ads:
Ca
r
Dis
s
M
edi
d
o
r
acteriza
ç
co
m
s
ertação
ca da U
n
o
s requi
s
Unive
r
I
n
s
ç
ão estru
m
ênfase
n
Orient
a
de Dou
t
n
iversid
a
s
itos par
a
r
sidade F
s
tituto d
e
tural do
c
n
o meca
n
a
dor: Pr
M
ônica
S
t
orado a
p
a
de Fede
a
obtenç
ã
ederal d
o
e
Bioquí
m
c
iclo re
p
n
ismo de
of. Jers
o
S
antos
d
p
resenta
d
ral do R
i
ã
o do gr
a
200
o
Rio de
m
ica Mé
d
p
licativo
d
fusão d
e
o
n Lima
d
d
e Freita
s
d
a ao In
s
i
o de Ja
n
a
u de D
o
7
Janeiro
d
ica
d
e vírus
e
membr
a
d
a Silva
s
s
tituto d
e
n
eiro (U
F
o
utora e
m
envelop
a
a
nas.
e
Bioquí
m
F
RJ) co
m
m
Ciênci
a
a
dos
m
ica
m
o um
a
s.
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
Mônica Santos de Freitas
Caracterização estrutural do ciclo replicativo de
vírus envelopados com ênfase no mecanismo
de fusão de membranas
Número de volumes: 1
Dissertação de Doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Química
Biológica, Instituto de Bioquímica Médica,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
parte dos requisitos necessários à obtenção do
título de Doutor em Ciências.
Orientador: Jerson Lima da Silva
Rio de Janeiro
2007
ads:
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Freitas, Mônica Santos de
Caracterização estrutural do ciclo replicativo de vírus envelopados
com ênfase no mecanismo de fusão de membranas / Mônica Santos de
Freitas. Rio de Janeiro: UFRJ/ IBqM, 2007
xix, 196 f.: il.
Orientador: Jerson Lima da Silva
Dissertação de Doutorado- UFRJ/ Instituto de Bioquímica Médica/
Programa de Pós- Graduação em Química Biológica
Referências Bibliográficas: f. 152- 169
1. Alfavírus. 2. Filovírus. 3. Estado ativo de fusão. 4. Espectroscopia
de fluorescência. 5. Ressonância Magnética Nuclear. I. Silva, Jerson
Lima da. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de
Bioquímica Médica, Programa de Pós- graduação em Química
Biológica. III. Título.
iv
O trabalho experimental desta tese foi realizado no Laboratório de Termodinâmica de
Proteínas e Estruturas Virais Gregório Weber, do Programa de Biologia Estrutural e no
Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear de Macromoléculas Jiri Jonas, do
Instituto de Bioquímica Médica do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, sob a orientação do Prof. Jerson Lima da Silva, com recursos do Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Instituto Milênio para
Biologia Estrutural em Biomedicina e Biotecnologia (Programa Milênio- CNPq), Fundação
Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Rede
Nacional de Biologia Molecular Estrutural, Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) do
Brasil, e pelo the International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB)
para o Dr. Jerson. Lima da Silva.
v
Mônica Santos de Freitas
Caracterização estrutural do ciclo replicativo de vírus envelopados com
ênfase no mecanismo de fusão de membranas.
Tese submetida ao corpo docente do Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal
do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutora em
Química Biológica.
Orientador:
- Dr. Jerson Lima da Silva
Doutor em 1983, pela Universidade Federal do Rio de Janeiro
Prof. Titular- Instituto de Bioquímica Médica/ UFRJ
Revisor:
- Dr. Fábio Ceneviva Lacerda de Almeida
Doutor em 1994,pela Universidade de São Paulo
Prof. Adjunto- Instituto de Bioquímica Médica- UFRJ)
Membros Titulares da Banca:
- Dra. Ana Carolina Zeri
Doutora em 2003, pela University of California, San Diego
Pesquisadora- Laboratório Nacional de Luz Sincrotron
- Dr. Igor Polikarpov
Doutor em 1993, pela Max Planck Gesselschaft
Prof. Titular-Instituto de Física de São Carlos/ USP
- Dra. Russolina Beneta Zingali
Doutora em 1993, pela Universidade Federal do Rio de Janeiro
Profa. Adjunta- Instituto de Bioquímica Médica/ UFRJ
Membros Suplentes da Banca:
- Dr. Luis Maurício Trambaioli da Rocha e Lima
Doutor 2001, pela Universidade Federal do Rio de Janeiro
Prof. Adjunto- Faculdade de Farmácia/ UFRJ
- Dr. Fábio Ceneviva Lacerda de Almeida
Doutor em 1994, pela Universidade de São Paulo
Prof. Adjunto- Instituto de Bioquímica Médica/ UFRJ
vi
À minha família
Aos meus pais:
Jorge Carvalho de Freitas
Marina Santos de Freitas
Aos meus irmãos:
Carlos Alberto Santos de Freitas
Márcia Santos de Freitas
Verônica Santos de Freitas
vii
Agradecimentos
Este é um momento muito importante para mim, pois sem a ajuda das pessoas, aqui
mencionadas, nada teria sido possível. Muitas delas eu não conseguiria agradecer só com
palavras, mas aqui deixo registrada a minha eterna gratidão. Muito obrigada.
W Não poderia deixar de agradecer a Deus, por me dar saúde e força para superar momentos
difíceis, e ao mesmo tempo poder curtir os lindos momentos que a vida tem me
proporcionado.
W Agradeço aos meus pais por serem exatamente como eu gostaria que fossem. Agradeço ao
meu pai por sempre esta disponível para me buscar não importa se for de tarde, de noite ou de
madrugada, ele sempre está lá. A minha mãe pelo seu enorme carinho diário, por sua atenção,
pelos seus conselhos, por ser a minha querida e amável mãe. Ao meu irmão Carlos Alberto
que me deu a felicidade de ter um sobrinho cheio de saúde, alegre, esperto e muito fofo. A
minha irmã Verônica que mesmo com nossas diferenças de humor sempre tivemos a nossa
linguagem especial, gosto muito de você. A minha querida irmã Márcia de quem sinto muita
falta, de quem lembro todos os dias, de quem gostaria de ter ao meu lado. Obrigada pelos
momentos que passamos juntas, e por seus ensinamentos, nunca te esquecerei minha irmã
querida.
W Ao prof. Jerson, por sua bondade, generosidade, pela liberdade que sempre me deu para
que eu pudesse desenvolver os projetos. Pela confiança e por acreditar em mim. Muito
obrigada. A minha passagem por seu laboratório será um aprendizado que levarei por toda a
minha vida.
W A profa Débora, sempre atenciosa, disposta a ajudar. Agradeço por todas as vezes que pedi
conselhos científicos e a senhora prontamente me ajudou. Agradeço também pela confiança e
por acreditar na minha competência profissional.
W A Luciane Pinto Gaspar, que não participou diretamente da minha tese de doutorado, mas
que contribui para a formação da pesquisadora que sou hoje. Muito obrigada.
viii
W Ao meu aluno de iniciação científica, Guilherme Augusto Piedade de Oliveira. Tenho
muito orgulho de ser sua co-orientadora. Você é o tipo de aluno que dá gosto ensinar. A sua
vontade de aprender e a sua felicidade ao trabalhar te guiarão para um futuro brilhante.
Obrigada por me ajudar no projeto do vírus Mayaro e por ser tão dedicado em todos os
projetos em que trabalha.
W A Karinne, com o seu jeito mineiro de ser. No início pedia a tradução de tudo que ela
falava, pois não entendia nada. Agora ela já fala igual carioca. Obrigada, por me mostrar que
na vida temos que superar as dificuldades. Por sua bondade, amizade e pelas nossas conversas
que faziam e fazem os momentos de descanso serem bem divertidos. O nosso tão famoso
Capuccino com chocolate. Muito obrigada por tudo.
W A minha aluna Susanna, que mesmo com toda a sua indecisão, que me deixa muito aflita,
tem me ajudado muito com a clonagem, expressão, purificação e caracterização da proteína M
do vírus Dengue. Você me dá muitos sustos ao longo do dia, mas também me faz rir inúmeras
vezes, fazendo o meu dia muito mais divertido. Nunca se esqueça dos seus sonhos, pois o
tempo não para.
W Ao prof. Fabio que sempre esteve disponível para me ajudar com os programas de RMN,
com minhas dúvida teóricas e com protocolos experimentais. Muito obrigada.
W A profa Ana Paula pela ajuda na RMN. Por sempre esta disposta a conversar sobre algum
experimento. Muito obrigada.
W Aos membros da banca, Ana Carolina Zeri, Igor Polikarpov, Russolina Zingali, Luis
Maurício Trambaioli e Fábio Almeida, por aceitarem participar deste momento tão importante
para mim.
W Ao prof. Ronaldo Mohana Borges, pelas conversas que sempre me fizeram pensar e
aperfeiçoar algum protocolo. Por sua generosidade em fornecer qualquer material que eu
estivesse precisando para desenvolver os meus projetos. Pela pronta disposição de me
ix
emprestar às chaves de seu laboratório para que eu pudesse realizar alguns ensaios. Muito
obrigada, aprendi muito ao seu lado.
W Ao Cristian Follmer por ser um colaborador excepcional. Conseguiu todos os equipamentos
que eu precisa utilizar em tempo record. Obrigada também por nossas conversas na hora do
almoço. Muito obrigado por tudo.
W Ao Francisco (Chico-Ronaldo) por sempre me receber de braços abertos, com um sorriso
maravilhoso, e sempre pronto a me ajudar. Muito obrigada.
W Ao Francisco Gomes (Chico-NMR) pela sua paciência, por toda ajuda que me forneceu na
estação de trabalho do centro nacional de ressonância magnética nuclear. Muito obrigada.
W Ao Dr. Marcius Almeida por me ajudar com NMR quando precisei. Por sua atenção e boa
vontade em me ajudar.
W A Caratina Myamoto, por todas sua ajuda na biologia molecular. Pelas nossas conversas
que sempre me fizeram pensar bastante, e que me trouxeram grandes idéias. Muito obrigado
por sua simpatia e por sua contagiante alegria.
W Ao Emerson, que sempre acreditou no meu potencial, sempre me ajudou e que muito
contribuiu para a realização desta tese. Muito obrigada.
W Carlos, por sempre me fornecer células e por ser este aluno brilhante, trabalhador e assim
como o Guilherme desempenhando seu trabalho com um enorme amor a ciência.
W A Ana Paula Diniz pelos momentos de descontração. Por sua amizade e por toda ajuda.
W A Yanina, por todas as palavras de incentivo. Por ser uma pessoa super legal e sempre para
frente. Obrigada.
W A profa. Martha Sorenson pela ajuda na correção dos artigos 1 e 3. Muito obrigada.
x
W A Roseany Freitas por sua competência e por toda ajuda.
W A profa. Maria Lúcia Bianconi, por me ensinar a mexer no calorímetro. Por tirar as minhas
dúvidas nos sistemas complexos que eu levava para estudar no equipamento. Muito obrigada.
W A Juliana Cortines, uma grande pessoa, um formidável coração. As inúmeras caronas, as
conversas, o prazer em desenvolvermos projetos juntas, os estímulos diários, nunca irei
esquecer desta pessoa tão especial. Como estou escrevendo este agradecimento no dia do seu
aniversário, não poderia deixar de te desejar muita saúde, paz e amor. Muito obrigada por
tudo.
W A Carolina Braga por ser uma pessoa muito gentil, pelas ajudas sempre que o HPLC dava
algum problema, por sempre esta disposta a me ajudar. Muito obrigada.
W A Lenize por me ensinar a utilizar os programas de RMN e por toda atenção a mim
dispensada. Obrigada.
W Ao Leonardo por sempre esta melhorando a qualidade de trabalho no laboratório, pelas
ajudas na manutenção do dicroísmo circular, por sempre me ajudar. Obrigada.
W A Yraima, uma pesquisadora fantástica, que topou em submeter meu projeto para o LNLS
e foi gentilmente até as instalações realizar os ensaios comigo e com a minha aluna Susanna.
Obrigada também por suas palavras sempre gentis. Muito obrigada.
W Ao Ivanildo por me ensinar a mexer no microscópio de fluorescência.
W A Mariana, aluna da profa. Bianconi, por sempre esta disposta a me ajudar no calorímetro.
W A profa. Geórgia por aceitar colaborar na determinação lipídica dos “lipid rafts”. Obrigada.
W A Aninha e a Patrícia do espectrômetro de massa, por sempre estarem dispostas a lerem as
minhas amostras e a me ensinar analisar os meus dados.
xi
W Ao Carlos, aluno das profas Lina e Débora, por me indicar o Maldi Tof Tof que para mim
foi super importante.
W A todos do LTPV, que com certeza cada um contribuiu para a realização desta tese.
W A todos do LAPA, que com certeza cada um contribuiu para a realização desta tese.
W A todos do laboratório do prof. Vivaldo, por me permitirem utilizar o microscópio de
fluorescência.
W A todos do CNRMN por toda ajuda na estação de trabalho.
W A Suzy por sua felicidade, lealdade e por sempre me deixar feliz.
xii
RESUMO
Freitas, Mônica Santos de. Caracterização estrutural do ciclo replicativo de vírus
envelopados com ênfase no mecanismo de fusão de membranas. Tese (Doutorado em
Ciências)- Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de
Janeiro, 2007.
A compreensão do ciclo replicativo de vírus envelopados tem sido de grande
importância para o desenvolvimento de estratégias antivirais, que poderiam melhorar a
qualidade de vida da população. Nesta tese, utilizamos como modelos experimentais, o vírus
Mayaro e o peptídeo de fusão do vírus Ebola. Como o ciclo replicativo viral apresenta
inúmeras etapas, escolhemos como alvo de estudo a entrada do vírus na célula, dando ênfase
no mecanismo de fusão de membranas. Nesta tese foi possível acompanhar as alterações
estruturais envolvidas na aquisição do estado ativo de fusão do vírus Mayaro e isolar a
conformação específica viral que interage com a membrana da célula alvo. Além disso, à alta
pressão hidrostática foi possível inativar parcialmente partículas virais sem alterar a
capacidade de suscitar resposta imunológica, tornando-se um atrativo para o desenvolvimento
de vacinas antivirais. Além disto, os nossos estudos com o peptídeo de fusão do vírus Ebola,
nos forneceram a estrutura tridimensional desta região da proteína de fusão viral na presença
de um modelo mimético de membrana, as micelas de SDS. Em adição, nos forneceu
importantes informações acerca dos resíduos envolvidos na interação com membranas
biológicas, apontando a interação aromático-aromático como responsável pelo ganho de
estrutura helicoidal durante esta interação. Contudo, de forma bastante inovadora, possibilitou
a efetiva correlação entre fusão de membranas e lipid rafts. Como existe uma grande
discussão quanto ao modo de entrada do Ebola na célula, os nossos dados parecem suportar a
hipótese de que dois caminhos poderiam ser seguidos pelo vírus no início da infecção. Uma
delas seria via endocitose com dependência do baixo pH, e a outra sugerida nesta tese, é a
endocitose envolvendo caveolas e lipid rafts, independente de pH.
xiii
ABSTRACT
Freitas, Mônica Santos de. Caracterização estrutural do ciclo replicativo de vírus
envelopados com ênfase no mecanismo de fusão de membranas. Tese (Doutorado em
Ciências)- Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de
Janeiro, 2007.
The knowledge about enveloped virus replication cycle has been of wide importance
for antiviral strategies, that could to improve the quality of life of the population. In this
thesis, we use Mayaro virus and Ebola fusion peptide as experimental models. As there are
several steps in the virus life cycle, we chose as a target of our studies the virus entry into
cells, with emphasis in the membrane fusion mechanism. In this thesis, it was possible to
follow structural changes involved in the acquisition of the fusion active state of Mayaro virus
and isolate the specific conformation that binding to target cell. Moreover, the high
hydrostatic pressure induced partial virus inactivation without changes its capacity to activate
immunological functions. Then, high hydrostatic pressure is an attractive to development of
antiviral vaccines. Besides, our studies with Ebola fusion peptide allowed us to solve its three
dimensional structure in the presence of membrane models, such as SDS micelles. In addition,
the data showed us important information about residues involved in peptide- membrane
interaction, and pointed out the aromatic-aromatic interaction as responsible for helical gain
during this interaction. However, innovative data allowed us an effective correlation between
membrane fusion and lipid rafts. Because of a wide discussion about the way in which Ebola
virus enters into cells, our data support the hypothesis that two ways could be followed by
virus at the beginning of infection. The first one, would be an endocytose way pH dependent
and the second one an endocytosis, involving caveolae and lipid rafts, in a pH independent
way.
xiv
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. ESQUEMA DA SIMETRIA ICOSAÉDRICA PRESENTE NOS VÍRUS. ............................................................ 3
F
IGURA 2. ESTRUTURA DOS ALFAVÍRUS OBTIDA POR CRIOMICROSCOPIA ELETRÔNICA. .................................... 6
F
IGURA 3. CICLO INFECCIOSO DOS ALFAVÍRUS. ................................................................................................... 7
F
IGURA 4. ESQUEMA DO PROCESSO DE TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO DO ARN 49S (+) DOS ALFAVÍRUS. ............ 8
F
IGURA 5. PRODUÇÃO DAS GLICOPROTEÍNAS E1 E E2. ...................................................................................... 10
F
IGURA 6. MORFOLOGIAS DO VÍRUS EBOLA. ...................................................................................................... 12
F
IGURA 7. DESENHO ESQUEMÁTICO DO CICLO REPLICATIVO DOS FILOVÍRUS. ................................................. 14
F
IGURA 8. ESTRUTURAS DOS GENOMAS DOS FILOVÍRUS. ................................................................................... 15
F
IGURA 9. ESQUEMA DO LOCAL DE CLIVAGEM DA GP DOS DIFERENTES SUBTIPOS DE VÍRUS EBOLA. ............. 17
F
IGURA 10. ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO DOS VÍRUS CLASSE I. ......................................................... 20
F
IGURA 11. MECANISMO DE FUSÃO VIRAL. ......................................................................................................... 22
F
IGURA 12. ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO DOS VÍRUS CLASSE II. ....................................................... 24
F
IGURA 13. MUDANÇA CONFORMACIONAL NA ESPÍCULA VIRAL. ....................................................................... 25
F
IGURA 14. DOMÍNIOS DO PEPTÍDEO DE FUSÃO EM VÍRUS ENVELOPADOS. ........................................................ 26
F
IGURA 15. MODELO DA REGIÃO CARBOXI-TERMINAL DO DOMÍNIO TRANSMEMBRANA DO VÍRUS EBOLA. .. 152
xv
Abreviaturas
* ADN Ácido desoxiribonucléico
* ATCC “American Type Culture Collection”
* ARNm Ácido Ribonucléico Mensageiro
* Bis-ANS Bis-1,8 anilino-naftaleno-sulfonato
* BHK-21 “Baby Hamster Kidney Cells”, linhagem 21
* C Proteína capsídica
* CMC Carboximetilcelulose
* CO
2
Dióxido de Carbono
* DC Dicroísmo Circular
* DMEM “Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium”
* DMSO Dimetil Sulfóxido
* E1, E2 e E3 Glicoproteínas estruturais
* EDTA Ácido Etilenodiamino Tetracético
* F1 e F2 Glicoproteínas dos vírus parainfluenza
* GP ou gp Glicoproteínas
* HA1 e HA2 Hemaglutininas 1 e 2 do vírus da Influenza
* HIV Vírus da imuno deficiência humana
* HNE Tampão composto por HEPES, NaCl e EDTA
* m.o.i. multiplicidade de infecção
* MoMLV Vírus moloney de leucemia de murinos
* NaCl Cloreto de Sódio
* nsP1, nsP2, nsP3 e nsP4 Proteínas não estruturais
xvi
* nt nucleotídeos
* p Pressão
* P123 e P1234 Poliproteínas precursoras das proteínas não estruturais
* p130 Poliproteína precursora das proteínas estruturais
* PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
* PE2 Proteína precursora de E2 e E3
* PEG Poli Etileno Glicol
* PSA Persulfato de Amônio
* RE Retículo Endoplasmático
* SDS Dodecil Sulfato de Sódio
* SIV Vírus da imuno deficiência de símios
* Temed N,N,N,N, Tetrametiletilenodiamina
* TN Tampão composto por Tris e Nacl
* TNE Tampão Composto por Tris, NaCl e EDTA
* Tris Tris (hidroximetil aminometano)
* U. A. Unidade Arbitrária
* U. F. P. Unidade Formadora de Placa
* VFA Vírus da febre aftosa
* VPI 3 Vírus parainfluenza tipo 3
xvii
ÍNDICE
INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 1
1.0. INTRODUÇÃO AOS VÍRUS .......................................................................................... 2
2.0. SIMETRIA ICOSAÉDRICA ........................................................................................... 3
3.0. OS ALFAVÍRUS ............................................................................................................... 4
3.1. ESTRUTURA DOS ALFAVÍRUS ............................................................................................. 5
3.2. CICLO BIOLÓGICO DOS ALFAVÍRUS .................................................................................... 6
3.3. O VÍRUS MAYARO ........................................................................................................... 10
4.0. OS FILOVÍRUS .............................................................................................................. 11
4.1. ESTRUTURA DOS FILOVÍRUS ........................................................................................... 11
4.2. CICLO REPLICATIVO DOS FILOVÍRUS ................................................................................ 12
4.3. O VÍRUS EBOLA ............................................................................................................... 17
5.0. MECANISMO DE FUSÃO DE MEMBRANAS .......................................................... 19
OBJETIVOS ........................................................................................................................... 28
MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 30
1. REAGENTES ........................................................................................................................ 31
2. LIPÍDEOS ............................................................................................................................ 31
3.
CULTURA DE CÉLULAS ....................................................................................................... 31
5.
DOSAGEM DE COLESTEROL ................................................................................................ 31
6. PROPAGAÇÃO VIRAL .......................................................................................................... 32
7. PURIFICAÇÃO DO VÍRUS MAYARO ...................................................................................... 32
8. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS PAGE) ............................................... 32
9. ENSAIO DE TITULAÇÃO DAS AMOSTRAS VIRAIS .................................................................. 33
10. OBTENÇÃO DO PEPTÍDEO DE FUSÃO DO VÍRUS EBOLA ...................................................... 33
11. PREPARAÇÃO DE LIPOSSOMOS UNILAMELARES ................................................................ 33
12.
DETERMINAÇÃO DE HOMOTRÍMERO RESISTENTE À TRIPSINA ........................................... 34
13.
ANÁLISE DA ESTRUTURA SECUNDÁRIA DO VÍRUS MAYARO ............................................. 34
14. DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE ESTRUTURA SECUNDÁRIA DO PEPTÍDEO DE FUSÃO .... 34
14.1. Dicroísmo Circular (CD) .................................................................................. 34
xviii
14.2. Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourrier (FTIR) ....... 35
15. ANÁLISE DA FLUORESCÊNCIA DE BIOMOLÉCULAS ............................................................ 35
15.1. Ensaio de mistura de lipídeos ........................................................................... 36
15.2. Ensaio de supressão de fluorescência do triptofano ......................................... 37
15.2.1. Ensaio de supressão de fluorescência do triptofano do peptídeo EBO
16
...... 37
15.2.2. Ensaio de supressão de fluorescência do triptofano do vírus Mayaro .......... 38
16. ANÁSLISE DA AGREGAÇÃO VESICULAR UTILIZANDO ESPALHAMENTO DE LUZ DINÂMICO
(DLS) .................................................................................................................................... 38
17. CALORIMETRIA DE TITULAÇÃO ........................................................................................ 38
18. O PREPARO DAS AMOSTRAS PARA RMN .......................................................................... 38
19. ESPECTROS DE RMN ........................................................................................................ 39
19.1. Espectroscopia de correlação total (TOCSY) ................................................... 39
19.2. Espectroscopia de efeito Overhauser Nuclear (NOESY) .................................. 39
20. ASSINALAMENTO DO ESPECTRO ....................................................................................... 39
21. CÁLCULO DA ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DO PEPTÍDEO DE FUSÃO DO VÍRUS EBOLA .... 40
RESULTADOS ....................................................................................................................... 42
ARTIGO 1 ............................................................................................................................. 43
ARTIGO 2 ............................................................................................................................. 56
ARTIGO 3 ............................................................................................................................. 74
ARTIGO
4 ........................................................................................................................... 107
DISCUSSÃO GERAL .......................................................................................................... 139
1- IMPLICAÇÕES DO PH E DA ALTA PRESSÃO HIDROSTÁTICA NA EXPOSIÇÃO DE REGIÕES
HIDROFÓBICAS DO VÍRUS
MAYARO ...................................................................................... 140
2- EFEITO DO BAIXO PH E DA ALTA PRESSÃO HIDROSTÁTICA NA ESTRUTURA SECUNDÁRIA DO
VÍRUS
MAYARO ................................................................................................................... 141
3-
METAESTABILIDADE VIRAL E O ESTADO ATIVO DE FUSÃO ............................................... 142
4- REARRANJO ESTRUTURAL DA E1 DO VÍRUS MAYARO EM DIFERENTES CONDIÇÕES DE PH 144
5- FUSÃO DE MEMBRANA INDUZIDA PELA ALTA PRESSÃO E PELO BAIXO PH......................... 144
6- SISTEMAS DE MICELAS DE SDS E SOLUBILIZAÇÃO DE PEPTÍDEO DE FUSÃO ...................... 145
7-
EFEITO DOS MODELOS DE MEMBRANA NA ESTRUTURA SECUNDÁRIA DO PEPTÍDEO DO EBOLA
............................................................................................................................................. 146
xix
8- REFINAMENTO DO CONTEÚDO DE ESTRUTURA SECUNDÁRIA DO PEPTÍDEO DE FUSÃO ....... 148
9- ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DO PEPTÍDEO DE FUSÃO .................................................... 149
REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 153
CURRICULUM VITAE ...................................................................................................... 171
ANEXO I ............................................................................................................................... 180
ANEXO II ............................................................................................................................. 188
Introdução
1
INTRODUÇÃO
Introdução
2
1.0. Introdução aos vírus
Os vírus foram, inicialmente, detectados como agentes infecciosos pelo botânico russo
D. Ivanovski. Em 1892, estudando uma planta doente, ele verificou que o fluido extraído das
folhas, mesmo depois de filtrado, era capaz de tornar outras folhas doentes. Posteriormente, o
cientista holandês Martinus Beijerinck, em 1898, utilizou a palavra vírus para designar esses
agentes filtráveis. Nesta época, foi descoberto que a febre aftosa e a febre amarela eram
causadas por vírus (Loeffler & Frosch, 1898; Reed e cols., 1901). A partir desse momento,
ocorreu uma evolução nas técnicas para detecção desses agentes infecciosos possibilitando a
descoberta de inúmeros outros vírus.
Os vírus apresentam um material genético, ADN ou ARN, que interage com um envoltório
protéico, o capsídeo. O capsídeo conjugado com o ácido nucléico constitui uma estrutura
denominada nucleocapsídeo. Alguns vírus apresentam o nucleocapsídeo coberto por um
envelope lipídico. Esse envelope é adquirido em conseqüência do brotamento da partícula
viral da membrana da célula hospedeira. Os lipídios do envelope desses vírus são derivados
da membrana da célula hospedeira, e as proteínas do envelope são codificadas pelo próprio
vírus. Essas proteínas presentes no envelope do vírus são mediadoras da entrada da partícula
viral nas células. O processo de internalização pode ocorrer de duas formas: fusão direta do
envelope do vírus com a membrana plasmática da célula, como acontece com o vírus HIV; ou
por endocitose mediada por receptor, sendo o nucleocapsídeo do vírus lançado no citoplasma
da célula após a fusão do envelope viral com a membrana do endossoma, como acontece com
os alfavírus.
A fusão de membranas é um mecanismo comum aos vírus envelopados e, por isso, torna-se
um atrativo para o desenvolvimento de uma estratégia capaz de bloquear o ciclo infeccioso de
uma ampla variedade de vírus. Para isso, faz-se necessário um conhecimento acurado da
organização e da estrutura das proteínas envolvidas neste processo. Neste contexto, o presente
estudo busca enriquecer o conhecimento acerca da fusão de membranas, utilizando para isto,
o vírus Mayaro e o peptídeo de fusão do vírus Ebola.
Introdução
3
2.0. Simetria icosaédrica
A maioria dos vírus apresenta estrutura com simetria icosaédrica. O icosaedro é um
poliedro regular de vinte lados idênticos, exatamente, vinte triângulos equiláteros. A simetria
icosaédrica é caracterizada por um arranjo de rotações que levam à coincidência com a
posição anterior. Existem três tipos de eixos de rotação: o eixo de ordem 2, onde o icosaedro é
rodado 180
o
a partir do eixo médio de rotação localizado no meio de cada uma das trinta
arestas; o eixo de ordem 3, onde o icosaedro é rodado 120
o
a partir do eixo de rotação
localizado no meio de cada uma das vinte faces, e o eixo de ordem 5 onde a cada 72
o
o eixo
de rotação passa pelo centro do icosaedro e por cada um dos doze vértices (Branden & Tooze,
1991) (Figura 1A). O icosaedro pode ser subdividido em unidades menores chamadas
unidades assimétricas (Figura 1B). O número de unidades assimétricas do icosaedro é de
sessenta, sendo que cada triângulo equilátero que compõe o icosaedro pode ser dividido em
três partes assimétricas (Figura 1B). O genoma dos vírus, normalmente, é grande para ser
envolto por apenas 60 subunidades protéicas. Em 1962, Caspar e Klug mostraram que o único
caminho seria aumentar o número de subunidades protéicas para preservar a simetria
icosaédrica. Neste modelo, cada unidade assimétrica conteria mais que uma subunidade
protéica e o número de subunidades seriam um múltiplo de 60. Esse múltiplo foi denominado
de número de triangulação, e o representaram pela letra T (Caspar & Klug, 1962).
Figura 1. Esquema da simetria icosaédrica presente nos vírus. (A) Os eixos de simetria de
um icosaedro regular. O eixo cinco vezes passando pelos vértices, o eixo três vezes passando
pelo centro de cada face, e o eixo duas vezes passando pelo centro de cada aresta. (B) Divisão
da face do icosaedro em unidades assimétricas. (1) Uma face do icosaedro dividida em três
unidades assimétricas. (2) O icosaedro com as 60 unidades assimétricas (Adaptado de
Branden & Tooze, 1991).
BA
Introdução
4
3.0. Os alfavírus
O gênero Alphavírus é composto por 27 membros que possuem estruturas similares
(Schlesinger & Schlesinger, 1996). A seqüência genômica de vários alfavírus tem sido
determinada, e para esses alfavírus são observados 45 % de homologia entre os aminoácidos
das proteínas estruturais e 60 % de homologia entre os aminoácidos das proteínas não
estruturais. Os alfavírus podem ser agrupados em três grandes grupos: o grupo do vírus da
Encefalite Eqüina Venezuelana (EEV) e da Encefalite Eqüina do Este (EEE); o grupo do vírus
da Floresta de Semliki (FS) e o grupo do vírus Sindbis (SIN) (Tabela I). O grupo EEV/EEE
apresenta distribuição apenas no Novo Mundo. O grupo FS apresenta distribuição no velho
mundo com exceção do vírus Mayaro que foi encontrado na América do Sul. O grupo SIN
apresenta distribuição por todo o mundo: América do Sul, Ásia, Europa, Nova Zelândia,
Austrália e África (Strauss & Strauss, 1994).
Tabela I. Distribuição geográfica dos alfavírus. Os três grandes grupos em que se dividem
os alfavírus e sua distribuição pelo mundo (Adaptado de Strauss & Strauss, 1994).
Grupo Abreviaturas Nome do vírus Distribuição
EEV/EEE EEE
EEV
Encefalite Eqüina do Este
Encefalite Eqüina Venezuelana
América do Norte e do Sul
América do Sul e Central
FS
FS
MID
CHIK
ONN
RR
FB
MAY
Floresta de Semliki
Middelburg
Chikungunya
O’Nyong- Nyong
Rio Ross
Floresta de Barmah
Mayaro
África, Europa e Ásia
África
África
África
Austrália e Oceania
Austrália
América do Sul
SIN
SIN
AURA
WHA
Sindbis
Aura
Whataroa
África, Ásia, Europa e Austrália
Brasil e Argentina
Nova Zelândia
Introdução
5
Os alfavírus representam uma grande ameaça para a saúde humana em muitas áreas do
mundo. Os vírus Chikungunya (CHIK) e o O’Nyong- Nyong (ONN) têm causado milhões de
doentes caracterizados por sintomas como febre, erupção cutânea e artralgia. Os vírus do Rio
Ross (RR) e da Floresta de Barmah (FB) causam poliartrite em humanos com sintomas que
podem persistir por meses ou anos. Os vírus Sindbis e da Floresta de Semliki, utilizados em
laboratórios de pesquisa básica e aplicada, são normalmente considerados de pouca virulência
para humanos (Strauss & Strauss, 1994). Não foi descrito nenhum caso de infecção pela
manipulação desses vírus em laboratório. No entanto, subtipos desses vírus presentes na
natureza são descritos como causadores de poliartrite, febre, erupção, mialgia e artralgia
(Mathiot e cols., 1990; Niklasson, 1988; Niklasson e cols., 1984).
3.1. Estrutura dos alfavírus
Os alfavírus são vírus envelopados constituídos por um envelope glicoprotéico com
diâmetro de aproximadamente 640 a 680 Å (Harrison, 1986; Vogel e cols., 1986; Fuller,
1987; Paredes e cols., 1993; Vénien-Bryan & Fuller, 1994). O material genético consiste de
um ARN de 49S, fita simples com polaridade positiva, envolto por 240 cópias de uma mesma
proteína, denominada proteína do capsídeo (cerca de 34 kDa). O complexo ARN-proteína do
capsídeo forma uma estrutura denominada nucleocapsídeo que é coberta por um envelope
lipídico originado na sua maioria da membrana plasmática de células de vertebrados.
Entretanto, em células de invertebrados o envelope é originado a partir de vesículas internas
(Mezencio e cols., 1989). O envelope lipídico é composto por dois tipos de glicoproteínas,
E1 e E2, com peso molecular de aproximadamente 50 kDa. Essas glicoproteínas formam
heterodímeros que se associam em trímeros originando uma das 80 espículas presentes na
superfície viral. As espículas se organizam em simetria T=4 semelhante à simetria do
capsídeo, conferindo à partícula viral uma relação de 1:1 entre as proteínas do envelope e as
proteínas do capsídeo (Paredes e cols., 1993) (Figura 2).
Introdução
6
Figura 2. Estrutura dos alfavírus obtida por criomicroscopia eletrônica. (A) Estrutura
tridimensional do vírus do Rio Ross. As espículas protéicas são mostradas em azul e a
bicamada lipídica em verde. (B) Em azul estão mostrados as glicoproteínas do envelope, em
verde a bicamada lipídica e amarelo o nucleocapsídeo (Extraído de Strauss e cols., 1995).
3.2. Ciclo biológico dos alfavírus
Os alfavírus infectam uma grande variedade de células, entre elas, células de mosquito
e de mamíferos. A grande quantidade de células que podem ser infectadas pelos alfavírus
reflete a manutenção desses vírus na natureza por um ciclo alternado de replicação em células
de invertebrados e de vertebrados (Koblet, 1990). Em 1992, mostrou-se o receptor laminina
como o receptor utilizado pelos alfavírus em várias linhagens de células de mamíferos e de
mosquitos (Wang e cols., 1992). Contudo, devido à grande gama de tipos celulares que
podem ser infectados pelos alfavírus, tem sido proposto dois caminhos para interação do vírus
com a célula: 1
o
) uso de um receptor altamente conservado entre os alfavírus, e o 2
o
) uso de
mais de um receptor.
A primeira evidência de que os alfavírus entram nas células hospedeiras por meio de
endocitose mediada por receptor foi apresentada por Fan e Selton, em 1978, quando eles
demonstraram que as glicoproteínas virais não se mantinham na superfície celular após a
infecção. A endocitose mediada por receptor tem início com o reconhecimento específico das
proteínas e carboidratos presentes na superfície viral. As glicoproteínas E2 são as proteínas
dos alfavírus que interagem com os receptores da célula hospedeira. Após essa interação, o
A
B
Introdução
7
vírus é transportado em direção ao citoplasma celular em regiões da membrana revestidas por
clatrinas (Helenius e cols., 1980). Essas regiões invaginam-se e formam vesículas endocíticas.
Em seguida, o pH no interior do endossoma torna-se ácido devido à ação das ATPases
bombeadoras de prótons presentes na sua membrana (Mellman e cols., 1986). A acidez do
endossoma causa mudanças conformacionais nas glicoproteínas do envelope viral induzindo a
fusão do envelope do vírus com a membrana do endossoma. Posteriormente, o
nucleocapsídeo é liberado no citoplasma celular (Figura 3). Os vírus que não sofreram fusão e
as espículas que se mantiveram na membrana do endossoma são transportados ao longo do
caminho endocítico para o compartimento lisossomal, onde são rapidamente degradados
(Kielian, 1995).
Figura 3. Ciclo infeccioso dos alfavírus. A espícula do vírus interage com o receptor da
superfície celular formando vesículas contendo os vírus (1). O pH no interior da vesícula é
acidificado favorecendo a fusão da membrana viral com a da vesícula endocítica e a posterior
liberação do nucleocapsídeo para o citosol celular (2). No citosol, o capsídeo é desmontado
(3) e o ARN viral é associado ao ribossoma (4) ocorrendo o processo de tradução e
transcrição viral. Finalmente, o capsídeo montado adquire envelope e a partícula viral brota da
célula hospedeira (5) (Adaptado de Alberts e cols., 1994).
