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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz
Caracterização e comportamento fermentativo de linhagens de
Dekkera contaminantes da fermentação alcoólica
Maria Cristina Meneghin
Dissertação apresentada para obtenção do título
de Mestre em Ciências. Área de concentração:
Ciência e Tecnologia de Alimentos
Piracicaba
2007
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Maria Cristina Meneghin
Biomédica
Caracterização e comportamento fermentativo de linhagens de Dekkera
contaminantes da fermentação alcoólica
Orientadora:
Profª. Dra. SANDRA REGINA CECCATO-ANTONINI
Dissertação apresentada para obtenção do título
de Mestre em Ciências. Área de Concentração:
Ciência e Tecnologia de Alimentos
Piracicaba
2007
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Meneghin, Maria Cristina
Caracterização e comportamento fermentativo de linhagens de Dekkera contaminantes
da fermentação alcoólica / Maria Cristina Meneghin. - - Piracicaba, 2008.
85 p. : il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2008.
Bibliografia.
1. Álcool 2. Fermentação alcoólica 3. Leveduras 4. Vinho I. Título
CDD 660.62
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
Aos meus pais
José Carlos e Maria Beatriz,
que venceram na vida e são os meus guias,
pelo apoio, compreensão, paciência
e incentivo ao aprendizado,
DEDICO E OFEREÇO
4
AGRADECIMENTOS
Demonstro aqui meus sinceros agradecimentos às pessoas que, sem o apoio,
compreensão, orientação e ajuda prestados, não seria possível a realização deste
trabalho.
Primeiramente, agradeço a Deus por ter me concedido saúde, inteligência, força e
esperança em todos os momentos;
À Profª Drª Sandra Regina Ceccato Antonini (UFSCar), pela orientação, compreensão,
confiança e amizade;
Ao Prof. Dr. Jorge Horii (ESALQ/USP), pela colaboração e carinho;
Á minha família, em especial meu pai, José Carlos Meneghin, pelas sábias e valiosas
sugestões, e minha mãe Maria Beatriz Marretto Meneghin, pelo companheirismo e
paciência;
Á minha tia, amiga e colega de trabalho, Profª Silvana Perissatto Meneghin (UFSCar),
pelo incentivo e oportunidade;
Às minhas amigas Sílvia Nalli, Fernanda Maróstica, Caroline Gueraldini e Lariana
Carrocini, que sempre estiveram ao meu lado em todos os momentos, em especial à
Marina Torrezan, que além de amiga, é irmã, confidente, companheira de estudos e de
profissão;
Ao querido Danilo Cassimiro de Oliveira, pelo companheirismo, amor, paciência e apoio
ímpar;
Aos colegas do LAMAM (UFSCar), pela colaboração, convivência, sugestões e
amizade;
À técnica do LAMAM (UFSCar), Lúcia T. Picollo Silva, pela colaboração, carinho e
amizade;
Ao Centro de Ciências Agrárias – CCA/UFSCar, pela oportunidade de execução da
parte experimental deste trabalho;
Aos professores, funcionários e colegas da Pós-Graduação do Departamento de
Agroindústria, Alimentos e Nutrição da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”,
5
em especial a Gislaine, Regina, e Bia, pelo convívio harmonioso e afetuoso que me
proporcionaram.
À FAPESP, pela concessão da bolsa de estudos (05/53401-6) e apoio à pesquisa
(05/04011-0).
6
"É melhor atirar-se à luta em busca de dias melhores mesmo
correndo o risco de perder tudo, do que permanecer estático, como
os pobres de espírito que não lutam, mas também não vencem, que
não conhecem a dor da derrota nem a glória de ressurgir dos
escombros. Esses pobres de espírito, ao final de sua jornada na
Terra não agradecem a Deus por terem vivido, mas desculpam-se
perante Ele, por terem apenas passado pela vida."
(Bob Marley)
7
SUMÁRIO
RESUMO.........................................................................................................................09
ABSTRACT.....................................................................................................................10
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................11
2 DESENVOLVIMENTO..................................................................................................13
2.1 Revisão de literatura..................................................................................................13
2.2 Material e métodos....................................................................................................20
2.2.1 Isolamento e seleção de linhagens de leveduras...................................................20
2.2.2 Caracterização bioquímica/fisiológica das leveduras.............................................21
2.2.2.1 Produção de ácido...............................................................................................21
2.2.2.2 Formação de esporos sexuais............................................................................21
2.2.2.3 Formação de pseudomicélio...............................................................................22
2.2.2.4 Crescimento em extrato de malte........................................................................22
2.2.2.5 Crescimento em ágar malte................................................................................23
2.2.2.6 Assimilação de compostos de carbono...............................................................23
2.2.2.7 Assimilação de compostos de nitrogênio............................................................24
2.2.2.8 Crescimento a 37 ºC...........................................................................................24
2.2.2.9 Crescimento a 50 % glicose-ágar extrato de levedura........................................24
2.2.2.10 Fermentação ....................................................................................................25
2.2.3 Caracterização molecular.......................................................................................25
2.2.3.1 Obtenção do DNA genômico...............................................................................25
2.2.3.2 PCR....................................................................................................................28
2.2.3.3 Purificação de produto PCR................................................................................29
2.2.3.4 Sequenciamento da região ITS do rDNA............................................................30
2.2.4 Ensaio killer............................................................................................................30
2.2.5 Ensaios fermentativos............................................................................................32
2.2.5.1 Material biológico.................................................................................................32
2.2.5.2 Meios de cultura..................................................................................................32
2.2.5.3 Propagação de células para obtenção do inóculo...............................................32
2.2.5.4 Teste fermentativo...............................................................................................33
2.2.5.4.1 Plaqueamento em meios WLN e WLD.............................................................34
8
2.2.5.4.2 Contagem e viabilidade celular........................................................................34
2.2.5.4.3 pH.....................................................................................................................34
2.2.5.4.4 ºBrix..................................................................................................................34
2.2.5.4.5 Açúcares redutores totais (ART)......................................................................35
2.2.5.4.6 Álcool................................................................................................................36
2.2.5.4.7 Cálculo de eficiência fermentativa....................................................................37
2.2.6 Meios e soluções utilizados para cultivos e ensaios..............................................37
2.3 Resultados e discussão.............................................................................................42
2.3.1Identificação e caracterização das linhagens de leveduras....................................42
2.3.2 Ensaios fermentativos............................................................................................56
3 CONCLUSÕES ...........................................................................................................73
REFERÊNCIAS...............................................................................................................75
ANEXOS..........................................................................................................................81
9
RESUMO
Caracterização e comportamento fermentativo de linhagens de Dekkera
contaminantes da fermentação alcoólica
As leveduras Dekkera/Brettanomyces estão envolvidas na deterioração de
vinhos após o término das fermentações alcoólicas e maloláticas, tendo se apresentado
como agente contaminante de processos contínuos de produção de etanol industrial.
São caracterizadas pela morfologia celular típica (células alongadas e ogivais), alta
produção de ácido e crescimento lento, porém de difícil identificação. Embora muitos
trabalhos já tenham sido publicados acerca do seu papel na fermentação do vinho,
pouco se conhece sobre o seu comportamento no processo de fermentação para
produção de álcool combustível. Desta forma, este trabalho objetivou selecionar,
identificar e caracterizar linhagens de Dekkera e Brettanomyces isoladas de processos
fermentativos, através de testes de taxonomia clássica, moleculares (PCR e
sequenciamento) e de biotipagem através do sistema killer, visando a avaliação de
fermentações mistas de Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxellensis, a última em
níveis de contaminação variando de 10
1
a 10
3
células/mL, em meio de caldo de cana,
em processo de fermentação em batelada com reciclo celular (14 ciclos de 12 horas)
para produção de etanol. Os testes morfológicos e fisiológicos/bioquímicos de oito
linhagens selecionadas pela alta produtividade de ácido a partir da glicose e morfologia
celular característica, apontaram os gêneros Dekkera ou Brettanomyces, sem
possibilidade de identificação em nível de espécie devido à ambigüidade dos resultados
dos testes fisiológicos. O sequenciamento da região ITS (Internal transcribed spacer) do
DNA ribossomal confirmou somente três linhagens como Dekkera bruxellensis, sendo
as demais predominantemente pertencentes à espécie Pichia guillermondii. O tamanho
da região ITS, incluindo o gene 5,8S, variou de 400 500 pb entre as três linhagens. A
utilização do sistema killer como método de biotipagem para leveduras Dekkera
mostrou-se inviável devido ao fenótipo predominantemente neutro apresentado pelas
linhagens. Somente a levedura killer CCA510 (Kluyveromyces marxianus) apresentou
atividade inibitória contra as três linhagens de D. bruxellensis. Os ensaios fermentativos
realizados com a linhagem de D. bruxellensis (CCA059) em fermentações puras e
mistas com S. cerevisiae (CCA193, PE-02), mostraram que a levedura contaminante foi
capaz de crescer em meio de caldo de cana, independentemente do tamanho do seu
inóculo inicial (10
1
a 10
3
células/mL), impactando negativamente a fermentação
etanólica, causando a diminuição da viabilidade de S. cerevisiae, diminuindo o pH do
meio, decréscimo na produção de etanol e eficiência fermentativa, possivelmente
devido à produção de ácido acético a partir do ART do meio de fermentação.
Extrapolando-se os resultados obtidos em escala de laboratório para a escala industrial
de uma destilaria de médio porte, a contaminação por Dekkera bruxellensis acarretaria
uma perda de 6 milhões a 15 milhões de litros de álcool na safra, que deixariam de ser
produzidos, dependendo do nível de contaminação.
Palavras-chave: Dekkera bruxellensis; levedura contaminante; fermentação alcoólica.
10
ABSTRACT
Characterization and fermentative behavior of Dekkera strains contaminating alcoholic
fermentation
Dekkera/Brettanomyces yeasts are found to be either contaminants in wine
after completion of alcoholic and malolactic fermentations and in continuous
fermentations for fuel alcohol production. They are characterized by typical cell
morphology (elongated and ogival cells), high acid production and slow growth, however
not easily identified. Although their role in wine fermentations is well-defined, a little is
known about their behavior during fermentation for ethanol production. This work aimed
the screening, identification and characterization of Dekkera and Brettanomyces strains
isolated from fermentative processes, through classical taxonomic tests, molecular
analysis (PCR and DNA sequencing) and biotyping by killer system. Following
fermentation essays were carried out to evaluate mixed fermentations of
Saccharomyces cerevisiae and Dekkera bruxellensis, the last one in contamination
levels varying from 10
1
to 10
3
cells/mL, in sugar cane medium, using batch fermentation
process with cell recycle (fourteen 12-hour cycles) for fuel ethanol production.
Morphological and physiological/biochemical tests involving eight strains selected for
their high acid production from glucose and typical cell morphology, pointed out to the
genera Dekkera or Brettanomyces, without possibility of species identification due to the
variability and ambiguity of physiological tests. DNA sequencing of the ITS (Internal
transcribed spacer) region belonging to ribosomal DNA confirmed only three strains as
Dekkera bruxellensis, the others were predominantly Pichia guilliermondii. The ITS
region, including the 5,8S gene, varied from 400 to 500 bp among the three strains. The
use of killer system as a biotyping method for Dekkera strains might not be applied
because the strains were predominantly neutral to killer toxins. Only the killer strain
CCA510 (Kluyveromyces marxianus) showed to have inhibitory activity against the
strains of D. bruxellensis. The fermentative essays using a strain of D. bruxellensis
(CCA059) in mixed and pure fermentations with S. cerevisiae (CCA193, PE-02), have
shown that the contaminant yeast was able to grown in sugar cane juice, regardless of
the initial inoculum size ((10
1
to 10
3
cells/mL), impairing the bioethanol fermentation,
causing diminished S. cerevisiae viability, pH decrease, lower ethanol production and
fermentative efficiency, mainly due to the acetic acid production from reducing sugar
present in fermentation medium. Extrapolation of the results obtained in laboratory scale
to industrial scale in a medium-sized distillery, have revealed that contamination by
Dekkera bruxellensis would result in a alcohol loss of 6 millions to 15 millions of liters,
which would not be produced, depending on the contamination level.
Key words: Dekkera bruxellensis, contaminant yeast, alcoholic fermentation
11
1 INTRODUÇÃO
As leveduras Brettanomyces/Dekkera estão envolvidas na deterioração da
cerveja e vinho, com a produção de compostos secundários (CHATONNET et al., 1992,
1995; EDLIN et al., 1995; DIAS et al., 2003). Em vinho, estas leveduras crescem
tipicamente em baixos números depois do término da fermentação alcoólica e
malolática, durante o envelhecimento em barris, tanques e garrafas. Os aromas
característicos dos metabólitos produzidos são descritos como de plástico queimado,
fumaça, suor de cavalo, couro, lã molhada e de rato (HERESZTYN, 1986;
CHATONNET et al., 1992; IBEAS et al., 1996).
O gênero Brettanomyces já era conhecido desde 1904, mas somente em 1940
teve sua morfologia e fisiologia descritas. A forte produção de ácido, crescimento lento
em extrato de malte e freqüência de células ogivais possibilitou seu enquadramento em
um grupo especifico, sendo que a forma anamórfica do gênero Dekkera é o gênero
Brettanomyces. Na reprodução sexuada, os ascos são evanescentes e possuem um a
quatro ascósporos, em formato de chapéu ou esférico com borda tangencial.
Estudos moleculares das espécies dentro deste gênero se baseiam no genoma
mitocondrial e nos genes do DNA ribossomal (HOEBEN; CLARK-WALKER, 1986;
MOLINA et al., 1993; CAI et al., 1996; EGLI; HENICK-KLLING, 2001).
A importância enológica das leveduras Dekkera/Brettanomyces repousa no
potencial que possuem as espécies representantes desse gênero em deteriorar vinhos
já elaborados. Possuem características metabólicas diferentes daquelas apresentadas
por Saccharomyces cerevisiae, contribuindo para seu comportamento não competitivo,
durante o processo de fermentação, mas bastante oportunista, permitindo que as
demais leveduras atuem no processo fermentativo. Após essa fase, entram lenta e
progressivamente em atividade, causando sérios danos ao vinho. Devido ao
metabolismo, estes microrganismos podem provocar aumento da acidez volátil e a
formação do 4-etil-fenol no vinho (SILVA et al., 2005), levando à depreciação do
produto final. A ação deteriorante dos gêneros Dekkera/Brettanomyces é de efeito
retardado (SILVA, 2003).
12
Silva (1994) documentou a ocorrência de uma severa contaminação por
levedura selvagem no processo contínuo de produção de etanol industrial,
demonstrando-se a não estabilidade do fermento inicial que foi praticamente substituído
por Dekkera bruxellensis. Vários estudos foram conduzidos em fermentação de mosto
de milho para produção de álcool, mas pouco se conhece sobre seu papel na
fermentação do caldo de cana.
Outro ponto importante se refere à caracterização e identificação destas
leveduras contaminantes. A identificação baseada em características morfológicas e
fisiológicas geralmente é demorada e os resultados incertos, sendo o advento de
técnicas moleculares um importante passo na caracterização destes microrganismos,
tornando os testes mais rápidos e precisos.
A intervenção de leveduras killer produtoras de toxinas capazes de combater
as atividades destas leveduras indesejáveis aparenta ser uma abordagem interessante,
visto que quando estabelecida, esta levedura é de difícil remoção.
Desta maneira, devido ao importante papel que as leveduras dos gêneros
Dekkera/Brettanomyces exercem nos processos fermentativos (vinho e álcool) como
contaminantes e a pouca informação que se tem sobre isso especialmente quanto à
fermentação etanólica, esse trabalho se propõe a:
- caracterizar linhagens de Dekkera/Brettanomyces isoladas de processos
fermentativos diversos utilizando-se testes fisiológicos/bioquímicos, moleculares e de
suscetibilidade às toxinas killer;
- avaliar o crescimento e o comportamento fermentativo dessas linhagens
em condições de fermentação.
Espera-se com os resultados poder contribuir para o entendimento do papel
que as leveduras Dekkera/Brettanomyces têm no processo de fermentação alcoólica,
uma vez que é freqüente a sua detecção, geralmente associada com prejuízos à
indústria.
