HIV, doença clínica e morte (levando em média

dois anos a partir do início dos sintomas até a morte do paciente) (UNAIDS/WHO,

2002).

Após a infecção primária, ocorre a replicação viral e a viremia pode ser detectada por

volta da sexta semana (Figura 5). O vírus encontra-se disseminado por todo o corpo,

nesta fase os órgãos linfóides são invadidos. Neste momento inicial há uma queda

significativa de células T CD4

circulantes. Surge uma resposta imune no período de

uma semana a três meses após a infecção, a viremia cai e verifica-se uma recuperação na

contagem de células T CD4

. Células infectadas persistem nos linfonodos. Este período

de latência pode variar de meses a anos, e eventualmente o paciente passa a desenvolver

sintomas e doenças clinicamente aparentes como infecções oportunistas e neoplasias

(Macias & Ponce-de-Leon, 2005; Luciw, 1996).

Os pacientes podem evoluir para a AIDS de diferentes maneiras: o desenvolvimento

da AIDS ocorre após 6 até 10 anos de infecção (progressor típico), os pacientes que

levam de 2 a 5 anos para evoluir para AIDS (progressor rápido) que abrange cerca de

15% dos infectados, mas há ainda os indivíduos que permanecem assintomáticos por

período superior a 11 anos (progressor lento ou não progressor) representando 5 a 10%

dos infectados. As fases clínicas da doença são divididas em três: infecção aguda,

latência clínica, e AIDS (Figura 5). A AIDS é o desenvolvimento da fase sintomática da

infecção devido a uma contínua deteriorização do estado clínico e imunológico do

paciente. Com o declínio da contagem de células T CD4

e aumento da carga viral

circulante, surgem as manifestações clínicas (Gutierrez et al., 2006; Jawetz, Melnick &

Adelberg, 1998; Freed & Martin, 2001).

Figura 5. Evolução clínica típica da infecção pelo HIV-1.

Infec

ão Primária

Morte

Latência Clínica

Infecções

oportunísticas

Anos Semanas

Tem

o de Infec

ão

Cóp

RNA

HIV

(cóp

as/

élulas T

(

cél.

)

Começo dos

Sintomas

Infecção aguda ao HIV

O acompanhamento do paciente HIV-1 positivo é feito através do monitoramento

dos níveis de células T CD4

, da quantificação do RNA viral circulante e do estado

clínico do paciente. Em 1994 o CDC (“Centers for Disease Control and Prevention”).

definiu as categorias segundo os quadros clínico e imunológico (Tabela 2) do paciente

infectado pelo HIV, incluindo-se crianças menores que 13 anos (Tabela 3). Este critério é

utilizado até hoje.

Tabela 2. Classificação das categorias imunológicas pelo CDC em 1994

(www.cdc.gov).

Idade – Contagem de células TCD4/mm

de sangue Alteração

imunológica

<12 meses 1 a 5 anos 6 a 12 anos

Ausente (1)

>1500 ≥1000 ≥500

Moderada (2)

750-1499 500-999 200-499

Severa (3)

<750 <500 <200

Tabela 3. Classificação segundo CDC em 1994, da infecção pelo HIV em crianças

menores que 13 (www.cdc.gov).

Alterações clínicas Ausente (1) Moderada (2) Severa (3)

N=ausência de sinais e/ou

sintomas clínicos

N1 N2 N3

A=sinais e/ou sintomas

clínicos leves

A1 A2 A3

B=sinais e/ou sintomas

clínicos moderados

B1 B2 B3

C=sinais e/ou sintomas

clínicos graves

C1 C2 C3

1.6. A terapia antiretroviral.

Possíveis alvos de terapia foram descritos e testados, mas os principais alvos

atualmente são: a TR e a PR. A TR tem sido muito utilizada com alvo terapêutico já que

é uma enzima inexistente no nosso organismo, fato que teoricamente pode ajudar na

redução de reações cruzadas e alterações em nosso corpo, possibilitando uma ação mais

seletiva. Em 1986 foi lançada no mercado a primeira droga inibidora da replicação viral

do HIV, aprovada pelo FDA (“Food and Drug Admistration”), o AZT ou zidovudine, era

o primeiro inibidor nucleosídico da atividade da transcriptase reversa (Yarchoan et al.,

1986). Hoje em dia existem quatro classes de medicamentos anti-HIV no mercado, os

INTR-inibidores nucleosídicos da transcriptase reversa, os INNTR-inibidores não

nucleosídicos da transcriptase reversa, os IP-inibidores de protease e aprovado

recentemente o primeiro inibidor de fusão.

São 8 os INTR: zidovudina, didanosina, zalcitabina, stavudina, lamivudina, abacavir,

emtricitabina e tenofovir (este último um inibidor acíclico monofosfato, portanto análogo

nucleotídico da adenosina). Estes inibidores se ligam no sítio catalítico da enzima,

competindo com os nucleotídeos (dNTP) presentes na célula e bloqueando a atividade da

TR após sua incorporação na fita nascente de DNA (UNAIDS/WHO, 2002).

A enzima TR é um heterodímero que forma tridimensionalmente uma estrutura

terciária de “palm and finger”, possuindo uma região hidrofóbica, chamada de bolsão

alostérico (“pocket”). É nesta região que a segunda classe de drogas voltadas a inibir a

TR se ligam: os INNTR. Quando os análogos não nucleosídicos com alta afinidade por

este sítio alostérico acoplam-se, a molécula muda de conformação e fica praticamente

inativa. Esta é uma inibição não competitiva e até o momento existem três fármacos

disponíveis para uso: a nevirapina, delavirdina e efavirenz; destes apenas a delavirdina é

desaconselhada para uso pediátrico (Luciw, 1996).

A Protease viral é um dímero simétrico que consiste de duas unidades idênticas de

99 aminoácidos ligadas não covalentemente. A PR do HIV é uma aspartil protease, com

resíduos de aminoácidos aspartil conservados na região do centro ativo da enzima

(posições 25 e 25`), A inativação dessa protease pela inibição química ou por mutações

leva à produção de partículas virais imaturas e não infecciosas (Sarmati et al, 2003). A

terceira classe de inibidores é a classe mais potente, os Inibidores de Protease (IP)

mimetizam ligações peptídicas com o objetivo de encaixar-se no sítio catalítico da

enzima por competição com o substrato natural Gag (e GagPol), reduzindo a atividade

enzimática de forma quase irreversível, sendo a velocidade de ligação destes peptídeo-

miméticos à enzima muito maior que a de dissociação pela alta afinidade. Quando usados

em combinação com INTR, uma supressão viral durável é normalmente alcançada

(Gulick, 1997). São oito as drogas inibidoras de PR aprovadas: saquinavir, ritonavir,

nelfinavir, indinavir, lopinavir, amprenavir (e fos-amprenavir), atazanavir e tipranavir.

Antes de se iniciar a terapia é fundamental que alguns aspectos sejam estudados

para a eficácia do esquema terapêutico, tais como a adesão; disponibilidade do

medicamento; impacto na qualidade de vida (frequência de administração e necessidade

de ingestão com ou sem alimentos, habilidade dos responsáveis na administração de

regimes complexos de drogas-no caso de crianças em terapia); e potencial de interação

com outras drogas (Ministério da Saúde, 1999).

Existem várias combinações de drogas antiretrovirais (regimes terapêuticos),

porém a monoterapia e biterapia parecem possuir um efeito menor na inibição da

replicação viral. Por esta razão, recomenda-se atualmente que a terapia anti-HIV seja

feita com pelo menos três drogas, sendo chamada de terapia antiretroviral altamente

ativa, ou no inglês HAART. A combinação, de no mínimo três drogas, deve conter dois

INTR associados a um INNTR ou a um inibidor da protease viral. Com isto, espera-se

que a carga viral do paciente tenha uma queda de pelo menos 1,0 log em adulto e 0,5-0,7

log em crianças em um período de no máximo três meses desde o início da administração

das drogas. Caso não ocorra a queda da carga viral do paciente, este poderá estar

desenvolvendo resistência às drogas antiretrovirais, sendo este um dos maiores

obstáculos a uma supressão duradoura do HIV-1.

1.7. Resistência às drogas anti-retrovirais

O HIV possui uma alta taxa replicativa diária, com a produção aproximada de 10

bilhões de partículas virais por dia (10

). Além disso a TR, cuja taxa de erro é de

aproximadamente 2,7x10

-5

(mutação / nucleotídeo / ciclo replicativo) (Roberts, Bebenek

& Kunkel, 1988) faz com que a cada ciclo replicativo vários mutantes sejam gerados,

estaes genomas “diferentes” podem ser mais adaptadas, menos adaptadas, defeituosas, ou

simplesmente tão adaptados quanto seus ancestrais selvagens.

Eventualmente um mutante gerado pode ser mais resistente ao ambiente sobre a

pressão seletiva das drogas anti-retrovirais, e sobreviver mais facilmente à pressão

seletiva das terapias, sendo mais adaptado este mutante seria capaz de replicar em maior

quantidade, e se sobreporia sobre a população de vírus sensíveis, os selvagens. Ao longo

do tempo já não se veria a presença majoritária de vírus sensíveis –combatidos pela

terapia- em um evento clássico de falha terapêutica, que será discutido adiante (Suzuki Y,

Yamaguchi-Kabata & Gojobori, 2000). Mesmo com toda essa possibilidade do vírus de

escapar do ARV disponíveis, a terapia HAART (“Highly Active Antiretroviral Therapy“)

ainda é muito eficaz na maioria dos casos, prolongando bastante a vida do paciente (Di

Mascio et al., 2004; Arici et al., 2001; Shafer & Vuitton, 1999).

O aparecimento da resistência às drogas anti-HIV é o fator limitante para o

sucesso da terapia da AIDS. A falha terapêutica de muitos pacientes HIV-1

soropositivos, pode estar relacionada à não adesão ao tratamento e à replicação elevada

de vírus mutantes resistentes aos ARV administrados nos pacientes, sendo esta a maior

problemática na aplicação clínica dos ARV inibidores da protease e da transcriptase

reversa viral.

A resistência viral é a conseqüência direta da diversidade genética do HIV. A taxa

de erro da transcriptase reversa somada a pressão seletiva exercida pela drogas

antiretrovirais, é a causa direta da falha terapêutica em 20 a 30% dos pacientes HIV

positivos (Valle-Bahena et al., 2006; Vella & Palmisano, 2000). Além disso, a

recombinação tem um papel significativo na geração da diversidade genética do HIV

(Robertson et al., 1995).

A análise por sequenciamento dos genes pol e env presente em isolados

resistentes aos antiretrovirais, demostraram tanto na transcriptase reversa, na protease

viral quanto na gp41 a presença de determinadas posições onde determinada troca de

aminoácido levaria a redução na eficiência dos medicamentos (figura 4). Algumas destas

posições podem ocasionar a resistência a mais de um tipo de droga (Geretti, 2006; Pillay,

Taylor & Richman, 2000). O acúmulo de mutações ao longo do tempo acarreta na

coexistência de diferentes mutações em um único vírus, levando a padrões complexos de

mutações, e consequentemente, à resistência cruzada às drogas antiretrovirais.

MUTAÇÕES NO GENE DA PROTEASE ASSOCIADAS A RESISTÊNCIA AOS IPs.

INIBIDORES

DA PROTEASE

Tipo de aa selvagem -

Posição do aa ( mutação -

primária em negrito)

Aa substituto -

MUTAÇÕES

Inserção

↓

Figura 6. Mutações mais freqüentemente encontradas no gene da protease do HIV-1 que

conferem resistência às determinadas drogas, 2007 (www.iasusa.org).

As mutações de resistência descritas para a transcriptase reversa viral se

concentram em resíduos diretamente relacionados com a organização das regiões

conservadas da estrutura terciária “palm and finger” da enzima. Os INNTR se associam

próximos ao centro ativo da enzima em um bolso hidrofóbico. As mutações relacionadas

a estas drogas provocam alterações conformacionais impedindo que a droga se aloje

novamente neste bolso hidrofóbico. Já para os INTR, um dos mecanismos é o

mecanismo estrutural de resistência observado não se localiza no sítio de ligação de

dNTP, mas sim em um subdomínio dos “dedos” da estrutura “palm and finger” da

transcriptase reversa, alterando a habilidade desta em selecionar ou não os dNTP

(Erickson & Burt, 1996).

Para a protease viral, o centro ativo da enzima não é o alvo principal das

mutações de resistência (Figura 7), tendo em vista que as mutações nessa região podem

afetar a atividade da mesma. O mecanismo estrutural de resistência, aos inibidores da

protease viral observado parece influenciar a habilidade do inibidor em se ligar

efetivamente a enzima, já que estas mutações afetam os resíduos da região “flap” e os da

interface do dímero no qual consiste a enzima protease (Erickson & Burt, 1996). Na

protease viral, existem dois tipos de mutações, as primárias, que são as mutações

principais responsáveis pela resistência as drogas anti-HIV, e sozinhas já conferem altos

níveis de resistência; e as compensatórias, que estariam compensado a perda do fitness

viral com uma enzima mutante. Essas últimas quando presentes isoladamente conferem

baixa ou nenhuma resistência aos IP.

Pesquisadores através de estudos in vivo e in vitro, conseguiram estabelecer um

mapa de mutações relacionando-as com o tipo de droga que é capaz de selecioná-las e o

grau de resistência. Estes dados vêm sendo ampliados a medida que novas drogas são

disponibilizadas no mercado, e também através do resultado que os diferentes arranjos

na administração da terapia podem resultar nos padrões de mutações, acarretando em

resistência cruzada e até mesmo na reversão da resistência pela presença de

determinadas mutações (Figura 6).

Algumas destas substituições são pré-existentes como polimorfismos genéticos

naturais de certos subtipos não-B (como M36I em subtipos C e F) e aumentam a chance

do vírus evoluir mais rapidamente para o perfil de resistência com uma boa capacidade

replicativa (Shafer et al., 1999; Holguin et al., 2004).

Pesquisas para o desenvolvimento de novas drogas estão sendo realizadas

visando à formulação de antiretrovirais que sejam eficazes no combate dos vírus

mutantes, ou seja, drogas para inibir a protease e transcriptase reversa viral com seus

domínios alterados pelas mutações de resistência. Se estas drogas forem desenvolvidas

podemos esperar uma expectativa de vida melhor para o paciente HIV-1 positivo (Saliba

& Yeni, 2006).