3
Introdução
8
Após a liberação do nucleocapsídeo no citoplasma, o capsídeo será desmontado,
liberando assim, o ARN genômico do vírus no citosol da célula. Alguns trabalhos mostram
evidências de que a ligação de ribossomas ao nucleocapsídeo, durante a sua liberação no
citoplasma, dispara o processo de desmontagem do nucleocapsídeo (Singh & Helenius, 1992;
Wengler & Wengler, 1984). Com o capsídeo desmontado, o ARN 49S (genômico), que
apresenta 11703 nucleotídeos, é traduzido em uma poliproteína que é processada dando
origem às proteínas não estruturais nsP1, nsP2, nsP3 e nsP4 (Figura 4). Essas proteínas não
estruturais formam um complexo de replicação viral necessário para a transcrição e replicação
do ARN genômico, que atua de modo semelhante a um ARN mensageiro. A nsP1 apresenta
atividade metiltransferase e guanililtransferase (Ahola e cols., 1995, 1997); a nsP2 é uma
NTPase, ARN helicase e ARN 5’ trifosfatase, bem como protease responsável pela clivagem
autocatalítica da poliproteína ns (Rikkonen e cols., 1994; Gomez De Cedron e cols., 1999;
Vasiljieva e cols., 2000). A nsP3 é uma fosfoproteína, cuja função ainda não foi determinada
(Peränen e cols., 1988). Já a nsP4 é uma subunidade catalítica da ARN polimerase (Strauss e
Strauss, 1994).
Figura 4. Esquema do processo de transcrição e tradução do ARN 49S (+) dos alfavírus.
As proteínas não estruturais são traduzidas pelo ARN 49S (+) como uma poliproteína que é
processada em quatro proteínas nsP1, nsP2, nsP3 e nsP4. O ARN 49S (+) é transcrito em um
ARN 49S (-) que serve como molde para o ARN subgenômico, o ARN 26S (+). Esse ARN é
traduzido em uma poliproteína p130 que após ser processada dá origem as proteínas
estruturais E1, E2 e C (Adaptado de Dominguez e cols., 1990).
Introdução
9
O ARN genômico também é transcrito em um ARN de polaridade negativa. Esse ARN
49S (-) serve como molde para o ARN 49S (+), que é empacotado formando novas partículas
virais, e para o ARN 26S (+) conhecido como ARN subgenômico. O ARN subgenômico
traduz uma poliproteína de 130 kDa (p130) que dá origem às proteínas estruturais E1, PE2, C
e 6K (Strauss & Strauss, 1994) (Figura 4). Posteriormente, a proteína capsídica é liberada da
cadeia da poliproteína p130, e então, as demais proteínas estruturais são inseridas no retículo
endoplasmático (RE) e são clivadas por diferentes enzimas. As proteínas 6K são deletadas e
as proteínas PE2 e E1 são rapidamente associadas em heterodímero dentro do próprio RE para
formar um heterodímero ligado não covalentemente (Ziemiecki e cols., 1980). O
heterodímero segue pelo complexo de Golgi onde é acetilado e glicosilado e depois
transferido para a membrana plasmática (Bonatti e cols., 1989).
Durante o transporte, a PE2 é clivada formando as proteínas E2 e E3 (deCurtis &
Simons, 1988). Além disso, o domínio hidrofóbico da E2 interage com o domínio hidrofóbico
da E1, ao longo da montagem viral, e cada três heterodímeros E2/E1 são trimerizados para
formar uma espícula protéica das 80 que compõem a superfície viral (Figura 5) (Strauss e
cols., 2002). Ambas E1 e E2 são ancoradas na membrana plasmática próximas as suas regiões
carboxi-terminal. E1 apresenta apenas 2 resíduos transmembrana, enquanto que E2 apresenta
33. A região citoplasmática de E1 é composta por dois resíduos de arginina, que são
altamente conservados entre os alfavírus. Acredita-se que esta região citoplasmática de E1
não apresenta importância na saída do vírus da célula ou mesmo na entrada, quando analisado
in vitro (Barth e cols., 1992). Contudo, é possível que os dois resíduos de arginina tenham
importância na multiplicidade viral. Por outro lado, existem evidências estruturais e genéticas
que apontam para a interação do domínio citoplasmático de E2 com o nuclepocapsídeo
durante a montagem viral (Skoging e cols., 1996; Strauss e cols., 1995).
O nucleocapsídeo é montado no citoplasma da célula infectada devido à existência de
um sinal de encapsidação no ARN viral que promove uma montagem eficiente do
nucleocapsídeo dentro da célula (Rümenapf e cols., 1995). Tem sido proposto que o
brotamento do vírus é iniciado pela ligação do nucleocapsídeo a uma região específica do
heterodímero E1/E2 (Garoff e cols., 1998). Esta interação entre a glicoproteína e o
nucleocapsídeo é crítica para o brotamento do vírus, e a energia de ligação entre estes dois
Introdução
10
componentes fornece mais energia livre para realização do brotamento (Strauss e cols., 1995).
Desta forma, é de consenso geral que o nucleocapsídeo, ao interagir com a espícula viral, é
englobado por este envelope lipídico ao longo do brotamento da partícula viral na membrana
da célula infectada (Kielian, 1995). As partículas virais maduras são liberadas no ambiente
extracelular, dando assim continuidade ao ciclo infeccioso dos vírus.
Figura 5. Produção das glicoproteínas E1 e E2. A esquerda são mostradas as seqüências
sinais (verde); os sinais de inserção da glicoproteína no RE (azul). A direita é mostrada a
heterodimerização de E2/E1. Em azul claro são representados os resíduos de cisteínas e a
estrela vermelha representa o possível local de fosforilação.
3.3. O vírus Mayaro
O vírus Mayaro foi inicialmente isolado em 1954 do sangue de um humano infectado
em Trinidad, na Bolívia (Anderson e cols., 1957). Após três anos de sua descoberta, foi
isolado no Brasil, em humanos e em outros mamíferos, principalmente na região amazônica
(Causey & Moroja, 1957). Recentemente, foram relatados alguns casos de infecção com o
vírus Mayaro na Guiana Francesa (Talarmin e cols., 1998). Este vírus apresenta como
hospedeiros mamíferos e pássaros que podem ser infectados pelas picadas de mosquitos. O
período de incubação pode durar de três a onze dias e os sintomas são caracterizados por
febre, poliartrite, mialgia e dor de cabeça. Os prováveis reservatórios naturais são os primatas,
os quais apresentam uma alta viremia sem manifestar a doença (Office Biosafety, 2001). O
vírus Mayaro tem sido isolado em mosquitos, principalmente do gênero Haemagogus e, por
isso, pode ser explicada a sua prevalência em regiões de florestas tropicais. O diagnóstico é
feito por meio do isolamento do vírus, preferencialmente, em células de rim de macaco verde
(Vero). Este vírus apresenta grande importância clínica devido aos surtos epidêmicos, que
provocam grande morbidade na população.
Introdução
11
O vírus Mayaro pode ser replicado tanto em células de vertebrados quanto em
invertebrados (Brown & Condreay, 1986). Em células de vertebrados, ele promove alterações
na síntese de macromoléculas da célula hospedeira induzindo modificações na morfologia da
membrana celular. Além disso, o processo de brotamento ocorre na membrana plasmática
dessas células (Mezencio e cols., 1990). Em células de invertebrados, como as células C6/36
(Aedes albopictus), a sua multiplicação não é acompanhada de efeitos citopáticos podendo
tornar-se uma infecção persistente. Além disso, a liberação das partículas virais ocorre através
do brotamento da membrana do retículo endoplasmático, formando vesículas que são
conduzidas para a membrana plasmática para que ocorra a endocitose (Mezencio e cols.,
1989).
4.0. Os Filovírus
O filovírus é um gênero pertencente a uma família de vírus emergentes conhecida
como Filaviridae (Kiley e cols., 1982). Este gênero é constituído por duas espécies: a do vírus
Marburg (MBG) e a do vírus Ebola (EBO). Os vírus Ebola isolados foram agrupados em
quatro subtipos: Ebola-Sudan (EBO-S), Ebola-Zaire (EBO-Z), Ebola-Reston (Ebola-R) e
Ebola-Ivory Coast (EBO-IC), os quais podem ser distinguidos pela neutralização cruzada.
Contudo, não existe interação cruzada entre o MGB e o EBO. Entre os 4 subtipos do EBO
existe uma similaridade de 47 % na seqüência de nucleotídeos, a qual pode ser considerada
baixa, quando comparada aos 72 % de divergência observada entre o EBO-Z e o MBG
(Feldmann e cols., 1993; Sanchez e cols., 1993). O primeiro filovírus foi descrito em 1967
quando trabalhadores de laboratórios na Alemanha e na Iugoslávia, que manipulavam tecidos
infectados de macacos verdes, desenvolveram a doença. Um total de 31 casos foram
observados sendo que destes, 7 foram a óbito. Este vírus foi posteriormente isolado e
chamado de Marburg. Após este episódio, o MBG somente voltou a aparecer em 1975 e,
desde então têm sido notificados alguns casos esporádicos. Já o vírus Ebola emergiu em duas
grandes epidemias, que ocorreram quase simultaneamente, no Zaire e a no Sudão, em 1976,
envolvendo mais de 500 casos.
4.1. Estrutura dos filovírus
Os filovírus, quando observados por meio de microscopia eletrônica, mostram grande
similaridade com os Rabdovírus. Morfologicamente, os filovírus são filamentosos e
Introdução
12
pleomórficos, podendo apresentar-se como um longo filamento em forma de U, circular ou
em forma de 6 (Figura 6). Os filovírus possuem comprimento variável (acima de 14 000 nm),
mas com diâmetro uniforme de 80 nm. O material genético consiste de um ARN 46S, linear,
não segmentado, de polaridade negativa que é circundado por um capsídeo helicoidal de
aproximadamente 50 nm de diâmetro. O conjunto formado pelo ARN e pelo capsídeo formam
o nucleocapsídeo viral que encontra-se envolto por um envelope lipídico derivado da
membrana plasmática da célula hospedeira (Buchmeier e cols., 1983; Kiley e cols., 1988). O
envelope lipoprotéico é composto por um único tipo de glicoproteína, a GP, a qual apresenta-
se altamente glicosilada e arranjada na forma trimérica, constituindo as espículas que
emergem da superfície viral (Fields, 1996). As espículas apresentam, aproximadamente, 7 nm
de comprimento com espaçamento de 10 nm que são visíveis na superfície viral.
Figura 6. Morfologias do vírus Ebola. O vírus Ebola é bastante pleomórfico, podendo ser
encontrado nas diferentes forma mostradas nesta figura.
4.2. Ciclo replicativo dos filovírus
Os filovírus apresentam tropismo por vários tipos celulares, entre eles, células de
fígado humano, células endoteliais e células epiteliais. Contudo, em 1998, foi mostrado que o
vírus Ebola não era capaz de infectar células linfóides, sugerindo que estes tipos celulares não
possuem receptores para os filovírus (Wool-Lewis e Bates, 1998). O conhecimento sobre o
Introdução
13
receptor dos filovírus permanece obscuro, contudo, é conhecido o seu cofator, o receptor α
folato (FR-α), que é necessário para a entrada do vírus nas células (Chan e cols., 2001). Esta
molécula é uma proteína ligada a glicosil fosfatidilinositol (GPI) de 38-39 kDa, que é
expressa na superfície celular. Assim como para outras proteínas de superfície ligadas a
GPI, ο FR-α é endocitado via caveolina (Anderson, 1998). As caveolinas são vesículas
enriquecidas com colesterol e esfingolipídeos e estão presentes em vários eventos biológicos,
tais como: sinalização transmembrana, homeostase de colesterol celular, entrada celular por
certas bactérias, toxinas e vírus (Anderson, 1998; Shin e Abrahan, 2001a, b; Smart e cols.,
1999; van Meer, 2001).
A primeira evidência de que os filovíus entram na célula através de endocitose
mediada por caveolinas foi apresentada por Empig e Goldsmith, em 2002. Estas vesículas de
caveolinas, por apresentarem regiões ricas em colesterol, adotam um estado físico de fluidez
reduzida e habilidade de mobilidade lateral e rotacional aumentados (Simons e Ikonen, 1997;
Brown e London, 1998). Desta forma, esses microdomínios conhecidos como lipid rafts, são
capazes de acomodar seletas moléculas, como o cofator FR-α, assim como receptores de
vários vírus envelopados (Bavari e cols., 2002; Freed, 2002). Acredita-se que a endocitose
mediada por receptor tem início com a interação da glicoproteína GP com receptores da
superfície celular (Figura 7). Em seguida, a partícula viral é endocitada por vesículas de
caveolina, para o interior citoplasmático. Em algum momento do ciclo replicativo, o baixo pH
é requerido para que este ciclo tenha prosseguimento, porém, o momento exato em que isto
ocorre, não está claro (Wool-Levis e Bates, 1998). Isto se deve ao pequeno conhecimento
adquirido, até então, acerca do ciclo replicativo dos filovírus. Apesar disto, acredita-se que o
desnudamento da partícula viral ocorra de modo semelhante ao dos outros vírus ARN de
polaridade negativa. Sendo assim, após liberação do material genético no citoplasma ele é
transcrito em ARN de polaridade positiva e em ARNm, o qual é traduzido nas proteínas
estruturais.
O ARN genômico possui sete genes arranjados seqüencialmente em uma molécula
simples de, aproximadamente, 19 kb de comprimento. Os genes são delineados pelos sinais
transcripcionais altamente conservados, começando no 3’ final e terminando com a
poliadenilação. Os genes dos filovírus tendem a possuir longas regiões não codificantes as
Introdução
14
quais contribuem para o aumento do seu genoma e podem atuar na estabilidade dos
transcritos. Uma outra característica dos filovírus é a posição de certos genes vizinhos.
Enquanto que os genes dos rabidovírus e paramixovírus usualmente são separados por curtas
regiões intergênicas de um ou mais nucleotídeos, os genes dos filovírus sobrepõem um ao
outro. Para o vírus Marburg foi identificada apenas uma região de sobreposição localizada
entre os genes codificante para VP30 e VP24. No caso do Ebola foram, identificadas 3 regiões
de sobreposição gênica: a primeira entre os genes VP35 e VP40; a segunda entre os genes GP
e VP30; a terceira entre os genes VP24 e ARN polimerase (Figura 8). Embora se saiba da
existência destas regiões de sobreposições, a sua função ainda não foi elucidada (Peters e
cols., 1996).
Figura 7. Desenho esquemático do ciclo replicativo dos filovírus. (A) Transporte da
proteína VP40 pelo endossoma tardio; (B) Transporte da proteína GP, (C) transporte das
proteínas do nucleocapsídeo (NP, VP30, VP35, L e VP24). Os microdomínios “lipid
rafts”(LR) servem como plataforma para montagem viral (Hartlieb and Weissenhorn., 2005).
O primeiro gene codificado pelo genoma viral dá origem à proteína estrutural, a
nucleoproteína, que está associada ao nucleocapídeo. O segundo gene codifica a proteína
VP35, que apresenta um papel essencial na síntese de ARN, agindo como um antagonista do
interferon (IFN). Isto se deve ao fato de que a produção do antagonista do IFN pode
contribuir para a patogenicidade do vírus Ebola, de modo semelhante à proteína NS1, um
outro antagonista do IFN, que aumenta a habilidade de replicação do vírus da influenza
Introdução
15
(Garcia-Sastre e cols., 1998; Takada e Kawaoka, 2001). O terceiro gene codifica a proteína
VP40, que é equivalente à proteína de matriz de outros vírus de ARN (Figura 8). A VP40 é a
proteína mais abundante do vírus e está localizada abaixo da membrana viral, onde
presumivelmente mantém a integridade da estrutura do vírus. Para os vírus envelopados, as
proteínas de matriz apresentam um importante papel na entrada e na saída da partícula viral da
célula hospedeira. No vírus da estomatite vesicular, por exemplo, a proteína de matrix dirige
a formação de vesículas (Justice e cols., 1995). Já para os retrovírus, a proteína Gag é
montada nas partículas que brotam da superfície celular (Delchambre e cols., 1989). As
proteínas da matriz de muitos vírus envelopados estão associadas com a membrana e acredita-
se que a interação dar-se-á pela porção citoplasmática da glicoproteína viral.
Figura 8. Estruturas dos genomas dos Filovírus. IR: intervening regions (regiões que
intervem); GP: viral glycoprotein (glicoproteínas virais); VPxx: viral proteins (proteínas
virais); sítio de edição é mostrado pela seta verde. As setas amarelas mostram os pontos de
sobreposição gênica.
O quarto gene codifica duas glicoproteínas, a glicoproteína secretória não estrutural
(sGP) e a glicoproteína de envelope (GP). A sGP é o produto primário do gene, ela é
secretada da célula hospedeira. A proteína GP por ser a única proteína de superfície dos
filovírus é apontada como a responsável pela ligação ao receptor e pela fusão com a
membrana celular. Ela é expressa como um precursor de cadeia única de 676 aminoácidos,
por uma edição transcripcional, que resulta na adição de algumas adenosinas extras dentro das
7 adenosinas da região codificante da molécula. A GP e sGP apresentam aproximadamente
300 aminoácidos amino-terminais, mas contêm um adicional de 376 e 70 aminoácidos
carboxi-terminal, respectivamente. A GP é uma proteína integral de membrana que forma
projeções no envelope viral e apresenta glicosilações do tipo O e N, as quais contribuem para
Introdução
16
o seu elevado peso molecular, se comparado ao peso molecular predito pela análise de sua
seqüência de aminoácidos.
Para muitos vírus envelopados, a clivagem proteolítica da glicoproteína de membrana
é um pré-requisito para a fusão entre o envelope viral e a membrana da célula hospedeira. O
vírus Ebola Zaire sofre clivagem proteolítica em sua proteína GP por uma furino protease,
dando origem as subunidades GP1 e GP2, as quais são covalentemente ligadas por pontes
dissulfetos. Além disso, todos os outros filovírus, incluindo os menos patogênicos que o
Ebola Zaire, como o Ebola-Reston e o Marburg, possuem local de reconhecimento para
furina. Como o Ebola-Reston apresenta uma seqüência de clivagem com baixa especificidade
para a furina, foi postulado que o processamento proteolítico da GP seria um importante fator
na patogenicidade do vírus Ebola (Figura 9). A GP1 é a proteína responsável pela interação
com o receptor celular, enquanto que, a GP2 mostra-se essencial no processo de fusão de
membranas (Volchkov e cols., 1998). Recentemente, foi determinada a estrutura da GP2 a
nível atômico, propiciando uma análise mais detalhada deste domínio (Malashkevich e cols.,
1999). A subunidade GP2 apresenta várias características interessantes. No seu amino-
terminal está presente um segmento altamente hidrofóbico, chamado de peptídeo de fusão.
Este peptídeo é inserido na membrana alvo durante os estágios iniciais do processo de fusão
de membranas. Na região adjacente ao peptídeo encontra-se uma região hidrofóbica com
repetições 4,3, que estruturalmente encontra-se altamente espiralada. A sua porção carboxi-
terminal está estruturada em hélice.
O quinto gene codifica a proteína VP30, a qual é a menor nucleoproteína. Ela
apresenta-se intimamente ligada no nucleocapsídeo, e alguns estudos têm sugerido a sua
interação com o ARN viral (Elliott e cols., 1993). Isto poderia ser explicado pela grande
quantidade de aminoácidos básicos em sua seqüência primária (particularmente arginina). O
sexto gene codifica a proteína VP24, que é uma proteína associada à membrana. O seu papel
ainda é desconhecido, mas acredita-se que ela possa atuar como uma pequena proteína de
matriz, ou então, que ela possa participar do desnudamento do vírus durante a infecção. O
sétimo e último gene codifica a proteína ARN polimerase.
Introdução
17
Figura 9. Esquema do local de clivagem da GP dos diferentes subtipos de vírus Ebola. O
aminoácido alterado na seqüência de clivagem do subtipo Reston esta marcado pela caixa
(Adaptado de Volchkov e cols., 1998).
Após o término das transcrições e traduções, novas partículas virais são formadas.
Sendo o nucleocapsídeo montado no citoplasma, e o envelope lipídico adquirido durante o
brotamento do vírus da célula alvo.
4.3. O vírus Ebola
Os vírus são agentes infecciosos que ao longo dos anos vem promovendo grande
mortalidade em humanos e em outros animais. Alguns vírus podem levar ao aparecimento de
sintomas leves e ou moderados, enquanto que outros podem ser tão agressivos a ponto de
conduzir o indivíduo a morte, em poucos dias, após a sua infecção. O vírus Ebola causa febre
hemorrágica em humanos e em primatas não humanos, o que resulta em uma taxa de
mortalidade superior a 80 % entre os infectados. Em 1976, 318 pessoas foram infectadas com
o vírus Ebola e, destas, 88 % faleceram. Em adição, em 1995, no Zaire, 255 pessoas
morreram em uma epidemia que envolveu a infecção de 315 pessoas (Centers for Disease
Control and Prevention, 1995). Posteriormente a esses episódios epidêmicos (Tabela II),
várias análises genéticas, dos vírus isolados, puderam ser realizadas, conduzindo à
identificação de quatro subtipos do vírus Ebola: o Zaire, o Sudão, o Ivory Coast e o Reston.
Introdução
18
Ano Espécie do Ebola País Número de casos
em humanos
Porcentagem de
mortes entre os
casos
1976 Ebola-Zaire Zaire 318 88 %
1976 Ebola-Sudão Sudão 284 53 %
1976 Ebola-Sudão Inglaterra 1 0 %
1977 Ebola-Zaire Zaire 1 100 %
1979 Ebola-Sudão Sudão 34 65 %
1989 Ebola-Reston E.UA. 0 0 %
1992 Ebola-Reston Itália
1994 Ebola-Zaire Gabão 49 59 %
1994 Ebola-Ivory Coast Ivory Coast 1 0 %
1995 Ebola-Zaire Democrática
Republica do Congo
315 81%
1996 Ebola-Zaire Gabão 31 68 %
1996 Ebola-Zaire Gabão 60 75 %
1996 Ebola-Zaire África do Sul 2 50 %
1996 Ebola-Reston E.U.A 0 0 %
1996 Ebola-Reston Filipinas 0 0 %
2000-2001 Ebola-Sudão Uganda 425 53 %
2001-2002 Ebola-Zaire Gabon e Republica
do Congo
122 79 %
2002-2003 Ebola-Zaire Republica do Congo 178 88,8%
2004 Ebola-Sudão Sudão 17 41%
Tabela II. Casos relatados de infecção ocorridas pelo vírus Ebola desde a sua descoberta até
os dias atuais (Adaptado do CDC, 2004).
O subtipo Zaire, primeiramente isolado em 1976, parece ser o mais virulento,
conduzindo ao óbito, aproximadamente, 90 % dos indivíduos infectados. Por outro lado, o
subtipo Reston, inicialmente isolado de macacos Cinomologus, importados das Filipinas para
os EUA, em 1989, é o menos patogênico em primatas não humanos e aparentemente não é um
vírus patogênico para humanos (Center Disease Control, 1990). Os sintomas provenientes da
infecção pelo Ebola podem ser divididos em dois estágios: poucos dias após à infecção, onde
Introdução
19
grande parte dos enfermos apresentam febre alta, dor de cabeça, dor muscular, dor estomacal,
fadiga e diarréia, podendo em alguns casos vomitar sangue e evacuar sangue. Uma semana
após a infecção, o enfermo normalmente avança para um quadro de choque e morte.
Nos últimos anos, vários grupos de pesquisa têm se empenhado no estudo funcional e
estrutural da proteína GP, devido a dois grandes motivos. Esta proteína interage com
receptores da superfície celular e é responsável pelo processo de fusão entre o envelope viral e
a membrana da célula hospedeira. Além disso, a GP apresenta uma região compreendida entre
os aminoácidos 524 e 539, que representa o domínio de fusão desta proteína. Apesar da
grande importância de se conhecer melhor este domínio de fusão, poucos estudos bioquímicos
e estruturais têm sido realizados.
5.0. Mecanismo de fusão de membranas
Para que os vírus envelopados transfiram o seu genoma para o interior da célula
hospedeira, é requerida a fusão entre o envelope do vírus com a membrana endossomal, ou
então, com a membrana plasmática celular. Contudo, existe uma barreira energética associada
a este processo, que, é superada pela própria proteína do envelope viral (Peisajovich e Shai,
2002). A capacidade que estas proteínas de fusão apresentam de sofrer alterações
conformacionais é uma característica crucial para mediação da fusão do envelope viral com a
membrana alvo. Entretanto, não são apenas as mudanças estruturais nestas proteínas de fusão
que conduzem à exposição de um peptídeo de fusão, mais sim, a energia liberada por esta
alteração de conformação que favorece o processo de fusão (Hernandez e cols., 1996). Uma
das características das proteínas de fusão é que elas são sintetizadas como um precursor
inativo que pode ele mesmo ser proteoliticamente clivado, ou então, requerer a clivagem de
uma proteína acessória. Este processamento gera um estado metaestável que é potencialmente
ativo para fusão, e pode ser irreversivelmente convertido para um estado conformacional mais
estável.
As proteínas de fusão viral que apresentam alterações conformacionais irreversíveis
foram agrupadas em duas classes. A classe I é representada pelos ortomixiovírus, retrovírus,
paramixovírus, e filovírus, todos dos quais são ativados pela clivagem proteolítica. A
clivagem da proteína precursora resulta na formação das glicoproteínas; HA1 e HA2 para o
Introdução
20
vírus da influenza, F2 e F1 para o parainfluenza, GP1 e GP2 para o Ebola, gp120 e gp41 para
o HIV (Malashkevich e cols., 1999). Para cada um desses vírus, a primeira subunidade é
responsável pela ligação a receptores da superfície celular, e a segunda responsável por
mediar o processo de fusão. As proteínas de fusão dessa classe apresentam estruturas em
grampos formadas por trímeros, com estruturas secundárias super espiraladas (Figura 10). A
seqüência hidrofóbica localizada na região N-terminal das glicoproteínas HA2, F1, GP2 e
gp41, que são geradas pela clivagem do precursor, é conhecida como peptídeo de fusão
(Skehel & Wiley, 1998). Em adição, esta região da proteína, a qual contém o peptídeo de
fusão, está localizada próxima a região C-terminal, a qual contém uma hélice transmembrana.
Figura 10. Estrutura das proteínas de fusão dos vírus classe I. A figura mostra as
proteínas de fusão do vírus Ebola, vírus moloney de leucemia de murinos (MoMLV), vírus da
leucemia de células T humana, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da
imunodeficiência de símios (SIV), vírus Visna, vírus da influenza, vírus sincicial respiratório,
vírus parainfluenza SV5 e vírus da doença Newcastle com estrutura secundária super
espiralada em forma de trímero em grampo. O N-terminais da região super espiralada (coiled
coil) é ilustrado em azul e o C-terminal da molécula em verde. (Extraído de Malashkevich e
cols., 2001).
Introdução
21
Para que a proteína viral consiga mediar a fusão de membrana, é requerida uma
ativação específica. No caso do HIV, a ativação acontece durante a ligação do vírus a
receptores da superfície celular (Chan & Kim, 1998), e para o vírus da influenza ocorre
devido à redução do pH no endossoma. A conseqüência estrutural dessa ativação é conhecida
em detalhes para a proteína HA2 do vírus da influenza (Skehel & Wiley, 2000).
Comparações dos dados de cristalografia de raio-X da HA, em pH neutro e em pH ácido,
mostram que a ativação envolve o rearranjo e reenovelamento da proteína. Durante este
rearranjo conformacional, é observada a movimentação do peptídeo de fusão para 100 Å do
topo da molécula, podendo assim, ser projetado no sentido da membrana alvo. Contudo, a
inserção do peptídeo na membrana lipídica não explica como ocorre a aproximação entre as
duas membranas. O mecanismo proposto, em 1994, por Yu e colaboradores, é baseado em
estudos com peptídeos sintéticos que compreendem a região da cadeia polipeptídica da HA2.
Segundo ele, a ligação do peptídeo de fusão à membrana alvo, poderia contribuir para a
inserção de algumas ou de todas as estruturas triméricas altamente espiraladas e, com isto,
aproximar as duas membranas. Em contrapartida, em 1996, foi mostrado que tanto no início
quanto no estágio tardio de fusão, a única região do ectodomínio da HA2 que é inserida na
bicamada lipídica é o peptídeo de fusão (Durrer e cols., 1996). Em adição, alguns resultados
obtidos com o HIV-1 e complementado com resultados obtidos para outros vírus desta classe
de proteínas de fusão, têm ajudado a montar um novo modelo (Durrer e cols., 1996).
Segundo este novo modelo de fusão, a proteína gp120 ao se ligar ao receptor celular,
sofre alterações conformacionais liberando a gp41 para uma conformação de α-hélice
estendida que transloca o peptídeo de fusão de modo a facilitar a sua inserção na membrana
alvo (Figura 11). Esta conformação de pré-grampo expõe as regiões amino e carboxi
terminais de seqüências repetidas (Heptad Repeat) (Furuta e cols., 1998). Subseqüentemente,
estas regiões são enoveladas em uma conformação de baixa energia, a conformação em
grampo. A energia liberada neste processo como resultado do enovelamento estrutural, para
uma conformação altamente termoestável, ajuda durante a sobreposição das duas membranas
(Lu e cols., 1995). A fusão de membranas é um mecanismo energeticamente custoso, pois
envolve a desestabilização da bicamada lipídica e desidratação da região de interface de
imersão na membrana (Rand, 1981). A região amino terminal da seqüência repetida pode
ligar-se à membrana, e promover a sua desestabilização para o evento de fusão onde após um
Introdução
22
curto período pós inserção do peptídeo de fusão na membrana alvo, a região amino desta
seqüência de repetição pode desestabilizar a membrana.
Com as duas membranas interligadas pela proteína gp41, a sobreposição entre elas
pode ser direcionada pela baixa solubilidade da região amino da região de seqüência repetida,
devido a sua habilidade de ligar a membranas e de oligomerização. A desestabilização da
membrana na região de hemifusão pode ser caracterizada estruturalmente pela formação de
intermediário stalk, o qual facilita a ligação da estrutura altamente espiralada (Bentz, 2000b).
Esta região altamente espiralada estabiliza a região do peptídeo de fusão. A subunidade HA2
do influenza, a subunidade GP2 do Ebola, a subunidade F do Sendai, são correspondentes a
gp41 do vírus HIV-1. Os resultados apresentados em 2002 por Sackett e Shai demonstram o
potencial fusogênico da composição PF/NHR da gp41 suportando a idéia de um mecanismo
comum de fusão entre vários vírus envelopados. Desta forma, tem sido sugerido que o
posicionamento da região altamente espiralada, de forma, paralela à superfície de oposição
entre as duas membranas, mantém a ligação física entre a membrana alvo via inserção do
peptídeo de fusão e a membrana viral via ancora transmembrana (Malashkevich e cols., 1999;
Sackett e Shai, 2002).
Figura 11. Mecanismo de fusão viral. O vírus HIV ao interagir com o receptor celular
(CD4) sofre alteração conformacional que promove a exposição do peptídeo de fusão em
direção da membrana alvo. Após a interação do peptídeo com a membrana alvo a proteína
g41 passa do estado de pré-grampo para o estado de trímero de grampo ocorrendo a fusão
entre as duas membranas.
Introdução
23
Para os filovírus, o mecanismo com que o seu envelope fusiona com a membrana alvo
não está claro. Contudo, devido a alta similaridade observada entre a sua proteína de fusão e
as demais proteínas de fusão classe I, tem sido sugerido que a estrutura da GP2, obtida por
cristalográfica de raio x, é correspondente à proteína no estado ativo de fusão (Malashkevich e
cols., 1999; Takada e cols., 1997). Alguns estudos suportam a idéia de que o vírus Ebola
depende do baixo pH para sofrer alteração conformacional em sua proteína, assim como a
observada para o vírus da influenza (Takada e cols., 1997). Embora a estrutura nativa não
tenha sido determinada, o baixo pH parece estar diretamente relacionado à habilidade do vírus
iniciar a infecção. Além disso, tem sido observado que a região que compreende a estrutura
altamente espiralada também é de grande importância para a infecciosidade do vírus. Em
1999, foi visto que o loop, localizado adjacente ao final da hélice amino terminal da GP2,
serve com uma dobradiça que pode modificar a direção da hélice C-terminal quando estiver
alterando a sua conformação (Weissenhorn e cols., 1998; Malashkevich e cols., 1999). Além
disso, tem sido sugerido que após uma alteração conformacional, a hélice localizada na região
carboxi-terminal poderia interagir com a hélice amimo-terminal para formar uma
conformação estável e ativa de fusão (Watanabe e cols., 2000).
Na classe II, a proteína que contém o peptídeo fusogênico liga-se a uma outra proteína
formando um heterodímero. A segunda proteína sofre uma clivagem proteolítica expondo o
peptídeo de fusão. Essa clivagem, in vivo, ocorre devido à acidificação do endossoma durante
uma das etapas do ciclo infecioso viral, que resulta na formação de homotrímeros (Wahlberg
& Garoff, 1992 a; Gibbons e cols., 2000). A primeira proteína de fusão da classe II a ter sua
estrutura determinada a nível atômico foi a proteína E do vírus da encefalite transmitida pelo
carrapato (TBE), pertencente à família Flaviviridae (Rey e cols., 1995). Os alfavírus também
contêm proteínas de fusão classe II, e alguns trabalhos sugerem a existência de um
antepassado comum entre as proteínas de fusão dos alfavírus e dos flavivírus, devido à grande
similaridade estrutural e funcional (Figura 12) (Lescar e cols., 2001; Strauss & Strauss, 2001).
Recentemente, foi determinada a estrutura da primeira proteína de fusão para os
alfavírus, a glicoproteína E1, pertencente ao vírus da Floresta de Semliki (Lescar e cols.,
2001). Como pode ser observado na figura 12, cada um dos três domínios estruturais da
proteína E1 do vírus da Floresta de Semliki, é estruturado de forma similar aos
Introdução
24
correspondentes domínios da proteína E do vírus da encefalite transmitida pelo carrapato.
Esta proteína é composta por três domínios que formam uma estrutura de barril-β antiparalela,
com a âncora transmembrana na porção final e o peptídeo de fusão na outra extremidade da
molécula. Na sua estrutura são encontradas algumas pontes dissulfetos, as quais são de grande
importância na estabilização das folhas β, do loop do domínio II, e do domínio III (Lescar e
cols., 2001).
Figura 12. Estrutura das proteínas de fusão dos vírus classe II. Diagrama 3D da estrutura
da E1 do vírus da Floresta de Semliki (acima) e da E do vírus da encefalite transmitida pelo
carrapato (abaixo), onde os três domínios estruturais são mostrados em diferentes cores. Cores
iguais entre as estruturas determinam o mesmo domínio. Em azul claro é mostrada a região
que contém o peptídeo de fusão. As regiões N-terminal e C-terminal são representadas por N
e C, respectivamente (Adaptado de Lescar e cols., 2001).
O domínio I não apresenta nenhuma ponte dissulfeto. Em adição, a proteína E1
alongada forma uma cobertura protéica na membrana da superfície viral, de modo, similar ao
observado para o vírus TBE (Garrof e Cheng, 2001; Gibbons e Kielian, 2002). Alguns
trabalhos sugerem uma dupla funcionalidade para a glicoproteína E1, que não seria apenas
uma proteína de fusão, mas também, formaria uma estrutura de proteína icosaédrica na
C
Domínio III
Domínio I
Domínio II
Peptídeo
De Fusão
Introdução
25
superfície externa da membrana, ajudando no direcionamento da saída e da manutenção da
simetria T=4 da partícula viral. Como, os flavivírus somente possuem a proteína E em seu
envelope, acredita-se que ela seja responsável por ambos os processo, de interação ao receptor
e de fusão de membranas. Por outro lado, os alfavírus apresentam duas glicoproteínas em seu
envelope, onde uma delas é responsável pela ligação ao receptor e a outra, responsável pela
atividade de fusão de membranas. De acordo, com a diferença na funcionalidade das proteínas
de fusão destes dois gêneros virais, foi sugerido, que a importante diferença na cinética de
fusão, a qual é mais rápida para os flavivírus do que para os alfavírus, pode ser atribuída a
presença da E2 no centro da espícula (Corver e cols., 2000).
Os alfavírus ligam-se a receptores celulares para depois serem internalizados por
vesículas cobertas de clatrinas e transportados para o interior dos endossomas. Durante a
ligação ao receptor a estrutura icosaédrica do envelope é desestabilizada (Paredes e cols.,
1993). Alguns trabalhos sugerem que essa desestabilização pode facilitar a fusão entre a
membrana do endossomo e a membrana viral (Paredes e cols., 1993). No interior do
endossoma, o pH é reduzido para valores inferiores a 6,3, resultando em uma segunda
mudança conformacional irreversível nas glicoproteínas E1 e E2 em, aproximadamente, 50
ms (Fuller e cols., 1995). Como as interações entre as glicoproteínas estão enfraquecidas, o
dímero E1-E2 é dissociado, formando posteriormente homotrímeros de E1 resistentes à ação
da tripsina (Wahlberg e cols., 1992a; Gibbons e cols., 2000) (Figura 13). O homotrímero fica
centralizado enquanto que a proteína E2 torna-se periférica. Em seguida, ocorre fusão entre a
membrana da célula e a do vírus (Wahlberg e cols., 1992b).
Figura 13. Mudança conformacional na espícula viral. A esquerda é mostrada a espícula
viral ancorada na membrana, formando o heterodímero E1-E2. Após a redução de pH, para
valores inferiores a 6,3, os dímeros são dissociados. A glicoproteína E1 é interiorizada
formando homotrímeros estáveis e resistentes à tripsina. (Adaptado de Helenius, 1995).