13
2 DESENVOLVIMENTO
2.1 Revisão de literatura
As leveduras estão presentes em vários ambientes e são usadas para a
elaboração de vinhos, cervejas e etanol através de processos fermentativos. A
fermentação consiste num processo químico decorrente da atividade desses
microrganismos, agindo sobre diversos substratos orgânicos de forma a alterá-los e
originar a formação de outras substâncias em qualidade e quantidade variáveis de
acordo com a seleção das leveduras utilizadas (SILVA, 1994).
O gênero Brettanomyces já era conhecido desde 1904, segundo Smith et al.
(1990), quando Claussen conseguiu isolar esta levedura a partir de cerveja inglesa no
final da fermentação. O nome Brettanomyces é uma alusão ao termo British, devido ao
uso de espécies deste gênero na elaboração de cerveja de aroma forte (FRANSON,
2001). Só em 1940 Custer revelou os detalhes desta levedura e descreveu sua
morfologia e fisiologia. O vigor na formação de ácido acético, o crescimento lento em
ágar malte ou extrato de malte, o curto período de sobrevivência, a freqüência de
células ogivais e a ausência de ascósporos, permitiram agrupar os integrantes deste
gênero em quatro espécies e duas variedades (linhagens).
van der Walt e van Kerken (1958), ao estudar a ocorrência de Brettanomyces,
citam a presença de outros gêneros de leveduras, com exceção de Dekkera. Isto se
deve ao fato de, naquela época, se pensar que o gênero Brettanomyces não possuía a
forma perfeita, ou seja, não formava ascósporos. No entanto, van der Walt e van
Kerken (1960), apud van der Walt (1964), mostraram a formação destas estruturas
(ascósporos) em algumas leveduras classificadas como Brettanomyces. van der Walt
(1964), com esta descoberta, transferiu as linhagens ascosporógenas para o gênero
teleomórfico Dekkera, criando assim outro gênero.
Em 1964, van der Walt propôs o nome Dekkera para o novo gênero e reportou
duas espécies, D. bruxellensis e D. intermedia. Barnett et al (1990) reconheceu quatro
espécies de Dekkera, D. anomala, D. bruxellensis, D. custersiana e D. naardensis e
agrupou a forma não-esporulada de Brettanomyces em quatro espécies sinônimas.
14
Brettanomyces, a forma anamórfica do gênero Dekkera, inclui cinco espécies.
B. nanus foi adicionado às quatro espécies reconhecidas (B. bruxellensis, B. anomalus,
B. custersianus e B. naardenensis), com base na homologia de seqüência do DNA
ribossomal (HOEBEN; CLARK-WALKER, 1986; BOEKHOUT et al, 1994).
As leveduras Brettanomyces/Dekkera não são freqüentemente incluídas entre
os gêneros encontrados na superfície de uvas, mas são facilmente encontradas em
vinícolas e destilarias e seu potencial deteriorante pode ser identificado próximo a todas
as áreas de produção vinícola do mundo (FUGESLSANG, 1997). A alteração de vinhos
ocorre tipicamente por leveduras Brettanomyces/Dekkera durante o envelhecimento do
mesmo em barris ou tanques (CHATONNET et al., 1995).
As leveduras Brettanomyces/Dekkera estão envolvidas na deterioração da
cerveja e vinho, com a produção de compostos secundários (CHATONNET et al., 1992,
1995; DIAS et al., 2003; EDLIN et al., 1995). Estas leveduras produzem grandes
concentrações de ácidos voláteis, compostos fenólicos, sendo o 4-etil-fenol, um éster
que contribui na composição de sabor e aroma dos vinhos, o mais proeminente. Em
baixas concentrações, estes compostos podem acrescentar complexidade ao vinho,
porém, acima de 620 µg/L este metabólito é considerado prejudicial, e estas leveduras
passam a desempenhar o papel de deteriorantes (CHATONNET, et al. 1995).
Os aromas característicos dos metabólitos produzidos são descritos como de
plástico queimado, fumaça, suor de cavalo, couro, lã molhada e de rato (CHATONNET
et al., 1992; HERESZTYN, 1986; IBEAS et al., 1996).
O gênero Dekkera apresenta, ao microscópio, células esferoidais a elipsoidais,
muitas vezes ogivais, podendo ser também cilindrícas ou alongadas. A reprodução
vegetativa se dá por brotamento e exibe pseudomicélio. Na reprodução sexuada, os
ascos são evanescentes e possuem um a quatro ascósporos, em formato de chapéu ou
esférico com borda tangencial. Como características gerais podem ainda ser citadas:
curta duração de vida em placas, aroma característico, forte produção de ácido acético
a partir da glicose e exigência de fonte externa de vitaminas (BARNETT et al., 1990;
KREGER VAN-RIJ, 1984).
Por serem oportunistas e apresentarem um caráter não competitivo, estes
gêneros permitem que as demais leveduras atuem no processo fermentativo. Após esta
15
fase, entram lenta e progressivamente em atividade, causando sérios danos ao vinho.
Devido ao seu metabolismo, estes microrganismos podem provocar aumento da acidez
volátil e a formação do 4-etil-fenol no vinho (SILVA et al., 2005), levando à depreciação
do produto final. A ação deteriorante dos gêneros Dekkera/Brettanomyces é de efeito
retardado (SILVA, 2003).
Os problemas que mais acometem os vinhos quando contaminados por essas
leveduras são de fácil detecção, como a turvação e formação de névoa, a formação de
filme e ainda, atenuação, visto que as leveduras selvagens podem crescer à custa de
fontes de carbono que normalmente S. cerevisiae não utiliza, aumentando o teor
etanólico e formando aromas indesejáveis (SILVA, 2003).
Embora os relatos sobre os efeitos da contaminação por leveduras
Dekkera/Brettanomyces sejam predominantemente em vinhos, elas têm sido isoladas
de outras fermentações. Silva (1994) documentou a ocorrência de uma severa
contaminação por levedura selvagem no processo contínuo de produção de etanol
industrial, demonstrando a não estabilidade do fermento inicial, o qual foi praticamente
substituído por Dekkera bruxellensis. O poder competitivo dessa espécie em condições
fermentativas foi de tal ordem que permitiu sua evolução populacional de
aproximadamente 62% para 96% do número total de leveduras em 8 dias de operação.
Dentre as inúmeras espécies de leveduras existentes, aquelas da espécie S.
cerevisiae são as mais usadas mundialmente quando se trata de processos
fermentativos industriais. Sendo assim, suas aplicações nos processos de fermentação
encontram-se bem estabelecidos. Porém outras espécies de leveduras têm sido
identificadas na maioria destes processos fermentativos, ora agindo favoravelmente ao
produto final, ora atuando como contaminante (LOUREIRO; MALFEITO-FERREIRA,
2003).
Na produção do etanol combustível, a definição para a contaminação
microbiana vem paralelamente ao rendimento e produtividade. O caldo da cana de
açúcar é um substrato complexo, o qual permite o crescimento de diferentes leveduras
e bactérias lácticas (SOUZA-LIBERAL et al., 2007).
No Brasil, o processo de fermentação para a produção de etanol combustível é
uma atividade não estéril que usa caldo de cana como substrato com reciclo da
16
população da levedura fermentativa após centrifugação, durante todo o período da safra
(WHEALS et al., 1999).
Durante a fermentação o fermento pode sofrer contaminação por outros
microrganismos. Quando se trata de bactérias, a contaminação pode ser facilmente
controlada utilizando-se agentes antibacterianos, como antibióticos. Já no caso das
leveduras este controle fica mais difícil. As leveduras derivadas do gênero
Dekkera/Brettanomyces são capazes de prejudicar o processo devido à produção
significante de ácido acético, que freqüentemente é considerado um inibidor de
leveduras S. cerevisiae, levando a um decréscimo de viabilidade e atividade (DELIA et
al., 2006). Além disso, a contaminação com estas leveduras implica numa mudança
acentuada da população de levedura do mosto, causando prejuízo econômico, que
pode vir a ser revertido, caso a contaminação seja detectada precocemente (SOUZA-
LIBERAL, et al., 2005).
Leveduras Dekkera/Brettanomyces têm sido relatadas como responsáveis por
vários episódios de contaminação em processos fermentativos em destilarias de países
da América do Norte como Estados Unidos e Canadá (ABBOTT et al., 2005; GUERRA,
1998 apud OLIVA-NETO, 2004), além de destilarias da Europa (CIANI et al., 2003;
MINIAC, 1989) e ainda em diversas destilarias estudadas por Basílio et al. (2005) na
América do Sul, porém em poucos casos foi utilizado caldo de cana como substrato
para fermentação.
Análises fisiológicas de isolados desta espécie mostraram que as leveduras do
gênero Brettanomyces apresentam uma reduzida capacidade fermentativa em relação à
levedura do processo S. cerevisiae. Estas características fazem com que destilarias
contaminadas com estas leveduras apresentem tanto queda no rendimento de etanol
quanto aumento no tempo de fermentação (ARAÚJO et al., 2005).
A levedura Dekkera bruxellensis tem sido detectada como a principal levedura
contaminante em diversos processos fermentativos, dentre eles o de produção de
etanol combustível, apresentando uma surpreendente capacidade de crescimento e
adaptação naqueles substratos. Apesar da grande importância desta levedura Dekkera
bruxellensis como contaminante de vários processos fermentativos, pouco se sabe
sobre suas características genéticas, e poucos trabalhos relatam a diversidade genética
17
desta levedura. Souza-Liberal et al. (2007) verificaram que a dinâmica de crescimento
da população de Dekkera/Brettanomyces pode aumentar mais rapidamente que a de S.
cerevisiae em sistemas contínuos industriais, pelo fato de possuir esta capacidade de
se adaptar ao substrato. Normalmente não é o que ocorre com as leveduras
Dekkera/Brettanomyces, visto que possuem taxa de crescimento mais lenta que a de S.
cerevisiae quando ensaiada em meio rico e suplementado (ABBOTT et al., 2005; CIANI
et al., 2003).
A exploração das leveduras killer como produtoras de micocinas capazes de
combater a atividade dessas leveduras indesejáveis parece ser uma abordagem
interessante. Comitini et al. (2004) descreveram duas toxinas de leveduras killer ativas
contra Dekkera/Brettanomyces, isoladas de Pichia anomala e Kluyveromyces
wickerhamii. O efeito fungicida exercido por essas leveduras foi estável por pelo menos
10 dias em vinho. No entanto, Tosta (2004), testando 4 linhagens de Dekkera sp.
isoladas de processo fermentativo para produção de etanol, mostrou que nenhuma das
29 leveduras killer testadas teve atividade contra as linhagens de Dekkera..
Tradicionalmente, a identificação e caracterização de espécies de leveduras
são baseadas em sua morfologia e em especial, em suas habilidades fisiológicas
(BARNETT et al., 1990; KREGER VAN-RIJ, 1984). Estas características são fortemente
influenciadas pelas condições da cultura e muitas vezes os resultados são ambíguos e
demorados, podendo chegar a três ou quatro semanas (EGLI et al., 1999; GUILLAMÓN
et al., 1997).
Em contraste, o desenvolvimento de técnicas moleculares de identificação de
leveduras tem reduzido substancialmente o tempo de identificação com a análise direta
do DNA; desta forma a identificação não varia com o estado fisiológico do organismo
(EGLI et al., 1999).
Além disso, estas técnicas de biologia molecular proporcionam métodos
alternativos e complementares, que estão cada vez mais se consolidando como uma
importante ferramenta para resolver problemas industriais (GUILLAMÓN et al., 1998).
Uma das técnicas mais utilizadas em biologia molecular é a PCR (Polymerase
Chain Reaction), a qual foi desenvolvida nos anos 80 por Kary Mullis possibilitando um
verdadeiro salto científico na área da biologia molecular, dada a sua rapidez,
18
versatilidade e sensibilidade. Atualmente esta técnica possui diversas derivações, como
é o caso do Polimorfismo do DNA Amplificado ao Acaso ou RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA).
A PCR consiste basicamente em amplificar milhões de cópias de um
determinado trecho do DNA, utilizando oligonucleotídeos iniciadores (primers)
(FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998).
A amplificação por PCR de seqüências específicas para identificação de
organismos tem se tornado comum devido à relativa manipulação fácil e à alta
reprodutibilidade (GUILLAMÓN et al., 1998).
Entre essas técnicas moleculares, aquelas baseadas na análise de
polimorfismo do DNA que codifica os genes ribossomais (5S; 5,8S; 18S e 26S) e as
regiões não codificadoras IGS (Internal intergenic spacer) e ITS (Internal transcribed
spacers) (Figura 1), são úteis para a detecção de muitas espécies de leveduras e outros
fungos (BALEIRAS-COUTO et al., 1996; FERNANDEZ-ESPINAR et al., 2000).
O interesse nessas técnicas vem do fato de que esses genes evoluíram
mostrando um baixo polimorfismo intraespecífico e alta variabilidade interespecífica,
possibilitando assim o agrupamento em gêneros e espécie.
A região ITS pode incluir o gene 5,8S do DNA ribossomal (Figura 2).
Geralmente os fragmentos amplificados pelos primers ITS-1 e ITS-4 têm tamanho entre
450 e 550 bp para as leveduras do gênero Brettanomyces, enquanto a maioria das
outras leveduras de uva ou específicas para vinhos varia entre 600 e 900bp (EGLI et
al., 1999).
Souza-Liberal et al. (2005) desenvolveram um procedimento para monitorar
contaminações na fermentação alcoólica através da amplificação da região ITS1 – 5,8S
– ITS2 do DNA ribossomal, dentro de um prazo de oito horas após amostragem.
19
Figura 1 – DNA ribossomal nuclear mostrando as unidades repetidas e os sítios de restrição para as
enzimas. Legenda: SSU = subunidade menor; LSU = subunidade maior
(FONTE: http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)
Figura 2 – Primers da região ITS. Legenda: SSU = subunidade menor; LSU = subunidade maior
(FONTE: http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)
Atualmente a grande dificuldade na implantação do monitoramento
microbiológico através das técnicas moleculares está relacionada ao grande custo do
processo e à necessidade de mão-de-obra qualificada (GUIDI, 2000).
20
2.2 Material e métodos
2.2.1 Isolamento e seleção de linhagens de leveduras
Inicialmente foram avaliadas cerca de 250 linhagens de leveduras da coleção
de culturas (código CCA) do Laboratório de Microbiologia Agrícola e Molecular
(LAMAM), Centro de Ciências Agrárias, UFSCar – campus de Araras, que se
encontram armazenadas em meio YEPD a temperatura ambiente, sob óleo mineral.
As culturas foram reativadas em placas com meio YEPD, a 30 ºC, sendo a
seguir avaliadas a capacidade de produção de ácido a partir da glicose (item 2.1), e a
morfologia celular ao microscópio óptico. Alta produção de ácido e presença de células
ogivais/elípticas são características de leveduras dos gêneros Dekkera/Brettanomyces
(KREGER-VAN RIJ, 1984).
Foram também isoladas linhagens de leveduras da fermentação etanólica
(vinho) da Usina Santa Lúcia, Araras/SP, assim como do fermento para produção de
cachaça orgânica, da unidade experimental do Laboratório de Alimentos Orgânicos
(LAO), Centro de Ciências Agrárias, UFSCar – campus de Araras, crescidas em meio
WLD e que apresentaram halo amarelo, característico de produção de ácido.
Para fins comparativos, foi adquirida uma linhagem da Fundação André Toselo,
Campinas – SP, catalogada sob código CCT2621 (DSM70001) como Dekkera
bruxelensis.
Após a etapa de seleção, foram estudadas as linhagens constantes da Tabela
1.