Figura 7. Estrutura tridimencional da protease do HIV-1. Esta representada na figura um dímero da

protease. Em vermelho vemos o centro ativo da enzima. As posições marcadas representam

códons sujeitos a mutações de resistência.

1.8. Processamento de Gag e Gag-Pol pela PR e resistência aos ARV.

Mudanças genéticas em gag nas regiões codificantes de p1-p6

gag

e/ou p6

pol

localizados exatamente antes do gene da Protease, mostraram-se envolvidas na

resistência aos ARV inibidores da protease.

A região codificante do peptídeo espaçador p1, por exemplo, possui estruturas

reguladoras (ricas em A-T) da atividade de escorregamento do ribossoma sobre o códon

finalizador de Gag Pr55 (“read-through”) causando a mudança de fase de leitura (“frame-

shift”) do genoma do HIV. Esta mudança permite a expressão do precursor Gag-Pol

Pr160. Mutações nesta região podem aumentar a síntese de Pr160

Gag-Pol

consequentemente, a quantidade de enzimas PR, TR e integrase produzidas (Mendonza,

Gallego & Soriano, 2002).

Uma outra evidência de relação entre os peptídeos Gag e Gag-Pol refere-se à co-

evolução entre a protease viral e seu substrato Gag (ou Gag-Pol). Mutações encontradas

nos sítios de clivagem de Gag/Gag-Pol pela PR recuperam a queda da afinidade ao

substrato pela enzima PR com mutações de resistência aos ARV (Mammano, Petit &

Clavel, 1998; Kolli, Lastere & Schiffer, 2006) e aumentam a frequência de clivagem para

níveis normais encontrados para a PR suscetível aos ARV e estruturas canônicas de Gag

(Figura 8).

Figura 8. Representação esquemática do processamento proteolítico sequencial dos

precursores Gag (G) e Gag-Pol (GP) pela PR viral. Taxas de clivagem reportadas, onde ocorrem

a primeira clivagem dos precurssores, a segunda e terceira clivagens. Adaptado de Shehu-

Xhilaga et al. 2001.

Sequências fora da região da protease também podem modular a susceptibilidade

aos IP. Por exemplo, polimorfismos que atrasem o autoprocessamento da protease nos

vírions reduzem a capacidade replicativa destes vírus, porém esta modulação pode

também aumentar a susceptibilidade aos IP (Whitehurst et al, 2003).

Em relação ao domínio tardio P(T/S)APP na p6

Gag

, foram detectadas inserções

que duplicavam total ou parcialmente este domínio em um significativo número de vírus

isolados de pacientes altamente tratados (21%), em comparação com apenas 5% de

pacientes sem tratamento (Peters et al., 2001). Mais precisamente, isto ocorreu nos 11

aminoácidos iniciais da p6, incluindo-se aí a região do domínio PTAPP. Neste caso, a

duplicação identificada foi o primeiro polimorfismo selecionado pela pressão seletiva dos

INTR, durante a via de acúmulo de mutações de resistência, elevando os níveis de

resistência aos INTR (Peters et al., 2001). Teoricamente, a duplicação do domínio

envolvido no brotamento e empacotamento das enzimas virais (Dettenhofer & Yu, 1999),

pode melhorar o recrutamento dos fatores celulares nos domínios de membrana,

modulando o brotamento e incorporação das enzimas (Mendonza, Gallego & Soriano,

2002).

As duplicações do domínio P(T/S)APP, são encontradas em diferentes subtipos e

CRF de HIV-1, sendo mais frequentes no subtipo B; também foram encontradas

variações no tamanho da proteína p6

Gag

nestes diferentes subtipos (Holguin, Alvarez &

Soriano, 2006; Holguín, Alvarez & Soriano, 2005; Marlowe et al. 2004).

Alguns estudos acharam o mesmo percentual de inserções em indivíduos tratados

e não tratados (~15% em indivíduos tratados e não tratados) e estes estudos sugerem que

estas inserções sejam polimorfismos genéticos do HIV-1, embora possam afetar a

susceptibilidade aos ARV e ter relevância clínica (Gallego et al., 2003). De fato essas

inserções antecipam a falha terapêutica (Mendonza, Gallego & Soriano, 2002).

Peters et al., em 2001 demonstrou que duplicações parciais do domínio PTAPP (+APP),

causavam um atraso na maturação das partículas. Entretanto, estas partículas

empacotavam um excesso de TR de 34%, e possuíam uma melhor adequação (“fitness”)

viral na presença de INTR. A presença de maior número de moléculas da TR por

partícula viral (vírion), disponíveis para a transcrição reversa do RNA viral

compensariam, ainda que parcialmente, a presença de inibidores competitivos do

substrato (dNTP).

Com já descrito, em 1995, Huang e Freed demonstraram pela primeira vez in

vitro que PTAPP era necessário para o brotamento viral, em um contexto de um clone

molecular com o genoma completo do HIV-1. Esse clone continha uma protease viral

mutante e inativa. Outros pesquisadores demonstraram que defeitos no domínio PTAPP

da p6

Gag

manifesta-se no estágio tardio da montagem e liberação dos vírions exatamente

quando a protease viral está mais ativa (Kaplan, Manchester & Swanstrom, 1994).

Pouco se sabe ainda sobre o impacto destas inserções/duplicações do domínio

tardio na resistência aos IP. Apesar disto, há fortes indicações estatísticas de correlação

entre as mesmas e o aparecimento de mutações de resistência na PR: estas inserções são

mais frequentes quando mutações da PR como V82A/F/T/S estavam presentes (Lastere et

al., 2004). Ainda, outros grupos demonstraram que estas inserções restauravam a

capacidade replicativa viral que tinha sido comprometida com as mutações de resistência

aos IP (Tamiya et al., 2004).

Pode-se presumir então que vírus que carregam proteases mutadas -com menor

processividade do substrato quando comparadas à PR suscetível e na ausência de ARV-

poderiam carrear ou adquirir inserções de duplicação do motivo PTAPP. Estas

duplicações supostamente aumentam a acessibilidade da enzima mutante ao substrato

e/ou aumentam a afinidade de ligação da enzima aos sítios de clivagem por associação

com a mesma, alternativamente às mutações nos sítios de clivagem. No entanto, ainda

não há, além de inferências estatísticas ou indiretas descritas anteriormente, nenhuma

comprovação biológica do envolvimento destas duplicações com a atividade proteolítica

da PR –em especial proteases mutantes resistentes aos IP- ou com o aumento da

capacidade de empacotamento de precursores Gag/Gag-Pol durante a montagem e

brotamento viral.

_______________________________ 2. Objetivo.

O objetivo deste trabalho foi caracterizar diferentes padrões de duplicação do

domínio tardio PTAPP, sua contribuição para a resistências aos IP: Amprenavir,

Saquinavir, Ritonavir, Idinavir, Lopinavir e Nelfinavir. Estas duplicações foram

encontradas em isolados virais obtidos a partir de pacientes não tratados ou tratados com

IP, e em falha terapêutica. Alguns destes isolados clínicos, além de carregarem

duplicações genéticas em p6, possuem também proteases mutantes e resistentes a IP.

Os objetivos específicos deste trabalho foram:

- Mutagenizar o vetor viral pR7gfp , criando sítios de restrição para a enzima BstEII nas

regiões que flanqueiam os genes das proteínas p6 e PR.

- Gerar vetores virais deletados nas regiões da p6 (pR7gfpUgag), PR (pR7gfpUpro) e

p6+PR (pR7gfpUgagpro).

- Gerar vírus recombinantes contendo as seqüências de p6

ins

e/ou PR

mut

provenientes de

isolados clínicos e os controles contendo p6 e PR da cepa NL4-3.

- Avaliar a extensão da influência das duplicações de domínios PTAPP em si,

independente da presença de mutações de resistência na protease, através da análise de

fenotipagem de resistência aos IP com clones recombinantes contendo apenas

duplicações PTAPP e com proteases suscetíveis aos IP.

- Avaliar a influência das duplicações do PTAPP quando presentes em vírus com

genótipo de resistência aos IP, através de fenotipagem de clones virais recombinantes

contendo a p6 com inserção e a PR mutante.

_____________________ 3. Materiais e Métodos.

3.1. Obtenção das amostras.

Durante a execução deste trabalho, utilizamos amostras de sangue de 4 crianças,

infectadas por transmissão vertical em tratamento no Hospital Universitário da UNIRIO,

Gafrée & Guinle (3 amostras: TVGG01, TVGG05 e TVGG08) e no Hospital da Escola

Paulista de Medicina (1 amostra: TVSP02). Para o estudo foram separados o plasma e a

fração de leucócitos (“buffy coat”) por 10 minutos de centrifugação à 2500xg para o

estudo. Nestes pacientes estavam sendo administrados antiretrovirais (IP) e/ou (INTR e

INNTR). Os pacientes foram avaliados segundo o critério de falha terapêutica: aumento

da carga viral circulante ou manutenção dos níveis de partículas virais circulantes como

no início do tratamento (Segundo o Ministério da Saúde do Brasil).

Estas amostras vieram de um estudo maior realizado com amostras de crianças

em falha terapêutica e resistência genotípica e fenotípica aos ARV, infectadas por

transmissão vertical, por vírus dos subtipos B e não-B (Brindeiro et al., 2002).

Foi observado que algumas destas amostras continham duplicações no domínio

tardio PTAPP da proteína p6

Gag

(Figura 9) e surgiu a pergunta sobre que efeito estas

duplicações causariam aos vírus, em relação aos IP na presença e ausência da protease

mutante respectiva de cada isolado viral, proteases estas com diferentes níveis de

resistência aos ARV. Na figura 10 podemos observar o alinhamento das proteínas p6

Gag-

Pol

dos isolados clínicos contra cepas de vírus referência.

LQSRPEPTAP P--------E ESFRS----- -----GVETT TPPQKQEPID KELYPLTSR

TAPPE ESFR------ ----FGEETT TPSQKQEPIN KELYPLASLR SLFGSDPSSQ

TVGG01 LQSRPEPTAP SR TAPPE ESFR------ ----FGEETT TPSQKQEPID KELYPLASLR SLFGNDPSSQ

TVGG08 LQSRPEPTAP P--------A ESFRPTAPPA ESFRFGEETT TPPQKQEPID KELYPLASLR SLFGNDPSSQ

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

10 20 30 40 50 60 70

HXB2- P6 LQSRPEPTAP P--------E ESFR------ ----SGVETT TPPQKQEPID KELYPLTSLR SLFGNDPSSQ

PNL43-P6 LQSRPEPTAP P--------E ESFR------ ----FGEETT TPSQKQEPID KELYPLASLR SLFGSDPSSQ

TVSP02 LQSRPEPTAP P-----APPE ESFR------ ----FGEETT TPSQKQGQTD QELYPLASLR SLFGNDPLSQ

TVGG05 LQSRPEPTAP SR

LEP

PEP

LQSRPEPTAP P--------E ESFRS----- -----GVETT TPPQKQEPID KELYPLTSR

Figura 9. Quatro isolados clínicos representando 3 diferentes tipos de duplicação do domínio

tardio. (ORF: Pr55KDa

Gag

) Destacado em rosa, duplicação parcial do domínio PT/SAPP: +APP

(inserção de 3 aminoácidos), em amarelo duplicação +RL/PEPTAPP (inserção de 8

aminoácidos), e em verde duplicação +PTAPPAESFR (inserção de 10 aminoácidos).

10 20 30 40 50 60 70

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

HXB2- P6 SE-------- QTRANSPT-- --------RR ELQVWGRDNN SPSEAGADRQ GTVSFNFPQV TLWQRPLVTI

PNL43-P6 SE-------- QTRANSPT-- --------RR ELQVWGRDNN SLSEAGADRQ GTVSFSFPQI TLWQRPLVTI

TVGG05 SEQTRANSPE QTRANSPT-- --------RR ELQVWRGDNN SLSEAGADKQ GIVSFSFPQI TLWQRPLVTI

TVGG01 SEQTRANSPE QARANSPT-- --------RR ELQVWGGDNN SLSEAGADRQ GTVSFSFPQI TLWQRPLVTI

TVSP02 SE-------- QTRANSPT-- -----SPTRR ELSVWGRNNH SLSEAGADRP GTVSLSFPQI TLWQRPIVTI

TVGG08 SE-------- QTRANSPTSR ELQANSPTSR ELQVWGGDNN SPSEAGADRQ GTVSLSFPQI TLWQRPLVTI

Figura 10. Alinhamento da proteína p6

Gag-Pol

dos isolados clínicos com vírus referência, na

região que se sobrepõe a p6

Gag

. (ORF: Pr160KDa

Gag-Pol

) Inserções da fase aberta de leitura

Gag-Pol

Na tabela 4 constam os esquemas de terapia utilizados, estágio clínico segundo

CDC, subtipos na Protease e mutações de resistência encontradas em cada isolado de

paciente segundo Brindeiro et al 2002.

Tabela 4. Último esquema terapêutico e mutações primárias em negrito.

Identificação

da amostra

Estágio

clínico

paciente

(CDC)

Subtipo

(PR)

ARVs utilizados na terapia

Mutações de resistência na Protease

TVGG 01 C1 B RTV, AZT, 3TC, DDI K20R, L24I, M36I, I54V, L63P,

V82L

TVGG 05 B1 B INV, AZT, 3TC, DDI, D4T L24I,M46L, I54V, L63P, V77I,

V82A

TVGG 08 B3 B AZT, 3TC, D4T, DDI L63P

TVSP 02 B3 B RTV, NVP, NFV, AZT, 3TC, D4T L10I, K20R, M36I, I54V, L63P,

A71V, V82A

3.2. Preparo das amostras.

3.2.1. Extração do RNA viral.

O RNA total foi isolado a partir de 140µL de plasma do paciente com o

QIAmp Viral RNA Mini kit (QIAGEN, EUA). O HIV-1 presente no plasma do paciente,

precipita-se no fundo do tubo após a centrifugação de 2h a 14.000 rpm à 4°C. O

protocolo utilizado foi o fornecido pelo fabricante do kit. O RNA extraído foi eluído em

50µL de água ultra pura (GIBCO) e o restante do cDNA, ficou armazenado a -70°C.

3.2.2. Obtenção de cDNA.

Para a transcrição reversa, utilizou-se o kit Hight-Capacity cDNA

Archive (Applied Biosystems ). A enzima Transcriptase Reversa do vírus Moloney da

leucemia murina- MuLV TR em conjunto com oligonucleotídios iniciadores, hexâmeros

de sequência aleatória nas condições estabelecidas pelo protocolo da empresa, levaram a

síntese do DNA complementar transcrito reversamente a partir do genoma completo do

vírus, o cDNA.