Introdução
26
A glicoproteína E1 possui um peptídeo de fusão composto por 17 aminoácidos
altamente conservados entre os alfavírus (Figura 14A), mas que não apresentam conservação
entre diferentes famílias de vírus (Figura 14B). A região da proteína E1 que compreende ao
peptídeo de fusão (resíduos 80 - 97) apresenta alta hidrofobicidade (Figura 14A) (Strauss &
Strauss, 1994; Garoff e cols., 1980). Esses peptídeos de fusão, normalmente, são ricos em
resíduos de alanina e glicina (Kielian, 1995).
Figura 14. Domínios do peptídeo de fusão em vírus envelopados. (A) Alinhamento das
seqüências de aminoácidos entre os resíduos 78 e 98 da glicoproteína E1 em alfavírus. Os
resíduos idênticos à seqüência do SIN são indicados por traços. Os resíduos hidrofóbicos
entre os aminoácidos 80 e 90 formam um domínio hidrofóbico. (B) Comparação da seqüência
de fusão dos alfavírus com outros vírus envelopados. No vírus da influenza a região
fusogênica é encontrada na região N-terminal da proteína hemaglutinina 2 (HA2) e nos vírus
parainfluenza na região N-terminal da proteína F2. A figura mostra dois vírus pertencentes à
família Paramixoviridae, o vírus parainfluenza tipo 3 (VPI 3) e o vírus Sendai. Os resíduos
conservados entre os vários gêneros de vírus são representados por um traço. As caixas
indicam o último resíduo da seqüência hidrofóbica (Adaptado de Strauss & Strauss, 1994).
Introdução
27
Vários trabalhos têm utilizado lipossomos como modelo de estudo para caracterizar o
processo de fusão viral (Kielian & Jungerwirth, 1990; Nieva e cols., 1994; Klimjack e cols.,
1994). Para isto, os lipossomos devem ser preparados de acordo com o tipo celular que o
vírus infecta. Apesar da concentração de fosfolipídeos e esteróis apresentarem variações de
acordo com o tipo celular, alguns fosfolipídeos como esfingomielina e fosfatidiletanolamina e
esteróis como o colesterol constituem cofatores necessários para que o evento de fusão
aconteça nos alfavírus (Vashishtha e cols., 1998; Lu e cols., 1999; Lu & Kielian, 2000;
Chatterjee e cols., 2000). A eficiência de fusão entre os vírus e os lipossomos indica que a
fusão de alguns alfavírus é independente de receptor (Kielian, 1995).
Objetivos
28
OBJETIVOS
Objetivos
29
Objetivos Gerais
Compreender melhor o mecanismo de fusão de membranas envolvido na entrada de
vírus envelopados nas células.
Objetivos Específicos
ARTIGO 1
1. Caracterizar as modificações estruturais induzidas pela alta pressão hidrostática no
vírus Mayaro;
ARTIGO 2
1. Caracterizar o estado pós-fusogênico do vírus Mayaro, induzido pela alta pressão
hidrostática;
ARTIGO 3
1. Analisar estruturalmente o peptídeo de fusão do vírus Ebola;
2. Acompanhar a interação do peptídeo de fusão com membranas biológicas;
ARTIGO 4
1. Avaliar a importância de colesterol durante o processo de fusão entre membranas
miméticas induzidas pelo peptídeo de fusão do vírus Ebola.
2. Caracterização da interação do peptídeo de fusão do vírus Ebola com lipid rafts.
Materiais e Métodos
30
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e Métodos
31
1. Reagentes
Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico. A água destilada empregada nos
experimentos foi filtrada e deionizada através de um sistema de purificação Milipore. O bis-
ANS foi obtido da Molecular Probes. A uréia utilizada foi obtida da Sigma Chemical Co.
2. Lipídeos
L-α-fosfatidilcolina de ovo, fosfatidiletanolamina de ovo, esfingomielina de ovo e
colesterol foram obtidos da Avanti Polar Lipids (Alabaster, Ala.).
3. Cultura de células
Para o estudo do vírus Mayaro, células BHK-21 provenientes de rim de hamster
(Mesocricetus auratus) foram utilizadas. Essas células foram crescidas em monocamada em
garrafas de vidro e incubadas em estufa com atmosfera composta por 5 % de CO
2
a 37
o
C. O
meio de cultura utilizado foi o Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Sigma
Chemical Co.), com pH em torno de 7,5. Foram acrescentados 10 % (v/v) de soro fetal bovino
(Cultilab Co.), e 3 % (v/v) de triptose fosfato (Reagen Co.).
4. Ensaio de viabilidade celular
Os ensaios de viabilidade celular foram realizados em placas de 96 poços.
Monocamada confluente de células BHK-21, vero ou C6/36 foram incubadas na ausência ou
na presença de MβCD e em seguida foi adicionado MTT
1
. As células foram mantidas na
estufa a 37
o
C com atmosfera composta por 5 % de CO
2
durante 4 horas. Em seguida, foi
adicionada solução de solubilização, que tem por finalidade destruir os cristais de formazan
2
.
As placas foram então deixadas durante a noite na estufa e lidas no espectrofotômetro no
comprimento de onda de 570 nm. A percentagem de células viáveis foram expressas em
função das células controles (não tratadas com MβCD).
5. Dosagem de colesterol
O conteúdo de colesterol de células BHK-21, vero e C6/36 não tratadas e tratadas com
MβCD foi quantificado com o kit Amplex Red Cholesterol Assay. Monocamadas confluentes
1
MTT é a abreviatura de 3-(4, 5- dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide).
2
Formazan é o produto do metabolismo do MTT.
Materiais e Métodos
32
de células foram incubadas com MβCD por 30 min. Em seguida, foram lavadas duas vezes
com PBS e incubadas por alguns segundos com solução dissociante (Gibco). As células foram
homogeneizadas e centrifugadas por 2 min a 730 x g por 2 vezes. Em seguida, foram dosadas
com o kit mencionado anteriormente. A porcentagem de colesterol foi calculada em relação a
amostra controle (não tratada com MβCD).
6. Propagação viral
O vírus Mayaro foi obtido da American Type Culture Collection MD, U.S.A.
Monocamadas de células BHK-21 foram infectadas com o vírus Mayaro com m.o.i = 1. Após
um período de 60 minutos, em atmosfera de 5 % de CO
2
a 37
o
C, os vírus não adsorvidos à
membrana celular foram removidos, e meio de cultura DMEM contendo 10 % de soro fetal
bovino e 3 % de triptose fosfato foi adicionado. Após 48 horas as células demostraram efeito
citopático visível quando observado no microscópio invertido (ZEISS – inverted transmitted
light microscope).
7. Purificação do vírus Mayaro
O vírus Mayaro foi purificado com base em uma metodologia modificada de Rebello e
colaboradores, em 1993 (Rebello e cols., 1993). Inicialmente, o vírus foi clarificado pela
centrifugação em 8.000 r.p.m. por 20 minutos, em rotor RPR12-2; posteriormente, o
sobrenadante foi centrifugado a 32.000 r.p.m. por 1 horas e 40 minutos, em colchão de
sacarose 30 %, em rotor Beckman 45Ti. O precipitado foi ressuspendido em 1 mL de tampão
TN (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) e aplicado no topo de um gradiente descontínuo de
sacarose de 5 % a 50 %, e centrifugado a 32.000 r.p.m. por 1 hora e 30 minutos, em rotor SW-
40. As frações do gradiente de sacarose foram coletadas utilizando-se bomba peristáltica. As
frações correspondentes aos vírus purificados foram detectadas através das leituras das
absorbâncias correspondentes ao ARN (260 nm) e a proteína (280 nm) e também através do
padrão de migração eletroforético em SDS-PAGE. As frações puras foram mantidas em 4
o
C
até a realização dos experimentos. A concentração de proteína foi determinada pela
metodologia descrita por Lowry em 1951.
8. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS PAGE)
O sistema de eletroforese em gel de poliacrilamida foi utilizado para analisar o grau de
Materiais e Métodos
33
pureza do vírus Mayaro. Para isso foram utilizados géis de 10 % e de 12,5 % de
poliacrilamida (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970). As amostras foram previamente tratadas com
tampão de amostra contendo 3-mercaptoetanol 5% (v/v), SDS 10% (v/v), Tris- HCl 1,0 M pH
6,8, glicerol 8 % (v/v) e azul de bromofenol 0,2 g%. Posteriormente, as amostras foram
aquecidas a 100 °C durante 5 minutos. O sistema utilizado foi o Bio- Rad. A corrida foi
realizada fixando-se a corrente em 25 mA. Após a corrida, o gel foi corado em solução
contendo metanol 30 % e ácido acético 10 %, e Brilhant blue R 0,4 %. Foi utilizado também o
método de coloração por nitrato de prata.
9. Ensaio de titulação das amostras virais
As quantificações do vírus Mayaro foram realizadas segundo metodologia modificada
de Volkmer e Rebello (1981), através de ensaios de placa e ensaios TCID50 (Burleson e cols.,
1992; Reed & Muench, 1938). Monocamadas confluentes de células BHK-21 foram crescidas
nas placas de petri de 60 mm. As células foram infectadas com diluições seriais das amostras
por 60 minutos a 37
o
C em atmosfera de 5 % de CO
2
. O vírus não adsorvido foi descartado, e
meio de cultura contendo 1,5 % de goma Karaya ou carboximetilcelulose (CMC) (Sigma
Chemical Co.) foram adicionados à monocamada. As placas foram deixadas a 37
o
C, por 48
horas, na estufa de CO
2
. As células foram fixadas e coradas com cristal violeta 1 %, e as
placas de lise foram contadas.
10. Obtenção do peptídeo de fusão do vírus Ebola
O peptídeo EBO
16
wt e EBO16 W8A correspondentes aos 16 resíduos da região N-
terminal (GAAIGALWIPYFGPAA e GAAIGALAIPYFGPAA, respectivamente) da proteína
GP2 do vírus Ebola foram sintetizado pela Genemed Synthesis, Inc.
11. Preparação de lipossomos unilamelares
Os lipossomos, largas vesículas unilamelares (LUV) foram preparados por extrusão
como descrito anteriormente (Wahlberg e cols, 1992). Os lipídeos foram misturados em 1 mL
de clorofórmio e secos através de um fluxo contínuo de nitrogênio, o qual propiciou a
formação de um filme lipídico. O filme lipídico foi hidratado pela adição de tampão HNE (5
mM Hepes, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0.01 mM EDTA) ou tampão fosfato sob contínua agitação
por 1 hora a 50
o
C. A suspensão lipídica foi filtrada 30 vezes à temperatura ambiente
Materiais e Métodos
34
utilizando-se filtro de 0,1 ou 0,2 μm de diâmetro de poro. Os lipossomos foram estocados a 4
o
C e utilizados até 4 dias após a preparação.
12. Determinação de homotrímero resistente à tripsina
Para o ensaio de visualização do homotrímero, o vírus Mayaro foi incubado na
ausência ou na presença de lipossomos, e em seguida, tratado para diferentes pHs, alta
temperatura ou agentes desnaturantes por 10 minutos a 37
o
C. O vírus, previamente
acidificado, foi neutralizado e subseqüentemente tratado com tripsina para uma concentração
final de 200 μg/mL, assim como todos os demais vírus submetidos aos tratamentos
mencionados acima. Em seguida, o perfil de digestão foi observado por meio do SDS-PAGE.
13. Análise da estrutura secundária do vírus Mayaro
O dicroísmo circular (DC) consiste na emissão de uma luz plano polarizada que ao
passar por um modulador é dividida em dois componentes: o componente de polarização da
direita e o da esquerda. Se os componentes de polarização passam pela amostra e não são
absorvidos, eles se combinam novamente regenerando a radiação polarizada no plano
original. Entretanto, se um dos componentes é absorvido pela amostra em uma extensão maior
que o outro, o resultado da combinação dos componentes é uma radiação elipticamente
polarizada. Os experimentos de dicroísmo circular foram realizados no aparelho Jasco J-715 e
as amostras foram acondicionadas em uma cubeta de quartzo de 0,1 cm de caminho ótico. As
análises foram realizadas varrendo o espectro de 190 a 260 nm, e assim, foram acompanhadas
as estruturas em α hélice, as quais apresentam dois picos negativos em 208 e 222 nm e em
folha β, que apresenta um pico em 216 nm. As amostras foram diluídas em tampão HNE pH
7,4 para uma concentração final de 200 μg/mL
14. Determinação do conteúdo de estrutura secundária do peptídeo de fusão
14.1. Dicroísmo Circular (CD)
As medidas de CD realizadas para os peptídeos EBO
16
selvagem e seu mutante EBO
16
W8A foram feitas no espectropolarímetro Jasco J-715. As medidas foram adquiridas em
células de caminho ótico de 0,01; 0,02; 0,1 e 0,2 cm. Cada medida foi o resultado da média de
quatro aquisições individuais com resolução de 1 nm e velocidade de aquisição de 50 nm/min.
A faixa de varredura espectral foi de 190 a 260 nm. O tampão utilizado foi fosfato de potássio
Materiais e Métodos
35
10 mM, pH 7. A contração da amostra foi variada, porém todos os espectros foram
normalizados para elipcicidade molar por resíduo conforme Equação 1, possibilitando a
comparação dos espectros obtidos. onde θ é a elicicidade, l é o caminho ótico, C é a
concentração molar e N é o número de resíduos.
Equação 1 [θ] = θ 10
-1
l
-1
C
-1
N
-1
,
14.2. Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourrier (FTIR)
As medidas de FTIR foram realizadas no aparelho Nicolet Magna-IR 760
(Nicolet,Madison/ WI, U.S.A.) com célula de CaF
2`
sem espaçadores. Os espectros foram
analisados com o software EZ OMNIC v6.01 (Thermo Nicolet Corporation) e as
deconvoluções foram realizadas no programa Origin v7.0 (OriginLab corporation). As
deconvoluções foram feitas através do “fitting” das curvas originais utilizando a função
Lorentz e com informações contidas na segunda derivada do espectro original. As posições
dos picos foram obtidas pela segunda derivada do espectro original, utilizando uma distância
de 8 cm
-1
entre os picos. A padronização utilizada para o reconhecimento do conteúdo de
estrutura secundária é ilustrada foi: α-hélice (1655-1660); estrutura- β (1620-1640 e 1650-
1695) e Aleatória (1640-1657 e 1660-1670). A concentração de peptídeo utilizada foi de 19.5
mM e de vesículas foi de 43,9 mM. Todos as curvas foram obtidas a 25
o
C.
15. Análise da fluorescência de biomoléculas
A espectroscopia de fluorescência ocorre quando fótons com alto nível de energia
interagem com moléculas transferindo sua energia para estas, e levando-as para um estado
excitado. Posteriormente, as moléculas sofrem um processo espontâneo de relaxação para um
estado fundamental de maior estabilidade. O fenômeno em que as moléculas excitadas
retornam para o estado fundamental através da emissão de energia luminosa é caracterizado
como fluorescência, e está na ordem de picosegundos (Lakowicz, 1983).
Nesta tese, foram realizadas medidas de fluorescência intrínseca dos resíduos de
triptofano presentes nas proteínas, e medidas extrínsecas do fluoróforo bis-ANS (bis 1,8
anilino- naftaleno- sulfonato). O máximo de emissão de fluorescência do triptofano é
dependente do ambiente no qual esse aminoácido está localizado. Desta forma, as medidas de
Materiais e Métodos
36
fluorescência intrínseca permitem acompanhar desnaturação ou dissociação protéica através
do desvio do espectro para valores de comprimento de onda maiores (desvio para o
vermelho), decorrente da exposição do resíduo de triptofano para ambiente polar. O bis-ANS
é uma sonda fluorescente muito utilizada para análises de mudanças estruturais de proteínas.
Ele se liga não covalentemente a regiões apolares próximas às cargas positivas, permitindo o
acompanhamento de mudanças nas regiões hidrofóbicas das proteínas através do aumento de
energia emitido.
Os experimentos foram realizados utilizando o espectrofluorímetro ISS 200 (ISS Inc.,
Champaign, IL). As medidas de fluorescência intrínseca foram realizadas a partir da excitação
em 280 nm, e monitoramento da emissão de 305 a 420 nm. As medidas de fluorescência
extrínseca do bis-ANS foram obtidas pela excitação das amostras em 360 nm e emissão de
400 a 600 nm.
15.1. Ensaio de mistura de lipídeos
A mistura de lipídeos foi acompanhada por meio de ensaios de transferência de
energia ressonante (FRET) (Struck e cols., 1981). Este ensaio consiste na utilização de dois
fluoróforos, um doador de energia e um outro aceptor de energia. O doador após absorver um
quanta de energia (h
υ
) vai para o estado excitado, porém ao retornar para o estado
fundamental ele libera energia, a qual é captada pelo fluoróforo receptor. Contudo, o receptor
somente irá conseguir absorver este quanta de energia se ele estiver a uma distância mínima
necessária para que a transferência possa ocorrer. Após ele absorver está energia, ele irá para
o estado excitado e retornará para o estado fundamental por meio da emissão de fluorescência.
Para os ensaios experimentais foram preparadas vesículas lipídicas contendo 0,6 mol % de
lipídios marcados com fluoróforo doador (PE-NBD
3
) e 0,6 mol % de lipídeos marcados com
o fluoróforo aceptor (PE-Rodamina). A emissão de fluorescência foi adquirida em 534 nm,
após a amostra ser excitada em 470 nm. A intensidade de fluorescência residual, F
0
, refere-se
a ausência de mistura de lipídeos. A máxima intensidade de mistura de lipídeos, Fmax, foi
obtida seguida adição de Triton X-100. A percentagem de mistura de lipídeos para um tempo
t foi calculada segundo a Equação 2:
3
NBD significa 7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl.
Materiais e Métodos
37
Equação 2. % mistura de lipídeos= [(F
t
-F
0
)/(F
max
-F
0
)] X 100
15.2. Ensaio de supressão de fluorescência do triptofano
A supressão da fluorescência do triptofano pode ocorrer de diferentes formas. Ela
pode ser colisional ou estática. A colisional ou dinâmica, é aquele em que o agente supressor
colide com o fluoróforo, enquanto que a estática é aquela em que a formação de complexos
moleculares leva à supressão do fluoróforo. Como neste trabalho somente será abordada a
supressão dinâmica, iremos nos restringir a ela.
Existe um componente espacial para quase todas as reações de supressão colisional
por aminas, este componente é o curto-alcance de < 2 Å do supressor em relação ao
fluoróforo, o que faz com que o contato molecular seja um requerimento para a supressão.
Sendo assim, a taxa de supressão é proporcional a concentração do agente supressor e é
descrita pela equação de Stern-Volmer (Equação 3) (Lakowicz, 1983):
Equação 3. F
0
/F = 1 +
τ
o
K
q
[Q] = 1 + Ksv [Q],
onde F
0
e F são as intensidades de fluorescência na ausência e na presença do agente
supressor [Q], respectivamente. K
q
é a constante de supressão biomolecular. O
τ
o
é o tempo de
vida do triptofano no estado excitado na ausência de supressor. O K
SV
é a constante de Stern-
Volmer. Ela é obtida da inclinação da curva de Stern-Volmer, e é uma medida da
acessibilidade do triptofano pelo supressor.
15.2.1. Ensaio de supressão de fluorescência do triptofano do peptídeo EBO
16
A inserção do peptídeo EBO
16
selvagem nas micelas de SDS pôde ser monitorada
através de mudanças na fluorescência intrínseca do resíduo de Trp presente na seqüência
primária do peptídeo. O agente supressor utilizado foi a acrilamida, devido à facilidade de
obtenção e também pela ampla caracterização já realizada para este tipo de abordagem
experimental (Pécheur e cols., 1998). Desta forma, quantidades crescentes de uma solução
estoque de acrilamida (1 M) foram acrescentadas a uma solução contendo peptídeos (10 μM)
na presença de micelas de SDS. Os espectros de emissão de fluorescência do Trp8 na
presença de micelas de SDS foram monitorados entre 300 nm e 420 nm para uma excitação
em 280 nm em tampão fosfato de potássio 15 mM (pH 7,0).
Materiais e Métodos
38
15.2.2. Ensaio de supressão de fluorescência do triptofano do vírus Mayaro
A interação do vírus Mayaro com lipossomos foi acompanhada por meio da supressão
de fluorescência dos triptofanos presentes nas glicoproteínas virais. O ensaio foi realizado
pela incubação do vírus após diferentes tratamentos químicos e físicos, juntamente com
vesículas lipídicas compostas por PC:PE:SPM:Cho nas razões molares de 1:1:1:1.5. Como o
peptídeo de fusão viral apresenta um resíduo de triptofano, caso ele fosse exposto devido
alguns dos tratamentos, nós poderíamos monitorá-lo por meio da supressão pela acrilamida.
Desta forma, antes e após cada tratamento, curvas de supressão foram realizadas. A
concentração viral utilizada foi de 200 μg/mL. A concentração de lipossomos foi de 1 mM.
16. Anáslise da agregação vesicular utilizando espalhamento de luz dinâmico (DLS)
As análises de espalhamento de luz dinâmico foram realizadas com o intuito de
observarmos o raio hidrodinâmico aparente (R
h
) das vesículas após serem incubadas com os
peptídeos de fusão do vírus Ebola. O aparelho utilizado foi um Zetasizer Nano ZS (Malvern,
United Kingdom). As medidas de espalhamentos foram feitas por backscatter para um ângulo
fixo de 173
o
. O programa utilizado para análise foi o DTS nano v4.2 (Malvern Instruments
Ltd.). A concentração do peptídeo foi de 100 μM. A concentração das vesículas foi de 1 mM.
Os experimentos foram realizados a 37
o
C.
17. Calorimetria de titulação
As curvas de titulação foram realizadas no aparelho VP isothermal titration
calorimetry produzido pela MicroCal Inc. (Northampton, MA). As soluções aplicadas na cela
foram previamente degasificadas por 5 minutos a 37
o
C. Cada curva foi composta por 14
injeções de 5 μL do estoque de 20 mM de vesículas. Dentro da cela foi colocado o peptídeo
de fusão do vírus Ebola na concentração de 100 μM. As curvas foram subtraídas do controle
(cela contendo peptídeo e seringa contendo tampão) e analisadas com o programa
MicroCalOrigin (OriginLab corporation).
18. O Preparo das amostras para RMN
Os peptídeos de fusão do vírus Ebola foram homogeneizado em tampão fosfato de
potássio (pH 7,0) para uma concentração final de 3 mM. Em seguida, foi adicionado SDS
para concentração final de 400 mM. Para o sinal de lock foi adicionado 10 % (v/v) de D
2
O.
Materiais e Métodos
39
19. Espectros de RMN
Os espectros de RMN foram adquiridos no aparelho Bruker DRX-600 operando na
freqüência de 600 MHZ. O sinal da água foi suprimido utilizando uma seqüência de pulso
Wartergate. Todos os dados foram adquiridos no modo sensível à fase usando State-TPPI.
Para o ajuste de fase e, conseqüente, processamento dos espectros foram utilizados os
programas NMRPipe e o NMRDraw (National Institute of Health (NIH), Bethesda,
Meryland).
19.1. Espectroscopia de correlação total (TOCSY)
O TOCSY também conhecido como HOHAHA (“Homonuclear Hartmann-Hahn”), é
um dos experimentos básicos para a determinação de estruturas de proteínas por RMN. Ele
utiliza o tempo de mistura para a transferência de magnetização entre spins via acoplamento
escalar forte. Como resultado a magnetização pode ser transferida por vários acoplamentos,
promovendo picos cruzados entre todas as ressonâncias de um sistema de spin. O que se
observa no TOCSY são picos cruzados a partir de cada spin do resíduo. Cada um desses
conjuntos de picos verticais é um sistema de spin pertencente a um resíduo de aminoácido.
Para o TOCSY o tempo de mistura (mixing time) foi de 120 ms, utilizando a seqüência
MLEV-17.
19.2. Espectroscopia de efeito Overhauser Nuclear (NOESY)
O NOESY utiliza o acoplamento dipolar como forma de transferência de
magnetização, durante o tempo de mistura. O que se observa no espectro de NOESY são
ressonâncias entre prótons a uma distância máxima de 5Å entre si. Desta forma, além dos
picos que aparecem no TOCSY, no NOESY aparecerão picos representando conexões
espaciais entre os sistemas de spin. Sendo este, uma importante ferramenta para o
assinalamento seqüencial. Para o NOESY o tempo de mistura foi de 80 ms. A temperatura de
realização dos experimentos foi de 25
o
C.
20. Assinalamento do espectro
O assinalamento
1
H dos sistemas de spin foi realizado através do espectro 2D TOCSY
e com uso do programa nmrView (Johnson e Blevins, 1994) como ferramenta de visualização.
Com o tempo de mistura de 120 ms, a maioria dos sistemas de spins mostraram-se completos.
Materiais e Métodos
40
O assinalamento seqüencial foi realizado através do 2D NOESY, de forma interativa com o
cálculo da estrutura. Inicialmente, partiu-se de uma cadeia peptídica linear, onde os NOEs
estabelecidos entre sistemas de spins de resíduos vizinhos foram os primeiros a serem
assinalados. Os NOEs assinalados puderam ser classificados, de acordo com a sua distância
seqüencial.
Distância seqüencial são aquelas entre os prótons do esqueleto carbônico ou entre um
próton do esqueleto e um próton β dos resíduos que estão próximos na seqüência de
aminoácidos. As distâncias podem ser divididas da seguinte forma: distância de curto alcance,
ou seqüencial, é aquela estabelecida entre prótons de aminoácidos i e seu vizinho i + 1;
distância de médio alcance, a qual, engloba todas as distâncias entre os inter-resíduos não
seqüenciais e o próton do esqueleto. Distâncias de longo alcance, são aquelas estabelecidas
com prótons do esqueleto que estão a mais de seis posições na seqüência. Todos os demais
inter-resíduos são referidos como de longa distância.
Com o espectro todo assinalado, foram obtidas evidências de tendência helicoidal do
peptídeo, quando se analisava os valores de deslocamento químico adquiridos
experimentalmente com relação aos valores padrão.
21. Cálculo da estrutura tridimensional do peptídeo de fusão do vírus Ebola
Para o cálculo da estrutura tridimensional do peptídeo foi utilizado o programa
cns_solve v.1.1 (Brunger e cols., 2000). Neste programa foram inseridas restrições de
distância
1
H-
1
H derivadas das medidas de NOEs. Para se calcular a distância alvo, tomamos
por base as intensidades ou volumes de cada NOE. A média dos 10 NOEs de menor
intensidade foi associada a distância de 5Å. Utilizando a equação I = α .1/r6 calculamos o
parâmetro de proporcionalidade α. A partir do α obtido, foi possível calcular as distâncias
alvo para cada NOE. Baseado na distância alvo classificamos com fraco, médio ou forte.
Sendo, os NOEs fracos aqueles com distâncias > 3,4 Å; os médios aqueles com distâncias
entre 3,4Å e 2,8 Å; os fortes aqueles com distâncias inferiores a 2,8 Å e 1,8 Å. Na tabela de
cálculo utilizamos:
NOEs fracos 1,8 – 5
NOEs Médios 1,8 – 3,4
Materiais e Métodos
41
NOEs fortes 1,8 – 2,8
No total foram adicionadas 148 restrições de NOE, e destas foram geradas 20
estruturas. O protocolo partiu de 50000 K, em fase quente de ângulos torcionais, sendo
resfriada até 0 K em uma fase fria de ângulo torcional. As 20 estruturas geradas foram
submetidas ao programas PROCHECK-NMR, e através das figuras de Ramachandram foi
possível verificar a coerência das estruturas em análise.
Resultados
42
RESULTADOS
Artigo 1. The fusogenic state of Mayaro virus induced by low pH and by hydrostatic pressure
Freitas e cols., 2006. Cell Biochemistry and Biophysics 44: 325- 335.
43
ARTIGO 1
Artigo 1. The fusogenic state of Mayaro virus induced by low pH and by hydrostatic pressure
Freitas e cols., 2006. Cell Biochemistry and Biophysics 44: 325- 335.
44
Como previamente descrito, a alta pressão promove um rearranjo estrutural nas
proteínas de superfície viral, conduzindo à exposição de regiões hidrofóbicas. Estas regiões
foram caracterizadas como possíveis pontos de interação com a membrana celular. No caso
dos alfavírus, especificamente para o vírus Sindbis, foi observado um aumento de sua
capacidade de induzir fusão do seu envelope com lipossomos. Com o objetivo de
caracterizarmos melhor este evento, utilizamos um outro alfavírus como modelo de estudo.
Neste caso, o modelo experimental não é considerado protótipo da família Togaviridae,
apesar de ter sido amplamente estudado.
Neste trabalho nós mostramos os efeitos induzidos pela alta pressão hidrostática na
estrutura do vírus Mayaro. Como pode ser observado, a pressão hidrostática foi capaz de
induzir inativação parcial da população viral analisada, promovendo a perda de,
aproximadamente, 7 ordens de magnitude na infecciosidade viral. Esta perda de atividade foi
associada às modificações na arquitetura das proteínas presentes no envelope viral, as quais
passaram a adotar uma conformação trimérica. Esta nova estruturação esta intimamente
correlacionada à atividade fusogênica deste vírus. De fato, foi possível observar que partículas
virais pressurizadas por 8 horas a 2.5 kbar foram capazes de fusionar o seu envelope com a
membrana de vesículas miméticas. Logicamente, como o efeito da pressão hidrostática não
foi o suficiente para induzir 100 % de inativação viral, a quantidade de partículas virais no
estado ativo de fusão também não foi máxima. Por este motivo, observamos que a extensão de
mistura de lipídeos do vírus pressurizado foi inferior à detectada em baixo pH.
A grande problemática de se compreender, mais profundamente, como que se dá a
fusão de membranas reside no fato de que o baixo pH induz perda de estrutura secundária, ou
seja, ele prepara o vírus para em milisegundos induzir fusão, mas depois desnatura a proteína
viral. Sendo assim, a faixa temporal para se estudar este evento é um fator limitante com
relação às técnicas existentes atualmente. Contudo, utilizando a alta pressão hidrostática, foi
possível isolar esta conformação, de modo que a mesma pudesse ser analisada em outra escala
de tempo, agora compatível com as técnicas existentes.
Artigo 1. The fusogenic state of Mayaro virus induced by low pH and by hydrostatic pressure
Freitas e cols., 2006. Cell Biochemistry and Biophysics 44: 325- 335.
45
Artigo 1. The fusogenic state of Mayaro virus induced by low pH and by hydrostatic pressure
Freitas e cols., 2006. Cell Biochemistry and Biophysics 44: 325- 335.
46
Artigo 1. The fusogenic state of Mayaro virus induced by low pH and by hydrostatic pressure
Freitas e cols., 2006. Cell Biochemistry and Biophysics 44: 325- 335.
47
Artigo 1. The fusogenic state of Mayaro virus induced by low pH and by hydrostatic pressure
Freitas e cols., 2006. Cell Biochemistry and Biophysics 44: 325- 335.
48
Artigo 1. The fusogenic state of Mayaro virus induced by low pH and by hydrostatic pressure
Freitas e cols., 2006. Cell Biochemistry and Biophysics 44: 325- 335.
49
Artigo 1. The fusogenic state of Mayaro virus induced by low pH and by hydrostatic pressure
Freitas e cols., 2006. Cell Biochemistry and Biophysics 44: 325- 335.
50
Artigo 1. The fusogenic state of Mayaro virus induced by low pH and by hydrostatic pressure
Freitas e cols., 2006. Cell Biochemistry and Biophysics 44: 325- 335.
51
Artigo 1. The fusogenic state of Mayaro virus induced by low pH and by hydrostatic pressure
Freitas e cols., 2006. Cell Biochemistry and Biophysics 44: 325- 335.
52
Artigo 1. The fusogenic state of Mayaro virus induced by low pH and by hydrostatic pressure
Freitas e cols., 2006. Cell Biochemistry and Biophysics 44: 325- 335.
53
Artigo 1. The fusogenic state of Mayaro virus induced by low pH and by hydrostatic pressure
Freitas e cols., 2006. Cell Biochemistry and Biophysics 44: 325- 335.
54
Artigo 1. The fusogenic state of Mayaro virus induced by low pH and by hydrostatic pressure
Freitas e cols., 2006. Cell Biochemistry and Biophysics 44: 325- 335.
55
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
56
ARTIGO 2
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
57
Alguns vírus envelopados, assim como o vírus da Influenza, apresentam a
característica de serem inativados se pré-incubados em baixo pH na ausência de membrana
alvo (Carr et al., 1997). A teoria existente, diz que a energia envolvida na mudança estrutural
decorrente a acidificação do meio, seria dissipada. Por este motivo, não teria energia
suficiente para perturbar a membrana celular de modo a induzir fusão entre o envelope viral e
a membrana alvo. Contudo, quando estes vírus eram incubados em pH ácido, na presença de
membranas, a inativação não era observada, pois a energia teria sido utilizada no momento
certo, corroborando a teoria existente. Em contraste, o vírus pressurizado não apresenta
inativação para fusão quando pressurizado na ausência de membranas. Desta forma, tem nos
feito supor a existência de incoerência na teoria de inativação viral. Por este motivo, este
trabalho visa encontrar características estruturais que justificassem os diferentes perfis de
inativação encontrados entre o vírus em baixo pH e o vírus pressurizado.
Os nossos dados mostram que todo o processo envolvido na ativação do vírus Mayaro
para fusão ocorre da mesma forma quando pressurizado e quando exposto ao baixo pH. Fato
este constatado pela semelhante exposição do peptídeo de fusão viral quando o vírus foi
submetido a ambos os tratamentos. Porém o perfil calorimétrico levanta a suspeita da
existência de algum fator que poderia potencializar a atividade de fusão quando o vírus é
pressurizado, justificando a manutenção da atividade de fusão no vírus após este tratamento.
Estes estudos conduzem a novas possibilidades para tentar explicar o mecanismo de fusão de
membranas. Sugerindo que o vírus para entrar na célula necessita sofrer e induzir um
complexo rearranjo estrutural e energético em sua superfície e na membrana da célula alvo.
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
58
Calorimetric and Fluorescence Characterization of the fusion active state
of Mayaro Virus induced by Hydrostatic Pressure
Mônica S. Freitas*, Guilherme A. P. Oliveira*, Maria L. Bianconi
#
and Jerson L.
Silva*
§
*Programa de Biologia Estrutural, Instituto de Bioquímica Médica, Centro Nacional
de Ressonância Magnética Nuclear de Macromoléculas Jiri Jonas, Universidade Federal do
Rio de Janeiro, 21941-590 Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
§
To whom correspondence and reprint requests should be addressed. Mailing address:
Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-590 Rio de
Janeiro, RJ, Brazil. Phone: 55-21-2562-6761; Fax: 55-21-3881-4155.
E-mail address: [email protected]
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
59
ABSTRACT
Mayaro is an enveloped virus that belongs to Alphavirus. The infectious cycle
comprise many types of protein-protein and protein-nucleic acid interactions. The virus
surface is composed of two noncovalently associated subunits, which play a critical role in the
viral life cycle. The Mayaro E1 and E2 subunits are responsible for mediating membrane
fusion and binding to cell-surface receptors, respectively. Although the alphaviruses have
been extensively studied, their fusion mechanism has not been completely elucidated. In this
work, we evaluate the correlation between virus conformational changes and the energetic
behavior of membrane fusion, using calorimetric and fluorescence approaches. We treated
Mayaro virus either wih low pH or high hydrostatic pressure induces vesicle leakage.
Moreover, the reorganization of viral protein is followed by increase in acrilamide
accessibility, which shows that both treatments were able to exposure a tryptophan residue
that interacts with lipid membrane during membrane fusion. We believe that this tryptophan
belongs to Mayaro fusion peptide. Calorimetric titration has allowed us to discriminate
between the energies involved in fusion and in conformational changes that are important for
virus entry into the target cells. Our results show the importance to understand the viral fusion
protein structurally and thermodynamically for the development of efficient antiviral
compounds.
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
60
INTRODUCTION
Virus infection requires fusion of the membrane on virus surfaces with the membrane
surrounding a target cell. However, specialized viral proteins are involved in the promotion of
membrane fusion (Lescar et al., 2001). This process, in general, is very slow and requires an
input of energy in order to destabilize the lipid bilayer (Carr et al., 1997). Some virus contains
a complex of two subunits that are responsible for binding to receptor on cell surface and for
promotion of the membrane fusion (Malashkevich et al., 1999). The Mayaro virus is
composed of two glycoproteins: E1, which mediates the interaction between virus and target
membrane and E2 that promotes membrane fusion. They are organized in 80 hetero-
oligomeric spikes. A single spike is composed of a trimer of E1/E2 heterodimers, which are
disulfide- bonded. The E1/E2 heterodimer mediates the infectious of Mayaro into its target
cell. The initial step in cell infection is the interaction of E2 with a cellular receptor.
Therefore, the virus particle is internalized through receptor mediated endocytosis and the
slightly acidic pH within the lumen of endosomes triggers the membrane fusion reaction.
Recently, we showed that high hydrostatic pressure induced conformational alteration on E1
structure leading this virus to fusion with target membrane (Freitas et al., 2006). It is believed
that E1 protein in its post-fusion conformation is considerably more stable than in its pre-
fusion form (metastable form).
Here we describe the effects of high hydrostatic pressure and low pH on the fusion
protein activity. We demonstrate that Mayaro virus after pressurization is able to induce pore
formation. Besides, we demonstrate either high hydrostatic pressure or low pH is able to
expose the fusion peptide, which is buried in the target membrane after fusion. The similar
behavior showed for fusion triggered by pressure and low pH, was corroborated by
calorimetric assays. Our data indicate a way to isolate a post-fusion protein conformation.