21
Tabela 1 - Linhagens de leveduras selecionadas
Sigla * Isolamento Origem
CCA053
Vinho Destilaria São Marino
CCA059
Água de diluição Destilaria São Marino
CCA077
Fermento Destilaria Álcoazul
CCA155
Vinho Destilaria São Marino
CCT2621
desconhecida DSM 70001
IF3
Vinho Usina Santa Lúcia
IF4
Vinho Usina Santa Lúcia
IF5
Fermento CCA
IF6
Fermento CCA
* CCA – Centro de Ciências Agrárias – UFSCar; CCT – Centro de Culturas Tropicais; IF = Isolado da
Fermentação
2.2.2 Caracterização bioquímica/fisiológica das leveduras
Foram utilizados testes tradicionais para identificação de leveduras como:
produção de esporos sexuais, formação de pseudomicélio, macro e micromorfologia,
produção de ácido e fermentação/assimilação de compostos de carbono e nitrogênio,
conforme Kreger van-Rij (1984) e Barnett et al. (1990).
2.2.2.1 Produção de ácido
Para avaliar a habilidade de produzir ácido a partir de glicose, as linhagens
foram inoculadas em placas de Petri contendo meio de cultura carbonato de cálcio.
Trata-se de um meio opaco, que se torna translúcido devido à ação do ácido, nos casos
em que a levedura o produz. Uma escala de 0 (zero) a 3 (três) para a estimativa da
produção quantitativa de ácido foi usada, na qual 0 (zero) significa produção nula;
1(um), produção fraca com fina camada translúcida; 2 (dois), produção mediana com
cerca de metade do volume do meio translúcido; e 3 (três), produção forte com o
volume total do meio translúcido.
2.2.2.2 Formação de esporos sexuais
A formação de esporos sexuais foi testada em três diferentes meios de cultura,
sendo eles o Gorodkowa, YM e Acetato, conforme sugerido por Barnett et al. (1990).
22
Após as linhagens serem inoculadas, as placas foram incubadas a 25ºC
durante 3 semanas, verificando-se a presença de esporos semanalmente. Para melhor
visualização dos esporos, utilizou-se a coloração de esporos pelo método de Virtz. As
células de leveduras foram fixadas em lâminas de vidro e coradas com solução de
verde malaquita, que em seguida foram aquecidas em bico de Bünsen por 60
segundos. As lâminas foram submetidas à lavagem em água corrente e posterior
coloração com solução de safranina por 30 segundos, seguida de nova lavagem em
água corrente, conforme Prada e Castro (1995).
As linhagens foram analisadas em microscópio, com aumento entre 40 a 400
vezes e fotodocumentadas com câmera digital Sony Cyber Shot 5.1 megapixels.
2.2.2.3 Formação de pseudomicélio
Para a verificação da formação de pseudomicélio, utilizou-se a técnica de
microcultivo em lâminas com meio CMA – Corn Meal Agar (Difco). O aparato foi
montado em placas de Petri contendo um suporte em forma de “V” e algodão com água
destilada estéril para manter a umidade do sistema. As lâminas foram recobertas com o
meio Corn Meal Agar estéril e após a solidificação do meio, as linhagens foram
inoculadas em três linhas paralelas e cobertas com uma lamínula estéril, conforme
Prada e Castro (1995). As placas permaneceram na incubadora por 7 a 10 dias a 25 ºC,
sendo posteriormente avaliadas ao microscópio, com aumento de 400 vezes e
fotografadas em câmera digital Sony Cyber Shot 5.1 megapixels.
2.2.2.4 Crescimento em extrato de malte
Para verificar a morfologia das células, formação de sedimento e aroma, o
meio extrato de malte foi disposto em alíquotas de 5 mL em tubos de ensaio e
posteriormente inoculado com as leveduras. Os tubos foram mantidos durante 5 dias a
28 ºC e após as verificações da morfologia das células em microscópio óptico (400x),
formação de sedimento e aroma característico, os tubos permaneceram a temperatura
ambiente por mais 10 dias quando foram submetidos às mesmas análises novamente,
sendo que ao final da análise microscópica, foram fotodocumentadas em câmera digital
Sony Cyber Shot 5.1 megapixels.
23
2.2.2.5 Crescimento em ágar malte
Para verificar a morfologia das colônias e crescimento lento, as leveduras
foram incubadas em meio ágar malte durante 6 semanas a temperatura ambiente.
2.2.2.6 Assimilação de compostos de carbono
As leveduras foram cultivadas em meio YEPD a 28 ºC por 5-7 dias, em placas.
Foi feita uma suspensão celular em tubo de ensaio contendo 3 mL de água destilada
estéril até densidade 2 pelo cartão de Wickerham, conforme procedimento adotado por
Prada e Castro (1995).
O cartão de Wickerham é composto de três linhas pretas que servem de
referência na estimativa da concentração celular da suspensão de células (Figura 3). A
avaliação foi realizada de forma comparativa em uma escala de 0 a 3, onde 0 (zero)
significa poucas células, com linhas pretas totalmente visíveis; 1 (um) significa
densidade fraca, com linhas visíveis, porém embaçadas; 2 (dois) é igual à densidade
média, com linhas embaçadas e difusas e, finalmente, 3 (três) significa densidade forte,
onde não se podem ver as linhas pretas.
0 1 2 3
Figura 3 - Cartão de Wickerham. Escala de avaliação da concentração celular utilizada como inóculo nos
testes de assimilação de fontes de carbono e nitrogênio, onde: 0 = poucas células, 1 =
densidade fraca, 2 = densidade média e 3 = densidade forte
FONTE: TOSTA (2004)
Para os testes de assimilação das diferentes fontes de carbono, foram
preparadas soluções de etanol a 3% (v/v), d-rafinose a 10% (p/v), sacarose, d-
galactose, d-xilose, d-celobiose, d-manitol, melibiose, d-glicose, maltose, ácido
24
succínico, ácido láctico, ácido cítrico, arabinose e inositol a 5% (p/v). Estas soluções
estoque foram esterilizadas por filtração em membrana de 0,22 µm de porosidade
(KREGER VAN-RJI, 1984).
Para a montagem dos testes, foram adicionados aos tubos de ensaio, 2 mL de
água destilada estéril, 0,25 mL do meio YNB – Yeast Nitrogen Base e 0,25 mL da
solução estoque a ser testada como fonte de carbono. Os tubos foram inoculados com
50 µL da suspensão de células com densidade 2 pelo cartão de Wickerham. Os tubos
inoculados permaneceram na incubadora a 28 ºC por 21 dias, sendo considerados
positivos os tubos que apresentaram densidade 2 ou 3, conforme avaliação com cartão
de Wickerham.
2.2.2.7 Assimilação de compostos de nitrogênio
O preparo do inóculo foi realizado como descrito no item 2.2.2.6.
Para os testes de assimilação das diferentes fontes de nitrogênio, soluções de
etilamina 0,64 % (v/v), lisina 0,56 % (p/v) e nitrato de potássio 0,78 % (p/v) foram
utilizadas, após esterilização por filtração em membrana de 0,22 µm de porosidade.
Foram adicionados aos tubos de ensaio, 2 mL de água destilada estéril, 0,25
mL do meio YCB - Yeast Carbon Base e 0,25 mL da solução estoque da fonte de
nitrogênio. Estes tubos foram inoculados com 50 µL de suspensão de células com
densidade 2 através do cartão de Wickerham, conforme Prada e Castro (1995) e
posteriormente incubados a 28 ºC por 21 dias, sendo considerados positivos aqueles
que apresentaram densidade 2 ou 3 conforme avaliação com cartão de Wickerham.
2.2.2.8 Crescimento a 37 ºC
Para o teste de crescimento a 37 ºC, as linhagens foram inoculadas em meio
MYPG e levadas a incubadora nesta temperatura por 5 – 7 dias.
2.2.2.9 Crescimento a 50 % glicose-ágar extrato de levedura
As leveduras foram inoculadas em placas de Petri contendo o meio 50 % (p/p)
glicose-ágar extrato de levedura, incubando-se a 25 ºC durante 5 dias, e verificando-se
a seguir se houve ou não crescimento da levedura neste meio.
25
2.2.2.10 Fermentação
Para o teste de fermentação, 5 mL de meio basal foram transferidos para tubos
contendo tubos de Durham invertidos, sendo então autoclavados. O teste foi preparado
adicionando-se ao tubo de ensaio 2,5 mL da solução fonte de carbono 6 % (glicose e
galactose), previamente esterilizada por filtração em membrana de 0,22 µm de
porosidade e inoculando-se 0,25 mL de suspensão de células com densidade 3,
conforme o cartão de Wickerham. Os tubos foram incubados a 28 ºC por 21 dias, sendo
a leitura realizada observando-se a formação de gás contido no tubo de Durham. Os
tubos com formação de gás foram considerados positivos para a fermentação da fonte
em questão.
Para fazer a suspensão de células, utilizou-se células crescidas em YM ou ágar
extrato de malte por 48 horas, transferindo a seguir para tubos contendo 4,5 mL de
água destilada estéril.
2.2.3 Caracterização molecular
A caracterização molecular das leveduras foi feita por PCR para amplificação
da região ITS do DNA ribossomal incluindo o gene 5,8S, e pelo sequenciamento da
referida região.
2.2.3.1 Obtenção do DNA genômico
Para obtenção do DNA genômicofoi realizada uma adaptação do método
executado por Gomes (1995). As linhagens foram incubadas sob agitação por 15 horas,
a 30 ºC, em 50 mL de meio YEPD liquido, sendo o material centrifugado a 4.000 G por
5 minutos em tubos falcon de 50 mL, e o sobrenadante descartado. A massa celular
obtida foi transferida para um almofariz previamente esterilizado, onde foi adicionado
aproximadamente 30 mL de nitrogênio líquido, sendo o material macerado com o auxílio
de um pistilo, também estéril. Tanto o almofariz como o pistilo foram mantidos em gelo
para evitar a rápida evaporação do nitrogênio liquido pelo aquecimento.
No próprio almofariz foram adicionados 3 mL de tampão Tris-HCl 0,1 M pH 8.
Um volume de 1.200 µL foram transferidos para dois tubos eppendorf de 1,5 mL (600
µL em cada) e adicionado de 75 µL de solução SDS 10% mais 60 µL de β-
26
mercaptoetanol (Sigma), sendo os tubos agitados lentamente até a solução tornar-se
viscosa.
Para executar a desproteinização do material, adicionou-se o mesmo volume
(735 µL) de clorofane aos tubos, os quais foram agitados lentamente por inversão
durante 10 minutos e centrifugados a 12.000 G por mais 10 minutos.
Após a centrifugação, a parte superior da solução foi transferida para novo tubo
eppendorf com o auxílio de uma micropipeta de 100 µL, sendo a parte inferior
descartada. Este procedimento foi repetido por três vezes, sendo que na última
repetição o clorofane foi substituído pela solução CIA.
Após a desproteinização, procedeu-se a precipitação dos ácidos nucléicos
adicionando-se 5% do volume de acetato de sódio 3M e o dobro do volume de etanol
absoluto resfriado a –20 ºC. Os tubos foram levados ao freezer também a -20 ºC onde
permaneceram por 10 minutos, sendo então submetidos à centrifugação de 12.000 G
por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado cuidadosamente evitando-se dispensar o
pellet de ácidos nucléicos formado no fundo do tubo. Os tubos foram invertidos e
deixados em temperatura ambiente para total evaporação do etanol remanescente.
O material foi então ressuspendido em 400 µL de tampão TE 1X. A este
material foram adicionados 15 µL de solução de RNAse (10 mg/mL), incubando-se a 37
ºC por 1 hora, para degradação do RNA.
Adicionou-se aos tubos o dobro do volume da solução CIA, sendo os mesmos
agitados lentamente por inversão durante 10 minutos e centrifugados a 12.000 G por
mais 10 minutos. A porção superior foi então transferida para novo tubo eppendorf com
o auxílio de uma micropipeta de 100 µL.
Para nova separação dos ácidos nucléicos, repetiu-se o procedimento citado
anteriormente, utilizando-se 5 % do volume de acetato de sódio 3 M e o dobro do
volume de etanol absoluto resfriado a –20 ºC. Os tubos foram levados ao freezer, onde
permaneceram por 10 minutos para a precipitação do DNA, sendo então submetidos à
centrifugação de 12.000 G por 5 minutos, lavados com 50 µL de etanol 70 % e
invertidos para a evaporação do etanol. O DNA foi então ressuspendido em 50 µL de
tampão TE 1X e congelado a –20 ºC.
27
Para estimativa da presença, quantidade e integridade do DNA, 2 µL de
amostra foram submetidos ao processo de eletroforese em gel de agarose 0,8 % (p/v)
em tampão TBE 1X, sendo o gel submetido a uma voltagem de 2,24 Volts/cm e
corrente de 90 mA por 3 horas (fonte EPS301 - Amersham biotech.). A estimativa de
concentração foi realizada comparativamente com a espessura e intensidade das
bandas do marcador molecular de 1 Kb (Invitrogen). O gel foi corado então com solução
de brometo de etídio 0,3 ng/µL sendo a visualização do DNA feita em transiluminador
de luz UV. As imagens foram fotodocumentadas em câmera digital Sony Cyber Shot 5.1
megapixels.
Utilizou-se também o protocolo proposto por Vancetto et al. (2006), o qual
consiste na lise celular por choque térmico.
Uma alçada da colônia de cada linhagem foi transferida para 10 mL de meio
YEPD, onde permaneceu overnight, a 30 °C a 160 rpm. O material foi centrifugado a
3000 rpm por 6 minutos, descartando-se o sobrenadante. Adicionou-se 10 mL de água
Milli-Q estéril, homogeneizou-se e transferiu-se 1,5 mL para um eppendorf. O material
foi centrifugado a 3000 rpm por 6 minutos e o sobrenadante descartado. As células
foram ressuspendidas em 200 µL de tampão de extração (TE).
Deu-se início a três ciclos de congelamento e descongelamento utilizando-se
nitrogênio líquido (-196 °C) e bloco de aquecimento a 65 °C.
Para a desproteinização do material, adicionou-se 200 µL de clorofane e
agitou-se por 8 minutos. O tampãoTE 1x foi acrescentado no volume de 200 µL, o tubo
agitado por 30 segundos e centrifugado a 13000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi
transferido para um novo eppendorf.
Novamente adicionou-se 200 µL de clorofane; agitou-se por 30 segundos e
transferiu-se o sobrenadante para um novo eppendorf. Repetiu-se mais uma vez este
procedimento, adicionando-se 500 µL de CIA, agitando-se por 30 segundos e
centrifugando-se o tubo a 13000 rpm por 5 minutos. Transferiu-se o sobrenadante para
um novo eppendorf e adicionou-se 1 mL de etanol absoluto gelado, o qual foi
centrifugado a 13000 rpm por 3 minutos.
28
O material permaneceu estocado no freezer overnight e foi centrifugado a
13000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o material ressuspendido em 400 µL de
TE 1x.
Adicionou-se 3 µL de RNAse (10 mg/mL) para que ocorresse a degradação do
RNA e incubou-se a 37 ºC por 1 hora. Posteriormente, acrescentou-se 10 µL de acetato
de sódio 3 M e 1 mL de etanol gelado para que os ácidos nucléicos fossem
precipitados. Agitou-se gentilmente e armazenou-se em freezer por 30 minutos.
Centrifugou-se a 13000 rpm por 3 minutos, descartou-se o sobrenadante e lavou-se o
pellet de ácido nucléico formado no fundo do tubo com etanol 70 %. Deixou-se secar
por 5 minutos e o material foi ressuspendido em 50 µL de TE 1x e armazenado em
freezer a -20 ºC.
A estimativa da presença, quantidade e integridade do DNA foram realizadas
conforme descrito acima.
2.2.3.2 PCR
As leveduras foram caracterizadas por PCR utilizando-se os primers ITS-1 e
ITS-4 (Tabela 2) para amplificação da região ITS do DNA ribossomal (WHITE et al.,
1994), através de PCR colônia.