3.3. Construção dos vetores para geração de vírus recombinantes.

3.3.1. O vetor

O plasmídeo utilizado contém o cDNA do genoma completo do HIV-1 subtipo

B, cepa HXB-2. O vetor pR7gfp possui 15Kb e o gene nef foi substituído nos primeiros 254

nt está inserido o gene da gfp (Page, Liegler & Feinberg, 1997).

3.3.2. Mutagênese sítio-dirigida.

Uma vez que no plasmídeo e na sequência da cepa de HIV-1 clonado não existe

sítios para a endonuclease de restrição BstEII (5`-G

↓

GTNACC-3`), foram desenhadas

sequências de oligonucleotídeos iniciadores “foward” e “reverso” contendo o sítio de BstEII.

Três pares de oligos foram desenhados com o objetivo de inserir 3 sítios: um

antes da p6

Gag

, um no início da Protease e outro no início da TR. O objetivo era criar 3

diferentes clones deletados na p6

Gag

, PR e p6

Gag

+PR. Todos os oligos utilizados nas reações

estão listados na tabela 5.

Tabela 5. Oligonucleotídeos utilizados para as reações de mutagênese sítio dirigida. Nucleotídeos em

letras minúsculas representam as bases que foram modificadas na sequência selvagem.

Nome do oligo

5' → 3'

mer

Posição

relação

ao HXB2

pR7 pro mut F GCCGATAGACAAGGAACgGTAaCCTTTAACTTCCCTCAGA 40 2220 – 2259

pR7 pro mut R TCTGAGGGAAGTTAAAGGtTACcGTTCCTTGTCTATCGGC 40 2259 – 2220

pR7 rt mut F GCCCTATTGAGACTGTACCgGTAAccTTAAAGCCAGGAATGGATG 45 2557 – 2601

pR7 rt mut R CATCCATTCCTGGCTTTAAggTTACcGGTACAGTCTCAATAGGGC 45 2601 – 2557

pR7 gag mut F GTCAGGGAGTAGGgtGACCCGGCCATAAGGC 31 1838 – 1868

pR7 gag mut R GCCTTATGGCCGGGTCacCCTACTCCCTGAC 31 1868 - 1838

As seguintes condições de reação de mutagênese sítio dirigida foram utilizadas:

100ng do plasmídeo selvagem, 12.5mM de dNTPs, 100ng de oligo, 2.5U da enzima

PfuTurbo® DNA Polimerase (Stratagene, EUA), tampão da enzima 1X e água para um

volume final de 50μL. Foram feitas 2 reações independentes, uma com o oligo foward e outra

com o oligo reverso nos 5 ciclos inicias da reação, então junta-se as duas reações em um

volume final de 100 μL e continua-se por mais 16 ciclos. Ciclagem: 95º C - 3`/(95º- 30``/55º

C- 1`/68º C- 32`)x n

de ciclos/ 68º C- 2`.

O produto desta reação foi digerido com DpnI (37ºC por 4 horas) com o bjetivo

de digerir as fitas metiladas reduzindo a trasformação de plasmídeos selvagens, sem as

mutações. Isso ocorre porque o DNA isolado da maioria das cepas de Escherichia coli é dam

metilado e portanto susceptível à digestão por DpnI (seqüência alvo: 5’-Gm6ATC-3’) 5 μL da

reação de digestão foi transformada em células competentes Stbl2

, derivada de E. coli

(Invitrogen, EUA)

3.3.3. Transformação em células competentes Stbl2

Uma alíquota de 50 μL de células competentes (MAX Efficiency® Stbl2

Invitrogen EUA) foi retirada do freezer -80ºC e colocada no gelo por 5`, o suficiente para o

descongelamento total, o DNA plasmidial foi então colocado nas células e incubado no gelo

por 30`, então foi dado o choque térmico a 42ºC por 25`` e depois incubava-se no gelo por

mais 2`.

Em seguida foram adicionados 450 μL de meio SOC e recuperavam-se as

bactérias, a 150 rpm (30º C) por 1 hora. Todo o volume era plaqueado em LB ágar com 100µg

de ampicilina por placa de petri.

As placas eram mantidas a 30º C até o crescimento ideal das colônias.

3.3.4. Seleção dos clones mutantes.

Foram feitas reações de PCR diretamente das colônias. Uma “pinçada” da

colônia era plaqueada em LB ágar para manutenção dos clones, apenas encostando na placa

réplica e então o resto da colônia era colocado diretamente na reação (volume final 50μL).

Condições e ciclagem descritas adiante.

Foram utilizados oligonucleotídeos flanqueadores das regiões dos sítios de

BstEII. Para os dados mutantes foram utilizados os seguintes pares de oligos “foward” e

“reverso” existentes no laboratório (Tabela 6) :

. pR7gfpBstEII PR Æ DP10 e RVP3

. pR7gfpBstEII PR BstEII TR Æ DP10 e RVP3

. pR7gfpBstEII GAG BstEII PR Æ P24 inF e PNL43 R

. pR7gfpUproBstEII GAG Æ P24 intF e PNL 43 R

Tabela 6. Primers do laboratório utilizados para reações de PCR e de sequenciamento.

Nome do oligo

5' → 3'

Mer

Posição em

Relação ao HXB2

DP10 CAACTCCCTCTCAGAAGCAGGAGCCG 26 2198 - 2223

RVP3 GGCAAATACTGGAGTATTGTATGG 24 2312 - 2735

P24 intF GTCCAAAATGCGAACCCAGATTGTAA 26 1756 - 1781

PNL43 R CGCTGCCAAAGAGTGATCTGAGGGAA 26 2250 - 2275

P24 2F AGRACYTTRAAYGCATGGGT 20 1237 - 1256

RT12 ATCAGGATGGAGTTCATAACCCATCCA 27 3234 - 3260

P6 outR GAGCTTCCTTTAGTTGCCCC 20 2300 - 2319

Em torno de 15 a 40 colônias eram amplificadas, e aquelas que davam

positivas eram então sequenciadas (segundo o protocolo descrito abaixo) com os

mesmos pares de oligos utilizados nas reações de PCR respectivas. Então foi feita a

edição manual das sequências e confirmada a presença de um ou mais sítios para BstEII.

5 a 8 clones foram selecionados e crescidos em meio LB líquido contendo

ampicilina e seus DNA plasmidiais foram purificados com kit de extração para

preparações de pequenas quantidades da QIAGEN (protocolo segundo fabricante).

Corria-se um gel de agarose 0,7% Tris Borato EDTA e o tamanho do plasmídio era

comparado com o do selvagem pR7gfp, com o objetivo de testar a integridade do

plasmídeo. Após estas etapas era selecionado um clone final.

3.3.5. Sequenciamento automático e edição.

Todo produto de ampificação proveniente de PCR de colônia dos clones

mutantes ou dos clones deletados (descrito a seguir), segue o mesmo procedimento de

sequenciamento.

As reações de PCR são purificadas com colunas Millipore, Montage

PCR Centrifugal Filter Devices (protocolo segundo o fabricante). O material purificado

foi eluído em água ultra pura (GIBCO) em volume final de 40 μL.

Este material foi quantificado em comparação com um padrão de massa

de DNA conhecido, através da visualização de intensidades das bandas na presenção de

luz ultravioleta.

Cada reação de sequenciamento consistia em 100 ng de DNA, 2.5 pmoles

de oligonucleotídeo (Tabela 6), 3 μL de BigDye

Terminator kit v.3.1 (Applied

Biosystems, EUA), tampão e água suficiente para volume final de 20 μL.

A reação de sequenciamento foi submetida a precipitação com

isopropanol 65%, centrifugando-se a 14.000 rpm por 30` 4º C , o material foi lavado

com etanol 70% e centrifugado novamente por mais 10` em temperatura ambiente. O

material foi secado em termociclador a 50ºC até que secasse completamente.

Por fim estas amostras foram ressuspendidas em formamida (o volume

dependia da concentração de DNA) e então eram aplicadas na placa de 96 poços para

colocar no sequenciador automático 3100 ABI PRISM - Applied Biosystems (Applied

Biosystems, EUA).

Os resultados obtidos, foram analisados no “software” SeqMan contido no

pacote DNASTAR (Lasergene, EUA). Neste, as sequências foram editadas manualmente

e a presença do(os) sítio(os) 5`-G

↓

GTNACC-3` era confirmada.

3.3.6. Deleção para obtenção dos 3 vetores de recombinação.

Em torno de 1 μg de cada um dos plasmídeos pR7gfpBstEII PR BstEII TR,

pR7gfpBstEII GAG BstEII PR foi submetido a digestão com a enzima BstEII a 60º C

por 4 horas. Após digestão foi corrido um gel de agarose 0,7% TBE com um padrão de

peso molecular conhecido e os clones, para confirmar se o tamanho do fragmento

deletado corresponde ao esperado, no caso do pR7gfpBstEII PR BstEII TR (339pb), do

pR7gfpBstEII GAG BstEII PR (387pb) e do pR7gfpUproBstEII GAG (726pb). A banda

do gel correspondente ao plasmídio foi então cortada.

Estes plasmídeos foram purificados com kit de purificação de DNA

extraído de gel da Promega (SV Wizard mini-column purification kit, protocolo segundo

fabricante), o material foi eluído em água e quantificado em gel de agarose por

comparação da intensidade contra um padrão de massa, após coloração com Brometo de

Etídio e visualisação quando exposto a luz ultravioleta.

Para a reação de ligação com T4 ligase foram utilizados 100ng de DNA

plasmidial e 10U da enzima T4 ligase. A reação foi feita a 16º C ao longo da noite

(volume final de 10μL). Então o volume total da reação foi transformado em 50 μL de

Stbl2

, e plaqueado em 2 placas LB agar com ampicilina para obtenção de colônias

isoladas.

Os vetores deletados foram submetidos ao mesmo processo de

confirmação feito nos vetores mutantes: PCR de colônia, sequenciamento para

verificação da deleção e ligação reconstruindo o sítio de BstEII, e por fim visualização da

integridade do plasmídio deletado em relação ao seu tamanho.

Uma vez que era confirmado os sítios e o tamanho do plasmídeo, gerava-

se massa de DNA para os experimentos de co-transfecção dos agora vetores de

recombinação pR7gfpUpro, pR7gfpUgag e pR7gfpUgagpro. Foram crescidos os

clones de Stbl2

contendo os plasmídeos em 1 litro de meio de cultura LB líquido mais

antibiótico, e este DNA plasmidial extraído com kit da QIAGEN para grandes

preparações (HiSpeed Plasmid Maxi kit, EUA), esta extração rende em torno de

400ng/μL de DNA em volume final de 1mL, que então era aliquotado para evitar

repetitivos descongelamentos em todo o estoque.

3.4. Geração de vírus não recombinantes e recombinantes.

3.4.1. Amplificação dos genes da p6

ins

, PR

mut

e p6

ins

+PR

mut

A partir do cDNA (feito após isolamento do RNA viral do plasma dos

pacientes em falha terapêutica, que contínham inserções na p6

Gag

e mutações no gene da

Protease - 3 amostras do Hospital Universitário da UNIRIO, Gafrée & Guinle: TVGG01,

TVGG05 e TVGG08 e 1 amostra do Hospital da Escola Paulista de Medicina: TVSP02)

, foram feitos reações de PCR em duas etapas nas seguintes condições: 5μL de cDNA,

125 mM MgCl

, Tampão da enzima 1X, 10μM de dNTPs, 12,5 pmoles de cada

oligonucleotídeo (P24 2F e RT12), 2U de Platinum®TaqDNA Polimerase (Invitrogen,

EUA), e água suficiente para 50 μL. Ciclagem 95ºC 5`/(95º C 30``, 56º C 45``e 72º C

1`50``)x 35 ciclos/ 72º C 10`.

O PCR Nested foi feito para gerar amplicon suficiente para a co-

transfecção em volume final de 375 μL (visando obter entre 11 e 15 μg de DNA) e a

temperatura de anelamento dos oligos foi de 57ºC. As mesmas condições e

concentrações foram mantidas variando apenas: No caso de amplificar p6

Gag

+PR os

oligos foram P24 int F e RVP3 e o tempo de extensão na ciclagem de 1`40``. No caso de

amplificar p6

Gag

os oligos foram P24 int F e P6 out R, e PRO utiliza-se DP10 e RVP3

ambos extendidos por 1`30``. O volume de reação do 1º round que se utilizou no PCR

em duas etapas variava de acordo com a concentração de DNA obtida no 1º round, com

o objetivo de evitar bandas inespecíficas e melhorar a quantidade de massa de DNA final

obtida.

A confirmação da amplificação e da massa obtida foi feita por

eletroforese em gel de agarose 1%.

Para geração dos vírus recombinantes controles, sem inserções e sem

protease mutante, foi amplificado o plasmídeo pNL4 3 (Adachi et al, 1986) como

representante do HIV-1 subtipo B e vírus referência.

3.4.2. Linearização dos vetores deletados.

Em torno de 20 μg de DNA plasmidial proveniente da Maxi preparação

HiSpeed QIAGEN foi digerido com BstEII e a digestão confirmada em gel de agarose

0.7%.

3.4.3. Precipitação do DNA para co-transfecção.

O produto da amplificação foi misturado com o produto da digestão

plasmidial em um único tubo, cada produto com seu respectivo plasmídeo deletado.

Adicionou 1% de AcNH

5M, 3X o volume de Etanol 100% e incubou-se

a -20º C ao longo da noite. Centrifugou-se então, a 14.000 rpm por 30` a 4º C. Lava-se

com etanol 70% e centrifuga-se por mais 10` na temperatura ambiente.

O DNA agora preciptado foi eluído em 100 μL de água ultra pura

(GIBCO).

3.4.4. Co-transfecção em cultura de células MT-4.

Nos experimentos de cultura de células foi utilizada a linhagem

linfocitária T CD4

estabelecida de origem humana: MT-4 (Harada et al, 1985) que foi

sempre mantida em estufa 37º C / 5% CO

. O meio de cultura utilizado era o RPMI 1640,

suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB), 2mM L-glutamina, 0,075% de

bicarbonato de sódio e 50 μg/mL de penicilina/estreptomicina (todos os reagentes

fornecidos pela GIBCO, EUA).