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
61
RESULTS AND DISCUSSION
In order to evaluate the capacity of Mayaro virus to induce vesicle permeabilization we used a
leakage assay. The dyes ANTS/DPX were encapsulated inside the LUVs composed of
PC:PE:SPM:Cho. Since DPX is a colisional quencher of ANTS, in the absence of fusion the
ANTS fluorescence is quenched, but in the presence of the leakage of vesicular content, the
DPX is diluted and ANTS fluorescence is increased. As observed in Fig. 1A, Mayaro virus
was able to induce vesicle destabilization in a pH dependent manner. At pH 5 and 5.5 was
observed, approximately, 50 % of leakage after 10 min (Fig. 1A). Interestingly, at pH 6 we
observed 60 % of fusion and the kinetic was faster than that found at pH 5 and 5.5. As this
experiment cannot distinguish between leakage and aqueous content mixing, it was not
possible to know the reason for this discrepancy. However, it was possible identify the virus
inactivation induced by pre-treatment at pH 6 (Fig 1, d). Besides, we showed that high
hydrostatic pressure was also able to induce membrane stabilization (Fig. 1B). Therefore, we
reinforce the fusion active state previously suggested by Freitas et al. (Freitas et al., 2006).
However, virus particles under pressure also were able to permeabilize lipid membranes, a
little more than the observed for free vesicles. Thus, the data indicate that hydrostatic pressure
could be changing not solely the virus protein but its lipid envelope. The data show that
Mayaro virus is able to fuse with vesicles.
Mayaro virus binding to lipid membrane
To investigate the conformational changes induced by high hydrostatic pressure and low pH
on virus surface, such as Trp exposure, a quencher of Trp fluorescence, acrylamide, was used.
This strategy is interesting, owing to the presence of one tryptophan residue at position 89 in
the E1 sequence that belongs to fusion peptide (Strauss and Strauss, 1994). Stern-Volmer
plots for the quenching of Trp by acrilamide are depicted in Fig. 2. The data show that
Mayaro virus at neutral and acidic pH or previously submitted to high hydrostatic pressure
were similarly quenched (Fig. 2A). However, was observed a deviation from linearity of the
Stern-Volmer plot, suggesting the existence of more than one population (Fig. 2A). Mayaro
virus contains two enveloped glycoproteins, E1 and E2, which both of them are composed of
four Trp residues (Netto et al., 2000). The Trp are located in closed to proximity to each other
in E2 protein, but in E1 protein was observed a widely distribution. Since, low pH and
hydrostatic pressure are able to induce conformational changes on viral glycoproteins from
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
62
native state to fusion active conformation (Freitas et al., 2006), a previously buried Trp 89
could become exposed. In order to evaluate the interaction of previous exposed Trp induced
by low pH or hydrostatic pressure we incubate the Mayaro virus with liposomes and the
quenching assays were performed. As observed, in the presence of LUVs was observed a less
decrement in fluorescence intensity in all conditions (Fig. 2B). Thus, revealing that Trp are
less accessible to acrylamide. However, the virus at pH 5.5 and pressurized showed similar
profile of accessibility, suggesting that the similar region interacts with liposomes (Fig. 2B).
Therefore, the mechanism of membrane fusion seems to be similarly induced by low pH and
hydrostatic pressure.
Energetic of interaction between Mayaro virus with membranes
The fusion active states induced by low pH and high hydrostatic pressure have been
shown to be remarkably similar (Gaspar et al., 2002; Freitas et al., 2006). However, when the
virus particles are incubated at low pH in the absence of lipid membrane it has a
conformational change, but is inactivated to fusion. On the other hand, the virus particles
pressurized in the absence of lipid membrane remains fusion-active after decompression. We
believed that low pH is a very effective form to trigger membrane fusion, because it induces a
very fast conformational change. However, long period of incubation at low pH without
interaction with target membrane, could be responsible for lost of secondary structure that
impaired the ability to fusion (Gaspar et al., 2002). Influenza virus is another virus for which
acidic inactivation was observed (Korte et al., 1999). However, the influence of a low-pH
preincubation of influenza virus has been showed to be dependent on the virus strain as well
as the chosen pH (Korte et al., 1999). For A/PR/8/34 HA a correlation was showed between
inactivation and loss of spike morphology as determined by cryoelectron microscopy
(Shangguan et al., 1999).
In order to investigate the differences between fusion active state induced by low pH
and hydrostatic pressure, we use a calorimetric approach. The Fig. 3 shows the titration curve
for Mayaro virus submitted to low pH. Eight injections (each 10 μL) of Mayaro virus at pH
7.4 were injected into calorimetric cell containing buffer at pH 5.5. As observed, the
injections resulted in an exothermic and an endothermic responses, which were attributed to
protonation and conformational changes heats (Fig. 3A). However, in the presence of
liposomes, were observed only endothermic contributions, suggesting that membrane fusion
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
63
requires heat absorption (Fig. 3B). In order to discriminate between protonation,
conformational changes and fusion heats, we subtract the isotherm showed in Fig 3B minus in
Fig 3A, that results only in the fusion heat contribution, as showed in Fig 4A. Besides, the
data showed a slow endothermic component that was decreasing during titration curve (Fig
4A). Then, the virus inactivation induced by low pH could be justified by energy loss during
protein activation, as have been described for influenza virus (Korte et al., 1999; Kielian and
Rey, 2006). However, pressurized virus in the presence of liposomes showed two heats
contributions, in this case, the exothermic contribution could be associated with Mayaro virus
particles that were not affected by pressurization (Fig. 4B). The partial effect induced by
hydrostatic pressure was demonstrated for Mayaro virus, in which its treatment for 8 hour at
2.5 kbar, was able to induce a decrease of seven order of magnitude in the virus infectivity
(Freitas et al., 2006). On the other hand, the endothermic heat was also related to fusion
process, showing a good agreement with the energetic behavior found to Mayaro virus at low
pH (Fig. 4B).
Hydrostatic pressure is a physical tool that introduces solely volume change during
macromolecular perturbation in solution (Silva et al., 2001). In contrast, high temperature
effects depend on several factors, such as total energy and volume. Ruigrok et al., reported
that heat can induce influenza fusion with liposome at neutral pH. However, they also showed
that this treatment alter the biochemical properties of the HA ectodomain more extensively
and less specified than that of the acid-induced conformational change (Ruigrok et al., 1986).
In this context, high pressure seems to induce a similar fusion mechanism for Mayaro virus
than observed at low pH. Thus, we introduce a new approach to investigate in more details the
conformational changes that trigger the fusion process.
Concluding remarks
The membrane fusion process seems to be a complex cascade of events that remains to
be elucidated. In this work, we pointed out the possibility that to use high hydrostatic pressure
to isolate the fusion active conformation for advanced studies that could be important to drug
design of antiviral that block virus particle in the metastable state. In this way the atomic
structure of E1 protein after pressurization may lead to the understanding of membrane fusion
and the myriad of conformational changes associated with cell entry.
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
64
Materials and methods
Chemicals
All reagents were of analytical grade. Distilled water was deionized and filtered through a
Millipore water purification system. The spectroscopic experiments were performed at 25 °C
in the standard buffer: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA (pH 7.4). Ultra-pure urea
was obtained from Sigma. Tris was chosen as buffer because their pK
a
values do not change
significantly under pressure. At 3.0 kbar, the value of pK
a
increases by only 0.1 unit (Neuman
et al., 1973). The following lipids used to make synthetic vesicles were ordered from Avanti
Polar Lipids (Alabaster, Ala): L-alpha-phosphatidyl choline from egg yolk, L-alpha-
phosphatidyl ethanolamine (made by transphosphatidylation of egg lecithin in the presence of
ethanolamine), sphingomyelin from egg and cholesterol, N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-
yl)diacyl phosphatidylethanolamine (N-NBD-PE) and lissamine-rhodamine-
phosphatidylethanolamine (N-Rh-PE).
Cells and virus
Baby Hamster Kidney (BHK-21) and Green Monkey Kidney (Vero) cells were maintained
and propagated as monolayers in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Sigma
Chemical Co.), supplemented with 10 % fetal bovine serum (Cultilab) and 3 % tryptose
phosphate (Difco Co.) and grown at 37 °C in a 5 % C0
2
incubator. Mayaro virus (VR-1277)
was obtained from the American Type Culture Collection (Rockville, MD, U.S.A).
Virus propagation and purification
Mayaro virus was grown in BHK-21 cells and propagated for 48 h in roller bottles at 37 °C.
After propagation, when a > 90 % cytopathic effect was evident, the supernatant was
collected and cleared of any cellular debris in a Hitachi centrifuge at 3,000 × g for 20 min at 4
°C. Mayaro virus was purified as previously described (Gaspar et al., 2001). Purified viruses
were harvested and dialyzed overnight at 4 °C against 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM
EDTA buffer (pH 7.4). Viral stocks were kept at –80 °C in ∼5 % (w/w) sucrose in 50 mM
Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA pH 7.5.
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
65
Liposomes
Large unilamelar vesicles (LUV) consisting of L-alpha-phosphatidyl choline (from egg yolk),
L-alpha-phosphatidyl ethanolamine (derived from egg phosphatidylcholine by
transphosphatidylation), sphingomyelin (from bovine brain) and cholesterol at a molar ratio of
1:1:1:1.5, respectively, were prepared according to the extrusion method previously described
(Hope et al., 1985) in HNE buffer (5 mM HEPES, 150 mM NaCl and 0.1 mM EDTA) (pH
7.4), 12.5 mM ANTS and 45 mM DPX. Lipid films were dissolved in chloroform and dried
under a stream of nitrogen. The lipid film formed was hydrated in 1 mL of HNE buffer.
Extrusion was done 20 times through stacked polycarbonate filters with a pore-size of 0.2 µm
(Nucleopore, Inc., Pleasanton, CA).
Leakage assay
Leakage between Mayaro virus and liposomes was performed by fluorescence quenching
assay (Smolarsky et al., 1977). This assay is based on the collisional quenching of the
polyanionic fluorophore ANTS by the cationic quencher DPX. Fluorescence was recorded at
excitation and emission wavelengths of 353 nm and 523 nm respectively, using an ISS PC1
spectrofluorometer. Measurements were carried out using 1 ml of sample in HNE buffer (pH
7,4). The reaction was beginning by addition of Mayaro virus. The initial fluorescence
intensity, F
0
, was taken as zero. The maximum fluorescence intensity, F
max
, was obtained by
disruption of the labeled lipids with Triton X-100 1%. The % lipid mixing at time t is given
by: [(F
t
-F
0
)/(Fmax-F
0
)]100.
High pressure and fluorescence
Fluorescence measurements were recorded on ISSPC1 spectrofluorometers (ISS Inc.,
Champaign, IL). The aromatic residues (tryptophan and tyrosine) residues were excited at 280
nm and emission was observed from 305 to 420 nm. The fluorescence quenching experiments
were performed with 50- 350 mM acrylamide as an extrinsic quencher. The fluorescence
quenching data were analyzed according to the Stern-Volmer relationship (Lehrer, 1971):
F
0
/F = 1 + Ksv [Q] (1)
where F
0
and F are the fluorescence intensities in the absence and in the presence of the
quencher, [Q] is the quencher concentration and Ksv is the quenching constant. The virus
concentration was 50 μg/mL. The liposome concentration was 1 mM.
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
66
Isothermal titration calorimetry. All measurements were carried out at 37
o
C in a VP
isothermal titration calorimetry produced by MicroCal Inc. (Northampton, MA). All solutions
were degassed for 5 min prior to use. For each injection, 10 μL of 280 μg/mL of Mayaro virus
were injected into the sample cell which contained 1 mM of LUVs. Data handling (baseline
subtraction, peak integration, sample dilution) procedures were performed with MicroCal
Origin software.
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
67
REFERENCES
Carr, C. M., Chaudhry, C., Kim, P. S. (1997). Influenza hemagglutinin is spring-loaded by a
metastable native conformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 14306-14313.
Freitas, M., Da Poian, A. T., Barth, O. M., Rebello, M. A., Silva, J. L. and Gaspar, L. P.
(2006). The fusogenic state of Mayaro virus induced by low pH and by hydrostatic pressure.
Cell Biochem Biophys. 44, 325-335.
Gaspar, L. P., Silva, A. C., Gomes, A. M., Freitas, M. S., Ano Bom, A. P., Schwarcz, W. D.,
Mestecky, J., Novak, M. J., Foguel, D. and Silva, J. L. (2002). Hydrostatic pressure induces
the fusion-active state of enveloped viruses. J. Biol. Chem. 277, 8433-8439.
Gaspar, L. P., Terezan, A. F., Pinheiro, A. S., Foguel, D., Rebello, M. A. and Silva, J. L.
(2001). The metastable state of nucleocapsids of enveloped viruses as probed by high
hydrostatic pressure. J. Biol. Chem. 276, 7415-7421.
Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G. and Cullis, P. R. (1985). Production of large unilamellar
vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume
and ability to maintain a membrane potential. Biochim. Biophys. Acta 812, 55- 65.
Korte, T., Ludwig, K., Booy, F. P., Blumenthal, R. and Herrmann, A. (1999). Conformational
Intermediates and Fusion Activity of Influenza Virus Hemagglutinin. J. Virol. 76, 4567–4574.
Lehrer, S. S. (1971). Solute perturbation of protein fluorescence. The quenching of the
tryptophyl fluorescence of model compounds and of lysozyme by iodide ion. Biochemistry
10, 3254- 3263.
Lescar J., Roussel, A., Wien, M. W., Navaza, J., Fuller, S. D., Wengler, G., Wengler, G., Rey,
F. A. (2001). The Fusion glycoprotein shell of Semliki Forest virus: an icosahedral assembly
primed for fusogenic activation at endosomal pH. Cell 105, 137-148.
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
68
Malashkevich VN, Schneider BJ, McNally ML, Milhollen MA, Pang JX, Kim PS (1999).
Core structure of the envelope glycoprotein GP2 from Ebola virus at 1.9-A resolution. Proc
Natl. Acad. Sci. U S A. 96, 2662-2667.
Netto, M. C. M. G., Shirako, Y., Strauss, E. G., Carvalho, M. G. C. And Strauss, J. H. (2000).
Mayaro virus, complete genome. NC_003417.
Neuman, R. C., Kauzmann, W. and Zipp, A. (1973). Pressure dependence of weak acid
ionization in aqueous buffers. J. Phys. Chem. 77, 2687-2691.
Ruigrok, R. W. H., Martin, S. R., Wharton, S. A., Skehel, J. J., Bayley, P. M. & Wiley, D. C.
(1986). Conformational changes in the hemagglutinin of influenza virus which accompany
heat-induced fusion of virus with liposomes. Virology 155, 484–497.
Shangguan, T., Siegel, D. P., Lear, J. D., Axelsen, P. H., Alford, D. and Bentz, J. (1998).
Morphological changes and fusogenic activity of influenza virus hemagglutinin. Biophys. J.
74, 54–62.
Smolarsky, M., Teitelbaum, D., Sela, M. and Gitler, C. (1977). A simple fluorescent method
to determine complement-mediated liposome immune lysis. J. Immunol. Methods. 15, 255-
265.
Strauss, J. H. and Strauss, E. G. (1994). The alphavirus: gene expression, replication, and
evolution. Microbiological Reviews 58, 491- 562.
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
69
LEGENDS
Figure 1. Leakage of liposomes induced by Mayaro virus. Leakage was measured at 37 °C by
measurement of the collisional quenching between the fluorophoro (ANTS) and the quencher
(DPX), as determined by an increase in ANTS fluorescence. (A) Mayaro virus at low pH. pH
6.0 (a); 5.0 (b); 5.5 (c); pre-incubated at pH 6.0 (d); 7.0 (e). Virus concentration was 200
μg/mL (B) Mayaro virus under and after pressurization. Mayaro virus was submitted at 2.5
kbar for 8 hours and after was incubated with LUVs (a); Mayaro virus under pressure at 2.5
kbar in the presence of LUVs (b); vesicle control under pressure at 2.5 kbar (c). Virus
concentration was 400 μg/mL. The sample was excited at 353 nm and emission was collected
at 523 nm
Figure 2. Stern-Volmer plots for the quenching of the fluorescence of Trp of Mayaro virus
glycoproteins by acrylamide (Q) in the absence (A) or in the presence (B) of LUVs. Mayaro
virus was incubated at pH 5.5 (■) or pH at pH 7.4 (▲) or was submitted at 2.5 kbar for 8
hours (●) and after was assayed. Increasing concentrations of acrylamide were added, and Trp
fluorescence was recorded at 320 nm (λ
exc
= 280 nm). The virus concentration was 50 μg/mL
and liposome concentration was 1 mM.
Figure 3. Isothermal titration calorimetry of Mayaro virus at low pH. Vírus was injected in
buffer at pH 5.5 in the absence (A) or in the presence (B) of liposomes. Each peak
corresponds to the injection of 10 μL aliquots of a 200 μg/mL solution of Mayaro virus. The
vesicles concentration was 1 mM. The heat of dilution was subtracting using Origin software.
Figure 4. Calorimetric heat flows resulting from interaction between Mayaro virus at low pH
(A) or after pressurization (B) and liposomes. The isotherm (A) was obtained by the
difference of isotherms B minus A of Fig. 2. Each peak corresponds to the injection of 10 μL
aliquots of a 200 μg/mL solution of Mayaro virus. The vesicles concentration was 1 mM. The
heat of dilution was subtracting using Origin software.
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
70
0 150 300 450 600 750
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
e
d
c
b
% leakage
Time (sec)
a
0 150 300 450 600 750
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
c
b
% leakage
Time (sec)
a
A
B
Figure 1
Freitas et al., 2007
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
71
0 60 120 180 240 300 360
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Fo/F
[Q] mM
0 60 120 180 240 300 360
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Fo/F
[Q] mM
A
B
Figure 2
Freitas et al., 2007
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
72
0 83 167 250 333
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
Time (min)
µcal/sec
0 83 167 250 333
0
2
4
6
8
Time (min)
µcal/sec
A
B
Figure 3
Freitas et al., 2007
Artigo 2. Hydrostatic pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state
73
083167250
-10
-5
0
5
10
15
Time (min)
µcal/sec
0 83 167 250 333
0
2
4
6
8
Time (min)
µcal/sec
A
B
Figure 4
Freitas et al., 2007
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
74
ARTIGO 3
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
75
O presente manuscrito foi desenvolvido com o intuito de caracterizarmos a interação
entre a proteína do envelope do vírus Ebola e a membrana da célula hospedeira. Para isto,
sintetizamos um peptídeo composto por 16 resíduos, previamente, caracterizado como
peptídeo de fusão viral. Embora esta pequena região, localizada na porção N-terminal da
proteína GP2, tenha sido apontado como possível região de interação com a membrana
celular, pouco se conhece acerca de sua estrutura e do seu mecanismo de ação. Neste
contexto, utilizamos técnicas espectroscópicas, a fim de analisarmos as modificações
estruturais estabelecidas durante a interação com modelos de membranas. Como pode ser
observado, o peptídeo em solução apresentou uma conformação randomizada, mas na
presença de micelas de SDS adotou uma estrutura mais estável. Com base nos dados de
dicroísmo circular foi possível observar a formação de estrutural helicoidal, a qual foi
confirmada por meio de experimentos de RMN. Desta forma, a estrutura do peptídeo foi
determinada e complementada com dados de dinâmica molecular, a fim de fornecer maiores
esclarecimentos quanto à interação deste peptídeo a membranas biológicas. Em adição, foi
possível observar a interação específica do peptídeo de fusão a modelos de membranas. Como
mostrado nos experimentos de transferNOE, o peptídeo foi capaz de interagir com regiões de
membranas biológicas ricas em colesterol e esfingolipídeos, chamadas de lipid rafts.
Com este trabalho, foi mostrado pela primeira vez a estrutura do peptídeo de fusão do
vírus Ebola, e sua propensão de interagir com lipid rafts. Além disto, foi possível mostrar a
grande similaridade estrutural entre o peptídeo de fusão do vírus Ebola e o peptídeo de fusão
do vírus da Influenza, apesar da grande divergência de estrutura primária existente entre estes
vírus.
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
76
Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment and the
Interaction with Lipid Rafts
Mônica S. Freitas*, Luciane P. Gaspar**, Marcos Lorenzoni , Fabio C. L. Almeida*,
Luzineide W. Tinoco
§
, Lenize F. Maia*, Léo Degrève , Ana Paula Valente* and Jerson L.
Silva*
*Programa de Biologia Estrutural, Instituto de Bioquímica Médica, Centro Nacional de Ressonância Magnética
Nuclear de Macromoléculas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-590 Rio de Janeiro, RJ, Brazil. **
Departamento de Virologia,
Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ, Brazil. Departamento de
Química- Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto. Universidade de São Paulo - 14040-901 -
Ribeirão Preto - S.P. - Brazil.
§
Núcleo de Produtos Naturais (NPPN)- Laboratório de Analise e Desenvolvimento
de Inibidores Enzimáticos. Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-590 Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
Running title: Ebola fusion peptide and membrane interaction
To whom correspondence and reprint requests should be addressed. Mailing address:
Instituto de Bioquímica Médica, CCS, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-590
Rio de Janeiro, RJ, Brazil. Phone: 2562-6761 Fax: 55-21-2270-8647.
E-mail: jerson@bioqmed.ufrj.br
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
77
SUMMARY
The fusion peptide EBO
16
(GAAIGLAWIPYFG PAA) comprises the fusion domain of an
internal sequence located in the envelope fusion glycoprotein (GP2) of the Ebola virus. This
region interacts with the cellular membrane of the host, leading to membrane destabilization
and fusion. In order to gain insight into the mechanism of the peptide interaction with a
mimetic membrane, insertion of the peptide was modeled by experiments in which the
tryptophan fluorescence and
1
H-NMR were monitored in the presence of sodium dodecyl
sulfate micelles or in the presence of lipid rafts. In the presence of SDS micelles, EBO
16
undergoes a random coil-helix transition, showing a tendency to self-associate. The three-
dimensional structure displays a 3
10
-helix in the central part of molecule, similar to the fusion
peptides of many known membrane fusion proteins. Our results also reveal that EBO
16
can
interact with lipid rafts, and strongly suggest that Trp 8 and Phe 12 are important for structure
maintenance within the membrane bilayer. Molecular dynamics studies of the interaction
between the peptide and the target membrane clearly show the crucial participation of these
aromatic residues. Our data shed light on the structural “domains” of fusion peptides, and
provide a clue for the development of a drug that might block the early step of viral infection.
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
78
INTRODUCTION
The Ebola virus belongs to the Filoviridae family and causes hemorrhagic fever in
primates, resulting in high mortality rates (1). Infection by the Ebola virus requires fusion of
viral and cellular membranes (1, 2). The membrane fusion process is a common feature of
enveloped viruses and is mediated by an envelope glycoprotein that acts as a membrane
fusion protein (3-5). The Ebola glycoprotein (GP) is responsible for both receptor binding and
membrane fusion during entry into the host cell. It is comprised of two polypeptides, GP1 and
GP2, linked by a disulfide bond. The structure of a fragment of Ebola fusion protein (GP2)
was solved at 1.9 Å resolution (6). However, the fusion peptide
(
524
GAAIGLAWIPYFGPAA
539
) was not included (6-8). This peptide shares general features
with many other viral membrane fusion proteins. As previously predicted, the fusion peptide
consists of 16 uncharged residuesthat are conserved within the virus family (9). The fusion
peptide region, which is believed to be inserted into the cellular membrane, is located at the
extreme NH
2
-terminus of GP2, and the GP2 COOH-terminal region is adjacent to the
transmembrane helix anchored in the viral membrane (10). In most enveloped viruses, when
the virus is inactive to fusion, the fusion peptide is buried and protected in a hydrophobic core
of the soluble glycoprotein ectodomain, whereas when the virus is in the active state, the
fusion peptide is exposed and available for fusion into the triggered host membrane (10).
To better understand the fusion mechanism, we have determined the structure of the
fusion peptide of the GP2 from Ebola virus, utilizing a combination of spectroscopic
techniques such as circular dichroism, intrinsic fluorescence, molecular dynamics and nuclear
magnetic resonance. We show the atomic structure and the conformational exchange of the
Ebola fusion peptide in the presence of micelles at pH 7, as well as its interaction with lipid
rafts. These structural studies are important to determine structural identities among the
enveloped viruses, which should help in the rational design of antiviral drugs.
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
79
EXPERIMENTAL PROCEDURES
Peptide. The Ebola fusion domain was purchased from Genemed Synthesis, South San
Francisco, CA. Its purity and molecular mass were assessed by electrospray mass
spectrometry, high-performance liquid chromatography and amino-acid analysis. The purity
was greater than 95 %. Stock solutions were prepared by suspending the peptide at 1 or 2 mM
in double-distilled water, where it is fully insoluble. The solubility was acquired after addition
of membrane models or dimethyl sulfoxide (DMSO). The peptide concentration was
calculated from the absorbance at 280 nm using a molar absorption coefficient ε
280
of 6970
cm
-1
M
-1
.
Circular dichroism. CD data were collected using a JASCO 715 spectropolarimeter. In
general, a 2-mm pathlength cuvette with 100
µM fusion peptide in 15 mM phosphate pH 7
was used
for CD experiments. Each of the CD spectra was obtained from an average of
four
scans with 2-nm bandwidth. The temperature was maintained at 298 K, the scan rate was 50
nm/min, the step resolution was 1.0; the response time was 8 s. After background
subtraction
and smoothing, all of the CD data were converted from
CD signal (millidegrees) into mean
residue molar ellipticity (deg cm
2
dmol
-1
) by using the following equation [θ] = θ.10
-1
l
-1
.c
-1
.N
-
1
where l is the cell length in cm, c is the molar concentration, and N is the number of amino-
acid residues in the peptide.
Peptide binding to SDS micelles. Peptide binding to SDS micelles was estimated by
variation of the fluorescence emitted by Trp, based on the spectral shift that accompanies the
change in its environment. Trp was excited at 280 nm and its fluorescence emission was
acquired from 315 to 420 nm. In addition, fluorescence quenching experiments were
performed with 10- 50 mM acrylamide as an extrinsic quencher. The fluorescence quenching
data were analyzed according to the Stern-Volmer relationship (27):
F
0
/F = 1 + K [Q] (1)
where F
0
and F are the fluorescence intensities in the absence and in the presence of the
quencher, [Q] is the quencher concentration and K is the quenching constant. Trp
fluorescence was recorded at 340 nm (λ
exc
= 280 nm). The peptide concentration was 10 μM.
Fluorescence polarization was measured with excitation at 295 nm and emission recorded
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
80
through a WG320S filter (50 % cut-off at 320 nm). The experiment was carried out at 25
o
C
in 15 mM phosphate buffer, pH 7. The peptide concentration was 100 μM.
Three dimensional structure. NMR measurements were carried out at 25
o
C on a Bruker
AMX 600 MHz NMR spectrometer in the phase-sensitive mode using States - time-
proportional phase incrementation (States-TPPI). The sample contained 2 mM peptide, 400
mM d
25
-SDS in phosphate buffer pH 7 [90 % H
2
O/ 10 % D
2
O (v/v)]. Total correlation
spectroscopy (TOCSY) experiments were performed with WATERGATE water suppression
and MLEV-17 spin-locking pulse with a mixing time of 100 ms. Nuclear Overhauser
spectroscopy (NOESY) experiments were recorded with a mixing time of 80 ms, also using
WATERGATE. The three-dimensional structure was calculated with the program
CNS_SOLVE 1.1 (28). The resulting 20 energy-minimized conformers were used to represent
the structure of the fusion domain in SDS micelles.
Molecular Dynamic Simulations. Simulations were carried out at 25
o
C using the
GROMACS package version (29). The initial configuration of micelle with 63 SDS and the
simulations parameters were described by Tieleman (30). The water SPC model was utilized
in both simulations with SDS and n-hexane molecules modeled by GROMOS45A3 force
field, being that the atomic charges of the polar head of SDS are the same utilized by
Schoweighofer (31). The n-hexane/water interface in the simulation box is (6.17 x 6.17 x
7.92) nm
3
and to micelle/water interface is (7.59 x 7.81 x 7.79) nm
3
. Counter-ions, Na
+
and
Cl
-
were utilized to maintain the electroneutrality of the systems. The Lennard-Jones and
electrostatic interactions were considered until 1.2 nm and the Particle-Mesh Ewald technique
(32) was used for the treatment of the electrostatic interactions since the residues are ionized
at pH = 7.
Lipid rafts purification. All procedures were carried out on ice. Four T-150 and two T-75
glasses of cells were washed twice with phosphate buffer and treated for 10 sec with a
dissociation buffer (enzyme free). Cells were harvested and washed by centrifugation at 730 g
for 2 min at 4
o
C in phosphate buffer, and then once in phosphate buffer containing protease
inhibitor cocktail (SIGMA, Saint Louis, Missouri), 20 mM sodium orthovanadate activated
(33), 2 mM aminoethyl-benzene sulfonyl fluoride (PMSF) and 1% triton X-100. The cells
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
81
were then lysed by passage through a 28 X 7 needle 10 times. An equal volume of 80 %
sucrose was added to mixer with lysed and placed in the bottom of sucrose gradient of 40 %
to 5 % and centrifuged at 30 000 rpm for 24 hours at 4
o
C using a SW40 Ti rotor. Gradient
was fractionated and raft fraction was confirmed by dot blotting using cholera toxin B
subunit-peroxidase conjugate (SIGMA, Saint Louis, Missouri).
Lipid rafts and peptide interaction. NMR measurements were carried out at 25
o
C on a
Bruker AMX 600 MHz NMR spectrometer in the phase-sensitive mode using time-
proportional phase incrementation (TPPI). The sample contained 1 mM peptide, lipid rafts in
phosphate buffer pH 7 [90 % H
2
O/ 10 % D
2
O (v/v)]. Nuclear Overhauser spectroscopy
(NOESY) experiments were recorded with a mixing time of 80 ms, using WATERGATE.
The spectra were collected in the presence of lipid rafts with 512 data points in F1, 4096
points in F2 and 32 scans. In the presence of LUVs (PC:PE:PI:Cho) the spectra were collected
with 128 data points in F1, 4096 points in F2 and 256 scans. The signal/noise was,
approximately, twice bigger in the presence of lipid rafts than in the presence of LUVs.
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
82
RESULTS AND DISCUSSION
Conformational changes induced by membrane-mimetic environments
Recent studies have pointed out the high hydrophobicity of the fusion peptide
sequence (9) and one or two charged amino acids have been added to the peptide sequence to
minimize peptide aggregation in solution (11). Because we were interested in the structure of
the fusion peptide in a membrane-mimetic environment, we did not add any charged amino
acids. To investigate the secondary structure of EBO
16
, we examined the far-UV CD spectra.
As shown in Fig. 1A, the peptide assumes a random-coil conformation in aqueous buffer and
a more defined structure in the presence of SDS micelles, where it displays a typical helical
structure. In the presence of 60 mM dodecylphosphocholine (DPC), a phospholipid-derived
detergent, the fusion peptide displays two conformational states, random coil and α-helix
(data not shown). This condition was not suitable for determining the structure by NMR,
because of the conformational exchange between folded and unfolded states. The CD studies
reveal that SDS micelles provide a good model for characterizing and determining the EBO
16
structure.
Interactions between the Ebola fusion peptide and SDS micelles
To follow the binding of EBO
16
with SDS micelles, we measured tryptophan
fluorescence emission. In EBO
16
there is only one tryptophan, located in the middle of the
sequence. Fluorescence emission in the absence of SDS shows a maximum emission
wavelength of approximately 337 nm (Fig. 1B). This maximum reflects the tryptophan
accessibility and the peptide aggregation because of its high hydrophobicity and random
structure. In fact, when EBO
16
was incubated with SDS micelles, the spectral peak was blue-
shifted from 337 to 327 nm (Fig. 1B). The shift of about 10 nm suggests that tryptophan
enters a hydrophobic environment in the SDS micelles. When the intrinsic fluorescence
polarization was evaluated as a function of the SDS concentration, it revealed that peptide
rotation was much slower at low SDS concentrations, i.e. in non-micellar conditions (below
CMC), than at high SDS concentration (presence of micelles) (data not shown). These data
indicate that EBO
16
binds to SDS micelles and rotates like the free peptide in solution.
To further characterize the peptide insertion into SDS micelles, we carried out
acrylamide fluorescence quenching experiments. Stern-Volmer plots provide an indication of
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
83
solvent accessibility; a steep slope indicates that the tryptophan residue is exposed to the
acrylamide, whereas a lower slope indicates that the tryptophan is protected from the
acrylamide (12). Fig. 1C shows the Stern-Volmer plots for EBO
16
in the absence and in the
presence of SDS micelles. In the absence of SDS micelles, a steep slope is observed
(Ksv=15.8 M
-1
), whereas in the presence of SDS micelles a reduced slope is obtained
(Ksv=10.2 M
-1
). The fluorescence data clearly indicate that the single Trp of EBO
16
is
completely embedded in the hydrophobic component of the SDS micelle. EBO
16
in the
micellar environment undergoes structural modifications, including intramolecular
rearrangements and acquisition of helical structure, showing a tendency to self-associate
NMR analysis of secondary structure
The
1
H-NMR data were obtained using perdeuterated SDS micelles at 298 K and pH
7. The NOESY spectrum of EBO
16
displayed numerous well-resolved cross-peaks
(Supplementary Fig. 1), indicating that the peptide is folded and that assignment should be
possible. The NOEs were assigned and differences in the H
α
chemical shifts (Δδ in p.p.m.)
between observed and random-coil values are shown in Fig. 2B. Negative Δδvalues > 0.1
p.p.m were observed in the middle of molecule, which is therefore considered to assume a
helical conformation (13). In fact, analysis of the NOESY spectra provided similar results
when intraresidual, sequential and medium-range connectivities were evaluated, as
summarized in Fig. 2A. The observation of weaker d
αN
and d
αN
(i, i+4) connectivities,
together with medium d
αN
(i, i+3) and stronger d
NN
, suggested a stabilized α-helix structure.
However, the presence of d
αN
(i, i+2) in the same region indicates a 3
10
helix conformation
(14). The data show a continuous pattern of d
αN
(i, i+3) NOEs between Leu 6 and Phe 12.
Furthermore, d
NN
and d
N
NOEs indicate the presence of helical structure in this region.
However, the absence of d
αN
(i, i+4) and the presence of the continuous pattern d
NN
(i, i+2)
and d
αN
(i, i+2) NOE connectivities suggest the 3
10
helix structure (Fig. 2A). Taken together,
the NOE connectivities and chemical shift deviation data support the presence of a helix from
Leu 6 to Phe 12 (Fig. 2A, B). This was also observed in 40 mM, 100 mM and 200 mM SDS,
which confirms a stable interaction between the peptide and SDS at concentrations above the
critical micellar concentration (data not shown).
NMR structure calculation
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
84
From a total of 416 assigned NOE crosspeaks, 198 non-redundant upper-limit
constraints were obtained for EBO
16
(Table 1). The backbone structures of the lowest energy
conformers of EBO
16
in SDS micelles at pH 7.0 are shown (Fig. 3B). From the initial 100
structures calculated, 20 structures were selected corresponding to those structures exhibiting
the lowest energy (Figs. 3A, B). They did not violate NOEs and dihedral angle constraints.
The overall energy of the selected structures was 23.97±3.03 kcal/mol. The room-mean-
square deviation (RMSD) among all peptide residues was 2.4 Å; however, the best fit was
found between Leu 6 and Phe 12 residues, probably because of the proximity of Trp 8 and
Phe 12, which stacks the rings edge-to-face (Fig. 3D). The aromatic- aromatic interaction can
induce structure stability because of the interaction of partial charges located in the face and
in the hydrogen atoms of aromatic rings (15). This region is located on a more hydrophobic
face of the EBO
16
peptide, as shown in Figs 3E, F. Since hydrophobic regions have been
related to membrane interaction, this region could play an important role in the lipid bilayer
destabilization (9, 16). The Trp 8 could be critical for fusion activity, as observed for dengue
virus (17).
To check for the presence of proline isomerization, the connectivities between Ile 9
and Pro 10 residues or Gly 13 and Pro 14 were available. The d
αα
(i, i+1) connectivity, typical
for the cis conformer, and the d
αδ
(i, i+1) connectivity, typical for the trans conformer of
proline, were evaluated. We found only one spin system for each proline residue, indicating a
single conformation for each amino acid (data not shown). The d
αδ
(i, i+1) connectivities were
observed, indicating that Pro 10 and Pro 14 are in trans conformation. Probably, the high
structural convergence in this portion of the molecule justifies the absence of two conformers
of Pro 10. In addition, there was a slight kink induced by proline. The proline kink would be
expected because of the absence of the amide proton of the proline, which leads to a break in
d
αN
(i, i+1), d
αΝ
(i, i+3), d
αN
(i, i+2) and other connectivities (Fig. 3A). However, the pattern
of NOEs connectivities of helical structure was maintained by α, γ, δ and β proton
connectivities (data not shown).
Membrane composition and peptide interaction
The lipid bilayer composition and its curvature should be the limiting step for peptide-
membrane interaction (18). EBO
EA
and EBO
EE
, two fusion peptides of Ebola with charged
residues added to decrease their hydrophobicity, were able to fuse with liposomes only in the
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
85
presence of phosphatidylinositol (10). Phosphatidylinositol usually is present in cellular
microdomains rich in cholesterol and sphingomyelin (lipid rafts). These microdomains were
shown to interact with Ebola GP protein (19), but the correlation with the fusion mechanism
was not investigated.