Tabela 2 - Primers (Invitrogen) utilizados nas reações PCR
Nome Seqüência 5’ Æ 3’ Orientação
ITS-1
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
Forward
ITS-4
TCCTCCGCTTATTGATATGC
Reverse
pB2
AGAGTGAGGGGATAATGATTTAAGG
Forward
A reação de amplificação foi realizada em um volume de 20 µL, contendo 2 µL
de tampão 10x, 0,6 µL de cloreto de magnésio 50 mM, 1,6 µL de cada dNTP 2,5 mM, 1
µL de cada primer 100 µM, 0,2 µL de Taq DNA polimerase (5 U/µL), 8,8 µL de água
Milli-Q e aproximadamente 0,25 µL de células crescidas recentemente, retiradas com o
auxílio de um palito estéril.
29
Foi utilizado o termociclador modelo Primus 96 Plus (MWGAG Biotech)
programado para um ciclo de 94 ºC por 4 minutos, seguido de 35 ciclos de 94 ºC por 1
minuto, 55 ºC por 1 minuto e 72 ºC por 2 minutos, seguidos de 1 ciclo de extensão final
a 72 ºC por 10 minutos.
Os produtos PCR obtidos (20 µL) foram submetidos à eletroforese em gel de
agarose 1,5 % (p/v) dissolvida em tampão TBE 1X. O gel foi submetido a uma voltagem
de 2,24 Volts/cm e corrente de 120 mA, por 90 minutos (fonte EPS301 – Amersham
Biotech). O gel foi corado com solução de brometo de etídio 0,3 ng/µL sendo a
visualização do DNA feita em transiluminador de luz UV e as imagens registradas em
câmera digital Sony Cyber Shot 5.1 megapixels.
Foi também realizada PCR com os primers pB2 e ITS-4 (Tabela 2) para
amplificação de fragmento da região ITS de leveduras da espécie Dekkera bruxellensis
(EGLI; HENICK-KLING, 2001).
A reação de amplificação foi realizada em um volume de 100 µL, contendo 10
µL de tampão 10x, 3 µL de cloreto de magnésio 50 mM, 8 µL de cada dNTP 2,5 mM, 1
µL de cada primer 100 µM, 0,25 µL de Taq DNA polimerase (5U/µL), 1 µL de DNA
genômico (100 ng) ou de produto PCR purificado e 51,75 µL de água Milli-Q.
Foi utilizado o termociclador modelo Primus 96 Plus (MWGAG Biotech) para a
amplificação do DNA, com o programa de um ciclo de desnaturação a 94 ºC por 1
minuto, seguido de 30 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 1 minuto, 55 a 65 ºC por 2
minutos e 72 ºC por 1 minuto, seguidos de 1 ciclo de extensão final a 72 ºC por 5
minutos.
Os produtos PCR obtidos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose
1,5 % (p/v) dissolvida em tampão TBE 1X, conforme descrito anteriormente.
2.2.3.3 Purificação de produto PCR
Para a purificação do produto PCR, foi realizado PCR colônia em triplicata,
obtendo-se 60 µL de produto final e em seguida este volume foi utilizado no kit de
purificação “DNA and Gel Band Purification Kit” (GE Health Care).
Os produtos PCR purificados foram submetidos à eletroforese em gel de
agarose 1,2 % (p/v) dissolvida em tampão TBE 1X, conforme descrito anteriormente.
30
2.2.3.4 Sequenciamento da região ITS do rDNA
O produto PCR purificado foi enviado ao IAC – Cordeirópolis/SP para
sequenciamento da região ITS. A PCR utilizada constituiu-se de 2-3 µL do produto
PCR, 0,5 µL do primer ITS-1 ou ITS-4 (5 pmoles/ µL), 0,4 µL do kit Big Dye Terminator
(Applied Biosystems), 2 µL do tampão SM e água Milli-Q para completar 10 µL. O
programa constituiu-se de 1 ciclo de 96 ºC por 2 minutos; 25 ciclos de 45 segundos a
96 ºC, 30 segundos a 50 ºC e 4 minutos a 60 ºC. Após a reação, o produto foi estocado
sob refrigeração a 4 ºC. Para precipitação, utilizou-se 80 µL de isopropanol 65 %,
agitando-se suavemente e deixando em repouso na bancada por 15 minutos. Em
seguida, centrifugou-se a 3000 rpm por 45 minutos, o sobrenadante foi descartado e a
placa invertida por 1 minuto em papel absorvente para secagem. Foram adicionados
200 µL de etanol 60 %, centrifugando-se a 3000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante
foi descartado, procedeu-se a secagem e lavagem novamente. Em seguida, foi aplicado
um pulso de centrifugação, deixando a placa secando na bancada ou fluxo laminar por
1 hora. Ressuspendeu-se em 10 µL de Hi-Di Formamida, procedendo-se a seguir a
desnaturação da solução com DNA a 95 ºC por 5 minutos, imediatamente imersa em
gelo ate o momento do sequenciamento, realizado em seqüenciado automático
ABI3730 (Applied Biosystems).
As seqüências (forward e reverse) foram analisadas através do programa
BlastN para identificação das mesmas junto ao banco de dados do Genbank
(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi).
2.2.4 Ensaio killer
As leveduras selecionadas foram avaliadas quanto à sensibilidade às toxinas
killer produzidas por 15 linhagens do banco de culturas do LAMAM/CCA/UFSCar –
campus de Araras/SP (Tabela 3) com a finalidade de se obter o perfil killer.
31
Tabela 3 - Linhagens de leveduras com atividade killer utilizadas nos testes de sensibilidade contra as
linhagens de leveduras selecionadas
Sigla * Isolamento ou Características Obtenção ou código
1
Identificação
2
CCA008
desconhecida YGSC-EUA
S. cerevisiae
CCA015
Fermentação KD1-Fermentec
S. cerevisiae
CCA194
Padrão K4 NCYC388/CCT2369
Candida glabrata
CCA199
Padrão K8 NCYC435/CCT4373
Hansenula anomala
CCA231
desconhecida Planalsucar
S. cerevisiae
CCA369
Fermento Usina Santa Lucia nd
CCA417
Fermento Usina Santa Lucia nd
CCA418
Fermento Usina Santa Lucia nd
CCA432
Melaço Usina Santa Lucia nd
CCA437
Melaço Usina Santa Lucia nd
CCA452
Mosto Usina Santa Lucia nd
CCA499
Vinho Usina Santa Lucia nd
CCA510
Vinho Usina Santa Lucia
Kluyveromyces marxianus
CCA542
Fermento Usina São João nd
CCA584
Mosto Usina São João nd
*
CCA = Centro de Ciências Agrárias;
1
NCYC = National Culture Yeast Collection; YGSC = Yeast Genetic
Stock Cultures; CCT = Coleção de Culturas Tropicais; ATCC = American Type Culture Colection;
2
nd: não determinada
Os testes de sensibilidade foram realizados em meio YEPD-azul de metileno,
espalhando-se 0,1 mL de suspensão celular com o auxilio de uma alça de Drigalski. As
linhagens produtoras de toxina killer foram inoculadas em pontos, utilizando-se palitos
estéreis, sendo as placas levadas para incubadora a 25 ºC por 48 horas. Os testes
foram realizados em triplicata.
A sensibilidade foi evidenciada pela presença de um halo de inibição ao redor
da colônia da levedura killer, assim como pela formação de um círculo azul, formado
por células mortas coradas pelo azul de metileno, ou seja, as linhagens que sofreram
inibição do crescimento pela toxina foram consideradas positivas para a sensibilidade à
mesma, mesmo que os halos tenham sido pequenos. Em caso de discrepância nos
resultados das triplicatas, para cada levedura foram considerados os resultados com
maior ocorrência.
As linhagens foram também avaliadas quanto à sua capacidade em expressar
a atividade killer diante das linhagens sensíveis CCA003 (S. cerevisiae, NCYC1006) e
32
CCA039 (Torulopsis glabrata, ATCC15126), em meio YEPD-azul de metileno,
espalhando-se 0,1 mL de suspensão celular das linhagens sensíveis e inoculando as
linhagens selecionadas em pontos, utilizando-se palitos estéreis. As placas foram
incubadas a 25 ºC, durante 7 dias e os testes foram realizados em triplicata.
2.2.5 Ensaios fermentativos
2.2.5.1 Material biológico
Foram utilizadas a linhagem S. cerevisiae CCA193 (PE-02, NCYC3233),
isolada de processo fermentativo da Usina da Pedra, Serrana/SP (gentilmente cedida
pela Fermentec – Piracicaba/SP), e a linhagem de Dekkera bruxellensis CCA059,
isolada de água de diluição da Destilaria São Marino, Pirassununga/SP.
A partir destas culturas foram feitas repicagens em placas de Petri e tubos com
meio YEPD, sendo mantidos a 4 °C.
2.2.5.2 Meios de cultura
Foi utilizado caldo de cana-de-açúcar obtido através de doação da Usina São
João, localizada no município de Araras/SP, safra 2007/2008. O caldo clarificado da
usina foi submetido à diluição prévia com água destilada a fim de se obter as
concentrações desejadas de 4 e 12 ºBrix e acrescido de solução de sais.
2.2.5.3 Propagação de células para obtenção do inóculo
O inóculo foi preparado em duas fases de cultivos sucessivos para cada
levedura separadamente. Na primeira fase, a de pré-inóculo, transferiu-se a levedura
para uma placa de Petri com meio de reativação YEPD e incubou-se a 30 °C por 48
horas. Na segunda fase, para obtenção do inóculo, foram transferidas duas alçadas do
crescimento celular da placa de Petri para um tubo de ensaio contendo 20 mL de
solução salina 0,85 %. Após homogeneização, transferiu-se 1 mL dessa suspensão
para um Erlenmeyer de 250 mL contendo 150 mL de meio de multiplicação, mantendo-
o em incubadora a 30 °C, sob agitação de 160 rpm, por 24 horas. A massa celular
obtida foi separada por centrifugação a uma rotação de 3400 rpm, durante 5 minutos.
33
As células oriundas da centrifugação foram incubadas novamente num novo meio de
multiplicação e submetidas às mesmas condições de crescimento. Após centrifugação,
a massa celular foi avaliada quanto ao número de células de leveduras/mL e
convenientemente diluída para um volume de 40 mL com o meio de fermentação,
conforme os tratamentos abaixo descritos.
2.2.5.4 Testes fermentativos
Os testes fermentativos foram realizados em condições de semi-aerobiose em
Erlenmeyers de 500 mL (tamponados com algodão) com 160 mL de meio de
fermentação acrescido de 40 mL do inóculo previamente preparado e diluído de forma a
se obter números finais de células nos Erlenmeyers dos testes fermentativos, conforme
os tratamentos a seguir:
F1: 10
8
células/mL de S. cerevisiae;
F2: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
1
células/mL de D. bruxellensis;
F3: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
2
células/mL de D. bruxellensis;
F4: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
3
células/mL de D. bruxellensis;
F5: 10
8
células/mL de D. bruxellensis.
Os ensaios foram realizados em triplicata, mantidos em estufa a 30 °C durante
14 ciclos de 12 horas cada. Ao término de cada ciclo, coletou-se 2 mL do caldo
fermentado para plaqueamento em meios WLN e/ou WLD e contagem de células em
microscópio. O caldo fermentado foi centrifugado a 3400 rpm por 5 minutos, sendo a
biomassa ressuspensa em 20 mL de solução salina a fim de se proceder a lavagem das
células, e posteriormente foi centrifugada a 3400 rpm durante 5 minutos. A seguir, a
biomassa foi ressuspensa em meio de fermentação, iniciando-se o segundo ciclo de
fermentação, e assim sucessivamente até o último ciclo. Após a centrifugação, foram
coletados 10 mL do sobrenadante para análises de pH e °Brix, 10 mL para análise de
etanol e 15 mL para análise de açúcares redutores totais (ART).
34
2.2.5.4.1 Plaqueamento em meios WLN e WLD
As amostras de 2 mL coletadas ao final de cada ciclo, antes da centrifugação,
foram convenientemente diluídas em tubos com solução salina, sendo espalhados 100
µL de cada diluição em meio WLN (de 5 tratamentos de fermentação) e meio WLD (de
4 tratamentos de fermentação, quando a linhagem D. bruxellensis estava presente). As
placas com WLN foram incubadas a 30 ºC por 48 horas e aquelas com WLD, por 7 dias
a 30 ºC. A seguir, foram contadas as colônias e os resultados expressos em UFC/mL.
Foram utilizadas diluições variando de 10
-3
a 10
-11
para os plaqueamentos em
WLN, e direto (sem diluição) a 10
-4
para os plaqueamentos em WLD, sempre utilizando
no mínimo 3 diluições e em duplicata.
2.2.5.4.2 Contagem e viabilidade celular
A viabilidade celular foi determinada através da contagem das células em
microscópio utilizando-se câmara de Neubauer, com solução de azul de metileno -
citrato de sódio como corante, segundo Lee et al. (1981). O cálculo da viabilidade foi
feito da seguinte forma:
Viabilidade celular (%) =
nº de células vivas x 100 (1)
nº células vivas + nº células mortas
2.2.5.4.3 pH
O pH foi obtido com o auxílio de um pH-metro digital (Corning).
2.2.5.4.4 ºBrix
O valor de Brix (º) foi obtido utilizando-se um refratômetro de campo.
35
2.2.5.4.5 Açúcares redutores totais (ART)
A quantidade de ART foi determinada pelo método do ácido 3,5
dinitrossalicílico (ADNS), conforme Martelli e Panek (1968), no qual alíquotas de 10 mL
das amostras previamente diluídas (quando necessário) foram colocadas em balão
volumétrico de 100 mL, acrescido de 2,5 mL de ácido clorídrico (HCl) 2N para se obter
hidrólise ácida através de aquecimento em banho-maria em temperatura de ebulição
durante 5 minutos. Resfriou-se em água com gelo e adicionou-se 2,5 mL de hidróxido
de sódio (NaOH) 2N. Completou-se o volume do balão com água destilada e em
seguida 1 mL da solução foi transferida para tubos de ensaio contendo 1 mL da solução
estoque do reagente ADNS. Após homogeneização, os tubos foram aquecidos por 5
minutos em banho-maria em temperatura de ebulição e posteriormente resfriados em
água corrente. Completou-se o volume para 10 mL com água destilada, homogeneizou-
se e realizou-se a leitura da absorbância a 540 nm em espectrofotômetro digital
(Thermo
®
Biomate 3). O mesmo procedimento foi feito utilizando-se água ao invés da
amostra para se obter o branco da reação, que foi utilizado para calibrar o aparelho.
A quantidade de açúcares redutores totais (ART) foi obtida através de uma
curva padrão de glicose, pesando-se 1,2 g de glicose previamente seca a 70 °C durante
2 horas e resfriada em dessecador de sílica gel, transferindo-a para um balão
volumétrico de 200 mL e completando-se o volume com água destilada. Alíquotas de 2,
4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20 mL desta solução foram transferidas para balões
volumétricos de 100 mL, completando-se o volume também com água destilada. Cada
mL dessas soluções, considerando-se a diluição, possuíam, respectivamente, 0,012;
0,024; 0,036; 0,048; 0,060; 0,072; 0,084; 0,096; 0,108; 0,120 mg de glicose. Para a
leitura da absorbância a 540 nm, realizou-se o mesmo procedimento anterior. A partir
da concentração de glicose e da respectiva absorbância, efetuou-se a regressão linear
e a correlação (R
2
) entre tais valores (Figura 4).
36
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14
Glicose (mg/mL)
Absorbância (540nm)
y=8,15x - 0,0433
R
2
= 0,998
Figura 4 - Curva padrão de glicose obtida através do método ADNS.
Para o cálculo do ART, utilizou-se a seguinte fórmula:
ART (mg/mL) =
A
540 nm
+ 0,0433 x diluição amostra (2)
8,15
2.2.5.4.6 Teor alcoólico
Para análise do teor alcoólico, procedeu-se a destilação de 10 mL das
amostras centrifugadas em microdestilador TE-012 (Tecnal) e posteriormente
determinou-se o teor alcoólico através da densidade alcoólica obtida em densímetro
digital DMA-45 (Anton Paar), conforme Amorim (1997). Os dados de densidade foram
transformados em g de álcool/100mL, de acordo com as tabelas de conversão.