Para a co-transfeção, a cultura de células era repicada no dia anterior ao

experimento com o objetivo das mesmas estarem em fase exponencial de crescimento e

em quantidade suficiente, 275μL de células 2.10

células/mL, para cada co-transfecção.

No dia do experimento as células foram centrifugadas e ressuspendidas em

meio 20% SFB para a obtenção da concentração 2.10

células/mL.

Em seguida, a solução de plasmídeo e PCR foram transferidas para uma

cuveta de eletroporação de 4 mm (Biorad, EUA) juntamente com 250µL da suspensão de

células (2,0 x10

/mL). A cuveta foi levemente agitada (evitando-se a formação de

bolhas) e colocada no eletroporador Gene Pulser II (Biorad, EUA), para receber o

choque. As condições de eletroporação são 250 Volts, 950 µF, durante 100-160 ms. Após

o choque, todo o conteúdo foi delicadamente retirado da cuveta com o auxílio de uma

pipeta sorológica de 1,0 mL, e transferido para uma garrafa de cultura de 25 cm

completando o volume com 5 mL de meio RPMI 10% SFB e adicionando-se, também,

25 µL de 2.10

células/mL. A garrafa era, então, incubada em estufa CO

a 37ºC.

No dia 3 pós-transfecção, adicionou-se 5 mL de meio RPMI 10% SFB.

No dia 4, adicionou-se 10 mL de RPMI 10% SFB, transferindo a cultura transfectada

para uma garrafa de cultura de 75 cm

. No dia 5, 20 mL de RPMI 10% foram

adicionados. Então, esperava-se 3 dias até o surgimento de efeito citopático, no dia 7 da

cultura (formação sincícios), que caracterizam a infecção da célula MT-4 pelo HIV-1. Se

após 3 dias cerca de 100% das células estivessem formando sincícios (caracteriza-se pela

presença de sincícios em mais de 90% dos grumos celulares), centrifugava-se todo o

conteúdo da garrafa por 10 minutos, a 1.500 g, a 4ºC, aliquotando-se todo o sobrenadante

em criotubos (cada um contendo 1,5 mL) e congelando a -70º C. Caso a cultura ainda não

apresentasse sinais de infecção ou pouquíssimos sincícios (<20% das células), centrifuga-

se todo o conteúdo da garrafa, descartando-se o sobrenadante e ressuspendendo as células

em 10 mL de RPMI com 10% SFB. Descarta-se 5 mL destas células, e os 5 mL restantes

acresenta-se 35 mL de RPMI com 10% SFB, transferindo, em seguida, para a mesma

garrafa de 75 cm

. Observar a cultura de 3 em 3 dias, até o surgimento dos sincícios,

indicadores da infecção. Repetir o mesmo procedimento descrito acima, aguardando o

surgimento de sincícios até no máximo 21 dias pós-transfecção.

Foi transfectado nas mesmas condições o vetor completo pR7gfp para

posterior utilização como controle dos experimentos a serem realizados.

3.4.5. Titulação dos Estoques Virais

Todos os vírus recombinantes, gerados como descrito a cima, tiveram os

seus valores de CCID

(dose de vírus capaz de infectar 50% da cultura de células)

determinados. O procedimento realizado foi o mesmo descrito em DAIDS Virology

Manual for HIV Laboratories, 1997; com pequenas modificações. Uma alíquota era

descongelada, e diluída 4 vezes por fator de 10 em volume de 300 μL (em tubos Falcon

de 15 mL). Então adicionava-se mais 300 μL de uma preparação de células 10

células/mL em cada diluição.

Este material (600 μL) foi submetido a centrifugação 1.200x g por 2 horas,

e o sobrenadante retirado. O precipitado foi então ressuspendido em 3 mL de meio, e

então 100 μL desta infecção foi plaqueado por poço (10

células/poço) num total de 12

poços por diluição, em placa de 96 poços. A última fileira da placa era sempre o “mock”,

controle de células.

No 5º dia foi adicionado 20 μL do corante de viabilidade celular Cell titer

blue (Promega, EUA) incubando ao longo da noite. No 6º dia emissão de fluorescência

era lida no Cytofluor (Applied Biosystems, EUA). Então calculava-se o CCID

de cada

vírus

3.5. Fenotipagem dos vírus com e sem duplicações no domínio PTAPP/ com e

sem protease respectiva (mutada).

O experimento para a determinação dos valores de EC50 (concentração efetiva que

inibe em 50% a infecção viral) foi realizado com todos os vírus recombinantes contendo:

ins

, PR

mut

, ou p6

ins

+PR

mut,

contra os seguintes inibidores de protease: saquinavir,

indinavir, ritonavir, nelfinavir, amprenavir e lopinavir.

Para a realização dos ensaios de fenotipagem, placas de 96 poços, contendo 10

células MT-4/poço foram infectadas com os HIV-1 recombinantes com uma MOI

(multiplicidade de infecção) de 0,002 (recomendação do NIH= 0,001 a 0,01) (DAIDS

VIROLOGY MANUAL FOR HIV LABORATORIES, 1997). As drogas foram

inicialmente diluídas em dimetil sulfóxido (DMSO) para concentração final de 20mM e

posteriormente diluídas em meio RPMI 1640 para 200µM. Oito poços das células

infectadas são expostos a concentrações decrescentes da droga a partir de 0,2µM (para

saquinavir), 0,4µM (para indinavir), 2,0µM (para ritonavir, nelfinavir e lopinavir) e

4,0µM (para amprenavir), por fator de 3 (figura 11). Um nono poço era mantido como

controle da infecção, sem a presença da droga. E o décimo poço era mantido sem droga e

sem a presença do vírus, para controle da célula. Cada linha de 10 poços de infecção era

produzida em quadruplicata, para tratamento estatístico posterior. A infecção foi mantida

em estufa 5% CO

a 37

C, e acompanhada diariamente por microscopia óptica de fase,

para análise do aparecimento de sincícios, o que acontece geralmente no quarto dia pós-

infecção.

Para a revelação do ensaio de fenotipagem, a técnica utilizada de coloração por

“cell titer blue” para medida da viabilidade celular, foi utilizada no quinto dia pós-

infecção, a fim de permitir a diferenciação de viabilidade celular pós formação de

sincício. Para tal, em cada poço das placas foi adicionado 20 μL de uma solução do

corante. As placas, em seguida, foram incubadas a 37º C durante a noite, em estufa com

5% de CO

. No dia seis a placa será lida em fluorímetro (Cytofluor, Applied Biosystem,

EUA).

Figura11. Esquema de uma placa de 96 poços utilizada para fenotipagem de HIV-1, corada

com corante azul que quando metabolizado pelas células transforma-se em tom de rosa.

Experimento feito em quadruplicata, cada linha representa uma concentração de droga. C.V.:

Controle de vírus, células infectadas sem droga; C.C.: Controle de células, somente células sem

vírus e sem drogas.

Os resultados foram analisados em matriz Microsoft Excel

para Windows XP

e no

programa SigmaPlot® 8.0. Efetuava-se a correção do branco e plotagem em gráfico da

freqüência de emissão do ensaio (em porcentagem, usando como padrão 100% a emissão

de poço de células viáveis sem infecção) como medida da viabilidade celular. O valor de

EC50 (concentração de droga que inibe em 50% a infecção viral) foi obtido no gráfico,

pela equação da curva de regressão não-linear de Hill (semi-logarítmica) com 3

parâmetros.

______________________________4. Resultados.

4.1. Vetores para a geração de vírus recombinantes.

Diferentes sítios foram criados ao longo do genoma do HIV, a fim de criar diferentes

combinações de mutantes, e consequentemente diferentes clones deletados. Veja a

representação esquemática em escala, da região onde foram inseridos os sítios. Figura 12.

Figura 12. Visão esquemática da p24, p2, p7, p6

Gag

, p6

Gag-Pol

, PR e início da TR. Os pontos

vermelhos são as regiões no genoma do HIV-1, onde foram inseridos os sítios de restrição

para a enzima BstEII. Localização da posição do 1º sítio antes do início da PR, do 2º sítio no

início da TR e do 3º sítio no fim da p24.

______387pb______ ______339pb______

1º

3º

2º

24 /

6 1º P

Figura 13. Vetor pR7gfpBstEII PR alinhado com outros clones positivos e por

último a sequência selvagem do vírus HXB2, da região que vai do primer DP10 ao RVP3.

Presença do 1º sítio para a enzima BstEII (GGTAACC) na posição 2247-2243.

O primeiro sítio inserido no plasmídeo selvagem, foi no início do gene da protease,

posição 2247-2243 em relação a cepa HXB2, utilizando os oligos pR7 mut pro F e pR7 mut

pro R (pR7gfpBstEII PR) (Figura 13).

O vetor pR7gfpBstEII PRO foi submetido a 2 novas reações diferentes, de mutagênese

sítio dirigida, para otimizar o tempo os 2 próximo vetores foram construídos a partir deste,

utilizando o par de oligos pR7 mut TR F e pR7 mut TR R foi inserida a mutação no 2º sítio no

início da TR, posição 2576-2582, gerando o vetor pR7gfpBstEII PR BstEII TR, um outro

vetor foi feito com os oligos pR7 mut gag F e pR7 mut gag R inserindo-se o 3º sítio no final

do gene da proteína p24, posição 1850-1856: pR7gfpBstEII GAG BstEII PR (Figura 14a). Um

quarto vetor mutante foi criado se inserindo o 3º sítio para BstEII já no plasmídeo

pR7gfpUpro (descrito abaixo) com o par de oligos pR7mut gag F e pR7mut gag R, gerando o

plasmídeo pR7gfpUproBstEII GAG (Figura 14b).

24 3º

6 1º P

Figura 14a. Vetor pR7gfpBstEII GAG BstEII PR alinhado com outros clones positivos

e por último a sequência selvagem do vírus HXB2, da região que que vai do primer P24

int F ao RVP3. Destacado o novo sítio gerado na posição 3, e a presença do sítio na

posição 1 no mesmo clone.

Fig 14b. mut GAG no Del PR Vetor pR7gfpUproBstEII GAG alinhado com outros

clones positivos e por último a sequência selvagem do vírus HXB2, da região que vai do

primer P24 int F ao RVP3 sem a região da protease. Destacado a mutação gerada no 3º

sítio, e a reconstrução do sítio para a BstEII após digestão e re-ligação do 1º e 2º

(deletando a PR).

Após deleção e re-ligação do pR7gfpBstEII PR BstEII TR, foi gerado o vetor para

recombinação pR7gfpUpro, Figura 15.

24 3º

2 /

7 /

6 1º/2º T

24 /

2 /

7 /

6 1º/2º T

Figura 15. Vetor pR7gfpUpro alinhado com um padrão construídos sem a região da

protease. Destacado a reconstrução do sítio para a BstEII após digestão e re-ligação do 1º

e 2º (deletando a PR).

Após digestão e re-ligação do pR7gfpBstEII GAG BstEII PR, foi gerado o vetor

pR7gfpUgag , Figura 16.

Figura 16. Vetor pR7gfpUgag alinhado com um padrão construídos sem a região da

Gag

. Destacado a reconstrução do sítio para a BstEII após digestão e re-ligação do 3º

com o 1º (deletando a p2/p7/p6).

Por último foi criado o vetor pR7gfpUgagpro, produto da digestão e re-ligação

do pR7gfpUproBstEII GAG, Figura 17.

24 3º /1º PR

24 3º /2º T

Figura 17. Vetor pR7gfpUgagpro alinhado com um padrão construídos sem a região da

Gag

+PR. Destacado a reconstrução do sítio para a BstEII após digestão e re-ligação do

3º com o 2º (deletando p2/p7/p6 e a PR).

4.2. Geração de vírus recombinantes por co-transfecção contendo p6

ins

, PR

mut

ins

+PR

mut

e seus respectivos controles selvagens.

Pela co-transfecção foram gerados todos os vírus recombinantes:

R7gfpUgagNL4-3, R7gfpUproNL4-3, R7gfpUgagproNL4-3, R7gfpUgagGG1,

R7gfpUproGG1, R7gfpUgagproGG1, R7gfpUgagGG5, R7gfpUproGG5,

R7gfpUgagproGG5, R7gfpUgagGG8, R7gfpUproGG8, R7gfpUgagproGG8,

R7gfpUgagSP2, R7gfpUproSP2 e R7gfpUgagproSP2. A partir de aproximadamente

35mL de sobrenadante de cultura, cada vírus é estocado em alíquotas de 1,8mL em

freezer -70ºC.

4.3. Titulação dos estoques virais contendo p6

ins

, PR

mut

ou p6

ins

+PR

mut

e seus

respectivos controles selvagens.

Através da diluição viral (em fator de 10), seguida de ensaio de infecção em

cultura de células MT4, Foi determinado o valor de CCID50 por mL para os

determinados vírus abaixo. Ou seja, foi determinada a quantidade de vírus capaz de

infectar 50% das células. A revelação foi feita com corante de viabilidade celular.

Tabela 7. Número de CCID50 por mL dos estoques virais gerados e

armazenados, para cada vírus recombinate gerado.

Vírus TCID50/mL

R7gfp controle 3.981,07

R7gfpUpro GG1 n/a

R7gfpUpro GG5 n/a

R7gfpUpro GG8 31.622,78

R7gfpUpro SP2 3.162,27

R7gfpUpro NL4-3 controle 31.622,78

R7gfpUgag GG1 3.162,27

R7gfpUgag GG5 n/a

R7gfpUgag GG8 31.622,78

R7gfpUgag SP2 3.162,27

R7gfpUgag NL4-3 controle 31.622,78

R7gfpUgagpro GG1 3.162,27

R7gfpUgagpro GG5 2.848,03

R7gfpUgagpro GG8 31.622,78

R7gfpUgagpro SP2 1.778,27

R7gfpUgagpro NL4-3 controle 3.162,27

4.4. Sequenciamento dos vírus recombinantes gerados.

Os vírus recombinantes: R7gfpUgagNL4-3, R7gfpUproNL4-3,

R7gfpUgagproNL4-3, R7gfpUgagGG1, R7gfpUgagproGG1, R7gfpUgagproGG5,

R7gfpUgagGG8, R7gfpUproGG8, R7gfpUgagproGG8, R7gfpUproSP2,

R7gfpUgagproSP2, foram submetidos a extração de RNA viral, seguido de reação de

Transcrição Reversa. Estes cDNA foram sequenciados nas regiões da p6

Gag

e da PR, com

a finalidade de confirmar o perfil genético da cada recombinante. As respectivas

inserções estavam presente em: R7gfpUgagGG1, R7gfpUgagproGG1,

R7gfpUgagproGG5, R7gfpUgagGG8, R7gfpUgagproGG8 e R7gfpUgagproSP2. E as

respectivas mutações na Protease foram confirmadas para os recombinantes:

R7gfpUgagproGG1, R7gfpUgagproGG5, R7gfpUproGG8, R7gfpUgagproGG8,

R7gfpUproSP2 e R7gfpUgagproSP2 como esperado. Nos vírus recombinantes

controles (com genótipo selvagem): R7gfpUgagNL4-3, R7gfpUproNL4-3 e

R7gfpUgagproNL4-3 não havia nenhuma inserção nem como mutação na Protease

( Figura 18a. e 18b.)