We used nuclear magnetic resonance to map the interacting amino acid residues with
the microdomains. Knowledge of the EBO
16
structure in solution allowed us to follow the
conformational changes in the presence of liposomes prepared with mixed lipid composition
and from lipid rafts (Fig. 4). One-dimensional 1H spectra in the presence of LUVs containg
PC:PE, PC/PE/PI/Cho and lipid rafts show sharp lines typical of the peptide EBO
16
in fast-
intermediate to intermediate exchange between the membrane-bound and free form (Fig. 4B).
Chemical shift changes could be observed especially when EBO
16
was in the presence of lipid
rafts (see the indolic hydrogen of Trp8 at ~10.1 ppm). This dynamic interaction enables the
observation of the transfer NOEs (Fig. 4A). Since EBO
16
is very flexible when free in
solution it did not show NOEs during the 80 ms of mixing time. We observed several NOEs
during the same mixing time in the presence of lipid rafts or LUVs containing PC/PE/PI/Cho
(Fig 4A). These transferred NOEs can be used to map the interacting residues, since these
hydrogens will become more rigid upon interaction. The increase in rigidity can be caused by
a gain of structure or because of the interaction itself.
The NOESY spectrum of EBO
16
in the presence of lipid rafts showed transfer NOEs
for all residues ranging from Leu 6 to Phe 12 (Fig. 4A). We also observed transferred NOEs
for the residues ranging from Leu6 to Ile9 for EBO
16
in the presence of LUVs containing
PC/PE/PI/Cho. On the other hand, a lack of these peaks was observed in the absence of rafts
(Supplementary Fig. 3). Our data show that the same region that is structured in the presence
of SDS is interacting with rafts or the LUV containing PC/PE/PI/Cho (Fig. 4A, 4C), These
data are the first indicative that EBO
16
can interact with lipid rafts in an early stage of
infection.
Model for the interaction between Ebola fusion peptide and biological membranes
The NMR structure and fluorescence data indicate that the peptide preferentially
interacts with the hydrophobic sector of micelles and membranes through its central residues.
Accordingly, we propose a model in which the middle of the peptide is inserted into the
membrane and both N-terminal and C-terminal residues extend away from the surface of the
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
86
membrane. Within the membrane, the peptide is more structured because hydrogen bonds
must form within and between peptides, whereas outside the membrane greater
conformational disorder is allowed because of the formation of peptide-H
2
O hydrogen bonds.
The central portion of EBO
16
exhibits more connectivity than the non-structured region
(Supplementary Fig. 2), suggesting that the central region excludes water. Indeed, the Stern-
Volmer constant obtained in the presence of SDS corroborates a shift of Trp 8 from a
hydrophilic to a hydrophobic environment, suggesting that the helix containing Trp may be
embedded in the bilayer core (Fig. 2B). On the other hand, five N-terminal (GAAIG) and four
C-terminal (GPAA) amino acids were not structured, indicating that the environment around
these regions may be slightly different from that surrounding the helical portion of the
molecule, with a tendency to destabilize the intra-molecular connectivities. Glycine is an
important residue in many enveloped viruses such as influenza, SIV and HIV-2 (20), although
its exact role has not been determined. It has been correlated with the conformational
flexibility of fusion peptides, which is necessary for fusion activity (21). In this work, we
suggest that glycines may be located on the same face before and after the helix, close to polar
groups of the lipid bilayer, improving an interface between inner and outer host membrane.
To understand the characteristics of peptide-micelle interactions, molecular- dynamic
(MD) simulations of EBO
16
were carried out using coordinates from the lowest energy NMR
structure reported here. We run two MD simulations: (1) EBO
16
in explicit SDS micelle and
(2) EBO
16
in explicit water-hexane interface. In 1, the peptide was initially placed 1 nm from
the interfaces (SDS surface or water:hexane) with the helix oriented toward the interface
(Supplementary Fig. 4). The peptide structure data was maintained frozen until the peptide
interaction with the surfaces reached equilibrium (Figure 5A and 5B). A simulation time of 4
ns was sufficient to reveal the interaction between EBO
16
and the SDS micelle (Fig. 5A). The
energy necessary for peptide- micelle interaction decreased further the peptide advanced into
the SDS micelle than in the case of the peptide- n-hexane interaction, suggesting that a simple
hydrophobic model would favor the peptide interaction (Figs 5A and 5B). In SDS micelles,
the helical segment is maintained throughout the MD simulation (Fig. 5E). This is the
interacting segment of EBO16, as showed by transfer NOEs in the presence of the lipid rafts
(Fig. 4A). In n-hexane, the MD simulations did not support the structure obtained by NMR
(Fig. 5F). The simpler model (water-n-hexane), takes into consideration only the interaction
due to the hydrophobicity of the peptide, but it lacks the steric and charge effects. The steric
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
87
effect of the SDS molecule, especially via the van der Walls contact with the hydrophobic
chains seems to contribute to the stabilization of the helical segment. The coulombic
interaction with the SDS charged group might have a role in the stabilization of the EBO
16
helical structure. The high hydrophobicity of EBO
16
probably
favors its partitioning into the
lipid bilayer. The fusion peptides of several enveloped viruses present an amphipathic helix,
whereas the helix of EBO
16
is hydrophobic
(22). For the fusion peptide of the influenza virus,
the charged amino acids are distributed over the opposite surface from the hydrophobic side
chains (22). In contrast, EBO
16
is formed with hydrophobic residues on the surfaces of the
helix. Thus, the entry of the entire helix into the cellular membrane should be favored by the
difference in dielectric constant between water and membrane. Thus, the interior of the
membrane is a more energetically favorable environment than outside, contributing to drive
the insertion of EBO
16
into the lipid bilayer. For EBO
16
- SDS micelles,
the peptide backbone
RMSD from residues 6-12 stabilized at 2 Å, similar to EBO
16
-water/n-hexane interface (Figs.
5C and 5D). However, the stabilization of residues 1-16 occurs at 4 Å in SDS micelles and at
6 Å in a water/n-hexane interface, suggesting the much higher structural stability of EBO
16
in
the presence of an amphipathic system (Figs. 5C and 5D).
The peptide-membrane interaction has been extensively characterized for influenza
virus fusion peptide, which exhibits a small helical structure close to the N-terminus at neutral
pH (22). In the fusion state, the influenza virus fusion domain undergoes a conformational
change that increases the peptide curvature and leads to a transition from an α-helix to a 3
10
-
helix localized at the C-terminus of the molecule. Like the influenza virus peptide, EBO
16
displays a central 3
10
-helix structure in the active state. The 3
10
-helix is the fourth most
common secondary motif in proteins and has recently attracted the attention of structural
biologists, since it may act as a folding intermediate in the formation of an α-helix (23, 24). In
fact, the presence of d
αΝ
(i,i+2) and the absence of d
αΝ
(i,i+4) connectivities illustrates the
high flexibility and capacity for self folding of EBO
16
in the presence of a lipid bilayer (Fig.
2A). In addition, the side-chain plays an important role in 3
10
-helix or α-helix forms, as well
as affecting the stability of a helix in comparison with a random coil (25).
Although EBO
16
self-folds when it interacts with lipid membranes, the fusion process
probably requires the coiled-coil region (present in the GP2 protein), which would help the
boomerang structure of the EBO
16
peptide to capture the target membrane and bring it in close
to the viral membrane so that lipid mixing takes place. This process was described for
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
88
influenza virus, where the hypothesis of spring-loading has been studied (26). Indeed, the
similarity in the fusion process among different enveloped viruses points to this process as a
potential target for the development of drugs that block virus entry and infection.
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
89
Concluding remarks
Here we describe the first structural characterization of the interaction of the fusion
peptide of Ebola virus with lipid rafts and membrane-mimetic environments. The Ebola virus
causes hemorrhagic fever in primates, including humans, resulting in high mortality rates.
Because of the difficulty to handle infectious particles, structural studies on the viral domain
involved with the fusion with the host cell are crucial to understand the mechanism of virus
entry and to develop compounds that might block the early step of viral infection. In this
article, we have determined the structure of the fusion domain (EBO
16
) located in the
envelope fusion glycoprotein (GP2) of the Ebola virus. This region interacts with the cellular
membrane of the host, leading to membrane destabilization and fusion. Fluorescence and
NMR experiments, as well molecular dynamics simulations, allowed us to characterize the
interaction with sodium dodecyl sulfate micelles and lipid rafts. The three-dimensional
structure clearly revealed how the aromatic residues (Trp 8 and Phe 12) play a crucial role for
structure maintenance within the membrane bilayer. Knowledge of the EBO
16
structure in
solution allowed us to characterize the structural changes upon interaction with lipid rafts
providing the first demonstration that Ebola fusion domain can interact with lipid
microdomains in an early stage of infection.
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
90
REFERENCES
1. Peters, C. J., Sanchez, A., Rollin, P. E., Ksiazek, T. G. and Murphy, F. A. (1996)
Filoviridae: Marburg and Ebola viruses, eds Fields B. N., Knipe D. M. and Howley P. M.,
Fields virology, Lippincott- Raven Publishers, Philadelphia, Pa.
2. Feldmann, H., Klenk, H. D. and Sanchez, A. (1993) Arch. Virol. 7, 81- 100.
3. Malashkevich, V., Singh, M. and Kim, P. S. (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8502-
8506.
4. Lescar, J., Roussel, A., Wien, M. W., Navaza, J., Fuller, S. D., Wengler, G., Wengler, G.
and Rey, F. A. (2001). Cell 105: 137-148.
5. Yao, Y., Ghosh, K., Epand, R. F., Epand, R. M. and Ghosh, H. P. (2003). Virology 310,
319- 332.
6. Malashkevich, V. N., Schneider, B. J., McNally, M. L., Milhollen, M. A., Pang, J. X. and
Kim, P. S. (1999). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 2662- 2667.
7. Weissenhorn, W., Carfi, A., Lee, K. H., Skehel, J. J. and Wiley, D. C. (1998). Mol. Cell 2,
605-616.
8. Weissenhorn, W., Calder, L. J., Wharton, S. A., Skehel, J. J. and Wiley, D. C. (1998). Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6032-6036.
9. Ito, H., Watanabe, S., Sanchez, A., Whitt, M. A. and Kawaoka, Y. (1999). J Virol 73, 8907-
8912.
10. Ruiz-Arguello, M. B., Goñi, F. M., Pereira, F. B. and Nieva, J. L. (1998). J Virol 72,
1775-1781.
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
91
11. Suárez, T., Gómara, M. J., Goñi, F. M., Mingarro, I., Muga, A., Pérez-Payá, E. and Nieva
J. L. (2003). FEBS 535, 23- 28.
12. Lakowicz, J. R. (1983) Principles of fluorescence spectroscopy, Plenum Press, New York.
13. Wishart, D. S. and Sykes, B. D. (1994). Methods Enzymol. 239, 363- 392.
14. Wüthrich, K. (1986) NMR of Proteins and Nucleic Acids, John Wiley & Sons, Inc, New
York.
15. Serrano, L., Bycroft, M. and Fersht, A. R. (1991). J Mol Biol 218, 465- 475.
16. Chernomordik, L. V. and Koslov, M. M. (2003). Ann Rev Biochem 72, 175- 207.
17. Modis, Y., Ogata, S., Clements, D. and Harrison, S. C. (2004). Nature 427, 313- 319.
18. Maia, L. F., Soares, M. R., Valente, A. P., Almeida, F. C., Oliveira, A. C., Gomes, A. M.,
Freitas, M. S., Schneemann, A., Johnson, J. E. and Silva, J. L. (2006). J Biol Chem 281,
29278-29286.
19. Bavari, S., Bosio, C. M., Wiegand, E., Ruthel, G., Will, A. B., Geisbert, T. W., Hevey,
M., Schmaljohn, C., Schmaljohn, A. and Aman, M. J. (2002). J Exp Med 195, 593-602.
20. Tamm, L. K., Han, X., Li, Y. and Lai, L. A. (2002). Biopolymers 66, 249- 260.
21. Wong, T. C. (2003). Biochim. Biophys. Acta 1609, 45- 54.
22. Han, X., Bushweller, J. H., Cafiso, D. S. & Tamm, L. K. (2001). Nat Struct Mol Biol 8,
715- 720.
23. Milhauser, G. L. (1995). Biochemistry 34, 3873- 3877.
24. Sheinerman, F. B. and Brooks, C. L. (1995). J Am Chem Soc 117, 10098–10103.
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
92
25. Yokum, T. S., Gauthier, T. J., Hammer, R. P. and McLaughlin, M. L. (1997). J Am Chem
Soc 119, 1167-1168.
26. Carr, C. M., Chaudhry, C. and Kim, P. S. (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14306-
14313.
27. Lehrer, S. S. (1971). Biochemistry 10, 3254- 3263.
28. Brünger, A. T., Adams, P. D., Clore, G. M., DeLano, W. L., Gros, P., Grosse-Kunstleve,
R. W., et al (1998). Acta Cryst D54, 905- 921.
29. Lindahl, E., Hess, B. and van der Spoel, D. J. (2001). Mol Mod 7, 306.
30. Tieleman, D. P., van der Spoel, D. and Berendsen, H. J. (2000). J. Phys. Chem. B. 104,
6380-6388.
31. Schweighofer, K. J.; Essmann, U. and Berkowitz, M. (1997). .J. Phys. Chem. B. 101,
3793-3799.
32. Darden, T.; York, D. and Pedersen, L. (1993). J. Chem. Phys. 98, 10089-10092.
33. Gordon, J. A. (1991). Methods Enzymol 201, 477- 482.
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
93
FOOTNOTES
We thank Martha Sorenson for critical reading of the manuscript and Emerson R. Goncalves
for competent technical assistance. This work was supported by grants from Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Millennium Institute for
Structural Biology in Biomedicine and Biotechnology (CNPq Millennium Program),
Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ),
Rede Nacional de Biologia Molecular Estrutural, Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP)
of Brazil, and by an international grant from the International Centre for Genetic Engineering
and Biotechnology (ICGEB) to J. L. S
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
94
FIGURE LEGENDS
Figure 1. Interactions between EBO
16
and SDS micelles monitored by circular dichroism and
tryptophan fluorescence of EBO
16
. (A) Circular dichroism of the Ebola fusion peptide in the
absence (blue) and in the presence (red) of SDS micelles. The SDS and peptide concentrations
were 10 mM and 100 μM, respectively. (B) Fluorescence emission spectra of the tryptophan
residue of Ebola virus fusion peptide acquired in the absence (solid line) or in the presence
(dashed line) of SDS micelles. The Trp 8 was excited at 280 nm and fluorescence emission
was acquired in the range of 315 to 420 nm. The peptide and SDS concentrations were 10 μM
and 10 mM, respectively. The inset shows peptide polarization in the presence of different
SDS concentrations. The peptide concentration was 100 μM. (C) Trp fluorescence quenching
experiments of Ebola fusion peptide by acrylamide (Q) in the absence (●) or in the presence
(▲) of SDS micelles are shown. The inset shows representative values of Ksv obtained from
the slopes. Peptide-coupled SDS micelles were preincubated for 10 min in 2 ml of buffer
before measurements. Increasing concentrations of acrylamide were added, and Trp
fluorescence was recorded at 340 nm (λ
exc
= 280 nm). The peptide concentration was 10 μM
and SDS concentration was 10 mM.
Figure 2. Secondary structure of EBO16. (A) Summary of the NOE connectivities for Ebola
virus fusion peptide in SDS micelles. The bar thickness indicates the intensity of NOE
connectivity: strong ( 2.8 to 5 Å), medium ( 2.8 to 3.4 Å) or weak ( 3.4 to 5 Å). (B)
Chemical shift deviation for the 16 residues of fusion peptide. The chemical shift deviation is
plotted for α-
1
H resonance assignments. In (A) and (B) the peptide concentration was 2 mM
and SDS concentration was 400 mM.
Figure 3. Structure of the Ebola fusion peptide in SDS micelles at pH 7 by
1
H-NMR. (A)
Superposition of 20 energy- minimized structures, showing side chain, (B) Backbone and (C)
ribbon representations. The structures are best- fitted to residues 6-12. (D) Trp 8 and Phe 12
form a steak to face, probably increasing the peptide structure stability. (E) and (F) show
hydrophobic surface representation of Ebola fusion peptide. Trp 8 and Phe 12 are indicated.
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
95
Figure 4. Interaction between Ebola fusion peptide and LUVs and lipid rafts. (A) Noesy
spectra of EBO
16
in the presence of lipid rafts (left) and in the presence of LUVs composed of
PC:PE:PI:Cho (right). The spectrum was recorded at 25
o
C and 600 MHZ at pH 7.0, with
peptide concentration of 1 mM or 200 μM, respectively. In blue are illustrated the transfer
NOEs assigned in the peptide structure, as viewed below. (B)
1
H-one-dimensional NMR
spectra of EBO16 in the presence of lipid rafts or large unilamellar vesicles (LUVs). (a) Free
peptide, (b) LUVs-PC:PE, (c) LUVs- PC:PE:PI:Cho and (d) lipid rafts vesicles. (C) Stereo
view of EBO
16
structure. The aminoacid residues where transferred NOEs could be observed
in the presence of lipid rafts are colored in cyan. The backbone is in dark green.
Figure 5. Interaction between Ebola fusion peptide and SDS micelles or water n-hexane
interface by molecular dynamics simulation. (A) and (B) show the intermolecular interaction
potential energy obtained by molecular dynamic. (C) and (D) show the RMSD for residues 1-
16 (red line) and 6- 12 (blue line). (E) and (F) show the comparison between NMR and
molecular dynamics structures. The blue structure was obtained by NMR and red and green
structures were obtained by molecular dynamics in the presence of SDS micelles or in the
presence of water n-hexane interface, respectively.
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
96
Table1. Summary of structural statistics of the EBO
16
peptide at pH 7.0 in SDS micelles.
NOE distance constraints 198
Energies (kcal/mol)
overall 23.97 ± 3.03
bond 1.04 ± 0.18
angle 9.36 ± 0.54
improper 1.33 ± 0.10
VDW (LJ) 3.24 ± 2.80
NOE 2.24 ± 0.96
Backbone pairwise rmsd (Å)
a
of residues 1-16
of residues 6-12
2.412
0.196
Heavy pairwise rmsd (Å)
a
of residues 1-16
of residues 6-12
2.532
0.654
% of residues in allowed region of Ramachandran
b
plot
99.5%
a
RMSD values from molmol
b
Data from PROCHECK-NMR
Table 1
Freitas et al., 2006
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
97
SDS [mM]
0 5 10 15 20 25 30 35
Polarization
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
λ (nm)
180 200 220 240 260
Mean residue molar ellipticity
(10
3
deg cm
2
dmol
-1
)
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
EBO
16
in Buffer
EBO
16
with SDS micelles
λ
(nm)
300 320 340 360 380 400 420 440
Normalized fluorescence
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
[Q] mM
0 20406080100
F
0
/F
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Absence Presence
K
SV
(mM
-1
)
0
4
8
12
16
20
A
B
C
Figure 1
Freitas et al., 2006
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
98
Figure 2
Freitas et al., 2006
Δ
ppm
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
B
A
Arti
g
o 3
.
and the
I
Freitas
e
A
B
C
.
Structure o
f
I
nteraction
w
e
cols., 2007.
S
f
the Ebola F
w
ith Lipid Ra
S
ubmetido a
o
usion Peptid
e
fts
o
Journal Bi
o
e
in a Memb
r
o
lo
g
ical Che
m
E
F
B
r
ane-mimeti
c
m
istr
y
F
i
F
r
E
E
F
Tr
p
B
c
Environme
n
i
gure 3
r
eitas et al.,
E
Tr
p
n
t
2006
99
Bott
o
Si
Phe
Phe
o
m
de
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
100
Figure 4
Freitas et al., 2006
C
Leu 6
Trp 8
T
y
r 11
Pro 10
Ala 7
Phe 12
Tyr 11
Phe 12
Tr
p
8
Leu 6
Ala 7
Pro 10
B
b
c
d
a
A
Ile 9
Ile 9
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
101
Time (ps)
0 2000 4000 6000 8000 10000
RMSD (nm)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Time (ps)
0 2000 4000 6000 8000 10000
Energy (kcal mol
-1
)
-300
-200
-100
0
Time (ps)
0 2000 4000 6000 8000 10000
Energy (kcal mol
-1
)
-300
-200
-100
0
Time (ps)
0 2000 4000 6000 8000 10000
RMSD (nm)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Figure 5
Freitas et al., 2006
A
B
C
D
E
F
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
102
Supplementary Figures
Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment and the Interaction
with Lipid Rafts
Mônica S. Freitas*, Luciane P. Gaspar**, Marcos Lorenzoni , Fabio C. L. Almeida*, Luzineide W.
Tinoco
§
, Lenize F. Maia*, Léo Degrève , Ana Paula Valente* and Jerson L. Silva*
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
103
Figure 1S. NOESY spectrum of EBO
16
in the presence of 400 mM of SDS. Amide region of 600 MHz
1
H-NMR. The mixing time was 80 ms. Spectrum was obtained from 2 mM peptide in 90 % H
2
0 and
10 % D
2
O at pH 7 and 25
o
C.
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
104
Figure 2S. Plot of the NOEs observed per residues. The connectivities are indicated in the graphic.
Amino acids
0123456789101112131415161718
NOEs
0
5
10
15
20
25
30
35
Seq
i,i+2
i,2+3
i,i+4
Artigo 3. Structure of the Ebola Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment
and the Interaction with Lipid Rafts
Freitas e cols., 2007. Submetido ao Journal Biological Chemistry
105
Figure 3S. NOESY spectrum of EBO16 in the absence of membrane models. Amide region of 600
MHz
1
H-NMR. The mixing time was 80 ms. Spectrum was obtained from 1 mM peptide in 90 % H
2
0
and 10 % D
2
O at pH 7 and 25
o
C.
Arti
g
o 3
.
and the
I
Freitas
e
Figure
4
EBO
16
p
Peptide
face to
f
High fle
x
A
B
C
.
Structure o
f
I
nteraction
w
e
cols., 2007.
S
4
S. EBO
16
o
n
p
laced 1 n
m
and micelle
s
f
ace interacti
o
x
ibility of p
e
f
the Ebola F
w
ith Lipid Ra
S
ubmetido a
o
n
the SDS
m
m
from the
S
s
at the end
o
n. (D) EB
O
e
ptide struct
u
usion Peptid
e
fts
o
Journal Bi
o
m
icelles surf
a
S
DS micelle
of simulati
o
O
16
inside bo
x
u
re induces
a
e
in a Memb
r
o
lo
g
ical Che
m
a
ce during
p
surface wit
h
o
n. (C) Trp
8
x
water. (E)
a
n unfavora
b
r
ane-mimeti
c
m
istr
y
p
eptide- mic
e
h
the helix
8
closed to
p
Partition of
E
b
le stability
o
D
E
F
c
Environme
n
e
lles or n-h
e
oriented to
w
p
roximity o
f
E
BO
16
into
n
o
f Trp 8 and
n
t
e
nane intera
c
w
ard the mi
c
f
Phe 12 sta
b
n
-hexane me
d
Phe 12 inter
106
c
tion. (A)
c
elle. (B)
b
ilizing a
d
ium. (F)
action.
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
107
ARTIGO 4
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
108
THE INTERACTION BETWEEN EBOLA FUSION PEPTIDE AND CELLULAR
MEMBRANES:
THE ROLE OF LIPID RAFTS IN MEMBRANE FUSION
Mônica S. Freitas, Critian Follmer, Marcius S. Almeida and Jerson L. Silva
Programa de Biologia Estrutural, Instituto de Bioquímica Médica,
Instituto de Ciências
Biomédicas and Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear de
Macromoléculas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-590 Rio de Janeiro,
RJ, Brazil
Runing titlte: The role of lipid rafts during virus entry into the host cell.
§
To whom correspondence and reprint requests should be addressed. Mailing address:
Instituto de Bioquímica Médica, ICB, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-
590 Rio de Janeiro, RJ, Brazil. Phone: 55-21-2590-4548; Fax: 55-21-2270-8647.
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
109
SUMMARY
Ebola virus is an enveloped virus that is involved in a important human pathogenesis.
Infection by Ebola virus appears to be dependent on pH mediated by viral glycoprotein
GP2, especially because low pH is required for optimal functioning of endosomal
proteases, such as cathepsin B and cathepsin L, which are important to virus infection.
However, it has not been confirmed the real correlation between low pH and fusion
process. On the other hand, it has also been suggested that filovirus use rafts to gain
entry into cells, as showed by immunofluorescence, confocal microscopy and electron
microscopy. Here, we used Ebola fusion peptide (EBO
16
) to evaluate the importance of
cholesterol in the early steps of viral infectious cycle. As expected, cholesterol was
required for efficient lipid mixing of living vero cells. Besides, the increase in the β-
structure of EBO
16
wt in the presence of lipid rafts appears to be related to the ability of
this peptide to cause lipid rafts aggregation. This work strongly suggests the importance
of microdomains rich in cholesterol as one way for Ebola virus entry into the cell.
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
110
INTRODUCTION
The family Filoviridae contains Ebola and Marburg viruses, which are enveloped and
composed of seven genes and encode eight proteins in Ebola and seven in Marburg
virus (Aman et al, 2003). The single-stranded negative-sense RNA genome is encased
in the nucleocapsid complex, which consists of four viral proteins: nucleoprotein (NP),
viral protein (VP) VP35, VP30 and the polymerase (L). This complex is surrounded by
a matrix, which consist of VP40 and VP24. It is packaged by lipid membrane envelope,
obtained during budding from the host cell. The envelope is composed of GP protein,
which is post-translationally cleaved by a furin protease into two fragments: GP1 and
GP2, although this cleavage is not necessary for in vitro viral infection of cells
(Neumann et al., 2002; Wool-Lewis and Bates, 1999). A disulfide bridge in the mature
molecule connects these subunits. GP1 is responsible for interaction with cellular
receptor and GP2 is involved in the mechanism of membrane fusion (Volchkov et al.,
1998 and 2000).
Membrane fusion is a common feature found among enveloped viruses and
displays an important role to virus infectious cycle. However, this process can be
triggered by different ways. Viruses can enter cells by direct fusion with the cell plasma
membrane or through the endocytic pathway (Stein et al., 1987; White et al., 1981).
Fusion is mediated by viral envelope protein that contains a nonpolar fusion peptide. In
general, fusion peptides that belong to class I viral fusion protein are located at the N-
terminal, whereas in class II, they are in the internal region (Kielian and Rey, 2006).
However, in both cases they are typically rich in alanine and glycine residues and highly
conserved within a virus family (Tamm et al., 2002). Its interaction with target
membrane is critical for fusion. Therefore, this region is exposed in a proper place and
in a correct time. The Ebola fusion peptide is a high conserved hydrophobic sequence of
about 16 residues (Ito et al., 1999). Recently, we have solved the NMR atomic structure
of Ebola fusion peptide in the presence of mimetic membranes (Freitas et al., 2007). It
is a loop with a central 3
10
-helix, which appears to be stabilized by aromatic-aromatic
interaction (Freitas et al., 2007). Its ability to induce membrane fusion has been
associated with the presence of Ca
2+
and phosphatidilinositol (Ruiz- Argüello et al.,
1998; Suaréz et al., 2001).
Recent studies have suggested a critical role of lipid rafts in filovirus entry into
the host cells. Lipid rafts are domains in biological membranes that are rich in
cholesterol and sphingolipids. It plays an important role in many events such as
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
111
endocytic, bio-synthetic and signal transduction pathway (Aloson and Millan, 2001;
Simons and Toomore, 2000). The requirement of lipid rafts for viral entry into the host
cells has been associated to localization of receptors and co-receptors in these
microdomains (Campbell et al., 2001; Stang et al., 1997). Many viruses use a specific
interaction between their GPs and cell surface receptors to initiate the attachment to
cells and subsequent fusion. Thus, rafts may promote virus entry by concentrating the
viral receptors and facilitating virus binding via efficient interaction of these receptors
with proteins. Interestingly, the filovirus co-factor folate receptor- α (FRα) is a raft-
associated glycophosphatidylinositol- anchored protein (Chan et al., 2001; Nichols et
al., 2001). However, in 2003 the critical role of FRα was questioned, because of cells
type lacking FRα were fully infectible by GP pseudotypes (Simmons et al. 2003).
In order to determine the importance of cholesterol during membrane fusion and
the real importance of aromatic-aromatic interaction in the peptide structure, we use
cholesterol-depleted cells, rafts isolated from Vero and BHK-21 cells and the mutant
EBO
16
W8A peptide. Our results demonstrate that Ebola fusion peptide interacts with
living cells and its capacity to induce cell-cell fusion is decreased in cells depleted of
cholesterol. Moreover, the peptide is able to induce aggregation of lipid rafts,
suggesting an importance of phosphatidylinositol and cholesterol during virus entry into
the target cells. At the end, we show that aromatic-aromatic interaction stabilizes the
central 3
10
helix of peptide structure during its interaction with lipid membranes.
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
112
RESULTS
Cholesterol depletion on cellular viability
The lipid composition and the curvature of biological membranes are limiting
steps for peptide interaction with living cells and liposomes (Volynsky et al., 2005;
Maia et al., 2006). Cholesterol has been proved essential for filovirus replication
(Empig and Goldsmith, 2002). The entry of Ebola and Marburg virus is inhibited after
cholesterol depletion of the target cells, and in cells not depleted of cholesterol, viral
proteins co-localize with caveolin after internalization (Empig and Goldsmith, 2002).
Caveolae are vesicles enriched with cholesterol and sphingolipids and have been shown
to be involved in a wide range of biological events such as cellular entry by certain
viruses (Anderson et al., 1996 and Werling et al., 1999). In this work we depleted
cholesterol from cell to understand its importance in the mechanism of membrane
fusion, an early step of Ebola infectious cycle. Since Vero and BHK-21 cells are
permissive to infection mediated by Ebola virus, initial attempts were performed by
using these cells (Wool-Lewis and Bates, 1998).
β
-cyclodextrins were used to produce
cholesterol depletion and they are very effective because they neither bind nor insert
into the plasma membrane and selectively extract membrane cholesterol from intact
cells (Ohtani et al., 1989; Yancey et al., 1996). Vero and BHK-21 cells were treated
with increasing concentration of MβCD for 30 min at 37
o
C and then assayed for
cholesterol quantification. As shown in Fig. 1A, the cholesterol depletion was dose
dependent for Vero and BHK-21 cells. In addition, insect cells, previously growth in
medium with cholesterol, were assayed as a cellular control with low cholesterol
content. Insect cells are cholesterol auxotrophs and can be depleted of cholesterol by
growth in delipidated serum. As observed in Fig. 1A, the cholesterol content of C6/36
cells was maintained until 12 mM MβCD. However, at 20 and 24 mM MβCD, it was
not possible to detect cholesterol because of a low cell adhesion induced by depletion.
To determine the effect of MβCD on the cell viability, vero, BHK-21 and C6/36 were
co-incubated in the absence or in the presence of MβCD and MTT reagents. The co-
incubation was necessary to prevent cellular lost during washing step. In general, insect
and mammalian cells monolayer were intact up to 16 and 24 mM of MβCD after 30 min
in the presence of this reagent, respectively (data not shown). Fig. 1B shows that insect
cells were more sensible to cholesterol depletion than mammalian cells. Indeed, 16 mM
MβCD was able to decrease 50- 60% of cholesterol of mammalian and insect cells, but
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
113
only affected insect cells viability (Fig. 1B). Besides, our results showed that different
MβCD concentration can induce similar levels of cholesterol depletion but different
response for cellular viability. Then, in this study we choose to work with low MβCD
concentration that causes depletion of cholesterol but does not affect the cellular
viability.
Ebola fusion peptide and lipid membrane interaction.
In order to study the ability of Ebola fusion peptide wild type (EBO
16
wt) to
induce cell-cell fusion, we synthesized a small and hydrophobic peptide, previously
described as a possible region belonging to GP2 protein that interacts with target cells
during virus- cell fusion (Gallaher, 1996; Ito et al., 1999). In this experiment, vero cells
were incubated at 25 or 37
o
C and fusion reactions were started by addition of EBO
16
wt. The data show that Ebola fusion peptide was able to induce cell-cell fusion at
neutral pH and in the absence of Ca
2+
(Fig. 2A). As expected, at 25
o
C the fusion kinetic
was slower than at 37
o
C, but in both cases the fusion occurred very well. Besides, to
determine the importance of cholesterol in this process, vero cells were depleted of
cholesterol by pre-treatement with MβCD. As shown in Fig. 2B, cholesterol-depleted
cells were less susceptible to lipid mixing, indicating that cholesterol is important for
fusion. However, previous works had shown that low endosomal pH is required for
infection and cell-cell fusion mediated by Ebola virus GP (Takada et al., 1997; Bär et
al., 2006). In addition, it was shown that low pH is required for optimal functioning of
cathepsin B and L, which are important for the initial step of Ebola virus entry into the
target cells (Schornberg et al., 2006). As some viruses may enter the cell in more than
one way (Lakadamyali et al., 2004), our results suggest that Ebola virus could use an
alternative route dependent on cholesterol not dependent on pH to induce membrane
fusion and to enter into the host cell.
Conformational changes induced by disruption of aromatic- aromatic interaction.
We hypothesized that interaction between aromatic ring of Trp8 and side chain
of Phe12 is important for maintenance of EBO
16
stability under interaction with mimetic
membranes (Freitas et al., 2007). To show the influence of aromatic- aromatic
interaction, we synthesized a mutant W8A. The structural behavior of mutant peptide
was followed by far-UV CD spectra in the presence of SDS micelles. As shown in Fig.
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
114
3A, the mutant W8A assumes a random coil conformation in the presence of SDS
micelles. On the other hand, the EBO
16
wt displays a typical helical structure at the
same condition. To identify more specifically the secondary elements of peptide
structure, we used α-carbon proton (Hα) chemical shifts deviation (Wishart et al.,
1992). This analysis refers to the observed values minus the random coil value. The data
indicates a small tendency for the peptide to assume an helical conformation from Ile4
to Ala8, because of the smallest values of chemical shift deviation (<0.1 ppm) (Fig. 3B).
Indeed, the mutant W8A chemical shift differences from wild-type showed the largest
changes at Ile9, and showed a loss of helical content at Ala7 (Fig. 3C). Negative
chemical shift difference values show the tendency to increase the helical content, since
positive values indicate a decrease. Taken together, CD, chemical shift deviation and
differences shows a loss of peptide secondary structure, probably, owing to the lack of
aromatic- aromatic interaction, which plays an important role to secondary structure
maintenance.
The
1
H-NMR data were obtained using perdeuterated SDS micelles at 298 K and
pH 7. The NOESY spectrum of EBO
16
W8A displayed numerous well-resolved cross-
peaks (Fig. 3D), indicating that assignment should be possible. The chemical shift
dispersion was more limited than observed with wt reflecting the random nature and
high degree of backbone mobility of SDS micelles binding structure (Fig. 3D). The
interaction between mutant W8A with SDS micelles caused some chemical shift
changes of amide and side chains hydrogen atoms in relation to the EBO
16
wt (Freitas et
al., 2007) (Fig. 3D). Ile9 amide proton was strongly modified for approximately 375
Hz, since Ala7 had a medium shift of 67.7 Hz, although some amino acids were not
changed, such as Ile4. In general, the NOESY spectra of W8A and wt were very similar,
with similar numbers of NOEs, but some different connectivities, as expected.
Cell- Cell interaction induced by Ebola fusion peptide
To better characterize the ability of Ebola fusion peptide to mediate cell- cell
fusion we used fluorescence microscopy based on cells stained for GM1 on cell surface
and for nucleus in living cells. Choleric toxin was used as primary antibody against
GM1 and was conjugated to Alexa fluor 488 (Invitrogen, Molecular Probes). The
nucleus was stained with Hoechst-33342 that is a vital DNA stain that binds
preferentially to A-T base pairs (Alexis Biochemicals). It allows us to detect two or
more nuclei surrounded by one membrane, indicating membrane fusion, occurring
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
115
between two or more living cells. As observed in Fig. 4, only some cells were stained
for GM1. Indeed, some nuclei were stained without plasma membranes (Fig. 4G).
Recent studies have shown that GM1 is enriched in the more ordered domains of
mimetic rafts compositions (Dietgrich et al., 2001; Samsonov et al., 2001) and to be one
of the most widely used marked for lipid rafts (Nichols, 2003). Then, the data suggests
that cells containing lipid rafts were the target of this analysis. Fig. 4A shows that vero
cells monolayer was well resolved and lack of lipid mixing. In fact, a plasma membrane
surrounds only one nucleus (Fig. 4D and G). In contrast, cells pre-treated with EBO
16
wt for 15 min shows signals of lipid mixing, as indicated by arrows (Fig. 4B). Indeed,
nuclei are in close to proximity to each other, and a small pore can be observed
connecting these nuclei (Fig. 4E). On the other hand, for EBO16 W8A the same
behavior was not observed (Fig. 4C and F), suggesting that in the time scale analyzed
here, the W8A was not able to induce lipid mixing in vero living cells staining to lipid
rafts.
Secondary structure induced by membrane interaction
Secondary structures for EBO
16
wt and its mutant W8A in the vesicles were
examined using conventional FT-IR spectroscopy. Representative spectra of the amide I
band for EBO
16
peptides in the absence or in the presence of vesicles are shown in Fig.
5. The amide I band consists of the C=O stretching (76 %), C-N stretching (14 %) and
C-C-N deformation (10 %) modes, and appears in the region from 1600 to 1700 cm
-1
.
This band is highly sensitive to the secondary structure of proteins and serves as an
indicator of the α- helix, β-sheet, β-turn and random conformation (Hering et al., 2004).