37
2.2.5.4.7 Cálculo de eficiência fermentativa
Para calcular a eficiência fermentativa utilizou-se a fórmula baseada no cálculo
estequiométrico teórico de Gay-Lussac (51,11 g de etanol/100 g de glicose) a seguir:
Eficiência fermentativa (%) =
Etanol / (ART
inicial
– ART
final
) x 100 (3)
0,511
Foram utilizados os dados de etanol, ART inicial e ART final em g/100 mL, para
cada ciclo de cada fermentação, calculando-se ao final, a eficiência fermentativa média
(dos 14 ciclos) para cada tratamento de fermentação.
2.2.6 Meios e soluções utilizados para cultivos e ensaios
Os meios de cultura e soluções foram esterilizados por autoclavagem a 120 ºC,
1 atm, por 15 minutos, ou filtrados em membranas de 0,22 µm de porosidade, quando
necessário.
CIA
Solução obtida da mistura de clorofórmio e álcool isoamílico na proporção de
24:1, respectivamente.
Clorofane
Solução obtida da mistura de fenol saturado, clorofórmio e álcool isoamílico na
proporção de 25:24:1, respectivamente.
Meio 50 % glicose – ágar extrato de levedura
Composto de 50 % (p/p) glicose e extrato de levedura dissolvidos em água
destilada e acrescido de ágar 1,5 % (p/v).
38
Meio Acetato
Composto de acetato de sódio 0,4 % (p/v) dissolvido em água destilada, pH
ajustado entre 6,5-7,0 e adicionado de 1,5 % de ágar (p/v), dissolvidos em água
destilada.
Meio Basal
Composto de extrato de levedura 0,45 % (p/v) e peptona 0,75 % (p/v). Os
reagentes foram dissolvidos em água destilada acrescentando-se o corante azul de
bromotimol até coloração verde-garrafa.
Meio Carbonato de Cálcio
Dissolveu-se extrato de levedura 0,5 % (p/v), carbonato de cálcio 0,5 % (p/v),
glicose 5 % (p/v) e ágar 2 % (p/v) em água destilada.
Meio Corn Meal Ágar
Dissolveu-se 1,7 g de meio Corn Meal Agar (Difco) em 80 mL de água
destilada aquecida, completando-se o volume para 100 mL.
Meio de fermentação
Caldo de cana clarificado 12 °Brix, acrescido de 10 mL de solução de sais por
litro de meio com pH ajustado a 4,3.
Meio de multiplicação
Caldo de cana clarificado 4 °Brix acrescido de 10 mL de solução de sais por
litro de meio com pH ajustado para 5,5 – 6,0.
Meio Gorodkowa
Composto de 0,1 % de d-glicose (p/v), 1 % de peptona (p/v), 0,5 % de cloreto
de sódio (p/v), e 2 % de ágar (p/v), dissolvidos em água destilada.
39
Meio MYPG para ativação das leveduras
Composto de 0,3 % de extrato de malte (p/v), 0,3 % de extrato de levedura
(p/v), 0,8 % de peptona (p/v), 1,0 % de glicose (p/v) e 2 % de ágar (p/v) dissolvidos em
água destilada.
Meio Yeast Nitrogen Base
Dissolveu-se 6,7 g de Yeast Nitrogen Base – YNB (Difco) em 60 mL de água
destilada completando-se o volume para 100 mL.
Meio Yeast Carbon Base
Dissolveu-se 11,7 g de Yeast Carbon Base – YCB (Difco) em 60 mL de água
destilada completando-se o volume para 100 mL.
Meio YEPD
Composto de 1 % de extrato de levedura (p/v), 2 % de peptona (p/v), 2 % de
glicose (p/v) e 2 % de ágar (p/v) dissolvidos em água destilada.
Meio YEPD-azul de metileno para testes de atividade killer
Tamponou-se uma solução de ácido cítrico 2 % (p/v) com solução de fosfato
hidrogenado de potássio (K
2
HPO
4
) 7 % (p/v) até pH 4,3. Adicionou-se 10 g/L de extrato
de levedura, 20 g/L de peptona e 20 g/L de glicose. Calculou-se um volume de água
destilada igual a 2 % do volume total obtido para dissolver 20 g/L de ágar, o qual foi
autoclavado. Após a autoclavagem a solução de nutrientes tamponada foi misturada
com o ágar ainda quente e adicionou-se 2 mL/L de solução de azul de metileno (1,5 %).
O pH permaneceu entre 4,5 e 4,7.
Meio YM
Composto de 0,3 % de extrato de malte (p/v), 0,3 % de extrato de levedura
(p/v), 0,5 % de peptona, 1 % de d-glicose (p/v) e 2 % de ágar (p/v), dissolvidos em água
destilada.
40
Meio WLN
Foram dissolvidos 80g do meio WL Nutrient Medium (Acumedia
®
) em 1000 mL
de água destilada. Adicionou-se 1 mL de suspensão de ácido nalidíxico (Wintomylon,
Sanofi Winthrop Farmacêutica Ltda) e 1 mL de ampicilina (0,005 ppm).
Meio WLD
Acrescentou-se 1 mL de uma solução 2 % de actidione para cada litro de meio
WLN esterilizado e liquefeito, em temperatura ao redor de 55 ºC (concentração final de
20 ppm de actidione).
RNAse
Esta solução foi preparada misturando-se 10 mg/mL de RNAse pancreática
(RNAse A) em solução de Tris-HCl pH 7,5 e NaCl 15 mM. A solução foi aquecida a 98
ºC por 15 minutos e estocada a –20 ºC.
SDS 10 %
Pesou-se 10 g de SDS e dissolveu-se em 80 mL de água Milli-Q aquecida.
Após resfriamento, completou-se o volume para 100 mL. Esta solução não foi
esterilizada.
Solução de azul de metileno
Para o preparo desta solução dissolveu-se 1,5 g do corante azul de metileno
em 100 mL de água destilada estéril.
Solução azul de metileno com citrato de sódio
Dissolveu-se 0,01 g de azul de metileno e 2,0 g de citrato de sódio em 100 mL
de água destilada.
Solução de safranina 0,5 %
Dissolveu-se 0,5 g de safranina em 50 mL de água destilada completando-se o
volume para 100 mL.
41
Solução de sais
Dissolveu-se 50 g de sulfato de amônio, 20 g de fosfato monobásico de
potássio, 10 g de sulfato de magnésio, 1 g de sulfato de zinco e 1 g de sulfato de
manganês em 500 mL de água destilada, completando-se o volume para 1000 mL.
Solução salina
Dissolveu-se 0,85 g de NaCl em 100 mL de água destilada.
Solução de verde-malaquita 5 %
Dissolveu-se 5 g de corante verde-malaquita em 50 mL de água destilada
completando-se o volume para 100 mL.
Tampão TBE 10X
Dissolveu-se 108 g de Trizma base e 55g de ácido bórico em 400 mL de EDTA
0,5M pH 8,0, sendo o volume completado para 1000mL com água Milli-Q e submetido a
autoclavagem.
Tampão TE (Tris-EDTA) 10X
Misturou-se 10 mL de Tris-HCl 1 M pH 7,5 com 2 mL de EDTA 0,5 M,
completando-se o volume com água Milli-Q para 1000 mL.
Tampão SM
Composto de 2,5 µL de cloreto de magnésio 2 M, 200 µL Tris-HCl 1 M pH 9,0,
completando-se para 1 mL com água Milli-Q estéril.
Tris-HCl 1M pH 8
Dissolveu-se 121,10 g de Trizma-base em 800 ml de água Milli-Q, ajustando-se
o pH para 8,0 com HCl e completando-se o volume para 1000 mL com água Milli-Q.
Para concentrações menores, diluiu-se esta solução convenientemente em água Milli-
Q estéril.
42
2.3 Resultados e discussão
2.3.1 Identificação e caracterização das linhagens de leveduras
Das linhagens testadas da coleção de culturas do LAMAM, CCA-UFSCar,
campus Araras, foram selecionadas 4 cepas (CCA053, CCA059, CCA077 e CCA155)
que apresentaram produção significativa de ácido a partir da glicose, ou seja,
intensidade 2 ou 3, e morfologia característica dos gêneros Dekkera/Brettanomyces,
cujas células apresentam-se freqüentemente ogivais (KREGER VAN-RJI, 1984). Estes
critérios foram também utilizados para selecionar 4 linhagens de leveduras isoladas de
meio WLD, a partir de amostras do vinho da Usina Santa Lúcia (IF3 e IF4) e do
fermento utilizado para produção de cachaça orgânica (IF5 e IF6).
Desta forma, nove linhagens (incluindo a cepa CCT2621) foram utilizadas nos
testes de identificação e caracterização das leveduras, incluindo testes taxonômicos
clássicos e moleculares.
Os resultados da produção de ácido, formação de esporos, produção de
pseudomicélio, crescimento a 37 ºC, fermentação da glicose e galactose e crescimento
em meio 50% glicose-ágar extrato de levedura encontram-se na Tabela 4.
43
Tabela 4 - Caracterização morfo-fisiológica das linhagens de leveduras selecionadas
Linhagem *
Crescimento a
37 ºC
Fermentação da
glicose
Fermentação da
galactose
Produção de
esporos
Produção de
pseudomicélio
Produção de
ácido
Crescimento em
50% glicose-
ágar extrato de
levedura
CCA022**
+ + - + + 1 +
CCA053
+ + + - + 2 -
CCA059
+ + + + + 3 -
CCA077
+ + + + + 3 -
CCA155
+ + + + + 3 -
CCT2621
+ + - - + 1 -
IF3
+ + + + + 2 -
IF4
+ + - + + 2 -
IF5
+ nd nd
nd + 2 -
IF6
+ nd
nd nd + 2 -
Legenda: (+): positivo (-): negativo nd: não determinado Intensidade: (0) = nula, (1) = fraca, (2) =
média e (3) = forte * CCA – Centro de Ciências Agrárias – UFSCar; CCT – Centro de Culturas Tropicais;
IF = Isolado da Fermentação; ** linhagem de Saccharomyces cerevisiae
A produção de ácido a partir da glicose variou quanto à intensidade, mas foi
considerada positiva para todas as leveduras selecionadas, uma vez que todas as
leveduras de interesse apresentaram intensidade de produção maior ou igual a 2.
(Tabela 4, Figura 5). A linhagem CCA022 (Saccharomyces cerevisiae) foi utilizada
como controle negativo, pois apresenta baixa produção de ácido. No entanto, a
linhagem CCT2621, catalogada como D. bruxellensis, apresentou fraca produção de
ácido a partir da glicose, característica marcante de leveduras dos gêneros
Dekkera/Brettanomyces (KREGER-VAN RIJ, 1984).
44
CCA022 (1) CCA053 (2) CCA059 (3)
CCA077 (3) CCA155 (3) CCT2621
IF3 (2) IF4 (2) IF5 (2)
IF6 (2)
Figura 5 - Teste de produção de ácido por 7-10 dias, a 30 ºC a partir da glicose em meio carbonato de
cálcio pelas linhagens de leveduras. Os números em parênteses, após os códigos das
culturas, referem-se à intensidade de produção de ácido, conforme Tabela 4
45
Em meio ágar malte, as colônias variaram quanto à cor, apresentando-se em
tons creme à marrom claro e ocasionalmente uma coloração alaranjada. Tanto em ágar
malte como em caldo extrato de malte o crescimento foi bastante lento. No caldo extrato
de malte foi possível também observar a presença de células filamentosas, células
freqüentemente ogivais ou elípticas e ocasionalmente esféricas (Figura 6). Após 10 dias
de incubação a temperatura ambiente, observou-se formação de aromas característicos
e o sedimento precipitado passou a ter aspecto mucóide.
A produção de pseudomicélio foi avaliada através de microcultivo em CMA –
Corn Meal Agar (Figura 7), sendo que todas as linhagens testadas apresentaram
produção de pseudomicélio.
Quanto à fermentação da glicose e galactose, todas as espécies de Dekkera
fermentam a primeira enquanto que em relação à galactose, a fermentação é variável
entre as espécies. Sendo assim, são consideradas D. intermedia aquelas que
fermentam a galactose e D. bruxellensis aquelas que não fermentam a galactose
(BARNETT et al., 1990).
Os resultados mostraram que as linhagens IF4 e CCT2621 não fermentam a
galactose, enquanto as demais fermentam. No caso da glicose, todas apresentaram
capacidade fermentativa (Tabela 4).
A produção de esporos sexuais foi avaliada em três diferentes meios (YM,
Acetato e Gorodkowa), e com exceção das linhagens CCA053 e CCT2621, foram
observados esporos sexuais (ascósporos) em número de 1-2 por asco, conforme Figura
8.
46
CCA022 CCA053 CCA059
CCA077 CCA155 CCT2621
IF3 IF4 IF5
IF6
Figura 6 - Morfologia celular das linhagens de leveduras em meio extrato de malte, por 7 dias, a 30 ºC. As
setas apontam a presença de células filamentosas. CCA022 é uma linhagem de S. cerevisiae
47
CCA022 CCA053 CCA059
CCA077 CCA155 CCT2621
IF3 IF4 IF5
IF6
Figura 7 - Produção de pseudomicélio em meio CMA – Corn Meal Agar, pelas linhagens de leveduras
selecionadas, em microcultivo, a 25 ºC. CCA022 é uma linhagem de S. cerevisiae
48
CCA053 – Meio Gorodkowa CCA059 – Meio Acetato CCA077 – Meio Acetato
CCA155 – Meio Acetato CCT2621 – Meio Gorodkowa IF3 – Meio YM
IF4 – Meio YM
Figura 8 - Formação de esporos sexuais pelas linhagens de leveduras em três diferentes meios de
cultura (Acetato, YM e Gorodkowa). As setas apontam a presença do esporo corado em verde
pelo método de Virtz
Quanto ao crescimento a 37 ºC (Tabela 4), observa-se que todas as leveduras
crescem a esta temperatura. O mesmo não ocorre quando se trata do meio de cultura
composto por 50 % glicose-ágar extrato de levedura. Estes resultados corroboram a
descrição de Kreger-van Rij (1984) para leveduras dos gêneros
Dekkera/Brettanomyces.
Os resultados obtidos nos testes de assimilação de fontes de carbono e
nitrogênio podem ser observados nas Tabelas 5 e 6, respectivamente.
49
Tabela 5 - Testes de assimilação de fontes de carbono pelas linhagens de leveduras
Fonte de carbono
Linhagem *
Sacarose
Rafinose
Galactose
Xilose
Arabinose
Celobiose
Manitol
Melibiose
Glicose
Etanol
Maltose
Ac. Lactico
Ac. Citrico
Ac. Succínico
Inositol
CCA022 **
+ +
+ + + - - - + + + - - - -
CCA053
+ +
+ + + + - - + - + - + + +
CCA059
- -
+ + + + - - + - + - - + +
CCA077
+ +
- - - + + - + + + - - + +
CCA155
- -
- - + + - - + - + - - + +
CCT2621
+ +
+ + - - + - + + + - - + +
IF3
+ +
+ + + - - + + + + - - + +
IF4
+ +
+ + + + - + + + + - - + +
IF5
nd nd
nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd
IF6
nd
nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd
Legenda: nd: não determinado * CCA – Centro de Ciências Agrárias – UFSCar; CCT – Centro de
Culturas Tropicais; IF = Isolado da Fermentação; ** linhagem de Saccharomyces cerevisiae
Segundo Barnett et al. (1990), as leveduras que não assimilam a celobiose são
consideradas D. bruxellensis e as que assimilam celobiose são consideradas D.
intermedia. Estes autores consideram as espécies D. bruxellensis e D. intermedia como
duas espécies distintas, ao contrário de outros (EGLI; HENICK-KLING, 2001) que
consideram as espécies como sinônimas. Em vista disto, a análise dos resultados não
permite uma conclusão definitiva sobre a identificação das linhagens destas leveduras
quanto à espécie, pois seus comportamentos diante da assimilação de compostos de
carbono são muito variáveis.