10 20 30

0 50 60 70

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|...

p6Gag HXB2 LQ--------SRPE----------PTAPP---EESFRSGVETTTPPQKQEPIDKELYPLTSLRSLFGNDPSSQ

TVGG1 DelGAGPRO p6Gag LQSRPEPTAPSRPE----------PTAPP---EESFRFGEETTTPSQKQEPIDKELYPLASLKSLFGNDPSSQ

TVGG1 DelGAG p6Gag LQSRPEPTAPSRPE----------PTAPP---EESFRFGEETTTPSQKQEPIDKELYPLASLRSLFGNDPSSQ

TVGG5 DelGAGPRO p6Gag LQSRPEPTAPSRLE----------PTAPP---EESFRFGEETTTPSQKQEPINKELYPLASLKSLFGNDPSSQ

TVGG8 DelPRO p6Gag LQ--------SRPE----------PTAPP---EESFRSGVETTTPXQKQEPIDKELYPLASLRSLFGXDPSSQ

TVGG8 DelGAG p6Gag LQ--------SRPEPTAPPAESLRPTAPP---AESFRSGVETTTPPQKQEPIDKELYPLTSLRSLFGNDPSSQ

TVGG8 DelGAGPRO p6Gag LQ--------SRPEPTAPPAESXRPTAPP---AESFRFGEETTTPPQKQEPIDKELYPLASLRSLFGNDPSSQ

TVSP2 DelPRO p6Gag LQ--------SRPE----------PTAPP---EESFRSGVETTTPPQKQEPIDXXLYPLASLRSLFGNDXLSQ

TVSP2 DelGAGPRO p6Gag LQ--------SRPE----------PTAPPAPPEESFRFGEETTTPSQKQGQTDQELYPLASLRSLFGNDPLSQ

Figura 18a. Alinhamento na ORF da p6

Gag

dos diferentes vírus recombinantes gerados que foram

submetidos a fenotipagem e sequência padrão do isolado HXB2. (Os aminoácidos que aparecem

com um X significa ambiguidade na sequência correspondente em nucleotídeos, sítio não

sinônimo – duas possibilidas de aminoácidos).

10 20 30 40 50 60 70 80 90

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....

PROTEASE HXB2 PQVTLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMSLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNF

TVGG1 DelGAG inicioPR PQITLWQRPLVTIKIGGQLKEA-----------------------------------------------------------------------------

TVGG1 DelGAGPRO PR PQITLWQRPLVTIKIGGQLREALIDTGADDTVLEDINLPGKWKPKMIGGIGGFVKVRQYDQVPVEICGHKAIGTVLXGPTPLNIIGRNLLTQIGCTLNF

TVGG5 DelGAGPRO PR PQITLWQRPLVTIKIGGQLKEALIDTGADDTVLEEMNLPGKWKPKLIGGIGGFVKVRQYDQIPVEICGHKAIGTVLVGPTPANIIGRNLLTQIGCTLNF

TVGG8 DelPRO PR PQITLWXRPLVTIKIGDQLKEALLDTGADDTVLEDMNLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYEQIPIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLXQIGCTLNF

TVGG8 DelGAG inicioPR PQVTLWQRPLVTIKIGGQLKEA-----------------------------------------------------------------------------

TVGG8 DelGAGPRO PR PQITLWQRPLVTIKIGDQLKEALLDTGADDTVLEDMNLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYEQIPIEICGHXAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNF

TVSP2 DelPRO PR PQITLWQRPXVTIKIGGQLXEALLXTGADDTVLEQIDLPGKWKPKMIGGIGGFVKVRQYEQIPIEICGHKVVGTVLVGPTPANIIGRNLLTXIGCTLNX

TVSP2 DelGAGPRO PR PQITLWQRPIVTIKIGGQLREALLDTGADDTVLEQIDLPGKWKPKMIGGIGGFVKVXQYEQXXIEICGHKVVGTVLVGPTPANIIGRNLLTQIGCTLN-

Figura 18b. Alinhamento na ORF da PR dos diferentes vírus recombinantes gerados que foram submetidos a

fenotipagem e sequência padrão do isolado HXB2. (Os aminoácidos que aparecem com um X significa

ambiguidade na sequência correspondente em nucleotídeos, sítio não sinônimo)

4.5. Fenotipagem.

A suscetibilidade aos IP: Indinavir (IDV), Lopinavir (LPV), Nelfinavir (NFV),

Saquinavir (SQV) e Ritonavir (RTV), foi testada para todos os vírus quimeras titulados e

com os devidos perfis genéticos confirmados. Para o IP Amprenavir (APV) , apenas os

recombinantes R7gfpUgagNL4-3, R7gfpUproNL4-3, R7gfpUgagproNL4-3,

R7gfpUgagGG8, R7gfpUproGG8, R7gfpUgagproGG8 foram testados.

Com o objetivo de determinar o nível de resistência de cada vírus quimera, era

determinado o valor de EC50 (em quadruplicata) para cada vírus recombinante

construído a partir de isolados clínicos, tal como o valor de EC50 para o respectivo

recombinante gerado a partir do isolado NL4-3 com perfil genético selvagem.

Determina-se então o valor de “Fold Resistance” que é a razão da média do EC50 do

vírus estudado sobre a média do EC50 do vírus selvagem (vírus padrão), obtem-se então

quantas vezes um vírus é resistente em relação “ao mesmo vírus” selvagem (Tabela 8).

Foram considerados resistentes, os clones que apresentavam valores de “Fold

Resistance” acima dos valores de cut-off biológico fenotípico estabelecidos pela VIRCO

– empresa especializada em realizar fenotipagem para HIV-1 ( Harrigan et al, 2001).

Estes valores são: 2,5 para APV e SQV; 4,0 para LPV e NFV; 3,0 para IDV e 3,5 para

RTV.

Nenhum vírus recombinante contendo inserção do domínio PTAPP e uma PR

com perfil genético selvagem demonstrou resistência a nenhum dos IP testados.

Mostrando que sua presença por si só, não é capaz de conferir resistência a IP (Tabela 8 e

Figuras: 19 e 20).

Surpreendente foi o resultado obtido com os recombinantes R7gfpUproSP2,

R7gfpUgagproSP2, que possuíam uma protease com genótipo de resistência a IP. O

vírus que possuía p6

ins

+PR

mut

teve redução na

FR em relação ao vírus que possuía apenas

a PR

mut

de 27,4 para 8,0 (LPV); de 35,3 para 15,7 (RTV); de 3,7 para 1,0 (SQV) neste

caso tornando o vírus susceptível à SQV. Mostrando que a presenção da duplicação do

domínio reduziu o nível de resistência à RTV, LPV e SQV (Tabela 8 e Figura 21).

Tabela 8. Valores de “Fold Resistance” obtidos para cada um dos vírus recombinantes

testados. DelGAG: Vírus quimera que contém a inserção na p6

Gag

proveniente do

isolado. DelPRO: Vírus quimera que contém as mutações de resistência no gene da PR

proveniente do isolado. DelGAGPRO: Vírus quimera que contém a inserção na p6

Gag

mais as mutações de resistência no gene da PR provenientes do isolado

Inibidor de Protease (valor de cut-off fenotípico para o respectivo inibidor de protease)

Desvio Padrão (DP) calculado a partir dos valores em quadruplicátas de EC50 obtido para cada clone viral.

Fold resistance (FR) = EC50 vírus quimera de isolado clínico / EC50 vírus quimera referência (NL4-3).

±0,001

1,0

±0,047

15,7

±0,030

6,3

±0,007

8,0

±0,013

5,1n/aUGagPro

±0,006

3,7

±0,205

35,3

±0,042

11,0

±0,009

27,4

±0,032

5,8n/aUPro

n/aTVSP2

±0,0009

0,8

±0,003

1,0

±0,011

0,9

±0,0001

0,3

±0,001

0,8

±0,005

0,8UGagPro

±0,001

1,1

±0,005

1,2

±0,004

0,7

±0,001

1,1

±0,0002

0,7

±0,004

0,6UPro

±0,001

0,9

±0,001

0,6

±0,003

0,7

±0,0007

0,8

±0,002

1,0

±0,001

0,8UGagTVGG8

±0,001

1,6

±0,185

35,1

±0,065

11,2

±0,010

22,2

±0,076

10,8n/aUGagPro

n/a

n/aTVGG5

±0,001

1,1

±0,146

42,2

±0,043

4,5

±0,001

2,9

±0,007

1,5n/aUGagPro

n/a

±0,002

2,1

±0,001

1,9

±0,001

0,4

±0,004

2,2n/aUGagTVGG1

±0,0009

1,0

±0,003

1,0

±0,008

1,0

±0,0001

1,0

±0,003

1,0

±0,005

1,0UGagPro

±0,0004

1,0

±0,006

1,0

±0,006

1,0

±0,004

1,0

±0,001

1,0

±0,004

1,0UPro

±0,0005

1,0

±0,003

1,0

±0,001

1,0

±0,003

1,0

±0,001

1,0

±0,002

1,0UGagNL4-3

(2,5)

(3,5)

(4,0)

(3,0)

(2,5)

SaquinavirRitonavirNelfinavirLopinavirIndinavirAmprenavir

Fold Resistance

±DP

Inibidor de Protease (valor de cut-off fenotípico para o respectivo inibidor de protease)

Desvio Padrão (DP) calculado a partir dos valores em quadruplicátas de EC50 obtido para cada clone viral.

Fold resistance (FR) = EC50 vírus quimera de isolado clínico / EC50 vírus quimera referência (NL4-3).

±0,001

1,0

±0,047

15,7

±0,030

6,3

±0,007

8,0

±0,013

5,1n/aUGagPro

±0,006

3,7

±0,205

35,3

±0,042

11,0

±0,009

27,4

±0,032

5,8n/aUPro

n/aTVSP2

±0,0009

0,8

±0,003

1,0

±0,011

0,9

±0,0001

0,3

±0,001

0,8

±0,005

0,8UGagPro

±0,001

1,1

±0,005

1,2

±0,004

0,7

±0,001

1,1

±0,0002

0,7

±0,004

0,6UPro

±0,001

0,9

±0,001

0,6

±0,003

0,7

±0,0007

0,8

±0,002

1,0

±0,001

0,8UGagTVGG8

±0,001

1,6

±0,185

35,1

±0,065

11,2

±0,010

22,2

±0,076

10,8n/aUGagPro

n/a

n/aTVGG5

±0,001

1,1

±0,146

42,2

±0,043

4,5

±0,001

2,9

±0,007

1,5n/aUGagPro

n/a

±0,002

2,1

±0,001

1,9

±0,001

0,4

±0,004

2,2n/aUGagTVGG1

±0,0009

1,0

±0,003

1,0

±0,008

1,0

±0,0001

1,0

±0,003

1,0

±0,005

1,0UGagPro

±0,0004

1,0

±0,006

1,0

±0,006

1,0

±0,004

1,0

±0,001

1,0

±0,004

1,0UPro

±0,0005

1,0

±0,003

1,0

±0,001

1,0

±0,003

1,0

±0,001

1,0

±0,002

1,0UGagNL4-3

(2,5)

(3,5)

(4,0)

(3,0)

(2,5)

SaquinavirRitonavirNelfinavirLopinavirIndinavirAmprenavir

Fold Resistance

±DP

TVGG8

APV IDV LPV NFV RTV SQV

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

DelGAG

DelPRO

DelGAGPRO

Figura 19. Valores de FR dos diferentes recombinantes gerados a partir do isolado clínico

TVGG8. Perfil genético do vírus TVGG8 na: p6

ins

(PTAPPAESFR) PR (L63P). DelGAG: Vírus

quimera que contém a inserção na p6

Gag

proveniente do isolado. DelPRO: Vírus quimera que

contém as mutações de resistência no gene da PR proveniente do isolado. DelGAGPRO: Vírus

quimera que contém a inserção na p6

Gag

mais as mutações de resistência no gene da PR

provenientes do isolado.

TVGG1

IDV LPV NFV RTV SQV

DelGAG

DelGAGPRO

Figura 20. Valores de FR dos diferentes recombinantes gerados a partir do isolado clínico

TVGG1. Perfil genético do vírus TVGG1 na: p6

ins

(RPEPTAPP) PR (K20R, L24I, M36I, I54V,

L63P, V82L). DelGAG: Vírus quimera que contém a inserção na p6

Gag

proveniente do isolado.

DelGAGPRO: Vírus quimera que contém a inserção na p6

Gag

mais as mutações de resistência

no gene da PR provenientes do isolado

TVSP2

IDV LPV NFV RTV SQV

DelPRO

DelGAGPRO

Figura 21. Valores de FR dos diferentes recombinantes gerados a partir do isolado clínico

TVSP2. Perfil genético do vírus TVSP2 na: p6

ins

(APP) PR (L10I, K20R, M36I, I54V, L63P, A71V,

V82A). DelPRO: Vírus quimera que contém as mutações de resistência no gene da PR

proveniente do isolado. DelGAGPRO: Vírus quimera que contém a inserção na p6

Gag

mais as

mutações de resistência no gene da PR provenientes do isolado

_______________________________________ 5. Discussão.

As mutações, nos genes alvo da terapia, que conferem resistência aos ARV

disponíveis são um fator limitante no sucesso terapêutico. Muitos estudos desses genes

tem sido feitos principalmente para o subtipo B do HIV-1, correlacionando o genótipo

com o fenótipo viral. Testes de fenotipagem da PR viral com diferentes perfís

genotípicos são feitos para os IP disponíveis, para testar a eficácia de uma possível nova

droga.