The EBO
16
wt and W8A diluted in 100 % DMSO show a principal peak at 1664 cm
-1
characteristic to the extended conformation (Fig. 5A). However, spectral
subcomponents at 1627.7, 1691, 1650.4 and 1667.9 for wt and 1659.6, 1671.4 and
1688.5 for W8A obtained by deconvolution, showed large structural difference among
these peptides (Table I). Curiously, in the presence of 50 % DMSO the mutant W8A
showed an increase in the helical component, since EBO
16
wt spectrum was completely
modified, assuming two bands at 1673 and 1625 cm
-1
, indicating a β-sheet conformation
that suggests peptide aggregation (Fig. 5B, Table I). Similar behavior was observed for
the EBO
16
wt in the presence of PC liposomes, showing 55 % of β-stand structure
(Table I). In addition, the α- helical conformation adopted by the mutant W8A in the
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
116
presence of DMSO was not observed in the presence of PC liposomes (Fig. 5C, Table
I). As previously described by Suarez et al., the ebola fusion peptide structure can be
correlated to the ability of the peptide to perturb membranes and causes permeability or
leads to fusion (Suarez et al., 2003). The adoption of β-structure has been associated
with fusion, only triggered in the presence of Ca
2+
.
The phosphatidylinositol has been described as an important lipid to Ebola
fusion peptide-membrane interaction. In order to obtain the structural information about
the interaction between the mutant W8A and lipid membrane composed of
phosphatidylinositol, peptides were added to liposome solution and analysed by FT-IR.
There are major differences between the wild type and the mutant W8A spectra, which
are attributed to increase in the helical content of wt peptide, in contrast to increase of
β-strand for the mutant W8A. Phosphatidylinositol is a lipid found in cellular membrane
microdomains rich in cholesterol and in sphingolipids. Then, vesicles rich in cholesterol
and sphingolipids were prepared and peptides structures were observed. Interestingly,
the β-strand content was highly increased from 52.2 % (50 % DMSO) to 80.6 %
(PC:PE:SPM:Cho LUVs) for the EBO
16
wt, athough the same behavior was not
observed for mutant W8A (Fig 5E, Table I). A similar result was observed for the
peptides in the presence of lipid rafts obtained from vero cells (Fig. 5F, Table I).
Spectral subcomponents at 1639.5 and 1676.3 cm
-1
indicated a β-strand structure and
the peak at 1656.4 cm
-1
a helical conformation for EBO
16
wt, since a peak at 1628 and
1675,2 cm
-1
indicated a β-strand and a band at 1648.7 cm
-1
a random conformation for
EBO
16
W8A. These findings suggest that Ebola fusion peptide in the presence of lipid
rafts adopts a β-strand structure that appears to be related to the ability of the peptide to
promote vesicles aggregation.
Vesicles aggregation induced by Ebola fusion peptide
To analyze vesicle aggregation qualitatively and quantitatively we measured
DLS of the incubation mixture. This method allowed us to determine the size of vesicles
and its distribution at each size range. As expected DLS measurements yielded a
diameter of, approximately, 100 nm for the starting liposomes, as expected owing to the
limited size membrane filter used during the extrusion (Fig. 6). After incubation of
EBO
16
wt with PC liposomes, DLS analysis revealed a new liposome population with
an average diameter of 878 nm (Fig. 6A, left), which represented 23.2 % of the starting
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
117
liposomes. In contrast, EBO
16
W8A was not able to induce PC vesicles aggregation
(Fig. 6A). These results were also evaluated in function of polidispersity index, which
showed us the sample size distribution broadness. Indeed, the presence of these two
membrane populations was responsible for the increase in the polydispersity index of
the EBO
16
wt, but the same was not observed for the W8A peptide (Fig. 6A, right). In
addition, similar vesicle perturbation was induced by EBO
16
wt in vesicles composed of
PC:PE:PI:Cho (Fig 6B, left). However, two additional peaks were observed with an
average diameter of 1340 and 629 nm that correspond to 5.2 and 3.2 % of started
liposomes (Fig 6B, left). On the other hand, EBO16 W8A was not able to induce vesicle
aggregation. Therefore, the polydispersity index for PC:PE:PI:Cho vesicles was not
changed in relation to free liposome (Fig. 6B, right). In spite of the interaction between
this vesicle and EBO16 wt had induced an increase in the polydispersity index, this
value was smaller than to observed for PC vesicles, suggesting a lesser perturbation of
these vesicles. In the case of vesicles composed of PC:PE:SPM:Cho both peptides were
able to induce vesicles aggregation (Fig. 6C, left). However, in the presence of EBO
16
wt was observed a large aggregate with an average diameter of 1300 nm that
corresponds to 2.9 % of starting liposomes. For W8A peptide was observed an
additional peak with average diameter of 486 nm, which represents just 1.7 % of started
vesicles (Fig. 6C, left). The polydispersity index observed for mutant W8A was a
consequence of an increase of peak width from 23.7 to 62.7 nm at the principal peak,
which correspond to 98.3 % of started vesicles (Fig. 6C, right). Then, for all liposomes
studied here were observed different extension of aggregation induced by the EBO
16
wt,
but the same was not observed for its mutant W8A, which only induced aggregation in
liposome composed of PC:PE:SPM:Cho (Fig. 6). In order to follow the effects of
peptide- lipid rafts interaction we used dynamic light scattering during incubation. As
observed in Figs 6D and E, the started lipid rafts vesicles had a more heterogeneous
profile than liposomes, with polydispersity index of 0.188 and 0.219 for lipid rafts from
BHK-21 and Vero cells, respectively. The additional data showed that EBO
16
W8A
induces small aggregates of lipid rafts from BHK-21 with z-average of 277 nm, since
EBO16 wt produces large aggregates with z-avarege of 1110 nm (Fig. 6D, left).
Therefore, the polydispersity index showed a more heterogeneity of aggregates obtained
by W8A- rafts interaction (PDI 0.329) than aggregates found for wt- rafts interaction
(PDI 0.394) (Fig. 6D, right), suggesting a slow capacity for the mutant W8A induces
large aggregates. Besides, in the presence of lipid rafts from Vero cells the mutant W8A
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
118
and wt were able to induce biggest aggregates. For EBO
16
wt was observed z-average of
1690 nm and for W8A of 597 nm (Fig. 6E, left). After that, a higher value of
polydispersity index indicates the solution heterogeneity (Fig 6E, right). These data
show us the ability of Ebola fusion peptide induces lipid rafts aggregation, which could
be associated with membrane fusion.
Energetics of peptide membrane interaction
To examine the energetic behavior of peptide membrane interaction we used
calorimetric titration. The heat used or released during the binding reaction reflects the
overall energy of peptide- lipid interaction. After each injection, the concentration of
free, evaluated peptide should decrease owing to progressive membrane binding.
However, in all isotherms showed here we did not observe a continuously decrease of
the absolute value of the flux heat during injections, in contrast to expected as a
consequence of peptide to vesicles binding. As shown in fig. 7A, the injections were
followed by two peaks. The first peak reflects an exothermic binding between PC
liposomes and free peptides and the second peak represents a small endothermic
component that could be associated with other energetic contributions triggered by
peptide-liposome binding, such as membrane destabilization and peptide
conformational changes. Although the binding to both peptides was found to be an
exothermic process, the binding to EBO
16
wt was distinctly more exothermic than
binding to EBO
16
W8A for PC liposomes (Fig 7A, a and b). Besides, the endothermic
process was very fast in both cases (≈ 1 min), and its contribution was more
significative for EBO
16
wt than for EBO
16
W8A peptide, although it has represented a
small energetic input (Fig. 7B). As Ebola fusion peptide wild type was able to induce
PC vesicles aggregation and was competent to promote vesicle leakage, the endothermic
behaviour was correlated with these events, since was not observed modification on
peptide structure (Table I). Similar titrations were performed in the presence of
PCPEPICho and PCPESPMCho vesicles (Fig. 7E and G). In the case of interaction
between EBO
16
wt or its mutant W8A and PC:PE:PI:Cho vesicles, it was observed a
similar exothermic binding contribution (Fig. 7C, a and b). Besides, the event correlated
to endothermic peak was more slow (≈ 2 min) if compared with observed in the
presence of PC liposomes (Fig.7D). On the other hand, for PC:PE:SPM:Cho the binding
to EBO
16
wt was less exothermic than binding to EBO
16
W8A (Fig 7E, a and b), and the
endothermic peak was sharper and the event correlated to it was faster (≈ 45 sec) (Fig.
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
119
7F). Thus, the data show that EBO
16
wt and its mutant W8A can interact with several
lipid composition but with a distinct energetic response. In addition, a more complex
event was observed in the presence of lipid rafts. In general, the isothermal titration is
performed by several injections, but after each one the flux heat tends to return to the
equilibrium. In the case of lipid rafts, the return for the equilibrium failed, in the time
scale used here, probably because of the presence of a very slow additional event. As
shown in Fig 6D and E, the Ebola fusion peptide was able to induces lipid rafts
aggregation significantly better than the other vesicles compositions (Fig. 6). However,
the energetic response for the interaction between EBO
16
W8A and lipid rafts from
BHK-21 cells showed a small endothermic and exothermic contribution (Fig. 7G, a). In
contrast, the EBO16 wt induced an inclined exothermic curve with temporal increment
of the exothermic peaks after its interaction with the same type of lipid rafts (Fig. 7G,
b). In both cases the data show endothermic peaks as observed for other vesicles,
although had not been possible to discriminate the end of the endothermic process. For
lipid rafts from Vero cells, it was observed the presence of sharp endothermic peaks
followed by a broader exothermic peak (Fig 7I, a and b; Fig 7J). However, such as in
the presence of lipid rafts from BHK-21, the EBO16 wt in contact with lipid rafts from
Vero cells was not able to reach the calorimetric equilibrium (Fig 7I, b).
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
120
DISCUSSION
Although studies with Ebola fusion peptide and Ebola pseudovirus have been at the
forefront of research into cell entry by of filovirus infectious cycle, many questions
involving GP2 binding and membrane fusion remain unresolved. In this study, we
demonstrate that Ebola fusion peptide is able to use lipid rafts as a target to virus entry
into cells. We documented this capability in experiments of rafts aggregation and cell-
cell fusion (Fig 2 and Fig. 6). Our results also demonstrate that Trp 8 has an important
role in virus infectious cycle. Its importance was observed after substitution of
tryptophan for alanine at position 8 in Ebola fusion peptide sequence. The mutation
abolished the acquisition of secondary structure in the presence of SDS micelles,
suggesting that aromatic-aromatic interactions established by Trp8 and Phe12 are
important for stabilize a helical content into peptide structure (Fig. 3). Mutation at the
same position has been described to affect the transport of GP to the cell surface and its
incorporation into VSV-Ebola virus pseudotype, besides to reduce its infectivity (Ito et
al., 1999). Futhermore, β-structure was directly correlated with fusion activity (Fig. 5).
In general, Ebola fusion peptide can adopt more than one structure that are environment
dependent. Is a consensus that unbound peptide adopts a random conformation (Freitas
et al., 2007; Suarez et al., 2001). However, two other states have been described for the
peptide bounded to membrane. The first one is an α-helix observed by the interaction
established in the absence of Ca
2+
. This structure appears to be related to the ability of
the peptide to membrane destabilization but not with membrane fusion (Gómara et al.,
2004; Ruiz-Argüello et al., 1998; Suarez et al., 2003). In contrast, we observed by DLS
experiments that EBO
16
wt was able to induce liposome aggregation in the absence of
Ca
2+
but the technique was not sensible to discriminate between aggregation and fusion
(Fig. 6). The second is a β-strand observed by interaction between peptide and
membrane in the presence of Ca
2+
(Gómara et al., 2004; Ruiz-Argüello et al., 1998;
Suarez et al., 2003). In this case, the structure is related to the ability of the peptide to
cause fusion. However, we suggest that β-structure acquisition is not a unique feature
that fusion peptide needs to induces fusion (Table I). In fact, EBO
16
wt in the presence
of PCPESPMCho displays high β-structure contents but was not able to induce
liposome aggregation as observed for lipid rafts. Thus, the correlation between structure
and fusion could not be a simple general rule.
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
121
Furthermore, calorimetric results showed that interaction between Ebola fusion
peptide and lipid rafts is a complex titration curve, suggesting multiple energetic
contributions (Fig. 7). The peptide conformational changes, lipid bilayer order/disorder
and vesicles aggregations represent energetic contributions for this profile. However, to
understand this interaction it is an important way to learn about filovirus infectious
cycle. This is the first work in which it is demonstrated the ability of fusion peptide to
interact with lipid rafts.
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
122
EXPERIMENTAL PROCEDURES
Peptide. The Ebola fusion domain was purchased from Genemed Synthesis, South San
Francisco, CA. Its purity and molecular mass were assessed by electrospray mass
spectrometry, high-performance liquid chromatography and amino-acid analysis. The
purity was greater than 95 %. Stock solutions were prepared by suspending the peptide
at 1 or 2 mM in double-distilled water, where it is fully insoluble. The solubility was
acquired after addition of membrane models or dimethyl sulfoxide (DMSO). The
peptide concentration was calculated from the absorbance at 280 nm using a molar
absorption coefficient ε
280
of 6970 cm
-1
M
-1
.
Vesicle size and aggregation. Vesicles sizes were characterized by dynamic light
scattering (DLS) measurements. The equipment used was a Zetasizer Nano ZS
(Malvern, United Kingdom). The measurement range was from 0.6 nm to 6 μm, and the
range analysed was from 50 to 2000 nm. The peptide concentration was 100 μM. The
liposome concentration was 1 mM.
Fourier Transformed Infrared. The FT-IR spectra were collected on a Nicolet
Magna-IR 760 Fourier transform instrument. The spectra analysis were performed with
the OMNIC (Nicolet,Madison/ WI, U.S.A.) software.
Light Scattering Measurement. Lipid rafts were incubated in 10 mM sodium
phosphate, 100 mM NaCl, pH 7.0. Then, the fusion peptide EBO16 wt (5 μM final
concentration) was added to lipid rafts samples. The light scattering was recorded by
exciting 420 nm and collecting the scattered light from 410- 430 in an ISS-PC1
spectrofluorimeter (ISS), under continuous stirring at 37
o
C.
Cholesterol quantification. Following treatment with the MβCD the Vero, BHK-21
and C6/36 monolayers were washed twice with PBS and treated with dissociation buffer
free enzime (Gibco, CO) for some seconds. Then, cells were scrapped into PBS and
centrifugated for 2 min at 730 x g. The pellet was treated with amplex red cholesterol
assay kit (Molecular Probes, Invitrogen). The cholesterol was quantified by excitating
530- 560 and emission 580 – 620.
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
123
Cell viability. The Vero, BHK-21 and C6/36 monolayers were washed twice with PBS
and incubated in the presence of the MβCD and MTT. Then, four hours late the cells
were incubated with solubilization buffer (20% SDS; 50 % dimethylformamide; pH 4.5)
overnight. The cell viability was measurement at nm.
Circular dichroism. CD data were collected using a JASCO 715 spectropolarimeter. In
general, a 0.2-mm pathlength cuvette with 3
mM fusion peptide in 15 mM phosphate pH
7 was used
for CD experiments. Each of the CD spectra was obtained from an average
of
four scans with 1-nm bandwidth. The temperature was maintained at 298 K, the scan
rate was 50 nm/min, the step resolution was 1.0; the response time was 8 s. After
background
subtraction and smoothing, all of the CD data were converted from
CD
signal (millidegrees) into mean residue molar ellipticity (deg cm
2
dmol
-1
) by using the
following equation [θ] = θ.l
-1
.c
-1
.N
-1
where l is the cell length in mm, c is the molar
concentration, and N is the number of amino-acid residues in the peptide.
Three dimensional structure. NMR measurements were carried out at 25
o
C on a
Bruker AMX 600 MHz NMR spectrometer in the phase-sensitive mode using States -
time-proportional phase incrementation (States-TPPI). The sample contained 2 mM
peptide, 400 mM d
25
-SDS in phosphate buffer pH 7 [90 % H
2
O/ 10 % D
2
O (v/v)].
Nuclear Overhauser spectroscopy (NOESY) experiments were recorded with a mixing
time of 80 ms, also using WATERGATE. The three-dimensional structure was
calculated with the program CNS_SOLVE 1.1 (28). The resulting 20 energy-minimized
conformers were used to represent the structure of the fusion domain in SDS micelles.
Lipid rafts purification. All procedures were carried out on ice. Four T-150 and two T-
75 glasses of cells were washed twice with phosphate buffer and treated for 10 sec with
a dissociation buffer (enzyme free). Cells were harvest and washed by centrifugation at
730 g for 2 min at 4
o
C in phosphate buffer, and then once in phosphate buffer
containing protease inhibitor cocktail (SIGMA, Saint Louis, Missouri), 20 mM sodium
orthovanadate activated (33), 2 mM aminoethyl-benzene sulfonyl fluoride (PMSF) and
1% triton X-100. The cells were then lysed by passage through a 28 X 7 needle 10
times. An equal volume of 80 % sucrose was added to mixer with lysed and placed in
the bottom of sucrose gradient of 40 % to 5 % and centrifugated at 30 000 rpm for 24
hours at 4
o
C using a SW40 Ti rotor. Gradient was fractionated and raft fraction was
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
124
confirmed by dot blotting using cholera toxin B subunit-peroxidase conjugate (SIGMA,
Saint Louis, Missouri).
Cell stained and fluorescence microscopy. Vero cells monolayer were incubated in
the absence or in the presence of Ebola fusion peptide for 15 min at room temperature.
Staining was performed on live cells for 35 min at 37
o
C in the presence of 10 mg/mL of
Hoechst-33342, washed twice and after incubated on ice for 30 min in the presence of
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugated (CTB-Alexa488) .
Cells were washed with PBS and fixed with 4 % parafomaldehyde for 10 min and
washed with PBS. Then, was mounted on microscope slides.
Isothermal titration calorimetry. All measurements were carried out at 37
o
C in a VP
isothermal titration calorimetry produced by MicroCal Inc. (Northampton, MA). All
solutions were degassed for 5 min prior to use. For each injection, 5 μL of a 20 mM
stock solution of LUVs were injected into the sample cell which contained 1.4 mL of
100 μM of EBO
16
wt or W8A. Data handling (baseline subtraction, peak integration,
sample dilution) procedures were performed with MicroCal Origin software.
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
125
LEGENDS
Figure 1. Effect of MβCD in cell viability. (A) Cholesterol depletion. Cells were pre-
treated with MβCD for 30 min at 37
o
C and cholesterol containt was quantified as
mentionated in material and methods. (B) Cell viability. Cells were co-incubated with
MβCD and MTT reagent for 30min at 37
o
C. Then, were incubated with solubilization
buffer. Samples were measured at 570 nm.
Figure 2. Peptide membrane interaction. (A) Living vero cells were incubated with
EBO
16
wt at 25 or 37
o
C. Membrane mixing was followed by pyrene eximer/monomer
ratio for 30 min. (B) Living Vero cells in the absence or in the presence of pretreatment
with MβCD were incubated with EBO16 wt at 37
o
C. Membrane mixing was followed
by pyrene eximer/monomer ratio for 30 min. The peptide concentration was 100 μM in
all experiments. The MBCD concentration was 20 mM.
Figure 3. Structure of EBO
16
W8A. (A) Circular dichroism of EBO
16
. Comparison
between EBO
16
wt and its mutant W8A secondary structure. The blue curve represents
the EBO
16
W8A and the red line represents the EBO
16
wt. The SDS and peptide
concentrations were 10 mM, 100 μM and 400 mM, 1 mM for Ebo16 wt and W8A,
respectively. (B) Chemical shift deviation for the 16 residues of fusion peptide. (C)
Chemical shift difference between EBO16 wt and its mutant W8A. The peptide
concentration was 2 mM and SDS concentration was 400 mM. (D) The overlay plot of
the
1
H-NOESY spectra of Ebo16 a wt and W8A. The red spectrum illustrate the wt spin
systems, since blue lines indicate the W8A spin systems. The spectrum was recorded at
25
o
C and 600 MHZ at pH 7.0, with peptide concentration of 2 mM.
Figure 4. FTIR spectra of the amide I band of EBO
16
WT and W8A in differents lipid
vesicles at 25
o
C. (A) Peptides in 100% DMSO (B) Peptides in 50 % DMSO. (C)
Peptides in the presence of PC LUVs. (D) Peptides in the presence of PC:PE:PI:Cho
LUVs. (E) Peptides in the presence of PC:PE:SPM:Cho LUVs. (F) Peptides in the
presence of lipids rafts from Vero cells. The peptide concentration was 19.5 mM and
LUVs concentration was 44 mM. The solid and dashed lines represent the EBO
16
wt
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
126
and W8A, respectively. The abscissa for each spectrum (left to right) is 1750 to 1550
cm
-1
, while the ordinate represents absorption (in arbitrary units).
Figure 5. Effect of EBO
16
interaction with cellular membrane. (A-C) Images of cells ,
stained with CTB-Alexa488 (D-F), Hoechst-H33342 (G-I) and merged (J-M). The cells
were incubated in the absence or in the presence of EBO
16
wt or W8A at 37
o
C for 15
min, and stained as showed in materials and methods. Cells images were taken under oil
at a X 100 magnification with a Nikon.
Figure 6. Dynamic light scattering of vesicles incubated with Ebola fusion peptide. (A)
PC LUVS, (B) PC:PE:PI:Cho LUVs, (C) PC:PE:SPM:Cho LUVs, (D) lipid rafts from
BHK-21 cells and (E) lipid rafts from vero cells. All experiments were measurement in
phosphate buffer at 37
o
C at pH7. The peptide concentration was 100 μM. The liposome
concentration was 1 mM.
Figure 7. Binding of EBO
16
wt and W8A to lipid membranes by isothermal titration
calorimetry. Measurement of binding of vesicles to a fixed amount of EBO
16
wt or
W8A peptide. (A) PC LUVs, (C) PC:PE:PI:Cho LUVs (2:1:0.5:1), (E) PC:PE:SPM:Cho
LUVs (1:1:1:1.5), (G) lipid rafts from Vero cells and (I) lipid rafts from BHK-21 cells.
(B), (D), (F), (H) and (J) are enlarged view of selected heat peak of titration experiments
showed in (A, b), (C, b), (E, b), (G, b) and (I, b) curves, respectively. All measurements
were conducted at pH 7 and 37
o
C. Each peak corresponds to the subtraction of the
injection of 5 μL of vesicles into the 100 μM solution of wt or W8A peptides minus the
same amount of vesicles injection into the aqueous buffer.
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
127
REFERENCES
Alonso, M. A., and Millan J. (2001). The role of lipid rafts in signalling and membrane
trafficking in T lymphocytes. J. Cell Sci. 114, 3957–3965.
Aman, M. J., Bosio, C. M, Panchal, R. G., Burnett, J. C., Schmaljohn, A and Bavari.S.
(2003). Molecular mechanism of filovirus cellular trafficking. Microbes and
Infection. 5, 639- 649.
Anderson, H. A., Chen, Y. and Norkin, L. C. (1996). Bound simian virus 40
translocates to caveolin-enriched membrane domains, and its entry is inhibited by
drugs that selectively disrupt caveolae. Mol. Biol. Cell 7, 1825–1834.
Bär, S., Takada, A., Kawaoka, Y. and Alizon, M. (2006). Detection of cell-cell fusion
mediated by Ebola virus glycoproteins. J. Virol. 80, 2815-2822.
Campbell, S. M., Crowe, S. M. and Mak J. (2001). Lipid rafts and HIV-1: from viral
entry to assembly of progeny virions, J. Clin. Virol. 22, 217–227.
Chan, S. Y., Empig, C. J., Welte, F. J., Speck, R. F., Schmaljohn, A. J., .Kreisberg, F.
and Goldsmith, M. A. (2001). Folate receptor-? is a cofactor for cellular entry by
Marburg and Ebola viruses. Cell. 106, 117–126.
Empig, C. J. and Goldsmith, M. A. (2002). Association of the caveola vesicular system
with cellular entry by filoviruses. J. Virol. 76, 5266-5270.
Gallaher, W. R. (1996). Similar structural models of the transmembrane proteins of
Ebola and avian sarcoma viruses. Cell 85, 477-478.
Ito, H., Watanabe, S., Sanchez, A., Whitt, M. A. and Kawaoka, Y. (1999). Mutational
analysis of the putative fusion domain of Ebola virus glycoprotein. J. Virol. 73,
8907-8912.
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
128
Kielian, M. and Rey, F. A. (2006). Virus membrane-fusion proteins: more than one way
to make a hairpin. Nat Rev Microbiol. 4, 67-76.
Lakadamyali, M., Rust, M. J. and Zhuang, X. (2004). Endocytosis of influenza viruses.
Microbes Infect 6, 929-936.
Maia, L. F., Soares, M. R., Valente, A. P., Almeida, F. C., Oliveira, A. C., Gomes, A.
M., Freitas, M. S., Schneemann, A., Johnson, J. E. and Silva, J. L. (2006). J. Biol.
Chem. 281, 29278-29286.
Neumann, G., Feldmann, H., Watanabe, S., Lukashevich, I. and Kawaoka, Y. (2002).
Reverse Genetics Demonstrates that Proteolytic Processing of the Ebola Virus
Glycoprotein Is Not Essential for Replication in Cell Culture. J. Virol. 76, 406-410.
Nichols, B. J., Kenworthy, A. K., Polishchuk, R. S., Lodge, R., Roberts, T. H.,
Hirschberg, K., Phair, R. D. and Lippincott- Schwartz, J. (2001). Rapid cycling of
lipid raft markers between the cell surface and Golgi complex. J. Cell Biol. 153,
529–541.
Ohtani, Y., Irie, T., Uekama, K., Fukunaga, K. and Pitha, J. (1989). Differential effects
of alpha-, beta- and gamma-cyclodextrins on human erythrocytes. 186, 17-22.
Schornberg, K., Matsuyama, S., Kabsch, K., Delos., S., Bouton, A. and White, J.
(2006). Role of endosomal cathepsins in entry mediated by the Ebola virus
glycoprotein. J. Virol. 80, 4174-4178.
Sieczkarski, S. B. and Whittaker, G. R. (2002). Influenza Virus Can Enter and Infect
Cells in the Absence of Clathrin-Mediated Endocytosis. J. Virol. 76, 10455-10464.
Simmons, G., Rennekamp, A. J., Chai, N., Vandenberghe, L. H., Riley, J. L., and Bates,
P. (2003). Folate receptor alpha and caveolae are not required for Ebola virus
glycoprotein-mediated viral infection. J. Virol. 77, 13433–13438.
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
129
Simons, K., and Toomre, D. (2000). Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol.
Cell Biol. 1, 31–39.
Stang, E., Kartenbeck, J. and Parton, R. G. (1997). Major histocompatibility complex
class I molecules mediate association of SV40 with caveolae. Mol. Biol. Cell 8, 47–
57.
Stein, B. S., Gowda, S. D., Lifson, J. D., Penhallow, R. C,, Bensch, K. G. and
Engleman, E. G. (1987). pH-independent HIV entry into CD4-positive T cells via
virus envelope fusion to the plasma membrane. Cell 49, 659-668.
Suarez, T., Gomara, M. J., Goni, F. M., Mingarro, I., Muga, A., Perez-Paya, E. and
Nieva, J. L. (2003). Calcium-dependent conformational changes of membrane-
bound Ebola fusion peptide drive vesicle fusion. FEBS Lett. 535, 23-28.
Takada, A., Robison, C., Goto, H., Sanchez, A., Murti, K. G., Whitt, M. A. and
Kawaoka, Y. (1997). A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14764-14769.
Tamm, L. K, Han, X., Li, Y. and Lai, A. L. (2002). Structure and function of membrane
fusion peptides. Biopolymers 66, 249-260.
Volchkov, V. E., Feldmann, H., Volchkova, V. A., Klenk, H. D. (1998). Processing of
the Ebola virus glycoprotein by the proprotein convertase furin. Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 95, 5762–5767.
Volchkov, V. E., Volchkova, V. A., Stroher, U., Becker, S., Dolnik, O., Cieplik, M.,
Garten, W., Klenk, H. D., Feldmann, H. (2000). Proteolytic processing of Marburg
virus glycoprotein. Virology 268, 1–6.
Volynsky P. E., Polyansky, A. A., Simakov, N. A. ; Arseniev, A. S. and Efremov, R. G.
(2005). Effect of lipid composition on the "membrane response" induced by a fusion
peptide. Biochemistry 44, 14626-14637.
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
130
Werling, D., Hope, J. C., Chaplin, P., Collins, R. A., Taylor, G. and Howard, C. J.
(1999). Involvement of caveolae in the uptake of respiratory syncytial virus antigen
by dendritic cells. J. Leukoc. Biol. 66, 50–58.
White, J., Matlin, K. and Helenius, A. (1981). Cell fusion by Semliki Forest, influenza,
and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679.
Wishart, D. S., Sykes, B. D. and Richards, F. M. (1992). Relationship between nuclear
magnetic resonance chemical shift and protein secondary structure. J. Mol. Biol.
222, 311-333.
Wool-Lewis RJ, Bates P. Endoproteolytic processing of the ebola virus envelope
glycoprotein: cleavage is not required for function.
Wool-Lewis, R. J. and Bates, P. (1998). Characterization of Ebola Virus Entry by Using
Pseudotyped Viruses: Identification of Receptor-Deficient Cell Lines. J. Virol. 72,
3155- 3160.
Wool-Lewis, R. J. and Bates, P. (1999). Endoproteolytic processing of the ebola virus
envelope glycoprotein: cleavage is not required for function. J. Virol. 73, 1419-
1426.
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts in membrane fusion.
131
Assigment
DMSO
100 %
DMSO
50 %
LUV1 LUV2 LUV3 Raft DMSO
100 %
DMSO
50 %
LUV1 LUV2 LUV3 Raft
α
-helix
(1655- 1660)
39.5 - - 70.8 10 24.3 15.8 49.3 - 28.8 19.3 -
β
-sheet and
β
-turn
(1620- 1640 and 1650- 1695)
9.5 52.2 55.1 29.2 80.6 75.7 59
41.4 25.2 56.2 43.7 59.2
Random and other
(1640- 1657 and 1660- 1670)
51 47 44.9 - 9.3 - 25.2 - 74.8 14.9 37 40.9
Wild type Mutant W8A
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
132
0
20
40
60
80
100
0
14
8
12
16
20
24
Cholesterol depletion
(% of control)
[MβCD] mM
0
20
40
60
80
100
120
140
20 2416128
4
10
Living Cells
(% of control)
[MβCD] mM
Freitas MS, 2007
Figure 1
A
B
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
133
Freitas MS, 2007
Figure 2
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40
0
10
20
30
40
% Lipid mixing
Time (min)
0 5 10 15 20 25 30
0
10
20
30
40
% Lipid mixing
Time (min)
A
B
A
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
134
Figure 3
Freitas MS, 2007
A
C
D
A
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0.0
0.1
0.2
A16
A15
P14
G13
F12
Y11
P10
I9
A8
A7
L6
G5
I4
A3
A2
Chemical shift deviation (ppm)
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0.0
0.1
0.2
A2
A16
A15
P14
G13
F12
Y11
P10
I9
*
A7
L6
G5
I4
A2
A3
Chemical Shift difference (ppm)
δ W8A- δ WT
180 200 220 240 260
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
Molar ellipticity per residue
(10
-3
x deg cm
2
dmol
-1
)
Wavelength (nm)
B
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts
in membrane fusion.
135
Freitas MS, 2007
Figure 4
G
Control WT W8A
GM1
Nuclei
Merged
D
B
E
H
C
F
I
A
G
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts in
membrane fusion.
136
Freitas MS, 2007
Figure 5
15501600165017001750
Wavenumber (cm
-1
)
15501600165017001750
Wavenumber (cm
-1
)
15501600165017001750
Wavenumber (cm
-1
)
15501600165017001750
Wavenumber (cm
-1
)
15501600165017001750
Wavenumber (cm
-1
)
B
D
F
C
E
15501600165017001750
Wavenumber (cm
-1
)
A
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts in
membrane fusion.
137
Freitas MS, 2007
Figure 6
R
h
(nm)
0.1 1 10 100 1000 10000 100000
Control
WT
W8A
C
A
E
WT
R
h
(nm)
0.1 1 10 100 1000 10000 100000
Control
W8A
D
B
Control WT W8A
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Polydispersity Index
Control WT W8A
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Polydispersity Index
Sample
Control WT W8A
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Polydispersity Index
Sample
Control WT W8A
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Polydispersity Index
Sample
Control WT W8A
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Polydispersity Index
R
h
(nm)
0.1 1 10 100 1000 10000 100000
Control
WT
W8A
R
h
(nm)
0.1 1 10 100 1000 10000 100000
Control
WT
W8A
R
h
(nm)
0.1 1 10 100 1000 10000 100000
Control
WT
W8A
B
A
E
Artigo 4. The Interaction between Ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts in
membrane fusion.
138
0 102030405060
Time (min)
0 102030405060
Time (min)
Freitas MS, 2007
Figure 7
A
B
12 13 14 15 16 17
Time (min)
≈ 1 min
0.112 μcal.sec
-1
a
b
0 102030405060
Time (min)
12 13 14 15 16 17
Time (min)
0.068 μcal.sec
-1
G H
E
0 102030405060
Time (min)
12 13 14 15 16 17
Time (min)
0.269 μcal.sec
-1
45 sec
C D
12 13 14 15 16 17
Time (min)
≈ 2 min
2.543 μcal.sec
-1
b
a
F
b
a
b
a
0 102030405060
Time (min)
25 26 27 28 29
Time (min)
0.044 μcal.sec
-1
I J
b
a
Discussion
139
DISCUSSÃO GERAL
Discussion
140
1- Implicações do pH e da alta pressão hidrostática na exposição de regiões hidrofóbicas do
vírus Mayaro
A fusão entre membranas não é uma característica exclusiva dos vírus, mas sim um
mecanismo importante para diversas funções biológicas, como: fertilização, transmissão
sináptica, exocitose e tráfego de proteínas (Cohen & Melikyan, 1998). O mecanismo de fusão
tem sido melhor compreendido para os vírus envelopados, devido ao fato, de ser um evento
chave do ciclo infeccioso destes vírus. O vírus da Influenza tem sido um dos vírus mais
utilizados nesse estudo. A hemaglutinina (HA) é a sua proteína de fusão, e também a
responsável pela ligação do vírus à membrana alvo. Ela é composta por duas subunidades, a
HA1 que apresenta a função de ligar-se aos receptores presentes na célula alvo, e a HA2 que é
a subunidade fusogênica. O vírus da influenza é internalizado na célula hospedeira, assim
como os alfavírus, através de endocitose mediada por receptor, e a fusão é ativada pela
redução do pH. As etapas que sucedem a redução do pH envolvem mudanças
conformacionais na hemaglutinina HA2, a qual irá induzir fusão da membrana viral com a
membrana do endossoma. Alterações conformacionais dependentes do baixo pH também
foram observadas para os vírus Sindbis e SFV, onde a proteína de fusão desses vírus, a E1,
formou uma estrutura homotrimérica (E1
3
), com conseqüente exposição de segmentos
hidrofóbicos, dentre esses, o correspondente ao peptídeo de fusão. Em contraste, outros vírus
como o HIV, por exemplo, podem sofrer fusão direta com a membrana plasmática da célula
hospedeira, em pH neutro. Embora existam diferenças entre esses dois tipos de fusão, a
estrutura da HA em sua conformação fusogênica, determinada por cristalografia de raio-X,
apresenta uma grande similaridade com as estruturas cristalográficas obtidas para as proteínas
de fusão dos vírus HIV e Ebola (Bullough e cols., 1994; Malashkevich e cols., 1999).
Indicando que proteínas de fusão, de diferentes vírus, provavelmente possuem um mecanismo
comum de ação.
As glicoproteínas do envelope dos vírus têm sido extensivamente estudadas. Isto se
deve à grande importância destas proteínas em relação ao ciclo replicativo do vírus, já que são
responsáveis pela entrada e saída do vírus na célula hospedeira, além de serem responsáveis
por suscitar resposta imune nos organismos infectados. Além disso, essas glicoproteínas
sofrem mudanças conformacionais ao longo do ciclo replicativo viral de forma a tornar
compatível os seus estados conformacionais com as funções exercidas durante algumas etapas
Discussion
141
do ciclo. Com o intuito de estudar essas conformações alguns trabalhos cietíficos têm
mostrado a utilização de sondas fluorescentes, tais como o bis-ANS (bis-1,8-anilino-
naftaleno-sulfonato) (Korte e cols., 1999; Gaspar e cols., 2002).
Estudos conformacionais realizados com partículas virais e com proteínas, quando
submetidas ao baixo pH, têm evidenciado a exposição de regiões hidrofóbicas pelo aumento
da intensidade de fluorescência da sonda bis-ANS (Bethell e cols., 1995; Korte e cols., 1999).
Nesta tese, observamos que o vírus Mayaro quando submetidos ao baixo pH apresentou um
aumento progressivo na ligação de bis-ANS até o pH 5,8 (Freitas e cols., 2006). Contudo, ao
reduzir ainda mais o pH, algumas regiões hidrofóbicas que estavam expostas, passaram a não
estar mais acessível ao bis-ANS. Desta forma, sugerimos que em pHs levemente ácidos as
proteínas de superfície viral sofram um conjunto de alterações em sua estrutura, que
contribuem para o aumento de regiões hidrofóbicas expostas. Quando o pH torna-se mais
ácido as alterações tornam-se mais específicas culminando com a estabilidade da partícula no
estado ativo de fusão. Nos alfavírus, SFV e Sindbis, essa modificação na superfície viral é
induzida, in vivo, pela redução do pH no endossoma celular, e resulta em uma mudança na
estrutura terciária e quaternária do heterodímero E1-E2, com conseqüente exposição de
regiões hidrofóbicas (Wahlberg and cols., 1992a; Walberg and cols., 1992b). Alterações
conformacionais devido à redução de pH também têm sido descritas para o vírus da influenza,
por meio do monitoramento da emissão de fluorescência da sonda bis-ANS (Meyer e cols.,
1992; Jones e cols., 1998).