Quanto à assimilação de fontes de nitrogênio (Tabela 6), os resultados obtidos
atendem à descrição das leveduras do gênero Dekkera/Brettanomyces, conforme
Kreger-van Rij (1984). É esta característica distintiva que as leveduras
Dekkera/Brettanomyces possuem que permite o isolamento destas linhagens em meios
seletivos, como o meio ágar lisina. Em processos fermentativos onde S. cerevisiae é
predominante em número, o isolamento destas leveduras contaminantes é possível no
meio citado, uma vez que o desenvolvimento de S. cerevisiae é prejudicado devido à
50
incapacidade de assimilação da lisina (CECCATO-ANTONINI; SILVA, 2000;
CECCATO-ANTONINI; TOSTA, 2005).
Tabela 6 - Testes de assimilação de fontes de nitrogênio pelas linhagens de leveduras
Fonte de Nitrogênio
Linhagem * Lisina Etilamina Nitrato
CCA022 **
- - -
CCA053
+ + +
CCA059
+ + +
CCA077
+ + +
CCA155
+ + +
CCT2621
+ + +
IF3
+ + +
IF4
+ + +
IF5
nd nd nd
IF6
nd nd nd
Legenda: nd: não determinado * CCA – Centro de Ciências Agrárias – UFSCar; CCT – Centro de
Culturas Tropicais; IF = Isolado da Fermentação; ** linhagem de Saccharomyces cerevisiae
Para complementar a identificação das linhagens, utilizou-se a técnica de PCR
colônia seguida por eletroforese em gel de agarose 1,5 %, sendo possível conhecer o
tamanho da região ITS do DNA ribossomal de cada levedura isolada (Figura 9). A
região ITS, incluindo o gene 5,8S do DNA ribossomal, amplificada pelos primers ITS-1 e
ITS-4 (WHITE et al., 1994) apresenta tamanho entre 450 e 550 bp para as leveduras do
gênero Dekkera/Brettanomyces, enquanto para a maioria das outras leveduras da
fermentação o tamanho varia entre 600 e 900 bp (EGLI et al., 1999).
Souza-Liberal et al. (2005) propuseram uma metodologia baseada no uso de
primers que amplificam a região ITS1 – 5,8S – ITS2 para detectar a presença de
leveduras não-Sacharomyces cerevisiae em vinhos da fermentação etanólica. Os
autores se basearam no fato de que a região ITS com tamanho entre 400 a 700 bp
pode caracterizar leveduras contaminantes, uma vez que S. cerevisiae apresenta região
ITS por volta de 800-850 bp (EGLI et al., 1999).
51
Algumas outras leveduras, por exemplo, Arxyozyma telluris e Kluyveromyces
bacillisporus, também apresentam tamanho ITS nesta faixa, porém, nenhuma delas já
foi isolada da fermentação etanólica (SILVA, 1994).
A Figura 9 mostra o gel de agarose com os produtos PCR da região ITS das
nove leveduras, na faixa de 450 a 600 bp, com exceção da linhagem CCT2621 (por
volta de 800 bp). Para fins de comparação, foram incluídas as linhagens CCA039 e
CCA022, as quais mostraram ITS ligeiramente superior aquele de CCT2621. A região
ITS da linhagem CCA022 de S. cerevisiae tem 841 bp, conforme Ceccato-Antonini et al.
(2005) e a linhagem CCA 039 foi identificada como Torulopsis glabrata. Há registro de
ITS de D. anomala por volta de 700 bp (SOUZA-LIBERAL et al., 2005).
2652 pb
800 bp
350 bp
50 bp
2072 bp
1500 bp
600 bp
M2
039 022
2621
IF6
IF5
IF4
IF3
155
077
059
053
M1
Figura 9 - Gel de agarose (1,5%) com os produtos PCR amplificados da região ITS do rDNA, incluindo o
gene 5,8S, das linhagens de leveduras. Os números e letras sobre os poços referem-se às
linhagens, com exceção de M1 (marcador molecular 50 bp) e M2 (marcador molecular 100 bp)
Egli e Henick-Kling (2001) propuseram primers específicos para espécies de
Brettanomyces/Dekkera, entre eles, o par pB2 e ITS-4, específico para B. bruxellensis,
na região ITS. Foi realizada PCR com estes primers a partir de DNA genômico e de
produto PCR da região ITS esperando-se obter um fragmento de 143 bp, mas mesmo
trabalhando-se com produto PCR purificado e variando-se a temperatura de
anelamento de 55 ºC a 65 ºC, não foram obtidas amplificações.
52
Com os resultados obtidos nos testes taxonômicos, a chave de identificação de
Kreger-van Rij (1984) leva ao gênero Dekkera, especialmente pela forte produção de
ácido e presença de ascósporos nas leveduras testadas, com exceção das linhagens
CCA053 e CCT2621 (esporos não visualizados). Estas poderiam estar na fase
anamórfica e, portanto, serem Brettanomyces.
Avançando na identificação em nível de espécie, os testes de fermentação
podem diferenciar o gênero Dekkera em duas espécies, dependendo da fermentação
da galactose positiva (D. intermedia) ou negativa (D. bruxellensis), para as linhagens
CCA053, CCA059, CCA077, CCA155 e IF3; e CCT2621 e IF4, respectivamente (Tabela
5). Porém, quanto à assimilação de celobiose, D. bruxellensis apresenta resultado
negativo enquanto D. intermedia é capaz de assimilar esta fonte de carbono. Neste
caso, há um resultado discrepante para a linhagem IF4, que não fermenta galactose e
assimila celobiose e, portanto não é possível dizer se se trata de D. bruxellensis ou D.
intermedia.
Os outros resultados de assimilação de fontes de carbono ora encaixam a
linhagem numa espécie ora caracterizam outra espécie, pondo em dúvida a
confiabilidade dos resultados de identificação. A Tabela 7 traz uma compilação dos
resultados esperados dos testes de fermentação e assimilação de fontes de carbono e
nitrogênio para as duas espécies de Dekkera, conforme Kreger-van Rij (1984),
permitindo uma comparação mais facilitada com os resultados aqui obtidos (Tabelas 4,
5 e 6).
53
Tabela 7 - Testes de fermentação e assimilação de fontes de carbono e nitrogênio para as espécies de
Dekkera (Compilada de KREGER-VAN RIJ, 1984)
Fermentação
Assimilação
Espécie
Glicose
Galactose
Sacarose
Rafinose
Galactose
Xilose
Arabinose
Celobiose
Manitol
Melibiose
Glicose
Etanol
Maltose
Ac. Lactico
Ac. Citrico
Ac. Succínico
Inositol
Nitrato
Dekkera
intermedia
+ + + v + - - + - nd nd nd + nd - v - v
Dekkera
bruxellensis
+ - + + - - - - - nd nd nd + nd - v - v
Legenda: nd:não determinada; v: variável
Para as linhagens CCA053 e CCT2621 não se observou produção de esporos
sexuais em três meios indutores de esporulação e assim, considerando-se a
comparativamente baixa produção de ácido (fraca a média, Tabela 4) e o tamanho
relativamente alto da região ITS da linhagem CCT2621 (Figura 9) duvidou-se até que
estas linhagens possam ser mesmo Brettanomyces.
Desta forma, resultados mais consistentes e confiáveis poderiam ser obtidos
com o sequenciamento da região ITS das leveduras selecionadas, já que a
caracterização morfo-fisiológica das leveduras apresentou resultados contraditórios.
Observando-se a Tabela 8, verifica-se que somente três das 9 linhagens foram
identificadas como Dekkera, todas da espécie bruxellensis. As demais leveduras
isoladas dos processos fermentativos pertenceram predominantemente à espécie
Pichia guilliermondii, inclusive a linhagem CCA053, anteriormente identificada por Tosta
(2004) como Dekkera intermedia. Ambas as espécies (D. bruxellensis e P.
guilliermondii) mostram perfis semelhantes relacionados à habilidade de produzir 4-etil-
54
fenol, o que dificulta sobremaneira a caracterização das culturas baseada
exclusivamente em características fisiológicas/bioquímicas. No entanto, a nível
molecular, as duas espécies se diferenciam quando se realiza a restrição com a enzima
Hinf1, sendo que a espécie de Dekkera apresenta baixa variabilidade no DNA
mitocondrial entre as espécies, enquanto Pichia apresenta alta variabilidade no DNA
mitocondrial (MARTORELL et al., 2005).
Tabela 8 - Identificação das linhagens de leveduras selecionadas através do sequenciamento da região
ITS do DNA ribossomal
Linhagem Espécie Tamanho da seqüência analisada (bp)
CCA053 Pichia guilliermondii
578
CCA059 Dekkera bruxellensis
432
CCA077 Dekekra bruxellensis
446
CCA155 Dekkera bruxellensis
435
CCT2621 Saccharomyces boulardii
785
IF3 Pichia guilliermondii
575
IF4 Pichia farinosa
478
IF5 Pichia guilliermondii
578
IF6 Pichia guilliermondi
576
Os resultados do sequenciamento também confirmaram que a linhagem
CCT2621 não é uma levedura Dekkera e sim Saccharomyces boulardii, o que já se
suspeitava pelo tamanho da região ITS. Mc Cullough et al. (1998) mostraram que
leveduras da espécie S. boulardii são linhagens asporogências (não formadoras de
esporos) de S. cerevisiae, não representativas de uma espécie distinta e separada e de
difícil identificação por métodos clássicos de taxonomia.
A produção de ácido foi a característica mais decisiva e discriminatória para a
identificação de linhagens de Dekkera, pois comparando-se com os resultados do
sequenciamento, verifica-se que somente aquelas linhagens com forte produção de
acido (Figura 5) confirmaram ser do gênero Dekkera.
55
As seqüências obtidas para cada uma das linhagens estão nos Anexos. Os
ensaios posteriores (atividade killer, perfil da sensibilidade às toxinas killer e testes
fermentativos) serão realizados somente com as linhagens Dekkera.
O ensaio killer foi realizado com a finalidade de verificar se as linhagens de
leveduras Dekkera selecionadas possuem este tipo de atividade (Tabela 9), assim
como avaliar se cada um dos isolados possui sensibilidade diante das toxinas
produzidas por leveduras killer (Tabela 10, Figura 10).
Tabela 9 - Ensaio killer das linhagens de Dekkera bruxellensis em meio YEPD-azul de metileno, a
25 °C, por 7 dias, contra as linhagens sensíveis CCA003 e CCA039
Linhagem CCA003 CCA039
CCA059
- -
CCA077
- -
CCA155
- -
(-) Não apresentou halo de inibição/zona azul
Tabela 10 - Sensibilidade das linhagens de Dekkera bruxellensis frente às leveduras killer
Leveduras killer
Linhagem
CCA008
CCA015
CCA194
CCA199
CCA231
CCA369
CCA417
CCA418
CCA499
CCA432
CCA437
CCA452
CCA510
CCA542
CCA584
CCA059
- - - - - - - - - - - - + - -
CCA077
- - - - - - - - - - - - + - -
CCA155
- - - - - - - - - - - - + - -
As três leveduras da espécie Dekkera bruxellensis não apresentaram atividade
killer frente às duas linhagens sensíveis. Além disso, foram suscetíveis à toxina da
levedura CCA510 (Kluyveromyces marxianus), apresentando-se neutras às 14
leveduras killer restantes (Tabelas 9 e 10; Figura 10). Comitini et al. (2004) mostraram
que a toxina de Kluyveromyces wickerhamii foi a mais eficaz no controle do crescimento
de leveduras Dekkera.
56
Figura 10 - Sensibilidade da levedura Dekkera bruxellensis (CCA155) à linhagem de Kluyveromyces
marxianus (CCA510), verificada pela presença de um halo de inibição ao redor da colônia
killer além da formação de uma zona azul ao redor da mesma, caracterizando a morte celular
Estes resultados inviabilizam a proposição de uma metodologia de biotipagem
por atividade killer para leveduras do gênero Dekkera/Brettanomyces, devido ao fato de
serem predominantemente neutras. No entanto, estudos com um número maior e mais
diversificado de linhagens podem trazer resultados mais discriminatórios. Tosta (2004)
já havia verificado este resultado para as mesmas linhagens, porem optou-se por repetir
os testes para confirmação. Naquele trabalho, o autor não detectou a sensibilidade das
linhagens à linhagem killer CCA510, possivelmente pelo fato do tempo menos de
incubação (3 dias) ao invés dos 7 dias aqui utilizados.
2.3.2 Ensaios fermentativos
Os ensaios fermentativos foram realizados com a finalidade de avaliar o
comportamento da levedura Dekkera bruxellensis como contaminante no processo
fermentativo. Para isso, foram planejados experimentos com um número grande de
reciclos celulares (14), uma vez que a levedura contaminante tem crescimento lento.
Diferentes níveis de contaminação foram avaliados, sendo eles, 10
1
, 10
2
e 10
3
células/mL, mantendo-se a concentração do agente da fermentação (S. cerevisiae)
estabelecido em 10
8
células/mL. Procedeu-se também um ensaio em condições
idênticas, inoculando-se apenas a linhagem contaminante de Dekkera bruxellensis
(CCA059) ao nível de 10
8
células/mL a fim de verificar seu comportamento ao longo dos
14 ciclos.
57
Resultados obtidos no Laboratório de Microbiologia Agrícola e Molecular
(LAMAM) no monitoramento microbiológico de destilarias por diversas safras, têm
mostrado que a contaminação por leveduras selvagens (isolamentos em meios
seletivos WLD e Agar – lisina) raramente excede 10
4
UFC/mL
1
, motivo pela qual
estabeleceu-se o limite de 10
3
células/mL de D. bruxellensis nos experimentos aqui
realizados.
A linhagem CCA193 (PE-02) foi escolhida devido ao seu alto rendimento
fermentativo e extensiva utilização industrial, enquanto a linhagem CCA059 por ser a
linhagem que mais apresentou resultados concordantes aos padrões estabelecidos
para Dekkera bruxellensis nas chaves de identificação clássicas.
Além das análises habituais para avaliação do processo fermentativo
(viabilidade celular, pH, Brix, ART e etanol), decidiu-se acompanhar a evolução do
crescimento das leveduras agente e contaminante (S. cerevisiae e D. bruxellensis,
respectivamente) durante o processo, através de plaqueamento das amostras em meio
de contagem geral, não seletivo (WLN) e em meio seletivo (WLD), no qual a levedura
agente não se desenvolve devido à presença de actidione por não apresentar
resistência, permitindo a avaliação do crescimento da contaminante, em diluições
inferiores àquelas utilizadas para o meio WLN.
Os resultados obtidos após plaqueamentos em meios WLN e WLD podem ser
observados nas Figuras 11 e 12.
1
CECCATO-ANTONINI, S.R. CCA, UFSCar – campus de ARARAS/SP
58
1.00E+00
1.00E+02
1.00E+04
1.00E+06
1.00E+08
1.00E+10
1.00E+12
1.00E+14
1.00E+16
01234567891011121314
Ciclos
nº leveduras (UFC/mL)
F1
F2
F3
F4
F5
Figura 11 - Número de leveduras (UFC/mL) crescidas em meio WLN durante o processo fermentativo
com reciclo celular. Legenda: F1: 10
8
células/mL de S. cerevisiae; F2: 10
8
células/mL de S.
cerevisiae + 10
1
células/mL de D. bruxellensis; F3: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
2
células/mL de D. bruxellensis; F4: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
3
células/mL de D.
bruxellensis; F5: 10
8
células/mL de D. bruxellensis
1.00E+00
1.00E+02
1.00E+04
1.00E+06
1.00E+08
1.00E+10
1.00E+12
1.00E+14
1.00E+16
01234567891011121314
Ciclos
nº leveduras (UFC/mL)
F1
F2
F3
F4
F5
Figura 12 - Número de leveduras (UFC/mL) crescidas em meio WLD durante o processo fermentativo
com reciclo celular (ciclos de 12 horas); Legenda: F1: 10
8
células/mL de S. cerevisiae; F2:
10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
1
células/mL de D. bruxellensis; F3: 10
8
células/mL de S.
cerevisiae + 10
2
células/mL de D. bruxellensis; F4: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
3
células/mL de D. bruxellensis; F5: 10
8
células/mL de D. bruxellensis
59
Como pode ser observado na Figura 11, o número total de leveduras (estimado
em WLN) foi ligeiramente maior nos tratamentos onde não havia contaminação por D.
bruxellensis, especialmente até o 9º ciclo. A partir daí, os valores foram similares.