Pouco é estudado em experimentos in vitro no que diz respeito ao fenótipo viral

de resistência a IP quando algum polimorfismo fora dos genes alvo da terapia acontece.

Os estudos que começaram a demonstrar relevância de alguns polimorfismos, mostrou

que mutações nos sítios de clivagem do substrato Gag e Gag-Pol estariam co-evoluindo

para a resistência viral aos IP, recuperando a afinidade ao substrato pela enzima mutante,

e por sua vez menos processiva (Mammano, Petit & Clavel, 1998; Kolli, Lastere &

Schiffer, 2006).

O papel de polimorfismos como inserções e deleções em regiões do gene gag,

fora dos sítios de clivagem, na susceptibilidade viral aos ARV e na capacidade

replicativa viral (adaptabilidade viral) vem sendo cada vez mais questionado.

Vários grupos vem discutindo a importância destas inserções, principalmente em

domínios conservados e essenciais para a replicação viral, como o domínio tardio

P(T/S)APP. Alguns grupos acharam a mesma frequência de aparecimento de duplicações

do domínio tardio na população viral de pacientes tratados como pacientes que nunca

foram tratados (Gallego et al., 2003), este dado seria um forte indício de que estas

inserções seriam apenas polimorfismos virais presentes.

Por outro lado, outros grupos suportam que estas duplicações, sejam parciais ou

completas do P(T/S)APP, estariam contribuindo para a resistência aos ARV, uma vez

que em algumas coortes a frequência de aparecimento destas inserções é maior na

população de pacientes altamente tratados (Petters et al., 2001).

Um trabalho corroborou ainda mais esta hipótese quando se calculava a

capacidade replicativa viral de um isolado com e outro sem inserção, com PR resistentes,

e este vírus com inserção demonstrava ter recuperado a capacidade replicativa viral,

perdida pela presença do genótipo resistência acumulado na PR mutante (Tamiya et

al.,2004).

Em 2002 foi desenvolvido pelo grupo um trabalho que testou a resistência

genotípica e fenotípica de isolados virais, de 52 amostras isoladas de crianças infectadas

por transmissão vertical e em falha terapêutica, através do sequenciamento do gene pol

(Brindeiro PA, et al.; 2002). Quando a PR foi sequenciada, viu-se em algumas amostras a

presença de diferentes padrões de duplicações na região N-terminal da PR, esta região

correspondia ao domínio tardio P(T/S)APP da proteina p6

Gag

. Foi a partir desta

evidência, que questionou-se o papel destas inserções na susceptibilidade aos IP, uma vez

que a poliproteína Pr55

Gag

é o substrato para a PR.

A sequência correspondente a este domínio, na p6

Gag-Pol

também tem sua região

duplicada, portanto podendo ter alguma diferença funcional nesta proteína, era preciso

“evitar” sua influência. Como a p6*, liga a proteína Nef do HIV-1, parecendo estar

facilitando o brotamento viral, utilizamos um clone deletado de Nef.

Com o objetivo de estudar o papel desta p6

Gag

quando presente em um isoldo viral

com diferentes PR, foram construídos 3 vetores plasmidiais virais, contendo o genoma do

HIV-1 deletados em diferentes regiões: p6

Gag

, PR e p6

Gag

+PR. A partir destes vetores,

foram gerados diferentes vírus recombinentes, dos isolados virais TVGG1, TVGG5,

TVGG8, TVSP2 e NL4-3 (controle): R7gfpUgagNL4-3, R7gfpUproNL4-3,

R7gfpUgagproNL4-3, R7gfpUgagGG1, R7gfpUgagproGG1, R7gfpUgagproGG5,

R7gfpUgagGG8, R7gfpUproGG8, R7gfpUgagproGG8, R7gfpUproSP2,

R7gfpUgagproSP2. Sendo este o primeiro trabalho a estudar o efeito na resistência a IP

através de diferentes combinações virais do mesmo isolado, separando o efeito da

presença da inserção (p6

ins

), da PR

mut

e da p6

ins

+PR

mut

Nenhum vírus contendo a duplicação quando presente uma PR susceptípel aos IP,

teve aumento ou redução desta susceptibilidade. Este resultado demonstra que in vitro,

esta inserção não influencia a resistência viral aos IP em uma população virgem de

tratamento com IP, o que suporta a teoria dos grupos que acreditam que estas inserções

sejam apenas polimorfismos virais (Gallego et al., 2003). Porém, nada ainda pode ser

concluído quanto ao efeito específico destas inserções na capacidade replicativa do HIV-

1, o que demanda experimentos com o objetivo de responder esta pergunta.

O resultado obtido comparando os vírus recombinantes R7gfpUproSP2 e

R7gfpUgagproSP2 (contendo uma PR com perfil genotípico que provoca altos níveis de

resistência fenotípica aos diferentes IP testados), indica que a presença da inserção (APP)

na p6Gag provoca uma redução na

FR em relação ao vírus que possuía apenas a PR

mut

27,4 para 8,0 (LPV); de 35,3 para 15,7 (RTV); de 3,7 para 1,0 (SQV) neste caso tornando

o vírus susceptível à SQV. Este resultado demonstra pela primeira vez que a presença da

duplicação do domínio PTAPP reduz o nível de resistência à RTV, LPV e SQV. A partir

destes resultados podemos especular que a duplicação parcial do domínio PTAPP da

Gag

, provoca essa diminuição na resistência aos IP por aumentar a afinidade da protease

viral (mutante e resistente) pelo seu substrato natural gag também mutado (com PTAP

duplicado). A recuperação desta afinidade, provavelmente está aumentando a capacidade

replicativa do vírus p6

ins

+PR

mut

, em relação ao PR

mut

, porque esta é a população

majoritária encontrada no plasma do paciente apresentando falha terapêutica aos ARV.

Ou seja, de alguma forma esta população é mais adaptada a pressão seletiva dos IP, do

que a populção viral sem duplicação no PTAPP, mesmo apresentando um nível inferior

de resistência fenotípica aos IP. Aparentemente, estamos diante de uma casuística onde a

população viral mais adaptada à pressão seletiva dos ARV não é aquela contendo apenas

mutações que provocam alto nível de resistência fenotípica. Mas sim, uma população que

apresenta níveis de FR suficientes para superar os cut-offs de resistência dos IP e, uma

alta capacidade replicativa, que pode ser explicada pela aumento da processividade da

protease mutante na presença de gag mutante, ou ainda pelo papel que estas inserções em

p6 podem estar desempenhando num possível favorecimento no brotamento do vírus.

Mais estudos sobre os polimorfismos virais no gag são necessários, já que a influência

na susceptibilidade aos ARV é fundamental na escolha da terapia para o paciente

infectado, principalmente se ele possui um genótipo na PR e na TR de resistência. É

necessário também avaliar o efeito destas duplicações nos subtipos não-B, uma vez que o

fenótipo deles se comportam de modo diferente pra algumas drogas. Também é

fundamental um estudo maior do balanço entre a capacidade replicativa viral e a

susceptibilidade aos ARV. Até que ponto é mais vantajoso para o vírus ganhar com a

capacidade replicativa e perder na resistência.

_______________________________________ 6. Conclusões.

Com os resultados obtidos podemos concluir que:

Æ Foi gerado um painel de clones de genoma viral deletados nos genes: gag p1-

p6, pro ou ambos, a fim de estudar o comportamento fenotípico de vírus recombinantes

gerados in vitro, através da recombinação com os respectivos produtos da amplificação

gênica de isolados clínicos, por co-transfecção.

Este painel permitirá efetuar estudos futuros sobre a importância de diferentes

polimorfismos das proteínas Gag p1 e p6, bem como da protease viral, para a

infecciosidade, a processividade e a maturação do HIV-1.

Æ É possível fazer um estudo fenotípico do efeito dos polimorfismos

em gag dos isolados virais, comparando-se os valores de FR das PR isoladas

como a PR em conjunto com gag.

Æ As duplicações do domínio tardio P(T/S)APP quando presentes em um isolado

viral contendo uma enzima PR com genótipo de susceptibilidade, não influenciam na

resistência aos IP.

Æ As duplicações do domínio tardio P(T/S)APP quando presente em

um isolado viral com uma PR resistente aos IP, apresentando um perfil

genotípico complexo de resistência, contribuem para a redução do FR viral para

as drogas LPV, RTV e NFV. Para SQV o vírus tornou-se susceptível ao IP, levando em

consideração os valores de cut-offs fenotípicos.

Æ Gag e PR quando analisados de diferentes isolados virais, podem ser

comparados quanto ao comportamento fenotípico de seus variantes. Isso se da uma vez

que seus perfis genotípicos de resistência são previamente conhecidos, através da

interpretação algorítmica (Stanford e algoritmo brasileiro).

Æ É necessário completar o estudo fenotípico com todos os variantes Gag, PR e

Gag+PR de cada isolado estudado, para aprofundar o entendimento sobre o efeito da co-

evolução entre variantes no domínio tardio Gag e a resistência na PR. Estudos de

capacidade replicativa dos clones gerados também deverão ser feitos com o mesmo

intuito.

_____________________________________ 7. Bibliografia.

ADACHI A, Gendelman HE, Koenig S, Folks T, Willey R, Rabson A, Martin MA. 1986.

Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and

nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. J. Virol., 59:284-91.

ALEXANDER L, Weiskopf E, Greenough TC, Gaddis NC, AuerPharmacia bach MR,

Malim MH., O’Brien SJ., Walker BD, Sullivan JL, and Desrosiers RC (2000). Unusual

polymorphisms in human immunodeficiency vírus type 1 associated with nonprogressive

infection. J. Virol., 74 4361–4376.

ARICI C, Ripamonti D, Ravasio V, Maggiolo F, Rizzi M, Finazzi MG, Suter F. 2001

Long-term clinical benefit after highly active antiretroviral therapy in advanced HIV-1

infection, even in patients without immune reconstitution. Int J STD AIDS. Sep;

12(9):573-81.

BABST M, Katzmann DJ, Estepa-Sabal E J, Meerloo T, Emr SD. 2002. ESCRT-III: an

endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting. Dev.

Cell 3:271–282.

BABST M, Katzmann DJ, Synder W B, Wendland B, Emr SD. 2002. Endosome-

associated complex, ESCRT-II, recruits transport machinery for protein sorting at the

multivesicular body. Dev. Cell 3:282–289.

BARRÉ-SINOUSSI F, Chermann JC, Rey F, Nugeyre MT, Chamaret S, Gruest J,

Dauguet C, Axler-Blin C, Vezinet-Brun F, Rouzioux C, Rozenbaum W, Montagnier L.

Isolation of a T-lymphotropic et al. 1983. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from

a patience at risk for acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Science, 220:868-

871.

BERKHOUT B, Jeang KT. 1992. Functional roles for the TATA promoter and enhancers

in basal and Tat-induced expression of the human immunodeficiency virus type 1 long

terminal repeat. J. Virol., 66:139-1

BOOKSCOLE, < http://www.bookscole.com>

BOUAMR F, Melillo JA, Wang MQ, Nagashima K, De Los Santos M, et al. 2003.

PPPYEPTAP motif is the late domain of human Tcell leukemia virus type 1 Gag and

mediates its functional interaction with cellular proteins Nedd4 and Tsg101. J. Virol.,

77:11882– 95.

BRIGGS JAG, Wilk T, Welker R, Kräusslich HG, Fuller SD. Structural organization of

authentic, mature HIV-1 virions and cores. 2003. The EMBO Journal, 22, 1707–1715.

BRINDEIRO PA, Brindeiro RM, Mortensen C, Hertogs K, De Vroey V, Rubini NP, Sion

FS, De Sa CA, Machado DM, Succi RC, Tanuri A. 2002. Testing genotypic and

phenotypic resistance in human immunodeficiency virus type 1 isolates of clade B and

other clades from children failing antiretroviral therapy. J Clin Microbiol. 40(12):4512-9.

BUKRINSKY M, Stanwick T, Dempsey M, et al. 1991. Quiescent T lymphocytes as an

inducible virus reservoir in HIV-1 infection. Science, 254 :423-427.

CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, Centers for Disease

Control Task. 1982. Force on Kaposi’s sarcoma and opportunistic infection. N. Engl. J.

Med, 306:248-252.

CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, <http://www.cdc.gov>

CHAZAL N, Gerlier D. 2003. Virus entry, assembly, budding, and membrane rafts.

Microbiol Mol Biol Rev. Jun; 67(2):226-37. Review.

CHECROUNE F, Yao XJ, Gottlinger HG, Bergeron D, Cohen EA. 1995. Incorporation

of Vpr into human immunodeficiency virus type 1: role of conserved regions within the

P6 domain of Pr55gag. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. Sep 1; 10(1):1-7.

CHEN CH, Weinhold KJ, Barlett JA, et al. 1993. CD8 T lymphocyte-mediated inhibition

of HIV-1 long terminal repeat transcription : A novel antiviral mechanism. AIDS Res.

Hum. Retroviruses, 71:1657-1661.

CHIU HC, Wang FD, Chen YM, Wang CT. Effects of human immunodeficiency virus

type 1 transframe protein p6* mutations on viral protease-mediated Gag processing.

2006. J Gen Virol. 87(Pt 7):2041-6.

CLAVEL F, Guétard D, Brun-Vézinet F, Chamaret S, Rey MA, Santos Ferreira MO,

Laurent AG, Dauguet C, Katlama C, Rousioux C. 1986. Isolation of a new human

retrovirus from West African patients with AIDS. Science, 233:343-346.

COFFIN JM, Haase A, Levy JA, et al. 1986. Human immunodeficiency viruses [letter].

Science, 232:697.

COHEN EA, Dehni G, Sodroski JG, et al. 1990. Human immunodeficiency virus vpr

product is a virion-associated regulatory protein. J. Virol., 64:3097-3099.

COLGROVE RC, Millet A, Bauer GR, Pitt J, Welles SL. Gag-p6 Tsg101 binding site

duplications in maternal-infant HIV infection. 2005. AIDS Res Hum Retroviruses.

21(3):191-9.

COSTA LJ, Zheng YH, Sabotic J, Mak J, Fackler OT, Peterlin BM. 2004. Nef binds p6*

in GagPol during replication of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol.,

78(10):5311-23.

CRAVEN RC, Harty RN, Paragas J, Palese P,Wills JW. 1999. Late domain function

identified in the vesicular stomatitis virus M protein by use of rhabdovirus-retrovirus

chimeras. J.Virol., 73:3359–65.