Recentemente, foi mostrado que a pressão hidrostática induz mudanças nas proteínas
do envelope do vírus da estomatite vesicular, no vírus da influenza e nos alfavírus Sindbis e
Mayaro, conduzindo-os para o estado fusogênico (Gaspar e cols., 2002; Gomes e cols., 2000).
Os dados obtidos durante este trabalho mostram que a alta pressão, ao contrário do baixo pH,
induz um aumento contínuo da ligação do bis-ANS a estrutura do vírus Mayaro (Freitas et al.,
2006).
2- Efeito do baixo pH e da alta pressão hidrostática na estrutura secundária do vírus
Mayaro
Para avaliarmos a estrutura secundária das proteínas do vírus Mayaro foi utilizada a
técnica de dicroísmo circular. O vírus Mayaro quando colocado em pHs ácidos apresentou
Discussion
142
uma perda de conteúdo de estrutura secundária, assim como observado para o vírus
pressurizado por 8 horas a 2.5 kbar (Artigo 1). Contudo, este comportamento não foi
observado para o vírus Sindbis, que após, ser incubado nas mesmas condições de temperatura
e pressão, apresentou aumento no seu conteúdo de estrutura secundária, mas quando
submetido ao baixo pH apresentou uma ligeira queda em relação ao controle experimental
(Gaspar e cols., 2002). Como a proteína E1 do vírus SFV apresenta uma estrutura em forma
de barril-β, e extrapolando para a proteína E1 do vírus Mayaro um semelhante perfil seria
observado, provavelmente, grande parte do conteúdo de estrutura β estaria sendo afetado
durante o tempo de incubação a baixo pH e após pressurização. Os dados de dicroísmo
circular, juntamente com os resultados obtidos pela espectroscopia de fluorescência da sonda
bis-ANS, mostram que o vírus após ser submetido ao baixo pH apresentou alterações em sua
estrutura, que afetou tanto o seu conteúdo de estrutura secundária, quanto o de terciária e
quaternária (Artigo 1).
3- Metaestabilidade viral e o estado ativo de fusão
Nos últimos anos, tem sido mostrado que proteínas no estado nativo (estado não
fusogênico) apresentam um enovelamento metaestável (Carr & Kim, 1993; Carr e cols., 1997;
Chan & Kim, 1998). Essa metaestabilidade pode ser adquirida por dois diferentes meios:
primeiro, pela clivagem de uma poliproteína precursora que dará origem as proteínas
constituintes do envelope viral, como ocorre para os alfavírus e para o vírus da influenza, ou
segundo, pode ser adquirida após o brotamento da partícula viral da membrana da célula
hospedeira, como ocorre com as glicoproteínas do HIV (Chan & Kim, 1998; Skehel & Wiley,
2000). De acordo com alguns trabalhos, as glicoproteínas no estado nativo (metaestável)
mostram-se termodinamicamente menos estáveis que as mesmas proteínas no estado
fusogênico (Gaspar e cols., 2002). Contudo, o vírus nativo é impedido, por uma barreira
energética de alcançar a conformação de fusão, a qual apresenta menor energia (Carr e cols.,
1997; Chan & Kim, 1998). Este tipo de barreira pode ser imposta durante o enovelamento
protéico por meio de fatores que impeçam a aquisição direta do estado fusogênico. A HA, por
exemplo, no interior celular apresenta-se como um precursor inativo para a fusão, conhecido
como HA0, o qual subseqüentemente sofre clivagem proteolítica dando origem à proteína no
estado maduro HA1/HA2 (Klenk e cols., 1975). Apesar disso, essa barreira energética pode
ser superada por meio de vários agentes químicos e físicos. Alguns trabalhos, utilizando as
Discussion
143
hemaglutininas do vírus da influenza como modelo de estudo, mostraram que altas
temperaturas e uréia fornecem energia suficiente ao sistema de forma a ultrapassar a barreira
energética entre o estado nativo e o fusogênico. Para verificarmos se a uréia poderia conduzir
o vírus Mayaro para o estado fusogênico resolvemos verificar a propensão do vírus em expor
regiões hidrofóbicas na presença de diferentes concentrações de uréia.
O vírus Mayaro quando incubado com concentrações de até 2 M de uréia apresentou
exposição de regiões hidrofóbicas e, a partir de 3 M já começou a desligar bis-ANS de regiões
hidrofóbicas de sua membrana lipídica (Artigo 1). A uréia possui ação desnaturante e atua
predominantemente sobre as pontes de hidrogênio presentes nas proteínas, promovendo a
desestabilização da estrutura viral. A adição de uréia às partículas virais promove perda das
estruturas secundárias e terciárias e, desta forma, resulta na desmontagem viral (Tanford,
1970). No entanto, algumas proteínas apresentam resistência à ação da uréia como, por
exemplo: a lisozima e a albumina de cavalo (Leonis, 1956; Kauzmann & Simpson, 1953).
Além disso, estruturas mais complexas como a do bacteriófago R17, também mostra
resistência à uréia, pois mesmo em concentrações de 5 M de uréia, esse vírus se mantém
infeccioso, sem sofrer alteração na estrutura do seu capsídeo (Da Poian e cols., 1993).
Entretanto, grande parte dos vírus não envelopados apresentam sensibilidade a altas
concentrações de uréia, assim como os picornavírus (Oliveira e cols., 1999) e o vírus do feijão
da corda (CPSMV) (Gaspar e cols., 1997). Os vírus envelopados, em sua maioria, também
apresentam desnaturação protéica quando incubados com altas concentrações de uréia. O
vírus Mayaro, por exemplo, quando submetido a 10 M de uréia, mostrou-se totalmente
desestruturado, com um desvio no espectro de centro de massa de 750 cm
-1
(Artigo 1) e com
perda da estrutura secundária, como observado pelos dados de dicroísmo circular (Artigo 1).
Contudo, os nossos dados indicam que em condições sub-desnaturantes a uréia estaria
atuando como uma indutora do estado ativo de fusão.
Resultados controversos são observados para o vírus SFV, o qual tem mostrado não
sofrer fusão de membranas quando colocados na presença de uréia ou alta temperatura
(Gibbons e cols., 2000). Já para o vírus da influenza, em 1986, Rugroik e colaboradores
observaram que este vírus poderia sofrer fusão com membranas alvos, quando em elevadas
temperaturas e pH neutro. Segundo este trabalho, o tratamento com calor alteraria as
Discussion
144
propriedades bioquímicas do ectodomínio da HA de forma distinta da mudança promovida
pelo baixo pH, indicando assim, que o mecanismo de fusão promovido pela temperatura é
diferente daquele induzido pelo baixo pH. Em contraste com esse trabalho, Carr e
colaboradores, mostraram em 1997 que existiam mecanismos comuns de ativação de fusão de
membranas, os quais estariam envolvidos na desestabilização do vírus no estado nativo. Essa
desestabilização poderia ser promovida pelo baixo pH, pela alta temperatura, ou mesmo, por
meio de agentes químicos.
4- Rearranjo estrutural da E1 do vírus Mayaro em diferentes condições de pH
Como uma outra forma de avaliarmos a alteração conformacional induzida pelo baixo
pH, nós utilizamos o ensaio de resistência à tripsina. Várias proteínas de fusão, inclusive a do
vírus da influenza, ao atingirem o estado de maior estabilidade (fusogênico) tornam-se
resistentes a ação de enzimas proteolíticas. Como pode ser observado em Freitas e cols., o
vírus nativo quando colocado em pH igual ou inferior a 6,0 já apresenta a capacidade de
formar E1 resistente a ação da enzima tripsina (Artigo 1). Este tipo de abordagem
experimental tem sido vista para o vírus SFV, o qual na presença de baixo pH apresenta a
formação de homotrímero de E1 resistente a tripsina (Gibbons & Kielian, 2002). Para o vírus
Mayaro, foi observada completa degradação das proteínas virais no pH neutro e quando pré-
incubada com 2 M de uréia. Por outro lado, o vírus incubado em baixo pH e pressurizado por
3 ou 8 horas foram resistentes a ação da tripsina (Artigo 1). Os nossos dados mostram que o
vírus Mayaro, assim como os outros alfavírus, sofrem alterações conformacionais sutis, as
quais envolvem o rearranjo de sua estrutura terciária, quaternária e secundária, que resultam
na formação de um homotrímero de E1 resistente a tripsina e competente para fusão (Artigo
1).
5- Fusão de membrana induzida pela alta pressão e pelo baixo pH
Como observado, a alta pressão hidrostática e o baixo pH conduzem as partículas
virais a múltiplas alterações na estrutura de suas proteínas de superfície, tornando- as
competente para fusão. Contudo, podemos destacar algumas diferenças entre o estado de
fusão induzido pela alta pressão e o induzido pelo baixo pH. Quando o vírus é incubado em
baixo pH na ausência de membrana alvo, ele apresenta ativação estrutural para a fusão, mas
ao ser colocado na presença de membranas não é observado fusão (Artigo 2). Por outro lado,
Discussion
145
o vírus quando incubado em pH ácido na presença da membrana alvo, induz uma rápida
mistura do conteúdo lipíco do seu envelope com o da membrana alvo e o extravasamento do
conteúdo intravesicular (Artigo 1 e Artigo 2). A grande questão que parece envolver a perda
da atividade fusogênica viral seria a ausência e presença de membrana alvo durante a
acidificação. Alguns trabalhos têm sugerido que a energia liberada durante a mudança
conformacional seria importante para promover modificações na organização da membrana
alvo, e consequentemente mistura de lipídeos e abertura de poros (Carr e cols., 1997). Porém,
os nossos dados sugerem que algum outro fator poderia contribuir para este evento. Como
pode ser observado para o vírus Mayaro, a alta pressão conseguiu leva-lo para o estado ativo
de fusão na ausência de membrana alvo, e ainda o manteve com a capacidade de induzir fusão
de membranas após descompressão. Desta forma, se a energia envolvida na modificação
estrutural, realmente fosse crucial para o processo de fusão, o vírus após ser pressurizado
deveria perder a capacidade de induzir mistura de lipídeos e de conteúdo aquoso. Contudo, o
oposto tem sido observado (Artigo 1; Artigo 2).
6- Sistemas de micelas de SDS e solubilização de peptídeo de fusão
Ao longo dos anos, tem aumentado o número de proteínas de fusão virais resolvidas a
nível atômico, como: a HA2 do vírus da influenza, a gp41 do vírus HIV, e dentre outras a
proteína GP2 do vírus Ebola. Embora a estrutura do ectodomínio da proteína GP2 do vírus
Ebola tenha sido resolvida, nenhuma estrutura de resolução atômica do domínio de fusão
deste vírus foi determinada. Normalmente, determinar a estrutura de peptídeos de fusão é um
problema devido a grande tendência destes domínios agregarem em solução. Inclusive o
peptídeo de fusão do vírus Ebola, que se mostrou insolúvel em água. Para resolvermos este
problema, inserimos o peptídeo de fusão do vírus Ebola em modelos de membranas, e
analisamos qual dos modelos seria o mais viável a ser utilizado para determinação da sua
estrutura.
Nós últimos anos a utilização de micelas de SDS para determinação de estrutura
tridimensional de proteínas e peptídeo, ligados a membranas, tem sido muito utilizado (Han e
cols., 2001; Hsu e cols., 2002). Normalmente, não são utilizados sistemas de bicamada
fosfolipídicas, tal como vesículas, pois estes apresentam uma alta massa molecular (>>10
5
Da) e um movimento molecular lento, conduzindo a um alargamento das linhas de
Discussion
146
ressonância, quando utilizada a técnica de RMN de alta resolução. Dificultando ou mesmo
impossibilitando a determinação de estrutura de proteínas ligadas a vesículas, em solução.
Para suprir esta limitação experimental tem-se utilizado o RMN de fase sólida ( ). Por outro
lado, as micelas de detergente são geralmente pequenas, com massa molecular de 10
4
Da, e
apresentam alta mobilidade, mesmo quando complexadas às proteínas ou peptídeo. Embora o
SDS possa atuar promovendo a desnaturação protéica, principalmente estruturas em α-hélice,
para peptídeos ele oferecem uma boa interface para o seu enovelamento e, neste caso, não
gerando o problema de desnaturação (Henry & Sykes, 1994; Artigo 2).
Além do SDS, existe um outro detergente muito utilizado na RMN, a
dodecilfosfocolina (DPC). A dodecilfosfocolina foi desenvolvida especificamente com um
detergente que mimetiza a membrana, para ser utilizado em experimentos de RMN (Brown,
1979). Ela foi modelado a partir da fosfatidilcolina, que é um fosfolipídeo predominante na
membrana celular animal. O DPC apresenta propriedades similares ao SDS, como a de formar
pequenas micelas. O uso de DPC tem sido aumentado nos últimos anos, mas ainda apresenta
limitações para experimentos de RMN envolvendo pequenos peptídeos e proteínas, pois suas
propriedades biológicas ainda não foram estabelecidas. O DPC, muitas das vezes, é utilizado
complementando o SDS nos estudos de peptídeos (Henry & Sykes, 1994).
O uso de solventes orgânicos tais como o triofluoretanol (TFE) tem contribuído para
obtenção de estrutura de peptídeos em solução. Isto se deve ao fato, de o TFE ser um solvente
orgânico muito utilizado para solubilizar peptídeos e proteínas para o RMN, tipicamente
misturado com água. Este solvente mimetiza um ambiente menos hidrofílico que a água, e
geralmente induz a formação de hélice em peptídeos (Damberg e cols., 2001).
7- Efeito dos modelos de membrana na estrutura secundária do peptídeo do Ebola
Para investigar as alterações estruturais do peptídeo de fusão do Ebola em diferentes
modelos de membranas, foi utilizado o dicroísmo circular, a fluorescência e a RMN. Em
solução aquosa o peptídeo de fusão do vírus Ebola mostrou uma estrutura totalmente
desordenada (Freitas e cols., 2007), semelhante a observada para o peptídeo de fusão do vírus
da influenza em solução (Han e cols., 2001) e contrastante com a estrutura volta-β mostrada
para o peptídeo de fusão do vírus HIV-tipo I (Chang e cols., 1997). Todavia, ao incubar o
Discussion
147
peptídeo de fusão do vírus Ebola na presença de SDS, este adotou um estado conformacional
helicoidal (Freitas e cols., 2007b), de forma semelhante ao observado na literatura para o
peptídeo do vírus da influenza e do vírus HIV-1 (Yang e cols., 2001). Em adição, quando
variada a razão molar peptídeo:SDS, o grau de estruturação do peptídeo de fusão do Ebola foi
alterado de uma estrutura-β (razão 1:40) para uma estrutura em hélice (1:50; 1:100 e 1:200)
(dados não mostrados). Curiosamente, o peptídeo de fusão do Ebola com a mutação W8A não
apresentou ganho de estrutura em hélice, confirmando a importância deste resíduo aromático
na estabilidade estrutural do peptídeo (Artigo 3).
Quando o peptídeo de fusão do Ebola foi incubado na presença de micelas de DPC foi
observada a presença de duas populações conformacionais. Uma população com estrutura
desordenada e outra com estrutura em hélice (dados não mostrados). Contrastando com este
quadro, foi mostrado que o peptídeo de fusão do vírus da influenza quando na presença de
micelas de DPC adotava uma única população comformacional em α-hélice, semelhante a
observada na presença de vesículas lipídicas (Han e cols., 2001). Desta forma, a presença
destes dois grupos populacionais observados para o peptídeo do Ebola, fizeram com que o
DPC não fosse o melhor sistema a ser utilizado para determinação da estrutura atômica deste
peptídeo. Em adição, um comportamento similar ao observado para o peptídeo na presença de
DPC, foi constatado na presença de TFE (dados não mostrados), onde concentrações
superiores a 50 % de TFE continuaram a apresentar as duas populações estruturais. Para o
peptídeo (559- 587) da gp41 do vírus HIV-1, concentração de 30 % de TFE foi suficiente para
induzir a formação de hélice (Chang e cols., 1999).
Como somente em SDS o peptídeo apresentou-se bem estruturado, o passo seguinte
foi avaliar a sua interação com as micelas de SDS, além da sua inserção neste sistema. Na
concentração acima da concentração micelar crítica pode ser observado um pequeno desvio
para o azul, no espectro do triptofano, revelando que nesta condição o peptídeo penetra nas
micelas de SDS (Artigo 3). Estas observações são consistentes com o dado de dicroísmo
circular, o qual mostra que nesta concentração de SDS o peptídeo foi mais estruturado do que
na ausência de SDS. Em adição, os experimentos de supressão de fluorescência do triptofano
pela acrilamida mostraram valores de K
SV
compatíveis a um triptofano inserido nas micelas
de SDS.
Discussion
148
Em experimentos previamente mostrados para a seqüência de fusão do vírus Ebola, foi
observada a sua capacidade de interação com vesículas lipídicas, promovendo a sua
desestabilização no sentido da fusão de membranas (Ruiz-Argüello e cols., 1998). Contudo,
para que houvesse este evento de fusão foi proposta a necessidade de fosfatidilinositol (PI) na
vesícula alvo. Uma explicação para esta requisição poderia ser baseada em algum tipo de
mudança nas propriedades físicas da membrana lipídica, induzida pelo PI, a qual seria
necessária para a associação do peptídeo. Contudo, ainda não existe nenhuma indicação de
alguma propriedade específica do PI. A existência da esteroespecificidade por um
fosfolipídeo tem sido mostrada para vários vírus, como o vírus SFV, o qual depende de
colesterol e ceramidas, e o VSV que necessita de fosfatidilserina, para que ocorra o processo
de fusão de membranas (Moesby e cols, 1995; Schlegel e cols.,, 1983). Nesta tese, foram
realizados grandes avanços na compreensão da interação do peptídeo de fusão do vírus Ebola
com vesículas. A interação inicial entre o peptídeo e a vesícula parece envolver um rearranjo
estrutural, que depende da composição lipídica utilizada. De forma bem interessante foi
possível observar que o pepetídeo adquiriu estrutura praticamente helicoidal na presença de
vesículas compostas por PI (Artigo 4). Contudo, esta estruturação não parece estar ligada a
capacidade do peptídeo induzir agregação. Por outro lado, na presença de microdomínios de
membranas, conhecidos como rafts, foi possível observar um aumento no conteúdo de
estrutura β, que neste caso parece ter forte correlação com a capacidade de agregação
vesicular (Artigo 4). A conexão entre estrutura e função já havia sido previamente descrita,
por Suarez e colaboradores, quando mostraram que a estrutura em hélice era mais encontrada
na ausência de Ca
2+
, situação em que o peptídeo não estaria apto a induzir fusão vesicular,
apesar de conseguir permeabilizar membranas (Suarez e cols., 2003). No entanto, estrutura
em folha β foi correlacionada com a capacidade do peptídeo induzir fusão entre membranas.
Desta forma, os nossos dados corroboram os previamente relatados na literatura (Suarez e
cols., 2003). Alem disto,vale ressaltar que esta é a primeira vez em que se mostra que um
peptídeo de fusão viral pode interagir com “lipid rafts”. Para o vírus Ebola, isto significa a
possíbilidade da descoberta de uma rota alternativa de entrada do vírus na célula.
8- Refinamento do conteúdo de estrutura secundária do peptídeo de fusão
O peptídeo de fusão é um dos domínios cruciais da poteína de fusão, para que esta
promova a fusão entre o envelope do vírus e a membrana plasmática da célula alvo. Durante
Discussion
149
os anos, vem sendo mostrado, para vários outros vírus, a tendência do peptídeo de fusão na
presença de micelas de SDS adquirir conformação em hélice, principalmente, na porção que
fica inserida na micela (Han e cols., 2001, Hsu e cols., 2002). Desta forma, com o intuito de
refinarmos os dados previstos no dicroísmo circular, foi realizada a análise do deslocamento
químico para cada um dos resíduos de aminoácidos do peptídeo. Como visto no Artigo 3, o
peptídeo mostrou uma forte tendência a hélice na presença de micelas de SDS, reforçando os
resultados vistos anteriormente no dicroísmo circular (Artigo 3). Em adição, foi possível
predizer este conteúdo helicoidal entre os resíduos de L6 e F12. Além disso, ao observarmos
as conetividades de NOEs de interesíduos, novamente constatamos a forte tendência
helicoidal desta região (Artigo 3). Entretanto, no caso do mutante W8A não foi observado um
perfil de deslocamento químico que suportaria uma estrutura helicoidal, corroborando os
dados obtivos por dicroísmo circular (Artigo 4).
9- Estrutura tridimensional do peptídeo de fusão
Para determinarmos a estrutura tridimensional do peptídeo do Ebola, foram utilizados
a princípio os assinalmentos seqüenciais e espaciais do peptídeo em 40 mM de SDS com um
tempo de mistura de 180 ms (Artigo 3). Com base no volume dos NOEs, pode-se calcular a
distância intra e interprótons, para um máximo de 5 Å de distância. As 20 estruturas obtidas
apresentaram uma boa sobreposição. Contudo, ao observamos as conectividades de NOEs,
notamos que muitos C
α
H faziam NOEs com prótons HN do resíduo anterior. Uma estrutura
com este tipo de conectividade teria que ter um conteúdo helicoidal muito apertado já que a
distância entre estes prótons é muito grande. Os nossos dados etavam sugerindo a presença de
difusão de spins durante a aquisição do NOESY. Normalmente, difusão de spins acomete
proteínas grandes, ou então, experimentos com tempo de mistura muito longo (acima da
linearidade). Como no NOESY o volume do pico reflete a distância entre os picos cruzados,
quando se tem difusão de spins esta relação deixa de ser verdadeira. Podendo assim, aparecer
NOEs que na verdade não eram para existir e NOEs com intensidades aumentadas, o que
provavelmente levaria ao assinalamento de NOEs inexistentes. Contudo, como solução para
esta questão, foi realizado o “build up” do peptídeo só que agora na concentração de 400mM
de SDS. Como observado em tempos de mistura superiores a 100 ms o espectro de NOESY já
apresenta muita difusão de spin, e certamente é por este motivo que as intensidades de NOEs
adquiridas no tempo de 180 ms apresentavam-se muito fortes (dados não mostrados). Com o
Discussion
150
novo tempo de mistura estabelecido (80 ms) pode ser feito um novo NOESY e determinado
um novo assinalamento da molécula.
Todas as análises a nível atômico foram muito parecidas entre o peptídeo em 40 mM e
em 400 mM. Contudo, a tendência a formar hélice mostrou-se mais pronunciada em 400 mM
de SDS, como pode ser visto pelas conectividades de NOEs tipo i,i+3, suportando os
resultados obtidos no diccroísmo circular (Artigo 3). Além disso, a energia da estrutura foi
reduzida drasticamente de 300 (peptídeo em 40 mM de SDS) para 23,97 kcal/mol (peptídeo
em 400 mM de SDS), indicando um melhor estado estruturado para o peptídeo em 400 mM.
A conformação apresentada pelo peptídeo é de uma volta contendo uma hélice 3
10`
central,
formando a estrutura ligeralmente invergada. Este tipo de estruturação tem sido observado
para vários peptídeos de fusão, inclusive o vírus da influenza (Han e cols., 2001). A maior
diferença entre a estrutura do peptídeo sintético do vírus da influenza em pH neutro e em
baixo pH é a ocorrência do V invertido no lado carboxi-terminal. No pH neutro é observada a
formação de uma estrutura estendida, enquanto que no baixo pH é observada uma pequena
hélice-3
10
(Cohen & Melikyan, 2001). Para o peptídeo de fusão do vírus Ebola não se tem a
estrutura em baixo pH logo não se tem conhecimento de ganho estrutural, curvatura e inserção
na membrana, os quais pudessem ser comparadas ao peptídeo em pH neutro.
Com o intuito de obtermos maiores informações do modo de inserção do peptídeo nas
micelas foram realizados alguns ensaios in silico. Desta forma, foram utilizados dos modelos
de estudo: micela de SDS e interface água/hexano. A micela de SDS serviu como base para
compreendermos a interação da estrutura resolvida por RMN com micelas de SDS, enquanto
que a interface água-hexano foi para observarmos se a interação era direcionado pela
hidrofobicidade do meio. Como pode ser observado, a estrutura do peptídeo foi fielmente
mantida após interação com o modelo de micelas (Artigo 3). Entretanto, pouca convergência
estrutural foi observada na presença de hexano. Por estes motivos, acreditamos que a estrutura
obtida por RMN seja um reflexo de múltiplas interações químicas estabelecidas entre o
peptídeo e a micelas, e não meramente uma questão de hidrofobicidade. Contudo, a
hidrofobicidade parece ser uma condição favorável para o direcionamento da interação. Além
disto, foi possível observar a interação entre o Trp8 e a Phe12, que poderiam esta
estabilizando a região de hélice. Esta suposição pode ser confirmada com o mutante W8A, o
qual foi incapaz de estabilizar uma região de hélice (Artigo 4).
Discussion
151
Em 2002, foi mostrada a grande importância da estrutura em V invertido para o evento
de fusão do vírus da influenza. Foi visto que a redução da dobra e a redução do conteúdo de
hélice na região carboxi-terminal culminavam com a abolição da fusão. Além disso, foi
sugerido que em pH neutro a porção amino-terminal do peptídeo estaria dentro da membrana
alvo e a porção carboxi- terminal voltada para o lado externo. Quando o pH fosse reduzido, os
resíduos carregados do peptídeo seriam neutralizados, e a hélice da região carboxi-terminal
aumentada. Sob estas condições, a região de quebra do peptídeo serviria como dobradiça,
permitindo que a região carboxi-terminal fosse inserida na membrana alvo (Hsu e cols.,
2002). Para o peptídeo de fusão do vírus Ebola existe uma quebra ocasionada pela Pro10, a
qual pode ser importante durante o processo de fusão. Análise mutacional da seqüência
correspondente ao peptídeo de fusão mostrou que a Pro10 quando substituída por uma
alanina, induz baixa incorporação da proteína GP na partícula viral e ainda promove perda de
infecciosidade viral, mostrando que a presença da prolina 10 é importante para ativida viral
(Ito e cols., 1999).
Ao longo dos anos tem sido mostrado que a região do peptídeo de fusão de várias
proteínas de fusão, incluindo a do SFV, a do vírus TBE , a do vírus West Nile, o do vírus de
sarcoma de ave e do vírus Ebola, esta na configuração de uma volta (Gallaher, 1996; Gibbons
& Kielian, 2002). Esta conformação de volta tem sido apontada como sendo de extrema
importância para a inserção da proteína de fusão na bicamada lipídica. Os nossos dados
mostrados aqui, sugerem a convergência estrutural entre o peptídeo do vírus Ebola e a volta
(Artigo 3) em que este peptídeo está presente na proteína GP2, indicando que a estrutura aqui
determinada poderia ser equivalente a estrutura na proteína. Além disso, nós sugerimos que a
importância desta volta poderia esta intimamente ligada a conformação de V invertido
mostrada para o vírus da influenza. Desta forma acreditamos que a estrutura do peptídeo do
Ebola seja curvada devido a sua forte tendência a forma uma volta. A boa correlação
observada entre o experimento in vitro (utilizando o peptídeo e modelos de membranas) e in
vivo (utilizando a partícula viral) confirmam a complementaridade e a potencialidade dos dois
métodos para estudar o mecanismo pelo qual a região do peptídeo de fusão induz fusão com a
bicamada lipídica.
Discussion
152
Figura 15. Modelo da região carboxi-terminal do domínio transmembrana da proteína
GP do vírus Ebola. Na caixa em destaque é mostrada a região em loop onde esta presente o
peptídeo de fusão (Adaptado de Gallaher, 1996).
NH2 terminal
Local de
glicosilação
Hélice
carregada
Local de
glicosilação
Hélice
anfipática
Peptídeo
de fusão
Loop dissulfeto
Referências
153
REFERÊNCIAS
Referências
154
Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., e Watson J. D. (1994). Molecular
Biology of the Cell. Garland Publishing Inc., New York, NY, pp 279.
Ahola T., and L. Kääriäinen. 1995. Reaction in alphavirus mRNA capping: formation of a
covalent complex of nonstructural protein nsP1 with 7-methyl-GMP. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 92:507-511
Ahola T., P. Laakkonen, H. Vihinen, and L. Kääriäinen. 1997. Critical residues of Semliki
Forest virus RNA capping enzyme involved in methyltransferase and
guanylyltransferase-like activities. J. Virol. 71:392-397.
Anderson R. G. (1998). The caveolae membrane system. Annu. Ver. Biochem., 67, 199-
225.
Anderson C. R., Downs W. G., Wattley G. H., Ahin N. W., Reese A. A. (1957).Mayaro
virus: a new human disease agent. II. Isolation from blood of patients in Trinidad, B.W.I.
Am J Trop Med Hyg, 6, 1012.
Barth B. U., Suomalainen M., Liljeström P., Garoff H. (1992). Alphavirus assembly and
entry: role cytoplasmatic tail of the E1 spike subunit. J. Virol., 66, 7560- 7564.
Bavari S., Bosio C. M., Wiegand E., Ruthel G., Will A. B., Geisbert T. W., Hevey M.,
Schmaljohn C., Schmaljohn A., and Aman J. (2002). Lipid Raft Microdomains: A
gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J. Exper.
Medicine, 195, 593- 602.
Beijerinck M. W. (1898). Concerning a Contagium Vivium Fluidum as a cause of the spot-
disease of Tabacco Leaves. Verh. Akad. Wetensch, Amsterdam, II 6, 3- 21.
Bentz J. (2000a). Minimal aggregate size and minimal fusion units for the first fusion pore of
influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. Biophys. J., 78, 227- 245.
Referências
155
Bentz J. (2000b). Membrane fusion mediated by coiled coils: a hypothesis.Biophys J., 78,
886- 900.
Bethell R. C., Gray N. M., Penn C. R. (1995). The kinetics of the acid-induced
conformational change of influenza virus haemagglutinin can be followed using 1,1'-
bis(4-anilino-5-naphthalenesulphonic acid). Biochem. Biophys. Res. Commun., 206, 355-
361.
Bonatti S., Migliaccio G., e Simons K. (1989). Palmitylation of viral membrane
glycoproteins takes place after exit from the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem., 264,
12590- 12595.
Branden C. & Tooze J.(1991). The Structure of Spherical Viruses. Em: Introduction to
Protein Structure, ed by pp 161-177.
Brown D. A., & London E. (1998). Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu.
Rev. Cell. Dev. Biol., 14, 111- 136.
Brown D. T. & Condreay L. D. (1986). Replication of alphavirus in mosquito cells. Em:
Schelsinger, S. & Schelsinger M. J. (Editors), The Togaviridae and Flaviviridae. Plenum
Press, New York, 171- 207.
Brown L. R. (1979). Use of fully deuterated micelles for conformational studies of
membrane proteins by high resolution 1H nuclear magnetic resonance. Biochim.
Biophys. Acta, 557, 135- 148.
A.T.Brunger, P.D.Adams, G.M.Clore, W.L.Delano, P.Gros, R.W.Grosse-Kunstleve, J.-
S.Jiang, J.Kuszewski, M.Nilges, N.S.Pannu, R.J.Read, L.M.Rice, T.Simonson,
G.L.Warren. CNSsolve software. Yale University. (2000).
Buchmeier M. J., DeFries R. U., McCormick J. B., and Kiley M. P. (1983). Comparative
analysis of the structural polypeptides od Ebola virus from Sudan and Zaire. J. Infect.
Referências
156
Dis., 147, 276- 281.
Bullough P. A., Hughson F. M., Skehel J. J., Wiley D. C. (1994).Structure of influenza
haemagglutinin at the pH of membrane fusion. Nature, 371, 37- 43.
Burleson F. G., Chambers T. M., e Wiedbrauk D. L. (1992). Virology, a Laboratory
Manual, Academic Press.
Carneiro F. A., Ferradosa A. S., e Da Poian A. T. (2001). Low pH-induced conformational
changes in vesicular stomatitis virus glycoprotein involve dramatic structure
reorganization. J. Biol. Chem., 276, 62- 67.
Carr C. M., Chaudhry C., e Kim P. S. (1997). Influenza hemagglutinin is spring-loaded by
a metastable native conformational. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 14306- 14313.
Carr, C. M., Chaudhry C., e Kim, P. S. (1997). Influenza hemagglutinin is spring-loaded by
a metastable native conformational. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 14306- 14313.
Carr, C. M. & Kim, P. S. (1993). A spring-load mechanisms for the conformational change
of influenza hemagglutinin, Cell, 73, 823- 832.
Caspar D. L. D. & Klug A. (1962). Physical Principles in the Construction of Regular
Viruses. Cold Spring HARB. Symp. Quant. Biol., 27, 1- 24.
Causey O. R. & Moroja O. M. (1957). Mayaro virus: a new human disease agent. III.
Investigation of an epidemic of acute febrile illnes on the river Guama in Para, Brazil and
isolation of Mayaro virus as a causative agent. Amer. J. Trop. Med., 6, 1017- 1023.
Chan D. C. & Kim P. S. (1998). HIV entry and its inhibition. Cell, 93, 681-684.
Chan S. Y., Empig C. J., Welt F. J., Speck R. F., Schmaljohn A., Kreisherg and
Goldsmith M. A. (2001). Folate receptor-alpha is a cofactor for cellular entry by
Referências
157
Marburg and Ebola virus. Cell, 106, 117- 126.
Chang D. K., Cheng S. F., e Chien W. J. (1997). The amino-terminal fusion domain peptide
of human immudeficiency virus type 1 gp41 inserts into the sodium dodecyl sulfate
micelle primarily as a helix with a conserved glycine at the miceclle-water interface. J.
Virol., 71, 6593- 6602.
Chang D. K., Cheng S. F., Trivedi V. D. e Lin K.L.(1999). Proline affects oligomerization
of a coiled coil by inducing a kink in a lolng helix. J. Struct. Biol. 128: 270- 279.
Chang D. K., Cheng S. F., Trivedi V. D. (2001). Conformation and interaction with the
membrane models of the amino-terminal peptide of influenza virus hemagglutinin HA2 at
fusion pH. Arch. Biochem. Biophys., 396, 89-98
Chatterjee P. K., Vashishtha M., e Kielian M. (2000). Biochemical consequences of a
mutation that controls the cholesterol dependence of Semliki Forest virus fusion. J.
Virol., 74, 1623-1631.
Cohen F. S. & Melikyan G. B. (1998). Methodologies in the study of cell-cell fusion.
Methods, 16, 215- 226.
Cohen F & Melikyan G. B. (2001). Implication of a fusion peptiode structure. Nature Struct.
Biol., 8, 653.
Corver J., Ortiz A., Allison S. L., Schalich J., Heinz F. X., and Wilschut J. (2000).
Membrane fusion activity of tick-borne encephalitis virus and recombinant subviral
particles in a liposomal model system. Virology, 269, 37- 46.
Da Poian A. T., Oliveira A C., Gaspar L. P., Silva J. L., e Weber G. (1993). Reversible
pressure dissociation of R17 bacteriophage: the phisical individuality of virus particles. J.
Mol. Biol., 291, 999- 1008.
Referências
158
Damberg P., Jüri J., and Gräslund A. (2001). Micellar systems solvents in peptide and
protein structure determination. Methods Enzimol., 339, 271- 285.
deCurtis I & Simons K. (1988). Dissection of Semliki Forest virus glycoprotein delivery
from the trans-Golgi network to the cell surface in permeabilized BHK cells. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 85, 8052- 8056.
Delchambre M., Gheysen D., Thines D., Thiriart C., Jacobs E., Verdin E., Horth M.,
Burny A., and Bex F. (1989). The Gag precursor of simian immunodeficiency virus
assembles into virus-like particles. EMBO J., 8, 2653- 2660.
Durrer P., Galli C., Hoenke S., Corti C., Glück R., Vorherr T., and Brunner J. (1996).
H+ induced membrrane insertion of influenza virus hemagglutinin involves the HA2
amino-terminal fusion peptide but not coiled coil region. J. Biol. Chem., 271, 13417-
13421.
Elliott L. H., Kiley M. P., McCormick J. B. (1985). Descriptive analysis of Ebola virus
proteins. Virology, 147, 169- 176.
Fan D. P. & Selton B. M. (1978). The entry into cells of Sindbis virus, vesicular stomatites
virus and Sendai virus. Cell, 15, 985- 992.
Feldmann H., Klenk H. D., Sanchez A. (1993). Molecular biology and evolution of
filoviruses. Arch. Virol. Suppl., 7, 81-100.
Freed E. O. (2002). Rafting with Ebola. Science, 296, 279.
Fuller S. D. (1987). The T = 4 Envelope of Sindbis Virus is Organized by Interactions with a
Complementary T = 3 capsid. Cell, 48, 923- 934.
Fuller S. D., Berriman J. A., Butcher S. J., e Gowen B. E. (1995). Low pH Induces
Swiveling of the Glycoprotein Heterodimers in the Semliki Forest Virus Spike Complex.
Referências
159
Cell, 81, 715- 725.
Furuta R. A., Wild C. T., Weng Y., Weiss C. D. (1998). Capture of an early fusion-active
conformation of HIV-1 gp41. Nat. Struct. Biol., 5, 276- 279.
Gallaher W. R. (1996). Similar structural models of the transmembrane proteins of Ebola
and avian sarcoma viruses. Cell, 85, 477-478.