Na fermentação pura com D. bruxellensis, a população de leveduras elevou-se
de 10
8
para 10
14
UFC/mL, enquanto nos tratamentos com somente S. cerevisiae ou
com S. cerevisiae + D. bruxellensis, a população total de levedura aumentou cerca de
100-1000 vezes. A Figura 12 permite avaliar o comportamento da levedura
contaminante quando em associação com S. cerevisiae. O número de células
aumentou ao longo dos ciclos passando de 10
1
para 7,8x10
2
, de 10
2
para 3x10
3
e de
10
3
para 1x10
6
UFC/mL ao final do 14º ciclo, nos tratamentos onde foram inoculados
10
1
, 10
2
e 10
3
células/mL de D. bruxellensis, respectivamente. Estes resultados
comprovam que a levedura contaminante cresce lentamente no caldo de cana ao
longo de 14 ciclos de fermentação, aumentando um ciclo logarítmico nos 2 primeiros
casos e 3 ciclos no caso em que havia 10
3
células iniciais/mL de D. bruxellensis. No
ensaio em que havia somente a linhagem de D. bruxellensis inoculada, houve
aumento de seis ciclos logarítmicos, passando de 10
8
células/mL iniciais para 10
14
células/mL ao final dos 14 ciclos fermentativos.
Estes resultados mostram o potencial de crescimento destas leveduras em
condições de fermentação, em meio de caldo de cana, e que a evolução do
crescimento depende do tamanho do inóculo inicial.
Abbott e Ingledew (2005) observaram que o crescimento de Brettanomyces foi
limitado a aproximadamente 1 ciclo log independentemente do nível de inóculo inicial,
que variou de 10
3
a 10
7
células/mL, em fermentações mistas com S. cerevisiae a
partir de mosto de milho.
Na Figura 13, observa-se o crescimento celular das colônias de leveduras
resistentes ao actidione, em meio WLD. A análise microscópica das colônias
confirmou serem da contaminante D. bruxellensis, pela morfologia característica das
células (alongadas, ogivais) e pela intensa produção de ácido, capaz de ocasionar
mudança da cor do meio.
60
Placa não inoculada Placa inoculada
Figura 13 - Aspecto das placas contendo meio WLD, antes e após inoculação de amostras da
fermentação mista S. cerevisiae + D. bruxellensis, evidenciando a mudança de coloração
do meio devido à produção de ácido pelas colônias de D. bruxellesnsis
Já a Figura 14 mostra a morfologia das células de leveduras coradas com azul
de metileno em ensaio com inoculação conjunta de S. cerevisiae e D. bruxellensis, onde
se observa a morfologia diferenciada da levedura D. bruxellensis.
1
2
Figura 14 - Morfologia das células de leveduras após coloração com azul de metileno sob microscópio
óptico (aumento 400x) em ensaio com inoculação conjunta de
S. cerevisiae e D. bruxellensis.
(1) células alongadas, características de Dekkera; (2) células esféricas, características de
S.cerevisiae. A seta aponta uma célula morta (corada pelo azul de metileno)
Com relação aos números de viabilidade, no ensaio em que havia somente S.
cerevisiae, a média da viabilidade foi de 96,9%, enquanto que nos ensaios em que
havia 10
1
, 10
2
e 10
3
células/ mL de Dekkera, a viabilidade celular foi de 92,5%, 95,5% e
de 87%, respectivamente, mostrando diminuição na viabilidade celular na presença da
61
levedura contaminante, especialmente após o 9º - 10º ciclo fermentativo. No ensaio
com somente D. bruxellensis, a média da viabilidade foi de 94% (Figura 15).
60
65
70
75
80
85
90
95
100
01234567891011121314
Ciclos
Viabilidade (%)
F1
F2
F3
F4
F5
Figura 15 - Viabilidade celular (%) das leveduras durante o processo fermentativo com reciclo celular
(ciclos de 12 horas); Legenda: F1: 10
8
células/mL de S. cerevisiae; F2: 10
8
células/mL de S.
cerevisiae + 10
1
células/mL de D. bruxellensis; F3: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
2
células/mL de D. bruxellensis; F4: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
3
células/mL de D.
bruxellensis; F5: 10
8
células/mL de D. bruxellensis
A análise estatística revelou diferenças significativas entre os tratamentos
(diferentes níveis de contaminação de D. bruxellensis), entre os ciclos fermentativos e
interação tratamento x ciclo (Tabela 11), mostrando em linhas gerais, que nas
fermentações mistas S. cerevisiae + D. bruxellensis, observa-se queda na viabilidade
celular à medida em que aumenta a concentração de D. bruxellensis, cujas médias são
significativamente inferiores às fermentações puras com S. cerevisiae ou D.
bruxellensis. Porém, na fermentação S. cerevisiae + 10
3
células/mL de D. bruxellensis,
a viabilidade celular apresentou valor intermediário entre a fermentação pura com D.
bruxellensis e a pura com S. cerevisiae (Tabela 12). De qualquer forma, é importante
destacar que a presença da levedura contaminante prejudica a levedura S. cerevisiae
de alguma maneira, pois embora não tenha se discriminado entre as leveduras durante
62
a contagem na câmara de Neubauer, a levedura S. cerevisiae sobrepuja em número
nos tratamentos e, portanto, a perda da viabilidade deve ser provavelmente das células
de S. cerevisiae.
Tabela 11 - Análise de variância dos resultados de viabilidade celular (%)
Grau de
Liberdade
SQ QM F
Tratamento
4 2441 610 37,5*
Ciclo
13 1203 93 5,7*
Tratamento*Ciclo
52 1735 33 2,1*
Resíduo
140 2277 16
Total
209 7655
*significativo a 5%
Tabela 12 - Teste de Tukey dos resultados de viabilidade celular
Tratamentos Médias (%)
10
8
células/mL de S. cerevisiae 96,7 a
10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
1
células/mL de D. bruxellensis 92,5 c
10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
2
células/mL de D. bruxellensis 95,5 ab
10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
3
células/mL de D. bruxellensis 87 d
10
8
células/mL de D. bruxellensis 93,5 bc
Obs.: Médias dos tratamentos com letras iguais não diferem estatisticamente entre si (Tukey 5%)
O pH do meio de fermentação decaiu ao longo dos ciclos nas fermentações
com D. bruxellensis, ao contrário da fermentação pura com S. cerevisiae (Figura 16). As
análises estatísticas apontaram diferenças significativas entre os tratamentos, entre os
ciclos fermentativos e interação ciclo x tratamento (Tabela 13). Os valores de pH
diferiram significativamente entre si em todos os tratamentos (Tabela 14), observando-
se uma queda nos valores com o aumento da contaminação por D. bruxellensis.
A diminuição do pH pode ser devida à elevada taxa de consumo do substrato
(ART), resultando em maior quantidade de gás carbônico eliminado e, portanto, em
aumento da acidez do meio. Isto resultaria em maior produção de álcool. Outra
possibilidade é a produção de ácido acético pelas leveduras Dekkera (CIANI;
FERRARO, 1997; ABBOTT et al., 2005; ABBOTT; INGLEDEW, 2005). Os autores têm
enfatizado que estas leveduras produzem grandes quantidades de ácido acético
especialmente quando a oxigenação é abundante, o que não ocorre durante a
fermentação etanólica. A primeira possibilidade não se concretizou nos experimentos
aqui realizados, como pode ser visto mais a frente, pois o teor alcoólico do vinho foi
63
menor em situação de contaminação por Dekkera. Desta forma, parece que a
possibilidade de produção de ácido acético não pode ser descartada. Ciani et al. (2003)
testaram diferentes condições de semi-aerobiose para a avaliação do crescimento e
fermentação de linhagens de Dekkera/Brettanomyces e verificaram que condições de
semi-aerobiose (frascos com tampão de algodão-lã, como aqueles aqui utilizados)
afetaram negativamente a fermentação, com o aumento da produção de ácido acético,
acetaldeído e etil-acetato.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
1234567891011121314
Ciclos
pH
F1
F2
F3
F4
F5
Figura 16 - pH do meio de fermentação durante o processo fermentativo com reciclo celular (ciclos de 12
horas); pH inicial: 4,3. Legenda: F1: 10
8
células/mL de S. cerevisiae; F2: 10
8
células/mL de
S. cerevisiae + 10
1
células/mL de D. bruxellensis; F3: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
2
células/mL de D. bruxellensis; F4: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
3
células/mL de D.
bruxellensis; F5: 10
8
células/mL de D. bruxellensis
Tabela 13 - Análise de variância dos valores de pH
Grau de
Liberdade
SQ QM F
Tratamento
4 9,69 2,42 118,82*
Ciclo
13 5,63 0,43 21,27*
Tratamento*Ciclo
52 16,066 0,309 15,16*
Erro
192 18,92 0,020
Total
209 34,24
*significativo a 5%
64
Tabela 14 - Teste de Tukey dos valores de pH
Tratamentos Médias
10
8
células/mL de S. cerevisiae 3,14 b
10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
1
células/mL de D. bruxellensis 2,97 c
10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
2
células/mL de D. bruxellensis 3,19 b
10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
3
células/mL de D. bruxellensis 2,78 d
10
8
células/mL de D. bruxellensis 3,42 a
Obs.: Médias dos tratamentos com letras iguais não diferem estatisticamente entre si (Tukey 5%)
Com relação ao Brix residual do meio de fermentação, foi possível observar
que os três ensaios fermentativos com a presença da levedura contaminante não
apresentaram diferenças entre si e em relação à fermentação somente com S.
cerevisiae após o 6º ciclo fermentativo. Já na fermentação com D. bruxellensis, o
decaimento do Brix foi lento ao longo dos 14 ciclos. Nas outras fermentações, com
exceção daquela contaminada com 10
2
células de D. bruxellensis/mL, o Brix decaiu
cerca de 50% logo ao final do primeiro ciclo (Figura 17).
0
2
4
6
8
10
12
1234567891011121314
Ciclos
Brix residual (º)
F1
F2
F3
F4
F5
Figura 17 - Brix residual (º) do meio de fermentação durante o processo fermentativo com reciclo celular
(ciclos de 12 horas); Brix inicial: 12º. Legenda: F1: 10
8
células/mL de S. cerevisiae; F2: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
1
células/mL de D. bruxellensis; F3: 10
8
células/mL de S.
cerevisiae + 10
2
células/mL de D. bruxellensis; F4: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
3
células/mL de D. bruxellensis; F5: 10
8
células/mL de D. bruxellensis
65
Há diferenças significativas entre os tratamentos, entre os ciclos e interação
ciclo x tratamento (Tabela 15), de forma que o menor Brix residual foi obtido na
fermentação mista S. cerevisiae + 10
3
células/mL de D. bruxellensis, significativamente
diferente da média na fermentação pura com S. cerevisiae e das demais. O maior teor
residual foi observado na fermentação pura com D. bruxellensis (Tabela 16).
Estes resultados podem apontar novamente para as duas situações:
independentemente da presença da contaminante e do seu crescimento no meio de
cultura, o açúcar está sendo consumido e convertido em etanol, e assim, não haveria
diferença na produção de etanol na presença da levedura contaminante; o açúcar
estaria sendo consumido, porém, não convertido proporcionalmente em etanol, sendo
utilizado como fonte de energia para o crescimento da levedura contaminante, e neste
caso, a produção de etanol não seria a mesma nos três ensaios. Os resultados de pH
final do meio de fermentação indicam uma acentuada acidificação do meio de
fermentação quando a contaminante está presente concomitantemente à S. cerevisiae,
podendo ser resultado da produção de álcool ou do crescimento da levedura D.
bruxellensis. O crescimento da contaminante no meio de fermentação pode ser
observado através dos plaqueamentos em meio WLD (Figura 12) e já foi descrito
anteriormente.
Tabela 15 - Análise de variância dos valores de Brix residual
Grau de
Liberdade
SQ QM F
Tratamento
4 902.867 225.717 25213,0*
Ciclo
13 170.320 13.102 1463,5*
Tratamento*Ciclo
52 98,213 1,889 211,0*
Resíduo
140 1,253 0,009
Total
209 1172.653
*significativo a 5%
Tabela 16 - Teste de Tukey dos resultados de Brix residual
Tratamentos Médias (º) Brix
10
8
células/mL de S. cerevisiae 4,8 d
10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
1
células/mL de D. bruxellensis 4,9 c
10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
2
células/mL de D. bruxellensis 5,6 b
10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
3
células/mL de D. bruxellensis 4,6 e
10
8
células/mL de D. bruxellensis 10,1 a
Obs.: Médias dos tratamentos com letras iguais não diferem estatisticamente entre si (Tukey 5%)
66
Os resultados de açúcares redutores residuais totais (ART) residuais mostram
mais claramente as diferenças entre os ensaios, pois na presença da contaminante D.
bruxellensis independentemente do seu nível de contaminação (10
1
, 10
2
ou 10
3
células/mL), a quantidade de açúcar residual é menor nos 7 primeiros ciclos, quando
comparado com o ensaio com somente S. cerevisiae. Após este período, não há
diferenças marcantes entre os ensaios (Figura 18).
A quantidade de ART residual apresentou média de 3,43, 3,44 e 3,46 mg/mL
nos ensaios em que a levedura contaminante D. bruxellensis estava presente nas
concentrações de 10
1
, 10
2
ou 10
3
células/mL, respectivamente. Tal fato evidencia o
consumo de ART pelas contaminantes não significativamente diferentes entre si; já no
ensaio em que havia somente S. cerevisiae, a média dos 14 ciclos de ART apresentou-
se em torno de 5 g/100mL de glicose, estatisticamente diferente das médias das
fermentações mistas S. cerevisiae + D. bruxellensis (Tabelas 17 e 18).
0
20
40
60
80
100
120
01234567891011121314
Ciclos
Açúcar redutor total residual (mg/mL)
F1
F2
F3
F4
F5
Figura 18 - ART residual (mg/mL) do meio de fermentação durante o processo fermentativo com reciclo
celular (ciclos de 12 horas); ART inicial: 113 mg/mL. Legenda: F1: 10
8
células/mL de S.
cerevisiae; F2: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
1
células/mL de D. bruxellensis; F3: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
2
células/mL de D. bruxellensis; F4: 10
8
células/mL de S.
cerevisiae + 10
3
células/mL de D. bruxellensis; F5: 10
8
células/mL de D. bruxellensis
67
Tabela 17 – Análise de variância dos valores de ART (mg/mL)
Grau de
Liberdade
SQ QM F
Tratamento
4 53220,86 13305,21 10392,57*
Ciclo
13 8689,37 668,41 522,09*
Tratamento*Ciclo
52 15922,61 306,20 239,17*
Resíduo
140 179,24 1,28
Total
209 78012,08
*significativo a 5%
Tabela 18 - Teste de Tukey dos resultados de ART
Tratamentos Médias (mg/mL)
10
8
células/mL de S. cerevisiae 5,14 b
10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
1
células/mL de D. bruxellensis 3,43 c
10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
2
células/mL de D. bruxellensis 3,44 c
10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
3
células/mL de D. bruxellensis 3,46 c
10
8
células/mL de D. bruxellensis 43,66 a
Obs.: Médias dos tratamentos com letras iguais não diferem estatisticamente entre si (Tukey 5%)
Quanto ao teor alcoólico do vinho, verificou-se um aumento gradativo ao longo
dos ciclos para todas as fermentações (Figura 19). A análise estatística revelou
diferenças significativas entre os tratamentos, entre os ciclos e interação ciclo x
tratamento (Tabela 19), mostrando médias estatisticamente diferentes entre si nos
tratamentos (Tabela 20). Com a contaminação por D. bruxellensis, o teor alcoólico
decaiu 0,3 a 0,7 pontos percentuais. A fermentação pura com D. bruxellensis resultou
em teor alcoólico irrisório (por volta de 1%).