CULLEN BR. 1991. Regulation of HIV-1 gene expression. FASEB J., 5:2361-2368.

DAIDS Virology Manual for HIV Laboratories. 1997. Division of AIDS, National

Institute of Allergy and Infectious Diseases. Publication NIH-97-3828. U.S. Department

of Health and Human services, Washington, D.C.

DANIEL MD, Letvin NL, King NW, Kannagi M, Sehgal PK, Hunt RD, Kanki PJ, Essex

M, Desrosiers RC.. 1985. Isolation of T-cell tropic HTLV-III-like retrovirus from

macaques. Science, 228:1201-1204.

DAYTON AI, Sodroski JG, Rosen CA, Goh WC, Haseltine WA. 1986. The trans-

activator gene of the human T cell lymphotropic virus type III is required for replication.

Cell, 44:941-947.

DAUTIN N, Karimova G, Ladant D. Human immunodeficiency virus (HIV) type 1

transframe protein can restore activity to a dimerization-deficient HIV protease variant.

2003. J. Virol., 77(15):8216-26.

DETTENHOFER M, Yu XF. 1999. Proline residues in human immunodeficiency virus

type 1 p6(Gag) exert a cell type-dependent effect on viral replication and virion

incorporation of Pol proteins. J. Virol., 73(6):4696-704.

DI MASCIO M, Markowitz M, Louie M, Hurley A, Hogan C, Simon V, Follmann D, Ho

DD, Perelson AS. 2004. Dynamics of intermittent viremia during highly active

antiretroviral therapy in patients who initiate therapy during chronic versus acute and

early human immunodeficiency virus type 1 infection. J. Virol., 78(19):10566-73.

DUMITRESCU O, Kalish ML, Kliks SC, Bandea CI, Levy JA. 1994. Characterization of

human immunodeficiency virus type 1 isolates from children in Romania: Identification

of a new envelope subtype. J. Infect. Dis., 169:281-288.

ERICKSON JW, Burt SK. 1996. Structural mechanisms of HIV drug resistance. Annu.

Rev. Pharmacol. Toxico.l, 36: 545-571.

ESPARZA J, Pattou C, Osmanov S. 2000. Establishing standards for HIV vaccines trials:

a process of international dialogue. in UNAIDS Rep.

FREED EO, Martin MA. 2001. HIVs and Their Replication. Fields Virolog. fourth

edition.

FREED EO, Ross SR. 2004. Retroviruses 2004: review of the 2004 Cold Spring Harbor

Retroviruses Conference. Retrovirology. 1(1):25.

GALLEGO O, de Mendoza C, Corral A, Soriano V. 2003. Changes in the human

immunodeficiency virus p7-p1-p6 gag gene in drug-naive and pretreated patients. J Clin

Microbiol., 41(3):1245-7.

GALLO RC, Salahuddin SZ, Popovic M, Shearer GM, Kaplan M, Haynes BF, Palker TJ,

Redfield R, Oleske J, Safai B, et al. 1984. Frequent detection and isolation of cytopathic

retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS. Science, 224:500-503.

GAO F, Bailes E, Robertson DL, Chen Y, Rodenburg CM, Michael SF, Cummins LB,

Arthur LO, Peeters M, Shaw GM, Sharp PM, Hahn BH. 1999. Origen of HIV-1 in the

chimpanzee Pan troglodytes troglodytes. Nature, 397(6718):436.

GARRUS JE, von Schwedler UK, Pornillos OW, Morham SG, Zavitz KH, Wang HE,

Wettstein DA, Stray KM, Cote M, Rich RL, Myszka DG, Sundquist WI. 2001. Tsg101

and the vacuolar protein sorting pathway are essential for HIV-1 budding. Cell,

107(1):55-65.

GARZINO-DEMO A, Devico AL, Gallo RC. 1998. Chemokine Receptors and

Chemokines in HIV Infection. J of Clin Imun., 18(4).

GERETTI AM. Clinical implications of HIV drug resistance to nucleoside and

nucleotide reverse transcriptase inhibitors. 2006. AIDS Rev., 8(4):210-20. Review

GOFF A, Ehrlich LS, Cohen SN, Carter CA. 2003 Tsg101 control of human

immunodeficiency virus type 1 Gag trafficking and release. J. Virol., 77(17):9173-82.

GOTTLIEB MS, Schroff R, Schanker H, Weisman JD, Fan PT, Wolf RA, Saxon A.

1981. Pneumocystis carinii pneumonia and mucosal candidiasis in previously healthy

homosexual men. N. Engl. J. Med., 305:1425-1430.

GOTTWEIN E, Bodem J, Muller B, Schmechel A, Zentgraf H, Krausslich HG. 2003.

The Mason-Pfizer monkey virus PPPY and PSAP motifs both contribute to virus release.

J. Virol., 77(17):9474-85.

GULICK RM. 1997. Current antiretroviral therapy: an overview. Qual Life Res.,

6(6):471-4

GUTIERREZ F, Padilla S, Masia M, Iribarren JA, Moreno S, Viciana P, Munoz L,

Sirvent JL, Vidal F, Lopez-Aldeguer J, Blanco JR, Leal M, Rodriguez-Arenas MA,

Hoyos SP. 2006. Clinical Outcome of HIV-Infected Patients with Sustained Virologic

Response to Antiretroviral Therapy: Long-Term Follow-Up of a Multicenter Cohort.

PLoS ONE. 20;1:e89.

HARADA S, Koyanagi Y, Yamamoto N. 1985. Infection of HTLV-3/LAV in HTLV-I-

carrying cells MT-2 and MT-4 and application in a plaque assay. Science 229:563-6.

HARRIGAN PR, MONTANER JS, WEGNER SA, VERBIEST W, MILLER V, WOOD

R, LARDER BA. 2001. World-wide variation in HIV-1 phenotypic susceptibility in

untreated individuals: biologically relevant values for resistance testing. AIDS. 15:1671-

HEMELAAR J, Gouws E, Ghys PD, Osmanov S. 2006. Global and regional distribution

of HIV-1 genetic subtypes and recombinants in 2004. AIDS. 20(16):W13-23.

HILL M, Tachedjian G, Mak J. The packaging and maturation of the HIV-1 Pol proteins.

2005. Curr HIV Res. 3(1):73-85. Review.

HIRSCH MS, Brun-Vezinet F, D'Aquila RT, Hammer SM, Johnson VA, Kuritzkes DR,

Loveday C, Mellors JW, Clotet B, Conway B, Demeter LM, Vella S, Jacobsen DM,

Richman DD. 2000. Atiretroviral Drug Resistance Testing in Adult HIV-1 infection:

recommendation of an Internacional ADS Society-USA Panel. JAMA, 283 (18): 2417-

2426.

HOLGUÍN A, Paxinos E, Hertogs K, Womac C, Soriano V. 2004. Impact of frequent

natural polymorphisms at the protease gene on the in vitro susceptibility to protease

inhibitors in HIV-1 non-B subtypes. J Clin Virol., 31(3):215-20.

HOLGUÍN A, Alvarez A, Soriano V. 2005. Differences in the length of gag proteins

among different HIV type 1 subtypes. AIDS Res Hum Retroviruses. 21(10):886-93.

HOLGUÍN A, Alvarez A, Soriano V. 2006. Variability in the P6gag domains of HIV-1

involved in viral budding. AIDS. 28;20(4):624-7.

HUANG M, Orenstein JM, Martin MA, Freed EO. 1995. p6Gag is required for particle

production from full-length human immunodeficiency virus type 1 molecular clones

expressing protease. J. Virol., 69(11):6810-8

HUET T, Cheynier R, Meyerhans A, Wain-Hobson S. 1990. Genetic organization of a

chipanzee lentivirus related to HIV-1. Nature, 345:356-9.

INTERNATIONAL AIDS SOCIETY, <http://www.iasusa.org>

JANSSENS W, Heyndryckx L, Fransen K, Motte J, Peeters M, Nkengasong JN, Ndumbe

PM, Delaporte E, Perret J-L, Atende C, Piot P, van der Groen G. 1994. Genetic and

phylogenetic analyses of env subtypes G and H in Central Africa. AIDS Res. Hum.

Retroviruses, 10:877-879

JAWETZ, Melnick & Adelberg. 1998. AIDS e Lentivírus Microbiologia Médica,

vigésima edição.

KATZMANN DJ, Babst M, Emr SD. 2001. Ubiquitin-dependent sorting into the

multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein

sorting complex, ESCRT-I. Cell, 106(2):145-55.

KAPLAN AH, Manchester M, Swanstrom R. 1994. The activity of the protease of

human immunodeficiency virus type 1 is initiated at the membrane of infected cells

before the release of viral proteins and is required for release to occur with maximum

efficiency. J. Virol., 68(10):6782-6.

KAMKAMIDZE G, Sullivan T & CharbonneaU T. 2001. Occurrence of HIV-1 reverse

transcriptase gene mutation at codon 215 in HIV-infected infants. J. Clin. Virol.,

22(1):143-148.

KEELE BF, Van Heuverswyn F, Li Y, Bailes E, Takehisa J, Santiago ML, Bibollet-

Ruche F, Chen Y, Wain LV, Liegeois F, Loul S, Ngole EM, Bienvenue Y, Delaporte E,

Brookfield JF, Sharp PM, Shaw GM, Peeters M, Hahn BH. 2006. Chimpanzee reservoirs

of pandemic and nonpandemic HIV-1. Science, 28;313(5786):523-6.

KOLLI M, Lastere S, Schiffer CA. 2006. Co-evolution of nelfinavir-resistant HIV-1

protease and the p1-p6 substrate. Virology, 347(2):405-9.

KONDO E, Gottlinger HG. 1996. A conserved LXXLF sequence is the major

determinant in p6gag required for the incorporation of human immunodeficiency virus

type 1 Vpr. J. Virol., 70(1):159-64

KUMAR S, Tamura K, Jakobsen IB, Nei M. 2001. MEGA2: molecular evolutionary

genetics analysis software. Bioinformatics, 17(12):1244-5.

LASTERE S, Dalban C, Collin G, Descamps D, Girard PM, Clavel F, Costagliola D,

Brun-Vezinet F; NARVAL Trial Group (ANRS 088). 2004. Impact of insertions in the

HIV-1 p6 PTAPP region on the virological response to amprenavir. Antivir Ther.

9(2):221-7.

LICATA JM, Simpson-Holley M, Wright NT, Han Z, Paragas J, Harty RN. 2003.

Overlapping motifs (PTAP and PPEY) within the Ebola virus VP40 protein function

independently as late budding domains: involvement of host proteins TSG101 and VPS-

4. J. Virol., 77:1812–19

LOUWANGIE J, McCutchan FE, Peteers M, Brennan TP, Sanders-Buell E, Eddy GA,

van der Groen G, Fransen K, GeIrshey-Damet G-M, Deleys R, Burke DS. 1993.

Comparison of gag genes from seventy international HIV-1 isolates provides evidence of

multiple genetic subtypes. AIDS, 7:769-780.

LOUWANGIE J, Janssens W, Mascola J, Heyndryckx L, Hegerich P, van der Groen G,

McCutchan FE, Burke D. 1995. Genetic diversity of the envelope glycoprotein from

human immunodeficiency virus type 1 isolates of African origin. J. Virol., 69:263-271

LU YL, Bennett RP, Wills JW, Gorelick R, Ratner L. 1995. A leucine triplet repeat

sequence (LXX)4 in p6gag is important for Vpr incorporation into human

immunodeficiency virus type 1 particles. J. Virol., 69(11):6873-9.

LUCIW PA. 1996. Human Immunodeficiency Viruses and Their Replication. Fields

Virology, third edition.

MACIAS AE, Ponce-de-Leon S. Infection control: old problems and new challenges.

2005. Arch Med Res. 36(6):637-45. Review.

MAMMANO F, Petit C, Clavel F. 1998. Resistance-associated loss of viral fitness in

human immunodeficiency virus type 1: phenotypic analysis of protease and gag

coevolution in protease inhibitor-treated patients. J. Virol., 72(9):7632-7.

MANN JM, Tarantola DJM, Netter TW. 1992. AIDS in the world. Cambridge, MA:

Harvard University Press.

MANSKY LM, Rouzic EL, Benichou S and Gajary L. 2003. Influence of reverse

transcriptase variants, drugs, and Vpr on human immunodeficiency virus type 1 mutant

frequencies. J. Virol., 77(3):2071-80.

MARLOWE N, Flys T, Hackett J Jr, Schumaker M, Jackson JB, Eshleman SH. 2004.

HIV Prevention Trials Network; Adult AIDS Clinical Trials Groups. Analysis of

insertions and deletions in the gag p6 region of diverse HIV type 1 strains. AIDS Res

Hum Retroviruses. 20(10):1119-25

MARTIN-SERRANO J, Zang T, Bieniasz PD. 2001. HIV-1 and Ebola virus encode

small peptide motifs that recruit Tsg101 to sites of particle assembly to facilitate egress.

Nat Med., 7(12):1313-9.

MARTIN-SERRANO J, Bieniasz PD. 2003. A bipartite late-budding domain in human

immunodeficiency virus type 1. J.Virol., 77(22):12373-7.

MARTIN-SERRANO J, Perez-Caballero D, Bieniasz PD. 2004. Context-dependent

effects of L domains and ubiquitination on viral budding. J. Virol., 78(11):5554-63.

MAZZE FM, Degreve L. 2006. The role of viral and cellular proteins in the budding of

human immunodeficiency virus. Acta Virol. 50(2):75-85. Review.

DE MENDOZA C, Gallego O, Soriano V. 2002. Mechanisms of resistance to

antiretroviral drugs--clinical implications. AIDS Rev., 4(2):64-82. Review.

MINISTÉRIO DA SAÚDE DO BRASIL, Programa Nacional de DST/AIDS. 1999.

Boletim Epidemiológico.

MINISTÉRIO DA SAÚDE DO BRASIL, Programa Nacional de DST/AIDS. 1999. A

Infecção pelo HIV em crianças - guia de tratamento clínico.

MINISTÉRIO DA SAÚDE DO BRASIL, Programa Nacional de DST/AIDS. 2000. Guia

de tratamento clínico da infecção pelo HIV em crianças.

MINISTÉRIO DA SAÚDE DO BRASIL, Programa Nacional de DST/AIDS. 2002/2003.

Recomendações para terapia anti-retroviral em adultos e adolescents infectados pelo

HIV-1.