Garcia-Sastre A., Egorov A., Matassov D., Brandt S., Levy D. E., Durbin J. E., Palese P.,
Muster T. (1998). Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-
deficient systems. Virology, 252, 324- 330.
Garoff H. & Cheng H. (2001). The missing link between envelope formation and fusion in
alphaviruses. Trends Microbiol., 9, 408- 410.
Garoff H., Frischauf A. M., Simons K., Lehrach H., e Delius H. (1980). The capsid protein
of Semliki Forst virus has clusters of basic amino acids and prolines in its amino-terminal
region. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 6376- 6380.
Garoff H., Hewson R., e Opstelten D.J. (1998). Virus maturation by budding. Microb. Mol.
Biol. Rew., 62, 1171- 1190.
Gaspar L. P., Johnson J. E., Silva J. L., e Da Poian A. T. (1997). Partially folded states of
the capsid protein of Cowpea Severe Mosaic virus in the disassembly pathway. J. Mol.
Biol., 273, 456- 466.
Gaspar L. P. , Silva A. C. , Gomes A. M., Freitas M. S., Ano Bom A. P., Schwarcz W. D.,
Mestecky J., Novak M. J., Foguel D., Silva J. L. (2002). Hydrostatic pressure induces
the fusion-active state of enveloped viruses. J. Biol. Chem., 277, 8433-8439.
Gibbons D. L., Ahn A., Chatterjee P. K., e Kielian M. (2000). Formation and
Characterization of the Trimeric Form of the Fusion Protein of Semliki Forest Virus. J.
Virol., 74, 7772- 7780.
Referências
160
Gibbons D. L. & Kielian M. (2002). Molecular dissection of the Semliki Forest virus
homotrimer reveals two functionally distinct regions of the fusion protein. J. Virol., 76,
1194- 1205.
Glomb-Reinmund S. & Kielian M. (1998). The role of low pH and disulfide shuffling in the
entry and fusion of Semliki Forest virus and Sindbis virus. Virology, 248, 372-381.
Gomes A. M. O, Pinheiro A S., Bonafe C. F. S. e Silva J. L. (2000). Pressure induced
fusogenic conformational of VSV G protein. Biophys. J., 78, 955.
Gomez De Cedron, M., N. Ehsani, M. L. Mikkola, J. A. García, and L. Kääriäinen. 1999.
RNA helicase activity of Semliki Forest virus replicase protein nsP2. FEBS Lett. 448:19-
22.
Han X., Bushweller J. H., Cafiso D. S., Tamm L. K. (2001). Membrane structure and
fusion-triggering conformational change of the fusion domain from influenza
hemagglutinin. Nat. Struct. Biol., 8, 715- 720.
Harrison S. C. (1986). Alphavirus structure. Em: The Togaviridae and Flaviviridae, ed. by
Schlesinger S. & Schlesinger M. J., Plenium Publishing Corp., New York, pp 21-34
Helenius A. Kartenbeck J., Simons K., e Fries E. (1980). On the entry of Semliki forest
virus into BHK-21 cells. J. Cell Biol., 84, 404- 420.
Helenius A. (1995). Alphavirus and Flavivirus Glycoproteins: Structure and Functions. Cell,
81, 651- 653.
Henry G. D. & Sykes B. D. (1994). Methods to study membrane protein structure in
solution. Methods Enzymol., 239, 515- 535.
Hernandez L. D., Hoffmann L. R., Wolfsberg T. G., e White J. M. (1996). Virus-cell and
cell-cell fusion. Annu. Ver. Cell Dev. Biol., 12, 627- 661.
Referências
161
Hsu CH., Wu SH., Chang DK., e Chen C. (2002). Structural characterization of fusion
peptide analogs of influenza virus hemagglutinin. J. Biol. Chem., 277, 22725- 22733.
Ito H., Watanabe S., Sanchez A., Whitt M. A., e Kawaoka Y. (1999). Mutational analysis
of the putative fusion domain of ebola virus glycoprotein. J. Virol., 73, 8907- 8912.
Ivanovski D. A. (1892). Concerning the Mosaic disease of the Tabacco Plant. St. Petersburg
Acad Imp Sci Bul, 35, 67- 70.
Johnson, B. A., and Blevins, R.A. (1994), Journal of Biomolecular NMR, 4, 603-614.
Jones P. L., Korte T., e Blumenthal R. (1998). Conformational changes in cell surface HIV-
1 envelope glycoproteins are triggered by cooperation between cell surface CD4 and Co-
receptors. J. Biol. Chem., 273, 404- 409.
Justice P. A., Sun W., Li Y., Ye Z., Grigera P. R., and Wagner R. P. (1995). Membrane
vesiculation function and exocitosis of wild-type and mutant matrix proteins of vesicular
stomatitis virus. J. Virol., 69, 3156- 3160.
Kauzmann W. & Simpson R. B. (1953). The kinetics of protein denaturation: the optical
rotations of serum albumin, b- lactoalbumina e pepsin in urea. J. Am. Chem. Soc., 75, 51-
54.
Kelly S. M. & Price N. C. (1997). The application of circular dichroism to studies of protein
folding and unfolding. Biochim Biophys Acta, 1338, 161- 185
Kielian M. (1995). Membrane fusion and alphavirus life cicle. Adv. Virus Res., 45, 113- 151.
Kielian M. & Jungerwirth S. (1990). Mechanism of enveloped virus entry into cells. Mol.
Biol. Med., 7, 14-31.
Referências
162
Kiley M. P., Bowen E. T. W., Eddy G. A., Isaacson K. M., McCormick J. B., Murphy F.
A., Pattyn S. R., Peters D., Prozesky O W., Regnery R. L., Simpson D. I. H.,
Sienczka W., Sureau P., van der Groen G., Webb P. A., and Wulff H. (1982).
Filoviridae: a taxonomic home for Marburg and Ebola viruses ? Intervirology, 18, 24- 32.
Kiley M. P., Cox N. J., Elliott L. H., Sanchez A., DeFries R., Bucchmeier M. J., Richman
D. D., and McCormick J. B. (1988). Physiochemical properties of Marburg virus:
evidence for three distinct virus strains and their relationship to Ebola virus. J. Gen.
Virol., 69, 1957- 1967.
Klenk H. D., Rott R., Orlich M., Blodorn J. (1975). Activation of influenza A viruses by
trypsin treatment. Virology, 68, 426- 439.
Klimjack M. R., Jeffrey S., e Kielian M. (1994). Membrane and protein interactions of a
soluble form of the Semliki Forest virus fusion protein. J. Virol.,68, 6940-6946.
Koblet H. (1990). The "merry-go-round": alphaviruses between vertebrate and invertebrate
cells. Adv. Virus Res., 38, 343- 402.
Korte T., Ludwig K., Booy F. P., Blumenthal R., Herrmann A. (1999). Conformational
intermediates and fusion activity of influenza virus hemagglutinin. J. Virol., 73,4567-74.
Laemmli U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, 277, 680- 658.
Lakowicz J. R. (1983). Principles of fluorescence spectroscopy. Plenum Press, New York.
Leonis J. (1956). Preliminary investigation of the behavior of lysozyme in urea solutions.
Arch. Biochem. Biophys., 65, 4292- 4300.
Lescar J., Roussel A., Wien M. W., Navaza J., Fuller S. D., Wengler G., Wengler G, e
Rey F. A. (2001). The Fusion glycoprotein shell of Semliki Forest virus: an icosahedral
assembly primed for fusogenic activation at endosomal pH. Cell, 105, 137-148.
Referências
163
Loeffler, F. and Frosch P. (1898). Berichte der Kommission zur Erforschung der Maul-und
Klauenseuche bei dem Institut fur Infektionskrankheiten. Part I, 23, 371- 391.
Lowry O. H., Rosebrough N. Y., Farr A. L., e Randall R. J. (1951). Protein
meassurements with the Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem., 193, 265-275.
Lu M., Blacklow S. C., Kim P. S. (1995). A trimeric structural domain of the HIV-1
transmembrane glycoprotein. Nat. Struct. Biol., 2, 1075- 1082.
Lu Y. E., Cassesse T., e Kielian M. (1999). The cholesterol requirement for Sindbis virus
entry and exit and characterization of a spike protein region involved in cholesterol
dependence. J. Virol., 73, 4272- 4278.
Lu Y. E. & Kielian M. (2000).Semliki forest virus budding: assay, mechanisms, and
cholesterol requirement. J. Virol., 74, 7708- 7719.
Malashkevich V. N., Schneider B. J., McNally M. L., Milhollen M. A., Pang J. X.,
Kim P. S. (1999). Core structure of the envelope glycoprotein GP2 from Ebola virus
at 1.9-A resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 2662- 2667.
Malashkevich V. N., Singh M., e Kim P. S. (2001). The trimer of hairpins motif in
membrane fusion: Visna virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 8502- 8506.
Mathiot C. C., Grimaund G., Garry P., Bouquety J. C., Mada A., Daguisy A. M., e
Georges A. J. (1990). An outbreak of human Semliki Forest virus infection in central
African Republic. Am. J. Trop. Med. Hyg., 42, 386- 393.
Mellman I., Fuchs R., e Helenius A. (1986). Acidification of the endocytic and exocytic
pathways. Annu. Rev. Biochem., 55, 663- 700.
Referências
164
Meyer W. J., Gidwitz R. E., Ayers V. K., Schoepp R. J. & Johnston, R. E. (1992).
Conformational alteration of Sindbis virion glycoproteins induced by heat, reducing
agents, or low pH. J. Virol., 66, 3504- 3513.
Mezencio J. M., de Souza W., Fonseca M. E., e Rebello M. A. (1989). Replication of
Mayaro virus in Aedes albopictus cells: an electron microscopic study. Arch. Virol., 104,
299- 308.
Moesby L., Corver J., Erukulla R. K., Bittman R., Wilschut J. (1995). Sphingolipids
activate membrane fusion of Semliki Forest virus in a stereospecific manner.
Biochemistry, 34, 10319-10324
Neidigh JW e Andersen NH. (2002). Peptide conformational changes induced by
tryptophan-phosphocholine interactions in a micelle. Biopolymers 65: 354- 361.
Nieva J. L., Bron R., Corver J., e Wilschut J. (1994). Membrane fusion of Semliki Forest
virus requires sphingolipids in the target membrane. EMBO J., 13, 2797-2804.
Niklasson B. (1988). The arbovirus: epidemiology and ecology. CRC Press, Inc., Boca
Raton, Fla. pp 167- 176.
Niklasson B., Aspmark A., LeDuc J. W., Gargan T. P., Ennis W. A., Tesh R. B., and
Main J. A. J. (1984). Association of a Sindbis-like virus with Ockelbo disease in
Sweden. Am. J. Trop. Med. Hyg., 33, 1212- 1217.
Oliveira A C., Ishimaru D., Gonçalves R. B., Mason P., Carvalho D., Smith T., e
Silva J. L. (1999). Low temperature and pressure stability of picornavirus : implication
for virus uncoating. Biophys. J., 76, 1270- 1279.
Opella S. J., Gesell J., Valente A. P., e Marassi F. M. (1997). Sstructural studies of the
pore-lining segments of neurotransmitter-gated channels. Biochem. Mol. Biol., 10, 153-
174.
Referências
165
Paredes A. M., Simon M. L., e Brown D. T. (1993). The Mass of the Sindbis Virus
Nucleocapsid Suggest it has T = 4 icosahedral Symmetry. Virology, 187, 329- 332.
Pecheur E. I., Martin I., Ruysschaert J. M. Bienvenue A., Hoekstra D. (1998). Membrane
fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: a structure-function study.
Biochemistry, 37, 2361- 2371
Peisajovich S. G. & Shai Y. (2002). New insights into the mechanism of vvirus-induced
membrane fusion. Trends Biochem. Sci., 27, 183- 190.
Peränen J., K. Takkinen, N. Kalkkinen, and L. Kääriäinen. 1988. Semliki Forest virus-
specific non-structural protein nsP3 is a phosphoprotein. J. Gen. Virol. 69:2165-2178
Peters C. J., Sanchez A., Rollin P. E., Ksiazek T. G., and Murphy F. A. (1996).
Filoviridae: Marburg and Ebola virus. Fields Virology-Terceira edição. Lippincoott-
Raven Publishers, Philadelphia. 1161- 1176.
Rand R. P. (1981). Interacting phospholipid bilayers: measured forces and induced structural
changes. Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 10, 277- 314.
Rebello M. C. S., Fonseca M. E. F., Marinho M. A., e Rebello M. A. (1993). Interferon
Action on Mayaro Virus Replication. Act. Virol., 37, 223-231.
Reed L. J. & Muench H. (1938). A simple method of estimating fifty percent end points.
Amer. J. Hyg., 27, 493- 497.
Reed W, Carroll J, Agramonte A. (1901). The etiology of yellow fever, an additional note.
JAMA, 36, 431- 440.
Rey F. A., Heinz F. X., Mandl C., Kunz C., e Harrison S. C. (1995). The envelope
glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. Nature, 375, 291-298.
Referências
166
Rikkonen M., J. Peränen, and L. Kääriäinen. 1994. ATPase and GTPase activities
associated with Semliki Forest virus nonstructural protein nsP2. J. Virol. 68:5804-5810
Rosen C. G. & Weber G. (1969). Dimer formation from 1-anilino-8-naphthalene sulfonate
catalyzed by bovine serum albumin. A new fluorescence molecule with exceptional
binding properties. Biochemistry, 8, 3915- 3920.
Ruigrok R. W. H., Martin, S. R., Wharton S. A., Skehel J. J., Bayley P. M. & Wiley D.
C. (1986). Conformational changes in the hemagglutinin of influenza virus which
accompany heat induced fusion of virus of with liposomes. Virology, 155, 484- 497.
Ruiz-Arguello M. B., Goni F. M., Pereira F. B., Nieva J. L. (1998). Phosphatidylinositol-
dependent membrane fusion induced by a putative fusogenic sequence of Ebola virus. J.
Virol., 72, 1775-1781.
Sackett K. & Shai Y. (2002). The HIV-1 gp41 N-terminal heptad repeat plays an essential
role in membrane fusion. Biochemistry, 41, 4678- 4685.
Sanchez A., Kiley M. P., Holloway B. P., and Auperin D. D. (1993). Sequence analysis of
the Ebola virus genome: organization, genetic elements and comparison with the genome
of Marburg virus. Virus Res., 29, 215- 240.
Schlegel R., Tralka T. S., Willingham M. C., Pastan I. (1983). Inhibition of VSV binding
and infectivity by phosphatidylserine: is phosphatidylserine a VSV-binding site? Cell, 32,
639- 646.
Schlesinger S. & Schlesinger M. J. (1996). Togaviridae: The Viruses and Their Replication.
Em: Fields Virology, ed by. pp. 825-885.
Simons K., & Ikonen E. (1997). Functional rafts in cell membranes. Nature, 387, 569- 572.
Referências
167
Singh I. & Helenius A. (1992). Role of ribosomes in Semliki Forest virus nucleocapsid
uncoating. J. Virol., 66, 7049- 7058.
Shin J. S. & Abraham S. N. (2001a). Cooption of endocytic functions of cellular caveolae
by pathogens. Immunology, 102, 2- 7.
Shin J. S. & Abraham S. N. (2001b). Glycosylphosphatidylinositol-anchored receptor-
mediated bacterial endocytosis. FEMS Microbiol. Lett., 197, 131- 138.
Skehel J. J. & Wiley D. C. (1998). Coiled coils in both intracellular vesicle and viral
membrane fusion. Cell, 95, 871-874.
Skehel J. J. & Wiley D. C. (2000). Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the
influenza hemagglutinin. Annu. Rev. Biochem., 69, 531-569.
Skoging U., Vihinen M., Nilsson L., e Liljeström P. (1996). Aromatic interactions defined
the binding of the alphavirus spike to its nucleocapsid. Structure, 4, 519- 529.
Smart E. J., Graf G. A., McNiven M. A., Sessa W. C., Engelman J. A., Scherer P. E.,
Okamoto T., Lisanti M. P. (1999). Caveolins, liquid-ordered domains, and signal
transduction. Mol. Cell Biol., 19, 7289- 7304.
Stiasny K., Allison S. L., Schalich J., e Heinz F. X. (2002). Membrane interaction of the
tick-borne encephalitis virus fusion protein E at low pH. J. Virol., 76, 3784- 3790.
Strauss J. H. & Strauss E. G. (1994). The alphavirus: gene expression, replication, and
evolution. Microbiological Reviews, 58, 491- 562.
Strauss J. H. & Strauss E. G. (2001). Virus evolution: How does an enveloped virus make a
regular structure ?. Cell, 105, 5- 8.
Referências
168
Strauss J. H., Strauss E. G., e Kuhn R. J. (1995). Budding of Alphaviruses. Trends in
Microbiology, 3, 346-350.
Strauss E. G., Lenches E. M., e Strauss J. H. (2002). Molecular genetic evidence that the
hydrophobic anchors of glycoproteins E2 and E1 interact during assembly of
alphaviruses. J. Virol., 76, 10188- 10194.
Talarmin A., Chandler L. J., Kazanzi M., Thoisy B., Debon P., Lelarge J., Labeau B.,
Bourreau E., Vie J. C., Shope R. E. & Sarthou J. L. (1998). Mayaro virus fever in
French Guiana: Isolation, identification, and seroprevalence. Am. J. Trop. Med. Hyg., 59,
452- 456.
Takada A., Robison C., Goto H., Sanchez A., Murti K. G., Whitt M. A., e Kawaoka Y.
(1997). A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 94, 14764- 14769.
Takada A. & Kawaoka Y. (1998). Pathogenesis of Ebola virus infection: recent insights.
Trends Microbiol., 6, 258- 259.
Takada A. & Kawaoka Y. (2001). The pathogenesis of Ebola hemorrahagic fever. Trends
Microbiol., 9, 506-511.
Tanford C. (1970). Protein denaturation. C. Teorical model for the mechanism of
denaturation. Adv. Protein Chem., 24, 1- 95.
Vashishtha M., Phalen T., Marquardt M. T., Ryu J. S., Nq A. C., e Kielian M. (1998). A
single point mutation controls the cholesterol dependence of Semliki Forest virus entry
and exit. J Cell Biol, 140, 91- 99.
van Meer, G. (2001). Caveolin, cholesterol, and lipid droplets ? J. Cell Biol., 152, F29- F34.
Referências
169
Vasiljieva L., A. Merits P. Auvinen, and L. Kääriäinen. 2000. Identification of a novel
function of the alphavirus capping apparatus RNA 5' triphosphatase activity of nsP2. J.
Biol. Chem., 275, 17281-17287
Vénien-Bryan C. & Fuller S. D. (1994). The organization of the spike complex of Semliki
Forest virus. J. Mol. Biol., 236, 572- 583.
Voet D. & Voet J. G. 1999. Fundametal of Biochemistry. Second edition. John Wiley &
Sons, iinc., New York.
Vogel R. H., Provencher S. W., von Bonsdorff C. H., Adrian M., e Dubochet J. (1986).
Envelope structure of Semliki Forest virus reconstructed from cryo-electron micrographs.
Nature, 320, 533- 583.
Volchkov V. E., Feldmann H., Volchkova V. A., e Klenk H. D. (1998). Processing of the
Ebola virus glycoprotein by the proprotein convertase furin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
95, 5762- 5767.
Volkmer N. & Rebello M. A. (1981). A plaque assay method for Marituba virus in mouse
L-A9 cells. IRCS. Med. Sci. Biochem., 9, 157-158.
Wahlberg J. M., Bron R., e Wilschut J. (1992a). Membrane Fusion of Semliki Forest Virus
Involves Homotrimers of the Fusion Protein. J. Virol., 66, 7309- 7318.
Wahlberg J. M. & Garoff H. (1992b). Membrane Fusion Process of Semliki Forest Virus I:
Low pH- induced Rearrangement in Spike Protein Quaternary Structure Precedes Virus
Penetration into Cells. J. Cell Biol., 116, 339- 348.
Wang K. S., Kuhn R. J., Strauss E. G., e Strauss J. H. (1992). High-affinity laminin
receptor is a receptor for Sindbis virus in mammalian cells. J. Virol., 66, 4992-5001.
Watanabe S., Takada A., Watanabe T., Ito H., Kida H., Kawaoka Y. (2000). Functional
importance of the coiled-coil of the Ebola virus glycoprotein. J. Virol., 74, 10194-10201.
Referências
170
Weissenhorn W., Calder L. J., Wharton S. A., Skehel J. J., Wiley D. C. (1998). The
central structure feature of the membrane fusion protein subunit from the Ebola virus
glycoprotein is a long triplestrranded coiled-coil. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 6032-
6036.
Weissenhorn W, Dessen A, Calder L. J., Harrison S. C., Skehel J. J., e Wiley D. C.
(1999). Structural basis for membrane fusion by enveloped viruses. Mol. Membr. Biol.,
16, 3-9.
Wengler G & Wengler G. X. (1984). Identification of a transfer of viral core protein to
cellular ribossome during the early stages of alphavirus infection. Virology, 134, 435-
442.
White D. O. & Fenner F. J. (1994). Togaviridae. Medical Virology. Academic Press. 4
a
ed.
pp.420.
Wishart D. S. & Sykes B. D. (1994). Chemical shifts as a tool for structure determination.
Methods Enzymol., 239, 363- 392.
Wool-Lewis, R. J. & Bates, P. (1998). Characterization of Ebola virus entry by using
pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. J. Virol., 72, 3155-
3160.
Wüthrich K. (1986). NMR of Proteins and Nucleic Acids. John Wwley & Sons, New York.
Yang J., Gabrys C. M, and Weliky D. P. (2001). Solid-state nuclear magnetic resonance
evidencee for na extended b strand conformation of the membrane-bound HIV-1 fusion
peptide. Biochemistry, 40, 8126- 8137.
Ziemiecki A, Garrof H., e Simons K. (1980). Formation of the Semliki Forest virus
membrane glycoprotein complex in the infected cell. J. Gen. Virol., 50, 111- 123.
Curriculum Vitae
171
CURRICULUM VITAE
Dados pessoais
Nome Monica Santos de Freitas
Nome em citações bibliográficas FREITAS, M. S.
Endereço profissional Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Ciências
Biomédicas, Departamento de Bioquímica.
Alameda Bahuínia, 400, CCS, sala E1-027
Ilha do Fundão
21941-590 - Rio de Janeiro, RJ - Brasil - Caixa-Postal: 68041
Telefone: (21) 25626761 Fax: (21) 22708647
Endereço eletrônico msfreitasbioqmedufrj.br
Formação acadêmica/Titulação
2003 Doutorado em Química Biológica.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil. Orientador: .
Bolsista do(a): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico, CNPq, Brasil.
2002 - 2003 Mestrado em Química Biológica.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil.
Título: Estudo dos Mecanismos Envolvidos na Aquisição do Estado
Fusogênico Viral: Alfavírus (Mayaro) e Filovírus (Ebola) como modelos, Ano
de Obtenção: 2003.
Orientador: Jerson Lima da Silva.
Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior, CAPES, Brasil.
1998 – 2001 Graduação em Ciencias Biológicas Modalidade Médica. Universidade Federal
do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil.
Título: Estudo dos Mecanismos envolvidos na Inativação e na Aquisição do
estado fusogênico de Alfavírus.
Orientador: Jerson Lima da Silva.
Curriculum Vitae
172
Bolsista do(a): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico, CNPq, Brasil.
1993 – 1995 Ensino Médio (2º grau).
Colégio Bezerra de Araújo, CBA, Brasil.
Formação complementar
2005 – 2005 Investigação de Estrutura de Proteínas por RMN.
Associação Brasileira de Tecnologia de Luz Sincrotron, ABTLuS, Brasil.
2005 – 2005 Curso avançado de estrutura e função de proteínas. (Carga horária: 40h).
Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Brasil.
2004 - 2004 NMR Applied to Biological Topics.
Instituto Militar de Engenharia, IME, Brasil.
2003 - 2003 Curso de Estabilidade de Proteínas.
Associação Brasileira de Tecnologia de Luz Sincrotron, ABTLuS, Brasil.
2003 - 2003 Curso de Cristalização.
Associação Brasileira de Tecnologia de Luz Sincrotron, ABTLuS, Brasil.
2001 - 2001 Princípios de Fluorescência e sua aplicabilidade b.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil.
2000 - 2000 Curso de Biossegurança.
Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, Brasil.
1998 - 1998 Curso de Introdução à Microscopia Ótica e aplicaçõ.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil.
Idiomas
Compreende Português (Bem), Espanhol (Bem), Inglês (Bem),
Fala Português (Bem), Espanhol (Razoavelmente), Inglês (Bem)
Lê Português (Bem), Espanhol (Bem), Inglês (Bem)
Escreve Português (Bem), Espanhol (Pouco), Inglês (Bem)
Prêmios e títulos
Curriculum Vitae
173
2006 Young investigator Travel Awards, FASEB Meeting- Virus Assembly.
2005 VI Prêmio Painel, XXXIVSociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia
Molecular.
2005 Travel Fellowship Program for Young Scientists, International Union for Pure
and Applied Biophysics (IUPAB).
2003 IV Prêmio Painel, XXXII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Bioquímica e Biologia Molecular- SBBq.
2002 VI Prêmio Helio Gelli Pereira, XIII National Meeting of Virology.
Experiência didática
2000 Aula Prática de Hemaglutinação- Influenza
Curso de Pós- Graduação Lato Sensu em Ensinos de Ciências e Biologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
2002 Mini-curso prático
Curso de Ciências Biológicas Modalidade- Médica- 1º período
Universidade Federal do Rio de Janeiro
2002 Monitora no curso intitulado “Os mistérios da Células”
Curso de Extensão/ Curso de Iniciação Científica
Universidade Federal do Rio de Janeiro
2003 Mini-curso prático
Curso de Ciências Biológicas Modalidade- Médica- 1º período
Universidade Federal do Rio de Janeiro
2004 Bioquímica III
Medicina- 1º período
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Curriculum Vitae
174
2005 Bioquímica de Macromoléculas
Ciências Biológicas de Macromoléculas- 1º período
Universidade Federal do Rio de Janeiro
2006 Método de Estudo da Estrutura e Função de Proteínas
Pós-graduação
Instituto Oswaldo Cruz- Fiocruz
Produção bibliográfica
Artigos completos publicados, aceitos e submetidos em periódicos
1. FREITAS, M. S.
, OLIVEIRA G.A.P., BIANCONI M.A., SILVA, J. L. Hydrostatic
pressure as a new approach to isolate Mayaro fusion active state. A ser submetido,
2007.
2. FREITAS, M. S.
, FOLMER, C., ALMEIDA, M. S., SILVA, J. L. The interaction
between ebola fusion peptide and cellular membranes: the role of lipid rafts in
membrane fusion. A ser submetido, 2007.
3. FREITAS, M. S.; GASPAR, L. P.; LORENZONI, M.; ALMEIDA, F.; TINOCO LW;
MAIA L; DEGRÈVE L; VALENTE, A. P.; SILVA, J. L. . Structure of the Ebola
Fusion Peptide in a Membrane-mimetic Environment and the Interaction with Lipid
Rafts. The Journal of Biological Chemistry, v. -, p. submetido, 2007.
4. MAIA L; SOARES, M. R.; VALENTE, A. P.; ALMEIDA, F.; CHEBLE, A. ;
GOMES, A. M. O.; FREITAS, M. S.; SCHNEEMANN, A. ; JOHNSON, J. E. ;
SILVA, J. L. . Structure of a Membrane-Binding Domain from a non-Enveloped
Animal Virus: Insights into the Mechanism of Membrane Permeability and Cellular
Entry. The Journal of Biological Chemistry, v. 281, p. 29278-29286, 2006.
5. FREITAS, M. S. ; POIAN, A. T. ; BARTH, O. M. ; REBELLO, M. A. ; SILVA, J. L.
; GASPAR, L. P. The Fusogenic State of Mayaro Virus Induced by Low pH and by
Curriculum Vitae
175
Hydrostatic Pressure. Cell Biochemistry and Biophysics, EUA, v. 44, p. 325-335,
2006.
6. GASPAR, L. P. ; BORGES, A. C. ; GOMES, A. M. O. ; FREITAS, M. S. ; BOM, A.
P. D. A. ; MESTEKI, J. ; FOGUEL, D. ; SILVA, J. L. . Hidrostatic Pressure induces
the fusion-active state of enveloped viruses. Journal of Biological Chemistry, Estados
Unidos, v. 277, n. 10, p. 8433-8439, 2002.
Trabalhos completos publicados em anais de congressos
1. FREITAS, M. S. ; GASPAR, L. P. ; SILVA, J. L. . Enveloped viruses in the fusogenic
state after and during high pressure treatment. In: SBBq, 2001, Minas Gerais, 2001.
2. GASPAR, L. P. ; FREITAS, M. S. ; SILVA, J. L. . Fluorescence probe kinetics to study
pressure-induced membrane fusion of enveloped viruses. In: Biophysical Society, 2001.
Biophysical Journal, 2001. v. 80. p. 420-421.
3. FREITAS, M. S. ; GASPAR, L. P. ; SILVA, J. L. . Fusogenic State of Alphavirus
Glycoprotein in the Disassembly Pathway. In: International Workshop on Spectrocopy
for Biology, 2001, São Paulo, 2001.
4. FREITAS, M. S. ; GASPAR, L. P. ; SILVA, J. L. . Fusion of Alphavirus with erythrocyte
Ghost Induced by Hydrostatic Pressure. In: FaSEB Summer Research Conferences,
2000, Vermont, 2000.
5. FREITAS, M. S. ; GASPAR, L. P. ; SILVA, J. L. . Fusogenic State of Alphavirus
Glycoprotein in the Disassembly Pathway. In: National Meeting of Virology and
Mercosul Meeting of Virology, 2000, Minas Gerais. Virus Reviews & Research-Journal
of the Brazilian Society for Virology, 2000.
6. FREITAS, M. S. ; GASPAR, L. P. ; SILVA, J. L. . Fusogenic State of Sindbis Virus
Induced by Hydrostatic Pressure. In: SBBq, 2000, Minas Gerais, 2000.
7. GASPAR, L. P. ; FREITAS, M. S. ; GALLER, R. ; SILVA, J. L. . Effects of High
Hydrostatic Pressure on Sindbis Virus. In: Encontro Nacional de Virologia e Encontro de
Virologia do Mercosul, 1999, Curitiba. Virus Reviews & Research- Journal of Brazilian
Society for Virology, 1999.
Curriculum Vitae
176
Resumos publicados em anais de congressos
1. FREITAS, M. S. . Importance of the Lipid Composition of Target Membrane for
Flavivirus Fusion Mechanisms. In: XXXV Reunião Anual- SBBq, 2006, Águas de
Lindóia. Sociedade Brasileira de Bioquímica, 2006.
2. FREITAS, M. S. . Is There Any Correlation Between Thermodynamic Stability And
Amyloidogenicity? Studies With WT And Variants Of The Immunoglobulin Light
Chain.. In: XXXV Reunião Anual- SBBq, 2006, Águas de Lindóia. Sociedade
Brasileira de Bioquímica, 2006.
3. FREITAS, M. S. . The structural characterization of interaction between Ebola fusion
peptide and lipid membranes. In: XXXV Reunião Anual- SBBq, 2006, Águas de
Lindóia. Sociedade Brasileira de Bioquímica, 2006.
4. FREITAS, M. S. . Structural and thermodynamic characterization of viral membrane
fusion. In: XXXV Reunião Anual, 2006, Águas de Lindóia. Sociedade Brasileira de
Bioquímica, 2006.
5. FREITAS, M. S. . Expression, purification and re-folding of Dengue membrane
protein. In: XXXV Reunião Anual-SBBq, 2006, Águas de Lindóia. Sociedade
Brasileira de Bioquímica, 2006.
6. FREITAS, M. S. . The structural characterization of interaction between Ebola fusion
peptide and lipid membranes. In: Virus Assembly, 2006, Vermont. FASEB Summer
Research Conferences, 2006.
7. FREITAS, M. S. ; GASPAR, L. P. ; POIAN, A. T. ; SILVA, J. L. . Structural
Characterization of Mayaro Virus by Spectroscopic Approachs. In: XXXIII Reunião
Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2004, Caxambú.
XXXIII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular,
2004.
8. FREITAS, M. S. ; GASPAR, L. P. ; Maia L ; Valente, A. P. ; Almeida, F. ; SILVA, J.
L. . Structural and Functional Analysis of Ebola Virus Fusion Peptide. In: 1st Latin
American Protein Society Meeting, 2004, Angra dos Reis. 1st Latin American Protein
Society Meeting, 2004.
9. FREITAS, M. S. ; Maia L ; Almeida, F. ; Valente, A. P. ; SILVA, J. L. . Correlation
Between NMR Solution Structure and Membrane Activity of y1-peptide from the
insect flock house virus. In: 1st Latin American Protein Society Meeting, 2004, Angra
dos Reis. 1st Latin American Protein Society Meeting, 2004.
Curriculum Vitae
177
10. FREITAS, M. S. ; GASPAR, L. P. ; Maia L ; Valente, A. P. ; Almeida, F. ; SILVA, J.
L. . Structural Analysis of Ebola Virus Fusion Peptide in SDS Micelles. In: XIV
National Meeting of Virology, 2003, Florianópolis. XIV National Meeting of
Virology, 2003.
11. FREITAS, M. S. ; GASPAR, L. P. ; Maia L ; Almeida, F. ; BOM, A. P. D. A. ;
SILVA, J. L. . Structural Analysis of Ebola Virus Fusion Peptide in SDS Micelles. In:
V Ibero-American Congress of Biophysics, 2003, Rio de Janeiro. V Ibero-American
Congress of Biophysics, 2003.
12. FREITAS, M. S. ; GASPAR, L. P. ; SILVA, J. L. . Characterization Of Mayaro Virus
Fusogenic State Using Biological And Physical Approaches. In: Sociedade Brasileira
de Bioquímica e Biologia Molecular, 2002, Minas Gerais. Sociedade Brasileira de
Bioquímica, 2002.
13. FREITAS, M. S. ; SILVA, J. L. ; GASPAR, L. P. . Structural Studies and Biochemical
Characterization of Mayaro Virus Fusion Active State Induced by Low pH. In: XXX
National Meeting of Virology, 2002, Águas de Lindóia. XXX National Meeting of
Virology, 2002.
14. FREITAS, M. S. ; GASPAR, L. P. ; Maia L ; Almeida, F. ; Valente, A. P. ; SILVA, J.
L. . Structural Analysis of Ebola virus fusion peptide by circular dichroism
spectroscopy and by nuclear magnetic resonance. In: XXX National Meeting of
Virology, 2002, Águas de Lindóia. XXX National Meeting of Virology, 2002.
15. FREITAS, M. S. ; Castro, L. ; Telles, J. ; Fontes, C. F. . 2002 Transdução de Sinal
relacionada a inibição da Na+, K+-. In: XVII Reunião Anual da Federação de
Sociedades de Biologia Experimental- (FeSBE), 2002, Salvador. XVII Reunião Anual
da Federação de Sociedades de Biologia Experimental- (FeSBE), 2002.
Produção técnica
Demais tipos de produção técnica
1. FREITAS, M. S. ; GASPAR, L. P. ; Maia L ; LORENZONI, M. ; Almeida, F. ;
Valente, A. P. ; SILVA, J. L. . The structureal characterization of interaction between
Ebola Fusion Peptide and lipid membranes. 2006. (Apresentação de
Trabalho/Congresso).
Curriculum Vitae
178
2. FREITAS, M. S. ; GASPAR, L. P. ; Maia L ; Almeida, F. ; Valente, A. P. ; SILVA, J.
L. . Dynamics and structure of viral fusion domains revealed by NMR and high
hydrostatic pressure. 2004. (Apresentação de Trabalho/Congresso).
Bancas Participação em bancas examinadoras
Participação em bancas examinadoras
Trabalhos de Conclusão de Curso de graduação
1. FREITAS, M. S.. Participação em banca de Cristiane Latgé. Estudo da alta pressão e
de agentes desnaturantes no vírus da influenza. 2005. Trabalho de Conclusão de Curso
(Graduação em Ciências Biológicas- Modalidade Médica) - Universidade Federal do
Estado do Rio de Janeiro.
Eventos Participação em eventos
1. Dynamics and structure of viral fusion domains revealed by NMR and high
hydrostatic pressure.XXXV Reunião Anual- SBBq. 2006. (Palestrante).
2. 1st. Latin American Protein Society Meeting.Dynamics and Structure of Viral Fusion
Domains Revealed by NMR and High Pressure Spectroscopy. 2004. (Palestrante
convidada).
3. V Semana de Biomedicina.Análise Estrutural do Mecanismo de Fusão de Membranas
em Vírus Envelopados. 2003. (Palestrante convidada).
Orientações em Andamento
Orientações em andamento
Iniciação científica
1. Guilherme Augusto Piedade de Oliveira. Caracterização do estado ativo de fusão do
vírus Mayaro. Início: 2005. Iniciação científica (Graduando em Ciencias Biológicas
Modalidade Médica) - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico. (Co-orientador).
Curriculum Vitae
179
2. Susanna Brandi. Clonagem e expressão da proteína M do vírus Dengue 2. Início:
2005. Iniciação científica (Graduando em Ciencias Biológicas Modalidade Médica) -
Universidade Federal do Rio de Janeiro. (Co-orientador).
ANEXO I
180
ANEXO I
ANEXO I
181
ANEXO I
182
ANEXO I
183
ANEXO I
184
ANEXO I
185
ANEXO I
186
ANEXO I
187
ANEXO II
188
ANEXO II
ANEXO II
189
ANEXO II
190
ANEXO II
191
ANEXO II
192
ANEXO II
193
ANEXO II
194
ANEXO II
195
ANEXO II
196
ANEXO II
197
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