68
0
1
2
3
4
5
6
7
1234567891011121314
Ciclos
Teor alcoólico (g/100mL)
F1
F2
F3
F4
F5
Figura 19 - Teor alcoólico (g/100mL) do vinho do processo fermentativo com reciclo celular (ciclos de 12
horas); Legenda: F1: 10
8
células/mL de S. cerevisiae; F2: 10
8
células/mL de S. cerevisiae +
10
1
células/mL de D. bruxellensis; F3: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
2
células/mL de D.
bruxellensis; F4: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
3
células/mL de D. bruxellensis; F5: 10
8
células/mL de D. bruxellensis
Tabela 19 - Análise de variância do teor alcoólico (g/100mL)
Grau de
Liberdade
SQ QM F
Tratamento
4 413,702 103,425 1430,79*
Ciclo
13 73,673 5,667 78,40*
Tratamento*Ciclo
52 32,919 0,633 8,76*
Resíduo
140 10,120 0,072
Total
209 530,414
*significativo a 5%
Tabela 20 - Teste de Tukey dos resultados do teor alcoólico
Tratamentos Médias (g/100 mL)
10
8
células/mL de S. cerevisiae 5,1 a
10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
1
células/mL de D. bruxellensis 4,6 c
10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
2
células/mL de D. bruxellensis 4,8 b
10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
3
células/mL de D. bruxellensis 4,4 d
10
8
células/mL de D. bruxellensis 1,3 e
Obs.: Médias dos tratamentos com letras iguais não diferem estatisticamente entre si (Tukey 5%).
69
Avaliando-se os resultados do teor alcoólico em conjunto com os outros
parâmetros analisados (viabilidade celular, crescimento em UFC/mL, pH, Brix residual e
ART residual), algumas considerações podem ser feitas:
- a levedura Dekkera bruxellensis é capaz de crescimento em meio de
fermentação à base de caldo de cana, independente do tamanho do seu inóculo inicial
(10
1
a 10
3
células/mL), com ART por volta de 11% e condições de semi-aerobiose
(frascos tamponados com algodão, sem agitação);
- em sistema de fermentação em batelada com reciclo celular, a contaminação
por D. bruxellensis na concentração de 10
1
a 10
3
células/mL é capaz de impactar
negativamente a fermentação etanólica, causando diminuição da viabilidade de S.
cerevisiae, diminuição do pH do meio e decréscimo na produção de etanol,
provavelmente pela produção de ácido acético às custas do ART do meio.
O decréscimo na produção de etanol encontrado por Abbott e Ingledew (2005)
se deveu à possível metabolização do álcool pelas leveduras Brettanomyces para a
produção de ácido acético. Porém, estes autores não detectaram crescimento
expressivo (cerca de 1 ciclo log) como aquele apresentado pela espécie D. bruxellensis
na fermentação mista com S. cerevisiae do caldo de cana (2 a 3 ciclos log). Assim,
reforça-se a idéia de que a produção de ácido deve estar relacionada com consumo
direto de ART e crescimento, “desviando” o açúcar que iria para a produção de etanol.
Vários autores têm apontado algumas questões como restritivas à concepção
da importância destas leveduras no processo fermentativo para produção de álcool
combustível, embora os resultados sejam a partir de mosto de milho (whole corn mash):
- incapacidade de produção de ácido acético em condições de baixa aeração e
altas concentrações de glicose (ABBOTT et al., 2005);
- leveduras Dekkera/Brettanomyces somente crescem mais rapidamente que
S. cerevisiae em concentrações de ácido acético acima de 0,45%, prejudicial a S.
cerevisiae (ABBOTT et al., 2005);
- a levedura S. cerevisiae é capaz de metabolizar ácido acético, assim como
espécies de Brettanomyces (ABBOTT; INGLEDEW, 2005).
A aeração parece ser o fator chave para a produção de ácido acético pelas
leveduras Dekkera/Brettanomyces, e desta forma os autores não estão convencidos do
70
papel destas leveduras na fermentação, ainda mais pela incapacidade de competir com
S. cerevisiae baseada nas suas taxas de crescimento lentas.
Porém, os resultados aqui apresentados revelam outros aspectos. Os
resultados discrepantes aqui obtidos podem estar relacionados ao tipo de substrato
utilizado, sendo o caldo de cana mais facilmente metabolizável que o mosto de milho; a
utilização de um sistema de fermentação com reciclo celular durante um tempo mais
longo (7 dias ou 14 ciclos de 12 horas) para permitir competitividade com S. cerevisiae,
uma vez que as leveduras Dekkera tem crescimento mais lento; a utilização de uma
linhagem isolada do processo fermentativo, portanto, mais adaptada às condições do
processo; e emprego de ensaios com fermentações mistas (S.cerevisiae + D.
bruxellensis), ao invés das fermentações puras utilizadas por alguns autores.
A Figura 20 traz os resultados da eficiência fermentativa média (%), baseada
no cálculo estequiométrico teórico de Gay-Lussac, onde 1 g de açúcar consumido rende
0,511 g de álcool. Houve uma queda acentuada na eficiência, confirmando o desvio do
açúcar para produção de outros metabólitos que não o álcool. A levedura S. cerevisiae
utilizada (PE-02, CCA193) apresentou uma boa eficiência fermentativa, por volta de
92%.
71
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Eficiência fermentativa média (%)
F1 F2 F3 F4 F5
Fermentações
Figura 20 - Eficiência fermentativa média (%), baseada no cálculo estequiométrico teórico de Gay-
Lussac, apresentada pelas fermentações puras e mistas de S. cerevisiae e D. bruxellensis
em meio de caldo de cana. Legenda: F1: 10
8
células/mL de S. cerevisiae; F2: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
1
células/mL de D. bruxellensis; F3: 10
8
células/mL de S.
cerevisiae + 10
2
células/mL de D. bruxellensis; F4: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
3
células/mL de D. bruxellensis; F5: 10
8
células/mL de D. bruxellensis
Para avaliar o real impacto da contaminação por D. bruxellensis no processo
de fermentação etanólica, realizou-se uma extrapolação com os dados obtidos junto a
uma destilaria de médio porte
2
, cuja capacidade de moagem foi de 2.500.000 toneladas
de cana na safra 2007/2008, com 191.499.000 Kg de ART dirigidos à produção de
etanol. Para cada fermentação realizada, foram calculados o volume total de álcool
produzido e a quantidade total de ART disponibilizado, somando-se os valores a cada
ciclo fermentativo, na hipótese de que 7 dias de fermentação (14 ciclos de 12 horas)
possam representar uma safra. Os dados obtidos quanto ao volume de álcool produzido
(em m
3
) estão representados na Figura 21, a qual mostra também o volume de álcool
que deixou de ser produzido devido à contaminação por D. bruxellensis, variando de
cerca de 6 milhões a 15 milhões de litros numa safra.
2
USINA ZANIN AÇÚCAR E ÁLCOOL LTDA, Araraquara/SP
72
11.173
5.940
15.296
81.698
0
20.000
40.000
60.000
80.000
100.000
120.000
Álcool produzido (m3)
F1 F2 F3 F4 F5
Fermentações
Figura 21 - Volume de álcool produzido (m
3
) durante as fermentações puras e mistas de S. cerevisiae e
D. bruxellensis, em meio de caldo de cana, extrapolando-se os resultados obtidos em escala
de laboratório para os números de ART da cana de uma destilaria de médio porte. O volume
de álcool que deixou de ser produzido nas fermentações com D. bruxellensis esta destacado
em vermelho e expresso em números sobre as barras. Legenda: F1: 10
8
células/mL de S.
cerevisiae; F2: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
1
células/mL de D. bruxellensis; F3: 10
8
células/mL de S. cerevisiae + 10
2
células/mL de D. bruxellensis; F4: 10
8
células/mL de S.
cerevisiae + 10
3
células/mL de D. bruxellensis; F5: 10
8
células/mL de D. bruxellensis
Considerando-se a média do preço do álcool durante a safra 2007/2008 (abril a
novembro) foi de R$ 0,67 por litro
3
, calcula-se que com a quantidade de álcool que na
safra deixaria de ser produzida, a usina sofreria um prejuízo de cerca de R$ 4 a 10
milhões dependendo do grau de contaminação com Dekkera bruxellensis.
Ainda que se considere a pequena escala de realização dos experimentos e o
controle do processo no laboratório (temperatura, assepsia, etc.) em comparação com
as condições industriais, o volume de álcool (em potencial) “produzido” pela levedura S.
cerevisiae CCA193 (PE-02) foi de cerca de 108.000 m
3
, enquanto na destilaria
anteriormente referida, a produção de álcool girou em torno de 110.000 m
3
, o que torna
mais confiável os resultados da extrapolação.
3
Cepea-ESALQ/USP
73
De uma forma geral, constatou-se que na fermentação com 10
2
células/mL de
D. bruxellensis, os resultados foram sempre mais favoráveis que a 10
1
e 10
3
células/mL
de D. bruxellensis, embora sempre críticos. Esse “desvio” de tendência pode ser
resultado do acaso ou estar relacionado a algum fator intrínseco da levedura. Estudos
adicionais são necessários para verificar esta questão da concentração do inóculo e
outras levantadas no texto, destacando-se como essencial a quantificação de ácido
acético no meio de fermentação.
3 CONCLUSÕES
Com os resultados obtidos foi possível concluir que:
- a taxonomia clássica não é uma ferramenta confiável para identificação de
leveduras do gênero Dekkera, visto que os resultados são ambíguos e variáveis;
- a amplificação e sequencicamento da região ITS do DNA ribossomal são
importantes ferramentas para identificação e caracterização de leveduras Dekkera, com
tamanhos variando entre 400 e 600 bp;
- as leveduras do gênero Pichia (especialmente Pichia guilliermondii) podem ser
facilmente confundidas com algumas espécies do gênero Dekkera pela alta produção
de ácido e tamanho da região ITS do rDNA, podendo ser diferenciadas pelo
sequenciamento desta região;
- os ensaios de sensibilidade às toxinas killer mostraram que é inviável o uso
deste método para biotipagem de leveduras do gênero Dekkera uma vez que as
linhagens analisadas apresentaram-se predominantemente neutras às toxinas;
- em condições de fermentação em batelada com reciclo celular, a levedura
Dekkera bruxellensis foi capaz de crescimento em meio de caldo de cana,
74
independentemente do tamanho do seu inóculo inicial (10
1
a 10
3
células/mL),
impactando negativamente a fermentação etanólica, causando a diminuição da
viabilidade de S. cerevisiae, diminuição do pH do meio e decréscimo na produção de
etanol e eficiência fermentativa, possivelmente devido à produção de ácido acético a
partir do ART do meio de fermentação;
- extrapolando-se os resultados obtidos em escala de laboratório para a escala
industrial de uma destilaria de médio porte, a contaminação por Dekkera bruxellensis
acarretaria numa perda de 6 milhões a 15 milhões de litros de álcool na safra, que
deixariam de ser produzidos, dependendo do nível de contaminação.
75
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81
ANEXOS
82
Sequências (5’ Æ 3’) da região ITS do r DNA, incluindo o gene 5,8S das
linhagens de leveduras estudadas.
CCT2621 – forward
GAAAGTAGAAATTTTGAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTA
CTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGC
GGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTG
TGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCAT
ATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAAC
ACAAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGA
AATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAG
AACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAAT
CTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTC
ATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAA
ATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTT
GAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTT
TATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATG
TTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAAGGTAGGAGTACCCGCTGACCT
CCA053 –forward
TAATCGAATTGCAGCGCTTACTGCGCGGCGAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTG
ATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACA
AAACACAATTTAATTATTTTTATTGATAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTC
AACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGT
AATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTC
TGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGT
TTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGAACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCAT
GGGTAGTACTGGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTT
GAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAAC
AAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAGCCG
CGGAGAGAATTA
83
CCA059 – forward
AGGGTGCTCTTATGACGTGCAGACACGTGGATGATGAATAGTGGAATACATTAAAT
TTATTTAGTTTAGTCAAGAAAGAAATTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCT
CGCGTCCATGAAGAACGCAACGAATTGCGATACTTAATGGGAATTGCAGATTTTCG
TGAATCATCCAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAAGGCATGC
CTGTTTGAACGTCATTTCCTTCTCACTTTCAGTGGGTATGAGATTACACGGAGGTGT
TTTCTTCCAAGGAAAGACAGGGGAGTTGAGGAATAATGATTCAAGGGTTCGGCCGT
TCATTAATTTTTTTCTCCCCCCTCCCTCAAGTTTGACCTCCAATCAGGTAGGAGGAC
CCGCTGAACTTAAGCATATCAAAATCAGAGGAAAAT
CCA077 – forward
CAATGCTGGACTTAGCCGTGCAGACACGTGGATGGAGAAGGAGAAAAGAAAATAC
ATTAAATTTTAGTTTAGTCAAGAAAGAAATTTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTG
GTTCTCGCGTCGATGAAGAGCGCAGCGAATTGCGATACTTAATGTGAATTGCAGAT
TTTCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGG
CATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCACTTTTTTTTTTAGTGGTTATGAAATTAC
ACGAGGGGGTTTTCTTCAAAGGGAAAAACAAGGGCAGTTAGGGAATGATGATTTAA
GGTTTCGGCCGTTCATTATTTCTTTATTACCCGTAATTAACAAGTTTGACCTCAAATC
AGGGAGGAGGACCCGCTGAACTTATGCCTATCAATAACCGAAAGAAAAA
CCA155 – forward
TTGGCGGAGTTTTATGCCGTGCAGACACGTGGATGAGGAATAGTGGAGATACATTA
AATTTATTTAGTTTAGTCAAGAAAGAAATTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGT
TCTCGCGTCGATGAAGAGCGCAGCGAATTGCGATACTTAATGTGAATTGCAGATTT
TCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGGTATTCCGGAAGGG
CATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCACTTTCAGTGGTTATGAGATTACACGGA
GGTGTTTTCTTCAAAGGAAAGACAGGGGAGTTGAGGAATAATGATTCAAGGTTTCG
GCCGTTCATTAATTTTTTTCTCCCCCATCCATCAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGG
AGGACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA
84
IF3 – forward
GAATTCGTATTGCAGCGCTTACTGCGCGGCGATAACCTTACACACAGTGTCTTTTT
GATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAAC
AAAACACAATTTAATTATTTTTATTGATAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTT
CAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAG
TAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCT
CTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGG
TTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGAACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCA
TGGGTAGTACTGGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGT
TGAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAA
CAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAACC
GGGAGGAG
IF4 – forward
CAAATTAAGCTAGATGCATTACACTTGATAGTACTGATATTCTCGCAAGAGCATAAA
CAACAAAAACTATTACAACCATGTCAACTAAGATTAATGTTAAAACTTTCAACAACGG
ATCTCTTGGTTCTCGCAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGCGAT
TTGCATTTTTTCGTGAGTCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCTTTGGTATTC
CAGAGAGCATGTCTGTTTGAGCGTCGTTTCCTTCTCAAACGCAAGTTTGGTGTTGG
GCGGTGCGTGAGCTAGCCTGAAATAATGGTTGTGGAGGCGCTGTATTGTCTTCTGT
AAAGTTTGTACTAGGAATAATACTTACTGGAGCAGGACCAAAGGCTACACAGTGCT
GCCACTGAATTTATCAAGCTCGACCTCAAATCAGACAAGAGTACCCGCTGAACTTA
AGCATATCAATAAGCGGGAGGAAAAA
IF5 – forward
CGATCGTTTGCAGCGCTTACTGCGCGGCGAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGA
TACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAA
AACACAATTTAATTATTTTTATTGATAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCA
ACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGCGATAAG
TAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCT
CTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGG
TTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGAACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCA
TGGGTAGTACTGGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGT
TGAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAA
CAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAAGC
CGGGAGAGAAA
85
IF6 – forward
CAAATACTTTTGCAGCGCTTACTGCGCGGCGAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTG
ATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACA
AAACACAATTTAATTATTTTTATTGATAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTC
AACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGT
AATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTC
TGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGT
TTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGAACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCAT
GGGTAGTACTGGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTT
GAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAAC
AAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAGGC
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