MINISTÉRIO DA SAÚDE DO BRASIL, Programa Nacional de DST/AIDS. 2006.

Boletim Epidemiológico.

MORITA E, Sundquist WI. 2004. Retrovirus budding. Annu Rev Cell Dev Biol., 20:395-

425.

MÜLLER B, Patschinsky T, Krausslich HG. 2002. The late-domain-containing protein

p6 is the predominant phosphoprotein of human immunodeficiency virus type 1 particles.

J. Virol., 76(3):1015-24.

MUNSHI UM, Kim J, Nagashima K, Hurley JH, Freed EO. 2007. An Alix fragment

potently inhibits HIV-1 budding: Characterization of binding to retroviral YPXL late

domains. J Biol Chem. 282(6):3847-55.

MYERS G, Korber BTM, Smith RF, Berzofski JA, Pavlakis GN. 1994. Theoretical

Biology and Biophysics, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. Human

Retroviruses and AIDS.

MYERS G. 1994. HIV: between past and future. AIDS Res. Hum. Retroviruses, 10:1317-

24.

NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION

<http://www.ncbi.nlm.nih.gov>

NERMUT MV, Grief C, Hashimi, Hockley DJ. 1993. Further evidence of icosahedral

symmetry in human immunodeficiency virus. AIDS Res Hum Retroviruses, 9:929-938.

NGUYEN DG, Booth A, Gould SJ, Hildreth JE. 2003. Evidence that HIV budding in

primary macrophages occurs through the exosome release pathway. J. Biol. Chem.

278:52347–54.

NGUYEN DH, Hildreth JE. 2000. Evidence for budding of human immunodeficiency

virus type 1 selectively from glycolipid-enriched membrane lipid rafts. J. Virol.,

74:3264–72.

NKENGASONG JN, Janssens W, Heyndrickx L, Fransen K, Ndumbe PM, Motte J,

Leonaers A, Ngolle M, Ayuk J, Piot P, van der Groen G. 1994. Genotypic subtypes of

HIV-1 in Cameroon. AIDS, 8:1405-12.

ONO A, Freed EO. 2001. Plasma membrane rafts play a critical role in HIV-1 assembly

and release. Proc Natl Acad Sci U S A, 98(24):13925-30.

ONO A, Freed EO . 2004. Cell-type-dependent targeting of human immunodeficiency

virus type 1 assembly to the plasma membrane and the multivesicular body. J. Virol.,

78(3):1552-63.

OTT DE, Coren LV, Copeland TD, Kane BP, Johnson DG, Sowder RC 2nd, Yoshinaka

Y, Oroszlan S, Arthur LO, Henderson LE. 1998. Ubiquitin is covalently attached to the

p6Gag proteins of human immunodeficiency virus type 1 and simian immunodeficiency

virus and to the p12Gag protein of Moloney murine leukemia virus. J. Virol., 72(4):2962-

OTT DE, Coren LV, Chertova EN, Gagliardi TD, Schubert U. 2000. Ubiquitination of

HIV-1 and MuLV Gag. Virology, 278(1):111-21.

OTT DE, Coren LV, Gagliardi TD, Nagashima K. 2005. Heterologous late-domain

sequences have various abilities to promote budding of human immunodeficiency virus

type 1. J. Virol., 79(14):9038-45.

OSLEN HS, Rosen CA. 1992. Contribution of the TATA motif to Tat-mediated

transcriptional activation of human immunodeficiency virus gene expression. Journal of

Virology, 66:5594-5597.

OSMANOV S, Heyward WL, Esparza J. 1994. The World Health Organization Network

for HIV Isolation and Characterization: summary of a pilot study.

AIDS Res Hum Retroviruses. 10(11):1325-6.

OSMANOV S, Heyward WL, Esparza J. 1995. HIV-1 Genetic Variability: Implications

for the Development of HIV Vaccines and Gene Therapy in AIDS. In report:

International Workshop. Naples.

OSMANOV S, Pattou C, Walker N, Schwardlander B, Esparza J; WHO-UNAIDS

Network for HIV Isolation and Characterization. 2002. Estimated global distribution and

regional spread of HIV-1 genetic subtypes in the year 2000. J Acquir Immune Defic

Syndr. 29(2):184-90.

PAGE KA, Liegler T, Feinberg MB. 1997. Use of a green fluorescent protein as a marker

for human immunodeficiency virus type 1 infection. AIDS Res Hum Retroviruses.

13(13):1077-81.

PARENT LJ, Bennett RP, Craven RC, Nelle TD, Krishna NK, Bowzard JB, Wilson CB,

Puffer BA, Montelaro RC, Wills JW. 1995. Positionally independent and exchangeable

late budding functions of the Rous sarcoma virus and human immunodeficiency virus

Gag proteins. J. Virol., 69:5455–60.

PATNAIK A, Chau V, Wills JW. 2000. Ubiquitin is part of the retrovirus budding

machinery. Proc Natl Acad Sci U S A, 97(24):13069-74.

PAULUS C, Ludwig C, Wagner R. 2004. Contribution of the Gag-Pol transframe

domain p6* and its coding sequence to morphogenesis and replication of human

immunodeficiency virus type 1. Virology, 330(1):271-83.

PAULUS C Paulus C, Hellebrand S, Tessmer U, Wolf H, Krausslich HG, Wagner R.

1999. Competitive inhibition of human immunodeficiency virus type-1 protease by the

Gag-Pol transframe protein. J Biol Chem., 274(31):21539-43.

PETERS S, Munoz M, Yerly S, Sanchez-Merino V, Lopez-Galindez C, Perrin L, Larder

B, Cmarko D, Fakan S, Meylan P, Telenti A. 2001. Resistance to nucleoside analog

reverse transcriptase inhibitors mediated by human immunodeficiency virus type 1 p6

protein. J. Virol., 75(20):9644-53.

PILLAY D, Taylor S, Richaman DD. 2000. Incidence and impact of resistance against

approved antiretroviral drugs. Rev. Med. Virol., 10(4): 231-53.

PORNILLOS O, Alam SL, Davis DR, Sundquist WI. 2002. Structure of the Tsg101 UEV

domain in complex with the PTAP motif of the HIV-1 p6 protein. Nat Struct Biol.,

9(11):812-7.

PORNILLOS O, Higginson DS, Stray KM, Fisher RD, Garrus JE, Payne M, He GP,

Wang HE, Morham SG, Sundquist WI. 2003. HIV Gag mimics the Tsg101-recruiting

activity of the human Hrs protein. J Cell Biol., 162(3):425-34.

RABSON AB, Martin MA. 1985. Molecular organization of the AIDS retrovirus. Cell,

40:477-80.

RAIBORG C, Rusten TE, Stenmark H. 2003. Protein sorting into multivesicular

endosomes. Curr Opin Cell Biol., 15(4):446-55. Review.

ROBERTS JD, Bebenek K, Kunkel TA. 1988. The accuracy of reverse transcriptase

from HIV-1.Science, 242(4882):1171-3.

ROBERTSON DL., SHARP PM, McCutchan FE, Hahn BH. 1995. Recombination in

HIV-1. Nature, 374: 124.

SAKAGUCHI K, Zambrano N, Baldwin ET, Shapiro BA, Erickson JW, Omichinski JG,

Clore GM, Gronenborn AM, Appella E. 1993. Identification of a binding site for the

human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

90:5219-23.

SALIBA G, Yeni P. 2006. Recent and future therapeutic advances in the management of

HIV infection. Pathol Biol., 10:545-50. Review.

SARMATI L, Nicastri E, Uccella I, D'Ettorre G, Parisi SG, Palmisano L, Galluzzo C,

Concia E, Vullo V, Vella S, Andreoni M. 2003. Drug-associated resistance mutations in

plasma and peripheral blood mononuclear cells of human immunodeficiency virus type

1-infected patients for whom highly active antiretroviral therapy is failing. J. Clin.

Microbiol., 41(4):1760-2.

SHAFER RW, Chuang TK, Hsu P, White CB, Katzenstein DA. 1999 Sequence and drug

susceptibility of subtype C protease from human immunodeficiency virus type 1

seroconverters in Zimbabwe. AIDS Res Hum Retroviruses, 15(1):65-9.

SHAFER RW, Vuitton DA. 1999. Highly active antiretroviral therapy (HAART) for the

treatment of infection with human immunodeficiency virus type 1. Biomed

Pharmacother., 53(2):73-86. Review.

SHEHU-XILAGA M, Crowe SM, Mak J. 2001. Maintenance of the Gag/Gag-Pol Ratio

is important for Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA Dimerization and Viral

Infectivity. J. Virol., 75(4) 1834-41.

SIMON F, Mauclere P, Roques P, Loussert-Ajaka I, Muller-Trutwin MC, Saragosti S,

Georges-Courbot MC, Barre-Sinoussi F, Brun-Vezinet F. 1998. Identification of a new

human immunodeficiency virus type 1 distinct from group M and group O. Nat .Med.,

4:1032-37.

STRACK B, A Calistri MA, Accola G, Palu, Gottlinger HG. 2000. A role for ubiquitin

ligase recruitment in retrovirus release. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13063–68.

STRACK B, Calistri A, Gottlinger HG. 2002. Late assembly domain function can exhibit

context dependence and involves ubiquitin residues implicated in endocytosis. J. Virol.,

76:5472–79.

STRACK B, Calistri A, Craig S, Popova E, Gottlinger HG. 2003. AIP1/ALIX is a

binding partner for HIV-1 p6 and EIAV p9 functioning in virus budding. Cell, 114:689–

99.

STUCHELL MD, Garrus JE, Muller B, Stray KM, Ghaffarian S, McKinnon R,

Krausslich HG, Morham SG, Sundquist WI. 2004. The human endosomal sorting

complex required for transport (ESCRT-I) and its role in HIV-1 budding. J Biol Chem.,

279(34):36059-71.

STYS D, Blaha I, Strop P. 1993. Structural and functional studies in vitro on the p6

protein from the HIV-1 gag open reading frame. Biochim Biophys Acta., 1182(2):157-

61.

SUZUKI YOSHIYUKI, Yamaguchi-Kabata Y and Gojobori T. 2000. Nucleotide

Substitution Rates of HIV-1. AIDS Rev., 2:39-47.

TAMIYA S, Mardy S, Kavlick MF, Yoshimura K, Mistuya H. 2004. Amino acid

insertions near Gag cleavage sites restore the otherwise compromised replication of

human immunodeficiency virus type 1 variants resistant to protease inhibitors. J. Virol.,

78(21):12030-40.

UNAIDS/WHO. 2002. AIDS epidemic update

UNAIDS/WHO. 2005. AIDS epidemic update.

VAN MAELE B, Busschots K, Vandekerckhove L, Christ F, Debyser Z. 2006. Cellular

co-factors of HIV-1 integration. Trends Biochem Sci. 31(2):98-105. Review.

VALLE-BAHENA OM, Ramos-Jimenez J, Ortiz-Lopez R, Revol A, Lugo-Trampe A,

Barrera-Saldana HA, Rojas-Martinez A. 2006. Frequency of protease and reverse

transcriptase drug resistance mutations in naive HIV-infected patients. Arch Med Res.

37(8):1022-7.

VELLA S, Palmisano L. 2000. Antiretroviral therapy: state of the HAART. Antiviral

Res., 45(1):1-7. Review.

VERPLANK L, Bouamr F, LaGrassa TJ, Agresta B, Kikonyogo A, Leis J, Carter CA.

2001. Tsg101, a homologue of ubiquitin-conjugating (E2) enzymes, binds the L domain

in HIV type 1 Pr55(Gag). Proc Natl Acad Sci U S A, 98(14):7724-9.

VON SCHWEDLER UK, Stuchell M, Muller B, Ward DM, Chung HY, Morita E, Wang

HE, Davis T, He GP, Cimbora DM, Scott A, Krausslich HG, Kaplan J, Morham SG,

Sundquist WI. 2003. The protein network of HIV budding. Cell., 114(6):701-13.

WAIN-HEBSON S, Vartanian JP, Henry M, Chenciner N, Cheynier R, Delassus S,

Martins LP, Sala M, Nugeyre MT, Guetard D. 1991. LAV revisited: origins of the early

HIV isolates from Institute Pasteur. Science, 252:961-5.

WEISS S, König B, Müller H-J, Seidel H, Goody RS. 1992. Synthetic human tRNAlys3

and natural bovine tRNAlys interact with HIV-1 reverse transcriptase and serve as

specific primers for retroviral cDNA synthesis. Gene, 111:183-97.

WHITEHURST N, Chappey C, Petropoulos C, Parkin N, Gamarnik A. 2003.

Polymorphisms in p1-p6/p6* of HIV type 1 can delay protease autoprocessing and

increase drug susceptibility. AIDS Res Hum Retroviruses, 19(9):779-84.

WHO NETWORK for HIV Isolation and Characterization. 1994. HIV type 1 variation in

World Health Organization-sponsored vaccine evaluation sites: genetic screening,

sequence analysis, and preliminary biological characterization of selected virus strains.

AIDS Res. Hum. Retroviruses, 10:1327-1343.

WILLS JW, Cameron CE, Wilson CB, Xiang Y, Bennett RP, Leis J. 1994. An assembly

domain of the Rous sarcoma virus Gag protein required late in budding. J. Virol.,

68:6605–18.

WILFLINGSEDER D, Stoiber H. 2007. Float on: lipid rafts in the lifecycle of HIV.

Front Biosci., 1(12)2124-35.

WU L, KewalRamani VN. 2006. Dendritic-cell interactions with HIV: infection and viral

dissemination. Nat Rev Immunol., 6(11):859-68.

YARCHOAN R, Klecker RW, Weinhold KJ, Markham PD, Lyerly HK, Durack DT,

Gelmann E, Lehrman SN, Blum RM, Barry DW, et al. 1986 Administration of 3'-azido-

3'-deoxythymidine, an inhibitor of HTLV-III/LAV replication, to patients with AIDS or

AIDS-related complex. Lancet, 1(8481):575-80.

YUAN B, Campbell S, Bacharach E, Rein A, Goff SP. 2000. Infectivity of moloney

murine leukemia virus defective in late assembly events is restored by late assembly

domains of other retroviruses. J. Virol., 74:7250–60.

ZACK JA, Arrigo SJ, Weitsman SR, et al. 1990. HIV-1 entry into quiescent primary

lymphocytes: Molecular analysis reveals a labile, latent viral structure. Cell, 61:213-22.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 